WO2016195157A1 - 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016195157A1
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seq
substituted
cysteine
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신항철
오종광
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(주)피앤피바이오팜
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    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]

Definitions

  • the present invention relates to highly stable basic fibroblast growth factor variants and uses thereof.
  • Growth factors play an important role in regulating cell growth, proliferation and differentiation. Therefore, there is a system that naturally repairs the damage and aging of the skin caused by internal and external factors such as wounds and surgery, and growth factors play an important role here.
  • various growth factors are generated and maintained at a constant concentration. As age increases, the concentration of growth factors in each tissue, such as the skin, is lowered, and aging progresses, as the regeneration and division of cells are weakened, wrinkles are formed, and elasticity is decreased.
  • bFGF Basic Fibroblast Growth Factor, FGF-2
  • FGF-2 Basic Fibroblast Growth Factor
  • bFGF protein therapeutics
  • the bioavailability of protein therapeutics such as bFGF is often limited by short plasma half-life and susceptibility to proteases, hindering maximum clinical efficacy.
  • the physical and chemical stability should be improved in vitro, and the use of bFGF in the manufacture, storage, and distribution of cosmetics such as quasi-drugs and creams will increase.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a basic fibroblast growth factor (bFGF) variant.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a molecular design method of modifying the amino acid sequence of the protein is applied, thereby providing excellent thermal stability and stability in aqueous solution.
  • the present invention was completed by confirming.
  • Another object of the present invention is to provide a DNA base sequence encoding a bFGF variant.
  • Another object of the present invention to provide an expression vector comprising the DNA base sequence.
  • Another object of the present invention to provide a transformant transformed by the expression vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a highly stable basic fibroblast growth factor variant.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic composition for improving skin conditions comprising a high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases comprising a high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • the present invention provides a highly stable basic compound wherein two or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with serine, one or more amino acids are substituted with cysteine, and one amino acid on the surface is substituted with tyrosine.
  • fibroblast growth factor variants Provides fibroblast growth factor variants.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • FGF-2 is a basic protein (pI 9.58) with a molecular weight of about 18 kDa that is mainly secreted by the pituitary gland and promotes the growth of various mesodermal derived cells. It is known. In addition, it is a protein that promotes the growth of vascular endothelial cells and smooth muscle cells, has an excellent effect on the treatment of trauma and vasculature, increases the synthesis of collagen and elastin, maintains skin elasticity, helps normal cells grow, and It is known to promote the recovery and to perform the healing action.
  • Variants of the present invention through the protein homogeneous alignment (homology alignment) method of the tertiary structure and species of the bFGF and computer modeling, using the computer site, the site irrelevant to the active site of bFGF was selected and produced through mutation experiments
  • cysteine amino acid residues in which bFGF and other bFGFs form disulfide bonds are replaced with serine residues of similar structure to increase stability against precipitation due to disulfide bonds on the surface.
  • stability is increased by a method of reducing loop entropy by replacing one residue close to the loop in bFGF with cysteine to generate disulfide bonds.
  • the stability is increased by a method of stabilizing the Cavity structure of the protein by increasing the hydrogen bonds and van der walls interaction by substituting His residue in the bFGF Tyr.
  • the serine-substituted amino acids are the 69th cysteine and the 87th cysteine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid substituted with cysteine is the 26th lysine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; 34th isoleucine at the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; The 40th valine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; The 50th histidine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; The 52nd lysine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; Alanine at the amino acid sequence of SEQ ID 1; The 76th mesionine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; 117th alanine in amino acid sequence of SEQ ID 1; 67th glycine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; The 68th valine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; Alanine at the amino acid sequence of SEQ ID 1; 82 leucine in the amino acid sequence of SEQ ID 1; Alanine at the amino acid sequence of SEQ ID 1; 108 th serine in amino acid sequence of SEQ ID 1; 136
  • a variant in which the histidine No. 50 residue, which is a residue exposed on the surface of the protein to the variant in which the 75th alanine is substituted with cysteine, is substituted with tyrosine is the most preferable variant.
  • cysteine which is the 69th and 87th amino acid residues of the native human bFGF amino acid sequence (SEQ ID NO: 1), is substituted with serine, 50th histidine tyrosine, and the 75th amino acid residue is Alanine is further substituted with cysteine to form intramolecular disulfide bonds and the remaining amino acid sequence provides a human bFGF mutein identical to the naturally occurring amino acid sequence.
  • the bFGF variant of the present invention has increased heat stability compared to the native form while maintaining protein activity. As shown in the following Experimental Examples 1 to 3 bFGF variant has the same activity as the natural type, it can be seen that the stability to heat is also significantly increased.
  • K75 Stable basic Fibroblast Growth Factor, sbFGF
  • K75 Stable basic Fibroblast Growth Factor, sbFGF
  • the thermal stability was improved compared to the bFGF variant in which amino acids No. and 87 were substituted with serine and the bFGF variant in which amino acid No. 75 was substituted with cysteine.
  • HsbFGF substituted with the histidine tyrosine No. 50 of K75 better thermal stability than the natural type and K75 as a control group was improved.
  • the present invention provides a DNA base sequence (SEQ ID NO: 2) encoding the bFGF variant and an expression vector comprising the same.
  • Expression vectors of the present invention can be prepared by inserting the gene of bFGF in a general expression vector.
  • a pET21a vector was used as an expression vector in a preferred embodiment of the present invention, the present invention is not limited thereto, and any cell expression vector that can be used generally can be used.
  • a vector in which the bFGF gene was inserted into the pET21a vector was prepared and named "pSSB-bFGF" (disclosed in FIG. 1B).
  • the present invention provides a transformant which is a host cell transformed by the expression vector.
  • the bFGF variant of the present invention can be prepared by transforming host cells with a vector containing a gene encoding a bFGF variant prepared by site-specific mutation induction and the like, and expressing the bFGF variant, and also by chemical amino acid synthesis. Can be prepared.
  • the DNA encoding the bFGF variant is the DNA encoding the amino acid of the substituted site of native bFGF.
  • Preferred as DNA sequences encoding bFGF variants are those in which the 69th and 87th codons are substituted with codons encoding serine and the 75th codon with codons encoding cysteine.
  • HsbFGF substituted with the histidine tyrosine No. 50 of K75 better thermal stability than the natural type and K75 as a control group was improved.
  • Such DNA encoding the bFGF variant may be chemically synthesized or prepared by using a method such as site-specific mutation induction based on the production of native bFGF cDNA.
  • the DNA encoding the bFGF variant of the present invention prepared above can be expressed using any of the appropriate prokaryotic or eukaryotic expression systems well known in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd). ed., Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, USA, 1989).
  • Escherichia coli eg, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli JM109 (DE3), Escherichia coli NM522, etc.
  • suitable vectors that can be used for expression in E. coli are Sambrook (Homologous) and Papers et al. ("Proced. 8th Int. Biotechnology Symposium", Soc. Frac, de Microbiol., Paris, (Durand et al., Eds.), Pp. 680-697 , 1988).
  • Transformation of host cells by the vector described above can be carried out by any of the conventional methods (Sambrooketal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989; Ito et al., J. Bacteriol. 153: 263, 1983). .
  • a competent cell capable of absorbing DNA can be prepared, and then treated according to a known method.
  • the present invention provides a method for producing a basic fibroblast growth factor (bFGF) mutant comprising the following steps:
  • step (b) separating the variant from the culture obtained in step (a).
  • step (b) of the method is a preferred embodiment of the invention.
  • host microorganisms containing the desired expression vector are cultured at their optimum growth conditions in a range that maximizes the production of the desired protein.
  • E. coli BL21 (DE3) cells transformed with a vector containing an empicillin resistance gene as a selection marker are cultured at 37 ° C. in LB medium containing empicillin.
  • Recovery and purification of the produced bFGF variant after culturing the transformed host cell can be carried out by using various methods known in the art or a combination thereof.
  • bFGF variants expressed in transformed Escherichia coli cells can be recovered by extraction from cell culture or by appropriate methods known in the protein chemistry following disruption of the cells.
  • the culture medium of recombinant E. coli cells is centrifuged to harvest the cells, and the harvested cells are suspended in lysozyme-added buffer and crushed by ultrasound.
  • the cell lysate is centrifuged to separate the aggregates in the form of insoluble granules, and the separated aggregates are removed.
  • the supernatant from which the aggregates are removed is separated and purified using ion exchange resin chromatography, and purified by ion exchange resin followed by heparin affinity chromatography to obtain the resultant high stability bFGF variant.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases comprising the high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • the high stability bFGF variants of the present invention have the same activity as native bFGF, and have very good thermal stability and stability in aqueous solution. Therefore, the composition of the present invention is very effective for the prevention or treatment of skin diseases.
  • the composition of the present invention is such as skin inflammation, acute and chronic eczema, contact dermatitis, atopic dermatitis, seborrheic dermatitis, chronic simple gland, interrogation, deprivation dermatitis, papular urticaria, psoriasis, sun dermatitis and acne. Used for the prevention or treatment of skin diseases.
  • composition of the present invention can provide a composition for treating wounds.
  • the composition of the present invention is used for the treatment of closed wounds and open wounds.
  • closed windows include a contusion or burise
  • open windows include abrasions, lacerations, avulsions, penetrated wounds, and gun shot wounds.
  • composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the bFGF variant of the invention described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the bFGF variants described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, or the like. Can be.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. Meanwhile, the preferred daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets, capsules, or gels (eg, hydrogels), and may further include dispersants or stabilizers. .
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving skin condition comprising the high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • the high stability bFGF variants of the present invention have the same activity as native bFGF, and have very good thermal stability and stability in aqueous solution. Therefore, the composition of the present invention is very effective for improving skin condition.
  • the composition of the present invention is used to improve skin conditions such as wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, hair loss prevention or hair growth, skin moisturization improvement, mushroom removal or acne treatment.
  • composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the bFGF variant of the present invention described above; And (b) a cosmetically acceptable carrier.
  • cosmetic effective amount means an amount sufficient to achieve the skin improving efficacy of the composition of the present invention described above.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • animal oils vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide
  • cellulose derivatives polyethylene glycols
  • silicones bentonites
  • silicas talc or zinc oxide
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention include components conventionally used in cosmetic compositions, in addition to the bFGF variant and carrier component as active ingredients, and include, for example, conventional agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. Phosphorus adjuvant.
  • compositions of the present invention include the above-mentioned high-stability bFGF variant of the present invention as an active ingredient, the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the bFGF variant of the present invention has excellent thermal stability and stability in an aqueous solution state, and thus, during the distribution and storage process, the production of functional cosmetics that does not lose activity unlike conventional natural bFGF products, and as a skin wound coating agent. It can be used.
  • 1 and 2 show an overview of the assembly of the plasmid and pSSB-bFGF.
  • Figures 3 to 4 show the SDS-PAGE results of T (cell suspension after cell disruption) S (supernatant after cell disruption) P (insoluble aggregate after cell disruption) after cell disruption of native bFGF and the bFGF variant of the present invention.
  • TM melting temperature
  • Figure 6 shows the results of comparing the activity of the natural type bFGF and bFGF variant of the present invention.
  • Figure 8 is an analysis using SDS-PAGE after the final purification of natural bFGF (A) and bFGF variant (K75) (B) of the present invention.
  • Figure 9 shows the difference between the natural type bFGF, the sbFGF variant of the present invention and HsbFGF TM (Melting temperature) which is an indicator of the thermal stability.
  • Figure 11 shows the stability comparison after incubation at 60 °C in natural type bFGF and the sbFGF variant of the present invention and HsbFGF PBS (Phosphate buffer saline) state most similar to the state of the human body.
  • HsbFGF PBS Phosphate buffer saline
  • Figure 12 shows the quantitative comparison of HPLC after incubation at 60 °C in natural form of bFGF and sbFGF variant of the present invention and HsbFGF PBS (Phosphate buffer saline) state most similar to the human state.
  • HsbFGF PBS Phosphate buffer saline
  • Figure 13 shows the comparison of the bFGF activity of the natural type bFGF and bFGF variants of the present invention.
  • BL21 DE3
  • Rosetta DE3
  • Cloning E. coli strain was used as Top10.
  • Restriction enzymes used for genetic recombination are all NEB (New England Biolabs) product
  • the ligase is Roche's T4 DNA ligase.
  • Ex taq DNA polymerase used for PCR is a product of Takara
  • pfuUltra TM HF DNA polymerase used for point mutations is a product of Agilent.
  • DNA gel extraction kit and plasmid mini prep kit are products of Cosmojintech.
  • primers were produced by Cosmojin Tech Co., Ltd. DNA sequencing was also performed by Cosmojin Tech Co., Ltd.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • ampicillin and chloramphenicol used as antibiotics were all purchased from Sigma.
  • the bacto tryptone and yeast extract used to make E. coli cultured LB medium were purchased from BD (Becton Dicknson), and NaCl was used as Duksan.
  • Reagents used in the purification process using the highest purity products, and the reagents used in the purification process are as follows. sodium phosphate monobasic (Sigma), sodium phosphate dibasic (Sigma) and sodium chloride (Sigma).
  • the columns used in FPLC were SP-sephrose and heparin affinity columns from GE Healthcare.
  • the CD used Jasco's J-810 spectropolarimeter.
  • the YASARA Web server was used to predict the formation of disulfide bonds.
  • the plotting progream which measures the distance at which disulfide bonds can be used, uses protein contact map visualization (Andreas Viklund.).
  • PET21a vector (Novagen) was used as an expression vector for producing variant bFGF.
  • the wild type bFGF gene was obtained from PnP biopharm Co., Ltd. and amplified the native form through PCR (polymerase chain reaction) using the following primers.
  • the PCR product thus obtained was conjugated by inserting the pET21a vector after treatment with restriction enzymes Nde I and Xho I.
  • the amino acid moiety to be changed was found through the structure of the protein (PDB: 4FGF) and molecular model method, and the Quikchange mutagenesis method using pfu Ultra TM DNA polymerase using the following primer (Example 4). Amplified using. In order to remove the used natural bFGF template, Dpn I reaction was performed and transformed to Top10, and mutants were identified through sequencing.
  • the recombinant vector into which bFGF was inserted was transformed into E. coli BL21 (DE3) by a heat shock method.
  • This E. coli strain was inoculated in 500 ml LB medium containing 50 ug / ml ampicillin and grown at 37 ° C until the O.D600 value was 0.6. Thereafter, 0.5 mM IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside) was added thereto, followed by 4 hours of incubation. When the O.D600 value was 2.0 or more, cells were collected by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes.
  • Cells were disrupted to obtain proteins from E. colil expressing bFGF protein.
  • the harvested cells were suspended in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and crushed by sonicator at 4 ° C. Thereafter, the mixture was centrifuged at 13000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. to remove the insoluble body, and the supernatant was taken and confirmed by SDS-PAGE.
  • Candidate groups capable of disulfide bonds were set using 1BLA (NMR), a structure of proteins registered in PDB.
  • the protein contact map visualization program was used to analyze the residues of two amino acids with a C-alpha carbon of less than 7 ⁇ and a C-beta carbon of 5 ⁇ .
  • the formation of disulfide bonds was analyzed using Yasara energy minimization server and energy minimization was performed using AMBER force filed FF99 of chimera.
  • the structure of the resulting protein was aligned with the natural type bFGF, RMSD was measured to have a structure having a value of 0.5 or less.
  • bFGF was dissolved in 20 mM sodium phosphate (pH 7.0), respectively, to make a final concentration of 0.2 mg / ml.
  • the band width is 1 nm
  • response 0.25 sec the band width
  • data pitch 0.1 nm
  • scanning speed 20 nm / min
  • cell length 1 cm
  • accumulation number 8 the temperature is 20 °C.
  • the melting temperature was 0.2 mg / ml concentration in 0.1 cm cell at 205nm wavelength at 20 °C and 95 °C. The conditions were measured from 20 degreeC to 95 degreeC on the conditions of 1 degree-C / min.
  • NIH-3T3 cells used in the experiment were maintained using DMEM complete medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, and 100 mg / ml streptomycin. 2x10 3 cells / well of NIH-3T3 cells were seeded on a 96 well culture plate. NIH-3T3 cells were incubated for 24 hours in serum-free DMEM medium, starvation was followed by treatment of sample solution in each concentration in DMEM medium containing 0.5% FBS and incubated for 72 hours.
  • MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution was added and reacted for 2 hours, followed by a formazan crystal with 100 ul of DMSO. Was dissolved. Absorbance was measured at 540 nm using a spectrophotometer. Drug sensitivity was compared as a percentage of drug-treated wells for absorbance of untreated drug (control).
  • Incubation test of the native type bFGF and variants was performed to confirm the storage degree at room temperature.
  • Each wild type FGF-2 and mutants were dissolved at 0.5 mg / ml in 1X PBS (pH 7.3) and incubated in 37 °C, 50 °C and 60 °C water baths. Sampling was performed every 24 hours and centrifuged at 13000 rpm for 15 minutes at 4 ° C to obtain only supernatants for quantification and HPLC analysis using Nano drop.
  • Human mononuclear cDNA library was used as a template, and DNA encoding bFGF was prepared by polymerase chain reaction using a primer.
  • the base sequence of the primer used is as follows:
  • the bFGF portion of FIG. 2 was amplified using the primers specified above, and 1 ug of the amplified DNA fragment was dissolved in 50 ul TE (pH8.0) solution, followed by 2 units of Nde I (NEB) and 2 units of Bam HI. After mixing with (NEB Co., Ltd.), and reacted for 2 hours at 37 °C to have a Nde I restriction enzyme site at the 5'-end and Bam HI restriction enzyme site at the 3'-end. After only DNA was purified using a DNA purification kit (GeneAll), 20 ng of this DNA fragment was treated with Nde I and Bam HI in the same manner, together with 20 ng of pET21a (+) plasmid (Novagen).
  • pSSB-bFGF T4 DNA ligase
  • the expression plasmid pSSB-bFGF was transformed into heat shock in E. coli BL21 (DE3). Ampicillin-resistant colonies, which were generated in solid medium after transformation, were selected and inoculated in 10 ml of LB medium (LB / ampicillin). After incubating at 37 ° C. for 12 hours, 100% glycerol was mixed 1: 1 and stored at -70 ° C.
  • the stock prepared in Example 2 was inoculated into 10 ml of LB medium (LB / ampicillin) and then cultured for at least 12 hours. Thereafter, 500 ml of LB medium (LB / ampicillin) was transferred to IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside) when the absorbance was 0.4 to 0.5 at 600 nm, and the final concentration was 0.5 mM. After shaking for 4 hours at 37 °C shaking culture at 200 rpm centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to obtain a E. coli pellet (pellet). The pellet was suspended in 25 ml of 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer and then cells were disrupted by sonication.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • PSSB-bFGF variant plasmids were made by PCR using two complementary primers corresponding to each variant using pfuUltra TM HF DNA polymerase as a template with the native pSSB-bFGF plasmid. Then, using ppn I, the native pSSB-bFGF plasmid was cut and transformed into heat shock in E. coli Top10. After transformation, colonies resistant to ampicillin generated in solid medium were selected and inoculated into 10 ml of LB medium (LB / ampicillin). After incubating at 37 ° C. for 16 hours, DNA prep was performed, and the resulting DNA was identified by sequencing the pSSB-bFGF variant plasmid. The base sequence of the primer used is as follows:
  • Each of the expression plasmids of the bFGF variant was transformed into E. coli BL21 (DE3) in the same manner as in Example 2 to make stock, and cultured in 500 ml of LB medium (LB / ampicillin) in the same manner as in Example 3. Purification yielded bFGFs each about 18 KDa in size. The amount of mutants obtained was different according to the mutants, and about 4-12 mg of bFGF was obtained according to the mutants, and the purity was more than 98%.
  • Each bFGF variant is as follows.
  • the 69th and 87th cysteines of SEQ ID NO: 1 are substituted with serine, the 75th alanine is substituted with cysteine, Variant with 50th histidine substituted with tyrosine
  • Example 5 The structure and thermal stability of the purified bFGF variant of Example 5 were determined by circular dichroism analysis using a J-810 spectrometer (JASCO). Natural bFGF was used bFGF purified in Example 3. For structural analysis, each bFGF is dissolved in 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) to make a final concentration of 0.1 mg / ml. In a 0.1 cm cell, a band width of 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm / min, cell length 1 cm, accumulation number 8, and a temperature of 20 °C was analyzed.
  • Tm melting temperature
  • Table 2 shows the results of measuring the fraction unfolded by temperature at the wavelength of 208 nm during the circular dichroism analysis, which is a measure of the degree of structural change and thermal stability of the natural bFGF and bFGF variants.
  • the structural change is shown in the region around 208 nm, and the Tm (melting temperature) is measured within the range of 20 ⁇ 95 °C to analyze the correct Tm value.
  • the bFGF variants are those in which the 69th and 87th cysteines of SEQ ID NO: 1 are substituted with serine, followed by further substitution of residues at respective positions with cysteines to induce intramolecular disulfide bonds.
  • thermal stability Tm was almost the same as the bFGF variant compared to the natural type bFGF 58 °C, of which the K75 variant was confirmed to improve the thermal stability up to 62 °C. This means that thermal stability was increased by artificially adding disulfide bonds by replacing one amino acid with cysteine.
  • the native bFGF of SEQ ID NO: 1 BFGF variant (Cys ⁇ Ser variant) in which only the 69th and 87th cysteines of SEQ ID NO: 1 were substituted with serine, bFGF variant (natural + disulfide bond) in which only the 75th alanine of SEQ ID NO: 1 was substituted with cysteine, and K75
  • BFGF variant Cys ⁇ Ser variant
  • bFGF variant naturally + disulfide bond
  • K75 The thermal stability of the variant (Cys ⁇ Ser variant + disulfide bond, bFGF variant where the 69th and 87th cysteines of SEQ ID NO: 1 were substituted with serine and the 75th alanine was substituted with cysteine) was compared.
  • the TM of the natural bFGF was about 57.5 degrees
  • the TM of the Cys ⁇ Ser variant was 58 ° C.
  • the TM of the native + disulfide bond was 61.5 ° C.
  • the K75 variant (Cys ⁇ Ser variant + disulfide).
  • the bond TM was found to be 62 ° C., indicating an increased thermodynamic stability of the K75 variant.
  • the TM of the natural bFGF was about 57.5 ° C.
  • the TM of the K75 variant (Cys ⁇ Ser variant + disulfide bond) was 62 ° C.
  • HsbFGF (K75 + His ⁇ Tyr) TM was This means that the thermodynamic stability of the variant was increased to 65 ° C.
  • Cell proliferation assay was performed by selecting bFGF and analyzing the results of Tm and its structure using solubility and circular dichroism.
  • Cell proliferation assay was performed with GeneHwell Co., Ltd. with NIH3T3 cell line, a skin cell sensitive to bFGF.
  • NIH-3T3 cells were maintained using DMEM complete medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, and 100 mg / ml streptomycin. Seed the NIH-3T3 cells of 2x10 3 cells / well in a 96 well culture plate.
  • the NIH-3T3 cells incubated for 24 hours were treated with serum-free DMEM medium, each sample concentration was treated in DMEM medium containing 0.5% FBS, and cultured for 72 hours. After incubation, 10 ul of MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution was added and reacted for 2 hours, followed by a formazan crystal with 100 ul of DMSO. Was dissolved. Absorbance was measured at 540 nm using a spectrophotometer. Drug sensitivity was compared as a percentage of drug-treated wells for absorbance of untreated drug (control). As shown in FIGS. 6 and 12, the bFGF variant showed similar cell proliferation capacity as the native bFGF.
  • the native bFGF and its variants were dissolved at 0.5 mg / ml and incubated in a water bath at 37 ° C. After 48 hours, 7 days, and 10 days, the samples were centrifuged at 13000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. to obtain only supernatant, and the protein was quantified using Nano drop. Over time, the concentrations of native bFGF and variants were quantified, and the native bFGF decreased more severely than the variants. The results are shown in Table 3.
  • the K75 variant has long-term preservation stability in comparison with the native bFGF in the PBS (Phosphate buffer saline) state, which is most similar to the human state, using the K75 variant having increased thermal stability.
  • natural bFGF and K75 variants were dissolved in PBS (Phosphate buffer saline) at the same concentration and incubated at 25 ° C. for 20 days. After centrifugation, only the supernatant was quantitatively analyzed using HPLC.
  • the K75 variant in incubation was significantly higher stability than the natural type bFGF, which is the result showing the superiority of the K75 variant of the present invention.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • the natural type bFGF was hardly confirmed after 3 days in the quantification using a 60 ° C UV spectrometer. Only 22% remained after 5 days for K75, and 40% after 5 days for HsbFGF.

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Abstract

본 발명은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된, 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant), 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열, 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 bFGF 변이체 생산 방법, 및 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 bFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않는 기능성화장품 및 피부 염증 치료제의 생산이 가능하다.

Description

안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도
본 발명은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
성장인자는 세포의 성장, 증식, 분화를 조절하는 중요한 역할을 수행한다. 따라서 우리 몸은 상처, 수술 등 내적 및 외적요인에 의한 피부의 손상과 노화에 대해 자연적으로 수리하는 시스템이 존재하며 여기서 중요한 역할을 담당하는 것이 성장인자들이다. 각 조직의 기능을 유지하기 위해 각종 성장인자들 등이 생성되어 일정농도로 유지되면서 기능을 수행하고 있다. 나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다.
그 중 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor, FGF-2)는 154개의 아미노산으로 구성되어있으며, 분자량 17.123 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드로 구성되어 있다. 이는 발생, 혈관생성 그리고 상처치유에 중요한 역할을 한다. FGF-2는 마이토젠(유사분열물질)과 화학 주성인자로써, 상처 치유, 혈관생성, 그리고 신경계의 성장에서 강력한 매개체이다.
그러나, 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 성장 인자들의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, 특히 bFGF의 경우 그 구조상에 이황화결합을 형성하지 않는 4개의 시스테인 잔기를 가짐으로 인하여 그 안정성에 많은 영향을 받는다는 문제점이 있다.
또한, bFGF와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 플라즈마 반감기 및 프로테아제에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 방해한다. bFGF를 더욱 효과적으로 용도를 개발하기 위해서는 체내에서의 안정성 외에도 체외에서의 물리 화학적 안정성을 향상 시켜야 의약외품 및 크림 등의 화장품의 제조, 보관, 유통과정에 사용이 증가할 것이다.
따라서, 보다 안정하고 활성이 있는 신규 bFGF 변이체의 개발이 필요하다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020090083062호
본 발명자들은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant)를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, bFGF 단백질의 안정성을 증가시키고, 이합체화(dimerization)를 방지하기 위하여, 단백질의 아미노산 서열에 변형을 주는 방식의 분자설계 방식을 적용하여, 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수한 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 생산 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 표면의 아미노산 1개가 타이로신으로 치환된 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)" 또는 "FGF-2"는 분자량 약 18 kDa에 달하는 염기성 단백질(pI 9.58)로서 뇌하수체에서 주로 분비되며 다양한 중배엽 유래 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 혈관 내막 세포 및 평활근 세포의 성장을 촉진하는 단백질로서 외상치료 및 맥관 형성에 탁월한 효능을 나타내고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 유지하며, 정상적인 세포의 성장을 돕고 상처로부터의 회복을 촉진하고, 그 치유작용을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 변이체는, bFGF의 3차 구조와 종간의 상동성 얼라인먼트(homology alignment) 방법 및 컴퓨터를 이용한 단백질 분자 모델링을 통해, bFGF의 활성부위와 관련 없는 부위를 선정하고, 변이실험을 통해 제조된 변이체로서, bFGF와 다른 bFGF가 이황화결합을 형성하는 시스테인 아미노산 잔기가 유사한 구조의 세린 잔기로 치환되어 표면의 이황화결합으로 인한 침전에 대하여 안정성이 증가된다. 또한, bFGF 내 루프에서 가까운 잔기 1개를 시스테인(cysteine)으로 치환시켜 이황화결합을 추가적으로 생성시킴으로써 루프 엔트로피를 감소시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다. 또한, bFGF 내에 His 잔기를 Tyr으로 치환함으로써 수소결합 및 Van der walls interaction 을 증가시켜 단백질의 Cavity 구조를 안정시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세린으로 치환된 아미노산은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 69번째 시스테인 및 87번째 시스테인이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시스테인으로 치환된 아미노산은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 26번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 34번째 아이소루신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 40번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 50번째 히스티딘; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 52번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 76번째 메사이오닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 117번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 67번째 글라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 82번째 루이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 84번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 108번째 세린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 136번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 137번째 아이소루신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 138번째 루이신; 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 144번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 40번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 50번째 히스티딘; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 52번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 76번째 메사이오닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 117번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75번째 알라닌이다.
추가적인 변이체로 75번째 알라닌을 시스테인으로 치환한 변이체에 단백질표면에 노출되어진 잔기인 히스티딘 50 번 잔기를 타이로신으로 치환한 변이체가 가장 바람직한 변이체이다.
즉, 본 발명의 bFGF 변이체는 천연형 인간 bFGF 아미노산 서열(서열번호 1)의 69번째 및 87번째 아미노산 잔기인 시스테인이 모두 세린으로 치환되고, 50번째 히스티딘의 타이로신으로 치환되고, 75번째 아미노산 잔기인 알라닌이 시스테인으로 추가 치환되어, 분자내 이황화결합을 형성하고 나머지 아미노산 서열은 천연형의 아미노산 서열과 동일한 인간 bFGF 뮤테인(mutein)을 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 단백질 활성은 유지하면서 열에 대한 안정성이 천연형에 비해 증가한다. 하기 실험예 1 내지 3에서 보는 바와 같이 bFGF 변이체는 천연형과 동등한 활성을 지니고 있으며, 열에 대한 안정성이 역시 현저히 증가되었음을 알 수 있다. bFGF 변이체 중에서 69번과 87번 아미노산을 세린으로 치환하고, 75번 아미노산을 시스테인으로 치환한 후 이황화결합을 유도한 본 발명의 K75(Stable basic Fibroblast Growth Factor, sbFGF)는 대조군인 천연형 bFGF, 69번과 87번 아미노산을 세린으로 치환한 bFGF 변이체, 75번 아미노산을 시스테인으로 치환한 bFGF 변이체에 비하여 열안정성이 향상되었다. 또한 상기 K75의 50번 히스티딘의 타이로신으로 치환된 HsbFGF 의 경우 대조군인 천연형 및 K75 보다 뛰어난 열안정성이 향상되었다
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열(서열번호 2) 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현벡터는 일반적인 발현용 벡터에 bFGF의 유전자를 삽입하여 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 발현용 벡터로 pET21a 벡터를 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 사용할 수 있는 모든 세포 발현용 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pET21a 벡터에 bFGF 유전자를 삽입한 벡터를 제조하고, 이를 "pSSB-bFGF"라 명명하였다(도 1b에 개시).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포인 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 부위특이 돌연변이 유도법 등에 의해 제조한 bFGF 변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로 숙주세포를 형질 전환시켜 bFGF 변이체를 발현시키는 방법으로 제조할 수 있으며, 또한 화학적 아미노산 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
bFGF 변이체를 코딩하는 DNA는 천연형 bFGF의 상기 치환되는 부위의 아미노산을 코딩하는 DNA이다. bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 서열로서 바람직한 것은 69번째와 87번째 코돈이 세린을 코딩하는 코돈으로 치환되고, 75번째 코돈이 시스테인을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이다. 또한 상기 K75의 50번 히스티딘의 타이로신으로 치환된 HsbFGF 의 경우 대조군인 천연형 및 K75 보다 뛰어난 열안정성이 향상되었다
한편, 코돈의 퇴화(degeneracy)에 의해 하나의 아미노산을 코딩하는 코돈이 다수 존재이므로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA라도 그 뉴클레오티드 서열이 다를 수 있음은 주지된 사실이다.
이와 같은 bFGF 변이체을 코딩하는 DNA는 화학적으로 합성하거나 천연형 bFGF cDNA를 제조하여 이를 바탕으로 부위특이 돌연변이 유도법 등의 방법을 사용하여 제조할 수도 있다.
상기 제조된 본 발명의 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA는 당 분야에 잘 공지된 적당한 원핵 또는 진핵 발현 시스템중 어느 하나를 사용하여 이를 발현시킬 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, USA, 1989).
발현은 당화되지 않은 bFGF 변이체의 경우 바람직하게는 대장균, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109(DE3), 대장균 NM522 등에서 수행되며, 대장균에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 적당한 벡터들은 샘브룩 등의 문헌(상동) 및 피어스(Fiers)등의 논문("Proced. 8th Int. Biotechnology Symposium", Soc. Frac, de Microbiol., Paris,(Durand et al., eds.), pp. 680-697, 1988)에 언급되어 있다.
상술한 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환은 통상적인 방법중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다(Sambrooketal., Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 1989; Ito et al., J. Bacteriol. 153:263, 1983).
대장균을 형질 전환시킬 경우, DNA를 흡수할 수 있는 콤피턴트 세포(competent cell)를 준비하고, 이어서 공지된 방법등에 따라 처리할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant) 생산 방법을 제공한다:
(a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법의 (b) 단계는,
(c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 응집체를 제거하는 단계;
(e) 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
(f) 상기 이온교환 수지 후 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 목적 발현 벡터를 함유하는 숙주 미생물은 목적 단백질의 생산을 최대화하는 범위에서 그들의 최적 성장 조건에서 배양된다. 예를 들면, 엠피실린 저항 유전자를 선택 표지로 함유하는 벡터로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3) 세포는 엠피실린이 함유된 LB 배지에서 37℃로 배양한다.
형질 전환된 숙주세포를 배양한 후 생산된 bFGF 변이체의 회수 및 정제는 당해 분야에 공지된 여러 방법 또는 그들을 조합하여 사용함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환된 대장균 세포에서 발현된 bFGF 변이체는 세포 배양물로부터 또는 세포의 파쇄 후에 단백질 화학계에 공지된 적합한 방법에 의해 추출함으로써 회수될 수 있다.
바람직하게는, bFGF 변이체를 정제하기 위해, 재조합 대장균 세포의 배양액을 원심 분리하여 세포를 수확하고, 수확한 세포를 리소자임이 첨가된 완충용액에 현탁시키고 초음파로 파쇄한다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 불용성 과립형태의 응집체를 분리하고, 상기 분리된 응집체를 제거한다. 상기 응집체가 제거된 상청액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제하고, 이온교환 수지 후 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하여 결과물인 고안정성 bFGF 변이체를 획득한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 피부 염증, 급ㆍ만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성 단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름과 같은 피부 질환의 예방 또는 치료에 이용된다.
또한, 본 발명의 조성물은 창상 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 폐쇄창(closed wound) 및 개방창(open wound)의 치료에 이용된다. 폐쇄창의 예는 좌상(contusion or Burise)을 포함하고, 개방창의 예는 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 결출상(Avulsion), 관통상(penetrated wound) 및 총상(gun shot wound)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 유효량"은 상술한 bFGF 변이체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/ ㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선에 이용된다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장료 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 bFGF 변이체와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물들은 상술한 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 bFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않는 기능성화장품의 생산 및 피부창상 피복제등으로 활용이 가능하다.
도 1 및 2는 플라스미드 및 pSSB-bFGF의 조립에 관한 개요를 보여준다.
도 3 내지 4는 천연형 bFGF와 본 발명의 bFGF 변이체의 세포 파쇄 이후 T(세포파쇄 후 현탁액) S(세포 파쇄 후 상층액) P(세포파쇄 후 불용성 응집체)의 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 5는 천연형 bFGF와 본 발명의 bFGF 변이체의 열안정성의 지표인 TM(Melting temperature) 의 차이 결과를 보여준다.
도 6은 천연형 bFGF와 본 발명의 bFGF 변이체의 활성 비교결과를 보여준다.
도 7은 천연형 bFGF와 본 발명의 bFGF 변이체의 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 25℃에서 20일간 인큐베이션한 후 안정성 비교결과를 보여준다.
도 8은 천연형 bFGF(A)와 본 발명의 bFGF 변이체(K75)(B)의 최종 정제후 SDS-PAGE 를 이용한 분석이다.
도 9는 천연형 bFGF와 본 발명의 sbFGF 변이체 및 HsbFGF 의 열안정성의 지표인 TM(Melting temperature) 의 차이 결과를 보여준다.
도 10은 본 발명의 sbFGF 변이체 및 HsbFGF 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 50℃에서 일주일간 인큐베이션한 후 안정성 비교결과를 보여준다.
도 11은 천연형 bFGF 와 본 발명의 sbFGF 변이체 및 HsbFGF 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 60℃에서 5일간 인큐베이션한 후 안정성 비교결과를 보여준다.
도 12는 천연형 bFGF 와 본 발명의 sbFGF 변이체 및 HsbFGF 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 60℃에서 5일간 인큐베이션한 후 HPLC 정량 비교 결과를 보여준다.
도 13은 천연형 bFGF와 본 발명의 bFGF 변이체들의 bFGF 활성 비교결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험방법 및 재료
DNA 컨스트럭션(construction)
단백질 발현 벡터인 pET21a(도 1)와 발현용 E.coli 균주로는 BL21(DE3), Rosetta(DE3)을 Novagen에서 구입하였으며 Cloning용 E.coli 균주는 Top10을 사용하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 NEB(New England Biolabs)의 제품이며, ligase는 Roche사의 T4 DNA ligase이다. PCR시 사용된 Ex taq DNA polymerase는 Takara사의 제품이며 점 돌연변이에 사용된 pfuUltra™HF DNA polymerase는 Agilent사의 제품이다. DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 (주)코스모진텍의 제품이다. 또한, primer들은 (주)코스모진텍에서 제작하였으며, DNA sequencing도 (주)코스모진텍에 의뢰하여 수행하였다.
단백질 발현(Protein expression)
발현 유도체인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 항생제로 쓰인 ampicillin과 chloramphenicol은 모두 Sigma사에서 구입하였다. E.coli 배양 LB배지를 만들 때 사용한 bacto tryptone, yeast extract는 BD(Becton Dicknson)사에서 구입하였으며, NaCl은 덕산 제품을 사용하였다.
단백질 정제(Protein purification)
정제과정에 사용되는 시약은 최대한 순도가 높은 제품을 사용하였으며, 정제 과정에서 사용한 시약은 다음과 같다. sodium phosphate monobasic(Sigma), sodium phosphate dibasic(Sigma), sodium chloride(Sigma) 이다. FPLC에서 사용된 column은 GE healthcare의 SP-sephrose, heparin affinity column을 사용하였다.
FPLC
FPLC는 GE UPC-800을 사용하였다.
CD(Circular dichroism)
CD는 Jasco사의 J-810 spectropolarimeter를 사용하였다.
상동성 모델링(Homology modeling)
Homology modeling은 Modeller(Andrej Sali lab)를 이용하였다.
에너지 미니마이제이션(Energy minimization)
Energy minimization은 Chimera에 포함된 Amber 99FF force filed를 사용하였다.
이황화결합 예측(Disulfide predict)
이황화 결합의 형성에 따른 예측은 YASARA Web server를 이용하였다.
이황화결합 거리 측정
이황화결합이 가능한 거리를 측정해주는 ploting progream은 Protein contact map visualization (Andreas Viklund.)을 이용하였다.
단백질의 구조
PDB에 등록된 4FGF,1BLA 1BLD를 사용하였다.
벡터 시스템(Vector system)
변이체 bFGF을 생산하기 위한 발현 vector로 pET21a vector(Novagen)을 사용하였다. 천연형(wild type) bFGF 유전자는 (주)PnP biopharm에서 얻었으며 이를 하기 프라이머를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 천연형을 증폭시켰다. 이렇게 얻은 PCR 산물을 pET21a vector에 제한효소인 Nde I, Xho I을 처리한 후 삽입하여 접합시켰다.
점 돌연변이(Point mutation)
bFGF의 안정성을 증가시키기 위하여 단백질의 구조(PDB:4FGF)와 분자모델방법을 통하여 변화시킬 아미노산 부분을 찾았고, 하기 프라이머(하기 실시예4)를 사용하여 pfu Ultra™ DNA polymerase를 이용하여 Quikchange mutagenesis 방법을 이용하여 증폭시켰다. 사용한 천연형 bFGF 주형을 제거하기 위하여 Dpn I반응을 진행하여 Top10에 형질전환(transformation)시켰고, 시퀀싱을 통하여 변이체(mutant)를 확인하였다.
천연형 및 변이체 bFGF의 발현
bFGF가 삽입된 재조합 벡터를 E.coli BL21(DE3)에 Heat shock 방법으로 형질전환시켰다. 이 E.coli 균주를 50 ug/ml ampicillin을 포함하는 500ml LB 배지에 접종하여 O.D600값이 0.6가 될 때까지 37℃에서 키웠다. 그 후 0.5 mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 넣어 4시간 배양한 후 O.D600 값이 2.0 이상이 되면 8000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 cell을 취했다.
세포 파쇄
bFGF 단백질을 발현시킨 E.colil 에서 단백질을 얻기 위해 세포를 파쇄 하였다. harvest한 세포에 20 mM sodium phosphate buffer(pH7.0)에 현탁하여 4℃에서 sonicator로 파쇄 하였다. 이 후, 13000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심 분리하여 불용성 물질(inclusion body)을 제거한 후 상층액을 취해 SDS-PAGE로 확인하였다.
형질전환체(transformation)의 정제
초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4 ℃에서 13000 rpm으로 15 분간 원심 분리하였다. 상층액을 취해서 0.45 um 필터를 이용하여 필터링을 하고 이 용액을 FPLC(Fast performance liquid chromatography) SP칼럼과 Heparin 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 100mM NaCl 용액 A와 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 1M NaCl B를 SP 칼럼에 2 ml/분의 속도로 0 % A에서 100% B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 KDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이후 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 500mM NaCl용액 A와 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 2M NaCl B를 heparin affinity 칼럼에 2 ml/분의 속도로 0% A에서 100% B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 KDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 bFGF를 포함하는 분획을 SDS-PAGE 분석법으로 확인 후에 정량을 진행하였다.
분자 모델링(Molecular modeling)
PDB에 등록된 단백질의 구조인 1BLA(NMR)을 이용하여 이황화 결합이 가능 후보군을 설정하였다. Protein contact map visualization 프로그램을 이용하여 두 개의 아미노산의 C-alpha 탄소의 거리가 7Å 이하, C-beta 탄소의 거리가 5Å인 잔기를 plot 을 이용하여 분석하였다. 이후 Yasara energy minimization server를 이용하여 disulfide bond의 생성유무를 분석 하였고 chimera의 AMBER force filed FF99를 이용하여 energy minimization을 진행하였다. 이후 생성된 단백질의 구조를 천연형의 bFGF align하여 RMSD를 측정 0.5이하인 값을 갖는 구조를 실험으로 진행하였다.
CD(Circular dichroism)
천연형 bFGF와 변이체의 구조분석 및 TM 측정을 위하여 각각 bFGF를 20 mM sodium phosphate(pH 7.0)에 녹여 최종농도가 0.2 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8 번, 온도는 20℃ 조건으로 구조를 분석하였다. 온도 안정도를 분석하기 위하여 melting temperature는 20℃와 95℃에서의 205nm 파장에서 0.1 cm cell에 0.2 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1℃/min의 조건으로 20℃ ~ 95℃까지 측정하였다.
이황화 결합이 가능한 잔기(Residue number)와 예측결과를 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2015007734-appb-T000001
세포 증식 분석(Cell proliferation assay)
만들어진 천연형 bFGF와 변이체가 실제로 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 세포 증식 능력을 이용한 실험을 (주)제네웰에 의뢰하여 진행하였다. 실험에 사용한 NIH-3T3 cell은 10 % heat-inactivation 된 fetal bovine serum, 100 units/ml의 penicillin, 100 mg/ml의 streptomycin이 포함된 DMEM complete배지을 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 분주(seeding)하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 기아(starvation) 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample solution을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. Absorbance는 spectrophotometer를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(control)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다.
인큐베이션 테스트(Incubation test)
실온에서 보관정도를 확인하기 위하여 천연형 bFGF와 변이체의 incubation test를 진행하였다. 1X PBS(pH 7.3)에서 각각의 wild type FGF-2와 mutant들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37℃, 50℃ 와 60℃ water bath에서 incubation을 하였다. 24시간 단위로 sampling하여 13000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심 분리하여 supernatant만 얻어 Nano drop을 통한 정량 및 HPLC 분석을 진행하였다.
<실시예 1: 사람 bFGF cDNA를 포함하는 pSSB-bFGF 플라스미드의 구축>
사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄 반응에 의해 bFGF를 코딩 하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다:
센스프라이머 5'-GGCGGGCATATGCCCGCCTTGCCCGAGG-3'(서열번호 3) 및
안티센스프라이머 3'-TGATGAGGATCCTCATCAGCTCTTAGCAGACAT-5'(서열번호 4).
도 2의 bFGF 부분을 상기에 명시된 프라이머를 이용하여 증폭하였고, 증폭된 DNA 절편 1 ug을 50 ul TE(pH8.0) 용액에 녹인 후 2 단위의 Nde I(NEB사)과 2단위의 Bam H I(NEB사)과 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 5'-말단에 Nde I 제한효소 부위와 3'-말단에 Bam H I 제한효소 부위를 갖도록 하였다. DNA 정제 키트(GeneAll사)를 사용하여 DNA만을 정제한 후, 이 DNA 절편 20 ng을 동일한 방법으로 Nde I과 Bam H I 으로 각각 처리하여 준비한 20 ng의 pET21a(+) 플라스미드 (Novagen사)와 함께 10 ul의 TE(pH 8.0) 용액에 섞은 후, 1 단위의 T4 DNA리가제(NEB사)를 첨가하여 16℃에서 4시간 동안 반응시켜 접합시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pSSB-bFGF이라고 명명하였다.
<실시예 2: 사람 bFGF의 대장균 형질 전환체의 제조>
발현 플라스미드 pSSB-bFGF로 E.coli BL21(DE3)에 heat shock으로 형질전환 시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는, 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 100 % glycerol와 1:1로 섞어 -70℃에 스탁을 보관하였다.
<실시예 3: 사람 bFGF의 정제>
실시예 2에서 만든 스탁을 10 ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 접종한 후 12시간 이상 배양하였다. 그 후 500 ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 옮겨 600 nm에서 흡광도가 O.D 0.4~0.5일 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37℃에서 4시간 동안 200 rpm 속도로 진탕 배양한 후 8000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 얻었다. 이 펠렛을 25 ml의 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 현탁시킨 후 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다.
초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4℃에서 13000 rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 취해서 0.45 um 필터를 이용하여 필터링을 하고 이 용액을 FPLC(Fast performance liquid chromatography)와 SP칼럼과 Heparin컬럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 100mM NaCl 용액 A와 조건은 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 2M NaCl B를 SP 칼럼에 2 ml/분의 속도로 0 % A에서 50 % B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 KDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이후 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 100mM NaCl 용액 A와 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) 완충액에 2M NaCl B를 SP 칼럼에2 ml/분의 속도로 50 % A에서 100% B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 KDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 bFGF를 포함하는 분획을 SDS-PAGE 분석법으로 확인 후에 정량을 진행하였고 10mg의 bFGF를 획득하였다.
<실시예 4: pSSB-bFGF 변이체 플라스미드의 구축>
천연형의 pSSB-bFGF 플라스미드를 주형으로 pfuUltra™HF DNA 중합효소를 이용하여 각각의 변이체들에 해당하는 두 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 pSSB-bFGF 변이체 플라스미드들을 만들었다. 그리고 Dpn I을 이용하여 주형이었던 천연형의 pSSB-bFGF 플라스미드를 절단 한 후 E.coli Top10에 heat shock으로 형질전환 시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37℃에서 16시간동안 배양한 후 DNA prep을 실시하고 얻어진 DNA를 sequencing을 통하여 pSSB-bFGF 변이체 플라스미드를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
69 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TCT ATC AAA GGA GTG TCT GCT AAC CGT TAC CTG-3'(서열번호 5) 및 안티센스프라이머 3'-CAG GTA ACG GTT AGC AGA CAC TCC TTT GAT AGA-5'(서열번호 6);
87 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TTA CTG GCT TCT AAA TCT GTT ACG GAT GAG TGT-3'(서열번호 7) 및 안티센스프라이머 3'-ACA CTC ATC CGT AAC AGA TTT AGA AGC CAG TAA-5'(서열번호 8);
75 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-GCT AAC CGT TAC CTG TGC ATG AAG GAA GAT GGA-3'(서열번호 9) 및 안티센스프라이머 3'-TCC ATC TTC CTT CAT GCA CAG GTA ACG GTT AGC-5'(서열번호 10);
26 번째 라이신의 코돈인 AAA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG CGG CTG TAC TGC TGC AAC GGG GGC TTC TTC-3'(서열번호 11) 및 안티센스프라이머 3'-GAA GAA GCC CCC GTT GCA GCA GTA CAG CCG CTT-5'(서열번호 12);
34 번째 아이소루신의 코돈인 ATC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGC TTC TTC CTG CGC TGC CAC CCC GAC GGC CGA-3'(서열번호 13) 및 안티센스프라이머 3'-TCG GCC GTC GGG GTG GCA GCG CAG GAA GAA GCC-5'(서열번호 14);
40 번째 발린의 코돈인 GTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CAC CCC GAC GGC CGA TGC GAC GGG GTC CGG GAG-3'(서열번호 15) 및 안티센스프라이머 3'-CTC CCG GAC CCC GTC GCA TCG GCC GTC GGG GTG-5'(서열번호 16);
50 번째 히스티딘의 CAC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TGC ATC AAG CTA CAA CTT-3'(서열번호 17) 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT GCA AGG GTC GCT CTT CTC-5'(서열번호 18);
52 번째 라이신의 코돈인 AAG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AGC GAC CCT CAC ATC TGC CTA CAA CTT CAA GCA-3'(서열번호 19) 및 안티센스프라이머 3'-TGC TTG AAG TTG TAG GCA GAT GTG AGG GTC GCT-5'(서열번호 20);
76 번째 메사이오닌의 코돈인 ATG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAC CGT TAC CTG GCT TGC AAG GAA GAT GGA AGA-3'(서열번호 21) 및 안티센스프라이머 3'-TCT TCC ATC TTC CTT GCA AGC CAG GTA ACG GTT-5'(서열번호 22);
117 번째 알라닌의 코돈인 GCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ACC AGT TGG TAT GTG TGC CTG AAG CGA ACT GGG-3'(서열번호 23) 및 안티센스프라이머 3'-CCC AGT TCG CTT CAG GCA CAC ATA CCA ACT GGT-5'(서열번호 24);
67 번째 글라이신의 코돈인 GGA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GTT GTG TCT ATC AAA TGC GTG TCT GCT AAC CGT-3'(서열번호 25) 및 안티센스프라이머 3'-ACG GTT AGC AGA CAC GCA TTT GAT AGA CAC AAC-5'(서열번호 26);
68 번째 발린의 코돈인 GTG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환 센스프라이머 5'-GTG TCT ATC AAA GGA TGC TCT GCT AAC CGT TAC-3'(서열번호 27) 및 안티센스프라이머 3'-GTA ACG GTT AGC AGA GCA TCC TTT GAT AGA CAC-5'(서열번호 28);
70 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ATC AAA GGA GTG TCT TGC AAC CGT TAC CTG GCT-3'(서열번호 29) 및 안티센스프라이머 3'-AGC CAG GTA ACG GTT GCA AGA CAC TCC TTT GAT-5'(서열번호 30);
82 번째 루이신의 코돈인 TTA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG GAA GAT GGA AGA TGC CTG GCT TCT AAA TCT-3'(서열번호 31) 및 안티센스프라이머 3'-AGA TTT AGA AGC CAG GCA TCT TCC ATC TTC CTT-5'(서열번호 32);
84 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAT GGA AGA TTA CTG TGC TCT AAA TCT GTT ACG-3'(서열번호 33) 및 안티센스프라이머 3'-CGT AAC AGA TTT AGA GCA CAG TAA TCT TCC ATC-5'(서열번호 34);
108 번째 세린의 코돈인 TCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TAC AAT ACT TAC CGG TGC AGG AAA TAC ACC AGT-3'(서열번호 35) 및 안티센스프라이머 3'-ACT GGT GTA TTT CCT GCA CCG GTA AGT ATT GTA-5'(서열번호 36);
136번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGA CCT GGG CAG AAA TGC ATA CTT TTT CTT CCA-3'(서열번호 37) 및 안티센스프라이머 3'-TGG AAG AAA AAG TAT GCA TTT CTG CCC AGG TCC-5'(서열번호 38);
137 번째 아이소루신의 코돈인 ATA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CCT GGG CAG AAA GCT TGC CTT TTT CTT CCA ATG-3'(서열번호 39) 및 안티센스프라이머 3'-CAT TGG AAG AAA AAG GCA AGC TTT CTG CCC AGG-5'(서열번호 40);
138 번째 루이신의 코돈인 CTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGG CAG AAA GCT ATA TGC TTT CTT CCA ATG TCT-3'(서열번호 41) 및 안티센스프라이머 3'-AGA CAT TGG AAG AAA GCA TAT AGC TTT CTG CCC-5'(서열번호 42); 및
144 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TTT CTT CCA ATG TCT TGC AAG AGC TGA TGA-3'(서열번호 43) 및 안티센스프라이머 3'-TCA TCA GCT CTT GCA AGA CAT TGG AAG AAA-5'(서열번호 44).
50번째 히스티딘의 코돈인 CAC가 타이로신의 코돈인 TAT로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TAT ATC AAG CTA CAA CTT -3'(서열번호 45) 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT ATA AGG GTC GCT CTT CTC-5'(서열번호 46).
<실시예 5: bFGF 변이체의 생산 및 정제>
상기 bFGF 변이체의 발현 플라스미드 각각으로 실시예 2에서와 동일한 방법으로 E.coli BL21(DE3)에 형질 전환시켜 스탁을 만들고 LB배지(LB/ampicillin) 500 ml에 배양하여 실시예 3에서와 동일한 방법으로 정제하여 각각 약 18KDa 크기의 bFGF를 얻었다. 이 때 얻은 변이체의 양은 변이체에 따라 그 차이가 있었으며 변이체에 따라 약 4~12 mg의 bFGF를 얻을 수 있었으며 순도는 98% 이상이었다.
상기 각 bFGF 변이체는 다음과 같다
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 34번째 아이소루신 및 67번째 글라이신이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 34번째 아이소루신 및 70번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 34번째 아이소루신 및 84번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 40번째 발린 및 82번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 40번째 발린 및 84번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 50번째 히스티딘 및 69번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 52번째 라이신 및 68번째 발린이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 76번째 메사이오닌 및 108번째 세린이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 117번째 알라닌 및 136번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 117번째 알라닌 및 137번째 아이소루신이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 26번째 라이신 및 87번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 138번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 52번째 라이신 및 144번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환고, 50 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 변이체
천연형과 변이체의 정제는 SP-sephrose와 haparin affinity column을 통해 정제가 가능하다. 두 종 모두 SP 컬럼에서 약 400 mM NaCl 농도에서 용출되었고 heparin 컬럼의 경우 1.5M NaCl에서 용출되었다. 최종 heparin affinity column 정제를 진행한 후 SDS Page 분석을 하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 천연형의 경우 다이머(Dimer)와 트리머(trimer)가 관찰되는 반면, 변이체의 경우 모노머(monomer) 사이즈에 단일 밴드 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 활성이 없는 다이머, 트리머가 완벽하게 제거되고 모노머 상태로 존재한다는 것을 알 수 있었다.
도 8에 최종 정제 이후 천연형(A)와 변이체(B)의 SDS-PAGE 결과를 나타내었다.
<실험예 1: 천연형과 변이체 bFGF의 circular dichroism을 이용한 구조 분석>
J-810 spectrometer(JASCO)를 사용하여 circular dichroism 분석을 통하여 실시예 5의 정제된 bFGF 변이체의 구조와 열 안정성을 측정하였다. 천연형 bFGF은 실시예 3에서 정제된 bFGF를 사용하였다. 구조분석을 위하여 각각의 bFGF를 20 mM sodium phosphate(pH 7.0)에 녹여 최종농도가 0.1 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8번, 온도는 20℃ 조건으로 구조를 분석하였다.
열 안정도를 분석하기 위하여 Tm(melting temperature)는 20℃와 95℃에서의 far-UV를 비교 분석하여 208 nm 파장을 결정하였으며 0.1 cm cell에 0.1 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1℃/min의 조건으로 20℃ ~ 95℃까지 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.
표 2
변이체 bFGF명칭 구조변화 (Tm) 변이체 bFGF명칭 구조변화(Tm) 변이체 bFGF명칭 구조변화(Tm)
천연형 bFGF(서열번호 1) - (57.5℃) 변이체A34-67 감소48 변이체B34-70( 변화 없음
변이체C34-84 변화 없음 변이체D40-82 변화 없음 변이체E40-84 변화 없음
변이체F50-69(서열번호 8) 변화 없음 변이체G52-68(서열번호 9) 변화 없음 변이체 H76-108 변화 없음
변이체I117-136 변화 없음 변이체J117-137 변화 없음 변이체K75 변화(62℃)
변이체L26-87 변화 없음 변이체 M138 변화 없음 변이체N52-144 변화 없음
변이체K75+H50Y (65℃)
표 2는 천연형 bFGF와 bFGF 변이체에 대한 구조 변화 정도와 열 안정성 측정 실험인 circular dichroism 분석 중 208 nm의 파장에서 온도 별 풀림 구조비율(fraction unfolded)을 측정한 결과를 나타낸 값이다. 접힘-풀림 현상이 일어날 때에는 208 nm 부근의 구간에서 구조의 변화를 보이게 되는데 이를 이용하여 20~95 ℃범위 내에서 Tm(melting temperature)을 측정하여 정확한 Tm값을 분석하였다.
상기 bFGF 변이체들은, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인을 세린으로 치환한 후, 추가적으로 각 해당 위치의 잔기를 시스테인으로 치환하여 분자내 이황화결합을 유도시킨 변이체들이다.
그 결과, 구조변화에선 대부분이 천연형 bFGF와 동일한 구조를 나타내 변화가 거의 없었으며 이황화결합을 추가한 변이체들에서 특별한 구조를 가지지 않았다. 열 안정도를 나타내는 Tm은 58℃인 천연형 bFGF와 비교하여 거의 대부분이 bFGF 변이체와 동일하였고, 그 중 K75 변이체에서 62℃까지 열 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이는 아미노산을 1개를 시스테인으로 치환시켜 이황화결합을 인위적으로 추가시킴으로써 열 안정성이 증가되었음을 의미한다.
한편, 본 발명의 특정 위치인 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 추가적인 치환된 K75 변이체의 현저성을 확인하기 위하여, 서열번호 1의 천연형 bFGF, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인만이 세린으로 치환된 bFGF 변이체(Cys→Ser 변이체), 서열번호 1의 75 번째 알라닌만이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체(천연형 + disulfide bond) 및 K75 변이체(Cys→Ser 변이체 + disulfide bond, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체)의 열 안정성을 비교 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 천연형 bFGF의 TM은 약 57.5도, Cys→Ser 변이체의 TM은 58℃, 천연형 + disulfide bond의 TM은 61.5℃, K75 변이체 (Cys→Ser 변이체 + disulfide bond)의 TM은 62℃로 확인되었으며, 이는 K75 변이체의 열역학적 안정성이 증가되었음을 의미한다.
추가적 실험으로 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 추가적인 치환된 K75 변이체에 50번째 히스티딘이 타이로신으로 으로 치환된 HsbFGF 의 열 안정도를 나타내는 Tm은 58℃인 천연형 bFGF와 62℃ K75 변이체와 비교하여 65℃까지 열 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이는 표면에 존제하는 아미노산을 1개를 타이로신으로 치환시켜 단백질 내부의 cavity 의 안정화를 가져오고 새롭게 형성된 Hydrogen bond 와 Van deer waals interaction 으로 인한 열 안정성이 증가되었음을 의미한다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 천연형 bFGF의 TM은 약 57.5℃, K75 변이체 (Cys→Ser 변이체 + disulfide bond)의 TM은 62℃로 확인되었으며, HsbFGF(K75+His→Tyr) TM은 65℃로 변이체의 열역학적 안정성이 증가되었음을 의미한다.
<실험예 2: 천연형과 변이체 bFGF의 세포증식검정>
만들어진 천연형 bFGF와 변이체 중 solubility와 circular dichroism을 이용한 구조와 Tm 의 결과 분석을 통하여 좋은 결과를 bFGF을 선정하여 세포증식검정을 실시하였다. 세포증식검정은 (주)제네웰에 의뢰하여 bFGF에 민감한 피부세포인 NIH3T3 세포 주를 가지고 수행하였다. 실험 방법으로는 NIH-3T3 cell을 10 % heat-inactivation 된 fetal bovine serum, 100 units/ml의 penicillin, 100 mg/ml의 streptomycin이 포함된 DMEM complete배지을 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample solution을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. Absorbance는 spectrophotometer를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(control)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다. 도 6,및 12에서 보는 바와 같이 bFGF 변이체가 천연형 bFGF와 유사한 세포증식능력을 보이고 있다.
<실험예 3: 천연형과 변이체 bFGF의 incubation에 따른 단백질의 정량 분석>
천연형 bFGF와 변이체들[서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인만이 세린으로 치환된 bFGF 변이체(Cys→Ser 변이체), 서열번호 1의 75 번째 알라닌만이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체(천연형 + disulfide bond) 및 K75 변이체(Cys→Ser 변이체 + disulfide bond, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체)의 안정성을 확인하기 위하여, 37℃ 단기간 incubation test를 진행하였다. 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37℃인 water bath에서 incubation을 하였다. 48시간, 7일, 10일 단위로 sampling 하여 13000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 Nano drop을 이용하여 단백질을 정량하였다. 시간이 지날수록 천연형 bFGF 와 변이체들의 농도를 정량하였고, 천연형 bFGF가 변이체에 비하여 더 심한 감소를 보였다. 상기 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3
bFGF명칭 Day 0 After 48h After one week After 10days
천연형 100 56 26 16
CYS→SER 변이체 100 88 80 62
천연형 + disulfide 100 92 78 64
K75(CYS→SER 변이체 + disulfide bond) 100 90 88 80
또한, 상기 결과들을 토대로, 열 안정성이 증가된 K75 변이체를 이용하여 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 천연형 bFGF와 비교하여 K75 변이체가 장기간 보존 안정성을 갖는지의 여부를 확인하였다. 먼저, PBS(Phosphate buffer saline) 상태에 천연형 bFGF와 K75 변이체를 같은 농도로 녹인 후 20일간 25℃에서 인큐베이션시켰다. 그리고 원심 분리하여 상층액 만을 가지고 HPLC를 이용하여 정량분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 인큐베이션 중 K75 변이체가 천연형 bFGF에 비하여 안정도가 월등히 높았으며, 이는 본 발명의 K75 변이체의 우수성을 보여주는 결과이다.
<실험예 4: 천연형과 변이체 bFGF들의 50,60℃incubation에 따른 HPLC 분석>
천연형 bFGF와 K75 변이체(Cys→Ser 변이체 + disulfide bond, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체) 및 HsbFGF K75 변이체(Cys→Ser 변이체 + disulfide bond, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고 50번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 bFGF 변이체) 안정성을 확인하기 위하여, 50℃에서 일주일간, 60℃ 5일간 incubation test를 진행하였다. PBS(Phosphate buffer saline)에서 각각의 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 50℃,60℃인 water bath에서 incubation을 하였다. 날짜에 짜른 sampling 하여 13000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 HPLC 및 UV spectrometer 을 이용하여 단백질을 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 uv spectrometer 을 이용한 정량에서, 5일 후부터 천연형 bFGF 는 정량을 할수 없었고. K75 변이체의 경우 7일후 38% 남아 있고, hsbFGF의 경우 72%를 유지하는 것을 볼 수 있었다.
또한 도 11에 나와있듯 60℃ UV spectrometer를 이용한 정량에서 천연형 bFGF의 경우 3일 후부터는 거의 확인할 수 없었으며 K75의 경우 5일 후 22%만 남아있었고, HsbFGF의 경우 5일 후 40%를 유지하는 것을 볼 수 있었다
도 12에 나와 있는 결과를 이용 HPLC의 분석에서 7일 후 천연형 bFGF의 경우 HPLC로 정량할 수 없었으며 K75의 경우 30% HsbFGF의 경우 60%이상 남아 있는 것을 확인할 수 있었다

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된, 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(stable basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인을 세린으로 치환한 후, 추가적으로 다른 잔기를 시스테인으로 치환하여 분자내 이황화결합을 유도시킨 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 시스테인으로 치환된 아미노산은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 26번째 라이신, 34번째 아이소루신, 40번째 발린, 50번째 히스티딘, 52번째 라이신, 75번째 알라닌, 76번째 메사이오닌, 117번째 알라닌, 67번째 글라이신, 68번째 발린, 70번째 알라닌, 82번째 루이신, 84번째 알라닌, 108번째 세린, 136번째 알라닌, 137번째 아이소루신, 138번째 루이신 및 144번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 고안정성 bFGF 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 50번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 bFGF 변이체.
  5. 제 1 항 내지 제4항 중에서 어느 한 항의 변이체를 코딩하는 유전자.
  6. 제 5 항에 있어서 상기 유전자는 서열번호 2의 DNA 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  7. 제 5 항의 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터.
  8. 제 6 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
  9. 다음 단계를 포함하는 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant) 생산 방법:
    (a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
    (c) 상기 형질전화체를 세포 파쇄하고 응집체를 분리하는 단계;
    (d) 상기 분리된 응집체를 제거하는 단계;
    (e) 상기 응집체가 제거된 상청액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
    (f) 이온교환 수지 후 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으
    로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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