WO2020027620A1 - 리폭시게나아제 조합반응을 이용하여 이수산화지방산 또는 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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lipoxygenase
acid
composition
derived
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오덕근
서민주
강우리
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건국대학교 산학협력단
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention is a combination of two lipoxygenases having different position specificity to prepare a dihydroxy fatty acid, or further combination of the epoxide hydrolase to two lipoxygenases having different position specificity to prepare a lipid modulator It relates to compositions and methods.
  • Hydroxylated fatty acids are substances that exist in nature and are present in lipids of various organisms such as animals, plants, insects, and microorganisms, including triglycerol, cerebroside, wax, and the like. Because it has a hydroxyl group, it has excellent reactivity and is used as a raw material industrially. In addition, it is used as a raw material for cosmetics due to the reduction of surface tension and an increase in antifungal activity.
  • hydroxide fatty acids are used as precursors of signaling substances, and a single substance is involved in various physiological activities.
  • Lipid mediator a type of signaling substance, is an important substance involved in various physiological functions such as immune response and homeostasis control in animals including humans. Among these substances, protectin mainly contains lipoxygenase with carbon number. It acts on and converts 20 and 22 polyunsaturated fatty acids (C20 and C22).
  • Protectin D1 is an endogenous stereoselective lipid mediator derived from docosahexaenoic acid, an omega fatty acid, mainly found in tissues such as the retina, lung and nervous system. It acts as an anti-inflammatory, anti-cancer and neuroprotective agent, and studies in animal models of stroke patients and Alzheimer's disease have shown that it prevents cell degeneration by potentially reducing oxidative stress-induced inflammation and inhibiting cell death. It was. In addition, it is known to possess the ability to inhibit the infectivity of avian influenza viruses such as H5N1 and to relieve inflammation by weakening the influenza virus replication ability.
  • biotin has a strong anti-inflammatory effect in viral or bacterial inflammation. It suggests that it can play a role as a new antiviral agent as well as a marker.
  • protectin is protected in case of 10R, 17S-dioxide docosahexaenoic acid, and in the case of protectin D1 (protectin D1, PD1), 10S, 17S-docosahexaenoic acid. It is called Tin DX (protectin DX, PDX).
  • PDX like PD1
  • PDX is an anti-inflammatory substance that inhibits the influx of circulating white blood cells into the peritoneum in inflammatory mouse models.
  • cyclooxygenase cyclooxygenase
  • Protectin has the potential as a next-generation medical substance in place of chemically synthesized drugs with side effects, and can be used as a research material in various disciplines such as medicine, biology, and biotechnology, but no biological production method has yet been developed. .
  • resolbin in the lipid mediator a type of human signaling material, is mainly produced from polyunsaturated fatty acids and is converted by lipoxygenase and epoxide hydrolase.
  • Liposomal regulators, including resolbin are important substances involved in various physiological activities such as homeostasis control and immune response in mammals including humans.
  • resolvin (RV) is a product of a combination reaction of lipoxygenases (lipoxygenase, LOX) and is mainly omega 3 polyunsaturated fatty acid eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • DHA is a substance belonging to the trihydroxy fatty acid form of eicosanoids produced by the sequential reaction of LOX.
  • resolvin E eicosaptananoic acid
  • resolbin D docosahexaenoic acid.
  • These substances are endogenous lipid mediators derived from the phase of acute inflammation, confirming potent anti-inflammatory and early inflammation in several animal models.
  • Resolvin E1 and Resolbin D1 were able to prevent anti-inflammatory and postoperative pain, respectively.
  • Resolvin E1 was treated with nanograms of substances in animal models treated with inflammatory substances. Confirmed to have analgesic effects.
  • Resolbin E1 and Resolbin D1 have been found to prevent incision-induced pain, especially Resolbin D1, which has been shown to heal or prevent hyperalgesia and allodynia following surgery in rats. Inflammation when injected directly into the spinal cavity There is a finding that the resolution effect is more effective.
  • Resolbin E1, Resolbin D1, and Resolbin D2 have also been reported to stimulate the dermis of mouse skin to reduce neutrophil infiltration and promote skin regeneration, while D1 and D2 of the Resolbin D family are wound in a diabetic mouse model. It has been reported to promote healing.
  • a resolvin analog (RV analogue) having a similar material structure
  • RV analogue a resolvin analog having a similar material structure
  • the strong bioactivity like the existing resolbins may suggest the possibility of replacing drugs related to other inflammatory remedies. It is thought that research and development is necessary in that it can be used, and suggests that it can be used as a research material in various fields such as medicine, biology, and biotechnology, as in other lipid mediators, as well as the possibility of being a medical substance related to the next generation inflammatory treatment.
  • lipid modulators including lipoxin are important substances involved in various physiological activities such as homeostatic regulation, immune response in mammals including humans.
  • lipoxin (LX) is an interaction product of lipoxygenase (LOX) and is a substance belonging to the trihydroxy fatty acid type eicosanoid mainly produced by the sequential reaction of lipoxygenase from arachidonic acid.
  • LOX lipoxygenase
  • the structure of these substances is formed during cell-cell interactions and is an important substance involved in immune mechanisms and anti-inflammatory responses in the human body.
  • Lipoxine is a substance that acts on specific G-protein-linked receptors and regulates cellular responses to inflammation and inflammatory processes, while lipoxin A4 (lipoxin A4, LXA4) and lipoxin B4 (LXB4) work similarly to aspirin's mechanism of action. Among them, 15-epi-LX is synthesized during acetylation of cyclooxygenase (COX), which is involved in the inflammatory reaction, thereby inhibiting TNF- ⁇ production.
  • COX cyclooxygenase
  • lipoxins have been proved to be eicosanoid compounds that promote anti-inflammatory and anti-inflammatory properties in vivo through animal models such as rabbits and rats, and inflammation, asthma, arthritis, cardiovascular disease, gastrointestinal disease, periodontal disease, kidney disease and grafts.
  • the representative immune function of LXA4 binds to the leukotriene receptor of T-cell, which acts in the inflammatory response, to relieve inflammation, inhibit bronchial contraction and asthma. It is known to have the effect of relieving the contracted period of time of the patient.
  • lipoxin which has been studied so far, provides a new approach to the treatment of general diseases related to inflammation, and when lipoxin analogs (LX analogues) having similar material structures in addition to known lipoxins are developed,
  • LX analogues lipoxin analogs
  • the development of a new type of lipoxin analogue is considered necessary in that it can present the functionality as a substance and can be used as a research material in various disciplines such as medicine, biology and biotechnology.
  • Lipoxygenase is a dioxygenase and catalyzes the synthesis of oxidized fatty acids. It is an oxidase but does not have a heme. Instead, it is an enzyme containing iron. Characterized by using a polyunsaturated fatty acid having one or more cis, cis-1,4-pentadiene as a substrate as a substrate to catalyze stereospecificity and reaction specificity through dioxygenation.
  • Location specificity differs depending on the type of polyunsaturated fatty acid used as a substrate, and among them, arachidonic acid 8-lipoxygenase (hereafter 8-lipoxygenase) which generates a hydroxyl group at position 8 of the arikidonic acid of the animal polyunsaturated fatty acid.
  • 8-lipoxygenase arachidonic acid 8-lipoxygenase
  • a hydroxyl group is formed only at the carbon position 8 in an unsaturated fatty acid having 20 or more carbon atoms such as arachidonic acid.
  • this enzyme forms a hydroxyl group at the carbon number 10 in unsaturated fatty acids having 22 or more carbon atoms.
  • Resolbinates known to date are also reported to be produced by acetylated cycloxygenase-2, P450 or human-derived 5-lipoxygenase and 15-lipoxygenase.
  • acetylated cycloxygenase-2, P450 or human-derived 5-lipoxygenase and 15-lipoxygenase a combination of site-specific oxidases and epoxide hydrolases has not been synthesized, and new site-specific resolbins and analogs thereof have not been previously reported, especially 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxy.
  • the production of resolbin D2 analogs from docosahexaenoic acid in combination with side hydrolases has not been reported.
  • an object of the present invention is to provide a composition and method for producing a dihydric acid fatty acid or lipid modulator using a combination reaction of mouse-derived and microbial-derived lipoxygenase.
  • the present invention is a mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; And 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis strain as an active ingredient, wherein the fatty acid is represented by any one of the following Chemical Formulas 1 to 9: to provide:
  • the 8-lipoxygenase may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the 15-lipoxygenase may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the composition is for treatment to a substrate comprising an unsaturated fatty acid selected from the group consisting of arachidonic acid, aicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid,
  • concentration of unsaturated fatty acids may be 0.5 mM to 5 mM.
  • Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis strains; And a composition for preparing a lipid modulator comprising an epoxide hydrolase derived from Myxococcus xanthus strain as an active ingredient, wherein the lipid modulator is represented by any one of the following Formulas 10 to 15:
  • the 8-lipoxygenase is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the 15-lipoxygenase is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the epoxide hydrolase may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 have.
  • a composition encoding 8-lipoxygenase derived from Mus musculus mouse; And a composition encoding a 15-lipoxygenase-derived gene derived from Burkholderia thailandensis strain as an active ingredient, wherein the fatty acid is represented by any one of Formulas 1 to 9.
  • Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase In another embodiment of the invention, Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; And a method of preparing dihydroxyfatty acid by bioconversion by treating 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis strain to a substrate, wherein the dihydroxyfatty acid is represented by any one of Formulas 1 to 9. , Provides a way.
  • the treatment may be carried out in the range of pH 6.5 to 7.5 and temperature 10 °C to 30 °C range.
  • Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase In another embodiment of the invention, Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; And a method of preparing a lipid modulator by bioconversion by treating 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis strain to a substrate, wherein the lipid modulator is represented by any one of Formulas 10 to 15, and To provide.
  • a transformant transformed with the recombinant expression vector in a host cell.
  • a novel dihydroxy fatty acid represented by any one of Formulas 2 to 9 is provided.
  • the present invention provides a novel lipid modulator, represented by any one of Formulas 10 to 15, or represented by any one of Formulas 16 to 21:
  • the present invention can be produced in a variety of industrial fields, such as medicine, food and cosmetics because it can be produced with a high productivity and a high yield of various dihydroxy fatty acid or lipid regulators by an environmentally friendly method.
  • Protectin DX, resolbin D2 analogue, lipoxin analogue, etc. prepared according to the present invention are expected to be involved in various bioactive functions in animals including humans.
  • Figure 1 shows the synthetic route of the protective protein DX produced using docosahexaenoic acid as a substrate using 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the material identification of the protectin DX using LC-MS / MS.
  • Figure 4 shows the reaction of the recombinant E. coli expressing 8-lipoxygenase of the present invention alone (8-LOX single), recombinant E. coli expressing 15-lipoxygenase after the reaction by recombinant E. coli expressed 8-lipoxygenase (8-LOX add 15-LOX), or reaction with recombinant E. coli expressing 15-lipoxygenase, followed by addition of recombinant E. coli expressing 8-lipoxygenase (15-LOX add 8-LOX) It is a figure which confirmed the quantity of the protectin DX becoming.
  • FIG. 5 is a diagram showing the amount of protective protein DX produced over time of the recombinant E. coli expressing 15-lipoxygenase after the reaction with the recombinant E. coli expressing 8-lipoxygenase.
  • FIG. 5 is a diagram showing the amount of protective protein DX produced over time of the recombinant E. coli expressing 15-lipoxygenase after the reaction with the recombinant E. coli expressing 8-lipoxygenase.
  • Figure 6 shows the purification of 10-hydroxy docosahexaenoic acid produced by 8-lipoxygenase from docosahexaenoic acid followed by 15-lipoxygenase treatment on the purified substrate to convert the conversion of protectin DX over time. This is confirmed.
  • Figure 7 shows the synthetic pathway of the two types of resolbin D2 analogs produced using docosahexaenoic acid as a substrate using 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase of the present invention. .
  • Figure 8a is an HPLC chromatogram confirming the production of resolbin D2 analog-1
  • Figure 8b is an HPLC chromatogram confirming the production of resolbin D2 analog-2
  • Figure 8c shows the degree of synthesis of resolbin D2 analogs over time The graph shown.
  • FIG. 9A illustrates a material identification process using LC-MS / MS for material identification of resolbin D2 analog-1.
  • FIG. 9B is a result of material identification of resolbin D2 analog-2.
  • Figure 10 shows the synthetic pathway of lipoxin A4 and B4 analogues produced using arachidonic acid as a substrate using 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase of the present invention.
  • Figure 11a is an HPLC chromatogram confirming the production of lipoxin A4 analogue
  • Figure 11b is an HPLC chromatogram confirming the production of lipoxin B4 analogue
  • Figure 11c is a graph showing the degree of synthesis of lipoxin B4 analogues over time.
  • FIG. 12A illustrates the identification of lipoxin A4 analogues using LC-MS / MS.
  • FIG. 12B illustrates the identification of lipoxin B4 analogues.
  • FIG. 12C illustrates the identification of leukotriene B4 analogues. to be.
  • Figure 13 shows the synthetic pathway of lipoxin A5 and B5 analogues produced using eicosapentaenoic acid as a substrate using 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase of the present invention. .
  • FIG. 14A is an HPLC chromatogram confirming the production of lipoxin A5 analogue
  • FIG. 14B is an HPLC chromatogram confirming the production of lipoxin B5 analog.
  • FIG. 15A illustrates a material identification using LC-MS / MS to identify a lipoxin A5 analogue.
  • FIG. 15B shows a material identification result of a lipoxin B5 analogue.
  • FIG. 15C shows a material identification result of a leukotriene B5 analogue. to be.
  • Figure 16a shows a recombinant vector synthesized from the mouse-derived 8-lipoxygenase of the present invention, 15-lipoxygenase derived from Burcolderia tyrandensis, respectively
  • Figure 16b is a mus musculus of the present invention 8-lipoxygenase derived, 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis and epoxide hydrolase derived from Myxococcus xanthus are shown.
  • the inventors of the present invention conducted a continuous study to produce more effective protective protein DX through the biotransformation process, Mus musculus ( Mus musculus ) mouse-derived 8-lipoxygenase and Burkholderia thailandensis ) Cloning the strain-derived 15-lipoxygenase to produce a recombinant expression vector and transformed microorganism therefrom, producing whole cells using the same, and then treating the substrate with a new eco-friendly biotransformation pathway. It was confirmed that the protectin DX can be produced with high productivity and high yield, and completed the present invention.
  • the inventors of the present invention conducted a continuous study to more effectively prepare resolbin D2 analogues or lipoxine analogues through a bioconversion process, 8-lipoxygenase derived from Mus musculus mice, Burcolderia tyran Epoxide hydrolase from 15-lipoxygenase and Myxococcus xanthus strain from Burkholderia thailandensis strain was cloned to prepare recombinant expression vector and transformed microorganism therefrom.
  • the whole cells are produced and then treated with a substrate to prepare 10, 17-dihydric fatty acids and two types of resolbin D2 analogues with high productivity and high yield, or 8, 15-dihydric fatty acids or two types of It was confirmed that leukotriene analogues and four kinds of lipoxin analogues can be produced with high productivity and high yield. , And it completed the present invention.
  • the present invention provides a mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; And 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis strain as an active ingredient, wherein the fatty acid is represented by any one of the following Chemical Formulas 1 to 9: to provide:
  • the present invention provides a gene encoding 8-lipoxygenase derived from Mus musculus mice; And a composition encoding a 15-lipoxygenase-derived gene derived from Burkholderia thailandensis strain as an active ingredient, wherein the fatty acid is represented by any one of Formulas 1 to 9. To provide a composition.
  • the present invention provides a mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis strains; And a composition for preparing a lipid modulator comprising an epoxide hydrolase derived from Myxococcus xanthus strain as an active ingredient, wherein the lipid modulator is represented by any one of the following Formulas 10 to 15:
  • lipid modulator represented by any one of the following Chemical Formulas 16 to 21 may be generated as an intermediate:
  • the present invention provides a gene encoding 8-lipoxygenase derived from Mus musculus mice; Gene encoding 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis strain; And a composition for preparing a lipid modulator comprising a gene encoding an epoxide hydrolase derived from Myxococcus xanthus strain as an active ingredient, wherein the lipid modulator is represented by any one of the following Formulas 10 to 15: To provide.
  • dihydroxyhydric acid is a concept that includes all of protective protein DX, 10,17-dihydric fatty acid, 8,15-dihydric fatty acid or leukotriene analogue.
  • protecting protein DX is a compound represented by Formula 1, 10S, 17S-dihydroxy-4Z, 7Z, 11E, 13Z, 15E, 19Z-docosahexaenoic acid (docosahexaenoic acid), also called 10S, 17S-dihydroxydocosahexaenoic acid.
  • Protectin DX can be used as a research material in a variety of disciplines such as medicine, biology, biotechnology as described above, but no biological production method has been developed yet.
  • "10,17-dihydroperoxydocosahexaenoic acid” refers to 10-hydroxyl, 17-dihydrohydroxide docosahexaenoic acid (10,17 (P) -DiHETE, 10-hydroxy & 17- hydroperoxydocosahexaenoic acid) or 10-peroxide, and 17-docosahexaenoic acid (10-hydroperoxy & 17-docosahexaenoic acid), meaning new compounds, each represented by Formulas 2 and 3 in order.
  • 8,15-dihydric fatty acid means 8-hydroxyl, 15-peroxide arachidonic acid (8,15 (P) -DiHETE, 8-hydroxy & 15-hydroperoxyarachidonic acid), 8-peroxide, 15- 8-hydroperoxy & 15-hydroxyarachidonic acid, 8-hydroxyl, 15-peroxide, eicosapentaenoic acid (8,15 (P) -DiHEPE, 8-hydroxy & 15-hydroperoxyeicosapentaenoic acid), 8-peroxide, 15- Hydroxyoxysapentaenoic acid (8-hydroperoxy & 15-hydroxyeicosapentaenoic acid), which means any one selected from the group consisting of, as a novel compound, each represented by the formulas (4) to (7) in order.
  • leukotriene analogue herein means any one selected from the group consisting of leukotriene B4 analogue (LTA4 analogue, 8,15-dihydroxyeicosatetraenoic acid) and leukotriene B5 analogue (LTB5 analogue, 8,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid) and is novel As the compounds, they are represented by the formulas (8) and (9) in order.
  • lipid modulator is a concept that includes both resolbin D2 analogues or lipoxin analogues.
  • resolvin D analog is resolvin D2 analogue-1 (10,16,17-trihydroxydocosahexaenoic acid) or resolvin D2 analog-2 (resolvin D2 analogue-2, 10,11). , 17-trihydroxydocosahexaenoic acid), and as a novel compound, respectively, are represented by the following formulas (10) and (11).
  • lipoxin B4 analogue LXB4 analogue, 8,14,15-trihydroxyeicosatetraenoic acid
  • lipoxin A5 analogue LXA5 analogue, 8,9,15-trihydroxyeicosapentaenoic acid
  • lipoxin B5 analogue LXB5 analogue , 8,14,15-trihydroxyeicosapentaenoic acid
  • the 8-lipoxygenase derived from Mus musculus mouse is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • the 15-lipoxygenase derived from the strain Burkholderia thailandensis ( Burkholderia thailandensis ) is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but one or more substitutions, deletions, additions, etc. to the sequence to achieve the desired effect All mutant enzymes that can be achieved are within the scope of this invention.
  • the 8-lipoxygenase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the 15-lipoxygenase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the epoxide hydrolase derived from the Myxococcus xanthus strain is not only composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but also a functional equivalent thereof, that is, a mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence. It means to include all the mutants to achieve the object of the present invention by inducing, the epoxide hydrolase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the composition is an unsaturated fatty acid having 20 carbon atoms as a substrate, in particular, at least one cis, cis-1,4 pentadiene having 20 to 22 carbon atoms, preferably arachidonic acid (arachidonic acid), eicosapentaenoic acid (eicosapentaenoic acid) and docosahexaenoic acid (docosahexaenoic acid) may be for treatment to a substrate comprising an unsaturated fatty acid selected from the group consisting of,
  • the concentration may be 0.1 mM to 5 mM (preferably 0.5 mM to 3 mM).
  • the present invention provides a mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase; And a method of preparing dihydroxyfatty acid by bioconversion by treating 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis strain to a substrate, wherein the dihydroxyfatty acid is represented by any one of Formulas 1 to 9. , Provides a way.
  • the present invention is Mus musculus ( Mus musculus ) mouse-derived 8-lipoxygenase; And a 15-lipoxygenase derived from Burkholderia thailandensis strain to a substrate to prepare a lipid modulator by bioconversion, wherein the lipid modulator is represented by any one of Formulas 10 to 15, Provide a method.
  • the 8-lipoxygenase derived from Mus musculus mouse is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • the 15-lipoxygenase derived from the strain Burkholderia thailandensis ( Burkholderia thailandensis ) is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but one or more substitutions, deletions, additions, etc. to the sequence to achieve the desired effect All mutant enzymes that can be achieved are within the scope of this invention.
  • the 8-lipoxygenase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the 15-lipoxygenase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the epoxide hydrolase derived from the Myxococcus xanthus strain is not only composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but also a functional equivalent thereof, that is, a mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence. It means to include all the mutants to achieve the object of the present invention by inducing, the epoxide hydrolase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the substrate is an unsaturated fatty acid having 20 carbon atoms, in particular, at least one cis, cis-1,4 pentadiene having 20 to 22 carbon atoms, preferably arachidonic acid (arachidonic) acid), eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid may include an unsaturated fatty acid selected from the group consisting of, the concentration of unsaturated fatty acid in the substrate is 0.1 mM to 5 mM ( Preferably, 0.5 mM to 3 mM).
  • the method is preferably carried out the reaction in the pH 6.5 to 7.5 range, the method is preferably carried out in the temperature range 10 °C to 30 °C, but is not limited thereto.
  • the invention provides a recombinant expression vector comprising 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase, respectively; And it provides an expression vector containing all of the enzymes.
  • the present invention provides a gene encoding 8-lipoxygenase consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A gene encoding 15-lipoxygenase consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; And a recombinant expression vector for producing a lipid modulator comprising a gene encoding an epoxide hydrolase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a transformant transformed with the recombinant expression vector in a host cell.
  • genes encoding 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase are composed not only of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, but also functional equivalents thereof, ie one or more substitutions in the sequence, It is meant to include all mutants that cause mutations such as deletions to achieve the object of the present invention.
  • the gene encoding the epoxide hydrolase is not only composed of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, but also functional equivalents thereof, that is, causing mutations such as one or more substitutions, deletions, etc. in the sequence. It is meant to include all mutants that achieve the purpose.
  • the whole cell containing the 8-lipoxygenase is a gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Or it is preferable to culture the transformant transformed with a recombinant expression vector comprising a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, obtain and use it.
  • whole cells including the 15-lipoxygenase may include a gene encoding an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; Or it is preferable to culture the transformant transformed with a recombinant expression vector comprising a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, obtain and use it.
  • the whole cell containing the epoxide hydrolase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4; Or it is preferable to culture the transformant transformed with a recombinant expression vector comprising a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, obtain and use it.
  • any vector may be used as long as it is a plasmid vector used in the art for gene recombination.
  • pET-28a (+) or pACYC duet plasmid is more preferably used, but not limited thereto. .
  • any microorganism may be used as long as the microorganism is transformed with a recombinant expression vector to overexpress a desired gene and produce an active enzyme protein.
  • E. coli ER 2566 strain may be used. However, it is not limited thereto.
  • the present invention (1) to produce a recombinant expression vector comprising 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase gene; (2) culturing the microorganism transformed with the recombinant expression vector; (3) inducing the expression of 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase genes, and (4) providing a recombinant protein expressed and a method for producing a strain comprising the same.
  • Whole cells comprising the 8-, 15-lipoxygenase and / or epoxide hydrolase is i) recovering the primary whole cells by centrifuging the culture of the microorganism; ii) washing the recovered whole cells with saline solution; iii) centrifuging the washed whole cells to remove the supernatant and obtaining whole cells; And iv) washing the second-recovered whole cells with physiological saline once again.
  • the recovery of the whole cells in step i) can be carried out in the range of about 13,000 g using a device known in the art such as a centrifuge, the washing of the whole cells in step ii) with less than 0.9% sodium chloride solution It is suitable to carry out.
  • the present invention synthesizes 10, 17-dihydroxide fatty acid and two kinds of resolbin D2 analogues using cultured 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase cells. Provides a production method for synthesizing dihydric fatty acids or two types of leukotriene analogues and four types of lipoxin analogues.
  • E. coli transformed with a recombinant expression vector comprising the genes of 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase to induce the expression of the recombinant enzyme gene and then recover the strain containing the expressed protein. It is preferable to use.
  • an unsaturated fatty acid having 20 carbon atoms as a substrate in particular, an unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms having at least one cis, cis-1,4 pentadiene, preferably arachidonic acid, eicosapentaeno It can be used including unsaturated fatty acids selected from the group consisting of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, the concentration of the unsaturated fatty acid in the substrate is 0.1 mM to 5 mM (preferably, 0.5 mM to 3 mM).
  • the enzyme reaction is preferably made in the range of pH 6.5 to pH 7.5, more preferably in the range of pH 7.0.
  • HEPES buffer solution may be used as the reaction solvent.
  • the enzyme reaction is preferably made in the temperature range of 10 ° C to 30 ° C, more preferably in the temperature range of about 25 ° C. By maintaining these conditions, the production activity of the lipid modulator can be improved.
  • the time of the whole-cell reaction can be appropriately adjusted according to a conventional method.
  • the method comprises a concentration of cells with lipoxygenase (or lipoxygenase and epoxide hydrolase), an enzyme that produces dihydroxyfatty acid (or lipid modulator) from unsaturated fatty acids.
  • lipoxygenase or lipoxygenase and epoxide hydrolase
  • an enzyme that produces dihydroxyfatty acid or lipid modulator
  • Treatment in the range of g / l to 50 g / l is preferred, but not limited thereto.
  • the Mousse no loose School (Mus musculus) mouse-derived 8-Lipoxygenase and buffer kolde Syrian den tailran sheath (Burkholderia thailandensis) By using the strain-derived 15-Lipoxygenase, reported to date It is possible to produce a variety of dihydroxyfatty acid or lipid modulators that contain new substances.
  • various dihydroxy fatty acids or lipid modifiers can be produced with high productivity and high yield in an environmentally friendly manner than materials obtained by chemical synthesis using heavy metals and organic solvents, various industries such as medicine, food and cosmetics It can be usefully used in the field.
  • Protectin DX, resolbin D2 analogue, lipoxin analogue, etc. prepared according to the present invention are expected to be involved in various bioactive functions in animals including humans.
  • Example 1-1 Construction of Recombinant Expression Vectors and Transgenic Microorganisms for Expression of 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase or Epoxide Hydrolase
  • the gene sequencing and amino acid sequences are already specified in the Korea Microorganism Conservation Center Mus musculus , Burkholderia thailandensis and Myxococcus xanthus were purchased and selected, and 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase derived therefrom. or genomic mouse cDNA, member kolde Ria tailran den sheath (Burkholderia thailandensis) or dynamic Socorro kusu glass tooth (Myxococcus xanthus) in order on the basis of the DNA nucleotide sequence of the epoxide hydrolase carrying out the polymerase chain reaction (PCR) DNA was extracted and used as a template for PCR.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Polymerase chain reaction was performed by designing primers based on DNA sequences of 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase or epoxide hydrolase, respectively. (PCR) was performed. Nde I and XhoI were used as restriction enzymes of each gene. The cloning method was performed using Gibson assembly method.
  • each vector was also prepared using PCR and ligated using isothermal buffer to prepare recombinant 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase. It was.
  • the recombinant expression vector obtained as described above is transformed into E. coli ER 2566 strain purchased from New England Biolabs (Hertfordshire, UK) by a conventional transformation method, the transformed microorganism is a 20% glycerin (glycerine) solution After incubation with addition, the product was stored frozen at -70 ° C before use.
  • Example 1-2 Expression of 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase or epoxide hydrolase
  • the transformed microorganisms frozen in (1) were aspirated at 200 rev / min in a flask containing 500 ml of LB (Difco, Sparks, MD, USA) medium and 20 ⁇ g / ml kanamycin Incubated at 37 ° C under the conditions.
  • the absorbance of bacteria reached 0.6 to 0.8 at 600 nm
  • the final concentration of 0.1 mM IPTG was added to induce protein expression of the enzymes, and the culture was incubated with stirring at 16 rev for 150 hours at 16 ° C. .
  • E. coli cells comprising cultured 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase or epoxide hydrolase were collected and used.
  • the 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase or epoxide hydrolase produced by overexpressing as described above is 0.85% sodium chloride by centrifuging the culture of the transformed strain at 6,000xg for 30 minutes at 4 °C Washed twice with (NaCl) and used as recombinant cells.
  • Example 2-1 Synthesis route of protectin from docosahexaenoic acid using 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase
  • Docosahexaenoic acid was used as a substrate in order to construct a synthetic pathway of protectin using the 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase.
  • Protectin used 30 g / L recombinant 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase, respectively, from 1 mM docosahexaenoic acid and whole cell reaction for 1 hour at pH 7.0, 25 ° C. was carried out.
  • Example 2-2 Synthesis of Protectin DX Using 8-lipoxygenase Single Whole Cell Reaction and Combination of Two Recombinant Enzymes of 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase
  • the present invention uses lipids in animals including humans using Mus musculus mouse-derived 8-lipoxygenase and Burkholderia thailandensis strain-derived 15-lipoxygenase.
  • the present invention relates to a method for producing hydroxide fatty acid and protectin DX, which can act as a lipid mediator, by using a bioconversion method.
  • the substrate is a transformed cell using docosahexaenoic acid and containing 8-lipoxygenase from Mus musculus and 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis .
  • 10-hydroxylated fatty acid, 17-hydroxylated fatty acid and protectin DX can be produced by using bioconversion method, so as to overcome the environmentally friendly conditions compared to the conventional chemical method, as well as not reported previously
  • bioconversion method so as to overcome the environmentally friendly conditions compared to the conventional chemical method, as well as not reported previously
  • the production of lipid modulators and the specific production by bioconversion methods have great significance.
  • Docosahexaenoic acid was used as a substrate to construct a synthetic pathway of resolbin D2 analogue using the 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase.
  • 1 Synthetic route was prepared by using 10-hydroxyl docosahexaenoic acid from 8-lipoxygenase, and 17-hydroxyl docosahexaenoic acid from 15-lipoxygenase for the synthetic route of resolbin D2 analog-2. was prepared and used.
  • Resolbin D2 analog-1 used 40 g / L recombinant 8-lipoxygenase from 1 mM 10-hydroxy docosahexaenoic acid, and resolbin D2 analog-2 was 1 mM 17-hydroxy docosahexa.
  • 40 g / L of recombinant 8-lipoxygenase from enoic acid was used, and both reactions were performed with whole cell reaction for 1 hour at pH 7.0, 25 ° C with epoxide hydrolase.
  • the present invention relates to 8-lipoxygenase from mouse, 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis , and epoxide hydrolase from Myxococcus xanthus .
  • the present invention relates to a method for producing hydroxylated fatty acids that can act as lipid mediators in animals including humans and resolbin D2 analogues, which have not been reported so far, using bioconversion.
  • the substrate uses docosahexaenoic acid, and the epoxide derived from mouse-derived 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis , and Myxococcus xanthus.
  • 10,17-dihydrohydroxyfatty acid and resolbin D2 analogs can be produced using biotransformation using transformed cells containing hydrolase, so that they are environmentally friendly compared to conventional chemical methods.
  • the production of lipid regulators which have not been reported previously, and the specific production by bioconversion methods have great significance.
  • Example 4-1 Synthesis pathway of lipoxin A4 and B4 analogues from arachidonic acid using 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase
  • the lipoxin A4 analog used 40 g / L of recombinant 8-lipoxygenase from 1 mM 15-hydroxylated arachidonic acid, and the lipoxin B4 analogue was 40 g / L of recombinant 15 from 1 mM 8-hydroxylated arachidonic acid.
  • -Lipoxigenase was used and both reactions were carried out with whole cell reaction for 1 hour at pH 7.0, 25 °C with epoxide hydrolase.
  • 15-HPETE and 8-HPETE formed from 15-lipoxygenase and 8-lipoxygenase from the 1 mM arachidonic acid described above were reduced to 15-HETE and 8-HETE by treatment with 100 mM Cysteine.
  • Each substance was once again used as a substrate to form respective perhydroxy fatty acids using 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase, and then treated with 8,15-dihydrate when treated with 100 mM Cysteine. It was confirmed that the leukotriene B4 analog, fatty acid (8,15-DiHETE, LTB4 analogue), was formed.
  • the lipoxin A4 and B4 analogues converted at the reaction conditions presented above were identified using HPLC and the amount produced over time for the quantifiable lipoxin B4 analogues (Fig. 11 (a)-(c)). In the case of substance identification, it was confirmed through LC-MS / MS, and it was confirmed that the lipoxin A4 and B4 analogues and the leukotriene B4 analogues (Fig. 12 (a) to (c)).
  • Example 4- Synthesis pathway of lipoxin A5 and B5 analogues from eicosapentaenoic acid using 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase
  • Eicosapentaenoic acid (EPA) was used as a substrate to construct a synthetic pathway of lipoxin A5 and B5 analogues using the 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase and epoxide hydrolase.
  • a 15-hydroxylated eicosapentaenoic acid was prepared from the 15-lipoxygenase for the A5 analogue synthesis route, and 8-hydroxylated eicosapentaenoic acid from the 8-lipoxygenase for the lipoxin B5 analogue synthesis route. was prepared and used.
  • the lipoxin A5 analog used 40 g / L of recombinant 8-lipoxygenase from 1 mM of 15-hydroxylated eicosapentaenoic acid, while the lipoxin B5 analog was 1 mM of 8-hydroxylated eicosapentaenoic acid.
  • 40 g / L of recombinant 15-lipoxygenase was used and both reactions were performed with whole cell reaction for 1 hour at pH 7.0, 25 ° C with epoxide hydrolase.
  • 15-HPEPE and 8-HPEPE formed from 15-lipoxygenase and 8-lipoxygenase from the reaction conditions given above from 1 mM eicosapentaphosphate were treated with 100- mM Cysteine to 15-HEPE and 8-HEPE.
  • Each substance was once again used as a substrate to form each of the perhydroxy fatty acids using 8-lipoxygenase and 15-lipoxygenase, and then treated with 100 mM Cysteine. It was confirmed that the leukotriene B5 analog, which is a dihydroxy fatty acid (8,15-DiHEPE, LTB5 analogue), was formed.
  • 8-lipoxygenase was formed using 15-HPEPE and 8-HPEPE formed from 15-lipoxygenase and 8-lipoxygenase from 1 mM arachidonic acid under the reaction conditions described above to synthesize analogs of lipoxin A5 and B5.
  • 15-OH-8,9-Ep-HEPE and 8-OH-14,15-Ep-HEPE, which were obtained through the two-step reaction of azease and 15-lipoxygenase, were produced, and the epoxide formed was epoxide hydrolase. Hydrolysis to synthesize lipoxin analogs.
  • the synthetic route as shown in FIG. 13 was constructed.
  • the present invention relates to 8-lipoxygenase from mouse, 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis , and epoxide hydrolase from Myxococcus xanthus .
  • substrates are derived from arachidonic acid and eicosapentaenoic acid and derived from mouse-derived 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis , and Myxococcus xanthus .
  • substrates are derived from arachidonic acid and eicosapentaenoic acid and derived from mouse-derived 8-lipoxygenase, 15-lipoxygenase from Burkholderia thailandensis , and Myxococcus xanthus .
  • leukotriene analogues and lipoxin A4, B4, A5 and B5 analogues can be produced by bioconversion Compared with the conventional chemical methods, not only environmentally friendly conditions are overcome, but the production of lipid modifiers not previously reported and specific production by bioconversion methods have great significance.

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Abstract

본 발명은 리폭시게나아제 조합반응을 이용하여 이수산화지방산 또는 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용함으로써, 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질을 포함하는 다양한 이수산화지방산 또는 지질조절제를 생산할 수 있다.

Description

리폭시게나아제 조합반응을 이용하여 이수산화지방산 또는 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 다른 위치특이성을 지닌 두 개의 리폭시게나아제를 조합하여 이수산화지방산을 제조하거나, 다른 위치특이성을 지닌 두 개의 리폭시게나아제에 에폭사이드 가수분해효소를 추가로 조합하여 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
수산화 지방산은 자연계에 존재하는 물질로 트리글리세롤, 세레브로시드, 왁스 등을 포함하여 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질에 존재하며 일반적으로 수산화기를 가지고 있는 자연계의 물질이다. 수산화기를 가지기 때문에 반응성이 뛰어나 산업적으로 원료물질로 사용되며, 또한 이 수산화기의 작용으로 표면장력의 감소, 항곰팡이 활성의 증가로 화장품의 원료물질로 사용되기도 한다. 특히 동물에서 수산화 지방산은 신호전달물질의 전구체로 이용되며, 단일 물질만으로도 다양한 생리활성에 관여한다. 신호전달물질의 한 종류인 지질 조절제(lipid mediator)는 인간을 포함한 동물 내에서 면역반응, 항상성 조절 등의 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질로서 그 물질들 중 프로텍틴은 주로 리폭시게나아제가 탄소수 20개 및 22개(C20 및 C22)의 다가불포화지방산에 작용하여 전환된다.
프로텍틴 중 일반적으로 알려진 프로텍틴 D1(protectin D1, PD1)은 내인성 입체 선택성 지질 매개체로 오메가 지방산인 도코사헥사엔산으로부터 유래한 물질로 주로 망막, 폐 및 신경계와 같은 조직에서 발견되었다. 이 물질은 항염증제, 항암제 및 신경 보호제의 역할을 수행하는데 뇌졸중 환자 및 알츠하이머 병 동물 모델 연구 결과 이 물질 처리 시 산화 스트레스에 의한 염증을 잠재적으로 감소시키고 세포 사멸 유발을 억제함으로 세포 퇴행을 예방함을 확인하였다. 또한 인플루엔자 바이러스 복제능을 약화시킴으로 H5N1과 같은 조류 인플루엔자 바이러스의 감염능을 저해시키고 염증을 해소시키는 능력을 보유한 것으로 알려져 있다. 프로텍틴의 처리를 통해 숙주 세포에서 유해한 부작용을 일으킬 수 있는 숙주의 RNA에 유해한 점을 유도하지 않는다고 확인된 효능을 감안해서 바이러스 또는 세균성 염증에서의 강력한 항염 능력을 지닌 이 물질을 바이러스 감염에 대한 바이오 마커 뿐만 아니라 새로운 항바이러스제로서의 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 한편, 프로텍틴은 수산기의 카이랄성(chirality)에 따라 10R, 17S-이수산화도코사헥사엔산의 경우 프로텍틴 D1(protectin D1, PD1), 10S, 17S-이수산화도코사헥사엔산의 경우 프로텍틴 DX(protectin DX, PDX)으로 일컫는다. PDX 또한 PD1과 마찬가지로 항염능을 지닌 물질로서 염증 마우스 모델에서 순환되는 백혈구가 복막으로 유입되는 것을 억제한다. 또한 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)를 억제하여 프로스타글란딘의 형성을 억제하고 혈소판의 집적 반응을 차단하는 역할을 수행한다. 프로텍틴은 부작용을 동반하는 화학 합성된 의약품을 대신하여 차세대 의료물질로써의 가능성을 지니고 있으며, 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산 방법이 개발되어 있지 않다.
한편, 인간 신호전달물질의 한 종류인 지질 조절제(lipid mediator) 중 레졸빈은 주로 다가불포화지방산으로부터 생산되는 물질로 리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소에 의해 전환된다. 레졸빈을 포함하는 지질 조절제들은 인간을 포함한 포유류 내에서 항상성 조절, 면역반응 등 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질이다. 구체적으로, 레졸빈(resolvin, RV)은 리폭시게나아제들(lipoxygenase, LOX)의 조합반응의 산물로 주로 오메가 3 다가불포화지방산인 에이코사펜타노익산(eicosapentaenoic acid, EPA) 또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)산으로부터 LOX의 순차적인 반응으로 생성되는 trihydroxy fatty acid 형태의 에이코타노이드(eicosanoid)에 속하는 물질이다. 시작되는 기질에 따라 에이코사펜타노익산을 이용시 레졸빈 E, 도코사헥사엔산을 이용시 레졸빈 D로 분류되고 있다. 이러한 물질들은 급성 염증의 해소 단계에서 유래되는 내인성 지질 매개체로 여러 동물 모델에서 강력한 항염증 및 초기 염증 해소작용을 확인했다. 레졸빈 E1 및 레졸빈 D1의 경우 각각 소염작용과 수술 후 통증을 막을 수 있음을 확인할 수 있었는데 구체적으로 레졸빈 E1의 경우 염증성 물질을 처리한 동물모델에 나노그램(nanogram) 단위의 물질 처리로 강력한 진통 효능을 보임을 확인했다. 레졸빈 E1 및 레졸빈 D1는 절개로 유발되는 통증을 막는 것을 확인했고 특히 레졸빈 D1의 경우 랫 모델에서 수술 후에 생기는 통각과민상태와 이질통을 치유해주거나 막아주는 것을 확인하였으며 척수강에 직접 주사 했을 때 염증 해소 효과가 좀 더 효과적임을 확인한 결과가 있다. 또한 레졸빈 E1, 레졸빈 D1 및 레졸빈 D2는 각각 마우스 피부의 진피를 자극하여 호중구의 침투를 감소시키고 피부 재생을 촉진시키는 것이 보고되었고, 레졸빈 D 계열 중 D1, D2는 당뇨병 마우스 모델에서 상처 치유를 촉진시킨다는 것이 보고되었다. 이에 따라 지금까지 연구된 레졸빈류 외에 비슷한 물질 구조를 지닌 레졸빈류 유사체 (RV analogue)가 개발되면 기존의 레졸빈 류와 같이 강력한 생체 활성은 다른 염증 해소와 관련된 약물을 대체할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다는 부분에서 연구 개발이 필요하다고 생각되며 다른 지질 매개체들과 같이 차세대 염증해소와 관련된 의료물질로의 가능성과 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있다는 점에 있다고 제시한다.
한편, 리폭신을 포함하는 지질 조절제는 인간을 포함한 포유류 내에서 항상성 조절, 면역반응 등 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질이다. 구체적으로, 리폭신(lipoxin, LX)은 리폭시게나아제 (lipoxygenase, LOX)의 상호작용 산물로 주로 아라키돈산으로부터 리폭시게나아제의 순차적인 반응으로 생성되는 trihydroxy fatty acid 형태의 eicosanoid에 속하는 물질이다. 이러한 물질의 구조는 세포-세포간 상호작용과정에서 형성되며 인체 내에서 면역 기작 및 항염증반응에 관여하는 중요물질이다. 리폭신은 특정 G-단백질 연결 수용체에 작용하는 물질로 염증 및 염증해소에 관련한 세포의 반응을 조절하며 리폭신A4 (lipoxin A4, LXA4), 리폭신B4 (LXB4)는 아스피린의 작용기작과 비슷하게 작용하는데, 그 중 염증반응에 관여되는 사이클로옥시게나아제 (cyclooxygenase, COX)의 아세틸화과정에서 15-epi-LX가 합성되어 TNF-α의 생성을 억제함으로써 항염작용에 영향을 미친다. 이러한 리폭신류는 토끼, 쥐 등의 동물모델을 통해 생체 내에서 항염증 및 염증해소 촉진을 보이는 eicosanoid 계열 화합물로 증명되었으며, 염증, 천식, 관절염, 심혈관질환, 위장병, 치주병, 신장질환 및 이식편대숙주질환 등을 포함한 많은 질환에서 중요한 역할을 하는 물질로써 구제적으로 LXA4의 대표적 면역기능은 염증반응에서 작용하는 T-cell의 류코트리엔 수용체와 결합하여 염증을 해소하며, 기관지 수축 작용을 억제하고 천식환자의 수축된 기간지를 완화시키는 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 지금까지 연구된 리폭신은 염증과 관련된 일반적인 질환 치료에 대한 새로운 접근법을 제공하며 기존 알려진 리폭신 이외에 비슷한 물질구조를 가지는 리폭신 유사체 (LX analogues)가 개발되면, 기존 리폭신과 같이 차세대 의료물질로써의 기능성을 제시할 수 있다는 부분에서 새로운 유형의 리폭신 유사체 개발은 필요하다고 생각되어지고 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있다.
리폭시게나아제(lipoxygenase, LOX)는 이산소화효소이며, 산화지방산을 합성하는 반응을 촉매한다. 산화효소이지만 헴(heme)을 지니지 않는 것이 특징으로, 대신 철을 함유한 효소이다. 특징적으로 하나 또는 다수의 시스, 시스-1,4-펜타디엔을 가지는 다가불포화지방산을 기질로 이용하여 이산소화 반응을 통해 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다. 기질로 사용되는 다가불포화지방산의 종류에 따라 위치특이성이 다른데, 그 중에서도 동물성 다가불포화지방산의 아리키돈산의 8번 위치에 수산기를 생성하는 아라키돈산 8-리폭시게나아제(이하, 8-리폭시게나아제로 명명)의 경우, 특이적으로 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 8번 탄소 위치에만 수산기를 형성한다. 또한, 이 효소는 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 10번 탄소 위치에 수산기를 형성한다. 8-리폭시게나아제의 경우, 현재까지 마우스 외의 동물에서는 발견된 바가 없으며, 최근엔 해양생물인 산호(coral)류에서 존재가 보고되어 있다. 마우스 유래의 8-리폭시게나아제는 특이적으로 이중 이산화과정을 거치는데 아라키돈산으로부터 8-수산화 아라키돈산을 형성 한 뒤 15번 탄소위치에 수산기를 형성하여 8,15-이수산화 아라키돈산을 형성한다. 프로텍틴 생합성에 이용하고자 하는 추가적인 효소로 아라키돈산 15-리폭시게나아제(이하, 15-리폭시게나아제로 명명)의 경우 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 15번 탄소 위치에만 수산기를 형성한다. 또한, 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 17번 탄소 위치에 수산기를 형성한다.
현재까지 보고된 프로텍틴의 합성방법으로는 8 단계의 수렴입체선택적인 화학합성 방법이 보고되어 있고 15 %의 수율로 합성되는 것으로 알려져 있다. 이 과정은 유기용매와 팔라듐과 같은 중금속 및 수소 첨가 반응을 이용하여 합성하는 방법으로 이러한 화학합성 과정에서 생산되는 오염물질 및 부산물은 자연에서 생분해 되지 않아 환경 오염을 야기한다는 점에서 한계가 있다. 본 발명에서는 위치특이적인 리폭시게나아제를 단독 또는 조합 사용하여 프로텍틴을 생합성 하고자 해당 경로를 구축하고 그 전환에 대해 확인하였다. 현재까지 생물전환을 이용하여 8-리폭시게나아제(8-LOX)를 단독으로 또는 8-리폭시게나아제와 15-리폭시게나아제를 조합하여 도코사헥사엔산으로부터 프로텍틴을 제조하는 방법은 보고된 바 없다.
또한, 현재까지 알려진 레졸빈류는 아세틸화된 cycloxygenase-2, P450 또는 인간유래의 5-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제에 의해 생성되는 물질이 보고되어 있다. 하지만 위치특이적 산화효소들과 에폭사이드 가수분해효소를 조합하여 기존 보고된 물질이 아닌 새로운 위치특이적 레졸빈 및 그 유사체 합성된 바 없으며, 특히 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 조합하여 도코사헥사엔산으로부터 레졸빈 D2 유사체의 생산은 보고된 바가 없다.
또한, 현재까지 위치특이적 리폭시게나아제들을 조합하여 기존 보고된 물질이 아닌 새로운 위치특이적 리폭신 유사체는 합성된 바 없으며, 특히, 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 조합하여 아라키돈산 또는 에이코사펜타에노익산으로부터 리폭신 유사체 및 류코트리엔 유사체의 생산은 보고된 바가 없다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 마우스 유래 및 미생물 유래 리폭시게나아제의 조합반응을 이용하여 이수산화지방산 또는 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 이수산화지방산은 하기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000001
,
[화학식 2]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000002
,
[화학식 3]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000003
,
[화학식 4]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000004
,
[화학식 5]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000005
,
[화학식 6]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000006
,
[화학식 7]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000007
,
[화학식 8]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000008
,
[화학식 9]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000009
.
상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 불포화지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것이고, 상기 기질 내 불포화지방산의 농도는 0.5 mM 내지 5 mM 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 유효성분으로 포함하는 지질조절제의 제조용 조성물로서, 상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다:
[화학식 10]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000010
,
[화학식 11]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000011
,
[화학식 12]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000012
,
[화학식 13]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000013
,
[화학식 14]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000014
,
[화학식 15]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000015
.
상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 이수산화지방산은 상기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 지질조절제의 제조용 조성물로서, 상기 지질조절제는 상기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 이수산화지방산을 제조하는 방법으로서, 상기 이수산화지방산은 상기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 방법을 제공한다.
상기 처리는 pH 6.5 내지 7.5 범위 및 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 지질조절제를 제조하는 방법으로서, 상기 지질조절제는 상기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 지질조절제의 제조용 재조합 발현 벡터로서, 상기 지질조절제는 상기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 숙주세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질 전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 2 내지 화학식 9 중 어느 하나로 표시되는, 신규 이수산화지방산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 10 내지 화학식 15 중 어느 하나로 표시되거나, 하기 화학식 16 내지 화학식 21 중 어느 하나로 표시되는, 신규 지질조절제를 제공한다:
[화학식 16]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000016
,
[화학식 17]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000017
,
[화학식 18]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000018
,
[화학식 19]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000019
,
[화학식 20]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000020
,
[화학식 21]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000021
.
본 발명에 따르면, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용함으로써, 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질을 포함하는 다양한 이수산화지방산 또는 지질조절제를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 환경친화적인 방법으로 다양한 이수산화지방산 또는 지질조절제를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 프로텍틴 DX, 레졸빈 D2 유사체, 리폭신 유사체 등은 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 이용하여 도코사헥사엔산을 기질로 하여 생성되는 프로텍틴 DX의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 2는 프로텍틴 DX의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 LC-MS/MS를 이용하여 프로텍틴 DX의 물질동정을 진행한 도이다.
도 4는 본 발명의 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균의 단독반응(8-LOX 단일), 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의한 반응 후 15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균의 첨가(8-LOX add 15-LOX), 또는 15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의한 반응 후 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균의 첨가(15-LOX add 8-LOX) 시 생성되는 프로텍틴 DX의 양을 확인한 도이다.
도 5는 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균으로 반응 후 15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균의 시간별 프로텍틴 DX의 생성량을 나타낸 도이다.
도 6은 도코사헥사엔산으로부터 8-리폭시게나아제에 의해 생성된 10-하이드록시 도코사헥사엔산을 정제한 후 정제한 기질에 15-리폭시게나아제를 처리하여 프로텍틴 DX의 전환을 시간별로 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 도코사헥사엔산을 기질로 하여 생성되는 두 종류의 레졸빈 D2 유사체의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 8a는 레졸빈 D2 유사체-1의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 8b는 레졸빈 D2 유사체-2의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 8c는 시간에 따른 레졸빈 D2 유사체의 합성정도를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 레졸빈 D2 유사체-1의 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정을 진행한 도면이며, 도 9b는 레졸빈 D2 유사체-2의 물질동정 결과이다.
도 10은 본 발명의 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 아라키돈산을 기질로 하여 생성되는 리폭신 A4와 B4 유사체의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 11a는 리폭신 A4 유사체의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 11b는 리폭신 B4 유사체의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 11c는 시간에 따른 리폭신 B4 유사체의 합성정도를 나타낸 그래프이다.
도 12a는 리폭신 A4 유사체의 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정을 진행한 도면이며, 도 12b는 리폭신 B4 유사체의 물질동정 결과이고, 도 12c는 류코트리엔 B4 유사체의 물질동정 결과이다.
도 13은 본 발명의 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 에이코사펜타에노익산을 기질로 하여 생성되는 리폭신 A5와 B5 유사체의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 14a는 리폭신 A5 유사체의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 14b는 리폭신 B5 유사체의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 15a는 리폭신 A5 유사체의 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정을 진행한 도면이며, 도 15b는 리폭신 B5 유사체의 물질동정 결과이고, 도 15c는 류코트리엔 B5 유사체의 물질동정 결과이다.
도 16a는 본 발명의 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스 유래 15-리폭시게나아제를 각각 합성시킨 재조합 벡터를 나타낸 것이고, 도 16b는 본 발명의 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 각각 합성시킨 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 프로텍틴 DX를 제조하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 친환경적인 생물전환방법으로 새로운 생산경로로 프로텍틴 DX를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 레졸빈 D2 유사체 또는 리폭신 유사체를 제조하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 10, 17-이과수산화 지방산 및 2가지 종류의 레졸빈 D2 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조하거나, 8, 15-이과수산화 지방산 또는 2가지 종류의 류코트리엔 유사체과 4가지 종류의 리폭신 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
일 측면에서, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 이수산화지방산은 하기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000022
,
[화학식 2]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000023
,
[화학식 3]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000024
,
[화학식 4]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000025
,
[화학식 5]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000026
,
[화학식 6]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000027
,
[화학식 7]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000028
,
[화학식 8]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000029
,
[화학식 9]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000030
.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 이수산화지방산은 상기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다.
또는, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 유효성분으로 포함하는 지질조절제의 제조용 조성물로서, 상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다:
[화학식 10]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000031
,
[화학식 11]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000032
,
[화학식 12]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000033
,
[화학식 13]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000034
,
[화학식 14]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000035
,
[화학식 15]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000036
.
한편, 하기 화학식 16 내지 화학식 21 중 어느 하나로 표시되는 신규 지질조절제가 중간물질로 생성될 수 있다:
[화학식 16]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000037
,
[화학식 17]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000038
,
[화학식 18]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000039
,
[화학식 19]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000040
,
[화학식 20]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000041
,
[화학식 21]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000042
.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 지질조절제의 제조용 조성물로서, 상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 “이수산화지방산”이라 함은 프로텍틴 DX, 10,17- 이과수산화 지방산, 8,15-이과수산화 지방산 또는 류코트리엔 유사체를 모두 포함하는 개념이다. 이때, 본 명세서에서 “프로텍틴 DX”은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로, 10S,17S-디히드록시(dihydroxy)-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid)이고, 10S,17S-디히드록시도코사헥사엔산(10,17-dihydroxydocosahexaenoic acid)이라고도 한다. 프로텍틴 DX는 상술한 바와 같이 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산 방법이 개발되어 있지 않다. 또한, 본 명세서에서 "10,17- 이과수산화 지방산(10,17-dihydroperoxydocosahexaenoic acid)"는 10-수산화, 17-이과수산화도코사헥사엔산(10,17(P)-DiHETE, 10-hydroxy&17-hydroperoxydocosahexaenoic acid) 또는 10-과수산화, 17-수산화도코사헥사엔산(10-hydroperoxy&17-docosahexaenoic acid)를 의미하고 신규 화합물로서, 각각 순서대로 상기 화학식 2 및 화학식 3으로 표시된다. 또한, 본 명세서에서 "8,15-이과수산화 지방산"은 8-수산화, 15-과수산화 아라키돈산(8,15(P)-DiHETE, 8-hydroxy&15-hydroperoxyarachidonic acid), 8-과수산화, 15-수산화아라키돈산 (8-hydroperoxy&15-hydroxyarachidonic acid), 8-수산화, 15-과수산화 에이코사펜타엔산(8,15(P)-DiHEPE, 8-hydroxy&15-hydroperoxyeicosapentaenoic acid), 8-과수산화,15-수산화에이코사펜타엔산(8-hydroperoxy&15-hydroxyeicosapentaenoic acid), 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 의미하고 신규 화합물로서, 각각 순서대로 상기 화학식 4 내지 화학식 7로 표시된다. 또한, 본 명세서에서 "류코트리엔 유사체"는 류코트리엔 B4 유사체(LTA4 analogue, 8,15-dihydroxyeicosatetraenoic acid) 및 류코트리엔 B5 유사체(LTB5 analogue, 8,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 의미하고 신규 화합물로서, 각각 순서대로 상기 화학식 8 및 화학식 9로 표시된다.
본 명세서에서 “지질조절제”라 함은 레졸빈 D2 유사체 또는 리폭신 유사체를 모두 포함하는 개념이다. 이때, 본 명세서에서 "레졸빈 D 유사체는 레졸빈 D2 유사체-1 (resolvin D2 analogue-1, 10,16,17-trihydroxydocosahexaenoic acid) 또는 레졸빈 D2 유사체-2 (resolvin D2 analogue-2, 10,11,17-trihydroxydocosahexaenoic acid)를 의미하고, 신규 화합물로서, 각각 순서대로 상기 화학식 10 및 화학식 11로 표시된다. 또한, 본 명세서에서 "리폭신 유사체"는 리폭신 A4 유사체(LXA4 analogue, 8,9,15-trihydroxyeicosatetraenoic acid), 리폭신 B4 유사체(LXB4 analogue, 8,14,15-trihydroxyeicosatetraenoic acid), 리폭신 A5 유사체(LXA5 analogue, 8,9,15-trihydroxyeicosapentaenoic acid), 및 리폭신 B5 유사체(LXB5 analogue, 8,14,15-trihydroxyeicosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 의미하고 신규 화합물로서, 각각 순서대로 상기 화학식 12 내지 화학식 15로 표시된다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래의 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것; 상기 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
또한, 상기 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것 뿐 만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 20개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 불포화지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있고, 상기 기질 내 불포화지방산의 농도는 0.1 mM 내지 5 mM (바람직하게, 0.5 mM 내지 3 mM)일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 이수산화지방산을 제조하는 방법으로서, 상기 이수산화지방산은 상기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제;를 기질에 처리하여 생물 전환으로 지질조절제를 제조하는 방법으로서, 상기 지질조절제는 상기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래의 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것; 상기 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
또한, 상기 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것뿐 만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 기질은 탄소수가 20개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 불포화지방산을 포함할 수 있고, 상기 기질 내 불포화지방산의 농도는 0.1 mM 내지 5 mM(바람직하게, 0.5 mM 내지 3 mM) 일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 있어서, 상기 방법은 반응을 pH 6.5 내지 7.5 범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 상기 방법은 반응을 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
다른 측면에서, 본 발명은 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 각각 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 상기 효소를 모두 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 지질조절제의 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 2 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
또한, 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 6으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 8-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 15-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 서열번호 3로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질 전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 재조합 발현 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 또는 pACYC duet 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환된 형질전환체로서, 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 ER 2566 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 미생물을 배양하고; (3) 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소 유전자의 발현을 유도하여 (4) 발현된 재조합 단백질과 이를 포함한 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 8-, 15리폭시게나아제 및/또는 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 i) 상기 미생물의 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ii) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; iii) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 iv) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, i) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ii) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
본 발명은 배양된 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소 포함한 세포를 이용하여 10, 17-이과수산화 지방산 및 2가지 종류의 레졸빈 D2 유사체를 합성하거나, 8, 15-이과수산화 지방산 또는 2가지 종류의 류코트리엔 유사체과 4가지 종류의 리폭신 유사체를 합성하는 생산방법을 제공한다.
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 단백질 포함한 균주를 회수하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 기질로서 탄소수가 20개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 불포화지방산을 포함하여 사용할 수 있고, 상기 기질 내 불포화지방산의 농도는 0.1 mM 내지 5 mM(바람직하게, 0.5 mM 내지 3 mM) 일 수 있다.
또한, 상기 효소 반응은 pH 6.5 내지 pH 7.5의 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 7.0 내외 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 HEPES 완충용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 효소 반응은 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 25℃ 내외의 온도 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 조건을 유지함으로써, 지질조절제의 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 전세포 반응의 시간을 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 예에 있어서, 상기 방법은 불포화지방산으로부터 이수산화지방산(또는 지질조절제)를 생산하는 효소인 리폭시게나아제(또는 리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소)를 지닌 세포의 농도를 10 g/ℓ 내지 50 g/ℓ 범위에서 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용함으로써, 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질을 포함하는 다양한 이수산화지방산 또는 지질조절제를 생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 중금속과 유기용매를 이용한 화학합성으로 얻는 물질보다 환경친화적인 방법으로 다양한 이수산화지방산 또는 지질조절제를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 프로텍틴 DX, 레졸빈 D2 유사체, 리폭신 유사체 등은 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명에서는 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소를 제조하기 위하여, 마우스, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주의 유전자로부터 각각 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 한국미생물보존센터(서울)에서 유전자 염기서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)를 구입하여 선별하고, 이로부터 유래한 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 마우스 cDNA, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 또는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)의 genomic DNA를 추출하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각 유전자들의 제한효소로 Nde I과 XhoI을 이용하였으며 클로닝 방법은 Gibson assembly 방법을 이용하였고 각각의 primer는 다음과 같다.
마우스 유래 8-리폭시게나아제 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GCG AAA TGC AGG GTG AGA GTA TCC ACG(서열번호 7), R: ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TTA GAT GGA GAC ACT GTT CTC AAT GAG GGG(서열번호 8)로 구성하였고, 버콜데리아 타일렌덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GTC AAT CAC AAA ACC GGG TCA AAT ATG(서열번호 9), R: ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TCA AAT GTT CGT GCT TGC CGG AAT CCG GCT(서열번호 10)로 구성하였으며, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래 에폭사이드 가수분해효소 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GCT GAC ATC ACG CAT CGA ACC GTA AAG(서열번호 11), R: ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TCA GGC CGG CAG CTT CTT CAG GAA GGC CAG(서열번호 12)로 구성하였다. 또한, 각 유전자를 pET 28a에 클로닝하기 위하여 각각의 벡터들 또한 PCR을 이용하여 준비 후 isothermal buffer를 이용하여 라이게이션하여 재조합 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 제작하였다.
이후, 상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs (Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 형질전환 된 미생물들은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 배양한 뒤 사용 전에 -70℃에 냉동 보관하였다.
실시예 1-2. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현
효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관시킨 형질전환 된 미생물들은 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
배양된 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소는 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 재조합 세포로 사용하였다.
실시예 2-1. 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 이용한 도코사헥사엔산으로부터 프로텍틴의 합성경로 구축
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제를 이용하여 프로텍틴의 합성경로를 구축하기 위하여 도코사헥사엔산을 기질로 하였다. 프로텍틴은 1 mM의 도코사헥사엔산으로부터 각각 30 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 사용하였으며 pH 7.0, 25 ℃에서 1 시간 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 [도 1]과 같은 합성경로를 구축하였다. 또한 프로텍틴 생성여부를 HPLC를 이용하여 확인하였으며(도 2), LS-MS를 통해 프로텍틴 이라는 것을 확인하였고(도 3), NMR 분석을 통해 10S, 17S-디히드록시 (dihydroxy)-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid)을 확인하면서 프로텍틴DX (protectin DX, PDX)라 명명하게 되었다(화학식 1, 표 1).
[화학식 1]
Figure PCTKR2019009660-appb-I000043
.
C No. 1H (δ) multiplet J (Hz) Protons 13C (δ)
1
2 2.39 t 2H 33.9
3 2.31 m 2H 23.1
4 3.38-4.41 m 1H 128.3
5 3.38-4.41 m 1H 129.0
6 5.64 t 6.85 2H 24.7
7 6.52-6.81 m 1H 130.2
8 7.18 m 1H 124.9
9 2.49 d 15.01, 6.85 2H 35.3
10 3.04 dd 14.01, 5.88 1H 72.1
11 8.19 dd 15.01, 5.82 1H 137.3
12 3.29-3.39 m 1H 124.1
13 5.61-5.72 m 1H 128.9
14 5.62 t 10.23 1H 128.9
15 4.40 dd 15.29, 10.23 1H 125.1
16 1.20 dd 15.29, 5.94 1H 135.1
17 1.29 dt 5.94, 6.72 1H 73.1
18 2.11-2.30 m 2H 34.9
19 3.29-3.44 m 1H 125.4
20 3.29-3.44 m 1H 133.7
21 1.98 dt 7.49, 7.11 2H 22.5
22 0.84 t 3.97 3H 11.1
실시예 2-2. 8-리폭시게나아제 단일 전세포 반응과 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제 두 종류의 재조합 효소의 조합반응을 이용하여 프로텍틴 DX의 합성
상기 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의해 단일반응으로 생성되는 프로텍틴 DX와 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의한 반응 후 15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균의 첨가, 15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의한 반응 후 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균의 첨가 시 생성되는 프로텍틴DX의 양을 확인하였다. 기질로서 1 mM의 도코사헥사엔산에 대하여 pH 7.0에서, 온도를 25 ℃에서 1 시간 동안 전세포 반응을 실시하였고 각 반응 촉매별 프로텍틴의 생산 정도를 확인하였다.
그 결과, [도 4]에 나타난 바와 같이, 8-리폭시게나아제가 발현된 단일 반응에 의해 약 300 μM의 프로텍틴 DX가 생성됨을 확인하였으며, 8-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의한 반응 후 15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균을 첨가한 조합 반응에 의해서는 약 400 μM의 프로텍틴 DX가 생성되어 단일 반응보다 약 1.3배 증가된 생산량을 확인하였으며, 이로부터 단일 반응보다 두 효소를 조합했을 때 반응성이 좋아짐을 알 수 있었다. 동일한 조건에서 시간별 프로텍틴 DX의 생산을 나타낸 결과는 [도 5]에 나타내었다.
다음으로, 두 효소를 조합했을 때 반응성이 더 좋아졌던 점을 참고하여 도코사헥사엔산으로부터 8-리폭시게나아제에 의해 생성된 10-하이드록시 도코사헥사엔산을 정제한 후 정제한 기질에 15-리폭시게나아제를 처리하여 프로텍틴 DX의 전환을 확인하였다. 2.5 mM의 10-하이드록시 도코사헥사엔산에 대하여 pH 7.5에서, 온도를 30 ℃에서 30 분동안 전세포 반응을 실시하였다. 그 결과, [도 6]에 나타난 바와 같이, 약 1.9 mM의 프로텍틴 DX가 생성됨을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 지질조절제(lipid mediator)로 작용할 수 있는 수산화 지방산과 프로텍틴 DX를 생물전환법을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 도코사헥사엔산을 사용하고 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제를 포함한 형질전환된 세포를 이용하여 특이적으로 10-수산화 지방산, 17-수산화 지방산 및 프로텍틴 DX를 생물전환법을 이용하여 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 기존에 보고되지 않은 지질 조절제의 생산과 생물전환법에 의한 특이적인 생산이 큰 의미를 가진다.
실시예 3. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 도코사헥사엔산으로부터 레졸빈 D2 유사체의 합성경로 구축
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 레졸빈 D2 유사체의 합성경로를 구축하기 위하여 도코사헥사엔산(DHA)을 기질로 하였으며, 레졸빈 D2 유사체-1 합성경로의 경우 8-리폭시게나아제로부터 10-수산화 도코사헥사엔산을 제조하여 사용하였고, 레졸빈 D2 유사체-2의 합성경로의 경우 15-리폭시게나아제로부터 17-수산화 도코사헥사엔산을 제조하여 사용하였다. 레졸빈 D2 유사체-1은 1 mM의 10-수산화 도코사헥사엔산으로부터 40 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제를 사용하였으며, 레졸빈 D2 유사체-2는 1 mM의 17-수산화 도코사헥사엔산으로부터 40 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제를 사용하였으며 두 반응 모두 에폭사이드 가수분해 효소와 함께 pH 7.0, 25 ℃에서 1 시간 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 [도 7]과 같은 합성경로를 구축하였다. 상기 제시된 반응 조건에서 전환된 두 종류의 레졸빈 D2 유사체는 HPLC를 이용하여 확인하고(도 8(a)~(c)). 물질동정의 경우 LC-MS/MS를 통해 레졸빈 D2 유사체임을 확인하였다(도 9(a)~(b)).
상술한 바와 같이, 본 발명은 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 지질조절제(lipid mediator)로 작용할 수 있는 수산화 지방산과 지금까지 보고되지 않은 레졸빈 D2 유사체를 생물전환법을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 도코사헥사엔산을 사용하고 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제와 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 형질전환 된 세포를 이용하여 특이적으로 10,17-이과수산화지방산 및 레졸빈 D2 유사체를 생물전환법을 이용하여 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 기존에 보고되지 않은 지질 조절제의 생산과 생물전환법에 의한 특이적인 생산이 큰 의미를 가진다.
실시예 4-1. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 아라키돈산으로부터 리폭신 A4와 B4 유사체의 합성경로 구축
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 리폭신 A4와 B4 유사체의 합성경로를 구축하기 위하여 아라키돈산(AA)을 기질로 하였으며, 리폭신 A4 유사체 합성경로의 경우 15-리폭시게나아제로부터 15-수산화 아라키돈산을 제조하여 사용하였고, 리폭신 B4 유사체 합성경로의 경우 8-리폭시게나아제로부터 8-수산화 아라키돈산을 제조하여 사용하였다. 리폭신 A4 유사체는 1 mM의 15-수산화 아라키돈산으로부터 40 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제를 사용하였으며, 리폭신 B4 유사체는 1 mM의 8-수산화 아라키돈산으로부터 40 g/L의 재조합 15-리폭시게나아제를 사용하였으며 두 반응 모두 에폭사이드 가수분해 효소와 함께 pH 7.0, 25 ℃에서 1 시간 동안 전세포 반응(whole cell reaction)을 실시하였다.
1 mM 아라키돈산으로부터 상기 제시된 반응 조건에서 15-리폭시게나아제 및 8-리폭시게나아제로부터 형성된 15-HPETE 및 8-HPETE는 100 mM 시스테인(Cysteine)을 처리하여 15-HETE 및 8-HETE로 환원시켰으며, 각각의 물질을 다시 한 번 기질로 하여 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 이용하여 각각의 과수산화 지방산을 형성한 뒤 100 mM 시스테인(Cysteine) 처리하였을 때 8,15-이수산화 지방산 (8,15-DiHETE, LTB4 analogue)인 류코트리엔 B4 유사체가 형성되는 것을 확인하였다. 또한 리폭신 A4 및 B4의 유사체를 합성하기 위하여 상기 제시된 반응 조건에서 1 mM 아라키돈산으로부터 15-리폭시게나아제 및 8-리폭시게나아제로부터 형성된 15-HPETE 및 8-HPETE를 기질로 하여 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제의 이단반응을 통해 얻어진 15-OH-8,9-Ep-HETE 및 8-OH-14,15-Ep-HETE를 생성하였고 형성된 에폭사이드는 에폭사이드 가수분해효소를 통해 가수분해하여 리폭신 유사체를 합성하였다. 그 결과 [도 10]와 같은 합성경로를 구축하였다. 상기 제시된 반응 조건에서 전환된 리폭신 A4 및 B4 유사체는 HPLC를 이용하여 확인하였으며 수치화가 가능한 리폭신 B4 유사체의 경우 시간에 따른 생성량을 확인하였다(도 11(a)~(c)). 물질동정의 경우 LC-MS/MS를 통해 확인하였으며 확인결과 리폭신 A4 및 B4 유사체와 류코트리엔 B4 유사체임을 확인하였다(도 12(a)~(c)).
실시예 4-2. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 에이코사펜타에노익산으로부터 리폭신 A5와 B5 유사체의 합성경로 구축
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 리폭신 A5와 B5 유사체의 합성경로를 구축하기 위하여 에이코사펜타에노익산(EPA)을 기질로 하였으며, 리폭신 A5 유사체 합성경로의 경우 15-리폭시게나아제로부터 15-수산화 에이코사펜타에노익산을 제조하여 사용하였고, 리폭신 B5 유사체 합성경로의 경우 8-리폭시게나아제로부터 8-수산화 에이코사펜타에노익산을 제조하여 사용하였다. 리폭신 A5 유사체는 1 mM의 15-수산화 에이코사펜타에노익산으로부터 40 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제를 사용하였으며, 리폭신 B5 유사체는 1 mM의 8-수산화 에이코사펜타에노익산으로부터 40 g/L의 재조합 15-리폭시게나아제를 사용하였으며 두 반응 모두 에폭사이드 가수분해 효소와 함께 pH 7.0, 25 ℃에서 1 시간 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
1 mM 에이코사펜타인산으로부터 상기 제시된 반응 조건에서 15-리폭시게나아제 및 8-리폭시게나아제로부터 형성된 15-HPEPE 및 8-HPEPE는 100 mM 시스테인(Cysteine)을 처리하여 15-HEPE 및 8-HEPE로 환원시켰으며, 각각의 물질을 다시 한 번 기질로 하여 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 이용하여 각각의 과수산화 지방산을 형성한 뒤 100 mM 시스테인(Cysteine) 처리하였을 때 8,15-이수산화 지방산 (8,15-DiHEPE, LTB5 analogue)인 류코트리엔 B5 유사체가 형성되는 것을 확인하였다. 또한 리폭신 A5 및 B5의 유사체를 합성하기 위하여 상기 제시된 반응 조건에서 1 mM 아라키돈산으로부터 15-리폭시게나아제 및 8-리폭시게나아제로부터 형성된 15-HPEPE 및 8-HPEPE를 기질로 하여 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제의 이단반응을 통해 얻어진 15-OH-8,9-Ep-HEPE 및 8-OH-14,15-Ep-HEPE를 생성하였고 형성된 에폭사이드는 에폭사이드 가수분해효소를 통해 가수분해하여 리폭신 유사체를 합성하였다. 그 결과 그 결과 [도 13]와 같은 합성경로를 구축하였다. 또한 생성된 리폭신 A5 및 B5 유사체는 HPLC를 이용하여 확인하였으며(도 14(a)~(b)), 물질동정의 경우 LC-MS/MS를 통해 확인하였으며 확인결과 리폭신 A4 및 B4 유사체와 류코트리엔 B5 유사체임을 확인하였다(도 15(a)~(c)).
상술한 바와 같이, 본 발명은 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 지질조절제(lipid mediator)로 작용할 수 있는 수산화 지방산, 류코트리엔 B4, B5 유사체 및 지금까지 보고되지 않은 리폭신 A4, B4, A5 및 B5 유사체를 생물전환법을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 아라키돈산과 에이코사펜타에노익산을 사용하고 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제와 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 형질전환 된 세포를 이용하여 특이적으로 8,15-이과수산화 지방산, 류코트리엔 유사체 및 리폭신 A4, B4, A5 및 B5 유사체를 생물전환법을 이용하여 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 기존에 보고되지 않은 지질 조절제의 생산과 생물전환법에 의한 특이적인 생산이 큰 의미를 가진다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 지방산 업계 및 약학계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및
    버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서,
    상기 이수산화지방산은 하기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000044
    ,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000045
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000046
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000047
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000048
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000049
    ,
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000050
    ,
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000051
    ,
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000052
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 불포화지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것이고,
    상기 기질 내 불포화지방산의 농도는 0.1 mM 내지 5 mM 인, 조성물.
  4. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제;
    버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 및
    믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 유효성분으로 포함하는 지질조절제의 제조용 조성물로서,
    상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 조성물:
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000053
    ,
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000054
    ,
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000055
    ,
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000056
    ,
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000057
    ,
    [화학식 15]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000058
    .
  5. 제4항에 있어서,
    상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진, 조성물.
  6. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및
    버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서,
    상기 이수산화지방산은 하기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000059
    ,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000060
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000061
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000062
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000063
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000064
    ,
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000065
    ,
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000066
    ,
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000067
    .
  7. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자;
    버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및
    믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 지질조절제의 제조용 조성물로서,
    상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 조성물:
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000068
    ,
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000069
    ,
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000070
    ,
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000071
    ,
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000072
    ,
    [화학식 15]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000073
    .
  8. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및
    버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 이수산화지방산을 제조하는 방법으로서,
    상기 이수산화지방산은 하기 화학식 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는, 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000074
    ,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000075
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000076
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000077
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000078
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000079
    ,
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000080
    ,
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000081
    ,
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000082
    .
  9. 제8항에 있어서,
    상기 처리는 pH 6.5 내지 7.5 범위 및 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 반응을 수행하는, 방법.
  10. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및
    버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 지질조절제를 제조하는 방법으로서,
    상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 방법:
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000083
    ,
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000084
    ,
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000085
    ,
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000086
    ,
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000087
    ,
    [화학식 15]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000088
    .
  11. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 지질조절제의 제조용 재조합 발현 벡터로서,
    상기 지질조절제는 하기 화학식 10 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 재조합 발현 벡터:
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000089
    ,
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000090
    ,
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000091
    ,
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000092
    ,
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000093
    ,
    [화학식 15]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000094
    .
  12. 숙주세포에 제11항에 따른 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질 전환체.
  13. 하기 화학식 2 내지 화학식 9 중 어느 하나로 표시되는, 신규 이수산화지방산:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000095
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000096
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000097
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000098
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000099
    ,
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000100
    ,
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000101
    ,
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000102
    .
  14. 하기 화학식 10 내지 화학식 21 중 어느 하나로 표시되는, 신규 지질조절제:
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000103
    ,
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000104
    ,
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000105
    ,
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000106
    ,
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000107
    ,
    [화학식 15]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000108
    ,
    [화학식 16]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000109
    ,
    [화학식 17]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000110
    ,
    [화학식 18]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000111
    ,
    [화학식 19]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000112
    ,
    [화학식 20]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000113
    ,
    [화학식 21]
    Figure PCTKR2019009660-appb-I000114
    .
PCT/KR2019/009660 2018-08-03 2019-08-02 리폭시게나아제 조합반응을 이용하여 이수산화지방산 또는 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법 WO2020027620A1 (ko)

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