WO2018016814A1 - 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2018016814A1
WO2018016814A1 PCT/KR2017/007637 KR2017007637W WO2018016814A1 WO 2018016814 A1 WO2018016814 A1 WO 2018016814A1 KR 2017007637 W KR2017007637 W KR 2017007637W WO 2018016814 A1 WO2018016814 A1 WO 2018016814A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
variant
bfgf
substituted
amino acid
seq
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/007637
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
신항철
오종광
박연희
Original Assignee
(주)피앤피바이오팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)피앤피바이오팜 filed Critical (주)피앤피바이오팜
Publication of WO2018016814A1 publication Critical patent/WO2018016814A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]

Definitions

  • the present invention relates to a highly stable fibroblast growth factor variant having a modified N-terminal amino acid site and its use, and more particularly, to an N-terminal amino acid of a basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the present invention relates to the production of pure single component high stability bFGF by inhibiting the N-terminal amino acid loss that may occur during production using microorganisms.
  • Growth factors play an important role in regulating cell growth, proliferation and differentiation. Therefore, there is a system that naturally repairs the damage and aging of the skin caused by internal and external factors such as wounds and surgery, and growth factors play an important role here.
  • various growth factors are generated and maintained at a constant concentration. As age increases, the concentration of growth factors in each tissue, such as the skin, is lowered, and aging progresses, as the regeneration and division of cells are weakened, wrinkles are formed, and elasticity is decreased.
  • bFGF is composed of 154 amino acids and is composed of a polypeptide having a molecular weight of 17,123 Daltons. It plays an important role in development, angiogenesis and wound healing. bFGF is a mitogen and chemotactic factor and is known to be a powerful mediator of wound healing, angiogenesis, and growth of the nervous system.
  • bFGF has four cysteine residues that do not form disulfide bonds in its structure. There is a problem that is greatly affected by the stability of having.
  • HsbFGF high stability bFGF
  • the N-terminal heterogeneity problem is misunderstood as an impurity, that is, it is recognized as not a single component, which interferes with the production and quality control of the recombinant protein and must be solved because it is recognized as a low-purity product in the drug licensing process. This is a task that must be done (KFDA B1-2014-3-018).
  • the present invention has been made in view of the above problems and the above-mentioned necessity, and an object of the present invention is to provide a highly stable bFGF N-terminal variant capable of successfully inhibiting N-terminal amino acid loss.
  • Another object of the present invention is to provide a DNA base sequence encoding a bFGF variant.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector comprising the DNA base sequence.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant transformed by the expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing high stability bFGF variant.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic composition for improving skin conditions comprising a high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases comprising a high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • the present invention provides a highly stable bFGF wherein two or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with serine, one or more amino acids are substituted with cysteine, and one amino acid on the surface is substituted with tyrosine. Provide variants.
  • the recombinant protein to be finally produced by introducing a deletion mutation at two amino acid residues of the N-terminal region of the existing high stability bFGF variant and inserting methionine to prevent N-terminal hydrolysis that may occur immediately after expression of the recombinant protein. It was to have a homogeneity of.
  • bFGF is a basic protein (pI 9.58) with a molecular weight of about 18 kDa, which is mainly secreted by the pituitary gland and is known to promote growth of various mesodermal derived cells.
  • bFGF is a protein that promotes the growth of vascular endothelial cells and smooth muscle cells, has an excellent effect on the treatment of trauma and vasculature, increases the synthesis of collagen and elastin, maintains skin elasticity, helps normal cells grow, and It is known to promote the recovery and to perform the healing action.
  • Variants of the present invention through the homogeneous alignment (homology alignment) method of the tertiary structure and species of bFGF and computer molecular protein modeling, by selecting a site unrelated to the active site of bFGF, was prepared through mutation experiments
  • cysteine amino acid residues in which bFGF and other bFGFs form disulfide bonds are replaced with serine residues of similar structure to increase stability against precipitation due to disulfide bonds on the surface.
  • stability is increased by a method of reducing loop entropy by additionally generating disulfide bonds by replacing one residue close to the loop in bFGF with cysteine.
  • hydrogen bonds and van der Waals interactions are increased to stabilize the cavity structure inside the protein structure.
  • the serine-substituted amino acids are the 68th cysteine and 86th cysteine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid substituted with cysteine is 25 lysine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • the variant in which the histidine No. 49 residue, which is a residue exposed on the surface of the protein, is substituted with tyrosine in the variant where the 74th alanine is substituted with cysteine the most preferred variant.
  • the bFGF variant of the present invention is the 68th and 86th amino acid residues of the variant (SEQ ID NO: 1) after removing two amino acid sequences of the N-terminal sequence from the wild-type and adding methionine as a starting sequence.
  • cysteines are substituted with serine, the 49th histidine is substituted with tyrosine, and the 74th amino acid residue, alanine, is further substituted with cysteine to form intramolecular disulfide bonds and the remaining amino acid sequence is identical to the naturally occurring amino acid sequence. Provide variants.
  • the bFGF variant of the present invention is a variant made by inducing a deletion mutation of the N-terminal sequence to the sequence of the aforementioned HsbFGF (KR 10-2015-0078930 / PCT-KR2015-007734).
  • the first and second sequences of proline and alanine at the N-terminus of the existing HsbFGF are induced as deletion mutations and methionine is inserted as a start sequence.
  • the bFGF variant of the present invention has increased heat stability compared to the native form while maintaining protein activity. As shown in Experimental Example 2 below, the bFGF variant has the same activity as the natural type, and it can be seen that the stability against heat was also significantly increased.
  • amino acids 68 and 86 were substituted with serine
  • amino acid 74 was substituted with cysteine
  • the variant K (sbFGF, K74) of the present invention which induced disulfide bonds, was substituted with tyrosine of histidine No. 49 in variant K.
  • variant O HsbFGF
  • the thermal stability was improved than that of the natural type control group.
  • the present invention provides a DNA base sequence (SEQ ID NO: 2) encoding the bFGF variant and an expression vector comprising the same.
  • Expression vectors of the present invention can be prepared by inserting the gene of bFGF in a general expression vector.
  • pET21a vector was used as the expression vector, but the present invention is not limited thereto, and any cell expression vector that can be used generally can be used.
  • a vector in which the bFGF gene was inserted into the pET21a vector was prepared and named "pSSB-bFGF" (FIG. 2).
  • the present invention provides a transformant which is a host cell transformed by the expression vector.
  • the bFGF variant of the present invention can be prepared by transforming a host cell with a vector containing a gene encoding a bFGF variant prepared by site-specific mutation induction and the like, and expressing the bFGF variant by a chemical amino acid synthesis method. Can be prepared.
  • the DNA sequence encoding the bFGF variant is the 68th and 86th codons with the removal of the N-terminal proline and alanine from the native bFGF and the insertion of methionine in place with the codons encoding serine and the 74th codon It was substituted with a codon encoding this cysteine.
  • variant O HsbFGF
  • tyrosine of histidine No. 49 of the variant K the thermal stability superior to the natural type and the variant K (sbFGF) was improved.
  • DNA encoding the bFGF variant may be chemically synthesized or prepared by using a method such as site-specific mutation induction based on the production of native bFGF cDNA.
  • the DNA encoding the bFGF variant of the present invention prepared above can be expressed using any of the appropriate prokaryotic or eukaryotic expression systems well known in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd). ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). Expression is preferably performed in Escherichia coli, eg, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli JM109 (DE3), Escherichia coli NM522, etc.
  • Transformation of host cells by the vector described above can be carried out by any of the conventional methods (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989; Ito et al., J. Bacteriol. 153: 263 , 1983).
  • water-soluble cells capable of absorbing DNA can be prepared, and then treated according to known methods.
  • the present invention provides a method for producing high stability bFGF variant, comprising the steps of: (a) culturing the transformant; And (b) separating the variant from the culture obtained in step (a).
  • step (b) of the method comprises the steps of: (c) cell disrupting the transformant and removing aggregates; (d) separating and purifying the supernatant from which the aggregates have been removed using ion exchange resin chromatography; And (e) separating and purifying the highly stable bFGF variant after the ion exchange resin using heparin affinity chromatography.
  • host microorganisms containing the desired expression vector are cultured at their optimum growth conditions in a range that maximizes the production of the desired protein.
  • E. coli BL21 (DE3) cells transformed with a vector containing an empicillin resistance gene as a selection marker are cultured at 37 ° C in LB medium containing empicillin.
  • Recovery and purification of the produced bFGF variant after culturing the transformed host cell can be carried out by using various methods known in the art or a combination thereof.
  • bFGF variants expressed in transformed E. coli cells can be recovered by extraction from cell culture or by appropriate methods known in the proteomics following cell disruption.
  • the culture medium of recombinant E. coli cells is centrifuged to harvest the cells, and the harvested cells are suspended in lysozyme-added buffer and crushed by ultrasound.
  • the cell lysate is centrifuged to remove aggregates in insoluble granules.
  • the supernatant from which the aggregates are removed is separated and purified using ion exchange resin chromatography, and purified by ion exchange resin followed by heparin affinity chromatography to obtain the resultant high stability bFGF variant.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases comprising the high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • the high stability bFGF variants of the present invention have the same activity as native bFGF, and have very good thermal stability and stability in aqueous solution. Therefore, the composition of the present invention is very effective for the prevention or treatment of skin diseases.
  • the composition of the present invention is such as skin inflammation, acute and chronic eczema, contact dermatitis, atopic dermatitis, seborrheic dermatitis, chronic simple gland, interrogation, deprivation dermatitis, papular urticaria, psoriasis, sun dermatitis and acne. Used for the prevention or treatment of skin diseases.
  • composition of the present invention can provide a composition for treating wounds.
  • the composition of the present invention is used for the treatment of closed wounds and open wounds.
  • closed windows include contusion or bruise
  • open windows include abrasion, laceration, avulsion, penetrated wound and gun-shot wound. .
  • composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the bFGF variant of the invention described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the bFGF variants described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It is not.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, or the like. Can be.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. Meanwhile, the preferred daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets, capsules, or gels (eg, hydrogels), and may further include dispersants or stabilizers. .
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving skin condition comprising the high stability bFGF variant as an active ingredient.
  • the high stability bFGF variants of the present invention have the same activity as native bFGF, and have very good thermal stability and stability in aqueous solution. Therefore, the composition of the present invention is very effective for improving skin condition.
  • the composition of the present invention is used to improve skin conditions such as wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, hair loss prevention or hair growth, skin moisturization improvement, mushroom removal or acne treatment.
  • composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the bFGF variant of the present invention described above; And (b) a cosmetically acceptable carrier.
  • cosmetic effective amount means an amount sufficient to achieve the skin improving efficacy of the composition of the present invention described above.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, including, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • animal oils vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide
  • cellulose derivatives polyethylene glycols
  • silicones bentonites
  • silicas talc or zinc oxide
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the carrier component is aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention include components conventionally used in cosmetic compositions, in addition to the bFGF variant and carrier component as active ingredients, and include, for example, conventional agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. Phosphorus adjuvant.
  • compositions of the present invention include the above-mentioned high-stability bFGF variant of the present invention as an active ingredient, the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the novel HsbFGF variant made through the modification of the N-terminus has excellent thermal stability and stability in aqueous solution, and thus does not lose activity unlike conventional natural bFGF products during distribution and storage, and when produced in microorganisms, It is made of pure single substance and can be used as a material for functional cosmetics and as a therapeutic agent for skin wounds.
  • 1 and 2 show an overview of the assembly of plasmid pSSB-bFGF.
  • Figure 3 is an analysis using SDS-PAGE after the final purification of the native type bFGF and the existing K75 (sbFGF) and the novel HsbFGF (Variant O) developed in the present invention.
  • FIG 4 shows the results of the difference between Tm (melting temperature) which is an indicator of the thermal stability of the natural type of bFGF and K74 (variant K), the existing HsbFGF (existing variant) and the new HsbFGF (variant O).
  • Figure 5 shows the results of stability after incubation for 5 days at 50 °C in phosphate buffer of the natural type bFGF and the existing HsbFGF and novel HsbFGF (Variant O).
  • Figure 6 shows the results of the stability after incubation for 5 days at 60 °C in phosphate buffer of the natural type bFGF and the existing HsbFGF and novel HsbFGF (Variant O).
  • Figure 7 shows the comparison between the natural type of bFGF and the novel HsbFGF (Variant O) of the present invention and the existing HsbFGF activity.
  • FIG 8 shows the N-terminal analysis of the novel HsbFGF (Variant O) of the present invention
  • Figure 9 shows the N-terminal analysis of the existing HsbFGF.
  • 11 and 12 show the results of incubation at 37 ° C. for 100 days with natural bFGF and K74 (variant K), and novel HsbFGF (variant O) of the present invention using SDS-PAGE and HPLC.
  • Figure 13 shows the results of toxicity experiments using L929 cells of novel HsbFGF (Variant O).
  • PET21a (Fig. 1), which is a protein expression vector
  • BL21 (DE3) were purchased from Novagen as the E. coli strain for expression, and Top10 was used as the cloning E. coli strain.
  • Restriction enzymes used for genetic recombination are all NEB (New England Biolabs) product, the ligase is Roche's T4 DNA ligase.
  • Ex taq DNA polymerase used in PCR is a product of Takara and pfuUltra used for point mutation HF DNA polymerase is a product of Agilent.
  • DNA gel extraction kit and plasmid mini prep kit are products of Cosmojintech.
  • primers were produced by Cosmojin Tech Co., Ltd.
  • DNA sequencing was also performed by Cosmojin Tech Co., Ltd.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • ampicillin and chloramphenicol used as antibiotics were all purchased from Sigma.
  • E. coli The bacto tryptone and yeast extract used to make cultured LB medium were purchased from BD (Becton Dicknson), and NaCl was used as a Duksan product.
  • Reagents used in the purification process using the highest purity products, and the reagents used in the purification process are as follows. sodium phosphate monobasic (Sigma), sodium phosphate dibasic (Sigma), sodium chloride (Sigma).
  • the columns used in FPLC were SP-sepharose and heparin affinity columns.
  • the CD used Jasco's J-810 spectropolarimeter.
  • the YASARA Web server was used to predict the formation of disulfide bonds.
  • the plotting program for measuring disulfide bond distances was performed using protein contact map visualization (Andreas Viklund).
  • the amino acid moiety to be changed was found through the structure of the protein (PDB: 4FGF) and the molecular model method, and amplified by the Quickchange mutagenesis method using pfuUltra HF DNA polymerase with the following primer (Example 2). .
  • the DpnI reaction was performed and transformed to Top10, and mutants were identified through sequencing.
  • Candidate groups capable of disulfide bonds were set using 1BLA (NMR), the structure of proteins registered in PDB.
  • the protein contact map visualization program was used to analyze residues with C-alpha carbon of less than 7 ⁇ and C-beta carbon of 5 ⁇ .
  • the formation of disulfide bonds was analyzed using a Yasara energy minimization server, and energy minimization was performed using the AMBER force field FF99 of chimera.
  • the structure of the produced protein was aligned with the bFGF of the natural type, and the structure having a value of less than 0.5 was measured by RMSD.
  • bFGF is constant to 0.2 mg / ml, respectively.
  • band width 1 nm is analyzed.
  • data pitch 0.1 nm scanning speed 20 nm / min, pathlength length 1 cm, accumulation No. 8, temperature at 20 °C was analyzed.
  • the melting temperature was performed at a concentration of 0.2 mg / ml in a 0.1 cm cuvette at 205 nm wavelength at 20 °C and 95 °C. The conditions were measured from 20 degreeC to 95 degreeC on condition of 1 degree-C / min.
  • NIH-3T3 and L929 cells used in the experiment were maintained using DMEM complete medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, and 100 mg / ml streptomycin. 2x10 3 cells / well of NIH-3T3 cells were seeded on a 96 well culture plate. The NIH-3T3 cells incubated for 24 hours were treated with sample solution in DMEM medium containing 0.5% FBS for each concentration after starvation with serum-free DMEM medium, and cultured for 72 hours.
  • MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution was added and reacted for 2 hours, followed by formazan crystal with 100 ul of DMSO. Was dissolved. Absorbance was measured at 540 nm using a spectrophotometer. Drug susceptibility was compared as a percentage of drug-treated wells for absorbance of untreated drug (control).
  • Incubation test of the native type bFGF and the variant was carried out to confirm the storage degree at room temperature.
  • Each native bFGF and its variants were dissolved at 0.5 mg / ml in 1X PBS (pH 7.2) and incubated in 37 °C, 50 °C and 60 °C water baths. After sampling for 24 hours, centrifugation at 13000 rpm for 15 minutes at 4 °C to obtain only the supernatant and quantitative analysis and HPLC analysis by nano drop.
  • Human mononuclear cDNA library was used as a template, and DNA encoding bFGF was prepared by polymerase chain reaction using a primer.
  • the base sequence of the primer used is as follows:
  • Sense primer 5'-GGCGGGCATATGTTGCCCGAGG-3 '
  • Antisense Primer 3'-CCTCGGGCAACATATGCCCGCC-5 '.
  • the bFGF portion of FIG. 2 was amplified using the primers specified above, and 1 ug of the amplified DNA fragment was dissolved in 50 ul TE (pH8.0) solution, followed by 2 units of NdeI (NEB) and 2 units of After mixing with BamHI (NEB), the reaction was carried out at 37 °C for 2 hours to have a NdeI restriction enzyme site at the 5'-end and BamHI restriction site at the 3'-end. After only DNA was purified using a DNA purification kit (GeneAll), 10 ul of 20 ng of this DNA fragment was treated with 20 ng of pET21a (+) plasmid prepared by NdeI and BamHI in the same manner.
  • the expression plasmid thus prepared was transformed into heat shock in E. coli BL21 (DE3). After transformation, colonies resistant to ampicillin in solid medium were selected and inoculated into 10 ml of LB medium (LB / ampicillin). The selected expression strains were incubated at 37 ° C. for 12 hours, mixed with 100% glycerol 1: 1, and stored at ⁇ 70 ° C.
  • Expression strains were inoculated in 10 ml of LB medium (LB / ampicillin) and then cultured for 12 hours or more. Thereafter, 500 ml of LB medium (LB / ampicillin) was transferred to an absorbent OD 600 of 0.4 to 0.5, and IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside) was added to a final concentration of 0.5 mM. After shaking for 4 hours at 37 °C shaking culture at 200 rpm centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to obtain E. coli pellets (pellets) cells were disrupted by ultrasonic treatment. Then SP and heparin column purification using FPLC. After confirming the fraction containing bFGF for each fraction through the SDS-PAGE analysis, it was quantitated by Bradford assay method, and as a result 10 ⁇ 18 mg of bFGF was obtained.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • PSSB-bFGF variant plasmids were made by PCR using two complementary primers corresponding to the respective variants using HF DNA polymerase. Variant plasmids were identified.
  • the base sequence of the primer used is as follows:
  • the codon of the 25th lysine is substituted with TGC, the codon of cysteine, the sense primer 5'-AAG CGG CTG TAC TGC TGC AAC GGG GGC TTC TTC-3 'and the antisense primer 3'-GAA GAA GCC CCC GTT GCA GCA GTA CAG CCG CTT-5 ';
  • GTG the codon of the 67th valine, was substituted with TGC, the codon of cysteine Sense Primer 5'-GTG TCT ATC AAA GGA TGC TCT GCT AAC CGT TAC-3 'and Antisense Primer 3'-GTA ACG GTT AGC AGA GCA TCC TTT GAT AGA CAC-5 ';
  • Senseprimer 5'-GAT GGA AGA TTA CTG TGC TCT AAA TCT GTT ACG-3 'and antisense primer 3'-CGT AAC AGA TTT AGA GCA CAG TAA TCT TCC ATC-5 ';
  • bFGF Variant Incubated in 500 ml LB medium (LB / ampicillin) and purified in the same manner as in Example 1 to obtain bFGFs each having a size of about 18 KDa. At this time, the amount of the mutant was different depending on the mutant, and about 4 to 12 mg of bFGF was obtained according to the mutant, and the purity was more than 98%.
  • Each bFGF variant is as follows.
  • the dimer and trimer were observed in the natural form, whereas the variant (HsbFGF) was found to exist in the form of a single band in the monomer size. This data shows that inactive dimers and trimers are completely removed and present in monomeric state.
  • Example 3 The structure and thermal stability of the purified bFGF variant of Example 3 were measured by circular dichroism analysis using J-810 spectropolarimeter (JASCO). Natural bFGF was used bFGF purified in Example 1. For structural analysis, each bFGF is dissolved in 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) to make a final concentration of 0.1 mg / ml. And then put in 0.1 cm cell, band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm / min, cell length 1 cm, accumulation No. 8, temperature at 20 °C Was analyzed.
  • Tm was determined by comparing far-UV at 20 °C and 95 °C to determine the wavelength of 208 nm and proceeded to 0.1 mg / ml concentration in 0.1 cm cuvette. The conditions were measured from 20 degreeC to 95 degreeC on condition of 1 degree-C / min. The results are shown in Table 1.
  • Variant bFGF Name Structural change (Tm) Variant bFGF Name Structural change (Tm) Variant bFGF Name Structural change (Tm) BFGF of the present invention (SEQ ID NO: 1) -(57.5 °C) Variant AC68S, C86SI33C, G66C (SEQ ID NO: 3) 48 °C Variants BC68S, C86SI33C, A69C (SEQ ID NO: 4) No change Variant CC68S, C86SI33C, A83C (SEQ ID NO: 5) No change Variant DC68S, C86SV39C, L81C (SEQ ID NO: 6) No change Variant EC68S, C86SV39C, A83C (SEQ ID NO: 7) No change Variant FC68S, C86SH49C (SEQ ID NO: 8) No change Variants GC68S, C86SK51C, V67C (SEQ ID NO: 9) No change Variants HC
  • Table 1 shows the results of measuring unfolded fraction by temperature at wavelength of 208 nm during circular dichroism analysis, which is a measure of the degree of structural change and thermal stability of native bFGF and bFGF variants.
  • the structural change is shown in the region around 208 nm, and the accurate Tm value was analyzed by measuring the Tm within the range of 20 ⁇ 95 °C.
  • SEQ ID NO: 1 is a variant in which the methionine is added as a starting sequence after removing two amino acid sequences of the N-terminal sequence from the natural sequence.
  • Cell proliferation assay was performed by selecting bFGF which showed good results through analysis of structure and Tm using solubility and circular dichroism among natural bFGF and variants.
  • Cell proliferation assays were performed with the NIH-3T3 cell line, a skin cell sensitive to bFGF.
  • NIH-3T3 cells were maintained using DMEM complete medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, and 100 mg / ml streptomycin. Seed the NIH-3T3 cells of 2x10 3 cells / well in a 96 well culture plate.
  • NIH-3T3 cells incubated for 24 hours were treated with serum-free DMEM medium, and then sample solution was treated in DMEM medium containing 0.5% FBS for each concentration, followed by incubation for 72 hours. After incubation, 10 ul of MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution was added and reacted for 2 hours, followed by a formazan crystal with 100 ul of DMSO. Was dissolved. Absorbance was measured at 540 nm using a spectrophotometer. Drug susceptibility was compared as a percentage of drug-treated wells for absorbance of untreated drug (control).
  • the new HsbFGF was confirmed that the SDS-PAGE and HPLC analysis is preserved only after 100 days.
  • Mouse L929 cells (ECACC, no. 85011425) were maintained using DMEM complete medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin. Seed the NIH-3T3 cells of 5x10 3 cells / well in a 96 well culture plate. L929 cells were incubated for 24 hours, sample solution was treated for each concentration, and incubated for 24 hours. After incubation, 10 ul of MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] solution was added and reacted for 2 hours, followed by a formazan crystal with 100 ul of DMSO.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • Edman N-terminal analysis was performed on the purified protein through the above procedure at Korea Institute of Mass Spectrometry. Prepare to be 0.5 mg / ml. Soak PVDF membrane in 100% MeOH for 30 seconds to 1 minute. Then transfer using 0.45 um PVDF membrane. Immerse the blotting finished membrane in tertiary distilled water for 5 minutes. Dyeing is done within 5 minutes using dyeing reagent. After discarding the dyeing reagent, bleaching is performed immediately using a bleaching reagent. When the band of protein is clearly visible, discard the decolorizing reagent and wash it with 3rd distilled water. Air dry the membrane after washing.
  • the remaining PITC reagent remains during the coupling of the N-terminal amino acid with the PITC reagent, which is shown in the mass spectrometry, which is not related to the N-terminal amino acid.
  • Dptu in the following peak is a reagent used as a reference in separation using chromatography as a reference and standard reagent.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 고안정성 bFGF의 N-말단 아미노산 서열의 변형을 통하여 미생물을 이용한 생산과정에서의 분해를 억제함으로써 생산성을 증가시킨 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 서열번호 1 의 아미노산 서열 내 2 개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1 개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된, 고안정성 bFGF 변이체에 N-말단의 결실 및 삽입 돌연변이를 유래한 변이체, 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열, 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 bFGF 변이체 생산 방법, 및 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 bFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않는 기능성화장품 및 피부 염증 치료제의 생산이 가능하다.

Description

변형된 N-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도
본 발명은 변형된 N-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF, basic fibroblast growth factor)의 N-말단 아미노산 서열의 변형을 통하여, 미생물을 이용한 생산과정에서 나타날 수 있는 N-말단의 아미노산 소실을 억제하여 순수한 단일성분의 고안정성 bFGF를 생산하는 것에 관한 것이다.
성장인자는 세포의 성장, 증식, 분화를 조절하는 중요한 역할을 수행한다. 따라서 우리 몸은 상처, 수술 등 내적 및 외적요인에 의한 피부의 손상과 노화에 대해 자연적으로 수리하는 시스템이 존재하며 여기서 중요한 역할을 담당하는 것이 성장인자들이다. 각 조직의 기능을 유지하기 위해 각종 성장인자들 등이 생성되어 일정농도로 유지되면서 기능을 수행하고 있다. 나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다.
그 중 bFGF는 154 개의 아미노산으로 구성되어있으며, 분자량 17,123 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드로 구성되어 있다. 이는 발생, 혈관생성 그리고 상처치유에 중요한 역할을 한다. bFGF는 마이토젠(mitogen)과 화학주성인자(chemotactic factor)로써, 상처 치유, 혈관생성, 그리고 신경계의 성장에서 강력한 매개체로 알려져 있다.
그러나, 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 성장인자들의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, 특히 bFGF의 경우 그 구조상에 이황화결합(disulfide bond)을 형성하지 않는 4 개의 시스테인(cysteine) 잔기를 가짐으로 인하여 그 안정성에 많은 영향을 받는다는 문제점이 있다.
또한, bFGF와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 혈액 내 반감기 및 단백질분해효소에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 방해한다. bFGF를 더욱 효과적으로 용도를 개선하기 위해서는 체내에서의 안정성 외에도 체외에서의 물리 화학적 안정성을 향상시켜야 의약품 및 화장품의 제조, 보관, 유통과정에 사용이 증가할 것이다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 피앤피바이오팜에서는 2016년 고안정성 bFGF(HsbFGF라고 명명됨)를 개발한 바 있다(KR 10-2015-0078930/PCT-KR2015-007734).
하지만, 고안정성 bFGF를 대장균을 이용하여 생산하는 경우, bFGF의 N-말단이 아미노펩티디아제(aminopeptidase)에 의하여 일부 가수분해되어 bFGF의 N-말단부분에서 일부 아미노산의 손실이 일어나게 된다. 이로 인해 고안정성 bFGF 최종 정제물은 N-말단이 서로 다른 개체들이 섞여 있게 되고, 추가적으로 분리하기도 쉽지 않은 문제가 생긴다.
즉, 이러한 N-말단 비균질성(heterogeneity) 문제는 불순물로 오인되는 즉, 단일성분이 아닌 것으로 인식되어 재조합 단백질의 생산 및 품질관리에 지장을 주며, 의약품 인허가과정에서 저순도 생산품으로 인식되기 때문에 반드시 해결해야만 하는 과제이다(식약처가이드라인. B1-2014-3-018).
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 성공적으로 N-말단 아미노산 소실을 억제할 수 있는 고안정성 bFGF N-말단 변이체(mutant)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체 생산방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2 개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1 개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 표면의 아미노산 1개가 타이로신으로 치환된 고안정성 bFGF 변이체를 제공한다.
더욱 바람직하게는 기존 고안정성 bFGF 변이체의 N-말단부위의 2 개의 아미노산 잔기에 결실돌연변이를 도입하고, 메치오닌을 삽입하여 재조합단백질 발현 직후 발생할 수 있는 N-말단 가수분해를 막음으로써 최종 생산될 재조합단백질의 균질성을 갖도록 하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 bFGF는 분자량 약 18 kDa에 달하는 염기성 단백질(pI 9.58)로서 뇌하수체에서 주로 분비되며 다양한 중배엽 유래 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 혈관 내막 세포 및 평활근 세포의 성장을 촉진하는 단백질로서 외상치료 및 맥관 형성에 탁월한 효능을 나타내고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 유지하며, 정상적인 세포의 성장을 돕고 상처로부터의 회복을 촉진하고, 그 치유작용을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 변이체는, bFGF의 3 차 구조와 종간의 상동성 정렬(homology alignment) 방법 및 컴퓨터를 이용한 단백질 분자 모델링을 통해, bFGF의 활성부위와 관련 없는 부위를 선정하고, 변이실험을 통해 제조된 변이체로서, bFGF와 다른 bFGF가 이황화결합을 형성하는 시스테인 아미노산 잔기가 유사한 구조의 세린 잔기로 치환되어 표면의 이황화결합으로 인한 침전에 대하여 안정성이 증가된다. 또한, bFGF 내 루프에서 가까운 잔기 1개를 시스테인으로 치환시켜 이황화결합을 추가적으로 생성시킴으로써 루프 엔트로피(loop entropy)를 감소시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다. 또한, bFGF 내에 히스티딘 잔기를 타이로신으로 치환함으로써 수소결합 및 반데르발스결합(van der Waals interaction)을 증가시켜 단백질 구조 내부의 구멍(cavity) 구조를 안정시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세린으로 치환된 아미노산은 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 68 번째 시스테인 및 86 번째 시스테인이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시스테인으로 치환된 아미노산은, 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 25 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 33 번째 아이소루신; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 39 번째 발린; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 49 번째 히스티딘; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 51 번째 라이신; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 74 번째 알라닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 75 번째 메치오닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 116 번째 알라닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 66 번째 글라이신; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 67 번째 발린; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 69 번째 알라닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 81 번째 루이신; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 83 번째 알라닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 107 번째 세린; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 135 번째 알라닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 136 번째 아이소루신; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 137 번째 루이신; 및 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 143 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 39 번째 발린; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 49 번째 히스티딘; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 51 번째 라이신; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 74 번째 알라닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 75 번째 메치오닌; 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 116 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 74 번째 알라닌이다.
추가적인 변이체로 74 번째 알라닌을 시스테인으로 치환한 변이체에 단백질 표면에 노출된 잔기인 히스티딘 49 번 잔기를 타이로신으로 치환한 변이체가 가장 바람직한 변이체이다. 즉, 본 발명의 bFGF 변이체는 천연형 서열(wild-type)에서 N-말단의 2 개의 아미노산서열을 제거한 후 시작서열로 메치오닌을 추가한 변이체(서열번호 1)의 68 번째 및 86 번째 아미노산 잔기인 시스테인이 모두 세린으로 치환되고, 49 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환되고, 74 번째 아미노산 잔기인 알라닌이 시스테인으로 추가 치환되어, 분자 내 이황화결합을 형성하고 나머지 아미노산 서열은 천연형의 아미노산 서열과 동일한 인간 bFGF 변이체을 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 위에 언급된 기존 HsbFGF(KR 10-2015-0078930/PCT-KR2015-007734)의 서열에 N-말단의 서열의 결실 돌연변이를 유도하여 만들어진 변이체이다.
더욱 바람직하게는 기존 HsbFGF의 N-말단의 첫 번째와 두 번째 서열인 프롤린과 알라닌을 결실돌연변이를 유도하고 메치오닌을 삽입하여 시작서열로 추가하였다.
본 발명의 bFGF 변이체는 단백질 활성은 유지하면서 열에 대한 안정성이 천연형에 비해 증가한다. 하기 실험 예 2에서 보는 바와 같이 bFGF 변이체는 천연형과 동등한 활성을 지니고 있으며, 열에 대한 안정성이 역시 현저히 증가되었음을 알 수 있다. bFGF 변이체 중에서 68 과 86 번 아미노산을 세린으로 치환하고, 74 번 아미노산을 시스테인으로 치환한 후 이황화결합을 유도한 본 발명의 변이체 K(sbFGF, K74)와 변이체 K에 49 번 히스티딘의 타이로신으로 치환된 변이체 O(HsbFGF)의 경우 대조군인 천연형 보다 열안정성이 향상되었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기서열(서열번호 2) 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현벡터는 일반적인 발현용 벡터에 bFGF의 유전자를 삽입하여 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예 에서는 발현용 벡터로 pET21a 벡터를 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 사용할 수 있는 모든 세포 발현용 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예 에서는 pET21a 벡터에 bFGF 유전자를 삽입한 벡터를 제조하고, 이를 "pSSB-bFGF"라 명명하였다(도 2).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포인 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 부위특이 돌연변이 유도법 등에 의해 제조한 bFGF 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질 전환시켜 bFGF 변이체를 발현시키는 방법으로 제조할 수 있으며, 또한 화학적 아미노산 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 서열로서 바람직한 것은 천연형 bFGF로부터 N-말단의 프롤린과 알라닌이 제거되고 그 자리에 메치오닌이 삽입된 68 번째와 86 번째 코돈이 세린을 코딩하는 코돈으로 치환되고, 74 번째 코돈이 시스테인을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이다. 또한 상기 변이체 K의 49 번 히스티딘의 타이로신으로 치환된 변이체 O(HsbFGF)의 경우 대조군인 천연형 및 변이체 K(sbFGF)보다 뛰어난 열안정성이 향상되었다.
한편, 코돈의 축중현상(degeneracy)에 의해 하나의 아미노산을 코딩하는 코돈이 다수 존재하므로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA라도 그 뉴클레오티드 서열이 다를 수 있음은 주지된 사실이다. 이와 같은 bFGF 변이체을 코딩하는 DNA는 화학적으로 합성하거나 천연형 bFGF cDNA를 제조하여 이를 바탕으로 부위특이 돌연변이 유도법 등의 방법을 사용하여 제조할 수도 있다.
상기 제조된 본 발명의 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA는 당 분야에 잘 공지된 적당한 원핵 또는 진핵 발현 시스템 중 어느 하나를 사용하여 이를 발현시킬 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). 발현은 당화되지 않은 bFGF 변이체의 경우 바람직하게는 대장균, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109(DE3), 대장균 NM522 등에서 수행되며, 대장균에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 적당한 벡터들은 샘브룩 등의 문헌(상동) 및 피어스(Fiers)등의 논문("Proced. 8th Int. Biotechnology Symposium", Soc. Frac. de Microbiol., Paris,(Durand et al., eds.), pp. 680-697, 1988)에 언급되어 있다.
상술한 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환은 통상적인 방법 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989; Ito et al., J. Bacteriol. 153:263, 1983). 대장균을 형질 전환시킬 경우, DNA를 흡수할 수 있는 수용성 세포(competent cell)를 준비하고, 이어서 공지된 방법 등에 따라 처리할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 고안정성 bFGF변이체 생산 방법을 제공한다: (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법의 (b) 단계는, (c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 제거하는 단계; (d) 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및 (e) 상기 이온교환 수지 후 고안정성 bFGF 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 목적 발현 벡터를 함유하는 숙주 미생물은 목적 단백질의 생산을 최대화하는 범위에서 그들의 최적 성장 조건에서 배양된다. 예를 들면, 엠피실린 저항 유전자를 선택 표지로 포함하는 벡터로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3) 세포는 엠피실린이 포함된 LB 배지에서 37℃로 배양한다.
형질 전환된 숙주세포를 배양한 후 생산된 bFGF 변이체의 회수 및 정제는 당해 분야에 공지된 여러 방법 또는 그들을 조합하여 사용함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환된 대장균 세포에서 발현된 bFGF 변이체는 세포 배양물로부터 또는 세포의 파쇄 후에 단백질화학분야에 공지된 적합한 방법에 의해 추출함으로써 회수될 수 있다.
바람직하게는, bFGF 변이체를 정제하기 위해, 재조합 대장균 세포의 배양액을 원심 분리하여 세포를 수확하고, 수확한 세포를 리소자임이 첨가된 완충용액에 현탁시키고 초음파로 파쇄한다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 불용성 과립형태의 응집체를 제거한다. 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제하고, 이온교환 수지 후 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하여 결과물인 고안정성 bFGF 변이체를 획득한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 피부 염증, 급ㆍ만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성 단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름과 같은 피부 질환의 예방 또는 치료에 이용된다.
또한, 본 발명의 조성물은 창상 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 폐쇄창(closed wound) 및 개방창(open wound)의 치료에 이용된다. 폐쇄창의 예는 좌상(contusion or bruise)을 포함하고, 개방창의 예는 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 결출상(avulsion), 관통상(penetrated wound) 및 총상(gun-shot wound)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 유효량"은 상술한 bFGF 변이체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제조에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선에 이용된다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장료 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 bFGF 변이체와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물들은 상술한 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 의하면, N-말단의 변형을 통해 만들어진 신규 HsbFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않으며 미생물에서 생산 시, 순수한 단일물질로 만들어지는 물질이며 이는 기능성 화장품의 소재 및 피부창상 치료제 등으로 활용이 가능하다.
도 1 및 2는 플라스미드 pSSB-bFGF의 조립에 관한 개요를 보여준다.
도 3은 천연형 bFGF와 기존 발명의 K75(sbFGF)와 본 발명에서 개발한 신규 HsbFGF(변이체 O)의 최종 정제 후 SDS-PAGE를 이용한 분석이다.
도 4은 천연형 bFGF와 K74(변이체 K), 기존 HsbFGF(기존 발명의 변이체)와 신규 HsbFGF(변이체 O)의 열안정성의 지표인 Tm(melting temperature) 의 차이 결과를 보여준다.
도 5는 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF 및 신규 HsbFGF(변이체 O)의 인산완충액 상태에서 50 ℃ 에서 5일간 incubation한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 6은 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF와 신규 HsbFGF(변이체 O)의 인산완충액 상태에서 60 ℃ 에서 5일간 incubation한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 7은 천연형 bFGF와 본 발명의 신규 HsbFGF(변이체 O)와 기존 HsbFGF 활성 비교결과를 보여준다.
도 8은 본 발명의 신규 HsbFGF(변이체 O)의 N-말단 분석결과를 나타내고, 도 9는 기존 HsbFGF의 N-말단 분석결과를 나타낸다.
도 10은 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF 변이체, 신규 HsbFGF(변이체 O)의 37℃ 1달간 incubation 결과를 농도 정량을 통하여 분석한 결과이다.
도 11 및 12는 본 발명의 천연형 bFGF와 K74(변이체 K), 그리고 신규 HsbFGF(변이체 O)의 37℃ 100일간 incubation 결과를 SDS-PAGE와 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 13은 신규 HsbFGF(변이체 O)의 L929세포를 이용한 독성실험 결과이다.
이하, 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험방법 및 재료
DNA 주형제작(construction)
단백질 발현 벡터인 pET21a(도 1)와 발현용 E. coli 균주로는 BL21(DE3)을 Novagen에서 구입하였으며 cloning용 E. coli 균주는 Top10을 사용하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 NEB(New England Biolabs)의 제품이며, ligase는 Roche사의 T4 DNA ligase이다. PCR시 사용된 Ex taq DNA polymerase는 Takara사의 제품이며 점 돌연변이에 사용된 pfuUltra HF DNA polymerase는 Agilent사의 제품이다. DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 (주)코스모진텍의 제품이다. 또한, 프라이머들은 (주)코스모진텍에서 제작하였으며, DNA sequencing도 (주)코스모진텍에 의뢰하여 수행하였다.
단백질 발현(Protein expression)
발현 유도체인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 항생제로 쓰인 앰피실린과 클로람페니콜은 모두 Sigma에서 구입하였다. E. coli 배양 LB배지를 만들 때 사용한 bacto tryptone, yeast extract는 BD(Becton Dicknson)사에서 구입하였으며, NaCl은 덕산 제품을 사용하였다.
단백질 정제(Protein purification)
정제과정에 사용되는 시약은 최대한 순도가 높은 제품을 사용하였으며, 정제 과정에서 사용한 시약은 다음과 같다. sodium phosphate monobasic(Sigma), sodium phosphate dibasic(Sigma), sodium chloride(Sigma)이다. FPLC에서 사용된 column은 SP-sepharose, 헤파린 친화 칼럼을 사용하였다.
FPLC
FPLC는 GE UPC-800을 사용하였다.
CD(Circular dichroism )
CD는 Jasco사의 J-810 spectropolarimeter를 사용하였다.
상동성 모델링 (Homology modeling)
Homology modeling은 Modeller(Andrej Sali)를 이용하였다.
에너지 최소화(Energy minimization)
에너지최소화는 Chimera에 포함된 Amber 99FF force field를 사용하였다.
이황화결합 예측(Disulfide predict)
이황화 결합의 형성에 따른 예측은 YASARA Web server를 이용하였다.
이황화결합 거리 측정
이황화결합이 가능한 거리를 측정해주는 plotting program은 Protein contact map visualization (Andreas Viklund)을 이용하였다.
점 돌연변이(Point mutation)
bFGF의 안정성을 증가시키기 위하여 단백질의 구조(PDB:4FGF)와 분자모델방법을 통하여 변화시킬 아미노산 부분을 찾았고, 하기 프라이머(실시예 2)로 pfuUltra HF DNA polymerase를 이용하여 Quickchange mutagenesis 방법을 통해 증폭시켰다. 사용한 천연형 bFGF 주형을 제거하기 위하여 DpnI 반응을 진행하여 Top10에 형질전환(transformation)시켰고, 서열분석을 통하여 변이체(mutant)를 확인하였다.
분자 모델링 (Molecular modeling)
PDB에 등록된 단백질의 구조인 1BLA(NMR)을 이용하여 이황화 결합이 가능한 후보군을 설정하였다. Protein contact map visualization 프로그램을 이용하여 두 개의 아미노산의 C-alpha 탄소의 거리가 7Å 이하, C-beta 탄소의 거리가 5 Å인 잔기를 plot 을 이용하여 분석하였다. 이후 Yasara energy minimization server를 이용하여 이황화결합의 생성유무를 분석 하였고 chimera의 AMBER force field FF99를 이용하여 에너지 최소화를 진행하였다. 이후 생성된 단백질의 구조를 천연형의 bFGF와 구조 정렬하여 RMSD를 측정 0.5이하인 값을 갖는 구조를 실험으로 진행하였다.
CD(Circular dichroism )
천연형 bFGF와 변이체의 구조분석 및 Tm 측정을 위하여 각각 bFGF를 0.2 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, pathlength length 1 cm, accumulation 8 번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다. 온도 안정도를 분석하기 위하여 melting temperature는 20 ℃와 95 ℃에서의 205 nm 파장에서 0.1 cm 큐벳에 0.2 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~ 95 ℃까지 측정하였다.
세포 증식 분석 및 독성실험(cell proliferation assay)
만들어진 천연형 bFGF와 변이체가 실제로 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 세포 증식 능력을 이용한 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 NIH-3T3, L929 cell 은 10 % 열불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete 배지를 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 분주(seeding)하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample 용액을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다.
장기보존실험(Incubation test)
실온에서 보존정도를 확인하기 위하여 천연형 bFGF와 변이체의 incubation test를 진행하였다. 1X PBS(pH 7.2)에서 각각의 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37 ℃, 50 ℃ 와 60 ℃ 수조에서 incubation을 하였다. 24 시간 단위로 sampling하여 13000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 nano drop을 통한 정량 및 HPLC 분석을 진행하였다.
<실시예 1: 사람 bFGF cDNA를 포함하는 pSSB-bFGF 플라스미드의 구축 및 정제>
사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄 반응에 의해 bFGF를 코딩 하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
센스 프라이머:5'-GGCGGGCATATGTTGCCCGAGG-3'
안티센스 프라이머:3'-CCTCGGGCAACATATGCCCGCC-5'.
도 2의 bFGF 부분을 상기에 명시된 프라이머를 이용하여 증폭하였고, 증폭된 DNA 절편 1 ug을 50 ul TE(pH8.0) 용액에 녹인 후 2 단위(unit)의 NdeI(NEB사)과 2 단위의 BamHI(NEB사)과 섞은 후, 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켜 5'-말단에 NdeI 제한효소 부위와 3'-말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하였다. DNA 정제 키트(GeneAll사)를 사용하여 DNA만을 정제한 후, 이 DNA 절편 20 ng을 동일한 방법으로 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 준비한 20 ng의 pET21a(+) 플라스미드(Novagen사)와 함께 10 ul의 TE(pH 8.0) 용액에 섞은 후, 1 단위의 T4 DNA리가제(NEB사)를 첨가하여 16 ℃에서 4 시간 동안 반응시켜 접합시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pSSB-bFGF이라고 명명하였다. 이렇게 제조된 발현 플라스미드로 E. coli BL21(DE3)에 heat shock으로 형질전환시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종하였다. 선별된 발현균주를 37 ℃에서 12 시간 동안 배양한 후 100 % 글리세롤과 1:1 로 섞어 -70 ℃에 보관하였다.
발현균주를 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종한 후 12 시간 이상 배양하였다. 그 후 500 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 옮겨 흡광도 O.D600 0.4 ~ 0.5일 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37 ℃에서 4 시간 동안 200 rpm 속도로 진탕 배양한 후 8000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 얻었다 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다. 그 후 FPLC를 이용하여 SP 및 헤파린 칼럼 정제하였다. 각 분획에 대하여 SDS-PAGE 분석법을 통하여 bFGF가 포함된 분획을 확인 후, Bradford assay 법으로 정량을 진행하였고 결과적으로 10 ~ 18 mg의 bFGF를 획득하였다.
<실시예 2: pSSB-bFGF 변이체 플라스미드의 구축>
천연형의 pSSB-bFGF 플라스미드를 주형으로 pfuUltra HF DNA 중합효소를 이용하여 각각의 변이체들에 해당하는 두 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 pSSB-bFGF 변이체 플라스미드들을 만들었다. 변이체 플라스미드를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
68 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TCT ATC AAA GGA GTG TCT GCT AAC CGT TAC CTG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CAG GTA ACG GTT AGC AGA CAC TCC TTT GAT AGA-5';
86 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TTA CTG GCT TCT AAA TCT GTT ACG GAT GAG TGT-3' 및 안티센스프라이머 3'-ACA CTC ATC CGT AAC AGA TTT AGA AGC CAG TAA-5';
74 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-GCT AAC CGT TAC CTG TGC ATG AAG GAA GAT GGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCC ATC TTC CTT CAT GCA CAG GTA ACG GTT AGC-5';
25 번째 라이신의 코돈인 AAA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG CGG CTG TAC TGC TGC AAC GGG GGC TTC TTC-3'및 안티센스프라이머 3'-GAA GAA GCC CCC GTT GCA GCA GTA CAG CCG CTT-5';
33 번째 아이소루신의 코돈인 ATC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGC TTC TTC CTG CGC TGC CAC CCC GAC GGC CGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCG GCC GTC GGG GTG GCA GCG CAG GAA GAA GCC-5';
39 번째 발린의 코돈인 GTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CAC CCC GAC GGC CGA TGC GAC GGG GTC CGG GAG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CTC CCG GAC CCC GTC GCA TCG GCC GTC GGG GTG-5';
49 번째 히스티딘의 CAC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TGC ATC AAG CTA CAA CTT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT GCA AGG GTC GCT CTT CTC-5';
51 번째 라이신의 코돈인 AAG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AGC GAC CCT CAC ATC TGC CTA CAA CTT CAA GCA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TGC TTG AAG TTG TAG GCA GAT GTG AGG GTC GCT-5';
75 번째 메치오닌의 코돈인 ATG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAC CGT TAC CTG GCT TGC AAG GAA GAT GGA AGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCT TCC ATC TTC CTT GCA AGC CAG GTA ACG GTT-5';
116 번째 알라닌의 코돈인 GCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ACC AGT TGG TAT GTG TGC CTG AAG CGA ACT GGG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CCC AGT TCG CTT CAG GCA CAC ATA CCA ACT GGT-5';
66 번째 글라이신의 코돈인 GGA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GTT GTG TCT ATC AAA TGC GTG TCT GCT AAC CGT-3' 및 안티센스프라이머 3'-ACG GTT AGC AGA CAC GCA TTT GAT AGA CAC AAC-5';
67 번째 발린의 코돈인 GTG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환 센스프라이머 5'-GTG TCT ATC AAA GGA TGC TCT GCT AAC CGT TAC-3' 및 안티센스프라이머 3'-GTA ACG GTT AGC AGA GCA TCC TTT GAT AGA CAC-5';
69 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ATC AAA GGA GTG TCT TGC AAC CGT TAC CTG GCT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AGC CAG GTA ACG GTT GCA AGA CAC TCC TTT GAT-5';
83 번째 루이신의 코돈인 TTA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG GAA GAT GGA AGA TGC CTG GCT TCT AAA TCT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AGA TTT AGA AGC CAG GCA TCT TCC ATC TTC CTT-5';
85 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAT GGA AGA TTA CTG TGC TCT AAA TCT GTT ACG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CGT AAC AGA TTT AGA GCA CAG TAA TCT TCC ATC-5';
107 번째 세린의 코돈인 TCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TAC AAT ACT TAC CGG TGC AGG AAA TAC ACC AGT-3' 및 안티센스프라이머 3'-ACT GGT GTA TTT CCT GCA CCG GTA AGT ATT GTA-5';
135 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGA CCT GGG CAG AAA TGC ATA CTT TTT CTT CCA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TGG AAG AAA AAG TAT GCA TTT CTG CCC AGG TCC-5';
136 번째 아이소루신의 코돈인 ATA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CCT GGG CAG AAA GCT TGC CTT TTT CTT CCA ATG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CAT TGG AAG AAA AAG GCA AGC TTT CTG CCC AGG-5';
137 번째 루이신의 코돈인 CTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGG CAG AAA GCT ATA TGC TTT CTT CCA ATG TCT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AGA CAT TGG AAG AAA GCA TAT AGC TTT CTG CCC-5'; 및
143 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TTT CTT CCA ATG TCT TGC AAG AGC TGA TGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCA TCA GCT CTT GCA AGA CAT TGG AAG AAA-5'.
49 번째 히스티딘의 코돈인 CAC가 타이로신의 코돈인 TAT로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TAT ATC AAG CTA CAA CTT -3' 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT ATA AGG GTC GCT CTT CTC-5'.
<실시예 3: bFGF 변이체의 생산 및 정제>
bFGF 변이체의 발현 LB배지(LB/앰피실린) 500 ml에 배양하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 정제하여 각각 약 18 KDa 크기의 bFGF를 얻었다. 이 때 얻어진 변이체의 양은 변이체에 따라 각각 차이가 있었으며 변이체에 따라 약 4 ~ 12 mg의 bFGF를 얻을 수 있었으며 순도는 98% 이상이었다.
상기 각 bFGF 변이체는 다음과 같다.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 33 번째 아이소루신 및 66 번째 글라이신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 33 번째 아이소루신 및 69 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 33 번째 아이소루신 및 83 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 39 번째 발린 및 81 번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 39 번째 발린 및 83 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 49번째 히스티딘 및 68 번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 51번째 라이신 및 67 번째 발린이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 메치오닌 및 107 번째 세린이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 116 번째 알라닌 및 135 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 116 번째 알라닌 및 136 번째 아이소루신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 25 번째 라이신 및 86 번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 137 번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 51 번째 라이신 및 143 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 49 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 변이체.
천연형과 변이체의 정제는 SP-sepharose와 헤파린 친화 칼럼을 통해 정제가 가능하다. 최종 헤파린 친화 칼럼 정제를 진행한 후 SDS-PAGE 분석을 하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 천연형의 경우 이량체(dimer)와 삼량체(trimer)가 관찰되는 반면, 변이체(HsbFGF) 경우 단량체(monomer) 사이즈에 단일 밴드 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 활성이 없는 이량체, 삼량체가 완벽하게 제거되고 단량체 상태로 존재한다는 것을 보여주는 자료이다.
<실험예 1: 천연형과 변이체 bFGF의 circular dichroism을 이용한 구조 분석>
J-810 spectropolarimeter(JASCO)를 사용하여 circular dichroism 분석을 통하여 실시예 3의 정제된 bFGF 변이체의 구조와 열 안정성을 측정하였다. 천연형 bFGF은 실시예 1에서 정제된 bFGF를 사용하였다. 구조분석을 위하여 각각의 bFGF를 20 mM sodium phosphate(pH 7.0)에 녹여 최종농도가 0.1 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다.
열 안정도를 분석하기 위하여 Tm는 20 ℃와 95 ℃에서의 far-UV를 비교 분석하여 208 nm 파장을 결정하였으며 0.1 cm 큐벳에 0.1 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~ 95 ℃까지 측정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.
변이체 bFGF 명칭 구조변화 (Tm) 변이체 bFGF 명칭 구조변화(Tm) 변이체 bFGF 명칭 구조변화(Tm)
본 발명의 bFGF(서열번호 1) - (57.5℃) 변이체 AC68S,C86SI33C,G66C(서열번호 3) 감소48℃ 변이체 BC68S,C86SI33C,A69C(서열번호 4) 변화 없음
변이체 CC68S,C86SI33C,A83C(서열번호 5) 변화 없음 변이체 DC68S,C86SV39C,L81C(서열번호 6) 변화 없음 변이체 EC68S,C86SV39C,A83C(서열번호 7) 변화 없음
변이체 FC68S,C86SH49C(서열번호 8) 변화 없음 변이체 GC68S,C86SK51C,V67C(서열번호 9) 변화 없음 변이체 HC68S,C86SM75C,S107C(서열번호 10) 변화 없음
변이체 IC68S,C86SA116C,A135C(서열번호 11) 변화 없음 변이체 JC68S,C86SA116C,I136C(서열번호 12) 변화 없음 변이체 KC68S,C86SA74C(서열번호 13) 변화(62℃)
변이체 LC68S,C86SL25C(서열번호 14) 변화 없음 변이체 MC68S,C86SK137C(서열번호 15) 변화 없음 변이체 NC68S,C86SK51C,A143C(서열번호 16) 변화 없음
변이체 OC68S,C86SA74C,H49Y(서열번호 17) (65℃)
표 1은 천연형 bFGF와 bFGF 변이체에 대한 구조 변화 정도와 열 안정성 측정 실험인 circular dichroism 분석 중 208 nm의 파장에서 온도 별 풀림 구조비율(unfolded fraction)을 측정한 결과를 나타낸 값이다. 접힘-풀림 현상이 일어날 때에는 208 nm 부근의 구간에서 구조의 변화를 보이게 되는데 이를 이용하여 20 ~ 95 ℃ 범위 내에서 Tm을 측정하여 정확한 Tm값을 분석하였다.
본 표1에서 서열번호 1은 천연서열에서 N-말단의 2개의 아미노산서열을 제거한 후 시작서열로 메치오닌을 추가한 변이체임.
상기 발명에서 제작된 신규 변이체를 대상으로 Tm 측정을 한 결과, 기존 특허(KR 10-2015-0078930/PCT-KR2015-007734)의 결과와 비교하였을 때 기존 HsbFGF와 유사한 Tm 패턴을 나타내어 N-말단 서열은 bFGF의 구조에는 큰 영향을 미치지 않음을 보여준다.
기존 특허에서 보였던 양상과 같이, 구조변화 측면에선 대부분이 천연형 bFGF와 동일한 구조를 나타내었으며 이황화결합을 추가한 변이체들에서 특별한 구조를 가지지 않았다. 열 안정도를 나타내는 Tm의 경우 기존의 특허의 실험과 거의 유사하게 나왔으며 58 ℃인 천연형 bFGF와 비교하여 거의 대부분이 bFGF 변이체와 동일하였고, 그 중 기존 특허의 K75와 동일하게, 변이체 K(K74)에서 62 ℃까지 Tm 값이 상승하였고, 변이체 K에 49 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 변이체 O(신규 HsbFGF)의 열 안정도를 나타내는 Tm은 65 ℃까지 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 실험을 토대로 열 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었고 기존 특허의 내용과 일치하는 데이터를 보여주었다.
<실험예 2: 천연형과 변이체 bFGF의 세포증식검정>
만들어진 천연형 bFGF와 변이체 중 용해도와 circular dichroism을 이용한 구조와 Tm의 결과분석을 통하여 좋은 결과를 보여준 bFGF을 선정하여 세포증식검정을 실시하였다. 세포증식검정은 bFGF에 민감한 피부세포인 NIH-3T3 세포주를 가지고 수행하였다. 실험 방법으로는 NIH-3T3 cell을 10 % 열불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete 배지을 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24 시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample solution을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2 시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다.
<실험예 3: 천연형과 변이체 bFGF의 incubation에 따른 단백질의 정량 분석>
천연형 bFGF와 변이체들의 안정성을 확인하기 위하여, 37 ℃, 50 ℃, 60 ℃ incubation test를 진행하였다. 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(인산완충액)상태에서 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 각 온도의 water bath에서 incubation을 하였다. 0, 24, 48 시간, 7 일, 10 일 단위로 sampling 하여 13,000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 nano drop을 이용하여 단백질을 정량하였다. 시간이 지날수록 천연형 bFGF 와 변이체들의 농도를 정량하였고, 천연형 bFGF가 변이체에 비하여 더 심한 감소를 보였다.
또한, 상기 결과들을 토대로, 열 안정성이 증가된 기존 HsbFGF, 신규 HsbFGF 변이체 및 천연형 bFGF를 incubation 진행하였다. 그 결과 천연형 bFGF에 비하여 변이체들은 안정도가 월등히 높았다. 이러한 실험을 토대로 천연형과 기존 HsbFGF와 신규 HsbFGF를 한달간 37℃에서 incubation을 진행하면서 비교한 결과 천연형에 비해 월등히 우수한 결과를 보여주었다.
<실험예 4: 천연형과 변이체 bFGF들의 37℃ 장기간 incubation에 따른 SDS-PAGE 및 HPLC 분석>
천연형 bFGF과 변이체 K 및 신규 HsbFGF 변이체 안정성을 확인하기 위하여, 37℃에서 100일간 incubation test를 진행하였다. PBS(인산완충액)에서 각각의 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37 ℃인 수조에서 incubation을 하였다. 날짜에 따라 분획을 취하여 13,000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 HPLC 및 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분석하였다.
도 11과 12에 나와 있듯이 신규 HsbFGF의 경우 SDS-PAGE와 HPLC분석결과 유일하게 100 일 이후에도 보존되고 있는 것을 확인 할 수 있었다.
<실험예 5: L929 사멸 분석>
Mouse L929 세포(ECACC, no. 85011425)를 10 % 열불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete 배지를 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 5x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24 시간 배양된 L929 cell에 sample 용액을 각각의 농도 별로 처리하고, 24 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2 시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다. 도 13 에서 알 수 있는 것과 같이, 새로 제작된 새로운 HsbFGF는 독성이 검출되지 않았다.
<실험예 6: N-말단분석>
상기 과정을 통해 정제된 단백질을 (주)한국질량분석기술원에 Edman N-말단 분석법을 실시하였다. 0.5 mg/ml이 되도록 준비한다. PVDF membrane을 100 % MeOH 에 30 초 ~ 1 분간 담근다. 이후 0.45 um의 PVDF membrane을 이용하여 transfer를 진행한다. Blotting이 끝난 membrane 을 3 차 증류수에 5 분간 담가둔다. 염색시약을 이용하여 5 분 이내로 염색을 진행한다. 염색시약을 버린 후, 탈색시약을 이용하여 바로 탈색을 실시한다. 단백질의 band가 명확히 보이는 시점에서 탈색시약을 버린 후, 3차 증류수로 세척한다. 세척이 끝난 membrane을 충분히 풍건(공기건조)한다. 이후 phenylisothiocyanate(PITC) coupling 반응을 통한 N- 말단의 폴리펩타이드 사슬들이 형성되는 초기 반응을 개시로 phenylthiocarbamyl(PTC)-polypetide, anilinothiazolamine(ATZ)-amino acid 그리고 최종 phenylthiohydantoin(PTH) derivative amino acid 형태의 안정화된 구조 형성을 시키고 HPLC에 매 반복에서 생성된 아미노산 유도체를 주입하여 순차적으로 서열을 확인한다. 도 8 및 9 에 나와있는 PITC 피크의 경우 N-말단의 아미노산을 PITC시약을 이용하여 coupling시키는 과정 중 잔여 PITC 시약이 남아 질량분석에 보여지는 피크로서 이는 N-말단 아미노산과는 관련이 없다. 또한 하기 피크중 Dptu는 기준 및 표준 시약으로써 크로마토그래피를 이용한 분리에서 기준으로 사용되는 시약이다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1 의 아미노산 서열 내 2 개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1 개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된, 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF, basic fibroblast growth factor) 변이체(mutant).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인을 세린으로 치환한 후, 추가적으로 다른 잔기를 시스테인으로 치환하여 분자 내 이황화결합을 유도시킨 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 시스테인으로 치환된 아미노산은, 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 25번째 라이신, 33 번째 아이소루신, 39 번째 발린, 49 번째 히스티딘, 51 번째 라이신, 74 번째 알라닌, 75 번째 메사이오닌, 116 번째 알라닌, 66 번째 글라이신, 67 번째 발린, 69 번째 알라닌, 81 번째 루이신, 83 번째 알라닌, 107 번째 세린, 135 번째 알라닌, 136 번째 아이소루신, 137 번째 루이신 및 143 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 고안정성 bFGF 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 49 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 bFGF 변이체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중에서 어느 한 항의 변이체를 코딩하는 유전자.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2 의 DNA 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  7. 제 5 항의 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터.
  8. 제 7 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
  9. 다음 단계를 포함하는 고안정성 bFGF 변이체 생산 방법:
    (a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
    (c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 제거하는 단계;
    (d) 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
    (e) 이온교환 수지 후 고안정성 bFGF 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
PCT/KR2017/007637 2016-07-21 2017-07-17 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도 WO2018016814A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0092598 2016-07-21
KR1020160092598A KR101891678B1 (ko) 2016-07-21 2016-07-21 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018016814A1 true WO2018016814A1 (ko) 2018-01-25

Family

ID=60996006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/007637 WO2018016814A1 (ko) 2016-07-21 2017-07-17 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101891678B1 (ko)
WO (1) WO2018016814A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4067374A4 (en) * 2019-11-25 2024-03-06 Korea Institute Of Ocean Science And Tech FGF2 POLYPEPTIDE WITH IMPROVED TEMPERATURE STABILITY AND PROTEASE RESISTANCE AND USE THEREOF

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0494664A1 (en) * 1991-01-09 1992-07-15 FARMITALIA CARLO ERBA S.r.l. Human bFGF derivatives, their analogs and process for their production
US5851990A (en) * 1991-04-26 1998-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. bFGF mutein and its production
KR100982178B1 (ko) * 2008-01-29 2010-09-14 (주)케어젠 모노－페길화된 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및그의 용도
US20110053841A1 (en) * 2006-09-28 2011-03-03 Avner Yayon N-terminal fgf variants having increased receptor selectivity and uses thereof
KR20160083383A (ko) * 2014-12-30 2016-07-12 (주)피앤피바이오팜 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5604293A (en) * 1985-09-12 1997-02-18 Scios Inc. Recombinant human basic fibroblast growth factor

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0494664A1 (en) * 1991-01-09 1992-07-15 FARMITALIA CARLO ERBA S.r.l. Human bFGF derivatives, their analogs and process for their production
US5851990A (en) * 1991-04-26 1998-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. bFGF mutein and its production
US20110053841A1 (en) * 2006-09-28 2011-03-03 Avner Yayon N-terminal fgf variants having increased receptor selectivity and uses thereof
KR100982178B1 (ko) * 2008-01-29 2010-09-14 (주)케어젠 모노－페길화된 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및그의 용도
KR20160083383A (ko) * 2014-12-30 2016-07-12 (주)피앤피바이오팜 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4067374A4 (en) * 2019-11-25 2024-03-06 Korea Institute Of Ocean Science And Tech FGF2 POLYPEPTIDE WITH IMPROVED TEMPERATURE STABILITY AND PROTEASE RESISTANCE AND USE THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180010468A (ko) 2018-01-31
KR101891678B1 (ko) 2018-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016195157A1 (ko) 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도
US5874406A (en) Synthetic peptide analogs of lung surface protein SP-C
WO2022065805A1 (ko) 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2018070829A1 (en) Expression cassette for preparing copper peptide and use thereof
EP0511393B1 (en) Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism
CA2202390C (en) Keratinocyte growth factor analogs
Donato et al. Hints on the evolutionary design of a dimeric RNase with special bioactions
JPH05306297A (ja) 新規なハイブリド形質転換成長因子
WO2018016814A1 (ko) 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도
WO2016108394A1 (ko) 네오아가로올리고당을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물
KR101754272B1 (ko) 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도
WO2019027224A2 (ko) 결핵균 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 펩타이드 및 이의 용도
US5352450A (en) Method for preparing vaccine for dental caries and vaccinal compositions for dental caries used as nasal drop
WO2019004674A1 (ko) 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드
JPH08503376A (ja) 細菌内の異種遺伝子の発現の間の内因性アミノペプチダーゼ媒介ｎ−末端アミノ酸開裂の防止
WO2022139524A1 (ko) 신규 fk506 유도체 및 이를 포함하는 발모 촉진용 조성물
WO2018004294A2 (ko) 인간 성장호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
KR20160083383A (ko) 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도
CA2002210C (en) Expression and processing of authentic fgf&#39;s in yeast
WO2020222315A1 (ko) 피부 또는 세포 투과능이 우수한 피부 주름 개선 또는 치료용 조성물
WO2020027620A1 (ko) 리폭시게나아제 조합반응을 이용하여 이수산화지방산 또는 지질조절제를 제조하기 위한 조성물 및 방법
KR101841482B1 (ko) 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-9 변이체 및 이의 용도
WO2013077534A1 (en) Protein p14 with anti-cancer and anti-allergy activity and pharmaceutical composition comprising the same
WO2017074163A1 (ko) 초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법 및 그의 이용
WO2023229053A1 (ko) 코로나바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17831287

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17831287

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1