KR20240094252A - 신규한 수산화 지방산의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지금까지 규명된 적 없는 수산화 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 산호 유래 8R-리폭시게나아제와 미생물 유래 15S-리폭시게나아제를 조합하여 지방산 기질로부터 신규한 수산화 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 친환경적인 방법으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10; 10-epi-PDX), 8R,15S-DiHEPA 및 10R,17S-DiHDPA를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있다. 상기 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10; 10-epi-PDX), 8R,15S-DiHEPA 및 10R,17S-DiHDPA는 의약품, 기능성 식품 및 기능성 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있으며 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 지금까지 규명된 적 없는 수산화 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 산호 유래 8R-리폭시게나아제와 미생물 유래 15S-리폭시게나아제를 조합하여 지방산 기질로부터 신규한 수산화 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
수산화 지방산은 일반적으로 지방산에 수산화기(hydroxyl group)를 가지고 있는 물질을 의미하며 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질에 존재하는 자연계의 물질이다. 특히, 수산화 지방산은 반응성이 뛰어나 산업적으로 원료물질로 사용되며, 수산화기의 작용으로 표면장력의 감소, 항균 및 항진균력 활성이 높아 화장품의 원료물질로 사용된다. 여러 생물체 중 동물에서 발견되는 수산화 지방산은 인체 내의 신호전달물질의 전구체로 이용되며, 단일 물질만으로도 다양한 생리활성에 관여한다. 인간 신호전달물질의 한 종류인 지질 조절제(lipid mediator) 중 프로텍틴은 도코사헥사엔산으로부터 리폭시게나아제에 의해 에폭사이드 중간체를 형성한 후 다시 리폭시게나아제 의해 전환되어 생성되거나 다른 위치특이성을 지닌 두 개의 리폭시게나아제를 조합하여 생성된다. 프로텍틴을 포함하는 지질 조절제는 인간을 포함한 포유류 내에서 항상성 조절, 면역반응 등 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질이다.
프로텍틴 중 가장 많이 알려진 프로텍틴 D1(protectin D1, PD1, 10R,17S-dihydroxy-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-docosahexaenoic acid)은 내인성 입체 선택성 지질 매개체로 오메가 지방산인 도코사헥사엔산으로부터 유래한 물질로 주로 망막, 폐 및 신경계와 같은 조직에서 발견되었다. 이 물질은 항염증제, 항암제 및 신경 보호제의 역할을 수행하는데 뇌졸중 환자 및 알츠하이머 병 동물 모델 연구 결과 이 물질 처리 시 산화 스트레스에 의한 염증을 잠재적으로 감소시키고 세포 사멸 유발을 억제함으로 세포 퇴행을 예방함을 확인하였다. 또한 인플루엔자 바이러스 복제능을 약화시킴으로 H5N1과 같은 조류 인플루엔자 바이러스의 감염능을 저해시키고 염증을 해소시키는 능력을 보유한 것으로 알려져 있다. 프로텍틴의 처리를 통해 숙주 세포에서 유해한 부작용을 일으킬 수 있는 숙주의 RNA에 유해한 점을 유도하지 않는다고 확인된 효능을 감안해서 바이러스 또는 세균성 염증에서의 강력한 항염 능력을 지닌 이 물질을 바이러스 감염에 대한 바이오마커 뿐만 아니라 새로운 항바이러스제로서의 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 한편, 프로텍틴은 수산기의 카이랄성(chirality)에 따라 10R,17S-이수산화 도코사헥사엔산의 경우 프로텍틴 D1(protectin D1, PD1, 10R,17S-dihydroxy-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-docosahexaenoic acid), 10S,17S-이수산화 도코사헥사엔산의 경우 프로텍틴 DX(protectin DX, PDX, 10S,17S-dihydroxy-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)으로 일컫는다. PDX 또한 PD1과 마찬가지로 항염능을 지닌 물질로서 염증 마우스 모델에서 순환되는 백혈구가 복막으로 유입되는 것을 억제한다. 또한 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)를 억제하여 프로스타글란딘(prostaglandin)의 형성을 억제하고 혈소판의 집적 반응을 차단하는 역할을 수행한다. 프로텍틴은 부작용을 동반하는 화학 합성된 의약품을 대신하여 차세대 의료물질로써 가능성을 지니고 있으며, 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구 물질로 사용될 수 있다.
리폭시게나아제(lipoxygenase, LOX)는 이산소화(dioxygenating) 효소이며, 산화지방산을 합성하는 반응을 촉매한다. 산화효소이지만 헴(heme)을 지니지 않는 것이 특징으로, 대신 철을 함유한 효소이다. 특징적으로 하나 또는 다수의 시스, 시스 1,4-펜타디엔을 가지는 다가불포화지방산을 기질로 이용하여 이산소화 반응을 통해 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다. 기질로 사용되는 다가불포화지방산의 종류에 따라 위치특이성이 다른데, 그 중에서도 동물성 다가불포화지방산의 아리키돈산의 8번 위치에 R-형태 수산기를 생성하는 아라키돈산 8R-리폭시게나아제(이하, 8R-리폭시게나아제로 명명)의 경우, 특이적으로 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 8번 탄소 위치에만 R-형태 수산기를 형성한다. 또한, 이 효소는 탄소수 22개 이상의 불포화지방산에서는 10번 탄소 위치에 R-형태 수산기를 형성한다. 8R-리폭시게나아제의 경우, 해양생물인 산호(coral)류에서 존재가 보고되어 있다. 프로텍틴 생합성에 이용하고자 하는 추가적인 효소로 아라키돈산 15S-리폭시게나아제(이하, 15S-리폭시게나아제로 명명)의 경우 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 15번 탄소 위치에 S-형태 수산기를 형성한다. 또한, 탄소수 22 개 이상의 불포화지방산에서는 17번 탄소 위치에 S-형태 수산기를 형성한다.
현재까지 보고된 프로텍틴 D1 및 프로텍틴 DX는 강력한 항염 능력과 항바이러스제 및 다양한 기능성을 지닌 물질이다. 다만, 다양한 기능성을 지닌 새로운 화합물의 필요성은 계속되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 프로텍틴 D1과 프로텍틴 DX와 유사한 기능성을 가질 수있는 새로운 화합물을 생산하기 위해 예의노력한 결과, 두 가지 위치특이적인 리폭시게나아제 함유 전세포(whole cells)를 조합 반응을 통하여 도코사헥사엔산으로부터 신규 화합물을 생합성하기 위해 각각의 리폭시게나아제 함유 전세포에 의한 전환에 대해 확인하였으며, 8R-리폭시게나아제(8R-LOX)와 15S-리폭시게나아제(15R-LOX)를 통해 각각 단독으로 도코사헥사엔산으로부터 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-HDHA) 및 17S-수산화 도코사헥사엔산(17S-HDHA)을 생합성 할 수 있음을 확인하였고, 생성된 10R-수산화 도코사헥사엔산에 15S-리폭시게나아제를 반응하여 도코사헥사엔산으로부터 두 단계로 10-에피-프로텍틴 DX (epimer of protectin DX at C10; 10-epi-PDX)을 생합성할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 10-에피-프로텍틴 DX는 지금까지 단독으로 LC-MS 및 LC-MS/MS로 분석되어 규명된 적이 없으며, 본 발명에서 처음으로 단독으로 생산되어 NMR을 통해 규명되었다. 또한, 상기 10-에피-프로텍틴 DX는 프로텍틴 류의 구조를 지니고 있기에 기능성 또한 기존에 보고된 프로텍틴 D1 및 DX와 유사한 기능성을 지닐 것으로 기대된다.
나아가, 본 발명자들은 상기 8R-리폭시게나아제와 15S-리폭시게나아제를 조합하여 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA)으로부터 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA), 8R,15S-dihydroxyicosa-5,9,11,14,17-pentaenoic acid(8R,15S-DiHEPA)를 생합성 할 수 있으며, 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA)로부터 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA), 10R,17S-Dihydroxy-4,7,11,13,15-docosapentaenoic acid(10R,17S-DiHDPA)를 생합성 할 수 있음을 확인하였다. 8R,15S-DiHEPA 및 10R,17S-DiHDPA은 지금까지 규명된 적 없는 신규한 화합물이다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 도출된 것으로서 본 발명의 목적은 지금까지 규명되지 않은 화합물인 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10; 10-epi-PDX), 8R,15S-DiHEPA 및 10R,17S-DiHDPA를 제공하고, 산호 유래 8R-리폭시게나아제 함유 전세포 및 미생물 유래 15S-리폭시게나아제 함유 전세포의 조합 반응을 통하여 상기 화합물들을 고수율로 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 측면에서 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 유효성분으로 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(10-Epimer protectin DX, 10-epi-PDX) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-프로텍틴 DX(10-Epimer protectin DX, 10-epi-PDX)는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX)는 10R,17S-dihydroxy-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid다.
본 발명에 있어서, 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 기질로 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 88R,15S-DiHEPA는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 2]
본 발명에 있어서, 상기 88R,15S-DiHEPA는 8R,15S-dihydroxyicosa-5,9,11,14,17-pentaenoic acid이다.
본 발명에 있어서, 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 기질로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 기질로8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-PDXn-3(10R,17S-DiHDPA)은 하기 화학식 3로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 3]
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA)은 10R,17S-Dihydroxy-4,7,11,13,15-docosapentaenoic acid이다.
본 발명에 있어서, 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 기질로 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA) 및/또는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 기질로 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열이 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환체는 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하며, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli) 및 상기 대장균과 유사한 유전정보를 보유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환에 사용될 수 있는 미생물은 대장균(Escherichia coli) 및 상기 대장균과 유사한 유전정보를 보유하는 미생물, 예를 들어, 상기 대장균의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 미생물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 장내세균(예컨대, 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella) 또는 클렙시엘라(Klebsiella)), 그람 음성군(예컨대, 슈도모나스(Pseudomonas), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 및 델로비브리오(Bdellovibrio))로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징을 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)으로 구성된 군으로 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조 방법을 제공한다.
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 전세포는 8R-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 2 내지 8 g/L인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 1.0 mM 내지 3.0 mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.0 내지 9.0에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 40℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 8R-리폭시게나아제는 20℃ 내지 40℃, 바람직하게 20℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게 25℃ 내지 35℃에서 효소 활성이 우수하며, 15S-리폭시게나아제는 15℃ 내지 35℃, 바람직하게 15℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게 15℃ 내지 25℃에서 효소 활성이 우수하기 때문이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 전세포는 15S-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 2 내지 8 g/L인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 0.5 mM 내지 2.5 mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.5 내지 9.5에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 35℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 15S-리폭시게나아제는 15℃ 내지 35℃, 바람직하게, 15℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게, 15℃ 내지 25℃에서 효소 활성이 우수하기 때문이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조 방법을 제공한다.
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질로 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 전세포는 15S-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 2 내지 8 g/L인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 0.5 mM 내지 2.5 mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.5 내지 9.5에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 35℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 8R,15S-DiHEPA 제조 방법을 제공한다.
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 8R,15S-DiHEPA 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 8R,15S-DiHEPA 제조 방법을 제공한다.
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 8R,15S-DiHEPA 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질로 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조 방법을 제공한다.
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질로 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA) 및/또는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조 방법을 제공한다.
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 기질로 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 10-에피-프로텍틴 DX, 88R,15S-DiHEPA 및 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA)은 신호전달물질과 염증해소 촉진 매개인자(specialized pro-resolving mediator, SPM)로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대되며, 의약, 기능성 식품 및 기능성 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 활용될 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 산호인 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 유래 8R-리폭시게나아제 함유 전세포 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용함으로써, 지금까지 규명된 적 없는 화합물인 10-에피-프로텍틴 DX, 88R,15S-DiHEPA 및 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA)를 환경친화적인 방법으로 프로텍틴을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있다.
도 1은 도코사헥사엔산으로부터 수산화 도코사헥사엔산으로 전환시키는 리폭시케나아제 함유 전세포의 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX으로 전환시키는 리폭시케나아제 함유 전세포의 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 8R-리폭시게나아제 함유 전세포 및 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용하여 도코사헥사엔산을 기질로 하여 생성되는 10-에피-프로텍틴 DX의 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 4는 표준품 프로텍틴 DX와 함께 10-에피-프로텍틴 DX의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5는 8R-리폭시게나아제 함유 전세포의 pH(도 5a) 및 온도(도 5b)가 도코사헥사엔산을 기질로 하여 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 도코사헥사엔산(도 6a) 및 8R-리폭시게나아제 함유 전세포(도 6b)의 농도가 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 8R-리폭시게나아제 함유 전세포에 의한 도코사헥사엔산으로부터 10R-수산화 도코사헥사엔산으로의 생산을 나타낸 것이다.
도 8은 15S-리폭시게나아제 함유 전세포의 pH(도 8a) 및 온도(도 8b)가 10-에피-프로텍틴 DX의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 15S-리폭시게나아제 함유 전세포 농도 변화에 따른 10-에피-프로텍틴 DX의 생산을 나타낸 것이다.
도 10은 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10R-수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX로의 생산을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 각각 발현시킨 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX으로 전환시키는 리폭시케나아제 함유 전세포의 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 8R-리폭시게나아제 함유 전세포 및 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용하여 도코사헥사엔산을 기질로 하여 생성되는 10-에피-프로텍틴 DX의 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 4는 표준품 프로텍틴 DX와 함께 10-에피-프로텍틴 DX의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5는 8R-리폭시게나아제 함유 전세포의 pH(도 5a) 및 온도(도 5b)가 도코사헥사엔산을 기질로 하여 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 도코사헥사엔산(도 6a) 및 8R-리폭시게나아제 함유 전세포(도 6b)의 농도가 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 8R-리폭시게나아제 함유 전세포에 의한 도코사헥사엔산으로부터 10R-수산화 도코사헥사엔산으로의 생산을 나타낸 것이다.
도 8은 15S-리폭시게나아제 함유 전세포의 pH(도 8a) 및 온도(도 8b)가 10-에피-프로텍틴 DX의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 15S-리폭시게나아제 함유 전세포 농도 변화에 따른 10-에피-프로텍틴 DX의 생산을 나타낸 것이다.
도 10은 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10R-수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX로의 생산을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 각각 발현시킨 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 8R-수산화 지방산, 15S-수산화 지방산 또는 프로텍틴 유사체를 제조하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 친환경적인 생물전환방법으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX)를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 일관점에서 화학식 1로 표시되는 10-에피-프로텍틴 DX(10-Epimer protectin DX, 10-epi-PDX)에 관한 것이다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX)는 10R,17S-디히드록시-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-도코사헥사엔산(10R,17S-dihydroxy-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)이고, 10R,17S-디히드록시도코사헥사엔산(10R,17S-dihydroxydocosahexaenoic acid)이라고도 한다.
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-프로텍틴 DX은 신호전달물질 및/또는 염증해소 촉진 매개인자(specialized pro-resolving mediator, SPM)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 화학식 2로 표시되는 8R,15S-DiHEPA에 관한 것이다.
[화학식 2]
본 발명에 있어서, 상기 88R,15S-DiHEPA는 8R,15S-dihydroxyicosa-5,9,11,14,17-pentaenoic acid이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 화학식 3으로 표시되는 10-에피-PDXn-3(10R,17S-DiHDPA)에 관한 것이다.
[화학식 3]
본 발명에 있어서, 상기 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA)은 10R,17S-Dihydroxy-4,7,11,13,15-docosapentaenoic acid이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 88R,15S-DiHEPA 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA) 및/또는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 88R,15S-DiHEPA 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터로서 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현 예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및/또는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열이 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환된 형질전환체로서 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 ER 2566 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형질전환에 사용될 수 있는 미생물은, 대장균(Escherichia coli) 및 상기 대장균과 유사한 유전정보를 보유하는 미생물, 예를 들어, 상기 대장균의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 미생물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 장내세균(예컨대, 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella) 또는 클렙시엘라(Klebsiella)), 그람 음성군(예컨대, 슈도모나스(Pseudomonas), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 및 델로비브리오(Bdellovibrio))로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method) 등을 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음의 단계를 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조 방법에 관한 것이다.
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조하는 단계.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 전세포는 8R-리폭시게나아제를 포함할 수 있다. 상기 8R-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 전세포는 15S-리폭시게나아제를 포함할 수 있다. 상기 15S-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 또는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 8R-리폭시게나아제 및/또는 15S-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 i) 상기 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ii) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; iii) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 iv) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, i) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ii) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 (b) 단계의 전세포는 8R-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 2 내지 8 g/L, 가장 바람직하게는 4 g/L인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 0.2 mM 내지 6 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 3.0 mM, 가장 바람직하게는 2mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.0 내지 9.0, 바람직하게 pH 7.0 내지 8.5에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 헤페스(HEPES) 완충용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 8R-리폭시게나아제는 20℃ 내지 40℃, 바람직하게 20℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게 25℃ 내지 35℃에서 효소 활성이 우수하며, 15S-리폭시게나아제는 15℃ 내지 35℃, 바람직하게 15℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게 15℃ 내지 25℃에서 효소 활성이 우수하기 때문에 상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 40℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 (b) 단계의 전세포는 15S-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 0.2 내지 1.2 g/L, 가장 바람직하게는 1g/L인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 0.5 mM 내지 2.5 mM, 가장 바람직하게는 1.4mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.5 내지 9.5, 바람직하게는 pH 8.0 내지 9.0에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 헤페스(HEPES) 완충용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 15S-리폭시게나아제는 15℃ 내지 35℃, 바람직하게, 15℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게 15℃ 내지 25℃에서 효소 활성이 우수하기 때문에 상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 35℃, 바람직하게는 15℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조건들을 유지함으로써, 10R-수산화 지방산 및 10-에피-프로텍틴 DX 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하는 시간은 적절히 조절할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조 방법에 관한 것이다.
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음의 단계를 포함하는 8R,15S-DiHEPA 제조 방법에 관한 것이다.
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 8R,15S-DiHEPA 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음의 단계를 포함하는 8R,15S-DiHEPA 제조 방법에 관한 것이다.
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 8R,15S-DiHEPA 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음의 단계를 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조 방법에 관한 것이다.
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA) 및/또는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음의 단계를 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조 방법에 관한 것이다.
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Arcahngium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 이용함으로써, 10-에피-프로텍틴 DX, 8R,15S-DiHEPA 및 8R,15S-DiHEPA를 높은 생산성과 기존 중금속과 유기용매를 이용한 화학합성으로 얻는 물질보다 친환경적인 방법과 위해성이 없는 부산물을 생산하지 않게 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 기능성 식품 및 기능성 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
8
R
-리폭시게나아제 또는 15
S
-리폭시게나아제의 발현을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환체의 제작
본 발명의 8R-리폭시게나아제 또는 15R-리폭시게나아제를 제조하기 위하여, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주의 유전자로부터 각각 8R-리폭시게나아제 및 15S-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자를 먼저 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제는 바이오니어 회사(Bioneer corporation, Daejeon, Republic of Korea)에 유전자 합성을 의뢰하여 pET-28a(+) 벡터에 클로닝된 플라스미드를 구매하였다. 또한, 15S-리폭시게나아제는 독일생물자원센터(독일)에서 유전자 염기 서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) DSM 52838 균주를 구입하여 선별하고, 이로부터 유래한 리폭시게나아제의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)의 genomic DNA를 추출하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 리폭시게나아제의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각 유전자들의 제한효소로 NdeI과 SalI을 이용하였으며 클로닝 방법은 깁슨 조립(Gibson assembly) 방법을 이용하였고 프라이머(primer)는 다음 표 1과 같다. 리폭시게나아제 서열의 프라이머는 하기 표 1과 같다. 또한, 유전자를 pET-28a(+)에 클로닝하기 위하여 벡터 또한 PCR을 이용하여 준비 후 라이게이션하여 재조합 리폭시게나아제를 제조하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 염기서열 |
| 5 | Archangium violaceum 15S-lipoxygenase Forward primer | AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG ATG CGT TCC ATT CCC TCC CTG CCC CAG AAT |
| 6 | Archangium violaceum 15S-lipoxygenase Reverse primer | ATT CTG GGG CAG GGA GGG AAT GGA ACG CAT CAT ATG GCT GCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT |
이후, 상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs (Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 형질전환된 미생물들은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 10R-수산화 지방산, 17S-수산화 지방산 및 프로텍틴의 생산을 위하여 배양한 뒤 사용 전에 -70℃에 냉동 보관하였다.
8
R
-리폭시게나아제 또는 15
S
-리폭시게나아제의 제조
효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관시킨 형질전환 된 미생물들은 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 분당 200 번의 회전의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM 아이피티지(IPTG)를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 분당 150 번의 회전의 교반 조건으로 배양하였다.
배양된 8R-리폭시게나아제 또는 15S-리폭시게나아제를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 8R-리폭시게나아제 또는 15S-리폭시게나아제는 상기 형질전환 된 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 10R-수산화 지방산, 17S-수산화 지방산 및 10-에피-프로텍틴 DX을 생산하기 위한 재조합 세포로 사용하였다.
8
R
-리폭시게나아제 또는 15
S
-리폭시게나아제를 이용한 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX의 생산
상기 8R-리폭시게나아제 또는 15S-리폭시게나아제를 이용하여 10-에피-프로텍틴 DX의 생산 반응 순서를 확립하기 위하여 도코사헥사엔산과 10R-수산화 도코사헥사엔산, 17S-수산화 도코사헥사엔산을 기질로 하였다. 10R-수산화 도코사헥사엔산 및 17S-수산화 도코사헥사엔산은 1 mM의 도코사헥사엔산으로부터 각각 5 g/L의 재조합 8R-리폭시게나아제 및 15S-리폭시게나아제를 사용하였으며 pH 8.0, 25℃에서 30분 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다. 생산된 10R-수산화 도코사헥사엔산 및 17S-수산화 도코사헥사엔산은 다음 반응에 사용하기 위하여 추출하여 보관하였다. 10-에피-프로텍틴 DX는 1 mM의 10R-수산화 도코사헥사엔산 및 17S-수산화 도코사헥사엔산으로부터 각각 5 g/L의 재조합 15S-리폭시게나아제 및 8R-리폭시게나아제를 사용하였으며 pH 8.0, 25℃에서 30분 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 도코사헥사엔산으로부터 수산화 도코사헥사엔산으로 전환시키는 활성은 15S-리폭시게나아제가 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX로 전환시키는 활성 또한 15S-리폭시게나아제가 높은 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 8R-리폭시게나아제의 경우 수산화 도코사헥사엔산에 대한 활성이 없는 것으로 확인되었기에, 1차 반응으로 순서를 결정하였다.
따라서, 결정된 리폭시게나아제 반응순서로 도 3과 같은 생합성경로를 구축하였다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 10-에피-프로텍틴 DX의 생성여부를 에이치피엘씨(HPLC)를 이용하여 확인하였으며, NMR 분석을 통해 새로운 물질인 10R,17S-디히드록시 도코사헥사엔산(10R,17S-dihydroxy-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)으로 확인하면서10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX)라 명명하게 되었다(표 2).
[화학식 1]
8
R
-리폭시게나아제를 이용한 도코사헥사엔산으로부터 10
R
-수산화 도코사헥사엔산으로의 생물전환
(실시예 4-1) 8
R
-리폭시게나아제 함유 전세포의 pH 및 온도가 10
R
-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 미치는 영향
상기 8R-리폭시게나아제함유 전세포를 이용한 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 0.5 mM 도코사헥사엔산에 대하여, 헤페스 (HEPES buffer, pH 7.0-8.0), 이피피에스 (EPPS buffer, pH 8.0-8.5) 완충용액 및 체스 (CHES buffer, pH 8.5-9.0) 완충용액에서 5분 동안 효소함유 전세포 반응을 실시하였다. 그 결과, 최적 pH는 7.0 내지 9.0, 바람직하게, 7.0 내지 8.5, 보다 바람직하게, 7.5 내지 8.5인 것으로 확인되었다(도 5a).
또한, 상기 8R-리폭시게나아제함유 전세포를 이용한 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산에 대한 온도의 효과를 조사하기 위하여, 0.5 mM 도코사헥사엔산에 대하여, 50 mM HEPES 완충용액 pH 8.0에서, 온도를 20℃에서 40℃까지 5℃ 간격으로 범위를 정한 다음, 5분 동안 효소함유 전세포 반응을 실시하였다. 그 결과, 최적 온도는 20℃ 내지 40℃, 바람직하게, 20℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게, 25℃ 내지 35℃인 것으로 확인하였다(도 5b).
(실시예 4-2) 도코사헥사엔산의 농도 변화에 따른 생물전환 확인
상기 8R-리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리 시, 도코사헥사엔산의 농도 변화가 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 0.2 내지 6 mM의 범위로 농도를 달리한 도코사헥사엔산 및 과수산화 지방산(hydroperxy fatty acid)를 수산화 지방산(hydroxy fatty acid)으로 전환시키는 환원제인 시스테인(cysteine) 200 mM를 반응 초반에 첨가하고, pH 8.0, 30℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, 도6a에 나타난 바와 같이, 최적 기질 농도가 1 내지 3 mM, 바람직하게는 2 mM 인 것을 확인하였다.
(실시예 4-3) 8
R
-리폭시게나아제 함유 전세포의 농도 변화에 따른 생물전환 확인
상기 8R-리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 도코사헥사엔산에 처리 시, 전세포의 농도 변화가 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 2 mM의 도코사헥사엔산에 대하여, 0.2 내지 8 g/L 농도의 전세포, 200 mM 농도의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.0 30℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 8R-리폭시게나아제를 포함하는 전세포의 최적 농도는 2 내지 8 g/L, 바람직하게는 4 g/L인 것을 확인하였다.
8
R
-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 도코사헥사엔산으로부터 10
R
-수산화 도코사헥사엔산으로의 생산
상기 8R-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10R-수산화 도코사헥사엔산의 생산을 확인하기 위하여, 2 mM 도코사헥사엔산에 대하여, 10R-리폭시게나아제 4 g/L를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 pH 8.0 및 온도 30℃에서 실시하여 10R-수산화 도코사헥사엔산의 시간별 전환률을 측정하였다.
그 결과, 상기 8R-리폭시게나아제 함유 전세포는 1.4 mM 10R-수산화 도코사헥사엔산을 생산하였고, 10R-수산화 도코사헥사엔산의 최종 전환 수율은 70 %인 것으로 확인하였다(도 7).
15
S
-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10
R
-수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX으로의 생물전환
(실시예 6-1) 15
S
-리폭시게나아제 함유 전세포의 pH 및 온도가 10-에피-프로텍틴 DX의 생산에 미치는 영향
상기 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10-에피-프로텍틴 DX의 생산에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 0.5 mM 10R-수산화 도코사헥사엔산에 대하여, 이피피에스 (EPPS buffer, pH 7.5-8.5) 완충용액 및 체스 (CHES buffer, pH 8.5-9.5) 완충용액에서 5분 동안 효소 함유 전세포 반응을 실시하였다. 그 결과, 최적 pH는 7.5 내지 9.5, 바람직하게, 8.0 내지 9.0인 것으로 확인하였다(도 8a).
또한, 상기 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10-에피-프로텍틴 DX의 생산에 대한 온도의 효과를 조사하기 위하여, 0.5 mM 10R-수산화 도코사헥사엔산에 대하여, 50 mM 체스 완충용액 pH 8.5에서, 온도를 15℃에서 35℃까지 5℃ 간격으로 범위를 정한 다음, 5분 동안 효소 함유 전세포 반응을 실시하였다. 그 결과, 최적 온도는 15℃ 내지 35℃, 바람직하게, 15℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게, 15℃ 내지 25℃인 것으로 확인하였다(도 8b).
(실시예 6-2) 15
S
-리폭시게나아제 함유 전세포의 농도 변화에 따른 생물전환
상기 15S-리폭시게나아제를 포함하는 전세포를 10R-수산화 도코사헥사엔산에 처리 시, 전세포의 농도 변화가 10-에피-프로텍틴 DX의 생성 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 1.4 mM의 10R-수산화 도코사헥사엔산에 대하여, 0.2 내지 1.2 g/L 농도의 전세포, 200 mM 농도의 시스테인을 반응 초반에 첨가하고, pH 8.5 및 25℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 15S-리폭시게나아제를 포함하는 전세포의 최적 농도는 0.2 내지 1.2 g/L, 바람직하게는 1 g/L인 것을 확인하였다.
15
S
-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10
R
-수산화 도코사헥사엔산으로부터 10-에피-프로텍틴 DX 생산
상기 15S-리폭시게나아제 함유 전세포를 이용한 10-에피-프로텍틴 DX의 생산을 확인하기 위하여, 1.4 mM 10R-수산화 도코사헥사엔산에 대하여, 15S-리폭시게나아제 함유 전세포 1 g/L를 함유한 50 mM 체스 완충용액에서 pH 8.5 및 온도 25℃로 하여 10-에피-프로텍틴 DX의 시간별 전환률을 측정하였다.
그 결과, 상기 15S-리폭시게나아제는 1.2 mM 10-에피-프로텍틴 DX을 생산하였고, 10-에피-프로텍틴 DX의 최종 전환 수율은 86 %인 것으로 확인하였다(도 10).
상술한 바와 같이, 본 발명은 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 지질 매개체 (lipid mediator)로 작용할 수 있는 수산화 지방산과 10-에피-프로텍틴 DX를 생물전환법을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 도코사헥사엔산을 사용하고 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 포함한 형질전환된 세포를 이용하여 특이적으로 10R-수산화 지방산, 17S-수산화 지방산 및 10-에피-프로텍틴 DX를 생물전환법을 이용하여 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 기존에 생산법이 개발되지 않은 지질 조절제의 생물전환법에 의한 특이적인 생산법을 개발하여 큰 의미를 가진다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 결과, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[서열목록]
서열번호 1
Plexaura homomalla
8
R
-lipoxygenase
MetAlaIleTyrAsnValGluValGluThrGlyAspArgGluHisAlaGlyThrAspAlaThrIleThrIleArgIleThrGlyAlaLysGlyArgThrAspTyrLeuLysLeuAspLysTrpPheHisAsnAspPheGluAlaGlySerLysGluGlnTyrThrValGlnGlyPheAspValGlyAspIleGlnLeuIleGluLeuHisSerAspGlyGlyGlyTyrTrpSerGlyAspProAspTrpPheValAsnArgValIleIleIleSerSerThrGlnAspArgValTyrSerPheProCysPheArgTrpValIleLysAspMetValLeuPheProGlyGluAlaThrLeuProPheAsnGluValProAlaIleValSerGluGlnArgGlnLysGluLeuGluGlnArgLysLeuThrTyrGlnTrpAspTyrValSerAspAspMetProGlyAsnIleLysAlaLysThrHisAspAspLeuProArgAspValGlnPheThrAspGluLysSerArgSerTyrGlnGluSerArgLysAlaAlaLeuValAsnLeuGlyIleGlySerLeuPheThrMetPheGluAsnTrpAspSerTyrAspAspTyrHisIleLeuTyrArgAsnTrpIleLeuGlyGlyThrProAsnMetAlaAspArgTrpHisGluAspArgTrpPheGlyTyrGlnPheLeuAsnGlyAlaAsnProValIleLeuThrArgCysAspAlaLeuProSerAsnPheProValThrAsnGluHisValAsnAlaSerLeuAspArgGlyLysAsnLeuAspGluGluIleLysAspGlyHisIleTyrIleValAspPheLysValLeuValGlyAlaLysSerTyrGlyGlyProValLeuGluAspIleGlyTyrLysValProAspHisLeuLysHisAspGluAlaAspIleArgTyrCysAlaAlaProLeuAlaLeuPheTyrValAsnLysLeuGlyHisLeuMetProIleAlaIleGlnIleAsnGlnGluProGlyProGluAsnProIleTrpThrProHisGluGluAsnGluHisAspTrpMetMetAlaLysPheTrpLeuGlyValAlaGluSerAsnPheHisGlnLeuAsnThrHisLeuLeuArgThrHisLeuThrThrGluSerPheAlaLeuSerThrTrpArgAsnLeuAlaSerAlaHisProValPheLysLeuLeuGlnProHisIleTyrGlyValLeuAlaIleAspThrIleGlyArgLysGluLeuIleGlySerGlyGlyIleValAspGlnSerLeuSerLeuGlyGlyGlyGlyHisValThrPheMetGluLysCysPheLysGluValAsnLeuGlnAspTyrHisLeuProAsnAlaLeuLysLysArgGlyValAspAspProSerLysLeuProGlyPheTyrTyrArgAspAspGlyLeuAlaLeuTrpGluAlaIleGluThrPheIleGlyGluIleIleAlaIlePheTyrLysAsnAspAspAspValLysArgAspAsnGluIleGlnSerTrpIleTyrAspValHisLysAsnGlyTrpArgValAsnProGlyHisGlnAspHisGlyValProAlaSerPheGluSerArgGluGlnLeuLysGluValLeuThrSerLeuValPheThrPheSerCysGlnHisAlaAlaValAsnPheSerGlnLysAspHisTyrGlyPheThrProAsnAlaProAlaValLeuArgHisProProProLysLysLysGlyGluAlaThrLeuGlnSerIleLeuSerThrLeuProSerLysSerGlnAlaAlaLysAlaIleAlaThrValTyrIleLeuThrLysPheSerGluAspGluArgTyrLeuGlyAsnTyrSerAlaThrAlaTrpGluAspLysAspAlaLeuAspAlaIleAsnArgPheGlnAspLysLeuGluAspIleSerLysLysIleLysGlnArgAsnGluAsnLeuGluValProTyrIleTyrLeuLeuProGluArgIleProAsnGlyThrAlaIle
서열번호 2
Plexaura homomalla
8
R
-lipoxygenase
ATGGCTATTTATAATGTTGAGGTGGAGACTGGAGACCGAGAGCATGCTGGTACAGATGCTACAATCACCATCAGGATAACGGGTGCAAAAGGCCGCACAGATTATCTAAAATTGGACAAATGGTTCCATAATGATTTTGAAGCTGGAAGTAAAGAACAGTATACGGTTCAAGGTTTCGATGTTGGAGATATCCAGTTAATTGAACTTCATTCTGATGGAGGTGGATATTGGTCAGGTGATCCAGACTGGTTCGTGAACAGAGTGATTATAATAAGTTCAACTCAAGATCGTGTTTACTCTTTCCCATGCTTCAGATGGGTGATAAAAGATATGGTATTATTCCCTGGTGAAGCTACCTTACCATTCAATGAAGTTCCAGCCATAGTCAGTGAACAGCGTCAGAAGGAATTGGAACAAAGGAAGTTGACATACCAGTGGGACTACGTGTCAGATGATATGCCTGGAAATATCAAGGCAAAGACACATGACGATCTACCACGTGATGTCCAGTTTACTGATGAGAAATCAAGGTCGTATCAAGAGAGTAGAAAAGCAGCTCTAGTCAATCTTGGAATAGGTTCTCTTTTCACAATGTTTGAGAACTGGGATTCATATGACGATTACCATATCTTATACCGCAACTGGATTCTTGGAGGTACTCCTAATATGGCGGACCGATGGCATGAAGATCGCTGGTTTGGTTATCAGTTTCTCAACGGAGCAAACCCTGTGATCCTTACGCGTTGTGACGCACTTCCTTCAAACTTCCCGGTAACCAATGAACACGTGAATGCTTCCTTGGATAGAGGAAAGAATTTGGATGAAGAAATTAAGGATGGACATATCTATATTGTTGATTTCAAGGTGTTGGTTGGTGCTAAGTCTTACGGTGGTCCAGTGCTGGAAGACATAGGCTACAAAGTACCTGATCATCTCAAACATGATGAAGCTGACATCCGATACTGTGCTGCACCTCTTGCCTTGTTCTATGTCAATAAGCTTGGTCATCTAATGCCCATCGCTATCCAGATTAATCAAGAACCAGGTCCTGAGAATCCAATATGGACACCACACGAGGAAAATGAACATGACTGGATGATGGCGAAGTTTTGGCTTGGTGTTGCGGAATCGAATTTCCACCAGCTGAATACTCACTTGCTTCGAACTCATTTGACCACTGAATCATTTGCTTTATCAACCTGGCGAAATCTGGCATCAGCTCATCCAGTATTTAAATTGCTACAACCTCACATCTATGGTGTCCTTGCCATTGATACCATTGGTCGTAAAGAATTGATTGGATCAGGCGGAATTGTTGATCAGTCTTTGTCCTTGGGCGGTGGGGGGCACGTCACTTTTATGGAAAAATGTTTCAAAGAGGTAAACCTTCAAGACTACCACCTTCCAAATGCATTAAAGAAACGTGGTGTCGATGACCCATCAAAACTGCCAGGCTTTTACTACCGAGACGATGGTCTTGCTCTCTGGGAAGCTATTGAAACATTTATCGGTGAAATCATTGCTATCTTTTACAAGAATGACGACGATGTGAAGCGAGATAACGAGATTCAAAGCTGGATCTATGATGTCCACAAAAATGGTTGGCGTGTTAACCCTGGTCATCAAGATCACGGAGTTCCAGCCTCATTTGAAAGTCGAGAACAACTTAAAGAAGTACTTACATCCCTAGTTTTTACCTTTTCTTGTCAACATGCTGCAGTTAATTTCAGTCAGAAAGATCACTATGGATTCACTCCTAATGCCCCCGCCGTCTTAAGACATCCACCACCAAAGAAAAAAGGAGAAGCTACGTTGCAATCTATCCTGTCCACTCTGCCCAGTAAATCTCAAGCAGCCAAAGCCATAGCAACTGTTTATATTTTGACTAAGTTTTCAGAGGACGAGCGCTATTTGGGTAATTATAGTGCCACAGCTTGGGAAGACAAAGACGCTCTTGATGCAATTAACCGTTTCCAAGACAAGCTTGAAGATATTTCAAAGAAAATAAAACAACGAAATGAGAATTTGGAAGTCCCATACATCTATCTTCTTCCAGAACGTATTCCTAACGGAACAGCG
ATCTAA
서열번호 3
Archangium violaceum
15
S
-lipoxygenase
MetSerAsnProAlaGlnAsnThrProProAlaSerAlaGluAspAsnProAlaAspProLysGlnLeuTyrArgTyrAspTyrThrLysLeuAlaProLeuAlaMetIleAlaThrLeuProLysAlaGluLysProAspIleArgTrpIleMetGlnCysValGlnLeuSerLeuGlnAlaValArgAsnArgLeuHisTrpAspAspSerLeuSerTyrSerAspAspAspThrAlaValValAspLeuAsnHisValGlyLeuGlyThrValAsnLeuAspAlaMetProLeuHisArgValAlaProHisGluThrSerGluLeuAlaProAlaGlnLeuGluArgMetThrProGluGlnLeuGluValAlaLeuProGlnGluGluGluGlyProLeuThrPheSerGlyAspGluHisGluProGlyLeuLeuSerLeuLeuLysThrValAlaValValSerArgAspPheLeuGlnLysGlyIleThrAsnProLeuGlyIleLeuAspAlaMetLeuLysLysThrAspAlaLysArgSerGlyArgProThrSerLeuAspAspTyrAlaArgLeuPheThrThrLeuGluArgProTrpPheAlaAspLysPheGluSerAspGluValPheAlaTyrLeuArgValAlaGlyPheAsnProMetValLeuLysArgValAlaThrProGlyGluLysPheProValThrAspGluGlnLeuHisValValLeuArgAspThrGlyAspAsnLeuAlaGlnAlaGlyAlaGluGlyArgLeuPheLeuCysAspTyrAlaAlaLeuAlaGlyValLysAsnGlyAsnPheProLeuGlyProLysTyrCysPheAlaProLeuAlaLeuPheAlaLeuProArgSerGlySerGlyProArgArgLeuHisProValAlaIleGlnCysGlyGlnGluProArgAlaTyrProIlePheThrProAlaAspGlyGluAlaTrpLysLysAlaLysLeuValValThrValAlaAspPheAsnHisHisGluLeuValSerHisLeuGlyLeuThrHisLeuLeuIleGlyProIleAlaIleAlaThrHisArgCysIleProGluAlaHisProValSerLeuLeuLeuArgProHisPheGluGlyThrLeuSerIleAsnAspMetAlaGlnAlaThrLeuValAlaProGlyHisGluValAspLysSerLeuGlyGlyThrIleGlyAlaSerArgGluValAlaArgAspGlyLeuAsnSerArgProPheAsnSerLeuPheLeuProGluAspLeuLysAlaArgGlyValAsnAspProAlaLeuGluTyrProTyrArgAspAspAlaLeuGluLeuTrpHisAlaIleGluAlaTrpValThrThrTyrValLysLeuTyrTyrArgSerAspGluGluValArgAlaAspArgAlaLeuGlnGluTrpAlaAlaGluIleValSerGlnAspGlyAlaArgIleProGlyPheGlyAspAlaGlyAspGlyArgIleGlnSerLeuAlaTyrLeuCysArgAlaLeuThrLeuLeuValPheThrAlaSerAlaGlnHisAlaAlaValAsnAlaProGlnAlaGlyLeuMetAsnTyrAlaProAlaThrProProAlaAlaTyrArgAlaAlaProLeuSerLeuSerAspSerAspAsnAsnAspTyrLeuAspTyrPheProProLeuGluMetAlaSerLeuGlnMetGluPheLeuHisLeuLeuGlyGlyValValHisThrArgLeuGlyArgTyrGluArgAspTrpPheLysAspAlaLysValArgGluProLeuAlaArgPheGlnSerLysLeuGluGluLeuGluAlaLeuIleThrGluArgAsnArgThrArgPheGlyProTyrProPheLeuLeuProSerArgValProGlnSerIleAsnIle
서열번호 4
Archangium violaceum
15
S
-lipoxygenase
GTGTCCAACCCCGCCCAGAACACCCCGCCCGCTTCCGCCGAGGACAACCCGGCGGACCCGAAGCAGCTCTACCGGTACGACTACACGAAGCTCGCGCCGCTCGCGATGATCGCCACGCTTCCGAAGGCGGAGAAGCCGGACATCCGGTGGATCATGCAGTGCGTGCAGCTCTCGCTCCAGGCCGTGCGCAACCGCCTGCACTGGGATGACTCACTCTCGTATTCCGACGACGACACGGCGGTGGTGGACCTCAACCACGTGGGCCTCGGTACCGTGAATCTCGACGCGATGCCGTTGCACCGGGTGGCGCCGCACGAGACCTCCGAGCTGGCTCCGGCCCAGCTCGAGCGCATGACGCCGGAGCAGCTCGAGGTGGCGCTCCCCCAGGAAGAAGAGGGGCCGCTGACCTTCAGTGGAGATGAGCACGAGCCGGGGCTGCTCTCCCTGCTCAAGACGGTCGCGGTCGTCTCGCGGGACTTCCTCCAGAAGGGCATCACCAACCCGCTCGGCATCCTCGATGCCATGCTCAAGAAGACGGACGCGAAGCGCTCCGGGCGTCCCACGTCCCTGGATGACTACGCCCGCCTGTTCACCACGCTCGAGCGGCCCTGGTTCGCCGACAAGTTCGAGTCCGACGAGGTCTTCGCCTACCTGCGGGTGGCGGGCTTCAACCCGATGGTGCTCAAGCGCGTGGCCACTCCCGGGGAGAAGTTCCCCGTCACCGACGAGCAGTTGCACGTCGTCCTGCGCGACACGGGAGACAATCTGGCGCAGGCGGGCGCCGAGGGCCGGCTCTTCCTGTGTGACTACGCGGCCCTGGCGGGCGTGAAGAATGGCAACTTCCCCCTGGGCCCCAAGTATTGCTTCGCCCCGCTCGCCCTGTTCGCGCTTCCCCGGAGCGGCTCGGGACCGCGGCGGCTCCATCCGGTGGCCATCCAATGCGGGCAGGAGCCGCGTGCCTATCCCATCTTCACCCCCGCGGACGGCGAGGCCTGGAAGAAGGCGAAGCTCGTGGTCACCGTGGCCGACTTCAACCACCACGAACTCGTCTCCCACCTGGGGCTCACGCACCTGCTGATCGGCCCGATCGCGATTGCCACGCACCGGTGCATTCCGGAGGCGCACCCGGTGAGCCTGCTGCTGCGGCCGCACTTCGAGGGCACGCTCAGCATCAACGACATGGCGCAGGCCACGCTGGTGGCGCCCGGGCACGAGGTGGACAAGTCGCTCGGCGGCACCATCGGGGCCAGCCGCGAGGTCGCCAGGGACGGACTGAACTCCCGGCCGTTCAACTCGCTCTTCCTGCCCGAGGACCTCAAGGCCCGCGGCGTGAACGACCCCGCGCTCGAGTACCCCTACCGGGATGACGCGCTGGAGCTCTGGCACGCCATCGAGGCGTGGGTGACCACCTACGTCAAGCTGTACTACCGCTCGGACGAGGAGGTGCGGGCGGACAGGGCCCTCCAGGAGTGGGCGGCGGAGATCGTCTCGCAGGACGGTGCGCGCATCCCCGGCTTCGGCGACGCGGGGGACGGGCGCATCCAGAGCCTCGCGTACCTGTGCCGGGCGCTCACGTTGCTCGTCTTCACCGCGAGCGCGCAGCACGCGGCCGTCAACGCGCCGCAAGCGGGGCTGATGAACTACGCGCCCGCCACGCCGCCCGCGGCGTACCGCGCGGCCCCGCTCTCCCTGAGCGACTCCGACAACAACGACTATCTCGACTACTTCCCGCCGCTCGAGATGGCCTCGCTGCAGATGGAGTTCCTGCACCTGCTGGGCGGTGTGGTCCACACGCGGCTCGGCCGCTACGAGCGGGACTGGTTCAAGGACGCGAAGGTGCGCGAGCCGCTCGCGCGCTTCCAGTCGAAGCTCGAGGAGCTCGAGGCGTTGATCACCGAGCGCAACCGGACCCGCTTCGGGCCCTATCCCTTCCTGCTGCCGAGCCGGGTGCCCCAGAGCATCAACATCTGA
서열번호 5
Archangium violaceum
15
S
-lipoxygenase Forward primer
AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG ATG CGT TCC ATT CCC TCC CTG CCC CAG AAT
서열번호 6
Archangium violaceum
15
S
-lipoxygenase Reverse primer
ATT CTG GGG CAG GGA GGG AAT GGA ACG CAT CAT ATG GCT GCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT
서열목록 전자파일 첨부
Claims (54)
- 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는, 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 10-에피-프로텍틴 DX는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조성물:
[화학식 1]
.
- 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는, 8R,15S-DiHEPA 생산용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 8R,15S-DiHEPA는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조성물:
[화학식2]
.
- 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 8R,15S-DiHEPA는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조성물:
[화학식3]
.
- 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA) 및/또는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는, 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 조성물.
- 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는, 8R,15S-DiHEPA 생산용 조성물.
- 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 조성물.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 발현 벡터.
- 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 발현 벡터.
- 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 발현 벡터.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열 및/또는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열이 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체.
- 제25항에 있어서,
상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 장내세균(예컨대, 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella) 또는 클렙시엘라(Klebsiella)), 그람 음성군(예컨대, 슈도모나스(Pseudomonas), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 및 델로비브리오(Bdellovibrio))로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
- 제19항의 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10) 생산용 재조합 세포.
- 제20항의 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 8R,15S-DiHEPA 생산용 재조합 세포.
- 제21항의 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체 및/또는 이의 배양액을 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 생산용 재조합 세포.
- 다음의 단계를 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조 방법:
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 8R,15S-DiHEPA 제조 방법:
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 8R,15S-DiHEPA 제조하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조 방법:
(a) 플렉사우라 호모말라(Plexaura homomalla) 산호 유래 8R-리폭시게나아제를 암호화하는 서열; 및 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조하는 단계.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a)단계의 8R-리폭시게나아제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b) 단계의 전세포는 8R-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 2 내지 8 g/L인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 1.0 mM 내지 3.0 mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.0 내지 9.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질은 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 40℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b) 단계의 전세포는 15S-리폭시게나아제를 포함하고 있으며, 상기 전세포의 농도는 2 내지 8 g/L인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 기질을 0.5 mM 내지 2.5 mM 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 pH 7.5 내지 9.5에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질은 10R-수산화 도코사헥사엔산이며, 상기 (b)단계는 15℃ 내지 35℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제31항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및/또는 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제32항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질로 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid, DPA) 및/또는 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조 방법:
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 10-에피-프로텍틴 DX(epimer of protectin DX at C10, 10-epi-PDX) 제조하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 8R,15S-DiHEPA 제조 방법:
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 8R,15S-DiHEPA 제조하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조 방법:
(a) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 15S-리폭시게나아제를 암호화하는 서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 및/또는 이의 배양액으로부터 전세포(whole-cell)를 회수하고 상기 전세포(whole-cell)를 기질에 처리하여 생물전환으로 포함하는 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA) 제조하는 단계.
- 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a)단계의 15S-리폭시게나아제는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제46항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및/또는 10R-수산화 도코사헥사엔산(10R-hydroxydocosahexaenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제47항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질로 8R-hydroxyicosa-5Z,9E,11Z,14Z,17Z-pentaenoic acid (8R-HEPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제48항에 있어서,
상기 (b)단계의 기질로 10R-Hydroxy-7,11,13,16,19-Docosapentaenoic Acid(10R-HDPA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 31항 또는 제47항의 방법으로 제조된, 8R, 15S-DiHEPA.
- 제 32항 또는 제48항의 방법으로 제조된, 10-에피-PDXn-3 (10R17S-DiHDPA).
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