KR101934900B1 - 수산화지방산, 헤폭실린 b 또는 트리오실린 b 제조용 조성물 - Google Patents

수산화지방산, 헤폭실린 b 또는 트리오실린 b 제조용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 12-지방산화효소; 또는 상기 12-지방산화효소 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조용 조성물; 및 이를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조방법에 관한 것이다.

Description

수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조용 조성물{COMPOSITION FOR PRODUCING HYDROXYFATTY ACID, HEPOXILIN B OR TRIOXILIN B}
본 발명은 12-지방산화효소; 및 상기 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조용 조성물에 관한 것이다.
수산화지방산(hydroxyfatty acid)은 자연계에 존재하는 물질로서 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질 등에 존재하며, 왁스, 트리글리세롤, 세레브로시드 등에서도 발견된다. 일반적으로 수산화지방산은 수산화기를 가지기 때문에 다른 지방산과 달리 반응성이 좋아 산업적으로 왁스, 나일론, 레진, 그리고 플라스틱 등의 시작 물질로 사용되며, 또한 항곰팡이 활성을 가지고, 표면장력을 줄여주기 때문에 화장품의 원료로도 사용될 수 있다. 특히 동물에서의 수산화지방산은 다양한 생리활성에 관여하며, 지질 조절제 등의 인간 신호전달물질 전구체로 이용된다.
한편, 지질 조절물질(lipid mediator)은 인간을 포함한 동물 내에서 항상성 조절, 면역반응, 항염증 등 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질이다. 그 중에서도 헤폭실린(hepoxilin) 및 트리오실린(trioxilin)은 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소가 다가불포화지방산에 작용하여 전환되는 지질 조절물질로써, 현재까지는 동물에서만 발견되었다. 매우 극소량으로도 인체 내에서 인슐린 및 칼슘의 분비 조절과 지방산 대사, 항염증반응 및 면역기작 등 다양한 생리활성을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 다양한 활성을 통해 기존의 부작용을 동반하는 화학합성법으로 합성된 의약품을 대신하여 차세대 의료물질로써 가능성을 지니고 있다. 또한 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문에서 연구물질로써의 가치를 지닌다.
이때, 수산화지방산 및 헤폭실린을 합성하는 지방산화효소(lipoxygenase)는 이산소화 효소로써, 반응을 진행하기 위하여 철을 요구하며, 두 가지 반응을 모두 촉매하는 다기능 효소이다. 지방산화효소는 특이적으로 하나 또는 다수의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지는 다가불포화지방산의 이산소화 반응에서 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다. 그 중에서도 동물성 다가불포화지방산의 12번 위치에 수산기를 붙여주는 12-지방산화효소(12-lipoxygenase)의 경우, 비헴철 효소로써 660-710개의 아미노산으로 이루어져 있으며 특이적으로 12번 탄소 위치에만 수산기를 형성한다.
또한, 헤폭실린으로부터 생성되는 트리오실린은 에폭사이드 가수분해효소(epoxide hydrolase)에 의해 반응이 촉매되며, 반응에서 물을 요구한다. 현재까지 다양한 생물에서 이 효소의 존재가 확인되었으며, 특히 인간을 포함한 동물 내에서 에폭사이드 가수분해효소는 5종류가 존재한다. 그 중에서도 헤폭실린의 에폭사이드를 가수분해하는 효소는 인간에서만 보고가 되어져 있다.
현재까지 수산화지방산, 헤폭실린 및 트리오실린은 인간유래 12-지방산화효소(human 12-lipoxygenase) 및 인간유래 에폭사이드 가수분해효소(human epoxide hydrolase)를 이용하여 동물성 다가불포화지방산으로부터 생산을 확인하였다. 하지만 효소 정제수율이 매우 낮고 효소의 활성도 높지 않아 생물전환법을 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 및 트리오실린의 생산은 어려움이 있었다.
본 발명은 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 12-지방산화효소를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 조성물을 제공한다.
상기 12-지방산화효소는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주로부터 유래될 수 있다.
상기 수산화지방산은 12-수산화아라키돈산(12-hydroxyarachidonic acid), 12-과수산화아라키돈산(12-perhydroxyarachidonic acid), 12-수산화에이코사펜타엔산(12-hydroxyeicosapentaenoic acid), 12-과수산화에이코사펜타엔산(12-perhydroxyeicosapentaenoic acid), 14-수산화도코사헥사엔산(14-hydroxydocosahexaenoic acid) 및 14-과수산화도코사헥사엔산(14-perhydroxydocosahexaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 헤폭실린 B는 헤폭실린 B3(10-hydroxy-11,12-epoxy-5,8,14(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 헤폭실린 B4(10-hydroxy-11,12-epoxy-5,8,14,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid) 및 헤폭실린 B5(12-hydroxy-13,14-epoxy-4,7,10,16,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 12-지방산화효소를 포함하는 전세포의 농도는 3.0 g/l 내지 16.0 g/l일 수 있다.
상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 추가로 포함하고, 트리오실린 B를 추가로 제조하기 위한 것일 수 있다.
상기 트리오실린 B는 트리오실린 B3(10,11,12-trihydroxy-5,8,14(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 트리오실린 B4(10,11,12-trihydroxy-5,8,14,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid) 및 트리오실린 B5(12,13,14-trihydroxy-4,7,10,16,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 12-지방산화효소 및 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포의 농도는 3.0 g/l 내지 16.0 g/l일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 조성물을 제공한다.
서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 트리오실린 B를 추가로 제조하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조방법을 제공한다.
상기 기질은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하고, 상기 기질 내 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 10mM일 수 있다.
상기 처리는 pH 7.5~10.0 및 25~45℃ 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 트리오실린 B를 추가로 제조하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 숙주세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로, 하기 화학식 1로 표시되는 헤폭실린 B5를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017047844133-pat00001
.
본 발명의 다른 구현예로, 하기 화학식 2로 표시되는 트리오실린 B5 를 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112017047844133-pat00002
.
본 발명에 따르면, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 12-지방산화효소를 이용함으로써, 환경 친화적인 방법으로 수산화지방산 또는 헤폭실린 B를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
뿐만 아니라, 복합효소로서, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용함으로써, 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B는 지질 조절물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
도 1a는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소를 아라키돈산에 처리시, 12-수산화 아라키돈산 및 헤폭실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이고(● : 아라키돈산, ■: 12-과수산화 아라키돈산, ▲ : 12-수산화 아라키돈산, ◆ : 헤폭실린 B3), 도 1b는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소를 에이코사펜타에논산에 처리시, 12-수산화 에이코사펜타에논산 및 헤폭실린 B4의 시간별 생산농도를 나타낸 것이며(● : 에이코사펜타에논산, ■: 12-과수산화 에이코사펜타에논산, ▲ : 12-수산화 에이코사펜타에논산, ◆ : 헤폭실린 B4), 도 1c는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소를 도코사헥사에논산에 처리시, 14-수산화 도코사헥사에논산 및 헤폭실린 B5의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 도코사헥사에논산, ■: 14-과수산화 도코사헥사에논산, ▲ : 14-수산화 도코사헥사에논산, ◆ : 헤폭실린 B5).
도 2는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소를 포함한 전세포의 농도별로 아라키돈산에 처리시, 12-수산화 아라키돈산 및 헤폭실린 B3 생산농도를 나타낸 것이다 (●: 아라키돈산, ○: 헤폭실린 B3)
도 3은 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소를 포함한 전세포와 다양한 농도의 아라키돈산을 반응시, 12-수산화 아라키돈산 및 헤폭실린 B3 생산농도를 나타낸 것이다.
도 4는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소를 포함한 전세포에 고농도의 아라키돈산에 처리시, 12-수산화 아라키돈산 및 헤폭실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 아라키돈산, ■: 12-과수산화 아라키돈산, ◆ : 12-수산화 아라키돈산, ▲ : 헤폭실린 B3).
도 5a는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포에 아라키돈산를 처리시, 12-수산화 아라키돈산, 헤폭실린 B3 및 트리오실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이고(● : 아라키돈산, ■: 12-과수산화 아라키돈산, ▲ : 12-수산화 아라키돈산, ◆ : 헤폭실린 B3, ▼ : 트리오실린 B3), 도 5b는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 에이코사펜타에논산에 처리시, 12-수산화 에이코사펜타에논산, 헤폭실린 B4 및 트리오실린 B4의 시간별 생산농도를 나타낸 것이며(● : 아라키돈산, ■: 12-과수산화 에이코사펜타에논산, ▲ : 12-수산화 에이코사펜타에논산, ◆ : 헤폭실린 B4, ▼ : 트리오실린 B4), 도 5c는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 도코사헥사에논산에 처리시, 14-수산화 도코사헥사에논산, 헤폭실린 B5 및 트리오실린 B5의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 도코사헥사에논산, ■: 14-과수산화 도코사헥사에논산, ▲ : 14-수산화 도코사헥사에논산, ◆ : 헤폭실린 B5, ▼ : 트리오실린 B5).
도 6은 다양한 pH에서 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 아라키돈산에 처리시, 12-수산화 아라키돈산, 헤폭실린 B3 및 트리오실린 B3 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다(●: EPPS buffer, ○: CHES buffer).
도 7은 다양한 온도에서 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622 유래 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 아라키돈산에 처리시, 12-수산화 아라키돈산, 헤폭실린 B3 및 트리오실린 B3 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 12-수산화 지방산 또는 헤폭실린 B를 제조하고자, 미생물 유래 12-지방산화효소에 대한 지속적인 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 12-지방산화효소, 에폭사이드 가수분해효소, 또는 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 효소가 포함된 전세포를 각각 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 12-수산화 지방산 또는 헤폭실린 B(또는 트리오실린 B)을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본원 명세서 내 “수산화지방산”이라 함은 지방산에 1개의 수산화기 또는 과산화기가 치환된 것을 의미하는 것으로, 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 12 내지 14번째 탄소에 수산화기 또는 과산화기를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 수산화지방산은 12-수산화아라키돈산(12-hydroxyarachidonic acid), 12-과수산화아라키돈산(12-perhydroxyarachidonic acid), 12-수산화에이코사펜타엔산(12-hydroxyeicosapentaenoic acid), 12-과수산화에이코사펜타엔산(12-perhydroxyeicosapentaenoic acid), 14-수산화도코사헥사엔산(14-hydroxydocosahexaenoic acid) 및 14-과수산화도코사헥사엔산(14-perhydroxydocosahexaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서 내 “헤폭실린 B”라 함은 지방산에 1개의 에폭시드기 및 1개의 수산화기가 각각 치환된 것을 의미하는 것으로, 탄소수가 20개인 불포화 지방산의 경우, 11 및 12번째 탄소에 에폭시드기 및 10번째 탄소에 수산화기를 가지는 것이 바람직하고, 탄소수가 22개인 불포화 지방산의 경우, 13 및 14번째 탄소에 에폭시드기 및 12번째 탄소에 수산화기를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 헤폭실린 B는 헤폭실린 B3(10-hydroxy-11,12-epoxy-5,8,14(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 헤폭실린 B4(10-hydroxy-11,12-epoxy-5,8,14,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid) 및 헤폭실린 B5(12-hydroxy-13,14-epoxy-4,7,10,16,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 헤폭실린 B5는 신규 화합물로서, 하기 화학식 1로 표시된다:
[화학식 1]
Figure 112017047844133-pat00003
.
본원 명세서 내 “트리오실린 B”라 함은 지방산에 3개의 수산화기가 치환된 것을 의미하는 것으로, 헤폭실린 B의 에폭시드기가 가수분해하여 생성되는 것을 의미하는 것으로, 탄소수가 20인 불포화 지방산의 경우, 10 내지 12번째 탄소에 수산화기를 가지는 것이 바람직하고, 탄소수가 22인 불포화 지방산의 경우, 12 내지 14번째 탄소에 수산화기를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 트리오실린 B는 트리오실린 B3(10,11,12-trihydroxy-5,8,14(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 트리오실린 B4(10,11,12-trihydroxy-5,8,14,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid) 및 트리오실린 B5(12,13,14-trihydroxy-4,7,10,16,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 트리오실린 B5역시 신규 화합물로서, 하기 화학식2로 표시된다:
[화학식 2]
Figure 112017047844133-pat00004
.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 조성물을 제공한다.
또는, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 12-지방산화효소 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조용 조성물을 제공한다.
상기 12-지방산화효소는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 12-지방산화효소는 서열번호 3로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 또한, 상기 12-지방산화효소는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주의 최적 활성 온도는 25℃ 내지 45℃, 바람직하게 25℃ 내지 35℃이다.
또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소 역시 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 12-지방산화효소를 포함하는 전세포, 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포, 또는 상기 12-지방산화효소 및 상기 에폭사이드 가수분해효소를 모두 포함하는 전세포의 농도는 3.0 g/l 내지 16.0 g/l인 것이 바람직하고, 8.0 g/l 내지 16.0 g/l인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 전세포는 이러한 농도를 유지함으로써, 헤폭실린 B3의 생산농도 및 전환수율을 향상시킬 수 있다.
상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4-펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
상기 기질 내 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 10mM인 것이 바람직하고, 4mM 내지 8mM인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산은 이러한 농도를 유지함으로써, 헤폭실린 B3의 생산농도를 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 조성물을 제공한다.
또는, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조용 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또는, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
또한, 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 12-지방산화효소를 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 모두 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자와 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 동시에 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 재조합 발현 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 또는 pACYC duet 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환된 형질전환체로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 ER 2566 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 ⅰ) 상기 미생물의 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ⅱ) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; ⅲ) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 ⅳ) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, ⅰ) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ⅱ) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화지방산 또는 헤폭실린 B 제조방법을 제공한다.
또는, 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B 제조방법 은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 것으로, 상기 조성물의 구체적인 내용에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 기질은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4-펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함할 수 있다.
상기 기질 내 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 10mM인 것이 바람직하고, 4mM 내지 8mM인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산은 이러한 농도를 유지함으로써, 헤폭실린 B3의 생산농도를 향상시킬 수 있다.
상기 처리는 pH 7.5~10.0 및 25~45℃ 조건에서 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 8.0~9.0인 것이 바람직하고, pH 8.5인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 EPPS 완충용액 또는 CHES 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 25~35℃인 것이 바람직하고, 30℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조건을 유지함으로써, 12-수산화 아라키돈산, 헤폭실린 B3및 트리오실린 B3 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 12-지방산화효소를 이용함으로써, 환경친화적인 방법으로 수산화지방산 또는 헤폭실린 B를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
뿐만 아니라, 복합효소로서, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용함으로써, 수산화지방산, 헤폭실린 B 또는 트리오실린 B를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B는 지질 조절물질로서,인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현
(1) 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명에서는 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소를 발현하기 위하여, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주의 유전자로부터 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 한국미생물보존센터(서울)에서 아미노산 서열 및 염기 서열이 이미 특정되어 있는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622를 구입하여 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소 염기 서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)의 genomic DNA를 추출(Intron)하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소의 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 12-지방산화효소 염기서열의 프라이머는 제한효소로 EcoR I과 Not I을 이용하였고, F; GGA TTC ATG AGC GCG AGT GTG A와 R; GCG GCC GCT TAG ATA TTG ATG C로 구성하였다. 에폭사이드 가수분해효소 염기서열의 프라이머는 제한효소로 Nde I과 Hind III를 이용하였고, F; GCG CAT ATG GCT GAC ATC ACG CAT CGA AC와 R; GCT AAG CTT TCA GGC CGG CAG CTT CTT CA로 구성하였다. 또한, 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 하나의 벡터로 조합하기 위하여 조합 벡터(pACYC duet)에 대한 프라이머를 구성하였다. 12-지방산화효소의 경우, 제한효소로 EcoR I과 Hind III를 이용하였고, 에폭사이드 가수분해효소의 경우, 제한효소로 Nde I과 Xho I을 이용하였다. 각각 F; GAT CGA ATT CAT GAG CGC GAG TGT GAC CCG GA, R; GCC GCA AGC TTT TAG ATA TTG ATG CGG GAA CTG A와 F; GCG CAT ATG GCT GAC ATC ACG CAT CGA ACC GT, R; GCG CTC GAG TCA GGC CGG CAG CTT CTT CA로 구성하였다. 그런 다음, 재조합 플라스미드 벡터 pET 28a(+)(Novagen사 제품) 및 pACYC duet(Novagen사 제품) 또한 제한효소를 처리하여 준비하였으며, ligation하여 각각 pET 28(+)a/12-지방산화효소, pET 28(+)a/에폭사이드 가수분해효소 및 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 모두 포함하는 pACYC duet/12-지방산화효소/에폭사이드 가수분해효소를 제작하였다.
이후 이러한 재조합 발현 벡터들은 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs(Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하고, 형질전환된 미생물들은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 수산화지방산 및 헤폭실린 B의 제조를 위한 배양을 실시하기 전에 -70℃에 냉동 보관하였다.
(2) 12-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현 및 전세포 준비
효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관시킨 형질전환된 미생물들은 450 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신(클로람페니콜)을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후, 그 배양액을 18시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
이후 이러한 효소를 포함한 전세포를 확보하기 위해서, 형질전환된 균주들의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 수산화지방산 및 헤폭실린 B의 제조를 위한 전세포로 사용하였다.
실시예 2: 12-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 제조
본 발명에서는 12-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 제조를 확인하기 위하여, pH 8.5 및 30℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 12-지방산화효소를 포함한 전세포 14.4 g/ℓ를 함유한 50 mM EPPS 완충용액을 기질로서, 1 mM의 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산에 각각 처리하여, 수산화지방산 및 헤폭실린 B의 시간별 생산농도를 측정하였고, 그 결과는 도 1a~c에 나타내었다.
도 1a에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소를 아라키돈산에 처리한 경우, 0.31 mM 농도의 12-수산화아라키돈산, 0.68 mM 농도의 헤폭실린 B3를 생산하였고, 헤폭실린 B3의 최종 전환수율은 68%인 것으로 확인된다.
도 1b에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소를 에이코사펜타엔산에 처리한 경우, 0.38 mM 농도의 12-수산화에이코사펜타엔산, 0.61 mM 농도의 헤폭실린 B4를 생산하였고, 헤폭실린 B4의 최종 전환수율은 61%인 것으로 확인된다.
도 1c에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소를 도코사헥사엔산에 처리한 경우, 0.49 mM 농도의 14-수산화도코사헥사엔산, 0.50 mM 농도의 헤폭실린 B5를 생산하였고, 헤폭실린 B5의 최종 전환수율은 50%인 것으로 확인된다. 이때, 생상된 헤폭실린 B5은 신규 화합물로서, 그 구조를 확인하기 위하여 NMR로 측정하였고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
# 1H (δ) multiplet J (Hz) Protons 13C (δ)
1 174.2
2 2.20 t 6.93 2H 34.2
3 2.24 dt 6.93 2H 22.7
4 5.38 m 1H 128.9
5 5.39 m 1H 128.3
6 2.78 m 2H 25.2
7 5.32 m 1H 128.1
8 5.30 m 1H 129.7
9 2.78 m 2H 25.2
10 5.39 m 1H 129.6
11 5.35 m 1H 129.4
12 4.09 dd 5.95
8.34		 1H 67.1
13 2.72 dd 2.02
5.95		 1H 60.7
14 2.84 m 1H 54.8
15 2.32
2.21		 m
m		 1H
1H		 29.0
16 5.33 m 1H 124.0
17 5.43 m 1H 130.4
18 2.74 t 7.16 2H 25.2
19 5.27 m 1H 126.9
20 5.36 m 1H 131.6
21 2.02 dt 7.03
7.52		 2H 20.0
22 0.92 t 7.52 3H 14.1
따라서, 헤폭실린 B5는 하기 화학식 1로 표시된다:
[화학식 1]
Figure 112017047844133-pat00005
.
실시예 3: 12-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 제조시, 전세포의 최적 농도 확인
본 발명에서는 12-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 제조시, 전세포의 최적 농도를 확인하기 위하여, pH 8.5 및 30℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 12-지방산화효소의 전세포 0 g/ℓ ~14.4 g/ℓ를 함유한 50 mM EPPS 완충용액을 기질로서, 5 mM의 아라키돈산에 30분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 전세포의 농도가 14.4 g/ℓ인 경우, 헤폭실린 B3의 생산농도 및 전환수율이 최대인 것으로 확인된다.
실시예 4: 12 -지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 제조시, 기질 내 아라키돈산의 최적 농도 확인
본 발명에서는 12-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 제조시, 기질 내 아라키돈산의 최적 농도를 확인하기 위하여, pH 8.5 및 30℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 12-지방산화효소 전세포 14.4 g/ℓ를 함유한 50 mM EPPS 완충용액을 기질로서, 2 mM ~ 10 mM 의 아라키돈산에 30분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 기질 내 아라키돈산의 농도가 6 mM 인 경우, 헤폭실린 B3의 생산농도가 최대인 것으로 확인된다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소 전세포를 6 mM의 이라키돈산에 처리한 경우, 2.34 mM 농도의 12-수산화아라키돈산, 2.15 mM 농도의 헤폭실린 B3를 생산하였고, 헤폭실린 B3의 최종 전환수율은 35%인 것으로 확인된다. 즉, 12-지방산화효소를 6 mM의 이라키돈산에 처리한 경우, 12-지방산화효소를 1 mM의 이라키돈산에 처리한 경우에 비해, 헤폭실린 B3의 최종 전환수율은 약 2배 정도 낮지만, 헤폭실린 B3의 생산농도는 약 3배 이상 높은 것으로 확인된다.
실시예 5: 12 -지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B 제조
본 발명에서는 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B 제조를 확인하기 위하여, pH 8.5 및 30℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소 전세포 14.4 g/ℓ를 함유한 50 mM EPPS 완충용액을 기질로서, 1 mM의 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산에 각각 처리하여, 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B의 시간별 생산농도를 측정하였고, 그 결과는 도 5a~c에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이라키돈산에 처리한 경우, 0.23 mM 농도의 트리오실린 B3를 생산하였고, 이의 최종 전환수율은 23%인 것으로 확인된다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 에이코사펜타엔산에 처리한 경우, 0.19 mM 농도의 트리오실린 B4를 생산하였고, 이의 최종 전환수율은 19%인 것으로 확인된다.
도 5c에 나타난 바와 같이, 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 도코헥사엔산에 처리한 경우, 0.15 mM 농도의 트리오실린 B5를 생산하였고, 이의 최종 전환수율은 15%인 것으로 확인된다. 이때, 생성된 헤폭실린 B5은 신규 화합물로서, 그 구조를 확인하기 위하여 NMR로 측정하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
# 1H (δ) multiplet J (Hz) Protons 13C (δ)
1 174.3
2 2.21 t 6.45 2H 34.33
3 2.25 dt 6.45 2H 22.7
4 5.35 m 1H 128.7
5 5.33 m 1H 128.3
6 2.8 dd 2H 25.1
7 5.33 m 1H 128.0
8 5.33 m 1H 127.8
9 2.88
2.78		 m 1H
1H		 25.7
10 5.32 m 1H
11 5.53 m 1H 132.1
12 4.53 dd 8.89, 2.25 1H 65.6
13 3.04 dd 7.49, 2.25 1H 76.9
14 3.47 ddd 2.74, 7.49, 8.19 1H 70.4
15 2.38
2.06		 m 1H
1H		 31.0
16 5.50 m 1H 127.6
17 5.33 m 1H 128.3
18 2.75 dd 2H 25.3
19 2.29 m 1H 127.4
20 5.34 m 1H 131.3
21 2.03 dt 6.82, 7.53 2H 20.0
22 0.92 t 7.53 3H 14.1
따라서, 트리오실린 B5는 하기 화학식 2로 표시된다:
[화학식 2]
Figure 112017047844133-pat00006
.
실시예 6: 12 -지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B 제조시, 최적 pH 확인
본 발명에서는 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B 제조시, 최적 pH를 확인하기 위하여, 30℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소 전세포 14.4 g/ℓ를 함유한 50 mM EPPS 완충용액(pH 7.5-8.5) 또는 CHES 완충용액(pH 8.5-10.0)을 기질로서, 1 mM 의 아라키돈산에 15분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 최적 pH가 8.0 내지 9.0, 바람직하게 8.5인 것으로 확인된다.
실시예 7: 12 -지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B 제조시, 최적 온도 확인
본 발명에서는 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 및 트리오실린 B 제조시, 최적 온도를 확인하기 위하여, pH 8.5 및 25℃~45℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 12-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소 전세포 14.4 g/ℓ를 함유한 50 mM EPPS 완충용액을 기질로서, 1 mM 의 아라키돈산에 15분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 최적 온도가 25℃ 내지 35℃, 바람직하게 30℃인 것으로 확인된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING HYDROXYFATTY ACID, HEPOXILIN B OR TRIOXILIN B <130> 1062353 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 715 <212> PRT <213> Myxococcus xanthus <400> 1 Met Ser Ala Ser Val Thr Arg Arg Gly Gly Ala Asp Asp Arg Arg Trp 1 5 10 15 Asp Gly Arg Ala Arg Gly Met Gly Thr Gly Met Met Phe Ala Gly Leu 20 25 30 Arg Arg Trp Met Gly Ala Leu Gly Gly Lys Gly Arg Glu Ser Gly Ser 35 40 45 Asn Glu Val Leu Asp Ala Glu Glu Leu Ser Arg Trp Tyr Ser Gly Leu 50 55 60 Ala Leu Glu Glu Arg Leu Ala Ile Ser Arg Glu Leu Ala Pro Arg Val 65 70 75 80 Arg Ala Val Arg Pro Ala Arg Glu Pro Ser Thr Leu Pro Ala Val Ala 85 90 95 Val Gly Arg Leu Val Phe Glu Gln Asp Gly Pro Gln Gly Pro Ile Pro 100 105 110 Met His His Ile Lys Val Glu Leu Trp Asp Arg Asp Phe Gly Thr Pro 115 120 125 Asp Asp Phe Leu Gly Glu Gly Phe Thr Asp Ser Asp Gly Cys Phe Ser 130 135 140 Ile Arg Tyr Asp Pro Ala Asp Ala Gly Val Asn Asp Leu Pro Asp Leu 145 150 155 160 Glu Val Arg Phe Phe Glu Pro Gln His Ser Phe Arg Pro Asp Gly Arg 165 170 175 Val Val Glu Ala Trp Cys Arg Ile Gly Ser Glu Lys Gly Pro Asp Asp 180 185 190 His Gly Gly Leu His Tyr Asp Phe Gly Thr Leu Arg Leu Pro Tyr Trp 195 200 205 Glu Tyr Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Leu Leu Val Thr Glu Glu 210 215 220 Gly Thr Pro Pro Thr Ala Tyr Ala Pro Gly Arg Ala Leu Ala Met Leu 225 230 235 240 Lys Ala Val Ala Pro Ile Glu Leu Val Lys Arg Arg His Leu Leu Gln 245 250 255 Gly Arg Leu Gly Gln Ala Pro Ser Leu Asp Arg Ile Gln Ala Asp Tyr 260 265 270 Pro Glu Ala Met Thr Val Arg Met Glu Arg Glu Ser Pro Gly Ser Thr 275 280 285 Arg Thr Asp Ala Phe Phe Gly Glu Arg Leu Leu Asn Gly Met Phe Ser 290 295 300 Thr Leu Met Asp Gly Asp Pro Glu Ala Pro Gly Asp Pro Glu Ala Phe 305 310 315 320 Arg Leu Tyr Phe Pro Trp Asn Ala Tyr Glu Gln Asp Gly Val His Cys 325 330 335 Leu Pro Asp Val Asp Val Arg Leu Arg Leu Val Glu Gly Arg Leu Leu 340 345 350 Pro Val Arg Ile Ile Leu Gly Met Arg Glu Pro Gly Ala Thr Ala Pro 355 360 365 Gly Ser Pro Val Thr Arg Arg Ser Tyr Thr Pro Ala Asp Gly Glu Ala 370 375 380 Trp Glu Ala Ala Lys Arg Met Ala Arg Val Ser Ala Thr Leu Glu Thr 385 390 395 400 Glu Leu Gly Asn His Leu Gly Gln Cys His Phe Asn Val Glu Gln Tyr 405 410 415 Ala Ile Ala Ala His Arg Asn Leu Arg Arg Ser Pro Leu Arg Trp Leu 420 425 430 Leu Met Pro His Leu Arg Glu Val Val Leu Ile Asn His Ser Ala Asn 435 440 445 Gly Phe Leu Val Gly Pro Thr Gly Tyr Ile Thr Arg Ala Ser Ala Leu 450 455 460 Thr Glu Arg Ser Val Glu Thr Arg Leu Leu His Leu Met Gly Ser Tyr 465 470 475 480 Asp Trp Lys Gly Phe Ala Pro Ala Pro Pro Ile Cys Glu Ser His Arg 485 490 495 Tyr Ala Arg Ala Ala Gly Leu Phe Trp Arg Leu Val Gly Glu His Val 500 505 510 Asp Ala Phe Phe Ala Glu His Gly Ala Ala Leu Glu Ala Gln Trp Ser 515 520 525 Glu Val Arg Arg Phe Ser Asp Asp Leu Val Gly His Ser Ala Pro Ala 530 535 540 Phe Val Cys Arg Tyr Leu Arg Ala Thr Val Pro Gly Arg Ala Ala Pro 545 550 555 560 Trp Phe Val Arg Ser Glu Arg Met Asp Leu Asp Ala Lys Val Ala Ala 565 570 575 Thr His Ala Lys Ala Val Ser Ala Val Thr Arg Thr Asp Ala Pro Gln 580 585 590 Pro Gly Glu Met Glu Ala Leu Lys Gln Leu Cys Arg Tyr Val Ile Tyr 595 600 605 Phe Ala Thr Phe Arg His Ala Trp Ala Asn Asn Leu Gln Trp Asp Asp 610 615 620 Ala Gly Glu Val Leu Tyr Ala Cys Leu Gly Leu Arg Trp Gly Lys Ala 625 630 635 640 Gly Ala Leu Ser Thr Glu Ala Asp His Asp Val Ala Pro Pro Pro Glu 645 650 655 Glu Ala Thr Glu Met Leu Trp Ile Ser Trp Met Leu Ser Lys Thr Ser 660 665 670 Tyr Gly Phe Leu Leu Ala Asn Glu Glu Ala Asp Val His Pro Arg Phe 675 680 685 Val Glu Cys Leu Arg Ala His Ala Ala Glu Phe Ser Ala Leu Gly Met 690 695 700 Asp Ile Arg Thr Val Ser Ser Arg Ile Asn Ile 705 710 715 <210> 2 <211> 319 <212> PRT <213> Myxococcus xanthus <400> 2 Met Ala Asp Ile Thr His Arg Thr Val Lys Thr Asn Gly Ile Asn Leu 1 5 10 15 His Leu Ala Glu Ala Gly Ser Gly Pro Leu Val Leu Leu Leu His Gly 20 25 30 Trp Pro Glu Ser Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Leu Pro Ala Leu Ala 35 40 45 Ala Ala Gly Tyr His Ala Val Ala Pro Asp Val Arg Gly Tyr Gly Gln 50 55 60 Ser Asp Lys Pro Glu Ala Ile Glu Ala Tyr Ser Met Lys Gln Leu Val 65 70 75 80 Gly Asp Ala Val Gly Leu Leu Asp Ala Leu Gly Glu Arg Thr Ala Ile 85 90 95 Val Ile Gly His Asp Trp Gly Ser Ala Ile Ala Trp Asn Cys Ala Ala 100 105 110 Leu His Pro Asp Arg Phe Arg Ala Val Val Gly Met Ser Val Pro His 115 120 125 Leu Gly Arg Ala Pro Met Pro Pro Met Gln Leu Phe Gln Arg Met Phe 130 135 140 Gly Glu Lys Trp Phe Tyr Ile Leu Tyr Phe Gln Glu Pro Gly Val Ala 145 150 155 160 Glu Ala Glu Phe Glu Ala Asp Val Pro Arg Thr Val Arg Ala Ile Leu 165 170 175 Thr Gly Thr Pro Gly Phe Asp Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Ala Lys 180 185 190 Lys Lys Gly Glu Gly Phe Leu Ala Arg Leu Asp Val Pro Glu Thr Leu 195 200 205 Pro Gly Trp Leu Thr Glu Ala Asp Val Ala Tyr Phe Ala Lys Glu Leu 210 215 220 Ala Gly Ser Gly Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Met Asp 225 230 235 240 Arg Asp Trp His Glu Leu Pro Glu Leu Ala Thr Ala Val Ile Ser Gln 245 250 255 Pro Ala Leu Tyr Ile Val Gly Glu Lys Asp Pro Val Arg Ala Phe Ser 260 265 270 Pro Val Asp Pro Met Lys Ala Leu Val Pro Asn Leu Ala Asp Ile His 275 280 285 Val Ile Pro Gly Ala Gly His Trp Val Gln Gln Glu His Ala Ala Glu 290 295 300 Val Asn Ala Ala Leu Leu Ala Phe Leu Lys Lys Leu Pro Ala Glx 305 310 315 <210> 3 <211> 2148 <212> DNA <213> Myxococcus xanthus <400> 3 atgagcgcga gtgtgacccg gagaggtgga gctgatgaca gacgttggga cgggcgcgcc 60 cgcggcatgg ggacggggat gatgttcgca gggctgcgcc gatggatggg cgctctcggg 120 ggcaaaggac gcgagagcgg aagcaacgag gtgctcgacg cggaggagct gtcccggtgg 180 tactcggggc tcgcgctcga ggagcgtctg gccatcagcc gcgagctcgc accgcgcgtc 240 cgggctgtcc gtcccgcgag ggagcccagc acgctgccag ccgtcgcggt cgggcggttg 300 gtcttcgagc aggacgggcc ccagggcccc attcccatgc atcacatcaa ggtggagctg 360 tgggaccggg acttcggcac gccggatgac ttcctggggg aggggttcac ggactcggat 420 ggatgttttt ccattcgcta tgacccggcc gacgcgggcg tgaatgacct gcccgacctg 480 gaggtgcgct tcttcgagcc ccagcacagc ttccgcccgg atgggcgggt ggtggaggca 540 tggtgccgca tcggctctga gaaggggccg gatgaccatg gtgggctcca ctacgacttc 600 ggcacgctgc ggctgcctta ctgggagtac gaccccacga cgccgttggc ccggttgctt 660 gtcacggagg aggggactcc gcccacggcc tacgcgccgg ggcgcgcgct ggcgatgctg 720 aaggcggtgg cgcccatcga gctcgtcaag cgccgccacc tgctccaggg acggctggga 780 caggcgccga gcctggacag gattcaggcg gactatccgg aggcgatgac ggtgcggatg 840 gagcgcgagt cgccgggctc cacgcgcacc gacgccttct tcggagagcg gctgctcaac 900 ggcatgttct ccaccctcat ggatggcgac ccggaggctc ccggggaccc ggaggcgttc 960 cggctctact tcccgtggaa cgcttacgag caggacggcg tccactgcct gccggacgtg 1020 gacgtgcggc tgcggctggt ggaggggcgg ctgttgccgg tgcgcatcat cctgggcatg 1080 cgcgagccgg gcgcgacggc gccgggctct cccgtgacgc ggcggagcta cacgcccgcg 1140 gacggcgagg cctgggaggc cgccaagcgg atggcgcggg tgagcgcgac gctggagacg 1200 gagctgggca accacctggg gcagtgccac ttcaacgtgg agcagtacgc catcgccgcg 1260 caccgcaatc tgcgccgcag tccgctgcgc tggctgctca tgccgcacct gcgggaggtg 1320 gtcctcatca accactccgc caacggcttc ctcgtgggac ccaccggcta catcacccgc 1380 gccagcgcgc tcaccgagcg cagcgtggag acgcggctgt tgcacctgat gggcagctac 1440 gactggaagg gcttcgcgcc cgcgccgccc atctgcgagt cgcaccgcta cgcacgcgcg 1500 gcgggcctgt tctggcggct ggtaggggag cacgtggatg ccttcttcgc cgagcacggc 1560 gcggcgttgg aggcgcagtg gagcgaggtg cggcgcttct cggacgacct ggtggggcac 1620 tcggcgcccg ccttcgtgtg ccgctacctg cgcgcgacgg tgccgggaag ggcggcgccg 1680 tggttcgtgc gctccgagcg catggacctg gacgcgaagg tcgccgcgac ccacgccaag 1740 gccgtcagcg cggtgacccg gacggacgcg ccccagcccg gagagatgga ggcgctcaag 1800 cagttgtgcc ggtacgtcat ctacttcgcg acgttccgcc atgcctgggc caacaacctc 1860 caatgggacg acgcgggcga ggtgctctat gcgtgcctgg gcctgcgctg gggcaaggcg 1920 ggcgcgctgt cgacggaggc ggaccatgac gtcgcgccgc ctccggagga ggccacggag 1980 atgctgtgga tttcgtggat gctctcgaag acgagctacg gcttcctgct ggccaacgag 2040 gaggcggacg tgcatccccg cttcgtggag tgcctgcgcg cccacgccgc cgagttctcc 2100 gcgctgggga tggacatccg caccgtcagt tcccgcatca atatctaa 2148 <210> 4 <211> 957 <212> DNA <213> Myxococcus xanthus <400> 4 atggctgaca tcacgcatcg aaccgtaaag acgaatggca tcaacctgca cctcgcggag 60 gcgggttcag ggccgctcgt gttgctcctg catggttggc cggagtcctg gtactcgtgg 120 cgccatcagc ttccggcgtt ggcggcggcg gggtaccacg cggtggcccc agacgtccgt 180 ggctacggcc agagcgacaa gccggaggcc atcgaggcgt acagcatgaa gcagttggtg 240 ggtgatgcgg ttggcctgct ggatgcgctg ggggagagga cggccatcgt catcggccac 300 gactggggct cggcgattgc ctggaactgt gccgccctgc atcccgaccg cttccgcgcg 360 gtggtgggaa tgagcgttcc ccatctgggg cgcgcgccca tgccgcccat gcagttgttt 420 cagcgcatgt tcggtgagaa gtggttctac atcctctact tccaggagcc cggcgtggcc 480 gaggccgagt tcgaggcgga cgtcccgagg acggtccggg cgattctcac gggcaccccc 540 ggcttcgatg tgacgaatcc cgccgtgctg gcgaagaaga agggggaagg cttcctcgcg 600 aggctcgacg tacctgagac gttgcccggc tggctcaccg aggcggacgt cgcgtacttc 660 gcgaaggagc tcgccggcag tggattccgg ggcgggctca atcgctaccg caacatggac 720 cgggactggc acgaactgcc ggagctggcg acggcggtca tctcgcagcc ggccctctac 780 atcgtcggag agaaggaccc ggtgcgtgcc ttctctcccg ttgacccgat gaaggccctg 840 gtgccgaacc tggccgacat ccacgtcatt cccggcgcgg gtcattgggt tcagcaggag 900 cacgccgccg aggtgaatgc cgcgctgctg gccttcctga agaagctgcc ggcctga 957

Claims (19)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물로서,
    상기 수산화지방산은 14-수산화도코사헥사엔산(14-hydroxydocosahexaenoic acid) 또는 14-과수산화도코사헥사엔산(14-perhydroxydocosahexaenoic acid)이고,
    상기 헤폭실린 B5는 하기 화학식 1로 표시되며,
    상기 조성물은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것인 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112018077844317-pat00020
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 12-지방산화효소는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주로부터 유래된
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 12-지방산화효소를 포함하는 전세포의 농도는 3.0 g/l 내지 16.0 g/l인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 추가로 포함하고,
    하기 화학식 2로 표시되는 트리오실린 B5를 추가로 제조하기 위한 것인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112018077844317-pat00021
    .
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서,
    상기 12-지방산화효소 및 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포의 농도는 3.0 g/l 내지 16.0 g/l인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물.
  9. 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물로서,
    상기 수산화지방산은 14-수산화도코사헥사엔산(14-hydroxydocosahexaenoic acid) 또는 14-과수산화도코사헥사엔산(14-perhydroxydocosahexaenoic acid)이고,
    상기 헤폭실린 B5는 하기 화학식 1로 표시되며,
    상기 조성물은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것인 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112018077844317-pat00022
    .
  10. 제9항에 있어서,
    서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고,
    하기 화학식 2로 표시되는 트리오실린 B5를 추가로 제조하기 위한 것인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112018077844317-pat00023
    .
  11. 제1항 또는 제9항에 따른 조성물을 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하는 단계를 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    상기 기질 내 상기 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)의 농도는 1mM 내지 10mM인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 처리는 pH 7.5~10.0 및 25~45℃ 조건에서 수행되는 것인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조방법.
  15. 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 12-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 재조합 발현 벡터로서,
    상기 수산화지방산은 14-수산화도코사헥사엔산(14-hydroxydocosahexaenoic acid) 또는 14-과수산화도코사헥사엔산(14-perhydroxydocosahexaenoic acid)이고,
    상기 헤폭실린 B5는 하기 화학식 1로 표시되는 재조합 발현 벡터:
    [화학식 1]
    Figure 112018077844317-pat00024
    .
  16. 제15항에 있어서,
    서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고,
    하기 화학식 2로 표시되는 트리오실린 B5를 추가로 제조하기 위한 것인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B5 제조용 재조합 발현 벡터:
    [화학식 2]
    Figure 112018077844317-pat00025
    .
  17. 숙주세포에 제15항 또는 제16항에 따른 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체.
  18. 하기 화학식 1로 표시되는 헤폭실린 B5:
    [화학식 1]
    Figure 112017047844133-pat00007
    .
  19. 하기 화학식 2로 표시되는 트리오실린 B5:
    [화학식 2]
    Figure 112017047844133-pat00008
    .
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