KR102278582B1

KR102278582B1 - 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물 및 이를 이용한 이수산화지방산의 제조방법

Info

Publication number: KR102278582B1
Application number: KR1020190102945A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 이진
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-07-15
Also published as: KR20210023153A

Abstract

본 발명은 리폭시게나아제 변이체를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 리폭시게나아제 변이체는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제의 아미노산 서열로부터, 429번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로, 430번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로 각각 치환시킨 것이고, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조용 조성물 및 이를 이용한 이수산화지방산의 제조방법 등에 관한 것이다.

Description

리폭시게나아제 변이체를 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물 및 이를 이용한 이수산화지방산의 제조방법{COMPOSITION FOR PRODUCING DIHYDROXY FATTY ACID COMPRISING LIPOXYGENASE VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING DIHYDROXY FATTY ACID USING THE SAME}

본 발명은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제가 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된, 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물 및 이를 이용한 이수산화지방산의 제조방법에 관한 것이다.

수산화지방산은 희귀지방산의 일종으로 지방산 사슬에 -OH (Hydroxy radical, 수산기)가 결합되어 있으며, 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질에 존재하며 일반적으로 수산화기를 가지고 있는 자연계의 물질이다. 또한 불포화산에서 합성된 히드록시산을 수산화지방산이라고 부른다. 수산화기를 가지기 때문에 반응성이 뛰어나 산업적으로 원료물질로 사용되며, 또한 이 수산화기의 작용으로 표면장력의 감소, 항곰팡이 활성의 증가로 화장품의 원료물질로 사용되기도 한다. 특히 동물에서 수산화지방산은 신호전달물질의 전구체로 이용되며, 단일 물질만으로도 다양한 생리활성에 관여한다. 신호전달물질의 한 종류인 지질 조절제(lipid mediator)는 인간을 포함한 동물 내에서 면역반응, 대사조절, 항상성 조절 등의 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질로서 그 물질들 중 염증해결 특화 지방산(Specialized pro-resolving mediator, SPM)은 적극적으로 염증을 해소하여 항염효과를 갖도록 특화된 물질로 상당수의 물질들이 오메가 3지방산인 EPA, DHA, DPA로부터 합성된다고 알려져 있다. 이 물질들을 처리하게 되면 염증을 잠재적으로 감소시키고 해소시키는 능력을 보유한 것으로 알려져 있다. 부작용을 동반하는 화학 합성된 의약품을 대신하여 차세대 의료물질로써의 가능성을 가지고 있으며, 의학, 생물학, 생명공학 등 폭넓은 학문의 연구물질로 사용될 수 있지만 아직까지 생물학적 생산방법이 개발되지 않았다.

한편, 리폭시게나아제(lipoxygenase, LOX)는 이산소화(dioxygenase) 효소이며, 산화지방산을 합성하는 반응을 촉매한다. 산화효소이지만 헴(heme)을 지니지 않는 것이 특징으로, 대신 철을 함유한 효소이다. 특징적으로 하나 또는 다수의 시스, 시스-1,4-펜타디엔을 가지는 다가불포화 지방산을 기질로 이용하여 이산소화 반응을 통해 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다.

이때, 야생형(wild-type) 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 유래 리폭시게나아제는 5,15-리폭시게나아제로서, 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 7번과 17의 탄소 위치에 수산기를 형성하고, 탄소수 20개의 불포화 지방산에서는 5번과 15번의 탄소 위치에 수산기를 형성한다.

본 발명은 종래 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제와 달리, 이의 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 이용함으로써, 다른 위치 특이성을 가지는 이수산화지방산을 새로운 경로를 통해 제조하기 위한 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 리폭시게나아제 변이체를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 리폭시게나아제 변이체는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제의 아미노산 서열로부터, 429번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로, 430번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로 각각 치환시킨 것이고, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조용 조성물을 제공한다.

상기 리폭시게나아제 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜다엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.

상기 조성물 내 상기 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 전세포의 농도는 0.5 g/L 내지 4 g/L일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 이수산화지방산의 제조방법으로서, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조방법을 제공한다.

상기 기질은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜다엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함할 수 있다.

상기 기질 내 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 농도는 1 mM 내지 5 mM일 수 있다.

상기 처리는 pH 7.0~9.0 범위에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 처리는 100mM 내지 400mM 농도의 시스테인과 반응을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 재조합 발현 벡터로서, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 숙주세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 의하면, 종래 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제와 달리, 이의 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 이용함으로써, 환경 친화적인 방법으로 다른 위치 특이성을 가지는 이수산화지방산을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에 따라 제조된, 5,12-이수산화아라키돈산, 5,12-이수산화에이코사펜타엔산, 7,14-이수산화도코사헥사엔산 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산와 같은 이수산화지방산은 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.

도 1(a)~(d)는 본 발명에 따른 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 이용하여 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 및 도코사펜타엔산을 기질로 하여 생성되는 5,12-이수산화아라키돈산, 5,12-이수산화에이코사펜타엔산, 7,14-이수산화도코사헥사엔산 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산의 합성경로를 각각 나타낸 것이다.
도 2(a)~(c)는 본 발명에 따라 생성되는 5,12-이수산화아라키돈산에 대한 HPLC 크로마토그램 및 LC-MS/MS 결과를 나타낸 것이다.
도 3(a)~(b)는 본 발명에 따라 생성되는 5,12-이수산화에이코사펜타엔산에 대한 HPLC 크로마토그램 및 LC-MS/MS 결과를 나타낸 것이다.
도 4(a)~(h)는 본 발명에 따라 생성되는 7,14-이수산화도코사헥사엔산에 대한 HPLC 크로마토그램; LC-MS/MS; 및 수소, 탄소, COSY, HSQC 및 HMBC NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 5(a)~(h)는 본 발명에 따라 생성되는 7,14-이수산화도코사펜타엔산에 대한 HPLC 크로마토그램; LC-MS/MS; 및 수소, 탄소, COSY, HSQC 및 HMBC NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6(a)~(d)는 본 발명에 따른 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A) 및 시스테인를 이용하여 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 및 도코사펜타엔산을 기질로 하여 생성되는 5,12-이수산화아라키돈산, 5,12-이수산화에이코사펜타엔산, 7,14-이수산화도코사헥사엔산 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산의 생산량을 각각 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A) 및 시스테인을 이용하여 이수산화지방산을 제조함에 있어, 시스테인의 최적화 농도를 확인한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)을 이용하여 이수산화지방산을 제조함에 있어, 최적화 pH를 확인한 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 포함하는 전세포를 이용하여 이수산화지방산을 제조함에 있어, 전세포의 최적화 농도를 확인한 것이다.
도 10는 본 발명에 따른 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 합성시킨 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 5,12-이수산화아라키돈산, 5,12-이수산화에이코사펜타엔산, 7,14-이수산화도코사헥사엔산 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산와 같은 이수산화지방산을 제조하고자 지속적인 연구를 수행하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제가 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된, 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환 미생물을 제조하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 환경 친화적인 방법으로 5,12-이수산화아라키돈산, 5,12-이수산화에이코사펜타엔산, 7,14-이수산화도코사헥사엔산 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산와 같은 이수산화지방산을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이수산화지방산의 제조용 조성물

본 명세서 내 “이수산화지방산”은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 의미한다.

구체적으로, 상기 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid; 5,12-DiHETE)은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:

[화학식 1]

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또한, 상기 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid; 5,12-DiHEPE)은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:

[화학식 2]

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또한, 상기 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid; 7,14-DiHoHE(7S-MaR1))는 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다:

[화학식 3]

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또한, 상기 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid; 7,14-DiHDPAn-3(7S-MaR1n-3))는 하기 화학식 4로 될 수 있다:

[화학식 4]

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본 발명에 따른 이수산화지방산의 제조용 조성물은 리폭시게나아제 변이체를 유효성분으로 포함하는 것으로, 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 전세포를 포함할 수 있다.

상기 리폭시게나아제 변이체는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제의 아미노산 서열로부터, 429번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로, 430번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로 각각 치환시킨 것을 말한다.

이때, 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제는 야생형(wild-type)으로서, 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 7번과 17번의 탄소 위치에 수산기를 형성하고, 탄소수 20개의 불포화 지방산에서는 5번과 15번의 탄소 위치에 수산기를 형성한다.

한편, 상기 리폭시게나아제 변이체는 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제의 아미노산 서열로부터, 429번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로, 430번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로 각각 치환시킨 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것 뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 리폭시게나아제 변이체는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 또한, 상기 리폭시게나아제 변이체는 상기 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제와 달리, 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 7번과 14번의 탄소 위치에 수산기를 형성하고, 탄소수 20개의 불포화 지방산에서는 5번과 12번의 탄소 위치에 수산기를 형성한다. 이때, 상기 리폭시게나아제 변이체의 최적 활성 pH는 7.0 내지 9.0, 바람직하게 8.5이고, 최적 활성 온도는 15℃ 내지 35℃이다.

구체적으로, 상기 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 전세포는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 후술하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 재조합 발현 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28(+)a 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 ER 2566 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 전세포는 ⅰ) 상기 미생물의 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ⅱ) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; ⅲ) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 ⅳ) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함하여 수득될 수 있다. 구체적으로, ⅰ) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ⅱ) 단계에서 전세포의 세척은 0.85% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.

이때, 상기 조성물 내 상기 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 전세포의 농도는 0.5 g/L 내지 4 g/L일 수 있고, 2 g/L 내지 3 g/L인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 기질 내 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 농도는 1 mM 내지 5 mM인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산은 이러한 농도를 유지함으로써, 이수산화지방산의 생산 농도를 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조용 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 재조합 발현 벡터로서, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 리폭시게나아제 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.

이수산화지방산의 제조방법

본 발명은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 이수산화지방산의 제조방법으로서, 상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 이수산화지방산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 이수산화지방산의 제조방법은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함한다.

상기 조성물은 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제의 아미노산 서열로부터, 429번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로, 430번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로 각각 치환시킨 리폭시게나아제 변이체를 포함하거나, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로, 구체적인 내용에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 처리는 pH 7.0~9.0 및 15~35℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 EPPS 또는 CHES 완충용액을 사용할 수 있다. 이러한 pH 조건을 유지함으로써, 사용되는 효소를 최적으로 활성화시킬 수 있어, 최종적으로 이수산화지방산을 높은 생산성 및 높은 수율로 제조할 수 있다. 또한, 상기 처리는 10분 이상 수행되는 것이 바람직하고, 30분 이상 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 처리는 100mM 내지 400mM 농도의 시스테인과 반응을 통해 수행될 수 있고, 100 mM 내지 300mM 농도의 시스테인과 반응을 통해 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이로써, 사용되는 효소를 최적으로 활성화시킬 수 있어, 최종적으로 이수산화지방산을 높은 생산성 및 높은 수율로 제조할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 종래 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제와 달리, 이의 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 이용함으로써, 환경 친화적인 방법으로 다른 위치 특이성을 가지는 이수산화지방산을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A) 발현을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제가 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된, 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 제조하기 위하여, 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유전자로부터 리폭시게나아제를 코딩하는 유전자를 먼저 분리하고, 이를 위치 지정 돌연변이에 의해 변형하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 독일생물자원센터(독일)에서 유전자 염기 서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) DSM 52838 균주를 구입하여 선별하고, 이로부터 유래한 리폭시게나아제의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum)의 genomic DNA를 추출하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 리폭시게나아제의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각 유전자들의 제한효소로 Nde I과 SalI을 이용하였으며 클로닝 방법은 Gibson assembly 방법을 이용하였고 primer는 다음과 같다. 리폭시게나아제 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG ATG CGT TCC ATT CCC TCC CTG CCC CAG AAT(서열번호 3), R: ATT CTG GGG CAG GGA GGG AAT GGA ACG CAT CAT ATG GCT GCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT(서열번호 4)로 구성하였다. 또한, 유전자를 pET 28a에 클로닝하기 위하여 벡터 또한 PCR을 이용하여 준비 후 isothermal buffer를 이용하여 라이게이션하여 재조합 리폭시게나아제를 제조하였다.

이후, 상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 위치 지정 돌연변이에 의해 변형하기 위해 특정 염기서열 영역인 아미노산서열 429번과 430번의 류신(Leusine)잔기를 알라닌(Alanine)잔기로 바꿈으로써 돌연변이를 일으키고 이러한 재조합 벡터를 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs (Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 형질전환 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 이수산화지방산의 생산을 위하여 배양한 뒤 사용 전에 -80℃에 냉동 보관하였다. 위치 지정 돌연변이를 위한 프라이머는 F: CCG GTG GAC CAG GCG GCC GCC GGT GA (서열번호 5), R: TCA CCG GCG GCC GCC TGG ACC GG (서열번호 6)로 구성하였다. 또한, PCR을 이용하여 준비 후 Site-directed mutazyme을 37 ℃에 2시간 처리하여 원하는 플라스미드만 남긴 후 위치 지정 돌연변이에 의해 변형된 리폭시게나아제 변이체를 제작하였다.

실시예 2: 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)의 제조

효소의 단백질 발현을 위하여, 실시예 1에서 냉동 보관시킨 형질전환 미생물은 450 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.

배양된 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)는 상기 형질전환된 균주의 배양액을 7,000xg로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 이수산화지방산을 생산하기 위한 재조합 세포로 사용하였다.

실시예 3: 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)를 이용한 불포화 지방산으로부터 이수산화지방산의 합성경로 구축

상기 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)인 5,12-리폭시게나아제를 이용하여 5,12-이수산화아라키돈산, 5,12-이수산화에이코사펜타엔산, 7,14-이수산화도코사헥사엔산 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산와 같은 이수산화지방산의 합성경로를 구축하기 위해, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 및 도코사펜타엔산와 같은 불포화 지방산을 기질로 하였다. 이수산화지방산은 3 mM의 불포화 지방산들로부터, 2 g/L의 5,12-리폭시게나아제를 사용하였으며 시스테인 농도 200mM, pH 8.5, 20 ℃에서 60 분 동안 전세포 반응(whole cell reaction)을 실시하였다. 그 결과 도 1(a) 내지 (d)와 같은 합성경로를 구축하였다.

이때 생성된 5,12-이수산화아라키돈산은 하기 화학식 1로 표시되는 것으로, HPLC 크로마토그램을 이용하여 확인하였고(도 2(a) 및 (b)), LC-MS/MS를 통한 물질 동정을 이용하여 확인하였다(도 2(c)):

[화학식 1]

.

또한 생성된 5,12-이수산화에이코사펜타엔산은 하기 화학식 2로 표시되는 것으로, HPLC 크로마토그램을 이용하여 확인하였고(도 3(a)), LC-MS/MS를 통한 물질 동정을 이용하여 확인하였다(도 3(b)):

[화학식 2]

.

또한 생성된 7,14-이수산화도코사헥사엔산은 하기 화학식 3으로 표시되는 것으로, HPLC 크로마토그램을 이용하여 확인하였고(도 4(a)), LC-MS/MS를 통한 물질 동정을 이용하여 확인하였으며(도 4(b)), 수소, 탄소, COSY, HSQC 및 HMBC NMR 스펙트럼을 각각 이용하여 확인하였다(표 1 및 도 4(c) 내지 (h)):

[화학식 3]

.

C No.	¹ H (δ)	multiplet	J (Hz)	Protons	¹³ C (δ)
1					176.4
2	2.44	t	7.23	2H	33.2
3	2.42-2.35	m		2H	22.6
4	5.51	dt	10.95, 6.92	1H	130.8
5	5.48-5.43	m		1H	126.4
6	2.43-2.31	m		2H	35.1
7	4.31-4.27	m		1H	71.7
8	5.77	dd	15.60, 5.91	1H	136.3
9	6.78-6.71	m		1H	125.5
10	5.99	d	10.12	1H	128.9
11	5.99	d	10.12	1H	128.9
12	6.78-6.71	m		1H	125.5
13	5.77	dd	15.60, 5.91	1H	136.3
14	4.31-4.27	m		1H	71.9
15	2.43-2.31	m		2H	35.3
16	5.43-5.38	m		1H	132.3
17	5.48-5.43	m		1H	126.7
18	2.81	t	7.27	2H	35.7
19	5.56	dtt	10.79, 7.39, 1.56	1H	131.9
20	5.43-5.38	m		1H	124.4
21	2.07	quin	7.49	2H	20.6
22	0.97	t	7.49	3H	14.3

또한 생성된 7,14-이수산화도코사펜타엔산은 하기 화학식 4로 표시되는 것으로, HPLC 크로마토그램을 이용하여 확인하였고(도 5(a)), LC-MS/MS를 통한 물질 동정을 이용하여 확인하였으며(도 5(b)), 수소, 탄소, COSY, HSQC 및 HMBC NMR 스펙트럼을 각각 이용하여 확인하였다(도 5(c) 내지 (h)).

[화학식 4]

.

C No.	¹ H (δ)	multiplet	J (Hz)	Protons	¹³ C (δ)
1					177.4
2	2.35	t	7.01	2H	33.5
3	1.68-1.59	m		2H	24.6
4	1.41-1.34	m		2H	28.7
5	1.41-1.34	m		2H	25.0
6	1.63-1.51	m		2H	36.8
7	4.21	td	6.56, 6.81	1H	72.6
8	5.71	dd	6.81, 15.05	1H	137.1
9	6.68	dd	9.67, 15.05	1H	125.7
10	5.99	d	9.67	1H	128.9
11	5.99	d	9.76	1H	129.0
12	6.74	dd	9.76, 15.07	1H	125.5
13	5.77	dd	5.92, 15.07	1H	136.4
14	4.29	dt	5.92, 6.11	1H	71.9
15	2.41-2.31	m		2H	35.3
16	5.44-5.37	m		1H	124.4
17	5.56	dt	8.00, 8.73	1H	132.0
18	2.81	t	7.09	2H	25.7
19	5.29	dt	7.83, 8.56	1H	126.7
20	5.44-5.37	m		1H	132.3
21	2.07	td	7.48, 7.05	2H	20.6
22	0.97	t	7.48	3H	14.3

실시예 4. 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A) 및 시스테인 처리를 이용한 이수산화지방산의 제조

상기 리폭시게나아제 변이체(L429A-L430A)인 5,12-리폭시게나아제가 발현된 재조합 대장균에 의해 시스테인이 첨가된 반응물에서 5,12-리폭시게나아제가 단일반응으로 생성되는 이수산화지방산의 생산량을 확인하였다. 기질로서 3 mM의 불포화 지방산에 대하여 200 mM의 시스테인을 첨가하고, pH 8.5에서, 온도를 20 ℃에서 30분 동안 전세포 반응을 실시하였고 이수산화지방산의 생산량을 확인하였다.

그 결과, 도 6(a)에 나타난 바와 같이, 아라키돈산을 기질로 약 0.65 mM의 5,12-이수산화아라키돈산이 생성됨을 확인하였고, 도 6(b)에 나타난 바와 같이, 에이코사펜타엔산을 기질로 약 0.17 mM의 5,12-이수산화에이코사펜타엔산이 생성됨을 확인하였다. 또한, 도 6(c)에 나타난 바와 같이, 도코사헥사엔산을 기질로 약 0.31 mM의 7,14-이수산화도코사헥사엔산이 생성됨을 확인하였고, 도 6(d)에 나타난 바와 같이, 도코사펜타엔산을 기질로 약 0.65 mM의 7,14-이수산화도코사펜타엔산이 생성됨을 확인하였다. 도 7을 참고하면, 이러한 결과는 시스테인을 처리하지 않은 반응보다 평균적으로 약 2.6배 증가된 최적화된 생산량으로 볼 수 있다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 지방산 업계 및 약학계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING DIHYDROXY FATTY ACID COMPRISING LIPOXYGENASE VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING DIHYDROXY FATTY ACID USING THE SAME <130> 2019-i217 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 680 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Archangium violaceum <400> 1 Met Arg Ser Ile Pro Ser Leu Pro Gln Asn Asp Ser Pro Ala Gln Gln 1 5 10 15 Glu Leu Arg Leu Ala Thr Leu Thr Gln Glu Arg Gln Val Tyr Ala Tyr 20 25 30 Asn Phe Asp Ser Arg Leu Ser Pro Leu Gly Ile Ala Ala Gln Val Pro 35 40 45 Arg Gln Asp Asn Phe Ser Phe Val Trp Leu Asp Gly Val Ala Thr Thr 50 55 60 Gly Leu Gln Leu Leu Gly Asn Val Leu Ala Ile Gly Ala Lys Leu Phe 65 70 75 80 Asp Asn Gly Glu Ala Ile Gln Asn Asp Ala Gly Leu Ser Glu Leu Glu 85 90 95 Leu Arg Arg Val Glu Gly Thr Tyr Arg Glu Leu Thr Asp Gly Phe Ser 100 105 110 Arg Leu Ser Asp Arg Thr Ser Arg Leu His Gln Ala Pro Arg Ser Pro 115 120 125 Ala Val Thr Leu Ile Ala Asp Val Ile Glu Arg Pro Arg Thr Leu Leu 130 135 140 Lys Ala Ala Gly Gln Lys Leu Glu Glu Thr Ala Gly Val Ala Ile Val 145 150 155 160 Ser Glu Leu Ala Thr Gln Ala Ala Leu Asp Ala Pro Ala Ile Gly Gln 165 170 175 Asp Ile Leu Asp Leu Ile Asp Thr Leu Leu Lys Lys Leu Leu Ser Glu 180 185 190 Ala Gly Asp Leu Phe Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Ala Ala 195 200 205 Ser Leu Asp Asn Tyr Thr Ala Gln Phe Ser Leu Leu Gln Pro Pro Ser 210 215 220 Val Ala Ser Asn Tyr Glu Thr Asp Leu Ile Phe Ala Arg Met Arg Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Asn Pro Ala Leu Leu Gln Gly Ile Ala Ala Leu Pro Glu 245 250 255 Lys Phe Pro Val Thr Asp Ala Gln Tyr Gln Ser Val Met Gly Ser Gln 260 265 270 Asp Thr Leu Ala Arg Ala Gly Gln Glu Gly Arg Leu Tyr Leu Leu Asp 275 280 285 Tyr Ala Val Phe Gln Gly Ile Pro Thr Gly Gln Thr Ser Gly Gly Gln 290 295 300 Lys Tyr Ile Glu Ala Pro Leu Ala Leu Phe Ala Val Pro Ala Ala Asn 305 310 315 320 Gln Ala Asp Arg Lys Leu Arg Ala Val Ala Ile Gln Cys Ser Gln Thr 325 330 335 Pro Gly Arg Ser Asn Pro Ile Phe Thr Pro Ala Asp Gly Thr Ser Trp 340 345 350 Ser Leu Ala Arg Leu His Val Gln Val Ala Asp Gly Asn Tyr His Glu 355 360 365 Leu Ile Ala His Leu Gly Leu Thr His Leu Ile Leu Glu Glu Phe Thr 370 375 380 Leu Ser Thr His Arg Gln Leu Ala Pro Gln His Pro Leu Tyr Leu Leu 385 390 395 400 Leu Thr Pro His Phe Gln Gly Thr Leu Ala Ile Asn Asn Ala Ala Glu 405 410 415 Thr Ser Leu Ile Ala Pro Gly Gly Pro Val Asp Gln Ala Ala Ala Gly 420 425 430 Glu Ile Lys Ala Ser Thr Gln Val Ser Ile Gln Ala Val Ala Asn Gln 435 440 445 Ser Ile Asn Gln Ser Phe Leu Pro Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val 450 455 460 Asp Asp Ala Ser Lys Leu Pro Asp Tyr Pro Tyr Arg Asp Asp Ala Leu 465 470 475 480 Leu Leu Trp Asn Asp Ile Arg Ala Trp Val Ser Asp Tyr Leu Ala Ile 485 490 495 Tyr Tyr Asn Asp Asp Ala Ala Val Arg Ser Asp Tyr Glu Leu Gln Pro 500 505 510 Gly Ser Arg Ser Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ser Glx Arg Met Glx 515 520 525 Arg Arg Ala Glu Gly Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ile Trp Trp Thr Glx 530 535 540 Pro Pro Thr Ser Ser Ser Arg Arg Ala Cys Ser Thr Arg Arg Ser Thr 545 550 555 560 Ser Arg Ser Ala Arg Ser Glx Ala Thr Pro Arg Arg Cys Arg Trp Arg 565 570 575 Pro Thr Leu Pro Arg Pro Pro Pro Trp Lys Ser Cys Arg Arg Ala Arg 580 585 590 Ser Glx Pro Thr Cys Arg Arg Cys Arg Trp Pro Ser Cys Ser Arg Arg 595 600 605 Ser Pro Ser Gly Trp Ala Thr Cys Thr Ser Pro Gly Trp Ala Ala Thr 610 615 620 Thr Arg Thr Cys Ala Ser Pro Gly Ser Arg Thr Arg Ala Cys Gly Pro 625 630 635 640 Pro Trp Arg Ser Ser Arg Ser Ala Cys Ala Pro Arg Ser Gly Arg Ser 645 650 655 Ala Ser Ala Thr Cys Arg Ala Ser Pro Thr Arg Arg Cys Cys Pro Arg 660 665 670 Arg Phe Arg Arg Ala Ser Thr Ser 675 680 <210> 2 <211> 680 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> l429A/l430A double mutant of 5,15-lipoxygenase <400> 2 Met Arg Ser Ile Pro Ser Leu Pro Gln Asn Asp Ser Pro Ala Gln Gln 1 5 10 15 Glu Leu Arg Leu Ala Thr Leu Thr Gln Glu Arg Gln Val Tyr Ala Tyr 20 25 30 Asn Phe Asp Ser Arg Leu Ser Pro Leu Gly Ile Ala Ala Gln Val Pro 35 40 45 Arg Gln Asp Asn Phe Ser Phe Val Trp Leu Asp Gly Val Ala Thr Thr 50 55 60 Gly Leu Gln Leu Leu Gly Asn Val Leu Ala Ile Gly Ala Lys Leu Phe 65 70 75 80 Asp Asn Gly Glu Ala Ile Gln Asn Asp Ala Gly Leu Ser Glu Leu Glu 85 90 95 Leu Arg Arg Val Glu Gly Thr Tyr Arg Glu Leu Thr Asp Gly Phe Ser 100 105 110 Arg Leu Ser Asp Arg Thr Ser Arg Leu His Gln Ala Pro Arg Ser Pro 115 120 125 Ala Val Thr Leu Ile Ala Asp Val Ile Glu Arg Pro Arg Thr Leu Leu 130 135 140 Lys Ala Ala Gly Gln Lys Leu Glu Glu Thr Ala Gly Val Ala Ile Val 145 150 155 160 Ser Glu Leu Ala Thr Gln Ala Ala Leu Asp Ala Pro Ala Ile Gly Gln 165 170 175 Asp Ile Leu Asp Leu Ile Asp Thr Leu Leu Lys Lys Leu Leu Ser Glu 180 185 190 Ala Gly Asp Leu Phe Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Ala Ala 195 200 205 Ser Leu Asp Asn Tyr Thr Ala Gln Phe Ser Leu Leu Gln Pro Pro Ser 210 215 220 Val Ala Ser Asn Tyr Glu Thr Asp Leu Ile Phe Ala Arg Met Arg Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Asn Pro Ala Leu Leu Gln Gly Ile Ala Ala Leu Pro Glu 245 250 255 Lys Phe Pro Val Thr Asp Ala Gln Tyr Gln Ser Val Met Gly Ser Gln 260 265 270 Asp Thr Leu Ala Arg Ala Gly Gln Glu Gly Arg Leu Tyr Leu Leu Asp 275 280 285 Tyr Ala Val Phe Gln Gly Ile Pro Thr Gly Gln Thr Ser Gly Gly Gln 290 295 300 Lys Tyr Ile Glu Ala Pro Leu Ala Leu Phe Ala Val Pro Ala Ala Asn 305 310 315 320 Gln Ala Asp Arg Lys Leu Arg Ala Val Ala Ile Gln Cys Ser Gln Thr 325 330 335 Pro Gly Arg Ser Asn Pro Ile Phe Thr Pro Ala Asp Gly Thr Ser Trp 340 345 350 Ser Leu Ala Arg Leu His Val Gln Val Ala Asp Gly Asn Tyr His Glu 355 360 365 Leu Ile Ala His Leu Gly Leu Thr His Leu Ile Leu Glu Glu Phe Thr 370 375 380 Leu Ser Thr His Arg Gln Leu Ala Pro Gln His Pro Leu Tyr Leu Leu 385 390 395 400 Leu Thr Pro His Phe Gln Gly Thr Leu Ala Ile Asn Asn Ala Ala Glu 405 410 415 Thr Ser Leu Ile Ala Pro Gly Gly Pro Val Asp Gln Leu Leu Ala Gly 420 425 430 Glu Ile Lys Ala Ser Thr Gln Val Ser Ile Gln Ala Val Ala Asn Gln 435 440 445 Ser Ile Asn Gln Ser Phe Leu Pro Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val 450 455 460 Asp Asp Ala Ser Lys Leu Pro Asp Tyr Pro Tyr Arg Asp Asp Ala Leu 465 470 475 480 Leu Leu Trp Asn Asp Ile Arg Ala Trp Val Ser Asp Tyr Leu Ala Ile 485 490 495 Tyr Tyr Asn Asp Asp Ala Ala Val Arg Ser Asp Tyr Glu Leu Gln Pro 500 505 510 Gly Ser Arg Ser Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ser Glx Arg Met Glx 515 520 525 Arg Arg Ala Glu Gly Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ile Trp Trp Thr Glx 530 535 540 Pro Pro Thr Ser Ser Ser Arg Arg Ala Cys Ser Thr Arg Arg Ser Thr 545 550 555 560 Ser Arg Ser Ala Arg Ser Glx Ala Thr Pro Arg Arg Cys Arg Trp Arg 565 570 575 Pro Thr Leu Pro Arg Pro Pro Pro Trp Lys Ser Cys Arg Arg Ala Arg 580 585 590 Ser Glx Pro Thr Cys Arg Arg Cys Arg Trp Pro Ser Cys Ser Arg Arg 595 600 605 Ser Pro Ser Gly Trp Ala Thr Cys Thr Ser Pro Gly Trp Ala Ala Thr 610 615 620 Thr Arg Thr Cys Ala Ser Pro Gly Ser Arg Thr Arg Ala Cys Gly Pro 625 630 635 640 Pro Trp Arg Ser Ser Arg Ser Ala Cys Ala Pro Arg Ser Gly Arg Ser 645 650 655 Ala Ser Ala Thr Cys Arg Ala Ser Pro Thr Arg Arg Cys Cys Pro Arg 660 665 670 Arg Phe Arg Arg Ala Ser Thr Ser 675 680 <210> 3 <211> 2043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> l429A/l430A double mutant of 5,15-lipoxygenase_DNA gene <400> 3 atgcgttcca ttccctccct gccccagaat gactctcccg cccagcagga gctgcgcctc 60 gccacgctca cacaagagcg gcaggtctac gcctacaact tcgacagccg gctgagtccg 120 ctggggatcg cggcccaggt cccccgtcag gacaacttct ccttcgtctg gttggatggc 180 gtcgccacca ccggcctgca gctgctgggc aacgtgctgg ccatcggcgc gaagctcttc 240 gacaacgggg aggcgatcca gaacgacgcc ggcctgtccg agctggagct ccgcagggtc 300 gaggggacct accgggagct gaccgacgga ttcagccggc tgtcggaccg gacctcccgg 360 ctccaccagg cgccgcgctc cccggcggtg acgctcatcg ccgatgtcat cgagcgcccc 420 cggacgctgc tcaaggcggc gggccagaag ctggaggaga ccgccggtgt cgccatcgtc 480 tccgagctcg ccacccaggc cgcgctggat gcgcccgcca tcgggcagga catcctcgac 540 ctcatcgaca ccctgttgaa gaagctgttg tccgaggccg gagatctgtt cctgaagtac 600 ctggggctgt acggcaaggc ggcgtcgctc gacaactaca cggcccagtt ctcgctgctg 660 cagcctccgt cggtcgccag caattacgag accgacctca tcttcgcgcg catgcggctg 720 gccgggccca acccggcgct gctccagggc atcgcggccc tccccgagaa gttcccggtg 780 acggacgcgc agtaccagtc cgtgatgggc tcgcaggaca ccctggcccg cgcgggccag 840 gaaggtcggc tgtacctgct ggactacgcc gtcttccagg gcatccccac cggacagacg 900 tcgggcggac agaagtacat cgaagcgccg ctcgccctgt tcgccgtgcc cgccgcgaac 960 caggccgacc ggaagctgcg cgcggtggcc atccagtgct cgcagacgcc gggccgctcc 1020 aaccccatct tcaccccggc ggacggcacc tcctggagcc tggcgcgcct gcacgtgcag 1080 gtggcggatg gcaactacca cgagctcatc gcgcacctgg gcctcacgca cctgattctg 1140 gaagagttca ccctgtccac gcaccggcag ctcgcgcccc agcacccgct ctacctgctg 1200 ctgacgccgc acttccaggg caccctggcc atcaacaacg ccgcggagac gtccctcatc 1260 gcgcccggtg gcccggtgga ccaggcgctc gccggtgaga tcaaggcctc cacccaggtg 1320 agcatccagg ccgtggccaa ccaatccatc aaccagtcgt tcctgccccg ggcgctggcg 1380 gcccgcgggg tggacgacgc ctcgaagctg ccggactacc cgtaccgcga cgacgcgctg 1440 ctgctctgga acgacatccg cgcctgggtg agcgactacc tggccatcta ctacaacgat 1500 gacgcggcgg tgcggagcga ctacgagctg caggcctggg tcacggagct cgccagcccc 1560 gacgccggca agctgaagga tgtgacggag ggcggagggg gcatccagac cttcgagtat 1620 ctggtggacc tgaccaccta catcatcttc acggcgagcg tgcagcacgc ggcggtcaac 1680 ttcccgcagc gcacggtcat gagctacacc ccggcgctgc cgctggcggc ctacgctccc 1740 gcgcccacct ccgtggaaga gctgccgccg agcacggagc tgacccacct gccgccgttg 1800 cagatggcct tcctgcagca ggcggtcacc ttcgggctgg gcaacgtgta cttcacccgg 1860 ctgggcggct acgacacgta cctgcgcgag ccctggttcg cggacgcgcg cgtgtggccc 1920 gccctggagg tcttccagaa gcgcctgcgc gccacggagc gggagatcgg ccagcgcaac 1980 ctgtcgcgca tcccctacga gacgctgctg cccacggcga ttccgcagag catcaacatc 2040 taa 2043

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서,
상기 리폭시게나아제 변이체는 아르캉기움 비오라시움(Archangium violaceum) 균주 유래 5,15-리폭시게나아제의 아미노산 서열로부터, 429번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로, 430번째 아미노산인 류신(L)을 알라닌(A)으로 각각 치환시킨 것이고,
상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며,
상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜다엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것인, 이수산화지방산의 제조용 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 조성물 내 상기 리폭시게나아제 변이체를 포함하는 전세포의 농도는 0.5 g/L 내지 4 g/L인, 이수산화지방산의 제조용 조성물.
서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 조성물로서,
상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
상기 조성물은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜다엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것인, 이수산화지방산의 제조용 조성물.
제 1항, 제 4항 및 제 5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 이수산화지방산의 제조방법으로서,
상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
상기 기질은 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜다엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는, 이수산화지방산의 제조방법.
삭제
제6항에 있어서,
상기 기질 내 상기 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산의 농도는 1 mM 내지 5 mM인, 이수산화지방산의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 처리는 pH 7.0~9.0 범위에서 수행되는 것인, 이수산화지방산의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 처리는 100mM 내지 400mM 농도의 시스테인과 반응을 통해 수행되는 것인, 이수산화지방산의 제조방법.
서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 리폭시게나아제 변이체 유전자를 유효성분으로 포함하는 이수산화지방산의 제조용 재조합 발현 벡터로서,
상기 이수산화지방산은 5,12-이수산화아라키돈산(5,12-dihydroxyarachidonic acid), 5,12-이수산화에이코사펜타엔산(5,12-dihydroxyeicopentaenoic acid), 7,14-이수산화도코사헥사엔산(7,14-dihydroxydocosahexaenoic acid) 및 7,14-이수산화도코사펜타엔산(7,14-dihydroxydocosapentaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
상기 벡터는 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜다엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 도코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것인, 이수산화지방산의 제조용 재조합 발현 벡터.
숙주세포에 제11항에 따른 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체.