KR20220115539A - 형질전환 미생물을 이용한 유리 지방산 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형질전환 미생물을 이용한 유리 지방산의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 특정 유전자가 결실 및 도입된 형질전환된 대장균을 이용하고 탄소 대 질소(C/N) 비율을 특정 수준으로 조절한 기질액을 공급함으로써, 발효에 의한 유리 지방산의 생산량을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 형질전환 미생물을 이용한 유리 지방산의 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 형질전환 미생물을 이용한 유리 지방산의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유리 지방산을 과생산하기 위해 형질전환된 대장균 및 이를 이용한 효과적인 발효 방법에 관한 것이다.
유리 지방산(free fatty acid, FFA)은 간단한 촉매 처리에 의해 알케인(alkane)과 지방 에틸에스테르(fatty ethyl esters)로 쉽게 전환될 수 있어서, 바이오디젤 생산에 잠재적인 공급 원료 중 하나이다. 최근, 바이오디젤과 같은 함유 화학제품의 수요가 급증함에 따라 기존의 방법과는 달리 지속가능하고 친환경적인 방법, 예를 들어 미생물로부터 지방산을 생산하는 방법이 연구되고 있다.
일례로서 미생물, 특히 대장균의 대사경로를 조절하여 대사흐름을 바꿈으로써 지방산의 생산을 증대시킬 수 있는 대사공학적 방법이 주목을 받고 있다(Pfleger et al., Metab Eng. 29, 1-11, 2015). 대장균은 빠르게 성장하고 유전자 조작이 쉽다는 점에서 바이오 연료 생산 균주로 많이 이용되고 있다. 대장균에서의 지방산 합성은 여러 단백질이 관여하는 복잡한 과정에 의해 수행된다. 일반적으로, acetyl-CoA가 여러 단계의 효소반응을 통해 acyl-ACP가 된 후에 최종적으로 싸이오에스터라아제(thioesterase)에 의해 지방산으로 전환된다.
지방산 생산 경로에서 만들어진 acyl-ACP는 음성 피드백 억제(negative feedback inhibition)를 통해 생산에 관여하는 여러 단백질의 활성을 저해시킨다(Fujita et al., Mol. Microbiol. 66, 829839. 2007). 따라서, 싸이오에스터라아제의 발현을 통한 음성 피드백 억제의 완화는 대장균에서의 지방산 생산량을 15배 증가시키는 것으로 확인되었다(Lu et al., Metab. Eng. 10, 333339, 2008). 추가적인 지방산의 생산 증대는 분해 경로를 불활성화 시킴으로써 이루어졌다. 지방산의 분해 경로에 수반되는 유전자의 제거는 생성된 지방산의 분해를 막아 대장균에서의 지방산 합성을 향상시켰고(Steen et al., Nature 463, 559562, 2010), 핵심탄소대사과정(central carbon metabolism)을 조절함으로써 지방산 전구체의 공급을 증가시키는 기법도 대장균에서의 지방산 생산을 증가시켰다(He et al., Biotechnol Bioeng. 111, 575585 2014). 또한, 대장균의 지방산 대사를 전반적으로 조절하는 전사인자의 발현은 지방산 대사경로를 활성화시켜 생산량을 증가시켰다(Zhang et al., Metab. Eng. 14, 653660. 2012).
하지만, 대장균에 의해 생산되는 많은 양의 지방산은 전자 전달계 방해, 산화성 인산화, 영양분 수송 방해, 그리고 세포의 용해와 같은 항균 효과(antibacterial effect)를 나타내어 대장균의 세포 생장을 억제하는 등의 부작용이 있었다(Desbois and Smith, Appl. Microbiol. Biotechnol. 85. 1629-1642. 2010; Lennen et al., Appl. Environ. Microbiol. 77, 81148128. 2011). 이러한 지방산의 세포 독성은 대장균에서의 지방산 생산 증대를 방해하는 걸림돌 중 하나이다.
이와 같이, 대장균을 이용하여 유리 지방산의 생산량을 증가시키기 위한 많은 연구들이 이루어졌으나, 아직 상용화하기에는 많이 부족한 수준이다.
Pfleger et al., Metab Eng. 29, 1-11, 2015
Fujita et al., Mol. Microbiol. 66, 829839. 2007
Lu et al., Metab. Eng. 10, 333339, 2008
Steen et al., Nature 463, 559562, 2010
He et al., Biotechnol Bioeng. 111, 575585 2014
Zhang et al., Metab. Eng. 14, 653660. 2012
Desbois and Smith, Appl. Microbiol. Biotechnol. 85. 1629-1642. 2010
Lennen et al., Appl. Environ. Microbiol. 77, 81148128. 2011
이에 본 발명자들은 효율적으로 유리 지방산을 생산하는 방법에 대해 연구한 결과, 특정 유전자가 결실 및 도입된 형질전환 대장균을 제작하고, 상기 형질전환 대장균을 이용하여 특정 조건에서 유리 지방산의 생산량이 증대되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제에 따라, 본 발명의 일 측면은 i) 대장균을 최소 배지에서 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및 ii) 상기 배양액에 탄소 대 질소(C/N) 비율이 30 이상인 기질액을 공급하면서 발효를 수행하여 유리 지방산을 생산하는 단계를 포함하고, 상기 대장균은 envR, gusC 및 mdlA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결실됨과 함께, mmc, tesA, ppc 및 fadR로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 도입된 것인, 유리 지방산의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 특정 유전자가 결실 및 도입된 형질전환 대장균을 이용하고 탄소 대 질소(C/N) 비율을 특정 수준으로 조절한 기질액을 공급함으로써, 발효에 의한 유리 지방산의 생산량을 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 형질전환 미생물을 이용한 유리 지방산의 생산에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 제조예 1에서 사용한 pBbB6c-'tesA 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 대장균에서 envR, gusC 및 mdlA 유전자를 결실시키기 위한 조작을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 제조예 3에서 사용한 pBbE2k-mmc 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 제조예 4에서 사용한 pBbB6c-'tesA R64C 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 제조예 5에서 사용한 pBbS2a-ppc 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 6은 제조예 6에서 사용한 pBbB6c-'tesA R64C -fadR 벡터를 도식화여 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 형질전환 대장균(SBF06, SBF25, SBF40, SBF41, SBF43)을 이용하여 유리 지방산을 생산한 결과를 나타낸 것이다(막대 그래프: 유리 지방산 생산량, 검은 점: 세포 건조 중량).
도 8은 실험예 2에서 형질전환 대장균(SBF42, SBF43, SBF45)을 이용하여 유리 지방산을 생산한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 4에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 25에서 35로 증가함에 따른 SBF43 균주의 세포 건조 중량 및 유리 지방산 생산 결과를 나타낸 것이다(막대 그래프: 유리 지방산 생산량, 검은 점: 세포 건조 중량).
도 10은 실험예 4에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 25에서 35로 증가함에 따른 SBF43 균주의 세포당 유리 지방산 생산량을 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 4에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 각각 5, 10, 20, 30, 40, 50 및 120으로 조절된 조건에서, SBF43 균주의 유리 지방산 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 5에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 약 32±2로 조절된 조건에서 SBF43 균주의 유리 지방산 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 대장균에서 envR, gusC 및 mdlA 유전자를 결실시키기 위한 조작을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 제조예 3에서 사용한 pBbE2k-mmc 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 제조예 4에서 사용한 pBbB6c-'tesA R64C 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 제조예 5에서 사용한 pBbS2a-ppc 벡터를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 6은 제조예 6에서 사용한 pBbB6c-'tesA R64C -fadR 벡터를 도식화여 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 형질전환 대장균(SBF06, SBF25, SBF40, SBF41, SBF43)을 이용하여 유리 지방산을 생산한 결과를 나타낸 것이다(막대 그래프: 유리 지방산 생산량, 검은 점: 세포 건조 중량).
도 8은 실험예 2에서 형질전환 대장균(SBF42, SBF43, SBF45)을 이용하여 유리 지방산을 생산한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 4에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 25에서 35로 증가함에 따른 SBF43 균주의 세포 건조 중량 및 유리 지방산 생산 결과를 나타낸 것이다(막대 그래프: 유리 지방산 생산량, 검은 점: 세포 건조 중량).
도 10은 실험예 4에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 25에서 35로 증가함에 따른 SBF43 균주의 세포당 유리 지방산 생산량을 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 4에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 각각 5, 10, 20, 30, 40, 50 및 120으로 조절된 조건에서, SBF43 균주의 유리 지방산 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 5에서 탄소 대 질소(C/N) 비율이 약 32±2로 조절된 조건에서 SBF43 균주의 유리 지방산 생산 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 대장균의 발효를 수행하여 유리 지방산을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 탄소 대 질소(C/N) 비율이 30 이상인 기질액을 대장균의 배양액과 같은 대장균의 배지에 공급하는 것을 특징으로 하고, 상기 대장균은 envR, gusC 및 mdlA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결실됨과 함께, mmc, tesA, ppc 및 fadR로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 도입된 것이다.
본 발명의 일 측면은 i) 대장균을 최소 배지에서 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및 ii) 상기 배양액에 탄소 대 질소(C/N) 비율이 30 이상인 기질액을 공급하면서 발효를 수행하여 유리 지방산을 생산하는 단계를 포함하고, 상기 대장균은 envR, gusC 및 mdlA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결실됨과 함께, mmc, tesA, ppc 및 fadR로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 도입된 것인, 유리 지방산의 생산 방법을 제공한다.
상기 i) 단계에서 상기 최소 배지는 포도당, 인산칼륨, 인산이암모늄, 시트르산, 황산암모늄, 효모 추출물, 탄산나트륨, 황산마그네슘, 황산구리, 황산아연, 황산철, 황산망간, 헵타몰리브덴산암모늄, 붕사, 염화칼륨, 이인산나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 염화칼슘, 염화암모늄 및 이들의 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 최소 배지는 포도당, 인산칼륨, 인산이암모늄, 시트르산 일수화물, 황산암모늄, 효모 추출물, 탄산나트륨, 황산마그네슘 칠수화물, 황산구리 오수화물, 황산아연 칠수화물, 황산철 칠수화물, 황산망간 사수화물, 헵타몰리브덴산암모늄 사수화물, 붕사 십수화물 및 염화칼륨 이수화물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 최소 배지는 포도당, 인산칼륨, 인산이암모늄, 시트르산 일수화물, 황산암모늄, 효모 추출물, 탄산나트륨 및 황산마그네슘 칠수화물을 포함할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 최소 배지는 포도당, 인산칼륨, 인산이암모늄, 시트르산 일수화물, 황산암모늄, 효모 추출물, 탄산나트륨, 황산마그네슘 칠수화물, 황산구리 오수화물, 황산아연 칠수화물, 황산철 칠수화물, 황산망간 사수화물, 헵타몰리브덴산암모늄 사수화물, 붕사 십수화물 및 염화칼륨 이수화물을 포함할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 최소 배지는 포도당 25 g/L 내지 35 g/L, 인산칼륨 6.0 g/L 내지 7.5 g/L, 인산이암모늄 3.5 g/L 내지 4.5 g/L, 시트르산 일수화물 0.5 g/L 내지 1.5 g/L, 황산암모늄 2.5 g/L 내지 3.5 g/L, 효모 추출물 25 g/L 내지 35 g/L, 탄산나트륨 1.5 g/L 내지 2.5 g/L, 황산마그네슘 칠수화물 0.5 g/L 내지 1.2 g/L, 이인산나트륨 5.5 g/L 내지 7.5 g/L, 인산칼륨 2.5 g/L 내지 3.5 g/L, 염화나트륨 0.3 g/L 내지 0.7 g/L, 및 염화암모늄 0.7 g/L 내지 1.2 g/L로 이루어진 군에서 적어도 하나를 포함할 수 있다. 또한, 상기 최소 배지는 황산구리 오수화물, 황산아연 칠수화물, 황산철 칠수화물, 황산망간 사수화물, 헵타몰리브덴산암모늄 사수화물, 붕사 십수화물, 염화칼륨 이수화물, 염화제이철 육수화물, 염화코발트 육수화물, 염화제이구리, 염화아연, 몰리브덴산나트륨 이수화물, 붕산 및 염화망간 사수화물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 미량으로, 예를 들어 각각 0.1 g/L 미만으로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 최소 배지는 인산나트륨 완충액, 황산마그네슘 및 염화칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 미량으로, 예를 들어 각각 100 mM 이하, 10 mM 이하, 또는 1 mM 이하로 더 포함할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 최소 배지는 포도당 28 g/L 내지 32 g/L, 인산칼륨 6.3 g/L 내지 7.0 g/L, 인산이암모늄 3.7 g/L 내지 4.2 g/L, 시트르산 일수화물 0.8 g/L 내지 1.0 g/L, 황산암모늄 2.8 g/L 내지 3.2 g/L, 효모 추출물 28 g/L 내지 32 g/L, 탄산나트륨 1.8 g/L 내지 2.0 g/L, 및 황산마그네슘 칠수화물 0.7 g/L 내지 0.9 g/L을 포함할 수 있다. 또한, 상기 최소 배지는 황산구리 오수화물, 황산아연 칠수화물, 황산철 칠수화물, 황산망간 사수화물, 헵타몰리브덴산암모늄 사수화물, 붕사 십수화물, 염화칼륨 이수화물, 염화제이철 육수화물, 염화코발트 육수화물, 염화제이구리, 염화아연, 몰리브덴산나트륨 이수화물, 붕산 및 염화망간 사수화물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 미량으로, 예를 들어 각각 0.1 g/L 미만으로 더 포함할 수 있다.
상기 i) 단계에서 상기 배양액의 600 nm 파장에서의 흡광도(OD600)가 6 내지 10에 도달되었을 때 효소 발현을 위한 유도물질을 투입할 수 있다. 상기 흡광도 범위 내일 때, 지수함수적 증식단계를 시작점으로 하여 최적화된 단백질에 비해 발현 면에서 보다 유리할 수 있다. 또한, 상기 유도물질은 예를 들어 ITPG (isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside) 및 테트라사이클린 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 유도물질을 상기 배양액에 10 nM 내지 1 mM의 양으로 투입할 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 배양액에 0.1 mM 내지 0.5 mM의 ITPG 및 테트라사이클린 10 nM 내지 50 nM 중에서 적어도 하나를 투입할 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 유도물질 ITPG는 pLlacO1 프로모터, 이의 제어 하에 있는 tesA R63C 유전자, pLlacO1 프로모터 및 이의 제어 하에 있는 fadR를 유도할 수 있으며, 테트라사이클린은 tet 프로모터, 이의 제어 하에 있는 mmc 및 ppc 유전자를 유도할 수 있다.
또한, 상기 i) 단계의 배양은 상기 배양액의 600 nm 파장에서의 흡광도가 20 내지 30에 도달될 때까지 수행될 수 있다. 다시 말해, 상기 ii) 단계에서 기질액의 공급은 상기 배양액의 600 nm 파장에서의 흡광도(OD600)가 20 내지 30에 도달하였을 때 시작할 수 있다. 상기 흡광도 범위 내일 때, 초기 공급된 질소가 고갈되어 더 이상 대장균의 증식이 일어나지 않고 발효의 효율이 향상될 수 있다. 따라서, 상기 배양의 완료 시점(또는 기질액의 공급 시점)은 포도당의 공급에도 배양액의 흡광도의 증가가 정체되는 시점으로 확인될 수도 있다.
상기 ii) 단계의 발효는 i) 단계에서 얻은 배양액에 기질액(feeding solution)을 지속적으로 공급하는 유가 배양(fed-batch)를 통해 수행될 수 있다. 상기 기질액은 형질전환 대장균을 이용하여 발효를 통해 유리 지방산을 생산하기 위한 원료 성분을 포함한다.
상기 ii) 단계에서 기질액은 5.7 ㎖/h 내지 6.3 ㎖/h의 속도로 공급될 수 있다. 상기 공급 속도 범위일 때, 영양소 결핍에 대한 스트레스를 최소화한 상태에서 제한된 질소 조건에서 발효를 실시한다는 면에서 보다 유리할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 ii) 단계에서 기질액의 탄소 대 질소(C/N) 비율은 30 이상으로 조절되며, 상기 범위 내일 때 발효에 의한 유리 지방산의 생산량이 향상될 수 있다. 여기서 상기 탄소 대 질소(C/N) 비율은 기질액 내의 탄소 및 질소의 중량을 기준으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 기질액 내의 탄소 대 질소(C/N) 비율은 31 이상일 수 있고, 또는 32 이상일 수 있다. 다른 예로서, 상기 기질액 내의 탄소 대 질소(C/N) 비율은 50 이하일 수 있고, 40 이하, 35 이하, 34 이하, 또는 33 이하일 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 기질액 내의 탄소 대 질소(C/N) 비율은 30 내지 50, 30 내지 45, 30 내지 40, 30 내지 38, 30 내지 36, 30 내지 35, 31 내지 35, 또는 32 내지 35일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 기질액 내의 탄소 대 질소(C/N) 비율은 30 내지 35일 수 있다. 상기 바람직한 범위 내에서 세포당 유리 지방산 생산량이 보다 향상될 수 있다.
예를 들어, 상기 기질액은 포도당, 황산암모늄, 황산마그네슘, 이인산나트륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 염화칼슘, 염화암모늄, 및 이들의 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 기질액은 포도당, 황산암모늄 및 황산마그네슘 칠수화물을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 기질액은 포도당 500 g/L 내지 900 g/L, 황산암모늄((NH4)2SO4) 35 g/L 내지 50 g/L, 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4·7H2O) 6.5 g/L 내지 9.5 g/L, 이인산나트륨 5.5 g/L 내지 7.5 g/L, 인산칼륨 2.5 g/L 내지 3.5 g/L, 염화나트륨 0.3 g/L 내지 0.7 g/L, 및 염화암모늄 0.7 g/L 내지 1.2 g/L로 이루어진 군에서 적어도 하나를 포함할 수 있다. 또한, 상기 기질액은 인산나트륨 완충액, 황산마그네슘 및 염화칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 미량으로, 예를 들어 각각 100 mM 이하, 10 mM 이하, 또는 1 mM 이하로 더 포함할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 기질액은 포도당 660 g/L 내지 740 g/L, 황산암모늄((NH4)2SO4) 40 g/L 내지 45 g/L, 및 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4·7H2O) 7.5 g/L 내지 8.5 g/L을 포함할 수 있다.
상기 ii) 단계에서 기질액의 공급은 배양액의 600 nm 파장에서의 흡광도(OD600)가 약 110 내지 130에 도달할 때까지 수행될 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 i) 단계에서 상기 배양액의 600 nm 파장에서의 흡광도가 6 내지 10에 도달되었을 때 효소 발현을 위한 유도물질을 투입하고, 상기 ii) 단계에서 상기 기질액의 공급은 상기 흡광도가 20 내지 30에 도달하였을 때 시작하여 상기 흡광도가 110 내지 130에 도달하였을 때까지 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 특정 유전자가 결실 및 도입된 대장균, 즉 형질전환 대장균을 사용한다. 이에 따라 본 발명의 방법은 잘 알려진 대장균으로부터 공지의 유전자 재조합 기술을 이용하여 형질전환 대장균을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 대장균은 envR, gusC 및 mdlA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결실된 것이다.
일례로서, 상기 대장균은 envR, gusC 또는 mdlA 유전자가 결실된 것일 수 있다. 다른 예로서, 상기 대장균은 envR 및 gusC 유전자; envR 및 mdlA 유전자; 또는 mdlA 및 gusC 유전자가 결실된 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 대장균은 envR, gusC 및 mdlA 유전자 모두가 결실된 것일 수 있다.
상기 envR(envCD로도 알려짐) 유전자는 항생제, 세제 및 유기 화합물에 대한 내성을 부여하는 약물/H+ 역수송체인 AcrAB의 발현을 억제하는 것으로 알려진 전사 조절 인자이다. envR 유전자의 결실은 AcrAB의 과발현을 일으켜 유리 지방산의 과생산을 유발할 수 있다.
상기 gusC 유전자는 합성 [14C]phenyl-1-thio-β-d-glucuronide를 기질로 하여 베타 글루쿠로니드(β-glucuronides)의 수송을 담당하는 단백질을 암호화하는 유전자이다.
상기 mdlA 유전자는 다중약물의 저항성을 가진 것으로 보이며, mdlA 유전자의 결실과 유리 지방산의 생산 사이의 관계를 설명하기는 어렵지만, mdlA 유전자가 유리 지방산 생산에서 적어도 간접적인 역할은 하는 것으로 보인다.
또한 본 발명에서 사용하는 대장균은 mmc, tesA, ppc 및 fadR로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 도입된 것이다.
일례로서, 상기 대장균은 mmc, tesA, ppc 또는 fadR 유전자가 도입된 것일 수 있다. 다른 예로서, 상기 대장균은 mmc 및 tesA 유전자; mmc 및 ppc 유전자; mmc 및 fadR 유전자; tesA 및 ppc 유전자; tesA 및 fadR 유전자; 또는 ppc 및 fadR 유전자가 도입된 것일 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 대장균은 mmc, tesA 및 ppc 유전자; mmc, tesA 및 fadR 유전자; tesA, ppc 및 fadR 유전자; 또는 mmc, ppc 및 fadR 유전자가 도입된 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 대장균은 mmc, tesA, ppc 및 fadR 유전자 모두가 도입된 것일 수 있다.
상기 mmc 유전자는 세포의 진행 주기를 음성 조절하는 유전자이다. mmc 유전자는 (S)-methylmalonyl-CoA+pyruvate에서 propanoyl-CoA+oxaloacetate로의 가역적 반응을 촉매함과 함께, oxaloacetate+acetyl-CoA에서 malonyl-CoA+pyruvate로의 반응도 촉매한다. 이로써 Acetyl-CoA로부터 malonyl-CoA를 합성할 수 있는 대체 경로를 제시할 수 있다. 또한, mmc 유전자의 발현은 TCA 회로에서 유리 지방산 합성과 관련한 탄소 유동(carbon flux)을 강화시킬 수 있다,
상기 tesA 유전자는 지방산 합성 경로의 여러 효소들을 억제하는 acyl-ACPs을 세포질에서 가수분해함으로써 유리 지방산으로 전환시키고 그 분비를 도와준다. 또한, 다운스트림 유량(downstream flux)을 효율적으로 증가시켜 malonyl-CoA 소비 증가, 유리 CoA의 결핍을 완화 및 유리지방산을 세포막 합성에 필요한 인지질 생합성으로부터 분리함으로써 유리지방산 생산량을 증가시킬 수 있다.
상기 tesA 유전자는 야생형 또는 돌연변이 유전자일 수 있다. 구체적으로, 상기 돌연변이는 R64C일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 돌연변이는 tesA의 64번째 아르기닌(arginine)을 시스테인(cysteine)으로 치환한 돌연변이 유전자, 즉 tesA R64C일 수 있다. tesA R64C는 그런 tesA의 활성을 2배 가량 높일 수 있는 것으로 보인다. 상기 돌연변이 유전자의 제조에는 acyl-CoA 싸이오에스터라아제의 26번째 아미노산 잔기가 없는 tesA(leaderless form; 'tesA)가 사용될 수 있다.
상기 ppc 유전자는 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 보충하는데 관여하는 유전자로, MMC(methylmalonyl-CoA carboxyltransferase) 경로를 통한 malonyl-CoA 공급을 향상시킨다. 특히, ppc 와 mmc 유전자의 동시 발현은 ACC(acetyl-CoA carboxylase) 경로와 동일하게 포스포엔올피루브산(phosphoenolpyruvate)으로부터 malonyl-CoA를 생산하여 유리 지방산 합성을 강화시킬 수 있다.
상기 fadR 유전자는 지방산 생합성의 활성제(activator)와 지방산 분해의 억제제(repressor)를 기능하는 이중 조절인자 단백질이다. fadR 유전자를 발현하는 경우, 불포화 지방산 합성 유전자인 fabA와 fabB 유전자가 활성화되며 팔미톨레산(palmitoleic acid)과 올레산(oleic acid)을 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "돌연변이" 또는 "변이"는 야생형과 비교하여 유전자 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화를 가리킨다. 이러한 돌연변이는 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution), 점 돌연변이(point mutation), 다수의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 돌연변이, 전위(transposition), 역위(inversion), 프레임 쉬프트(frame shift), 표적 서열을 넌센스 돌연변이 또는 유전자의 야생형 서열과 차별화하는 다른 형태의 변형을 포함한다.
상기 대장균에서 각각의 유전자는 독립적인 방법에 의해 도입될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 즉 mmc, tesA R64C, ppc 및 fadR 유전자는 서로 다른 방법에 의해 도입될 수 있다.
상기 대장균은 변이되지 않은 대장균, 예컨대 야생형(wild-type) 대장균과 비교하여 개선된 유리 지방산 생성능을 나타낼 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
세균 균주, 플라스미드 및 프라이머
하기 실시예에서 사용된 프라이머를 하기 표 1에 나타내었고, 균주 및 플라스미드를 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 | 서열 (5'-3') | 서열번호 |
tesA FP | AAAGAATTCAAAAGATCTTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCGGACACGTTATTGAT | 1 |
tesA RP | TTACTCGAGTTATGAGTCATGATTTACTA | 2 |
A2k-mmc_fwd | GGATCCAAACTCGAGTAAG | 3 |
A2k-mmc_rev | TCAGCCGATCTTGATGAG | 4 |
mdlA KO FP | TCTTTACCCATCGAATAAATATCCAGAATCAGGTCAGGACACAACGCGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC | 5 |
mdlA KO RP | GCTTGAGAGTCGGCCACAGTTGGCTAAAACTACGCATCGACGGCCTCCTCATTCCGGGGATCCGTCGACC | 6 |
mdlA seq FP | AACGGCTGGAGGACGACGGTATCCT | 7 |
mdlA seq RP | ACAGCAGCGACTGCGCGTAATGTAG | 8 |
gusC KO FP | CCGGAGATTTTTCTCTCCGGCGTTATTTTTTACTTCAGCATAAAGTCATAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC | 9 |
gusC KO RP | ACTAATTAATATTCAATAAAAATAATCAGAACATCAAAGGTGCAACTATGATTCCGGGGATCCGTCGACC | 10 |
gusC seq FP | GGCATGTTTGCGATGCCAGCTCTTA | 11 |
gusC seq RP | CCGGCGTGCGAATTGAAGGGCTCAC | 12 |
envR KO FP | GAACTGAATTTTCAGGACAGAATGTGAATTTACATGACACTTAATTCATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC | 13 |
envR KO RP | ATTTTCTCACTCTGTGTCGAATATATTTATTTCCTGAATAATTAATCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC | 14 |
envR seq FP | GTTAAGCGAAGTTGACCCCGATCTC | 15 |
envR seq RP | AAAGAAAAATACAGTTCGCTATCCT | 16 |
ptsI with ppc for gib FP | CCGGGATTGCGGCAGGTATGCGTAATACCGGCTAAGGATCTTTAAGAAGGAGATATACATATGATTTCAGGCATTTTAGCATCCCC | 17 |
ptsI with ppc for gib RP | GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCAGGCATCAAATAAAGCATCTCGTGGATTAGCAGA | 18 |
TesA_fadR Gib FP | AGTAAATCATGACTCATAACTCGAGTTTAAGAAGGAGATATACAT | 19 |
TesA-fadR-RP | GCCTGGAGATCCTTACTCGAGTTTGGATCCTTATCGCCCC | 20 |
pntAB_gib_FP | TTTAAGAAGGAGATATACATATGCGAATTGGCATACCAAG | 21 |
pntAB_gib_RP | GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCCCGTCAGGGTTACAGAGCTT | 22 |
CaGapN gib_FP | TTTAAGAAGGAGATATACATATGTTTGAAAATATATCATC | 23 |
CaGapN gib_RP | GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCGTGAGATTGGATAGAATAAAATTATAGGTT | 24 |
ppc_fwd | GTCTCATCAAGATCGGCTGAGAATTCAAAAGATCTTTTAAGAAGG | 25 |
ppc_mid_seq_FP | AAGCACTGTGGCCGTTAG | 26 |
ppc_rev | CCTTACTCGAGTTTGGATCCTTAGCCGGTATTACGCATAC | 27 |
Bb_FP | GGATCCAAACTCGAGTAAGG | 28 |
유전자형 및 설명 | |
균주 | |
MG1655 | E. coli K-12 F-λ-ilvG-rfb-50rph -1 (Blattner et al., Science 277, 5331, 1453-1474(1997) 참고) |
SBF06 (TesA) | MG1655 with pBbB6c-'tesA |
SBF25 (egm) | MG1655 with △envR::FRT, △gusC::FRT, △mdlA::FRT, and pBbB6c-'tesA |
SBF40 (MMC) | SBF25 with pBbE2k-mmc |
SBF41(TesAR64C) | MG1655 with △envR::FRT, △gusC::FRT,△mdlA::FRT, pBbE2k-mmc, and pBbB6c'tesA R64C |
SBF42 (PPC) | MG1655 with △envR::FRT, △gusC::FRT, △mdlA::FRT, pBbE2k-mmc, pBbB6c-'tesA R64C, and pBbS2a-ppc |
SBF43 (FadR) | MG1655 with △envR::FRT, △gusC::FRT, △mdlA::FRT, pBbE2k-mmc, pBbB6c-'tesA R64C-fadR , and pBbS2a-ppc |
SBF45 | MG1655 with pBbB6c-'tesA-fadR |
플라스미드 | |
pBbB6c-'tesA | pBbB6c-gfp with △gfp::'tesA, CmR |
pBbE2k-mmc | pBbE2k-rfp with △rfp::mmc, KmR |
pBbS2a-ppc | pBbS2a-rfp with △rfp::ppc, AmpR |
pBbB6c-'tesA-fadR | pBbB6c-gfp with △gfp::'tesA-fadR, CmR |
pBbB6c-'tesA R64C | pBbB6c-gfp with △gfp::'tesA R64C, CmR |
pBbB6c-'tesA R64C-fadR | pBbB6c-gfp with △gfp::'tesA R64C-fadR, CmR |
이하 제조예 1 내지 7에서 PCR 반응을 위해 Q5TM DNA 중합효소(New England Biolabs, USA)를 사용하여 플라스미드 제작을 완료하였으며, 사용된 모든 제한 효소는 플라스미드를 단리하기 위해 Fermentas(리투아니아)로부터 구입하였다. 제작된 플라스미드 정제에는 Cosmo Genentech(한국)의 LaboPass plasmid miniprep kit를 사용하였다. 또한 GeneAll Biotechnology(한국)로부터 DNA 정제(Cat. No. 103-102) 및 젤 추출 키트(Cat. No. 102-102)를 구입하였다.
Q5TM PCR은 1단계 98℃에서 3분 30초, 2단계 98℃에서 30초, 3단계 56℃ 내지 68℃에서 40초, 4단계 72℃에서 1분 내지 2분 30초 및 5단계 72℃에서 5분 조건으로 수행하였다. 상기 2단계부터 4단계를 25회 반복하였다.
제조예 1.
'tesA
유전자가 도입된 형질전환 대장균(SBF06)
문헌(Shin et al., Biotechnol Biofuels (2016) 9:208)에 개시된 방식에 따라 'tesA(leaderless form) 유전자를 상기 표 1의 tesA FP(서열번호 1) 및 tesA RP(서열번호 2) 프라이머 및 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다. 상기 증폭시킨 'tesA 유전자를 EcoRI-XhoI으로 절단하여 단편을 얻은 후, 상기 절단된 단편을 동일한 제한 효소로 처리된 대장균용 발현 플라스미드 pBbB6c(Joint BioEnergy Institute, USA)에 삽입하여 'tesA를 포함하는 pBbB6c-'tesA 벡터를 제조하였다(도 1). 상기 pBbB6c-'tesA 벡터 및 전기천공법을 이용하여 MG1655 균주를 형질전환시켰다. 그 결과 MG1655 균주에 'tesA 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF06" 균주로 명명하였다.
제조예 2.
envR
,
gusC
및
mdlA
유전자가 결실된 형질전환 대장균(SBF25)
envR, gusC 및 mdlA 각각의 유전자와 상동성 서열을 지니고 있는 프라이머(envR의 결실을 위한 서열번호 13 및 14의 프라이머, gusC의 결실을 위한 서열번호 9 및 10의 프라이머, mdlA의 결실을 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머) 및 주형으로서 pKD13을 이용하여 kan 카세트를 PCR을 이용하여 증폭하였다. λ-레드 재조합 시스템(lambda-red recombination system)을 이용하여 pSIM5로부터 발현시킨 후, 상동성 재조합을 통해 상기 유전자들을 결실시켰다. 이후, pCP20를 이용하여 kan 카세트를 제거하여 envR, gusC 및 mdlA 유전자를 대장균의 게놈에서 결실시켰다(도 2).
이를 통해, 상기 SBF06 균주에서 envR, gusC 및 mdlA 유전자를 결실시킨 형질전환 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF25" 균주로 명명하였다.
제조예 3. 유전자 삼중 결실과 함께
mmc
유전자가 도입된 형질전환 대장균(SBF40)
mmc 유전자를 상기 표 1의 A2k-mmc_fwd(서열번호 3)와 A2k-mmc_rev(서열번호 4) 프라이머, 프로피오니박테리움 프레우덴레이키(KCTC5753(BSL1), Korea)의 염색체 및 PCR을 이용하여 확보 및 증폭시켰다.
상기 증폭시킨 mmc 유전자를 BamHI-XhoI으로 절단하여 단편을 얻은 후, 상기 절단된 단편을 동일한 제한 효소로 처리된 대장균용 발현 플라스미드 pBbE2k에 삽입하여 mmc 유전자를 포함하는 pBbA2k-mmc 벡터를 제조하였다(도 3).
상기 pBbA2k-mmc 및 전기천공법을 이용하여 SBF25 균주를 형질전환시켰다. 그 결과, 상기 SBF25 균주에서 mmc 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF40" 균주로 명명하였다.
제조예 4. 유전자 삼중 결실과 함께
mmc
및
'tesA
R64C
유전자가 도입된 형질전환 대장균(SBF41)
문헌(Shin et al., Biotechnol Biofuels (2016) 9:208)에 개시된 방식에 따라 'tesA R64C 유전자를 tesA FP(서열번호 1) 및 tesA RP(서열번호 2) 프라이머 및 PCR을 이용하여 증폭시켰다.
상기 증폭된 'tesA R64C 유전자를 BamHI-XhoI로 절단하여 단편을 얻은 후, 상기 절단된 단편을 동일한 제한 효소로 처리된 대장균용 발현 플라스미드 pBbB6c에 삽입하여 tesA R64C 유전자를 포함하는 플라스미드 pBbB6c-'tesA R64C를 제조하였다(도 4).
상기 pBbB6c-'tesA R64C 벡터 및 전기천공법을 이용하여 SBF40 균주를 형질전환시켰다. 그 결과, 상기 SBF40 균주에서 'tesA R64C 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF41" 균주로 명명하였다.
제조예 5. 유전자 삼중 결실과 함께
mmc, 'tesA
R64C
및
ppc
유전자가 도입된 형질전환 대장균(SBF42)
MG1655의 염색체로부터 ppc 유전자를 상기 표 1의 ppc_fwd(서열번호 25)와 ppc_rev(서열번호 27) 프라이머 및 PCR을 이용하여 확보 및 증폭시켰다.
상기 증폭된 ppc 유전자를 BamHI-XhoI으로 절단하여 단편을 얻은 후, 상기 절단된 단편을 동일한 제한 효소로 처리된 대장균용 발현 플라스미드 pBbS2a에 삽입하여 ppc 를 포함하는 플라스미드 pBbS2a-ppc를 제조하였다(도 5).
제조된 발현 플라스미드 pBbS2a-ppc 및 전기천공법을 이용하여 SBF41 균주를 형질전환시켰다. 상기 SBF41 균주에서 ppc 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF42" 균주로 명명하였다.
제조예 6. 유전자 삼중 결실과 함께
mmc, 'tesA
R64C
, ppc 및 fadR
유전자가 도입된 형질전환 대장균(SBF43)
MG1655의 염색체로부터 fadR 유전자를 상기 표 1의 TesA-fadR Gib FP(서열번호 19)와 TesA-fadR-RP(서열번호 20) 프라이머 및 PCR을 이용하여 확보 및 증폭시켰다.
상기 증폭된 fadR 유전자를 BamHI-XhoI으로 절단하여 단편을 얻은 후, 상기 절단된 단편을 동일한 제한 효소로 처리된 대장균용 발현 플라스미드 pBbB6c-'tesA R64C에 삽입하여 fadR를 포함하는 pBbB6c-'tesA R64C -fadR 벡터를 제조하였다(도 6).
상기 pBbB6c-'tesA R64C -fadR 벡터 및 전기천공법을 이용하여 SBF42 균주를 형질전환시켰다. 그 결과, 상기 SBF42 균주에서 fadR 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF43" 균주로 명명하였다.
제조예 7.
'tesA
R64C
및
fadR
유전자가 도입된 형질전환 대장균(SBF45)
상기 제조예 4의 pBbB6c-'tesA R64C 벡터 및 전기천공법을 이용하여 MG1655 균주를 형질전환시켰다. 그 후, 상기 제조예 6의 pBbB6c-'tesA R64C -fadR 벡터 및 전기천공법을 이용하여 형질전환시켰다. 그 결과 MG1665 균주에 'tesA R64C 와 fadR 유전자가 도입된 대장균을 제조하였으며, 이를 "SBF45" 균주로 명명하였다.
실험예 1. 형질전환 대장균(SBF06, SBF25, SBF40, SBF41, SBF43)을 이용한 유리 지방산의 생산
상기 제조예 1 내지 6의 균주를 이용하여 유리 지방산을 생산한 후 생산량을 비교 분석하였다.
먼저, 상기 제조예 1 내지 6의 균주의 단일 집락(colony)을 3 ㎖의 LB(Luria-Bertani) 배지에 넣어 회전 진탕기에서(rotary shaker) 200 rpm, 37℃ 조건에서 사전 배양(pre-cultures)하였다. 10시간의 배양 후, 사전 배양액 50 ㎕를 5 ㎖의 M9 배지에 옮겨 담았다. 이때, M9 배지는 3 % 포도당, 100 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0), 2 mM 황산마그네슘(MgSO4), 0.1 mM 염화칼슘(CaCl2) 및 미량 원소를 포함하였다. 또한 필요에 따라 적절한 항생제를 첨가하였다.
상기 배양액을 250 ㎖의 진탕 플라스크에 하룻밤 동안 배양하여 25 ㎖의 부피로 만들고, OD600 값이 1 내지 1.5가 될 때까지 37℃ 온도에서 배양하였다. 상기 배양액에 효소 발현을 위한 유도물질(inducer)로서 0.2 mM IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside) 및 25 nM 테트라사이클린(tetracycline)을 첨가하였다.
분광 광도계(Libra S22)를 사용하여 세포 흡광도(OD600)를 측정하였다. 유리 지방산의 농도는 DB-5 컬럼(30m x 0.25mm, Agilent)이 구비된 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)를 사용하여 정량화하였다. 각 샘플은 가스 크로마토그래피 분석을 위한 메틸화를 수행하기 위해 500 ㎕씩 분취하였다. 상기 분취한 시료에 30%(w/v) HCl 50 ㎕ 및 메틸 노나데카노에이트(methyl nonadecanoate, Sigma-Aldrich)의 에틸 아세테이트 용액 50 ㎕를 첨가하여 메틸화를 수행하였다.
총 1 ㎖의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 2회 추출한 후, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상을 분리하였다. 추출된 유기층 400 ㎕를 GC 바이알에 옮겨 메탄올 80 ㎕와 트리메틸실릴-디아조메탄(trimethylsilyl-diazomethane) 50 ㎕을 첨가하고 10분 동안 배양한 후, 가스 크로마토그래피로 분석하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, SBF25 균주로부터 생산된 유리 지방산은 SBF06에 비해 57% 더 증가하였다. 이는 막 수송 관련 envR, gusC 및 mdlA 유전자의 결실이 유리 지방산의 생산능을 증가시킨다는 것을 보여준다. 또한, SBF40 균주로부터 생산된 유리 지방산은 SBF25 균주 대비 196%로 증가하였고 SBF06 균주 대비 344%로 증가하는 것으로 나타났다. 이는 ACC 없이 acetyl-CoA에서 malonyl-CoA를 합성할 수 있는 mmc 유전자의 발현이 유리 지방산의 생산능을 증가시킨다는 것을 보여준다. 나아가, SBF41 균주로부터 생산된 유리 지방산은 SBF40 균주 대비 135%로 증가하는 것으로 나타났다. 이는 'tesA의 64번째의 아르지닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 'tesA R64C 유전자의 발현이 유리 지방산의 생산능을 증가시킨다는 것을 보여준다. 또한, SBF43 균주로부터 생산된 유리 지방산은 SBF41 균주 대비 244%로 증가하는 것으로 나타났다. 이는 PEPC(phosphoenolpyruvate carboxylase) 경로와 관련한 pcc 유전자 및 지방산 합성의 전사 활성체(transcriptional activator) 인자인 fadR 유전자의 도입이 유리 지방산의 생산능을 증가시킨다는 것을 보여준다.
이를 통해, envR, gusC 및 mdlA 유전자의 결실과 mmc, 'tesA R64C, ppc 및 fadR 유전자의 도입이 유리 지방산의 생산능 증가에 관여하는 것을 확인하였다.
실험예 2. 형질전환 대장균(SBF42, SBF43, SBF45)을 이용한 유리 지방산의 생산
상기 제조예 5 내지 7의 형질전환 균주를 이용하여 실험예 1에서와 동일한 조성의 배지에서 배양하여 유지 지방산의 생산량을 측정하였다. 상기 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 나타낸 바와 같이, SBF43 균주로부터 생산된 유리 지방산은 SBF42 균주 대비 235%로 증가하는 것으로 나타났다. 지방산 합성의 전사 활성체(transcriptional activator) 인자인 fadR 유전자의 도입이 유리 지방산의 생산능을 증가시킨다는 것을 보여준다.
SBF45 균주로부터 생산된 유리 지방산은 SBF42 균주 대비 172%로 증가하는 것으로 나타났다. 즉 'tesA와 fadR 유전자만 발현한 SBF45 균주가 fadR 유전자를 제외한 모든 전략을 도입한 SBF42에 비해 높은 생산능을 가지는 것으로 나타났다. 이는 유리 지방산 생산 과정에 있어, fadR 유전자의 추가적 발현이 생합성 경로의 다른 개별 유전자를 결실 및 도입시키는 것보다 더욱 효과적이라는 것을 보여준다.
실험예 3. 형질전환 대장균(SBF06, SBF25, SBF40, SBF41, SBF42, SBF43, SBF45)을 이용한 유리 지방산의 생산
상기 제조예 1 내지 7의 형질전환 균주를 이용하여 유리 지방산을 생산한 후 생산량을 비교 분석하였다. 실험예 1에서와 같이, 제조예 1 내지 7의 형질전환 균주를 상기와 동일한 조성의 배지에서 배양하여 유리 지방산의 생산량을 측정하였다.
상기 각 형질전환 대장균의 유리 지방산 생산량을 표 3에 나타내었다.
균주 | 측정값 | 유리 지방산 생산능 (g/gDCW/h) |
||
유리 지방산(FFA) (mg/L) | 아세테이트(ACE) (g/L) | 포도당(Glc) 소모량 (g/L) | ||
SBF06 | 518 ± 99.1 | 5.12 ± 0.42 | 10.21 ± 2.47 | 0.0026 |
SBF25 | 910 ± 248.5 | 3.68 ± 0.50 | 7.04 ± 3.80 | 0.0042 |
SBF40 | 1781 ± 240.1 | 0.31 ± 0.07 | 6.61 ± 3.31 | 0.0115 |
SBF41 | 2401 ± 90.7 | 1.29 ± 0.86 | 7.24 ± 3.65 | 0.0102 |
SBF42 | 2498 ± 241.0 | 0.98 ± 1.06 | 8.02 ± 4.05 | 0.0118 |
SBF43 | 5862 ± 355.9 | 0 ± 0 | 15.3 ± 1.54 | 0.0317 |
SBF45 | 4295 ± 131.0 | 0.1 ± 0.05 | 16.2 ± 0.18 | 0.0138 |
표 3에 나타난 바와 같이, SBF06 균주는 0.0026 g/gDCW/h의 유리 지방산 생산능을 나타내었다. 또한, SBF25 균주는 0.0042 g/gDCW/h의 유리 지방산 생산능을 나타내었다. 나아가, SBF40, SBF41, SBF42 및 SBF45 균주는 상기 SBF06 및 SBF25 균주보다 유리 지방산 생산능이 우수하였으며, 각각 0.0115, 0.0102, 0.0118 및 0.0138 g/gDCW/h의 유리 지방산 생산능을 나타내었다. 특히, 상기 형질전환된 대장균 중 SBF43 균주는 5862(±355.9) mg/L의 최종 생산능을 나타내었고 0.0317g/gDCW/h의 유리 지방산 생산능을 나타내었다.
실험예 4. 유리 지방산 생산량 증대를 위한 기질액의 C/N 비율 변화
상기 제조예 6의 SBF43 균주를 37℃에서 5 ㎖의 LB 배지에 10시간 동안 배양시킨 후, 5 ㎖의 LB 배지에서 밤새 계대 배양하였다. 이후 배양액을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포와 상등액을 분리하였다. 분리된 세포에 증류수 1 ㎖을 가하여 세척한 후 13,000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하였다. 상기와 같은 세척 과정을 2회 반복한 후, 250 ㎖의 진탕 플라스크 내의 25 ㎖의 M9 배지에 SBF43 균주를 초기 흡광도(OD600)가 0.1가 되도록 접종하고 48시간 동안 배양하였다.
이때, 상기 M9 배지는 이인산나트륨 6.78 g/L, 일인산칼륨 3 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 3% 포도당, 100 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0), 2 mM 황산마그네슘(MgSO4), 0.1 mM 염화칼슘(CaCl2), 0.2 mM IPTG, 25 nM 테트라사이클린(tetracycline)을 포함하였으며, 탄소 대 질소(C/N) 비율이 각각 25, 27.5, 30, 32.5 및 35가 되도록 0.72 내지 1.13 g/L 염화 암모늄을 각각 첨가하였다. 또한, 상기 배지에 미량의 성분으로서 염화제이철 육수화물(FeCl3·6H2O) 1.2 ㎎/L, 염화코발트 육수화물(CoCl2·6H2O) 0.1 ㎎/L, 염화제이구리 이수화물(CuCl2·2H2O) 0.075 ㎎/L, 염화아연(ZnCl2) 0.15 ㎎/L, 몰리브덴산나트륨 이수화물(Na2MO4·2H2O) 0.15 ㎎/L, 붕산(H3BO3) 0.0375 ㎎/L, 및 염화망간 사수화물(MnCl2·4H2O) 0.02475 ㎎/L를 추가로 첨가하였다.
상기 SBF43 균주로부터 생산된 유리 지방산(mg/L)은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하여 도 9에 나타내었고, 세포당 생산량을 알아보기 위해 흡광도(OD600)로 나눈 유리 지방산(mg/L/OD600)을 계산하여 도 10 및 하기 표 4에 나타내었다. 그 결과, 도 9 및 10, 및 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 세포 건조 중량은 탄소 대 질소 비율이 25에서 35로 증가함에 따라 감소하나, 세포당 생산된 유리 지방산의 양은 탄소 대 질소 비율이 25에서 35로 증가함에 따라 전반적으로 증가(35의 경우에는 32.5에 비해 약간 감소)하는 경향을 확인하였다.
C/N 비율 | 유리 지방산 (mg/L/OD600) |
25 | 453.30 ± 10.94 |
27.5 | 487.97 ± 8.99 |
30 | 571.02 ± 10.39 |
32.5 | 633.47 ± 9.24 |
35 | 624.84 ± 7.68 |
대량의 세포를 활용하여 유리 지방산을 생산하는 발효기를 사용하는 경우 세포당 생산량이 더 큰 영향을 줄 수 있으므로, 탄소 대 질소 비율이 30 내지 35인 기질액을 공급하는 것이 적합하다는 것을 확인하였다. 특히, 탄소 대 질소 비율이 32.5인 경우 세포당 생산된 유리 지방산의 양이 가장 높았으며, 탄소 대 질소 비율이 35인 경우 32.5인 경우 대비 약간 감소하였으나 세포당 생산된 유리 지방산이 두 번째로 높은 것을 확인하였다.
또한, 보다 넓은 C/N 비율 범위(즉 5 내지 120의 C/N 비율)에서 유리 지방산 생산량의 변화를 알아보기 위해, 상기와 동일한 배양 및 세척 과정을 거친 SBF43 균주를 25 ㎖의 M9 배지에 초기 흡광도(OD600)가 0.1가 되도록 접종하고 48시간 동안 배양하였다.
이때, 상기 M9 배지는 이인산나트륨 6.78 g/L, 일인산칼륨 3 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 3% 포도당, 100 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0), 2 mM 황산마그네슘(MgSO4), 0.1 mM 염화칼슘(CaCl2), 0.2 mM IPTG, 25 nM 테트라사이클린을 포함하였으며, 탄소 대 질소(C/N) 비율이 각각 5, 10, 20, 30, 40, 50 및 120이 되도록 0 내지 6.82 g/L 염화 암모늄을 각각 첨가하였다. 또한, 상기 배지에 미량의 성분으로서 염화제이철 육수화물(FeCl3·6H2O) 1.2 ㎎/L, 염화코발트 육수화물(CoCl2·6H2O) 0.1 ㎎/L, 염화제이구리 이수화물(CuCl2·2H2O) 0.075 ㎎/L, 염화아연(ZnCl2) 0.15 ㎎/L, 몰리브덴산나트륨 이수화물(Na2MO4·2H2O) 0.15 ㎎/L, 붕산(H3BO3) 0.0375 ㎎/L, 및 염화망간 사수화물(MnCl2·4H2O) 0.02475 ㎎/L를 추가로 첨가하였다.
상기 SBF43 균주로부터 생산된 유리 지방산(mg/L)은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하여 도 11에 나타내었다. 그 결과, 탄소 대 질소 비율이 30인 경우에 대비하여, 탄소 대 질소 비율이 30 미만인 경우(즉, 탄소 대 질소 비율이 5, 10 및 20인 경우) 또는 탄소 대 질소 비율이 35 초과인 경우(즉, 탄소 대 질소 비율이 40, 50 및 120인 경우)에 SBF43 균주로부터 생산된 유리 지방산(mg/L)이 오히려 저하된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5. C/N 비율이 조절된 조건에서 형질전환 대장균(SFB43)을 이용한 유리 지방산의 생산
상기 제조예 6의 SBF43 균주를 37℃에서 5 ㎖의 LB 배지에서 10시간 동안 배양시킨 후, 250 ㎖의 진탕 플라스크 내의 25 ㎖의 최소 배지에서 밤새 계대 배양하였다. 이후, 0.5 L의 최소 배지를 포함하는 1.5 L LiFlus GX 발효기(한일, 한국)에 SBF43 균주를 초기 흡광도(OD600)가 0.1 내지 0.2가 되도록 접종하고 하룻밤 동안 배양하였다.
상기 최소 배지는 포도당 30 g/L, 인산칼륨 6.67 g/L, 인산이암모늄 3.96 g/L, 시트르산 일수화물 0.88 g/L, 황산암모늄 3 g/L, 효모 추출물 30 g/L, 탄산나트륨 1.91 g/L, 황산마그네슘 칠수화물 0.79 g/L, 황산구리 오수화물 0.005 g/L, 황산아연 칠수화물 0.011 g/L, 황산철 칠수화물 0.05 g/L, 황산망간 사수화물 0.0025 g/L, 헵타몰리브덴산암모늄 사수화물 0.0005 g/L, 붕사 십수화물 0.0001 g/L, 및 염화칼륨 이수화물 0.01 g/L이 첨가된 것을 사용하였다.
SBF43 균주 배양액의 OD600이 약 10에 도달하였을 때, 효소 발현을 위한 유도물질(inducer)로서 0.2 mM IPTG 및 25 nM 테트라사이클린을 첨가해주었다. 그 후 배양액 내에 초기 공급된 질소가 결핍되고 나서 기질액의 공급을 시작하였다. 구체적으로, 배양액의 OD600이 약 25에 도달하였을 때, 포도당 700 g/L, 황산암모늄((NH4)2SO4) 42.28 g/L, 및 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4·7H2O) 7.9 g/L이 첨가되어 탄소 대 질소(C/N) 비율이 약 32±2로 조절된 기질액을 공급하였다. 유가 배양(fed-batch) 동안, 기질액 6 ㎖/h의 속도로 연속적으로 공급되었다.
상기 SBF43 균주로부터 생산된 유리 지방산은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, SBF43 균주의 유리 지방산 생산량은 배양액에서 20.25 g/L로 측정되었고 발효기 내에서 총 27.18 g/L로 측정되었으며, 0.72 g/h의 생산성을 나타내었고, 이는 지금까지 보고된 대장균의 유리 지방산 생산량에 비해 현저히 우수한 결과이다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_tesA RP
<400> 2
ttactcgagt tatgagtcat gatttacta 29
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_A2k-mmc_fwd
<400> 3
ggatccaaac tcgagtaag 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_A2k-mmc_rev
<400> 4
tcagccgatc ttgatgag 18
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_mdlA KO FP
<400> 5
tctttaccca tcgaataaat atccagaatc aggtcaggac acaacgcgtg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_mdlA KO RP
<400> 6
gcttgagagt cggccacagt tggctaaaac tacgcatcga cggcctcctc attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_mdlA seq FP
<400> 7
aacggctgga ggacgacggt atcct 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_mdlA seq RP
<400> 8
acagcagcga ctgcgcgtaa tgtag 25
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_gusC KO FP
<400> 9
ccggagattt ttctctccgg cgttattttt tacttcagca taaagtcata gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_gusC KO RP
<400> 10
actaattaat attcaataaa aataatcaga acatcaaagg tgcaactatg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_gusC seq FP
<400> 11
ggcatgtttg cgatgccagc tctta 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_gusC seq RP
<400> 12
ccggcgtgcg aattgaaggg ctcac 25
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_envR KO FP
<400> 13
gaactgaatt ttcaggacag aatgtgaatt tacatgacac ttaattcatt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_envR KO RP
<400> 14
attttctcac tctgtgtcga atatatttat ttcctgaata attaatcatg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_envR seq FP
<400> 15
gttaagcgaa gttgaccccg atctc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_envR seq RP
<400> 16
aaagaaaaat acagttcgct atcct 25
<210> 17
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_ptsI with ppc for gib FP
<400> 17
ccgggattgc ggcaggtatg cgtaataccg gctaaggatc tttaagaagg agatatacat 60
atgatttcag gcattttagc atcccc 86
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_ptsI with ppc for gib RP
<400> 18
ggatccaaac tcgagtaagg atctccaggc atcaaataaa gcatctcgtg gattagcaga 60
60
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_TesA_fadR Gib FP
<400> 19
agtaaatcat gactcataac tcgagtttaa gaaggagata tacat 45
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_TesA-fadR-RP
<400> 20
gcctggagat ccttactcga gtttggatcc ttatcgcccc 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_pntAB_gib_FP
<400> 21
tttaagaagg agatatacat atgcgaattg gcataccaag 40
<210> 22
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_pntAB_gib_RP
<400> 22
ggatccaaac tcgagtaagg atctccccgt cagggttaca gagctt 46
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_CaGapN gib_FP
<400> 23
tttaagaagg agatatacat atgtttgaaa atatatcatc 40
<210> 24
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_CaGapN gib_RP
<400> 24
ggatccaaac tcgagtaagg atctccgtga gattggatag aataaaatta taggtt 56
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_ppc_fwd
<400> 25
gtctcatcaa gatcggctga gaattcaaaa gatcttttaa gaagg 45
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_ppc_mid_seq_FP
<400> 26
aagcactgtg gccgttag 18
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_ppc_rev
<400> 27
ccttactcga gtttggatcc ttagccggta ttacgcatac 40
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_Bb_FP
<400> 28
ggatccaaac tcgagtaagg 20
Claims (10)
- i) 대장균을 최소 배지에서 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및
ii) 상기 배양액에 탄소 대 질소(C/N) 비율이 30 이상인 기질액을 공급하면서 발효를 수행하여 유리 지방산을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 대장균은 envR, gusC 및 mdlA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결실됨과 함께, mmc, tesA, ppc 및 fadR로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 도입된 것인, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 i) 단계에서 최소 배지는 포도당, 인산칼륨, 인산이암모늄, 시트르산 일수화물, 황산암모늄, 효모 추출물, 탄산나트륨 및 황산마그네슘 칠수화물을 포함하는, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 i) 단계에서 상기 배양액의 600 nm 파장에서의 흡광도(OD600)가 6 내지 10에 도달되었을 때 효소 발현을 위한 유도물질을 투입하고,
상기 ii) 단계에서 상기 기질액의 공급은 600 nm 파장에서의 흡광도(OD600)가 20 내지 30에 도달하였을 때 시작하여 상기 흡광도가 110 내지 130에 도달하였을 때까지 수행하는, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 ii) 단계에서 기질액의 탄소 대 질소(C/N) 비율이 30 내지 35인, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 ii) 단계에서 기질액은 포도당, 황산암모늄 및 황산마그네슘 칠수화물을 포함하는, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 ii) 단계에서 기질액은 5.7 ㎖/h 내지 6.3 ㎖/h의 속도로 공급되는, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 대장균은 envR, gusC 및 mdlA의 유전자가 결실된 것인, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 대장균은 mmc, tesA, ppc 및 fadR의 유전자가 도입된 것인, 유리 지방산의 생산 방법. - 제1항에 있어서,
상기 tesA 유전자는 야생형 또는 돌연변이 유전자인, 유리 지방산의 생산 방법. - 제9항에 있어서,
상기 돌연변이는 R64C인, 유리 지방산의 생산 방법.
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---|---|---|---|
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KR1020220017491A KR20220115539A (ko) | 2021-02-10 | 2022-02-10 | 형질전환 미생물을 이용한 유리 지방산 생산 방법 |
Country Status (1)
Country | Link |
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KR (1) | KR20220115539A (ko) |
-
2022
- 2022-02-10 KR KR1020220017491A patent/KR20220115539A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
Desbois and Smith, Appl. Microbiol. Biotechnol. 85. 1629-1642. 2010 |
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