JP6218250B2 - ターゲット分析用センサ、ターゲット分析用デバイス、および、これを用いたターゲットの分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ターゲット分析用センサ、ターゲット分析用デバイス、および、これを用いたターゲットの分析方法に関する。
臨床医療、食品、環境等の様々な分野において、ターゲットの検出が必要とされている。前記ターゲットの検出は、一般的に、前記ターゲットとの相互作用が利用されており、中でも、前記ターゲットに特異的に結合する抗体を用いた手法が汎用されている。この方法では、例えば、ペルオキシダーゼ等の酸化還元酵素で標識化した抗体にターゲットを結合させる。そして、発色基質を用いて、前記標識化抗体における前記酵素により発色反応を行い、その発色を検出する。前記発色の検出により、間接的に、前記ターゲットの分析、例えば、定性分析および定量分析が行われている。
しかしながら、前記抗体は、動物への免疫によって取得されるため、毒性のターゲットおよび低分子のターゲットに対して特異的な抗体を取得することが極めて困難である。そこで、近年、ターゲットに結合する核酸分子、いわゆる核酸アプタマー(以下、アプタマーともいう)が注目されている。前記アプタマーは、試験管内で取得できることから、例えば、毒性のターゲットおよび低分子のターゲットに対しても、アプタマーを取得可能である。
そして、このようなアプタマーを、前記抗体に代えて、ターゲットの検出に使用するにあたって、ペルオキシダーゼと同様の触媒活性を示すDNAzymeの併用が試みられている。前記DNAzymeは、一般に、グアニンリッチな構造モチーフを有し、G−カルテット構造をとり、ヘミンと結合して複合体を形成することによって、ペルオキシダーゼと同様の触媒機能を生起するDNAである。
前記ターゲットの検出においては、具体的に、一本鎖核酸分子であるアプタマーと、一本鎖核酸分子であるDNAzymeの末端とを連結した一本鎖核酸センサが利用されている(非特許文献1)。しかしながら、実用面において、新たな構造のセンサの提供が望まれている。
Tellerら, Anal.Chem., 2009年, vol.81, p.9114−9119
そこで、本発明は、新たなターゲット分析用センサ、およびこれを用いたターゲット分析用デバイスならびにターゲットの分析方法を提供することを目的とする。
本発明のターゲット分析用センサは、一本鎖核酸分子を含み、前記一本鎖核酸分子が、第1触媒核酸領域(D1)、第2触媒核酸領域(D2)およびターゲットに結合する結合核酸領域(Ap)を含み、前記結合核酸領域(Ap)の一方の末端側に前記第1触媒核酸領域(D1)を有し、前記結合核酸(Ap)の他方の末端側に前記第2触媒核酸領域(D2)を有し、ターゲット非存在下、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能が阻害され、ターゲット存在下、前記結合核酸領域(Ap)への前記ターゲットの接触により、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とのG−カルテット形成により触媒機能が生起されることを特徴とする。
本発明のターゲット分析用デバイスは、基材、ターゲット分析用センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記センサおよび前記検出部が配置され、前記センサは、前記本発明のターゲット分析用センサであり、前記検出部は、前記センサにおける前記第1触媒機能領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明のターゲット分析用試薬は、前記本発明のターゲット分析用センサを含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析方法は、前記本発明のターゲット分析用センサに試料を接触させる接触工程、および、前記ターゲット分析用センサにおける前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析用センサによれば、簡便且つ効率的に、優れたS/N比でターゲットを分析できる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
1.ターゲット分析用センサ
本発明のターゲット分析用センサは、前述のように、一本鎖核酸分子を含み、前記一本鎖核酸分子が、第1触媒核酸領域(D1)、第2触媒核酸領域(D2)およびターゲットに結合する結合核酸領域(Ap)を含み、前記結合核酸領域(Ap)の一方の末端側に前記第1触媒核酸領域(D1)を有し、前記結合核酸領域(Ap)の他方の末端側に前記第2触媒核酸領域(D2)を有し、ターゲット非存在下、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能が阻害され、ターゲット存在下、前記結合核酸領域(Ap)への前記ターゲットの接触により、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とのG−カルテット形成により触媒機能が生起されることを特徴とする。
本発明のターゲット分析用センサは、前述のように、一本鎖核酸分子を含み、前記一本鎖核酸分子が、第1触媒核酸領域(D1)、第2触媒核酸領域(D2)およびターゲットに結合する結合核酸領域(Ap)を含み、前記結合核酸領域(Ap)の一方の末端側に前記第1触媒核酸領域(D1)を有し、前記結合核酸領域(Ap)の他方の末端側に前記第2触媒核酸領域(D2)を有し、ターゲット非存在下、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能が阻害され、ターゲット存在下、前記結合核酸領域(Ap)への前記ターゲットの接触により、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とのG−カルテット形成により触媒機能が生起されることを特徴とする。
以下、本発明のターゲット分析用センサをセンサ、核酸領域を領域ともいう。また、本発明における前記一本鎖核酸分子は、例えば、一本鎖核酸素子ということもできる。
本発明において、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とは、両者が一対となりG−カルテット構造(G−tetradともいう)を形成することにより触媒機能を生起する、二本鎖型(スプリット型ともいう)の触媒核酸分子である。前記G−カルテットは、例えば、G(グアニン)が四量体となった面の構造である。前記G−カルテット構造は、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型のいずれでもよく、好ましくは、パラレル型である。本発明のセンサにおいて、G−カルテット構造の個数は、特に制限されず、例えば、1面でもよい、2面以上の複数でもよいが、G−カルテットが複数面重なった、グアニン四重鎖(またはG−quadruplexという)構造を形成することが好ましい。本発明において、前記第1触媒領域(D1)および前記第2触媒領域(D2)は、それぞれ、前記G−カルテット構造を形成する配列であればよく、より好ましくは、グアニン四重鎖構造を形成する配列である。
前記触媒機能は、特に制限されず、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応であればよい。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性(以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という)等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)活性があげられる。前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とは、DNA配列の場合、DNAエンザイムまたはDNAzymeと呼ぶことができ、また、RNA配列の場合、RNAエンザイムまたはRNAzymeと呼ぶことができる。
本発明のセンサは、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。
一般的に、核酸配列は、形成し得る構造の間で熱力学的に揺らいでおり、相対的に安定性の高いものの存在比率が高くなると考えられている。そして、アプタマー等の結合核酸分子は、一般的に、ターゲット存在下では、ターゲットとの接触によって、ステムループ構造を有するより安定な立体構造に変化して、前記ターゲットに結合することが知られている。また、DNAzyme等の触媒核酸分子も、一般的に、G−カルテット構造のような安定な立体構造によって、触媒活性を生起することが知られている。本発明のセンサは、前述のように、一対となってG−カルテット構造を形成し、触媒活性を生起する前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが、前記結合領域(Ap)を介して、それぞれ離れて配置されている。このように、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが距離を置いて配置されているため、ターゲット非存在下では、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との間で、G−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能が阻害される(スイッチ−OFF)。この状態の構造を、不活性型ともいう。他方、前記センサは、ターゲット存在下では、前記結合領域(Ap)への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域(Ap)の立体構造が、ステムループ構造を有するより安定な構造に変化する。この前記結合領域(Ap)の立体構造の変化に伴い、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが接近し、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との間で、G−カルテット構造が形成され、結果として、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能が生起される(スイッチ−ON)。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、触媒機能が生起されず、ターゲット存在下でのみ、触媒機能が生起されるため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
本発明は、前述のように、二本鎖型の触媒核酸分子を使用し、前記結合領域(Ap)を介して、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とを配置している。このため、例えば、アプタマーの種類ごとに条件設定を行う必要がなく、前記結合領域(Ap)として所望のアプタマーをセットできることから、汎用性に優れる。
本発明において、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)は、前記結合領域(Ap)を介して配置されていればよく、いずれが前記結合領域(Ap)の5’側または3’側に配置されてもよい。以下、特に説明しない限り、便宜上、前記結合領域(Ap)の5’側に前記第1触媒領域(D1)、前記結合領域(Ap)の3側に前記第2触媒領域(D2)が配置されている例を示す。
本発明において、前記一本鎖核酸分子は、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記結合領域(Ap)との間が、直接的または間接的に連結してもよいし、前記第2触媒領域(D2)と前記結合領域(Ap)との間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが、リンカー領域を介して結合していることを意味し、具体的には、一方の領域の3’末端とリンカー領域の5’末端とが直接結合し、リンカー領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味する。前記リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
前記一本鎖核酸分子は、前述のように、前記第1触媒領域(D1)と前記結合領域(Ap)との間に前記核酸リンカー領域(第1リンカー領域(L1))を有し、前記第2触媒領域(D2)と前記結合領域(Ap)との間に前記核酸リンカー領域(第2リンカー領域(L2))を有することが好ましい。前記第1リンカー領域(L1)および前記第2リンカー領域(L2)は、いずれか一方でもよく、両方を有することが好ましい。前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)の両方を有する場合、それぞれの長さは、同じ長さでもよいし異なってもよい。
前記リンカー領域の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、1、3、5、7、9塩基長であり、その上限は、例えば、20、15、10塩基長である。
また、前記第1リンカー領域(L1)の5’末端側からの塩基配列と前記第2リンカー領域(L2)の3’末端側からの塩基配列とは、例えば、互いに非相補的であることが好ましい。この場合、前記第1リンカー領域(L1)の5’末端側からの塩基配列と前記第2リンカー領域(L2)の3’末端側からの塩基配列は、アライメントした状態で、前記一本鎖核酸分子の分子内で内部ループを形成する領域ともいえる。このように、前記第1触媒領域(D1)および前記第2触媒領域(D2)と前記結合領域(Ap)との間に、非相補的な前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(D2)を有することで、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との距離を十分に保つことができる。このため、例えば、ターゲット非存在下における、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによるG−カルテット構造の形成を、十分に抑制し、ターゲット非存在下での、触媒機能に基づくバックグラウンドを十分に低下することができる。
前記一本鎖核酸分子として、前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)と有する形態について、図1の模式図を用いて、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能のON−OFFを説明する。なお、本発明は、これには制限されない。図1は、前記一本鎖核酸分子における触媒機能のON−OFFを示す概略図である。図1の左に示すように、ターゲット非存在下、前記一本鎖核酸分子は、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との間でのG−カルテット構造の形成が抑制された不活性型となる。他方、ターゲット存在下では、前記結合領域(Ap)にターゲットが接触することで、前記結合領域(Ap)の立体構造が変化し、これに伴い、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが接近して、両者の間でG−カルテット構造が形成された活性型となる。
前記一本鎖核酸分子は、例えば、「D1−W−D2」で表され、リンカーとして、前記第1リンカー領域(L1)のみを有する場合、前記式におけるWは、例えば、5’側から、第1リンカー領域(L1)と前記結合領域(Ap)とをこの順序で有し、前記第2リンカー領域(L2)のみを有する場合、前記式におけるWは、例えば、5’側から、前記結合領域(Ap)と第2リンカー領域(L2)とをこの順序で有し、前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)の両方を有する場合、前記式におけるWは、例えば、5’側から、前記第1リンカー領域(L1)と前記結合領域(Ap)と前記第2リンカー領域(L2)とをこの順序で有する。この場合、D1−W−D2で表される一本鎖核酸分子は、それぞれ、例えば、D1−L1−Ap−D2、D1−Ap−L2−D2またはD1−L1−Ap−L2−D2と表すことができる。
前記一本鎖核酸分子は、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが、それぞれ、前記結合領域(Ap)の位置とは反対側の末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。具体的には、例えば、前記第1触媒領域(D1)が前記結合領域(Ap)の5’側に配置されている場合、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とは、前記第1触媒領域(D1)の5’末端と前記第2触媒領域(D2)の3’末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。また、例えば、前記第1触媒領域(D1)が前記結合領域(Ap)の3’側に配置されている場合、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とは、前記第1触媒領域(D1)の3’末端と前記第2触媒領域(D2)の5’末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。このように、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが、それぞれの末端における前記相補的な配列を有することで、前記配列間で、分子内アニーリングによりステム構造の形成が可能となる。このため、例えば、ターゲット存在下、ターゲットの接触による前記結合領域(Ap)の立体構造の変化に伴い、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが接近した際、前記配列間でのステム構造の形成によって、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とのG−カルテット構造の形成がより容易になる。
前記一本鎖核酸分子は、例えば、前述のように、D1−W−D2で表すことができ、具体的には、下記式(I)で表すことができる。
前記式(I)中、5’側の配列(N)n1-GGG-(N)n2-(N)n3-が、前記第1触媒領域(D1)の配列(d1)であり、3’側の配列-(N)m3-(N)m2-GGG-(N)m1が、前記第2触媒領域(D2)の配列(d2)であり、Wが、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との間の領域であって、前記結合領域(Ap)を含み、Nは、塩基を示し、n1、n2およびn3ならびにm1、m2およびm3は、それぞれ塩基Nの繰り返し個数を示す。
前記式(I)は、前記一本鎖核酸分子において、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とを分子内アライメントした状態を示すが、これは、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との配列の関係を示すための模式図であって、本発明において、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とが、この状態を取ることを限定するものではない。
前記第1触媒領域(D1)の配列(d1)および前記第2触媒領域(D2)の配列(d2)は、例えば、(N)n1と(N)m1とが、下記条件(1)を満たし、(N)n2と(N)m2とが、下記条件(2)を満たし、(N)n3と(N)m3とが、下記条件(3)を満たすことが好ましい。
条件(1)
(N)n1および(N)m1は、(N)n1の5’末端側からの塩基配列と(N)m1の3’末端側からの塩基配列とが、互いに相補的であり、n1およびm1は、同じ0または正の整数である。
(N)n1および(N)m1は、(N)n1の5’末端側からの塩基配列と(N)m1の3’末端側からの塩基配列とが、互いに相補的であり、n1およびm1は、同じ0または正の整数である。
条件(2)
(N)n2および(N)m2は、(N)n2の5’末端側からの塩基配列と(N)m2の3’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的であり、n2およびm2は、それぞれ、正の整数であり、同じでも異なってもよい。
(N)n2および(N)m2は、(N)n2の5’末端側からの塩基配列と(N)m2の3’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的であり、n2およびm2は、それぞれ、正の整数であり、同じでも異なってもよい。
条件(3)
(N)n3および(N)m3は、n3およびm3が、それぞれ、3または4であり、同じでも異なってもよく、3つの塩基Gを有し、n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。
(N)n3および(N)m3は、n3およびm3が、それぞれ、3または4であり、同じでも異なってもよく、3つの塩基Gを有し、n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。
前記条件(1)は、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とをアライメントした場合の5’末端の(N)n1と3’末端の(N)m1との条件である。前記条件(1)において、前記(N)n1の5’末端側からの塩基配列と前記(N)m1の3’末端側からの塩基配列とは、互いに相補的であり、同じ長さである。(N)n1と(N)m1とは、同じ長さの相補的な配列であるため、アライメントした状態で、ステムを形成するステム領域ともいえる。
n1およびm1は、同じ0または正の整数であればよく、例えば、それぞれ、0、1〜10、1、2または3である。
前記条件(2)は、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とをアライメントした場合の(N)n2と(N)m2との条件である。前記条件(2)において、前記(N)n2の塩基配列と前記(N)m2の塩基配列とは、互いに非相補的であり、n2およびm2は、同じ長さでも異なる長さでもよい。 (N)n2と(N)m2とは、非相補的な配列であるため、アライメントした状態で、内部ループを形成する領域ともいえる。
n2およびm2は、正の整数であり、例えば、それぞれ、1〜10であり、好ましくは、1または2である。n2とm2とは、同じでも異なってもよく、例えば、n2=m2、n2>m2、n2<m2のいずれでもよく、好ましくはn2>m2、n2<m2である。
前記条件(3)は、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とをアライメントした場合の (N)n3と(N)m3との条件である。前記条件(3)において、前記(N)n3の塩基配列と前記(N)m3の塩基配列とは、それぞれ、3つの塩基Gを有する3塩基長または4塩基長の配列であり、同じでも異なってもよい。n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。3つのGを有する(N)n3および(N)m3は、(N)n1と(N)n2との間のGGGおよび(N)m1と(N)m2との間のGGGとともに、G−カルテット構造を形成するG領域である。
n3およびm3は、例えば、n3=m3、n3>m3、n3<m3のいずれでもよく、好ましくはn3>m3、n3<m3である。
G以外の塩基である前記塩基Hは、例えば、A、C、TまたはUがあげられ、好ましくは、A、CまたはTである。
前記条件(3)は、具体例として、下記条件(3−1)、(3−2)または(3−3)があげられる。
条件(3−1)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGHGGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−2)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGGHGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−3)
(N)n3および(N)m3の両方の配列がGGGである。
条件(3−1)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGHGGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−2)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGGHGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−3)
(N)n3および(N)m3の両方の配列がGGGである。
前記第1触媒領域(D1)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、7塩基長、8塩基長、10塩基長であり、上限は、例えば、30塩基長、20塩基長、10塩基長、その範囲は、例えば、7〜30塩基長、7〜20塩基長、7〜10塩基長である。前記第2触媒領域(D2)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、7塩基長、8塩基長、10塩基長であり、上限は、例えば、30塩基長、20塩基長、10塩基長、その範囲は、例えば、7〜30塩基長、7〜20塩基長、7〜10塩基長である。前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)の長さは、それぞれ同じであっても異なってもよい。
前記一本鎖核酸分子において、前記第1触媒領域(D1)の配列(d1)と前記第2触媒領域(D2)の配列(d2)との組み合わせを、以下に例示するが、本発明は、これらには制限されない。下記1〜49の組み合わせにおいて、Wは、前記一本鎖核酸分子における前記配列(d1)および前記配列(d2)との間の領域を意味し、5’末端側および3’末端側の小文字領域は、それぞれ(N)n1および(N)m1を示し、5’側および3’側の下線部領域は、それぞれ(N)n2および(N)m2を示し、5’側および3’側の下線部領域とWとの間の領域が、それぞれ(N)n3および(N)m3を示す。
表1の組み合わせ1−24は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、0−3塩基長に変化させ、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、ACの2塩基長とAの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GGGの3塩基長とGTGGの4塩基長に設定した配列であり、Wは、制限されない。
表2の組み合わせ25−48は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、Aの1塩基長とTの1塩基長、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、1または2塩基長に変化させ、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGG、GGAG、GCGGおよびGTGGの4種類の4塩基長とGGGの3塩基長に設定した配列であり、Wは、制限されない。表2の組み合わせ49は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、CAの2塩基長とTGの2塩基長、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、TおよびAの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGGの4塩基長とGGGの3塩基長に設定した配列であり、Wは、制限されない。
ターゲット存在下、前記一本鎖核酸分子における前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との間で形成されるG−カルテット構造について、一例として、組み合わせ24(配列番号24)を図2に示す。図2は、組み合わせ24(配列番号24)の一本鎖核酸分子における、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との間で形成されるG−カルテット構造の概略である。図2に示すように、前記第1触媒領域(D1)におけるGと前記第2触媒領域(D2)におけるGとの間で、G−カルテットが3面重なったグアニン四重鎖が形成される。なお、本発明は、この例示に限定されない。
本発明のセンサにおいて、ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットが選択できる。そして、前記任意のターゲットに応じて、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を、前記結合領域(Ap)として使用すればよい。
前記ターゲットは、特に制限されず、例えば、低分子化合物、微生物、ウイルス、食物アレルゲン、農薬、カビ毒、抗体等が例示できる。前記低分子化合物は、例えば、メラミン、抗生物質、農薬、環境ホルモン等があげられる。前記微生物は、例えば、サルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌、カビ等があげられ、前記ウイルスは、例えば、ノロウイルス等があげられる。
前記結合領域(Ap)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、12塩基長、15塩基長、18塩基長であり、上限は、例えば、140塩基長、80塩基長、60塩基長であり、その範囲は、例えば、12〜140塩基長、15〜80塩基長、18〜60塩基長である。
本発明において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、例えば、両者間でアニーリングが生じ得る配列であることを意味する。前記アニーリングを、ステム形成ともいう。本発明において、相補的とは、例えば、2種類の配列をアラインメントした際の相補性が、例えば、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以、99%以上、100%、すなわち完全相補である。
本発明において、前記一本鎖核酸分子の全長の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、25塩基長、30塩基長、35塩基長であり、上限は、例えば、200塩基長、100塩基長、80塩基長、その範囲は、例えば、25〜200塩基長、30〜100塩基長、35〜80塩基長である。
本発明のセンサは、例えば、前記一本鎖核酸分子を有する分子でもよいし、前記一本鎖核酸分子からなる分子でもよい。
本発明のセンサは、ヌクレオチド残基を含む分子であり、例えば、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。具体的に、前記センサは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むDNAでもよいし、リボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むRNAでもよいし、前者と後者とを含むキメラ(DNA/RNA)でもよい。前記センサは、好ましくは、DNAである。
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基(非人工塩基)および非天然塩基(人工塩基)のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、A、C、G、T、Uおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、2’−フルオロピリミジン、2’−O−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、2’−フルオロウラシル、2’−アミノウラシル、2’−O−メチルウラシル、2−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、2’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記ターゲット分析用センサは、例えば、PNA(ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
G−カルテット構造を有する触媒核酸には、例えば、ポルフィリンとの複合体を形成することで、より高い触媒活性を示すものがある。このため、本発明のセンサにおいて、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とのG−カルテット構造による触媒機能は、例えば、ポルフィリン存在下で検出することが好ましい。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、N−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
本発明のセンサは、例えば、遊離状態で使用してもよいし、固定化した状態で使用してもよい。後者の場合、例えば、前記センサを前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。前記基材は、例えば、プレート、シート、フィルム、スワブ等の基板;ウェルプレート、チューブ等の容器;ビーズ、粒子、フィルター等があげられる。前記センサは、例えば、5’末端および3’末端のいずれを固定化してもよい。
前記固定化方法は、特に制限されず、例えば、化学的結合による連結が例示できる。具体例としては、例えば、前記基材および前記センサのいずれか一方に、ストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、他方に、ビオチンを結合させ、前者と後者との結合を利用して固定化する方法があげられる。
前記固定化方法は、例えば、この他に、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許5,424,186号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法は、例えば、前記基材上で前記センサを合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許5,807,522号明細書、特表平10−503841号公報等を参照できる。
前記センサは、例えば、前記基材に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記センサの末端において、前記センサを前記基材に固定化することが好ましい。後者の場合、例えば、前記センサを、固定化用のリンカーを介して、前記基材に固定化してもよい。前記センサの前記基材への配置は、例えば、後述する本発明の分析用デバイスを参照できる。前記リンカーは、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよい。
本発明のセンサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のターゲットの分析方法に使用できる。
本発明の分析方法は、前述のように、ターゲットの分析方法であり、前記本発明のセンサに、試料を接触させる接触工程、および、前記センサにおける前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料、およびターゲットを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。被検体が、例えば、液体の場合、前記被検体をそのまま試料として使用してもよいし、溶媒に混合した希釈液を試料として使用してもよい。被検体が、例えば、固体、粉末等の場合は、溶媒に混合した混合液、または、溶媒に懸濁した懸濁液等を、試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記被検体は、例えば、生体、土壌、海水、川水、下水、飲食品、浄水、空気中等から採取した被検体があげられる。
本発明のセンサを遊離状態で使用する際は、例えば、前記容器内で、前記センサと前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明のセンサを前記基材に固定化した状態で使用する際は、例えば、前記基材上の前記センサに、前記試料を接触させることができる。
前記検出工程は、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との触媒機能により生成されるシグナルを検出することが好ましい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルおよび電気化学的シグナル等があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色シグナル、発光シグナル、蛍光シグナル等があげられる。
前記シグナルは、例えば、前記第1触媒領域(D1)の触媒機能により、基質から生成されることが好ましい。そこで、前記検出工程は、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との触媒機能に応じた基質の存在下で、行うことが好ましい。
前記基質は、例えば、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光が消失する生成物を生成する基質、また、前記触媒機能によって、異なる発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質等があげられる。このような基質によれば、例えば、発色、発光もしくは蛍光の有無、または、発色、発光もしくは蛍光の変化や強度等をシグナルとして、目視で確認することにより、前記触媒機能を検出できる。また、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等をシグナルとして、光学的な手法で測定することにより、前記触媒機能を検出することもできる。前記触媒機能は、例えば、前述のような酸化還元反応の触媒機能があげられる。
また、前記触媒機能が、前記酸化還元反応の触媒機能である場合、例えば、電子の授受が可能な基質があげられる。この場合、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とにより、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。
前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)、1,2-Phenylenediamine(OPD)、2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt(ABTS)、3,3’-Diaminobenzidine(DAB)、3,3’-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate(DAB4HCl)、3-Amino-9-ethylcarbazole(AEC)、4-Chloro-1-naphthol(4C1N)、2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid、2,4-Dichlorophenol、4-Aminoantipyrine、4-Aminoantipyrine Hydrochloride、ルミノール等があげられる。
前記検出工程において、前記基質は、例えば、前記センサに前記試料を接触させる前に、予め、前記センサに供給してもよいし、前記試料の接触と同時または前記試料を接触させた後、前記センサに供給してもよい。前記基質は、例えば、液体に混合した基質液として、前記センサに供給することが好ましい。前記基質を混合する液体は、例えば、Tris−HCl等の緩衝液が好ましい。前記基質液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、0.1〜5mmol/L、0.5〜2mmol/Lである。また、前記基質液のpHは、例えば、6〜9、6.8〜9である。
前記検出工程において、前記触媒領域(D)による反応条件は、特に制限されない。温度は、例えば、15〜37℃であり、時間は、例えば、10〜900秒である。
また、前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、ポルフィリンを共存させてもよい。公知のDNAzymeには、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することによって、さらに高い酸化還元活性を示すものがある。そこで、本発明においても、例えば、ポルフィリンを共存させて、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とポルフィリンとの複合体として、酸化還元活性を検出してもよい。前記ポルフィリンの供給は、特に制限されず、前記基質と同様に行うことができる。前記ポルフィリンは、前述の通りである。
本発明の分析方法において、前記接触工程と前記検出工程との間に、さらに、洗浄工程を有してもよい。前記洗浄工程は、例えば、前記センサと前記試料とを接触させた後、前記センサを洗浄液で洗浄する工程である。前記洗浄工程によって、例えば、前記試料中に含まれる夾雑物を除去でき、さらに精度に優れる分析が可能となる。前記洗浄液は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記センサは、例えば、前記洗浄工程が容易に行えることから、前述のような基材に固定化されていることが好ましい。
2.分析用デバイス
本発明の分析用デバイスは、ターゲットの分析用デバイスであり、基材、ターゲット分析用センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記センサおよび前記検出部が配置され、前記センサは、前記本発明のターゲット分析用センサであり、前記検出部は、前記センサにおける前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析用デバイスは、ターゲットの分析用デバイスであり、基材、ターゲット分析用センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記センサおよび前記検出部が配置され、前記センサは、前記本発明のターゲット分析用センサであり、前記検出部は、前記センサにおける前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
本発明の分析用デバイスは、前記本発明のターゲット分析用センサを使用することが特徴であって、その他の構成に関しては何ら制限されない。特に説明しない限り、本発明の分析用デバイスは、例えば、前記本発明のターゲット分析用センサの説明を援用できる。
本発明の分析用デバイスにおいて、前記センサの配置方法は、特に制限されない。前記分析用デバイスにおいて、前記センサは、例えば、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前記センサの配置に関しては、例えば、前記本発明のターゲット分析用センサの説明を援用できる。
前記基材における前記センサの配置部位は、特に制限されず、例えば、前記検出部に配置されている形態があげられる。
本発明の分析用デバイスは、例えば、さらに、試薬部を有してもよい。前記試薬部は、例えば、前記検出部に配置してもよい。前記試薬部は、例えば、予め試薬が配置されてもよいし、使用時に試薬を供給してもよい。前記試薬としては、例えば、前述のような基質、前記ポルフィリン等があげられる。
本発明の分析用デバイスにおいて、前記検出部は、前述のように、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とによる触媒機能を検出する検出部である。前記検出部は、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との触媒機能によって生成されるシグナルを検出する検出部であることが好ましい。前記シグナルは、前述のように、例えば、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との触媒機能による、基質からのシグナルがあげられる。前記シグナルは、例えば、前述のような、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられる。前記検出部は、例えば、外部から前記検出部において発生するシグナルが検出されることから、被検出部ということもできる。
前記シグナルが光学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、光学的シグナルの検出部であり、吸光度、反射率、蛍光強度等の検出部が例示できる。
前記シグナルが前記電気化学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、電極系を有する。この場合、前記検出部は、例えば、前記基材の表面に、前記電極系を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基材に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。
前記電極系は、例えば、作用極および対極を含んでもよいし、作用極、対極および参照極を含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀/塩化銀の電極があげられる。前記銀/塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。
本発明の分析用デバイスが、前記電極系を有する場合、前記センサは、例えば、前記電極系に配置すること好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。本発明の分析用デバイスが、前記電極系と前記試薬部とを有する場合、例えば、前記電極系の上に、前記試薬部を配置することが好ましい。
本発明の分析用デバイスは、例えば、複数の検出部を備えてもよい。この場合、前記分析用デバイスは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような検出部を備えることが好ましい。本発明の分析用デバイスにおいて、1つの検出部に配置するセンサの数は、特に制限されない。
前記基材は、特に制限されない。前記基材は、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基材は、例えば、絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する基材でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
本発明の分析用デバイスの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のターゲットの分析方法に使用できる。
本発明の分析方法は、前述のように、ターゲットの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)との触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
本発明の分析方法は、前記本発明のターゲット分析用センサを備える前記分析用デバイスを使用することが特徴であって、その他の条件は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、例えば、前記本発明のターゲット分析用センサにおける分析方法の説明を援用できる。
3.分析用試薬
本発明の分析用試薬は、前記本発明のターゲット分析用センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用試薬は、前記本発明のターゲット分析用センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用試薬は、前記センサの他に、例えば、前記基質、前記ポルフィリン、前記緩衝液、および/または前記基材等の構成成分を含んでもよい。
本発明の分析用試薬は、例えば、分析用キットでもよい。この場合、例えば、前記センサと、前述したその他の構成成分とを含み、それぞれ別個に収容されてもよい。前記センサは、例えば、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
(実施例1)
前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とについて、ステム領域を形成する前記式(I)の(N)n1および(N)m1を変化させたメラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とについて、ステム領域を形成する前記式(I)の(N)n1および(N)m1を変化させたメラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
(1)センサ
表3の各配列について、Wを、配列番号50で表される塩基配列W1としたセンサを作製した。内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2は、ACの2塩基長とAの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3は、GGGの3塩基長とGTGGの4塩基長に固定し、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、0−3塩基長に変化させた。W1において、下線部配列が、12塩基長のポリdTを有する、メラミンに対する結合領域(Ap)であり(以下、Mel06という)、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)とは、アライメントした状態で互いに非相補的な配列とした。
W1(配列番号50) 5’-aagaaCGCTTTTTTTTTTTTGCGaaaat-3’
表3の各配列について、Wを、配列番号50で表される塩基配列W1としたセンサを作製した。内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2は、ACの2塩基長とAの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3は、GGGの3塩基長とGTGGの4塩基長に固定し、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、0−3塩基長に変化させた。W1において、下線部配列が、12塩基長のポリdTを有する、メラミンに対する結合領域(Ap)であり(以下、Mel06という)、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)とは、アライメントした状態で互いに非相補的な配列とした。
W1(配列番号50) 5’-aagaaCGCTTTTTTTTTTTTGCGaaaat-3’
(2)化学発光分析
エッペンドルフチューブに、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、25℃で60秒反応させた後、前記反応液について、相対化学発光強度(RLU)を測定した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした(以下、同様)。測定は、測定装置(商品名TECAN infinite F200、TECAN社)を使用した。基質は、ルミノール誘導体であるL−012(和光純薬社)を使用した。
エッペンドルフチューブに、下記試薬1、試薬2および試薬3をこの順序で添加し、25℃で60秒反応させた後、前記反応液について、相対化学発光強度(RLU)を測定した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした(以下、同様)。測定は、測定装置(商品名TECAN infinite F200、TECAN社)を使用した。基質は、ルミノール誘導体であるL−012(和光純薬社)を使用した。
(試薬1)
400nmol/L 核酸センサ
200nmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
5mmol/L メラミン
(試薬3)
50μmol/L 基質
50μmol/L H2O2
400nmol/L 核酸センサ
200nmol/L ヘミン
50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)
20mmol/L KCl
0.05%(w/v) TritonX−100
(試薬2)
5mmol/L メラミン
(試薬3)
50μmol/L 基質
50μmol/L H2O2
蛍光強度の測定が正常に行われていることを示すポジティブコントロール(PC:DNAzyme)として、前記センサに代えて、前記DNAzymeであるneco0584(配列番号51)を使用し、同様に測定した。また、ネガティブコントロール(NC:w/o sensor)として、前記試薬1から前記センサを除いた以外は同様に調製したセンサ未添加の反応液についても、同様に測定した。PCおよびNCは、以下の実施例でも同様とした。
NECO 0584(配列番号51)
GGGTGGGAGGGTCGGG
NECO 0584(配列番号51)
GGGTGGGAGGGTCGGG
これらの結果を図3に示す。図3は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、S/N比を、表4に示す。表4において、配列名におけるHの数値は、結合領域(Ap)のポリdTの長さを示す(以下、同様)。図3に示すように、実施例のセンサを使用した結果、メラミン添加の発光強度が、メラミン無添加の発光強度に対して有意差を示し、さらに、表4に示すように、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)が、PC(DNAzyme)と比較して、非常に向上した。中でも、Mel06dsGs0006(配列番号5)、Mel06dsGs0034(配列番号9)、Mel06dsGs0036(配列番号12)、Mel06dsGs0008(配列番号14)、Mel06dsGs0033(配列番号17)は、優れたS/Nを示した。これらの結果から、実施例のセンサによれば、バックグランドを抑制した状態で、メラミンを検出できることがわかった。
(実施例2)
メラミンに対する結合領域(Ap)におけるポリdTの長さを30塩基長にした以外は、前記実施例1と同様に、メラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
メラミンに対する結合領域(Ap)におけるポリdTの長さを30塩基長にした以外は、前記実施例1と同様に、メラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
(1)センサ
実施例1の前記表3のうちS/Nが高いdsGs0006(配列番号5)、dsGs0034(配列番号9)、dsGs0036(配列番号12)、dsGs0008(配列番号14)、dsGs0033(配列番号17)について、Wを、配列番号52で表される塩基配列W2としたセンサを作製した。W2は、前記実施例1におけるW1について、ポリdTを30塩基長とした以外は、同じ配列であり、下線部配列が、30塩基長のポリTを有する、メラミンに対する結合領域(Ap、Mel06)であり、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。
W2(配列番号52)
5’-aagaaCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGaaaat-3’
実施例1の前記表3のうちS/Nが高いdsGs0006(配列番号5)、dsGs0034(配列番号9)、dsGs0036(配列番号12)、dsGs0008(配列番号14)、dsGs0033(配列番号17)について、Wを、配列番号52で表される塩基配列W2としたセンサを作製した。W2は、前記実施例1におけるW1について、ポリdTを30塩基長とした以外は、同じ配列であり、下線部配列が、30塩基長のポリTを有する、メラミンに対する結合領域(Ap、Mel06)であり、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。
W2(配列番号52)
5’-aagaaCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGaaaat-3’
(2)化学発光分析
前記センサを使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
前記センサを使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
これらの結果を図4に示す。図4は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、S/N比を、表5に示す。表5において、配列名におけるHの数値は、結合領域(Ap)のポリdTの長さを示す。図4に示すように、実施例のセンサを使用した結果、メラミン添加の発光強度が、メラミン無添加の発光強度に対して有意差を示し、さらに、表5に示すように、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)が、PC(DNAzyme)と比較して、非常に向上した。これらの結果から、実施例のセンサによれば、バックグランドを抑制した状態で、メラミンを検出できることがわかった。
(実施例3)
前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とについて、内部ループ領域を形成する前記式(I)の(N)n2および(N)m2ならびにG領域を形成する前記式(I)の(N)n3および(N)m3を変化させたメラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
前記第1触媒領域(D1)と前記第2触媒領域(D2)とについて、内部ループ領域を形成する前記式(I)の(N)n2および(N)m2ならびにG領域を形成する前記式(I)の(N)n3および(N)m3を変化させたメラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
(1)センサ
表6の各配列について、Wを、配列番号50で表される前記塩基配列W1としたセンサを作製した。ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、Aの1塩基長とTの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGG、GGAG、GCGGおよびGTGGの4種類の4塩基長とGGGの3塩基長に固定し、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、1または2塩基長に変化させた。
表6の各配列について、Wを、配列番号50で表される前記塩基配列W1としたセンサを作製した。ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、Aの1塩基長とTの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGG、GGAG、GCGGおよびGTGGの4種類の4塩基長とGGGの3塩基長に固定し、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、1または2塩基長に変化させた。
(2)化学発光分析
前記センサを使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
前記センサを使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
これらの結果を図5に示す。図5は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、S/N比を、表7に示す。表7において、配列名におけるHの数値は、結合領域(Ap)のポリdTの長さを示す。図5に示すように、実施例のセンサを使用した結果、メラミン添加の発光強度が、メラミン無添加の発光強度に対して有意差を示し、さらに、表7に示すように、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)が、PCと比較して、非常に向上した。中でも、Mel06dsGs0847(配列番号26)、Mel06dsGs0984(配列番号31)、Mel06dsGs0563(配列番号33)、Mel06dsGs0843(配列番号34)、Mel06dsGs0914(配列番号35)、Mel06dsGs1054(配列番号38)、Mel06dsGs0913(配列番号44)は、優れたS/Nを示した。これらの結果から、実施例のセンサによれば、バックグランドを抑制した状態で、メラミンを検出できることがわかった。
(実施例4)
メラミンに対する結合領域(Ap)におけるポリdTの長さを36塩基長にした以外は、前記実施例3と同様に、メラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
メラミンに対する結合領域(Ap)におけるポリdTの長さを36塩基長にした以外は、前記実施例3と同様に、メラミン分析用センサを作製し、メラミンの分析を行った。
(1)センサ
前記実施例1−3においてS/Nが高かったdsGs0847(配列番号26)、dsGs0006_Gm0847(配列番号49)、dsGs0006(配列番号5)について、Wを、以下の塩基配列W3としたセンサを作製した。W3は、前記実施例1におけるW1について、ポリdTを36塩基長とした以外は、同じ配列であり、下線部配列が、36塩基長のポリTを有する、メラミンに対する結合領域(Ap、Mel06)であり、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。また、Mel06dsGs0001(配列番号24)について、Wを、ポリdTが30塩基長である前記塩基配列W2としたセンサを作製した。
W3(配列番号54)
5’-aagaaCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGaaaat-3’
前記実施例1−3においてS/Nが高かったdsGs0847(配列番号26)、dsGs0006_Gm0847(配列番号49)、dsGs0006(配列番号5)について、Wを、以下の塩基配列W3としたセンサを作製した。W3は、前記実施例1におけるW1について、ポリdTを36塩基長とした以外は、同じ配列であり、下線部配列が、36塩基長のポリTを有する、メラミンに対する結合領域(Ap、Mel06)であり、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。また、Mel06dsGs0001(配列番号24)について、Wを、ポリdTが30塩基長である前記塩基配列W2としたセンサを作製した。
W3(配列番号54)
5’-aagaaCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGaaaat-3’
(2)化学発光分析
前記センサを使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。また、実施例2と同様に、前記センサN1Mel06I1A0D3C_CG-H30も使用した。
前記センサを使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。また、実施例2と同様に、前記センサN1Mel06I1A0D3C_CG-H30も使用した。
これらの結果を図6に示す。図6は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。また、S/N比を、表8に示す。表8において、配列名におけるHの数値は、結合領域(Ap)のポリdTの長さを示す。図6に示すように、実施例のセンサを使用した結果、メラミン添加の発光強度が、メラミン無添加の発光強度に対して有意差を示し、さらに、表8に示すように、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比(S/N)が、PC(DNAzyme)と比較して、非常に向上した。これらの結果から、実施例のセンサによれば、バックグランドを抑制した状態で、メラミンを検出できることがわかった。
(実施例5)
メラミン分析用センサを作製し、メラミンの検出感度を確認した。
メラミン分析用センサを作製し、メラミンの検出感度を確認した。
(1)センサ
Mel06dsGs0006(配列番号5)について、Wを、ポリdTが36塩基長である前記塩基配列W3としたメラミン分析用センサを作製した。
Mel06dsGs0006(配列番号5)について、Wを、ポリdTが36塩基長である前記塩基配列W3としたメラミン分析用センサを作製した。
(2)化学発光分析
反応液におけるメラミンの最終濃度を、0、3または5mmol/Lとした以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
反応液におけるメラミンの最終濃度を、0、3または5mmol/Lとした以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
これらの結果を図7に示す。図7は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。図7に示すように、実施例のセンサを使用した結果、3〜5mmol/Lのメラミン濃度について、十分な検出感度を示した。
(実施例6)
結合領域(Ap)をIgEに結合する結合核酸分子に変更したIgE分析用センサを作製し、IgEの分析を行った。
結合領域(Ap)をIgEに結合する結合核酸分子に変更したIgE分析用センサを作製し、IgEの分析を行った。
(1)センサ
実施例の前記表3におけるdsGs0001(配列番号24)について、Wを、下記表9の塩基配列としたセンサを作製した。表9の各配列において、大文字の配列は、IgEに対する結合領域(Ap)であり、下線部は、前記結合領域(Ap)のステム領域を示し、ステムの長さを8塩基長および7塩基長に設定した。また、表9の各配列において、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。
実施例の前記表3におけるdsGs0001(配列番号24)について、Wを、下記表9の塩基配列としたセンサを作製した。表9の各配列において、大文字の配列は、IgEに対する結合領域(Ap)であり、下線部は、前記結合領域(Ap)のステム領域を示し、ステムの長さを8塩基長および7塩基長に設定した。また、表9の各配列において、5’側の小文字配列が、第1リンカー領域(L1)であり、3’側の小文字配列が、第2リンカー領域(L2)である。
(2)化学発光分析
前記センサを使用し、前記試薬2として、メラミンに代えて、100nmmol/L IgE(商品名:Immunoglobulin E, Human Myeloma Plasma, Lambda、 Athens Research & Technology社製)を使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
前記センサを使用し、前記試薬2として、メラミンに代えて、100nmmol/L IgE(商品名:Immunoglobulin E, Human Myeloma Plasma, Lambda、 Athens Research & Technology社製)を使用した以外は、前記実施例1と同様にして化学発光分析を行った。
これらの結果を図8に示す。図8は、前記反応液の発光強度(RLU)を示すグラフである。図8に示すように、実施例のセンサを使用した結果、IgE添加の発光強度が、IgE無添加の発光強度に対して有意差を示し、IgE添加の発光強度とIgE未添加の発光強度との比(S/N)に優れる結果となった。これらの結果から、実施例のセンサによれば、バックグランドを抑制した状態で、IgEを検出できることがわかった。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
この出願は、2013年7月23日に出願された日本出願特願2013−152502を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明のターゲット分析用センサによれば、簡便且つ効率的に、優れたS/N比でターゲットを分析できる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
Claims (23)
- 一本鎖核酸分子を含み、
前記一本鎖核酸分子が、第1触媒核酸領域(D1)、第2触媒核酸領域(D2)、およびターゲットに結合する結合核酸領域(Ap)を含み、
前記結合核酸領域(Ap)の一方の末端側に前記第1触媒核酸領域(D1)を有し、
前記結合核酸領域(Ap)の他方の末端側に前記第2触媒核酸領域(D2)を有し、
ターゲット非存在下、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合核酸領域(Ap)への前記ターゲットの接触により、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とのG−カルテット形成による触媒機能が生起されることを特徴とするターゲット分析用センサ。 - 前記第1触媒核酸領域(D1)と前記結合核酸領域(Ap)との間、および、前記第2触媒核酸領域(D2)と前記結合核酸領域(Ap)との間が、それぞれ、直接的または間接的に連結している、請求項1記載のターゲット分析用センサ。
- 前記結合核酸領域(Ap)と前記第1触媒核酸領域(D1)との間、および、前記結合核酸領域(Ap)と前記第2触媒領域(D2)との間の少なくとも一方が、核酸リンカー領域で連結されている、請求項1または2記載のターゲット分析用センサ。
- 前記結合核酸領域(Ap)と前記第1触媒核酸領域(D1)との間が、第1核酸リンカー領域(L1)で連結され、前記結合核酸領域(Ap)と前記第2触媒領域(D2)との間が、第2核酸リンカー領域(L2)で連結され、前記第1核酸リンカー領域(L1)の5’末端側からの塩基配列と前記第2核酸リンカー領域(L2)の3’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的である、請求項3記載のターゲット分析用センサ。
- 前記核酸リンカー領域の長さが、1〜20塩基長である、請求項3または4記載のターゲット分析用センサ。
- 前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とが、それぞれ、前記結合核酸領域(Ap)の位置とは反対側の末端に、互いに相補的な配列を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサ。
- 前記一本鎖核酸分子が、下記式(I)で表され、式(I)中、5’側の配列(N)n1-GGG-(N)n2-(N)n3-が、前記第1触媒核酸領域(D1)の配列(d1)であり、3’側の配列-(N)m3-(N)m2-GGG-(N)m1が、前記第2触媒核酸領域(D2)の配列(d2)であり、Wが、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)との間の領域であって、前記結合核酸領域(Ap)を含み、Nは、塩基を示し、n1、n2およびn3ならびにm1、m2およびm3は、それぞれ塩基Nの繰り返し個数を示し、(N)n1と(N)m1が、下記条件(1)を満たし、(N)n2と(N)m2が、下記条件(2)を満たし、(N)n3と(N)m3が、下記条件(3)を満たす、請求項1から6のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサ。
(N)n1および(N)m1は、(N)n1の5’末端側からの塩基配列と(N)m1の3’末端側からの塩基配列とが、互いに相補的であり、n1およびm1は、同じ0または正の整数である。
条件(2)
(N)n2および(N)m2は、(N)n2の5’末端側からの塩基配列と(N)m2の3’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的であり、n2およびm2は、それぞれ、正の整数であり、同じでも異なってもよい。
条件(3)
(N)n3および(N)m3は、n3およびm3が、それぞれ、3または4であり、同じでも異なってもよく、3つの塩基Gを有し、n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。 - 前記条件(1)において、n1およびm1が、それぞれ、1、2または3である、請求項7記載のターゲット分析用センサ。
- 前記条件(2)において、n1およびm1が、それぞれ、1または2であり、同じでも異なってもよい、請求項7または8記載のターゲット分析用センサ。
- 前記条件(3)が、下記条件(3−1)、(3−2)または(3−3)である、請求項7から9のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサ。
条件(3−1)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGHGGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−2)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGGHGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−3)
(N)n3および(N)m3の両方の配列がGGGである。 - 前記条件(3)において、Hが、塩基A、C、TまたはUである、請求項7から10のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサ。
- 前記第1触媒核酸領域(D1)の配列(d1)と前記第2触媒核酸領域(D2)の配列(d2)とが、下記1〜49からなる群から選択された少なくとも一つの組み合わせであり、下記組み合わせにおいて、Wは、前記一本鎖核酸分子における前記配列(d1)および前記配列(d2)との間の領域を意味する、請求項1から11のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサ。
- 前記結合核酸配列(Ap)の長さが、8〜120塩基長である、請求項1から12のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサ。
- 基材、ターゲット分析用センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記センサおよび前記検出部が配置され、前記センサは、請求項1から13のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサであり、前記検出部は、前記センサにおける前記第1触媒機能領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能を検出する検出部であることを特徴とするターゲット分析用デバイス。
- 前記ターゲット分析用センサが、リンカーを介して、前記基材に連結されている、請求項14記載の分析用デバイス。
- 前記ターゲット分析用センサが、前記検出部に配置されている、請求項14または15記載の分析用デバイス。
- 前記検出部は、前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部である、請求項14から16のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
- 前記シグナルが、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルである、請求項17記載の分析用デバイス。
- さらに、試薬部を有し、前記試薬部が、前記触媒核酸領域(D)の触媒機能に対する基質を含む、請求項14から18のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサを含むことを特徴とするターゲットの分析用試薬。
- さらに、前記ターゲット分析用センサにおける前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能に対する基質を含む、請求項20記載の分析用試薬。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載のターゲット分析用センサに試料を接触させる接触工程、および、前記ターゲット分析用センサにおける前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。
- 前記ターゲット分析用センサにおける前記第1触媒核酸領域(D1)と前記第2触媒核酸領域(D2)とによる触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項22記載の分析方法。
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