WO2019216458A1 - 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2019216458A1
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insulin receptor
aptamer
insulin
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김윤동
이조운이
최솔잎
임소령
류성호
윤나오
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    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Definitions

  • the present invention relates to a DNA aptamer that specifically binds to an insulin receptor, a pharmaceutical composition for treating diabetes and a diagnostic composition comprising the same.
  • Insulin is a blood glucose control hormone secreted by the human pancreas. It transfers excess glucose in the blood to the cells to supply cells with energy and maintains blood sugar at normal levels.
  • insulin may not function normally due to the lack of insulin or insulin resistance and the loss of beta cell function.
  • diabetics cannot use glucose in the blood as an energy source and have high glucose levels in the blood, resulting in the discharge of glucose into the urine, which causes various complications. Therefore, diabetic patients with abnormal insulin production (Type I) or insulin resistance (Type II) need insulin treatment, and insulin administration can control blood glucose to normal levels.
  • insulin induces cell division in addition to glucose uptake, and changes in amino acid sequence introduced in some insulin derivatives may bind to IGF-1 receptor. And increase activation. Therefore, long-term insulin administration for the treatment of diabetes can increase the incidence of cancer, and concerns about the side effects caused by insulin such as atherosclerosis have been continuously raised.
  • Several epidemiological studies have also reported a significant correlation between sustained insulin administration and increased cancer incidence. Thus, the development of biased agonists for insulin receptors that increase glucose uptake only without inducing cell division may be a good alternative to insulin administration.
  • Aptamers are single-stranded nucleotides, such as DNA and RNA, which have stable tertiary structures and which are capable of binding to target molecules with high affinity and specificity. Since 1990, many aptamers have been discovered that can bind to a variety of target molecules, including small molecule organics, peptides and membrane proteins. Aptamers have the property of selectively binding to target molecules with high binding force and specificity, and thus can be used for discriminating specific substances.
  • aptamers have the potential to act as functional agonists by mimicking specific protein-protein bonds.
  • Agonist aptamers to activate the target function is currently a difficult problem.
  • the present inventors have tried to develop a therapeutic agent for diabetes with reduced side effects, and thus develop an aptamer that induces selective phosphorylation of the insulin receptor and activates only signaling associated with glucose absorption, and develops a pharmaceutical composition for treating diabetes comprising the same.
  • the present invention has been completed.
  • One object of the present invention is to provide an insulin receptor aptamer comprising the nucleotide sequence of the following general formula (1).
  • R1 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • R2 is guanine nucleotide (G) or empty
  • R3 is thymine nucleotide (T) or uracil nucleotide (U);
  • R4 is naphthyl-uracil nucleotide (P) or benzyl-uracil nucleotide (Z);
  • R5 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • R6 is guanine nucleotide (G) or adenine nucleotide (A);
  • R7 is adenine nucleotide (A) or empty
  • R8 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • R9 is cytosine nucleotide (C) or adenine nucleotide (A);
  • R10 is naphthyl-uracil nucleotide (P) or benzyl-uracil nucleotide (Z);
  • R11 is adenine nucleotide (A) or naphthyl-uracil nucleotide (P);
  • R12 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • the empty is one in which nucleotides have been removed or a linker.
  • Another object of the present invention is to provide an insulin receptor agonist comprising said insulin receptor aptamer.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating insulin-related diseases, including the insulin receptor aptamer as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing or treating insulin-related diseases comprising administering the pharmaceutical composition to a subject other than a human.
  • Yet another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing diabetes or diabetic complications comprising the insulin receptor aptamer as an active ingredient.
  • Insulin receptor aptamer of the present invention is a bar for activating insulin receptor lower signaling than insulin or a conventional insulin receptor aptamer used for the treatment of insulin-related diseases, such as diabetes mellitus, composition for preventing or treating insulin-related diseases It can be used effectively.
  • b is a diagram showing the sequence of the library for A48m construction.
  • FIG. 2 shows the binding affinity test results of each round pool using RI labels.
  • 3 is a diagram showing the ratio of the sequence of each round as the round progresses
  • b is a diagram showing the state of each round of the 12 candidate sequences.
  • Fig. 5 shows the ITT assay results of A48m aptamer, insulin and Humulin.
  • Figure 6a is a diagram showing the insulin receptor phosphorylation activity of A48m combi 1
  • b to d shows the insulin receptor phosphorylation activity of A48m combi 2 to 5
  • Figures e and f shows the insulin receptor phosphorylation activity of A48m combi 3 '. It is a figure which shows.
  • FIG. 7 is a diagram showing the serum stability of A48m combi 2 to 5.
  • FIG. 8 shows insulin receptor selective phosphorylation activity of A48m combi 3 to 5.
  • FIG. 9 is a diagram showing the phosphorylation activity of the "k-long insulin sub-signaling stage" of A48m combi 3 in differentiated 3T3-L1 cells.
  • Fig. 10 shows the in vivo blood glucose reduction effect of A48m combi 3 aptamer.
  • FIG. 11 is a diagram showing the in vitro glucose absorption effect of A48m combi 3 aptamer.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of inhibiting lipolysis of A48m combi 3 aptamer.
  • an insulin receptor aptamer comprising the nucleotide sequence of the following general formula (1).
  • R1 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • R2 is guanine nucleotide (G) or empty
  • R3 is thymine nucleotide (T) or uracil nucleotide (U);
  • R4 is naphthyl-uracil nucleotide (P) or benzyl-uracil nucleotide (Z);
  • R5 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • R6 is guanine nucleotide (G) or adenine nucleotide (A);
  • R7 is adenine nucleotide (A) or empty
  • R8 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • R9 is cytosine nucleotide (C) or adenine nucleotide (A);
  • R10 is naphthyl-uracil nucleotide (P) or benzyl-uracil nucleotide (Z);
  • R11 is adenine nucleotide (A) or naphthyl-uracil nucleotide (P);
  • R12 is cytosine nucleotide (C) or empty
  • the empty is one in which nucleotides have been removed or a linker.
  • insulin receptor aptamer refers to an aptamer capable of binding to insulin specific affinity.
  • the insulin receptor may be derived from human insulin receptor protein, but is not limited thereto.
  • aptamers are short single-stranded oligonucleotides capable of specifically recognizing the target material with high affinity, and may form a three-dimensional structure capable of binding to the target material with high affinity and specificity.
  • the aptamer not only specifically binds to the target protein but also effectively inhibits its function, and thus can be used to determine the function of the target protein.
  • the insulin receptor aptamer is characterized in that it specifically binds to the insulin receptor, the aptamer may be composed of 25 to 90, specifically 27 to 80, more specifically 27 to 50 nucleotides, but is not limited thereto. no.
  • the binding capacity to the insulin receptor phosphorylation activity of the insulin receptor and serum To improve the stability.
  • the base of a specific site of the nucleotide sequence of the present invention is replaced with another kind of base; Removing the base portion of the specific site and mutating the pentose site with a linker or spacer;
  • the present invention was completed by confirming that in addition to nucleotides, chemical modifications resulted in superior binding ability to insulin receptors, phosphorylation activity of insulin receptors, and serum stability.
  • the nucleotide sequence replaces the 12th nucleotide with cytosine nucleotide (C), the 17th nucleotide with guanine nucleotide (G), and the 22nd nucleotide with adenine nucleotide (A ).
  • the 28th nucleotide was replaced with naphthyl-uracil nucleotide (P), the 33rd nucleotide was removed, and naphthyl-uracil nucleotide (P) was added between the 12th and 13th nucleotides,
  • the sequence of the new insulin receptor aptamer (A48m, SEQ ID NO: 6) was derived, and the first, second, twelfth, And the 33rd nucleotide is substituted with a linker or spacer and the 10th nucleotide is substituted with benzy
  • one or more of the third, fourth, fifth, fourteenth, sixteenth, nineteenth, 21st, 23rd, 27th, 30th, 31st, and 32nd nucleotides of the nucleotide sequence of the modified aptamer can further improve the effect of the insulin receptor aptamer.
  • Insulin receptor aptamer of the present invention comprises a nucleotide sequence of the general formula (1).
  • Formula 1 may be represented by SEQ ID NO: 11.
  • Formula 1 may be composed of adenine nucleotide (A), thymine nucleotide (T), guanine nucleotide (G), cytosine nucleotide (C) and uracil nucleotide (U), and the position 5 of uracil is substituted with a hydrophobic functional group.
  • A adenine nucleotide
  • T thymine nucleotide
  • G guanine nucleotide
  • C cytosine nucleotide
  • U uracil nucleotide
  • nucleotides comprising modified bases.
  • the hydrophobic functional group may include naphthyl group, benzyl group, pyrrolebenzyl group, isobutyl group, or tryptophan, and specifically, the present invention may include naphthyl group or benzyl group, but is not limited thereto.
  • the modified uracil substituted with the naphthyl group is called naphthyl-uracil and is represented by P in the general formula (1).
  • the modified uracil substituted with the benzyl group is called benzyl-uracil and is represented by Z in the general formula (1).
  • the naphthyl group is represented by Formula 1 below, and the benzyl group is represented by Formula 2.
  • insulin receptor aptamer of the present invention may be one or more of the nucleotide sequence of the general formula (1) is empty.
  • empty may mean that the nucleotide is removed or a linker.
  • the removal of nucleotides may mean that not only the base and the pentose sugar of the nucleotides, but also the phosphate backbone are removed, thereby removing the nucleotides themselves.
  • the linker is a nucleotide is substituted with a linker, the nucleoside including the base or base and pentose sugar of the nucleotide is removed, but the phosphate backbone remains but the empty space remains It may mean, and the nucleotides next to the empty space may mean a state connected to maintain a constant constant original, but is not limited thereto.
  • the linker of the present invention can be used interchangeably with 'spacer'.
  • the linker or spacer may consist of three carbons, but is not limited thereto, as long as it can maintain a constant distance between nucleotides.
  • the linker or spacer of the present invention may be a linker or spacer composed of three carbons, which may be referred to as a C3 linker, or a C3 spacer.
  • the C3 linker or spacer may be included in the 5'-terminal, 3'-terminal, intermediate or both ends of the insulin receptor aptamer of the present invention, specifically, may be included in the middle, but is not limited thereto.
  • the structure in which the C3 linker is linked to the 5'-end (Formula 3), 3'-end (Formula 4), and the middle (Formula 5) of the nucleotide sequence is shown in the following formula.
  • any one or more of R1, R2, R5, R7, R8, and R12 of Formula 1 may be a C3-linker, any one or more of R1, R2, and R12 may be a nucleotide is removed, Any one or more of R5, R7 and R8 may be a C3-linker, but is not limited thereto.
  • the insulin receptor aptamer of the present invention may be an aptamer comprising a nucleotide sequence in which the 12th nucleotide of Formula 1 is cytosine nucleotide (C) and the 18th nucleotide is guanine nucleotide (G); 12th nucleotide of Formula 1 is cytosine nucleotide (C), 15th nucleotide is adenine nucleotide (A), 18th nucleotide is guanine nucleotide (G), 29th nucleotide is adenine nucleotide (A) and 33rd nucleotide is removed It may be an aptamer comprising a sequence; Alternatively, 12th nucleotide of Formula 1 may be cytosine nucleotide (C), 18th nucleotide is guanine nucleotide (G), 23rd nucleotide is adenine nucleotide (A), and 29
  • R6 of Formula 1 is a guanine nucleotide (G)
  • R9 is an adenine nucleotide (A)
  • R11 is a naphthyl-uracil nucleotide (P)
  • R12 is a cytosine nucleotide (C).
  • G guanine nucleotide
  • R9 is an adenine nucleotide
  • A is a naphthyl-uracil nucleotide
  • R12 is a cytosine nucleotide
  • It may be an aptamer including, and specifically, it may be an A48m aptamer, but is not limited thereto.
  • the aptamer including the nucleotide sequence may be an aptamer having improved binding to the insulin receptor than the conventional A48 aptamer, and also has a better aptamer than the A48 seq 1-3 or A48 seq 1-4. Can be.
  • the insulin receptor aptamer of the present invention may be an aptamer including a nucleotide sequence in which one or more of R1, R2, R5, R7, R8, and R12 of Formula 1 is empty, and specifically R1, R2, R5 and R12 may be an empty nucleotide sequence, or the nucleotides of R1, R2, and R12 may be removed, but are not limited thereto.
  • the aptamer may have better insulin receptor phosphorylation activity than A48m, and in particular, may be an aptamer excellent in phosphorylation activity of the Y1150 region of the insulin receptor.
  • the aptamer may be specifically called A48m combi 2, 3, 4, or 5 in the present invention, but is not limited thereto.
  • the insulin receptor aptamer of the present invention may be an aptamer comprising a nucleotide sequence in which one or more of R7 and R8 of Formula 1 is empty, and specifically, R7 and R8 may be empty; R7 may be adenine nucleotide (A) and R8 may be cytosine nucleotide (C); Or R7 is empty, and R8 may be cytosine nucleotide (C), but is not limited thereto.
  • the insulin receptor aptamer of the present invention may be an aptamer including a nucleotide sequence in which R4 in Formula 1 is benzyl-uracil nucleotide (Z), and / or R10 is naphthyl-uracil nucleotide (P).
  • the aptamer wherein R4 is benzyl-uracil nucleotide (Z) may be an aptamer having better insulin receptor phosphorylation activity than A48m, in particular, an aptamer having a superior phosphorylation activity at the Y1150 region of the insulin receptor and having improved serum stability.
  • the aptamer may be specifically A48m combi 2, 3, 4, or 5, but is not limited thereto.
  • the aptamer may be an aptamer including a nucleotide sequence in which R3 of Formula 1 is thymine nucleotide (T) or uracil nucleotide (U).
  • R3 of Formula 1 is thymine nucleotide (T) or uracil nucleotide (U).
  • the thymine or uracil nucleotide is a base which is distinguished according to the presence or absence of the methyl group of carbon 5, and is generally known to exist in the form of thymine in DNA and uracil in RNA.
  • the insulin receptor phosphorylation activity of the aptamer wherein R3 of Formula 1 is thymine nucleotide (T) or uracil nucleotide (U) (Example 3-1), was general in the aptamer of the present invention.
  • R 3 in Formula 1 may be mutually substituted with thymine nucleotide (T) and uracil nucleotide (U).
  • the aptamer wherein R 10 is naphthyl-uracil nucleotide (P) may be an aptamer having better insulin receptor phosphorylation activity and serum stability than A48m combi 2, and the aptamer may be specifically A48m combi 3, 4, or 5 However, it is not limited thereto.
  • the aptamer may also be a compound of formula 1 wherein both R4 and R10 are naphthyl-uracil nucleotides (P) or benzyl-uracil nucleotides (Z); Or may be an aptamer comprising a nucleotide sequence wherein R 4 is benzyl-uracil nucleotide (Z) and R 10 is naphthyl-uracil nucleotide (P).
  • the insulin receptor aptamer of the present invention is A48m (SEQ ID NO: 6), A48m combi 2 (SEQ ID NO: 7), A48m combi 3 (SEQ ID NO: 8), A48m combi 4 (SEQ ID NO: 9) or A48m combi 5 (SEQ ID NO: 10) It may be, but is not limited to, an aptamer comprising a nucleotide sequence.
  • the A48m aptamer is the 12th nucleotide of the general formula 1 cytosine nucleotide (C), the 18th nucleotide guanine nucleotide (G), the 23rd nucleotide adenine nucleotide (A) and the 29th nucleotide naphthyl-uracil nucleotide (P It may be an aptamer including a nucleotide sequence of), specifically, an aptamer comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the first nucleotide of Formula 1 is empty, the second nucleotide is empty, the 10th nucleotide is benzyl-uracil nucleotide (Z), the 12th nucleotide is empty, the 16th nucleotide is empty , The 17th nucleotide is empty, the 28th nucleotide is benzyl-uracil nucleotide (Z), the 33rd nucleotide may be an aptamer comprising an empty nucleotide sequence, specifically an aptamer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 Can be.
  • the first nucleotide of Formula 1 is empty, the second nucleotide is empty, the 10th nucleotide is benzyl-uracil nucleotide (Z), the 12th nucleotide is empty, and the 33rd nucleotide is empty.
  • It may be an aptamer including a nucleotide sequence, and specifically, an aptamer including a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the first nucleotide of Formula 1 is empty, the second nucleotide is empty, the 10th nucleotide is benzyl-uracil nucleotide (Z), the 12th nucleotide is empty, the 16th nucleotide is empty
  • the 33rd nucleotide may be an aptamer including an empty nucleotide sequence, and specifically, may be an aptamer including a nucleotide sequence of SEQ ID NO.
  • the first nucleotide of Formula 1 is empty, the second nucleotide is empty, the 10th nucleotide is benzyl-uracil nucleotide (Z), the 12th nucleotide is empty, the 16th nucleotide is empty.
  • the 17th nucleotide may be empty and the 33rd nucleotide may be an aptamer including an empty nucleotide sequence.
  • the aptamer may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the A48m, A48m combi 2, A48m combi 3, A48m combi 4 or A48m combi 5 aptamer has a insulin receptor binding capacity (Example 1-7), insulin receptor phosphorylation activity (Example 3-1) and serum than conventional A48 aptamer It was confirmed that the stability in Example (Example 3-2) is excellent, it can be seen that will show a better effect in vivo than the existing insulin receptor aptamer.
  • Insulin receptor aptamers of the present invention are nucleotides located at the 5'-terminus, 3'-terminus, middle or both termini in order to increase resistance to nucleotide degrading enzymes to enhance serum stability or to regulate renal clearance. At least one can be modified.
  • the nucleotide modification process is called a post-SELEX process.
  • Modification by the post-SELEX process is PEG (polyethylene glycol), biotin, inverted deoxythymidine (IDT), Locked Nucleic Acid (LNA), methoxy group (-OMe),
  • PEG polyethylene glycol
  • IDT inverted deoxythymidine
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • methoxy group -OMe
  • One or more selected from the group consisting of an amino group (-NH 2 ), a fluorine group (-F), an amine linker, a thiol linker, cholesterol, and the like may be combined, and specifically, a methoxy group or a fluorine group may be combined.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the methoxy group may be bonded to the position 2 of the pentose sugar of the nucleotide, the third, fourth, fifth, 14th, 16th, 19th, 21st,
  • One or more nucleotides of the 23rd, 27th, 30th, 31st, and 32nd nucleotides may be bound to, but are not limited to.
  • the fluorine group may be bound to position 2 of the pentose sugar of the nucleotide, and may be bound to one or more nucleotides of the 17th or 20th nucleotide of Formula 1, but is not limited thereto. no.
  • the insulin receptor aptamer of the present invention may be an insulin receptor aptamer having a dissociation constant (Kd) of 0.1 to 5 nM upon binding to the insulin receptor, but is not limited thereto.
  • Kd dissociation constant
  • the term "dissociation constant (Kd)" of the present invention is a criterion for measuring the degree of binding of a membrane protein and a ligand. The lower the Kd value, the better the binding force.
  • the dissociation constant values for the insulin receptors of A48 seq 1-3, A48 seq 1-4, and A48 seq 1-19, which are improved from the conventional insulin receptor aptamer A48 are higher than those of A48. It was confirmed that the low (Example 1-7), through which it can be seen that the aptamer of the present invention has excellent binding capacity to the insulin receptor.
  • the insulin receptor aptamer of the present invention may be to phosphorylate Y1150 of the insulin receptor, but is not limited thereto. Specifically, it was confirmed that the aptamer of the present invention phosphorylates only Y1150 of six tyrosines (Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, and Y1322) in the region of the insulin receptor cell (Example 3-3). It is suggested that aptamers can selectively activate the downstream signaling of insulin.
  • an insulin receptor agonist comprising the insulin receptor aptamer.
  • the insulin receptor aptamer is as described above.
  • agonist of insulin receptor refers to a pharmaceutically acceptable agent that selectively binds to the insulin receptor.
  • Insulin receptor agonists typically represent a new class of diabetes therapies that have been developed to effectively regulate blood glucose.
  • Insulin receptor agonists of the invention not only bind specifically to the insulin receptor but also are characterized by no side effects of cancer development. Thus, the agonists of the insulin receptor can be used for the diagnosis or treatment of various diseases related to insulin.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of insulin-related diseases comprising the insulin receptor aptamer as an active ingredient.
  • the insulin receptor aptamer is as described above.
  • insulin-associated disease refers to a disease associated with abnormal secretion of insulin, non-ideal binding between insulin and insulin receptors, or non-ideal activity of insulin receptors and sub-signaling proteins of insulin, such as diabetes mellitus, Diabetes, metabolic syndrome, obesity, cardiovascular disease, and the like, but are not limited thereto.
  • prevention means any action that inhibits or delays insulin-related diseases by administering a composition of the present invention to an individual
  • treatment means administering the composition of the present invention to an individual It means any action that improves or benefits the condition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable” in the present invention means that it is commonly used in the pharmaceutical arts, without stimulating the organism upon administration, without compromising the biological activity and properties of the compound to be administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated with the carrier and used as food, medicine, feed additives, drinking water additives, and the like.
  • the type of the carrier is not particularly limited and any carrier can be used as long as it is commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, maltodextrin, glycerol, ethanol, and the like. Can be. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used by adding other pharmaceutically acceptable additives, such as excipients, diluents, antioxidants, buffers or bacteriostatic agents, if necessary, fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants
  • the binder may be used by additionally adding a lubricant or the like.
  • compositions of the present invention can be formulated and used in suitable dosage forms for oral or parenteral administration.
  • Non-limiting examples of the formulation for oral administration include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups or elixirs, and the like. Can be mentioned.
  • a binder such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin and the like; Excipients such as dicalcium phosphate and the like; Disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax and the like can be used, and sweeteners, fragrances, syrups and the like can also be used.
  • a liquid carrier such as fatty oil may be further used in addition to the above-mentioned materials.
  • Non-limiting examples of the parenteral preparations include injection liquids, suppositories, respiratory inhalation powders, spray aerosols, ointments, application powders, oils, creams, and the like.
  • a sterile aqueous solution In order to formulate the pharmaceutical composition for parenteral administration, a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a freeze-dried preparation, an external preparation, and the like may be used.
  • the non-aqueous solvent and the suspension may be propylene glycol, Polyethyleneglycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyloleate and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when the pharmaceutical composition of the present invention is formulated as an injection solution, the composition of the present invention is mixed with water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which may be used as an ampoule or vial. It may be formulated for unit administration.
  • a propellant or the like when the pharmaceutical composition of the present invention is formulated with an aerosol, a propellant or the like may be combined with the additive to disperse the dispersed concentrate or the wet powder.
  • Insulin receptor aptamer of the present invention has the effect of reducing blood glucose in vivo (Example 3-5), absorbing glucose in vitro (Example 3-6) and reducing lipolysis (Example 3-7) As it was confirmed that it is better, the pharmaceutical composition comprising the aptamer as an active ingredient can be used for the prevention or treatment of insulin-related diseases.
  • the present invention provides a method for preventing or treating insulin-related diseases comprising administering to a subject other than humans a pharmaceutical composition comprising the insulin receptor aptamer as an active ingredient. do.
  • the insulin receptor aptamers, insulin related diseases, prevention and treatment are as described above.
  • mammals means all animals, including mammals, including rats, domestic animals, humans, and the like.
  • the route of administration and mode of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent of each other, and are not particularly limited in the way, and any route of administration and administration as long as the pharmaceutical composition can reach the desired site of interest. You can follow the way.
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral or parenteral administration.
  • parenteral administration for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration or subcutaneous administration may be used, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may have a pharmaceutically effective amount
  • an effective dosage may vary depending on the method of formulating the pharmaceutical composition, the mode of administration, the time of administration and / or route of administration, and to achieve by administering the pharmaceutical composition Type and extent of response, type of subject to be administered, age, weight, general state of health, condition or extent of disease, sex, diet, excretion, drug used in the subject simultaneously or with other components of the composition, etc. And various similar factors well known in the medical arts, and those skilled in the art can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
  • the insulin receptor aptamer is preferably 0.0001 mg / kg to 100 mg / kg, more preferably 0.001 mg / kg to 10 mg / day. It is preferred to be administered in kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprising the insulin receptor aptamer as an active ingredient is not particularly limited in its effective dosage amount, but for more preferable effect, the insulin receptor aptamer may be administered in an amount in the ranges indicated above.
  • the dosage of the entire pharmaceutical composition can be adjusted.
  • Administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once a day, may be divided into several times.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • composition of the present invention may be administered alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention, amelioration or treatment of insulin-related diseases.
  • composition for diagnosing diabetes or diabetes complications comprising the insulin receptor aptamer as an active ingredient.
  • diagnosis refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and may specifically determine whether diabetes mellitus or diabetic complications occur.
  • the present invention provides a method for providing information on diabetic or diabetic complications using the insulin receptor aptamer.
  • the method of providing information for diagnosing diabetes or diabetic complications may include preparing an isolated biological sample; Reacting the biological sample with an insulin receptor aptamer according to the present invention; And measuring the degree of binding of the insulin receptor aptamer in the biological sample, and when the degree of binding of the insulin receptor aptamer in the biological sample is higher than that of the normal sample, it may be characterized as diagnosing diabetes. have.
  • Measuring the degree of binding of the insulin receptor aptamer in the biological sample may be performed using DNA aptamer binding measurement techniques commonly used in the art, such as fluorescent or radioactive material at the end of the insulin receptor aptamer Labeling may be used to measure fluorescence or radioactive intensity, or to image and observe, but is not limited thereto.
  • IR-A48 aptamer known as a conventional insulin receptor aptamer (Korean Patent Publication No. 10-2017-0013178) (SEQ ID NO: 1) Modifications were made by sequence optimization or chemical optimization.
  • aptamers having an excellent effect as an active ingredient for treating insulin-related diseases, such as diabetes have been developed by improving the effects of binding to insulin receptors and stability in serum than conventional aptamers.
  • Example 1 Improved Insulin Receptor Through Sequence Optimization of A48 Aptamer Manufacture (A48m)
  • sequence optimization was performed to modify some sequences of A48.
  • the A48 variant synthesized through the sequence optimization improved the binding capacity to the insulin receptor than the conventional A48, thereby producing an aptamer having a better effect than the conventional insulin receptor aptamer.
  • the sequences of the primers used in the above examples are shown in Table 1 below.
  • SELEX was synthesized antisense library (biotin) bound to the 5 '(Fig. 1).
  • 1 mM dNTP dATP, dGTP, dCTP, Nap-dU
  • 0.25 U / ul KOD XL 10X extension buffer (1.2 M Tris-HCl pH 7.8, 100 mM KCl, 60 mM
  • Double stranded DNA was prepared by reacting with 50 uM of forward primer (SEQ ID NO: 2) at 70 ° C.
  • Example 1-2 binding reaction with insulin receptor
  • a selection buffer 200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 25 mM KCl
  • the protein competitor buffer 10 uM prothrombin, 10 uM Casein, 0.1% HSA (Human Serum Albumin)
  • HSA Human Serum Albumin
  • Dynabead TALON was washed five times with 100 ul of selective buffer (200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 25 mM KCl), and the fifth wash was performed by transferring to a new tube.
  • a library bound to the target was eluted by adding 85 ul of 2 mM NaOH to the tube and neutralized with 20 ul of 8 mM HCl.
  • Example 1-3 Amplification of Library DNA Bound to Insulin Receptor
  • Amplification was carried out using QPCR (quantitative PCR) to obtain library DNA bound to the insulin receptor in Example 1-2.
  • the antisense library in which the biotin was bound to 5 'and the forward primer (SEQ ID NO: 2) and 5', respectively, were prepared using 5 uM, 1 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0.075 U / ul KOD, 25
  • a 25ul solution containing mM MgCl 2 was made and then mixed into 100ul of the prepared library. This was repeated once in 96 °C 15 seconds, 55 °C 10 seconds, 70 °C 30 minutes conditions, and 96 times 15 seconds, 70 °C 1 minutes conditions to prepare a double-stranded library.
  • eDNA is enzymatic DNA, which means aptamers produced using DNA templates and polymerases.
  • the DNA library made through the QPCR was mixed with 25ul of MyOne SA bead and fixed at room temperature for 5 minutes.
  • the library bound to the beads was expanded buffer (1.2 M Tris-HCl pH 7.8, 100 mM KCl, 60 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 70 mM MgSO 4 , 1% TritonX100, 1 mg / ml BSA), 0.5 mM dNTP ( dATP, dGTP, dCTP, Nap-dU), and DNA containing the modified nucleotides were synthesized by reacting with 500 pmole of forward primer (SEQ ID NO: 2) at 70 ° C.
  • SEQ ID NO: 2 forward primer
  • Binding affinity assays using RI labeling and QPCR were performed to analyze the binding affinity with the insulin receptor of the selected sequence pool in each round.
  • labeled eDNA obtained in each round of SELEX was subjected to 1X SB17 buffer (200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 25 mM KCl, 5 mM EDTA). And slowly cooled from 95 ° C to 37 ° C in 0.1 second each.
  • the insulin receptor protein was sequentially diluted to 7 points at 100 nM at 4 points by 1 ⁇ SB17 buffer, and then 30 ⁇ l of eDNA was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the DNA was spotted on the nylon membrane by 2 ul and then reacted with Zorbax resin 5.5 ul for 1 minute.
  • Example 1-6 selected Aptamer Sequencing
  • the resulting 5, 6 and 7 rounds were PCR amplified using a forward primer (SEQ ID NO: 2) and a reverse primer (SEQ ID NO: 3).
  • the PCR product was subjected to Next Generation Sequencing (NGS) using Illumina NextSeq platform and Illumina TruSeq Nano DNA LT Sample Preparation Kit.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • Example 1-7 Selected Aptamer Binding affinity Assay
  • a clone binding affinity assay was performed to confirm that the binding affinity of the three aptamers selected above was superior to the A48 aptamer.
  • 1X SB18 buffer 200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 25 mM KCl
  • the insulin receptor protein was sequentially diluted to 7 points at 100 nM by 4.64 times using 1 ⁇ SB18 buffer, and then 30 ⁇ l of aptamer was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 5.5 ul of Dynabead TALON was added to the aptamer and the protein conjugate, and reacted at room temperature for 5 minutes.
  • the aptamer and protein conjugate obtained above were amplified using QPCR.
  • Total volume of 0.2 uM forward primer (SEQ ID NO: 2) and reverse primer (SEQ ID NO: 3), 0.2 uM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 mM MgCl 2 , 0.025 U / ul KOD XL and DNA protein conjugate 20 ul was mixed and amplified by repeating once at 96 ° C. 15 seconds, 55 ° C. 10 seconds, 70 ° C. 30 minutes, and 96 ° C. 15 seconds, 55 ° C. 10 seconds, and 70 ° C. 1 minute.
  • Kt and Bmax were calculated with SigmaPlot after normalizing the Ct values to standard (FIG. 4).
  • A48 seq 1-19 was selected as the final variant through sequence optimization of A48, which was named A48m.
  • Example 1-8 A48m in vivo Check active
  • ITT Insulin Tolerance Test
  • STZ streptozotocin
  • A48m aptamer was found to be effective in reducing blood glucose levels in type 1 diabetic rats. There was also no hypoglycemia in normal mice. It was found that the A48m aptamer was excellent in hypoglycemic effect (Fig. 5).
  • Example 1 was developed through the sequence optimization aptamers that are superior to the conventional A48, in order to develop aptamers having a better effect than this, a chemical optimization process was performed.
  • the synthesized A48m chemical variant improved insulin receptor phosphorylation activity and serum stability than A48m.
  • Example 2-1 A48m Identify the effects of chemical modifications on each nucleotide of the sequence
  • A48 seq 1-3 A48 seq 1-4 and A48 seq 1-19 (A48m) prepared in Example 1, 25 except for naphthyl uracil (P) in A48m consisting of 33 nucleotides
  • P naphthyl uracil
  • Each of the nucleotides was modified with 2'-OMe (N me ), C3-linker (L) or 2'-F (N f ), respectively, resulting in a total of 75 A48m chemical variant samples.
  • eight Ps were each modified with benzyl uracil (Z) to produce eight additional A48m chemical variant samples.
  • Example 2-1 In order to confirm the insulin receptor phosphorylation activity of the A48m chemically modified sample prepared in Example 2-1, the following experiment was performed. Specifically, 10 5 Rat-1 / hIR cells were plated in each well of a 12 well-plate, and then cultured in high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FBS for one day. Cells were incubated in DMEM without FBS for 3 hours prior to treatment of the aptamer sample and washed three times with 1 ⁇ PBS followed by Krebs-Ringer HEPES buffer [25 mM HEPES (pH 7.4), 120 mM NaCl, 5 mM KCl.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the aptamer sample was an A48m chemical variant prepared in Example 2.1 and then cooled at room temperature for 5 minutes at 95 ° C., after which the tertiary structure of the aptamer was reconstituted.
  • the aptamer was prepared by dissolving in Krebs-Ringer HEPES buffer for the experiment.
  • Aptamer samples were incubated for 1 hour after addition to each well of the 12 well-plate. After 1 hour, washed 3 times with 1 ⁇ PBS, cells were removed from the plate and lysed with lysis buffer. The cell lysates were separated by centrifugation at 14,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The separated sample was heated at 100 ° C. with 5 ⁇ sample buffer for 5 minutes and then cooled slowly to room temperature to prepare Western blot samples. The prepared samples were electrophoresed for 1 hour 30 minutes on 4% -12% SDS-PAGE and transferred to a Nitrocellulose membrane for 1 hour 30 minutes.
  • the membrane was then blocked in blocking buffer (1xPBST, 3% skim milk powder) solution at room temperature for 40 minutes, and then the primary antibody [anti-phospho-IR (10C3), Santa Cruz Biotechnology Or anti- ⁇ -actin (D6A8), Cell Signaling Technology] 1: 500 or 1: 1000 and incubated at room temperature for 1 hour. Thereafter, the membrane was washed three times with 1 ⁇ PBS, and then bound to the blocking buffer solution. The secondary antibody was diluted 1: 20000, incubated at room temperature for 1 hour, and washed three times with 1 ⁇ PBST. After spraying the ECL solution on the membrane and incubated for 1 minute at room temperature, the membrane was exposed to the x-ray film. The intensity of the band on the membrane was quantified compared to A48m.
  • the degree of insulin receptor phosphorylation was different for each nucleotide position and chemical modification type, and the phosphorylation degree was shown in Tables 4 and 5 below based on the phosphorylation activity of A48m that was not chemically modified.
  • Example 2-3 A48m According to the chemical modification combination A48m Chemical Variant Sequence selection
  • the candidate sequence is an aptamer consisting of two nucleotides (CG) at 5 'end of A48m and one nucleotide (C) at 3' end in common, and the candidate sequence is A48m combi 1 To combi 5.
  • Example 3 chemically optimized A48m Insulin receptor As an aptamer Check active
  • Example 3-1 A48m Identification of Insulin Receptor Phosphorylation Activity of Chemically Optimized Candidate Sequences
  • aptamers modified from methoxy-uracil to methoxy-thymine in A48m combi 3 were named A48m combi 3 ', and their insulin receptor phosphorylation was confirmed.
  • insulin receptors of A48m combi 3 and A48m combi 3' were identified. It was confirmed that the degree of phosphorylation is similar (Figs. 6e and f), it can be seen that the thymine and uracil in the aptamer of the present invention does not affect the function of the aptamer even when mutually substituted.
  • Example 3-1 the serum stability of A48m combi 2 to combi 5 except for A48m combi 1 having no insulin receptor phosphorylation was confirmed.
  • the serum stability is to determine how long aptamer can be in vivo when administered as a therapeutic agent, the higher the serum stability, the longer the aptamer will be in vivo to maintain the effect, so the dosage interval There is an advantage of widening.
  • 10 ul of 10 uM aptamer was added to 45 ul 100% serum and then incubated at 37 ° C. for 0, 4, 24, 48 and 72 hours, respectively. After incubation, 5 ul of 10 uM control aptamer was added and diluted with 165 ul of distilled water. The same volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added to the sample, mixed gently, and centrifuged at 16,000 g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new tube, 5X sample buffer was added, and heated at 95 ° C. for 5 minutes. The sample was electrophoresed at 220V for 25 minutes in an urea gel and the gel was stained with SYBR gold to identify the gel with a Gel Doc TM EZ System infrared imaging system.
  • A48m combi 2 to combi 5 aptamers all showed a better serum stability than A48m, it can be seen that it has a stable activity in vivo as a therapeutic agent for diabetes (Fig. 7).
  • anti-phospho-IR antibody (Y1150 / Y1151) (10C3, Santa Cruz Biotechnology), anti-phospho-IR antibody (Y960) (Invitrogen), anti-phospho-IR antibody (Y1146) (Invitrogen), anti-phospho-IR antibody (Y1316) (Invitrogen), anti-phospho-IR antibody (Y1322) (Invitrogen), anti-phospho-IR antibody (Py) (4G10, Millipore) anti-IR Antibodies (Santa Cruz, CA, USA) and anti- ⁇ -actin (D6A8) (Cell Signaling Technology) were used as primary antibodies to confirm the phosphorylation activity of the insulin receptor through Western blotting as in Example 2. It was.
  • Example 3-3 it was confirmed that A48m combi 3 to combi 5 aptamers induce only phosphorylation of Y1150 among several tyrosine of insulin, and it was confirmed how the selective phosphorylation influences the lower signaling of insulin.
  • the cells were treated with 200 nM of A48m combi 3 aptamer cooled to room temperature for 5 minutes at 95 ° C. and cooled at room temperature to fully differentiated 3T3-L1 cells as in Example 2, and then sampled for anti-phospho-AKT antibody.
  • T308 anti-phospho-AKT antibody
  • S473 anti-phospho-ERK antibody
  • T202 / Y204 anti-phospho-ERK antibody
  • Example 3-5 chemically optimized A48m in vivo Check blood glucose reduction activity
  • the A48m combi 3 aptamer showed a better blood glucose reduction effect than insulin in type 1 diabetes model rats, it was found that the A48m combi 3 aptamer has a superior hypoglycemic effect (Fig. 10a).
  • Example 3-6 chemically optimized A48m Confirmation of glucose absorption activity in vitro
  • the fully differentiated 3T3-L1 adipocytes without any treatment were determined to be in a steady state, and the experiment was performed by inducing 10ng / ml of TNF- ⁇ to the fully differentiated 3T3-L1 adipocytes to induce insulin resistance. Proceeded.
  • Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated in DMEM without FBS for 3 hours for serum deficiency and then with Krebs-Ringer HEPES buffer for 1 hour. Thereafter, 1.6 nM, 8 nM, 40 nM, 200 nM, 1000 nM of insulin or A48m combi 3 aptamers were treated for that time, followed by 2-deoxy [14C] glucose (0.1 ⁇ Ci / ml) for 10 minutes. Washed 3 times with PBS with 20 mM glucose and dissolved the cells with a solution containing 0.5 N NaOH and 1% SDS. A liquid scintillation counter was used to observe the amount of 2-Deoxy-D-glucose absorbed into the cells.
  • A48m combi 2 to 5 To determine the effect of chemically optimized A48m (A48m combi 2 to 5) on the inhibition of lipolysis as insulin receptor aptamers, glycerol secreted during the lipolysis process using fully differentiated 3T3-L1 adipocytes The amount was measured.
  • 3T3-L1 adipocytes were treated in DMEM without FBS for serum deficiency for 3 hours and then treated with Krebs-Ringer HEPES buffer for 1 hour to induce lipolysis due to glucose deficiency. .
  • insulin or A48m combi 3 aptamer at concentrations of 0.93 nM, 2.59 nM, 7.26 nM, 20.34 nM, 56.94 nM, 159.44 nM, 446.43 nM, 1250 nM, 3500 nM, respectively, the treated buffers were harvested. .
  • the EC50 (9.6nM) of glucose uptake and the IC50 (2.07nM) of lipolysis were 4.6 times different for insulin, but the EC50 (16.5nM) of glucose uptake and IC50 (11nM) of glucose uptake was observed for A48m combi 3 ) Showed a 1.5-fold difference (Fig. 12), which means that the aptamer of the present invention has a relatively low lipolysis inhibitory effect as compared to glucose absorbing activity, and thus has a lower lipolysis inhibitory effect than insulin in a situation of inducing the same glucose absorption. It can be seen that.

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Abstract

본 발명은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는당뇨병 치료용 약학적 조성물 및 진단용 조성물에 관한 발명이다. 상기 인슐린 수용체 압타머는 기존에 당뇨병 등 인슐린 관련 질환의 치료용으로 사용된 인슐린 또는 기존의 인슐린 수용체 압타머보다 인슐린 수용체 하위 신호전달을 활성화시키는 정도가 우수한 바, 인슐린 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물
본 발명은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물 및 진단용 조성물에 관한 발명이다.
인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로서, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 수행하지 못한다. 그로 인해 당뇨 환자는 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며, 이는 다양한 합병증의 원인이 되고 있다. 따라서 인슐린 생성에 이상이 있거나(Type I), 인슐린 내성으로 인한(Type II) 당뇨 환자는 인슐린 치료가 필요하며, 인슐린 투여로써 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다.
따라서, 오늘날 당뇨병 환자의 혈당을 정상적으로 조절하기 위해 많은 종류의 인슐린 유도체들이 개발되어 사용되고 있으나 인슐린은 포도당 흡수 이외에도 세포 분열을 유도하며 몇몇 인슐린 유도체에 도입된 아미노산 서열의 변화는 IGF-1 수용체에 대한 결합력과 활성화를 증가시킨다. 따라서 당뇨병 치료를 위한 장기간의 인슐린 투여는 반대로 암 발생률을 높일 수 있고 죽상동맥경화와 같은 인슐린에 의한 부작용에 관한 우려가 지속적으로 제기되어 왔다. 또한 몇몇 역학조사를 통해 지속된 인슐린 투여와 암 발병률 증가 사이에 유의미한 상관관계가 있다는 내용 역시 보고되었다. 따라서 세포분열을 유도하지 않고 포도당 흡수만을 증가시키는 인슐린 수용체에 대한 biased agonist의 개발은 인슐린 투여에 대한 좋은 대안이 될 수 있다.
압타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 DNA, RNA 등의 단일가닥 뉴클레오티드이다. 1990년 이후 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 높은 결합력과 특이성으로 표적분자에 선택적으로 결합할 수 있다는 특성이 있어서 특정한 물질을 감별하는 용도로 사용될 수 있다.
현재 압타머의 높은 결합력 및 특이성을 이용한 기능적 압타머를 발굴하기 위한 대부분의 노력은 표적에 대한 압타머의 저해 능력에 초점이 맞춰져 있다. 특히 임상적 응용을 위해서 표적분자의 활성을 방해하는 다양한 종류의 저해성 압타머(inhibitory aptamer)가 질병치료를 위해 개발되어 왔다 (e.g Macugen, Fovista). 하지만 분자간의 상호작용은 필연적으로 구조적인 변화를 동반한다는 점을 염두해 봤을 때, 만약 압타머-단백질 결합이 단백질의 적절한 구조 변화를 유도시킬 수 있다면 단백질 기능의 활성화가 가능해질 것이라 여겨진다. 따라서 이론적으로 압타머는 특정 단백질-단백질 결합을 모방함으로써 기능적 Agonist로 역할을 할 수 있는 잠재력을 가진다. 하지만 현재 표적의 기능을 활성화 시키는 Agonist 압타머의 개발은 어려운 문제로 남아있다.
본 발명자들은 부작용이 감소된 당뇨병 치료제를 개발하고자 노력한 결과, 인슐린 수용체의 선택적 인산화를 유도하여, 포도당 흡수와 관련된 신호전달만을 활성화시키는 압타머를 개발하고, 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 일반식 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 인슐린 수용체 압타머를 제공하는 것이다.
5'- R1-R2-C-C-R3-G-G-P-G-R4-P-R5-P-A-R6-R7-R8-G-A-C-C-P-R9-P-A-G-G-R10-R11-A-G-G-R12 - 3' (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
R2는 구아닌 뉴클레오티드(G) 또는 비어있음;
R3은 티민 뉴클레오티드(T) 또는 우라실 뉴클레오티드(U);
R4는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z);
R5는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
R6은 구아닌 뉴클레오티드(G) 또는 아데닌 뉴클레오티드(A);
R7은 아데닌 뉴클레오티드(A) 또는 비어있음;
R8은 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
R9는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 아데닌 뉴클레오티드(A);
R10은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z);
R11은 아데닌 뉴클레오티드(A) 또는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P); 및
R12는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
여기에서, 상기 비어있음은 뉴클레오티드가 제거된 것, 또는 링커인 것임.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 인슐린 수용체 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 기존에 당뇨병 등 인슐린 관련 질환의 치료용으로 사용된 인슐린 또는 기존의 인슐린 수용체 압타머보다 인슐린 수용체 하위 신호전달을 활성화시키는 정도가 우수한 바, 인슐린 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1의 a는 압타머 SELEX 과정의 대략적인 모식도를 나타내는 도면이고, b는 A48m 제작을 위한 라이브러리의 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 RI 표지를 이용한 각 라운드 Pool의 결합 친화도 테스트 결과를 나타내는 도면이다.
도 3의 a는 라운드가 진행될수록 각 라운드 별 서열의 비율을 나타내는 도면이고, b는 12개의 후보 서열의 각 라운드별 상태를 나타낸 도면이다.
도 4는 A48m 후보 서열의 인슐린 수용체 단백질에 대한 결합력을 나타내는 도면이다.
도 5는 A48m 압타머, 인슐린, Humulin의 ITT 어세이 결과를 나타내는 도면이다.
도 6의 a는 A48m combi 1의 인슐린 수용체 인산화 활성을 나타내는 도면이고, b 내지 d는 A48m combi 2 내지 5의 인슐린 수용체 인산화 활성을 나타내고, 도 e 및 f는 A48m combi 3'의 인슐린 수용체 인산화 활성을 나타내는 도면이다.
도 7은 A48m combi 2 내지 5의 혈청 안정성을 나타내는 도면이다.
도 8은 A48m combi 3 내지 5의 인슐린 수용체 선택적 인산화 활성을 나타내는 도면이다.
도 9는 분화된 3T3-L1 세포에서 A48m combi 3의 인슐린 하위신호전달 단"k길의 인산화 활성을 나타내는 도면이다.
도 10은 A48m combi 3 압타머의 in vivo 혈당 감소 효과를 나타내는 도면이다.
도 11은 A48m combi 3 압타머의 in vitro 포도당 흡수 효과를 나타내는 도면이다.
도 12는 A48m combi 3 압타머의 지방분해 억제 효과를 나타내는 도면이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 하기 일반식 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 인슐린 수용체 압타머를 제공한다.
5'- R1-R2-C-C-R3-G-G-P-G-R4-P-R5-P-A-R6-R7-R8-G-A-C-C-P-R9-P-A-G-G-R10-R11-A-G-G-R12 - 3' (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
R2는 구아닌 뉴클레오티드(G) 또는 비어있음;
R3은 티민 뉴클레오티드(T) 또는 우라실 뉴클레오티드(U);
R4는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z);
R5는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
R6은 구아닌 뉴클레오티드(G) 또는 아데닌 뉴클레오티드(A);
R7은 아데닌 뉴클레오티드(A) 또는 비어있음;
R8은 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
R9는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 아데닌 뉴클레오티드(A);
R10은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z);
R11은 아데닌 뉴클레오티드(A) 또는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P); 및
R12는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
여기에서, 상기 비어있음은 뉴클레오티드가 제거된 것, 또는 링커인 것임.
본 발명의 용어, "인슐린 수용체 압타머(Insulin receptor aptamer)"는 인슐린에 특이적인 친화도로 결합할 수 있는 압타머를 의미한다. 상기 인슐린 수용체는 인간 인슐린 수용체 단백질에서 유래하는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한 "압타머"는 높은 친화성으로 표적물질을 특이적으로 인지할 수 있는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있다. 또한 대부분의 경우에 상기 압타머는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다.
상기 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 상기 압타머는 25 내지 90개, 구체적으로 27 내지 80개, 더 구체적으로 27 내지 50개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 공개특허 제10-2017-0013178호에 개시된 인슐린 수용체 압타머(A48)(서열번호 1)를 기반으로, 인슐린 수용체에 대한 결합력, 인슐린 수용체의 인산화 활성 및 혈청 안정성을 향상시키고자 하였다.
그에 따라, 뉴클레오티드 서열의 최적화 및 화학적 변형을 이용한 최적화를 수행하기 위해, 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 특정 부위의 염기를 다른 종류의 염기로 치환하거나; 특정 부위의 염기 부분을 제거하고 5탄당 부위를 링커 또는 스페이서로 변이시키거나; 뉴클레오티드에 추가적으로 화학적 변형을 일으킬 경우 인슐린 수용체에 대한 결합력, 인슐린 수용체의 인산화 활성 및 혈청 안정성이 우수해짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 구체적으로, A48 압타머를 기반으로 하여 뉴클레오티드 서열의 12번째 뉴클레오티드를 시토신 뉴클레오티드(C)로 치환하고, 17번째 뉴클레오티드를 구아닌 뉴클레오티드(G)로 치환하고, 22번째 뉴클레오티드를 아데닌 뉴클레오티드(A)로 치환하고, 28번째 뉴클레오티드를 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)로 치환하고, 33번째 뉴클레오티드를 제거하였으며, 12번째와 13번째 뉴클레오티드 사이에 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)가 추가할 경우, 인슐린 수용체에 대한 결합력이 향상됨을 확인하여(실시예 1-7), 신규 인슐린 수용체 압타머(A48m, 서열번호 6)의 서열을 도출하였고, 상기 A48m의 뉴클레오티드 서열의 1번째, 2번째, 12번째, 및 33번째 뉴클레오티드를 링커 또는 스페이서로 치환되고 10번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z)로 치환될 경우, 인슐린 수용체의 인산화 활성 및 혈청 안정성이 향상됨을 확인하였으며, 추가로, 선택적으로 16번째 및 17번째 뉴클레오티드가 링커 또는 스페이서로 치환되고 28번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z)로 치환될 경우 인슐린 수용체의 인산화 활성 및 혈청 안정성이 향상됨을 확인하였다. 또한, 1번째, 2번째 및 33번째 뉴클레오티드를 제거하는 변형을 통해 인슐린 수용체의 인산화 활성 및 혈청 안정성이 향상됨을 확인하였다(실시예 3-1 및 3-2).
또한, 상기 변형된 압타머의 뉴클레오티드 서열의 3번째, 4번째, 5번째, 14번째, 16번째, 19번째, 21번째, 23번째, 27번째, 30번째, 31번째 및 32번째 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드에 메톡시기를 결합시키거나, 17번째 또는 20번째 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드에 플루오르기를 결합시키는 화학적 변형을 통해 인슐린 수용체 압타머의 효과를 더욱 개선할 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 일반식 1은 서열번호 11로 표현될 수 있다. 상기 일반식 1은 아데닌 뉴클레오티드(A), 티민 뉴클레오티드(T), 구아닌 뉴클레오티드(G),시토신 뉴클레오티드(C) 및 우라실 뉴클레오티드(U)로 구성될 수 있고, 우라실의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 소수성 작용기는 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 이소부틸기, 또는 트립토판을 포함할 수 있고, 본 발명에서는 구체적으로 나프틸기 또는 벤질기를 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 나프틸기로 치환되어 변형된 우라실은 나프틸-우라실로 불리고, 상기 일반식 1에서 P로 표시된다. 또한, 상기 벤질기로 치환되어 변형된 우라실은 벤질-우라실로 불리고, 상기 일반식 1에서 Z로 표시된다.
상기 나프틸기는 아래 화학식 1에, 벤질기는 화학식 2에 표시하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018005400-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2018005400-appb-I000002
또한, 본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상이 비어있는 것일 수 있다.
상기 "비어있음"은 뉴클레오티드가 제거된 것, 또는 링커인 것을 의미할 수 있다. 구체적으로, 뉴클레오티드가 제거된 것은 뉴클레오티드의 염기 및 오탄당 뿐만 아니라, 포스페이트 백본까지 제거되어 그 위치의 뉴클레오티드 자체가 제거된 것을 의미하는 것일 수 있다. 또한, 구체적으로 링커는 뉴클레오티드가 링커로 치환된 것으로서, 상기 뉴클레오티드의 염기 또는 염기 및 오탄당을 포함하는 뉴클레오사이드가 제거되었지만 포스페이트 백본(phosphate backbone)은 남아 상기의 빈 공간은 유지된 채로 남아있는 상태를 의미할 수 있고, 빈 공간 양 옆의 뉴클레오티드는 본래의 일정한 거리를 유지하며 연결된 상태를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 링커는 '스페이서(spacer)'와 혼용되서 사용될 수 있다. 상기 링커 또는 스페이서는 탄소 3개로 구성될 수 있지만, 뉴클레오티드 사이의 일정한 거리를 유지할 수 있다면, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 링커 또는 스페이서는 탄소 3개로 구성되는 링커 또는 스페이서일 수 있으며, 이는 C3 링커(linker), 또는 C3 스페이서(spacer)로 불릴 수 있다. 상기 C3 링커 또는 스페이서는 본 발명의 인슐린 수용체 압타머의 5'-말단, 3'-말단, 중간 또는 양 말단에 포함될 수 있으며, 구체적으로는 중간에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(화학식 3), 3'-말단(화학식 4), 중간(화학식 5)에 상기 C3 링커가 연결된 구조는 하기의 화학식에 표시하였다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2018005400-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2018005400-appb-I000004
[화학식 5]
Figure PCTKR2018005400-appb-I000005
구체적으로는, 상기 일반식 1의 R1, R2, R5, R7, R8 및 R12 중 어느 하나 이상은 C3-링커일 수 있고, R1, R2 및 R12 중 어느 하나 이상은 뉴클레오티드가 제거된 것일 수 있으며, R5, R7 및 R8 중 어느 하나 이상은 C3-링커일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1의 12번째 뉴클레오티드가 시토신 뉴클레오티드(C) 및 18번째 뉴클레오티드가 구아닌 뉴클레오티드(G)인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있고; 상기 일반식 1의 12번째 뉴클레오티드가 시토신 뉴클레오티드(C), 15번째 뉴클레오티드가 아데닌 뉴클레오티드(A), 18번째 뉴클레오티드가 구아닌 뉴클레오티드(G), 29번째 뉴클레오티드가 아데닌 뉴클레오티드(A) 및 33번째 뉴클레오티드가 제거된 서열을 포함하는 압타머 일 수 있고; 또는 상기 일반식 1의 12번째 뉴클레오티드가 시토신 뉴클레오티드(C), 18번째 뉴클레오티드가 구아닌 뉴클레오티드(G), 23번째 뉴클레오티드가 아데닌 뉴클레오티드(A) 및 29번째 뉴클레오티드가 나프틸-우라실(P) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 압타머는 기존의 A48 압타머보다 인슐린 수용체에 대한 결합력이 향상된 압타머 일 수 있고, 구체적으로 본 발명 내에서 A48m 압타머 또는 A48 seq 1-19 압타머라고 불릴 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1의 R6은 구아닌 뉴클레오티드(G), R9는 아데닌 뉴클레오티드(A), R11은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 및 R12는 시토신 뉴클레오티드(C)인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있고, 구체적으로 A48m 압타머 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머는 기존의 A48 압타머보다 인슐린 수용체에 대한 결합력이 향상된 압타머 일 수 있고, 또한, A48 seq 1-3 또는 A48 seq 1-4 보다 인슐린 수용체 결합력이 보다 우수한 압타머 일 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1의 R1, R2, R5, R7, R8 및 R12 중 하나 이상이 비어있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있고, 구체적으로 상기 R1, R2, R5 및 뿐만 아니라 R12가 모두 비어있는 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 또는 R1, R2 및 R12의 뉴클레오티드가 제거된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 압타머는 A48m 보다 인슐린 수용체 인산화 활성이 우수하며, 특히 인슐린 수용체의 Y1150 부위의 인산화 활성이 우수한 압타머 일 수 있다. 또한 상기 압타머는 구체적으로 본 발명 내에서 A48m combi 2, 3, 4, 또는 5라고 불릴 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1의 R7 및 R8 중 하나 이상이 비어있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있고, 구체적으로 상기 R7 및 R8은 비어있을 수 있고; R7은 아데닌 뉴클레오티드(A) 및 R8은 시토신 뉴클레오티드(C)일 수 있고; 또는 R7은 비어있고, R8은 시토신 뉴클레오티드(C)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 상기 일반식 1의 R4는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z), 및/또는 R10은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다. 구체적으로, 상기 R4가 벤질-우라실 뉴클레오티드 (Z)인 압타머는 A48m 보다 인슐린 수용체 인산화 활성이 우수하며, 특히 인슐린 수용체의 Y1150 부위의 인산화 활성이 우수한 압타머이고 혈청 안정성 또한 향상된 압타머 일 수 있다. 또한 상기 압타머는 구체적으로 A48m combi 2, 3, 4, 또는 5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 압타머는 상기 일반식 1의 R3가 티민 뉴클레오티드(T) 또는 우라실 뉴클레오티드(U)인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다. 상기 티민 또는 우라실 뉴클레오티드는 5번 탄소의 메틸기 유무에 따라 구별되는 염기로서, 일반적으로 DNA에서는 티민으로, RNA에서는 우라실의 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 상기 일반식 1의 R3가 티민 뉴클레오티드(T) 또는 우라실 뉴클레오티드(U)인 압타머의 인슐린 수용체 인산화 활성이 유사한 것을 확인하였는 바(실시예 3-1), 본 발명의 압타머에서 일반식 1의 R3는 티민 뉴클레오티드(T)와 우라실 뉴클레오티드(U)로 상호 치환될 수 있다.
또한, 상기 R10이 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)인 압타머는 A48m combi 2 보다 우수한 인슐린 수용체 인산화 활성 및 혈청 안정성을 갖는 압타머일 수 있고, 상기 압타머는 구체적으로 A48m combi 3, 4, 또는 5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 압타머는 또한 일반식 1의 R4 및 R10은 모두 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)이거나 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z); 또는 R4는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z)이고 R10은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 A48m(서열번호 6), A48m combi 2(서열번호 7), A48m combi 3(서열번호 8), A48m combi 4(서열번호 9) 또는 A48m combi 5(서열번호 10)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 A48m 압타머는 상기 일반식 1의 12번째 뉴클레오티드가 시토신 뉴클레오티드(C), 18번째 뉴클레오티드가 구아닌 뉴클레오티드(G), 23번째 뉴클레오티드가 아데닌 뉴클레오티드(A) 및 29번째 뉴클레오티드가 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있고, 구체적으로 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다.
상기 A48m combi 2 압타머는 상기 일반식 1의 1번째 뉴클레오티드가 비어있고, 2번째 뉴클레오티드가 비어있고, 10번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z), 12번째 뉴클레오티드가 비어있고, 16번째 뉴클레오티드가 비어있고, 17번째 뉴클레오티드가 비어있고, 28번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z)이고, 33번째 뉴클레오티드가 비어있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있고, 구체적으로 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다.
상기 A48m combi 3 압타머는 상기 일반식 1의 1번째 뉴클레오티드가 비어있고, 2번째 뉴클레오티드가 비어있고, 10번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z), 12번째 뉴클레오티드가 비어있고, 33번째 뉴클레오티드가 비어있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있고, 구체적으로 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다.
상기 A48m combi 4 압타머는 상기 일반식 1의 1번째 뉴클레오티드가 비어있고, 2번째 뉴클레오티드가 비어있고, 10번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z), 12번째 뉴클레오티드가 비어있고, 16번째 뉴클레오티드가 비어있고, 33번째 뉴클레오티드가 비어있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있고, 구체적으로 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다.
상기 A48m combi 5 압타머는 상기 일반식 1의 1번째 뉴클레오티드가 비어있고, 2번째 뉴클레오티드가 비어있고, 10번째 뉴클레오티드가 벤질-우라실 뉴클레오티드 (Z), 12번째 뉴클레오티드가 비어있고, 16번째 뉴클레오티드가 비어있고, 17번째 뉴클레오티드가 비어있고, 33번째 뉴클레오티드가 비어있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머일 수 있고, 구체적으로 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 일 수 있다.
상기 A48m, A48m combi 2, A48m combi 3, A48m combi 4 또는 A48m combi 5 압타머는 기존의 A48 압타머보다 인슐린 수용체 결합력(실시예 1-7), 인슐린 수용체 인산화 활성(실시예 3-1) 및 혈청 내 안정성(실시예 3-2)이 우수함을 확인하였는 바, 기존의 인슐린 수용체 압타머보다 생체내에서 보다 우수한 효과를 나타낼 것임을 알 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 뉴클레오티드 분해효소에 대한 저항성을 높여 혈청 내 안정성을 증진시키거나 신장 클리어런스(renal clearance)를 조절하기 위하여, 5'- 말단, 3'- 말단, 중간 또는 양 말단에 위치한 뉴클레오티드를 적어도 하나 이상 변형시킬 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변형 과정은 post-SELEX 과정이라고 불린다.
상기 post-SELEX 과정에 의한 변형은 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), 비오틴, idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 메톡시기(-OMe), 아미노기(-NH2), 플루오르기(-F), 아민 링커, 티올 링커 및 콜레스테롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합된 것일 수 있고, 구체적으로, 메톡시기 또는 플루오르기가 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 일 예로, 상기 메톡시기는 뉴클레오티드의 오탄당의 2번 위치에 결합된 것일 수 있고, 상기 일반식 1의 3번째, 4번째, 5번째, 14번째, 16번째, 19번째, 21번째, 23번째, 27번째, 30번째, 31번째 및 32번째 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드에 결합된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예로, 상기 플루오르기는 뉴클레오티드의 오탄당의 2번 위치에 결합된 것일 수 있고, 상기 일반식 1의 17번째 또는 20번째 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드에 결합된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 0.1 내지 5 nM인, 인슐린 수용체 압타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "해리 상수(Kd)"는 막 단백질과 리간드의 결합 정도를 가늠할 수 있는 기준으로서, Kd 값이 낮을수록 결합력이 우수함을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 기존의 인슐린 수용체 압타머인 A48보다 개량된 A48 seq 1-3, A48 seq 1-4 및 A48 seq 1-19의 인슐린 수용체에 대한 해리 상수 값이 A48의 해리 상수 값보다 낮음을 확인하였는 바(실시예 1-7), 이를 통해 본 발명의 압타머의 인슐린 수용체에 대한 결합력이 우수함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체의 Y1150을 인산화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 압타머는 인슐린 수용체 세포 내 영역의 6개의 티로신(Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322) 중 Y1150 만을 인산화시키는 것을 확인하였는 바(실시예 3-3), 이를 통해 상기 압타머는 인슐린의 하위 신호전달을 선택적으로 활성화시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 상기 인슐린 수용체 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist)를 제공한다. 상기 인슐린 수용체 압타머는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "인슐린 수용체의 작용제"는 인슐린 수용체에 선택적으로 결합하는 약학적으로 허용 가능한 제제를 나타낸다. 통상적으로 인슐린 수용체 작용제는, 효과적으로 혈당을 조절하기 위하여 개발된 새로운 종류의 당뇨병 치료제를 나타낸다. 본 발명의 인슐린 수용체 작용제는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합할 뿐 아니라 암 발생의 부작용이 없는 특징이 있다. 따라서, 상기 인슐린 수용체의 작용제는 인슐린과 관련한 다양한 질병의 진단 또는 치료용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 인슐린 수용체 압타머는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "인슐린 관련 질환"은 인슐린의 비정상적인 분비, 인슐린과 인슐린 수용체간의 비이상적 결합 또는 인슐린 수용체 및 인슐린의 하위 신호전달 단백질의 비이상적 활성 등과 관련된 질환으로서, 그 예로, 상기 질환은 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만, 심혈관 질환 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하여 인슐린 관련 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물을 개체에 투여하여 인슐린 관련 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효 성분으로 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 이를 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 상기 담체와 함께 제제화되어, 식품, 의약품, 사료 첨가제, 음용수 첨가제 등으로 활용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합한 양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다.
나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
상기 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 보다 구체적으로 본 발명의 상기 약학 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 약학 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와함께 배합할 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 in vivo에서의 혈당 감소 효과(실시예 3-5), in vitro에서의 포도당 흡수 효과(실시예 3-6) 및 지방분해 감소 효과(실시예 3-7)가 인슐린보다 우수하다는 것을 확인하였는 바, 상기 압타머를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료 용도로 이용될 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 것을 포함하는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 인슐린 수용체 압타머, 인슐린 관련 질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개체"는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여,근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적 유효량, 유효 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 보다 바람직한 효과를 위한 투여량에 있어서, 상기 인슐린 수용체 압타머는 바람직하게는 1일 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 투여되는 것이 좋다.
따라서, 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 그 유효적 투여량이 특별히 제한되지는 아니하나, 보다 바람직한 효과를 위하여 상기 인슐린 수용체 압타머가 상기 제시된 범위의 양으로 투여될 수 있도록 약학 조성물 전체의 투여량을 조절할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 인슐린 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 구체적으로 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 발병 여부를 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인슐린 수용체 압타머를 이용하여 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단에 대한 정보 제공방법을 제공한다.
상기 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단에 정보를 제공하는 방법은 분리된 생물학적 시료를 준비하는 단계; 상기 생물학적 시료에, 본 발명에 따른 인슐린 수용체 압타머를 반응시키는 단계; 및 상기 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고, 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 압타머의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우, 당뇨병인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대 인슐린 수용체 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질 표지하여 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나, 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 효과가 우수한 인슐린 수용체 압타머를 개발하기 위해, 기존의 인슐린 수용체 압타머로 알려진 IR-A48 압타머(이하, A48)(대한민국 공개특허 제10-2017-0013178호)(서열번호 1)를 서열 최적화 또는 화학적 최적화 과정으로 변형시켰다. 이를 통해 기존의 압타머보다 인슐린 수용체와의 결합력 및 혈청 내 안정성 등의 효과를 향상시킴으로서 당뇨병 등의 인슐린 관련 질환의 치료제의 유효성분으로서 우수한 효과를 갖는 압타머를 개발하였다.
실시예 1: A48의 서열최적화를 통한 개량된 인슐린 수용체 압타머 제조(A48m)
A48의 효과를 개선하기 위해, A48의 일부 서열을 변형시키는 서열최적화를 수행하였다. 상기 서열최적화를 통해 합성된 A48 변형체는 기존의 A48보다 인슐린 수용체에 대한 결합력이 향상되었는 바, 기존의 인슐린 수용체 압타머보다 효과가 우수한 압타머를 제조하였다. 상기 실시예에서 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 1에 기재하였다.
서열목록 서열 서열번호
인슐린 압타머 정방향 프라이머_F 5'- GAGTGACCGTCCGCCTG -3' 2
인슐린 압타머 역방향 프라이머_R 5'- GGCTGGTGGTGTGGCTG -3' 3
실시예 1-1: 라이브러리 합성
A48에서 일부 서열을 변형시키는 서열최적화를 위해 어떠한 뉴클레오티드를 변형시켰을 때 효과가 향상되는 지를 확인하기 위한, A48의 서열 중 9개의 뉴클레오티드가 무작위로 결정된 라이브러리를 합성하였다.
구체적으로, 압타머 SELEX에 필요한 라이브러리를 제조하기 위하여 5'에 비오틴(biotin)이 결합된 안티센스(antisense) 라이브러리를 합성하였다(도 1). 상기 안티센스 라이브러리를 합성하기 위해, 1 mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Nap-dU), 0.25 U/ul KOD XL, 10X extension 완충액(1.2 M Tris-HCl pH 7.8, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 70 mM MgSO4, 1% TritonX100, 1 mg/ml BSA)상에서 70℃ 2시간 동안 50uM의 정방향 프라이머(서열번호 2)와 반응시켜 이중가닥 DNA를 제조하였다. 여기에 20 mM NaOH를 이용하여 단일가닥 변형 DNA를 용출한 뒤 HCl 용액으로 중화시켰다. 제조된 라이브러리는 10% 요소 겔(urea gel)을 이용하여 정량하였다.
실시예 1-2: 인슐린 수용체와의 결합 반응
상기에서 합성된 라이브러리 중 인슐린 수용체와의 결합력이 우수한 압타머 후보 서열을 선별하기 위해, 인슐린 수용체와의 결합 반응을 수행하였다.
구체적으로, 상기에서 합성된 라이브러리 1 nmole을 선택 완충액(selection buffer)(200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 25 mM KCl)에 넣고 95℃, 70℃, 48℃, 37℃에서 각각 5분간 반응시킨 후, 선택을 위해 단백질 경쟁 완충액(protein competitor buffer)(10 uM prothrombin, 10 uM Casein, 0.1% HSA(Human Serum Albumin))을 혼합한 뒤, 상층액이 제거된 10 mg/ml Dynabeads® TALON™ + 1 mg/ml Hexa-Histidine bead (Hexa-His TALON bead)에 첨가하여 37에서 10분간 반응시켰다.
상기 선택 후, 상층액만 새로운 튜브에 옮긴 후, 인슐린 수용체 단백질과 결합시킨 Dynabead TALON을 첨가하여 37에서 1시간 동안 반응시켰다. 100 ul의 선택 완충액(200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 25 mM KCl)로 Dynabead TALON을 5번 세척 하였고, 5번째 세척은 새로운 튜브에 옮겨서 수행하였다. 상기 튜브에 2 mM NaOH를 85 ul 첨가하여 표적에 결합하는 라이브러리를 용출한 뒤, 8 mM HCl 20 ul로 중화하였다.
실시예 1-3: 인슐린 수용체와 결합한 라이브러리 DNA의 증폭
상기 실시예 1-2에서 인슐린 수용체에 결합한 라이브러리 DNA를 수득하기 위해 QPCR(정량적 PCR)을 이용하여 증폭하였다. 구체적으로, 라이브러리 제조에 사용된 정방향 프라이머(서열번호 2)와 5'에 비오틴이 결합된 안티센스 라이브러리를 각각 5 uM, 1 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0.075 U/ul KOD, 25 mM MgCl2가 포함된 25ul 용액을 만든 후, 제조한 라이브러리 100 ul에 혼합하였다. 이를 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 조건으로 1회, 그리고 96℃ 15초, 70℃ 1분 조건으로 20회 반복하여 이중가닥 라이브러리를 제조하였다.
실시예 1-4: eDNA의 제조
eDNA는 enzymatic DNA로 DNA 주형과 폴리머라제를 이용해 생산한 압타머를 의미한다. 상기 QPCR을 통하여 만들어진 DNA 라이브러리를 25ul의 MyOne SA bead에 혼합하여 상온에서 5분간 고정하였다. Bead에 결합된 라이브러리는 extension 완충액(1.2 M Tris-HCl pH 7.8, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 70 mM MgSO4, 1% TritonX100, 1mg/ml BSA), 0.5 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, Nap-dU), 0.0625 U/ul KOD 상에서 70℃, 30분 동안 500 pmole의 정방향 프라이머(서열번호 2)와 반응시켜 변형 뉴클레오티드를 포함하는 DNA를 합성하였다. 합성된 eDNA는 다음 라운드에 사용하였고, 총 8 라운드의 SELEX를 수행하였다. SELEX를 진행할수록 더 선택적인 결합이 진행되게 하기 위하여, 3라운드부터는 DNA와 인슐린 수용체 단백질 결합체를 10 mM Dextran sulfate 용액에 1/200로 희석하여 선택을 진행하였다. 각 라운드에 대한 결합 조건은 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2018005400-appb-T000001
실시예 1-5: 라운드 pool의 결합 친화도 분석
각 라운드에서 선택된 서열 Pool의 인슐린 수용체와의 결합 친화도를 분석하기 위해 RI 표지 및 QPCR을 이용한 결합 친화도 분석 실험을 수행하였다.
먼저, RI 표지를 이용한 결합 친화도 분석을 수행하기 위해, SELEX의 각 라운드에서 얻어 표지된 eDNA를 1X SB17 완충액(200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 25 mM KCl, 5 mM EDTA)에 넣고 95℃에서부터 1초에 0.1씩 37℃까지 천천히 냉각시켰다. 그리고 1X SB17 완충액을 이용하여 인슐린 수용체 단백질을 100 nM에서 4.64배씩 7 포인트로 순차적으로 희석한 뒤, eDNA를 30 ul씩 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 나일론 막에 상기 DNA를 2 ul씩 스포팅 한 뒤 Zorbax resin 5.5 ul를 첨가하여 1분간 반응시켰다. 그리고 미리 1X SB17 완충액 30 ul로 적셔 놓은 Durapore 필터 플레이트에 넣고 진공을 걸어주었다. 1X SB17 완충액 100 ul를 넣어 진공을 걸어 씻어주었다. 나일론 필터와 Durapore 플레이트를 phosphorimager screen에 밤새 노출 시킨 뒤, 이미지를 정량화 하였다(도 2).
각 라운드의 SELEX pool의 결합 친화도 분석 결과 5, 6, 7R pool의 결합 친화도가 좋은 것으로 확인되었는 바, 5, 6, 7R의 pool을 Next Generation Sequencing(NGS)로 염기서열 분석하였다.
실시예 1-6: 선택된 압타머의 염기서열 분석
상기 5, 6 및 7 라운드의 결과물을 정방향 프라이머 (서열번호 2) 및 역방향 프라이머(서열번호 3)를 사용하여 PCR 증폭 하였다. 상기 PCR 산물을 Illumina NextSeq platform 및 Illumina TruSeq Nano DNA LT Sample Preparation Kit를 사용하여 Next Generation Sequencing(NGS)을 수행하였다.
그 결과, 각 라운드 pool에 존재하는 read 수가 많은 상위 50개의 서열을 선별하고 각 라운드별 상기 서열들의 비율 변화를 확인하여(도 3), 라운드가 진행될수록 비율이 증가하는 서열이 결합 친화도에 기여한다고 판단하고, 이에 해당하는 서열을 선별하였다. 상기 과정에서 1-1, 1-2, 1-7, 1-8 및 1-10 서열은 라운드가 진행될수록 비율이 감소하였고, 1-5, 1-6, 1-9 및 1-11 서열은 다른 서열에 의해 오염되었는 바, 이에 해당되지 않는 1-3, 1-4 및 1-19 서열을 pool의 효능을 대표하는 서열로 선별하였고, 상기 3개의 압타머 1-3, 1-4 및 1-19를 각각 A48 seq 1-3, A48 seq 1-4 및 A48 seq 1-19로 명명하였다. 이를 통해 선별된 서열은 하기 표 3에 기재하였다.
서열목록 서열 크기 서열번호
A48 seq 1-3 5'- CGCCTGGPGPPCPAAACGACCPCPAGGPAAGG - 3' 32mer 4
A48 seq 1-4 5'- CGCCTGGPGPPAAGACAACCPCPAGGPAAGGCT - 3' 33mer 5
A48 seq 1-19 5'- CGCCTGGPGPPCPAGACGACCPAPAGGPPAGGC - 3' 33mer 6
실시예 1-7: 선별된 압타머의 결합 친화도 어세이
상기에서 선별된 3개의 압타머의 인슐린 수용체에 대한 결합력이 A48 압타머보다 우수한지 확인하기 위해 클론 결합 친화도 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 상기 압타머 10 fmole을 1X SB18 완충액(200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 25 mM KCl)에 넣고 95℃, 70℃, 48℃, 37℃에서 각각 5분간 반응시켰다. 그리고 1X SB18 완충액를 이용하여 인슐린 수용체 단백질을 100 nM에서 4.64배씩 7 포인트로 순차적으로 희석한 뒤, 압타머를 30 ul씩 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 상기 압타머와 단백질 결합체에 Dynabead TALON 5.5 ul를 첨가하고 상온에서 5분간 반응시켰다. 그리고 미리 1X SB18 완충액 30 ul로 적셔 놓은 Durapore 필터 플레이트에 넣고 진공을 걸어주었다. 1X SB18 완충액 100 ul를 넣어 진공을 걸어 씻어주었다. 그 후, 2 mM NaOH 용액을 넣고 상온에서 5분간 반응시켜 용출하고 8 mM HCl 용액으로 중화하였다.
상기에서 수득한 압타머와 단백질 결합체를 QPCR을 이용하여 증폭하였다. 0.2 uM 정방향 프라이머(서열번호 2)와 역방향 프라이머(서열번호 3), 0.2 uM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 mM MgCl2, 0.025 U/ul KOD XL과 DNA 단백질 결합체를 총 부피가 20 ul가 되도록 혼합하여, 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 조건으로 1회, 그리고 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 1분 조건으로 40회 반복하여 증폭시켰다. Ct 값을 표준으로 정규화한 뒤 SigmaPlot으로 Kd 및 Bmax를 계산하였다(도 4).
그 결과, 상기 3개의 압타머의 인슐린 수용체에 대한 Kd 값이 모두 기존의 A48보다 우수함을 확인하고, 이 중 A48 seq 1-19는 Bmax 값 또한 A48보다 우수한 것을 확인하였는 바, 3개의 압타머 중 A48 seq 1-19가 가장 우수함을 알 수 있었다. 이에 따라, 상기 A48 seq 1-19을 A48의 서열 최적화를 통한 최종 변형체로서 선택하고, 이를 A48m으로 명명하였다.
실시예 1-8: A48m의 in vivo 활성 확인
A48m의 in vivo에서 인슐린 수용체 압타머로서 활성을 갖는지 확인하기 위해, 정상쥐와 스트렙토조토신(streptozotocin:STZ)로 유도한 1형 당뇨모델 쥐에서 인슐린 내성 테스트(ITT: Insulin Tolerance Test) 어세이를 수행하였다. 구체적으로, 8주령의 수컷 C57Bl/6J 실험 쥐를 12시간 동안 금식시킨 후 A48m을 PBS에 녹여 10 mg/kg의 용량으로 복강주사를 통해 실험 쥐에 투여하였다. 투여 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분이 지났을 때, 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈당측정기(Accu-Check Active; Roche Diagnostics)를 통해 혈당의 변화를 관찰 하였다.
그 결과, A48m 압타머는 1형 당뇨 모델 쥐에서 효과적인 혈당 감소 효과를 알 수 있었다. 또한 정상쥐에서 저혈당 현상이 나타나지 않았다. 이를 통해 A48m 압타머는 혈당강하 효과가 우수함을 알 수 있었다(도 5).
실시예 2: 화학적 최적화를 통한 A48m의 개량
상기 실시예 1에서 서열최적화를 통해 기존의 A48보다 효과가 우수한 압타머를 개발하였고, 이보다 더 우수한 효과를 갖는 압타머를 개발하기 위해, 화학적 최적화 과정을 수행하였다. 이를 통해 합성된 A48m 화학적 변형체는 A48m 보다 인슐린 수용체 인산화 활성 및 혈청 안정성이 향상되었다.
실시예 2-1: A48m 서열의 각 뉴클레오티드에 대한 화학적 변형의 효과 확인
상기 실시예 1을 통해 제조한 A48 seq 1-3, A48 seq 1-4 및 A48 seq 1-19(A48m) 중 대표예로서, 33개의 뉴클레오티드로 구성되는 A48m에서 나프틸 우라실(P)을 제외한 25개의 뉴클레오티드 각각을 2'-OMe(Nme), C3-링커(L) 또는 2’-F(Nf)로 각각 변형시켜, 총 75개의 A48m 화학적 변형체 샘플을 제작하였다. 또한, 8개의 P를 벤질 우라실(Z)로 각각 변형시켜 8개의 추가적인 A48m 화학적 변형체 샘플을 제작하였다.
실시예 2-2: A48m 화학적 변형체 샘플의 인슐린 수용체 인산화 활성 확인
실시예 2-1에서 제작된 A48m 화학적 변형체 샘플의 인슐린 수용체 인산화 활성을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, Rat-1/hIR 세포 105개를 12웰-플레이트의 각 웰에 플레이팅 한 후, 10% FBS를 함유하는 고함량 글루코스 DMEM(high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 하루 동안 배양하였다. 상기 압타머 샘플을 처리하기 전 세포를 FBS가 포함되지 않은 DMEM에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 1xPBS로 3회 세척 후 Krebs-Ringer HEPES 완충액[25 mM HEPES (pH 7.4), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 및 1.3 mM KH2PO4]에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 압타머 샘플은 실시예 2.1에서 제작한 A48m 화학적 변형체로서 95℃에서 5분 동안 가열 후, 압타머의 3차 구조가 재구성되도록 실온에서 천천히 식혔다. 상기 압타머는 실험을 위해 Krebs-Ringer HEPES 완충액에 용해하여 준비하였다.
압타머 샘플을 상기 12웰-플레이트의 각 웰에 첨가 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후 1xPBS로 3회 세척 후 세포를 플레이트에서 떼어내어 용해 완충액으로 용해시켰다. 상기 세포 용해물은 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심 분리하여 단백질을 분리해 내었다. 상기 분리된 샘플은 5X 샘플 완충액과 함께 100℃에서 5분 동안 가열 후, 실온에서 천천히 식혀 웨스턴블랏 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플은 4%~12% SDS-PAGE 상에서 1시간 30분 동안 전기영동 하였고, 1시간 30분 동안 니트로 셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane)에 옮겨졌다. 그 후 상기 막을 블락킹 완충용액(1xPBST, 3% 탈지분유) 용액에 40분 동안 실온에서 블락킹 한 후, 블락킹 완충용액에 1차 항체[항-포스포-IR(10C3), Santa Cruz Biotechnology 또는 항-β-엑틴(D6A8), Cell Signaling Technology] 1:500 또는 1:1000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후 상기 막을 후 1xPBS로 3회 세척 후 블락킹 완충용액에 결합 2차 항체를 1:20000으로 희석시켜 1시간 동안 상온에서 인큐베이션 한 후, 1xPBST로 3회 세척하였다. 상기 막에 ECL 용액을 뿌린 후 상온에서 1분 동안 인큐베이션 시킨 후, x-ray 필름에 상기 막을 노출시켰다. 상기 막에 생긴 밴드의 강도는 A48m과 비교하여 정량화하였다.
그 결과, 각 뉴클레오티드 위치 별, 화학적 변형 종류별로 인슐린 수용체 인산화의 정도가 각각 달랐고, 상기 인산화 정도를 화학적 변형이 되지 않은 A48m의 인산화 활성을 기준으로 하여 하기 표 4 및 표 5에 나타냈다.
Figure PCTKR2018005400-appb-T000002
Figure PCTKR2018005400-appb-T000003
실시예 2-3: A48m의 화학적 변형 조합에 따른 A48m 화학적 변형체 서열 선별
상기 실시예 2-2의 A48m의 뉴클레오티드의 각 위치의 화학적 변형에 따른 인슐린 수용체 인산화 활성화 정도를 토대로, 각 위치의 화학적 변형에 따른 수많은 조합 실험을 수행하여 화학적 최적화가 된 것으로 보이는 5개의 후보 서열을 선별하였다. 후보 서열을 선별하기 위해서는 인산화 활성 정도 및 압타머 자체의 안정성을 고려하여 선별하였고, 안정성 향상에 초점을 두었는 바, 심각한 인산화 활성 감소가 아니라면 안정성이 향상되는 방향으로 후보 서열을 선별하였다. 안정성 향상의 기여도는 일반적으로 링커 > 메톡시화 > 플루오르화 이므로, 인산화 활성이 비슷하다면 링커로 변형된 서열을 선별하였다.
또한, A48m의 티민을 메톡시화시키는 경우에는 메톡시화가 RNA로부터 비롯되므로, T 메톡시보다 U 메톡시가 일반적인 경우이다. 따라서 티민의 RNA에서의 존재 형태인 우라실로 변형한 후, 메톡시화를 진행하였다.
상기 후보 서열은 공통적으로 A48m의 5' 말단의 2개의 뉴클레오티드(CG) 및, 3'말단의 1개의 뉴클레오티드(C)를 비워두며 제작된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 압타머로서, 상기 후보 서열은 A48m combi 1 내지 combi 5로 명명하였다.
실시예 3: 화학적 최적화된 A48m의 인슐린 수용체 압타머로서의 활성 확인
실시예 3-1: A48m의 화학적 최적화 후보 서열의 인슐린 수용체 인산화 활성 확인
실시예 2에서 선별한 5개의 후보 서열인 A48m combi 1 내지 combi 5의 인슐린 수용체 인산화 정도를 확인한 결과, A48m combi 1은 인슐린 수용체를 전혀 인산화 시키지 못하는 반면(도 6a), 나머지 A48m combi 2 내지 combi 5의 경우에는 모두 A48m보다 우수한 효과를 보여줬다(도 6b 내지 d). 따라서, A48m combi 1을 제외한 A48m combi 2 내지 combi 5를 이용하여 하기의 실험들을 진행하였다. 상기 A48m combi 2 내지 combi 5의 서열은 하기 표 6에서 나타낸다.
Figure PCTKR2018005400-appb-T000004
또한, 상기 압타머에서 메톡시-우라실이 메톡시-티민으로 치환된 경우의 인슐린 수용체 인산화 활성을 확인하였다.
구체적으로, A48m combi 3에서 메톡시-우라실을 메톡시-티민으로 변형한 압타머를 A48m combi 3'로 명명하고, 이의 인슐린 수용체 인산화 정도를 확인한 결과, A48m combi 3과 A48m combi 3'의 인슐린 수용체 인산화 정도가 유사한 것을 확인하였는 바(도 6e 및 f), 본 발명의 압타머에서 티민과 우라실은 상호 치환되더라도 압타머의 기능에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
실시예 3-2: 압타머의 혈청 안정성 확인
상기 실시예 3-1에서 인슐린 수용체 인산화 효과가 없는 A48m combi 1을 제외한 A48m combi 2 내지 combi 5의 혈청 안정성을 확인하였다. 상기 혈청 안정성은 압타머를 치료제로서 생체 내에 투여했을 때 얼마나 오랫동안 생체 내에 존재할 수 있는 지 확인하는 것으로, 혈청 안정성이 높을수록 압타머가 생체 내에 더 오래 존재하여 효과를 오래 유지할 수 있으며, 따라서 투약 간격이 넓어지는 장점이 있다.
구체적으로, 10 uM 압타머 10 ul 를 45 ul 100% 혈청에 첨가 후, 37℃에서 각각 0, 4, 24, 48, 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후 10 uM 대조군 압타머 5 ul를 첨가한 후, 증류수 165ul로 이를 희석하였다. 상기 용액과 동일한 부피의 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)을 상기 샘플에 넣어 부드럽게 섞고, 10분 동안 16,000 g로 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 5X 샘플 완충액을 넣고 95℃에서 5분간 가열하였다. 상기 샘플은 urea 겔에서 25분동안 220V에서 전기영동한 후 상기 겔을 SYBR gold로 염색하여 Gel Doc™ EZ System infrared imaging system으로 상기 겔을 확인하였다.
상기 혈청 안정성 확인 결과, A48m combi 2 내지 combi 5 압타머는 모두 A48m보다 우수한 혈청 안정성을 보여주었는 바, 당뇨병 치료제로서 생체 내에서 안정적으로 활성을 갖는 것을 알 수 있다(도 7).
실시예 3-3: 인슐린 수용체의 선택적 인산화 확인
상기 실시예 3-2의 혈청 안정성 실험에서 보다 더 효과가 우수했던, A48m combi 3 내지 combi 5 압타머의 인슐린 수용체 선택적 인산화를 확인하기 위해, 인슐린 수용체의 세포 내 영역의 6개의 티로신(Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322) 영역 각각의 인산화 활성을 다양한 종류의 인슐린 수용체 인산화 항체를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 참고적으로 Y953의 인산화 항체는 개발되지 않아 상기 영역은 제외하고 실험을 수행하였다.
구체적으로, 항-포스포(phospho)-IR 항체(Y1150/Y1151)(10C3, Santa Cruz Biotechnology), 항-포스포-IR 항체(Y960)(Invitrogen), 항-포스포-IR 항체 (Y1146)(Invitrogen), 항-포스포-IR 항체(Y1316)(Invitrogen), 항-포스포-IR 항체(Y1322)(Invitrogen), 항-포스포-IR 항체(Py)(4G10, Millipore) 항-IR-항체 (Santa Cruz, CA, USA), 항-β-액틴(D6A8)(Cell Signaling Technology)의 항체를 1차 항체로 사용하여, 실시예 2와 같이 웨스턴블랏을 통해 인슐린 수용체의 인산화 활성을 확인하였다.
그 결과, 인슐린은 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322의 모든 영역의인산화 활성을 갖지만, A48m combi 3 내지 combi 5 압타머는 오직 Y1150 영역의 인산화 활성만을 갖는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 3-4: 인슐린 신호전달 단백질의 인산화
상기 실시예 3-3에서 A48m combi 3 내지 combi 5 압타머가 인슐린의 여러개의 티로신 중 Y1150의 인산화만을 유도한다는 것을 확인하였는 바, 상기 선택적 인산화가 인슐린의 하위 신호전달에 어떤 영향을 끼치는 지 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2와 같이 완전히 분화된 3T3-L1 세포에 95℃에서 5분간 가열하고 실온에서 식힌 A48m combi 3 압타머 200 nM을 세포에 처리한 후, 이를 샘플링하여 항-포스포-AKT 항체(T308), 항-포스포-AKT 항체(S473) 및 항-포스포-ERK 항체(T202/Y204)를 1차 항체로 사용하여, 웨스턴블랏을 통해 인슐린 신호전달 단백질의 인산화를 확인하였다.
그 결과, AKT S473 영역의 인산화가 일어남이 확인되었으나, AKT T308 영역 및 ERK 단백질(T202/Y204)은 인슐린과는 달리 인산화가 일어나지 않았다(도 9).
상기 결과를 통해, A48m combi 3 압타머의 인슐린 수용체 선택적 인산화가 인슐린 신호전달 단백질의 선택적 인산화를 유도하는 것을 알 수 있다.
실시예 3-5: 화학적 최적화된 A48m의 in vivo 혈당 감소 활성 확인
화학적 최적화된 A48m(A48m combi 2 내지 5)이 in vivo에서 인슐린 수용체 압타머로서 활성을 갖는지 확인하기 위해, 실시예 1-8과 같은 방법으로 정상쥐와 스트렙토조토신(streptozotocin:STZ)로 유도한 1형 당뇨모델 쥐에서 인슐린 내성 테스트(ITT: Insulin Tolerance Test) 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 8주령의 수컷 C57Bl/6J 실험 쥐를 12시간 동안 금식시킨 후 A48m combi 3 압타머를 PBS에 녹여 10 mg/kg의 용량으로 복강주사를 통해 실험 쥐에 투여하였다. 투여 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분이 지났을 때, 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈당측정기(Accu-Check Active; Roche Diagnostics)를 통해 혈당의 변화를 관찰 하였다.
그 결과, A48m combi 3 압타머는 1형 당뇨 모델 쥐에서 인슐린보다 우수한 혈당 감소 효과를 보여주는 바, 이를 통해 A48m combi 3 압타머는 혈당강하 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다(도 10a).
또한, A48m combi 3 압타머를 2 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg 용량으로 1형 당뇨모델 쥐에 투여하여 혈당 변화를 관찰한 결과, 농도의존적인 혈당 감소 효과를 보여주었다(도 10b).
실시예 3-6: 화학적 최적화된 A48m의 in vitro 포도당 흡수 활성 확인
화학적 최적화된 A48m(A48m combi 2 내지 5)이 인슐린 수용체 압타머로서 정상 상태 또는 인슐린 저항성 상태에서 포도당 흡수 활성을 갖는지 확인하기 위해, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 in vitro 포도당 흡수 실험을 수행하였다.
구체적으로, 아무런 처리도 하지 않은 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 정상 상태로 정하였고, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포에 10ng/ml의 TNF-α를 처리하여 인슐린 저항성 상태로 유도하여 실험을 진행하였다.
완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 혈청 결핍을 위해 FBS가 없는 DMEM에 3시간 동안 처리한 후, 1시간 동안 Krebs-Ringer HEPES 완충용액으로 처리했다. 그 후, 1.6nM, 8nM, 40nM, 200nM, 1000nM 의 인슐린 또는 A48m combi 3 압타머를 해당 시간 동안 처리한 후, 2-deoxy[14C]glucose(0.1 μCi/ml)를 10분 동안 처리하였다. 20mM 포도당이 첨가된 PBS로 3번을 씻어내고 0.5 N NaOH과 1% SDS가 포함된 용액으로 세포를 녹여내었다. 액체 섬광 계수기(Liquid scintillation counter)를 사용하여 세포 내로 흡수된 2-Deoxy-D-glucose의 양을 관찰하였다.
그 결과, 정상 상태 및 인슐린 저항성 상태에서 A48m combi 3를 처리한 경우의 포도당 흡수율이 인슐린을 처리한 경우와 유사하다는 것을 확인할 수 있는바(도 11), 본 발명의 압타머가 인슐린과 포도당 흡수 효과 측면에서 유사한 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 3-7: 화학적 최적화된 A48m의 지방분해 억제 활성 확인
화학적 최적화된 A48m(A48m combi 2 내지 5)이 인슐린 수용체 압타머로서 지방분해 억제에 미치는 효과를 확인하기 위해, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 지방분해 과정에서 분비되는 글리세롤 (Glycerol)의 양을 측정했다.
구체적으로, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 혈청 결핍을 위해 FBS가 없는 DMEM에 3시간 동안 처리한 후, 포도당 결핍에 의한 지방분해를 유도하기 위해 1시간 동안 Krebs-Ringer HEPES 완충용액으로 처리했다. 인슐린 혹은 A48m combi 3 압타머를 0.93nM, 2.59nM, 7.26nM, 20.34nM, 56.94nM, 159.44nM, 446.43nM, 1250nM, 3500nM의 농도로 각각 4시간 동안 처리 후, 세포에 처리된 버퍼를 채취하였다. 96-well 플레이트에 채취된 버퍼 20ul를 각각 넣고 Free glycerol reagent (Sigma F6428) 200ul를 더한 후, 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 세포에서 분비된 글리세롤의 농도를 의한 발색을 540nm 흡광도를 통해 측정하였다.
그 결과, 인슐린의 경우 포도당 흡수의 EC50(9.6nM)과 지방분해의 IC50(2.07nM)이 4.6배 차이를 보였지만, A48m combi 3의 경우 포도당 흡수의 EC50(16.5nM)과 지방분해의 IC50(11nM)이 1.5배 차이를 보였는 바(도 12), 이를 통해 본 발명의 압타머는 포도당 흡수 활성에 비해 지방분해 억제 효과가 상대적으로 적기 때문에 동일한 포도당 흡수를 유도하는 상황에서는 인슐린보다 지방분해 억제 효과가 적은 것을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 하기 일반식 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 인슐린 수용체 압타머:
    5'- R1-R2-C-C-R3-G-G-P-G-R4-P-R5-P-A-R6-R7-R8-G-A-C-C-P-R9-P-A-G-G-R10-R11-A-G-G-R12 - 3' (일반식 1)
    상기 일반식 1에서,
    R1은 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
    R2는 구아닌 뉴클레오티드(G) 또는 비어있음;
    R3은 티민 뉴클레오티드(T) 또는 우라실 뉴클레오티드(U);
    R4는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z);
    R5는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
    R6은 구아닌 뉴클레오티드(G) 또는 아데닌 뉴클레오티드(A);
    R7은 아데닌 뉴클레오티드(A) 또는 비어있음;
    R8은 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
    R9는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 아데닌 뉴클레오티드(A);
    R10은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z);
    R11은 아데닌 뉴클레오티드(A) 또는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P); 및
    R12는 시토신 뉴클레오티드(C) 또는 비어있음;
    여기에서, 상기 비어있음은 뉴클레오티드가 제거된 것, 또는 링커인 것임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 R6은 구아닌 뉴클레오티드(G)이고, R9는 아데닌 뉴클레오티드(A)이고, R11은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)이고, R12는 시토신 뉴클레오티드(C)인, 인슐린 수용체 압타머.
  3. 제2항에 있어서, 상기 일반식 1의 R4는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Z)인, 인슐린 수용체 압타머.
  4. 제2항에 있어서, 상기 일반식 1의 R10은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(P)인, 인슐린 수용체 압타머.
  5. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 R1, R2 및 R12 중 하나 이상은 뉴클레오티드가 제거된 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  6. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 R5, F6 및 R8 중 하나 이상은 링커인 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  7. 제2항에 있어서, 상기 일반식 1의 R1, R2, R5 및 R12 중 하나 이상은 비어있는 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 수용체 압타머는 서열번호 6 내지 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  9. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 수용체 압타머에 포함된 적어도 하나의 뉴클레오티드는 PEG(polyethylene glycol), 비오틴 idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 메톡시(methoxy)기, 아미노(amino)기, 플루오르(Fluoro)기, 아민 링커(amine linker), 티올 링커(thiol linker) 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 결합된 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  10. 제9항에 있어서, 상기 일반식 1의 3번째, 4번째, 5번째, 14번째, 16번째, 19번째, 21번째, 23번째, 27번째, 30번째, 31번째 및 32번째 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드에 메톡시기가 결합된 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  11. 제9항에 있어서, 상기 일반식 1의 17번째 또는 20번째 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드에 플루오르기가 결합된 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 0.1 내지 5 nM인, 인슐린 수용체 압타머.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체의 Y1150을 인산화시키는 것인, 인슐린 수용체 압타머.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 수용체 압타머는 이량체(dimer) 또는 다량체(multimer)로 존재하는, 인슐린 수용체 압타머.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist).
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 인슐린 관련 질환은 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 또는 심혈관 질환인 약학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  19. 제16항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료방법.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물.
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