KR20220113020A - 노난디오산을 생산하는 형질전환 미생물 및 이를 이용한 노난디오산 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 노난디오산을 생산하는 형질전환 미생물 및 이를 이용한 노난디오산 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대장균 균주의 유전자를 조작하여 노난산(nonanoic acid)으로부터 노난디오산(nonanedioic acid, NDA)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 대장균을 노난산에서 빠르게 성장할 수 있게 할 뿐만 아니라 대장균으로 하여금 노난산으로부터 고부가 가치 물질인 노난디오산을 과 생산할 수 있게 한다는 점에서 기존의 노난디오산 생산 방법에 비해 현저한 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 대장균은 노난디오산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 노난디오산을 생산하는 형질전환 미생물 및 이를 이용한 노난디오산 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대장균 균주의 유전자를 조작하여 노난산(nonanoic acid)으로부터 노난디오산(nonanedioic acid, NDA)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
중쇄 α,ω-디카르복실산(MCDCA)은 2개의 말단 카르복실 작용기를 가진 유기 화합물(C8 내지 C14)이다. 이는 나일론 및 기타 폴리아미드, 폴리에스테르, 및 수지와 같은 다양한 제품의 생산을 위한 중합체 산업에서뿐만 아니라 화장품 성분에 광범위하게 적용되고 있다. 현재까지, MCDCA는 주로 화학적 합성 또는 불포화 지방산의 오존 첨가 분해에 의해 생산된다. 알킬 사슬의 ω-탄소의 직접 수산화에 의해 MCDCA를 화학적으로 합성하기 위해 고체 금속 촉매가 사용된다. 그러나, 이러한 고체 금속 촉매는 낮은 효율과 불량한 선택성으로 어려움을 겪는다. 불포화 지방산의 오존 첨가 분해는 높은 선택성과 효율로 인해 MCDCA 생산을 위한 대안적인 방법이다. 그러나, 이 방법은 고에너지 투입 공정, 가혹한 반응 조건, 및 부산물 형성을 비롯한 여러 가지 한계를 지닌다.
지방산의 MCDCA 및 그 유래의 화합물로의 생물전환은 기존의 MCDCA 생산 공정을 대체할 유망한 방법이다. 힘(heme)-함유 사이토크롬 P450 효소를 사용한 ω-산화가 디카르복실산의 생산에 사용되었는데, 이는 이것이 지방산의 말단 알칸 사슬을 직접 수산화시키기 때문이다.
유사하게, 높은 효율 및 위치 선택성으로 중쇄 지방산(MCFA, C8 내지 C14)을 ω-산화시키기 위해 대장균으로의 Pseudomonas putida GPo1 ω-산화 경로 시스템의 도입이 연구되었다. P. putida GPo1의 ω-산화 경로 시스템은 알칸 분해 경로의 일부로 알칸 하이드록실라제(alkane hydroxylase)(AlkBGT) 시스템을 포함한다. 이 AlkBGT 시스템은 MCFA의 말단 위치의 산화에 대해 높은 특이성을 갖는다.
한편, 노난디오산(NDA)은 플라스틱 및 여드름 약물 치료에 사용되는 9개의 탄소 사슬 길이의 디카르복실산이다. NDA는 작물과 동물 산물에서 발견되는 천연 생성물이다. 기미와 주근깨에 대한 미백 효과와 더불어 항균 및 항염증 효과로 인해 화장품에 사용하기 위한 원료로서의 NDA의 가치가 높아졌다. 따라서, 노난산의 ω-산화에 의한 NDA의 생물학적 생산은 실행 가능하고 매력적인 방법이 된다.
대장균은 β-산화 경로를 통해 장쇄 지방산을 사용하여 성장할 수 있다. FadR은 지방산 분해(β-산화)의 억제 인자로서, 이의 결실은 β-산화를 향상시킨다. 그러나, 여러 연구에서 fadR-결실 대장균 균주는 MCFA를 유일 탄소원으로 사용할 때 잘 성장하지 않는다고 보고되었다. 이러한 낮은 성장은 대장균에 대한 MCFA의 독성과 MCFA에 대한 아실-CoA 합성 효소 FadD의 낮은 기질 특이성에 기인할 수 있다.
MCDCA의 대량 생산의 경우, 전구체로서 지방산의 직접 공급이 효과적인 전략이 될 수 있지만, MCFA의 독성으로 인해, 기존 전략의 대안으로는 독성을 거의 나타내지 않는 메틸화 지방산 또는 장쇄 지방산의 전구체로서의 사용이 있다. 그러나, 이 방법은 일반적으로 지방산의 에스테르화와 모노에스테르화-카르복실산의 α,ω-DCA로의 전환을 모두 필요로 하며, 그에 따라 궁극적으로는 MCDCA의 생산에 적합하지 않다.
이에 본 발명자들은 대장균 균주의 유전자를 조작하여 노난산으로부터 노난디오산을 생산하는 방법을 개발하기 위해, 특정 대장균 균주를 실험실 적응 진화시킨 후 야생형 균주와 비교하여 유일 탄소원인 노난산에서 가장 빠른 성장을 보인 대장균 돌연변이체를 얻고, 이 대장균 돌연변이체로부터 총 6개의 돌연변이를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하게 위하여, 본 발명의 일 측면은, i) fadR 유전자가 결실되고, ii) AcrR, FadD, DppA, Crp, e14 프로파지 및 YeaR로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 돌연변이된 형질전환 대장균을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, i) 상기 형질전환 대장균을 배양하는 단계; 및 ii) 상기 형질전환 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함하는 노난디오산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) 야생형 대장균의 fadR 유전자를 결실시키는 단계; ii) 상기 대장균을 노난산이 유일탄소원인 최소배지에서 10일 이상 배양시키는 단계; 및 iii) 90일 이상 반복적으로 계대배양시키는 단계를 포함하는, 노난산으로부터 노난디오산을 생산하는 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 방법으로 제조된 대장균을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) 상기 대장균을 배양하는 단계; 및 ii) 상기 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함하는 노난디오산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 대장균을 노난산에서 빠르게 성장할 수 있게 할 뿐만 아니라 대장균으로 하여금 노난산으로부터 고부가 가치 물질인 노난디오산을 과 생산할 수 있게 한다는 점에서 기존의 노난디오산 생산 방법에 비해 현저한 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 대장균은 노난디오산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 M9 최소배지에서 성장시킨 대장균 야생형 MG1655(WT), fadR-결실 대장균(MRD), 및 MRD를 실험실 적응 진화에 적용한 후 분리된 10개의 돌연변이체(C1 내지 C10)의 성장 곡선를 나타낸 그래프이다.
도 2는 M9 최소배지에서 성장시킨 대장균 야생형 MG1655(WT), fadR-결실 대장균(MRD), 및 MRD를 실험실 적응 진화에 적용한 후 분리된 10개의 돌연변이체 중 가장 빠른 성장을 보인 C6(MRE)의 성장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 MRE, MRE-유래 단일 돌연변이 복원 균주, 및 MRD-Pf의 성장 곡선을 도시하고; 도 3b는 노난산에서 배양된 MRE, MRD, 및 MRD-유래 단일 돌연변이-도입 균주의 세포 생존 능력을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 MRE-BGT, MRD-BGT, 및 MRD-EB의 NDA 농도를 나타내는 그래프를 도시하고; 도 4b는 생물변환 24시간째의 MRE-BGT, MRD-BGT 및 MRD-유래 단일 돌연변이-도입 fadE-결실 alkBGT 발현 균주의 NDA 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 M9 최소배지에서 성장시킨 대장균 야생형 MG1655(WT), fadR-결실 대장균(MRD), 및 MRD를 실험실 적응 진화에 적용한 후 분리된 10개의 돌연변이체 중 가장 빠른 성장을 보인 C6(MRE)의 성장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 MRE, MRE-유래 단일 돌연변이 복원 균주, 및 MRD-Pf의 성장 곡선을 도시하고; 도 3b는 노난산에서 배양된 MRE, MRD, 및 MRD-유래 단일 돌연변이-도입 균주의 세포 생존 능력을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 MRE-BGT, MRD-BGT, 및 MRD-EB의 NDA 농도를 나타내는 그래프를 도시하고; 도 4b는 생물변환 24시간째의 MRE-BGT, MRD-BGT 및 MRD-유래 단일 돌연변이-도입 fadE-결실 alkBGT 발현 균주의 NDA 농도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, i) fadR 유전자가 결실되고, ii) AcrR, FadD, DppA, Crp, e14 프로파지 및 YeaR로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 돌연변이된 형질전환 대장균을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "fadR "유전자는 지방산 분해(β-산화)의 억제 인자인 FadR를 암호화하는 유전자이다. 상기 FadR 및 이를 암호화하는 fadR 유전자는 Gene ID: 948652에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효소 또는 폴리펩티드 등을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 예를 들면, Cre/loxP 재조합 시스템을 사용하여 유전자 결손을 위한 카세트를 모균주에 형질전환함으로써 수행될 수 있고, 대장균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 일부 핵산 서열이 결실된 유전자 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 아울러, 상기 효소 또는 폴리펩티드를 암호화하는, 염색체 상의 염기서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 염기서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 염기서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "AcrR"란, acrAB 유전자의 잠재적 조절 단백질로, 상기 AcrR 및 이를 암호화하는 acrR 유전자는 Gene ID: 945516에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 AcrR 돌연변이는 서열번호 42로 표시되는 염기서열 중 567번째 염기인 아데닌(A)이 결실된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "FadD"란, 분해 또는 인지질로의 통합을 위해 외인성 장쇄 지방산의 CoA 티오에스테르로의 수송과 함께 에스테르 화를 촉매하는 단백질이다. 상기 FadD 및 이를 암호화하는 fadD 유전자는 Gene ID: 946327에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 FadD 돌연변이는 서열번호 43으로 표시되는 fadD와 yeaY의 유전자간 영역(yeaY/fadD intergenic region)의 염기서열 중 90번째 염기인 구아닌(guanin) 및 94번째 염기인 사이토신(cytosine)이 아데닌(adenine)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "DppA"란, 디펩타이드 수송 단백질(plasmic dipeptide transport protein )로, 상기 DppA 및 이를 암호화하는 dppA 유전자는 Gene ID: 948062에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 DppA 돌연변이는 서열번호 44로 표시되는 염기서열 중 1570번째 염기에 이동성 유전인자 (mobile genetic element) IS5가 삽입된 것일 수 있다. 상기 DppA 돌연변이는 서열번호 51로 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "Crp"란, CRP-cAMP 활성화 전사 조절인자 CRP(cAMP-activated global transcriptional regulator CRP)로, 상기 Crp 및 이를 암호화하는 crp 유전자는 Gene ID: 947867에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 Crp 돌연변이는 서열번호 45로 표시되는 crp와 yhfA의 유전자간 영역(yhfA/crp intergenic region)의 염기서열 중 125번째 염기에 이동성 유전인자 IS5(서열번호 52)가 삽입된 것일 수 있다. 상기 crp와 yhfA의 유전자간 영역은 서열번호 45으로 표시되는 염기서열 일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "e14 프로파지"란, 여러 유전자들을 갖고 있는 것으로, 대장균(E. coli) 게놈(genome)의 1195432 bp 부터 1210646 bp까지 해당한다. 상기 e14 프로파지 돌연변이는 서열번호 46으로 표시되는 염기서열의 icd-icdC 유전자가 결실된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "YeaR"란, 질산염에 반응하여 유도되는 것으로 보고된 알려지지 않은 기능을 가진 단백질로, 상기 YeaR 및 이를 암호화하는 yeaR 유전자는 Gene ID: 946317에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 YeaR 돌연변이는 서열번호 47으로 표시되는 염기서열 중 115번째 염기에 이동성 유전인자 IS186(서열번호 54)가 삽입된 것일 수 있다. 상기 YeaR 돌연변이는 서열번호 53으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, i) 상기 형질전환 대장균을 배양하는 단계; 및 ii) 상기 형질전환 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함하는 노난디오산을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 대장균에 fadE 유전자를 결실시키는 단계; ii) 상기 대장균에 alkBGT 유전자 및 IPTG-유도성 프로모터를 포함하는 발현벡터를 삽입시키는 단계; iii) 상기 대장균을 배양하는 단계; iv) IPTG를 처리한 후, 상기 대장균을 배양하는 단계; 및 v) 상기 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 노난디오산을 생산하는 방법에 있어서, 상기 형질전환 대장균에 대해서는 전술한 형질전환 대장균에 대한 설명을 참조한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "fadE"유전자는 아실-CoA 탈수소효소를 암호화하는 유전자이다. 상기 아실-CoA 탈수소효소 및 fadE 유전자는 Gene ID: 949007에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "alkBGT"유전자란, alkB(서열번호 48), alkG(서열번호 49) 및 alkT(서열번호 50) 3개 유전자로 이루어진 오페론으로, 알칸 모노옥시게나제를 암호화하는 유전자이다. 상기 알칸 모노옥시게나제는 중간탄소사슬길이의 탄소 말단 부분을 산화시켜 산소를 첨가하는 반응에 관여한다. 상기 alkBGT"유전자는 P. putida GPo1로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "배양"이란, 상기 형질전환 대장균으로부터 노난디오산을 생산하기 위하여, 상기 형질전환 대장균을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 형질전환 대장균을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 노난디오산으로 대사될 수 있는 하나 이상의 기질을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 상기 배양은 노난산 존재 하에 형질전환 대장균을 배양하는 것일 수 있다.
사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스를 주탄소원으로 사용하며, 이외에 자일로스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다.
상기 배양은 글루코스 존재 하에 효모를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
통상적으로, 대장균은 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 적절한 배지 내에 배양(성장)할 수 있다. 본 발명에서 배지는, 예를 들면, 암모늄 설페이트, 및 탄소/에너지 공급원으로서의 덱스트로스를 포함하는 브로스(broth) 또는 상업적으로 제조된 통상적인 배지일 수 있다. 그밖에 정의되거나 합성된 배지도 사용할 수 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효과학 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
상기 형질전환 대장균을 통해 생산된 노난디오산은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양 배지로부터 분리할 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피, 가스크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 가스 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) 야생형 대장균의 fadR 유전자를 결실시키는 단계; ii) 상기 대장균을 노난산이 유일탄소원인 최소배지에서 10일 이상 배양시키는 단계; 및 iii) 90일 이상 반복적으로 계대배양시키는 단계를 포함하는, 노난산으로부터 노난디오산을 생산하는 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 i) 단계에서 야생형 대장균의 fadE 유전자를 결실시키는 단계가 추가적으로 더 포함될 수 있다.
상기 ii) 단계에서 노난산은 적어도 3 g/L의 농도로 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 ii) 단계에서 최소배지가 NaH2PO4, KH2PO4, NaCl, NH4Cl, MgSO4·7H2O 및 CaCl2 가 첨가된 M9 최소배지일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 5 g/L, NaH2PO4 6.78 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH4Cl 1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.49 g/L, 및 CaCl2 0.011 g/L가 첨가된 M9 최소배지를 사용하였다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 방법으로 제조된 대장균을 제공한다. 상기 대장균은 fadR 유전자가 결실되고, AcrR, FadD, DppA, Crp, e14 프로파지 및 YeaR의 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 돌연변이된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 대장균은 fadE 유전자가 추가적으로 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) 상기 대장균을 배양하는 단계; ii) 상기 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함하는 노난디오산을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 i) 상기 대장균에 alkBGT 유전자 및 IPTG-유도성 프로모터를 포함하는 발현벡터를 삽입시키는 단계; ii) 상기 대장균을 배양하는 단계; iii) IPTG를 처리한 후, 상기 대장균을 배양하는 단계; 및 iv) 상기 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 배양 방법 및 노난디오산 수득 방법은 형질전환 대장균을 이용한 노난디오산을 생산하는 방법에서 상술한 바와 동일하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 미생물 균주 및 플라스미드
대장균 DH10B를 플라스미드 구축에 사용하고, 대장균 MG1655 K-12(Blattner et al., Science 277, 5331, 1453-1474(1997) 참고)를 실험실 적응 진화 및 생물변환을 위한 이종 유전자 발현을 비롯한 모든 유전자 변형을 위한 모균주로 사용하였다. 구축된 균주 및 플라스미드는 하기 표 1에 나타내었다. 염색체 유전자의 결실은 λ-재조합 시스템을 이용하여 수행하였으며, 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
| 균주 | 유전자형 및 설명 |
| WT | E. coli MG1655 K-12 F-λilvG-rfb-50rph -1 |
| MRD | △fadR::FRT를 지닌 WT |
| MRE | 유일 탄소원으로 3 g/L의 노난산을 사용하는 배지에서 성장하도록 진화된 MRD |
| MRD-a | acrR*를 지닌 MRD |
| MRD-Pf | PfadD*를 지닌 MRD |
| MRD-e | e14 프로파지 결실을 지닌 MRD |
| MRD-y | yeaR*를 지닌 MRD |
| MRD-Pc | Pcrp*를 지닌 MRD |
| MRD-d | dppA*를 지닌 MRD |
| MRE-a | acrR이 복원된 MRE |
| MRE-Pf | PfadD가 복원된 MRE |
| MRE-y | yeaR이 복원된 MRE |
| MRE-Pc | Pcrp가 복원된 MRE |
| MRE-d | dppA가 복원된 MRE |
| MRD-BGT | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD |
| MRE-BGT | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRE |
| MRD-EB | 6개의 MRE 돌연변이, △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD |
| MRD-aFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD-a |
| MRD-PfFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD-Pf |
| MRD-eFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD-e |
| MRD-yFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD-y |
| MRD-PcFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD-Pc |
| MRD-dFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRD-d |
| MRE-aFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRE-a |
| MRE-PfFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRE-Pf |
| MRE-yFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRE-y |
| MRE-PcFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRE-Pc |
| MRE-dFB | △fadE::FRT 및 A6c-alkBGT를 지닌 MRE-d |
| 플라스미드 | |
| pBbA6c-rfp | p15A 레플리콘, PLlacO-1 프로모터 및 rfp, CmR을 지님 |
| pBbA6c-alkBGT | △rfp::alkBGT, CmR을 지닌 A6c-rfp |
별표(*)는 진화된 균주인 MRE에서의 해당 돌연변이를 나타냄.
| 프라이머 | 서열(5'-3') | 목적 | 서열번호 |
| fadR del H1 F | TCTGGTATGATGAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC | fadR 녹아웃 | 1 |
| fadR del H2 R | AACAACAAAAAACCCCTCGTTTGAGGGGTTTGCTCTTTAAACGGAAGGGAATTCCGGGGATCCGTCGACC | fadR 녹아웃 | 2 |
| fadR seq F | GGGCGAGTTTGTACCAGTCGG | fadR 시퀀싱 | 3 |
| fadR seq R | GCGCGGCGACCGTTCGCTG | fadR 시퀀싱 | 4 |
| fadE del H1 F | CCATATCATCACAAGTGGTCAGACCTCCTACAAGTAAGGGGCTTTTCGTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC | fadE 녹아웃 | 5 |
| fadE del H2 R | TTACGCGGCTTCAACTTTCCGCACTTTCTCCGGCAACTTTACCGGCTTCGATTCCGGGGATCCGTCGACC | fadE 녹아웃 | 6 |
| fadE seq F | AAAAGTTAGCCAGCGTTTCCGCCGC | fadE 시퀀싱 | 7 |
| fadE seq R | ACGTTGGGAGATGAGACGTATCAGG | fadE 시퀀싱 | 8 |
| PfadD* MAGE Oligo | ATATTAACTCATCATACCAGCTTGATAATTACCCAACGAAAAGTTTGTGAAGCGCGTCACTATTTATTTTTATCTTTACCGTAAGAATGC | PfadD 돌연변이유발 | 9 |
| PfadD back | ATATTAACTCATCATACCAGCTTGATAATTACCCAACGAAAAGGTTGCGAAGCGCGTCACTATTTATTTTTATCTTTACCGTAAGAATGC | PfadD 야생형 돌연변이유발 | 10 |
| PfadD* tetA H1P1 F | CTGTTTCTGCATTCTTACGGTAAAGATAAAAATAAATAGTGACGCGCTTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | PfadD 돌연변이유발 | 11 |
| PfadD* tetA H2P4 R | TAACATAATATTAACTCATCATACCAGCTTGATAATTACCCAACGAAAAGATTCCGGGGATCCGTCGACC | PfadD 돌연변이유발 | 12 |
| acrR tetA H1P1 F | CGGCCTGATGGAAAACTGGCTCTTTGCCCCGCAATCTTTTGATCTTAAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | acrR 돌연변이유발 | 13 |
| acrR tetA H2P4 R | GGCACAGGAGATACATCTCCAGTAAGATGGCAACGTAATCGCGGGCTTCTATTCCGGGGATCCGTCGACC | acrR 돌연변이유발 | 14 |
| acrR* MAGE Oligo | GAGATACATCTCCAGTAAGATGGCAACGTAATCGCGGGCTTCTTTTTAAGATCAAAAGATTGCGGGGCAAAGAGCCAGTTTTCCATCAGG | acrR 돌연변이유발 | 15 |
| acrR back | ATATTAACTCATCATACCAGCTTGATAATTACCCAACGAAAAGGTTGCGAAGCGCGTCACTATTTATTTTTATCTTTACCGTAAGAATGC | acrR 야생형 돌연변이유발 | 16 |
| acrR seq F | CCTGTTAGGGCTAAGCTGCC | acrR 시퀀싱 | 17 |
| acrR seq R | CGCCGTGTTCTGGCATAACA | acrR 시퀀싱 | 18 |
| e14 H1-P4 | AAAGTAAATCCTGGCTCTATTATTCTCTCCGCTGAGATGATGCTGCGCCAATTCCGGGGATCCGTCGACC | e14 프로파지 결실 | 19 |
| e14 H2-P1 | CGCCTTCCATACCTTTAACAATCAGGTCAGCCGCTTCAGTCCAACCCATAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | e14 프로파지 결실 | 20 |
| e14 MAGE oligo | TCCATACCTTTAACAATCAGGTCAGCCGCTTCAGTCCAACCCATATGGCGCAGCATCATCTCAGCGGAGAGAATAATAGAGCCAGGATTT | e14 프로파지 결실 | 21 |
| e14 seq F | GTAATTCCCCTGTCTTCAGG | e14 프로파지 시퀀싱 | 22 |
| e14 seq R | AACAACGGGCGTGTTATACG | e14 프로파지 시퀀싱 | 23 |
| yeaR H1-P4 | CACCTGCCGGAATATTCGAACGTCATCTTGATAAAGGAACGCGCCCGGGGATTCCGGGGATCCGTCGACC | yeaR 돌연변이유발 | 24 |
| yeaR H2-P1 | TCAGCGTAGCCGAGATATTTGACCGCCCCATGCATAACGGAAAGGCGTGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | yeaR 돌연변이유발 | 25 |
| yeaR IS186 FP | CACCTGCCGGAATATTCGAA | yeaR 돌연변이유발 | 26 |
| yeaR IS186 RP | TCAGCGTAGCCGAGATATTT | yeaR 돌연변이유발 | 27 |
| PyhfA/crp H1-P4 | CCTGGGTCATGCTGAAGCGAGACACCAGGAGACACAAAGCGAAAGCTATGATTCCGGGGATCCGTCGACC | PyhfA/crp 돌연변이유발 | 28 |
| PyhfA/crp H2-P1 | CTTTGCATACATGCAGTACATCAATGTATTACTGTAGCATCCTGACTGTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | PyhfA/crp 돌연변이유발 | 29 |
| PyhfA/crp IS5 FP | CCTGGGTCATGCTGAAGCGA | PyhfA/crp 돌연변이유발 | 30 |
| PyhfA/crp IS5 RP | CTTTGCATACATGCAGTACA | PyhfA/crp 돌연변이유발 | 31 |
| dppA H1-P4 | CCGTGTTTGAACCGGTACGTAAAGAAGTTAAAGGCTATGTGGTTGATCCAATTCCGGGGATCCGTCGACC | dppA 돌연변이유발 | 32 |
| dppA H2-P1 | TTGTATGGCTTTTAATTATTCGATAGAGACGTTTTCGAAGTGATGTTTGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | dppA 돌연변이유발 | 33 |
| dppA IS5 FP | CCGTGTTTGAACCGGTACGT | dppA 돌연변이유발 | 34 |
| dppA IS5 RP | TTGTATGGCTTTTAATTATT | dppA 돌연변이유발 | 35 |
| dppA IS5 seq FP | GCCTCTGAACAAGGCTCCAA | dppA 시퀀싱 | 36 |
| dppA IS5 seq RP | ACAGCGCCACCGGGTATACA | dppA 시퀀싱 | 37 |
| PyhfA/crp IS5 seq FP | TTATCGCCTGAGTTGCCGTC | PyhfA/crp 시퀀싱 | 38 |
| PyhfA/crp IS5 seq RP | AACCATTCGAGAGTCGGGTC | PyhfA/crp 시퀀싱 | 39 |
| yeaR IS186 seq FP | CTTCGCTGATATGGTGCTAA | yeaR 시퀀싱 | 40 |
| yeaR IS186 seq RP | CTTTCCGTTGTTGCGCACCT | yeaR 시퀀싱 | 41 |
모든 프라이머는 마크로젠(한국)으로부터 구입하였음.
실험예 2. 화학 물질, 효소 및 배양 조건
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 시약은 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다. 제한 효소 및 Phusion high-Fidelity DNA 중합 효소(Thermo Fischer Scientific) 및 DNA 리가아제(New England Biolabs)를 클로닝 및 유전자 변형에 사용하였다.
균주는 LB(Luria-Bertani) 배지(리터당 조성: 5 g의 효모 추출물, 10 g의 펩톤, 및 10 g의 NaCl)에서 배양하였다. 실험실 적응 진화의 경우, M9 최소배지(리터당 조성: 6.78 g의 NaH2PO4, 3 g의 KH2PO4, 0.5 g의 NaCl, 1 g의 NH4Cl, 0.49 g의 MgSO4·7H2O, 및 0.011 g의 CaCl2)를 사용하였다. 배지에 0.5% Tween-80 및 3 g/L의 노난산을 보충하였다. 균주를 호기성 조건하에 37℃, 200 rpm 조건의 진탕기에서 교반하면서 배양하였다. 항생제는 암피실린(100 mg/L), 카나마이신(50 mg/L), 및 클로람페니콜(30 mg/L)를 사용하였다.
실험예 3. 실험실 적응 진화
LB 플레이트 상의 fadR 유전자를 결실시킨 MRD 균주의 단일 콜로니를 3 ㎖의 LB broth 배지에 접종하였다. 먼저, 유일 탄소원으로서 3 g/L의 노난산이 보충된 5 ㎖의 새로운 M9 최소배지에서 1:100으로 희석하였다. 하룻밤 동안 배양시킨 MRD 균주의 광학 밀도(OD600)가 2.5에 도달하였을 때, 5 ㎖의 동일한 M9 최소배지에서 1:100으로 희석하여 접종하여 배양하였다. 이 과정을 30회 반복하여 계대배양하였다.
상기 계대배양이 끝나고 LB 플레이트에서 배양된 균주의 단일 콜로니를 3 ㎖의 LB broth 배지에 접종하고 37℃ 온도에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 균주를 4 g/L의 글루코스가 보충된 5 ㎖의 M9 최소배지에서 1:100으로 희석하여 접종하였다. 24시간 배양 후, 균주를 0.5% Tween-80 및 3 g/L의 노난산이 보충된 25 ㎖의 새로운 M9 최소배지에서 1:25로 희석하여 접종하였다. OD600을 측정하고, OD600이 가장 높은 균주를 "MRE" 균주로 명명하였으며, 이를 추가 연구를 위해 선별하였다.
실험예 4. 전체 게놈 시퀀싱
게놈 DNA를 GeneAll DNA 분리 키트(㈜진올바이오테크놀러지, Cat. No. 103-102)를 제조사의 매뉴얼에 따라 MRE 균주로부터 분리하고, Illumina HiSeq 2000 플랫폼에서 차세대 시퀀싱(NGS)(한국 마크로젠)을 사용하여 시퀀싱하였다. 이때, 야생형 대장균 MG1655 균주의 게놈(NCBI 번호 NC_000913.3)을 게놈 어셈블리를 위한 기준으로 사용하였다. 모든 돌연변이는 Sanger DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
실험예 5. 세포 생존 능력 측정
LB broth 배지에서 하룻밤 동안 배양시킨 균주를 새로운 M9 최소배지로 2회 세척하였다. 그 후, 8Х107개 세포수가 되도록 3 g/L의 노난산이 보충된 M9 최소배지를 사용하여 96-웰 플레이트에 재분주한 후, 37℃ 및 200 rpm 조건에서 30분 동안 배양하였다. 30분 후, 배양물을 연속적으로 희석하고, LB 한천 플레이트 상에 분주하였다. 37℃ 온도에서 하룻밤 동안 배양시킨 후 개별 콜로니를 계수하였다. 이어서, 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하였다. 모든 처리는 데이터 재현성을 보장하기 위해 3회 반복하여 수행하였다.
실험예 6. RNA 시퀀싱
4 g/L의 글루코스가 보충된 M9 최소배지에서 하룻밤 동안 배양시킨 균주를 1 g/L의 노난산이 보충된 새로운 M9 최소배지에서 1:25로 희석하여 접종하고, 37℃ 및 200 rpm 조건에서 배양하였다. RNA 샘플은 OD600이 0.5에 도달했을 때 배양물로부터 준비하였다. 균주로부터 RNA를 분리하기 위해, 먼저 RNAprotect® Bacteria Reagent(Qiagen #76506)로 처리하여 RNA를 안정화시켰다. 그 후, rRNA의 제거를 위해, riboPooL Probes(Pan-prokaryote)(siTOOLS BIOTECH)를 사용하였고, RNA Clean & Concentrator(Zymoresearch R1013)를 통해 순수한 RNA를 얻었다. KAPA Stranded RNA-seq Library Preparation Kit(Roche KK8400)를 사용하여 RNA 라이브러리를 구축하고, Nextseq를 시퀀싱에 사용하였다. 시퀀싱 결과 파일을 Bowtie, samtools, cufflinks로 분석하고, metascope로 시각화하였다. 유전자 발현을 log2 배수 변화로 계산하였으며, 여기서 4배 이상(log2 척도에서는 2배)의 유전자 발현 변화가 유의한 것으로 간주되었다. 이때, GO(Gene Ontology) term 분석을 위해, GO Consortium(http://geneontology.org/) 및 PANTHER를 사용하였다.
실험예 7. 생물변환(biotransformation)
재조합 균주 또는 MRE 균주의 단일 콜로니를 5 ㎖의 LB broth 배지에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 배양된 균주를 400 ㎖의 LB broth 배지에 접종(1:100)하고, 0.7 내지 0.8의 OD600에서 0.1 mM 농도의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 처리하여 표적 유전자의 발현을 유도하였으며, 30℃ 및 200 rpm 조건에서 16시간 동안 배양하였다.
그 후, 상기 균주를 4℃, 2,600Хg 조건에서 15분 동안 원심 분리하고, 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)에 재현탁시켰다. 상기 균주를 OD600이 35가 될 때까지 농축하여 사용하였다.
생물변환은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중에 96%의 노난산 스톡 용액을 1 g/L의 최종 농도가 되도록 10 ㎖의 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 및 1 X 필터 살균된 미량 원소 용액(g/L: 2.4 g의 FeCl3·6H2O, 0.3 g의 CoCl2·H2O, 0.15 g의 CuCl2·2H2O, 0.3 g의 ZnCl2, 0.3 g의 Na2MO4·2H2O, 0.075 g의 H3BO3, 및 0.495 g의 MnCl2·4H2O)에 첨가하여 250 ㎖의 진탕 플라스크에서 수행하였다. 보조기질(co-substrate)인 0.4% 글리세롤을 보충하고, 30℃ 및 200 rpm 조건의 진탕기에서 수행하였다. 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)를 이용한 산물 정량 및 확인을 위해 샘플을 서로 다른 시점에서 수집하였다.
실험예 8. 산물 및 데이터 분석
노난디오산(nonanedioic acid, NDA)의 정량 및 확인을 위해, 500 ㎕의 상층액을 50 ㎕의 12 N 농도의 HCl과 50 ㎕의 1 g/L농도의 노나데카노에이트(Sigma-Aldrich)에 첨가하였다.
그 후, 500 ㎕의 에틸 아세테이트 및 격렬한 볼텍싱를 이용하여 노난디오산을 2회 추출하였다. 원심분리한 후, 500 ㎕의 유기층을 수집하고, 이를 100 ㎕의 MeOH와 50 ㎕의 트리메틸실릴-디아조메탄(Sigma-Aldrich)와 혼합하였다. 불꽃 이온화 검출기(FID)와 DB-5 컬럼(30 mХ0.25mm, Agilent Technologies)이 장착된 가스 크로마토그래피(Agilent 7890A)를 사용하여 노난디오산 메틸 에스테르(NDAME)를 분석하였다.
가스 크로마토그래피 분석 시 다음과 같은 조건으로 수행하였다:
주입 부피, 2 ㎕;
분할 비가 1:10인 270℃의 주입구;
검출기 온도, 300℃;
운반 가스, N2;
유속, 0.82 ㎖ min-1;
오븐 온도, 60℃의 초기 온도에서 2분간 유지하고, 이어서 20℃ min-1로 180℃까지 승온하여 2분간 유지하고, 20℃ min-1로 300℃까지 승온하여 6분간 유지함.
표적 화합물의 농도는 검량선(R2 > 0.99)을 사용하여 결정하였다.
실시예 1.
fadR
유전자가 결실된 대장균(MRD) 균주 제조 및 실험실 적응 진화
대장균의 fadR 유전자의 결실은 FadA, FadD, 및 FadE와 같은 관련 효소의 발현을 상향 조절하여 그의 β-산화 경로를 탈억제하는 바, 본 실시예에서는 fadR 유전자가 결실된 대장균인 MRD 균주를 실험실 적응 진화시켜 노난산을 유일 탄소원으로 사용하고 더 빠르게 성장하는 돌연변이체를 얻고자 하였다.
구체적으로, MG1655 균주에서 fadR 유전자가 결실된 MRD 균주를 제조하기 위해, lambda-red recombination system와 및 FLP-매개 부위-특이 재조합 시스템(FLP-mediated site-specific recombination system)을 이용하였다. 구체적으로, fadR 유전자와 상동성 서열을 지니고 있는 프라이머(서열번호 1 및 2) 및 주형으로서 pKD13을 이용하여 kan 카세트를 PCR 증폭하였다. lambda Red 재조합 시스템을 이용하여 pSIM5로부터 발현시킨 후, 상동성 재조합을 통해 fadR 유전자를 kan 카세트로 치환하여 결실시켰다. 이후, pCP20를 이용하여 치환된 kan 카세트를 Flp-FRT 재조합으로 제거하였다.
상기 실험예 2 및 실험예 3에 기재된 바와 같이, 3 g/L의 노난산이 보충된 M9 최소배지에서 MRD 균주를 반복적으로 계대 배양함으로써 실험실 적응 진화시켰다. 구체적으로, 30회의 반복적인 계대배양(90일) 후, 10개의 단일 적응 균주(C1 내지 C10)를 무작위로 분리하였다. 상기 분리한 C1 내지 C10 균주를 실험예 5의 방법으로 3 g/L의 노난산에서의 성장 정도를 확인하였다. 이때, 대조군으로서 야생형 대장균(WT) 및 실험실 적응 진화에 적용되지 않은 MRD를 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, C6(이하 MRE 균주) 균주가 10개의 균주 중에서 가장 빠른 성장을 보였다. MRE 균주는 야생형 대장균 및 MRD 균주에 비해 성장능이 크게 향상되었으며, 특히, 배양 120시간째에 OD600이 2.7에 도달하였다.
또한, 상기 야생형 대장균, MRD 균주 및 MRE 균주에 대해 3 g/L의 노난산에서의 성장 정도를 추가 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 30회의 반복적인 계대배양 후, MRE 균주는 배양 72시간만에 OD600이 1.5에 도달하였다. 반면에, 야생형 대장균과 MRD 균주는 모두 배양 120시간째까지 전혀 성장하지 못하는 것을 확인하였다. 이는 대장균 균주의 성장이 노난산에 의해 저해되었음을 암시한다.
이를 통해, fadR 유전자가 결실된 MRD 균주를 실험실 적응 진화시켜 노난산 존재하에서도 빠르게 성장하는 MRE 균주를 수득하였다.
실시예 2. MRE 균주의 돌연변이 확인
MRE 균주에서 발생한 임의의 돌연변이를 확인하기 위해 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)를 수행하였다.
그 결과, MRE 균주는 MRD 균주와 비교하여 6개의 돌연변이가 발생한 것을 확인하였다. 각 돌연변이의 정보를 하기 표 3에 나타내었다. 모든 돌연변이는 Sanger DNA 시퀀싱을 이용하여 확인하였다.
| 유전자 | 유전자 산물 | 서열 변화 a | 단백질 및 뉴클레오타이드 변화 b |
| acrR | HTH-타입 전사 조절 인자 AcrR | ΔA | 코딩(567/648 nt) |
| crp/yhfA | cAMP-활성화 광역 전사 조절 인자 CRP/OsmC 패밀리 단백질 YhfA |
IS5(-) | 비-코딩(-177 nt)/(-126 nt) |
| dppA | 주변세포질 디펩타이드 수송 단백질 | IS5(-) | 코딩(1570-1573/1608 nt) |
| fadD | 장쇄 지방산-CoA 리가제 | C→A & G→A | 비-코딩(-111 nt) & (-115 nt) |
| icd-icdC | e14 프로파지 | 큰 DEL | (1-15,204/15,204 nt) |
| yeaR | 기능이 알려지지 않은 단백질 | IS186(-) | 코딩(115-120/360 nt) |
DEL, 결실
a (-), NCBI에서 이용 가능한 MG1655의 서열(NC_000913.3)에 대해 음성됨.
b 비-코딩 영역에서의 돌연변이는 인접 유전자들의 시작 코돈(들)의 업스트림에 있는 위치에 의해 주석이 추가됨
상기 표 3에 나타난 바와 같이, acrR 유전자의 염기서열의 567번째 위치에서의 아데노신(A)이 결실된 것을 확인하였다. 상기 결실은 26개의 후속 아미노산을 53개의 상이한 아미노산으로 변경시켰다.
또한, MRE 균주의 CRP-cAMP 조절에서 다음과 같은 2개의 돌연변이가 발생하였다: (1) crp와 yhfA의 유전자간 영역으로의 IS5의 삽입(Pcrp*); (2) fadD 프로모터의 CRP-cAMP 결합 부위에서의 2개의 뉴클레오타이드 변화(P fadD* ).
나아가, MRE 균주에서 다음과 같은 2개의 추가의 이동성 요소 삽입 돌연변이가 있었다: (1) 주변세포질 결합 단백질 유전자인 dppA 유전자의 정지 코돈으로부터 위쪽 30번째 위치에서의 IS5 삽입; (2) 주석이 없는(unannotated) 유전자 yeaR의 115번째 뉴클레오타이드에서의 IS186 삽입. 상기 IS5 삽입은 dppABCDF 오페론의 중간에서 발생하여, dppA 프로모터로부터의 그의 전사 개시를 변경시켰다.
마지막으로, 15.2 kbp의 은닉성 프로파지 요소(cryptic prophage element) e14 프로파지가 MRE 균주에서 결실된 것을 확인하였다.
실시예 3. 돌연변이에 따른 노난산에서의 성장능 및 노난디오산의 생산능 비교
실시예 2에서 확인된 돌연변이가 노난산에서의 MRE 균주의 성장에 기여하는지 분석하기 위해, 각각의 단일 돌연변이를 야생형 유전자로 복원시킨 MRE 균주 유래의 재조합 균주를 실험예 5의 방법으로 세포 성장을 분석하였다(도 3a).
구체적으로, 각각의 단일 돌연변이를 야생형 유전자로 복원시킨 MRE 균주 유래의 재조합 균주를 제조하기 위해, lambda-red 재조합 시스템과 tetA 이중 선별 시스템(doi: 10.1371/journal.pone.0181501 참고)을 이용하였다. 구체적으로, acrR, fadD, dppA, crp, yeaR 유전자의 돌연변이 바깥으로 상동성 서열을 지니고 있는 프라이머 및 주형으로 P3-BCD2-tetA를 이용하여 tetA 카세트를 PCR 증폭하였다. 사용한 각 유전자의 프라이머는 acrR 프라이머(서열번호 13 및 14), fadD 프라이머(서열번호 11 및 12), dppA 프라이머(서열번호 32 및 33), crp 프라이머(서열번호 28 및 29), yeaR 프라이머(서열번호 24 및 25)와 같다. lambda Red 재조합 시스템을 이용하여 pSIM5로부터 발현시킨 후, 상동성 재조합을 통해 상기 돌연변이들을 tetA 카세트로 치환하였다. 이후, lambda Red 재조합 시스템을 이용하여 야생형 서열을 가진 oligo 또는 카세트로 치환하였다. 사용한 각 유전자의 oligo는 acrR oligo(서열번호 16), fadD oligo(서열번호 10)이고 카세트 증폭시키기 위한 프라이머는 dppA 프라이머(서열번호 34 및 35), crp 프라이머(서열번호 30 및 31), yeaR 프라이머(서열번호 26 및 27)와 같다. 야생형로 치환된 대장균은 니켈을 사용하여 선별하였다.
그 결과, P fadD* 돌연변이가 노난산에서의 MRE 성장에 중요한 것을 확인하였다. P fadD* 돌연변이가 MRE 균주에서 복원된 MRE-Pf 균주는 노난산에서 최종 OD600이 0.1을 초과하여 성장하지 못했다. 반대로, P fadD* 돌연변이를 MRD 균주에 도입시킨 MRD-Pf 균주는 최종 OD600이 1.0까지 도달하였다.
또한, MRE-a 균주 및 MRE-d 균주의 성장 곡선에 기초하여, acrR 및 dppA 돌연변이도 노난산에서의 MRE 균주의 성장에 기여하는 것을 확인하였다. acrR* 돌연변이가 MRE 균주에서 복원된 MRE-a 균주 및 dppA* 돌연변이가 MRE 균주에서 복원된 MRE-d 균주는 노난산에서 120시간째에 MRE 균주의 성장을 각각 59% 및 82%로 감소시켰다. 독성 내성 및 유리한 막 수송과 같은 다른 요인이 노난산에서의 균주 성장에 유익하다는 것을 확인하였다.
이를 통해, P fadD* 돌연변이가 노난산에서의 균쥬의 성장에 중요한 돌연변이인 한편, 다른 돌연변이들도 MRE 균주의 성장에 부분적으로 기여할 수 있음을 확인하였다.
한편, MRE 균주의 노난산 독성 내성 관련 돌연변이를 확인하기 위해, MRD 균주에 각각의 단일 돌연변이를 도입시킨 균주를 제조하여 30분간 3 g/L의 노난산에서 배양시킨 후 콜로니 형성 단위(CFU)를 계수하여 세포 생존 능력을 평가하였다(도 3b).
구체적으로, 각각의 단일 돌연변이를 도입한 MRD 균주 유래의 재조합 균주를 제조하기 위해, lambda-red 재조합 시스템와 tetA 이중 선별 시스템(doi: 10.1371/journal.pone.0181501 참고)을 이용하였다. 구체적으로, acrR, fadD, dppA, crp, yeaR, e-프로파지의 돌연변이가 일어났던 위치 바깥으로 상동성 서열을 지니고 있는 프라이머 및 주형으로 P3-BCD2-tetA를 이용하여 tetA 카세트를 PCR 증폭하였다. 사용한 각 유전자의 프라이머는 acrR 프라이머(서열번호 13 및 14), fadD 프라이머(서열번호 11 및 12), dppA 프라이머(서열번호 32 및 33), crp 프라이머(서열번호 28 및 29), yeaR 프라이머(서열번호 24 및 25), icd-icdC 프라이머(서열번호 19 및 20)와 같다. lambda Red 재조합 시스템을 이용하여 pSIM5로부터 발현시킨 후, 상동성 재조합을 통해 상기 돌연변이들을 tetA 카세트로 치환하였다. 이후, lambda Red 재조합 시스템을 이용하여 돌연변이 서열을 가진 oligo 또는 카세트로 치환하였다. 사용한 각 유전자의 oligo는 acrR oligo(서열번호 15), fadD oligo(서열번호 9)이고 카세트 증폭시키기 위한 프라이머는 dppA 프라이머(서열번호 34 및 35), crp 프라이머(서열번호 30 및 31), yeaR 프라이머(서열번호 26 및 27)와 같다. 돌연변이로 치환된 대장균은 nickel을 사용하여 선별하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, MRD 균주에 acrR 돌연변이를 도입시킨 MRD-a 균주의 생존율은 MRD 균주에 비해 2.8배 증가하였다. 또한, MRD 균주에 P fadD* 돌연변이를 도입시킨 MRD-Pf 균주는 MRD 균주보다 3.3배 더 높은 생존율을 보였다.
또한, MRD 균주의 e14 프로파지를 코딩하는 유전자를 결실시킨 MRD-e 균주는 은닉성 프로파지와 산성 스트레스 또는 과산화수소 스트레스와 같은 스트레스에 대한 균주의 반응과 밀접한 관계로 인해, 약간 증가된 노난산 독성 내성을 나타내었다.
이를 통해, 실험실 적응 진화가 지방산 대사를 향상 시킬 뿐만 아니라 노난산에 대한 독성 내성을 획득하도록 진행되었음을 확인하였다.
실시예 4. MRE 균주를 이용한 노난디오산 생산
MRE 균주를 이용하여 노난산으로부터 노난디오산을 생산하기 위해, β-산화 경로에 의한 노난산 분해를 방지하도록 MRE 균주에서 아실-CoA 탈수소효소 유전자(fadE)를 결실시킨 후에 생물변환하였다. 상기 fadE 유전자가 결실된 균주는 프라이머(서열번호 5 및 6)를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
또한, P. putida GPo1 유래의 AlkBGT 시스템을 이용하게 위해 alkBGT 유전자를 pBbA6c 플라스미드 상에서 P LlacO-1 프로모터의 제어하에 발현시키고, 이를 fade 유전자가 결실된 MRE 균주 및 MRD 균주에 도입하여 각각 MRE-BGT 균주 및 MRD-BGT 균주를 제조하였다. 노난디오산의 생물변환은 하기 균주들을 사용하여 수행하였다: MRE-BGT, MRD-BGT, 및 MRD-EB(모든 6개의 MRE 돌연변이가 도입된 MRD-BGT). 상기 MRD-EB 균주는 MRE 균주의 acrR*, PfadD*, dppA*, crp*, e-프로파지* 및 yeaR* 돌연변이 유전자를 모두 실시예 3과 동일한 방법으로 도입시켜 제조하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, MRE-BGT 균주는 24시간째에 221 mg/L의 노난디오산을 생산하였으며, 이는 MRD-BGT 균주의 생산량(17.3 mg/L)보다 12.8배 더 높은 것을 확인하였다. 또한, MRD-EB 균주의 노난디오산 생산량은 MRE-BGT 균주와 비슷하였으며, 이로부터 도입된 돌연변이(모든 6개의 MRE 돌연변이)가 균주로 하여금 노난디오산의 생산량을 증가시키는 것을 확인하였다.
또한, 노난디오산 생산과 관련된 돌연변이를 분석하기 위해, 실시예 3의 MRD 균주 유래 돌연변이 균주의 fade 유전자를 결실시킨 후, 플라스미드 pBbA6c-alkBGT로 형질전환시켰다. 생성된 균주들의 노난디오산 생산량을 비교 분석하였다(도 4b).
그 결과, 각각의 단일 돌연변이를 도입시킨 균주(MRD-PcFB, MRD-eFB, MRD-dFB, MRD-PfFB, MRD-aFB 및 MRD-yFB)는 MRD-BGT 균주에 비해 노난디오산 생산량이 모두 유의미하게 증가하였다. 특히, 각각의 단일 돌연변이를 도입시킨 균주들 중에서, P crp* (crp 프로모터 돌연변이) 돌연변이가 도입된 MRD-PcFB 균주의 노난디오산 생산량이 MRE-BGT 균주의 노난디오산 생산량의 68.6% 정도로 크게 증가하였고, 이를 통해, P crp* 돌연변이가 노난디오산 생산에 중요한 것을 확인하였다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadR del H1 F
<400> 1
tctggtatga tgagtccaac tttgttttgc tgtgttatgg aaatctcact gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadR del H2 R
<400> 2
aacaacaaaa aacccctcgt ttgaggggtt tgctctttaa acggaaggga attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadR seq F
<400> 3
gggcgagttt gtaccagtcg g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadR seq R
<400> 4
gcgcggcgac cgttcgctg 19
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadE del H1 F
<400> 5
ccatatcatc acaagtggtc agacctccta caagtaaggg gcttttcgtt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadE del H2 R
<400> 6
ttacgcggct tcaactttcc gcactttctc cggcaacttt accggcttcg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadE seq F
<400> 7
aaaagttagc cagcgtttcc gccgc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_fadE seq R
<400> 8
acgttgggag atgagacgta tcagg 25
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PfadD* MAGE Oligo
<400> 9
atattaactc atcataccag cttgataatt acccaacgaa aagtttgtga agcgcgtcac 60
tatttatttt tatctttacc gtaagaatgc 90
<210> 10
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PfadD back
<400> 10
atattaactc atcataccag cttgataatt acccaacgaa aaggttgcga agcgcgtcac 60
tatttatttt tatctttacc gtaagaatgc 90
<210> 11
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PfadD* tetA H1P1 F
<400> 11
ctgtttctgc attcttacgg taaagataaa aataaatagt gacgcgcttc gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PfadD* tetA H2P4 R
<400> 12
taacataata ttaactcatc ataccagctt gataattacc caacgaaaag attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 13
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_acrR tetA H1P1 F
<400> 13
cggcctgatg gaaaactggc tctttgcccc gcaatctttt gatcttaaaa gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_acrR tetA H2P4 R
<400> 14
ggcacaggag atacatctcc agtaagatgg caacgtaatc gcgggcttct attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 15
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_acrR* MAGE Oligo
<400> 15
gagatacatc tccagtaaga tggcaacgta atcgcgggct tctttttaag atcaaaagat 60
tgcggggcaa agagccagtt ttccatcagg 90
<210> 16
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_acrR back
<400> 16
atattaactc atcataccag cttgataatt acccaacgaa aaggttgcga agcgcgtcac 60
tatttatttt tatctttacc gtaagaatgc 90
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_acrR seq F
<400> 17
cctgttaggg ctaagctgcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_acrR seq R
<400> 18
cgccgtgttc tggcataaca 20
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_e14 H1-P4
<400> 19
aaagtaaatc ctggctctat tattctctcc gctgagatga tgctgcgcca attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 20
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_e14 H2-P1
<400> 20
cgccttccat acctttaaca atcaggtcag ccgcttcagt ccaacccata gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 21
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_e14 MAGE oligo
<400> 21
tccatacctt taacaatcag gtcagccgct tcagtccaac ccatatggcg cagcatcatc 60
tcagcggaga gaataataga gccaggattt 90
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_e14 seq F
<400> 22
gtaattcccc tgtcttcagg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_e14 seq R
<400> 23
aacaacgggc gtgttatacg 20
<210> 24
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_yeaR H1-P4
<400> 24
cacctgccgg aatattcgaa cgtcatcttg ataaaggaac gcgcccgggg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 25
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_yeaR H2-P1
<400> 25
tcagcgtagc cgagatattt gaccgcccca tgcataacgg aaaggcgtgg gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_yeaR IS186 FP
<400> 26
cacctgccgg aatattcgaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_yeaR IS186 RP
<400> 27
tcagcgtagc cgagatattt 20
<210> 28
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PyhfA/crp H1-P4
<400> 28
cctgggtcat gctgaagcga gacaccagga gacacaaagc gaaagctatg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 29
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PyhfA/crp H2-P1
<400> 29
ctttgcatac atgcagtaca tcaatgtatt actgtagcat cctgactgtt gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PyhfA/crp IS5 FP
<400> 30
cctgggtcat gctgaagcga 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PyhfA/crp IS5 RP
<400> 31
ctttgcatac atgcagtaca 20
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_dppA H1-P4
<400> 32
ccgtgtttga accggtacgt aaagaagtta aaggctatgt ggttgatcca attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 33
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_dppA H2-P1
<400> 33
ttgtatggct tttaattatt cgatagagac gttttcgaag tgatgtttgc gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_dppA IS5 FP
<400> 34
ccgtgtttga accggtacgt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_dppA IS5 RP
<400> 35
ttgtatggct tttaattatt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_dppA IS5 seq FP
<400> 36
gcctctgaac aaggctccaa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_dppA IS5 seq RP
<400> 37
acagcgccac cgggtataca 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PyhfA/crp IS5 seq FP
<400> 38
ttatcgcctg agttgccgtc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_PyhfA/crp IS5 seq RP
<400> 39
aaccattcga gagtcgggtc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_yeaR IS186 seq FP
<400> 40
cttcgctgat atggtgctaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for primer_yeaR IS186 seq RP
<400> 41
ctttccgttg ttgcgcacct 20
<210> 42
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for acrR
<400> 42
atggcacgaa aaaccaaaca agaagcgcaa gaaacgcgcc aacacatcct cgatgtggct 60
ctacgtcttt tctcacagca gggggtatca tccacctcgc tgggcgagat tgcaaaagca 120
gctggcgtta cgcgcggtgc aatctactgg cattttaaag acaagtcgga tttgttcagt 180
gagatctggg aactgtcaga atccaatatt ggtgaactag agcttgagta tcaggcaaaa 240
ttccctggcg atccactctc agtattaaga gagatattaa ttcatgttct tgaatccacg 300
gtgacagaag aacggcgtcg attattgatg gagattatat tccacaaatg cgaatttgtc 360
ggagaaatgg ctgttgtgca acaggcacaa cgtaatctct gtctggaaag ttatgaccgt 420
atagaacaaa cgttaaaaca ttgtattgaa gcgaaaatgt tgcctgcgga tttaatgacg 480
cgtcgcgcag caattattat gcgcggctat atttccggcc tgatggaaaa ctggctcttt 540
gccccgcaat cttttgatct taaaaaagaa gcccgcgatt acgttgccat cttactggag 600
atgtatctcc tgtgccccac gcttcgtaat cctgccacta acgaataa 648
<210> 43
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for fadD/yeaY intergenic region
<400> 43
ttgcttgttt ttaaagaaaa agaaacagcg gctggtccgc tgtttctgca ttcttacggt 60
aaagataaaa ataaatagtg acgcgcttcg caaccttttc gttgggtaat tatcaagctg 120
gtatgatgag ttaatattat gttaacggca tgtatatcat ttggggttgc gatgacgacg 180
aacacgcatt ttagaggtga agaa 204
<210> 44
<211> 1608
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for dppA
<400> 44
atgcgtattt ccttgaaaaa gtcagggatg ctgaagcttg gtctcagcct ggtggctatg 60
accgtcgcag caagtgttca ggctaaaact ctggtttatt gctcagaagg atctccggaa 120
gggtttaacc cgcagctgtt tacctccggc accacctatg acgcctcttc cgtcccgctt 180
tataaccgtc tggttgaatt taaaatcggc accaccgaag tgatcccggg cctcgctgaa 240
aagtgggaag tcagcgaaga cggtaaaacc tataccttcc atctgcgtaa aggtgtgaag 300
tggcacgaca ataaagaatt caaaccgacg cgtgaactga acgccgatga tgtggtgttc 360
tcgttcgatc gtcagaaaaa cgcgcaaaac ccgtaccata aagtttctgg cggcagctac 420
gaatacttcg aaggcatggg cttgccagag ctgatcagtg aagtgaaaaa ggtggacgac 480
aacaccgttc agtttgtgct gactcgcccg gaagcgccgt tcctcgctga cctggcaatg 540
gacttcgcct ctattctgtc aaaagaatat gctgatgcga tgatgaaagc cggtacaccg 600
gaaaaactgg acctcaaccc aatcggaacc ggtccgttcc agttacagca gtatcaaaaa 660
gattcccgta tccgctacaa agcgtttgat ggctactggg gcaccaaacc gcagatcgat 720
acgctggttt tctctattac ccctgacgct tccgtgcgtt acgcgaaatt gcagaagaat 780
gaatgccagg tgatgccgta cccgaacccg gcagatatcg ctcgcatgaa gcaggataaa 840
tccatcaatc tgatggaaat gccggggctg aacgtcggtt atctctcgta taacgtgcag 900
aaaaaaccac tcgatgacgt gaaagttcgc caggctctga cctacgcggt gaacaaagac 960
gcgatcatca aagcggttta tcagggcgcg ggcgtatcag cgaaaaacct gatcccgcca 1020
accatgtggg gctataacga cgacgttcag gactacacct acgatcctga aaaagcgaaa 1080
gccttgctga aagaagcggg tctggaaaaa ggtttctcca tcgacctgtg ggcgatgccg 1140
gtacaacgtc cgtataaccc gaacgctcgc cgcatggcgg agatgattca ggcagactgg 1200
gcgaaagtcg gcgtgcaggc caaaattgtc acctacgaat ggggtgagta cctcaagcgt 1260
gcgaaagatg gcgagcacca gacggtaatg atgggctgga ctggcgataa cggggatccg 1320
gataacttct tcgccaccct gttcagctgc gccgcctctg aacaaggctc caactactca 1380
aaatggtgct acaaaccgtt tgaagatctg attcaaccgg cgcgtgctac cgacgaccac 1440
aataaacgcg ttgaactgta caaacaagcg caggtggtga tgcacgatca ggctccggca 1500
ctgatcatcg ctcactccac cgtgtttgaa ccggtacgta aagaagttaa aggctatgtg 1560
gttgatccat taggcaaaca tcacttcgaa aacgtctcta tcgaataa 1608
<210> 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for yhfA/crp intergenic region
<400> 45
ttttgctact ccactgcgtc aattttcctg acagagtacg cgtactaacc aaatcgcgca 60
acggaaggcg acctgggtca tgctgaagcg agacaccagg agacacaaag cgaaagctat 120
gctaaaacag tcaggatgct acagtaatac attgatgtac tgcatgtatg caaaggacgt 180
cacattaccg tgcagtacag ttgatagccc cttcccaggt agcgggaagc atatttcggc 240
aatccagaga cagcggcgtt atctggctct ggagaaagct tataacagag gataaccgcg 300
c 301
<210> 46
<211> 15204
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for icd-icdC
<400> 46
catgggttgg accgaagcgg ctgacttaat tgttaaaggt atggaaggcg caatcaacgc 60
gaaaaccgta acctatgact tcgagcgtct gatggatggc gctaaactgc tgaaatgttc 120
agagtttggt gacgcgatca tcgaaaacat gtaatgccgt agtttgttaa atttattaac 180
gggagcgtaa cgctcccgtt gttttttgtt aggctgctaa cggttatcaa aattttatca 240
aaaaaagtta tcaaaacccc tcggtagttt tggggtaggc tggccggtca ggtggtagtt 300
ctactactag tctcccacat agatattcct tagcttttta ttattgctgg cggacgctcg 360
ttaatattta aggtcttcat tgattaagac atccccaaag ttagttatgt attcactgtt 420
attaggacaa ttatgaatta ccactcctta cacccgctca aatattgtta aattgccggt 480
tttgtatcaa ctactcaccc gggactcgcc aggggacagc caacaggcat tgggtgcaat 540
caccttagcg ttcaggtaca tgcggaatgt aaaaaaggcc gcgagcgcgg ccccttcaca 600
tacatcttta gtactgagac tgtttaacct agggaattat tatcgtatta tattgcatta 660
caactcccaa cagtgacata tgaacttcct gctttactcc acgactttaa tatttcaagg 720
ccatgtgaag aacatatttc ttgcactgcg agttcatcga gtaatccata gtaagaaaca 780
ctttttgaat ttttgtaaat gtatccgtaa agatgttttc ttcctgtttc gtattttttg 840
aagtatgagc ttttatattg atttacaata agagtctcac ctcctgattt tagtaatctc 900
ttgatgctaa gaactatttt gtcgattgta tcccgacaag gaacggcaga gagaacatta 960
gagcaaagga tgaaatcgta acccccaatt attttgtcga catcctcgaa agcaactgta 1020
tttgcatttt tataatatcg tgggacatag tcaataattt tagttttaat tcctctaata 1080
atttgctctc tttcaagttg ccttttcgag tctagaaaag taacttcatc aaatttactg 1140
attaattcat cagaatatct aagttttccg cagccaaaat caagggcgtg gccatttttc 1200
tcaatgcttc taatatactc gcaaagatat ctagagggca tcgtatgagg ttttgctgca 1260
ttctctgagc gaatattaac tccgtgcata ttatagttca aagcaagtac cattcaatta 1320
atgttatttt tagtgaaaaa ttcttttatt ttatcgtccg ggatttttcc gacttgactt 1380
tcagttctgg gcttaactgt caaagcaaag ataataccac tcactgagaa tgataaaatt 1440
acaaaaaaga ataaagacag caaagaacct tcaacatgaa aaatatccat ttgtttgcaa 1500
aaaaagatta ttaggaagga aattaatgca attatcgaaa attcaaaaaa tatccaaaaa 1560
tagtatactt tattccagaa gagttcaata taatgtttgt cttcaatttt tcttacttca 1620
gggtaatata gattgctcat tacattgtga gcttcatctt tatttaattt tctgttgact 1680
ccagctctcc gtgataacgg ttttataatt agatgcttat cccaaagata tcgcacccga 1740
agtagtttgg ctgcattgtt atgtaggtct aacgcaccgc taattaaata tgcaaaaatc 1800
gcaaaagcac aaggtaatat accaaaagat agtgcccaat taataaagct ctcatgatct 1860
ttaataggtg ggacatactt ggttggtaat gttattaaag ggatgtattc gtaaataact 1920
agaagtatgc aatatattag cgtatttaag aaagttgctt tatgaagttt aggcaacatt 1980
tcattataat ttttgggggg ttcgaacata ttattcacct gagtcacgct ttaggatagt 2040
gtaatggtaa tatttaatta agtgtcatta tatacttttc agtaggttag ttacaatttt 2100
ttgtatctgt tcaggctgac ctagcttcgc tgacagacaa tattgtgatc agtagcacgt 2160
atcgaggagg agtagcgcta caaatttgac gctgggtgag aatctgaaat tgatagaaat 2220
gaaataatga aataatgaaa tgatgaaatg atgaaatgat gaaatgatga aatgatgaaa 2280
tgatgacaga gtgtccagtg ggcacggatg gtgtcttacg acatgcttac cttaatcgtt 2340
cccagtgtgc ctatagcaga tattctaaac atgtcgataa ttcattacgc atatagtatc 2400
gaacatagaa aaaactgaag attcatctta ttttgtatat actacctagc ccaacaatgt 2460
agaggttaac gaaaaatgcg ctcaccaatt tgtcatcttt tctcagcaat taattcatca 2520
ccatttaaga ttgcaccaga gaaggagcaa gatcttaaaa cgatagttga cgacaaaaaa 2580
attataattt cagttgtgag tgaacctggt tttaatatcc gagtcaggaa gaatgagagt 2640
aataattcac atgaaatagt tctaacagta gcttcacttg aatatatttg ggcattttcc 2700
aatttctttt gggtttttac gcaagagtac tccaaatctc agaaaaataa tgatgagcac 2760
tttgatttaa caggaaaaaa taggcttaaa aagtctgatg aacttcttaa atgggcaagg 2820
aaaaacttgc aaacaacagg ttgcgaatca tggcctaaaa aatgtcccaa gccagaagca 2880
tatttacaag gaagcgaaga ctcacaagtt gctagcgaga tatttctttg tgctattgct 2940
tggattcttc atcatgaaat aagtcatgtt gttttacagc atccattggt cactacagca 3000
ttctccactc aagaggagcg tgaagcagat tcacatgcta caaaatggat attaggcaac 3060
ctgtatgaat ccgctcctga attaaagaaa cgtgcacttg gcattgctac ggcagtgctt 3120
tgtatacaaa gcttagaagt tgaaaattac ttctgtttac aaaatacaca cccagctgca 3180
tatgagcgta tatattcgaa tatttcatgc taccctgtcg gaaatgaaga gttgattgaa 3240
gctctatgta cagtgatgct tcaatatctt ttccatggca aaaatatcaa tgtgaatcta 3300
gatggggagt ccttttcatc gattttaggt gatcttctct gtgatatttc acgtcttacc 3360
agtaactgat atggctgtcc gccgctcgct taaagtggac tttttagttt ttatcatgtg 3420
cggtgagaaa ttcaatgtgg cgttgagatg cttaaaggtt cacaacgcta ctttgctcca 3480
tcctttacct cgatcatcat gataacgatc ggtttgttgt tgtgttttat gaccaagtag 3540
tttttgtgtg tctaacccct gttctttata cagacgttca gataaagacc tttgctcatg 3600
gaatgtcgca ggtgaaccct ctccccagtc aattcttgct aaatctctcg ctttactaaa 3660
attcatcgtc aatgtattgg ctttaacctg cgctccgcgc tctgcttgtg aagttgaacg 3720
aaaaaaatgc actaagtatg cactgactgc atagtcacgg cagcgggcta ctacatcgcg 3780
taaactccag ttaatcgcat tgaggcgaag agaaagagga attgcgattt tgctcccggt 3840
cttttcctga atgacatgaa gatgatcatc ccaaatatcg ctaaatttca tacgcgaaat 3900
atcacctaac cgctgaccag taaccagcgc taacagcatg gcatttccca tgtaacgatg 3960
agtagcgtct gcgatatcga agattttttt ccattcttca aggctcagcc gttgtcgggt 4020
aatttttctt cttggttgtt tagtggctaa tgctgggtta tagccaggag gtacttctcc 4080
gtagtgctgc gcctctttga aaacatcaat caggacggag cgaactactt gtgccattct 4140
tggccgccca gcggcgatat actcatcaag caattgtgct atatctctga catcaacggc 4200
tgagatcaac ttcattcctg ctcgttctct gagcaaggat actggtttag ctttttgttt 4260
ataggtgttg agtcttatat caccactttt aagcctgtca tcctggatcg cttgatagcg 4320
atctaaccag gttgacgttg tgatagcctt tcctttgctg gttgcgatcc tgtcactgat 4380
agccagaatc tgccgggttc tttgttcagc caggcgagtg ttggcctcag tggcaatagc 4440
gatagcttca gcttcgtttg ttcccaaagc atggaatttt cctgtcactg gatgcttata 4500
ccgccaatag actttattta ccttcctact ataaagcgga tataagttag ggactgaaac 4560
attattctta cgcggtctgg ctgccattac tcaaaatccg ttgcaaaagt aatgagtcat 4620
ttttcttgat tacaggtgtt accaactccc caactaactc ggcgtcctca cgcactcgcc 4680
ataaccggcc ttgtttcatg gccggtggac aaaataaatt ctgcttagca taacgacgca 4740
atgtggacac acttggagga ttacttctgt atttttcagc agcccattct tcaagagtta 4800
acatttgaag catatgcgat caccttatta ctacactaac tgcttagtct cagcatatcg 4860
accctgcacg gtcggttagt ttctccacaa aacagagaag agcacctgtg gccacagcta 4920
tcaggatggg tcgggttatt aacccgtcat ccggggatac tcttctctgt tttgtaaaaa 4980
gggcggtacc agaaaggact aaggaaaaaa ctggtaccgc caagactaca cacagcataa 5040
agttgtggtg tcgggtgccc ccggtgcctg gcgaaggttg cacaccaggc gggtgggtat 5100
ccacagaagg tcgattgtca gcctcaacct taacccgcgt gcgctgagcc gcattcacca 5160
caacgctaag gattctctct ggttgaaaat acttagctgt tatgtgcctg tcttttcacc 5220
acttcaggct cggtggtatg ctggagttct cacacagcca gcaagcaagg aaacttaatg 5280
aaccagtttt atgttcacgt tcgtctattt gaagacacag ccgaacagac caaaaaattt 5340
gaagaattaa tgcttaactt tctgtaccag aaaacagtta aagagtctga cgatagctgc 5400
tgcagactga ttccagaggg atatatcctc aaaagtacaa tgaactgcca acaaatcctt 5460
gatcaaacat tttcaattgc taacagtgcc ggtgttgacg caaatatatt tgtctgtaaa 5520
tttgaacaaa gcgcatgctt acttccgtct gcttccttag ttggtaacga tttcgttcat 5580
tacgatctta cgcctaagcc catcaagctc gattcttaaa gccttaacca ttgtgtcgtg 5640
ataaacacgg ctcaccttct ctccattgca tggcagaggg gtgagtgtgt tagccatgaa 5700
attcatgaac tcggttcgac caggggcttg cgccccgcaa gtctttaatg cctgttttgc 5760
taacaaaatg cgggcctcag tgcctgcatt tggctctatc tgctgcaaac gtttagcgtc 5820
ttccagcaac aatgcgatca catgcttcaa attctgctca ttcatctatt ctctccactg 5880
aaatcatccg ctaacgaatc atcccggtct tcgtacgtac cgggcgggct acttcgtggg 5940
cgtcctgcct gtttgttgtt tctcttgggt acattatgta tctcaaaggt acattgtcaa 6000
gtataaaaaa acctgccgaa gcaggttcat aaacattgat taggctttga ttttgtatct 6060
tcttggtttt cctgagaaaa tcacagtacc aattatagag caattaccgt tgatcttaat 6120
gtaaggctca ggccagtttg ggtttaacgc tttgagataa cgctgtgtcc catcttctat 6180
caaccttttg aaggtggttt cacctgtatc gtgcatcaat gcaataacgt cgtcaccgtg 6240
gcaggcaggt acttcaggat cgacaaaaat catgtctccc gggcggtact catcaatcat 6300
tgaatcacct attacccgca agatataagt catttcccca cagggtacag ggcagggata 6360
cgtttctgct gtgctcaaat caacctcaga atatccaact tctttccatg ctccggcctg 6420
tacccatgat atgacaggga ctaatgtgat ttgtttatta gtgattgaaa catcaggttt 6480
ttttgtgatg ttcgttgtct ggtgttcttg atcgagccat cctacaggca ggtcgaaaca 6540
tttttcgatg tgtcgtgcca tgctgtcacc gatattttta gtagcaccat ctcccataaa 6600
cctgctggtc tgggttggct cgcgatcaat catagtggca aaggaagaat tcccgccaac 6660
accatctctc agttttctgg cgttagaccg ccggatgtca tggattgttt tcataacgaa 6720
attaaaaccc ttgtaccgtt aaggtacaag tatcttgaag gttcatttca atcatgtaat 6780
atgtacaccg gaggtacata ttgtatgaaa gcgtattggg actctttaac caaagaacag 6840
cagggcgagt tggccggaaa agttggctca acacctggct acttacggct ggttttcaat 6900
ggctataaaa aagccagttt tgtgctggct aaaaaacttg agcaatacac atcaggtgca 6960
attacgaaat ctgacttaag accggatatc tatccgaaag attagcagaa cactttcaat 7020
ttttaaccac agaacgatga ggctaatcgt gggtaagcat cactggaaaa tagaaaaaca 7080
gcctgagtgg tacgtgaaag ctgtcagaaa aactatcgcg gcgttgccga gtggttacgc 7140
tgaagcggct gactggctcg atgtaacaga aaacgcttta ttcaaccgcc ttcgtgcaga 7200
tggcgatcag attttcccgc tgggatgggc aatggtttta cagcgtgctg gtggcactca 7260
cttcattgct gatgctgtgg cgcagtctgc aaatggcgtc tttgtgtctc ttcctgacgt 7320
cgaggatgtg gacaacgccg atattaacca gcgtctgctg gaagtcattg aacagatcgg 7380
cagttattca aaacagattc gttcagcaat cgaagacggt gtagtggaac cgcatgagaa 7440
gacagcaatt aacgacgagc tgtatctctc aatttcgaag ctgcaggagc atgcagcact 7500
tgtctacaaa attttttgca tttcagaaag taatgacgcc cgcgagtgtg cagctccggg 7560
cgtcgtggcg tcgattgctt ctggttgtgg agaaactaac gcatgaacag tttaacaaca 7620
cactaccgtc gctcgcaact gattgcgctt cctgtaccgg gtggaaaagc gaaggtggaa 7680
tattgctatg cagtgaatgt accaggtgac agggaaattg taacccacag ctttgcagag 7740
tgggctgtgg gtgatttcaa ccggcagaag gagacagtcc tttgcgacaa gttaaccgct 7800
ggttcaaaga tcactacgga gtgcccgtca gagtcattcg ttgggagccg gaaacacaac 7860
gggttatcta cctccgcgaa ggttatgagc atgaatgctt cagcccgctc gaacagtttc 7920
gtcgtaaatt cagggaaata gaggtcggtc atgagcacta aattaaccgg ctatgtatgg 7980
gatggttgcg ctgcatcagg catgaagtta tccagcgtgg caattatggc ccgcctggct 8040
gatttcagta atgacgaagg tgtgtgctgg ccatcaattg aaaccattgc ccgtcagatt 8100
ggcgcgggga tgagtaccgt cagaacggct atcgcacggc tggaagcaga aggctggtta 8160
acgcgtaagg cgcgtcgcca gggtgatggt tcatcacccc actgtgccgt ggtggatgaa 8220
tatcacgagc acgccacaga tgcgctttac accacgatgc ttaccgggat gggggcgcga 8280
cgccagccac tgatgtgggc cattaccacc gccgggtaca acattgaggg gccgtgctac 8340
gacaaacggc gggaagtcat cgagatgctc aacggctcgg tgccaaacga tgaactgttc 8400
gggatcatct ataccgttga tgaaggtgac gactggaccg acccgcaggt gctggaaaaa 8460
gccaatccaa atattggcgt gtcggtttat cgcgaatttt tgttaagtca gcagcagcgt 8520
gcgaaaaata acgcccgtct ggcaaacgtc tttaaaacaa aacacctcaa tatctgggcg 8580
tcggcgcgtt cggcgtattt caacctggtg agctggcaga gctgcgagga taaatcactg 8640
acccttgagc agttcgaggg gcagccgtgc attctggcct ttgacctggc gcgtaagctg 8700
gatatgaaca gcatggcgcg actttatacc cgcgagattg acggtaaaac gcattactac 8760
agtgtggccc cgcgtttctg ggtaccgtat gacacggtgt acagcgtcga gaaaaatgaa 8820
gatcgccgga cagccgaacg ctttcagaaa tgggtggaaa tgggcgttct gaccgttacc 8880
gatggtgcgg aggtggatta tcgctacatc ctcgaagagg ccaaagcggc gaacaaaatc 8940
agcccggtca gtgagtcacc catcgacccc ttcggggcga ccgggctgtc acatgacctt 9000
gctgatgaag acctgaaccc cgtcaccatc attcagaact acaccaacat gtccgatccg 9060
atgaaagagc tggaagcggc gattgaatcg gggcgctttc atcatgacgg caatcccatc 9120
atgacctggt gtatcggcaa cgtggtcggc aaaaccattc cgggtaacga tgatgtggtg 9180
aagcccgtca aggagcaggc ggaaaacaaa atcgatggtg cagttgcgct gattatggcg 9240
gttggcagag ccatgctgta cgagaaagaa gacacgctgt ctgatcacat tgagtcctac 9300
gggatccgct cgctttaact gaggtaatta tgatcatgct gattctcgcg cctctggtgg 9360
gcgtgctggg tgcgcttttg ctggcgtatg gtgcctggct gatttatccc ccggcgggtt 9420
ttgttgttgc cggggcgctg tgcctgttct ggtcgtggct ggtggcgcga tatctcgacc 9480
gtacacagtc gtctgtcggc ggaggtaaat agtgttcttt tcgggattat ttcaacgaaa 9540
aagtgacgca ccggtgacca cgccagcaga gctggcggat gccatcgggc tgtcgtatga 9600
cacctatacc ggaaagcaga tcagcagtca gcgggctatg cgactgacgg cggttttttc 9660
ctgcgtcaga gtgctggcag agtcggtcgg gatgttgccc tgcaatctgt atcacctgaa 9720
cggcagcctg aagcagagag ccaccggcga acgtctgcat aaactgatct ccacgcatcc 9780
caatggctat atgacgccgc aggagttctg ggagctggtg gtcacctgtc tgtgcctgag 9840
gggaaacttt tacgcctaca aagtgaaagc atttggcgaa gtggctgaac tgctgcccgt 9900
cgatcccggc tgtgtggtat atgcgctggg aaggtgtcag cgatggcctg aaggtgaccg 9960
ccgggagtgt tattcagcgc gatgacctgg tgcagtacac gacaactgac gatgcaacca 10020
gctccggtgg tgtcctgcgc gtgccgatcg cctgctcaag tgcaggtgcg gtcggtaacg 10080
ctgacgacgg tacggcatta atcctggtca cgccggtgaa tggtctgccg tcttccggtg 10140
tggctgacac cctgacaggc ggatttgata ctgaagagct ggaaacgtgg cgcgcccgcg 10200
tcattgagcg gtattactgg acgccgcagg gcggggctga cggggactat gtcgtctggg 10260
ctaaagaagt gcccggcatt acccgcgcat ggacataccg tcacttgatg ggaacgggaa 10320
ctgtcggtgt gatgattgcc agcagtgacc tgattaatcc cattccggaa gaatcaacgg 10380
aaacggcggc aagacaacat atcgggccac tggccccggt ggcaggctct gatttgtatg 10440
tgttcaggcc ggtggcacat acggtggatt ttcatatccg cgtgacgccg gacacaccag 10500
aaatacgggc tgccattacc gcggagttgc gttcgttcct gctgcgtgat ggttatccgc 10560
agggagaact caaggtatcg cgtatcagtg aggcgatttc cggtgcgaac ggggaataca 10620
gccatcagtt gcttgcaccg gtggacaata tctccattgc gaaaaacgaa ctggcggtac 10680
tggggacgat ttcatggacg tgacaaacga tgattacatc cgcctgttat cggcactgtt 10740
gccgcccggt ccggtgtggt cagccagcga tccggcgatt gccggtgcgg caccgtcatt 10800
aacccgtgtt catcagcgtg cggatgccct gatgcgggag ctggatccgc gcaccaccac 10860
tgaactgata aaccgctggg agcgtctgtg cggtctgccg gatgaatgta ttccggcggg 10920
aacgcagacc cttcgccagc gtcagcaacg gctggatgcg aaggttaacc tggcgggcgg 10980
catcaacgag gatttttatc ttgcacagct tgctgccctg ggcagaccag atgccaccat 11040
cacgcgatac gacaaaagca ctttcacctg ctcatcggcc tgtactgacg cggtgaatgc 11100
gccggaatgg cggtattact ggcaggtcaa catgccagcc accaccaact ccacctggat 11160
gacatgtggc gatccctgtg attccgcact gcgtatctgg ggtgacaccg ttgtcgagtg 11220
tgtgcttaac aaactctgcc cgtcgcatac ctacgtaatt tttaaatatc cggagtaatc 11280
catgcatcgt atagacacga aaaccgcgca gaaggataag ttcggcgcgg gtaagaacgg 11340
ttttacccgt ggtaaccccc agaccggcac gcctgccacc gatctggatg atgactactt 11400
tgacatgttg caggaggaac tttgcagcgt ggtggaggca tccggtgcca gcctggagaa 11460
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agaaggagca aaactcaatg cagcaacggc tacattagga cgcaccggtt tcatagctat 11640
accggttatg attggtggta ttgagcaatc agtaatcatt cagtgggggt ggaatgccgc 11700
aaaagcatct gcctctgggg gggatggaaa tacagttgta ttcccggttg cgtttaataa 11760
tgcctgtgtt gccgttgttg caaattatga caatgtcagc gcacctatca atgcagtggc 11820
aacgggggga tatacaacca cttcgttttt attacggtgc gcagctcaaa cgggtagtta 11880
ttactataac tggattgcta ttgggtatta agatgaaaat atactgttgc ttaaataccg 11940
ttggtttttt tatggatggc tgtggcgtca ttccgccaga ttctaaagaa ataacggcag 12000
aacactggca gtcattatta aaatctcaag ctgaaggagg cgtgatcgat ttttctgttt 12060
ttcctccttc tattaaagag gttatccgta ctcatgatga tgaagtcgca gatgcgaact 12120
ttcaaaagca gatgcttatc tctgatgcaa ctgattttat caatagcaga cagtggcagg 12180
gtaaggctgc attgggaaga cttaaagaag atgagctgaa acaatataat ttgtggctgg 12240
attatctgga agcactggaa ctggttgata catccagtgc gccagatatt gaatggccta 12300
cgcctccggc agttcaggcc agatgacatc cggcgcggtg ctggtatctg ttgccgtcac 12360
cgcgtcaatg taatccagca cagcgttaag tctggttgtt tctgcctgcg tcagtttacg 12420
tccggcctgc aatttcagtt gaatcagact aatggaagcc attgcagcat caatcagtga 12480
ctggcgctgt gcttctgccg cgtctactgc ggcgctatgc tgtgcttcag tatcggtcac 12540
ccatttctca ccatcccatt tatcgtatgg agataaaggg gcgatagtgg ttgtattttc 12600
agggtaatca cccggagctt tgatttcttt tgattctcca gttttggtgc tatagaccgt 12660
ttcaccgcga tggtctggca catattccca tgagttaaaa tctgcagaac ggcagattgc 12720
ataaccagcc ttatgtgtac caggggcatc taaacaggaa catgccggaa tgccgacacc 12780
aacggcaaga tattcatttg aagtggaaat atattcccgt gtttcaccat cgtagttata 12840
aacggtaaca tcccctgcct ttgttgcaat aaggtcacta tttaatattg ctttatgcat 12900
caggctgccc tcacgatata gttaaatgca atattacgcg gacgcgtttc tgaggctgcg 12960
gcacctaaac catccactga ttgtttatat gttttaaagg ttccataatc cggggctggt 13020
aatccggcat cgtttgtgtt tcctcttttg ataatgtcag tgccactatt tacccatatt 13080
tcatcaaaat agaaattaat cgttgcatca gtcacaatcg tggatcttga cggtaatcca 13140
tgagcatgat cctccgttgc atacccctga atacttaaaa tagagcgacc tgtatcaatc 13200
ccccgcccgt catcccagcc acgaataaac tcaccacgta aatcaggcaa tttatttgtc 13260
ggataagcct ttgccagttc cgggtattct tcagcagaaa aagcggcacc attgcatttc 13320
agccagcctg ttggcggagt ggctgaaggc cacggaaccg ggacaccaac aggtaatgca 13380
gagccttctc ccaaaccaac gtttatgaaa atgaagaaat aacaagcaaa tggcatcatt 13440
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ccagaacaca gatctacaac gtaatgcgct gaactgtgca ggatgcgagc tgatttttga 13560
agacaagata agcggcacaa agtccgaaag gccgggactg aaaaaactgc tcaggacatt 13620
atcggcaggt gacactctgg ttgtctggaa gctggatcgg ctggggcgta gtatgcggca 13680
tcttgtcgtg ctggtggagg agttgcgcga acgaggcatc aactttcgta gtctgacgga 13740
ttcaattgat accagcacac caatgggacg ctttttcttt catgtgatgg gtgccctggc 13800
tgaaatggag cgtgaactga ttgttgaacg aacaaaagct ggactggaaa ctgctcgtgc 13860
acagggacga attggtggac gtcgtcccaa acttacacca gaacaatggg cacaagctgg 13920
acgattaatt gcagcaggaa ctcctcgcca gaaggtggcg attatctatg atgttggtgt 13980
gtcaactttg tataagaggt ttcctgcagg ggataaataa agttaaagac actttgtgta 14040
caaaagaaag taaaacaaca gcaacttgtt gcaattttat caataaaagt agtattgtcg 14100
tgaaaaattg attaaagatt aatattatgc atgtttttga taataatgga attgaactga 14160
aagctgagtg ttcgataggt gaagaggatg gtgtttatgg tctaatcctt gagtcgtggg 14220
ggccgggtga cagaaacaaa gattacaata tcgctcttga ttatatcatt gaacggttgg 14280
ttgattctgg tgtatcccaa gtcgtagtat atctggcgtc atcatcagtc agaaaacata 14340
tgcattcttt ggatgaaaga aaaatccatc ctggtgaata ttttactttg attggtaata 14400
gcccccgcga tatacgcttg aagatgtgtg gttatcaggc ttattttagt cgtacgggga 14460
gaaaggaaat tccttccggc aatagaacga aacgaatatt gataaatgtt ccaggtattt 14520
atagtgacag tttttgggcg tctataatac gtggagaact atcagagctt tcacagccta 14580
cagatgatga atcgcttctg aatatgaggg ttagtaaatt aattaagaaa acgttgagtc 14640
aacccgaggg ctccaggaaa ccagttgagg tagaaagact acaaaaagtt tatgtccgag 14700
acccgatggt aaaagcttgg attttacagc aaagtaaagg tatatgtgaa aactgtggta 14760
aaaatgctcc gttttattta aatgatggaa acccatattt ggaagtacat catgtaattc 14820
ccctgtcttc aggtggtgct gatacaacag ataactgtgt tgccctttgt ccgaattgcc 14880
atagagaatt gcactatagt aaaaatgcaa aagaactaat cgagatgctt tacgttaata 14940
taaaccgatt acagaaataa aattatttat taaagtcaca tttaagacgt aataccctac 15000
agggtaaaaa ttttctctga tcttaacttc tgcaaatgtt aactgctatt tttatgctaa 15060
aaatggttat caaaactcaa aaacacatgt ttataatcaa tgagttatag aaatgctaag 15120
ggctaatgag ttatatgcaa attagtaaaa ttatgttgct atgtcagata gttacgattt 15180
agtcatctaa ctaatgctgc gcca 15204
<210> 47
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for yeaR
<400> 47
atgcttcaaa tcccacagaa ttatattcat acgcgctcaa cgcctttctg gaataaacaa 60
actgcacctg ccggaatatt cgaacgtcat cttgataaag gaacgcgccc gggggtttac 120
ccacgccttt ccgttatgca tggggcggtc aaatatctcg gctacgctga tgaacacagt 180
gcagagcctg atcaggtgat ccttatcgaa gcggggcagt ttgcggtgtt ccctccagaa 240
aagtggcaca acattgaagc catgactgac gatacttatt tcaacattga cttcttcgtg 300
gctcctgaag tcctgatgga aggtgcgcaa caacggaaag tcattcataa cgggaaatga 360
360
<210> 48
<211> 1206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for alkB
<400> 48
atgctggaaa aacatcgtgt cctggatagt gccccggaat acgtggataa aaagaaatac 60
ctgtggattc tgtctacgct gtggccggcg accccgatga ttggcatctg gctggccaac 120
gaaacgggct ggggtatctt ttatggcctg gtgctgctgg tttggtacgg tgcactgccg 180
ctgctggacg caatgtttgg tgaagatttc aacaatccgc cggaagaagt ggttccgaaa 240
ctggaaaagg aacgttatta ccgcgtcctg acctatctga cggtgccgat gcattacgcg 300
gccctgattg tttccgcatg gtgggtcggc acccagccga tgtcatggct ggaaattggt 360
gcactggctc tgtcgctggg catcgtgaac ggtctggccc tgaataccgg ccatgaactg 420
ggtcacaaaa aggaaacgtt cgatcgctgg atggcaaaaa ttgttctggc tgtcgtgggc 480
tatggtcatt tctttatcga acacaacaag ggccatcacc gtgacgtcgc aaccccgatg 540
gatccggcta cgagccgtat gggtgaatct atctacaagt tcagtatccg tgaaatcccg 600
ggtgcattta tccgtgcatg gggtctggaa gaacagcgtc tgtctcgtcg cggccaaagc 660
gtgtggtctt ttgacaatga aattctgcaa ccgatgatta tcaccgtgat cctgtatgca 720
gttctgctgg ctctgtttgg cccgaaaatg ctggttttcc tgccgattca gatggcattt 780
ggttggtggc aactgacgag cgctaactat atcgaacatt acggcctgct gcgtcagaaa 840
atggaagatg gtcgctacga acatcaaaag ccgcatcaca gttggaactc caatcacatt 900
gtcagcaatc tggtgctgtt ccatctgcaa cgtcactctg accatcacgc acacccgacc 960
cgttcatatc aatcgctgcg tgattttccg ggtctgccgg cactgccgac gggctacccg 1020
ggtgcgttcc tgatggccat gatcccgcag tggtttcgca gtgttatgga tccgaaagtt 1080
gtcgactggg cgggcggtga tctgaataag attcaaatcg atgacagcat gcgtgaaacc 1140
tatctgaaaa agtttggcac ctcatcggcg ggtcattcat caagcacctc ggcagtggcg 1200
tcgtaa 1206
<210> 49
<211> 522
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for alkG
<400> 49
atggcatcct ataagtgtcc ggactgtaac tatgtctatg atgaatctgc gggcaatgtg 60
catgaaggct tttcgccggg tacgccgtgg catctgattc cggaagattg gtgctgtccg 120
gactgcgcag tgcgtgataa actggacttt atgctgatcg aatctggcgt cggtgaaaag 180
ggcgtgacca gcacgcacac ctcaccgaac ctgagcgaag tttctggtac gagtctgacc 240
gcggaagcag tggttgcacc gacgtcgctg gaaaaactgc cgagcgctga tgtcaaaggc 300
caggacctgt ataagaccca accgccgcgt tccgatgcac agggcggtaa agcgtatctg 360
aagtggattt gcatcacctg tggccatatt tacgatgaag cgctgggtga cgaagccgaa 420
ggctttacgc cgggcacccg tttcgaagat attccggatg actggtgctg cccggattgt 480
ggtgcgacga aagaagatta tgtcctgtat gaagaaaagt aa 522
<210> 50
<211> 1158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for alkT
<400> 50
atggctatcg ttgtggttgg tgctggtacg gctggcgtca atgcggcgtt ttggctgcgt 60
caatacggct ataaaggtga aattcgtatt tttagccgtg aaagcgtggc accgtatcaa 120
cgcccgccgc tgagcaaagc cttcctgacc agcgaaatcg ctgaatctgc ggtgccgctg 180
aagccggaag gtttttacac caacaataac attacgatca gtctgaatac cccgattgtc 240
tccatcgatg tgggtcgtaa aattgttagc tctaaagacg gcaaggaata tgcatacgaa 300
aagctgatcc tggctacccc ggctagtgca cgtcgcctga cgtgcgaagg tagtgaactg 360
tccggcgttt gttatctgcg ttctatggaa gatgcaaaaa atctgcgtcg caagctggtc 420
gaatcagctt cggtggttgt cctgggcggt ggcgtgattg gcctggaagt tgcaagcgcg 480
gccgtcggtc tgggtaaacg tgtgacggtt atcgaagcaa ccccgcgtgt catggctcgc 540
gtggttaccc cggcagctgc gaacctggtg cgtgcacgcc tggaagcaga aggtatcgaa 600
tttaaactga acgcaaagct gacgagcatc aaaggtcgca acggccatgt tgaacagtgc 660
gtcctggaat ctggcgaaga aattcaagcc gatctgatcg tcgtgggtat tggcgcgatc 720
ccggaactgg aactggccac cgaagccgca ctggaagttt ccaacggtgt tgtcgtggat 780
gaccagatgt gcacctcaga tacgtcgatt tacgcgatcg gtgactgtgc gatggcgcgt 840
aatccgttct ggggcacgat ggtgcgcctg gaaaccattc ataacgctgt gacgcacgcg 900
cagattgttg ccagttccat ctgtggcacc agcacgccgg caccgacccc gccgcgtttt 960
tggtcggacc tgaagggtat ggcactgcaa ggtctgggtg cactgaaaga ttatgacaag 1020
ctggttgtcg ccattaataa cgaaaccctg gaactggaag tgctggcata caaacaggaa 1080
cgcctgatcg ctacggaaac catcaatctg ccgaagcgtc aaggtgccct ggcgggttca 1140
atcaaactgc cggactaa 1158
<210> 51
<211> 2807
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for dppA(mutation)
<400> 51
atgcgtattt ccttgaaaaa gtcagggatg ctgaagcttg gtctcagcct ggtggctatg 60
accgtcgcag caagtgttca ggctaaaact ctggtttatt gctcagaagg atctccggaa 120
gggtttaacc cgcagctgtt tacctccggc accacctatg acgcctcttc cgtcccgctt 180
tataaccgtc tggttgaatt taaaatcggc accaccgaag tgatcccggg cctcgctgaa 240
aagtgggaag tcagcgaaga cggtaaaacc tataccttcc atctgcgtaa aggtgtgaag 300
tggcacgaca ataaagaatt caaaccgacg cgtgaactga acgccgatga tgtggtgttc 360
tcgttcgatc gtcagaaaaa cgcgcaaaac ccgtaccata aagtttctgg cggcagctac 420
gaatacttcg aaggcatggg cttgccagag ctgatcagtg aagtgaaaaa ggtggacgac 480
aacaccgttc agtttgtgct gactcgcccg gaagcgccgt tcctcgctga cctggcaatg 540
gacttcgcct ctattctgtc aaaagaatat gctgatgcga tgatgaaagc cggtacaccg 600
gaaaaactgg acctcaaccc aatcggaacc ggtccgttcc agttacagca gtatcaaaaa 660
gattcccgta tccgctacaa agcgtttgat ggctactggg gcaccaaacc gcagatcgat 720
acgctggttt tctctattac ccctgacgct tccgtgcgtt acgcgaaatt gcagaagaat 780
gaatgccagg tgatgccgta cccgaacccg gcagatatcg ctcgcatgaa gcaggataaa 840
tccatcaatc tgatggaaat gccggggctg aacgtcggtt atctctcgta taacgtgcag 900
aaaaaaccac tcgatgacgt gaaagttcgc caggctctga cctacgcggt gaacaaagac 960
gcgatcatca aagcggttta tcagggcgcg ggcgtatcag cgaaaaacct gatcccgcca 1020
accatgtggg gctataacga cgacgttcag gactacacct acgatcctga aaaagcgaaa 1080
gccttgctga aagaagcggg tctggaaaaa ggtttctcca tcgacctgtg ggcgatgccg 1140
gtacaacgtc cgtataaccc gaacgctcgc cgcatggcgg agatgattca ggcagactgg 1200
gcgaaagtcg gcgtgcaggc caaaattgtc acctacgaat ggggtgagta cctcaagcgt 1260
gcgaaagatg gcgagcacca gacggtaatg atgggctgga ctggcgataa cggggatccg 1320
gataacttct tcgccaccct gttcagctgc gccgcctctg aacaaggctc caactactca 1380
aaatggtgct acaaaccgtt tgaagatctg attcaaccgg cgcgtgctac cgacgaccac 1440
aataaacgcg ttgaactgta caaacaagcg caggtggtga tgcacgatca ggctccggca 1500
ctgatcatcg ctcactccac cgtgtttgaa ccggtacgta aagaagttaa aggctatgtg 1560
gttgatccat tagggaaggt gcgaataagc ggggaaattc ttctcggctg actcagtcat 1620
ttcatttctt catgtttgag ccgatttttt ctcccgtaaa tgccttgaat cagcctattt 1680
agaccgtttc ttcgccattt aaggcgttat ccccagtttt tagtgagatc tctcccactg 1740
acgtatcatt tggtccgccc gaaacaggtt ggccagcgtg aataacatcg ccagttggtt 1800
atcgtttttc agcaacccct tgtatctggc tttcacgaag ccgaactgtc gcttgatgat 1860
gcgaaatggg tgctccaccc tggcccggat gctggctttc atgtattcga tgttgatggc 1920
cgttttgttc ttgcgtggat gctgtttcaa ggttcttacc ttgccggggc gctcggcgat 1980
cagccagtcc acatccacct cggccagctc ctcgcgctgt ggcgcccctt ggtagccggc 2040
atcggctgag acaaattgct cctctccatg cagcagatta cccagctgat tgaggtcatg 2100
ctcgttggcc gcggtggtga ccaggctgtg ggtcaggcca ctcttggcat cgacaccaat 2160
gtgggccttc atgccaaagt gccactgatt gcctttcttg gtctgatgca tctccggatc 2220
gcgttgctgc tctttgttct tggtcgagct gggtgcctca atgatggtgg catcgaccaa 2280
ggtgccttga gtcatcatga cgcctgcttc ggccagccag cgattgatgg tcttgaacaa 2340
ttggcgggcc agttgatgct gctccagcag gtggcggaaa ttcatgatgg tggtgcggtc 2400
cggcaaggcg ctatccaggg ataaccgggc aaacagacgc atggaggcga tttcgtacag 2460
agcatcttcc atcgcgccat cgctcaggtt gtaccaatgc tgcatgcagt gaatgcgtag 2520
catggtttcc agcggataag gtcgccggcc attaccagcc ttggggtaaa acggctcgat 2580
gacttccacc atgttttgcc atggcagaat ctgctccatg cgggacaaga aaatctcttt 2640
tctggtctga cggcgcttac tgctgaattc actgtcggcg aaggtaagtt gatgactcat 2700
gatgaaccct gttctatggc tccagatgac aaacatgatc tcatatcagg gacttgttcg 2760
caccttcctt aggcaaacat cacttcgaaa acgtctctat cgaataa 2807
<210> 52
<211> 1195
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for IS5
<400> 52
ggaaggtgcg aacaagtccc tgatatgaga tcatgtttgt catctggagc catagaacag 60
ggttcatcat gagtcatcaa cttaccttcg ccgacagtga attcagcagt aagcgccgtc 120
agaccagaaa agagattttc ttgtcccgca tggagcagat tctgccatgg caaaacatgg 180
tggaagtcat cgagccgttt taccccaagg ctggtaatgg ccggcgacct tatccgctgg 240
aaaccatgct acgcattcac tgcatgcagc attggtacaa cctgagcgat ggcgcgatgg 300
aagatgctct gtacgaaatc gcctccatgc gtctgtttgc ccggttatcc ctggatagcg 360
ccttgccgga ccgcaccacc atcatgaatt tccgccacct gctggagcag catcaactgg 420
cccgccaatt gttcaagacc atcaatcgct ggctggccga agcaggcgtc atgatgactc 480
aaggcacctt ggtcgatgcc accatcattg aggcacccag ctcgaccaag aacaaagagc 540
agcaacgcga tccggagatg catcagacca agaaaggcaa tcagtggcac tttggcatga 600
aggcccacat tggtgtcgat gccaagagtg gcctgaccca cagcctggtc accaccgcgg 660
ccaacgagca tgacctcaat cagctgggta atctgctgca tggagaggag caatttgtct 720
cagccgatgc cggctaccaa ggggcgccac agcgcgagga gctggccgag gtggatgtgg 780
actggctgat cgccgagcgc cccggcaagg taagaacctt gaaacagcat ccacgcaaga 840
acaaaacggc catcaacatc gaatacatga aagccagcat ccgggccagg gtggagcacc 900
catttcgcat catcaagcga cagttcggct tcgtgaaagc cagatacaag gggttgctga 960
aaaacgataa ccaactggcg atgttattca cgctggccaa cctgtttcgg gcggaccaaa 1020
tgatacgtca gtgggagaga tctcactaaa aactggggat aacgccttaa atggcgaaga 1080
aacggtctaa ataggctgat tcaaggcatt tacgggagaa aaaatcggct caaacatgaa 1140
gaaatgaaat gactgagtca gccgagaaga atttccccgc ttattcgcac cttcc 1195
<210> 53
<211> 1709
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for yeaR(mutation)
<400> 53
atgcttcaaa tcccacagaa ttatattcat acgcgctcaa cgcctttctg gaataaacaa 60
actgcacctg ccggaatatt cgaacgtcat cttgataaag gaacgcgccc gggggtttac 120
cccataagcg ctaacttaag ggttgaacca tctgaagaat gcgacgcctc ggtgcctcgt 180
taagacgatg cctcgcgttc ttcaattgcg ttttgtaggc tgtcagggat actgtcccac 240
gaatggccac ctgtaagctc cagatgacca tttttgttat tctccacaac gagttagttc 300
ttcttttcgg atccggcact tctggggggg aaatccagcg atggctggat tatgtcgtca 360
attaaaaatg cggcgagtag attagcaaat atccacgctt tcgcgagttc aggttccttt 420
gcacgcaaag catccaggtg cagcaaactt ttgagccgct taaaagccag ttcaatttgc 480
catcgcagac ggtaacaatc agccacttgc tctgctgaat attcatcttc cggtaatgat 540
gttagcaata gcacatggcc cgctgcttcc agcgtttccg cctgaactac tcgtcctttt 600
cgacgattct cgctgagcag tcgggtttta ctgattaatg ctttttcggg aggaagtgat 660
acggcaatga gacgtgccgg aaagggagct ccggcttttt tattacctga attgcctatc 720
attacagtgg tttcaccgtt cttaccgcaa tccagcccgc gcagaaaacc catcatgtca 780
aagcgcattc cttctgcagt taaccagcgc aatcctcgcc agtgaacccg gacgatataa 840
tcagcttctc caaaagcaag tgagcggata cattcgggac gcgaaccgaa tccccggtca 900
gcaatgcgta tctcgtctgc cgtttgcgca aatcggtcca gccgttcagc gtctctgctg 960
tcggttagct caaaatcagt gaactgacag gtatgaggat catatcccat atgtagtcgc 1020
cattcagcgc tgccgccccc gggcgcactg attgctgttc catcgacaag acgcaatctc 1080
tttccgcttg tacaacccgt aactgcggcg cgtacagcaa gtgtttgtgc ggcaagtatg 1140
ccaaaccagt cggcggcatt ccgcagccgc ttcaggagag ccacgtcaga taatgttgca 1200
acgtcatgga gctgagccca tgcagtgact tcacgtaatg acatcccccc ggggccgtaa 1260
gccagcccca gacgtagcag agttgcagca tcacgaattt cgcggcggcg ggttagagcc 1320
ccggcattac gtgccgaagt atccagttct tcgggcttac caatatgggc cagaattgct 1380
gaccagttat cgtgagagta attcatcggc acgttaaatc atatcaggcg taataccaca 1440
acccttaagt tagcgcttat ggggtttacc cacgcctttc cgttatgcat ggggcggtca 1500
aatatctcgg ctacgctgat gaacacagtg cagagcctga tcaggtgatc cttatcgaag 1560
cggggcagtt tgcggtgttc cctccagaaa agtggcacaa cattgaagcc atgactgacg 1620
atacttattt caacattgac ttcttcgtgg ctcctgaagt cctgatggaa ggtgcgcaac 1680
aacggaaagt cattcataac gggaaatga 1709
<210> 54
<211> 1343
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for IS186
<400> 54
cccataagcg ctaacttaag ggttgtggta ttacgcctga tatgatttaa cgtgccgatg 60
aattactctc acgataactg gtcagcaatt ctggcccata ttggtaagcc cgaagaactg 120
gatacttcgg cacgtaatgc cggggctcta acccgccgcc gcgaaattcg tgatgctgca 180
actctgctac gtctggggct ggcttacggc cccgggggga tgtcattacg tgaagtcact 240
gcatgggctc agctccatga cgttgcaaca ttatctgacg tggctctcct gaagcggctg 300
cggaatgccg ccgactggtt tggcatactt gccgcacaaa cacttgctgt acgcgccgca 360
gttacgggtt gtacaagcgg aaagagattg cgtcttgtcg atggaacagc aatcagtgcg 420
cccgggggcg gcagcgctga atggcgacta catatgggat atgatcctca tacctgtcag 480
ttcactgatt ttgagctaac cgacagcaga gacgctgaac ggctggaccg atttgcgcaa 540
acggcagacg agatacgcat tgctgaccgg ggattcggtt cgcgtcccga atgtatccgc 600
tcacttgctt ttggagaagc tgattatatc gtccgggttc actggcgagg attgcgctgg 660
ttaactgcag aaggaatgcg ctttgacatg atgggttttc tgcgcgggct ggattgcggt 720
aagaacggtg aaaccactgt aatgataggc aattcaggta ataaaaaagc cggagctccc 780
tttccggcac gtctcattgc cgtatcactt cctcccgaaa aagcattaat cagtaaaacc 840
cgactgctca gcgagaatcg tcgaaaagga cgagtagttc aggcggaaac gctggaagca 900
gcgggccatg tgctattgct aacatcatta ccggaagatg aatattcagc agagcaagtg 960
gctgattgtt accgtctgcg atggcaaatt gaactggctt ttaagcggct caaaagtttg 1020
ctgcacctgg atgctttgcg tgcaaaggaa cctgaactcg cgaaagcgtg gatatttgct 1080
aatctactcg ccgcattttt aattgacgac ataatccagc catcgctgga tttccccccc 1140
agaagtgccg gatccgaaaa gaagaactaa ctcgttgtgg agaataacaa aaatggtcat 1200
ctggagctta caggtggcca ttcgtgggac agtatccctg acagcctaca aaacgcaatt 1260
gaagaacgcg aggcatcgtc ttaacgaggc accgaggcgt cgcattcttc agatggttca 1320
acccttaagt tagcgcttat ggg 1343
Claims (15)
- i) fadR 유전자가 결실되고,
ii) AcrR, FadD, DppA, Crp, e14 프로파지 및 YeaR로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 돌연변이된 형질전환 대장균. - 제1항에 있어서,
상기 AcrR 돌연변이는 서열번호 42로 표시되는 염기서열 중 567번째 염기인 아데닌(A)이 결실된 것인, 형질전환 대장균. - 제1항에 있어서,
상기 FadD 돌연변이는 서열번호 43으로 표시되는 fadD와 yeaY의 유전자간 영역(yeaY/fadD intergenic region)의 염기서열 중 90번째 염기인 구아닌(guanin) 및 94번째 염기인 사이토신(cytosine)이 아데닌(adenine)으로 치환된 것인, 형질전환 대장균. - 제1항에 있어서,
상기 DppA 돌연변이는 서열번호 44로 표시되는 염기서열 중 1570번째 염기에 이동성 유전인자 (mobile genetic element) IS5가 삽입된 것인, 형질전환 대장균. - 제1항에 있어서,
상기 Crp 돌연변이는 서열번호 45로 표시되는 crp와 yhfA의 유전자간 영역(yeaY/fadD intergenic region)의 염기서열 중 125번째 염기에 이동성 유전인자 IS5가 삽입된 것인, 형질전환 대장균. - 제1항에 있어서,
상기 e14 프로파지 돌연변이는 서열번호 46으로 표시되는 염기서열의 icd-icdC 유전자가 결실된 것인, 형질전환 대장균. - 제1항에 있어서,
상기 YeaR 돌연변이는 서열번호 47로 표시되는 염기서열 중 115번째 염기에 이동성 유전인자 IS186가 삽입된 것인, 형질전환 대장균. - i) 제1항의 형질전환 대장균을 배양하는 단계; 및
ii) 상기 형질전환 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함하는, 노난디오산의 생산방법. - 제8항에 있어서,
상기 배양은 노난산 존재 하에 형질전환 대장균을 배양하는 것을 특징으로 하는 것인, 노난디오산의 생산방법. - i) 야생형 대장균의 fadR 유전자를 결실시키는 단계;
ii) 상기 대장균을 노난산이 유일탄소원인 최소배지에서 10일 이상 배양시키는 단계; 및
iii) 90일 이상 반복적으로 계대배양시키는 단계를 포함하는, 노난산으로부터 노난디오산을 생산하는 대장균을 제조하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 ii) 단계에서 노난산은 적어도 3 g/L의 농도로 존재하는 것인, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 ii) 단계에서 최소배지가 NaH2PO4, KH2PO4, NaCl, NH4Cl, MgSO4·7H2O 및 CaCl2 가 첨가된 M9 최소배지인, 방법. - 제10항의 방법으로 제조된, 대장균.
- 제13항에 있어서,
상기 대장균이 fadR 유전자가 결실되고, AcrR, FadD, DppA, Crp, e14 프로파지 및 YeaR로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 돌연변이된 것을 특징으로 하는, 대장균. - i) 제13항의 대장균을 배양하는 단계; 및
ii) 상기 대장균으로부터 생산되는 노난디오산을 수득하는 단계를 포함하는, 노난디오산의 생산방법.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116837016A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-10-03 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用 |
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| US20180112241A1 (en) | 2015-07-08 | 2018-04-26 | Rheinisch-Westfaelische Technische Hochshule Aachen (RWTH) | Extracellular production of designer hydroxyalkanoyloxy alkanoic acids with recombinant bacteria |
| US20200277634A1 (en) | 2016-02-01 | 2020-09-03 | Invista North America S.á.r.l. | Methods and materials for producing 7-carbon monomers |
-
2021
- 2021-02-05 KR KR1020210016693A patent/KR102608905B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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| Title |
|---|
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| CN116837016A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-10-03 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用 |
| CN116837016B (zh) * | 2023-08-29 | 2024-01-02 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用 |
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| Publication number | Publication date |
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