CN110100829B - N-甲基卟啉二丙酸ix在抗植物病毒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本名公开了N‑甲基卟啉二丙酸IX在抗植物病毒中的应用。通过农杆菌介导将含有TMV病毒的质粒转化到本氏烟草中，考察N‑甲基卟啉二丙酸IX对TMV的防治效果，结果发现，N‑甲基卟啉二丙酸IX对TMV病毒具有显著的抑制效果，且表现出剂量依赖性。N‑甲基卟啉二丙酸IX是一种安全有效的植物病毒抑制剂，可作为农药活性成分应用于抗植物病毒中。

Description

N-甲基卟啉二丙酸IX在抗植物病毒中的应用
技术领域
本发明属于农药领域，特别是抗植物病毒农药领域，具体涉及一种N-甲基卟啉二丙酸IX作为抗病毒化合物的应用。
背景技术
植物病毒病是危害农作物的重要病源之一，其种类多、危害大、防治困难，在农业生产中是仅次于真菌的第二大植物病害，绝大部分经济作物都因植物病毒的危害而造成不同程度减产或品质下降，全球每年因植物病毒造成的农作物经济损失高达数百亿美元，素有“植物癌症”之称。
近年来，植物病毒病在蔬菜、果树、花卉上的危害日益严重，此类病害多数由烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起。例如TMV或PVY侵染烟草后，植株生长迟缓，叶片生长受抑制，叶小、畸形，影响烟叶的产量和品质，严重时减产80％以上；CMV寄主范围广，能够侵染85科365属1000多种植物，是造成很多经济作物和观赏植物毁灭的根源之一。由于病毒在寄主细胞绝对寄生，且寄主植物本身缺乏完整的免疫代谢系统，植物一旦被病毒侵染，往往终生带毒，因此植物病毒病的防治始终是个困难。目前，仅有少数抗病毒药剂进入实用阶段，如宁南霉素、毒氟磷、病毒唑、病毒A等，并且许多抗病毒药剂只能降低症状的严重度，远未达到有效而令人满意的应用效果，抗病毒剂往往对寄主植物本身也会产生不利影响。面对植物病毒病危害的日益严重性，以及抗病毒剂短缺的局面，寻找开发新型的抗病毒活性化合物并研究其抗病毒机理具有重要的意义。
本课题组在新型、高效、低毒的抗植物病毒活性成分的筛选、研发过程中，首次发现N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)对TMV具有较高的抑制活性，NMM结构式如下所示。该活性物质在低浓度下对TMV就表现出显著的抑制效果，且活性明显高于已报道的植物病毒抑制剂。NMM是一种非对称性的卟啉类化合物，能够与G-四链体结合使荧光增强，该特点已在专利CN107817228A、CN105452467A中公开，但作为抗植物病毒活性成分及其应用未见任何报道。
Figure BDA0002047883510000021
发明内容
本发明的目的是提供一种卟啉类衍生物N-甲基卟啉二丙酸IX在抗植物病毒中的应用。
申请人通过农杆菌介导将含有TMV病毒的质粒转化到本氏烟草中，考察N-甲基卟啉二丙酸IX对TMV的防治效果，结果发现，N-甲基卟啉二丙酸IX对TMV病毒具有显著的抑制效果，且表现出剂量依赖性。当N-甲基卟啉二丙酸IX在5μg/mL处理剂量下，其对TMV的防治效果与宁南霉素240μg/mL相当，表现出高效的抗TMV活性。
N-甲基卟啉二丙酸IX处理7天后，与空白对照组相比，处理后的烟草生长状态良好，无明显的抑制或不利影响，表明N-甲基卟啉二丙酸IX对寄主安全。
因此，N-甲基卟啉二丙酸IX是一种安全有效的植物病毒抑制剂，可作为农药活性成分应用于抗植物病毒中。
所述植物病毒不局限于烟草花叶病毒，也包括黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒等。
本发明的另一目的是提供一种抗植物病毒农药，所述农药的活性成分为N-甲基卟啉二丙酸IX。
优选地，所述N-甲基卟啉二丙酸IX在农药中的浓度为0.05-5μg/mL。
所述农药以二甲基亚砜为溶剂，并于-20℃下避光储存。
本发明的有益效果如下：
1、所述NMM易溶于水，不易降解、稳定性高。
2、所述NMM低毒，对农作物无要害和不利影响，是农业生产上急需的低毒性、高活性的抗病毒物质。
3、本发明提供了NMM的新用途，发现其在抗植物病毒方面的新应用，其抑制植物病毒复制效果更为突出。
附图说明
图1：NMM与表达病毒载体的农杆菌共注射进烟草叶片后，叶片荧光随时间的动态变化。
图2：NMM处理后，叶片荧光面积随时间的增长曲线。
具体实施方式
下述实施例以抗TMV为例，但并不限定本发明化合物抗其它病毒的应用。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
将TMV病毒以农杆菌介导的手段转化到本氏烟草中，考察NMM的抗病毒作用，具体测定程序如下：
1、农杆菌转化：采用文献方法构建TMV-GFP质粒(其中GFP为绿色荧光蛋白，在紫外灯照射下发出绿色荧光)，将保存在-80℃的农杆菌感受态放在冰上解冻，然后将1μg TMV-GFP质粒加入到50μL农杆菌感受态中，轻弹混匀后，冰上静置5分钟，然后液氮速冻1分钟，转移至37℃水浴5分钟进行热激，冰上放置至温度降到0℃，加入500μL没有抗性的LB液体培养基(LB液体培养基组分：10g蛋白胨粉末，5g酵母提取物，10g NaCl，溶于1L去离子水中)，在28℃，200rpm条件下培养3小时。将转化产物涂布在含有抗生素的LB培养基中。48小时后，查看单克隆，进行菌液PCR，并挑选阳性单克隆，保存备用。
2、农杆菌悬浮培养：将阳性克隆菌液扩大培养至5mL饱和菌液，培养条件为28℃，220rpm，培养时间为48小时。培养结束后，按饱和菌液：悬浮液＝1:100的比例，于28℃，200rpm条件下悬浮培养16小时，(悬浮液组分：1μL乙酰丁香酮(0.2M)，100μL2-(N-吗啉)(0.5M)，5μL利福平(10mg/mL)，5μL壮观霉素(100mg/mL)，加入到5mL LB液体培养基中)。之后悬浮菌液用纱布过滤，除去絮状物，于4500rpm条件下离心5分钟，收集菌体沉淀。用悬浮液调OD600至0.5即为所需菌液浓度，室温静置备用。
3、化合物溶液的配制：根据试验剂量设计，准确称取NMM于容量瓶中，加入200μL二甲基亚砜使其充分溶解，用农杆菌重悬菌液将NMM配制成0.05，0.5和5μg/mL 3个浓度，同时分别以宁南霉素(240μg/mL)、农杆菌重悬液和去离子水作为阳性、阴性和空白对照。
4、寄主：本氏烟(Nicotiana benthamiana)。烟草种子用0.1％(质量浓度)硝酸银消毒10-15分钟，然后用去离子水冲洗3-4次，将其播种于基质。试验过程中烟草培养于25±2℃的温室中。待烟草生长约4周，长至5-6叶期时，进行不同的处理。
5、化合物处理：采用共注射的方法，使用注射器将含有化合物的农杆菌重悬液注入烟草叶片。叶背面注射，每株烟草注射3片叶，每叶注射300μL，每片叶主脉两侧各注射一个点，每个注射点直径不超过2厘米。注射后采用数码照相机(紫外灯照射下)每隔1小时拍照一次，记录叶片表面荧光面积的变化，连续观察7天。统计荧光面积的变化，计算化合物对TMV的防治效果。
N-甲基卟啉二丙酸IX抗TMV的结果如图1、图2所示。烟草叶片在相同处理时间下，随NMM处理剂量的增加，其荧光面积明显降低，表现出剂量依赖性，对TMV具有显著的抑制效果。并且，NMM在5μg/mL处理剂量下，其对TMV的防治效果与宁南霉素240μg/mL相当，表现出高效的抗TMV效果。
化合物处理7天后，与空白对照组相比，NMM处理后的烟草生长状态良好，无明显的抑制或不利影响，表明NMM对寄主安全。

Claims (1)

1.N-甲基卟啉二丙酸IX在抗烟草花叶病毒中的应用。
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