KR20240029670A - 신규한 15r-지방산화효소, 이를 이용한 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물 및 제조방법 - Google Patents

신규한 15r-지방산화효소, 이를 이용한 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리아에서 유래한 카이랄성 또는 손대칭성이 R-형태를 띄는 신규한 지방산화효소(lipoxygenase)를 이용하여 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 흡착 수지 가 첨가된 반응물에서 불포화지방산인 에이코사펜타에논산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사에논산(docosahexaenoic acid, DHA) 그리고 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)으로부터 향상된 농도의 레졸빈 E4 입체이성질체 (enantiomer of resolvin E4, RvE4)와 레졸빈 D5 입체이성질체(enantiomer of resolvin D5, RvD5) 및 5R,15R-이수산화 아라키돈산(5R,15R-dihydroxy eicosatetraenoic acid, 5R,15R-DiHETE)을 제조하는 방법 및 그 제조용 조성물에 관한 것이다.본 발명에 의하면, 친환경적인 방법으로, 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있고 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 15R-지방산화효소, 이를 이용한 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물 및 제조방법{Novel 15R-lipoxygenase, composition and method for producing hydroxylated fatty acid or dihydroxy fatty acid using the same}
본 발명은 박테리아에서 유래한 카이랄성 또는 손대칭성이 R-형태를 띄는 신규한 지방산화효소(lipoxygenase)를 이용하여 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 기술이다.
이수산화 지방산은 여러 생물체의 지질에 존재하여 지질로부터 생성되고 동물, 식물, 미생물 및 곤충과 같은 다양한 유기체에서 내포하고 있는 물질이다. 지방산에 작용기인 수산화기를 가지게 되면 항균 및 항진균력 등의 활성을 가져 의약품 및 화장품의 원료 물질로 사용된다. 이 중에 동물에서 생성되는 C20 및 C22 이수산화 지방산은 신호전달물질 및 그 전구체로 이용되며, 다양한 복합적인 생리활성에 관여한다. 에이코사펜타에논산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및 도코사헥사에논산(docosahexaenoic acid, DHA)로부터 생성된 이수산화 지방산은 인간신호전달물질의 한 종류인 염증해소 촉진 매개인자(specialized pro-resolving mediators, SPMs)이며 그 유사체들은 감염 및 염증의 내인성 조절인자로 인간을 포함한 동물 내에서 면역반응, 항상성 조절 등의 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질이다. 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)으로부터 생성되는 이수산화 지방산은 지질조절제(lipid mediator, LM)에 속하며 단일 물질로도 다양한 생리활성을 나타내며 인체 내에서 신호전달물질의 전구체로 이용된다.
이수산화 지방산(dihydroxy fatty acid, DiHFA)은 두개의 수산화기를 가지는 지질조절제의 일종으로, 동물성 불포화지방산으로부터 아스피린이 처리된 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX)와 사이토크롬 P450(cytochrome P450, CYP) 및 지방산화효소의 생체 내 조합반응에 의해 생합성된다. 이수산화 지방산은 지질조절제에 속하며 지질 조절제는 염증해소 촉진 매개인자를 포함한다. 염증발생 촉진 매개인자로는 이수산화 지방산 및 그 유도체인 류코트리엔(leukotrienes, LT) 및 산화지방산인 프로스탄글딘(prostaglandin, PG)이 있고 염증해소 촉진 매개인자에는 프로텍틴(protectin, PT), 레졸빈(resolvin, RV), 마레신(maresin, MaR), 리폭신(lipoxin)이 속하며, 이 중 레졸빈은 내인성 지질 매개체로 지방산화효소(lipoxygenase, LOX)의 조합반응 및 이중 산화반응에 의해 생성된다. 이는 오메가 지방산인 에이코사펜타에논산, 도코사펜타에논산 및 도코사헥사에논산으로부터 유래된 물질이다. 레졸빈은 주로 지방산화효소가 동물성 불포화지방산인 에이코사펜타에논산 및 도코사헥사에논산에 작용하여 각각 레졸빈 E 및 레졸빈 D로 전환된다. 최근에는 레졸빈의 이성질체 및 유사체의 구조가 강력한 염증해소 촉진제로서 작용된다고 알려져 있다. 레졸빈과 그 이성질체의 기능성은 인체 내에서 감염부위의 급성 염증의 해소, 혈소판 응집 차단, 생존율 향상 및 항생제 요구량 감소, 항염증 활성 및 식균 작용의 강화 등의 기능성을 가진다. 그리고 물질을 처리 시 산화 스트레스에 의한 염증을 감소시키고 세포 사멸을 억제함으로서 퇴행을 예방함을 확인하였다. 마찬가지로 세균성 염증에서의 항염 능력을 지니고 바이러스 감염에 대한 바이오 마커 뿐만 아니라 새로운 항바이러스제로서의 역할을 수행할 수 있음을 시사하며 이에 따라 연구된 레졸빈 류를 포함하여 이성질체 및 유사체들(resolvin analogues)을 개발하면 강력한 생체활성과 또 다른 염증 해소와 관련된 약물의 가능성을 제시할 수 있어 연구개발이 필요하다고 생각된다. 또한 차세대 염증해소와 관련된 물질로서 의학과 생명공학 등의 학문의 연구물질로서 사용될 수 있다는 점을 제시한다.
지방산화효소(lipoxygenase, LOX)는 이산소화효소(dioxygenation enzyme)로서 동물성 불포화 지방산을 기질로 위치 및 입체 선택적 과산화를 촉매한다. 하나 또는 다수의 시스, 시스-1,4-펜타디엔을 가지는 다가불포화지방산을 기질로 이용하여 이산소화 반응을 통해 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다. 기질로 사용되는 다가불포화지방산의 종류에 따라 위치특이성이 다른데, 그 중에서도 동물성 다가불포화지방산의 아리키돈산의 탄소 5번, 8번, 9번, 11번, 12번, 15번 위치에 수산기를 생성하는 지방산화효소는 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 특정 탄소 위치에만 수산기를 형성한다. 또한, 이 효소는 탄소수 22개 이상의 불포화지방산에서 7번, 10번, 11번, 13번, 14번, 17번 탄소에서 수산기를 형성한다. 입체특이성의 경우에는 카이랄성 또는 손대칭성이 R-형태 또는 S-형태를 띄는 지방산화효소이며, 이는 R-지방산화효소, S-지방산화효소로 나뉜다.
R-지방산화효소의 경우, R-하이드로퍼록사이드(R-hydroperoxide)를 생성하며, 일반적으로 아미노산 서열에서 코파-사이트(coffa-site)라고하는 단일 보존 잔기가 알라닌(alanine)일 때 S-형, 글리신(glycine)일 때 R-형으로 수산기의 카이랄성(R/S)이 결정된다고 알려져 있다. 현재까지 알려진 R-지방산화효소는 인간 유래 12R-지방산화효소(Homo sapiens ARA 12R-LOX), 마우스 유래 12R-지방산화효소(Mus musculus ARA 12R-LOX), 산호 8R-지방산화효소(Plexaura homomalla ARA 8R-LOX), 아카리오클로리스 마리나 11R-지방산화효소(Acaryochloris marina ARA 11R-LOX), 노스톡 11R-지방산화효소(Nostoc sp. linoleate 9R-LOX), 가우만노미시스 그라미니스 13R-지방산화효소(Gaeumannomyces graminis linoleate 13R-LOX)가 있다. 이 중 포유동물에서 15R-지방산화효소는 R-선택적 아스피린이 처리된 사이클로옥시게나아제 또는 사이토크롬 P450으로 다른 포유류에 일반적으로 분포되어 있다. 그러나 박테리아 및 포유류를 포함한 다른 유기체에서도 15R-지방산화효소는 보고된 적이 없다. 아라키돈산 15R-지방산화효소의 경우 아라키돈산과 같은 탄소수 20개의 불포화지방산에서 15번 탄소 위치에만 R-수산기를 형성한다. 또한, 탄소수 22개의 불포화 지방산에서는 17번 탄소 위치에 R-수산기를 형성한다.
현재까지 보고된 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 합성방법으로는 25 단계의 입체선택적인 화학합성 방법이 보고되어 있으며 이는 약 20%의 수율로 합성되는 것으로 알려져 있다. 합성과정 중에 벤젠 동족체와 중금속이 사용 및 방출되며 이러한 화학합성 과정에서 생산되는 오염물질 및 부산물은 자연에서 생분해 되지 않아 환경 오염을 야기한다는 점에서 한계가 있다. 또한 생체 내에서 합성되어지는 레졸빈을 포함하는 이수산화 지방산들은 조직 손상 및 감염에 대한 세포간 반응에 의해 생합성되며, 두개 이상의 지방산화효소의 조합반응에 의해 250 pg/mL 이하의 소량으로 생합성된다. 전세포를 이용한 두 종류의 지방산화효소들의 조합반응에 의한 이수산화 지방산 생산에는 2단계 생물전환으로 수행되었다고 보고되었다. 그러나 2단계 생물전환에서는 특정 농도 이상의 기질 및 생산된 중간체에 의해 산화반응의 억제효과를 보였으며 소수성 지방산의 반응 억제효과는 흡착 수지의 첨가에 의해 약화된다고 알려져 있다.
본 발명에서는 다가불포화지방산으로부터 이중 산소화를 촉매하는 박테리아 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 미생물 유래 15R-지방산화효소를 처음 발굴하였고, 촉매 반응을 통하여 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들을 생산하였다. 현재까지 단독으로 이중 산소화를 촉매하는 15R-지방산화효소는 보고된 바가 없다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 도출된 것으로서 본 발명의 목적은 미생물 유래 신규한 지방산화효소의 촉매반응을 통하여 레졸빈 입체이성질체를 포함하는 이수산화 지방산 생산용 조성물 및 생산방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주 유래 15R-지방산화효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 효소를 유효성분으로 포함하는 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명자들은 상기 과제를 달성하기 위해, 향상된 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 15R-수산화 지방산, 17R-수산화 지방산, 레졸빈 입체이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들을 제조하고자 지속적인 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주 유래 15R-지방산화효소를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 친환경적인 생물전환방법으로 새로운 생산경로로 15R-수산화 에이코사펜타에논산(15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E,17Z-eicosapentaenoic acid, 15R-HEPE하고도 함), 17R-수산화 도코사헥사에논산(17R-hydroxy-4Z,7Z,10Z,13Z,15E,19Z)-docosahexaenoic acid, 17-HDHA라고도 함), 15R-수산화 아라키돈산(15R-hydorxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic acid, 15R-HETE라고도 함) 및 최종 산물인 레졸빈 E4 입체이성질체(5R,15R-dihydroxy-6E,8Z,11Z,13E,17Z-eicosapentaenoic acid, enantiomer of resolvin E4라고도 함), 레졸빈 D5 입체이성질체(7R,17R-dihydroxy-4Z,8E,10Z,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid, enantiomer of resolvin D5라고도 함) 및 5R,15R-이수산화 아라키돈산(5R,15R-dihydroxy-6E,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic acid, 5R,15R-DiHETE라고도 함)을 각각 생산하였고, 생물전환 공정에 흡착 수지를 처리함으로써 기질 저해효과를 약화시켜 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 내 "수산화 지방산"이라 함은 지방산, 바람직하게, 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산에 1개의 수산기가 치환된 것을 의미하고, 본 명세서 내 "이수산화 지방산"이라 함은 지방산, 바람직하게, 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산에 2개의 수산기가 치환된 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 레졸빈 E4 입체이성질체 (enantiomer of resolvin E4)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로, 명칭은 5R,15R-dihydroxy-6E,8Z,11Z,13E,17Z-eicosapentaenoic acid이다. 5R,15R-디히드록시에이코사펜타논산(5R,15R-dihydroxyeicosapentaenoic acid)이라고도 한다. 레졸빈 D5 입체이성질체 (enantiomer of resolvin D5)은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로, 명칭은 7R,17R-dihydroxy-4Z,8E,10Z,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid이고 7R,17R-디히드록시도코사헥사논산(7R,17R-dihydroxydocosahexaenoic acid)이라고도 한다. 그리고 5R,15R-이수산화 아라키돈산은 하기 화학식 3로 표시되는 화합물로, 명칭은 5R,15R-dihydroxy-6E,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic acid이고 5R,15R-디히드록시에이코사테트라논산(5R,15R-dihydroxyeicosatetraenoic acid)이라고도 한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
15R-지방산화효소를 이용한 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들은 상술한 바와 같이 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산 방법이 개발되어 있지 않다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주 유래 15R-지방산화효소를 제공한다.
상기 15R-지방산화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 상기 15R-지방산화효소는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있으며, 이의 기능적 동등성, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 상기 15R-지방산화효소를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+)를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환된 형질전환체로서, 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 C2566 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 15R-지방산화효소와 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고; (3) 15R-지방산화효소 유전자의 발현을 유도하여 (4) 발현된 재조합 단백질과 이를 포함한 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 15R-지방산화효소를 포함하는 전세포는 i) 상기 미생물이 포함된 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ii) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; iii) 상기 생리식염수로 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 회수하는 단계; 및 iv) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, i) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ii) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
본 발명은 상기 15R-지방산화효소를 유효성분으로 포함하는 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물로서, 상기 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산은 15R-수산화 지방산, 17R-수산화 지방산, 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 구현 예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 20개와 22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 시스,시스-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 에이코사펜타에논산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사에논산(docosahexaenoic acid, DHA) 및 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것으로, 이를 추가로 포함할 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 레졸빈 이성질체는 레졸빈 E4 입체이성질체 및 레졸빈 D5 입체이성질체 중 어느 하나 이상일 수 있다.
일실시예에 있어서, 상기 조성물은 흡착 수지로 반응 중 지방산과 결합하여 기질저해효과를 줄여주는 흡착 수지일 수 있으며, 바람직하게는 SP207, SP825, SP850, HP20 및 SP2MG로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SP825일 수 있다(도 7 참조).
일실시예에 있어서, 상기 조성물의 흡착 수지의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL 농도가 바람직하고, 5 mg/mL 내지 10 mg/mL가 더욱 바람직하다(도 7 참조).
본 발명은 또한, 상기 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조방법으로서, 상기 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산은 15R-수산화 지방산, 17R-수산화 지방산, 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조방법을 제공한다.
하나의 실시예에 있어서, 상기 제조방법에서 기질은 에이코사펜타에논산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사에논산(docosahexaenoic acid) 및 아라키돈산(arachiconic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 상기 제조방법에서 레졸빈 이성질체는 레졸빈 E4 입체이성질체 및 레졸빈 D5 입체이성질체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 기질을 2 mM 내지 20 mM 범위로 사용하는 것이 바람직하고, 4 mM 내지 6 mM의 농도가 더욱 바람직하다. 상기 제조방법은 흡착 수지 종류로 SP825의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL 농도가 바람직하고, 5 mg/mL 내지 10 mg/mL가 더욱 바람직하다.
또한, 상기 제조방법은 pH 7.0 내지 pH 9.5의 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 내지 pH 8.5의 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 HEPES 완충용액을 사용할 수 있다.
상기 효소 반응은 온도 20℃내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 23℃내지 27℃ 온도 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 조건을 유지함으로써, 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4 와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)의 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서, 15R-지방산화효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 단백질 포함한 균주를 회수하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 15R-지방산화효소를 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 전세포 반응의 시간을 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 제조방법은 전술한 15R-지방산화효소를 지닌 세포의 농도를 0.1 g/L 내지 6 g/L 범위에서 처리하는 것이 바람직하며, 0.5 g/L 내지 3 g/L 범위에서 처리하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주 유래 15R-지방산화효소를 이용함으로써, 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산을 기질억제효과를 완화시키는 흡착 수지 처리로 인해 높은 생산성과 위해성이 없는 부산물을 생성하지 않게 높은 수율로 제조가 가능하였다.
본 발명에 따라 제조된 레졸빈 이성질체를 포함하는 수산화 지방산들은 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할수 있다. 본 발명의 제조방법을 이용하는 경우, 기존보다 높은 생산성과 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규한 15R-지방산화효소를 이용하여 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산을 기질로 하여 생성되는 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 합성경로를 나타낸다.
도 2는 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 지방산화효소의 위치특이성 및 키이랄성의 특성을 생성되는 1차 생성물인 15R-수산화 아라키돈산을 확인한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소의 1차 생성물질 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정 결과이다.
도 4는 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소의 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정 결과이다.
도 5는 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소의 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 물질동정을 위하여 NMR을 이용한 물질동정 결과이다.
도 6은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소가 발현된 재조합 대장균의 시간별 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 생성량을 나타낸다.
도 7은 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 생성량을 높이기 위해 반응물에 존재하는 지방산들을 잘 흡착시키는 흡착 수지 종류 및 최적 농도를 나타낸다.
도 8은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소가 발현된 재조합 대장균의 생성량을 높이기 위해 흡착 수지 SP825 존재 유무에 따른 기질인 아라키돈산 농도별 실험 결과이다.
도 9는 흡착 수지 SP825가 첨가된 반응물에서 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소가 발현된 재조합 대장균의 시간별 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 생성량을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소를 합성시킨 재조합 벡터를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
15 R -지방산화효소의 발현을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명의 15R-지방산화효소를 제조하기 위하여, 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주의 유전자로부터 15R-지방산화효소로 예측되는 유전자를 먼저 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 독일생물자원센터(독일)에서 유전자 염기서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있지 않은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum)를 구입하여 선별하고, 이로부터 유래한 15R-지방산화효소의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum)의 genomic DNA를 추출하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 15R-지방산화효소의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각 유전자들의 제한효소로 Nde I과 Hind Ⅲ을 이용하였으며 클로닝 방법은 Gibson assembly 방법을 이용하였고 각각의 primer는 다음과 같다.
솔란지움 셀룰로좀 유래 15R-지방산화효소 서열의 프라이머는 하기와 같이 구성하였다.
서열(5' -> 3') 서열번호
F AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG ATG AGT AAC CCG TCC CTG CCT CAA AAC GAC 서열번호 3
R GTG GTG GTG CTC GAG TGC GGC CGC AAG CTT TCA GAT GTT GAT GCT CTG CGG GAT CTG CGA 서열번호 4
또한, 각 유전자를 pET 28a에 클로닝하기 위하여 각각의 벡터들 또한 PCR을 이용하여 준비 후 DNA를 봉합(ligation) 하여 재조합 15R-지방산화효소를 제작하였다. 클로닝하여 서열을 확인한 결과 서열이 특정되어 있지 않은 새로운 유전자 서열이며 이를 15R-지방산화효소로서 규명하였다.이후, 상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs(Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 C2566 균주에 형질 전환하고, 형질전환 된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 15R-수산화지방산, 17R-수산화지방산, 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)생산을 위하여 배양한 뒤 사용 전에 -70℃에 냉동 보관하였다.
15 R -지방산화효소의 제조
효소들의 단백질 발현을 위하여, 실시예 1에서 냉동 보관시킨 형질전환 된 미생물들은 20 μg/ml의 카나마이신을 포함하는 1 L의 엘비(LB; Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 진탕 삼각 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
배양된 15R-지방산화효소를 포함하는 대장균 세포를 모아서 반응에 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 15R-지방산화효소는 상기 형질전환 된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 15R-수산화지방산, 17R-수산화지방산, 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)을 생산하기 위한 재조합 세포로 사용하였다.
15 R -지방산화효소를 이용한 불포화지방산으로부터 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산으로의 합성경로 확인
상기 15R-지방산화효소를 이용하여 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산의 합성경로를 알아보기 위하여 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산을 기질로 하여 반응하였다. 레졸빈 E4 입체이성질, 레졸빈 D5 입체이성질 및 5R,15R-이수산화 아라키돈산은 각각 4 mM의 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산으로부터 1 g/L의 재조합 15R-지방산화효소를 사용하였으며 pH 8.0, 25℃에서 60분 또는 90분 동안 전세포 반응(whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과, 도 1과 같은 합성경로를 구축하였다. 또한, 지방산화효소 규명을 위해 아라키돈산으로부터 생성되는 1차 생성물인 수산화 지방산을 HPLC를 이용하여 확인하였으며(도 2), 물질동정을 통해 생성되는 수산화 지방산과 이수산화 지방산은 15R-수산화지방산, 17R-수산화지방산, 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)임을 확인하였다(도 3과 도 4). 물질의 정확한 규명을 위해 레졸빈 입체이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들은 NMR을 통하여 이중 결합의 절대 입체화학과 수산화기의 형태를 확인하였다(도 5).
15 R -지방산화효소의 재조합 효소의 단일 반응을 이용하여 레졸빈 이성질체와 이수산화 아라키돈산의 합성
상기 15R-지방산화효소가 발현된 재조합 대장균에 의해 불포화 지방산인 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산을 기질로 각각 생성되는 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)의 양을 확인하였다.
기질로서 4 mM의 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산에 대하여 pH 8.0에서, 온도를 25℃에서 60분 또는 90분 동안 전세포반응을 실시하였고 각 반응 촉매별 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)의 생산 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 15R-지방산화효소가 발현된 전세포반응에 의해 약 3.3 mM의 레졸빈 E4 입체이성질체, 3.0 mM의 레졸빈 D5 입체이성질체 및 3.74 mM의 5R,15R-이수산화 아라키돈산이 생성됨을 확인하였다(도 6).
흡착 수지 SP825 처리 하에 15 R -지방산화효소의 재조합 효소의 기질저해효과를 극복함에 따라 레졸빈 이성질 체를 포함하는 이수산화 지방산들의 생산량 향상
상기 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들의 생성량을 높이기 위해 흡착 수지의 종류와 농도를 최적화하였다.
반응물에 존재하는 지방산들을 잘 흡착시키는 흡착 수지 종류 및 최적 농도를 알아보기 위하여, 4 mM의 아라키돈산에 대하여 pH 8.0에서, 온도를 25℃에서 60분 전세포반응을 실시하였다. 그 결과, 지방산 흡착 정도는 SP825가 높았으며, 농도는 5 mg/mL에서 최적임을 확인하였다(도 7).
또한, 상기 15R-지방산화효소가 발현된 재조합 대장균에 의해 흡착 수지 SP825가 첨가된 반응물에서 기질 농도별로 처리하였을 때 존재 유무에 따른 최적 기질 농도를 확인하였다. 기질로서 아라키돈산 농도 2 mM 내지 20 mM 범위에 대하여 pH 8.0에서, 온도를 25℃에서 60분 동안 전세포반응을 실시하였을 때 최대 생산을 나타내는 최적 기질 농도가 흡착 수지 SP825를 처리하였을 때 6 mM로 높아진 것을 확인하였다 (도 8).
상기 흡착 수지 SP825 존재 하에 15R-지방산화효소가 발현된 재조합 대장균에 의해 불포화 지방산인 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산을 기질로 각각 생성되는 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)의 양을 확인하였다. 기질로서 6 mM의 에이코사펜타에논산, 도코사헥사에논산 및 아라키돈산에 대하여 pH 8.0에서, 온도를 25℃에서 90분 또는 120분 동안 전세포반응을 실시하였고 각 반응 촉매별 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)의 생산 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 15R-지방산화효소가 발현된 전세포반응에 의해 약 5.19 mM의 레졸빈 E4 입체이성질, 4.75 mM의 레졸빈 D5 입체이성질 및 5.45 mM의 5R,15R-이수산화 아라키돈산이 생성됨을 확인하였다. 이는 흡착 수지 SP825를 처리하지 않았을 때보다 약 157 %, 189 %, 171 %의 생산량이 높아진 것을 확인하였다 (도 9).
상술한 바와 같이, 본 발명은 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주 유래 새롭게 발굴된 15R-지방산화효소를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 염증해소 촉진 매개인자(specialized pro-resolving mediators) 및 지질 매개체(lipid mediator)로 작용할 수 있는 레졸빈 이성질체를 포함하는 이수산화 지방산들을 생물전환법을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 및 아라키돈산을 사용하고 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 유래 15R-지방산화효소를 포함한 형질전환된 세포를 이용하여 흡착 수지 SP825가 첨가된 반응물에서 향상된 농도의 15R-수산화 지방산, 17R-수산화 지방산, 레졸빈 입체이성질체(enantiomer of resolvin E4와 enantiomer of resolvin D5) 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)을 생물전환법을 이용하여 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 기존에 보고되지 않은 지질 조절제의 생산과 생물전환법에 의한 특이적인 생산이 큰 의미를 가진다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였지만, 지방산 업계 및 약학계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 솔란지움 셀룰로좀(Sorangium cellulosum) 균주 유래 15R-지방산화효소.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 15R-지방산화효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 15R-지방산화효소.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 15R-지방산화효소는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진, 15R-지방산화효소.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 15R-지방산화효소.
  5. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진, 15R-지방산화효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 15R-지방산화효소를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  7. 제6항의 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 형질전환체.
  8. 제1항 내지 제5항의 15R-지방산화효소를 유효성분으로 포함하는 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 생성용 조성물로서,
    상기 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산은 15R-수산화 지방산, 17R-수산화 지방산, 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 기질로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 아라키돈산(arachiconic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 레졸빈 이성질체는 레졸빈 E4 입체이성질체 및 레졸빈 D5 입체이성질체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 흡착 수지로 SP207, SP825, SP850, HP20 및 SP2MG이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 흡착 수지는 SP825인, 조성물.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 조성물의 흡착 수지의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL 인, 조성물.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조방법으로서,
    상기 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산은 15R-수산화 지방산, 17R-수산화 지방산, 레졸빈 이성질체 및 이수산화 아라키돈산(5R,15R-DiHETE)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 수산화 지방산 또는 이수산화 지방산 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 기질은 에이코사펜타에논산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사에논산(docosahexaenoic acid) 및 아라키돈산(arachiconic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 제조방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 레졸빈 이성질체는 레졸빈 E4 입체이성질체 및 레졸빈 D5 입체이성질체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 제조방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 제조방법에서 기질은 0.5 mM 내지 20 mM 범위로 사용하는, 제조방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 제조방법은 pH 7.0 내지 9.5 범위에서 반응을 수행하는 것인, 제조방법.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 제조방법은 온도 20℃내지 40℃ 범위에서 반응을 수행하는 것인, 제조방법.
  20. 제14항에 있어서,
    상기 제조방법은 15R-지방산화효소를 포함하는 세포의 농도를 0.1 g/L 내지 6 g/L 범위에서 처리하는, 제조방법.

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