WO2020153782A2 - 박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제에 의한 이수산화지방산의 생산 - Google Patents

박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제에 의한 이수산화지방산의 생산 Download PDF

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WO2020153782A2
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오덕근
이진
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건국대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention relates to a novel lipoxygenase derived from bacteria, a method for producing fatty acid dihydride using the same, and a composition for producing the same.
  • Fatty acid hydroxide is a substance that exists in nature, and is present in the lipids of various organisms such as animals, plants, insects, and microorganisms. Because it has a hydroxyl group, it has excellent reactivity and is used industrially as a raw material. Also, due to the action of the hydroxyl group, it is used as a raw material for cosmetics due to a decrease in surface tension and an increase in antifungal activity.
  • fatty acid hydroxide is used as a precursor for signal transduction in animals, and a single substance is involved in various physiological activities.
  • Lipid mediator a type of signal transduction substance, is an important substance involved in various physiological functions such as immune response and homeostasis control in animals including humans. Among them, 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-Eicosapentaenoic acid or resolbin D5 is mainly converted by lipoxygenase to act on polyunsaturated fatty acids.
  • 5,15-dihydroxy arachidonic acid is a biomarker that provides a more specific inflammatory response than the commonly known Leukotriene B4. It is known that it can reflect the intercellular signal transduction process and is produced more by biostimulation through 5-lipoxygenase (LOX) activation of blood cells in patients with asthma than healthy people. In addition, it inhibits the synthesis of leukotriene, which has toxicity in cells, and is present in leukocytes that have an immune system involved in body protection and acts as a substance to protect cells. It is known that the treatment of this substance has the ability to potentially reduce and relieve inflammation. It has the potential as a next-generation medical substance in place of chemically synthesized medicines with side effects, and can be used as a research material in a wide range of fields such as medicine, biology, and biotechnology, but a biological production method has not been developed.
  • LOX 5-lipoxygenase
  • 5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid (5,15-diHEPE) have been studied in recent years, but few have been identified.
  • 5,15-Eicosapentaenoic acid is a physiologically active substance produced by human macrophages and is known to relieve inflammation and promote tissue repair as exposed to pathogenic bacteria.
  • 5,15-Eicosapentaenoic acid has an anti-inflammatory reaction and autoimmunity, and is also involved in removing external invaders through activating phagocytosis of white blood cells against external invaders such as bacteria and viruses. In addition, it is derived from the acute inflammation relieving step, and confirmed strong anti-inflammatory and early inflammatory action.
  • resolbin D5 (resolvin D5; RvD5) is produced from the omega-3 unsaturated fatty acid docosahexaenoic acid (DHA).
  • DHA omega-3 unsaturated fatty acid docosahexaenoic acid
  • This substance regulates human infection to solve acute inflammation and increase phagocytosis.
  • resolvin D1, resolvin D5, and protectin D1 each of which is called Specialized pro-resolving mediators (SPMs) are directly phagocytosed.
  • resolbin D5 (resolvin D1) activates resolbin D1 (overlapping modulator).
  • Resolbin D1 resolbin D1
  • resolbin D1 promotes wound healing in a diabetic mouse model. Therefore, if such resolbin D5 is produced, it is expected to activate resolbin D1.
  • Resolbin D5 protects hypothermia and viability, improves the effectiveness of antibiotics to eliminate skin infections caused by S. aureus, a gram-negative bacterium, and decomposes antibiotics and mediators of bacteria to remove bacteria. Lowering and reducing antibiotic use offers new opportunities to address antibiotic resistance.
  • Lipoxygenase which synthesizes hydroxyl fatty acids, is a dioxygenase and is an oxidase, but is characterized by not having a heme, but instead an iron-containing enzyme. Characteristically, a polyunsaturated fatty acid having one or more cis, cis-1,4-pentadiene is used as a substrate to catalyze stereospecificity and reaction specificity through a dioxygenation reaction.
  • the known lipoxygenase of bacteria has only one site specificity with respect to the substrate, and thus contains only one hydroxyl group, and in the case of lipoxygenase having a dioxygenation function, in eukaryotes such as rabbits and soybeans It has been found, but no lipoxygenase having a bacterial-derived dioxygenation function has been reported.
  • Resolbin D5 was mainly produced using a chemical synthesis method (J. Org. Chem., 82 (4), (2017) pp 2032-2039).
  • the chemical synthesis method is a method of synthesizing using organic solvents, heavy metals such as tin and lead, and carcinogens that are highly toxic and harmful to the human body.
  • the chemical synthesis method causes contamination, and so far, resolbins, which have been known to date, have not reported a technique for producing a dual position-specific product by one lipoxygenase.
  • the present inventors have tried diligently to synthesize a fatty acid such as 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid or resolbin D5 in an eco-friendly method, resulting in a double position derived from bacteria.
  • a fatty acid such as 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid or resolbin D5 in an eco-friendly method, resulting in a double position derived from bacteria.
  • Discovering specific lipoxygenase and using it to build its synthetic pathway and at the same time produce 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid in an environmentally friendly manner without generating by-products from polyunsaturated fatty acids, or It was confirmed that the dihydroxy fatty acid such as Resolbin D5 was biosynthesized with high yield, and the present invention was completed.
  • the main object of the present invention is to provide a dual position-specific lipoxygenase gene, protein, recombinant vector and transformant that converts unsaturated fatty acids to dihydroxy fatty acids.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a fatty acid and a composition for its production by a biotransformation process using the dual position-specific lipoxygenase or transformant.
  • the present invention provides a composition for the production of fatty acid diacids containing 5,15-lipoxygenase from Archangium violaceum or a gene encoding it as an active ingredient.
  • the dihydroxy fatty acid is 5,15-dihydroxy arachidonic acid, 5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid or resolbin D5 (resolvin D5) It may be.
  • the 5,15-lipoxygenase derived from Arcanium biorasium may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding 5,15-lipoxygenase derived from Arcanium biorasium may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the composition may further include an unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms as a substrate.
  • the unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms may be arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, or docosahexaenoic acid.
  • the method may be to use an unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms as a substrate in a range of 1 mM to 5 mM.
  • the method may be to add cysteine at a concentration of 100 mM to 300 mM.
  • the method may be to perform the reaction in the range of pH 7.5 to 9.5.
  • the method may be to perform the reaction in the temperature range of 20 °C to 35 °C.
  • a recombinant vector comprising a 5,15-lipoxygenase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is provided.
  • a transformant transformed with the recombinant vector is provided.
  • a lipoxygenase gene consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is provided.
  • a lipoxygenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is provided.
  • 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid, or dihydroxy fatty acid, such as resolbin D5 can be produced with high productivity and high yield in an environmentally friendly manner not reported to date. Since it can be manufactured, it can be usefully used in various industries such as medicine, food and cosmetics.
  • Dihydroxydiacids such as 5,15-dihydroxyhydride arachidonic acid, 5,15-dihydroeicosapentaenoic acid, or resolbin D5 are signal transduction agents, and various physiological activities in animals, including humans. It is expected to be involved in function.
  • FIG. 1 shows a synthetic route of 5,15-dihydroxyarachidonic acid produced upon treatment of arachidonic acid with a lipoxygenase derived from Archangium violaceum .
  • Figure 2 is an HPLC chromatogram confirming the production of 5,15-arakidonic acid dihydride.
  • Figure 3 is a diagram proceeding the material identification of 5,15-arachidonic acid using LC-MS/MS.
  • Figure 4 is a graph confirming the amount of 5,15-dihydroxyarachidonic acid generated over time when all cells containing lipoxygenase from Archangium violaceum are treated with arachidonic acid : Arachidonic acid, ⁇ : 5,15-dihydric arachidonic acid, ⁇ : 5-hydroxyhydric arachidonic acid).
  • Figure 5 shows the effect of changes in the concentration of cysteine on the production activity of 5,15-dihydroxyarachidonic acid when arachidonic acid is treated with all cells containing lipoxygenase from Archangium violaceum It is a graph.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of changes in the concentration of all cells containing Arpoxium violaceum- derived lipogenase on the production concentration of 5,15-arachidonic acid.
  • FIG. 7 shows the effect of changes in the concentration of arachidonic acid on the production concentration of 5,15-arachidonic acid when arachidonic acid was treated with arachidonic acid for all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum . It is a graph showing.
  • FIG. 8 shows a synthetic pathway of 5,15-dihydroeicosapentaenoic acid generated when treatment with lipoxygenase from Archangium violaceum on eicosapentaenoic acid.
  • Figure 9 is an HPLC chromatogram confirming the production of 5,15-eicosapentaenoic acid dihydrate.
  • 10 is a diagram showing the progress of mass identification of 5,15-eicosapentaenoic acid using LC-MS/MS.
  • FIG. 11 shows the amount of 5,15- dihydro-eicosapentaenoic acid generated over time when all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum are treated with eicosapentaenoic acid. It is a graph confirming ( ⁇ : eicosapentaenoic acid, ⁇ : 5,15-eicosapentaenoic acid dioxide, ⁇ : 5-eicosapentaenoic acid hydroxide).
  • FIG. 12 shows that when eicosapentaenoic acid is treated with all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum , the concentration of cysteine changes to 5,15-eicosapentaenoic acid. It is a graph showing the effect on activity.
  • FIG. 13 shows that when eicosapentaenoic acid is treated with all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum , the concentration change of eicosapentaenoic acid is 5,15-Eicosa Dihydrate It is a graph showing the effect on the concentration of pentaenoic acid produced.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of changes in concentration of whole cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum on the production concentration of 5,15-eicosapentaenoic acid.
  • FIG. 15 shows a synthetic route of resolbin D5 generated when treating a lipoxygenase derived from Archangium violaceum with docosahexaenoic acid.
  • 17 is a view proceeding the mass identification of Resolbin D5 using LC-MS/MS.
  • FIG. 18 is a graph confirming the amount of resolbin D5 generated by time when all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum are treated with docosahexaenoic acid ( ⁇ : Doco Sahexaenoic acid, ⁇ : Resolbin D5, ⁇ : 5-hydroxydocosahexaenoic acid).
  • 19 is a graph showing the effect of changes in cysteine concentration on resolbin D5 production activity when all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum are treated with docosahexaenoic acid .
  • FIG. 20 shows the effect of pH change and buffer type on the production activity of resolbin D5 when all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum are treated with docosahexaenoic acid. It is the graph shown.
  • FIG. 21 shows the effect of temperature changes of docosahexaenoic acid on the production activity of resolbin D5 when all cells containing lipoxygenase derived from Archangium violaceum are treated with docosahexaenoic acid. It is a graph showing the impact.
  • the present inventors have conducted continuous research to more effectively produce 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid, or dihydroxy fatty acid such as resolbin D5 through a bioconversion process. Specifically, the present inventors cloned a lipoxygenase derived from Arcanium violaceum to produce a recombinant expression vector and a microorganism transformed therefrom, and produced whole cells using the same, followed by By treating the substrate with an environmentally friendly bioconversion method, it is possible to produce fatty acids such as 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid, or resolbin D5 with high productivity and high yield. It confirmed, and completed this invention.
  • the present invention provides a lipoxidase fatty acid composition
  • a lipoxidase fatty acid composition comprising a lipoxygenase derived from Archangium violaceum or a gene encoding it as an active ingredient.
  • the fatty acid dihydrate is 5,15-dihydroxy arachidonic acid, 5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid (5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid) or resolbin D5 (resolvin D5).
  • 5,15-dihydroxyarachidonic acid is a compound represented by Formula 1 below, and the IUPAC name is 5,15-dihydroxyeicosa- 6E,8Z,11Z ,13E -tetraenoic acid).
  • 5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid is a compound represented by the following Chemical Formula 2, and the IUPAC name is 5,15-dihydroxy- 6E,8Z, 11Z,13E,17Z -eicosapentaenoic acid).
  • Resolbin D5 (Resolbin D5; RvD5) is a compound represented by the following Chemical Formula 3, and the IUPAC name is 7,17 -dihydroxydocosa- 5Z,8E,10Z,13Z,15E, 19Z-docosahexaenoic acid).
  • the diacid fatty acids can be used as research materials in various disciplines such as medicine, biology, and biotechnology, but a biological production method has not been developed.
  • 5,15-lipoxygenase is a site-specific enzyme, such as arachidonic acid or eicosapentaenoic acid, having a hydroxyl group only at carbon positions 5 and 15 in an unsaturated fatty acid having 20 or more carbon atoms. Can form, and can form hydroxyl groups only at positions 7 and 17 in docosahexaenoic acid.
  • the substrate is treated with a dual position-specific enzyme, it undergoes a double-dioxide process, forms 15-araxydonic acid from arachidonic acid, and then forms a hydroxyl group at carbon number 5 to form 5,15-dihydroxyarachidonic acid.
  • the 5,15-lipoxygenase of the present invention is a lipoxygenase derived from Archangium violaceum , to date, a dual position-specific lipoxygenase has been found in eukaryotic organisms such as rabbits and soybeans. However, a dual site-specific lipoxygenase derived from bacteria has not been found.
  • the lipoxygenase derived from the Archangium violaceum is not only composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Functional equivalents thereof, ie, mutant enzymes capable of achieving the desired effect of the present invention by one or more substitutions, deletions, additions, etc. to the sequence are included in the scope of the present invention.
  • the lipoxygenase derived from the Arcanium biorasium may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the composition is an unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms as a substrate, in particular, at least one cis, cis-1,4 pentadiene having an unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms, preferably May further include arachidonic acid (AA), eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid (DHA).
  • AA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the present invention provides a method of producing fatty acid dihydrogenation by bioconversion by treating a 5,15-lipoxygenase from Archangium violaceum on a substrate.
  • the lipoxygenase derived from the Archangium violaceum consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is viewed as one or more substitutions, deletions, additions, etc. to the sequence. All mutant enzymes capable of achieving the desired effect of the present invention are included in the scope of the present invention.
  • the lipoxygenase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the method is an unsaturated fatty acid having 20 to 22 carbon atoms as a substrate, in particular, an unsaturated fatty acid having at least one cis, cis-1,4 pentadiene and having 20 to 22 carbon atoms, preferably Arachidonic acid (AA), eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid (docosahexaenoic acid, DHA) may be used, and the substrate is used at a concentration of 1 mM to 5 mM. It is preferable in terms of improving the production concentration of dihydroxy fatty acid, but is not limited thereto.
  • AA Arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the method may further improve cysteine as a reducing agent, thereby improving the production yield of fatty acid dihydrate by reducing epoxide to dioxide.
  • cysteine when using arachidonic acid as a substrate, treatment with the cysteine at a concentration of 100 mM to 300 mM is 5,15-arachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid or le It is preferable in terms of improving the production concentration of diacid fatty acids, such as Zolbin D5, but is not limited thereto.
  • the method is carried out in a pH range of 7.5 to 9.5, and an EPPS buffer solution may be used as a reaction solvent to maintain the pH condition.
  • the enzymatic reaction is carried out at a temperature of 15 °C to 35 °C range of 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-dihydrohydroxyexapentaenoic acid or the production concentration of dihydroxy fatty acid such as resolbin D5 It is preferable in terms of improvement, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding a lipoxygenase from Archangium violaceum .
  • the recombinant vector uses an expression vector for efficient expression of a gene encoding 5,15-lipoxygenase derived from the Arcanium biorasium.
  • expression vector is a recombinant vector capable of expressing a target peptide in a suitable host cell, and refers to a gene construct containing essential regulatory elements operatively linked to express a gene insert.
  • the expression vector of the present invention is an element generally contained in a suitable expression vector, and includes expression control elements such as a promoter, an operator, and an initiation codon.
  • the initiation codon and termination codon are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and must be in action and in frame with the coding sequence when the gene construct is administered.
  • the promoter of the vector can be constitutive or inducible.
  • the fusion polypeptide may include a signal sequence for the release of the fusion polypeptide in order to promote the separation of the protein from the cell culture.
  • Specific initiation signals may also be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences.
  • an exogenous translational control signal should be provided that may include an ATG initiation codon. These exogenous translational control signals and initiation codons can be a variety of natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by the introduction of suitable transcription or translation enhancing factors.
  • any conventional expression vector can be used.
  • plasmid DNA plasmid DNA, phage DNA, and the like can be used.
  • Specific examples of plasmid DNA include commercial plasmids such as pUC18 and pIDTSAMRT-AMP.
  • Other examples of plasmids that can be used in the present invention include E. coli-derived plasmids (pYG601BR322, pBR325, pUC118 and pUC119), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110 and pTP5) and yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50).
  • phage DNA examples include ⁇ -phages (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11 and ⁇ ZAP).
  • animal viruses such as retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, and insect viruses such as baculovirus can also be used. Since the expression vector and expression of the protein are different depending on the host cell, such an expression vector may be used by selecting the host cell that is most suitable for the purpose.
  • the gene encoding the 5,15-lipoxygenase was introduced into the plasmid vector pET 28(+) to produce a recombinant expression vector.
  • the present invention provides a transformant transformed with a recombinant vector comprising the 5,15-lipoxygenase gene.
  • the transformant of the present invention is obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a suitable host.
  • Types of host include Escherichia genus, Pseudomonas genus, Ralstonia genus, Alcaligenes genus, Comamonas genus, Burkholderia genus, Agrobacterium, Flavoacterium, Vibrio, Enterobacter, Rhizobium, Gluconobacter, Acinetobacter ), Moraxella, Nitrosomonas, Aeromonas, Paracoccus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus (Lactobacillus), Corynebacterium, Arthrobacter, Achromobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Streptococcus ) Genus, Streptomyces genus, Actinomyces genus, Nocardia genus, Methylobacterium genus and other bacteria.
  • yeasts such as the
  • the recombinant vector of the present invention is capable of autonomously replicating itself in a host, and at the same time, a DNA containing a promoter, a 5,15-lipoxygenase gene, and It is desirable to have a configuration necessary for expression such as transcription termination sequence.
  • the recombinant vector contains a fragment for expression suppression with various functions for suppressing or amplifying or inducing expression, a marker for selection of transformants, a gene resistant to antibiotics, or secretion from outside the cell. It is also possible to have another gene encoding a signal for the purpose.
  • the production of 5,15-lipoxygenase according to the present invention is, for example, by culturing a transformant obtained by transforming a host by a recombinant vector having a gene encoding it, and in a culture (cultured cell or culture supernatant). This is done by generating and accumulating 5,15-lipoxygenase, a gene product, and obtaining an enzyme from the culture.
  • the method for culturing the transformant of the present invention may be a conventional method used for culturing a host.
  • any method used for culturing ordinary microorganisms such as a batch type, a flow batch type, a continuous culture, and a reactor type, can be used.
  • a medium for transformants obtained by using bacteria such as E. coli as a host
  • a complete medium or a synthetic medium for example, LB medium, M9 medium, etc.
  • the culture temperature can be accumulated and recovered in 5,15-lipoxygenase by culturing in the above-mentioned range of red temperature.
  • the transformant was produced by transforming the plasmid vector pET 28(+) into which the 5,15-lipoxygenase gene of the present invention was introduced into E. coli ER 2566 strain.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising (1) lipoxygenase and a gene; (2) culturing the microorganism transformed with the recombinant vector; (3) Inducing the expression of a lipoxygenase gene, and (4) providing a method for producing the expressed recombinant protein and whole cells containing the same.
  • the whole cell containing the lipoxygenase is i) centrifuging the culture medium of the microorganism to recover the primary whole cell; ii) washing the recovered whole cells with a saline solution; iii) a second centrifugation of the washed whole cells to remove the supernatant and obtaining whole cells; And iv) washing the whole cells recovered with the second time with physiological saline.
  • the recovery of all cells in step i) may be performed in a range of about 13,000 g using a device known in the art such as a centrifuge, and the washing of all cells in step ii) with a sodium chloride solution of 0.9% or less It is suitable to perform.
  • the present invention is to produce a fatty acid such as 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicosapentaenoic acid or resolbin D5 using whole cells containing lipoxygenase. Provides a method.
  • a fatty acid as a substrate, and more preferably, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid is used.
  • the concentration of the substrate is preferably a concentration of 1 mM to 5 mM, and more preferably around 3 mM.
  • the enzymatic reaction is preferably performed in the range of pH 7.5 to pH 9.5, more preferably in the range of about pH 8.5.
  • an EPPS buffer solution can be used as a reaction solvent.
  • the enzymatic reaction is preferably carried out in a temperature range of 15°C to 35°C, more preferably in a temperature range of around 20°C. By maintaining these conditions, it is possible to improve the production activity of fatty acid dioxide.
  • the enzymatic reaction is preferably performed at a cysteine concentration of 100 mM to 300 mM, and more preferably, the cysteine concentration is preferably performed at a concentration range of about 200 mM.
  • the time of the whole cell reaction can be appropriately adjusted according to a conventional method.
  • the method is preferred to treat the concentration of cells with lipoxygenase, an enzyme that produces dihydroxy fatty acids from unsaturated fatty acids, in the range of 0.1 g/L to 1 g/L, but is not limited thereto. It is not.
  • the present invention provides a lipoxygenase gene consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence may be any nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, preferably may be made of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the gene is derived from Archangium violaceum .
  • the present invention provides a lipoxygenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the full-length cDNA of the lipoxygenase encodes a polypeptide of 681 amino acids.
  • the lipoxygenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention includes a variant, and the variant means a protein having a sequence having 90% or more homology to the lipoxygenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 do.
  • the 5,15-lipoxygenase derived from the Archangium violaceum of the present invention is 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-echo dihydrate without the production of byproducts using unsaturated fatty acids as a substrate.
  • Dihydrated fatty acids such as sapentaenoic acid or resolbin D5 can be produced in high yield.
  • the 5,15-lipoxygenase of the present invention produced 1.87 mM 5,15-arachidonic acid with 3 mM arachidonic acid as a substrate, and showed a conversion yield of 62.5% per hour. have.
  • the 5,15-lipoxygenase of the present invention produced 1.45 mM of 5,15-dihydro-eicosapentaenoic acid with 3 mM eicosapentaenoic acid as a substrate and 48.3 per hour. % Conversion yield.
  • the 5,15-lipoxygenase of the present invention produced 0.66 mM resolbin D5 using 3 mM docosahexaenoic acid as a substrate and exhibited a conversion yield of 22% per hour. .
  • 5,15-dioxidized arachidonic acid is used by using an Archangium violaceum- derived lipoxygenase. Because it can be produced in a high yield not to produce environmentally friendly methods and harmless by-products than substances obtained by high productivity and chemical synthesis using conventional heavy metals and organic solvents, such as acid or resolbin D5, medicine, food And it is expected to be useful in various industries such as cosmetics.
  • the dihydroxy fatty acids prepared according to the present invention are signaling agents, and various physiology in animals, including humans. It is expected to be involved in active function.
  • Arcanium violaceum ( Archangium violaceum ) derived from the present invention to prepare a lipoxygenase
  • a gene encoding lipoxygenase was first isolated from the gene of the Archangium violaceum strain, and a recombinant expression vector was constructed to overexpress it.
  • the gene base sequence and the amino acid sequence are already specified in the German Center for Biological Resources (Germany).
  • Archangium violaceum DSM 52838 was purchased and screened, and Arcanium biora was used to perform polymerase chain reaction (PCR) based on the DNA sequence of lipoxygenase derived therefrom.
  • the genomic DNA of Ariumium violaceum was extracted and used as a template for PCR, and primers based on the DNA sequencing of lipoxygenase were devised to perform polymerase chain reaction (PCR).
  • NdeI and SalI were used as restriction enzymes for each gene, and the cloning method used the Gibson assembly method, and the primers are as follows.
  • the primer sequence of the dual position-specific 5, 15-lipoxygenase from Archangium violaceum is F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG ATG CGT TCC ATT CCC TCC CTG CCC CAG AAT ( SEQ ID NO: 3), R: ATT CTG GGG CAG GGA GGG AAT GGA ACG CAT CAT ATG GCT GCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT (SEQ ID NO: 4).
  • a vector was prepared using PCR, and then ligated using an isothermal buffer to produce recombinant 5, 15-lipoxygenase.
  • the recombinant expression vector obtained as described above was transformed into E. coli ER 2566 strain purchased from New England Biolabs (Hertfordshire, UK) by a conventional transformation method, and the transformed microorganisms were treated with 20% glycerin solution. After addition, the cells were cultured for the production of 5,15-dihydroxydiacid and stored frozen at -80°C before use.
  • Example 1 For protein expression of enzymes, the transformed microorganisms stored frozen in Example 1 were aspirated at 200 rev/min in a flask with 500 ml of LB (Difco, Sparks, MD, USA) medium and 20 ⁇ g/ml of kanamycin. Cultured at 37 °C under conditions. When the absorbance of bacteria reached 0.6 to 0.8 at 600 nm, a final concentration of 0.1 mM IPTG was added to induce protein expression of enzymes, and the culture was incubated with stirring at 150 rev/min at 16° C. for 16 hours. .
  • E. coli cells containing cultured 5, 15-lipoxygenase were collected and used.
  • the lipoxygenase produced by over-expressing as described above was centrifuged at 6,000 xg for 30 minutes at 4° C., and washed twice with 0.85% sodium chloride (NaCl), followed by 5,15-. It was used as a recombinant cell for producing dihydroxy fatty acid.
  • Arachidonic acid was used as a substrate to construct a synthetic route of 5,15-dihydroxyarachidonic acid using the 5,15-lipoxygenase.
  • 5,15-dihydroxyarachidonic acid 0.5 g/L of all cells containing lipoxygenase was used for 3 mM of arachidonic acid, and the whole cell was reacted for 30 minutes at a cysteine concentration of 200 mM, pH 8.5, and 20°C for 30 minutes (whole cell reaction).
  • the amount of 5,15-dihydroxyarachidonic acid produced by a 5,15-lipoxygenase enzyme in a single reaction was confirmed in the reactant containing cysteine by the recombinant E. coli expressing the 5,15-lipoxygenase.
  • 200 mM cysteine was added to 3 mM arachidonic acid at the beginning of the reaction, and the whole cell reaction was performed at pH 8.5 and the temperature at 20° C. for 30 minutes, followed by the production of 5,15-dihydroxyarachidonic acid over time. Concentration was measured.
  • the addition of cysteine as shown in FIG. 5 has a higher activity of producing 5,15-dihydroxyarachidonic acid than when no cysteine was added. This is due to the fact that a large amount of hydroxyarachidonic acid, a primary product, is generated by the addition of cysteine and passes through the 5,15-dihydroxyarachidonic acid route of the present invention rather than the conventionally known route.
  • the optimal addition concentration of cysteine is 100 to 300 mM, preferably 200 mM.
  • the optimal concentration of all cells containing lipoxygenase was 0.1 to 0.7 g/L, preferably 0.5 g/L.
  • the optimal substrate concentration is 2 to 5 mM, preferably 3 mM.
  • Eicosapentaenoic acid was used as a substrate in order to construct a synthetic route of 5,15-dihydroxydiethylacosapentaenoic acid using the 5,15-lipoxygenase.
  • 5,15-dihydroeicosapentaenoic acid 0.5 g/L of whole cells containing lipoxygenase was used for 3 mM eicosapentaenoic acid, and cysteine concentration was 250 mM, pH 8.5, and 30 minutes at 20°C. During the whole cell reaction was performed.
  • cysteine was not added to 3 mM eicosapentaenoic acid, or it was added at the beginning of the reaction by varying the concentration in the range of 100 to 300 mM, and the reaction was performed at pH 8.5 and 20° C. for 30 minutes.
  • cysteine has a higher 5,15-eicosapentaenoic acid production activity than when no cysteine was added. This is due to the fact that a large amount of hydroxyeicosapentaenoic acid, a primary product, is generated by the addition of cysteine, and thus passes through a 5,15-dihydroeicosapentaenoic acid pathway, rather than the previously known hepoxylin pathway.
  • the optimal addition concentration of cysteine is 150 to 300 mM, preferably 250 mM.
  • the optimal substrate concentration is 2 to 5 mM, preferably 3 mM.
  • Docosahexaenoic acid was used as a substrate to construct the synthetic route of Resolbin D5 using the 5,15-lipoxygenase.
  • Resolbin D5 used 0.5 g/L of whole cells containing lipoxygenase against 3 mM docosahexaenoic acid, and reacted with whole cells for 30 minutes at a cysteine concentration of 200 mM, pH 8.5, and 20°C for 30 minutes. reaction).
  • the amount of resolbin D5 produced by the 5,15-lipoxygenase enzyme in a single reaction was confirmed in the reactant to which cysteine was added by the recombinant E. coli expressing the 5,15-lipoxygenase.
  • As a substrate 200 mM cysteine was added to 3 mM docosahexaenoic acid at the beginning of the reaction, and the whole cell reaction was performed at pH 8.5 and the temperature at 20°C for 30 minutes, and the production concentration of resolbin D5 was hourly. It was measured.
  • cysteine was not added to docosahexaenoic acid, or it was added at the beginning of the reaction by varying the concentration in the range of 100 to 300 mM, and the reaction was performed at pH 8.5 and 20°C for 30 minutes.
  • resolbin D5 production activity was higher than when cysteine was not added. This is due to the fact that a large amount of hydroxydocosahexaenoic acid, a primary product, is generated by the addition of cysteine and passes through the resolbin D5 pathway of the present invention rather than the conventionally known pathway.
  • the optimal addition concentration of cysteine was confirmed to be 100 to 300 mM, and preferably, when the cysteine concentration was 200 mM, it was confirmed that 0.66 mM resolbin D5 was generated.
  • the optimum pH was 7.5 to 8.5, preferably 8.5, and it was confirmed that the use of EPPS buffer was more effective for bioconversion activity.
  • the optimum temperature is 15 to 25°C, preferably 20°C, as shown in [Fig. 21].
  • the present invention uses a 5,15-lipoxygenase derived from Archangium violaceum to biodegrade fatty acids that can act as lipid mediators in animals, including humans. It is about the method of production by the conversion method. Specifically, the substrate is bioconverted using arachidonic acid, eicopentaenoic acid, or docosahexaenoic acid, and transformed cells containing 5,15-lipoxygenase from Archangium violaceum By using the method, it is possible to specifically produce 5,15-dihydroxyarachidonic acid, 5,15-eicopentaenoic acid or resolbin D5, thereby overcoming the problems of conventional chemical methods under environmentally friendly conditions. In addition, the production of lipid regulators not previously reported and specific production by bioconversion methods have great significance.

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Abstract

본 발명은 박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제, 이를 이용하여 이수산화지방산을 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 현재까지 보고되지 않은 친환경적인 방법으로 이수산화지방산을 높은 생산성과 높은 수율로 생합성할 수 있다. 본 발명에 의해 생산된 이수산화지방산은 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있으며, 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 체내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.

Description

박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제에 의한 이수산화지방산의 생산
본 발명은 박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제, 이를 이용하여 이수산화지방산을 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물에 관한 것이다.
수산화지방산은 자연계에 존재하는 물질로 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질에 존재하며 일반적으로 수산화기를 가지고 있는 자연계의 물질이다. 수산화기를 가지기 때문에 반응성이 뛰어나 산업적으로 원료물질로 사용되며, 또한 이 수산화기의 작용으로 표면장력의 감소, 항 곰팡이 활성의 증가로 화장품의 원료물질로 사용되기도 한다. 특히 동물에서 수산화지방산은 신호전달물질의 전구체로 이용되며, 단일 물질만으로도 다양한 생리활성에 관여한다. 신호전달물질의 한 종류인 지질 조절제(lipid mediator)는 인간을 포함한 동물 내에서 면역반응, 항상성 조절 등의 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질로서 그 물질들 중 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5는 주로 리폭시게나아제가 다가 불포화지방산에 작용하여 전환된다.
5,15-이수산화아라키돈산(5,15-dihydroxy arachidonic acid; 5,15-DiHETE)은 일반적으로 알려져 있는 류코트리엔 B4(Leukotriene B4) 보다 더 특이적인 염증반응상태를 알려주는 바이오마커(biomarker)로서 세포간 신호 전달 과정을 반영할 수 있고, 건강한 사람에 비해 천식환자의 경우 혈액세포의 5-리폭시게나아제 (lipoxygenase, LOX) 활성화를 통한 생체자극에 의해 더 많이 생성된다고 알려져 있다. 또, 세포 내에 독성을 가지는 류코트리엔의 합성을 억제하며, 신체보호에 관여하는 면역 시스템을 가지는 백혈구 속에 존재하여 세포를 지키기 위한 물질로서 작용한다. 이 물질을 처리하게 되면 염증을 잠재적으로 감소시키고 해소시키는 능력을 보유한 것으로 알려져 있다. 부작용을 동반하는 화학 합성된 의약품을 대신하여 차세대 의료물질로써의 가능성을 가지고 있으며, 의학, 생물학, 생명공학 등 폭넓은 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산방법이 개발되지 않았다.
또한, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산(5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid; 5,15-diHEPE)에 대한 기능적 실험은 최근 들어 연구가 되고 있으나 아직까지 밝혀진 부분은 많지 않다. 5,15-이수산화에이코사펜타엔산은 인간의 대식세포에서 만들어내는 생리활성물질로 병원성 균에 노출될수록 염증을 완화하고 조직복구를 촉진한다고 알려져 있다. 5,15-이수산화에이코사펜타엔산은 항염증 반응과 자가면역을 가져 세균 및 바이러스 같은 외부 침입원에 대하여 백혈구의 포식작용 활성화를 통한 외부 침입원 제거에도 관여한다. 또한, 급성염증의 해소단계에서 유래되며, 강력한 항염증 및 초기 염증 해소작용을 확인했다. 이 물질을 처리하게 되면 염증을 잠재적으로 감소시키고 해소시키는 능력을 보유한 것으로 알려져 있다. 부작용을 동반하는 화학 합성된 의약품을 대신하여 차세대 의료물질로써의 가능성을 가지고 있으며, 의학, 생물학, 생명공학 등 폭넓은 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산방법이 개발되지 않았다.
또한, 레졸빈 D5(resolvin D5; RvD5)는 오메가-3 불포화 지방산인 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)으로부터 생성된다. 이 물질은 급성 염증의 해소단계에서 유래되는 내인성 지질매개체로 여러 동물 모델에서 강력한 항염증 및 초기 염증 해소 작용을 확인했다. 이 물질은 인간의 감염을 조절하여 급성염증을 해결하고, 식균작용이 증가하게 한다. 인간의 호중구 및 대식세포에서 염증 해소 촉진 매개체 (Specialized pro-resolving mediators, SPMs)이라 불리는 레졸빈 D1(resolvin D1), 레졸빈 D5(resolvin D5), 프로텍틴 D1(protectin D1) 각각은 직접적으로 식균작용을 증강시키며, 특히 레졸빈 D5(resolvin D5)은 레졸빈 D1(resolvin D1)의 조절인자가 겹쳐 레졸빈 D1(resolvin D1)을 활성화시킨다. 레졸빈 D1의 경우 각각 소염작용과 수술 후 통증을 막을 수 있음을 확인할 수 있었다. 또, 레졸빈 D1의 경우 당뇨병 마우스 모델에서 상처치유를 촉진시킨다는 것이 보고되었다. 따라서 이러한 레졸빈 D5를 생산해 낸다면, 레졸빈 D1까지 활성화시킬 것으로 예상한다. 또한, 레졸빈 D5는 저체온증과 생존력을 보호하고 그람음성균인 포도상구균(S.aureus)으로부터 유발되는 피부감염을 제거하는데 항생제 효과를 향상시키며, 박테리아의 항생제와 매개체를 분해하여 박테리아 제거를 위해 항생제 용량을 낮추고, 항생제 사용을 줄임으로써 항생제 내성을 다루는 새로운 기회를 제공한다.
수산화지방산을 합성하는 리폭시게나아제(lipoxygenase, LOX)는 이산소화효소이며, 산화효소이지만 헴(heme)을 지니지 않는 것이 특징으로, 대신 철을 함유하는 효소이다. 특징적으로 하나 또는 다수 개의 시스, 시스-1,4-펜타디엔을 가지는 다가불포화지방산을 기질로 이용하여 이산소화 반응을 통해 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다.
지금까지 알려진 박테리아의 리폭시게나아제는 기질에 대해 하나의 위치특이성을 가지므로 하나의 수산기만 포함하고 있고, 다이옥시게네이션(dioxygenation) 기능을 갖는 리폭시게나아제의 경우, 토끼, 대두와 같은 진핵생물에서 발견된 바 있으나, 박테리아 유래 다이옥시게네이션(dioxygenation) 기능을 갖는 리폭시게나아제는 보고된 바 없다.
한편, 5,15-이수산화아라키돈산은 아직까지 생물학적 생산방법이 개발되지 않았으며, 화학적 합성방법을 이용하여 생산하였다(J. Am. Chem. Soc.,　106　(19), pp. 5734-5736 (1984)). 그러나, 화학적 합성방법은 유기용매와 주석, 납과 같은 중금속 및 독성이 강하고 인체에 해를 끼치는 발암물질을 이용하여 합성하는 방법으로 이러한 화학합성 과정에서 생산되는 오염물질 및 부산물은 자연에서 생분해 되지 않아 환경 오염을 야기한다는 점에서 한계가 있었다.
또한, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산은 아직까지 생물학적 생산방법이 개발되지 않았으며, 화학적 합성방법을 이용하여 생산 하였다(Biochwmca et Biophysics Acta 917 (1987) 398-405). 그러나, 화학적 합성방법은 유기용매와 주석, 납과 같은 중금속 및 독성이 강하고 인체에 해를 끼치는 발암물질을 이용하여 합성하는 방법으로 이러한 화학합성 과정에서 생산되는 오염물질 및 부산물은 자연에서 생분해 되지 않아 환경 오염을 야기한다는 점에서 한계가 있었다.
또한, 레졸빈 D5은 주로 화학적 합성방법을 이용하여 생산 하였다(J. Org. Chem., 82 (4), (2017) pp 2032-2039). 그러나 화학적 합성방법은 유기용매와 주석, 납과 같은 중금속 및 독성이 강하고 인체에 해를 끼치는 발암물질을 이용하여 합성하는 방법으로 이러한 화학합성 과정에서 생산되는 오염물질 및 부산물은 자연에서 생분해 되지 않아 환경 오염을 야기한다는 점에서 한계가 있으며, 현재까지 알려진 레졸빈류는 하나의 리폭시게나아제에 의해 이중 위치특이적 산물을 생산하는 기술을 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 친환경적인 방법으로 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 합성하고자 예의 노력한 결과, 박테리아 유래의 이중 위치특이적인 리폭시게나아제를 발견하고, 이를 이용하여 그 합성 경로를 구축함과 동시에 다가 불포화지방산으로부터 부산물의 생성 없이 친환경적으로 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산이 고수율로 생합성되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명의 주된 목적은 불포화지방산을 이수산화지방산으로 전환하는 이중 위치특이적인 리폭시게나아제 유전자, 단백질, 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이중 위치특이적인 리폭시게나아제 또는 형질전환체를 이용하여 생물전환 공정으로 이수산화지방산을 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 5,15-리폭시게나아제 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산 생산용 조성물을 제공한다.
상기 이수산화지방산은 5,15-이수산화 아라키돈산(5,15-dihydroxy arachidonic acid), 5,15-이수산화에이코사펜타엔산(5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid) 또는 레졸빈 D5(resolvin D5)인 것일 수 있다.
상기 아르캉기움 비오라시움 유래의 5,15-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 아르캉기움 비오라시움 유래의 5,15-리폭시게나아제를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 조성물은 기질로 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)인 것일 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 5,15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 이수산화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 기질로 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산을 1 mM 내지 5 mM 범위로 사용하는 것일 수 있다.
상기 방법은 100 mM 내지 300 mM 농도의 시스테인을 추가하는 것일 수 있다.
상기 방법은 반응을 pH 7.5 내지 9.5 범위에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법은 반응을 온도 20℃ 내지 35℃ 범위에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 5,15-리폭시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase) 유전자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase)를 제공한다.
본 발명에 따르면, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 리폭시게나아제 유전자, 단백질, 재조합 벡터 및 형질전환체를 이용하여 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 현재까지 보고되지 않은 친환경적인 방법으로 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산은 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
도 1은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 아라키돈산에 처리시 생성되는 5,15-이수산화아라키돈산의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 2은 5,15-이수산화아라키돈산의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 LC-MS/MS를 이용하여 5,15-이수산화아라키돈산의 물질동정을 진행한 도이다.
도 4는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 아라키돈산에 처리시, 시간 별 생성되는 5,15-이수산화아라키돈산의 양을 확인한 그래프이다(■: 아라키돈산, ○: 5,15-이수산화아라키돈산, △: 5-수산화아라키돈산).
도 5은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 아라키돈산에 처리시, 시스테인의 농도 변화가 5,15-이수산화아라키돈산 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포의 농도 변화가 5,15-이수산화아라키돈산의 생성 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 아라키돈산에 처리 시, 아라키돈산의 농도 변화가 5,15-이수산화아라키돈산의 생성 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 에이코사펜타엔산에 처리시 생성되는 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 9는 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 10은 LC-MS/MS를 이용하여 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 물질동정을 진행한 도이다.
도 11은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리 시, 시간 별 생성되는 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 양을 확인한 그래프이다(■: 에이코사펜타엔산, ●: 5,15-이수산화에이코사펜타엔산, ▼: 5-수산화에이코사펜타엔산).
도 12는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리시, 시스테인의 농도 변화가 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리 시, 에이코사펜타엔산의 농도 변화가 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 생성 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포의 농도 변화가 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 생성 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 도코사헥사엔산에 처리시 생성되는 레졸빈 D5의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 16은 레졸빈 D5의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 17은 LC-MS/MS를 이용하여 레졸빈 D5의 물질동정을 진행한 도이다.
도 18은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, 시간 별 생성되는 레졸빈 D5의 양을 확인한 그래프이다(■: 도코사헥사엔산, ●: 레졸빈 D5, ▼: 5-수산화도코사헥사엔산).
도 19는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, 시스테인의 농도 변화가 레졸빈 D5 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 20은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, pH 변화 및 버퍼의 종류가 레졸빈 D5의 생성 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 21은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리 시, 도코사헥사엔산의 온도 변화가 레졸빈 D5의 생성 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 제조하고자 지속적인 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 리폭시게나아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질 전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 친환경적인 생물전환방법으로 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 이수산화지방산은 5,15-이수산화아라키돈산(5,15-dihydroxy arachidonic acid), 5,15-이수산화에이코사펜타엔산(5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid) 또는 레졸빈 D5(resolvin D5)일 수 있다.
구체적으로, 5,15-이수산화아라키돈산(5,15-dihydroxy arachidonic acid; 5,15-diHETE)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로, IUPAC 명칭은 5,15-dihydroxyeicosa-6E,8Z,11Z,13E-tetraenoic acid)이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020001156-appb-I000001
또한, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산(5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid; 5,15-diHEPE)은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로, IUPAC 명칭은5,15-dihydroxy-6E,8Z,11Z,13E,17Z-eicosapentaenoic acid)이다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2020001156-appb-I000002
또한, 레졸빈 D5(레졸빈 D5; RvD5)은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로, IUPAC 명칭은 7,17-dihydroxydocosa-5Z,8E,10Z,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)이다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2020001156-appb-I000003
상기 이수산화지방산들은 상술한 바와 같이 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산 방법이 개발되어 있지 않다.
본 명세서에서 5,15-리폭시게나아제(5,15-lipoxygenase)는 위치특이적인 효소로, 아라키돈산 또는 에이코사펜타엔산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 5번과 15번 탄소 위치에만 수산기를 형성할 수 있고, 도코사헥사엔산에서 7번과 17번 탄소 위치에만 수산기를 형성할 수 있다. 또한, 이중 위치특이적인 효소로 이를 기질에 처리하면 이중이산화 과정을 거치며, 아라키돈산으로부터 15-수산화아라키돈산을 형성한 뒤 5번 탄소위치에 수산기를 형성하여 5,15-이수산화아라키돈산을 형성할 수 있고, 에이코사펜타엔산으로부터 15-수산화에이코사펜타엔산을 형성한 뒤 5번 탄소위치에 수산기를 형성하여 5,15-이수산화에이코사펜타엔산을 형성할 수 있으며, 도코사헥사엔산으로부터 17-수산화도코사헥사엔산을 형성한 뒤 7번 탄소위치에 수산기를 형성하여 레졸빈 D5을 형성할 수 있다. 본 발명의 상기 5,15-리폭시게나아제는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 리폭시게나아제로, 현재까지 토끼, 대두와 같은 진핵생물에서 이중 위치특이적인 리폭시게나아제가 발견된 바 있으나, 박테리아 유래 이중 위치특이적인 리폭시게나아제는 발견된 바 없다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라. 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 아르캉기움 비오라시움 유래의 리폭시게나아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 아라키돈산 (arachidonic acid, AA), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 더 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 5,15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 이수산화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 리폭시게나아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 방법은 기질로 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 아라키돈산 (arachidonic acid, AA), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 사용할 수 있고, 상기 기질은 1 mM 내지 5 mM 농도로 사용하는 것이 이수산화지방산의 생성농도를 향상시킨다는 측면에서 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 방법은 환원제로 시스테인(cysteine)을 추가로 처리하여, 에폭사이드(epoxide)를 이수산화지방산(dioxide)로 환원시킴으로써 이수산화지방산의 생산 수율을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 아라키돈산을 기질로 사용할 때 상기 시스테인은 100 mM 내지 300 mM 농도로 처리하는 것이 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산의 생산 농도를 향상시키는 측면에서 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 방법은 반응을 pH 7.5 내지 9.5 범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 EPPS 완충용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 효소반응은 온도 15℃ 내지 35℃ 범위에서 수행하는 것이 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산의 생산 농도를 향상시킨다는 측면에서 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 리폭시게나아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 아르캉기움 비오라시움 유래의 5,15-리폭시게나아제를 암호화하는 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시 코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다.
또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 다 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 이러한 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.
본 발명에서는 상기 5,15-리폭시게나아제를 암호화하는 유전자를 플라스미드 벡터 pET 28(+)에 도입하여 재조합 발현벡터를 제작하였다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 5,15-리폭시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.
예를 들면, 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명의 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 5,15-리폭시게나아제 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다.
세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J.Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등을 이용할 수 있다.
또, 재조합 벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.
본 발명에 관한 5,15-리폭시게나아제의 제조는 예를 들면 이것을 암호화하는 유전자를 가진 재조합 벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 5,15-리폭시게나아제를 생성 및 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 5,15-리폭시게나아제를 균체 내에 축적시키고, 회수할 수 있다.
본 발명에서는 상기 본 발명의 5,15-리폭시게나아제 유전자가 도입된 플라스미드 벡터 pET 28(+)를 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하여 형질전환체를 제작하였다.
다른 측면에서, 본 발명은 (1) 리폭시게나아제와 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고; (2) 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 미생물을 배양하고; (3) 리폭시게나아제 유전자의 발현을 유도하여 (4) 발현된 재조합 단백질과 이를 포함하는 전세포의 제조방법을 제공한다.
상기 리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 i) 상기 미생물의 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ii) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; iii) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 iv) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, i) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ii) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
다른 측면에서, 본 발명은 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 이용하여 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은이수산화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 리폭시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 효소 단백질 포함하는 균주를 회수하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 기질로서 지방산을 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 또는 도코사헥사엔산을 사용하는 것이 좋다. 또한, 상기 기질의 농도는 1 mM 내지 5 mM의 농도가 바람직하고 3 mM 내외가 더욱 바람직하다.
또한, 상기 효소 반응은 pH 7.5 내지 pH 9.5의 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 8.5 내외 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 EPPS 완충용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 효소 반응은 온도 15℃ 내지 35℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20℃ 내외의 온도 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 조건을 유지함으로써, 이수산화지방산 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 효소 반응은 시스테인 농도 100 mM 내지 300 mM 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 시스테인 농도는 200 mM 내외의 농도 범위에서 이루어지는 것이 좋다.
또한, 상기 전세포 반응의 시간을 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 방법은 불포화지방산으로부터 이수산화지방산을 생산하는 효소인 리폭시게나아제를 지닌 세포의 농도를 0.1 g/L 내지 1 g/L범위에서 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 다른 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase) 유전자를 제공한다.
본 발명에서, 상기 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 유전자는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)에서 유래한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase)를 제공한다. 상기 리폭시게나아제의 full-length cDNA는 681개 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리폭시게나아제는 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리폭시게나아제와 90% 이상의 상동성을 가지는 서열을 가지는 단백질을 의미한다.
본 발명의 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 5,15-리폭시게나아제는 불포화지방산을 기질로 하여 부산물의 생성 없이 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 고수율로 생산할 수 있다.
하기 실시예를 참고하면, 본 발명의 5,15-리폭시게나아제는 3 mM의 아라키돈산을 기질로 1.87 mM의 5,15-이수산화아라키돈산을 생산하여 시간 당 62.5 %의 전환 수율을 나타낸 바 있다. 또한, 하기 실시예를 참조하면, 본 발명의 5,15-리폭시게나아제는 3 mM의 에이코사펜타엔산을 기질로 1.45 mM의 5,15-이수산화에이코사펜타엔산을 생산하여 시간당 48.3 %의 전환 수율을 나타낸 바 있다. 또한, 하기 실시예를 참조하면, 본 발명의 5,15-리폭시게나아제는 3 mM의 도코사헥사엔산을 기질로 0.66 mM의 레졸빈 D5를 생산하여 시간당 22 %의 전환 수율을 나타낸 바 있다.
이는 기존에 알려진 버크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 리폭시게나아제의 효소활성과 비교하였을 때, 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 리폭시게나아제의 활성은 22.3 umol/min/mg인 반면, 아르캉기움 비오라시움 의 활성은 46.6 umol/min/mg으로 약 2배 높은 것을 확인 할 수 있었다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)유래 리폭시게나아제를 이용함으로써, 이용하여 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산을 높은 생산성과 기존 중금속과 유기용매를 이용한 화학합성으로 얻는 물질보다 친환경적인 방법과 위해성이 없는 부산물을 생산하지 않게 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따라 제조된, 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 또는 레졸빈 D5와 같은 이수산화지방산은 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 5,15-리폭시게나아제의 발현을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명의 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)유래 리폭시게나아제를 제조하기 위하여, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주의 유전자로부터 리폭시게나아제를 코딩하는 유전자를 먼저 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 독일생물자원센터(독일)에서 유전자 염기서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) DSM 52838 를 구입하여 선별하고, 이로부터 유래한 리폭시게나아제의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)의 genomic DNA를 추출하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 리폭시게나아제의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각 유전자들의 제한효소로 NdeI과 SalI을 이용하였으며 클로닝 방법은 Gibson assembly 방법을 이용하였고 프라이머는 다음과 같다. 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 이중 위치특이적인 5, 15-리폭시게나아제의 프라이머 서열은 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG ATG CGT TCC ATT CCC TCC CTG CCC CAG AAT (서열번호 3), R: ATT CTG GGG CAG GGA GGG AAT GGA ACG CAT CAT ATG GCT GCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT(서열번호 4)로 구성하였다. 또한, 각 유전자를 pET 28a에 클로닝하기 위하여 벡터를 PCR을 이용하여 준비한 후 isothermal buffer를 이용하여 라이게이션 하여 재조합 5, 15-리폭시게나아제를 제작하였다.
이후, 상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs (Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 형질전환 된 미생물들은 20% 글리세린(glycerin) 용액을 첨가하여 5,15-이수산화지방산의 생산을 위하여 배양한 뒤 사용 전에 -80 ℃에 냉동 보관하였다.
[실시예 2] 5,15-리폭시게나아제의 발현
효소들의 단백질 발현을 위하여, 실시예 1에서 냉동 보관시킨 형질전환 된 미생물들은 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6 내지 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16 ℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
배양된 5, 15-리폭시게나아제를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과 발현되어 생산된 리폭시게나아제는 상기 형질전환 된 균주의 배양액을 6,000 xg로 4 ℃에서 30분 동안 원심 분리하여 0.85 % 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 5,15-이수산화지방산을 생산하기 위한 재조합 세포로 사용하였다.
[실시예 3] 5,15-리폭시게나아제를 이용한, 아라키돈산으로부터 5,15-이수산화아라키돈산의 합성경로 구축
상기 5,15-리폭시게나아제를 이용하여 5,15-이수산화아라키돈산의 합성경로를 구축하기 위하여 아라키돈산(arachidonic acid)을 기질로 하였다. 5,15-이수산화아라키돈산은 3 mM의 아라키돈산에 대하여, 리폭시게나아제를 포함하는 전세포 0.5 g/L를 사용하였으며 시스테인 농도 200 mM, pH 8.5, 20 ℃에서 30 분 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 [도 1]과 같은 합성경로를 구축하였다. 또한 생성된 5,15-이수산화아라키돈산을 HPLC를 이용하여 확인하였으며(도 2), 물질동정을 통해 5,15-이수산화아라키돈산을 확인하였다(도 3).
[실시예 4] 5,15-리폭시게나아제 및 시스테인을 이용한 5,15-이수산화아라키돈산의 합성
상기 5,15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의해 시스테인이 첨가된 반응물에서 5,15-리폭시게나아제 효소가 단일반응으로 생산하는 5,15-이수산화아라키돈산의 양을 확인하였다. 기질로서 3 mM의 아라키돈산에 대하여 200 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5에서, 온도를 20 ℃에서 30분 동안 전 세포 반응을 실시하였고 5,15-이수산화아라키돈산의 시간 별 생산농도를 측정하였다.
그 결과, [도 4] 에 나타난 바와 같이, 5,15-리폭시게나아제의 단일 반응에 의해 3 mM의 아라키돈산을 기질로 약 1.87 mM의 5,15-이수산화아라키돈산을 생산하였고, 5,15-이수산화아라키돈산의 시간당 전환수율은 62.5 %인 것으로 나타났다.
[실시예 5] 5,15-리폭시게나아제를 이용한 5,15-이수산화아라키돈산에 대한 생물전환 활성의 최적 조건 확립
5-1. 시스테인의 농도 변화에 따른 5,15-이수산화아라키돈산에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 아라키돈산에 처리시, 시스테인의 농도 변화가 5,15-이수산화아라키돈산 생산 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3 mM의 아라키돈산에 대하여 시스테인을 첨가하지 않거나, 100 내지 300 mM의 범위로 농도를 달리하여 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5, 20℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 5]에 나타난 바와 같이 시스테인을 첨가하면 시스테인을 첨가하지 않은 경우 보다 5,15-이수산화아라키돈산 생산 활성이 높은 것을 확인하였다. 이는 시스테인 첨가에 의해 1차 산물인 하이드록시아라키돈산이 다량 생성되어 기존에 알려져 있는 경로가 아닌 본 발명의 5,15-이수산화아라키돈산 경로를 거치는 것에 기인한 것이다. 한편, 시스테인의 최적 첨가 농도가 100 내지 300 mM, 바람직하게는 200 mM 인 것을 확인하였다.
5-2. 리폭시게나아제의 농도 변화에 따른 5,15-이수산화아라키돈산에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 아라키돈산에 처리시, 효소의 농도 변화가 5,15-이수산화아라키돈산의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3 mM의 아라키돈산에 대하여, 0.1 내지 0.9 g/L 농도의 전세포, 200 mM 농도의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5, 20 ℃에서 30 분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 6]에 나타난 바와 같이, 리폭시게나아제를 포함하는 전세포의 최적 농도는 0.1 내지 0.7 g/L, 바람직하게는 0.5 g/L인 것을 확인하였다.
5-3. 아라키돈산의 농도 변화에 따른 5,15-이수산화아라키돈산에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 아라키돈산에 처리시, 아라키돈산의 농도 변화가 5,15-이수산화아라키돈산의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 1 내지 5 mM의 범위로 농도를 달리한 아라키돈산 및 200 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5, 20℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 7]에 나타난 바와 같이, 최적 기질 농도가 2 내지 5 mM, 바람직하게는 3 mM 인 것을 확인하였다.
[실시예 6] 5,15-리폭시게나아제를 이용한, 에이코사펜타엔산으로부터 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 합성경로 구축
상기 5,15-리폭시게나아제를 이용하여 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 합성경로를 구축하기 위하여 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)을 기질로 하였다. 5,15-이수산화에이코사펜타엔산은 3 mM의 에이코사펜타엔산에 대하여, 리폭시게나아제를 포함하는 전세포 0.5 g/L를 사용하였으며 시스테인 농도 250 mM, pH 8.5, 20 ℃에서 30 분 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 [도 8]과 같은 합성경로를 구축하였다. 또한 생성된 5,15-이수산화에이코사펜타엔산을 HPLC를 이용하여 확인하였으며(도 9), 물질동정을 통해 5,15-이수산화에이코사펜타엔산을 확인하였다(도 10).
[실시예 7] 5,15-리폭시게나아제 및 시스테인을 이용한 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 합성
상기 5,15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의해 시스테인이 첨가된 반응물에서 5,15-리폭시게나아제 효소가 단일반응으로 생산하는 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 양을 확인하였다. 기질로서 3 mM의 에이코사펜타엔산에 대하여 250 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5에서, 온도를 20 ℃에서 30분 동안 전 세포 반응을 실시하였고 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 시간 별 생산농도를 측정하였다.
그 결과, [도 11] 에 나타난 바와 같이, 5,15-리폭시게나아제의 단일 반응에 의해 3 mM의 에이코사펜타엔산을 기질로 약 1.45 mM의 5,15-이수산화에이코사펜타엔산을 생산하였고, 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 시간당 전환수율은 48.3 %인 것으로 나타났다.
[실시예 8] 5,15-리폭시게나아제를 이용한 5,15-이수산화에이코사펜타엔산에 대한 생물전환 활성의 최적 조건 확인
8-1. 시스테인의 농도 변화에 따른 5,15-이수산화에이코사펜타엔산에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리시, 시스테인의 농도 변화가 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 생산 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3 mM의 에이코사펜타엔산에 대하여 시스테인을 첨가하지 않거나, 100 내지 300 mM의 범위로 농도를 달리하여 반응 초반에 첨가하여, pH 8.5, 20 ℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 12]에 나타난 바와 같이 시스테인을 첨가하면 시스테인을 첨가하지 않은 경우 보다 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 생산 활성이 높은 것을 확인하였다. 이는 시스테인 첨가에 의해 1차 산물인 하이드록시에이코사펜타엔산이 다량 생성되어 기존에 알려져 있는 헤폭실린 경로가 아닌 5,15-이수산화에이코사펜타엔산 경로를 거치는 것에 기인한 것이다. 한편, 시스테인의 최적 첨가 농도는 150 내지 300 mM, 바람직하게는 250 mM 인 것을 확인하였다.
8-2. 에이코사펜타엔산의 농도 변화에 따른 5,15-이수산화에이코사펜타엔산에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리시, 에이코사펜타엔산의 농도 변화가 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 1 내지 5 mM의 범위로 농도를 달리한 에이코사펜타엔산 및 250 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5, 20℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 13]에 나타난 바와 같이, 최적 기질 농도는 2 내지 5 mM, 바람직하게는 3 mM 인 것을 확인하였다.
8-3. 리폭시게나아제의 농도 변화에 따른 5,15-이수산화에이코사펜타엔산에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리시, 효소의 농도 변화가 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3 mM의 에이코사펜타엔산에 대하여, 0.1 내지 0.9 g/L 농도의 전세포, 250 mM 농도의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5, 20 ℃에서 30 분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 14]에 나타난 바와 같이, 리폭시게나아제를 포함하는 전세포의 최적 농도는 0.1 내지 0.7 g/L, 바람직하게는 0.5 g/L인 것을 확인하였다.
[실시예 9] 5,15-리폭시게나아제를 이용한, 도코사헥사엔산으로부터 레졸빈 D5의 합성경로 구축
상기 5,15-리폭시게나아제를 이용하여 레졸빈 D5의 합성경로를 구축하기 위하여 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)을 기질로 하였다. 레졸빈 D5은 3 mM의 도코사헥사엔산에 대하여, 리폭시게나아제를 포함하는 전세포 0.5 g/L를 사용하였으며 시스테인 농도 200 mM, pH 8.5, 20 ℃에서 30 분 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 [도 15]과 같은 합성경로를 구축하였다. 또한 생성된 레졸빈 D5를 HPLC를 이용하여 확인하였으며(도 16), 물질동정을 통해 레졸빈 D5를 확인하였다(도 17).
[실시예 10] 5,15-리폭시게나아제 및 시스테인을 이용한 레졸빈 D5의 합성
상기 5,15-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의해 시스테인이 첨가된 반응물에서 5,15-리폭시게나아제 효소가 단일반응으로 생산하는 레졸빈 D5의 양을 확인하였다. 기질로서 3 mM의 도코사헥사엔산에 대하여 200 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5에서, 온도를 20 ℃에서 30분 동안 전 세포 반응을 실시하였고 레졸빈 D5의 시간 별 생산농도를 측정하였다.
그 결과, [도 18] 에 나타난 바와 같이, 5,15-리폭시게나아제의 단일 반응에 의해 3 mM의 도코사헥사엔산을 기질로 약 0.66 mM의 레졸빈 D5를 생산하였고, 레졸빈 D5의 시간당 전환수율은 22 %인 것으로 나타났다.
[실시예 11] 5,15-리폭시게나아제를 이용한 레졸빈 D5에 대한 생물전환 활성의 최적 조건 확립
11-1. 시스테인의 농도 변화에 따른 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, 시스테인의 농도 변화가 레졸빈 D5 생산 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 3 mM의 도코사헥사엔산에 대하여 시스테인을 첨가하지 않거나, 100 내지 300 mM의 범위로 농도를 달리하여 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5, 20 ℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 19]에 나타난 바와 같이 시스테인을 첨가하면 시스테인을 첨가하지 않은 경우 보다 레졸빈 D5 생산 활성이 높은 것을 확인하였다. 이는 시스테인 첨가에 의해 1차 산물인 하이드록시도코사헥사엔산이 다량 생성되어 기존에 알려져 있는 경로가 아닌 본 발명의 레졸빈 D5 경로를 거치는 것에 기인한 것이다. 한편, 시스테인의 최적 첨가 농도는 100 내지 300 mM인 것을 확인하였으며, 바람직하게는 시스테인 농도가 200 mM 일 때 0.66 mM의 레졸빈 D5가 생성됨을 확인하였다.
11-2. pH 변화에 따른 레졸빈 D5에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, pH 변화가 레졸빈 D5 생산 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3 mM의 도코사헥사엔산에 대하여 200 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, 버퍼로 50 mM의 EPPS 버퍼(pH 7.5-8.5) 또는 50 mM의 CHES 버퍼(pH 8.5-9.5)를 사용하여 20℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 20]에 나타난 바와 같이 최적 pH는 7.5 내지 8.5, 바람직하게 8.5이고, EPPS 버퍼를 사용하는 것이 생물전환 활성에 더욱 효과적인 것을 확인하였다.
11-3. 온도 변화에 따른 레졸빈 D5에 대한 생물전환 활성 확인
아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, 온도 변화가 레졸빈 D5 생산 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3 mM의 도코사헥사엔산에 대하여 200 mM의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5에서, 15 내지 35 ℃로 온도를 달리하여 30분 동안 각각 반응을 실시하였다.
그 결과, [도 21]에 나타난 바와 같이 최적 온도가 15 내지 25 ℃, 바람직하게는 20 ℃인 것을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)유래 5,15-리폭시게나아제를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 지질 매개체(lipid mediator)로 작용할 수 있는 이수산화지방산을 생물 전환법으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 아라키돈산, 에이코펜타엔산 또는 도코사헥사엔산을 사용하고 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 5,15-리폭시게나아제를 포함한 형질 전환된 세포를 이용하여 생물 전환법을 이용하여 특이적으로 5,15-이수산화아라키돈산, 5,15-이수산화에이코펜타엔산 또는 레졸빈 D5를 생산할 수 있으므로, 환경 친화적인 조건으로 종래 화학적인 방법의 문제점을 극복할 뿐만 아니라 기존에 보고되지 않은 지질 조절제의 생산과 생물 전환법에 의한 특이적인 생산이 큰 의미를 가진다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 지방산업계 및 의료계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 5,15-리폭시게나아제 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이수산화지방산은 5,15-이수산화아라키돈산(5,15-dihydroxy arachidonic acid), 5,15-이수산화에이코사펜타엔산(5,15-dihydroxyeicosapentaenoic acid) 또는 레졸빈 D5(resolvin D5)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아르캉기움 비오라시움 유래의 5,15-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 아르캉기움 비오라시움 유래의 5,15-리폭시게나아제를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 기질로 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래의 5,15-리폭시게나아제를 기질에 처리하여 생물 전환으로 이수산화지방산을 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 방법은 기질로 탄소수가 20개 내지 22개인 불포화 지방산을 1 mM 내지 5 mM 범위로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 방법은 100 mM 내지 300 mM 농도의 시스테인을 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 방법은 반응을 pH 7.5 내지 9.5 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 방법은 반응을 온도 20℃ 내지 35℃ 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 5,15-리폭시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제12항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase) 유전자.
  15. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase).
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