WO2021194186A1 - Vgll1 펩타이드를 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

Vgll1 펩타이드를 포함하는 암 치료용 조성물 Download PDF

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WO2021194186A1
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vgll1
cancer
peptide fragment
variant
seq
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원미선
김보경
임주영
김다미
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원큐어젠 주식회사
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating cancer comprising a VGLL1 peptide and a method for treating cancer using the same.
  • the present invention was made with the support of the Korean government in accordance with the Ministry of Science and ICT's task number 1711098598, "Basic Research Project in Science and Engineering".
  • the present invention was made with the support of the Korean government in accordance with the Ministry of Science and ICT's task number 1711081422, "Original technology development project (biomedical technology)”.
  • the present invention was made with the support of the Korean government in accordance with the Ministry of Science and ICT's task number 1711100103, "Main Project (2019-2023)".
  • Cancer has a high mortality rate worldwide and is the second most common cause of death in Western societies after cardiovascular disease.
  • colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, etc. continue to increase due to the aging of the population, generalization of high-fat diet intake due to westernization of diet, rapid increase in environmental pollutants, and increase in alcohol consumption.
  • anticancer substances that can contribute to the promotion of human health, the improvement of the quality of healthy life, and the promotion of human health by enabling the early prevention and treatment of cancer.
  • a substance that causes mutation is called a carcinogen, and the step in which genetic modification occurs by this carcinogen is called initiation.
  • cancer suppressor genes eg, p53, PTEN, INK family, RB
  • constitutive active mutations active mutants, such as EGFR mt , RasG 12V
  • active mutants such as EGFR mt , RasG 12V
  • epidermal growth factor produces an activation signal by binding to the EGF receptor, but active mutants always send an activation signal to the downstream signaling system even if the ligand does not bind to the receptor.
  • One mutant cell generated in this process must penetrate the immune defense system in the body and grow into a tumor mass. This process is called promotion.
  • the promotion process requires a long time and mainly consists of activation of the signal transduction system.
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor- ⁇
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • the vestigial (vg) gene which is a coactivator of the Drosophila transcription factor, and the vestigial-like (VGLL) gene, which has structural similarity, acts as a cofactor for the transcription factors TEADs (TEA domain transcription factors) that bind to the TEA region.
  • TEADs TEA domain transcription factors
  • VGLL3 overexpression in gastric cancer patients is known to be associated with a low survival rate.
  • VGLL4 which binds TEAD competitively with YAP (Yes-associated protein), has been reported as a tumor suppressor.
  • VGLL1 forms a VGLL1-TEAD complex with high structural homology with YAP and TAZ (transcription coactivator with a PDZ-binding motif).
  • TAZ transcription coactivator with a PDZ-binding motif.
  • VGLL1 which is highly expressed in gastric cancer and correlates with the prognosis of patients with PIK3CA or PIK3CB overexpression, as a gene associated with gastric cancer malignancy.
  • the transcription of VGLL1 is regulated through the signaling mechanism of PI3K-AKT- ⁇ -catenin.
  • the VGLL1-TEAD complex was involved in the proliferation and metastasis of gastric cancer by increasing the expression of Matrix metallopeptidase 9 (MMP9).
  • MMP9 Matrix metallopeptidase 9
  • VGLL1 The specific action of VGLL1 in relation to the proliferation and metastasis of a series of cancer cells is unknown. With respect to VGLL1, there have been reports of a method for predicting the survival period of a patient with lung cancer using VGLL1 as a biomarker, or cancer cell proliferation or cancer metastasis related to the enhancement of VGLL1 expression in some literatures.
  • the present inventors have found that the peptide fragment of VGLL1 not only inhibits the expression of MMP9 but also inhibits the proliferation of cancer cells, thereby completing the present invention as a cancer therapeutic agent.
  • An object of the present invention is to provide a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer comprising administering the VGLL1 peptide fragment or a variant thereof to a subject.
  • One aspect of the present invention provides a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less.
  • the VGLL1 peptide fragment or variant thereof may be a VGLL1 peptide fragment or variant thereof having a sequence of 6 to 25 amino acids.
  • the VGLL1 peptide fragment or variant thereof may be a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the serine sequence at position 84 in the amino acid sequence between positions 52 and 115 of SEQ ID NO: 1.
  • the VGLL1 peptide fragment or a variant thereof may be a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof consisting of the 84th serine and 6 to 20 amino acids adjacent thereto.
  • the VGLL1 peptide fragment or variant thereof may be any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 9, the VGLL1 peptide fragment or variant thereof.
  • it may be a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof further comprising a cell-penetrating peptide.
  • the cell-penetrating peptide may be any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12 to 19, a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof.
  • it may be a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the VGLL1 peptide fragment or a variant thereof.
  • the cancer is gastric cancer, liver cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, head and neck squamous cell carcinoma, esophageal cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, mesothelioma, melanoma, sarcoma, It may be a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of any one cancer selected from the group consisting of osteosarcoma, liposarcoma, thyroid cancer, eugenoma, and hematologic cancer.
  • the cancer may be a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of gastric cancer.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating cancer comprising administering the composition to a subject.
  • the peptide fragment of VGLL1 containing the 84th serine of the present invention has an excellent effect in preventing and treating cancer by inhibiting the proliferation of cancer cells and inhibiting the invasion of cancer cells.
  • FIG. 11 shows the results of confirming the inhibition of proliferation of cancer cells by treatment with a peptide fragment of VGLL1 and a mutant thereof.
  • the present invention provides a VGLL1 peptide fragment or variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less.
  • the variant of the VGLL1 peptide fragment containing the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less includes the 84th serine of SEQ ID NO: 1 while containing the 84th serine (Serine) It may be any sequence having up to 35 between positions 115 and 115 or a variant thereof.
  • peptide and “protein” are used interchangeably and include reference to a polymer of amino acid residues.
  • the terms apply to natural amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues are artificial chemical analogues of the corresponding natural amino acid.
  • the terms also apply to those polymers containing conservative amino acid substitutions such that the protein remains functional.
  • the peptide may be synthesized using a gene recombination and protein expression system, and preferably synthesized in vitro through a peptide synthesizer or the like.
  • VGLL1 peptide refers to a polypeptide corresponding to the full-length VGLL1 protein. The term also includes any homologue, analog, fragment or derivative of the VGLL1 protein. In one embodiment, the isolated VGLL1 peptide has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).
  • VGLL1 encoding nucleic acid means DNA or RNA encoding at least a portion of a VGLL1 polypeptide or variant thereof.
  • the VGLL1 peptide fragment having a length of 35 amino acids or less may be 7 to 35 amino acids, preferably 7 to 25 amino acid residues, and more preferably 6 to 15 amino acids. or 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, or 35 amino acids in length, or an amino acid chain comprising any conceivable range thereof.
  • the VGLL1 peptide fragment of the present disclosure in some embodiments, has no more than 35 contiguous amino acids in the amino acid sequence between positions 52 and 115 of the VGLL1 peptide sequence of SEQ ID NO: 1 and includes Serine at position 84 may consist of a sequence of
  • the VGLL1 peptide fragment according to the present invention may be a 30 amino acid sequence having the amino acid sequences 55 to 84 of SEQ ID NO: 1 when the 84th serine of the sequence is included at the end.
  • the VGLL1 peptide fragment may be a 35 amino acid sequence having the amino acid sequence 80 to 114 of SEQ ID NO: 1 including the 80th serine of the sequence at the end.
  • amino acids having a sequence of 35 or less amino acids adjacent to and centering on the 84th serine sequence are fragments of the VGLL1 peptide included in the scope of the present invention.
  • it may be any sequence such that the total number of amino acid sequences is 35 or less, centering on the 84th serine sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it may be a sequence comprising or consisting of serine at position 84 of the amino acid sequence of the VGLL1 protein and 8 to 25, preferably 7 to 20 amino acids, and more preferably 6 to 15 amino acids adjacent thereto.
  • any sequence according to the present invention is, for example, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 of the VGLL1 peptide sequence of SEQ ID NO: 1 84, 85, 86 starting from any selected amino acid sequence at position , 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, or 82 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114 or any selected amino acid sequence up to the 115th amino acid sequence, and any sequence that satisfies the above-mentioned 35 or less can be included in the peptide fragment within the
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consisting of sequences 77 to 91 of VGLL1. More specifically, it may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 consisting of sequences 82 to 88 of VGLL1.
  • Such exemplary VGLL1 peptide fragment sequences are shown in SEQ ID NOs: 2 to 9 of Table 1 below, and this sequence includes the 84th serine sequence of the VGLL1 peptide, and corresponds to the sequence shown as an example, It is not limited.
  • SEQ ID NO:2 SEQ ID NOs: 77-91 PNQWRYSSPWTKPQP SEQ ID NO:3 SEQ ID NOs: 78-90 NQWRYSSPWTKPQ SEQ ID NO:4 SEQ ID NOs: 79-89 QWRYSSPWTKP SEQ ID NO:5 SEQ ID NOs: 80-88 WRYSSPWTK SEQ ID NO:6 SEQ ID NOs: 80-87 WRYSSPWT SEQ ID NO:7 SEQ ID NOs: 80-86 WRYSSPW SEQ ID NO:8 SEQ ID NOs: 81-87 RYSSPWT SEQ ID NO: 9 SEQ ID NOs: 82-88 YSSPWTK
  • biologically active refers to a peptide fragment having a similar structural function, and/or a regulatory function, and/or a biochemical function similar to that of an individual wild-type polypeptide as well as a peptide according to the present invention.
  • variant refers to any having a substitution, deletion or addition (or any combination thereof) from one (or more) amino acids or to a sequence, including allelic mutations, compared to a wild-type peptide. refers to a peptide (including a peptide encoded by a corresponding nucleic acid). In certain embodiments, the resulting polypeptide retains at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% or more of biological activity as compared to a wild-type polypeptide when used in the present invention. .
  • the variant according to the present invention is a sequence necessarily containing S84 of SEQ ID NO: 1, and is a sequence having 35 or less amino acids in which a mutation occurs at any site of the VGLL1 peptide between positions 52 and 115. maintaining activity.
  • Sequence identity or homology can be determined using standard techniques known in the art. Alignment will include the introduction of gaps in the sequence being aligned. It is also understood that for sequences comprising more or fewer amino acids compared to the proteins disclosed herein, the percentage of homology will be determined based on the number of homologous amino acids compared to the total number of amino acids.
  • variants of the VGLL1 polypeptide have at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least the peptide sequence of SEQ ID NO: 1 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence homology.
  • the variant according to the present invention is a variant of the VGLL1 peptide fragment containing the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less, and the 52nd to 115th of SEQ ID NO: 1 at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least taking into account the corresponding sequence between the 52nd to 115th sequences above. 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence homology.
  • a “deletion” is defined as a change in a nucleotide or amino acid sequence that lacks one or more nucleotide or amino acid residues, respectively, compared to a wild-type polynucleotide or polypeptide.
  • insertion or “addition” is a change in nucleotide or amino acid sequence resulting from the addition of one or more nucleotide or amino acid residues, respectively, compared to a wild-type polynucleotide or polypeptide.
  • substitution results from the replacement of one or more nucleotides or amino acids by different nucleotides or amino acids, respectively, compared to a wild-type polynucleotide or polypeptide.
  • the cytokine TGF-b induces phosphorylation of intracellular signaling proteins.
  • Treatment of TGF-b in cancer cells can induce phosphorylation of VGLL1.
  • a peptide fragment including S84 of VGLL1 can inhibit the expression of MMP9 by competitively inhibiting the binding of VGLL1 and TEAD4.
  • Amino acids that can be phosphorylated by TGF-b include serine, threonine and tyrosine. Accordingly, although not limited thereto, it may be preferable that the sequences 54, 59, 61, 62, 64, 66, 74, 76, 82, 83, 84 and 96 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are maintained without mutation. have.
  • preferred amino acid mutation at the substitution position may be performed based on the similarity of residues in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphiphilic properties.
  • negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid
  • positively charged amino acids include lysine and arginine
  • amino acids having an uncharged polar head group having a similar hydrophilicity value include leucine, isoleucine and valine; glycine and alanine; asparagine and glutamine; serine, threonine, phenylalanine and tyrosine;
  • Such mutations may include conservative substitutions.
  • a 'conservative substitution' refers to a substitution in which an amino acid is substituted with another amino acid having similar properties so that those skilled in the art can predict that the secondary structure and hydropathic nature (hydropathic nature) of the polypeptide are substantially unchanged.
  • the following groups of amino acids exhibit conservative changes: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his.
  • Exemplary amino acid substitutions that do not show a change in biological activity may include, but are not limited to, mutations at positions 85 and 87 of SEQ ID NO: 1.
  • P85A, T85A in SEQ ID NO: 1 may be a mutation.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following amino acid mutations at the aforementioned substitution positions: S-A, P->A, T->A, or Y->A.
  • variants may include non-conservative alterations.
  • the variant polypeptide may differ from the native sequence by substitution, deletion or addition of 5 amino acids or fewer amino acids.
  • variantants may also be altered, for example, by deletion or addition of amino acids with minimal impact on the secondary structure and hydropathic properties of the polypeptide.
  • the variant is phosphorylation (phosphorylation), sulfation (sulfation), acrylation (acrylation), glycosylation (glycosylation), methylation (methylation), farnesylation (farnesylation), acetylation (acetylation) and amylation (amidation) It may be modified (modification), etc.
  • the VGLL1 peptide fragment or variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less may further include a cell-penetrating peptide sequence for intracellular penetration.
  • the cell-penetrating peptide is a kind of signal peptide and is a peptide sequence that aims to transfer substances into cells. It mainly consists of a peptide sequence of about 7-30 amino acids, and any sequence having a signal peptide that can be delivered into a cell may be included in the present invention.
  • the cell-penetrating peptide mainly contains basic amino acid residues such as lysine/arginine, and thus serves to penetrate the fused proteins into the cell membrane and into the cell.
  • the cell-penetrating peptide is HIV-1 Tat protein, Drosophila antennapedia homeodomain (phenetratin), HSV VP22 transcriptional regulatory protein, vFGF-derived MTS peptide, PTD-5, transpotan or Pep-1 peptide Sequences derived from, but are not limited thereto.
  • viruses or cationic peptides are biologically active substances.
  • HIV-1 Tat SEQ ID NO: 12
  • YGRKKRRQRRR Penetratin SEQ ID NO: 13
  • RQIKIWFQNRRMKWKK HSV VP22 SEQ ID NO: 14
  • DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE MTS SEQ ID NO: 15
  • AAVALLPAVLLAAP Transportan SEQ ID NO: 16
  • GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL PEP-1 SEQ ID NO: 17
  • KETWWETWWTEWSQPKKKRKV Poly arginine
  • RRRRRRR PTD-5 SEQ ID NO: 19
  • sequence of SEQ ID NO: 12 may be linked to a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof.
  • a sequence may be, for example, a sequence peptide fragment such as SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29.
  • SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 a variant of the peptide fragment and a cell-penetrating sequence may be linked.
  • the cell-penetrating peptide can provide a fusion peptide comprising a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less.
  • the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding the VGLL1 peptide fragment or variant thereof, and a fusion peptide in which a cell-penetrating peptide is linked thereto.
  • Nucleic acid is intended to include DNA and RNA, and may be double-stranded or single-stranded.
  • a nucleic acid encoding a peptide can be operably linked to a peptide produced in an appropriate expression system using expression vectors and methods well known in the art of molecular biology. Nucleic acids encoding the peptides disclosed herein can be incorporated into any expression vector that ensures proper expression of the peptides. Possible expression vectors include, but are not limited to, plasmids, or modified viruses (eg replication deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses) so long as the vector is suitable for transformation of the host cell.
  • a recombinant expression vector “suitable for transformation of a host cell” is a nucleic acid molecule of the present disclosure, operably linked to a nucleic acid molecule, and comprising regulatory sequences selected based on the host cell used for expression.
  • operably linked or “operably linked” are used interchangeably and are intended to mean that the nucleic acid is linked to regulatory sequences in a manner that enables expression of the nucleic acid.
  • the present disclosure provides a recombinant expression vector comprising a nucleic acid encoding a peptide and regulatory sequences necessary for transcription and translation of the inserted protein-sequence.
  • Suitable regulatory sequences can be derived from a variety of sources, including bacterial, fungal or viral genes. The selection of appropriate regulatory sequences is generally dependent on the host cell selected and can be readily accomplished by one of ordinary skill in the art. Examples of such regulatory sequences include transcriptional promoters and enhancers or RNA polymerase binding sequences, ribosome binding sequences, including translation initiation signals.
  • sequences may be incorporated into the expression vector, such as origins of replication, additional DNA restriction sites, enhancers, and sequences that confer transcriptional inducibility. It will also be understood that the necessary regulatory sequences may be supplied by the native protein and/or flanking regions thereof.
  • Recombinant expression vectors can be introduced into host cells to produce transformed host cells.
  • the term “transformed host cell” is intended to include prokaryotic and eukaryotic cells transformed or transfected with the recombinant expression vectors of the present disclosure.
  • the terms “transformed with”, “transfected with”, “transformation” and “transfection” refer to the transfer of a nucleic acid (eg, a vector) into a cell by one of many possible techniques known in the art. It is intended to include introduction.
  • Suitable host cells include a wide variety of prokaryotic and eukaryotic host cells.
  • the proteins of the present disclosure can be expressed in bacterial cells such as E. coli, insect cells (using baculovirus), yeast cells, or mammalian cells.
  • Nucleic acid molecules of the present disclosure can also be synthesized chemically, using standard techniques. A variety of methods are known for chemically synthesizing polydeoxy-nucleotides, including fully automated solid-phase synthesis in commercially available DNA synthesizers, such as peptide synthesis.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less to provide.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and comprising a VGLL1 peptide fragment having a length of 35 amino acids or less or a variant thereof to provide.
  • composition according to the present invention has excellent effects in the prevention, metastasis, and treatment of cancer because the peptide of VGLL1 inhibits cancer cell proliferation and inhibits cancer cell invasion.
  • the composition according to the present invention includes both the direct therapeutic effect and the metastasis inhibitory effect as well as the action as an anticancer adjuvant.
  • treatment and “treating” refer to the administration or application of a therapeutic agent to a subject or the performance of a procedure or modality in a subject for the purpose of obtaining the benefit of treatment of a disease or health-related condition.
  • Prevention refer to an approach for preventing, inhibiting or reducing the likelihood of occurrence or recurrence of a disease or condition. Also delaying the onset or recurrence of a disease or condition, or the occurrence or recurrence of a disease or condition. It refers to delaying relapse.
  • subject and patient refer to a human or non-human, such as a primate, mammal, or vertebrate. In certain embodiments, the subject is a human.
  • therapeutic benefit refers to anything that promotes or enhances the health of a subject in connection with the medical treatment of such condition. This includes, but is not limited to, a decrease in the frequency or severity of signs or symptoms of a disease.
  • treating cancer may include reducing the size of the tumor, reducing the invasiveness of the tumor, reducing the rate of growth of the cancer, or preventing metastasis. Treating cancer may also refer to prolonging the survival of a subject having cancer.
  • cancer is gastric cancer, liver cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, head and neck squamous cell carcinoma, esophageal cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, mesothelioma, melanoma, sarcoma, osteosarcoma, liposarcoma, thyroid cancer , pancreatic cancer, and blood cancer.
  • an anticancer agent for example, promotes the death of cancer cells, induces apoptosis in cancer cells, reduces the growth rate of cancer cells, reduces the prevalence or number of metastases, reduces tumor size, or By inhibiting tumor growth, reducing blood supply to a tumor or cancer cells, promoting an immune response against cancer cells or tumors, preventing or inhibiting the progression of cancer, or increasing the lifespan of a subject with cancer; by negatively affecting the cancer cells/tumors of a subject.
  • the phrase "pharmaceutically or pharmacologically acceptable” refers to molecular substances and compositions that, when appropriate, do not cause side effects, allergic reactions or other inappropriate reactions when administered to animals, such as humans.
  • pharmaceutical compositions comprising antibodies or additional active components.
  • animal eg, human
  • manufacturing must meet sterility, pyrogenicity, general safety and purity standards as required by the FDA Office of Biological Standards.
  • the peptide fragment or variant thereof according to the present invention further includes a cell-penetrating peptide, so that it can be more easily delivered to cells in the human body.
  • compositions for use in the present invention may be formulated by standard techniques using one or more physiologically acceptable carriers or excipients. Suitable pharmaceutical carriers are disclosed herein and in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005).
  • the peptides of the invention may be formulated for administration by any suitable route, for example via inhalation, topically, nasally, orally, parenterally or rectally. Accordingly, administration of the above-mentioned pharmaceutical compositions can be performed intradermally, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intranasally, by inhalation, intracerebral, intratracheal, intraarterial, intraperitoneal, intravesical, intrapleural, intracoronary, subcutaneous or This can be done by intratumoral injection, using a syringe or other device. Transdermal administration is also contemplated as inhalation or aerosol administration. Tablets and capsules may be administered orally, rectally or intravaginally.
  • the pharmaceutical composition will typically comprise a peptide, or peptide, dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier preferably an aqueous carrier.
  • the peptides may be provided together or separately.
  • a variety of aqueous carriers can be used, such as buffered saline and the like. These solutions are sterile and generally free of undesirable substances.
  • These compositions may be sterilized by conventional, well-known sterilization techniques.
  • the composition may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, toxicity adjusting agents and the like, such as sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium It may contain lactate etc.
  • the concentration of peptides in these formulations can vary widely and will be selected based primarily on fluid volume, viscosity, body weight, etc., depending on the particular mode of administration selected and the needs of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is suitable for parenteral administration, including intravenous administration or body cavity administration.
  • the peptides of the invention may be formulated for parenteral administration by injection, for example by bolus injection or continuous infusion.
  • Formulations for injection may be presented in unit dosage form, for example, in ampoules or multi-dose containers, with an added preservative.
  • Injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and suppositories are preferably prepared from fatty emulsions or suspensions.
  • the composition may be sterilized and/or the composition may contain adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, dissolution promoters, salts for regulating the osmotic pressure and/or buffers.
  • the active ingredient may be in powder form, which is formulated by means of a suitable vehicle, for example sterile, pyrogen-free water, before use.
  • a suitable vehicle for example sterile, pyrogen-free water
  • the active ingredient may also contain other therapeutically valuable substances.
  • the compositions are prepared according to the respective conventional mixing, granulating or coating methods, and they contain from about 0.1 to 75%, preferably from about 1 to 50% of the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition or medicament may take the form of, for example, tablets or capsules prepared by conventional means, together with pharmaceutically acceptable excipients.
  • the active ingredient i.e., the composition of the present invention, is added to (a) a diluent or filler such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose (such as ethyl cellulose, microcrystalline cellulose), glycine, pectin, polyacrylic rate and/or calcium hydrogen phosphate, calcium sulfate, (b) lubricants such as silica, talcum, stearic acid, its magnesium or calcium salt, metallic stearate, colloidal silicon dioxide, hydrogenated vegetable oil, corn starch, sodium with benzoate, sodium acetate and/or polyethylene glycol; for tablets also (c) binders, for example magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyviny
  • the present invention administers the pharmaceutical composition to a patient in a therapeutically effective dose for preventing, treating or inhibiting a disease such as cancer or a malignant state thereof.
  • the pharmaceutical composition is administered to the patient in an amount sufficient to elicit an effective therapeutic or diagnostic response in the patient.
  • An effective therapeutic or diagnostic response is one that at least partially arrests or slows the symptoms or complications of the disease or malignancy.
  • An amount suitable to accomplish this is defined as a “therapeutically effective amount”.
  • the dosage of the peptide to be administered depends on the mammalian species, body weight, age, individual conditions, the surface area of the region to be treated, and the dosage form.
  • the size of the dose will also be determined by the presence, nature and extent of any side effects that accompany administration of a particular compound in a particular patient.
  • a unit dosage for administration to a mammal of about 50 to 80 kg, preferably a human, may contain an amount of about 1 mg/kg to 5 mg/kg of peptide.
  • the dosage of a compound of the present invention is a dosage sufficient to achieve the desired effect.
  • An optimal dosing schedule can be calculated from the measurement of the peptide, its accumulation in the patient's body. It may be given more than once a day, a week, a month, or a year. Those skilled in the art can readily determine the optimal dosage, method of administration, and repetition rate. One of ordinary skill in the art will be able to determine the optimal administration for administration of a peptide to a human according to established protocols known in the art and disclosed herein.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age, and sex, and therefore, the dosage may be any It is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention also provides a VGLL1 peptide fragment or a variant thereof comprising the 84th serine of the VGLL1 peptide sequence of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less for use in the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention also provides a VGLL1 peptide fragment comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less in the manufacture of a medicament for use in the prevention or treatment of cancer, or its Uses of the variant are provided.
  • the present invention also comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of a VGLL1 peptide fragment or variant thereof comprising the 84th serine of the peptide sequence of VGLL1 of SEQ ID NO: 1 and having a length of 35 amino acids or less It provides a method of treating cancer, comprising.
  • the peptide fragment of VGLL1 or a mutant thereof has an excellent effect in preventing and treating cancer by inhibiting cancer cell proliferation and cancer cell invasion, thereby completing the present invention.
  • this will be looked into in detail.
  • the human gastric cancer cell line NUGC3 was treated with TGF- ⁇ at each time period, mRNA was extracted from the cells, and complementary DNA was synthesized, followed by Matrix metalloproteinase 9 RT-PCR was performed using (MMP9) primers (Table 4).
  • Example 1-2 Confirmation of cancer cell proliferation and invasion by MMP9
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured overnight in a 6-well plate, and then 20 nM siSC and siMMP9 (SEQ ID NO: 22) were mixed with Lipofectamine 2000 and treated with the cell line. After 48 hours, mRNA was extracted from the cells and complementary DNA was synthesized, followed by RT-PCR using the MMP9 primer (FIG. 2A).
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured in a 96-well plate the next day, and 20 nM siSC and siMMP9 were mixed with Lipofectamine 2000 and treated with the cell line. After 48 hours, cells were fixed using 1% formalin solution. Thereafter, the cells were stained with 0.4% Sulforhodamine B solution for 1 hour, washed with acetic acid and dried. Then, the cells were dissolved in a 10 mM Tris solution and absorbance was measured at 540 nm using an ELISA plate reader ( FIG. 2B ).
  • a cell culture insert was fixed in a 24-well plate, and 100 ⁇ l of Matrigel was diluted 20-fold and added. The reaction was carried out at 37°C for 1 hour or more. 700 ⁇ l of medium containing 10% serum was added to a 24-well plate under the insert. MMP knockdown (knockdown) cells with the above siRNA were added to the insult according to 300 ⁇ l of serum-free medium to a concentration of 5 x 10 5 . After incubation for 48 hours, the insult was removed and fixed in 10% formalin solution. Cells remaining inside the insert were removed with a cotton swab and washed with water.
  • FIG. 2A shows the result of reduced expression of MMP9 according to siRNA (siMMP9) treatment.
  • FIG. 2B shows the result that the cell viability is greatly reduced by reducing the expression of MMP9 according to the siRNA (siMMP9) treatment.
  • FIG. 2C shows the result of greatly reduced cell invasiveness according to siRNA (siMMP9) treatment.
  • MMP9 promoter luciferase activity was confirmed after TGF- ⁇ treatment.
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured in a 48-well plate at a concentration of 2 x 10 4 cells/well. The next day, the pGL4.17-luciferase vector into which the MMP9 gene was inserted was transfected into cells using Lipofectamine 2000.
  • siSC SEQ ID NO: 23: 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGUdTdT-3′
  • siVGLL1 SEQ ID NO: 24: 5′-AGCCUAUAAAGACGGAAUGGAAUdTdT-3′
  • siTEAD4 SEQ ID NO: 25: 5′-GACACUACUCUUACCGCAU
  • siYAP SEQ ID NO: 26: 5'-CCACCA AGCUAGAUAAAGAAAdTdT-3'
  • Example 2-2 Confirmation of the effects of VGLL1 and TEAD4 on MMP9 mRNA expression by TGF- ⁇
  • MMP9 mRNA expression was confirmed by RT-PCR after TGF- ⁇ treatment.
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured in a 6-well plate the next day, and 20 nM siSC, siVGLL1, siTEAD4, and siYAP were mixed with Lipofectamine 2000 to treat the cell line. The next day, after treatment with TGF- ⁇ for 18 hours, mRNA was extracted from the cells and complementary DNA was synthesized, followed by RT-PCR.
  • VGLL1 is phosphorylated by TGF- ⁇
  • serine at positions 50, 84, and 124 of the VGLL1 amino acid sequence was mutated to alanine, and then, the phosphorylation of VGLL1 was checked.
  • serines at positions 50, 84, and 124 were replaced with alanine using site-direct mutagenesis products in pcDNA3-HA-VGLL1- vector.
  • pcDNA3-HA(EV), pcDNA3-HA-VGLL1(WT), pcDNA3-HA-VGLL1-S50A (S50A mutation), pcDNA3-HA- VGLL1-S84A (S84A mutant) and pcDNA3-HA-VGLL1-S124A (S124A mutant) were mixed with Turbofect to transform the cell line.
  • TGF- ⁇ was treated for 15 minutes, and proteins were extracted from the cells using RIPA buffer. The extracted protein was subjected to immunoprecipitation using agarose bound with HA antibody and separated by electrophoresis. Confirmed.
  • the GFP-TEAD4 vector and pcDNA3-HA (EV), pcDNA3-HA-VGLL1 (WT), pcDNA3-HA-VGLL1-S50A (S50A mutation), pcDNA3-HA-VGLL1-S84A (S84A mutation), pcDNA3- HA-VGLL1-S124A (S124A mutation) was mixed with Turbofect and transformed into a cell line cultured for 24 hours. After 48 hours, proteins were extracted from the cells using a lipid buffer, immunoprecipitated using agarose to which HA antibodies were bound, and separated by electrophoresis. was used to confirm the protein expression of genes.
  • MMP9 protein expression was confirmed by Western blot using the VGLL1 vectors used in ⁇ Example 3>.
  • pcDNA3-HA (EV), pcDNA3-HA-VGLL1 (WT), pcDNA3-HA-VGLL1-S50A (S50A), pcDNA3-HA -VGLL1-S84A (S84A) and pcDNA3-HA-VGLL1-S124A (S124A) were mixed with Turbofect to transform the cell line.
  • TGF- ⁇ was treated for 18 hours, and proteins were extracted from the cells using a lipa buffer. After the extracted protein was separated by electrophoresis, the protein expression was confirmed by using the MMP9, HA, and GAPDH antibodies in the moved polyvinylidene fluoride membrane.
  • FIG. 7 The results are shown in FIG. 7 . As can be seen in FIG. 7 , it was confirmed that the expression of MMP9 protein by TGF- ⁇ was decreased in the cell line in which the serine 84 of VGLL1 was substituted with alanine. This indicates that phosphorylation of VGLL1 by TGF- ⁇ is important for MMP9 expression, and that serine at position 84 of the VGLL1 peptide is an important factor.
  • Example 6-1 S84 VGLL1 peptide fragment reduces MMP9 expression by TGF- ⁇
  • a peptide fragment having the sequence shown in Table 6 below was prepared to check whether the expression of MMP9 could be inhibited, and its MMP9 expression inhibitory effect was confirmed.
  • the peptide fragment sequence in Table 6 provides sequences 77 to 91 of VGLL1 including S84 of VGLL1.
  • the sequence of SEQ ID NO: 27 includes the fluorescein moiety (FITC) and YGRKKRRQRRR, which is an HIV TAT transduction domain sequence required for introduction into cells, and sequences 77 to 91 of VGLL1 are linked thereto.
  • SEQ ID NO: 28 shows a sequence in which S84 of VGLL1 is substituted with S84A.
  • SEQ ID NO: 12 represents the HIV TAT transduction domain sequence as a control sequence.
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured in a 6-well plate the next day and cultured in serum-free cell culture for 24 hours.
  • TGF- ⁇ and a control peptide fragment (SEQ ID NO: 12), a peptide fragment containing serine 84 of VGLL1 (SEQ ID NO: 27), and a mutant peptide fragment containing alanine 84 of VGLL1 (SEQ ID NO: 28) were treated for 18 hours .
  • Proteins were extracted from the cells using a Lipa buffer and separated by electrophoresis, and then protein expression of genes was confirmed by using an antibody in the moved polyvinylidene fluoride membrane.
  • FIG. 8 The results are shown in FIG. 8 .
  • the increased expression of MMP9 in TGF- ⁇ was reduced by treatment with a peptide fragment containing serine 84 of VGLL1.
  • the sequence of the mutant peptide fragment including alanine 84 of VGLL1 was not affected by the treatment of the peptide fragment. From these results, it was confirmed that the peptide fragment sequence containing serine 84 of VGLL1 according to the present invention can exhibit an excellent effect in the treatment of cancer.
  • Example 6-2 Confirmation of cancer cell proliferation inhibitory effect by S84 VGLL1 peptide fragment
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured in a 96-well plate the next day, and the peptide fragment was treated, and cell proliferation was analyzed using a real-time cell analysis system (product name: Incucyte).
  • FIG. 9 The results are shown in FIG. 9 .
  • the S84 VGLL1 peptide fragment exhibited an effect of inhibiting cancer cell proliferation.
  • the control peptide fragment or the mutated VGLL1 peptide fragment containing an alanine at position 84 in which the position of S84 is mutated did not have any effect on the inhibition of cancer cell proliferation.
  • the gastric cancer cell invasion experiment by the VGLL1 peptide fragment was performed in a similar manner to Example 1-2.
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was placed in an insert together with the peptide fragment, and after 48 hours of cell culture, the insert was fixed in 10% formalin solution, and the cells that migrated downward were stained with 0.4% Sulforhodamine B solution to confirm.
  • FIG. 10 The results are shown in FIG. 10 .
  • the VGLL1 peptide fragment sequence including S84 exhibited an effect of inhibiting cancer cell invasion, whereas the sequence in which the corresponding position was mutated did not exhibit such an effect.
  • the gastric cancer cell line NUGC3 was cultured in a 96-well plate and treated with 60 ⁇ M peptide the next day, and cell proliferation was analyzed using a real-time cell analysis system (product name: Incucyte).
  • FIG. 11 A is a real-time cell proliferation graph
  • FIG. B is a graph drawn based on 100% control peptide after 4 days of cell proliferation.
  • the peptide fragment sequence containing the S84 serine of VGLL1 according to the present invention exhibits an excellent effect in the treatment of cancer through inhibition of proliferation and invasion of cancer cells.
  • the VGLL1 S84 peptide sequence of SEQ ID NO: 27 was treated in various cancer cell lines.
  • the cancer cells of Table 8 were cultured in a 96-well plate and treated with 60 ⁇ M peptide the next day, and cell proliferation was analyzed using a real-time cell analysis system (product name: Incucyte).
  • the S84 VGLL1 peptide fragment exhibits an excellent effect in inhibiting the proliferation of gastric cancer cells as well as colon cancer, lung cancer, liver cancer, prostate cancer, breast cancer, cervical cancer and ovarian cancer cells. Confirmed.

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Abstract

본 발명은 암 치료용 펩타이드 단편, 이의 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 VGLL1의 펩타이드 단편 및/또는 이의 변이체는 암세포의 증식을 억제시키고 암세포의 침윤을 억제시킴으로써 암의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다.

Description

VGLL1 펩타이드를 포함하는 암 치료용 조성물
본 발명은 VGLL1 펩타이드를 포함하는 암 치료용 조성물 및 이를 이용한 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 과학기술정보통신부의 과제번호 1711098598, "이공분야기초연구사업"에 따른 한국 정부의 지원을 받아 이루어졌다.
본 발명은 과학기술정보통신부의 과제번호 1711081422, "원천기술개발사업(바이오의료기술)"에 따른 한국 정부의 지원을 받아 이루어졌다.
본 발명은 과학기술정보통신부의 과제번호 1711100103, "주요사업(2019-2023)"에 따른 한국 정부의 지원을 받아 이루어졌다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화, 식생활의 서구화로 인한 고지방식의 섭취의 일반화, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.
암의 발생의 가장 큰 요인은 유전자에 돌연변이를 일으키는 것이다. 돌연변이를 일으키게 하는 물질을 발암원 (carcinogen)이라고 말하고, 이 발암원에 의해 유전자 변형이 일어나는 단계를 initiation이라고 한다. initiation 단계에서 포함되는 유전자들 중에는 발암억제유전자 (예; p53, PTEN, INK family, RB)들과 돌연변이로 인해서 항상 활성을 갖게 되는 constitutive active 돌연변이 (활성돌연변이체, 예: EGFR mt, RasG 12V)가 있다. 정상세포에는 epidermal growth factor가 EGF 수용체 (EGF receptor)에 결합함으로써 활성신호를 만들어 내지만, 활성 돌연변이체들은 수용체에 ligand가 결합하지 않아도 항상 활성신호를 하류 신호전달계에 보내주게 된다. 이 과정에서 생성된 하나의 돌연변이 세포는 몸 안에 있는 면역 방어시스템을 뚫고 종양덩어리로 성장하여야 하는데 이 과정을 promotion이라고 한다. 일반적으로 promotion 과정은 긴 시간이 요구되며, 주로 신호전달계의 활성화로 이루어진다.
많은 암의 경우, 사이토카인을 통한 다양한 신호전달 시스템의 활성화로 암관련 유전자들의 기능이 조절된다. TGF-β(Transforming growth factor-β)는 SMAD, Rho, PP2A 및 암관련 유전자의 신호 전달 경로 조절을 통해 세포 성장 억제, 세포 사멸, 분화 및 상피-간충직 전이 (epithelial-mesenchymal transition; EMT)와 같은 다양한 기능에 관여하고 있다. 동물 모델 및 환자에서 TGF-β가 발현성인자 (pleiotropic factor)로서 다양한 기전과 광범위한 역할에 대한 많은 연구가 수행되고 있다.
초파리 전사인자 coactivator 인 vestigial (vg) 유전자와 구조 유사성을 가진 Vestigial-like (VGLL) 유전자는 TEA 부위에 결합하는 전사인자 TEADs (TEA domain transcription factors)의 cofactor로 작용한다. 위암에서 VGLL 패밀리 단백질의 기능 및 기본 메커니즘이 연구되어 왔다. 위암 환자에서 VGLL3 과발현은 환자의 낮은 생존율과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. YAP(Yes-associated protein) 과 경쟁적으로 TEAD 결합하는 VGLL4는 종양 억제제로서 보고되어 있다. VGLL1은 YAP 및 TAZ (transcription coactivator with a PDZ-binding motif)와 구조적으로 상동성이 높아 VGLL1-TEAD 복합체를 형성한다. 우리는 위암에서 발현량이 높고 PIK3CA 또는 PIK3CB이 과발현 되는 환자의 예후와 상관성이 있는 VGLL1을 위암의 악성화와 관련 있는 유전자로 보고하였다. 또한, PI3K-AKT-β-카테닌에 신호전달 기전을 통해 VGLL1의 전사가 조절된다는 것을 밝혔다. 또한, VGLL1-TEAD 복합체는 MMP9 (Matrix metallopeptidase 9)의 발현을 증가시켜 위암의 증식과 전이에 관여함을 확인하였다.
일련의 암세포의 증식 및 전이와 관련하여 VGLL1의 구체적인 작용에 대해서는 알려진 바가 없다. VGLL1과 관련하여, VGLL1을 바이오 마커로 사용하여 폐암에 걸린 환자의 생존기간을 예측하는 방법이나, VGLL1의 발현 증진과 관련된 암 세포 증식 또는 암 전이에 대해 일부 문헌에서 보고된 바가 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 VGLL1의 펩타이드 단편이 MMP9의 발현을 억제할 뿐만 아니라 암세포의 증식을 억제함을 발견하여 암 치료제로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고, 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고, 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 6 내지 25개의 아미노산 서열을 가지는 것인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1의 52번 내지 115번째 사이의 아미노산 서열에서 84번째 세린 서열을 포함하는 것인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 84번째 세린 및 이에 인접한 6개 내지 20개 아미노산으로 이루어진 것인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 2 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 세포 투과성 펩타이드를 더 포함하는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 12 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 암은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 두경부 편평암 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 암은 위암인 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 84번째 세린을 포함하는 VGLL1의 펩타이드 단편은 암세포의 증식을 억제시키고 암세포의 침윤을 억제시킴으로써 암의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다.
도 1은 암세포에 TGF-β 처리에 의한 MMP9의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 암세포에서 MMP9의 발현 억제에 의한 암세포의 증식 및 침윤 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 암세포에서 VGLL1 및 TEAD4 억제에 의한 TGF-β에 의해 증가된 MMP9 프로모터 활성 감소를 루시퍼레이즈 (luciferase) 활성 검증을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 암세포에서 VGLL1 및 TEAD4 억제에 의한 TGF-β에 의해 증가된 MMP9 프로모터 활성 감소를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 TGF-β에 의한 VGLL1의 인산화에 VGLL1의 S84가 연관됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 VGLL1의 세린84번 위치가 TEAD4 와의 결합에 중요한 부위임을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 TGF-β에 의한 MMP9 발현 증가에 VGLL1의 인산화가 영향을 미치는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 VGLL1의 84번 세린 위치를 포함하는 펩타이드 단편 처리에 의해 TGF-β 처리로 증가된 MMP9 발현을 감소시킴을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 VGLL1의 84번 세린 위치를 포함하는 펩타이드 단편 처리에 의해 암세포의 증식이 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 VGLL1의 84번 세린 위치를 포함하는 펩타이드 단편 처리에 의해 암세포의 침윤이 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 VGLL1의 펩타이드 단편 및 이의 변이체 처리에 따른 암세포의 증식 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 VGLL1의 S84 펩타이드 단편 처리에 따른 다양한 암세포의 증식 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고, 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 제공한다.
구체적으로, 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편의 변이체는 서열번호 1의 84번째 세린(Serine)을 포함하면서 52번 내지 115번째 사이에서 35개 이하를 가지는 임의의 서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명에서, "펩타이드", 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어들을 천연 아미노산 중합체들뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용한다. 상기 용어들을 또한 단백질이 작용성으로 남아있도록 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 상기 중합체들에 적용한다. 본 발명에서 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.
본 발명에서, " VGLL1 펩타이드"는 전장 VGLL1 단백질에 해당하는 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, 상기 용어는 VGLL1 단백질의 모든 상동체, 유사체, 단편 또는 유도체를 포함한다. 일 구체예에서, 분리된 VGLL1 펩타이드는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)을 갖는다. " VGLL1 인코딩 핵산"은 VGLL1 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 적어도 한 부분을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 의미한다.
본 발명에서 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편은 7 내지 35개의 아미노산, 바람직하게는 7 내지 25 아미노산 잔기, 및 더욱 바람직하게는 6 내지 15개의 아미노산일 수 있다. 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개의 아미노산 길이, 또는 그 중 추산 가능한 임의의 범위를 포함하는 아미노산 사슬을 포함한다
본 개시내용의 VGLL1 펩타이드 단편은, 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 VGLL1 펩타이드 서열의 52번 내지 115번째 사이 아미노산 서열에서 35 개 이하의 연속적인 아미노산을 가지며 84번째 세린(Serine)을 포함하는 임의의 서열로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 VGLL1 펩타이드 단편은 서열의 84번째 세린(Serine)을 말단에 포함하는 경우 서열번호 1의 55번 내지 84번의 아미노산 서열을 가지는 30개의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, VGLL1 펩타이드 단편은 서열의 80번째 세린(Serine)을 말단에 포함하는 서열번호 1의 80번 내지 114번의 아미노산 서열을 가지는 35개의 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 상기 서열번호 1의 52번 내지 115번째 사이의 아미노산 서열에서 84번째 세린 서열을 포함하는 임의의 35개 이하의 서열일 수 있다. 즉, 84번째 세린 서열을 중심으로 이와 인접하여 35개 이하의 아미노산 서열을 가지는 아미노산은 본 발명의 범주에 포함되는 VGLL1 펩타이드의 단편이다.
예컨대 서열번호 1의 84번 세린 서열을 중심으로 하여 총 아미노산 서열 개수가 35개 이하가 되도록 하는 임의의 서열일 수 있다. 예를 들어, VGLL1 단백질의 아미노산 서열 중 84번째 세린 및 이에 인접한 8개 내지 25개, 바람직하게 7개 내지 20개 아미노산, 보다 바람직하게 6개 내지 15개를 더 포함하거나 이로 이루어진 서열일 수 있다.
보다 바람직하게는 서열번호 1의 84번 서열을 중심으로 하여 20개 이하, 15개 이하 또는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하의 서열로 이루어질 수 있다.
구체적으로, 본원 발명에 따른 임의의 서열은 예를 들어, 서열번호 1의 VGLL1 펩타이드 서열의 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 또는 82번째의 임의의 선택된 아미노산 서열로부터 시작하여 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 또는 115 번째의 임의의 선택된 아미노산 서열까지의 아미노산 서열을 포함하는 것으로, 그 길이가 상기 언급한 35 개 이하를 만족하는 것이라면 어떠한 서열도 본 발명의 범주의 펩타이드 단편에 포함될 수 있다
보다 구체적으로, VGLL1의 77 내지 91번 서열로 이루어진 서열번호 2의 아미노산 서열일 수 있다. 보다 구체적으로, VGLL1의 82 내지 88번 서열로 이루어진 서열번호 9의 아미노산 서열일 수 있다.
이러한 예시적인 VGLL1 펩타이드 단편 서열을 아래 표 1의 서열번호 2 내지 9에 나타내었고, 이러한 서열은 VGLL1 펩타이드의 84번째 세린 서열을 포함하는 것으로, 예시적으로 나타낸 서열에 해당하며, 이러한 서열의 예시에 한정되는 것은 아니다.
서열번호2 서열 77-91 PNQWRYSSPWTKPQP
서열번호3 서열 78-90 NQWRYSSPWTKPQ
서열번호4 서열 79-89 QWRYSSPWTKP
서열번호5 서열 80-88 WRYSSPWTK
서열번호6 서열 80-87 WRYSSPWT
서열번호7 서열 80-86 WRYSSPW
서열번호8 서열 81-87 RYSSPWT
서열번호9 서열 82-88 YSSPWTK
본 발명에서, "생물학적으로 활성이 있는"은 개별의 야생형 폴리펩타이드와 유사한 구조적 기능, 및/또는 유사한 조절 기능, 및/또는 유사한 생화학적 기능을 갖는 펩타이드 단편 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 의미한다.
본 발명에서, "변이체"는 야생형 펩타이드와 비교하여 대립유전자의 변이를 포함하여 하나(또는 그 이상)의 아미노산으로부터 또는 서열에의 치환, 결실 또는 부가(또는 이들의 임의의 조합)을 갖는 임의의 펩타이드(해당 핵산에 의해 암호화되는 펩타이드를 포함하여)를 의미한다. 어떤 구체예에서, 그 결과로 생기는 폴리펩타이드는 본 발명에서 사용될 때 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 생물학적 활성의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 변이체는 서열번호 1의 S84를 반드시 포함하는 서열로 52번째 내지 115번째 사이에서 VGLL1 펩타이드의 임의의 부위에 변이가 발생한 35개 이하의 아미노산을 가진 서열로 위 언급된 생물학적 활성을 유지하는 것을 포함한다.
서열 일치도 또는 상동성은 종래 알려진 표준 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 배열은 배열되는 서열에서 갭의 도입을 포함할 것이다. 또한, 여기에 개시된 단백질에 비해 더 많거나 적은 아미노산을 포함하는 서열에 대해, 상동성 비율은 전체 아미노산의 수와 비교하여 상동 아미노산의 수에 근거하여 측정될 것으로 이해된다. 결과적으로, VGLL1 폴리펩타이드의 변이체(해당 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 포함하여)는 서열번호 1의 펩타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가질 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 변이체는 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편의 변이체로써 서열번호 1의 52번째 내지 115번째 사이에서 변이를 가지며, 위 52번째 내지 115번째 서열 사이에서 상응하는 서열을 고려하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에서, "결실"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 없는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다.
본 발명에서, "삽입" 또는 "부가"는 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가로 인한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
본 발명에서, "치환"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체에서 비롯된다.
사이토카인 TGF-b는 세포 내 신호전달 단백질들의 인산화를 유도한다. 암세포에서 TGF-b를 처리하면 VGLL1이 인산화가 유도될 수 있다. 예를 들어, VGLL1의 S84을 포함하는 펩타이드 단편은 경쟁적으로 VGLL1과 TEAD4의 결합을 저해시킴으로써 MMP9의 발현을 억제할 수 있다. 이러한 TGF-b에 의해 인산화가 일어날 수 있는 아미노산은 serine, threonine 및 tyrosine이 있다. 이에 따라, 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 54, 59, 61, 62, 64, 66, 74, 76, 82, 83, 84 및 96 번 서열은 변이 없이 유지되는 것이 바람직할 수 있다.
한편, 치환 위치에서 바람직한 아미노산 변이는 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기반하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 음으로 하전된(negatively charged) 아미노산으로서는 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하며; 양으로 하전된(positively charged) 아미노산으로서는 리신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성값을 가지는 비하전성 극성 헤드기를 가지는 아미노산으로서는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신;을 들 수 있다. 상기 변이는 보존적 치환을 포함할 수 있다. ‘보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
예컨대, "생물학적 활성에 변형을 나타내지 않는 예시적인 아미노산 치환으로 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1의 85번, 87번 위치의 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1에서 P85A, T85A 변이일 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에서는 상기 언급된 치환 위치에서 다음의 아미노산 변이를 포함한다 : S- A, P->A, T->A, 또는 Y->A.
상기 변이체는 비보존적 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 변이체 폴리펩타이드는 5개 아미노산 또는 그것보다 적은 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과는 다를 수 있다. 변이체는 또한, 예를 들어 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수(hydropathic) 특성에 대해서 가지는 영향이 최소인 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변경될 수 있다.
경우에 따라서는, 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
예시적인 아미노산 치환된 변이 서열을 표 2에 나타내었다.
서열번호 10 P85A PNQWR YSSAWTKPQP
서열번호 11 T87A PNQWRY SSPWAKPQP
서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고, 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 세포 내 투과를 위하여 세포 투과성 펩타이드 서열을 더 포함할 수 있다.
세포 투과성 펩타이드란 일종의 신호 펩타이드로써 세포 내로 물질 전달을 목적하는 펩타이드 서열이다. 주로 7-30 개 정도의 아미노산 펩타이드 서열로 이루어지며, 세포 내로 전달될 수 있는 신호 펩타이드를 가지는 서열이라면 어떠한 서열이라도 본 발명에서 포함될 수 있다.
예컨대, 세포 투과성 펩타이드는 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 호메오도메인(페네트라틴), HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, PTD-5, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 바이러스 또는 양이온성 펩타이드로부터 동정/합성된 다양한 CPPs(예를 들어, TAT48-60, 페네트라틴(pAntp)43-58, 폴리아르기닌, Pep-1, 트랜스포탄, 등)은 생물학적 활성 물질은 약물운반체들의 이동을 매개하기 위해 세포 내재화 (internalization)가 가능한 활성을 가진다.
이러한 서열의 경우 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체의 N-말단에 연결된 것일 수 있다.
예시적인 서열의 경우 아래 서열번호 12 내지 19에 나타내었다.
HIV-1 Tat(서열번호 12) YGRKKRRQRRR
Penetratin(서열번호 13) RQIKIWFQNRRMKWKK
HSV VP22(서열번호 14) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
MTS(서열번호 15) AAVALLPAVLLAAP
Transportan(서열번호 16) GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
PEP-1(서열번호 17) KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
Poly arginine(서열번호 18) RRRRRRR
PTD-5(서열번호 19) RRQRRTSKLMKR
바람직하게는 상기 서열번호 12의 서열이 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체에 연결된 것일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들어 서열번호 27, 서열번호 29와 같은 서열 펩타이드 단편일 수 있다. 또한, 서열번호 30 또는 서열번호 31와 같이, 펩타이드 단편의 변이체와 세포 투과성 서열이 연결된 것일 수 있다.
즉, 본 발명에서는 세포 투과성 펩타이드; 및 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 펩타이드를 제공할 수 있다.
본 발명에서는 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체, 이에 세포 투과성 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 또한 제공한다. "핵산"은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도되며, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다.
펩타이드를 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 및, 분자생물학 분야에서 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여, 적절한 발현 시스템에서 생성된 펩타이드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 펩타이드의 적절한 발현을 보장하는 임의의 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 가능한 발현 벡터는, 벡터가 숙주 세포의 형질전환에 적합하는 한, 이에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드, 또는 변형된 바이러스 (예를 들어 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.
"숙주 세포의 형질전환에 적합한" 재조합 발현 벡터는 본 개시내용의 핵산 분자, 핵산 분자에 작동적으로 연결된 것으로, 발현에 사용되는 숙주 세포를 기반으로 선택된 조절 서열을 포함한다. 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 상호 혼용되며, 핵산이 핵산의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열에 연결되어 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
따라서, 본 개시내용은 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 삽입된 단백질-서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 적합한 조절 서열은 박테리아, 진균 또는 바이러스 유전자를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있다. 적절한 조절 서열의 선택은 일반적으로 선택된 숙주 세포에 의존적이며, 당업자에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예는 번역 개시 신호를 포함하여, 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 중합효소 결합 서열, 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가로, 선택된 숙주 세포 및 사용되는 벡터에 따라, 복제 기원, 추가의 DNA 제한 부위, 인핸서 및 전사 유도성을 부여하는 서열과 같은 다른 서열이 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 필요한 조절 서열은 천연 단백질 및/또는 그의 측접 영역에 의해 공급될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 형질전환 숙주 세포를 생성할 수 있다. 용어 "형질전환 숙주 세포"는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터로 형질전환되거나, 형질감염된 원핵 및 진핵세포를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "~로 형질전환된", "~로 형질감염된", "형질전환" 및 "형질감염"은 당업계에 공지된 많은 가능한 기법 중 하나에 의한 세포 내로의 핵산 (예를 들어, 벡터)의 도입을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 숙주 세포는 매우 다양한 원핵 및 진핵 숙주 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 단백질은 대장균과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포 (바쿨로바이러스를 사용함), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다.
본 개시내용의 핵산 분자는 또한 표준 기법을 사용하여, 화학적으로 합성될 수 있다. 펩타이드 합성과 같이, 상업적으로 이용 가능한 DNA 합성기에서 완전히 자동화된 고상 합성을 포함하여, 폴리데옥시-뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하는 다양한 방법이 공지되어 있다
본 발명은 또한, 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고, 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 암의 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 VGLL1의 펩타이드가 암세포 증식을 억제시키고 암세포의 침윤을 억제시킴으로써 암의 예방, 전이 억제 및 치료에 우수한 효과를 가진다. 본 발명에 따른 조성물은 직접적 치료 효과, 전이 억제 효과뿐만 아니라 항암 보조제로써의 작용을 모두 포함한다.
본 발명에서, "치료" 및 "치료하는"은 질병 또는 건강 관련 상태의 치료 이점을 얻을 목적의 대상체에의 치료제의 투여 또는 적용 또는 대상체에서의 절차 또는 방식의 수행을 지칭한다. 예방", "예방하는" 등은 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키기 위한 접근을 나타낸다. 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발을 지연시키거나 또는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다.
본 발명에서, "대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비 인간, 예컨대 영장류, 포유류, 척추동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명에서, "치료 이점" 또는 "치료적으로 유효한"은 이러한 상태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 건강을 촉진하거나 증대시키는 임의의 것을 지칭한다. 이는 이에 제한되는 것은 아니나, 질병의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함한다. 예를 들어, 암의 치료는 종양의 크기 감소, 종양의 침습성 감소, 암의 성장 속도 감소 또는 전이 방지를 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 가진 대상체의 생존을 연장시키는 것을 지칭할 수 있다.
본 발명에서, 암은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 두경부 편평암 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 혈액암 등을 포함한다.
본 발명에서, 항암은, 예를 들어, 암세포의 사멸을 촉진하거나, 암세포에서 아폽토시스를 유도하거나, 암세포의 성장 속도를 감소시키거나, 전이의 유병율 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진하거나, 암의 진행을 방지 또는 억제하거나, 암을 가진 대상체의 수명을 증가시킴으로써, 대상체의 암 세포/종양에 부정적인 영향을 주는 것을 의미한다.
본 발명에서 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한"이라는 어구는 적절한 경우, 동물, 예컨대 인간에 투여되는 경우, 부작용, 알레르기 반응 또는 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자성 물질 및 조성물을 지칭한다. 본 개시내용에 비추어, 당업자는 항체 또는 추가의 활성 구성요소를 포함하는 약제학적 조성물의 제조를 인식할 것이다. 또한, 동물 (예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제조는 FDA 생물 표준 국에서 요구하는 대로, 멸균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 함이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 앞서 언급한 바와 같이 세포 투과성 펩타이드를 더 포함함으로써 인체 내 세포 전달이 보다 더 용이할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 상기 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 표준 기법에 의해 제형화할 수 있다. 적합한 약학 담체는 본 발명 및 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)]에 개시된다.
본 발명의 펩타이드를 임의의 적합한 경로, 예를 들어 흡입을 통해, 국소, 코, 경구, 비경구 또는 직장에 의해 투여하기 위해서 제형화할 수 있다. 따라서, 상기 언급된 약학 조성물의 투여를 피내, 피하, 정맥 내, 근육 내, 비내, 흡입에 의해, 대뇌 내, 기관 내, 동맥 내, 복강 내, 방광 내, 흉막 내, 관상동맥 내, 피하 또는 종양 내 주사에 의해, 주사기 또는 다른 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여가 또한, 흡입 또는 에어로졸 투여와 같이 고려된다. 정제 및 캡슐을 경구, 직장 또는 질내 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 펩타이드, 또는 펩타이드를 포함할 것이다. 펩타이드는 함께 또는 별개로 제공될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충된 염수 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 살균성이며 바람직하지 못한 물질이 일반적으로 없다. 이들 조성물을 통상적인, 널리 공지된 살균 기법에 의해 살균시킬 수 있다. 상기 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수도 있다. 이들 제형 중 펩타이드의 농도는 광범위하게 다양할 수 있으며, 선택된 특정한 투여 모드 및 환자의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등을 근거로 선택될 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 정맥 내 투여 또는 체강 내 투여를 포함하여 비경구 투여에 적합하다.
본 발명의 펩타이드를 주사, 예를 들어 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형, 예를 들어 앰풀 또는 수회-용량 용기 중에, 첨가된 보존제와 함께 존재할 수 있다. 주사 가능한 조성물은 바람직하게는 수성 등장성 용액 또는 현탁액이며, 좌약을 바람직하게는 지방 유화액 또는 현탁액으로부터 제조한다. 상기 조성물을 살균하고/하거나 상기 조성물이 보조제, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 활성 성분은 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 멸균성의 발열원이 없는 물에 의해 조성되는 분말 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 활성 성분은 또한 다른 치료학적으로 귀중한 물질을 함유할 수도 있다. 상기 조성물들을 통상적인 각각의 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조하며, 이들은 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
경구 투여의 경우, 약학 조성물 또는 약제는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께, 예를 들어 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 활성 성분, 즉 본 발명의 조성물을 (a) 희석제 또는 충전제, 예를 들어 락토오스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스(예를 들어 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스), 글리신, 펙틴, 폴리아크릴레이트 및/또는 칼슘 수소 포스페이트, 칼슘 설페이트, (b) 윤활제, 예를 들어 실리카, 탤컴, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염, 금속성 스테아레이트, 콜로이드성 이산화 규소, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및/또는 폴리에틸렌글리콜과 함께; 정제의 경우 또한 (c) 결합제, 예를 들어 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 경우에 따라 (d) 붕해제, 예를 들어 전분(예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분), 글리콜레이트, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; (e) 습윤제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 및/또는 (f) 흡수제, 착색제, 풍미제 및 감미제와 함께 포함하는 정제 및 젤라틴 캡슐이 바람직하다.
본 발명은 약학 조성물을 암과 같은 질병 또는 이의 악성 상태를 예방하거나, 치료하거나 또는 억제하기 위한 치료 유효 용량으로 환자에게 투여한다. 상기 약학 조성물을 환자에게서 유효한 치료 또는 진단 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여한다. 유효한 치료 또는 진단 반응은 상기 병 또는 악성 상태의 증상 또는 합병증을 적어도 부분적으로 저지하거나 늦추는 반응이다. 이를 수행하기에 적합한 양을 "치료학적으로 유효한 양"으로서 정의한다.
투여되는 펩타이드의 투여량은 포유동물의 종, 체중, 연령, 개별적인 조건, 치료하려는 영역의 표면적 및 투여 형태에 따라 다르다. 상기 용량의 크기는 또한 특정 환자에게서 특정 화합물의 투여에 동반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다.
약 50 내지 80 ㎏의 포유동물, 바람직하게 인간에게 투여하기 위한 단위 투여량은 펩타이드에 대하여 약 1mg/kg 내지 5 mg/kg의 양을 함유할 수 있다.
전형적으로, 본 발명 화합물의 투여량은 목적하는 효과를 성취하기에 충분한 투여량이다. 최적의 투여 스케줄을 펩타이드의 측정, 환자의 신체 중의 누적으로부터 계산할 수 있다. 하루에, 일주일에, 한달에 또는 1년에 1 회 이상 제공될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 최적 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 쉽게 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 확립된 프로토콜에 따라 인간에게 펩타이드의 투여를 위한 최적 투여를 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 치료학적으로 유효한 양의 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 VGLL1의 펩타이드 단편 또는 이의 변이체가 암세포 증식을 억제시키고 암세포의 침윤을 억제시킴으로써 암의 예방 및 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이하에서는 이에 대해 구체적으로 살핀다.
<실시예 1> TGF-β에 의한 MMP9의 발현 증가에 의한 암세포의 증식 및 전이 확인
실시예 1-1. TGF-β에 의한 MMP9의 발현 확인
위암세포주에서 TGF-β 처리에 따른 MMP9의 발현 변화를 확인하기 위하여, 인간 위암세포주 NUGC3에 TGF-β를 각 시간대별로 처리한 후 세포로부터 mRNA를 추출하고 상보적 DNA를 합성한 후, Matrix metalloproteinase 9 (MMP9) 프라이머 (표 4)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.
프라이머 서열
MMP9-F 5'-TCTATGGTCCTCGCCCTGAA-3'(서열번호 20)
MMP9-R 5'-CATCGTCCACCGGACTCAAA-3'(서열번호 21)
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, TGF-β에 의해 6시간 이후부터 MMP9의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 1-2. MMP9에 의한 암세포 증식 및 침윤 확인
MMP9의 발현이 위암 세포의 증식 및 전이에 미치는 영향을 확인하기 위하여, siMMP9을 처리하여 암세포의 증식 및 침윤에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 위암 세포주 NUGC3를 6웰 플레이트(6-well plate)에 overnight으로 배양한 후, 20 nM siSC, siMMP9(서열번호 22)을 리포펙타민 2000과 혼합하여 상기 세포주에 처리하였다. 48시간 후, 세포로부터 mRNA를 추출하고 상보적 DNA를 합성한 후, MMP9 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 2A).
서열
siMMP9 5'-CCACAACAUCACCUAUUGGAUdTdT-3'
또한, MMP9의 세포 증식능을 확인하기 위하여, 위암 세포주 NUGC3를 96웰 플레이트(96-well plate)에 배양한 다음날 20 nM siSC, siMMP9을 리포펙타민 2000과 혼합하여 상기 세포주에 처리하였다. 48시간 후, 1% 포르말린(formalin) 용액을 사용하여 세포를 고정시켰다. 그 후, 0.4% Sulforhodamine B용액으로 상기 세포를 1시간 동안 염색한 후 아세트산(acetic acid)으로 세척하여 건조시켰다. 그런 다음, 상기 세포를 10 mM Tris 용액에 녹이고 엘라이자 플레이트 리더기(ELISA plate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 2B).
다음으로, MMP9의 세포 침윤능을 확인하기 위하여, 24웰 플레이트(24-well plate)에 세포배양용 인설트(cell culture insert)를 고정하고 매트리젤(matrigel)을 20배 희석하여 100 ㎕ 첨가하고 37℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 인설트 아래쪽 24웰 플레이트에 10% 혈청이 포함된 배지 700 ㎕를 첨가하였다. 위 siRNA로 MMP이 녹다운(knockdown)된 세포를 5 x 10 5 농도가 되도록 혈청이 없는 배지 300 ㎕에 맞추어 인설트에 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후, 인설트를 꺼내서 10% 포르말린 용액에 고정시켰다. 인설트 안쪽에 남아있는 세포를 면봉으로 제거하고 물로 세척하였다. 0.4% Sulforhodamine B 용액으로 세포를 1시간 동안 염색한 후, 아세트산(acetic acid)으로 세척하여 건조시켰다. 그런 다음, 광학현미경으로 사진을 찍고 인설트의 막(membrane)을 잘라낸 후, 10 mM Tris 용액에 녹여 엘라이자 플레이트 리더기(ELISA plate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 2C).
상기 각각의 실험결과를 도 2의 A 내지 C에 나타내었다.
도 2의 A는 siRNA(siMMP9) 처리에 따라, MMP9의 발현이 감소된 결과를 나타낸다. 또한, 도 2의 B는 siRNA(siMMP9) 처리에 따라 MMP9의 발현이 감소됨으로써 세포 생존율이 크게 감소하는 결과를 나타낸다. 또한, 도 2의 C는 siRNA(siMMP9) 처리에 따라 세포의 침윤 특성이 크게 감소한 결과를 나타낸다.
위 결과들에서 확인할 수 있는 바와 같이, siMMP9에 의해 MMP9의 발현이 억제되고, 이에 따라 위암세포주 NUGC3에서 증식 및 침윤능이 크게 감소되는 결과가 확안되었다.
<실시예 2> MMP9의 프로모터 활성 확인 및 이의 mRNA 발현에 VGLL1과 TEAD4의 작용 확인
실시예 2.1 TGF-β에 의한 MMP9의 프로모터 활성 확인 및 VGLL1과 TEAD4의 조절능 확인
NUGC3 인간 위암 세포주에서 MMP9의 프로모터 활성에 VGLL1과 TEAD4가 관여하는지 확인하기 위하여, TGF-β를 처리한 후 MMP9 프로모터 루시퍼레이즈 (luciferase) 활성을 확인하였다.
구체적으로, 위암 세포주 NUGC3를 48웰 플레이트(48-well plate)에 2 x 10 4 세포/웰 농도로 세포를 배양하였다. 그 다음날, MMP9 유전자가 삽입된 pGL4.17-luciferase 벡터를 리포펙타민 2000을 이용하여 세포에 형질 주입시켰다. 24시간 후, 20 nM siSC (서열번호 23: 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGUdTdT-3′) siVGLL1(서열번호 24 : 5′-AGCCUAUAAAGACGGAAUGGAAUdTdT-3′), siTEAD4(서열번호 25 : 5′-GACACUACUCUUACCGCAUdTdT-3′), siYAP(서열번호 26 : 5′-CCACCA AGCUAGAUAAAGAAAdTdT-3′)를 리포펙타민 2000과 혼합하여 상기 세포주에 처리하였다. 다음날 TGF-β를 18시간 처리한 후 세포 용해 완충액(passive lysis buffer)을 이용하여 상기 세포를 파쇄하였다. 그런 다음, 상기 세포를 원심분리한 후, 상층액 수득하고, 수득된 상기 상측액을 기질(제품명 dual-luciferase assay kit)과 함께 반응시키면 루시퍼레이즈 효소와 기질 반응으로 빛을 나타냄으로, 이때, 빅터(victor X Light)를 이용하여 상기 세포의 발광 정도를 확인하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, siVGLL1과 siTEAD4로 형질 주입시킨 세포는 대조군 (siSC)에 비해 TGF-β에 의해 증가된 MMP9 프로모터 활성이 감소되었다. 이러한 결과는 VGLL1과 TEAD4가 MMP9의 프로모터 활성을 조절하는 것을 보여준다.
실시예 2-2. TGF-β에 의한 MMP9의 mRNA 발현에 VGLL1과 TEAD4의 작용 확인
NUGC3 인간 위암 세포주에서 MMP9의 mRNA 발현에 VGLL1과 TEAD4가 관여하는지 확인하기 위하여, TGF-β를 처리한 후 MMP9 mRNA 발현을 RT-PCR로 확인하였다.
구체적으로, 위암 세포주 NUGC3를 6웰 플레이트(6-well plate)에 배양한 다음날 20 nM siSC, siVGLL1, siTEAD4, siYAP을 리포펙타민 2000과 혼합하여 상기 세포주에 처리하였다. 다음날 TGF-β를 18시간 처리한 후 세포로부터 mRNA를 추출하고 상보적 DNA를 합성한 후, RT-PCR을 수행하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, siVGLL1과 siTEAD4로 형질 주입시킨 세포는 대조군 (siSC)에 비해 TGF-β에 의해 증가된 MMP9 mRNA 발현을 감소시키는 것으로 확인되었다.
<실시예 3> TGF-β에 의한 VGLL1의 세린(Serine) 84번의 인산화 확인
TGF-β에 의해 VGLL1이 인산화 되는지 확인하기 위해 VGLL1 아미노산 서열 50, 84, 124번째 세린(Serine)을 알라닌 (Alanine)으로 돌연변이 시킨 후, VGLL1의 인산화여부를 확인하였다.
구체적으로, VGLL1의 특정 아미노산을 돌연변이 시키기 위해 pcDNA3-HA-VGLL1- 벡터에서 site-direct mutagenesis 제품을 사용하여 50, 84, 124번째 세린을 알라닌으로 바꾸었다.
또한 위암 세포주 NUGC3를 6웰 플레이트(6-well plate)에 배양한 다음날 pcDNA3-HA(EV), pcDNA3-HA-VGLL1(WT), pcDNA3-HA-VGLL1-S50A (S50A 변이), pcDNA3-HA-VGLL1-S84A(S84A 변이), pcDNA3-HA-VGLL1-S124A(S124A 변이)를 터보펙트와 혼합하여 세포주에 형질전환시켰다. 48시간 후 TGF-β를 15분간 처리하고 상기 세포로부터 리파 버퍼(RIPA buffer)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 HA 항체가 결합된 아가로즈를 이용하여 면역침전(Immunoprecipitation)시키고 전기영동으로 분리한 후, 이동된 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)에서 항체를 이용하여 유전자들의 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, TGF-β에 의한 VGLL1의 인산화는 WT, S50A, 및 S124A에서 세린/스레오닌 인산화(pSer/Thr) 항체에 의해 검출되었다. 반면 S84A 돌연변이로 형질전환시킨 세포주에서는 VGLL1의 인산화를 확인할 수 없었다. 이는 VGLL1의 세린84번 위치가 TGF-β에 의해 인산화되는 부위임을 보여주는 결과이다.
<실시예 4> 인산화된 VGLL1과 TEAD4 결합 확인
VGLL1이 전사인자 TEAD4와 결합하는지 확인하기 위해 면역침전법을 수행하였고, VGLL1의 인산화가 중요하게 작용하는지 확인하기 위해 <실시예 3>에서 사용한 벡터를 이용하였다.
구체적으로, GFP-TEAD4 벡터와 pcDNA3-HA(EV), pcDNA3-HA-VGLL1(WT), pcDNA3-HA-VGLL1-S50A (S50A 변이), pcDNA3-HA-VGLL1-S84A(S84A 변이), pcDNA3-HA-VGLL1-S124A(S124A 변이)를 터보펙트와 혼합하여 24시간 배양된 세포주에 형질전환 시켰다. 48시간 후 상기 세포로부터 리파 버퍼를 이용하여 단백질을 추출하고 HA 항체가 결합된 아가로즈를 이용하여 면역침전시키고 전기영동으로 분리한 후, 이동된 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)에서 항체를 이용하여 유전자들의 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, VGLL1과 TEAD4의 결합은 WT, S50A, S124A에서 지에프피(GFP) 항체에 의해 검출되었다. 반면 S84A 돌연변이로 형질전환시킨 세포주에서는 TEAD4의 결합을 확인할 수 없었다. 이는 VGLL1의 세린84번 위치가 TEAD4와의 결합에 중요한 부위에 해당함을 보여주는 결과이다.
<실시예 5> TGF-β에 의한 MMP9 발현 증가에 VGLL1의 인산화의 작용 확인
NUGC3 인간 위암 세포주에서 MMP9의 단백질 발현에 VGLL1의 인산화가 관여하는지 확인하기 위하여, 상기 <실시예 3>에서 사용한 VGLL1 벡터들을 사용하여 MMP9의 단백질 발현을 Western blot으로 확인하였다.
구체적으로, 위암 세포주 NUGC3를 6웰 플레이트(6-well plate)에 배양한 다음날 pcDNA3-HA(EV), pcDNA3-HA-VGLL1(WT), pcDNA3-HA-VGLL1-S50A (S50A), pcDNA3-HA-VGLL1-S84A(S84A), pcDNA3-HA-VGLL1-S124A(S124A)를 터보펙트와 혼합하여 세포주에 형질전환시켰다. 24시간 후 TGF-β를 18시간 처리하고 상기 세포로부터 리파 버퍼를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 전기영동으로 분리한 후, 이동된 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)에서 MMP9, HA, GAPDH 항체를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, TGF-β에 의한MMP9 단백질의 발현은 VGLL1 84번 세린을 알라닌으로 치환시킨 세포주에서 감소되는 것으로 확인되었다. 이는 TGF-β에 의한 VGLL1의 인산화가 MMP9 발현에 중요하다는 것을 나타내며, VGLL1 펩타이드의 84번째 위치의 세린이 중요인자임을 나타낸다.
<실시예 6> S84 VGLL1 펩타이드 단편의 MMP9 발현 억제와 암세포 증식 및 침윤 저해 효과 확인
실시예 6-1. S84 VGLL1 펩타이드 단편은 TGF-β에 의한 MMP9 발현을 감소시킴
인간 위암세포주에서 VGLL1과 TEAD4의 결합을 저해시키는 펩타이드 단편을 처리하는 경우, MMP9의 발현을 저해시킬 수 있는지 확인하기 위해 하기 [표 6]의 서열을 가지는 펩타이드 단편을 제작하여, 이의 MMP9 발현 억제 효과를 확인하였다.
펜타이드 단편 서열
VGLL1 (S84) YGRKKRRQRRRPNQWRYSSPWTKPQP (서열번호 27)
VGLL1 (S84A) YGRKKRRQRRRPNQWRYSAPWTKPQP (서열번호 28)
Control peptide YGRKKRRQRRR (서열번호 12)
상기 표 6에서 펩타이드 단편 서열은 VGLL1의 S84를 포함하는 VGLL1의 77 내지 91번째 서열을 제공한다. 구체적으로, 서열번호 27의 서열은 fluorescein moiety (FITC) 와 세포 내 도입에 필요한 HIV TAT transduction domain sequence인 YGRKKRRQRRR를 포함하고 이에 VGLL1의 77 내지 91번의 서열이 연결된 서열이다. 서열번호 28은 VGLL1의 S84을 S84A로 치환한 서열을 나타낸다. 서열번호 12는 Control 서열로 HIV TAT transduction domain sequence를 나타낸다.
상기 합성 펩타이드 단편을 이용하여 실험을 수행하였다. 위암 세포주 NUGC3를 6웰 플레이트(6-well plate)에 배양한 다음날 혈청이 없는 세포배양에서 24시간 배양시켰다. TGF-β와 컨트롤 펩타이드 단편 (서열번호 12), VGLL1의 84번 세린을 포함하는 펩타이드 단편 (서열번호 27), VGLL1의 84번 알라닌을 포함하는 변이 펩타이드 단편 (서열번호 28)을 18시간 처리하였다. 상기 세포로부터 리파 버퍼를 이용하여 단백질을 추출하고 전기영동으로 분리한 후, 이동된 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)에서 항체를 이용하여 유전자들의 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, TGF-β에 증가된MMP9 발현은 VGLL1의 84번 세린을 포함하는 펩타이드 단편 처리에 의해 감소되었다. 반면 VGLL1의 84번 알라닌을 포함하는 변이 펩타이드 단편 서열의 경우 펩타이드 단편의 처리에 의해 어떠한 영향도 받지 않았다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 VGLL1의 84번 세린을 포함하는 펩타이드 단편 서열이 암의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 6-2. S84 VGLL1 펩타이드 단편에 의한 암세포 증식 억제 효과 확인
위암세포에서 VGLL1과 TEAD4의 결합을 억제시켜 MMP9발현을 감소시키면 암세포의 증식에도 영향을 줄 수 있기 때문에, S84를 포함하는 VGLL1 펩타이드 단편에 의해 세포 증식이 억제되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 위암 세포주 NUGC3를 96웰 플레이트(96-well plate)에 배양한 다음날 펩타이드 단편을 처리하고, 실시간 세포 분석 시스템 (제품명 Incucyte)을 사용하여 세포 증식을 분석하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, S84 VGLL1 펩타이드 단편은 암세포 증식을 억제시키는 효과를 나타내었다. 반면 컨트롤 펩타이드 단편이나 S84의 위치가 변이된 84번 위치에 알라닌을 포함하는 변이 VGLL1 펩타이드 단편은 암세포 증식 억제에 어떠한 영향도 미치지 못하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 S84 VGLL1 펩타이드 단편 서열이 암세포 증식 억제에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실시예 7> S84 VGLL1 펩타이드 단편에 의한 암세포 침윤 억제 확인
VGLL1 펩타이드 단편에 의한 위암세포 침윤 실험을 실시예 1-2와 유사한 방법을 수행하였다.
위암 세포주 NUGC3를 펩타이드 단편과 함께 인서트(insert)에 넣고 48시간 세포 배양 후, 인서트를 10% 포르말린 용액에 고정하고 아래쪽으로 이동된 세포를 0.4% Sulforhodamine B 용액으로 염색하여 확인하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, S84를 포함하는 VGLL1 펩타이드 단편 서열은 암세포 침윤을 억제시키는 효과를 나타내었는 반면, 해당 위치가 변이된 서열의 경우 그러한 효과를 나타내지 못하였다.
<실시예 8> S84 VGLL1 펩타이드 단편 변이체의 암세포 증식 억제 효과 확인
VGLL1 S84 펩타이드 서열 중 주요 아미노산의 돌연변이에 의한 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해 표 7과 같이 펩타이드를 제작하였다.
펩타이드 서열
Control YGRKKRRQRRR (서열번호 12)
VGLL1 S84-S YGRKKRRQRRR- YSSPWTK (서열번호 29)
VGLL1 S84 YGRKKRRQRRR-PNQWR YSSPWTKPQP (서열번호 27)
VGLL1 S84A YGRKKRRQRRR-PNQWR YSAPWTKPQP (서열번호 28)
VGLL1 P85A YGRKKRRQRRR-PNQWR YSSAWTKPQP (서열번호 30)
VGLL1 T87A YGRKKRRQRRR-PNQWR YSSPWAKPQP (서열번호 31)
위암 세포주 NUGC3를 96웰 플레이트(96-well plate)에 배양한 다음 날 60μM 펩타이드를 처리하고 실시간 세포 분석 시스템 (제품명 Incucyte)을 사용하여 세포 증식을 분석하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11의 도면 A는 실시간 세포 증식 그래프이며, 도면 B는 4일 후 세포 증식을 컨트롤 펩타이드 100% 기준으로 그린 그래프이다.
도면에서 확인할 수 있는 바와 같이, S84 VGLL1 펩타이드 뿐만 아니라 S84-S, P85A, T87A 등을 처리한 경우 암세포 증식을 억제시키는데 우수한 효과를 나타내었다.
이러한 결과를 바탕으로, 세포 증식 억제 효과가 나타나는 펩타이드의 서열로 S84 서열이 가장 중요한 것을 확인하였다.
위 결과로부터 본 발명에 따른 VGLL1의 S84번의 세린을 포함하는 펩타이드 단편 서열이 암세포의 증식 억제 및 침윤 억제를 통해 암의 치료에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<실시예 9> S84 VGLL1 펩타이드 단편의 다양한 암세포 증식 억제 효과 확인
S84 VGLL1 펩타이드 단편 변이체의 다양한 암세포 증식 억제 효과를 확인하기 위하여, 서열번호 27의 VGLL1 S84 펩타이드 서열을 다양한 암 세포주에 처리하였다.
구체적으로, 표 8의 암세포를 96웰 플레이트(96-well plate)에 배양한 다음 날 60μM 펩타이드를 처리하고, 실시간 세포 분석 시스템(제품명 Incucyte)을 사용하여 세포 증식을 분석하였다.
암 종류 암 세포주 명
위암 NUGC3
AG5
NCI-N87
SNU484
MKN1
대장암 SW620
HCT116
WiDr
폐암 A549
H1650
H1299
간암 HepG2
SNU354
췌장암 ASPC1
PANC1
Mia-paca2
유방암 MCF7
SKBR3
자궁경부암 Hela
난소암 SK-OV3
그 결과, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, S84 VGLL1 펩타이드 단편은 위암 세포뿐만 아니라, 대장암, 폐암, 간암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암 및 난소암 세포의 증식을 억제시키는데 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
이러한 결과를 바탕으로, 다양한 암 세포 증식 억제 효과가 나타나는 펩타이드의 서열로 S84 서열이 중요한 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 VGLL1의 펩타이드 서열의 84번째 세린(Serine)을 포함하고, 35개 이하의 아미노산 길이를 가지는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 6 내지 25개의 아미노산 서열을 가지는 것인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1의 52번 내지 115번째 사이의 아미노산 서열에서 84번째 세린 서열을 포함하는 것인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 84번째 세린 및 이에 인접한 6개 내지 20개 아미노산으로 이루어진 것인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 2 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  6. 제1항에 있어서, 세포 투과성 펩타이드를 더 포함하는 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 12 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 VGLL1 펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 두경부 편평암 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 위암인 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제1항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
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