JP5596903B2 - インスリン結合性アプタマー - Google Patents
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Description
1.方法
(1) Gカルテットライブラリーの設計
30merのランダムな塩基配列の両端に18merのPCRプライマー結合領域を付加した、6種類の一本鎖DNA(ssDNA)(配列番号5〜10)を常法により合成した。ssDNAがGカルテット型構造をとり得るように、30merのランダムな塩基配列には、特定の4箇所にGを含ませた。すなわち、4箇所のG領域の間は2〜3塩基としてループ部分に2〜3個の塩基が含まれるようにし、各4箇所のGは2〜4個としてGテトラ平面を2〜4つ持つようにした。スクリーニングには、これら6種類のssDNAを混合したGカルテットライブラリーを用いた(図1)。
(i) インスリンに結合するssDNAの抽出
<1、2ラウンド目>
片面4.6 μg/4 μlのインスリンをPES膜の両面に滴下し、自然乾燥させることにより固定化した後、PBST(6 mM NaH2PO4、14 mM Na2HPO4、150 mM NaCl、0.05 % Tween20、pH7.3)を用いて10分間、3回洗浄した。官能基を不活性化させるため15 ml のTris-HCl 1 mM、pH 8.0中で1時間振とうし、15 mlのTrisT(10 mM Tris-HCl、100 mM KCl、0.05 % Tween20、pH 7.4)で10分間、3回洗浄した。GカルテットランダムライブラリーをTrisバッファー(10 mM Tris-HCl、100 mM KCl、pH 7.4)で5 μMに調製し、95℃で3分間熱処理後、30分かけて温度を25℃まで下げていくことで、フォールディングさせた。終濃度500 nM になるように調製したssDNA溶液とタンパク質を固定化したPES膜を1時間インキュベートした後、TrisTで10分間、3回洗浄した。洗浄後、膜のタンパク質を固定化した部分(直径6 mm程度の円)を切り抜き、222 μlの7M尿素および666 μlのフェノールクロロホルムを添加し、3分間攪拌した後に、30分間室温で静置した。ここへ超純水 111 μlを加え、3分間攪拌し、遠心分離(12000 rpm, 10〜20℃)して得られた上清を新しいエッペンに移した。ここへ上清と同量のクロロホルムを加え、3分間攪拌した後に、遠心分離(12000 rpm, 10〜20℃)し、上清を新しいエッペンに移し、この中に含まれるssDNA分子をエタノール沈殿により回収した後に得られたペレットを30 μlのTE buffer(10 mM Tris、1 mM EDTA)で溶解した。
片面4.6 μg/4 μlのインスリンをPES膜の両面に滴下し、自然乾燥させることにより固定化した後、PBS(6 mM NaH2PO4、14 mM Na2HPO4、150 mM NaCl、pH7.3)を用いて3分間、2回洗浄した。0.5 % スキムミルクを含むPBSTで1時間ブロッキングし、PBSTで3分間、3回洗浄した。官能基を不活性化させるため15 ml のTris-HCl 1mM、 pH 8.0中で1時間振とうし、5 mlのTrisTで5分間、3回洗浄した。GカルテットランダムライブラリーをTrisバッファーで500 nMに調製し、95℃で3分間熱処理後、30分かけて温度を25℃まで下げていくことで、フォールディングさせた。終濃度50 nM になるように調製したssDNA溶液とタンパク質を固定化したPES膜を1時間インキュベートした後、TrisTで5分間、3回洗浄した。洗浄後、膜のタンパク質を固定化した部分(直径6 mm程度の円)を切り抜き、222 μlの7M尿素および666 μlのフェノールクロロホルムを添加し、3分間攪拌した後に、30分間室温で静置した。ここへ超純水111 μlを加え、3分間攪拌し、遠心分離(12000 rpm, 10〜20℃)して得られた上清を新しいエッペンに移した。ここへ上清と同量のクロロホルムを加え、3分間攪拌した後に、遠心分離(12000 rpm, 10〜20℃)し、上清を新しいエッペンに移し、この中に含まれるssDNA分子をエタノール沈殿により回収した後に得られたペレットを30 μlのTEバッファー (10 mM Tris、1 mM EDTA)で溶解した。
20 pmol のdNTP、0.1 nmolのプライマー、2.5 Uの Taq DNAポリメラーゼ、60 fmolのテンプレートDNAを含んだPCR反応液100 μlを30本調製した。プライマーとしては、ライブラリーssDNAの5'側のプライマー結合領域(配列番号5〜10における1nt〜18nt)にハイブリダイズする、該1nt〜18ntの領域と同一の塩基配列からなる18塩基のプライマー、及び3'側のプライマー結合領域(配列番号5〜10における49nt〜66nt)にハイブリダイズする、該49nt〜66ntの領域と相補的な塩基配列からなる18塩基のプライマーを用いた。サーマルサイクラーで、95℃で30分加熱した後、95℃で1分、52℃で1分、72℃で1分を1サイクルとし、30サイクル繰り返した。各PCR産物は、2.5 %アガロース21ゲルを用いてTAEバッファー (40 mM Tris-酢酸、 1 mM EDTA)中で電気泳動を行いテンプレートとなるDNAが増幅されていることを確認した。確認の際は、20 bpラダーを電気泳動用のマーカーとした。
アビジン固定化アガロース75 μlを5倍量のカラムバッファー (30 mM HEPES、500 mM NaCl、5 mM EDTA、pH7.0)で2回洗浄した。PCR産物に、その1/10倍量の×50 TE Bufferおよび1/5倍量の5 M NaClを添加した溶液を、洗浄したアビジン固定化アガロースビーズに加え、30分インキュベートした。インキュベート後、上清を取り除き、ビーズを5倍量のカラムバッファーで2回洗浄した後、ビーズの1.5倍量の0.15 M NaOHを加えて10分間攪拌し、上清を回収した後、再びビーズに同量の0.15 M NaOHを加えて10分間攪拌し、ssDNAを溶出させ上清を回収した。ssDNAを含む上清を2 M HClで中和し、エタノール沈殿によりssDNAを回収した。得られたペレットを30 μlのTEバッファーで溶解し、分光光度計を用いて260 nmの吸収を測定することで、DNA濃度を算出した。なお、操作はすべて室温で行った。
スクリーニングの結果、4ラウンド目から、インスリンが固定化された部分にssDNAの結合を示すスポットが観察され、インスリンに結合するDNAが濃縮されていることがわかった。そこで、6ラウンド目のスクリーニングで得られたライブラリーの塩基配列を解析した結果、18本中16本が同一の塩基配列を有しており、配列の収束が確認された。得られた塩基配列を表1に示す。なお、表1中には、プライマー結合領域を除いたランダム領域に相当する領域の配列のみを示す。
本願発明者らは、これまでに、トロンビン阻害DNAアプタマーにタ−ゲット結合するDNAアプタマーを挿入し、トロンビンの酵素活性を指標に標的分子を検出するセンサー素子Aptameric Enzyme Subunit(AES)を開発している(特許文献1)。そこで上記実施例1で得られたアプタマーを用いてAESを構築し、インスリンの測定を試みた。
トロンビンに結合しその活性を阻害する能力を有するトロンビン制御アプタマー(配列番号11)の3'側のTTループ部位(配列番号11中の20nt-21nt間)でアプタマーを2つに分割した。分割部位の一方にはリンカー(tt)を介してインスリンアプタマーIGA3を付加した(3'トロンビン-IGA3アプタマー)。もう一方の分割部位には、IGA3の3'末端側の一部領域との相補的塩基配列をリンカー(ta)を介して付加した(5'トロンビン-IGA3アプタマー)。相補的塩基配列の鎖長としては、10mer、11mer、12merの3通りを検討した。これら2つのポリヌクレオチドから成るインスリン測定用AESの測定スキームを図3に示す。3'トロンビン-IGA3アプタマーと5'トロンビン-IGA3アプタマーがハイブリダイズしている状態では、分割されたトロンビン制御アプタマーがGカルテット構造を形成し、このトロンビン制御アプタマー部位に結合するトロンビンの活性が阻害される。しかし、インスリン存在下では、インスリンがIGA3部位に結合してIGA3が高次構造を形成し、3'トロンビン-IGA3アプタマーと5'トロンビン-IGA3アプタマーが解離する。これにより、トロンビン制御アプタマー部位のGカルテット構造が崩壊し、ここに結合していたトロンビンが解離するため、阻害されていたトロンビン活性が回復する。すなわち、このAESによる測定系は、インスリンの存在によりトロンビン制御アプタマーのトロンビン阻害能が減少し、トロンビン活性が上昇する系である。
トロンビンの酵素活性は、フィブリノーゲン溶液が固まる時間を指標として測定した。フィブリノーゲンは測定バッファー(50 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 pH 8.0)を用い2 mg / mlになるように調整した。上記3'トロンビン-IGA3アプタマー及び5'トロンビン-IGA3アプタマー(終濃度各500 nM)は、フォールディングバッファー(50 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2 pH 8.0)を用い、95℃に加熱させた後、30分かけてゆっくり25℃まで冷却することでフォールディングさせた。トロンビン(10μl、終濃度54 nM)、アプタマー(50μl、終濃度各500 nM)、測定バッファーに溶解したインスリン(40μl)混合溶液とフィブリノーゲン溶液100μlを別々に、37℃で5分間インキュベートした後に、フィブリノーゲン溶液に以下のいずれかを加え、37℃において溶液が固まる時間を測定した。
(1) トロンビンのみ
(2) トロンビン+5'トロンビン-IGA3アプタマー
(3) トロンビン+3'トロンビン-IGA3アプタマー
(4) トロンビン+5'トロンビン-IGA3アプタマー+3'トロンビン-IGA3アプタマー
(5) トロンビン+5'トロンビン-IGA3アプタマー+3'トロンビン-IGA3アプタマー+インスリン
(6) トロンビン+31merトロンビンアプタマー(配列番号11)
(7) トロンビン+31merトロンビンアプタマー(配列番号11)+インスリン
相補的塩基配列の鎖長が11merであるAESによる結果を図4に示す。3'トロンビン-IGA3アプタマー(配列番号12)又は5'トロンビン-IGA3アプタマー(配列番号13)単独ではトロンビンの活性が阻害されないのに対し(図4中の(2)、(3))、5'トロンビン-IGA3アプタマーと3'トロンビン-IGA3アプタマーの両者を加えると凝固時間が顕著に遅延し、トロンビン活性の阻害が確認された(図4中(4))。系内にさらにインスリンが加わると、インスリン非存在下よりも凝固時間が短くなり(図4中(5))、5'トロンビン-IGA3アプタマー及び3'トロンビン-IGA3アプタマーの混合アプタマーによるトロンビン活性阻害能の低下が認められた。なお、相補的塩基配列の鎖長が10mer又は12merであるAESにおいても、11merの場合と同様に、インスリン存在下でトロンビン活性阻害能の低下が認められた。
Claims (12)
- 配列表の配列番号1又は2に示される塩基配列中の少なくとも7nt〜23ntの領域を含み、サイズが100mer以下であるポリヌクレオチドから成る、インスリン結合性アプタマー。
- 配列表の配列番号1に示される塩基配列中の少なくとも3nt〜27ntの領域又は配列番号2に示される塩基配列中の少なくとも3nt〜28ntの領域を含む請求項1記載のインスリン結合性アプタマー。
- 配列表の配列番号1に示される塩基配列中の少なくとも2nt〜28ntの領域又は配列番号2に示される塩基配列中の少なくとも2nt〜29ntの領域を含む請求項2記載のインスリン結合性アプタマー。
- 配列表の配列番号1又は2に示される塩基配列を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載のインスリン結合性アプタマー。
- 前記サイズが66mer以下である請求項1ないし4のいずれか1項に記載のインスリン結合性アプタマー。
- 配列表の配列番号1又は2に示される塩基配列を有する請求項5記載のインスリン結合性アプタマー。
- 請求項1ないし6のいずれか1項に記載のインスリン結合性アプタマーを含むインスリン認識アプタマー部位と、酵素と結合し該酵素の活性を変化させる能力を有する酵素制御アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、インスリンが前記インスリン認識アプタマー部位に結合することにより、前記酵素制御アプタマー部位が前記酵素の活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチドであって、1分子から成る酵素制御アプタマーのループ構造内のいずれかの部位で分断して得られる断片をそれぞれ含む2分子のポリヌクレオチド鎖から成り、一方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には前記インスリン結合性アプタマーがリンカーを介して又は介さずに連結され、他方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には該インスリン結合性アプタマー中の少なくとも一部と相補的な領域がリンカーを介して又は介さずに連結され、2分子のポリヌクレオチド鎖の分子内及び/又は分子間の塩基対形成により前記酵素制御アプタマー部位の立体構造が形成されるポリヌクレオチド。
- 前記酵素がトロンビンである請求項6又は7記載のポリヌクレオチド。
- 前記酵素制御アプタマー部位は、配列表の配列番号11に示される塩基配列中の11nt〜12ntの領域、15nt〜17ntの領域、又は20nt〜21ntの領域で形成されるループ構造内のいずれかの部位で該塩基配列を分断して得られる2つの断片を含んで成る請求項8記載のポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号12に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド鎖と、配列番号13に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド鎖とから成る請求項9記載のポリヌクレオチド。
- 請求項6ないし10のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの前記酵素制御アプタマー部位に結合した酵素とを含む、インスリン測定試薬。
- 請求項11記載のインスリン測定試薬を、インスリンを含み得る検体と接触させる工程と、前記酵素制御アプタマー部位に結合した前記酵素の酵素活性の変化を測定する工程と、該変化を指標として該検体中のインスリンを測定する工程とを含む、インスリンの測定方法。
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