WO2011016565A1 - 分析用核酸素子、それを用いた分析方法、分析用試薬および分析用具 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a nucleic acid element for analysis, an analysis method using the same, an analysis reagent, and an analysis tool.
- Patent Document 1 discloses a method for inspecting ingredients in food using an antigen-antibody reaction.
- an object of the present invention is to provide a technique capable of easily analyzing a target analysis object.
- the nucleic acid element for analysis of the present invention includes a first nucleic acid part and a second nucleic acid part, and the first nucleic acid part is a binding part capable of binding to an analyte,
- the second nucleic acid part is a labeling part that can distinguish between binding and non-binding of the first nucleic acid part and the analyte.
- the analysis method of the present invention uses the nucleic acid element for analysis of the present invention, Binding the analyte to the first nucleic acid portion; The binding is analyzed by the second nucleic acid part.
- the reagent for analysis of the present invention is characterized by including the nucleic acid element for analysis of the present invention.
- the analysis tool of the present invention is characterized by including the analysis reagent of the present invention.
- an analysis object can be easily analyzed.
- aptamers are obtained in vitro, for example, unlike antibodies, aptamers for highly toxic compounds and aptamers that specifically recognize low-molecular compounds can be obtained. Therefore, for example, if aptamer technology is applied to the present invention, the problems of the technique using antigen-antibody reaction can be solved, and a simple inspection system can be constructed in the field of food and the like.
- FIGS. 1 (A) and 1 (B) are explanatory diagrams schematically showing the analytical nucleic acid element of Embodiment 1 of the present invention.
- FIGS. 2A and 2B are specific examples of the analysis method using the nucleic acid element for analysis of the first embodiment.
- 3A and 3B are explanatory diagrams schematically showing the analytical nucleic acid element of Embodiment 2 of the present invention.
- 4A, 4B, 4C, and 4D are specific examples of an analysis method that uses the nucleic acid element for analysis of the second embodiment.
- FIGS. 5A, 5B, and 5C are explanatory views schematically showing an analysis method using the analysis tool according to the third embodiment of the present invention.
- FIG. 6 is a specific example of an analysis method using the analysis tool according to the fourth embodiment of the present invention.
- the nucleic acid element for analysis of the present invention includes a first nucleic acid part and a second nucleic acid part,
- the first nucleic acid part is a binding part capable of binding to an analyte;
- the second nucleic acid part is a labeling part that can distinguish between binding and non-binding of the first nucleic acid part and the analyte.
- “analysis” is a concept including, for example, quantitative analysis, semi-quantitative analysis, and qualitative analysis (hereinafter the same).
- the first nucleic acid part and the second nucleic acid part each include a nucleic acid molecule, and may be composed of, for example, only the nucleic acid molecule or may include the nucleic acid molecule.
- the first nucleic acid part includes a nucleic acid molecule whose structure is changed by the binding of the analyte
- the second nucleic acid part is the structural change of the first nucleic acid part. It is preferable to include a nucleic acid molecule whose structure changes due to
- the first nucleic acid part is the binding part of the analysis target in the nucleic acid element for analysis.
- the first nucleic acid part includes, for example, a nucleic acid molecule that can bind to the analyte as the nucleic acid molecule.
- the nucleic acid molecule that can bind to the analyte is also referred to as “analyte-binding nucleic acid molecule”, for example.
- the first nucleic acid part may be composed of only the analyte-binding nucleic acid molecule or may include the analyte-binding nucleic acid molecule, for example.
- the second nucleic acid part is a label part that can distinguish the binding and the non-binding in the nucleic acid element for analysis.
- Examples of the second nucleic acid part include the following two forms.
- the first form of the second nucleic acid part is, for example, a form that can bind to a label.
- the second nucleic acid part includes, for example, a nucleic acid molecule to which the label can bind as the nucleic acid molecule.
- a nucleic acid molecule that can bind to the label is also referred to as a “label-bound nucleic acid molecule”.
- the second nucleic acid part may be composed of, for example, the label-binding nucleic acid molecule or may include the label-binding nucleic acid molecule.
- the label is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme as described later.
- the second form of the second nucleic acid part is, for example, a form that itself can distinguish between binding and non-binding of the first nucleic acid part and the analyte.
- the second nucleic acid part includes, for example, a nucleic acid molecule capable of causing an enzyme catalytic function as the nucleic acid molecule.
- a nucleic acid molecule capable of causing the catalytic function of the enzyme is also referred to as a “catalytic nucleic acid molecule”.
- the second nucleic acid part may be composed of, for example, only the catalyst nucleic acid molecule or may include the catalyst nucleic acid molecule.
- analyte-binding nucleic acid molecule the label-binding nucleic acid molecule, and the catalytic nucleic acid molecule are described below, but are not limited thereto.
- the constitutional unit of each nucleic acid molecule is not particularly limited.
- the structural unit is, for example, a nucleotide residue, and examples of the nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
- the nucleic acid molecule may be, for example, RNA composed of ribonucleotide residues, DNA composed of deoxyribonucleotide residues, or a nucleic acid molecule containing both deoxyribonucleotides and ribonucleotides.
- Examples of the structural unit include monomer residues such as PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), and ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids).
- the nucleic acid molecule may include these monomer residues, for example.
- the nucleotide residue may be, for example, a modified nucleotide residue.
- the modified nucleotide residue include those in which a sugar residue in the nucleotide residue is modified.
- examples of the sugar residue include a ribose residue and a deoxyribose residue.
- the modification site in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2 'position and / or the 4' position of the sugar residue. Examples of the modification include methylation, fluorination, amination, and thiolation.
- modified nucleotide residue examples include, for example, 2′-fluorouracil (2′-fluorinated-uracil nucleotide residue), 2′-aminouracil (2 ′) in which the 2 ′ position of the ribose residue is modified.
- '-Aminated-uracil-nucleotide residue 2'-O-methyluracil (2'-methylated-uracil nucleotide residue
- 2'-thiouracil 2'-thiolated-uracil nucleotide residue
- Each nucleic acid molecule may be, for example, a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
- the single-stranded nucleic acid include single-stranded RNA and single-stranded DNA.
- the double-stranded nucleic acid include double-stranded RNA, double-stranded DNA, and double-stranded nucleic acid of RNA and DNA.
- Each nucleic acid molecule is preferably a single-stranded nucleic acid, for example.
- each base may be a natural base (non-artificial nucleic acid) of adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) and uracil (u), or an artificial base.
- a cytosine
- c cytosine
- g guanine
- t thymine
- u uracil
- an artificial base may be used.
- the artificial base include a modified base and a modified base, and preferably have the same function as the natural base (a, c, g, t, or u).
- the artificial base having the same function is, for example, an artificial base capable of binding to cytosine (c) instead of guanine (g), an artificial base capable of binding to guanine (g) instead of cytosine (c), Instead of adenine (a), an artificial base capable of binding to thymine (t) or uracil (u), instead of thymine (t), an artificial base capable of binding to adenine (a), instead of uracil (u) And an artificial base capable of binding to adenine (a).
- the modified base include a methylated base, a fluorinated base, an aminated base, and a thiolated base.
- the modified base examples include 2'-fluorouracil, 2'-aminouracil, 2'-O-methyluracil, 2-thiouracil and the like.
- the bases represented by a, g, c, t and u include the meaning of the artificial base having the same function as each of the natural bases in addition to the natural base.
- Each nucleic acid molecule may have, for example, a secondary structure by self-annealing, and examples of the secondary structure include a stem-loop structure.
- Each nucleic acid molecule may be, for example, a naturally-occurring nucleic acid sequence or a synthesized nucleic acid sequence.
- the synthesis method is not limited at all, and examples thereof include a method of chemically synthesizing from a terminal base using dNTP, NTP, etc. as a material by a DNA synthesizer, an RNA synthesizer or the like.
- the analyte-binding nucleic acid molecule and the label-binding nucleic acid molecule are preferably aptamers, for example.
- the aptamer generally refers to a nucleic acid molecule that can bind to a specific target.
- the method for producing the aptamer is not particularly limited, and can be produced, for example, by the above-described known synthesis method.
- a known SELEX (Systematic Evolution of Legends by Exponential Enrichment) method or the like can be employed.
- the preparation of aptamers by the SELEX method is not particularly limited, and can be performed, for example, as follows.
- the nucleic acid pool is, for example, a nucleic acid library including a plurality of nucleic acid molecules.
- the target is not particularly limited.
- the nucleic acid pool and the target are bound (associated) to form a complex of the nucleic acid pool and the target. Then, by collecting only the nucleic acid pool involved in the formation of the complex from the complex, only the nucleic acid molecule that can bind to the target can be selected as an aptamer that can bind to the target.
- the nucleic acid pool is, for example, a library (mixture) of a plurality of nucleic acid molecules including random regions.
- Examples of the nucleic acid molecule in the library include polynucleotides such as RNA and DNA.
- the random region is, for example, a region in which bases of A, G, C and U or T are randomly connected, and the length thereof is, for example, 20 to 120 bases.
- the nucleic acid pool preferably includes, for example, 4 20 to 4 120 types (about 10 12 to 10 72 ) types of nucleic acid molecules, and more preferably 4 30 to 4 60 (about 10 18 to 10 36 ) types. is there.
- the polynucleotide included in the nucleic acid pool may have, for example, the random region, and other structures are not particularly limited.
- the polynucleotide has, for example, a primer region that can be annealed by a primer, a polymerase recognition region that can be recognized by a polymerase, and the like at least one of the 5 ′ end and the 3 ′ end of the random region. Is preferred.
- the polymerase recognition region can be appropriately determined according to, for example, the type of polymerase used in nucleic acid amplification described below.
- the polymerase recognition region is preferably, for example, a DNA-dependent RNA polymerase recognition region (hereinafter also referred to as “RNA polymerase recognition region”), and specific examples include T7 RNA polymerase recognition region. Examples of the region include the T7 promoter.
- the RNA polymerase recognition region and the primer region (hereinafter also referred to as “5 ′ end side primer region”) are linked in this order,
- the random region was linked to the 3 ′ end side of the 5 ′ end side primer region, and the primer region (hereinafter also referred to as “3 ′ end side primer region”) was linked to the 3 ′ end side of the random region.
- the 5 ′ terminal primer region in the RNA can bind to a sequence complementary to the 3 ′ side of the DNA antisense strand synthesized using the RNA as a template, that is, the 3 ′ side of the antisense strand, for example.
- the sequence is the same as that of a simple primer.
- the RNA pool may further have a region that assists binding to the target, for example.
- the polynucleotides included in the nucleic acid pool may have different random regions, respectively, or may have random regions in which some sequences are common. In the polynucleotide, the regions may be directly adjacent to each other, for example, or may be indirectly adjacent via an intervening sequence.
- the method for preparing the nucleic acid pool is not particularly limited, and a known method can be adopted.
- the nucleic acid pool is an RNA pool
- an initial pool containing DNA can be used and the DNA can be prepared as a template.
- a DNA strand that serves as a template for RNA in a nucleic acid pool is also referred to as an antisense strand
- a DNA strand having a sequence in which U of the RNA is replaced with T is also referred to as a sense strand.
- the initial pool containing the DNA has, for example, DNA (antisense strand) in which U in the random region in the RNA pool is replaced with T (antisense strand), and DNA having a sequence in which U in the random region is replaced with T It is preferable to include any one of (sense strand).
- transcription reaction using DNA-dependent RNA polymerase is performed using the obtained DNA amplification product as a template. Nucleic acid pools can be prepared.
- an initial pool containing DNA in which U in the random region is replaced with T is prepared, and using this as a template, a primer containing the RNA polymerase recognition region and a sequence complementary to the 5′-end primer region is annealed
- the nucleic acid pool of RNA can also be prepared by performing nucleic acid amplification.
- the nucleic acid pool and the target are reacted to form a complex of the nucleic acid molecule and the target.
- the target to be reacted with the nucleic acid pool may be, for example, the target itself or a degradation product of the target.
- the binding format between the nucleic acid pool and the target is not particularly limited, and examples thereof include intermolecular forces such as hydrogen bonding.
- Examples of the binding treatment between the nucleic acid pool and the target include a method of incubating the both in a solvent for a predetermined time.
- the solvent is not particularly limited, and those that retain the binding between the two are preferable, and examples thereof include various buffer solutions.
- the complex of the nucleic acid pool and the target is recovered.
- the reaction solution obtained by reacting the two to form the complex includes, for example, a nucleic acid pool that does not participate in the complex formation (hereinafter referred to as “unreacted nucleic acid pool”). . Therefore, for example, with respect to the reaction solution, it is preferable to separate the complex and the unreacted nucleic acid pool.
- the separation method is not particularly limited, and examples thereof include a method using a difference in adsorptivity between the target and the nucleic acid pool and a difference in molecular weight between the complex and the nucleic acid pool.
- Examples of the method using the former difference in adsorptivity include the following methods. That is, first, a carrier having adsorptivity to the target is brought into contact with the reaction solution containing the complex. At this time, the unreacted nucleic acid pool is not adsorbed on the carrier, while the complex of the target and the nucleic acid pool is adsorbed on the carrier. Thereby, the unreacted nucleic acid pool and the complex can be separated. Then, after removing the unreacted nucleic acid pool, the complex adsorbed on the carrier may be recovered. Moreover, before recovering the complex from the carrier, for example, it is preferable to wash the carrier in order to sufficiently remove the unreacted nucleic acid pool.
- the carrier having adsorptivity to the target is not particularly limited, and can be appropriately selected according to, for example, the type of the target. When the target is a protein such as an antibody, examples of the adsorptive carrier include a nitrocellulose membrane.
- Examples of the latter method using the difference in molecular weight include a method using a carrier.
- Examples of the carrier include a carrier having a pore of a size that allows the nucleic acid pool to pass through and the complex cannot pass through. By using such a carrier, the complex and the unreacted nucleic acid pool can be separated.
- the separation may be electrical separation using, for example, an agarose gel or a polyacrylamide gel.
- a method of using the target immobilized on a carrier at the time of forming the complex can be mentioned. That is, the target is immobilized on a carrier in advance, and the carrier and the nucleic acid pool are brought into contact with each other to form a complex of the immobilized target and the nucleic acid pool. Then, after removing the unreacted nucleic acid pool not bound to the immobilized target, the complex of the target and the nucleic acid pool may be dissociated from the carrier to recover the complex.
- the method for immobilizing the target on the carrier is not limited at all, and a known method can be adopted.
- a label is bound to the target, and the target substance bound to the label is brought into contact with a carrier having a binding group with the label.
- the label include His-tag
- the binding group include metal ions such as nickel ion (Ni 2+ ) and cobalt ion (Co 2+ ).
- Specific examples of the carrier include Ni-agarose and Ni-Sepharose based on the metal ions.
- the nucleic acid pool involved in the complex formation is recovered from the recovered complex.
- the nucleic acid pool involved in the complex formation can be recovered, for example, by releasing the binding between the target and the nucleic acid pool for the complex.
- nucleic acid amplification is performed on the collected nucleic acid pool involved in the complex formation.
- the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and can be performed by a known method according to the type of the nucleic acid pool, for example.
- the nucleic acid pool is an RNA pool
- cDNA is prepared by a reverse transcription reaction using an RNA-dependent DNA polymerase, and nucleic acid amplification of DNA is performed by PCR or the like using the cDNA as a template.
- RNA is further transcribed using, for example, a DNA-dependent RNA polymerase.
- the RNA pool involved in the complex formation can be amplified.
- RNA pool has the RNA polymerase recognition region, the 5′-end primer region, the random region, and the 3′-end primer region
- an amplification method using these regions can be used. can give.
- a polynucleotide containing a sequence complementary to the 3'-end primer region of the RNA pool as a primer.
- a polynucleotide containing the 5′-end primer region and a polynucleotide containing a complementary strand of the 3′-end primer region are used.
- the former polynucleotide preferably further has, for example, the RNA polymerase recognition region on the 5 'end side and the 5' end primer region on the 3 'end side.
- the DNA amplification product is used as a template and the 5′-end primer region and the 3′-end primer region contained in the DNA are used.
- Nucleic acid amplification such as PCR is performed using a sex DNA polymerase.
- the former polynucleotide preferably further has, for example, the RNA polymerase recognition region on the 5 'end side and the 5' end primer region on the 3 'end side. Then, using the obtained amplification product as a template, an in vitro transcription reaction is performed using a DNA-dependent RNA polymerase using an RNA polymerase recognition region contained in the amplification product. Thereby, nucleic acid amplification of the RNA pool involved in the complex formation can be performed.
- the antisense strand DNA has an RNA polymerase recognition region on the 3 ′ end side thereof, so that the DNA-dependent RNA polymerase binds to this region, and the antisense strand as a template, RNA can be synthesized.
- the RNA-dependent DNA polymerase used for the reverse transcription reaction is not particularly limited.
- avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase AMV Reverse Transscriptase
- the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and for example, a PCR method, various isothermal amplification methods and the like can be adopted. Also, the conditions are not particularly limited.
- the nucleic acid pool that has formed the complex with the target is recovered, and further, in the same manner as described above, it is involved in formation of the complex using the target, recovery of the complex, and formation of the complex.
- the nucleic acid aptamer having binding properties to the target can be finally obtained by repeatedly separating the nucleic acid pool and amplifying the separated nucleic acid pool.
- Examples of the catalytic nucleic acid molecule include a nucleic acid molecule capable of causing the catalytic function of an enzyme as described above.
- the catalyst function is not particularly limited, and examples thereof include a redox reaction catalyst function.
- the catalytic nucleic acid molecule inhibits or inactivates the catalytic function, and the first nucleic acid molecule When the analyte is bound to the part, the inhibition of the catalytic function is released or the catalytic function is activated.
- Examples of the oxidation-reduction reaction include a reaction that causes transfer of electrons between two substrates in the process of generating a product from the substrate.
- the kind of the redox reaction is not particularly limited.
- Examples of the nucleic acid molecule capable of causing the catalytic function of the oxidation-reduction reaction include those that exhibit the same activity as the enzyme that catalyzes the oxidation-reduction reaction. Specific examples include nucleic acid molecules having peroxidase activity, phosphatase activity, ribonuclease activity, and the like. Examples of the peroxidase activity include horseradish peroxidase (HRP) activity.
- DNA is called a DNA enzyme or DNAzyme
- RNA is called an RNA enzyme or RNAzyme.
- the catalyst nucleic acid molecule is preferably a nucleic acid molecule that forms a G-quartet (or G-tetrad) structure, and more preferably a nucleic acid molecule that forms a guanine quadruplex (or G-quadruplex) structure.
- the G-tetrad is, for example, a surface structure in which guanine is a tetramer
- the G-quadruplex is, for example, a structure in which a plurality of the G-tetrads are overlapped.
- the G-tetrad and the G-quadruplex are formed, for example, in a nucleic acid molecule that repeatedly has a G-rich structural motif.
- Examples of the G-tetrad include a parallel type and an anti-parallel type, and a parallel type is preferable.
- the catalytic nucleic acid molecule is inhibited from forming the G-tetrad, and the first nucleic acid part When the analyte binds, it is preferable that the inhibition is released to form the G-tetrad.
- the catalyst nucleic acid molecule is preferably a nucleic acid molecule that can bind to porphyrin, and specifically, a nucleic acid molecule that forms the G-tetrad and can bind to the porphyrin is preferable.
- the nucleic acid molecule having G-tetrad is known to cause a catalytic function such as a redox reaction by binding to the porphyrin to form a complex.
- the catalytic nucleic acid molecule is inhibited from binding with the porphyrin, and the first nucleic acid part
- the inhibition is released and the porphyrin is bound.
- the catalytic nucleic acid molecule inhibits the formation of the G-tetrad and thereby It is preferable that the binding to the porphyrin is inhibited, and the analyte is bound to the first nucleic acid part to form the G-tetrad and bind to the porphyrin.
- the porphyrin is not particularly limited.
- Examples of the porphyrin include unsubstituted porphyrin and derivatives thereof.
- Examples of the derivatives include substituted porphyrins and metal porphyrins that are complexed with metal elements.
- Examples of the substituted porphyrin include N-methylmesoporphyrin.
- Examples of the metal porphyrin include hemin, which is a trivalent iron complex.
- the porphyrin is, for example, preferably the metal porphyrin, more preferably hemin.
- the catalytic nucleic acid molecule is not limited at all.
- DNAzyme disclosed in the following articles (1) to (4) can be exemplified as DNA having peroxidase activity.
- the DNAzyme disclosed in these papers can generate a peroxidase activity higher than that of hemin alone by binding to a porphyrin such as hemin to form a complex.
- Cheng et al., Biochemistry, 2009, vol. 48, p. 7817-7823 (3) Teller et al., Anal. Chem. , 2009, vol. 81, p. 9144-9119 (4) Tao et al., Anal. Chem. , 2009, vol. 81, p. 2144-2149
- the method for producing the catalytic nucleic acid molecule is not particularly limited, and for example, it is possible to design and synthesize a sequence according to the type of desired redox reaction. At this time, for example, the secondary structure may be predicted and the sequence may be corrected by a computer or the like.
- the nucleic acid element for analysis of the present invention may be, for example, an element including only the first nucleic acid part and the second nucleic acid part, or may be an element including other components.
- the other components include the labeling substance and the porphyrin.
- the label is, for example, an optional component, and can be attached to and detached from the second nucleic acid part depending on whether the analyte is bound to the first nucleic acid part.
- the porphyrin may be present together with the analytical nucleic acid element at the time of analysis, for example.
- the other component includes, for example, a linker.
- the linker include nucleic acids containing nucleotides.
- the linker may be, for example, a nucleic acid consisting only of nucleotides or a nucleic acid containing nucleotides.
- the linker may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
- Examples of the linker include single-stranded DNA and single-stranded RNA in the case of a single-stranded nucleic acid, and examples of double-stranded nucleic acid include double-stranded DNA, double-stranded RNA, and DNA-RNA. Examples include double strands.
- the linker may contain a natural base as described above or a non-natural base as a base.
- the linker may include, for example, PNA, LNA and the like. The length of the linker is not particularly limited.
- the first nucleic acid part and the second nucleic acid part are preferably linked, for example, one end of the first nucleic acid part and the second nucleic acid part It is linked to one end of the nucleic acid part.
- the first nucleic acid part and the second nucleic acid part for example, the 5 ′ end of the first nucleic acid part and the 3 ′ end of the second nucleic acid part may be linked, The 3 ′ end of one nucleic acid part and the 5 ′ end of the second nucleic acid part may be linked.
- connection between the first nucleic acid part and the second nucleic acid part may be, for example, direct connection or indirect connection.
- the direct linkage for example, one end of the first nucleic acid part and one end of the second nucleic acid part are linked by a phosphodiester bond.
- the direct linking is, for example, a phosphodiester bond between the 5 ′ end of the first nucleic acid part and the 3 ′ end of the second nucleic acid part or the first nucleic acid part. Examples include phosphodiester linkage between the 3 ′ end and the 5 ′ end of the second nucleic acid part.
- the first nucleic acid part and the second nucleic acid part are linked via the linker.
- the linker interposed between the first nucleic acid part and the second nucleic acid part is hereinafter referred to as an intervening linker or an intervening sequence.
- the intervening linker include a form in which one end is linked to one end of the first nucleic acid part and the other end is linked to one of the second nucleic acid part.
- the indirect linking is performed, for example, by connecting one end of the intervening linker to the 5 ′ end of the first nucleic acid part and the other end 3 ′ of the second nucleic acid part.
- linkage between the linker and the first nucleic acid part or the second nucleic acid part include phosphodiester linkage.
- the nucleic acid element for analysis may further have the linker on any one end side. This linker is hereinafter referred to as an additional linker or additional sequence.
- the nucleic acid element for analysis may have the linker at the end opposite to the end to which the second nucleic acid part is linked in the first nucleic acid part, for example.
- the linker may be present at the end of the portion opposite to the end to which the first nucleic acid portion is linked.
- the nucleic acid element for analysis may have the additional linker at, for example, the opposite end of the first nucleic acid part and the opposite end of the second nucleic acid part, respectively.
- the nucleic acid element for analysis of the present invention is preferably a single-stranded nucleic acid in which the first nucleic acid part and the second nucleic acid part are linked.
- the nucleic acid element for analysis of the present invention is a single-stranded nucleic acid, for example, a change in secondary structure occurs due to binding of the analyte to the first nucleic acid part, and this change is The secondary structure of the second nucleic acid part is likely to change.
- the lengths of the first nucleic acid part and the second nucleic acid part are not particularly limited.
- the lower limit of the length of the nucleic acid molecule in the first nucleic acid part is not particularly limited, and is, for example, 7 bases.
- the upper limit of the length of the nucleic acid molecule in the first nucleic acid part is not particularly limited and is, for example, 120 bases, preferably 80 bases, more preferably 35 bases, and further preferably 20 bases. Yes, shorter is preferable.
- the length range of the nucleic acid molecule in the first nucleic acid part is, for example, 7 to 120 bases, preferably 7 to 80 bases, more preferably 7 to 35 bases, and further preferably 7 to 20 bases.
- the lower limit of the length of the nucleic acid molecule in the second nucleic acid part is not particularly limited, and is, for example, 7 bases.
- the upper limit of the length of the nucleic acid molecule in the second nucleic acid part is not particularly limited, and is, for example, 120 bases, preferably 80 bases, more preferably 60 bases, and further preferably 40 bases. Yes, particularly preferably 35 bases, shorter being preferred.
- the length range of the nucleic acid molecule in the second nucleic acid part is, for example, 7 to 120 bases, preferably 7 to 80 bases, more preferably 7 to 60 bases, and further preferably 7 to bases. 40 bases, particularly preferably 7 to 35 bases.
- the total length of the nucleic acid element for analysis is not particularly limited, and the range of the length is, for example, 14 to 240 bases, preferably 14 to 200 bases, more preferably 14 to 160 bases.
- the base is more preferably 14 to 140 bases, particularly preferably 14 to 75 bases, and still more preferably 14 to 55 bases.
- the lengths of the first nucleic acid part and the second nucleic acid part may be the same or different, for example.
- the analysis target is not particularly limited, and examples thereof include a high molecular compound, a low molecular compound, an organic substance, and an inorganic substance.
- the polymer compound or organic substance include microorganisms, viruses, polysaccharides, proteins, nucleic acids, resins, and the like.
- the low molecular weight compound include agricultural chemicals, pharmaceuticals, chemicals, oligosaccharides, monosaccharides, lipids, oligopeptides, amino acids, vitamins, and physiologically active substances.
- the inorganic substance include minerals, mineral acids, metals, and the like.
- the sample to be analyzed is not particularly limited, and for example, food (including beverages), pharmaceuticals, chemicals, soil, animals, plants, microorganisms, viruses, water (for example, tap water, wastewater, River water, seawater, rainwater, snow, etc.), garbage, waste, etc.
- nucleic acid element for analysis of the present invention will be exemplified.
- the present invention is not limited to this.
- the nucleic acid element for analysis of Embodiment 1 includes the analyte-binding nucleic acid molecule as the first nucleic acid part and the label-binding nucleic acid molecule as the second nucleic acid part.
- the nucleic acid element for analysis is Including the first nucleic acid part and the second nucleic acid part,
- the second nucleic acid part is When the analyte is not bound to the first nucleic acid part, it can bind to a label, When an analyte binds to the first nucleic acid part, it cannot bind to the label.
- the “labeled substance” is an optional component of the nucleic acid element for analysis of the present invention, and can be attached or detached depending on whether or not the analyte is bound to the first nucleic acid part.
- the secondary structure of the second nucleic acid part is changed by the binding of the analyte to the first nucleic acid part, and the secondary structure of the second nucleic acid part.
- the label is, for example, an enzyme.
- the enzyme function of the enzyme is inhibited, that is, the enzyme reaction of the enzyme is inhibited.
- the enzyme is liberated, the inhibition of the catalytic function, that is, the inhibition of the enzyme reaction is released.
- the structure of the first nucleic acid part may change, for example, when the analyte is bound. Then, the structure of the second nucleic acid part changes due to the change in the structure of the first nucleic acid part, and the labeling part bound to the second nucleic acid part is released from the second nucleic acid part. May be.
- nucleic acid element for analysis of the present embodiment will be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
- FIG. 1 schematically shows the configuration of the nucleic acid element for analysis.
- 1A shows a state where the analyte is not bound to the nucleic acid element for analysis
- FIG. 1B shows a state where the analyte is bound to the nucleic acid element for analysis.
- the nucleic acid element for analysis 16 is composed of a first nucleic acid part (binding part) 12 and a second nucleic acid part (labeling part) 13.
- the first nucleic acid part 12 is the analyte binding nucleic acid molecule
- the second nucleic acid part 13 is the label binding nucleic acid molecule.
- the first nucleic acid part 12 and the second nucleic acid part 13 are integrated by connection.
- the first nucleic acid part 12 and the second nucleic acid part 13 may be directly connected at both ends or indirectly connected via a linker.
- the connection between the first nucleic acid part 12 and the second nucleic acid part 13 is not particularly limited.
- the 5 ′ end of the second nucleic acid part 13 is connected to the 3 ′ end of the first nucleic acid part 12.
- the 3 ′ end of the second nucleic acid part 13 may be linked to the 5 ′ end of the first nucleic acid part 12.
- the label 14 is bound to the second nucleic acid part 13.
- the label 14 is released from the second nucleic acid part 13 due to the structural change of the second nucleic acid part 13 or the like. Liberate.
- the label 14 is an enzyme
- the catalytic function is inhibited by, for example, binding to the second nucleic acid part 13.
- the enzyme that is the label 14 is released from the second nucleic acid part 13
- the inhibition of the catalytic function is released.
- the analysis object 11 can be analyzed by analyzing the enzyme reaction.
- the method for analyzing the enzyme reaction is not particularly limited, and may be optical detection or electrochemical detection, for example.
- the optical detection includes, for example, detection of an optical signal such as color development or luminescence, and can be performed by measuring signal intensity such as absorbance, reflectance, and fluorescence intensity.
- the optical signal is generated, for example, by performing the enzymatic reaction in the presence of a substrate.
- the substrate is not particularly limited, but a substrate that develops color or emits light by the enzyme reaction is preferable.
- the electrochemical detection includes, for example, detection of an electrochemical signal, and can be performed by measuring signal intensity such as current.
- the electrochemical signal is generated as exchange of electrons, for example, by performing the enzyme reaction in the presence of a substrate.
- the transfer of electrons can be measured as an electric current by application to an electrode, for example.
- the enzyme reaction may be performed in the presence of the substrate and a mediator, and at that time, electron transfer with the mediator may be measured.
- the substrate is not particularly limited, and for example, a chromogenic substrate that develops color by an enzymatic reaction is preferable from the viewpoint of ease of analysis.
- the color development includes, for example, coloring.
- examples of the enzyme include oxidoreductase.
- the oxidoreductase means an enzyme that catalyzes a redox reaction in a broad sense.
- examples of the oxidoreductase include peroxidase and phosphatase.
- the phosphatase include alkaline phosphatase.
- the chromogenic substrate may be, for example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), 1,2-phenylenediamine (OPD), 2,2′-Azinobis (3-ethylbenzothiazole-6 -Sulfonic Acid Ammonium Salt (ABTS), 3,3'-Diaminobenzodinine (DAB), 3,3'-Diaminobenzoidine Tetrahhydrochloridate Hydrate (DAB4HCl), 3-Amino-9-EC-1A-e-Chroine-9-EC 4C1N), 2,4,6-Tribromo-3-hydroxyben Examples include ic Acid, 2,4-Dichlorophenol, 4-Aminoantipyrine, 4-Aminoantipyrine Hydrochloride, Luminol, etc.
- the chromogenic substrate is, for example, 5-Bromo-4-chloro-3-indophylphos / Nitrotetrazolium blue (Nitro-TB), Nitro-Blue Tetrazolium Chloride (NBT), etc. These chromogenic substrates can also be used as substrates in electrochemical detection, for example.
- the mediator is not particularly limited.
- the mediator is not particularly limited.
- FIG. 2 shows an example of an analysis nucleic acid element 16 in which an aptamer is applied to each of the first nucleic acid part 12 and the second nucleic acid part 13.
- 2A shows a state where the analyte 11 is not bound to the nucleic acid element 16 for analysis
- FIG. 2B shows a state where the analyte 11 is bound to the nucleic acid element 16 for analysis.
- the nucleic acid element for analysis 16 is composed of an aptamer of the first nucleic acid part 12 and an aptamer of the second nucleic acid part 13.
- the first nucleic acid part 12 is the analyte binding nucleic acid molecule
- the second nucleic acid part 13 is the label binding nucleic acid molecule.
- the aptamer of the first nucleic acid part 12 and the aptamer of the second nucleic acid part 13 are linked to form a single-stranded nucleic acid.
- the single-stranded nucleic acid include single-stranded RNA.
- the two may be directly connected to each other at their ends or indirectly connected via a linker.
- connection between the first nucleic acid part 12 and the second nucleic acid part 13 is not particularly limited.
- the 5 ′ end of the second nucleic acid part 13 is connected to the 3 ′ end of the first nucleic acid part 12.
- the 3 ′ end of the second nucleic acid part 13 may be linked to the 5 ′ end of the first nucleic acid part 12.
- the label 14 is bound to the aptamer of the second nucleic acid part 13.
- the labeled substance 14 becomes the second nucleic acid due to the structural change of the aptamer of the second nucleic acid part 13. Separate from the aptamer of part 13.
- the label 14 is an enzyme, the catalytic function is inhibited by, for example, binding to the second nucleic acid part 13.
- the enzyme that is the label 14 is released from the second nucleic acid part 13
- the inhibition of the catalytic function is released.
- a substrate is present, an enzymatic reaction occurs due to the catalytic function of the enzyme.
- the analysis object 11 can be analyzed by analyzing the enzyme reaction.
- FIG. 2 is an example, and the present invention is not limited to this.
- the second nucleic acid part 13 can be bound to the label 14, and the first nucleic acid part 12
- the analysis object 11 is bound to the second nucleic acid part 13 as long as the second nucleic acid part 13 cannot bind to the label 14, other points are not particularly limited.
- An analytical nucleic acid element using such an aptamer can be produced, for example, as follows. First, the aptamer of the first nucleic acid part is obtained using the analysis target as a target. In addition, the aptamer of the second nucleic acid part is obtained using the label, for example, an enzyme as a target. The above-described SELEX method can be applied to the aptamer acquisition method. Then, these two aptamers are combined.
- the binding method is not particularly limited, and examples thereof include a method in which two aptamer sequences are converted into single-stranded nucleic acid sequences, and nucleic acids are synthesized based on the single-stranded nucleic acid sequences. In this case, for example, the secondary structure of the two aptamers may be predicted by a computer or the like, the sequence of the single-stranded nucleic acid may be corrected, or the sequence may be added or deleted.
- the nucleic acid element for analysis of Embodiment 2 includes the analyte-binding nucleic acid molecule as the first nucleic acid part, and the catalytic nucleic acid molecule as the second nucleic acid part.
- the nucleic acid element for analysis is Including the first nucleic acid part and the second nucleic acid part,
- the second nucleic acid part is capable of causing a catalytic function of an enzyme;
- the second nucleic acid part is When the analyte is not bound to the first nucleic acid part, its catalytic function is inhibited, When an analyte binds to the first nucleic acid part, the inhibition of the catalytic function is released.
- the nucleic acid element for analysis is characterized in that the second nucleic acid part itself can cause a catalytic function of an enzyme.
- the secondary structure of the second nucleic acid part is changed by the binding of the analyte to the first nucleic acid part, and the secondary structure of the second nucleic acid part.
- the second nucleic acid part causes the catalytic function due to the change in.
- the catalytic function of the second nucleic acid part is inhibited, and the analyte is added to the first nucleic acid part. If the product is not bound, the inhibition of its catalytic function is released.
- the structure of the first nucleic acid part may change, for example, when the analyte is bound. Then, the structure of the second nucleic acid part may change due to a change in the structure of the first nucleic acid part, and the second nucleic acid part may cause the catalytic function due to this structural change.
- the control of the catalytic function of the second nucleic acid part is preferably performed as follows, for example. That is, in the nucleic acid element for analysis, for example, in a state where the analyte is not bound to the first nucleic acid part, the catalytic function of the second nucleic acid part is inactivated by cage formation. The In addition, it is preferable that the catalytic function of the second nucleic acid part is activated by self-association when the analyte binds to the first nucleic acid part.
- nucleic acid element for analysis in a state where the analyte is not bound to the first nucleic acid part, for example, a part of the first nucleic acid part and a part of the second nucleic acid part are: A stem structure is formed, the second nucleic acid part is caged by the stem structure, the catalytic function is inactivated, and the first nucleic acid part is a stem serving as a binding site for the analyte A loop structure is formed.
- the stem structure of a part of the first nucleic acid part and a part of the second nucleic acid part is released, thereby The second nucleic acid part is preferably released from the cage and further self-associates to activate the catalytic function.
- the control of the catalytic function of the second nucleic acid part is preferably performed as follows, for example.
- the intervening linker has one end linked to the 5 ′ end of the first nucleic acid part and the other end linked to the 3 ′ end of the second nucleic acid part.
- the additional linker is linked to, for example, the 3 ′ end of the first nucleic acid part.
- the intervening linker and the 3 ′ end region of the first nucleic acid part form a stem structure in a state where the analyte is not bound to the first nucleic acid part.
- the additional linker and the 3 ′ end region of the second nucleic acid part form a stem structure.
- the second nucleic acid part is caged by the stem structure, and the catalytic function is inactivated.
- the first nucleic acid part forms a stem-loop structure that serves as a binding site for the analyte.
- the analyte binds to the first nucleic acid part
- the stem structure with the intervening linker and the stem structure with the additional linker are released, whereby the second nucleic acid part is
- the catalytic function is preferably activated by releasing the cage and further self-associating.
- nucleic acid element for analysis of the present embodiment is exemplified, but not limited thereto.
- FIG. 3 schematically shows the configuration of the nucleic acid element for analysis.
- 3A shows a state where the analyte is not bound to the nucleic acid element for analysis
- FIG. 3B shows a state where the analyte is bound to the nucleic acid element for analysis.
- the nucleic acid element for analysis 36 includes a first nucleic acid part (binding part) 32 and a second nucleic acid part (labeling part) 33.
- the first nucleic acid part 32 is the analyte-binding nucleic acid molecule
- the second nucleic acid part 33 is the catalyst nucleic acid molecule.
- the first nucleic acid part 32 and the second nucleic acid part 33 are integrated by connection.
- the first nucleic acid part 32 and the second nucleic acid part 33 may be directly connected at both ends or indirectly connected via a linker.
- the connection between the first nucleic acid part 32 and the second nucleic acid part 33 is not particularly limited.
- the 5 ′ end of the second nucleic acid part 33 is connected to the 3 ′ end of the first nucleic acid part 32.
- the 3 ′ end of the second nucleic acid part 33 may be linked to the 5 ′ end of the first nucleic acid part 32.
- the second nucleic acid part 33 associates with the first nucleic acid part 32 and the catalyst The function is inhibited.
- FIG. 3B when the analyte 11 is bound to the first nucleic acid part 32, the association between the first nucleic acid part 32 and the second nucleic acid part 33 is released, and the second nucleic acid part 32
- the nucleic acid part 33 is in a state capable of causing the catalytic function.
- a catalytic reaction is caused by the catalytic function of the second nucleic acid part 33. For this reason, the analysis object 11 can be analyzed by analyzing the catalytic reaction.
- the second nucleic acid portion 33 is a catalytic nucleic acid molecule that forms the G-tetrad structure
- the following is performed.
- the second nucleic acid part 33 is caged by forming a stem structure of the first nucleic acid part 32 and the second nucleic acid part 33.
- the catalytic function of the second nucleic acid part 33 is inactivated.
- the analyte 11 binds to the first nucleic acid part 32, the secondary structure of the first nucleic acid part 32 changes, and the stem structure of the first nucleic acid part 32 and the second nucleic acid part 33 changes. Canceled.
- the second nucleic acid part 33 self-associates to form the G-tetrad and takes a G-quadruplex structure.
- porphyrin binds to the second nucleic acid portion 33 having a G-quadruplex structure to form a complex, and the catalytic function is activated.
- the analysis of the catalytic reaction is not particularly limited, and can be performed, for example, in the same manner as in the first embodiment.
- the method for analyzing the catalytic reaction is not particularly limited, and may be optical detection or electrochemical detection, for example.
- the optical detection includes, for example, detection of an optical signal such as color development or luminescence, and can be performed by measuring signal intensity such as absorbance, reflectance, and fluorescence intensity.
- the optical signal is generated, for example, by performing the catalytic reaction in the presence of a substrate.
- the substrate is not particularly limited, but a substrate that develops color or emits light by the catalytic reaction is preferable.
- the electrochemical detection includes, for example, detection of an electrochemical signal, and can be performed by measuring signal intensity such as current.
- the electrochemical signal is generated as exchange of electrons by performing the catalytic reaction in the presence of a substrate, for example.
- the transfer of electrons can be measured as a current, for example, by application to an electrode.
- the enzyme reaction may be performed in the presence of the substrate and a mediator, and at that time, electron transfer with the mediator may be measured.
- the type of the catalytic function of the second nucleic acid part 33 is not particularly limited, and examples thereof include the same catalytic function as that of the enzyme in the nucleic acid element for analysis of the first embodiment.
- Examples of the nucleic acid molecule capable of causing the catalytic function include DNA having Hemin peroxidase activity (Tao et al, Anal. Chem. 2009, 81, 2144-2149).
- the substrate is not particularly limited, and examples thereof include the same substrates as in Embodiment 1.
- FIG. 4 shows an example of an analytical nucleic acid element in which an aptamer is applied to the first nucleic acid part 32 and DNA capable of causing peroxidase activity is applied to the second nucleic acid part 33.
- (A) is DNA (SEQ ID NO: 1) capable of causing peroxidase activity
- (B) is an aptamer (SEQ ID NO: 2) for adenosine.
- FIG. 4C shows a nucleic acid element for analysis of single-stranded nucleic acid (SEQ ID NO: 3) in which the DNA (A) and the aptamer (B) are bound.
- SEQ ID NO: 3 single-stranded nucleic acid
- the aptamer (B) does not bind to adenosine, and thus the DNA (A) has a secondary structure that does not cause a catalytic function.
- adenosine binds to the aptamer (B), so that the DNA shown in FIG. 4 (C) has a secondary structure capable of causing a catalytic function as shown in FIG. 4 (D).
- FIG. 4 (D) shows a catalytic function of the DNA.
- the analysis of the catalytic reaction by the DNA makes it possible to analyze the analysis target adenosine.
- This nucleic acid element for analysis can be used, for example, for measurement of live bacteria in food.
- the presence of viable bacteria in food means that ATP exists, and the concentration of ATP is proportional to the number of viable bacteria. Therefore, when this analytical nucleic acid element is used to react a chromogenic substrate and food, color development proportional to the concentration of ATP derived from viable bacteria can be obtained. By analyzing this color development, the number of viable bacteria in the food can be analyzed. This is an example, and the use of the nucleic acid element for analysis of the present invention is not limited thereto.
- This nucleic acid element for analysis can be produced, for example, as follows. First, the aptamer of the first nucleic acid part is obtained using the analysis target as a target. The above-described SELEX method can be applied to the aptamer acquisition method. On the other hand, the sequence of the second nucleic acid part is designed and synthesized according to the desired catalytic function, for example. Then, the aptamer of the first nucleic acid part is bound to the second nucleic acid part.
- the binding method is not particularly limited.
- the aptamer sequence of the first nucleic acid part and the sequence of the second nucleic acid part are converted into a single-stranded nucleic acid sequence, and nucleic acid is synthesized based on the single-stranded nucleic acid sequence.
- the computer predicts the secondary structure of the first nucleic acid part, the second nucleic acid part and / or the single-stranded nucleic acid, and corrects the sequence of the single-stranded nucleic acid, Arrays may be added or deleted.
- the analytical reagent of the present invention is characterized by comprising the analytical nucleic acid element of the present invention.
- examples of the analytical nucleic acid element include the analytical nucleic acid element of Embodiment 1 and the analytical nucleic acid element of Embodiment 2.
- the analytical reagent of the present invention includes the analytical nucleic acid element of Embodiment 1, it is preferable that the analytical reagent further includes the label.
- the label is not particularly limited and is as described above. Among them, an enzyme is preferable.
- the analytical reagent of the present invention preferably further contains a substrate for the enzyme.
- the substrate is not particularly limited and is as described above. Among them, a chromogenic substrate that develops color by the reaction of the enzyme is preferable. The chromogenic substrate is as described above.
- the analytical reagent of the present invention includes the analytical nucleic acid element of Embodiment 2, it is preferable that the analytical reagent further includes a substrate.
- the substrate is not particularly limited and is as described above, and a chromogenic substrate that develops a color by the reaction of the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule that is the second nucleic acid part in the nucleic acid element for analysis is preferable.
- the chromogenic substrate is as described above.
- the analysis reagent of the present invention may be, for example, an analysis kit.
- the nucleic acid element for analysis of the present invention and other components may be contained separately and may be accommodated separately or in the same container.
- the other components include the label, the substrate, porphyrin, buffer solution, various additives, and the like.
- the other component may be added to the nucleic acid element for analysis when the nucleic acid element for analysis is used, for example.
- the analysis kit may further include instructions for use, for example.
- the analytical tool of the present invention includes the analytical reagent of the present invention.
- the analysis tool of the present invention is not particularly limited as long as it contains the nucleic acid element for analysis of the present invention as the analysis reagent of the present invention. Unless otherwise indicated, the analysis tool of the present invention is the same as the nucleic acid element for analysis and the reagent for analysis.
- the analysis nucleic acid element may be, for example, the analysis nucleic acid element of the first embodiment or the analysis nucleic acid element of the second embodiment.
- the nucleic acid element for analysis of the first embodiment the nucleic acid element for analysis in which the label is bound to the second nucleic acid part, that is, the label-bound nucleic acid molecule in advance, is preferable.
- the analysis tool of the present invention may include, for example, only one type of the nucleic acid element for analysis, or may include two or more types of the nucleic acid element for analysis with different targets. In the latter case, it is preferable that two or more kinds of the nucleic acid elements for analysis each have the first nucleic acid part having a different bindable target.
- the analysis tool of the present invention includes two types of nucleic acid elements for analysis having different targets, for example, two or more types of analytes can be detected in one analysis tool.
- the analysis tool of the present invention includes two or more types of nucleic acid elements for analysis
- the analysis tool preferably includes a plurality of detection units, and different nucleic acid elements for analysis are arranged in each detection unit. .
- the shape of the analysis tool of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include bags, sticks, tubes, chips, and the like.
- the analytical reagent is disposed on the inner surface of the container, and specifically, the analytical nucleic acid element of the present invention is disposed.
- the analysis tool of the present invention may further include other components.
- the other components include the substrate, the porphyrin, a buffer, and a solvent.
- the solvent include water, buffer solution, and physiological saline. The other components may be added to the container at the time of using the analytical tool, for example.
- the analysis tool of the present invention may further include a positive control, for example, in order to improve the reliability of analysis.
- the positive control is preferably disposed on the inner surface of the container, for example.
- the analysis tool of Embodiment 3 is an example of a bag-like analysis tool.
- the bag-shaped analysis tool 56 of this embodiment is shown.
- the bag-like analysis tool 56 has a reagent layer 57 containing an analytical nucleic acid element disposed on the inner surface thereof.
- the reagent layer 57 preferably includes the nucleic acid element for analysis, an enzyme as the label, and a substrate (for example, the chromogenic substrate).
- the reagent layer 57 preferably includes the nucleic acid element for analysis and a substrate (for example, the chromogenic substrate), and more preferably includes porphyrin.
- the reagent layer 57 may include a buffer, a hydrophilic polymer, and the like.
- the reagent layer 57 can be formed, for example, by preparing a reagent solution containing the analytical nucleic acid element, enzyme, substrate, and other components, applying the reagent solution to the inner surface of the bag-like container, and drying.
- the analysis object 11 when the analysis object 11 is put into the bag-like analysis tool 56, as shown in FIG. 5 (C), it reacts with the nucleic acid element for analysis in the reagent layer 57, and the substrate Develops color 58.
- the analysis object 11 By analyzing this color development 58, the analysis object 11 can be analyzed.
- the color development may be analyzed visually, for example, or may be analyzed using an optical detection device. In the latter case, for example, optical signals such as absorbance and reflectance may be measured.
- the shape is not limited to a bag shape, and may be, for example, a stick shape.
- a porous member such as filter paper may be used, and the reagent layer may be formed by infiltrating the reagent solution into the porous member and drying in the same manner as described above.
- the analysis tool according to the fourth embodiment is an example of an analysis tool used for electrochemical detection. Specifically, the analysis according to the second embodiment is capable of causing a catalytic function of a redox reaction as the nucleic acid element for analysis. It is an example provided with the nucleic acid element for use.
- the analysis tool of the present embodiment includes a substrate, the nucleic acid element for analysis, and an electric signal detection unit, On the substrate, the nucleic acid element for analysis and the detection unit are arranged, The detection unit is a detection unit that detects an electrical signal generated by an oxidation-reduction reaction by the second nucleic acid unit.
- the substrate is not particularly limited, but for example, a substrate having an insulating surface is preferable.
- the substrate may be, for example, a substrate made of an insulating material or a substrate having an insulating layer made of an insulating material on the surface.
- the insulating material is not particularly limited, and examples thereof include known materials such as glass, ceramic, insulating plastic, and paper.
- the insulating plastic is not particularly limited, and examples thereof include silicone resin, polyimide resin, epoxy resin, and fluorine resin.
- the detection unit only needs to be able to detect an electrical signal generated by the oxidation-reduction reaction of the second nucleic acid unit.
- the detection unit has, for example, an electrode system.
- the electrode system may include, for example, a working electrode and a counter electrode, or may include a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
- the material of the electrode is not particularly limited, and examples thereof include platinum, silver, gold, and carbon.
- Examples of the working electrode and the counter electrode include a platinum electrode, a silver electrode, a gold electrode, and a carbon electrode, and examples of the reference electrode include a silver / silver chloride electrode.
- the silver / silver chloride electrode can be formed, for example, by laminating a silver chloride electrode on a silver electrode.
- the detection unit can be formed, for example, by disposing the electrode on the upper surface of the substrate.
- the arrangement method of the electrodes is not particularly limited, and for example, a known method can be adopted. Specific examples include thin film forming methods such as vapor deposition, sputtering, screen printing, and plating.
- the electrodes may be disposed directly or indirectly on the substrate. Indirect arrangement includes, for example, arrangement through other members (hereinafter the same).
- the nucleic acid element for analysis may be disposed on the substrate, but is preferably immobilized on the substrate.
- the nucleic acid element for analysis may be directly or indirectly disposed on the surface of the substrate, for example.
- the nucleic acid element for analysis is preferably disposed, for example, in the detection unit in the substrate, more preferably disposed in the electrode in the detection unit, and disposed in the working electrode among the electrodes. It is preferable.
- the nucleic acid element for analysis may be disposed directly or indirectly on the detection unit or the electrode, for example.
- the “arrangement or immobilization of the nucleic acid element for analysis on the substrate” includes the meaning of the arrangement or immobilization of the detection unit on the substrate and the electrode of the detection unit unless otherwise specified.
- the arrangement method of the nucleic acid element for analysis is not particularly limited, and a known nucleic acid immobilization method can be adopted.
- the nucleic acid immobilization method include a method in which a nucleic acid prepared in advance is immobilized on the substrate, preferably the detection unit, more preferably the electrode. This method is, for example, a method using photolithography. As a specific example, US Pat. No. 5,424,186 can be referred to.
- Examples of the nucleic acid immobilization method include a method of synthesizing nucleic acid on the substrate, preferably on the detection unit, and more preferably on the electrode. As this method, for example, a so-called spot method can be mentioned, and specific examples thereof can be referred to US Pat.
- the nucleic acid element for analysis may be disposed on the substrate, for example, on either terminal side of the first nucleic acid part and the second nucleic acid part.
- Examples of the terminal side include the terminal of the first nucleic acid part or the terminal of the second nucleic acid part in the nucleic acid element for analysis.
- the terminal side may be, for example, the terminal opposite to the terminal to which the first nucleic acid part is linked in the additional linker.
- the terminal side may be, for example, the terminal opposite to the terminal to which the second nucleic acid part is linked in the additional linker.
- Form is preferred.
- the analysis tool may have, for example, a plurality of types of nucleic acid elements for analysis.
- Such an analytical tool for example, fractionates the surface of the substrate into a matrix, forms the electrode system as described above in each fractionation region, serves as a detection unit, and places a nucleic acid element in each detection unit. Can be formed.
- FIG. 6 schematically shows the configuration of the analysis tool.
- the left diagram shows a state in which the nucleic acid element for analysis in the analysis tool is not bound to the analysis object
- the right diagram shows a state in which the nucleic acid element for analysis in the analysis tool is bound to the analysis object.
- the analysis tool 1 includes a substrate 10, an electrode 20, and an analysis nucleic acid element 40, the electrode 20 is disposed on the substrate 10, and the analysis nucleic acid element 40 is immobilized on the electrode 20. ing.
- a region where the electrode 20 is disposed serves as a detection unit.
- the nucleic acid element for analysis 40 is a single-stranded nucleic acid composed of a first nucleic acid part 41, a second nucleic acid part 42, an intervening linker 43, a first addition linker 44, and a second addition linker 45.
- the first nucleic acid part 41 and the second nucleic acid part 42 are connected by an intervening linker 43, and the first additional linker 44 and the second nucleic acid part 41 are connected to the end of the first nucleic acid part 41.
- a second additional linker 45 is linked to the end of the nucleic acid part 42.
- the analytical nucleic acid element 40 is immobilized on the electrode 20 via the second additional linker 45 connected to the second nucleic acid part 42.
- the first nucleic acid part 41 is preferably single-stranded, and preferably has a stem-loop structure by self-annealing as shown in the left diagram of FIG. 6 in a state where it is not bound to the analyte.
- the method of using the first nucleic acid part 41 as an aptamer capable of binding to the analyte 50 and the second nucleic acid part 42 as DNA capable of causing peroxidase activity will be described. To do.
- a sample and a reagent are added to the detection unit of the analytical tool 1.
- the reagent includes the substrate and porphyrin.
- the analysis object 50 does not exist in the sample, as shown in the left diagram of FIG. 6, the analysis object does not bind to the first nucleic acid part 41 of the nucleic acid element for analysis 40, so the second nucleic acid part 42 Does not cause peroxidase activity.
- the second nucleic acid part 42 forms a stem structure with the first additional linker 44, whereby the second nucleic acid part 42 is caged and the catalytic function of the second nucleic acid part 42 is inactive. It becomes.
- the analyte 50 when the analyte 50 is present in the sample, the analyte binds to the first nucleic acid part 41 of the nucleic acid element for analysis 40 as shown in the right diagram of FIG.
- the part 42 changes to a secondary structure capable of causing peroxidase activity. Specifically, when the analyte 50 binds to the first nucleic acid part 41, the structure of the first nucleic acid part 41 changes, and the second nucleic acid part 42 and the first additional linker 44 are changed. The stem structure is released.
- the second nucleic acid part 42 self-associates to form the G-tetrad and has a G-quadruplex structure.
- Porphyrin binds to the second nucleic acid part 42 having a G-quadruplex structure to form a complex, and the catalytic function is activated. Then, in the process in which a product is generated from the substrate by the activated second nucleic acid unit 42, transfer of electrons occurs. As a result, an electric signal can be detected by the electrode 20 of the detection unit.
- the analysis tool 1 it is possible to analyze the presence or absence of an analysis target in a sample by detecting an electric signal.
- the reagent may further include the mediator, for example.
- a reagent solution containing each of the reagents may be added to the analysis tool before, at the same time as, or after the addition of the sample to the analysis tool.
- the analysis method of the present invention uses the nucleic acid element for analysis of the present invention, binds the analyte to the first nucleic acid part, and analyzes the binding by the second nucleic acid part. And The analysis method of the present invention can be carried out by the methods described in the nucleic acid element for analysis of the present invention, the analysis tool of the present invention and the like, unless otherwise specified.
- the nucleic acid element for analysis used in the analysis method of the present invention is as described above, and examples thereof include the nucleic acid element for analysis of the first embodiment and the nucleic acid element for analysis of the second embodiment.
- the binding is analyzed as follows. That is, for example, before the analysis, the second nucleic acid part is bound to the second nucleic acid part, and in the analysis, the second nucleic acid part is bound to the first nucleic acid part. It is preferable that the label is released from and the released label is analyzed. In this case, for example, when the analyte binds to the first nucleic acid part, the secondary structure of the second nucleic acid part changes, and due to the change of the secondary structure, the second nucleic acid part The labeled substance bound to is released from the second nucleic acid part.
- the label is not particularly limited and is as described above. Among them, an enzyme is preferable.
- the label is an enzyme, for example, when the enzyme is bound to the second nucleic acid part, the catalytic function of the enzyme is inhibited, and when the enzyme is released from the second nucleic acid part, The inhibition of the catalytic function of the enzyme is released. And in the said analysis, the enzyme reaction by the catalytic function of the said enzyme is analyzed.
- the enzyme bound to the second nucleic acid part is released from the second nucleic acid part, for example, when the analyte binds to the first nucleic acid part.
- the method for analyzing the binding is not particularly limited, and can be carried out, for example, by analyzing a released label.
- the analysis of the released label can be appropriately set according to the type of the label.
- the label is the enzyme
- it can be performed, for example, by analyzing the enzyme reaction of the released enzyme.
- the method for analyzing the enzyme reaction is not particularly limited, and may be optical detection or electrochemical detection, for example.
- the optical detection includes, for example, detection of an optical signal such as color development or luminescence, and can be performed by measuring signal intensity such as absorbance, reflectance, and fluorescence intensity.
- the optical signal is generated, for example, by performing the enzymatic reaction in the presence of a substrate.
- the substrate is not particularly limited, but a substrate that develops color or emits light by the enzyme reaction is preferable.
- the electrochemical detection includes, for example, detection of an electrochemical signal, and can be performed by measuring signal intensity such as current.
- the electrochemical signal is generated as exchange of electrons, for example, by performing the enzyme reaction in the presence of a substrate.
- the transfer of electrons can be measured as an electric current by application to an electrode, for example.
- the addition of the substrate is not particularly limited.
- it may coexist with the nucleic acid element for analysis in advance, or may be added simultaneously with the sample to be analyzed when the analyte is bound. It may be added after the sample to be analyzed is added.
- the binding is analyzed as follows. That is, for example, in analysis, it is preferable to cause the catalytic function of the second nucleic acid part to occur by binding the analyte to the first nucleic acid part and analyze the reaction due to the catalytic function.
- the catalytic function occurs.
- the method for analyzing the binding is not particularly limited, and can be performed, for example, by analyzing a catalytic reaction by the catalytic function of the second nucleic acid part.
- the analysis of the catalytic reaction can be appropriately set according to the type of catalytic function of the second nucleic acid part.
- the method for analyzing the reaction by the catalytic function is not particularly limited, and may be optical detection or electrochemical detection, for example.
- the optical detection includes, for example, detection of an optical signal such as color development or luminescence, and can be performed by measuring signal intensity such as absorbance, reflectance, and fluorescence intensity.
- the optical signal is generated, for example, by performing the catalytic reaction in the presence of a substrate.
- the substrate is not particularly limited, but a substrate that develops color or emits light by the catalytic reaction is preferable.
- the electrochemical detection includes, for example, detection of an electrochemical signal, and can be performed by measuring signal intensity such as current.
- the electrochemical signal is generated as exchange of electrons by performing the catalytic reaction in the presence of a substrate, for example.
- the transfer of electrons can be measured as a current, for example, by application to an electrode.
- the substrate When the substrate is added, it is not particularly limited. For example, it may coexist with the nucleic acid element for analysis in advance, may be added simultaneously with the sample to be analyzed, or the sample to be analyzed is added. It may be added later.
- the catalytic reaction is preferably performed in the presence of the porphyrin, for example.
- the addition of the porphyrin is not particularly limited. For example, it may coexist with the nucleic acid element for analysis in advance, may be added simultaneously with the sample to be analyzed, or the sample to be analyzed is added. It may be added later.
- the analysis method of the present invention can also be performed using, for example, the aforementioned analysis reagent of the present invention, the analysis tool of the present invention, and the like.
- the present invention can construct a simple inspection system, and its use is not limited, and can be widely applied to various fields such as food, medicine, agriculture, environment, and the like.
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Abstract
目的の分析対象物を簡易に分析可能な技術を提供する。第1の核酸部12と、第2の核酸部13とを含む分析用核酸素子16を使用する。前記分析用核酸素子16において、前記第1の核酸部12は、分析対象物11と結合可能な結合部であり、前記第2の核酸部13は、前記第1の核酸部12と分析対象物11との結合および非結合を区別可能な標識部である。前記第1の核酸部12は、前記分析対象物11に対するアプタマーであることが好ましい。そして、前記分析用核酸素子16を用い、前記第1の核酸部12に、前記分析対象物11を結合させ、前記結合を、前記第2の核酸部13により分析すれば、前記分析対象物11を、簡易に分析することが可能である。
Description
本発明は、分析用核酸素子、それを用いた分析方法、分析用試薬および分析用具に関する。
最近、偽装表示事件および農薬の混入事件等、食品に関する事件が発生している。また、大腸菌O157株およびサルモネラ菌等の微生物による食中毒事件ならびに病原性タンパク質によるクロイツフェルトヤコブ病等の食品を媒介とした感染症も発生している。また、高齢化社会の到来を受け、国民の健康志向は、ますます高まりつつある。このような背景から、国民の食品に対する意識は高く、安全で、健康によい食品が求められている。食品の品質を保証するには、食品生産工程、食品流通工程および食品消費工程の各工程において、食品の品質を検査するシステムが必要である。一方、特定の物質を特異的に検出する手法としては、抗原抗体反応を利用する方法がある。例えば、特許文献1では、食品中の成分を、抗原抗体反応を用いて検査する方法が開示されている。
食品の生産工程においては、食品衛生法の要請および食品会社等の自主的管理等により、衛生検査および異物混入検査が実施されている。しかしながら、流通工程および消費工程において、食品の品質が検査されることは、稀である。すなわち、スーパー、デパート、コンビニおよびレストラン等において、食品工場と同様な食品検査システムを導入することは、現実的ではない。また、食品生産工程においても、農薬等の化学物質の検査は、ほとんど実施されていないのが、実情である。これは、検査方法が煩雑だからである。また、抗原抗体反応を用いた方法は、検査対象物が限定される。例えば、農薬等の低分子化合物は、動物において抗原として認識され難く、また、毒性のものは、抗体を取るための動物において致命的である。このため、農薬等の低分子化合物を認識できる抗体の取得が困難である。さらに、抗原抗体反応を利用した手法は、簡易な検査システムにすることが困難である。このような簡易検査システムの要請は、食品分野に限らず、医療および農業等の国民の健康に関する全ての分野においても必要である。
そこで、本発明は、目的の分析対象物を簡易に分析可能な技術を提供することを目的とする。
本発明の分析用核酸素子は、第1の核酸部および第2の核酸部を含み
前記第1の核酸部は、分析対象物と結合可能な結合部であり、
前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能な標識部であることを特徴とする。
前記第1の核酸部は、分析対象物と結合可能な結合部であり、
前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能な標識部であることを特徴とする。
本発明の分析方法は、前記本発明の分析用核酸素子を用い、
前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させ、
前記結合を、前記第2の核酸部により分析することを特徴とする。
前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させ、
前記結合を、前記第2の核酸部により分析することを特徴とする。
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸素子を含むことを特徴とする。
本発明の分析用具は、前記本発明の分析用試薬を含むことを特徴とする。
本発明によれば、分析対象物を簡易に分析可能である。また、アプタマーは、試験管内で取得されるため、例えば、抗体とは異なり、毒性の高い化合物に対するアプタマーも、低分子化合物を特異的に認識するアプタマーも取得可能である。このため、本発明に、例えば、アプタマーの技術を適用すれば、抗原抗体反応を用いた手法の問題点を解決でき、食品等の分野において簡易検査システムを構築可能である。
<分析用核酸素子>
本発明の分析用核酸素子は、前述のように、第1の核酸部および第2の核酸部を含み、
前記第1の核酸部は、分析対象物と結合可能な結合部であり、
前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能な標識部であることを特徴とする。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である(以下、同様)。
本発明の分析用核酸素子は、前述のように、第1の核酸部および第2の核酸部を含み、
前記第1の核酸部は、分析対象物と結合可能な結合部であり、
前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能な標識部であることを特徴とする。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である(以下、同様)。
前記第1の核酸部および前記第2の核酸部は、それぞれ、核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子のみから構成されてもよいし、前記核酸分子を含んでもよい。本発明の分析用核酸素子において、前記第1の核酸部は、前記分析対象物の結合により構造変化する核酸分子を含み、前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部の前記構造変化により構造変化する核酸分子を含むことが好ましい。
前記第1の核酸部は、前述のように、前記分析用核酸素子における、前記分析対象物の前記結合部である。前記第1の核酸部は、例えば、前記核酸分子として、前記分析対象物と結合可能な核酸分子を含む。以下、前記分析対象物と結合可能な核酸分子を、例えば、「分析対象物結合核酸分子」ともいう。前記第1の核酸部は、例えば、前記分析対象物結合核酸分子のみから構成されてもよいし、前記分析対象物結合核酸分子を含んでもよい。
前記第2の核酸部は、前述のように、前記分析用核酸素子における、前記結合および前記非結合を区別可能な標識部である。前記第2の核酸部は、例えば、以下に示す2種類の形態があげられる。
前記第2の核酸部の第1形態は、例えば、標識物と結合可能な形態である。前記標識物は、例えば、前記第2の核酸部に結合しているか否かによって、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能である。前記第2の核酸部は、例えば、前記核酸分子として、前記標識物が結合可能な核酸分子を含む。以下、前記標識物と結合可能な核酸分子を、「標識物結合核酸分子」ともいう。前記第2の核酸部は、例えば、前記標識物結合核酸分子から構成されてもよいし、前記標識物結合核酸分子を含んでもよい。前記標識物は、特に制限されないが、後述するように、例えば、酵素等があげられる。
前記第2の核酸部の第2形態は、例えば、それ自身が、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能な形態である。前記第2の核酸部は、例えば、前記核酸分子として、酵素の触媒機能を生起可能な核酸分子を含む。前記酵素の触媒機能を生起可能な核酸分子を、「触媒核酸分子」ともいう。前記第2の核酸部は、例えば、前記触媒核酸分子のみから構成されてもよいし、前記触媒核酸分子を含んでもよい。
前記分析対象物結合核酸分子、前記標識物結合核酸分子および前記触媒核酸分子について、以下に説明するが、これらには制限されない。
前記各核酸分子の構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるRNAでもよく、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるDNAでもよく、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子でもよい。前記構成単位は、例えば、PNA(ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)、ENA(2’-O,4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acids)等のモノマー残基もあげられる。前記核酸分子は、例えば、これらのモノマー残基を含んでもよい。
前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化されたヌクレオチド残基でもよい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されているものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基またはデオキシリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されないが、例えば、前記糖残基の2’位および/または4’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例としては、例えば、リボース残基の2’位が修飾された、2’-フルオロウラシル(2’-フルオロ化-ウラシルヌクレオチド残基)、2’-アミノウラシル(2’-アミノ化-ウラシル-ヌクレオチド残基)、2’-O-メチルウラシル(2’-メチル化-ウラシルヌクレオチド残基)、2’-チオウラシル(2’-チオ化-ウラシルヌクレオチド残基)等があげられる。
前記各核酸分子は、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記一本鎖核酸は、例えば、一本鎖RNAおよび一本鎖DNAがあげられる。前記二本鎖核酸は、例えば、二本鎖RNA、二本鎖DNA、およびRNAとDNAとの二本鎖核酸があげられる。前記各核酸分子は、例えば、一本鎖核酸が好ましい。
前記各核酸分子において、各塩基は、例えば、アデニン(a)、シトシン(c)、グアニン(g)、チミン(t)およびウラシル(u)の天然塩基(非人工核酸)でもよいし、人工塩基(非天然塩基)でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基(a、c、g、tまたはu)と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン(g)に代えて、シトシン(c)に結合可能な人工塩基、シトシン(c)に代えて、グアニン(g)に結合可能な人工塩基、アデニン(a)に代えて、チミン(t)またはウラシル(u)に結合可能な人工塩基、チミン(t)に代えて、アデニン(a)に結合可能な人工塩基、ウラシル(u)に代えて、アデニン(a)に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、2’-フルオロウラシル、2’-アミノウラシル、2’-O-メチルウラシル、2-チオウラシル等があげられる。本発明において、例えば、a、g、c、tおよびuで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
前記各核酸分子は、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造は、例えば、ステムループ構造があげられる。
前記各核酸分子は、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよい。合成方法は、何ら制限されず、例えば、DNA合成機、RNA合成機等により、dNTP、NTP等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。
前記分析対象物結合核酸分子および前記標識物結合核酸分子は、例えば、アプタマーが好ましい。前記アプタマーは、一般的に、特定のターゲットに結合可能な核酸分子を意味する。
前記アプタマーの製造方法は、特に制限されず、例えば、前述の公知の合成方法によって製造できる。また、前記アプタマーの製造には、例えば、公知のSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法等が採用できる。
SELEX法によるアプタマーの調製は、特に制限されず、例えば、以下のようにして行える。まず、核酸プールおよびターゲットを準備する。前記核酸プールは、例えば、複数の核酸分子を含む核酸ライブラリーである。前記ターゲットは、特に制限されず、例えば、前記分析対象物に結合可能なアプタマーを調製する場合は、前記分析対象物であり、前記標識物に結合可能なアプタマーを調製する場合は、前記標識物である。つぎに、前記核酸プールと前記ターゲットとを結合(会合)させ、前記核酸プールと前記ターゲットとの複合体を形成する。そして、前記複合体から、前記複合体の形成に関与した前記核酸プールのみを回収することにより、前記ターゲットに結合可能な核酸分子のみを、前記ターゲットに結合可能なアプタマーとして選択できる。
以下に、一例として、SELEX法を用いて、ターゲットに結合可能なアプタマーを調製する方法をあげる。本発明は、これらには何ら制限されない。
前記核酸プールは、例えば、ランダム領域を含む複数の核酸分子のライブラリー(混合物)である。前記ライブラリーにおける前記核酸分子は、例えば、RNA、DNA等のポリヌクレオチドがあげられる。前記ランダム領域は、例えば、A、G、CおよびUまたはTの塩基をランダムに連結した領域であり、その長さは、例えば、20~120塩基長である。前記核酸プールは、例えば、420~4120種類(約1012~1072)種類の核酸分子を含むことが好ましく、より好ましくは、430~460(約1018~1036)種類である。
前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記ランダム領域を有していればよく、その他の構造は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドは、前記ランダム領域に加えて、例えば、前記ランダム領域の5’末端および3’末端の少なくとも一方に、プライマーがアニーリング可能なプライマー領域、ポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識領域等を有することが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、後述する核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記核酸プールがRNAプールの場合、前記ポリメラーゼの認識領域は、例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼの認識領域(以下、「RNAポリメラーゼ認識領域」ともいう)が好ましく、具体例としては、T7RNAポリメラーゼの認識領域であるT7プロモーター等があげられる。前記RNAプールの具体例としては、例えば、5’末端側から、前記RNAポリメラーゼ認識領域と前記プライマー領域(以下、「5’末端側プライマー領域」ともいう)とを、この順序で連結し、前記5’末端側プライマー領域の3’末端側に、前記ランダム領域を連結し、さらに、前記ランダム領域の3’末端側にプライマー領域(以下、「3’末端側プライマー領域」ともいう)を連結した構造があげられる。前記RNAにおける前記5’末端側プライマー領域は、例えば、前記RNAを鋳型として合成したDNAアンチセンス鎖の3’側に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の3’側に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記RNAプールは、例えば、さらに、前記ターゲットへの結合を補助する領域を有してもよい。また、前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、それぞれ、異なるランダム領域を有してもよいし、一部の配列が共通するランダム領域を有してもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各領域は、例えば、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
前記核酸プールの調製方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記核酸プールがRNAプールの場合、例えば、DNAを含む初期プールを使用し、前記DNAを鋳型として調製できる。以下、核酸プールのRNAの鋳型となるDNA鎖をアンチセンス鎖、前記RNAのUをTに置換した配列を有するDNA鎖をセンス鎖ともいう。前記DNAを含む初期プールは、例えば、前記RNAプールにおける前記ランダム領域の相補鎖のUをTに置換したDNA(アンチセンス鎖)、および、前記ランダム領域のUをTに置換した配列を有するDNA(センス鎖)のいずれか一方を含むことが好ましい。この初期プールのDNAを鋳型として、DNA依存性DNAポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたDNA増幅産物を鋳型として、DNA依存性RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行うことにより、RNAの核酸プールを調製できる。
また、前記ランダム領域のUをTに置換したDNAを含む初期プールを準備し、これを鋳型として、前記RNAポリメラーゼ認識領域と前記5’末端側プライマー領域に相補的な配列とを含むプライマーをアニーリングさせ、核酸増幅を行うことにより、RNAの核酸プールを調製することもできる。
そして、前記核酸プールと前記ターゲットとを反応させ、前記核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成する。前記アプタマーの調製において、前記核酸プールと反応させる前記ターゲットは、例えば、前記ターゲットそのものでもよいし、前記ターゲットの分解物でもよい。前記核酸プールと前記ターゲットとの結合形式は、特に制限されず、例えば、水素結合等の分子間力等があげられる。前記核酸プールと前記ターゲットとの結合処理は、例えば、前記両者を溶媒中で一定時間インキュベートする方法があげられる。前記溶媒は、特に制限されず、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、例えば、各種緩衝液があげられる。
続いて、前記核酸プールと前記ターゲットとの複合体を回収する。前記複合体形成のために前記両者を反応させた反応液には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない核酸プール(以下、「未反応核酸プール」という)が含まれる。このため、例えば、前記反応液について、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを、分離することが好ましい。前記分離方法は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットと前記核酸プールとの吸着性の違い、前記複合体と前記核酸プールとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
前者の吸着性の違いを利用する方法は、例えば、以下の方法が例示できる。すなわち、まず、前記ターゲットに吸着性を有する担体と、前記複合体を含む前記反応液とを接触させる。この際、前記未反応核酸プールは、前記担体に吸着せず、他方、前記ターゲットと前記核酸プールとの複合体は、前記担体に吸着する。これによって、前記未反応核酸プールと前記複合体とを分離できる。そして、前記未反応核酸プールを除去後、前記担体に吸着した前記複合体を回収すればよい。また、前記担体から前記複合体を回収する前に、例えば、前記未反応核酸プールを十分に除去するため、前記担体を洗浄することが好ましい。前記ターゲットに吸着性を有する担体は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットの種類に応じて適宜選択できる。前記ターゲットが、例えば、抗体等のタンパク質の場合、前記吸着性を有する担体としては、例えば、ニトロセルロース膜等があげられる。
後者の分子量の違いを利用する方法は、例えば、担体を使用する方法が例示できる。前記担体は、例えば、前記核酸プールが通過し且つ前記複合体が通過できないようなサイズのポアを有する担体があげられる。このような担体を利用して、前記複合体と前記未反応核酸プールとを分離できる。前記分離は、例えば、アガロースゲルおよびポリアクリルアミドゲル等を用いた電気的な分離であってもよい。
この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化した前記ターゲットを使用する方法もあげられる。すなわち、前記ターゲットを予め担体に固定化し、前記担体と前記核酸プールとを接触させ、前記固定化ターゲットと前記核酸プールとの複合体を形成させる。そして、前記固定化ターゲットに結合していない未反応の核酸プールを除去した後、前記担体から、前記ターゲットと前記核酸プールとの複合体を解離させて、前記複合体を回収すればよい。前記ターゲットの担体への固定化方法は、何ら制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、前記ターゲットに標識を結合しておき、前記標識との結合基を有する担体に、前記標識を結合した前記標的物質を接触させる方法があげられる。前記標識は、例えば、His-tag等があげられ、前記結合基は、例えば、ニッケルイオン(Ni2+)、コバルトイオン(Co2+)等の金属イオンがあげられる。前記担体の具体例は、例えば、前記金属イオンをベースとするNi-アガロース、Ni-セファロース等があげられる。
つぎに、回収した前記複合体から、前記複合体形成に関与した核酸プールを回収する。前記複合体形成に関与した核酸プールは、例えば、前記複合体について、前記ターゲットと前記核酸プールとの結合を解除することによって回収できる。
続いて、回収した前記複合体形成に関与した前記核酸プールについて、核酸増幅を行う。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸プールの種類に応じて、公知の方法により行うことができる。前記核酸プールがRNAプールの場合、例えば、まず、RNA依存性DNAポリメラーゼを用いた逆転写反応によりcDNAを調製し、前記cDNAを鋳型としてPCR等によりDNAの核酸増幅を行う。そして、得られた増幅産物を鋳型として、例えば、さらに、DNA依存性RNAポリメラーゼを用いて、RNAの転写を行う。これによって、前述の前記複合体形成に関与したRNAプールを増幅できる。
前記RNAプールが、例えば、前述のように、前記RNAポリメラーゼ認識領域、前記5’末端側プライマー領域、前記ランダム領域および前記3’末端側プライマー領域を有する場合、これらの領域を利用する増幅方法があげられる。前記RNAを鋳型として前記cDNAを調製するための逆転写反応では、例えば、プライマーとして、前記RNAプールの3’末端側プライマー領域に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、前記cDNAを鋳型とするDNAの増幅には、例えば、プライマーとして、前記5’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記3’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、5’末端側に前記RNAポリメラーゼ認識領域を有し、3’末端側に、前記5’末端側プライマー領域を有することが好ましい。得られたDNAの増幅産物を鋳型とするRNAの増幅には、前記DNA増幅産物を鋳型として、前記DNAに含まれる5’末端側プライマー領域および3’末端側プライマー領域を利用して、DNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、PCR等の核酸増幅を行う。この際、プライマーとしては、例えば、前記5’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記3’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、5’末端側に前記RNAポリメラーゼ認識領域を有し、3’末端側に、前記5’末端側プライマー領域を有することが好ましい。そして、得られた増幅産物を鋳型として、前記増幅産物に含まれるRNAポリメラーゼ認識領域を利用して、DNA依存性RNAポリメラーゼを用いて、in vitroでの転写反応を行う。これによって、前記複合体形成に関与するRNAプールの核酸増幅を行うことができる。増幅産物のうち、例えば、アンチセンス鎖のDNAは、その3’末端側に、RNAポリメラーゼ認識領域を有するため、この領域に前記DNA依存RNAポリメラーゼが結合し、前記アンチセンス鎖を鋳型として、前記RNAを合成できる。前記逆転写反応に使用するRNA依存性DNAポリメラーゼは、特に制限されないが、例えば、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ(AMV Reverse Transcriptase)等が使用できる。
前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、PCR法、各種等温増幅法等が採用できる。また、その条件も、特に制限されない。
このように、前記ターゲットとの前記複合体を形成した核酸プールを回収し、さらに、前述と同様にして、前記ターゲットを用いた複合体の形成、前記複合体の回収、前記複合体形成に関与した核酸プールの分離、前記分離した核酸プールの増幅等を繰り返し行うことで、最終的に、前記ターゲットに結合性を有する核酸アプタマーを得ることができる。
前記触媒核酸分子は、前述のように、酵素の触媒機能を生起可能な核酸分子があげられる。前記触媒機能は、特に制限されないが、例えば、酸化還元反応の触媒機能があげられる。前記触媒核酸分子は、前記分析用核酸素子において、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、その前記触媒機能が阻害または不活性化され、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合した場合、その触媒機能の前記阻害が解除または前記触媒機能が活性化される。
前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応があげられる。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能を生起可能な核酸分子は、例えば、酸化還元反応を触媒する酵素と同様の活性を示すものがあげられる。具体的には、例えば、ペルオキシダーゼ活性、フォスファターゼ活性、リボヌクレアーゼ活性等を有する核酸分子があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)活性があげられる。前記酵素と同様の触媒機能を有する核酸分子の中でも、例えば、DNAは、DNAエンザイムまたはDNAzymeと呼ばれ、RNAは、RNAエンザイムまたはRNAzymeと呼ばれる。
前記触媒核酸分子は、G-カルテット(またはG-tetradという)の構造を形成する核酸分子が好ましく、より好ましくはグアニン四重鎖(またはG-quadruplexという)の構造を形成する核酸分子である。前記G-tetradは、例えば、グアニンが四量体となった面の構造であり、G-quadruplexは、例えば、前記G-tetradが複数面重なった構造をいう。前記G-tetradおよび前記G-quadruplexは、例えば、反復してGリッチの構造モチーフを有する核酸分子において、形成される。前記G-tetradは、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型があげられるが、パラレル型が好ましい。前記触媒核酸分子は、前記分析用核酸素子において、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、前記G-tetradの形成が阻害され、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合した場合、前記阻害が解除され、前記G-tetradを形成することが好ましい。
前記触媒核酸分子は、ポルフィリンと結合可能な核酸分子が好ましく、具体的には、前記G-tetradを形成し且つ前記ポルフィリンと結合可能な核酸分子が好ましい。前記G-tetradを有する核酸分子は、例えば、前記ポルフィリンと結合して複合体を形成することによって、酸化還元反応等の触媒機能を生起することが知られている。前記分析用核酸素子において、前記触媒核酸分子は、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合した場合、前記阻害が解除され、前記ポルフィリンと結合することが好ましい。具体的には、前記分析用核酸素子において、前記触媒核酸分子は、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、前記G-tetradの形成が阻害され且つこれにより前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記G-tetradを形成し且つ前記ポルフィリンと結合することが好ましい。
前記ポルフィリンは、特に制限されない。前記ポルフィリンは、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリン、および金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、N-メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
前記触媒核酸分子は、前述のように、何ら制限されないが、例えば、ペルオキシダーゼ活性を有するDNAとして、下記論文(1)~(4)等に開示されているDNAzymeが例示できる。これらの論文に開示されているDNAzymeは、例えば、ヘミン等のポルフィリンと結合して複合体を形成することにより、ヘミン単独よりも高いペルオキシダーゼ活性を生起可能である。
(1)Travascioら, Chem.Biol., 1998年, vol.5, p.505-517
(2)Chengら, Biochemistry, 2009年, vol.48, p.7817-7823
(3)Tellerら, Anal.Chem., 2009年, vol. 81, p.9144-9119
(4)Taoら, Anal.Chem., 2009年, vol.81, p.2144-2149
(1)Travascioら, Chem.Biol., 1998年, vol.5, p.505-517
(2)Chengら, Biochemistry, 2009年, vol.48, p.7817-7823
(3)Tellerら, Anal.Chem., 2009年, vol. 81, p.9144-9119
(4)Taoら, Anal.Chem., 2009年, vol.81, p.2144-2149
前記触媒核酸分子の製造方法は、特に制限されないが、例えば、所望の酸化還元反応の種類に応じて、配列を設計し、合成できる。この際、例えば、コンピュータ等により、二次構造を予測し、配列を修正してもよい。
本発明の分析用核酸素子は、例えば、前記第1の核酸部および前記第2の核酸部のみからなる素子でもよいし、さらに、他の構成要素を含む素子であってもよい。前記他の構成要素は、例えば、前記標識物、前記ポルフィリン等があげられる。前記標識物は、例えば、任意成分であり、前記第1の核酸部への前記分析対象の結合の有無によって、前記第2の核酸部に着脱可能である。また、前記ポルフィリンは、例えば、分析時において、前記分析用核酸素子と共存すればよい。
前記他の構成要素は、例えば、リンカーがあげられる。前記リンカーは、例えば、ヌクレオチドを含む核酸があげられる。前記リンカーは、例えば、ヌクレオチドのみからなる核酸でもよいし、ヌクレオチドを含む核酸でもよい。前記リンカーは、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記リンカーは、一本鎖核酸の場合、例えば、一本鎖DNA、一本鎖RNA等があげられ、二本鎖核酸の場合、例えば、二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA-RNAの二本鎖等があげられる。また、前記リンカーは、塩基として、前述のような天然塩基を含んでもよいし、非天然塩基を含んでもよい。また、前記リンカーは、例えば、PNA、LNA等を含んでもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されない。
本発明の分析用核酸素子において、前記第1の核酸部と前記第2の核酸部とは、連結していることが好ましく、例えば、前記第1の核酸部の一方の末端と前記第2の核酸部の一方の末端とで連結している。前記第1の核酸部と前記第2の核酸部は、例えば、前記第1の核酸部の5’末端と、前記第2の核酸部の3’末端とが連結してもよいし、前記第1の核酸部の3’末端と、前記第2の核酸部の5’末端とが連結してもよい。
前記第1の核酸部と前記第2の核酸部との連結は、例えば、直接的な連結でもよいし、間接的な連結でもよい。
前記直接的な連結の場合、例えば、前記第1の核酸部の一方の末端と前記第2の核酸部の一方の末端とがホスホジエステル結合により連結する。具体的に、直接的な連結は、例えば、前記第1の核酸部の5’末端と前記第2の核酸部の3’末端とのホスホジエステル結合による連結、または、前記第1の核酸部の3’末端と前記第2の核酸部の5’末端とのホスホジエステル結合による連結があげられる。
前記間接的な連結の場合、例えば、前記リンカーを介して、前記第1の核酸部と前記第2の核酸部とが連結する。前記第1の核酸部と前記第2の核酸部との間に介在するリンカーを、以下、介在リンカーまたは介在配列という。前記介在リンカーは、例えば、一方の末端が、前記第1の核酸部の一方の末端に連結し、他方の末端が、前記第2の核酸部の一方の連結する形態があげられる。具体的に、前記間接的な連結は、例えば、前記介在リンカーの一方の末端が、前記第1の核酸部の5’末端に連結し、他方の末端が、前記第2の核酸部の3’末端に連結してもよいし、一方の末端が、前記第1の核酸部の3’末端に連結し、他方の末端が、前記第2の核酸部の5’末端に連結してもよいが、前者が好ましい。前記リンカーと前記第1の核酸部または前記第2の核酸部との連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。
前記分析用核酸素子は、いずれか一方の末端側に、さらに、前記リンカーを有してもよい。このリンカーを、以下、付加リンカーまたは付加配列という。前記分析用核酸素子は、例えば、前記第1の核酸部における、前記第2の核酸部が連結する末端とは反対側の末端に、前記リンカーを有してもよいし、前記第2の核酸部における、前記第1の核酸部が連結している末端とは反対側の末端に、前記リンカーを有してもよい。前記分析用核酸素子は、例えば、前記第1の核酸部の前記反対側の末端および前記第2の核酸部の前記反対側の末端に、それぞれ、前記付加リンカーを有してもよい。
本発明の分析用核酸素子は、前記第1の核酸部と前記第2の核酸部とが連結した一本鎖核酸であることが好ましい。このように、本発明の分析用核酸素子が一本鎖核酸であれば、例えば、前記第1の核酸部への前記分析対象物の結合により二次構造の変化が起こり、この変化が、前記第2の核酸部の二次構造の変化を起こしやすい。
本発明の分析用核酸素子において、前記第1の核酸部および前記第2の核酸部の長さは、それぞれ、特に制限されない。前記第1の核酸部における前記核酸分子の長さの下限は、特に制限されず、例えば、7塩基である。前記第1の核酸部における前記核酸分子の長さの上限は、特に制限されず、例えば、120塩基であり、好ましくは80塩基であり、より好ましくは35塩基であり、さらに好ましくは20塩基であり、短いほうが好ましい。前記第1の核酸部における前記核酸分子の長さの範囲は、例えば、7~120塩基であり、好ましくは7~80塩基であり、より好ましくは7~35塩基であり、さらに好ましくは7~20塩基である。前記第2の核酸部における前記核酸分子の長さの下限は、特に制限されず、例えば、7塩基である。前記第2の核酸部における前記核酸分子の長さの上限は、特に制限されず、例えば、120塩基であり、好ましくは80塩基であり、より好ましくは60塩基であり、さらに好ましくは40塩基であり、特に好ましくは35塩基であり、短いほうが好ましい。前記第2の核酸部における前記核酸分子の長さの範囲は、例えば、7~120塩基であり、好ましくは7~80塩基であり、より好ましくは7~60塩基であり、さらに好ましくは7~40塩基であり、特に好ましくは7~35塩基である。前記分析用核酸素子の全体における長さは、特に制限されず、長さの範囲は、例えば、14~240塩基であり、好ましくは14~200塩基であり、より好ましくは14~160塩基であり、さらに好ましくは14~140塩基であり、特に好ましくは14~75塩基、さらに特に好ましくは14~55塩基である。前記分析用核酸素子において、前記第1の核酸部および第2の核酸部のそれぞれの長さは、例えば、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
本発明において、分析対象物は、特に制限されず、例えば、高分子化合物、低分子化合物、有機物、無機物等があげられる。前記高分子化合物または有機物としては、例えば、微生物、ウィルス、多糖類、タンパク質、核酸、樹脂等があげられる。前記低分子化合物としては、農薬、医薬品、化学薬品、オリゴ糖、単糖、脂質、オリゴペプチド、アミノ酸、ビタミン類、生理活性物質等があげられる。前記無機物としては、ミネラル類、鉱酸、金属等があげられる。
本発明において、分析の対象となる試料は、特に制限されず、例えば、食品(飲料を含む)、医薬品、化学薬品、土壌、動物、植物、微生物、ウィルス、水(例えば、水道水、排水、河川の水、海水、雨水、雪等)、ゴミ、廃棄物等があげられる。
以下に、本発明の分析用核酸素子について、具体的な形態を例示する。なお、本発明は、これには制限されない。
(実施形態1)
実施形態1の分析用核酸素子は、前記第1の核酸部として前記分析対象物結合核酸分子、および前記第2の核酸部として前記標識物結合核酸分子を含む。具体的に、前記分析用核酸素子は、
前記第1の核酸部および前記第2の核酸部を含み、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、標識物と結合可能であり、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合した場合、前記標識物と結合不能である
実施形態1の分析用核酸素子は、前記第1の核酸部として前記分析対象物結合核酸分子、および前記第2の核酸部として前記標識物結合核酸分子を含む。具体的に、前記分析用核酸素子は、
前記第1の核酸部および前記第2の核酸部を含み、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、標識物と結合可能であり、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合した場合、前記標識物と結合不能である
前記「標識物」は、本発明の分析用核酸素子の任意の構成要素であり、前記第1の核酸部への前記分析対象物の結合の有無によって、着脱可能である。
前記分析用核酸素子は、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部の二次構造が変化し、前記第2の核酸部の二次構造の変化により、前記第2の核酸部に結合している前記標識物が、前記第2の核酸部から遊離する、という態様があげられる。この場合、前記標識物は、例えば、酵素である。前記分析用核酸素子において、前記酵素は、前記第2の核酸部に前記酵素が結合している場合、その触媒機能、すなわち、前記酵素の酵素反応が阻害され、前記第2の核酸部から前記酵素が遊離した場合、その触媒機能の前記阻害、すなわち、前記酵素反応の前記阻害が解除される、という態様があげられる。
前記第1の核酸部は、例えば、前記分析対象物が結合することにより、その構造が変化してもよい。そして、前記第1の核酸部の構造の変化により、前記第2の核酸部の構造が変化し、前記第2の核酸部に結合している前記標識部が、前記第2の核酸部から遊離してもよい。
以下に、本実施形態の分析用核酸素子の具体例を例示するが、これらには制限されない。
図1に、分析用核酸素子の構成を模式的に示す。図1において、(A)は、分析用核酸素子に前記分析対象物が結合していない状態を示し、(B)は、分析用核酸素子に前記分析対象物が結合した状態を示す。
図1に示すように、分析用核酸素子16は、第1の核酸部(結合部)12および第2の核酸部(標識部)13とから構成される。第1の核酸部12は、前記分析対象物結合核酸分子であり、第2の核酸部13は、前記標識物結合核酸分子である。第1の核酸部12および第2の核酸部13は、連結により一体化している。第1の核酸部12および第2の核酸部13は、例えば、両者の末端において、直接連結してもよいし、リンカーを介して間接的に連結してもよい。第1の核酸部12および第2の核酸部13の連結は、特に制限されず、例えば、第1の核酸部12の3’末端に、第2の核酸部13の5’末端が連結してもよいし、第1の核酸部12の5’末端に、第2の核酸部13の3’末端が連結してもよい。
図1(A)に示すように、分析対象物11が、第1の核酸部12に結合していない場合、標識物14は、第2の核酸部13に結合している。そして、図1(B)に示すように、第1の核酸部12に分析対象物11が結合すると、第2の核酸部13の構造変化等により、標識物14が第2の核酸部13から遊離する。標識物14が酵素の場合、例えば、第2の核酸部13との結合により、その触媒機能が阻害される。一方、標識物14である酵素が、第2の核酸部13から遊離すると、前記触媒機能の阻害が解除される。この時、基質が存在すれば、前記酵素の触媒機能により酵素反応が生起する。このため、前記酵素反応の分析により、前記分析対象物11の分析が可能となる。
前記酵素反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的検出でもよいし電気化学的検出でもよい。前記光学的検出は、例えば、発色または発光等の光学シグナルの検出があげられ、吸光度、反射率、蛍光強度等のシグナル強度を測定することにより行える。前記光学シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記酵素反応を行うことにより生じる。前記基質は、特に制限されないが、前記酵素反応により発色または発光する基質が好ましい。前記電気化学的検出は、例えば、電気化学的シグナルの検出があげられ、電流等のシグナル強度を測定することにより行える。前記電気化学的シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記酵素反応を行うことにより、電子の授受として生じる。前記電子の授受は、例えば、電極への印加により電流として測定可能である。また、電気化学的シグナルの検出の場合、例えば、前記基質とメディエータの存在下で前記酵素反応を行ってもよく、その際、前記メディエータとの電子授受を測定してもよい。
前記基質は、特に制限されず、例えば、分析の容易性から、酵素反応により発色する発色基質が好ましい。前記発色は、例えば、着色も含む。この場合、前記酵素は、例えば、酸化還元酵素があげられる。本発明において、前記酸化還元酵素は、広義で酸化還元反応を触媒する酵素を意味する。前記酸化還元酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼがあげられる。前記フォスファターゼは、例えば、アルカリフォスファターゼがあげられる。前記酵素がペルオキシダーゼの場合、前記発色基質は、例えば、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)、1,2-Phenylenediamine(OPD)、2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt(ABTS)、3,3’-Diaminobenzidine (DAB)、3,3’-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate(DAB4HCl)、3-Amino-9-ethylcarbazole(AEC)、4-Chloro-1-naphthol(4C1N)、2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid、2,4-Dichlorophenol、4-Aminoantipyrine、4-Aminoantipyrine Hydrochloride、ルミノール等があげられる。前記酵素がアルカリフォスファターゼの場合、前記発色基質は、例えば、5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue(Nitro-TB)、Nitro-Blue Tetrazolium Chloride(NBT)等があげられる。これらの発色基質は、例えば、電気化学的検出においても基質として使用できる。
前記メディエータは、特に制限されず、例えば、前記メディエータは、特に制限されず、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、メチルフェロセン、フェロセンジカルボン酸、プロマジン、テトラチアフルバレン(TTF)、メチレンブルー、1,4-ベンゾキノン、1,4-ビス(N,N-ジメチルアミノ)ベンゼン、4,4-ジヒドロピフェニル、α-ナフトキノンおよびこれらの誘導体等があげられる。
つぎに、図2に、第1の核酸部12および第2の核酸部13のそれぞれに、アプタマーを適用した分析用核酸素子16の例を示す。図2において、(A)は、分析用核酸素子16に分析対象物11が結合していない状態を示し、(B)は、分析用核酸素子16に分析対象物11が結合した状態を示す。図2において、図1と同一部分には同一符号を付している。
図2に示すように、分析用核酸素子16は、第1の核酸部12のアプタマーおよび第2の核酸部13のアプタマーから構成される。第1の核酸部12は、前記分析対象物結合核酸分子であり、第2の核酸部13は、前記標識物結合核酸分子である。第1の核酸部12のアプタマーと第2の核酸部13のアプタマーは、連結して一本鎖の核酸となっている。前記一本鎖核酸は、例えば、一本鎖RNAが例示できる。前記両者は、例えば、両者の末端において、直接連結してもよいし、リンカーを介して間接的に連結してもよい。第1の核酸部12および第2の核酸部13の連結は、特に制限されず、例えば、第1の核酸部12の3’末端に、第2の核酸部13の5’末端が連結してもよいし、第1の核酸部12の5’末端に、第2の核酸部13の3’末端が連結してもよい。
図2(A)に示すように、分析対象物11が、第1の核酸部12のアプタマーに結合していない場合、標識物14は、第2の核酸部13のアプタマーに結合している。そして、図2(B)に示すように、第1の核酸部12のアプタマーに分析対象物11が結合すると、第2の核酸部13のアプタマーの構造変化により、標識物14が第2の核酸部13のアプタマーから離れる。標識物14が酵素の場合、例えば、第2の核酸部13との結合により、その触媒機能が阻害される。一方、標識物14である酵素が、第2の核酸部13から遊離すると、前記触媒機能の阻害が解除される。この時、基質が存在すれば、前記酵素の触媒機能により酵素反応が生起する。このため、前記酵素反応の分析により、前記分析対象物11の分析が可能となる。
図2は、一例であり、本発明は、これには制限されない。分析用核酸素子16は、例えば、第1の核酸部12に分析対象物11が結合していない場合、第2の核酸部13が、標識物14と結合可能であり、第1の核酸部12に分析対象物11が結合した場合、第2の核酸部13が、標識物14と結合不能であればよく、その他の点は、特に制限されない。
このようなアプタマーを使用した分析用核酸素子は、例えば、以下のようにして製造できる。まず、前記分析対象物をターゲットにして、前記第1の核酸部のアプタマーを取得する。また、前記標識物、例えば、酵素をターゲットとして、前記第2の核酸部のアプタマーを取得する。前記アプタマーの取得方法は、前述のSELEX法を適用できる。そして、これら2つのアプタマーを結合させる。結合方法は、特に制限されないが、例えば、2つのアプタマーの配列を、一本鎖の核酸配列にし、前記一本鎖の核酸配列に基づき、核酸を合成する方法があげられる。この場合、例えば、コンピュータ等により、2つのアプタマーの二次構造を予測し、一本鎖核酸の配列を修正したり、配列を追加または削除してもよい。
(実施形態2)
実施形態2の分析用核酸素子は、前記第1の核酸部として前記分析対象物結合核酸分子、および前記第2の核酸部として前記触媒核酸分子を含む。具体的に、前記分析用核酸素子は、
前記第1の核酸部および前記第2の核酸部を含み、
前記第2の核酸部は、酵素の触媒機能を生起可能であり、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合していない場合、その触媒機能が阻害され、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合した場合、その触媒機能の前記阻害が解除される。
実施形態2の分析用核酸素子は、前記第1の核酸部として前記分析対象物結合核酸分子、および前記第2の核酸部として前記触媒核酸分子を含む。具体的に、前記分析用核酸素子は、
前記第1の核酸部および前記第2の核酸部を含み、
前記第2の核酸部は、酵素の触媒機能を生起可能であり、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合していない場合、その触媒機能が阻害され、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合した場合、その触媒機能の前記阻害が解除される。
前記分析用核酸素子は、前記第2の核酸部そのものが、酵素の触媒機能を生起可能であることが特徴である。
前記分析用核酸素子は、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部の二次構造が変化し、前記第2の核酸部の二次構造の変化により、前記第2の核酸部が、前記触媒機能を生起する、という態様があげられる。前記分析用核酸素子において、前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合している場合、その触媒機能が阻害され、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、その触媒機能の前記阻害が解除される。
前記第1の核酸部は、例えば、前記分析対象物が結合することにより、その構造が変化してもよい。そして、前記第1の核酸部の構造の変化により、前記第2の核酸部の構造が変化して、この構造変化により、前記第2の核酸部が、前記触媒機能を生起してもよい。
前記分析用核酸素子において、前記第2の核酸部の触媒機能の制御は、例えば、以下のように行われることが好ましい。すなわち、前記分析用核酸素子において、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない状態で、前記第2の核酸部は、ケージ化により、前記触媒機能が不活性化される。そして、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部は、自己会合により、前記触媒機能が活性化されることが好ましい。
具体例として、例えば、以下の形態があげられる。前記分析用核酸素子において、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない状態で、例えば、前記第1の核酸部の一部と前記第2の核酸部の一部とが、ステム構造を形成し、前記第2の核酸部は、前記ステム構造によりケージ化されて、前記触媒機能が不活性化され、前記第1の核酸部は、前記分析対象物の結合部位となるステムループ構造を形成する。一方、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第1の核酸部の一部と前記第2の核酸部の一部との前記ステム構造が解除され、これによって、前記第2の核酸部は、前記ケージ化が解除され、さらに自己会合することにより、前記触媒機能が活性化されることが好ましい。
また、前記分析用核酸素子が、前記介在リンカーと前記付加リンカーとを有する場合、前記第2の核酸部の触媒機能の制御は、例えば、以下のように行われることが好ましい。前記分析用核酸素子において、前記介在リンカーは、例えば、一方の末端が、前記第1の核酸部の5’末端に連結し、他方の末端が前記第2の核酸部の3’末端に連結し、前記付加リンカーは、例えば、前記第1の核酸部の3’末端に連結する。前記分析用核酸素子において、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない状態で、前記介在リンカーと前記第1の核酸部の3’末端領域とが、ステム構造を形成し、前記付加リンカーと前記第2の核酸部の3’末端領域とが、ステム構造を形成する。そして、前記ステム構造により、前記第2の核酸部はケージ化されて、前記触媒機能が不活性化される。また、前記第1の核酸部は、前記分析対象物の結合部位となるステムループ構造を形成する。一方、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記介在リンカーとのステム構造および前記付加リンカーとのステム構造が解除され、これによって、前記第2の核酸部は、前記ケージ化が解除され、さらに自己会合することにより、前記触媒機能が活性化されることが好ましい。
以下に、本実施形態の分析用核酸素子を例示するが、これらには制限されない。
図3に、分析用核酸素子の構成を模式的に示す。図3において、(A)は、分析用核酸素子に前記分析対象物が結合していない状態を示し、(B)は、分析用核酸素子に前記分析対象物が結合した状態を示す。
図3に示すように、分析用核酸素子36は、第1の核酸部(結合部)32および第2の核酸部(標識部)33とから構成される。第1の核酸部32は、前記分析対象物結合核酸分子であり、第2の核酸部33は、前記触媒核酸分子である。第1の核酸部32および第2の核酸部33は、連結により一体化している。第1の核酸部32および第2の核酸部33は、例えば、両者の末端において、直接連結してもよいし、リンカーを介して間接的に連結してもよい。第1の核酸部32および第2の核酸部33の連結は、特に制限されず、例えば、第1の核酸部32の3’末端に、第2の核酸部33の5’末端が連結してもよいし、第1の核酸部32の5’末端に、第2の核酸部33の3’末端が連結しても良い。
図3(A)に示すように、分析対象物11が、第1の核酸部32に結合していない場合、第2の核酸部33は、第1の核酸部32と会合して、前記触媒機能が阻害された状態になる。そして、図3(B)に示すように、第1の核酸部32に分析対象物11が結合すると、第1の核酸部32と第2の核酸部33との会合が解除され、第2の核酸部33が、前記触媒機能を生起可能な状態になる。この時、基質が存在すれば、第2の核酸部33の触媒機能により触媒反応が生起する。このため、前記触媒反応の分析により、分析対象物11の分析が可能となる。
第2の核酸部33が、前述のように、前記G-tetradの構造を形成する触媒核酸分子の場合、例えば、以下のようになる。分析対象物11が、第1の核酸部32に結合していない場合、第1の核酸部32と第2の核酸部33とのステム構造の形成により、第2の核酸部33がケージ化され、第2の核酸部33の触媒機能が不活性化される。そして、第1の核酸部32に分析対象物11が結合すると、第1の核酸部32の二次構造が変化して、第1の核酸部32と第2の核酸部33とのステム構造が解除される。これによって、第2の核酸部33が自己会合して、前記G-tetradを形成し、G-quadruplexの構造をとる。G-quadruplexの構造である第2の核酸部33には、例えば、ポルフィリンが結合して複合体を形成し、触媒機能が活性化される。
前記触媒反応の分析は、特に制限されず、例えば、前記実施形態1と同様に行うことができる。前記触媒反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的検出でもよいし電気化学的検出でもよい。前記光学的検出は、例えば、発色または発光等の光学シグナルの検出があげられ、吸光度、反射率、蛍光強度等のシグナル強度を測定することにより行える。前記光学シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記触媒反応を行うことにより生じる。前記基質は、特に制限されないが、前記触媒反応により発色または発光する基質が好ましい。前記電気化学的検出は、例えば、電気化学的シグナルの検出があげられ、電流等のシグナル強度を測定することにより行える。前記電気化学的シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記触媒反応を行うことにより、電子の授受として生じる。前記電子の授受は、例えば、電極への印加により、電流として測定可能である。また、電気化学的シグナルの検出の場合、例えば、前記基質とメディエータの存在下で前記酵素反応を行ってもよく、その際、前記メディエータとの電子授受を測定してもよい。
第2の核酸部33の触媒機能の種類は、特に制限されず、例えば、前記実施形態1の分析用核酸素子における前記酵素と同様の触媒機能があげられる。前記触媒機能を生起可能な核酸分子は、例えば、Heminペルオキシダーゼ活性があるDNAがあげられる(Tao et al, Anal.Chem.2009,81,2144-2149)。また、前記基質は、特に制限されず、例えば、前記実施形態1と同様の基質があげられる。
つぎに、図4に、第1の核酸部32に、アプタマーを適用し、第2の核酸部33に、ペルオキシダーゼ活性を生起可能なDNAを適用した分析用核酸素子の例を示す。図4において、(A)は、ペルオキシダーゼ活性を生起可能なDNA(配列番号1)であり、(B)は、アデノシンに対するアプタマー(配列番号2)である。図4(C)に、前記DNA(A)と前記アプタマー(B)とを結合した、一本鎖核酸の分析用核酸素子(配列番号3)を示す。図4(C)の分析用核酸素子は、前記アプタマー(B)がアデノシンと結合していないため、前記DNA(A)は、触媒機能を生起しない二次構造をとっている。そして、前記分析用核酸素子において、アデノシンが前記アプタマー(B)に結合することにより、図4(C)のDNAが、図4(D)に示すように、触媒機能を生起可能な二次構造に変化する。この時、基質があれば、前記DNAの触媒機能により触媒反応が生起する。このため、前記DNAによる前記触媒反応の分析により、前記分析対象物であるアデノシンの分析が可能となる。
この分析用核酸素子は、例えば、食品中の生菌の測定に使用できる。食品中に生菌が存在するということは、ATPが存在することになり、ATPの濃度は、生菌数に比例する。したがって、この分析用核酸素子を使用して、発色基質および食品を反応させると、生菌に由来するATPの濃度に比例した発色が得られる。この発色を分析することにより、食品中の生菌数を分析できる。これは一例であり、本発明の分析用核酸素子の用途は、これに制限されない。
この分析用核酸素子は、例えば、以下のようにして製造できる。まず、前記分析対象物をターゲットにして、前記第1の核酸部のアプタマーを取得する。前記アプタマーの取得方法は、前述のSELEX法を適用できる。一方、前記第2の核酸部の配列を、例えば、所望の触媒機能に応じてデザインし、合成する。そして、前記第1の核酸部のアプタマーと前記第2の核酸部とを結合させる。結合方法は、特に制限されないが、例えば、第1の核酸部のアプタマーの配列と第2の核酸部の配列を、一本鎖の核酸配列にし、前記一本鎖核酸配列に基づき、核酸を合成する方法があげられる。この場合、例えば、コンピュータ等により、前記第1の核酸部、前記第2の核酸部および/または前記一本鎖核酸の二次構造を予測し、前記一本鎖核酸の配列を修正したり、配列を追加または削除してもよい。
<分析用試薬>
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸素子を含むことを特徴とする。
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸素子を含むことを特徴とする。
本発明の分析用試薬において、前記分析用核酸素子は、例えば、前記実施形態1の分析用核酸素子、前記実施形態2の分析用核酸素子があげられる。
本発明の分析用試薬は、前記実施形態1の分析用核酸素子を含む場合、さらに、前記標識物を含むことが好ましい。前記標識物は、特に制限されず、前述の通りであり、中でも酵素が好ましい。前記標識物が酵素の場合、本発明の分析用試薬は、さらに、前記酵素の基質を含むことが好ましい。前記基質は、特に制限されず、前述の通りであり、中でも、前記酵素の反応によって発色する発色基質が好ましい。前記発色基質は、前述の通りである。
本発明の分析用試薬は、前記実施形態2の分析用核酸素子を含む場合、さらに、基質を含むことが好ましい。前記基質は、特に制限されず、前述の通りであり、前記分析用核酸素子における前記第2の核酸部である前記触媒核酸分子の触媒機能の反応によって、発色する発色基質が好ましい。前記発色基質は、前述の通りである。
本発明の分析用試薬は、例えば、分析用キットであってもよい。この場合、例えば、本発明の分析用核酸素子と、その他の成分とを含み、それぞれ別個に収容されてもよいし、同じ容器に収容されてもよい。前記他の成分は、例えば、前記標識物、前記基質、ポルフィリン、緩衝液、各種添加剤等があげられる。前記他の成分は、例えば、前記分析用核酸素子を使用する際に、前記分析用核酸素子に添加してもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
<分析用具>
本発明の分析用具は、前記本発明の分析用試薬を含むことを特徴とする。本発明の分析用具は、前記本発明の分析用試薬として、前記本発明の分析用核酸素子を含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。本発明の分析用具は、特に示さない限り、前記分析用核酸素子および前記分析用試薬と同様である。
本発明の分析用具は、前記本発明の分析用試薬を含むことを特徴とする。本発明の分析用具は、前記本発明の分析用試薬として、前記本発明の分析用核酸素子を含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。本発明の分析用具は、特に示さない限り、前記分析用核酸素子および前記分析用試薬と同様である。
本発明の分析用具において、前記分析用核酸素子は、例えば、前記実施形態1の分析用核酸素子でもよいし、前記実施形態2の分析用核酸素子でもよい。前記実施形態1の分析用核酸素子の場合、予め、前記第2の核酸部、すなわち、前記標識物結合核酸分子に前記標識物が結合した前記分析用核酸素子が好ましい。
本発明の分析用具は、例えば、一種類のみの前記分析用核酸素子を備えてもよいし、ターゲットが異なる二種類以上の前記分析用核酸素子を備えてもよい。後者の場合、二種類以上の前記分析用核酸素子が、それぞれ、結合可能なターゲットが異なる前記第1の核酸部を有することが好ましい。このように、本発明の分析用具が、ターゲットが異なる二種類の分析用核酸素子を備えることによって、例えば、一つの分析用具において、二種類以上の分析対象物の検出が可能となる。本発明の分析用具が、二種類以上の分析用核酸素子を備える場合、前記分析用具は、複数の検出部を有し、各検出部に、異なる分析用核酸素子が配置されていることが好ましい。
本発明の分析用具の形状は、特に制限されず、例えば、袋状、スティック状、チューブ状、チップ状等の容器あげられる。
本発明の分析用具は、例えば、前記容器の内面に前記分析用試薬が配置されており、具体的には、前記本発明の分析用核酸素子が配置されている。本発明の分析用具は、例えば、さらに、その他の成分が配置されてもよい。前記その他の成分は、例えば、前記基質、前記ポルフィリン、緩衝剤、溶媒等があげられる。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液、生理食塩水等があげられる。前記その他の成分は、例えば、前記分析用具の使用時に、前記容器内に添加してもよい。
本発明の分析用具は、例えば、分析の信頼性の向上のために、さらに、ポジティブコントロールを含んでもよい。前記ポジティブコントロールは、例えば、前記容器の内面に配置されていることが好ましい。
以下に、分析用具の具体例を例示するが、これらには制限されない。
(実施形態3)
実施形態3の分析用具は、袋状の分析用具の例である。図5に、本実施形態の袋状の分析用具56を示す。図5(A)に示すように、袋状分析用具56は、その内面に、分析用核酸素子を含む試薬層57が配置されている。試薬層57は、前記実施形態1の分析用核酸素子を使用する場合、前記分析用核酸素子、前記標識物として酵素、および基質(例えば、前記発色基質)を含むことが好ましい。試薬層57は、前記実施形態2の分析用核酸素子を使用する場合、前記分析用核酸素子および基質(例えば、前記発色基質)を含むことが好ましく、さらに、ポルフィリンを含むことがより好ましい。試薬層57は、この他に、緩衝剤、親水性高分子等を含んでもよい。試薬層57は、例えば、前記分析用核酸素子、酵素、基質、その他の成分を含む試薬液を調製し、前記試薬液を、袋状容器の内面に塗布し、乾燥することによって形成できる。
実施形態3の分析用具は、袋状の分析用具の例である。図5に、本実施形態の袋状の分析用具56を示す。図5(A)に示すように、袋状分析用具56は、その内面に、分析用核酸素子を含む試薬層57が配置されている。試薬層57は、前記実施形態1の分析用核酸素子を使用する場合、前記分析用核酸素子、前記標識物として酵素、および基質(例えば、前記発色基質)を含むことが好ましい。試薬層57は、前記実施形態2の分析用核酸素子を使用する場合、前記分析用核酸素子および基質(例えば、前記発色基質)を含むことが好ましく、さらに、ポルフィリンを含むことがより好ましい。試薬層57は、この他に、緩衝剤、親水性高分子等を含んでもよい。試薬層57は、例えば、前記分析用核酸素子、酵素、基質、その他の成分を含む試薬液を調製し、前記試薬液を、袋状容器の内面に塗布し、乾燥することによって形成できる。
図5(B)に示すように、袋状分析用具56に、分析対象物11を入れると、図5(C)に示すように、試薬層57の前記分析用核酸素子と反応し、前記基質が発色58する。この発色58を分析することにより、分析対象物11を分析できる。前記発色は、例えば、目視で分析してもよいし、光学検出装置を用いて分析してもよい。後者の場合、例えば、吸光度、反射率等の光学シグナルを測定してもよい。
本発明の分析用具において、前述のように、その形状は、袋状に限定されず、例えば、スティック状であってもよい。スティック状の場合、例えば、ろ紙等の多孔質部材を使用し、前述と同様にして、前記試薬液を前記多孔質部材に浸透させ、乾燥して前記試薬層を形成してもよい。
(実施形態4)
実施形態4の分析用具は、電気化学的検出に使用する分析用具の例であり、具体的には、前記分析用核酸素子として、酸化還元反応の触媒機能を生起可能な前記実施形態2の分析用核酸素子を備える例である。本実施形態の分析用具は、基板と、前記分析用核酸素子と、電気シグナルの検出部とを含み、
前記基板に、前記分析用核酸素子と、前記検出部とが配置され、
前記検出部は、前記第2の核酸部による酸化還元反応で発生する電気シグナルを検出する検出部であることを特徴とする。
実施形態4の分析用具は、電気化学的検出に使用する分析用具の例であり、具体的には、前記分析用核酸素子として、酸化還元反応の触媒機能を生起可能な前記実施形態2の分析用核酸素子を備える例である。本実施形態の分析用具は、基板と、前記分析用核酸素子と、電気シグナルの検出部とを含み、
前記基板に、前記分析用核酸素子と、前記検出部とが配置され、
前記検出部は、前記第2の核酸部による酸化還元反応で発生する電気シグナルを検出する検出部であることを特徴とする。
前記基板は、特に制限されないが、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基板は、例えば、絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する基板であってもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
前記検出部は、前記第2の核酸部の酸化還元反応により発生する電気シグナルを検出できればよい。前記検出部は、例えば、電極系を有する。前記電極系は、例えば、作用極と対極とを含んでもよいし、作用極と対極と参照極とを含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀/塩化銀の電極があげられる。前記銀/塩化銀の電極は、例えば、銀電極に塩化銀電極を積層することにより形成できる。
前記検出部は、例えば、前記基板の上面に、前記電極を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基板に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置とは、例えば、他の部材を介した配置があげられる(以下、同様)。
前記分析用核酸素子は、前述のように、前記基板に配置すればよいが、前記基板に固定化することが好ましい。前記分析用核酸素子は、例えば、前記基板の表面に、直接的に配置してもよいし、間接的に配置してもよい。具体的に、前記分析用核酸素子は、例えば、前記基板における前記検出部に配置することが好ましく、前記検出部における前記電極に配置することがより好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。前記分析用核酸素子は、例えば、前記検出部または前記電極に、直接的に配置してもよいし、間接的に配置してもよい。以下、「前記分析用核酸素子の前記基板への配置または固定化」とは、特に示さない限り、前記基板における前記検出部、前記検出部における前記電極への配置または固定化の意味も含む。
前記分析用核酸素子の配置方法は、特に制限されず、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記核酸固定化方法は、例えば、予め準備した核酸を、前記基板、好ましくは前記検出部、より好ましくは前記電極に固定化する方法があげられる。この方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法であり、具体例として、米国特許5,424,186号明細書等を参照できる。また、前記核酸固定化方法は、例えば、前記基板上、好ましくは前記検出部上、より好ましくは前記電極上で核酸を合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許5,807,522号明細書、特表平10-503841号公報等を参照できる。
前記分析用核酸素子は、例えば、前記第1の核酸部および前記第2の核酸部におけるいずれかの末端側において、前記基板に配置されてもよい。前記末端側は、例えば、前記分析用核酸素子における前記第1の核酸部の末端または前記第2の核酸部の末端があげられる。前記末端側は、前記第1の核酸部が前記付加リンカーを有する場合、例えば、前記付加リンカーにおける、前記第1の核酸部が連結している末端とは反対側の末端でもよい。また、前記末端側は、前記第2の核酸部が前記付加リンカーを有する場合、例えば、前記付加リンカーにおける、前記第2の核酸部が連結している末端とは反対側の末端でもよく、この形態が好ましい。
前記分析用具が、例えば、複数種類の前記分析用核酸素子を有してもよい。このような分析用具は、例えば、前記基板の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に前述のような電極系を形成して、検出部とし、各検出部に核酸素子を配置することで形成できる。
以下に、本実施形態の分析用具の具体例を例示するが、これには制限されない。
図6に、分析用具の構成を模式的に示す。図6において、左図は、分析用具における分析用核酸素子が分析対象物と結合していない状態を示し、右図は、分析用具における分析用核酸素子が分析対象物と結合した状態を示す。
図6に示すように、分析用具1は、基板10、電極20および分析用核酸素子40を備え、基板10上に、電極20が配置され、電極20上に分析用核酸素子40が固定化されている。基板10において、電極20が配置された領域が検出部となる。分析用核酸素子40は、第1の核酸部41、第2の核酸部42、介在リンカー43、第1の付加リンカー44および第2の付加リンカー45からなる一本鎖核酸である。分析用核酸素子40において、第1の核酸部41と第2の核酸部42とは、介在リンカー43で連結し、第1の核酸部41の末端には第1の付加リンカー44、第2の核酸部42の末端には第2の付加リンカー45が連結している。そして、分析用核酸素子40は、第2の核酸部42に連結した第2の付加リンカー45を介して、電極20に固定化されている。第1の核酸部41は、一本鎖であることが好ましく、分析対象物と結合していない状態で、図6の左図に示すように、自己アニーリングによりステムループ構造をとることが好ましい。
分析用具1について、第1の核酸部41を、分析対象物50に結合可能なアプタマーとし、第2の核酸部42を、ペルオキシダーゼ活性を生起可能なDNAとする例をあげて、使用方法について説明する。
まず、分析用具1の前記検出部に、サンプルおよび試薬を添加する。前記試薬は、前記基質およびポルフィリンを含む。前記サンプル中に分析対象物50が存在しない場合、図6の左図に示すように、分析用核酸素子40の第1の核酸部41に分析対象物が結合しないため、第2の核酸部42は、ペルオキシダーゼ活性を生起しない。具体的には、第2の核酸部42が第1の付加リンカー44とステム構造を形成することにより、第2の核酸部42がケージ化され、第2の核酸部42の触媒機能が不活性化される。したがって、第2の核酸部42による電子授受が生じないため、検出部の電極20により電気シグナルを検出できない。他方、前記サンプル中に分析対象物50が存在する場合、図6の右図に示すように、分析用核酸素子40の第1の核酸部41に分析対象物が結合するため、第2の核酸部42がペルオキシダーゼ活性を生起可能な二次構造に変化する。具体的には、第1の核酸部41に分析対象物50が結合することにより、第1の核酸部41の構造が変化して、第2の核酸部42と第1の付加リンカー44とのステム構造が解除される。これによって、第2の核酸部42は、自己会合して、前記G-tetradを形成し、G-quadruplexの構造をとる。G-quadruplexの構造である第2の核酸部42に、ポルフィリンが結合して複合体を形成し、触媒機能が活性化される。そして、活性化された第2の核酸部42により、前記基質から生成物が生成される過程において、電子の授受が生じる。その結果、検出部の電極20により電気シグナルが検出できる。このように、分析用具1によれば、電気シグナルの検出によって、サンプル中の分析対象物の有無を分析可能である。
前記試薬は、例えば、さらに前記メディエータを有してもよい。また、前記試薬は、例えば、前記分析用具へのサンプルの添加前、添加と同時、または添加後に、前記各試薬を含む試薬液を、前記分析用具に添加してもよい。
<分析方法>
本発明の分析方法は、前記本発明の分析用核酸素子を用い、前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させ、前記結合を、前記第2の核酸部により分析することを特徴とする。本発明の分析方法は、特に示さない限り、前記本発明の分析用核酸素子、前記本発明の分析用具等で述べた方法により行うことができる。
本発明の分析方法は、前記本発明の分析用核酸素子を用い、前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させ、前記結合を、前記第2の核酸部により分析することを特徴とする。本発明の分析方法は、特に示さない限り、前記本発明の分析用核酸素子、前記本発明の分析用具等で述べた方法により行うことができる。
本発明の分析方法において使用する前記分析用核酸素子は、前述の通りであり、例えば、前記実施形態1の分析用核酸素子および前記実施形態2の分析用核酸素子があげられる。
本発明の分析方法において、前記実施形態1の分析用核酸素子を使用する場合、例えば、以下のようにして、前記結合を分析する。すなわち、例えば、分析前において、前記第2の核酸部に、前記標識物を結合させ、分析において、前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させることにより、前記第2の核酸部から前記標識物を遊離させ、遊離した前記標識物を分析することが好ましい。この場合、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部の二次構造が変化し、前記二次構造の変化により、前記第2の核酸部に結合している前記標識物が、前記第2の核酸部から遊離する。
前記標識物は、特に制限されず、前述の通りであり、中でも、酵素が好ましい。前記標識物が酵素の場合、例えば、前記第2の核酸部に前記酵素が結合している場合、前記酵素の触媒機能が阻害され、前記第2の核酸部から前記酵素が遊離した場合、前記酵素の触媒機能の阻害が解除される。そして、前記分析において、前記酵素の触媒機能による酵素反応を分析する。前記第2の核酸部に結合した前記酵素は、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部から遊離する。
この場合、前記結合の分析方法は、特に制限されず、例えば、遊離した標識物の分析により行うことができる。前記遊離した標識物の分析は、前記標識物の種類に応じて適宜設定できる。前記標識物が前記酵素の場合、例えば、遊離した前記酵素の酵素反応の分析により行うことができる。前記酵素反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的検出でもよいし電気化学的検出でもよい。前記光学的検出は、例えば、発色または発光等の光学シグナルの検出があげられ、吸光度、反射率、蛍光強度等のシグナル強度を測定することにより行える。前記光学シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記酵素反応を行うことにより生じる。前記基質は、特に制限されないが、前記酵素反応により発色または発光する基質が好ましい。前記電気化学的検出は、例えば、電気化学的シグナルの検出があげられ、電流等のシグナル強度を測定することにより行える。前記電気化学的シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記酵素反応を行うことにより、電子の授受として生じる。前記電子の授受は、例えば、電極への印加により電流として測定可能である。
前記基質の添加時は、特に制限されず、例えば、予め、前記分析用核酸素子と共存させてもよいし、前記分析対象物を結合させる際に、分析対象のサンプルと同時に添加してもよいし、前記分析対象のサンプルを添加した後に添加してもよい。
本発明の分析方法において、前記実施形態2の分析用核酸素子を使用する場合、例えば、以下のようにして、前記結合を分析する。すなわち、例えば、分析において、前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させることにより、前記第2の核酸部の触媒機能を生起させ、前記触媒機能による反応を分析することが好ましい。この場合、例えば、前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部の二次構造が変化し、前記二次構造の変化により、前記第2の核酸部の前記触媒機能が生起する。
この場合、前記結合の分析方法は、特に制限されず、例えば、前記第2の核酸部の触媒機能による触媒反応の分析により行うことができる。前記触媒反応の分析は、前記第2の核酸部の触媒機能の種類に応じて適宜設定できる。前記触媒機能による反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的検出でもよいし電気化学的検出でもよい。前記光学的検出は、例えば、発色または発光等の光学シグナルの検出があげられ、吸光度、反射率、蛍光強度等のシグナル強度を測定することにより行える。前記光学シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記触媒反応を行うことにより生じる。前記基質は、特に制限されないが、前記触媒反応により発色または発光する基質が好ましい。前記電気化学的検出は、例えば、電気化学的シグナルの検出があげられ、電流等のシグナル強度を測定することにより行える。前記電気化学的シグナルは、例えば、基質の存在下で、前記触媒反応を行うことにより、電子の授受として生じる。前記電子の授受は、例えば、電極への印加により、電流として測定可能である。
前記基質の添加時は、特に制限されず、例えば、予め、前記分析用核酸素子と共存させてもよいし、分析対象のサンプルと同時に添加してもよいし、前記分析対象のサンプルを添加した後に添加してもよい。
前記実施形態2の分析用核酸素子を使用する場合、前記触媒反応は、例えば、前記ポルフィリンの存在下で行うことが好ましい。前記ポルフィリンの添加時は、特に制限されず、例えば、予め、前記分析用核酸素子と共存させてもよいし、分析対象のサンプルと同時に添加してもよいし、前記分析対象のサンプルを添加した後に添加してもよい。
本発明の分析方法は、例えば、前述した本発明の分析用試薬、本発明の分析用具等を用いて行うこともできる。
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
本出願は、2009年8月7日に出願された日本出願特願2009-185283を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明は、簡易な検査システムを構築でき、その用途は制限されず、例えば、食品、医療、農業、環境等の様々な分野に広く適用可能である。
1 分析用具
10 基板
11、50 分析対象物
12、32、41 第1の核酸部
13、33、42 第2の核酸部
14 標識物
16、36、40 分析用核酸素子
20 電極
43 介在リンカー
44 第1の付加リンカー
45 第2の付加リンカー
56 袋状分析用具
57 試薬層
58 発色
10 基板
11、50 分析対象物
12、32、41 第1の核酸部
13、33、42 第2の核酸部
14 標識物
16、36、40 分析用核酸素子
20 電極
43 介在リンカー
44 第1の付加リンカー
45 第2の付加リンカー
56 袋状分析用具
57 試薬層
58 発色
Claims (31)
- 第1の核酸部および第2の核酸部を含み、
前記第1の核酸部は、分析対象物および結合可能な結合部であり、
前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部と前記分析対象物との結合および非結合を区別可能な標識部であることを特徴とする分析用核酸素子。 - 前記第1の核酸部は、前記分析対象物の結合により構造変化する核酸であり、
前記第2の核酸部は、前記第1の核酸部の構造変化により構造変化する核酸である、請求項1記載の分析用核酸素子。 - 前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、標識物と結合可能であり、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合した場合、前記標識物と結合不能である、請求項1または2記載の分析用核酸素子。 - 前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、前記標識物と結合可能であり、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部の二次構造が変化し、
前記二次構造の変化により、前記第2の核酸部に結合している前記標識物が、前記第2の核酸部から遊離する、請求項3記載の分析用核酸素子。 - 前記標識物が、酵素であり、
前記酵素は、
前記第2の核酸部に結合している場合、その触媒機能が阻害され、
前記第2の核酸部から遊離した場合、その触媒機能の前記阻害が解除される、請求項3または4記載の分析用核酸素子。 - 前記第2の核酸部は、酵素の触媒機能を生起可能であり、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、その触媒機能が阻害され、
前記第1の核酸部に分析対象物が結合した場合、その触媒機能の前記阻害が解除される、請求項1または2記載の分析用核酸素子。 - 前記第2の核酸部は、G-カルテットを形成可能であり、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、G-カルテットの形成が阻害され、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合した場合、G-カルテットの形成の阻害が解除される、請求項6記載の分析用核酸素子。 - 前記第2の核酸部は、ポルフィリンと結合可能であり、
前記第2の核酸部は、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合していない場合、ポルフィリンとの結合が阻害され、
前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合した場合、ポルフィリンと結合する、請求項6または7記載の分析用核酸素子。 - 前記ポルフィリンは、三価鉄錯体である、請求項8記載の分析用核酸素子。
- 前記第2の核酸部は、DNAzymeまたはRNAzymeである、請求項6から9のいずれか一項に記載の分析用核酸素子。
- 前記第2の核酸部は、ペルオキシダーゼの触媒機能を生起可能な核酸である、請求項6から10のいずれか一項に記載の分析用核酸素子。
- 前記分析用核酸素子は、前記第1の核酸部と前記第2の核酸部とが連結した一本鎖核酸である、請求項1から11のいずれか一項に記載の分析用核酸素子。
- 前記核酸部が、RNAである、請求項1から12のいずれか一項に記載の分析用核酸素子。
- 前記第1の核酸部および前記第2の核酸部が、アプタマーである、請求項1から13のいずれか一項に記載の分析用核酸素子。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の分析用核酸素子を用い、
前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させ、
前記結合を、前記第2の核酸部により分析することを特徴とする分析方法。 - 請求項3記載の分析用核酸素子を用い、
分析前において、前記第2の核酸部に、前記標識物を結合させ、
分析において、前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させることにより、前記第2の核酸部から前記標識物を遊離させ、遊離した前記標識物を分析する、請求項15記載の分析方法。 - 前記第1の核酸部に前記分析対象物が結合することにより、前記第2の核酸部の二次構造が変化し、
前記二次構造の変化により、前記第2の核酸部に結合している前記標識物が、前記第2の核酸部から遊離する、請求項16記載の分析方法。 - 前記標識物が、酵素であり、
前記第2の核酸部に前記酵素が結合している場合、前記酵素の触媒機能が阻害され、
前記第2の核酸部から前記酵素が離れた場合、前記酵素の触媒機能の阻害が解除され、
前記分析において、前記酵素の触媒機能による反応を分析する、請求項16または17記載の分析方法。 - 請求項6から14のいずれか一項に記載の分析用核酸素子を用い、
分析において、前記第1の核酸部に、前記分析対象物を結合させることにより、前記第2の核酸部の触媒機能を生起させ、前記触媒機能による反応を分析する、請求項15記載の分析方法。 - 前記結合の分析が、光学的検出および電気化学的検出による分析である、請求項15から19のいずれか一項に記載の分析方法。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の分析用核酸素子を含むことを特徴とする分析用試薬。
- 請求項3から5のいずれか一項に記載の分析用核酸素子および標識物を含む、請求項21記載の分析用試薬。
- 前記標識物が酵素であり、さらに、前記酵素の基質を含む、請求項22記載の分析用試薬。
- 前記基質が、前記酵素の反応によって発色する発色基質である、請求項23記載の分析用試薬。
- 請求項6から14のいずれか一項に記載の分析用核酸素子および基質を含み、
前記基質は、前記第2の核酸部の触媒機能による反応の基質である、請求項21記載の分析用試薬。 - 前記基質が、前記触媒機能による反応によって発色する発色基質である、請求項25記載の分析用試薬。
- さらに、ポルフィリンを含む、請求項25記載の分析用試薬。
- 請求項21から27のいずれか一項に記載の分析用試薬を含むことを特徴とする分析用具。
- その形状が、袋状である、請求項28記載の分析用具。
- 前記袋の内面に、前記分析用試薬が配置されている、請求項29記載の分析用具。
- さらに、ポジティブコントロールを含む、請求項28から30のいずれか一項に記載の分析用具。
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Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013141291A1 (ja) * | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Necソフト株式会社 | ストレプトアビジンの分析用デバイスおよび分析方法 |
EP2657702A1 (en) * | 2010-12-24 | 2013-10-30 | NEC Soft, Ltd. | Analytical device and analytical method |
EP2657330A1 (en) * | 2010-12-20 | 2013-10-30 | NEC Soft, Ltd. | Detection tool, and detection system |
WO2014017471A1 (ja) * | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Necソフト株式会社 | メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法 |
JP5503062B1 (ja) * | 2013-07-23 | 2014-05-28 | Necソフト株式会社 | ターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲットの分析方法 |
WO2014136560A1 (ja) * | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Necソリューションイノベータ株式会社 | 核酸素子候補分子、および、これを用いたターゲット分析用核酸素子のスクリーニング方法 |
WO2015012060A1 (ja) * | 2013-07-23 | 2015-01-29 | Necソリューションイノベータ株式会社 | ターゲット分析用センサ、ターゲット分析用デバイス、および、これを用いたターゲットの分析方法 |
WO2015145851A1 (ja) * | 2014-03-26 | 2015-10-01 | Necソリューションイノベータ株式会社 | 検体検出装置、検体検出システム、検体検出キット、検体検出方法、プログラム、及び記録媒体 |
WO2015151350A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | Necソリューションイノベータ株式会社 | 卵アレルゲンに結合する核酸分子およびその用途 |
CN105518156A (zh) * | 2013-09-05 | 2016-04-20 | 日本电气方案创新株式会社 | 用于制备样品的方法和用于分析靶标的方法 |
US9880174B2 (en) | 2012-03-23 | 2018-01-30 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Device and method for analyzing target |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10296845B2 (en) * | 2013-07-01 | 2019-05-21 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Attribute estimation system |
EP3078747B1 (en) * | 2013-12-04 | 2019-05-15 | NEC Solution Innovators, Ltd. | Peanut-binding nucleic acid molecule and use thereof |
CN103983670B (zh) * | 2014-04-25 | 2015-06-10 | 青岛大学 | 基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法 |
US10934548B2 (en) * | 2015-11-16 | 2021-03-02 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Wheat allergen-binding nucleic acid molecule and use thereof |
SG11201809002RA (en) | 2016-04-29 | 2018-11-29 | Univ Nanyang Tech | G-quadruplex-containing antisense oligonucleotides |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
JPH10503841A (ja) | 1994-06-17 | 1998-04-07 | ザ ボード オブ トランティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 生体試料から成るミクロ配列を作成するための方法および装置 |
JP2004500109A (ja) * | 2000-03-22 | 2004-01-08 | クァンタム・ドット・コーポレイション | ビーズベースの核酸アッセイにおける半導体ナノクリスタルの使用方法 |
WO2005049826A1 (ja) * | 2003-11-22 | 2005-06-02 | Ultizyme International Ltd. | アプタマーを用いた標的分子の検出方法 |
WO2008038696A1 (fr) * | 2006-09-27 | 2008-04-03 | National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology | Procédé de dosage d'une substance cible dans un échantillon, aptamère et son procédé de fabrication |
JP2009133712A (ja) | 2007-11-30 | 2009-06-18 | Morinaga & Co Ltd | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
JP2009159965A (ja) * | 1997-12-15 | 2009-07-23 | Somalogic Inc | 診断用核酸リガンドバイオチップ |
JP2009185283A (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-20 | Daxin Material Corp | 液晶配向溶液 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1252335A4 (en) * | 2000-02-03 | 2005-03-02 | Res Dev Foundation | SIGNAL-TREATING APTAMERS THAT TRANSMIT MOLECULAR DETECTION TO A DIFFERENTIAL SIGNAL |
US7612185B2 (en) * | 2003-03-07 | 2009-11-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Nucleic acid biosensors |
DE102004053918B4 (de) | 2004-11-05 | 2007-06-14 | Analyticon Biotechnologies Ag | Aptamerbasiertes Testsystem |
US20060166222A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Yi Lu | Nucleic acid enzyme ligation sensor |
KR100896987B1 (ko) | 2007-03-14 | 2009-05-14 | 한국과학기술연구원 | 앱타머를 이용한 표적 단백질 검출 방법 및 검출키트 |
-
2010
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-
2014
- 2014-09-12 JP JP2014186852A patent/JP2015037407A/ja active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
JPH10503841A (ja) | 1994-06-17 | 1998-04-07 | ザ ボード オブ トランティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 生体試料から成るミクロ配列を作成するための方法および装置 |
US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
JP2009159965A (ja) * | 1997-12-15 | 2009-07-23 | Somalogic Inc | 診断用核酸リガンドバイオチップ |
JP2004500109A (ja) * | 2000-03-22 | 2004-01-08 | クァンタム・ドット・コーポレイション | ビーズベースの核酸アッセイにおける半導体ナノクリスタルの使用方法 |
WO2005049826A1 (ja) * | 2003-11-22 | 2005-06-02 | Ultizyme International Ltd. | アプタマーを用いた標的分子の検出方法 |
WO2008038696A1 (fr) * | 2006-09-27 | 2008-04-03 | National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology | Procédé de dosage d'une substance cible dans un échantillon, aptamère et son procédé de fabrication |
JP2009133712A (ja) | 2007-11-30 | 2009-06-18 | Morinaga & Co Ltd | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
JP2009185283A (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-20 | Daxin Material Corp | 液晶配向溶液 |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
CHENG ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 48, 2009, pages 7817 - 7823 |
ITO Y. ET AL.: "Design and synthesis of functional polymers by in vitro selection", POLYM. ADV. TECHNOL., vol. 15, no. 1-2, January 2004 (2004-01-01), pages 3 - 14, XP001224327 * |
LI TAO ET AL.: "Label-Free Colorimetric Detection of Aqueous Mercury Ion (Hg2+) Using Hg2+-Modulated G-Quadruplex-Based DNAzymes", ANAL. CHEM., vol. 81, no. 6, 15 March 2009 (2009-03-15), pages 2144 - 2149, XP008151992 * |
M.M.ALI ET AL.: "Colorimetric Sensing by Using Allosteric-DNAzyme-Coupled Rolling Circle Amplification and a Peptide Nucleic Acid- Organic Dye Probe", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 48, 13 May 2009 (2009-05-13), pages 3512 - 3515, XP008151991 * |
See also references of EP2463660A4 * |
TAO ET AL., ANAL. CHEM., vol. 8, no. 1, 2009, pages 2144 - 2149 |
TAO ET AL., ANAL. CHEM., vol. 81, 2009, pages 2144 - 2149 |
TELLER ET AL., ANAL. CHEM., vol. 81, 2009, pages 9144 - 9119 |
TOSHIHIRO IHARA: "Functional Nucleic Acids as Analytical Tools", BUNSEKI, vol. 9, 5 September 2009 (2009-09-05), pages 520 - 521, XP008152077 * |
TRAVASCIO ET AL., CHEM. BIOL., vol. 5, 1998, pages 505 - 517 |
Cited By (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2657330A1 (en) * | 2010-12-20 | 2013-10-30 | NEC Soft, Ltd. | Detection tool, and detection system |
EP2657330A4 (en) * | 2010-12-20 | 2015-01-14 | Nec Solution Innovators Ltd | DETECTION INSTRUMENT AND DETECTION SYSTEM |
US10295531B2 (en) | 2010-12-20 | 2019-05-21 | Nec Solutions Innovators, Ltd. | Detection instrument, and detection system |
EP2657702A4 (en) * | 2010-12-24 | 2014-12-03 | Nec Solution Innovators Ltd | ANALYSIS DEVICE AND ANALYSIS PROCEDURE |
EP2657702A1 (en) * | 2010-12-24 | 2013-10-30 | NEC Soft, Ltd. | Analytical device and analytical method |
US9880161B2 (en) | 2012-03-23 | 2018-01-30 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Device and method for analyzing streptavidin |
US9880174B2 (en) | 2012-03-23 | 2018-01-30 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Device and method for analyzing target |
JPWO2013141291A1 (ja) * | 2012-03-23 | 2015-08-03 | Necソリューションイノベータ株式会社 | ストレプトアビジンの分析用デバイスおよび分析方法 |
WO2013141291A1 (ja) * | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Necソフト株式会社 | ストレプトアビジンの分析用デバイスおよび分析方法 |
EP2829604A4 (en) * | 2012-03-23 | 2016-01-27 | Nec Solution Innovators Ltd | DEVICE FOR THE TARGET ANALYSIS OF STREPTAVIDINE, AND METHOD OF ANALYSIS |
WO2014017471A1 (ja) * | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Necソフト株式会社 | メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法 |
JPWO2014017471A1 (ja) * | 2012-07-27 | 2016-07-11 | Necソリューションイノベータ株式会社 | メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法 |
CN104508148A (zh) * | 2012-07-27 | 2015-04-08 | 日本电气方案创新株式会社 | 用于三聚氰胺分析的核酸传感器、分析装置和分析方法 |
WO2014136560A1 (ja) * | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Necソリューションイノベータ株式会社 | 核酸素子候補分子、および、これを用いたターゲット分析用核酸素子のスクリーニング方法 |
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