WO2021034101A1 - 신규 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법 - Google Patents

신규 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법 Download PDF

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variant
interferon
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김호민
정재희
신의철
홍선희
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한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to a novel interferon lambda variant prepared through structure-based glycoengineering and a method for preparing the same.
  • Interferons are a group of cytokines that act as the first line of defense against viruses.
  • the interferon family consisting of type I, type II, and type III interferons performs a wide variety of functions, such as affecting cell growth and immune surveillance for tumor cells. All three types of interferon families activate the JAK/STAT pathway and induce expression of interferon-stimulated genes (ISG) by binding to respective receptors.
  • interferons examples include type I interferon, IFN ⁇ R1 and IFN ⁇ R2 (IFN ⁇ / ⁇ ); Type II interferon, IFN ⁇ R1 and IFN ⁇ R2 (IFN ⁇ ), and type III interferon, IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ (IFN ⁇ 1-4) (Nature reviews Immunology 2005;5:375-86; Nature reviews Immunology 2015;15:87-103; Nat Immunol 2015 ;16:802-9; The Journal of biological chemistry 2017;292:7295-303).
  • type III IFN has been recently identified and has been reported to perform novel immunomodulatory functions in oncology and autoimmune diseases as well as antiviral functions (Drug discovery today 2016; 21: 167-71; Current opinion in immunology 2019;56:67-75).
  • IFN ⁇ 1 ⁇ 3 were identified through computer-based prediction through genome sequencing (Nat Immunol 2003;4:69-77; Nat Immunol 2003;4:63-8), and IFN ⁇ 4 was a patient infected with hepatitis C virus (HCV). Was found in genome-wide association studies (GWAS).
  • IFN ⁇ 4 still induces major ISG expression in the liver during chronic HCV infection and, in vitro, can elicit an antiviral response to viruses such as MERS-CoV (EMBO J 2013;32:3055-65). Similar to IFN ⁇ (Roferon-A for hairy cell leukemia) and IFN ⁇ (Avonex for multiple sclerosis), the phase 2 clinical trial of PEGylated IFN ⁇ 1 for hepatitis D virus (HDV) infection Highlight the pharmaceutical potential of the IFN ⁇ family.
  • transient expression of wild-type IFN ⁇ 4 could not produce an effective amount of recombinant IFN ⁇ 4.
  • Weak signal peptides in IFN ⁇ 4 may cause impaired secretion of IFN ⁇ 4, and there was an opinion that proper glycosylation of IFN ⁇ 4 may be required for secretion (Nat Genet 2013;45:164-71).
  • Recombinant IFN ⁇ 4 can be purified from a bacterial expression system by refolding the inclusion body (EMBO J 2013;32:3055-65), but the refolding method is complicated by the lack of glycosylation and the complexity of the purification step. It presents a number of problems, including endotoxin contamination, and further, the lack of glycosylation can affect the efficacy of IFN ⁇ 4.
  • glyco-moieties can affect various protein properties such as solubility, stability, in vivo activity, plasma half-life and improvement of productivity, thus introducing new glycosylation sites or altering the glycan composition of CHO cells.
  • Glyco-engineering techniques have been widely used to improve therapeutic proteins. For example, half-life and productivity are improved through glyco engineering of hIFN ⁇ -1a and hIFN ⁇ (PLoS One 2014;9:e96967; Biochimie 2008;90:437-49).
  • hIFN ⁇ -1a and hIFN ⁇ PoS One 2014;9:e96967; Biochimie 2008;90:437-49.
  • the secretion of lipase, cutinase, llama VHH antibody and macrophage inhibitory cytokine 1 is increased.
  • Can Applied and environmental microbiology 2000;66:4940-4; Biotechnology progress 2009;25:1468-75).
  • the present inventors are based on the model structure of the IL10R ⁇ -IFN ⁇ 4-IFN ⁇ R1 complex in order to improve the expression level and therapeutic properties of IFN ⁇ 4 through glyco-engineering of IFN ⁇ 4, the present inventors have a new potential N-glycosylation Various IFN ⁇ 4 variants were prepared by mutagenesis to introduce the site. In particular, it was confirmed that productivity was improved in the case of L28N, P73N, and L28N + P73N variants, and in particular, P73N showed a new glycosylation site.
  • the HEK293-expressed IFN ⁇ 4 variant of the present invention exhibits remarkably stronger IFN ⁇ 4 mediated signaling and antiviral activity than IFN ⁇ 4 derived from E.coli, while maintaining binding affinity for IL10R ⁇ and IFN ⁇ R1 receptors. Completed.
  • An object of the present invention is to provide a novel interferon lambda variant having significantly improved expression yield, high stability, long half-life, high antiviral activity, and interferon-stimulating gene induction activity than that of interferon lambda protein through structure-based glycoengineering.
  • Another object of the present invention is to provide an immunomodulatory use of the novel interferon lambda variant.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the novel interferon lambda variant for the prevention and treatment of viral infections.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the novel interferon lambda mutant to prevent and treat cancer, tumors, organ transplants (transplant rejection), chronic kidney failure, cirrhosis, diabetes or hyperglycemia.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an interferon lambda variant through structure-based glyco engineering.
  • the present invention provides an Interferon lambda (IFN ⁇ ) variant characterized by including a mutation at one or more sites that satisfy any one or more of the following conditions:
  • the common nucleotide sequence capable of glycosylation is N-X-(S or T), and X is any amino acid except proline.
  • the present invention also provides a gene encoding the interferon lambda variant.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a recombinant cell into which the gene or the recombinant vector has been introduced.
  • the present invention also provides a composition for immunomodulation comprising the interferon lambda mutant.
  • the present invention also provides an immunomodulatory use of the interferon lambda variant.
  • the present invention also provides an immunomodulatory method comprising treating or administering the interferon lambda mutant or immunomodulatory composition.
  • the present invention also provides a composition for preventing and treating viral infections comprising the interferon lambda mutant.
  • It provides a method for preventing and treating viral infections, characterized in that the interferon lambda variant of the present invention or a composition comprising the same is administered to a subject.
  • the present invention also provides the use of the interferon lambda mutant for preventing and treating viral infections.
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of immune diseases comprising the interferon lambda mutant.
  • the present invention also provides a method for preventing and treating immune diseases, characterized in that the interferon lambda variant or a composition containing the same is administered to a subject.
  • the present invention also provides the use of the interferon lambda mutant for preventing and treating immune diseases.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer, tumor, organ transplantation (transplant rejection), chronic kidney failure, cirrhosis, diabetes or hyperglycemia, including the novel interferon lambda mutant.
  • the present invention also provides the use of the novel interferon lambda mutant for the prevention and treatment of cancer, tumor, organ transplantation (transplant rejection), chronic kidney failure, cirrhosis, diabetes or hyperglycemia.
  • It provides a method of preventing and treating cancer, tumor, organ transplant (transplant rejection), chronic kidney failure, cirrhosis, diabetes or hyperglycemia, characterized in that the interferon lambda mutant of the present invention or a composition comprising the same is administered to a subject.
  • the present invention also includes the steps of expressing an interferon lambda variant comprising a mutation at one or more sites of interferon lambda satisfying any one or more of the following conditions; And it provides a method for producing an interferon lambda variant comprising the step of obtaining the expressed interferon lambda variant:
  • the common nucleotide sequence capable of glycosylation is N-X-(S or T), and X is any amino acid except proline.
  • 1 relates to the design of the IFN ⁇ 4 variant.
  • 1A shows a model structure (right) of IL10R ⁇ -IFN ⁇ 4-IFN ⁇ R1 constructed from IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 (PDB code: 5T5W, left).
  • Potential N-glycosylation potential mutant sites (L28, A54, P73, H97, K154, A173) are indicated in orange in the structure and endogenous N-glycosylation site N61 in blue in the structure.
  • Figure 1b is an alignment of the sequence of the IFN ⁇ 4 protein. Amino acids important for binding to IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ were highlighted in green and cyan, respectively. Mutation sites for potential N-glycosylation are indicated by orange boxes (M1-M6). The endogenous N-glycosylation site N61 is indicated by a blue box (M0). Preservation of the sequence was indicated in red, blue, and black in order from the highest retention rate.
  • the *IFN ⁇ 3 sequence was obtained from the crystal structure of the IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 complex containing an affinity-enhancing mutation in IFN ⁇ 3 to stabilize the interaction with IL10R ⁇ .
  • Figure 1c shows the binding mode of IFN ⁇ 3 and IFN ⁇ 4 to IL10R ⁇ .
  • a hydrogen bonding network between IFN ⁇ 3 and IL10R ⁇ appears, and a similar interaction between IFN ⁇ 4 and IL10R ⁇ is mapped based on the complex structure of IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 (left).
  • Y82 and W143 of IL10R ⁇ bound to the hydrophobic pocket present in both IFN ⁇ 3 and IFN ⁇ 4 and thus marked Y82 and W143 residues of this IL10R ⁇ (right). Hydrophobic residues of IFN ⁇ 3 and IFN ⁇ 4 are indicated in orange.
  • Figure 2 relates to the production of IFN ⁇ 4 variants.
  • Figure 2a is the result of the expression test of the IFN ⁇ 4 variant. Expression levels of wild-type IFN ⁇ 4 and IFN ⁇ 4 variants containing the C-terminal 6x-histidine tag were monitored by western blot with anti-his antibodies. Among the various variants, M1 (L28N), M3 (P73N) and M7 (L28N + P73N) were found to have enhanced expression, and were selected for large-scale expression.
  • 2B is a result of Coomassie blue staining of M1 (L28N), M3 (P73N) and M7 (L28N + P73N) purified under reducing and non-reducing conditions.
  • the protein was purified by affinity chromatography using IgG Sepharose followed by thrombin digestion and gel filtration chromatography.
  • Figure 2c shows a gel filtration chromatogram of M1, M3, M7 and standard protein. Each gel filtration peak corresponds to the standard proteins thyroglobulin (670 kDa), ⁇ -globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa), and vitamin B12 (1.35 kDa).
  • 3A shows the results of SDS-PAGE analysis of IFN ⁇ 4 variants M1, M3, and M7 with or without PNGase-F treatment.
  • 3B is a schematic diagram showing the N-glycosylation sites of IFN ⁇ 4 variants M1, M3 and M7 by mass spectrometry.
  • Figure 3c is a collision-induced dissociation (CID) tandem of precursor ions at m/z 813.95 [M+3H] 3+ corresponding to Hex5HexNAc4Fuc1NeuAc1 (NCS) with a peptide backbone on N61 from IFN ⁇ 4 variants. It shows the MS spectrum.
  • CID collision-induced dissociation
  • Figure 3d is a collision-induced dissociation (CID) tandem of precursor ions at m/z 813.95 [M+3H] 3+ corresponding to Hex5HexNAc4Fuc1 (NSSC) with a peptide backbone on P73N from IFN ⁇ 4 variants. It shows the MS spectrum.
  • CID collision-induced dissociation
  • Figure 4 shows the binding kinetics of IFN ⁇ 4 variant to IFN ⁇ R1 or IL10R ⁇ .
  • Figure 4a shows the binding curve of IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ to IFN ⁇ 4 variants M1, M3, M7 and eIFN ⁇ 4 at the indicated concentrations (500, 1000, 2000nM) of IFN ⁇ R1 or IL10R ⁇ .
  • Sensorgrams were obtained from a Blitz instrument. Data points are indicated in gray and corresponding fits are indicated in red (IFN ⁇ R1) and blue (IL10R ⁇ ). The KD value was calculated with a 1:1 global fit.
  • Figure 4b shows the binding kinetics of IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ to immobilized IFN ⁇ 4 variants (M1, M3, M7) and eIFN ⁇ 4. The fitness was evaluated by evaluating the generated ⁇ 2 and R 2 values for all fitness analysis.
  • Figure 5a shows the effect of activating the JAK-STAT pathway through the IFN ⁇ 4 receptor by the IFN ⁇ 4 variant.
  • Huh-7.5 cells were treated with IFN ⁇ or IFN ⁇ 4 mutant (10 nM) for 30 minutes.
  • IFN ⁇ R1 to indicate the change in phosphorylation level (pSTAT1) of STAT1 induced by IFN ⁇ 4 mutants (eIFN ⁇ 4, M1, M3 and M7) was inhibited with IFN ⁇ R1 specific siRNA (siIFN ⁇ R1).
  • FIG. 5B shows the effect of inducing the expression of interferon-stimulating gene 15 (ISG15) by the IFN ⁇ 4 mutant in Huh-7.5 cells.
  • Huh-7.5 cells were treated with 10 nM IFN ⁇ for 10 hours.
  • Figure 5c shows the effect of inhibiting the replication of HCV by the IFN ⁇ 4 mutant.
  • Huh-7.5 cells infected with HCVcc were treated with the indicated concentration of IFN ⁇ for 48 hours.
  • Figure 5d shows the production of U-ISGF3 by continuous administration of the IFN ⁇ 4 variant.
  • Huh-7.5 cells were treated with 10 nM of IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ or IFN ⁇ for 72 hours.
  • Prolonged exposure to type III interferon induced the expression of U-ISGF3 consisting of IRF9, non-phosphorylated STAT1, and non-phosphorylated STAT2.
  • a similar response was monitored in the IFN ⁇ 4 variant.
  • 5E shows the upregulation of Mx1 after long-term treatment with IFN ⁇ (10nM). Mx1 is preferentially expressed by I-ISGF3 after prolonged treatment with type III interferon.
  • Figure 5f shows the immunoblot results of USP18 and SOCS1 48 hours after treatment with IFN ⁇ at a final concentration of 10 nM in Huh-7.5 cells.
  • the intensity of ⁇ -actin versus USP18 (USP18/ ⁇ -actin) is plotted as a bar graph at the bottom.
  • 5G shows the induction of SOCS1 expression by 10 nM IFN ⁇ treatment in Huh-7.5 cells. Relative expression at 8 and 24 hours after treatment by quantitative PCR was determined by real-time quantitative PCR.
  • interferon lambda 4 (IFN ⁇ 4) has recently been known and studied for its role in hepatitis C virus (HCV) infection, but its clinical potential is considerably limited due to its low expression in vitro.
  • HCV hepatitis C virus
  • the conventional method for purification of recombinant IFN ⁇ 4 derived from bacteria through refolding includes the complexity of purification steps, lack of glycosylation and endotoxin contamination. Represents a lot of problems.
  • the structure of IL10R ⁇ -IFN ⁇ 4-IFN ⁇ R1 was modeled based on the IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 crystal structure. Based on this structure, the following mutation site conditions for the interferon lambda 4 variant were designed, and the mutation site was screened.
  • a recombinant interferon lambda 4 variant was prepared based on the screened mutation site, and some of the produced variants showed significantly higher expression and production capacity than wild-type interferon lambda 4, as well as improved therapeutic treatment. It was confirmed to exhibit properties and biological activity.
  • interferon lambda Since the variant of the present invention was designed based on the binding crystal structure of interferon lambda to the receptor, it will be said that it is not limited to interferon lambda 4 used in one embodiment, and type III interferon (Consereved sequence) is maintained ( Interferon lambda).
  • the novel interferon lambda variant generated through the structure-based design of the present invention has remarkably superior expression rate compared to the wild-type variant, has excellent therapeutic properties such as stability through charge balance, increased half-life, and further expression of immune-related genes. And it is characterized in that it significantly improves the induction of an immune response.
  • the present invention relates to an Interferon lambda (IFN ⁇ ) variant comprising a mutation at one or more sites that satisfy any one or more of the following conditions:
  • the common nucleotide sequence is N-X-(S or T), and X is any amino acid except proline.
  • Interferon lambda is a type III interferon group, and is represented by interferon lambdas 1 to 4. Interferon lambda protein is involved in the immune response against viral infection, and is known to have antiviral and antiproliferative effects through the JAK-STAT pathway.
  • mutant refers to nucleotides or amino acids generated by chemical means, enzymatic means, or various other known means, respectively, in a reference sequence (eg, a polynucleotide sequence encoding a wild-type interferon or an amino acid sequence of a sub-type interferon). It refers to deletion, insertion or substitution of residues.
  • the mutation causes a mutation in the gene sequence encoding the wild-type interferon lambda 4 protein, so that the amino acid encoded by the mutation portion becomes asparagine (N), but is not limited thereto.
  • interferon lambda variant has an amino acid sequence different from that of a wild-type interferon antibody; Addition, deletion and substitution of additional components such as carbohydrates, amino acids, lipids, and the like; Or it means an interferon lambda protein having different secondary and tertiary structures.
  • the interferon lambda variant may be an interferon lambda protein further comprising another amino acid sequence and/or a glycosylation site, but is not limited thereto.
  • a mutant was prepared based on the wild-type interferon lambda 4 sequence (SEQ ID NO: 20, NCBI Accession Number: AFQ38559.1), which is a type of type III interferon, and biological activity among numerous variants of interferon lambda 4
  • SEQ ID NO: 20 NCBI Accession Number: AFQ38559.1
  • AFQ38559.1 wild-type interferon lambda 4 sequence
  • Type III interferon is known to form a complex with two types of interferon lambda receptors, IL10R ⁇ and IFNLR1, and participate in the immune response through signaling (The Journal of General Virology.
  • the interferon lambda receptor under the condition (i) may be IL10R ⁇ and/or IFN ⁇ R1.
  • condition (ii) may be characterized in that the modified amino acid residue is exposed on the surface of the three-dimensional structure of interferon lambda.
  • glycosylation is not always accompanied by the mutation site.
  • a variant was prepared based on glyco engineering, and the M3 (P73N) and M7 (L28N + P73N) IFN ⁇ 4 variants are N- in the mutation site P73N in addition to the existing N-glycosylation site. It was confirmed that glycosylation occurred, however, in the case of M1 (L28N) among the variants showing an increase in the expression rate, N-glycosylation did not occur at the mutation site.
  • At least one site of interferon lambda may be glycosylated, and preferably, the mutation site may be glycosylated.
  • glycosylation or "glycosylation” of the present invention is the most common form of protein modification such as serine or asparagine, and the carbohydrate glycan is an amino acid residue, for example, the oxygen of serine. I mean the process of binding to nitrogen in asparagine.
  • the glycosylation may affect various properties such as protein secondary and tertiary structures, intercellular signaling, biological activity, and stability.
  • the glycosylation is N-glycosylation (N-(linked) glycosylation), O-glycosylation (O-(linked) glycosylation), phosphorylated serine glycosylation (Phosphoserine glycosylation) glycosylation) and C-mannosylation ( C-mannosylation), and the like, preferably N-glycosylation or O-glycosylation, and in one embodiment of the present invention, N-glycosylation is induced, but is not limited thereto.
  • saccharides such as mannose, fucose, Galactose, and GlcNAc may be added to the amino acid residue by the glycosylation, but is not limited thereto.
  • the mutated amino acid is glycosylated.
  • the sugar is bonded to the P73 position to be glycosylated.
  • the interferon lambda mutant may be characterized in that it exhibits improved binding affinity for IL10R ⁇ , and when the interferon lambda is interferon lambda 4, it is characterized in that it exhibits a KD value of 40 to 50 nM for IL10R ⁇ . I can.
  • the interferon lambda variant may be characterized in that it exhibits similar or improved binding affinity to IFN ⁇ R1 as wild-type interferon lambda, and when the interferon lambda is interferon lambda 4, a KD value of 10 to 25 nM in IFN ⁇ R1 It may be characterized by representing.
  • the interferon lambda mutant may be characterized in that the total charge is reduced compared to the wild-type interferon lambda by acidic N-glycosylation, etc., and stability is improved by a balance of charges.
  • the interferon lambda mutant may have an increased half-life in vivo compared to wild-type interferon lambda.
  • the interferon lambda mutant may particularly represent a fraction of a protein that exhibits functional activity in a continuous treatment process.
  • the interferon lambda mutant may be characterized by exhibiting antiviral activity and inducing activity of an interferon-stimulated gene (ISG).
  • ISG interferon-stimulated gene
  • the M1 mutant showed remarkably excellent expression and production yield even though no additional glycosylation occurred at the mutant site, which is a hydrophobic aggregation in which L28 interacts with a hydrophobic residue such as L29 or Y32. It was found to be related to the functioning of the nucleus (Proc Natl Acad Sci USA 2009;106:11937-42). Accordingly, in the present invention, the interferon lambda mutant may be characterized in that the hydrophobic interaction between interferon lambda is reduced compared to wild-type interferon lambda.
  • the interferon lambda is preferably interferon lambda 4 (IFN ⁇ 4), as confirmed in the Examples, but the variant of the present invention is modeled based on the complex structure of interferon lambda 3 receptors (IL10R ⁇ and IFN ⁇ R1). It is designed based on the crystal structure and can be extended to not only interon lambda 3 (IFN ⁇ 3) but also type III interferons (IFN ⁇ 1, IFN ⁇ 2, IFN ⁇ 3, etc.) that maintain a consereved sequence.
  • IFN ⁇ 4 interferon lambda 4
  • IFN ⁇ 4 interferon lambda 4
  • reference sequence refers to an amino acid sequence of a lambda protein or a nucleic acid sequence encoding the mutant of the present invention. A conserved sequence capable of indicating the biological activity of interferon lambda may be maintained between the reference sequences.
  • the reference sequence is preferably a wild-type interferon lambda sequence, but may be a homologous protein or other variant thereof that shares a conserved sequence, and when the interferon lambda is interferon lambda 4, the reference sequence is preferably For example, it may be SEQ ID NO: 20 as in the embodiment of the present invention, but is not limited thereto.
  • the mutation site when the interferon lambda is IFN ⁇ 4, the mutation site may be selected from L28, A54, P73, H97, K154 and A173 of SEQ ID NO: 20, and the interferon lambda is another interferon lambda protein.
  • the mutation site may be selected from amino acids corresponding to L28, A54, P73, H97, K154 and A173 of SEQ ID NO: 20.
  • corresponding amino acid refers to an amino acid corresponding to the amino acid at the position of SEQ ID NO: 20 when the amino acid sequence of another interferon lambda protein (eg, IFN ⁇ 1 to IFN ⁇ 4) is aligned with IFN ⁇ 4 (SEQ ID NO: 20). Means.
  • the mutation may be one in which one or more amino acids in the amino acid sequence of interferon lambda are substituted, and preferably, for glycosylation, the amino acid may be substituted with asparagine (N) or serine (S).
  • the mutation may be characterized in that the amino acid at any one or more positions of L28, A54, P73, H97, K154 and A173 in SEQ ID NO: 20 is substituted with asparagine.
  • the mutation may be characterized in that the amino acid at any one or more positions of L28N and P73N in SEQ ID NO: 20 is substituted with asparagine.
  • the interferon lambda variant may be preferably characterized in that it comprises any one of SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 28 amino acid sequence, most preferably SEQ ID NO: 22, 24 or 28. .
  • the present invention relates to a gene encoding the interferon lambda variant.
  • the interferon lambda mutant may share the same characteristics and embodiments as described above.
  • the gene may be characterized in that it comprises a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 13 to 19, preferably SEQ ID NOs: 13, 15, and 19.
  • the gene encoding the interferon lambda variant may further include a tag sequence such as Protein A or 6x-His tag at the end for purification.
  • the present invention relates to a recombinant vector comprising a gene encoding the interferon lambda variant.
  • the recombinant vector is a vector capable of inducing the expression of a protein encoded by the introduced gene
  • a person skilled in the art can appropriately select a vector known in the art and use without limitation.
  • T7 series T7A1, T7A2, T7A3, etc.
  • lac lacUV5, temperature-dependent ( ⁇ pL, ⁇ pR), phoA, phoB, rmB, tac, trc, trp or 1PL promoters are included.
  • a vector can be used, and when yeast is used as a host, a vector containing the ADH1, AOX1, GAL1, GAL10, PGK or TDH3 promoter can be used, and in the case of Bacillus, a vector containing the P2 promoter can be used, but this is partially implemented.
  • a vector containing a promoter for inducing the expression of the interferon lambda variant according to the present invention is suitable for a host without limitation, and various vectors known in the art are appropriately selected by those skilled in the art. Can be used.
  • the present invention relates to a recombinant cell into which the gene or recombinant vector has been introduced.
  • the recombinant cell refers to an expression cell into which a gene or a recombinant vector has been introduced to produce a protein or the like.
  • the recombinant cell may be used without limitation as long as it is a cell capable of expressing glycosylated interferon lambda, and may be preferably a eukaryotic cell, more preferably a yeast, an insect cell, an animal cell, and most preferably an animal cell.
  • a CHO cell line or a HEK cell line mainly used for expression of a recombinant protein may be used, and in one embodiment of the present invention, an Expi293 cell line, which is a HEK cell line, was used, but is not limited thereto.
  • the recombinant cells are used interchangeably in the same sense as “host cells” or “combined host cells”.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles, or simply potential genomic inserts. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, in the specification of the present invention "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably. However, the present invention encompasses other forms of vectors that have functions equivalent to those known or become known in the art. Protein expression vectors used in E.
  • coli include the pET family of Novagen (USA); The pBAD family of Invitrogen (USA); PHCE or pCOLD from Takara (Japan); GenoFocus (Korea USA) pACE family; Etc. can be used.
  • Bacillus bacillus a gene of interest is inserted into a specific part of the genome to realize protein expression, or a pHT family of vectors from MoBiTech (Germany) can be used. Even in fungi and yeast, protein expression is possible using genome insertion or self-replicating vectors.
  • a plant protein expression vector can be used using a T-DNA system such as Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Typical expression vectors for expression in mammalian cell cultures are based on for example pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) and pVL1392 (Pharmingen).
  • expression control sequence means a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • regulatory sequences include promoters to effect transcription, any operator sequences to regulate such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences that regulate termination of transcription and translation.
  • suitable regulatory sequences for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence and a ribosome binding site.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most affects the amount of gene expression in the plasmid is the promoter.
  • an SR ⁇ promoter and a cytomegalovirus-derived promoter are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major of phage lambda.
  • the T7 RNA polymerase promoter ⁇ 10 can be usefully used to express proteins in E. coli.
  • Nucleic acids are "operably linked” when placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. This may be a gene and regulatory sequence(s) linked in a manner that allows gene expression when the appropriate molecule (eg, a transcriptional activating protein) is bound to the regulatory sequence(s).
  • an appropriate molecule eg, a transcriptional activating protein
  • DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • the promoter or enhancer is operably linked to the coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when arranged to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the DNA sequence to which it is linked is in contact, and, in the case of a secretory leader, is contacted and is in the reading frame. However, the enhancer does not need to be contacted.
  • the ligation of these sequences is carried out by ligation (linkage) at convenient restriction enzyme sites. If such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method is used.
  • heterologous DNA means heterologous DNA, which is DNA that is not naturally found in host cells.
  • the expression vector once in the host cell, can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be generated.
  • the gene in order to increase the level of expression of a transfected gene in a recombinant cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that exert a function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the corresponding gene are included in a single expression vector that includes a bacterial selection marker and a replication origin.
  • the expression vector may further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • the host cell for expressing the recombinant protein can be cultured at a high concentration within a short time, and genetic manipulation is easy, and genetic and physiological characteristics are well known, such as Escherichia coli and Bacillus subtillis.
  • Prokaryotic cells have been widely used.
  • the recent single-celled eukaryotic yeast family (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha).
  • a host cell for expression a CHO cell line, a HEK cell line, or the like may be used as a host cell for expression, but is not limited thereto.
  • Expression vectors suitable for eukaryotic hosts include expression control sequences derived from, for example, SV40, bovine papillomavirus, anenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus.
  • Expression vectors that can be used in bacterial hosts include bacterial plasmids obtained from E. coli such as pBluescript, pGEX2T, pUC vector, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof, and a wider host range such as RP4.
  • Plasmids having ⁇ gt10 and ⁇ gt11, phage DNA which can be exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentous single-stranded DNA phage.
  • Expression vectors useful for yeast cells are 2 ⁇ plasmids and derivatives thereof.
  • a vector useful for insect cells is pVL 941.
  • the recombinant vector may be introduced into a host cell by a method such as transformation or transfection.
  • transformation means that DNA is introduced into a host so that the DNA becomes replicable either as an extrachromosomal factor or by chromosomal integrity completion.
  • transfection means that the expression vector is accepted by the host cell, whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • the single-celled host is the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, the secretion characteristics, the ability to accurately fold the protein, culture and fermentation requirements, the product encoded by the present DNA sequence from the host. It should be selected in consideration of factors such as ease of purification. Within the range of these variables, one skilled in the art can select various vector/expression control sequence/host combinations capable of expressing the DNA sequence of the present invention in fermentation or large-scale animal culture. As a screening method for cloning cDNA by expression cloning, a binding method, a panning method, a film emulsion method, or the like can be applied.
  • the gene and recombinant vector can be introduced into host cells through various methods known in the art.
  • the gene encoding the interferon lambda variant of the present invention may be directly introduced into the genome of a host cell and exist as a factor on a chromosome. It will be apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains that even if the gene is inserted into the genomic chromosome of the host cell, it will have the same effect as when the recombinant vector is introduced into the host cell.
  • Substantially identical means a protein that includes a case in which the homology of an amino acid or a nucleotide sequence is very high, and also shares structural features regardless of sequence homology or has the same function as used in the present invention.
  • a protein in which a sequence other than the sequence constituting the core of the present invention is partially deleted or a fragment of a nucleotide sequence encoding the same may be included in the present invention. Therefore, the present invention is used in the present invention regardless of the length of the fragment. It includes all amino acid or nucleotide sequences having the same function.
  • the produced novel interferon lambda 4 variant exhibits remarkably superior antiviral activity than wild-type interferon lambda 4 and induces the expression of similar or upregulated IFN signaling, which is the IFN ⁇ 4 variant. It means that it exhibits remarkably superior biological activity compared to eIFN ⁇ 4, which is wild-type IFN ⁇ 4.
  • the present invention relates to an immunomodulatory use of the interferon lambda variant of the present invention.
  • the present invention relates to a composition for immunomodulation comprising the interferon lambda variant of the present invention.
  • the present invention relates to an immunomodulatory method comprising administering to a subject an interferon lambda variant of the present invention or a composition comprising the same.
  • the term "immunoregulation" of the present invention refers to resolving immune imbalance in blood and maintaining immune homeostasis.
  • the maintenance of immune homeostasis refers to a state in which a balance between immune tolerance that suppresses immunity and immunity that enhances immunity is achieved, and maintenance of this state is due to abnormalities in immune regulation such as cancer and autoimmune diseases. Or it is an essential element in the treatment of a disease acting as a symptom.
  • the immunomodulation is preferably immunity enhancement, and in particular, it is most preferably the regulation of the immune response through the JAK-STAT pathway involving interferon lambda.
  • the composition for immunomodulation can significantly up-regulate the expression of interferon-stimulated gene (ISG).
  • ISG interferon-stimulated gene
  • the immunomodulatory composition can be used as a pharmaceutical composition or a health functional food for the purpose of controlling immune activity, preventing, improving or treating various infectious diseases and immune-related diseases including viruses and bacteria, and the amount and form of use are It can be adjusted accordingly.
  • the subject refers to a subject to which the interferon lambda variant of the present invention or a composition for various purposes including the same is administered, and the subject includes all of various plants, animals, etc., from cells and tissues, preferably It can be human.
  • the present invention relates to a use for the prevention and treatment of viral infections comprising the interferon lambda variant of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of viral infections comprising the interferon lambda variant of the present invention.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating viral infections comprising administering to a subject the interferon lambda variant of the present invention or a composition comprising the same.
  • the term "viral infection” means a symptom that is infected with a virus and exhibits various clinical symptoms such as inflammation, fever, fatigue, chills, vomiting, dizziness, coma, death, and the like.
  • the virus may be, for example, HCV, HDV, SARS virus, MERS virus, influenza virus, bird flu virus RSV virus, and includes the latest pandemic SARS-CoV-2 infection (COVID-19). However, it is not limited thereto.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays onset of a desired disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms for a desired disease are improved or advantageously changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention exhibits a preventive or therapeutic effect on various viral infections and immune-related diseases through the antiviral and immune function enhancement effects of the interferon lambda variant, which is an active ingredient.
  • the present compounds and compositions are used to treat, prevent, or delay various viral infections such as mammalian viral infections and especially human HCV, HDV, SARS, MERS, etc.
  • the pharmaceutical composition may further include a suitable carrier, excipient, and diluent that are commonly used in pharmaceutical compositions.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as generally used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated and used in various forms according to a conventional method. Suitable dosage forms include tablets, pills, powders, granules, dragees, hard or soft capsules, solutions, suspensions or emulsions, injections, oral dosage forms such as aerosols, external preparations, suppositories and sterile injectable solutions, etc. It is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared in a suitable formulation using a pharmaceutically inert organic or inorganic carrier. That is, when the dosage form is a tablet, a coated tablet, a dragee and a hard capsule, it may include lactose, sucrose, starch or a derivative thereof, talc, calcium carbonate, gelatin, stearic acid, or a salt thereof. In addition, when the formulation is a soft capsule, it may contain vegetable oils, waxes, fats, semi-solid and liquid polyols. In addition, when the formulation is in the form of a solution or syrup, it may include water, polyol, glycerol, and vegetable oil.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a preservative, a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a solubilizing agent, a sweetening agent, a colorant, an osmotic pressure regulator, an antioxidant, and the like in addition to the above carrier.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • a pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of disease, severity, and drug activity of the patient. , Sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the variant or composition of the present invention may be administered together with other conventional compounds or compositions known to have antiviral and immune enhancing effects, and to prevent side effects caused by the composition of the present invention, other compounds having an immunosuppressive effect Or it may be administered together with a composition or the like.
  • the variant or composition of the present invention may be co-administered with various antiviral agents or adjuvants, especially when used for antiviral purposes, for example, when used or administered for the prevention and treatment of COVID-19, other vaccines, It can be co-administered with therapeutic agents (eg, remdesivir, napamostat) and neutralizing antibodies.
  • therapeutic agents eg, remdesivir, napamostat
  • the variant or pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a subject by various routes.
  • the mode of administration can be administered, for example, by subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrauterine dural or cerebrovascular injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as the active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient and the severity of the disease.
  • the method of administering the pharmaceutical composition according to the present invention may be easily selected depending on the dosage form, and may be administered orally or parenterally.
  • the dosage may vary depending on the patient's age, sex, weight, severity of the condition, and route of administration.
  • the interferon lambda mutant, immunomodulatory composition, or pharmaceutical composition of the present invention exhibits a remarkable immunity enhancing effect, it can be used for the prevention and treatment of various diseases caused by lowering or abnormal immunity as well as viral infections.
  • the present invention relates to prevention and treatment of various diseases caused by decreased immunity or abnormalities in addition to viral infections including the interferon lambda variant of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of various diseases caused by or as a result of lowering or abnormal immunity in addition to viral infections including the interferon lambda variant of the present invention.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating various diseases caused by decreased immunity or abnormalities in addition to viral infections comprising administering to a subject an interferon lambda variant of the present invention or a composition comprising the same. will be.
  • the “various diseases caused by or as a cause or symptom of immune decline or abnormality in addition to viral infections” include, for example, cancer, tumor, organ transplant, chronic kidney failure, cirrhosis, diabetes and hyperglycemia, but are limited thereto. It is not.
  • the interferon lambda variant production method of the present invention is interferon lambda 4 It is not limited to, and can be used to generate interferon lambda that exhibits better expression capacity, therapeutic properties, and biological activity of type III interferon, and in particular, it can also be used for interferon lambda 3 based on a very similar binding model structure.
  • the interferon lambda mutant production method of the present invention can produce interferon lambda mutants having superior expression ability, therapeutic properties, and biological activity by inducing fewer mutations through structural-based screening of mutation sites among numerous interferon lambda mutation sites. There is an advantage that it can be usefully used to derive the screening of the mutation site.
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant microorganism or the recombinant cell of claim 14 to express the interferon lambda variant; And it relates to a method for producing an interferon lambda variant comprising the step of obtaining the expressed interferon lambda variant.
  • the interferon lambda variant prepared by the above manufacturing method may share the same characteristics and embodiments as described above.
  • the lambda variant mutant method of the present invention described in the Examples are only one embodiment, and it is easy without limitation through the conventionally known invention that can be selected by a person skilled in the art. Can be done.
  • Example 1-1 IL10R ⁇ -IFN ⁇ 4-IFN ⁇ R1 modeling
  • the model with the highest QMEAN-Z (Qualitative Model Energy ANalysis-Z) score (-2.56) was aligned with IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 (PDB code: 5T5W) to create an IL10R ⁇ -IFN ⁇ 4-IFN ⁇ R1 model.
  • Example 1-2 Cell line, cell culture and reagent
  • Expi293F (#A14527, Gibco®) cells were cultured according to ATCC guidelines, and used within 6 months after receipt. The cells were kept as a suspension in Expi293F expression medium (#14351, Gibco®) at 37°C and 8% CO 2 conditions while stirring at 125 rpm.
  • SiRNAs (Small-interfering RNAs) and scrambled sequences for IFN ⁇ R1 were obtained from Santa Cruz Biotechnology. Transfection of IFN ⁇ R1 siRNA was performed using lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen). Recombinant IFN- ⁇ -2a in PBL Assay Science, recombinant IFN- ⁇ in PeproTech, recombinant human IFN ⁇ 1 (1598-IL), ⁇ 2 (8417-IL), ⁇ 3 (5259-IL) and eIFN ⁇ 4 (9165-IL) Obtained from R & D Systems. As a control wild-type IFN ⁇ 4, eIFN ⁇ 4 produced in E. coli was used.
  • Example 1-3 Expression and purification of recombinant protein
  • the gene encoding human IFN ⁇ 4 (1-179) was cloned into a modified pcDNA3.1 (#V79020, InvitrogenTM) containing a C-terminal 6xHis tag.
  • the IFN ⁇ 4 variant was generated through the QuikChange site-Directed Mutagenesis Kit, #200519, Agilent using the IFN ⁇ 4 wild-type construct as a PCR template. Primers for site-directed mutagenesis are listed in Table 1 below.
  • M7 induces a double mutation (L28N+P73N) by simultaneously using the M1 and M3 mutagenesis primers in the above table.
  • IFN ⁇ 4-Protein A expression the C-terminal 6x-His in the IFN ⁇ 4 construct was replaced with a Protein A gene derived from PEZZ18 (#VPT4033, GE Healthcare life Sciences).
  • a thrombin cleavage sequence (LVPRGS) was introduced between the IFN ⁇ 4 gene and the Protein A gene using PCR primers.
  • IFN ⁇ 4 wild-type and variants containing 6x-His or Protein A were transfected into Expi293F cells using ExpiFectamine 293 Transfection Kits (#A14524, InvitrogenM) according to the manufacturer's protocol.
  • IFN ⁇ 4 variants For purification of IFN ⁇ 4 variants, the supernatant containing secreted IFN ⁇ 4-Protein A was loaded into IgG Sepharose resin (#17096902, GE Healthcare Life Sciences). After washing 3 times with 1x PBS, the protein-binding resin was incubated overnight at 4° C. with thrombin (1% (v/v) in 1x PBS) to remove the C-terminal ProteinA tag. Subsequently, the eluted IFN ⁇ 4 variant was purified by gel filtration chromatography on a Superdex 200 Increase 10/300 GL column (#28990944, GE Healthcare Life Sciences) equilibrated with 1xPBS.
  • IgG Sepharose resin #17096902, GE Healthcare Life Sciences
  • the antibodies used in the immunoblot method are as follows: IFN ⁇ 4 (1:200, mouse, Millipore MABF227), IFN ⁇ 4 (1:200, rabbit, Abcam ab196984), STAT1 (1:1000, rabbit, BD Biosciences 610120), PY -STAT1 (1:1000, mouse, BD Biosciences 612233), STAT2 (1:1000, rabbit, Santa Cruz Biotechnology sc-476), IRF9 (1:1000, rabbit, Santa Cruz sc-496), SOCS1 (Abcam #62584 ), USP18 (Cell Signaling Technology #4813), horseradish peroxidase (HRP)-conjugated rabbit IgG (1:5000, Abcam ab97051), and HRP-conjugated mouse IgG (1:5000, Abcam ab
  • N-glycans of IFN ⁇ 4 were removed using PNGase F kit (#P0704S, New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. Specifically, the IFN ⁇ 4 variant was boiled with a glycoprotein denaturing buffer (10x) and cooled with ice. GlycoBuffer (10x), NP-40 (10x), and 1 ⁇ l of PNGase F were added to the denatured protein and the mixture was incubated at 37° C. for 1 hour before Western blot analysis.
  • Glycopeptides produced by non-specific digestion were prepared by a known method (Journal of proteome research 2013;12:4414-23). Specifically, 50 ⁇ g/ ⁇ l of the IFN ⁇ 4 mutant was incubated with 50 ⁇ g/ ⁇ l of pronase E for 1 hour at 37°C. The digested glycopeptide was enriched by graphitized carbon solid-phase extraction (PGC-SPE) and analyzed by nanoLC-Chip Q-TOF MS (Agilent Technologies). LC-MS and MS/MS data were processed and interpreted with MAssHunter Qualitative Analysis software (version B.07.00, Agilent Technologies) and GP Finder software (Journal of proteome research 2006;5:2800-8).
  • the binding kinetics of IFN ⁇ 4 variants to IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ were measured using biolayer light interferometry (BLI) in a BLItz system (ForteBio, Pall Life Sciences). The mixture was stirred in a washing buffer (200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 5% glycerol, 0.01% Tween-20) at 2,200 rpm. Analysis was performed at room temperature.
  • a washing buffer 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 5% glycerol, 0.01% Tween-20
  • Biotinylated IFN ⁇ 4 at a concentration of 025 mg/ml was loaded on the surface of the streptavidin biosensor (ForteBio) for 1 minute, and then the loaded biosensor was washed with a washing buffer (200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8). , 5% glycerol, 0.01% Tween-20) for 2 minutes to remove unbound protein.
  • the biosensor tip was immersed in drops containing the indicated concentrations of IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ (500, 1000 and 2000 nM). Associations (on rate, kon) were measured at intervals of 2 minutes. Subsequently, the sensor was immersed in the wash buffer for 2 minutes to measure off-rate koff. Kd measured in nanomolar was calculated as the ratio of on-rate to off-rate.
  • the resulting data was analyzed by fitting to a 1:1 ligand model using the entire global fitting function.
  • Example 1-8 Production and infection of HCV-derived cell culture fluid (HCVcc)
  • JFH-1 HCVcc The Japanese fulminant hepatits-1 (JFH-1) strain (genotype 2a) of HCVcc was produced according to the method described above (Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112:10443-8).
  • DMEM containing 5% human serum was used to culture Huh-7.5 cells to generate infectious JFH1 HCVcc.
  • HCVcc infectivity was quantified by a previously published method, a colorimetric focus-forming assay (PLoS One 2012;7:e43960).
  • Huh-7.5 cells were infected with JFH-1 HCVcc at 0.5 MOI (multiplicity of infection)
  • Huh-7.5 cells were infected with JFH-1 HCVcc at 0.5 MOI (multiplicity of infection).
  • Example 1-9 RNA extraction and real-time quantitative PCR
  • RNA isolation and TaqMan Real-Time quantitative PCR were performed by a conventionally known method (20). Specifically, after total RNA was isolated with GeneAll RibospinTM (GeneAll), the mRNA level of the target gene was measured using TaqMan gene expression analysis (Applied Biosystems). Quantification of intracellular HCV RNA replication was performed by a known method (Journal of virology 2014;88:9233-44). Results were normalized to the mRNA level of GAPDH, and the data were calculated as the mean ⁇ standard error of the mean.
  • TaqMan analysis used in the present invention is as follows: IFNLR1 (Hs00417120_m1), ISG15 (Hs01921425_s1), MX1 (Hs00895608_m1), SOCS1 (Hs00705164_s1), USP18 (Hs00276441_m1), GAPDH (Hs02758), GAPDH.
  • IFNL proteins R&D Systems used in the present invention are as follows: IFNL1 (1598-IL), IFNL2 (8417-IL), IFNL3 (5259-IL), eIFNL4 (9165-IL).
  • IFN ⁇ 4 shares about 30% sequence identity with IFN ⁇ 1 to IFN ⁇ 3, but the sequence alignment results of IFN ⁇ 1 to 4 show that IFN ⁇ 4 is IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 ternary complex (Immunity 2017;46:379-92) for two reasons. ), suggests that it interacts with IFN ⁇ R1 and IL10R ⁇ in a similar manner.
  • amino acids of the IFN ⁇ family, which are important for IFN ⁇ R1 binding are well conserved in IFN ⁇ 4 (P37, L40, K44, R47, D48, I108, F159 and R163) (Fig. 1B).
  • the hydroxyl groups of several aromatic moieties (Y59, Y82, Y140 and W143) of IL10R ⁇ form a hydrogen bonding network with IFN ⁇ 3 (S44, L45, Q48R and E106D); They are also well preserved in IFN ⁇ 4 (S34, L35, R48 and Q100). Therefore, using the crystal structures of IFN ⁇ 3 and IFN ⁇ 1, the structure of IFN ⁇ 4 was modeled (FIG. 1A) and aligned with IL10R ⁇ -IFN ⁇ 3-IFN ⁇ R1 structured crystals to construct an IL10R ⁇ -IFN ⁇ 4-IFN ⁇ R1 model (FIG. 1B).
  • the amino acid residues at the mutation site will be exposed on the surface of interferon lambda to access the oligosaccharyltransferase (OST), which catalyzes the initial transfer of glycans from lipid-linked oligosaccharides to substrate asparagine. Be exposed.
  • OST oligosaccharyltransferase
  • Sites satisfying all three criteria were L28, A54, P73, H97, K154, and A173, and a total of six were derived (Figs. 1A and 1B), and were named as m1 to m6, respectively.
  • variants (M1 to M6) in which the amino acids at positions m1 to m6 were substituted with asparagine (N) were prepared, and L28 (m1) and P73 (m3)
  • a double variant (M7) substituted with asparagine (N) was prepared.
  • the gene sequence and amino acid sequence of each of the prepared interferon lambda variants (M1 to M7) are shown in Tables 2 and 3, respectively.
  • the construct used in Western blot for hit discovery has a 6x Histidine tag at the C-terminus, which may interfere with the proper secretion of the protein, considering a wide range of positively charged amino acids of IFN ⁇ 4. Therefore, the present inventors have replaced the 6x His tag with the Protein A tag for the removal of the Protein A tag and subsequent size exclusion chromatography, and purified IFN ⁇ 4 variants (M1, M3 and M7) using affinity chromatography and thrombin digestion.
  • IFN ⁇ 4 variants (M1, M3, and M7) were analyzed using SDS-PAGE and Coomassie blue staining under reducing and non-reducing conditions. The resulting bands indicate that the three IFN ⁇ 4 variants (M1, M3, and M7) are monomers (Fig. 2B).
  • the elution profile of the standard protein means that each monodisperse peak corresponds to the IFN ⁇ 4 variant (about 44 kDa) (Fig. 2C). In most cases, this oversized elution is due to the presence of N-glycosylation in IFN ⁇ 4, which was verified by the results described in Example 3.
  • the present inventors identified IFN ⁇ R1 dependent phospho-STAT1 signaling when treated with the IFN ⁇ 4 variant.
  • M1, M3, and M7 IFN ⁇ 4 mutants induce phosphorylation of STAT1, similar to IFN ⁇ 1 to 3, other type III interferons, and inhibit IFN ⁇ R1 expression with a small interfering RNA (siIFN ⁇ R1) specific for the IFN ⁇ R1 gene, IFN ⁇ 4 mutant Even if it was treated, it was confirmed that phosphorylation of STAT1 was blocked (Fig. 5A).
  • IFN ⁇ 4 stimulation has been reported to induce the assembly of the ISGF3 transcription factor complex consisting of phospho-STAT1, phospho-STAT2 and IRF9 and the expression of ISG15, which is important for antiviral activity (27, 28).
  • M1 It was confirmed that the M3 and M7 IFN ⁇ 4 mutants induced the expression of ISG15 and inhibited the replication of HCV in HCV-infected Huh-7.5 cells. Interestingly, the M1. M3 and M7 IFN ⁇ 4 variants exhibit significantly higher ISG induction and antiviral activity than eIFN ⁇ 4.
  • U-ISGF3 non-phosphorylated ISGF3
  • STAT1, STAT2 and IRF9 without tyrosine phosphorylation
  • expression of phosphorylated ISGF3 is reduced (PLoS One 2012;7:e43960).
  • upregulation of U-ISGF3-specific gene sets such as Mx1 is maintained for a long time.
  • the protein levels of the U-ISGF3 component were assessed, indicating that the protein levels of STAT1, STAT2 and IRF9 were equally upregulated by all IFN ⁇ 4. Confirmed (Fig. 5D).
  • the IFN ⁇ 4 mutant was significantly superior to eIFN ⁇ 4 in maintaining the upregulation of Mx1 expression, but it was confirmed that IFN ⁇ 1, IFN ⁇ 2 and IFN ⁇ 3 maintained stronger upregulation of Mx1 expression compared to the IFN ⁇ 4 mutant.
  • the results of the Examples indicate that the structure-based approach to the novel glycosylation selection of the present invention can maintain the biological activity of IFN ⁇ 4, and in particular, the IFN ⁇ 4 variant of the present invention expressed from HEK293 is remarkably superior to eIFN ⁇ 4. It means to show activity.
  • the result of these IFN ⁇ 4 variants preserves the major action residues of interferon lambda due to the design characteristics, and thus it can be extended to the entire III-type interferon (IFN ⁇ 1 to 4) acting with the same receptor.
  • novel interferon lambda mutant of the present invention and its preparation method show remarkably improved production and yield in mammalian cell lines, even through conventional purification protocols through structural information-based glyco engineering, stability, half-life, fraction of functional proteins during processing, etc. It shows significantly improved therapeutic properties compared to wild-type interferon lambda.
  • ISG interferon-stimulated genes

Abstract

본 발명은 구조 기반의 글리코엔지니어링(glycoengineering)을 통해 제조한 신규 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법은 구조적 정보 기반의 글리코엔지니어링을 통해 통상의 정제 프로토콜을 통해서도, 포유류 세포주에서 현저히 향상된 생산 및 수율을 나타내며, 안정성, 반감기, 처리시 기능성 단백질의 분율 등 야생형 인터페론 람다에 비해 현저히 향상된 치료학적 특성을 나타낸다. 또한, 항 바이러스 활성 및 인터페론-자극 유전자 (interferon-stimulated gene, ISG)의 유도 수준에서, 야생형 인터페론 람다보다 현저히 뛰어나므로, 면역조절을 통한 암, 자가면역 질환 등과 같은 면역 관련 질환 및 코로나 바이러스를 포함한 다양한 바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

신규 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법
본 발명은 구조 기반의 글리코엔지니어링(glycoengineering)을 통해 제조한 신규 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인터페론(IFN)은 바이러스에 대한 첫번째 방어선 역할을 하는 사이토카인 그룹이다. 상기 바이러스 감염에 대한 보호역할 외에도, I형, II형, 및 III형 인터페론으로 구성된 인터페론 패밀리는 종양세포에 대한 세포 성장 및 면역 감시에 영향을 미치는 등의 매우 다양한 기능을 수행한다. 상기 3가지 유형의 인터패론 패밀리는 모두 JAK/STAT 경로를 활성화하고, 각각의 수용체에 결합함으로써, 인터페론 자극 유전자(interferon-stimulated gene (ISG))의 발현을 유도한다. 상기 3가지 유형의 인터페론의 예는 다음과 같다: I형 인터페론, IFNαR1 및 IFNαR2 (IFNα/β); II형 인터페론, IFNγR1 및 IFNγR2 (IFNγ), 및 III형 인터페론, IFNλR1 및 IL10Rβ(IFNλ1~4) (Nature reviews Immunology 2005;5:375-86; Nature reviews Immunology 2015;15:87-103; Nat Immunol 2015;16:802-9; The Journal of biological chemistry 2017;292:7295-303). I형 및 II형과는 달리, III형 IFN은 최근 확인 된 것으로서, 항 바이러스 기능뿐 아니라, 종양학 및 자가 면역 질환에서, 신규한 면역조절 기능을 수행하는 것으로 보고되었다(Drug discovery today 2016;21:167-71; Current opinion in immunology 2019;56:67-75). IFNλ1~3은 게놈 시퀀싱을 통한 컴퓨터 기반의 예측을 통해 동정되었으며(Nat Immunol 2003;4:69-77; Nat Immunol 2003;4:63-8), IFNλ4는 C형 간염 바이러스(HCV)에 감염된 환자에 대한 게놈수준의 연관 연구(genome-wide association studies (GWAS))에서 발견되었다. 19번 염색체에서 IFNL3 유전자 위치의 상류에 있는 다이뉴클레오타이드 유전자 변이체(dinucleotide genetic variant (rs368234815))의 △G 대립 유전자는 기능성 IFNλ4를 생산하는 반면, TT 대립유전자는 프레임 시프트에 의해 위유전자(pseudogene)가 된다(Nat Genet 2013;45:164-71). 흥미롭게도, △G 대립 유전자를 갖고, IFNλ4의 발현이 향상된 HCV 환자는 TT 대립유전자를 보유하는 HCV 환자와 비교하여, PEGylated-IFNα-ribavirin 치료에 반응성이 낮았다(Nat Commun 2014;5:5699). 그러나, IFNλ4는 여전히 만성 HCV 감염 동안 간의 주요한 ISG 발현을 유도하며, in vitro에서, MERS-CoV와 같은 바이러스에 대한 항 바이러스 반응을 이끌어 낼 수 있다(EMBO J 2013;32:3055-65). IFNα(모발세포 백혈병(hairy cell leukemia)용 Roferon-A) 및 IFNβ(다발성 경화증(multiple sclerosis)용 Avonex) 과 유사하게, D형 간염 바이러스(HDV) 감염에 대한 PEG화 IFNλ1의 2상 임상시험은 IFNλ 패밀리의 약학적 잠재력을 강조한다.
한편, 종래 포유동물 세포에서, 야생형 IFNλ4의 일과성 발현(transient expression)은 유효한 양의 재조합 IFNλ4를 생성할 수 없었다. IFNλ4 내의 약한 신호 펩타이드는 IFNλ4의 분비 장애의 원인이 될 수 있으며, IFNλ4의 적절한 글리코실화가 분비를 위해 필요할 수 있다는 견해가 있었다(Nat Genet 2013;45:164-71). 재조합 IFNλ4는 봉입체(inclusion body)를 리폴딩(refolding)하여, 박테리아 발현 시스템으로부터 정제될 수 있으나(EMBO J 2013;32:3055-65), 상기 리폴딩 방법은 정제단계의 복잡성 글리코실화의 부족 및 내독소(endotoxin) 오염을 포함하는 많은 문제를 나타내며, 나아가 그리코실화의 부족은 IFNλ4의 효능에도 영향을 미칠 수 있다.
최근, 글리코-모이어티가 용해도, 안정성, 생체 내 활성, 혈장 반감기 및 생산성의 향상과 같은 다양한 단백질 특성에 영향을 줄 수 있고, 따라서 새로운 글리코실화 부위를 도입하거나, CHO 세포의 글리칸 조성을 변경하는 글리코-엔지니어링 기술이 치료용 단백질의 개선을 위해 널리 사용되어왔다. 예를 들어, hIFNβ-1a 및 hIFNα의 글리코 엔지니어링을 통해 반감기 및 생산성이 향상된다(PLoS One 2014;9:e96967; Biochimie 2008;90:437-49). 더욱이, 단일 N-글리코실화 부위의 첨가로, 리파아제(lipase), 큐티나아제(cutinase), 라마 VHH 항체(llama VHH antibody) 및 대식세포 억제 사이토카인 1(macrophage inhibitory cytokine 1)의 분비가 증가시킬 수 있다(Applied and environmental microbiology 2000;66:4940-4; Biotechnology progress 2009;25:1468-75).
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 본 발명자들은 IFNλ4의 글리코-엔지니어링을 통해, IFNλ4의 발현 수준 및 치료학적 특성을 개선하기 위해 IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1 복합체의 모델 구조에 기초하여 새로운 잠재적 N-글리코실화 부위를 도입하기 위해 돌연변이를 유발(mutagenesis)하여, 다양한 IFNλ4 변이체를 제조하였다. 특히, L28N, P73N, 및 L28N + P73N 변이체의 경우에 생산성이 향상되는 것을 확인하였으며, 특히 P73N은 새로운 글리코실화 부위를 나타내었다. 또한, HEK293-발현된 본 발명의 IFNλ4 변이체는 IL10Rβ 및 IFNλR1 수용체에 대한 결합 친화성을 유지하면서도, E.coli 유래의 IFNλ4보다 현저히 강력한 IFNλ4 매개 신호전달 및 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 구조 기반의 글리코엔지니어링을 통해 인터페론 람다 단백질보다 현저히 향상된 발현 수율, 높은 안정성, 긴 반감기, 높은 항 바이러스활성 및 인터페론-자극 유전자 유도 활성을 갖는 신규 인터페론 람다 변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 인터페론 람다 변이체의 면역조절 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 인터페론 람다 변이체의 바이러스 감염증의 예방 및 치료용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 인터페론 람다 변이체의 암, 종양, 장기이식(이식거부), 만성신부전, 간경변증, 당뇨 또는 고혈당증의 예방 및 치료용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 구조 기반의 글리코엔지니어링을 통한 인터페론 람다 변이체의 생산방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 중 어느 하나 이상의 조건을 만족하는 하나 이상의 부위에 변이를 포함하는 특징으로 하는 인터페론 람다 (Interferon lambda; IFNλ) 변이체를 제공한다:
(i) 인터페론 람다 수용체 결합 영역 밖일 것;
(ii) 변이된 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 표면에 노출될 것; 및
(iii) 한 점 돌연변이(single point mutation)에 의해 글리코실화가 가능한 공통 염기서열(Consensus sequence)이 달성될 것,
여기서, 상기 글리코실화가 가능한 공통 염기서열은 N-X-(S 또는 T) 이고, 상기 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임.
본 발명은 또한 상기 인터페론 람다 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체를 포함하는 면역조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체의 면역조절 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체 또는 면역조절용 조성물을 처리 또는 투여하는 것을 특징으로 하는 면역조절방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체의 바이러스 감염증의 예방 및 치료용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체를 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인터페론 람다 변이체의 면역질환의 예방 및 치료용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 신규 인터페론 람다 변이체를 포함하는 암, 종양, 장기이식(이식거부), 만성신부전, 간경변증, 당뇨 또는 고혈당증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 신규 인터페론 람다 변이체의 암, 종양, 장기이식(이식거부), 만성신부전, 간경변증, 당뇨 또는 고혈당증의 예방 및 치료용도를 제공한다.
본 발명의 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암, 종양, 장기이식(이식거부), 만성신부전, 간경변증, 당뇨 또는 고혈당증의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 중 어느 하나 이상의 조건을 만족하는 인터페론 람다의 하나 이상의 부위에 변이를 포함하는 인터페론 람다 변이체를 발현하는 단계; 및 발현된 인터페론 람다 변이체를 수득하는 단계를 포함하는 인터페론 람다 변이체의 생산방법을 제공한다:
(i) 인터페론 람다 수용체 결합 영역 밖일 것;
(ii) 변이된 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 표면에 노출될 것; 및
(iii) 한 점 돌연변이(single point mutation)에 의해 글리코실화가 가능한 공통 염기서열(Consensus sequence)이 달성될 것,
여기서, 상기 글리코실화가 가능한 공통 염기서열은 N-X-(S 또는 T) 이고, 상기 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임.
도 1은 IFNλ4 변이체의 설계에 관한 것이다.
도 1a는 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1(PDB code: 5T5W, 좌측)로부터 구축된 IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1의 모델 구조(우측)를 나타낸 것이다. 잠재적 N-글리코실화가 가능한 돌연변이 부위(L28, A54, P73, H97, K154, A173)는 구조 내에 주황색으로 표시하였으며 내인성 N-글리코실화 부위 N61을 구조 내에 파란색으로 표시하였다.
도 1b는 IFNλ4 단백질의 서열을 정렬한 것이다. IFNλR1 및 IL10Rβ와의 결합에 중요한 아미노산은 각각 녹색 및 청록색으로 강조하였다. 잠재적 N-글리코실화에 대한 돌연변이 부위는 주황색 박스(M1 내지 M6)로 표시하였다. 내인성 N-글리코실화 부위 N61은 청색 박스(M0)로 표시하였다. 서열의 보존은 보존율이 높은 것부터 차례로 빨강, 파랑 및 검정색으로 표시하였다. *IFNλ3 서열은 IL10Rβ와의 상호 작용을 안정화시키기 위해 IFNλ3에 친화도-향상 돌연변이를 함유하는 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1 복합체의 결정 구조로부터 수득하였다.
도 1c는 IL10Rβ에 대한 IFNλ3 및 IFNλ4의 결합 모드를 나타낸 것이다. IFNλ3과 IL10Rβ 사이의 수소 결합 네트워크가 나타나며, IFNλ4와 IL10Rβ 간의 유사한 상호작용은 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1(왼쪽)의 복합체 구조를 기반으로 맵핑된 것이다. IL10Rβ의 Y82 및 W143은 IFNλ3 및 IFNλ4 모두에 존재하는 소수성 포켓에 결합하기에 이 IL10Rβ의 Y82 및 W143 잔기들을 표시하였다 (우측). IFNλ3 및 IFNλ4 의 소수성 잔기는 주황색으로 표시하였다.
도 2는 IFNλ4 변이체의 생산에 관한 것이다.
도 2a는 IFNλ4 변이체의 발현 시험결과이다. C-말단 6x-히스티딘 태그를 함유하는 야생형 IFNλ4 및 IFNλ4 변이체의 발현 수준을 항-his항체로 웨스턴블롯을 통해 모니터링하였다. 다양한 변이체 중에서 M1 (L28N), M3 (P73N) 및 M7 (L28N + P73N)이 발현이 강화된 것으로 나타났으며, 큰 규모의 발현을 위해 선택되었다.
도 2b는 환원 및 비환원 조건 아래에서 정제된 M1 (L28N), M3 (P73N) 및 M7 (L28N + P73N)의 쿠마시 블루 염색결과이다. 단백질을 IgG 세파로스(IgG Sepharose)를 사용한 친화력 크로마토그래피에 이은 트롬빈 분해 및 겔 여과 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
도 2c는 M1, M3, M7 및 표준 단백질(standard protein)의 겔 여과 크로마토그램을 나타낸 것이다. 각각의 겔 여과 피크는 표준 단백질인 thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa), 및 vitamin B12 (1.35 kDa)에 해당한다.
도 3은 IFNλ4 변이체의 N-글리코실화를 확인한 결과이다.
도 3a는 IFNλ4 변이체 M1, M3 및 M7의 PNGase-F 처리의 유무에 관계없이 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과이다.
도 3b는 질량 분광법으로 IFNλ4 변이체 M1, M3 및 M7의 N-글리코실화 부위를 확인한 개략도이다.
도 3c는 IFNλ4 변이체로부터 N61 상의 펩타이드 백본을 갖는 Hex5HexNAc4Fuc1NeuAc1(NCS)에 대응하는 m/z 813.95 [M+3H]3+ 에서의 프리커서 이온의 충돌-유도된 해리(Collision-induced dissociation; CID) 탠덤 MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3d는 IFNλ4 변이체로부터 P73N 상의 펩타이드 백본을 갖는 Hex5HexNAc4Fuc1(NSSC)에 대응하는 m/z 813.95 [M+3H]3+ 에서의 프리커서 이온의 충돌-유도된 해리(Collision-induced dissociation; CID) 탠덤 MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 IFNλR1 또는 IL10Rβ에 대한 IFNλ4 변이체의 결합 동역학을 나타낸 것이다.
도 4a는 표기된 농도(500, 1000, 2000nM)의 IFNλR1 또는 IL10Rβ에서 IFNλ4 변이체 M1, M3, M7 및 eIFNλ4에 대한 IFNλR1 및 IL10Rβ의 결합곡선을 나타낸 것이다. 센서그램은 Blitz 기기로부터 얻었다. 데이터 포인트는 회색으로 표시되고, 상응하는 핏(fits)는 빨간색(IFNλR1) 및 파란색(IL10Rβ)으로 표시하였다. KD값은 1:1 전역 피팅으로 계산하였다.
도 4b는 고정된 IFNλ4 변이체(M1, M3, M7) 및 eIFNλ4에 대한 IFNλR1 및 IL10Rβ의 결합 동역학을 나타낸 것이다. 모든 적합도 분석에 대해 생성된 χ2 and R2 값을 평가하여 적합도를 평가하였다.
도 5는 IFNλ4 변이체의 생물학적 활성을 확인한 결과이다.
도 5a는 IFNλ4 변이체에 의한 IFNλ4 수용체를 통한 JAK-STAT 경로의 활성화 효과를 나타낸 것이다. Huh-7.5 세포를 IFNλ 또는 IFNλ4 변이체(10 nM)로 30분 동안 처리 하였다 IFNλ4 변이체(eIFNλ4, M1, M3 및 M7)에 의해 유발된 STAT1의 인산화 수준(pSTAT1)의 변화를 나타내기 위해 IFNλR1의 발현을 IFNλR1 특이적 siRNA(siIFNλR1)로 억제하였다.
도 5b는 Huh-7.5 세포에서 IFNλ4 변이체에 의한 인터페론-자극 유전자 15(ISG15)의 발현을 유도효과를 나타낸 것이다. Huh-7.5 세포를 10nM의 IFNλ로 10시간 처리하였다.
도 5c는 IFNλ4 변이체에 의한 HCV의 복제 억제 효과를 나타낸 것이다. HCVcc에 감염된 Huh-7.5 세포를 지시 된 농도의 IFNλ로 48시간 처리 하였다.
도 5d는 IFNλ4 변이체의 지속적인 투여에 의한 U-ISGF3의 생성을 나타낸 것이다. Huh-7.5 세포를 10nM의 IFNα, IFNβ, IFNγ 또는 IFNλ로 72시간 처리하였다. III형 인터페론에 대한 연장된 노출은 IRF9, 비인산화 STAT1, 및 비인산화 STAT2로 구성된 U-ISGF3의 발현을 유도하였다. IFNλ4 변이체에서도 유사한 반응이 모니터링되었다.
도 5e는 IFNλ (10nM)로 장기간 처리한 후, Mx1의 상향 조절을 나타낸 것이다. Mx1은 III형 인터페론으로 장기간 처리한 이후에 I-ISGF3에의해 우선적으로 발현된다.
도 5f는 Huh-7.5 세포에서 IFNλ를 최종농도 10nM로 처리한 후, 48시간 뒤에 USP18 및 SOCS1의 면역블롯 결과이다. β-액틴 대 USP18의 강도(USP18/β-actin)는 하단에 막대 그래프로 도시하였다.
도 5g는 Huh-7.5 세포에서 10nM의 IFNλ 처리에 의한 SOCS1 발현의 유도를 나타낸 것이다. 정량 PCR에 의해 처리 후 8 시간 및 24시간 째에 상대적 발현을 실시간 정량 PCR에 의해 결정하였다.
도 5a, 5d 및 5f에서, 면역 블롯은 유사한 결과를 갖는 3회의 독립실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5b, 5c, 5e, 및 5g에서, 모든 분석은 3번 수행되었으며 그래프는 유사한 결과를 가진 3회의 독립실험 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
최근까지 인터페론 람다 및 이의 임상 치료용도의 연구는 낮은 발현 수율로 인해 많은 어려움을 겪고 있다. 특히, 인터페론 람다 4 (IFNλ4)는 최근 C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus, HCV) 감염에서 그 역할에 대해 알려져 있고 연구되었지만, in vitro에서 낮은 발현으로 인해 임상 잠재력이 상당히 제한된다. 이러한 문제의 해결을 위해 종래 제안된 리폴딩을 통한 박테리아 유래의 재조합 IFNλ4의 정제방법(EMBO J 2013;32:3055-65)은 정제단계의 복잡성 글리코실화의 부족 및 내독소(endotoxin) 오염을 포함하는 많은 문제를 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에서는 이러한 문제를 해결하기 위해, IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1 결정구조를 기반으로 IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1의 구조를 모델링 하였다. 이러한 구조를 기반으로, 인터페론 람다 4 변이체를 위한 다음과 같은 변이 부위의 조건을 설계하고, 변이 부위를 스크리닝 하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 스크리닝된 변이 부위를 기반으로 재조합 인터페론 람다 4 변이체를 제조하였으며, 제조된 변이체 중 일부에서 야생형 인터페론 람다 4에 비해 현저히 높은 발현 및 생산 능력을 나타내고, 뿐만 아니라, 향상된 치료학적 특성 및 생물학적 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 변이체는 인터페론 람다의 수용체와의 결합 결정구조를 기반으로 설계되었기 때문에, 일 실시예에서 사용된 인터페론 람다 4에만 국한되지 않는다 할 것이며, 보존서열(Consereved sequence)이 유지되는 III형 인터페론(인터페론 람다)에 확장시킬 수 있다.
본 발명의 구조 기반의 설계를 통해 생성된 신규한 인터페론 람다 변이체는 야생형 변이체에 비해 발현율이 현저히 뛰어나며, 전하의 밸런스를 통한 안정성, 반감기 증가 등의 치료학적 특성이 우수하고, 나아가 면역관련 유전자의 발현 및 면역 반응의 유도를 현저하게 향상시키는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음 중 어느 하나 이상의 조건을 만족하는 하나 이상의 부위에 변이를 포함하는 특징으로 하는 인터페론 람다 (Interferon lambda; IFNλ) 변이체에 관한 것이다:
(i) 인터페론 람다 수용체 결합 영역 밖일 것;
(ii) 변이된 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 표면에 노출될 것; 및
(iii) 한 점 돌연변이(single point mutation)에 의해 공통 염기서열(Consensus sequence)이 달성될 것,
여기서, 상기 공통 염기서열은 N-X-(S 또는 T) 이고, 상기 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임.
본 발명의 용어, “인터페론 람다(Interferon lambda; IFNλ)”란 III형 인터페론 그룹으로, 인터페론 람다 1 내지 4로 대표된다. 인터페론 람다 단백질은 바이러스 감염에 대한 면역반응에 관여하며, JAK-STAT 경로를 통해 항바이러스 및 항 증식 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, “변이”란 참조서열(예, 야생형 인터페론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아생형 인터페론의 아미노산 서열)에서 각각 화학적 수단, 효소수단 또는 다른 다양한 공지된 수단에 의해 발생하는 뉴클레오티드 또는 아미노산잔기의 결실, 삽입 또는 치환 등을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이는 야생형 인터페론 람다 4 단백질을 코딩하는 유전자 서열에 돌연변이를 유발하여, 해당 변이 부분이 코딩하는 아미노산이 아스파라긴(N)이 되도록 하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “인터페론 람다 변이체”는 야생형 인터페론 항체와 상이한 아미노산 서열을 갖거나; 탄수화물, 아미노산, 지질 등과 같은 추가적인 구성성분의 첨가, 삭제 및 치환; 또는 상이한 2차 및 3차 구조를 갖는 인터페론 람다 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 인터페론 람다 변이체는 다른 아미노산 서열 및/또는 글리코실화 부위를 추가로 포함하는 인터페론 람다 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, III형 인터페론의 한 종류인 야생형 인터페론 람다 4 서열(서열번호 20, NCBI Accession Number: AFQ38559.1)을 기반으로 변이체를 제조하였으며, 인터페론 람다 4의 수많은 변이체 중 생물학적 활성에 부정적인 영향이 없이 발현율을 높이기 위해서, 글리코 엔지니어링을 위한 3가지 조건을 기준으로 변이 부위를 스크리닝 하였다. III형 인터페론(인터페론 람다)은 모두, IL10Rβ 및 IFNLR1의 두 종류의 인터페론 람다 수용체와 복합체를 이루어, 신호전달을 통해 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(The Journal of General Virology. 86 (Pt 6): 1589-96.) 따라서, 상기 3가지 조건은 인터페론 람다-수용체 복합체인 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1 결정구조를 기반으로 모델링한 IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1에 기초한 글리코엔지니어링 기술을 기반으로 설계되었다. i) 상기 IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1 복합체 구조에서, 수용체-리간드 결합 및 신호 활성의 변화를 최소화하기 위해 수용체 결합 영역 밖에 존재하고, ii) 지질-연결 올리고사카라이드에서 기질 아스파라긴으로 글리칸의 초기 이동을 촉매하는 올리고사카릴 전달효소(oligosaccharyltransferase; OST)에 접근할 수 있도록 인터페론 람다의 표면에 노출되며; iii) 변이로 인한 구조적 왜곡을 최소화하기 위해서 한점 돌연변이(single point mutation)로도 공통 염기서열(consensus sequence; NXS/T, X=프롤린을 제외한 임의의 아미노산)이 달성될 수 있는 변이부위를 스크리닝하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 (i) 조건의 인터페론 람다 수용체는 IL10Rβ 및/또는 IFNλR1인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (ii) 조건은 변이된 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 3차원 구조 표면에 노출되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 부위에 글리코실화가 항상 수반되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 글리코 엔지니어링을 기반으로 하여 변이체를 제조하였으며, M3 (P73N) 및 M7 (L28N + P73N) IFNλ4 변이체는 기존의 N-글리코실화 부위 이외에 추가로 변이 부위인 P73N에서 N-글리코실화가 발생한 것을 확인하였다, 그러나, 발현율의 증가를 나타낸 변이체 중 M1(L28N)의 경우에는 해당 변이 부위에 N-글리코실화가 발생하지는 않았다.
본 발명에 있어서, 상기 변이로 인해 인터페론 람다의 어느 한 부위 이상이 글리코실화(glycosylation)되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 변이 부위가 글리코실화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 “글리코실화(glycosylation)” 또는 “당쇄화”는 단백질의 세린이나 아스파라진 등 단백질의 변형 중 가장 흔한 형태로, 탄수화물체인 글리칸(glycan)이 아미노산 잔기, 예를 들어 세린의 산소나 아스파라진의 질소에 결합하는 과정을 의미한다. 상기 글리코실화는 단백질 2차 및 3차구조, 세포간 신호전달, 생물학적 활성, 안정성 등 다양한 특성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 글리코실화는 N-글리코실화(N-(linked) glycosylation), O-글리코실화(O-(linked) glycosylation), 인산화 세린 글리코실화(Phosphoserine glycosylation) glycosylation) 및 C-만노실화(C-mannosylation)등 일 수 있으며, 바람직하게는 N-글리코실화 또는 O-글리코실화 일수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 N-글리코실화를 유도하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 글리코실화로 만노스(mannose), fucose, Galactose, GlcNAc 등의 당류가 아미노산 잔기에 추가될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변이된 아미노산이 글리코실화되는 것을 특징으로 할 수 있다. 가장 바람직하게는 P73 위치에 당이 결합하여 글리코실화되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 IL10Rβ에 대해 향상된 결합 친화도를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 인터페론 람다가 인터페론 람다 4인 경우, IL10Rβ에 40 내지 50nM의 KD 값을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 IFNλR1에 대해 야생형 인터페론 람다와 유사하거나 향상된 결합 친화도를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 인터페론 람다가 인터페론 람다 4인 경우, IFNλR1에 10 내지 25nM의 KD 값을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 산성 N-글리코실화 등에 의해서, 야생형 인터페론 람다에 비해 전체 전하가 감소한 것을 특징으로 할 수 있으며, 전하의 밸런스에 의해 안정성이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 야생형 인터페론 람다에 비해 in vivo에서 반감기가 증가한 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 특히 지속적인 치료 과정에서 기능적 활성을 나타내는 단백질의 분율을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 항 바이러스 활성 및 인터페론-자극 유전자 (interferon-stimulated gene, ISG)의 유도 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, M1 변이체의 변이 부위에 추가적인 글리코실화가 발생하지 않았음에도 현저히 뛰어난 발현 및 생산수율을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 L28이 L29 또는 Y32와 같은 소수성 잔기와 상호작용하는 소수성 응집핵으로 작용하는 것과 관련이 있을 것으로 확인되었다(Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106:11937-42). 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 야생형 인터페론 람다에 비해 인터페론 람다 상호간의 소수성 상호작용이 감소한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다는 실시예에서 확인한 것과 같이, 인터페론 람다 4(IFNλ4)인 것이 바람직하나, 본 발명의 변이체는 인터페론 람다 3의 수용체(IL10Rβ 및 IFNλR1)와의 복합체 구조를 기초로 모델링한 결정구조를 기반으로 설계되었으며, 인터론 람다 3(IFNλ3)뿐아니라, 보존서열(Consereved sequence)이 유지되는 III형 인터페론(IFNλ1, IFNλ2, IFNλ3 등) 전체에 확장시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “참조서열(reference sequence)”은 본 발명의 변이의 대상이 람다 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 의미한다. 상기 참조서열 간에는 인터페론 람다의 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 보존서열이 유지될 수 있다.
본 발명에 있어서, 참조서열은 야생형 인터페론 람다의 서열이 바람직하나, 상동성을 갖는 단백질 또는 보존서열을 공유하는 이의 다른 변이체일 수 있으며, 상기 인터페론 람다가 인터페론 람다 4인 경우, 상기 참조서열은 바람직하게는 본 발명의 실시예에서와 같이 서열번호 20일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다가 IFNλ4인 경우, 상기 변이 부위는 서열번호 20의 L28, A54, P73, H97, K154 및 A173에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 인터페론 람다가 다른 인터페론 람다 단백질(예, IFNλ1 내지 IFNλ3)인 경우, 상기 변이 부위는 서열번호 20의 L28, A54, P73, H97, K154 및 A173에 상응하는 아미노산에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “상응하는 아미노산”이란, 다른 인터페론 람다 단백질(예, IFNλ1 내지 IFNλ4)의 아미노산 서열을 IFNλ4 (서열번호 20)와 정렬하는 경우, 서열번호 20의 상기 위치의 아미노산과 대응하는 아미노산을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 변이는 인터페론 람다의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게는 글리코실화를 위해, 아미노산이 아스파라긴(N) 또는 세린(S)으로 치환된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 변이는 서열번호 20에서 L28, A54, P73, H97, K154 및 A173 중 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 것을 특징으로 할 수 있다. 본 밞여에 있어서, 가장 바람직하게는 상기 변이는 서열번호 20에서 L28N 및 P73N 중 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 바람직하게는 서열번호 22 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 22, 24 또는 28일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 인터페론 람다 변이체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체는 상기한 것과 같은 특징 및 구현 예를 공유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 13 내지 19, 바람직하게는 서열번호 13, 15, 및 19로 표시되는 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 인터페론 람다 변이체를 코딩하는 유전자는 정제를 위해 말단에 Protein A 또는 6x-His 태그 등의 태그서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인터페론 람다 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
상기 재조합 벡터는 도입된 유전자가 코딩하는 단백질 발현을 유도할 수 있는 벡터라면 당업자가 당업계에 공지된 벡터를 적절히 선택하여 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 대장균을 숙주로 사용할 경우 T7계열 (T7A1, T7A2, T7A3 등), lac, lacUV5, 온도의존형 (λpL, λpR), phoA, phoB, rmB, tac, trc, trp 또는 1PL 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있고, 효모를 숙주로 사용할 경우 ADH1, AOX1, GAL1, GAL10, PGK 또는 TDH3 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있으며, 바실러스의 경우 P2 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있으나, 이는 일부 실시 양태를 나열한 것으로, 상기 프로모터를 포함하는 벡터 이외에도 본 발명에 따른 인터페론 람다 변이체의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함하는 벡터로써 숙주에 적합한 것이라면 제한없이, 당업계에 공지된 다양한 벡터를 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 세포는 단백질 등을 생산하기 위해, 유전자 또는 재조합 벡터 등이 도입된 발현용 세포를 의미한다. 상기 재조합 세포는 당쇄화된 인터페론 람다를 발현할 수 있는 세포라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 진핵세포, 더욱 바람직하게는 효모, 곤충세포, 동물세포, 가장 바람직하게는 동물세포일 수 있다. 예를 들어 재조합 단백질의 발현에 주로 사용되는 CHO 세포주 또는 HEK 세포주 등이 사용될 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 HEK 세포주인 Expi293 세포주를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 상기 재조합 세포는 “숙주세포” 또는 “제조합 숙주세포” 등과 동일한 의미에서 호환적으로 사용된다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 대장균에서 사용되는 단백질 발현 벡터로는 Novagen (미국) 사의 pET 계열; Invitrogen (미국)의 pBAD 계열; Takara (일본)의 pHCE 나 pCOLD; 제노포커스 (대한미국)의 pACE 계열; 등을 사용할 수 있다. 고초균에서는 게놈의 특정부분에 목적 유전자를 삽입하여 단백질 발현을 구현하거나, MoBiTech (독일)의 pHT 계열의 벡터, 등을 사용할 수 있다. 곰팡이나 효모에서도 게놈 삽입이나 자가복제 벡터들 이용하여 단백질 발현이 가능하다. Agrobacterium tumefaciens나 Agrobacterium rhizogenes 등의 T-DNA 시스템을 이용하여 식물용 단백질 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 상기 기술한 프로모터 이외에도, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 E.coli에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 재조합 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열(Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 고초균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용 가능하다. 예를 들어, CHO 세포주, HEK 세포주 등이 발현을 위한 숙주세포로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인터페론 람다 변이체를 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
상기 재조합 벡터는 형질전환 또는 형질감염 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절 가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
상기 유전자 및 재조합 벡터는 종래에 공지된 다양한 방법을 통해, 숙주세포에 도입될 수 있다. 본 발명의 인터페론 람다 변이체를 코딩하는 유전자가 직접적으로 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에서는 특정 아미노산 서열 및 염기 서열을 기재하였으나, 본 발명에서 실시하고자 하는 효소와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기 서열이 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 실질적으로 동일하다는 것은, 아미노산 또는 염기서열의 상동성이 매우 높은 경우를 포함하고, 그 밖에도 서열의 상동성과는 무관하게 구조적 특징을 공유하거나 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명의 핵심을 구성하는 서열을 제외한 다른 서열이 일부 결실된 단백질 또는 이를 코딩하는 염기서열의 단편도 본 발명에 포함될 수 있으며, 따라서 본 발명은 단편의 길이와는 무관하게 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 아미노산 또는 염기 서열을 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 생산한 신규 인터페론 람다 4 변이체가 야생형 인터페론 람다 4보다 현저히 뛰어난 항 바이러스 활성을 나타내며 및 유사하거나 상향조절된 IFN 신호전달자의 발현을 유도하는 것으로 확인하였으며, 이는 IFNλ4 변이체가 야생형 IFNλ4인 eIFNλ4에 비해 현저히 뛰어난 생물학적 활성을 나타내는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체의 면역조절용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 면역조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역조절방법에 관한것이다.
본 발명의 용어 “면역조절”이란, 혈액 내 면역 불균형을 해소하고 면역 항상성을 유지하는 것을 의미한다. 면역 항상성의 유지는 면역을 억제시키는 면역관용(tolerance)과 면역을 증진하는 면역반응(immunity)간의 균형을 이루는 상태를 일컫는 것으로 이러한 상태의 유지는 암, 자가면역질환 등과 같이 면역조절의 이상이 병원 또는 증상으로 작용하는 질병의 치료에 있어서 필수적인 요소이다. 본 발명에 있어서, 상기 면역조절은 면역강화인 것이 바람직하며, 특히, 인터페론 람다가 관여하는 JAK-STAT 경로를 통한 면역반응의 조절인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 면역조절용 조성물은 인터페론-자극 유전자(interferon-stimulated gene, ISG)의 발현을 현저하게 상향 조절할 수 있다.
상기 면역조절용 조성물은 면역 활성의 조절, 바이러스 및 세균을 포함한 각종 감염증 및 면역관련질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 목적으로 약학 조성물 또는 건강기능식품 등으로 사용될 수 있으며, 이때 사용량 및 사용 형태는 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 대상이란 본 발명의 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 다양한 용도의 조성물을 투여하는 대상을 의미하며, 상기 대상은 세포, 조직에서부터, 각종 식물, 동물 등을 모두 포함하고, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 및 치료용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 용어, “바이러스 감염증”이란, 바이러스에 감염되어 염증, 열, 피로, 오한, 구토, 어지러움, 혼수, 사망 등에 이르는 다양한 임상적 증상을 나타내는 증상을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 예를 들어, HCV, HDV, SARS 바이러스, MERS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스RSV 바이러스일 수 있으며, 최근 유행하는 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 그 유효성분인 인터페론 람다 변이체의 항 바이러스 효과 및 면역기능 향상효과를 통해 각종 바이러스 감염증 및 면역관련질환에 예방 또는 치료효과를 나타낸다. 특히, 포유류의 바이러스 감염 및 특히 인간의 HCV, HDV, SARS, MERS 등의 다양한 바이러스 감염증을 치료하거나, 방지하거나, 지연시키기 위하여 본 화합물 및 조성물이 사용된다.
상기 약학 조성물은 상기 인터페론 람다 변이체를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 변이체 또는 조성물은 항바이러스효과 및 면역증진효과를 가지는 것으로 알려진 종래의 다른 화합물 또는 조성물들과 함께 투여될 수 있으며, 본 발명의 조성물로 인한 부작용을 막기 위해, 면역억제효과를 갖는 다른 화합물 또는 조성물 등과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 변이체 또는 조성물은 특히 항바이러스용도로 사용되는 경우, 다양한 항 바이러스제 또는 보조제와 병용투여 될 수 있으며, 예를 들어, COVID-19의 예방 및 치료용도로 사용 또는 투여되는 경우, 다른 백신, 치료제(예, 렘데시비르, 나파모스타트), 중화 항체 등과 병용투여 될 수 있다.
본 발명의 변이체 또는 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 인터페론 람다 변이체, 면역조절용 조성물 또는 약학 조성물은 현저한 면역증강 효과를 나타내기 때문에, 바이러스 감염증 이외에도 면역저하 또는 이상을 원인 또는 증상으로 하는 각종 질병의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 바이러스 감염증 이외에도 면역저하 또는 이상을 원인 또는 증상으로 하는 각종 질병의 예방 및 치료용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 바이러스 감염증 이외에도 면역저하 또는 이상을 원인 또는 증상으로 하는 각종 질병의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 인터페론 람다 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증 이외에도 면역저하 또는 이상을 원인 또는 증상으로 하는 각종 질병의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 “바이러스 감염증 이외에도 면역저하 또는 이상을 원인 또는 증상으로 하는 각종 질병”은 예를 들어, 암, 종양, 장기이식, 만성신부전, 간경변증, 당뇨 및 고혈당증 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예의 인터페론 람다 4 변이체의 경우, 기존의 인터페론 람다 1 내지 4의 보존 서열이 유지될 수 있도록 구조 기반의 디자인을 통해 생성된 것이기 때문에, 본 발명의 인터페론 람다 변이체 생산방법은 인터페론 람다 4에만 국한되지 않으며, III형 인터페론의 보다 나은 발현 능력, 치료학적 특성 및 생물학적 활성을 나타내는 인터페론 람다를 생성하는데 사용될 수 있으며, 특히 극히 유사한 결합 모델 구조를 기반으로 하는 인터페론 람다 3에도 사용될 수 있다.
본 발명의 인터페론 람다 변이체 생산방법은 수많은 인터페론 람다 변이 부위 중 구조적 기반의 변이 부위 스크리닝을 통해 적은 변이의 유발만으로도 보다 뛰어난 발현능력, 치료학적 특성, 생물학적 활성을 갖는 인터페론 람다 변이체를 생산할 수 있으며, 잠재적 변이 부위의 스크리닝을 도출하는데 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 제14항의 재조합 미생물 또는 재조합 세포를 배양하여 인터페론 람다 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 인터페론 람다 변이체를 수득하는 단계를 포함하는 인터페론 람다 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법으로 제조된 인터페론 람다 변이체는 상기한 것과 같은 특징 및 구현 예를 공유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 실시예에 기재된 본 발명의 람다 변이체 변이방법, 재조합 세포 제조방법, 발현 및 정제 방법 등은 한 구현예에 불과하며, 통상의 기술자가 선택가능한 종래 공지된 발명을 통해 제한없이 용이하게 수행될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1 모델링
3가지 템플릿 (PDB code: 5T5W.1.C, 3OG6.1.A, 3OG4.1.A)을 주형으로 하는 SWISS-MODEL 상동성 모델링에 인간 IFNλ4 아미노산 서열(22~179, NCBI Accession Number: AFQ38559.1)을 사용하였다.
QMEAN-Z(Qualitative Model Energy ANalysis-Z) 점수가 가장 높은 모델(-2.56)을 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1 (PDB code: 5T5W)과 정렬(align)하여, IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1 모델을 생성하였다.
실시예 1-2: 세포주, 세포 배양 및 시약
ATCC 지침에 따라 Expi293F (#A14527, Gibco®) 세포를 배양하였으며, 수령 후 6월 이내에 사용하였다. 세포를 125rpm으로 교반하면서, 37°C 및 8% CO2 조건에서 Expi293F 발현 배지 (#14351, Gibco®) 내 현탁액으로 유지하였다. Huh-7.5 세포는 (Apath) 37°C 및 5% CO2 조건에서 10% 태아 소 혈청(fetal bovine serum, WelGENE), 4.5g/l glucose, L-glutamine, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(1% penicillin/streptomycin, WelGENE)을 함유하는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)에서 유지되었다. IFNλR1에 대한 siRNAs(Small-interfering RNAs) 및 스크램블된 서열은 Santa Cruz Biotechnology로부터 얻었다. IFNλR1 siRNA의 형질주입(transfection)은 lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen)를 사용하여 수행되었다. 재조합 IFN-α-2a는 PBL Assay Science에서, 재조합 IFN-β는 PeproTech에서, 재조합 인간 IFNλ1 (1598-IL), λ2 (8417-IL), λ3 (5259-IL) 및 eIFNλ4 (9165-IL)은 R & D Systems로부터 입수하였다. 대조군인 야생형 IFNλ4는 대장균에서 생산된 eIFNλ4를 사용하였다.
실시예 1-3: 재조합 단백질의 발현 및 정제
인간 IFNλ4(1~179)를 코딩하는 유전자를 C-말단 6xHis 태그를 포함하는 변형된 pcDNA3.1(#V79020, InvitrogenTM)에 클로닝하였다. IFNλ4 변이체는 IFNλ4 wild-type 구조물을 PCR 주형으로 사용하여 부위-지정 돌연변이 유발(QuikChange site-Directed Mutagenesis Kit, #200519, Agilent)을 통해 생성하였다. 부위-지정 돌연변이 유발에 대한 프라이머는 하기 표 1에 나열하였다.
Figure PCTKR2020011035-appb-T000001
M7은 상기 표의 M1 및 M3 돌연변이 유발 프라이머를 동시 사용하여, 이중 돌연변이(L28N+P73N)를 유도하였다.
IFNλ4-Protein A 발현을 위해, IFNλ4 구조물에서 C-말단 6x-His를 PEZZ18 (#VPT4033, GE Healthcare life Sciences) 유래의 Protein A 유전자로 치환하였다. Protein A제거를 위해, PCR 프라이머를 사용하여 IFNλ4 유전자 및 Protein A 유전자 사이에 트롬빈 절단 서열(LVPRGS)을 도입하였다. 6x-His 또는 Protein A를 함유하는 IFNλ4 야생형 및 변이체는 제조사의 프로토콜에 따라 ExpiFectamine 293 Transfection Kits (#A14524, InvitrogenM)를 사용하여 Expi293F 세포로 형질주입되었다. IFNλ4 변이체의 정제를 위해, 분비된 IFNλ4-Protein A를 함유하는 상층액을 IgG Sepharose resin (#17096902, GE Healthcare Life Sciences)에 로딩하였다. 1x PBS로 3회 세척한 후, 단백질-결합 수지를 트롬빈(1% (v/v) in 1x PBS)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 C-말단 ProteinA 태그를 제거하였다. 이어서, 용출된 IFNλ4 변이체를 1xPBS로 평형화된 Superdex 200 Increase 10/300 GL column(#28990944, GE Healthcare Life Sciences)에서 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 1-4: 면역블롯법(Immunoblotting)
세포를 RIPA 버퍼 (Thermo Fisher Scientific)로 용해하여, 총 세포 용해액을 제조하였다. 각각의 세포 용해액의 10 μg을 면역블롯 전에 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 면역블롯법에 사용된 항체는 다음과 같다: IFNλ4 (1:200, mouse, Millipore MABF227), IFNλ4 (1:200, rabbit, Abcam ab196984), STAT1 (1:1000, rabbit, BD Biosciences 610120), PY-STAT1 (1:1000, mouse, BD Biosciences 612233), STAT2 (1:1000, rabbit, Santa Cruz Biotechnology sc-476), IRF9 (1:1000, rabbit, Santa Cruz sc-496), SOCS1 (Abcam #62584), USP18 (Cell Signaling Technology #4813), HRP(horseradish peroxidase)-접합 rabbit IgG (1:5000, Abcam ab97051), 및 HRP-접합 mouse IgG (1:5000, Abcam ab97023).
실시예 1-5: PNGase F 처리
제조사의 지시에 따라 PNGase F kit (#P0704S, New England Biolabs)를 사용하여 IFNλ4의 N-글리칸을 제거하였다. 구체적으로, IFNλ4 변이체는 당단백질 변성 버퍼(Glycoprotein Denaturing Buffer, 10x)로 끓여 얼음으로 식혔다. 글리코버퍼(GlycoBuffer, 10x), NP-40(10x), 및 1μl의 PNGase F를 변성 단백질에 첨가하고 혼합물을 웨스턴 블롯 분석 전에 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다.
실시예 1-6: 클리코실화 부위 분석
비특이적 분해(digestion)로 생성된 글리코펩타이드는 공지된 방법으로 제조되었다(Journal of proteome research 2013;12:4414-23). 구체적으로 50μg/μl의 IFNλ4 변이체를 37℃에서 1시간동안 50μg/μl의 pronase E와 인큐베이션하였다. 분해(digestion)된 글리코펩타이드를 흑연화된 탄소 고체상 추출법(graphitized carbon solid-phase extraction; PGC-SPE)으로 강화하고, nanoLC-Chip Q-TOF MS (Agilent Technologies)으로 분석하였다. LC-MS 및 MS/MS 데이터는 MAssHunter Qualitative Analysis 소프트웨어(version B.07.00, Agilent Technologies) 및 GP Finder 소프트웨어로 처리 및 해석되었다(Journal of proteome research 2006;5:2800-8).
실시예 1-7: 결합 동역학 확인
IFNλR1 및 IL10Rβ에 대한 IFNλ4 변이체 결합 동역학을 BLItz 시스템 (ForteBio, Pall Life Sciences)에서 생물층 광 간섭법(biolayer light interferometry; BLI)을 사용하여 측정하였다. 혼합물을 세척 버퍼(200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 5% glycerol, 0.01% Tween-20)에서 2,200 rpm으로 교반하였다. 상온에서 분석을 수행하였다. 025mg/ml 농도의 비오티닐화 IFNλ4(Biotinylated IFNλ4)를 스트렙타비딘 바이오센서(ForteBio)의 표면에 1분간 로딩한 후, 로딩된 바이오 센서를 세척 버퍼 (200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 5% glycerol, 0.01% Tween-20)로 2분동안 세척하여, 비결합 단백질을 제거하였다. 바이오센서 팁을 지시된 농도의 IFNλR1 및 IL10Rβ (500, 1000 and 2000 nM)을 포함하는 방울(drops)에 침지하였다. 2분 간격으로 결합(Associations (on rate, kon))을 측정하였다. 이어서, 센서를 세척 버퍼에 2분동안 침지시켜, 해리(off-rate koff)를 측정하였다. 나노몰로 측정된 Kd는 off-rate 대비 on-rate의 비로 계산되었다. 전체 global fitting 함수를 사용하여 1:1 리간드 모델에 맞춤으로써 결과 데이터를 분석하였다.
실시예 1-8: HCV 유래 세포 배양액(HCVcc)의 생산 및 감염
HCVcc의 일본 fulminant hepatits-1 (JFH-1) 균주 (genotype 2a)는 앞서 기재한 방법과 같이 생산하였다 (Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112:10443-8). 전염성 JFH1 HCVcc를 생성하기 위해 5% 인간 혈청을 함유하는 DMEM을 Huh-7.5 세포를 배양하는데 사용하였다. 기존에 공개된 방법인비색 초점 형성 분석(colorimetric focus-forming assay)으로(PLoS One 2012;7:e43960), HCVcc 감염성을 정량화하였다. Huh-7.5 세포를 0.5MOI(multiplicity of infection)에서 JFH-1 HCVcc로 감염시켰다.Huh-7.5 세포를 0.5MOI(multiplicity of infection)에서 JFH-1 HCVcc로 감염시켰다.
실시예 1-9: RNA 추출 및 Real-Time 정량 PCR
전체 RNA 분리 및 TaqMan Real-Time 정량 PCR은 종래에 공지된 방법으로 수행하였다(20). 구체적으로, GeneAll RibospinTM(GeneAll)으로 총 RNA를 분리한 후, TaqMan 유전자 발현 분석(Applied Biosystems)을 사용하여 표적 유전자의 mRNA 수준을 측정했다. 세포 내 HCV RNA 복제의 정량화는 기존에 공지된 방법으로 수행하였다(Journal of virology 2014;88:9233-44). 결과는 GAPDH의 mRNA 수준으로 표준화하였으며, 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(Standard error)로 계산되었다. 본 발명에 사용된 TaqMan 분석(Applied Biosystems)은 다음과 같다: IFNLR1 (Hs00417120_m1), ISG15 (Hs01921425_s1), MX1 (Hs00895608_m1), SOCS1 (Hs00705164_s1), USP18 (Hs00276441_m1), GAPDH (Hs02758991_g1). 본 발명에 사용된 IFNL 단백질(R&D Systems)은 다음과 같다: IFNL1 (1598-IL), IFNL2 (8417-IL), IFNL3 (5259-IL), eIFNL4 (9165-IL).
실시예 1-10: 통계 분석
세포주를 사용한 실험의 데이터는 평균±평균의 표준오차(SE)로 제시된다. 통계 분석을 위해 Unapaired t-test 또는 two-tailed Mann-Whitney U-test를 수행하였다. Real-Time 정량 PCR에 대한 모든 분석은 GraphPad Prism version 7.01로 수행하였으며, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의미한 값임을 의미한다.
실시예 2: IFNλ4 변이체의 설계 및 발현
야생형 IFNλ의 수용체에 대한 낮은 친화성은 안정한 3-복합체-IL10Rβ-IFNλ-IFNλR1의 생성을 저해한다. 따라서, IFNλR1과의 복합체에서 IFNλ3 단독(The Journal of biological chemistry 2009;284:20869-75) 또는 IFNλ1(J Mol Biol 2010;404:650-64)의 구조만이 확인되었다. 최근 Mendoza, et al.은 IFNλ3에 친화성 향상 변이를 도입하여, IL10Rβ와의 상호작용을 안정화하였으며, III형 인터페론 신호전달 복합체 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1의 결정구조를 설명하였다(PDB code: 5T5W) (도 1A). IFNλ4가 IFNλ1 내지 IFNλ3과 약 30%의 서열 동일성을 공유하지만, IFNλ1 내지 4의 서열 정렬 결과는 IFNλ4가 두 가지 이유에서 IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1 3복합체(ternary complex) (Immunity 2017;46:379-92)와 유사한 방식으로 IFNλR1 및 IL10Rβ과 상호작용한다는 것을 시사한다. 첫째로, IFNλR1 결합에 중요한 IFNλ 패밀리의 아미노산은 IFNλ4 (P37, L40, K44, R47, D48, I108, F159 및 R163)에서 잘 보존되어있다(도 1B). 둘째로, IL10Rβ의 여러 방향족 잔기 (Y59, Y82, Y140 및 W143)의 하이드록실 그룹은 IFNλ3 (S44, L45, Q48R 및 E106D)와 수소결합 네트워크를 형성하고; 이들은 IFNλ4 (S34, L35, R48 및 Q100)에서도 잘 보존되어있다. 따라서, IFNλ3 및 IFNλ1의 결정구조를 이용하여, IFNλ4의 구조를 모델링하고 (도 1A), IL10Rβ-IFNλ3-IFNλR1 구조정으로 정렬하여 IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1 모델을 구축하였다(도 1B). 흥미롭게도, IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1의 모델 구조는 IL10Rβ의 소수성 잔기 (Y82 및 W143)를 정착시키기(harboring) 주요한 소수성 포켓이 IFNλ4의 표면에서 잘 유지되고 있음을 나타낸다(도 1C).
IL10Rβ-IFNλ4-IFNλR1 모델 구조를 사용하여, 3가지 기준(criteria)에 기초하여, IFNλ4의 새로운 N-글리코실화 후보부위를 스크리닝 하였다.
- 첫째, 수용체-리간드 결합 및 신호 활성의 변화를 최소화하기 위해 수용체 결합 영역 밖에 존재할 것.
- 둘째, 지질-연결 올리고사카라이드에서 기질 아스파라긴으로 글리칸의 초기 이동을 촉매하는 올리고사카릴 전달효소(oligosaccharyltransferase; OST)에 접근할 수 있도록 변이부위의 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 표면에 노출될 것에 노출될 것.
- 셋째, 변이로 인한 구조적 왜곡을 최소화하기 위해서 한점 돌연변이(single point mutation)로 글리코실화가 가능한 공통 염기서열(consensus sequence; NXS/T, X=프롤린을 제외한 임의의 아미노산)이 달성될 것.
상기 세 가지 기준을 모두 충족하는 사이트는 L28, A54, P73, H97, K154 및 A173로 총 6개가 도출되었다(도 1A 및 1B) 각각 m1 내지 m6로 명명하였다.
실시예 1-3의 표 1에 도시된 프라이머를 이용하여, m1 내지 m6의 위치의 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환된 변이체(M1 내지 M6)를 제조하였으며, L28(m1) 및 P73(m3)가 모두 아스파라긴(N)으로 치환된 이중 변이체(M7)을 제조하였다. 제조된 각각의 인터페론 람다 변이체(M1 내지 M7)의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 각각 다음 표 2 및 표 3과 같다.
Figure PCTKR2020011035-appb-T000002
Figure PCTKR2020011035-appb-I000001
Figure PCTKR2020011035-appb-T000003
다음으로, 웨스턴 블롯을 사용하여, IFNλ4 변이체(M1~M6)의 발현 수준을 조사하고, 2개의 IFNλ4 변이체, M1 (L28N 돌연변이) 및 M3 (P73N 돌연변이)에서 단백질 발현이 향상되는 것을 확인하였다 (도 2A).
흥미롭게도, M3만이 SDS-PAGE에서 현저한 상향 시프트를 나타내었으며, 이는 과당쇄화가 성공적으로 진행되었음을 의미한다. 또한, 이중 돌연변이(L28N 및 P73N, M7)는 M1 및 M3 변이체와 비교하여, 단백질 발현이 더욱 향상되었다(도 2A). hit discovery를 위해 웨스턴 블롯에 사용된 작제물은 C-말단에 6x Histidine tag를 보유하며, 이는 IFNλ4의 양 전하를 갖는 아미노산의 광범위한 붙포를 고려하면, 단백질의 적절한 분비를 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 Protein A tag의 제거 및 후속 크기 배제 크로마토그래피를 위해, 6x His tag를 Protein A tag로 대체하고, 친화력 크로마토그래피 및 트롬빈 분해를 사용하여 IFNλ4 변이체(M1, M3 및 M7)를 정제하였다. 최종 IFNλ4 변이체(M1, M3, 및 M7)를 환원 및 비환원 조건에서, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 사용하여 분석하였다. 결과 밴드는 3개의 IFNλ4 변이체(M1, M3, 및 M7)가 모노머임을 나타낸다(도 2B). 표준 단백질의 용출 프로파일은 각각의 단분산된 피크가 IFNλ4 변이체(약 44kDa)에 해당함을 의미한다(도 2C). 대부분의 경우, 이러한 대형 용출(oversized elution)은 IFNλ4에 N-글리코실화가 존재하기 때문이며, 이는 실시예 3에 기재된 결과로 검증하였다.
실시예 3: IFNλ4 변이체의 N-글리칸 식별(Identification)
상기 3개의 IFNλ4 변이체에서, N-글리칸의 존재를 확인하기 위해, PNGase F로 처리하고, 크기를 SDS-PAGE로 비교하였다. M3 (P73N) 및 M7 (L28N + P73N) IFNλ4 변이체는 M1 (L28N) IFNλ4 변이체와 비교하여 더 높은 분자량을 나타내었다. 그러나 PNGase F를 사용한 탈당화 후, 3개의 IFNλ4 변이체의 분자량이 동일한 수준으로 감소하여, 모든 IFNλ4 변이체에서 N-글리칸이 존재함을 확인하였지만, M1 N-글리코실화 부위는 M3 및 M7 IFNλ4 변이체의 N-글리코실화 부위와 다소 차이가 있을 수 있다(도 3A).
IFNλ4 변이체에서 N-글리칸의 정확한 위치를 결정하기 위해 질량 분석법을 사용하였다. 정제된 IFNλ4 변이체를 프로나아제 E(pronase E)로 처리하여 글리코펩타이드를 생성하였으며, 최종적으로 글리코실화 부위를 결정하였다. 이어서, 글리코펩타이드를 분리하고, nanoLC-Chip Q-TOF MS를 사용하여 분석하였다. LC/MS 데이터는 M1 및 M7 IFNλ4 변이체에서 변이된 L28N이 글리코실화되지 않은 반면, 원래의 N-글리코실화 부위인 Asn61 및 변이된 P73N이 N-글리칸에 의해 완전히 점유되었음을 나타낸다(도 3B 내지 3D). 이는 M1(L28N)이 M3(P73N) 또는 M7(L28N+P73N)보다 더 빠르게 이동하는 것으로 나타난 PNGase F 처리 결과와 일치한다.
실시예 4: IFNλ4 변이체의 수용체 결합 친화도 및 생물학적 활성
IFNλ4 변이체상의 돌연변이 및 추가적인 글리칸이 이의 수용체인 IL10Rβ 및 IFNλR1에 대한 결합에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 생물층 광 간섭법(biolayer light interferometry; BLI)으로, IL10Rβ 및 IFNλR1에 대한 IFNλ4 변이체의 in vitro 결합 친화력을 검사한 뒤, E.coli에서 정제된 야생형 IFNλ4 (eIFNλ4)과 비교하였다. eIFNλ4와 유사하게, 상기 3개의 IFNλ4 변이체는 수용체에 적절하게 결합하였으며, IFNλR1에 대한 결합 친화도는 IL10Rβ보다 높았다 (도 4). 또한, 본 발명의 IFNλ4 변이체는 eIFNλ4에 비해 IL10Rβ에 대해 다소 높은 친화력을 가졌으며 (IL10Rβ의 경우, KD M1 = 49 nM, KD M3 = 51 nM, KD M7 = 49 nM, KD eIFNλ4 = 71 nM), IFNλR1에 대한 결합 친화도는 eIFNλ4과 유사하였다 (IFNλR1의 경우, KD M1 = 14 nM, KD M3 = 22 nM, KD M7 = 17 nM, KD eIFNλ4 = 19 nM). 돌연변이 및 글리코실화에 의해 유발 된 변형은 그들의 특이 적 수용체와의 상호 작용을 억제하지 않으며, IFNλ4와 IL10Rβ 사이의 상호 작용을 더욱 안정화시킨다.
IFNλ4 변이체상의 돌연변이 및 추가적인 글리칸이 기능적 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 IFNλ4 변이체를 처리하는 경우의 IFNλR1 의존적 phospho-STAT1 신호전달을 확인하였다. 그 결과, M1, M3 및 M7 IFNλ4 변이체가 다른 III형 인터페론인 IFNλ1~3과 마찬가지로, STAT1의 인산화를 유도하고, IFNλR1유전자에 특이적인 작은 간섭 RNA(siIFNλR1)로 IFNλR1 발현을 억제하는 경우, IFNλ4 변이체를 처리하더라도 STAT1의 인산화가 차단되었음을 확인하였다(도 5A).
IFNλ4 자극은 phospho-STAT1, phospho-STAT2 및 IRF9로 구성된 ISGF3 전사인자 복합체의 조립 및 항 바이러스 활성에 중요한 ISG15의 발현을 유도을 유도하는 것으로 보고된다(27, 28). 도 5B 및 5C에 도시된 것과 같이, M1. M3 및 M7 IFNλ4 변이체가 ISG15의 발현을 유도하고 HCV-감염된 Huh-7.5 세포에서 HCV의 복제를 억제함을 확인하였다. 흥미롭게도, M1. M3 및 M7 IFNλ4 변이체는 eIFNλ4보다 현저히 높은 ISG 유도 및 항 바이러스 활성을 나타낸다.
IFNλ 단백질에 대한 장기간의 노출은 티로신 인산화 없이 STAT1, STAT2 및 IRF9로 구성된 비 인산화 된 ISGF3 (U-ISGF3)의 생성을 유도하는 반면 인산화 된 ISGF3의 발현은 감소된다 (PLoS One 2012;7:e43960). 그 결과, Mx1과 같은 U-ISGF3-특이적 유전자 세트의 상향조절이 장기간 유지된다. M1, M3 및 M7 IFNλ4 변이체의 장기간 처리가 유사한 기능을 나타내는지 확인하기 위해, U-ISGF3 구성요소의 단백질 수준을 평가하여, STAT1, STAT2 및 IRF9의 단백질 수준은 모든 IFNλ4에 의해 동일하게 상향 조절됨을 확인하였다(도 5D). 또한, IFNλ4 변이체는 eIFNλ4보다 Mx1 발현의 상향 조절에 대한 유지력이 현저히 뛰어났으나, IFNλ1, IFNλ2 및 IFNλ3은 IFNλ4 변이체에 비해 Mx1 발현의 상향 조절을 더 강하게 유지하는 것을 확인하였다.
종래, eIFNλ4는 SOCS1 및 USP18과 같은 IFN 신호 전달의 음성 조절자의 발현을 유도하는 것으로 보고된 바 있다 (Sci Rep 2017;7:3821; Journal of immunology 2017;199:3808-20). 글리코실화로 인한 IFN 신호 전달 음성 조절자의 발현에 대한 영향을 평가하기 위해, Huh7 세포주에 M1, M3 및 M7 변이체를 처리하는 경우의 SOCS1 및 USP18의 발현 수준을 조사하였다. IFNλ1, 2 및 3를 처리하는 경우, USP18의 수준이 유의하게 증가하는 반면, eIFNλ4는 USP18 수준을 미약하게 증가시켰다. 그러나, IFNλ4 변이체 (M1, M3 및 M7)는 IFNλ1, 2 및 3과 유사한 활성을 나타냈다 (도 5F). SOCS1의 단백질 발현은 어떠한 유형의 IFNλ의 처리에도 유의한 증가를 나타내지 않았다(도 5F). 다만, IFNλs 유형 간의 차이 없이 IFNλs의 처리는 SOCS1의 mRNA 발현은 다소 상향조절되었다(도 5G).
실시예의 결과는 본 발명의 신규한 글리코실레이션 선택에 대한 구조 기반의 접근 방식이 IFNλ4의 생물학적 활성을 유지시킬 수 있음을 나타내며, 특히, HEK293으로부터 발현된 본 발명의 IFNλ4 변이체가 eIFNλ4에 비해 현저히 뛰어난 활성을 나타내는 것을 의미한다. 이러한 IFNλ4 변이체의 결과는 설계의 특성상 인터페론 람다의 주요 작용잔기 등을 보존하고 있으므로, 동일한 수용체와 작용하는 III형 인터페론(IFNλ1 내지 4) 전반으로 확장이 가능하다 할 것이다. 최근 세계적인 대유행을 불러일으키고 있는 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19)에 인터페론 람다의 처리를 통한 임상시험이 속속 보고되고 있으며(임상 번호: NCT04388709; NCT04354259), MERS에 대한 효과가 논문을 통해 보고된 바 있음을 고려하면 (Antiviral Res. 2020 Aug; 180: 104860), 생산력 및 항바이러스성이 현저히 뛰어난 본 발명의 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법은 COVID-19의 예방 및 치료에도 보다 뛰어난 실용성 및 효과를 나타낼 수 있음은 자명하다.
본 발명의 신규한 인터페론 람다 변이체 및 이의 제조방법은 구조적 정보 기반의 글리코엔지니어링을 통해 통상의 정제 프로토콜을 통해서도, 포유류 세포주에서 현저히 향상된 생산 및 수율을 나타내며, 안정성, 반감기, 처리시 기능성 단백질의 분율 등 야생형 인터페론 람다에 비해 현저히 향상된 치료학적 특성을 나타낸다. 또한, 항 바이러스 활성 및 인터페론-자극 유전자 (interferon-stimulated gene, ISG)의 유도 수준에서, 야생형 인터페론 람다보다 현저히 뛰어나므로, 면역조절을 통한 암, 자가면역 질환 등과 같은 면역 관련 질환 및 코로나 바이러스를 포함한 다양한 바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (17)

  1. 다음 중 어느 하나 이상의 조건을 만족하는 하나 이상의 부위에 변이를 포함하는 인터페론 람다 (Interferon lambda; IFNλ) 변이체:
    (i) 인터페론 람다 수용체 결합 영역 밖일 것;
    (ii) 변이된 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 표면에 노출될 것; 및
    (iii) 한 점 돌연변이(single point mutation)에 의해 글리코실화가 가능한 공통 염기서열(Consensus sequence)이 달성될 것,
    여기서, 상기 글리코실화가 가능한 공통 염기서열은 N-X-(S 또는 T) 이고, 상기 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (i) 조건의 인터페론 람다 수용체는 IL10Rβ 또는 IFNλR1인 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이로 인해 인터페론 람다의 어느 한 부위 이상이 글리코실화(glycosylation)되는 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 글리코실화(glycosylation)는 N-글리코실화인 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 야생형 인터페론 람다에 비해 전체 전하가 감소한 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 야생형 인터페론 람다에 비해 in vivo에서 반감기가 증가한 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 야생형 인터페론 람다에 비해 인터페론 람다 상호간의 소수성 상호작용이 감소한 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인터페론 람다는 인터페론 람다 4(IFNλ4)인 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 부위는 상기 변이는 서열번호 20에서 L28, A54, P73, H97, K154 및 A173 중 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  10. 제8항에 있어서, 서열번호 20에서 L28 및 P73 중 어느 하나 이상이 아스파라긴으로 치환된 것을 특징으로 하는 인터페론 람다 변이체.
  11. 제1항의 인터페론 람다 변이체를 코딩하는 유전자.
  12. 제11항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제1항의 유전자 또는 제12항의 벡터가 도입된 재조합 숙주세포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 면역조절용 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 인터페론 람다 변이체를 포함하는 암, 종양, 이식거부, 만성신부전, 간경변증, 당뇨 또는 고혈당증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  17. 제13항의 재조합 세포를 배양하여, 다음 중 어느 하나 이상의 조건을 만족하는 인터페론 람다의 하나 이상의 부위에 변이를 포함하는 인터페론 람다 변이체를 발현하는 단계; 및
    상기 발현된 인터페론 람다 변이체를 수득하는 단계를 포함하는 인터페론 람다 변이체의 생산방법:
    (i) 인터페론 람다 수용체 결합 영역 밖일 것;
    (ii) 변이된 아미노산 잔기가 인터페론 람다의 표면에 노출될 것; 및
    (iii) 상기 변이에 의해 글리코실화가 가능한 공통 염기서열(Consensus sequence)이 달성될 것,
    여기서, 상기 글리코실화가 가능한 공통 염기서열은 N-X-(S 또는 T) 이고, 상기 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임.
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