KR102184967B1 - 수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물 - Google Patents

수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102184967B1
KR102184967B1 KR1020190025391A KR20190025391A KR102184967B1 KR 102184967 B1 KR102184967 B1 KR 102184967B1 KR 1020190025391 A KR1020190025391 A KR 1020190025391A KR 20190025391 A KR20190025391 A KR 20190025391A KR 102184967 B1 KR102184967 B1 KR 102184967B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acid
hydroxy
analog
triocillin
fatty acid
Prior art date
Application number
KR1020190025391A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200106766A (ko
Inventor
오덕근
안정웅
이인규
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020190025391A priority Critical patent/KR102184967B1/ko
Publication of KR20200106766A publication Critical patent/KR20200106766A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102184967B1 publication Critical patent/KR102184967B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/42—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D303/00—Compounds containing three-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D303/02—Compounds containing oxirane rings
    • C07D303/12—Compounds containing oxirane rings with hydrocarbon radicals, substituted by singly or doubly bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 15-지방산화효소; 또는 상기 15-지방산화효소 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체) 제조용 조성물; 및 이를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체) 제조방법에 관한 것이다.

Description

수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 또는 트리오실린 B 유사체 제조용 조성물{COMPOSITION FOR PRODUCING HYDROXYFATTY ACID, HEPOXILIN B ANALOG OR TRIOXILIN B ANALOG}
본 발명은 15-지방산화효소; 및 상기 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체) 제조용 조성물에 관한 것이다.
자연계에 널리 분포하는 수산화 지방산(hydroxy fatty acid)은 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질 등에 존재하며, 왁스, 트리글리세롤, 세레브로시드 등에서도 발견된다. 일반적으로 수산화기가 있어서 다른 지방산보다 반응성이 좋은 것으로 알려진 수산화 지방산은 산업적으로 다양한 물질(왁스, 나일론, 레진, 그리고 플라스틱 등)의 초기 물질로 사용되며, 또한, 항곰팡이 활성 및 표면장력을 줄여주기 때문에 화장품의 원료로도 사용될 수 있다. 특히, 동 식물에서의 수산화 지방산은 다양한 생리활성에 관여하는 신호전달물질로서, 인간에서는 지질 조절제(lipid mediators)로 분류된다.
인간 지질조절제로 분류되는 헤폭실린(hepoxilin)과 트리오실린(trioxilin)은 지방산화효소와 에폭사이드 가수분해효소가 다가불포화지방산에 작용하여 전환되는 산화지방산이다. 대표적으로 인체 내에서 페록시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)의 길항제로 작용하여, 인슐린 분비 및 지방대사를 조절한다. 뿐만 아니라, 항염증반응 및 면역기작, 칼슘의 분비 조절 등을 조절한다.
수산화 지방산과 헤폭실린을 합성하는 지방산화효소는 헴(heme)기 대신 철 또는 망간과 같은 금속이온을 가지고 있는 이산소화 효소로써, 이산소화 반응과 에폭시 생성반응, 두 가지를 모두 촉매하는 다기능 효소이다. 지방산화효소는 특이적으로 하나 또는 다수의 시스, 시스-1,4 펜타디엔 구조를 가지는 다가불포화지방산의 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다. 그 중에서도 동물성 다가불포화지방산의 15번 위치에 수산기를 붙여주는 15-지방산화효소(15-lipoxygenase)의 경우, 896-941개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 특이적으로 15번 탄소 위치에만 수산기(-OH)를 형성한다. 15-수산화 아리키돈산을 생성하는 미생물로는 대표적으로 슈도모나스 에로지노사(Pseudomonas aeruginosa), 쉬와넬라 우디(Shewanella woodyi), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsonii)가 있다.
또한, 헤폭실린으로부터 생성되는 트리오실린은 물이 있는 조건에서 에폭사이드 가수분해효소(epoxide hydrolase)에 의해 반응이 촉매된다. 에폭사이드 가수분해효소는 다양한 생물체에 존재하는 기본적인 효소로서, 특히 동물에서 에폭사이드 가수분해효소는 5종류가 존재하고 있으며, 그 중에서도 헤폭실린의 에폭사이드를 가수분해하는 효소는 인간에서만 보고가 되어져 있다. 하지만 최근 미생물인 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)에서 헤폭실린 에폭사이드 가수분해효소로 추정되는 효소를 확인하였다.
현재까지 15-수산화 지방산과 헤폭실린 그리고 트리오실린은 인간유래 15-지방산화효소(human 15-lipoxygenase)와 에폭사이드 가수분해효소(human epoxide hydrolase)를 이용하여 동물성 다가불포화지방산으로부터 생산을 확인하였다. 하지만 효소의 정제수율이 매우 낮으며, 활성 또한 좋지 않아서 생물전환법에 적용하여 15-수산화 지방산과 헤폭실린 및 트리오실린을 생산하기에는 어려움이 있어 왔다.
본 발명은 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물로서, 상기 수산화지방산은 상기 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태이고, 상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B3(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 14,15-헤폭실린 B4 (13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 14,15-헤폭실린 B2(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
상기 15-지방산화효소는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주로부터 유래될 수 있다.
상기 불포화 지방산은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 에이코사트리엔산(eicosatrienoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고, 상기 수산화지방산은 15-수산화아라키돈산(15-hydroxyarachidonic acid), 15-과수산화아라키돈산(15-perhydroxyarachidonic acid), 15-수산화에이코사펜타엔산(15-hydroxyeicosapentaenoic acid), 15-과수산화에이코사펜타엔산(15-perhydroxyeicosapentaenoic acid), 15-수산화 에이코사트리엔산(15-hydroxyeicosatrienoic acid), 15-과수산화 에이코사트리엔산(15-perhydroxyeicosatrienoic acid), 17-수산화도코사헥사엔산(17-hydroxydocosahexaenoic acid), 17-과수산화도코사헥사엔산(17-perhydroxydocosahexaenoic acid), 17-수산화도코테트라엔산(17-hydroxydocosatetraenoic acid) 및 17-과수산화도코사테트라엔산(17-perhydroxydocosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 15-지방산화효소를 포함하는 전세포의 농도는 6.0 g/l 내지 50.0 g/l일 수 있다.
서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 추가로 포함하고, 트리오실린 B 유사체를 추가로 제조하기 위한 것이며, 상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B3(13,14,15-hydroxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 13,14,15-트리오실린 B4 (13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5 (15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3 (15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 15-지방산화효소 및 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포의 농도는 6.0 g/l 내지 20.0 g/l일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물로서, 상기 수산화지방산은 상기 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태이고, 상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B3(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 14,15-헤폭실린 B4 (13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 14,15-헤폭실린 B2(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 트리오실린 B 유사체를 추가로 제조하기 위한 것이며, 상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B3(13,14,15-hydroxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 13,14,15-트리오실린 B4 (13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5 (15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3 (15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물을 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조방법을 제공한다.
상기 기질 내 상기 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 100mM일 수 있다.
상기 처리는 pH 6.5~8.5 및 20~35℃ 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터로서, 상기 수산화지방산은 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태이고, 상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B3(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 14,15-헤폭실린 B4 (13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 14,15-헤폭실린 B2(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 트리오실린 B 유사체를 추가로 제조하기 위한 것이며, 상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B3(13,14,15-hydroxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 13,14,15-트리오실린 B4 (13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5 (15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3 (15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 숙주세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 14,15-헤폭실린 B3(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 14,15-헤폭실린 B4 (13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 14,15-헤폭실린 B2(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 헤폭실린 B 유사체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 13,14,15-트리오실린 B3(13,14,15-hydroxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 13,14,15-트리오실린 B4 (13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5 (15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3 (15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 트리오실린 B 유사체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소를 이용함으로써, 환경 친화적인 방법으로 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
뿐만 아니라, 복합효소로서, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 이용함으로써, 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체는 신규 지질 조절물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
도 1(a)는 다양한 pH에서 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 아라키돈산에 처리시, 14,15-헤폭실린 B3 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다(●: HEPES buffer, ○?: Tris-HCl buffer). 도 1(b)는 다양한 온도에서 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 아라키돈산에 처리시, 14,15-헤폭실린 B3생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 2(a)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포의 농도별로 아라키돈산에 처리시, 14,15-헤폭실린 B3 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다(●: 14,15-헤폭실린 B3). 도 2(b)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 다양한 농도의 아라키돈산에 처리시, 14,15-헤폭실린 B3 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다(●: 14,15-헤폭실린 B3).
도 3(a)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 아라키돈산에 처리시, 15-수산화 아라키돈산 및 14,15-헤폭실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 아라키돈산, ▲ : 15-과수산화 아라키돈산, ■ : 15-수산화 아라키돈산, ○ : 14,15-헤폭실린 B3). 도 3(b)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리시, 15-수산화 에이코사펜타엔산 및 14,15-헤폭실린 B4의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 에이코사펜타엔산, ▲ : 15-과수산화 에이코사펜타엔산, ■ : 15-수산화 에이코사펜타엔산, ○ : 14,15-헤폭실린 B4). 도 3(c)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, 17-수산화 도코사헥사엔산 및 16,17-헤폭실린 B5의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 도코사헥사엔산, ▲ : 17-과수산화 도코사헥사엔산, ■ : 17-수산화 도코사헥사엔산, ○ : 16,17-헤폭실린 B5). 도 3(d)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 도코사테트라엔산에 처리시, 17-수산화 도코사테트라엔산 및 16,17-헤폭실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 도코사테트라엔산, ▲ : 17-과수산화 도코사테트라엔산, ■ : 17-수산화 도코사테트라엔산, ○ : 16,17-헤폭실린 B3). 도 3(e)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함한 전세포를 디호모-감마-리놀레산에 처리시, 15-수산화 에이코사트리에논산(γ) 및 14.15-헤폭실린 B2(γ)의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 디호모-감마-리놀레산, ▲ : 15-과수산화 에이코사트리엔산(γ), ■ : 15-수산화 에이사트리엔산(γ), ○ : 14,15-헤폭실린 B2(γ)).
도 4(a)는 고농도의 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소를 포함하는 전세포를 고농도의 아라키돈산에 처리시, 15-수산화 아라키돈산 및 14,15-헤폭실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 아라키돈산, ▲ : 15-과수산화 아라키돈산, ■ : 15-수산화 아라키돈산, ○ : 14,15-헤폭실린 B3). 도 4(b)는 고농도의 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포를 고농도의 아라키돈산에 처리시, 15-수산화 아라키돈산, 14,15-헤폭실린 B3 및 13,14,15-트리오실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 아라키돈산, ▲ : 15-과수산화 아라키돈산, ■ : 15-수산화 아라키돈산, ○ : 14,15-헤폭실린 B3, □ : 13,14,15-트리오실린 B3).
도 5(a)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 아라키돈산에 처리시, 15-수산화 아라키돈산, 14,15-헤폭실린 B3 및 13,14,15-트리오실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 아라키돈산, ▲ : 15-과수산화 아라키돈산, ■ : 15-수산화 아라키돈산, ○ : 14,15-헤폭실린 B3, □ : 13,14,15-트리오실린 B3). 도 5(b)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 에이코사펜타엔산에 처리시, 15-수산화 에이코사펜타엔산, 14,15-헤폭실린 B4 및 13,14,15-트리오실린 B4의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 에이코사펜타엔산, ▲ : 15-과수산화 에이코사펜타엔산, ■ : 15-수산화 에이코사펜타엔산, ○ : 14,15-헤폭실린 B4, □ : 13,14,15-트리오실린 B4). 도 5(c)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 도코사헥사엔산에 처리시, 17-수산화 도코사헥사엔산, 16,17-헤폭실린 B5 및 15,16,17-트리오실린 B5의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 도코사헥사엔산, ▲ : 17-과수산화 도코사헥사엔산, ■ : 17-수산화 도코사헥사엔산, ○ : 16,17-헤폭실린 B5, □ : 15,16,17-트리오실린 B5). 도 5(d)는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 유래 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포를 도코사테트라엔산에 처리시, 17-수산화 도코사테트라엔산, 16,17-헤폭실린 B3 및 15,16,17-트리오실린 B3의 시간별 생산농도를 나타낸 것이다(● : 도코사테트라엔산, ▲ : 17-과수산화 도코사테트라엔산, ■ : 17-수산화 도코사테트라엔산, ○ : 16,17-헤폭실린 B3, □ : 15,16,17-트리오실린 B3).
도 6(a)는 14,15-헤폭실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 도 6(b)는 14,15-헤폭실린 B3의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 6(c)는 14,15-헤폭실린 B3의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7(a)는 14,15-헤폭실린 B4의 수소 NMR 스펙트럼, 도 7(b)는 14,15-헤폭실린 B4의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 7(c)는 14,15-헤폭실린 B4의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8(a)는 16,17-헤폭실린 B5의 수소 NMR 스펙트럼, 도 8(b)는 16,17-헤폭실린 B5의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 8(c)는 16,17-헤폭실린 B5의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9(a)는 16,17-헤폭실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 도 9(b)는 16,17-헤폭실린 B3의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 9(c)는 16,17-헤폭실린 B3의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10(a)는 14,15-헤폭실린 B2(γ)의 수소 NMR 스펙트럼, 도 10(b)는 16,17-헤폭실린 B2(γ)의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 10(c)는 16,17-헤폭실린 B2(γ)의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11(a)는 13,14,15-트리오실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 도 11(b)는 13,14,15-트리오실린 B3의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 11(c)는 13,14,15-트리오실린 B3의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12(a)는 13,14,15-트리오실린 B4의 수소 NMR 스펙트럼, 도 12(b)는 13,14,15-트리오실린 B4의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 12(c)는 13,14,15-트리오실린 B4의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13(a)는 15,16,17-트리오실린 B5의 수소 NMR 스펙트럼, 도 13(b)는 15,16,17-트리오실린 B5의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 13(c)는 15,16,17-트리오실린 B5의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14(a)는 15,16,17-트리오실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 도 14(b)는 15,16,17-트리오실린 B3의 탄소 NMR 스펙트럼 및 도 14(c)는 15,16,17-트리오실린 B3의 COSY NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 15-수산화 지방산 및 헤폭실린 B 유사체를 동시에 제조하고자, 미생물 유래 15-지방산화효소에 대한 지속적인 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소; 또는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 효소가 포함된 전세포를 각각 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 15-수산화 지방산 및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체)를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본원 명세서 내 "수산화지방산"이라 함은 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태를 의미하는 것으로, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬 15번째 또는 17번째 탄소에 수산화기 또는 과산화기를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 수산화지방산은 15-수산화아라키돈산(15-hydroxyarachidonic acid), 15-과수산화아라키돈산(15-perhydroxyarachidonic acid), 15-수산화에이코사펜타엔산(15-hydroxyeicosapentaenoic acid), 15-과수산화에이코사펜타엔산(15-perhydroxyeicosapentaenoic acid), 15-수산화 에이코사트리엔산(15-hydroxyeicosatrienoic acid), 15-과수산화 에이코사트리엔산(15-perhydroxyeicosatrienoic acid), 17-수산화도코사헥사엔산(17-hydroxydocosahexaenoic acid), 17-과수산화도코사헥사엔산(17-perhydroxydocosahexaenoic acid), 17-수산화도코테트라엔산(17-hydroxydocosatetraenoic acid) 및 17-과수산화도코사테트라엔산(17-perhydroxydocosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서 내 "헤폭실린 B 유사체"라 함은 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬에 하나의 에폭시드기와 하나의 수산화기가 결합된 형태를 의미하는 것으로, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬 14~15번째 또는 16~17번째 탄소에 에폭시드기와 13번째 또는 15번째 탄소에 수산화기가 결합된 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B3(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 14,15-헤폭실린 B4(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 14,15-헤폭실린 B2(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서 내 "트리오실린 B 유사체"라 함은 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬에 세개의 수산화기가 결합된 형태를 의미하는 것으로, 상기 헤폭실린 B 유사체의 에폭시드기가 가수분해하여 생성되는 것을 말한다. 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산의 사슬 13~15번째 또는 15~17번째 탄소에 각각 세개의 수산화기가 결합된 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B3(13,14,15-hydroxy-5,8,11(Z,Z,Z)-eicosatrienoic acid), 13,14,15-트리오실린 B4 (13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5 (15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3(15,16,17-hydroxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
또는, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 15-지방산화효소 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
상기 15-지방산화효소는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 15-지방산화효소는 서열번호 3로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 또한, 상기 15-지방산화효소는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주의 최적 활성 온도는 25℃ 내지 30℃, 바람직하게 25℃이다.
또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소 역시 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 15-지방산화효소를 포함하는 전세포, 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포, 또는 상기 15-지방산화효소 및 상기 에폭사이드 가수분해효소를 모두 포함하는 전세포의 농도는 6.0 g/l 내지 50.0 g/l인 것이 바람직하고, 15.0 g/l 내지 50.0 g/l인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 전세포는 이러한 농도를 유지함으로써, 헤폭실린 B 유사체의 생산농도 및 몰전환수율을 동시에 향상시킬 수 있다.
상기 조성물은 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산(특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4-펜타디엔을 가지고 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것으로, 상기 불포화 지방산은 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 도코사테트라엔산 및 디호모-감마-리놀레산로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 기질 내 상기 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 100mM인 것이 바람직하고, 10mM 내지 100mM인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 불포화 지방산은 이러한 농도를 유지함으로써, 헤폭실린 B 유사체의 생산농도 및 몰전환수율을 동시에 향상시킬 수 있다.
또한, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
또는, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또는, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
또한, 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 15-지방산화효소를 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 모두 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자와 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 동시에 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 재조합 발현 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 또는 pACYC duet 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환된 형질전환체로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 ER 2566 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 15-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 ⅰ) 상기 미생물의 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ⅱ) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; ⅲ) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 ⅳ) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, ⅰ) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ⅱ) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조방법을 제공한다.
또는, 상기 조성물을 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체) 제조방법은 상기 조성물을 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하는 단계를 포함하는 것으로, 상기 조성물의 구체적인 내용에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 기질은 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산(특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4-펜타디엔을 가지고 탄소수가 18~22개인 불포화 지방산)을 포함하는 것으로, 상기 불포화 지방산은 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 도코사테트라엔산 및 디호모-감마-리놀레산로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 기질 내 상기 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 100mM인 것이 바람직하고, 10mM 내지 100mM인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 불포화 지방산은 이러한 농도를 유지함으로써, 헤폭실린 B 유사체의 생산농도 및 몰전환수율을 동시에 향상시킬 수 있다.
상기 처리는 pH 6.5~8.5 및 20~35℃ 조건에서 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 6.5~8.5인 것이 바람직하고, pH 7.5~8.0인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 헤페스(HEPES) 완충용액 또는 트리스-염산(Tris-HCl) 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 20~35℃인 것이 바람직하고, 25~30℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조건을 유지함으로써, 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체의 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소를 이용함으로써, 환경 친화적인 방법으로 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
뿐만 아니라, 복합효소로서, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-지방산화효소 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 이용함으로써, 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체는 신규 지질 조절물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 15 -지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현
(1) 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명에서는 15-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소를 발현하기 위하여, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주의 유전자로부터 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주의 유전자로부터 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이들을 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 한국미생물보존센터(서울)에서 아미노산 서열 및 염기 서열이 이미 특정되어 있는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) KCTC 23190 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622를 구입하여 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소 염기 서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)의 genomic DNA를 추출(Intron)하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소의 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 15-지방산화효소 염기서열의 프라이머는 제한효소로 Nhe I과 Hind III를 이용하였고, Forward : 5'-GCT AGC ATG GTC AAT CAC AAA ACC GG-3' / Reverse : 5'-AAG CTT TCA AAT GTT CGT GCT TGC CG-3'로 구성하였다. 에폭사이드 가수분해효소 염기서열의 프라이머는 제한효소로 Nde I과 Hind III를 이용하였고, Forward : 5'-GCG CAT ATG GCT GAC ATC ACG CAT CGA AC-3' / Reverse : 5'-GCT AAG CTT TCA GGC CGG CAG CTT CTT CA-3'로 구성하였다. 또한, 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 하나의 벡터로 조합하기 위하여 조합 벡터(pACYC duet)에 대한 프라이머를 구성하였다. 15-지방산화효소의 경우, 제한효소로 EcoR I과 Hind III를 이용하였고, 에폭사이드 가수분해효소의 경우, 제한효소로 Nde I과 Xho I을 이용하였다. 각각 Forward : 5'-GAT CGA ATG GTC AAT CAC AAA ACC GGG TC-3'/ Reverse; 5'-GCC GCA TCA AAT GTT CGT GCT TGC CGG AA-3''와 Foward : 5'-GCG CAT ATG GCT GAC ATC ACG CAT CGA ACC GT-3'/ Reverse : 5'-GCG CTC GAG TCA GGC CGG CAG CTT CTT CA-3'로 구성하였다. 그런 다음, 재조합 플라스미드 벡터 pET 28a(+)(Novagen사 제품) 및 pACYC duet(Novagen사 제품) 또한 제한효소를 처리하여 준비하였으며, ligation하여 각각 pET 28(+)a/15-지방산화효소, pET 28(+)a/에폭사이드 가수분해효소 및 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 모두 포함하는 pACYC duet/15-지방산화효소/에폭사이드 가수분해효소를 제작하였다.
이후 이러한 재조합 발현 벡터들은 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs(Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하고, 형질전환된 미생물들은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 수산화지방산 및 헤폭실린 B유사체의 제조를 위한 배양을 실시하기 전에 -70℃에 냉동 보관하였다.
(2) 15-지방산화효소 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현 및 전세포 준비
효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관시킨 형질전환된 미생물들은 450 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신(클로람페니콜)을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후, 그 배양액을 18시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
이후 이러한 효소들을 포함한 전세포를 확보하기 위해서, 형질전환된 균주들의 배양액을 3,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체의 제조를 위한 전세포로 사용하였다.
실시예 2: 15 -지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 최적 pH 확인
본 발명에서는 15-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 최적 pH를 확인하기 위하여, 25℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소를 포함한 전세포 15 g/ℓ를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액(pH 6.5-8.0) 및 트리스-염산(Tris-HCl) 완충용액(pH 7.5-8.5)을 기질로서, 1 mM 의 아라키돈산에 5분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 1(a)에 나타내었다.
도 1(a)에 나타난 바와 같이, 최적 pH가 6.5 내지 8.5, 바람직하게 7.5 내지 8.0인 것으로 확인된다.
실시예 3: 15 -지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 최적 온도 확인
본 발명에서는 15-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 최적 온도를 확인하기 위하여, pH 7.5 및 20~35℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소를 포함한 전세포 15 g/ℓ를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 기질로서, 1 mM 의 아라키돈산에 15분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 1(b)에 나타내었다.
도 1(b)에 나타난 바와 같이, 최적 온도가 25℃ 내지 30℃, 바람직하게 25℃인 것으로 확인된다.
실시예 4: 15 -지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 전세포의 최적 농도 확인
본 발명에서는 15-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 전세포의 최적 농도를 확인하기 위하여, pH 7.5 및 25℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소를 포함한 전세포 0 g/ℓ ~ 21.0 g/ℓ를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 기질로서, 10 mM의 아라키돈산에 30분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 2(a)에 나타내었다.
도 2(a)에 나타난 바와 같이, 전세포의 최적 농도가 15.0 g/ℓ 이상인 것으로 확인된다.
실시예 5: 15 -지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 기질 내 아라키돈산의 최적 농도 확인
본 발명에서는 15-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조시, 기질 내 아라키돈산의 최적 농도를 확인하기 위하여, pH 7.5 및 25℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소를 포함한 전세포 15.0 g/ℓ를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 기질로서, 1 mM ~ 12 mM 의 아라키돈산에 30분 동안 처리한 다음 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였고, 그 결과는 도 2(b)에 나타내었다.
도 2(b)에 나타난 바와 같이, 기질 내 아라키돈산의 최적 농도가 10 mM 이상인 것으로 확인된다.
실시예 6: 15 -지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조
본 발명에서는 15-지방산화효소를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조를 확인하기 위하여, pH 7.5 및 25℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소를 포함한 전세포 15.0 g/ℓ를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 기질로서, 10 mM의 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 도코사테트라엔산 및 디호모-감마-리놀레산에 각각 처리하여, 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체의 시간별 생산농도를 측정하였고, 그 결과는 도 3(a) 내지 (e)에 나타내었다.
도 3(a)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소를 아라키돈산에 처리한 경우, 1.48 mM 농도의 15-수산화아라키돈산, 8.47 mM 농도의 14,15-헤폭실린 B3를 생산하였고, 14,15-헤폭실린 B3의 최종 몰전환수율은 84.7%인 것으로 확인된다. 이때, 14,15-헤폭실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 6(a)~(c)를 통해 확인된다. 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소를 에이코사펜타엔산에 처리한 경우, 3.64 mM 농도의 15-수산화에이코사펜타엔산, 6.26 mM 농도의 14,15-헤폭실린 B4를 생산하였고, 14,15-헤폭실린 B4의 최종 몰전환수율은 62.6%인 것으로 확인된다. 이때, 14,15-헤폭실린 B4의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 7(a)~(c)를 통해 확인된다.
도 3(c)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소를 도코사헥사엔산에 처리한 경우, 4.91 mM 농도의 17-수산화도코사헥사엔산, 5.13 mM 농도의 16,17-헤폭실린 B5를 생산하였고, 16,17-헤폭실린 B5의 최종 몰전환수율은 51.3%인 것으로 확인된다. 이때, 16,17-헤폭실린 B5의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 8(a)~(c)를 통해 확인된다.
도 3(d)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소를 도코사테트라엔산에 처리한 경우, 5.13 mM 농도의 17-수산화도코사테트라엔산, 4.24 mM 농도의 16,17-헤폭실린 B3를 생산하였고, 16,17-헤폭실린 B3의 최종 몰전환수율은 42.4%인 것으로 확인된다. 이때, 16,17-헤폭실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 9(a)~(c)를 통해 확인된다.
도 3(e)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소를 디호모-감마-리놀레산에 처리한 경우, 8.90 mM 농도의 17-수산화에이코트리엔산(γ), 1.09 mM 농도의 14,15-헤폭실린 B2(γ)를 생산하였고, 14,15-헤폭실린 B2(γ)의 최종 몰전환수율은 11.0%인 것으로 확인된다. 이때, 14,15-헤폭실린 B2(γ)의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 10(a)~(c)를 통해 확인된다.
실시예 7: 전세포의 고농도 및 기질 내 아라키돈산의 고농도에 따른, 15-지방산화효소(선택적으로, 에폭사이드 가수분해효소)를 이용한 수산화지방산및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체) 제조
본 발명에서는 전세포의 고농도 및 기질 내 아라키돈산의 고농도에 따른, 15-지방산화효소(선택적으로, 에폭사이드 가수분해효소)를 이용한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체(선택적으로, 트리오실린 B 유사체) 제조를 확인하기 위하여, pH 7.5 및 25℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소를 포함한 전세포 혹은 15-지방산화효소와 에폭사이드 가수분해효소를 포함한 전세포 45.0 g/ℓ를 각각 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 기질로서, 50 mM 의 아라키돈산에 각각 처리하여, 헤폭실린 B 유사체 혹은 트리오실린 B 유사체)의 시간별 생산농도를 측정하였고, 그 결과는 도 4(a) 및 (b)에 나타내었다.
도 4(a)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소(전세포의 농도: 45.0 g/ℓ)를 이라키돈산(기질 내 아라키돈산의 농도: 50 mM)에 처리한 경우, 40 mM 농도의 14,15-헤폭실린 B3를 생산하였고, 이의 최종 몰전환수율은 87%인 것으로 확인된다. 한편, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소와 에폭사이드 가수분해효소(전세포의 농도: 45.0 g/ℓ)를 아라키돈산(기질 내 아라키돈산의 농도: 50 mM)에 처리한 경우, 32 mM 농도의 13,14,15-트리오실린 B3를 생산하였고, 이의 최종 몰전환수율은 73%인 것으로 확인된다.
즉, 도 4(b)의 경우, 후술하는 도 5(a)와 비교하면, 전세포의 농도 및 기질 내 아라키돈산의 농도가 높아짐에 따라, 13,14,15-트리오실린 B3의 최종 몰전환수율은 약 9.8% 정도 낮아지지만, 13,14,15-트리오실린 B3의 생산농도는 약 4배 이상 높은 것으로 확인된다.
실시예 8: 15 -지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체 제조
본 발명에서는 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체 제조를 확인하기 위하여, pH 7.5 및 25℃ 조건에서, 실시예 1에서 제조한 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소 전세포 15.0 g/ℓ를 함유한 50 mM 헤페스(HEPES) 완충용액을 기질로서, 10 mM의 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 및 도코사테트라엔산에 각각 처리하여, 수산화지방산, 헤폭실린 B 유사체 및 트리오실린 B 유사체의 시간별 생산농도를 측정하였고, 그 결과는 도 5(a) 내지 (d)에 나타내었다.
도 5(a)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 이라키돈산에 처리한 경우, 8.28 mM 농도의 13,14,15-트리오실린 B3를 생산하였고, 이의 최종 몰전환수율은 82.8%인 것으로 확인된다. 이때, 13,14,15-트리오실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 11(a)~(c)를 통해 확인된다.
도 5(b)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 에이코사펜타엔산에 처리한 경우, 6.23 mM 농도의 13,14,15-트리오실린 B4를 생산하였고, 이의 최종 몰전환수율은 62.3%인 것으로 확인된다. 이때, 13,14,15-트리오실린 B4의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 12(a)~(c)를 통해 확인된다.
도 5(c)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 도코사헥사엔산에 처리한 경우, 5.10 mM 농도의 15,16,17-트리오실린 B5를 생산하였고, 이의 최종 몰전환수율은 48.9%인 것으로 확인된다. 이때, 15,16,17-트리오실린 B5의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 13(a)~(c)를 통해 확인된다.
도 5(d)에 나타난 바와 같이, 15-지방산화효소 및 에폭사이드 가수분해효소를 도코사테트라엔산에 처리한 경우, 4.22 mM 농도의 15,16,17-트리오실린 B3를 생산하였고, 이의 최종 몰전환수율은 42.2%인 것으로 확인된다. 이때, 15,16,17-트리오실린 B3의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 COSY NMR 스펙트럼은 도 14(a)~(c)를 통해 확인된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING HYDROXYFATTY ACID, HEPOXILIN B ANALOG OR TRIOXILIN B ANALOG <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 695 <212> PRT <213> Burkholderia thailandensis <400> 1 Met Val Asn His Lys Thr Gly Ser Asn Met Asn Arg Arg Asp Leu Ile 1 5 10 15 Lys Phe Leu Ser Phe Ala Ala Ser Gly Thr Ala Phe Ala Gly Leu Val 20 25 30 Arg Ser Thr Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ile Thr Ala Ser Pro 35 40 45 Arg Thr Leu Asp Ala Gly Ile Gly Ile Ser Ser Pro Gln Ala Val Arg 50 55 60 Ala Ala Ala Pro Val Leu Pro Gln Lys Asp Thr Ala Ala Gly Arg Ile 65 70 75 80 Ala Arg Ala Gly Phe Leu Ala Thr Gln Arg Leu Ser Tyr Ile Trp Thr 85 90 95 Glu His Val Pro Thr Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ala Leu Val Thr Pro 100 105 110 Gln Asp Leu Pro Thr Ile Glu Trp Leu Ile Lys Phe Ile Ala Ile Val 115 120 125 Val Gly Val Ile Glu Asn Phe Leu Gly Ser Ala Pro Ala Thr Ala Val 130 135 140 Ala Leu Trp Arg Asp Gln Phe Ala Lys Ile Arg Val Asp Leu Leu Ser 145 150 155 160 Leu Glu Asn Leu Tyr Ser Asp Leu Thr His Asp Pro Asn Leu Gln Asp 165 170 175 Pro Val Ala Ile Ala Gln Ala Ala Ser Ile Gln Ala Ala Leu Ile Ala 180 185 190 Leu Leu Ala Asn Val Gly Val Leu Ser Lys Asp Ile Ile Ser Arg Leu 195 200 205 Gly Glu Ile Val Ser Asn His Asp Thr Arg Ser Glu Glu Asn Phe Lys 210 215 220 Ala Leu Phe Ser Thr Phe Pro Leu Pro Asp Ile Ser Ala Ala Tyr Gln 225 230 235 240 Arg Asp Asp His Phe Ala Ser Leu Arg Val Ala Gly Gln Asn Pro Val 245 250 255 Leu Ile Lys Arg Ile Ser Gly Leu Pro Ser Lys Phe Pro Leu Thr Asn 260 265 270 Ala Gln Phe Gln Gln Val Met Gly Pro Ala Asp Asn Leu Val Ser Ala 275 280 285 Ala Ala Glu Asn Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Tyr Val Asp Asn Gly Leu 290 295 300 Leu Ala Thr Ser Arg Ala Val Ala Lys Pro Leu Thr Gly Ile Gly Tyr 305 310 315 320 Ser Tyr Ala Pro Ile Ala Leu Phe Ala Leu Pro Arg Gly Gly Ala Ser 325 330 335 Leu Val Pro Val Ala Ile Gln Cys Asp Gln Asp Pro Ala Thr Asn Pro 340 345 350 Leu Phe Leu Pro Ala Asp Pro Ser Gln Glu Ser Ala Tyr Trp Ala Trp 355 360 365 Gln Met Ala Lys Thr Val Val Gln Cys Ala Glu Glu Asn Tyr His Glu 370 375 380 Met Phe Val His Leu Ala Arg Thr His Leu Val Thr Gly Ala Ile Cys 385 390 395 400 Val Ala Thr His Arg Asn Leu Ala Ser Thr His Pro Leu Tyr Ala Leu 405 410 415 Leu Met Pro His Phe Glu Gly Thr Leu Tyr Ile Asn Glu Leu Ala Ala 420 425 430 Leu Thr Leu Leu Pro Pro Leu Met Phe Ile Asp Thr Leu Phe Ala Ala 435 440 445 Pro Ile Gln Gln Thr Gln Gln Met Val Ala Ser Asp Arg Leu Ala Phe 450 455 460 Asp Phe Tyr Asp His Met Leu Pro Asn Asp Ile Glu Met Arg Gly Val 465 470 475 480 Gly Ala Ala Asn Leu Pro Asp Tyr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Leu Leu 485 490 495 Ile Trp Asn Ala Ile Ala Glu Trp Ala Lys Ala Tyr Val Asp Val Tyr 500 505 510 Tyr Lys Ser Asp Gln Asp Val Val Asp Asp Tyr Glu Leu Arg Ser Trp 515 520 525 Ala Ala Asp Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Lys Gly Phe Arg Pro Val 530 535 540 Arg Ser Lys Ala Gln Leu Ile Asp Val Leu Thr Met Ile Ile Phe Thr 545 550 555 560 Ala Ser Ala Gln His Ala Ala Val Asn Phe Ser Gln Ser Asp Phe Ser 565 570 575 Thr Tyr Ala Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Ser Ala Pro Ala Pro Thr 580 585 590 Ser Ala Val Gly Lys Ser Lys Ala Asp Trp Leu Lys Met Leu Pro Pro 595 600 605 Leu Val Ser Gly Ile Glu Arg Val Ala Ile Tyr Glu Ile Leu Ala Gly 610 615 620 Val Gln His Ser Ala Leu Gly Gln Tyr Arg Ser Asn Val Phe Pro Tyr 625 630 635 640 Arg Pro Leu Ile Thr Asp Pro Ala Ile Thr Gly Ser Asn Gly Pro Leu 645 650 655 Glu His Phe Arg Gln Ala Leu Gly Asp Val Glu Ser Gln Ile Asn Ala 660 665 670 Arg Asn Ser Ile Arg Lys Thr Pro Tyr Glu Tyr Leu Leu Pro Ser Arg 675 680 685 Ile Pro Ala Ser Thr Asn Ile 690 695 <210> 2 <211> 319 <212> PRT <213> Myxococcus xanthus <400> 2 Met Ala Asp Ile Thr His Arg Thr Val Lys Thr Asn Gly Ile Asn Leu 1 5 10 15 His Leu Ala Glu Ala Gly Ser Gly Pro Leu Val Leu Leu Leu His Gly 20 25 30 Trp Pro Glu Ser Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Leu Pro Ala Leu Ala 35 40 45 Ala Ala Gly Tyr His Ala Val Ala Pro Asp Val Arg Gly Tyr Gly Gln 50 55 60 Ser Asp Lys Pro Glu Ala Ile Glu Ala Tyr Ser Met Lys Gln Leu Val 65 70 75 80 Gly Asp Ala Val Gly Leu Leu Asp Ala Leu Gly Glu Arg Thr Ala Ile 85 90 95 Val Ile Gly His Asp Trp Gly Ser Ala Ile Ala Trp Asn Cys Ala Ala 100 105 110 Leu His Pro Asp Arg Phe Arg Ala Val Val Gly Met Ser Val Pro His 115 120 125 Leu Gly Arg Ala Pro Met Pro Pro Met Gln Leu Phe Gln Arg Met Phe 130 135 140 Gly Glu Lys Trp Phe Tyr Ile Leu Tyr Phe Gln Glu Pro Gly Val Ala 145 150 155 160 Glu Ala Glu Phe Glu Ala Asp Val Pro Arg Thr Val Arg Ala Ile Leu 165 170 175 Thr Gly Thr Pro Gly Phe Asp Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Ala Lys 180 185 190 Lys Lys Gly Glu Gly Phe Leu Ala Arg Leu Asp Val Pro Glu Thr Leu 195 200 205 Pro Gly Trp Leu Thr Glu Ala Asp Val Ala Tyr Phe Ala Lys Glu Leu 210 215 220 Ala Gly Ser Gly Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Met Asp 225 230 235 240 Arg Asp Trp His Glu Leu Pro Glu Leu Ala Thr Ala Val Ile Ser Gln 245 250 255 Pro Ala Leu Tyr Ile Val Gly Glu Lys Asp Pro Val Arg Ala Phe Ser 260 265 270 Pro Val Asp Pro Met Lys Ala Leu Val Pro Asn Leu Ala Asp Ile His 275 280 285 Val Ile Pro Gly Ala Gly His Trp Val Gln Gln Glu His Ala Ala Glu 290 295 300 Val Asn Ala Ala Leu Leu Ala Phe Leu Lys Lys Leu Pro Ala Glx 305 310 315 <210> 3 <211> 2087 <212> DNA <213> Burkholderia thailandensis <400> 3 atggtcaatc acaaaaccgg gtcaaatatg aaccgaaggg atttaattaa attcttgagc 60 ttcgccgcca gcggaaccgc gtttgcgggg ctcgtcaggt cgactctgtc gtcaccggcc 120 gcgtcgtcga tcaccgcaag ccctcgcacg ctcgacgccg gcatcggcat ttcgtcgccg 180 caggcggttc gcgcagccgc gccggtgctg ccgcaaaaag acacggccgc aggcaggatc 240 gcacgggcgg gttttctcgc cacgcaaaga ctgagttaca tctggacgga acatgtgccg 300 accgcgagcg gcattccact tgcgctggtc acgccgcaag atcttccaac cattgaatgg 360 ctgatcaaat tcatcgcgat cgttgtgggc gtcatcgaga attttctcgg ctccgcaccc 420 gcgacggcgg ttgccctctg gcgcgatcag ttcgccaaga tcagggtgga tctgctttcc 480 ctcgaaaacc tgtattcgga tctcacccac gatccgaact tgcaagaccc ggttgccatt 540 gctcaggcag cgagcattca ggcggccttg atcgcgctgt tggcgaacgt cggcgtcttg 600 tcgaaggaca tcatttcaag attgggcgaa atcgtctcca accacgacac tcgaagcgaa 660 gagaacttca aggcgctgtt ttccaccttc ccgcttcccg acatctccgc cgcgtaccag 720 cgggacgatc atttcgcgtc tctccgggtt gccggcagaa tccggtgttg atcaagcgca 780 tctccggctt gccgtcgaag ttcccactga cgaacgctca attccagcaa gtcatggggc 840 ccgccgacaa tctcgtcagc gccgccgcgg agaatcggct gtatctcctc gattacgtcg 900 acaacggtct gttggcgacg tcgcgggccg tggccaaacc actcacgggc atcggctact 960 cctatgcgcc catcgcactt ttcgcgctgc cgaggggcgg cgcgtccctc gttcccgtgg 1020 cgattcaatg cgatcaggat cccgcgacga atcccctgtt cctccctgcc gatcccagtc 1080 aggaatccgc ctattgggcg tggcaaatgg ccaagacggt cgttcaatgc gcggaggaaa 1140 actatcacga gatgtttgtt catctcgcgc gaacgcacct ggtgaccggc gcgatttgcg 1200 tcgccactca ccggaatctc gcgtcgacgc atccgctcta cgcgcttctg atgccgcact 1260 tcgagggcac tttgtacatc aacgaactcg ccgcgctcac gctgcttcca ccgttgatgt 1320 tcatcgatac gctgtttgcc gcgcccatcc agcagacgca acagatggtc gcaagcgatc 1380 ggctcgcgtt cgatttctac gatcacatgt tgcccaacga catcgaaatg cgcggagtcg 1440 gcgcggccaa cctgccggac tatccgtatc gcgacgacgg cctcctgatt tggaacgcca 1500 tcgccgaatg ggcgaaggcg tatgtcgatg tctattacaa gtccgatcag gatgtcgtcg 1560 atgactacga gctcaggtcc tgggccgccg acatcatcgc caacggcaag gtcaagggat 1620 tccggccggt gcgttcgaag gcgcaattga tcgacgtgct gaccatgatc atctttaccg 1680 caagcgccca gcacgccgcc gtcaacttct cgcagtcgga tttttcgacc tacgcgcccg 1740 cgctttccgc actgctgtcc gcgccggccc cgacaagcgc cgtgggaaaa agcaaggccg 1800 attggctgaa gatgctccct cccctcgttt cagggatcga gcgggttgcg atctacgaga 1860 tcttggcggg cgtccagcac agcgcgttgg gccagtatcg cagcaacgta tttccatatc 1920 ggccgctcat cacggacccc gcgatcaccg gaagcaacgg gccgctcgag catttccgac 1980 aggcgctcgg cgacgtcgaa tcgcagatca acgctcgcaa cagcatacgc aagacgcctt 2040 atgaatatct gctgccgagc cggattccgg caagcacgaa catttga 2087 <210> 4 <211> 957 <212> DNA <213> Myxococcus xanthus <400> 4 atggctgaca tcacgcatcg aaccgtaaag acgaatggca tcaacctgca cctcgcggag 60 gcgggttcag ggccgctcgt gttgctcctg catggttggc cggagtcctg gtactcgtgg 120 cgccatcagc ttccggcgtt ggcggcggcg gggtaccacg cggtggcccc agacgtccgt 180 ggctacggcc agagcgacaa gccggaggcc atcgaggcgt acagcatgaa gcagttggtg 240 ggtgatgcgg ttggcctgct ggatgcgctg ggggagagga cggccatcgt catcggccac 300 gactggggct cggcgattgc ctggaactgt gccgccctgc atcccgaccg cttccgcgcg 360 gtggtgggaa tgagcgttcc ccatctgggg cgcgcgccca tgccgcccat gcagttgttt 420 cagcgcatgt tcggtgagaa gtggttctac atcctctact tccaggagcc cggcgtggcc 480 gaggccgagt tcgaggcgga cgtcccgagg acggtccggg cgattctcac gggcaccccc 540 ggcttcgatg tgacgaatcc cgccgtgctg gcgaagaaga agggggaagg cttcctcgcg 600 aggctcgacg tacctgagac gttgcccggc tggctcaccg aggcggacgt cgcgtacttc 660 gcgaaggagc tcgccggcag tggattccgg ggcgggctca atcgctaccg caacatggac 720 cgggactggc acgaactgcc ggagctggcg acggcggtca tctcgcagcc ggccctctac 780 atcgtcggag agaaggaccc ggtgcgtgcc ttctctcccg ttgacccgat gaaggccctg 840 gtgccgaacc tggccgacat ccacgtcatt cccggcgcgg gtcattgggt tcagcaggag 900 cacgccgccg aggtgaatgc cgcgctgctg gccttcctga agaagctgcc ggcctga 957

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 포함하고, 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물로서,
    상기 불포화 지방산은 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 디호모-감마-리놀레산(dihomo-gamma-liolenic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고,
    상기 수산화지방산은 상기 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태이고,
    상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B4(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoicacid), 14,15-헤폭실린 B2(γ)(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoicacid)및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoicacid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 15-지방산화효소는 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주로부터 유래된
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 수산화지방산은 15-수산화에이코사펜타엔산(15-hydroxyeicosapentaenoic acid), 15-과수산화에이코사펜타엔산(15-perhydroxyeicosapentaenoic acid), 15-수산화 에이코사트리엔산(γ)(15-hydroxyeicosatrienoic acid), 15-과수산화 에이코사트리엔산(γ)(15-perhydroxyeicosatrienoic acid), 17-수산화도코사헥사엔산(17-hydroxydocosahexaenoic acid), 17-과수산화도코사헥사엔산(17-perhydroxydocosahexaenoic acid), 17-수산화도코테트라엔산(17-hydroxydocosatetraenoic acid) 및 17-과수산화도코사테트라엔산(17-perhydroxydocosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 15-지방산화효소를 포함하는 전세포의 농도는 6.0 g/l 내지 50.0 g/l인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 추가로 포함하고, 트리오실린 B 유사체를 추가로 제조하기 위한 것이며,
    상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B4(13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5(15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3(15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 15-지방산화효소 및 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포의 농도는 6.0 g/l 내지 21.0 g/l인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  7. 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물로서,
    상기 불포화 지방산은 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 디호모-감마-리놀레산(dihomo-gamma-liolenic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고,
    상기 수산화지방산은 상기 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태이고,
    상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B4(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoicacid), 14,15-헤폭실린 B2(γ)(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoicacid)및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoicacid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 트리오실린 B 유사체를 추가로 제조하기 위한 것이며,
    상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B4(13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5(15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3(15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느한 항에 따른 조성물을 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하는 단계를 포함하고,
    상기 불포화 지방산은 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 디호모-감마-리놀레산(dihomo-gamma-liolenic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 기질 내 상기 불포화 지방산의 농도는 1mM 내지 100mM인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 처리는 pH 6.5~8.5 및 20~35℃ 조건에서 수행되는 것인
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조방법.
  12. 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 15-지방산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터로서,
    상기 수산화지방산은 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 디호모-감마-리놀레산(dihomo-gamma-liolenic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 불포화 지방산의 사슬에 하나 이상의 수산화기 또는 과산화기가 결합된 형태이고,
    상기 헤폭실린 B 유사체는 14,15-헤폭실린 B4(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoicacid), 14,15-헤폭실린 B2(γ)(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoicacid)및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoicacid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서,
    서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 트리오실린 B 유사체를 추가로 제조하기 위한 것이며,
    상기 트리오실린 B 유사체는 13,14,15-트리오실린 B4(13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5(15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3(15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    수산화지방산 및 헤폭실린 B 유사체 제조용 재조합 발현 벡터.
  14. 숙주세포에 제12항 또는 제13항에 따른 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체.
  15. 14,15-헤폭실린 B4(13-hydroxy-14,15-epoxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoicacid), 14,15-헤폭실린 B2(γ)(13-hydroxy-14,15-epoxy-8,11(Z,Z)-eicosadienoic acid), 16,17-헤폭실린 B5(15-hydroxy-16,17-epoxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoicacid)및 16,17-헤폭실린 B3(15-hydroxy-16,17-epoxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatetraenoicacid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    헤폭실린 B 유사체.
  16. 13,14,15-트리오실린 B4(13,14,15-hydroxy-5,8,11,17(Z,Z,Z,Z)-eicosatetraenoic acid), 15,16,17-트리오실린 B5(15,16,17-hydroxy-4,7,10,13,19(Z,Z,Z,Z,Z)-docosapentaenoic acid) 및 15,16,17-트리오실린 B3(15,16,17-hydorxy-7,10,13(Z,Z,Z)-docosatrienoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    트리오실린 B 유사체.
KR1020190025391A 2019-03-05 2019-03-05 수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물 KR102184967B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190025391A KR102184967B1 (ko) 2019-03-05 2019-03-05 수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190025391A KR102184967B1 (ko) 2019-03-05 2019-03-05 수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200106766A KR20200106766A (ko) 2020-09-15
KR102184967B1 true KR102184967B1 (ko) 2020-12-01

Family

ID=72450559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190025391A KR102184967B1 (ko) 2019-03-05 2019-03-05 수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102184967B1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101934900B1 (ko) * 2017-05-19 2019-01-03 건국대학교 산학협력단 수산화지방산, 헤폭실린 b 또는 트리오실린 b 제조용 조성물

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Biological Chemistry, Vol. 284, pp. 31280-31290 (2009.)*
Lipids, Vol. 46, pp. 69-79 (2010.10.29.)*
Nature Communications, Vol. 9, pp. 128 (1-9) (2018.01.09.)
NCBI GenBank Accession No. ABC36974.1 (2014.01.31.)*
The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274, pp. 28213-28218 (1999.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200106766A (ko) 2020-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101934900B1 (ko) 수산화지방산, 헤폭실린 b 또는 트리오실린 b 제조용 조성물
KR100224120B1 (ko) 지방산의불포화화효소유전자,그유전자를함유한벡터
KR101934904B1 (ko) 11-수산화지방산, 헤폭실린 d3 또는 트리오실린 d3 제조용 조성물
DE102007015583A1 (de) Ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonyl-Coenzym A oder Ethylmalonyl-Coenzym A sowie dessen Verwendung
KR101642583B1 (ko) 버콜데리아 타일란덴시스 유래 지방산화효소에 의한 13-수산화 리놀레익산의 고수율 제조방법 및 그 조성물
AU2011235307A1 (en) Pentose phosphate pathway upregulation to increase production of non-native products of interest in transgenic microorganisms
KR102086235B1 (ko) 리폭시게나아제 조합반응에 의한 레졸빈 d2 유사체 제조방법 및 이로부터 제조된 레졸빈 d2 유사체
CA2394140A1 (en) Enzymes and genes used for producing vanillin
JPH11513255A (ja) 立体特異的ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ酵素をコードする核酸断片、ならびにキラルアミドおよび酸の生産に有用なそれら酵素を発現する組換え微生物
KR102184967B1 (ko) 수산화지방산, 헤폭실린 b 유사체 또는 트리오실린 b 유사체 제조용 조성물
KR102086298B1 (ko) 리폭시게나아제 조합반응에 의한 리폭신 유사체의 제조방법 및 이로부터 제조된 리폭신 유사체
CA2633847A1 (en) A novel 32 kda lipase from tetrasphaera
KR102131550B1 (ko) 박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제에 의한 레졸빈 d5의 생산
KR102555535B1 (ko) 9-리폭시게나아제 또는 이의 변이체를 이용한 수산화지방산 또는 이수산화지방산 제조용 조성물 및 이를 이용한 제조방법
KR102086236B1 (ko) 리폭시게나아제 조합반응에 의한 8,15-이과수산화 지방산 또는 류코트리엔 유사체의 제조방법
KR102120000B1 (ko) 박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제에 의한 5,15-이수산화아라키돈산의 생산
KR102278582B1 (ko) 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물 및 이를 이용한 이수산화지방산의 제조방법
KR102379220B1 (ko) 5r-리폭시게나아제 변이체를 이용한 수산화지방산 또는 이수산화지방산 제조용 조성물 및 이를 이용한 제조방법
KR102131549B1 (ko) 박테리아 유래의 신규 리폭시게나아제에 의한 5,15-이수산화에이코사펜타엔산의 생산
KR102190311B1 (ko) 리폭시게나아제 조합반응에 의한 프로텍틴 dx 제조방법
KR101596435B1 (ko) 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제
US20220282288A1 (en) Novel oleate hydratases
KR20240094252A (ko) 신규한 수산화 지방산의 제조방법
KR20240029670A (ko) 신규한 15r-지방산화효소, 이를 이용한 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물 및 제조방법
Ahn et al. Overexpression of thermoalkalophilic lipase from Bacillus stearothermophilus L1 in Saccharomyces cerevisiae

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant