WO2018004294A2 - 인간 성장호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

인간 성장호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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윤정혁
장병하
김순남
정인혜
박경수
남기엽
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주식회사 크레아플래닛
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    • A61K38/22—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention relates to a human growth hormone mutant protein, transferrin fusion protein thereof or a pharmaceutical composition comprising the protein as an active ingredient.
  • hGH Human growth hormone
  • hGH Human growth hormone
  • hGH drugs are 30% for norditropin (Novo Nordisk), 29% for genotropin (Pfizer), 15% for Nutropin (Roche), and 14 for humatrope (Eli Lilly). It is predicted that the growth hormone sales in Korea will continue to grow by more than 4% compared to 2011 and 2012.
  • Polypeptides, such as hGH are usually of low molecular weight and low stability, are easily denatured, are degraded by proteolytic enzymes in the blood, and are easily removed by the kidneys and liver, so that drugs can be administered to patients to maintain the concentration and titer of human growth hormone. It is necessary to administer it frequently.
  • Transferrin is the third largest amount of plasma protein, and it is responsible for transporting iron ions in the blood to various tissues. Shorter than albumin or immunoglobulin G (Igunoglobulin G, IgG), but has a relatively long half-life of 8 days, enters the cell through the transferrin receptor on the cell surface, supplies iron ions, and then binds to the receptor It is characterized by circulating freely outside the cell. Using this feature, conventional half-life has been used as a fusion partner to bind short proteins to increase circulating half-life.
  • the present invention induced the sulfide bond between the helix and the loop of C-term by replacing serine (serine), the 85th and 144th amino acids of human growth hormone, with cysteine. These sulfide bonds stabilized the structure of the protein to make it resistant to degradation of proteases.
  • the name of the present invention is called GHC3-P00-Th.
  • the present inventors have fused the variants of cysteine-substituted amino acids 85 and 114 of human growth hormone with transferrin, confirming that the specific activity and blood stability are significantly increased compared to unfused circular human growth hormone.
  • the invention has been completed.
  • An object of the present invention is a human growth hormone mutant protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serine of the amino acid sequence of the human growth hormone protein is replaced with a hydrophobic amino acid, and the transferrin at the terminal of the protein. It is to provide a bound fusion protein or a pharmaceutical composition containing the protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a human growth hormone mutant protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serine of the amino acid sequence of human growth hormone protein (Serine) is respectively replaced by a hydrophobic amino acid, a gene encoding the protein, An expression vector comprising the gene, and the transformant is introduced into the host cell provides a transformant.
  • the present invention is a fusion protein of a human growth hormone mutant protein and transferrin coupled to the transferrin (transferrin) to the N- terminal of the human growth hormone mutant protein, a gene encoding the protein, an expression vector comprising the gene, the An expression vector provides a transformant introduced into a host cell.
  • the present invention contains the human growth hormone mutant protein, a fusion protein, an expression vector containing the respective genes encoding the protein or each transformant introduced into the host cell as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for the treatment of growth failure (growth failure) or growth retardation (growth retardation).
  • the present invention is a childhood that contains the human growth hormone mutant protein, a fusion protein, an expression vector containing each gene encoding the protein or a transformant introduced into the host cell as an active ingredient as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating onset deficiency or adult onset deficiency is provided.
  • Human growth hormone mutant protein or transferrin fusion protein thereof consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serine of the human growth hormone protein of the present invention are substituted with hydrophobic amino acids, respectively Compared to the existing human growth hormone protein, the specific activity and blood stability are significantly increased, and the existing half-life is increased, which is useful for the treatment of growth failure or growth retardation. Can be.
  • 1 is a diagram showing a cleavage map of a pcDNA3.1 (+) / preTf vector.
  • Fig. 2 is a diagram showing a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / preTf (B) vector.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / Tf (B) vector.
  • FIG. 4 is a diagram showing a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / GHC3-P00-Th vector.
  • 5 is a diagram showing the amount of GGHC3-P00-Th expression of the Expi293F cell line transformed with GHC3-P00-Th plasmid.
  • 6 (6a, 6b) is a diagram showing the results of performing Q-sepharose chromatography during the purification of human growth hormone fusion protein.
  • Figure 7 shows the results confirmed by the Urea-page after the Q-sepharose purification, transferrin fused to human growth hormone in the form of iron combined.
  • 8 (8a, 8b) is a diagram showing the results of size exclusion chromatography to remove the remaining free iron ions after the iron ion binding of GHC3-P00-Th protein and to change the buffer.
  • FIG. 9 is a view showing the results of measuring the purity of the target protein elution section using reverse phase-HPLC during the size exclusion chromatography process.
  • 10 (10a, 10b, 10c) is a diagram showing the results of measuring the target band, purity and impurities of the protein using the SDS-PAGE, SEC-HPLC, and RP-HPLC for the final purified protein.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of confirming the intracellular activity analysis of GHC3-P00-Th expressed in animal cell line through Nb2-11 cell proliferation experiment.
  • Fig. 13 is a diagram showing a comparison of degradation resistance by protease of hGH and GHC3-P00-Th proteins.
  • FIG. 14 shows a comparison of plasma half-life of hGH and GHC3-P00-Th proteins in vivo.
  • 15 is a diagram showing the results of in vivo activity analysis by administering hGH, GHC3-P00-Th to rats from which the pituitary gland was removed.
  • FIG. 16 shows IGF-1 serum concentrations in pituitary gland rats after SC injection of hGH and GHC3-P00-Th.
  • Figure 17 is a diagram showing the weight gain results by administering hGH, GHC3-P00-Ta, GHC3-P00-Th to rats from which the pituitary gland was removed:
  • GHC3-P00-Ta a form in which no iron ions are bound
  • GHC3-P00-Th form in which iron ions are bound, together with free iron ions
  • GHC3-P00-Th Recombinant protein in the form of free iron ions removed.
  • the present invention provides a human growth hormone mutant protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serine of the amino acid sequence of human growth hormone protein (Serine) is respectively replaced by a hydrophobic amino acid, a gene encoding the protein, An expression vector comprising the gene, and the transformant is introduced into the host cell provides a transformant.
  • the present invention provides a human growth hormone mutant protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serine of the amino acid sequence of human growth hormone protein (Serine) is respectively replaced by a hydrophobic amino acid, a gene encoding the protein, An expression vector comprising the gene and a transformant having the expression vector introduced into a host cell are provided.
  • human growth hormone refers to analogs, fragments, homologs, derivatives or allelic variants of hGH that have the same function as human growth hormone and also naturally occurring polypeptides. allelic variant).
  • Growth hormones according to the invention may be purified from human or animal sources and may be produced chemically or recombinantly. hGH formulations are commercially available.
  • the amino acid sequence of the human growth hormone is represented by SEQ ID NO: 1, but at least one gene having the same activity as the protein or the same gene position encoding the human growth hormone protein on the chromosome is added. , Deletion, and substituted sequences.
  • the human growth hormone protein has at least 80% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more specifically at least 90% homology, most specifically at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% Consisting of homologous sequences, but not limited thereto.
  • the hydrophobic amino acid is preferably an amino acid capable of sulfidation, and the hydrophobic amino acid is preferably Cysteine.
  • the present invention provides a fusion protein of a human growth hormone mutant protein and a transferrin coupled to a transferrin at the end of the human growth hormone mutant protein, a gene encoding the protein, an expression vector including the gene, and the expression vector is a host. Provide a transformant introduced into the cell.
  • the terminal to which the transferrin is linked may be either an amino terminal (5-terminal, N-terminal) or a carboxy terminal (3-terminal, C-terminal).
  • the transferrin is a protein represented by the sequence of SEQ ID NO: 2, but at least one or several amino acids of the protein are added, deleted, or substituted with the same activity as the protein or at the same gene position encoding the transferrin on a chromosome. It may be composed of nucleotide sequences.
  • the transferrin protein has at least 80% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, more specifically at least 90% homology, most specifically at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% homology It consists of the sequence which has, but it is not limited to this.
  • the human growth hormone mutant protein is a protein represented by the sequence of SEQ ID NO: 3, but has the same activity as that of the protein or at least the same gene position encoding the human growth hormone mutant protein on the chromosome, one or several of the proteins Amino acids may be composed of the base sequence to be added, deleted, substituted.
  • the fusion protein is represented by SEQ ID NO: 4, but has the same activity as that of the protein or a gene having the same gene position encoding the fusion protein on a chromosome, wherein one or several amino acids of the protein are added, deleted, or substituted. It may consist of sequences.
  • Human growth hormone protein or transferrin used in the present invention may be derived from animals, plants, microorganisms, preferably human-derived growth hormone protein or transferrin, but is derived from heterologous having activity equivalent to human-derived growth hormone protein or transferrin Protein.
  • the protein may additionally have modifications such as phosphorylation, acetylation, methylation, glycosylation, etc., but may be combined with other proteins, but may be regarded as the same as the protein before modification unless it is changed enough to lose the function of the protein. .
  • the gene encoding the protein may be a substitution of the base sequence of the restriction enzyme recognition site in the gene with another base sequence encoding the same amino acid as the amino acid encoding the base sequence, a portion of the gene terminal region is removed, substituted, Or may be added to insert a restriction enzyme recognition site.
  • the protein may be a protein obtained by replacing thymine of BamH I restriction enzyme recognition site sequence (GGATCC) in the protein gene with cytosine, but is not limited thereto.
  • restriction enzymes examples include EcoR I, BamH I, Hind III, kpn I, Not I, Pst I, Sma I, Xho I, Fok I, Alw26 I, Bbv I, Bsr I, Ear I, Hph I, Mbo I used, and the like SfaN i, Tth111 i, Nae i, Nhe I, NgoM iv, Nhe I, Eco57 i, Bcg i, Bp i, Bsp24 i, Bae i, Cje i, EcoP i, Hint iii, StyLT i, Any restriction enzyme used in the art may be used without limitation, depending on the gene, expression vector or genetic engineering environment desired.
  • the expression vector may be prepared from a vector represented by any one cleavage map selected from the group consisting of FIGS. 1, 2, 3, and 4.
  • An 'expression vector' of the present invention is a means for introducing a nucleic acid sequence encoding a protein of interest into a host cell, and includes various forms such as plasmids, cosmids, BACs, viral nucleic acids, and the like.
  • the vector generally includes a selective marker such as an antibiotic resistance gene that can confirm that the target gene has been successfully introduced into the host cell, and includes a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, and a polya to induce the expression of the target gene.
  • the denylation sequence, enhancer, Kozak sequence, shine-dalgano sequence and the like can be variously included according to the purpose.
  • the origin of replication is included.
  • the host cell may be any one selected from the group consisting of E. coli, yeast, fungi, plant cells, and animal cells, and all host cells used for producing recombinant proteins in the art are not limited thereto.
  • the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) of the present invention disulfides each other by replacing the 85 th serine and the 144 th serine on the amino acid sequence of the native growth hormone (GH) with cysteine. Induced to be bound. By checking the presence of free cysteine, the disulfide bonds of cysteines 85 and 144 were indirectly confirmed.
  • the inventors of the present invention showed that the intracellular activity of the human growth hormone (hGH) and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) of the present invention, GHC3-P00-Th showed a low cell proliferation activity compared to hGH. Based on the above result, the value of EC 50 was calculated. For the calculated EC 50 value, respectively, it was confirmed that the hGH is 0.07 ng / ml and GHC3-P00-Th 0.47 ng / ml (see FIG. 12). In the case of GHC3-P00-Th, the biological efficacy of the hGH-domain was found to be conserved even with increasing molecular weight.
  • the inventors of the present invention in order to measure the degree of degradation resistance of the proteolytic enzymes in the blood of the GHC3-P00-Th protein of the present invention, after the reaction of the protein with human serum (Serum), the GH remaining in the serum at a predetermined time The amount was measured. In the case of natural GH, the remaining amount decreases with increasing serum and reaction time, and it can be seen that the amount is 15 to 30%, but in the case of GHC3-P00-Th protein, there is no significant change in the amount of protein until 15 hours. (See FIG. 13). The formation of disulfide bonds between cysteine 85 and 144 helped to increase the protein's resistance to proteases.
  • the present inventors measured the amount of Growth Hormone present in the serum after administration of the protein in mice when the GHC3-P00-Th fusion protein of the present invention is administered in vivo, in order to determine the biological half-life of the protein.
  • GHC3-P00-Th fusion protein showed higher blood half-life than native human Growth Hormone (see Table 1). This results in a slower filtration rate in the kidney because of its larger protein radius than Growth Hormone.
  • fusion of Growth Hormone mutant protein with increased resistance to blood protease to transferrin results in a reduction in kidney filtration rate and improvement in blood stability, thereby maximizing blood half-life in vivo (see FIG. 14).
  • the present inventors used a 5-week-old male rat (hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC, Japan) as an experimental animal for the in vivo activity experiment of the GHC3-P00-Th fusion protein of the present invention.
  • Weight gain analysis of rats that had been removed from the pituitary gland with solvent control showed little weight gain.
  • human growth hormone (hGH) and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) In the case of 10-day administration, the weight gain was continuously increased until the 10th day after the administration. In the 10th day, the weight gain rate of the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) was 3.53 rather than the human growth hormone (hGH).
  • the present inventors measured the amount of IGF-1 protein present in serum when the Growth Hormone transferrin fusion protein of the present invention was administered in vivo.
  • test substances GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) and hGH 30 ug / rat (Daily) were significantly higher than vehicle (p ⁇ 0.001 or p ⁇ 0.01).
  • GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher by day 5 than vehicle (p ⁇ 0.001 or p ⁇ 0.05).
  • GHC3-P00-Th 30 ug / rat was significantly higher than hGH 30 ug / rat (Daily) by day 10 (p ⁇ 0.001).
  • GHC3-P00-Th 200 ug / rat was significantly higher until the 3rd day compared to hGH 30 ug / rat (Daily) (p ⁇ 0.001) (see Figure 16).
  • the transfer fusion protein (GHC3-P00-Th) of the human growth hormone mutant protein of the present invention significantly increases the specific activity and blood stability, and increases the conventional half-life compared to the conventional human growth hormone protein. By showing an effect, it can be usefully used for the treatment of growth failure or growth retardation.
  • the present invention is a human growth hormone mutant protein, a transferrin fusion protein thereof, an expression vector comprising the gene encoding the protein or growth failure containing the transformant introduced into the host cell as an active ingredient (growth) It provides a pharmaceutical composition for treating failure or growth retardation.
  • the growth failure or growth retardation is preferably due to pituitary growth hormone secretion disorder, chronic renal disease, chronic renal disease, Turner's syndrome, cachexia or AIDS wasting, but is not limited thereto. .
  • the present invention is childhood growth deficiency deficiency protein containing a human growth hormone mutant protein, transferrin fusion protein thereof, an expression vector containing the gene encoding the protein or a transformant introduced into the host cell as an active ingredient Or it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating adult-type onset deficiency.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose ( lactose) or gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, according to the desired method, and may be administered externally or intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrathoracically, or intravascularly by injection of the parenteral when parenteral administration. It is desirable to choose.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient, the scope of the present invention in any way It is not intended to be limiting. Individual dosages specifically contain amounts in which the effective drug is administered at one time.
  • the single dose is 1 to 100 milligrams, preferably 3 to 50 milligrams, more preferably 6 to 30 milligrams, based on the amount of protein, can be administered once or several times a day, where several sites May be administered in divided doses.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • the transfer fusion protein (GHC3-P00-Th) of the human growth hormone mutant protein of the present invention significantly increases the specific activity and blood stability, and increases the conventional half-life compared to the conventional human growth hormone protein. By showing an effect, it can be usefully used for the treatment of growth failure or growth retardation.
  • HepG2 a human liver cancer cell
  • HepG2 cells were passaged at 37 ° C., 5% carbon dioxide incubator using DMEM (HyClone) containing 10% fetal bovine serum (WelGNE) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco). After passage, the medium of HepG2 cells cultured for 2 days was removed, washed with phosphate buffer (HyClone), and the cell pellets were collected and centrifuged to remove the medium, and then stored at -70 ° C. Cells stored at ⁇ 70 ° C.
  • RNA extraction kit (LeGene) to obtain total mRNA.
  • Total cDNA was synthesized using oligo (dT) as a cDNA synthesis system (LeGene).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Sense primer (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3 ', SEQ ID NO: 10) and antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 11) were used at 10 pmol, and distilled water was added to the DNA polymerase and buffer along with the cDNA template. The total volume was 50 ⁇ l.
  • the reaction was carried out at 98 ° C. for 30 seconds using a PCR instrument, and the circulation program was repeated 30 times at 98 ° C. for 10 seconds, at 30 ° C. for 30 seconds and at 72 ° C. for 30 minutes, and finally at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the amplified transferrin gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm its size, and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN) by cutting the agarose gel of the desired portion.
  • Transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid (Invitrogen) obtained through purification were treated with Nhe I (Enzynomics) and Xho I (Enzynomics) restriction enzyme, respectively.
  • 10 units of restriction enzyme and a buffer solution (10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA) were added and reacted at 37 ° C. for 2 to 3 hours. After the reaction, the size was confirmed by electrophoresis on a 1% agarose gel, and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN) by cutting the agarose gel.
  • iNtRoN DNA purification kit
  • the purified transferrin gene and pcDNA3.1 (+) vector were reacted with T4 DNA conjugated enzyme (Takara) at 16 ° C. for 16 hours. After the reaction, E. coli DH10B was transformed and E. coli colonies were selected by applying to agar plate containing an empicillin antibiotic (Agar) and incubated at 37 °C for 16 hours.
  • DNA polymerase was used to confirm the polymerase chain reaction (PCR). E. coli colonies were diluted in distilled water and used as templates, and a sense primer (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3 ', SEQ ID NO: 10) and an antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3, SEQ ID NO: 11) were used for transferrin gene amplification.
  • the reaction was carried out at 98 ° C. for 30 seconds, and the circulation program was repeated 30 times at 98 ° C. for 10 seconds, at 53 ° C.
  • Transferrin present in the gene in order to use the restriction enzymes BamH I site when plasmid was produced by the process of the BamH I site subjected to regioselective mutation (site-direct mutagenesis) removing the BamH I restriction site.
  • site-direct mutagenesis site-direct mutagenesis
  • the nucleic acid was replaced with cytosine (C) from thymine (T), but the amino acid sequence was maintained as aspartic acid.
  • the BamH I restriction enzyme site, GGATCC was replaced with a sense primer (5'-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3 ', SEQ ID NO: 12) and an antisense primer (5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3', SEQ ID NO: 13) to replace the nucleic acid with GGACCC.
  • a sense primer (5'-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3 ', SEQ ID NO: 12)
  • an antisense primer 5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3', SEQ ID NO: 13
  • the prepared pcDNA3.1 (+) / preTf plasmid was used as a template and was performed according to the instructions provided by the manufacturer using a regioselective mutation kit (iNtRON). After completion of the polymerase chain reaction, the gene was confirmed by electrophoresis on 1% agarose
  • coli colonies were inoculated in LB liquid medium containing an empicillin antibiotic and incubated in a 37 ° C. shaker for 16 hours.
  • the cultured E. coli was centrifuged to separate the supernatant and the cell pellet, and the cell pellet was purified using plasmid extraction kit (GeneAll).
  • the plasmid DNA was purified and sequenced analysis of the BamH I restriction enzyme site present in the transferrin gene. It was confirmed that the nucleic acid was substituted.
  • the plasmid thus produced is referred to herein as pcDNA3.1 (+) / preTf (B) (SEQ ID NO: 6) (FIG. 2).
  • Transferrin is a secreted protein and contains a signal peptide (Signal peptide) to help the protein synthesized at the N-terminus to the cell membrane, the amino acid sequence is MRLAVGALLVCAVLGLCLA (SEQ ID NO: 14).
  • a plasmid was prepared in which the signal peptide present in the transferrin was removed and the restriction enzyme Bam HI was placed at the 5' end.
  • Bam HI was placed at the 5' end.
  • Xho I and Stop codon (TAA) were located at the 3 'end. Polymerase chain reaction was carried out using DNA polymerase as pcDNA3.1 (+) / preTf (B).
  • the primers used for the reaction were used by customizing at Cosmojintech.
  • Sense primer (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3 ', SEQ ID NO: 15) and antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 11) were used as 10 pmol, and distilled water was added to the DNA polymerase and the buffer solution with the template. The total volume was 50 ⁇ l.
  • the reaction was carried out at 98 ° C. for 30 seconds using a PCR apparatus, and the circulation program was repeated 30 times at 98 ° C. for 10 seconds, at 53 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 minutes, and finally at 72 ° C.
  • the amplified transferrin gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm its size, and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN) by cutting the agarose gel.
  • Purified transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid were treated with Bam HI (Enzynomics) and Xho I (Enzynomics) restriction enzymes, respectively.
  • 10 ⁇ l of restriction enzyme and 2 ⁇ l of buffer solution (10 mM Tris-HCL pH 7.9,50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 ⁇ g / ml BSA) were added and reacted at 37 ° C.
  • Human growth hormone contained in the pCMV6-XL5 vector was used as a template by purchasing GH1 (untagged) -Human growth hormone 1 (GH1), transcript variant 1, and NM_000515.3 (OriGene, SC300088).
  • GH1 untagged
  • GH1 Human growth hormone 1
  • transcript variant 1 transcript variant 1
  • NM_000515.3 OriGene, SC300088
  • a sense primer (5'-ATAGCTAGCTCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3 ', SEQ ID NO: 16
  • an antisense primer 5'-TATGGATCCGAAGCCACAGCTGCCCTCCA-3', SEQ ID NO: 17
  • the gene was amplified.
  • the amplified gene contains a signal peptide that helps the protein synthesized at the N-terminus to be delivered to the cell membrane.
  • the amino acid sequence is MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 18).
  • Gene fragments were engineered to have a NheI restriction enzyme site and Kozak sequence at the 5 'end of the amplified gene, and a BamH I restriction enzyme at the 3' end.
  • the amplified human growth hormone gene and pcDNA3.1 (+) / Tf (B) plasmid were added with 20 units of Nhe I and Bam HI restriction enzymes for 3 hours at 37 ° C, followed by electrophoresis on 1% agarose gel.
  • DNA was purified using DNA Clean up Kit (COSMO).
  • COSMO DNA Clean up Kit
  • the purified DNA was reacted at 16 ° C. for 16 hours by adding T4 DNA conjugated enzyme (Takara).
  • T4 DNA conjugated enzyme Takara
  • E. coli DH10B was transformed and applied to agar plate containing empicillin and incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • E. coli colonies were selected from the plates and inoculated in LB liquid medium and shaken at 37 ° C. for 16 hours.
  • the cultured E. coli was centrifuged to separate the supernatant and the cell pellet, and the cell pellet was purified using Exprep TM PlasmidSV, mini (GeneAll).
  • the purified plasmid was confirmed by sequencing by Cosmojintech.
  • the plasmid thus made was named pcDNA3.1 (+) / GHW-P00-Th (SEQ ID NO: 8) in this specification.
  • the site-directed mutation was performed using pcDNA3.1 (+) / GHW-P00-Th as a template.
  • Each of the sense primer (5'-GCTGCTCATCCAGTGTTGGCTGGAGCCCG-3 ', SEQ ID NO: 19) and the antisense primer (5'-CGGGCTCCAGCCAACACTGGATGAGCAGC-3', SEQ ID NO: 20), the template, and DNA polymerase were added to amplify the gene by chain polymerization. .
  • the amplified DNA was reacted at 37 ° C. for 1 hour by adding Dpn I (Enzynomics) to remove the DNA used as a template.
  • the plasmid thus made was named pcDNA3.1 (+) / GHC3-P00-Th (SEQ ID NO: 9) in this specification (FIG. 4).
  • the proteins used in the present invention were expressed by secreting proteins out of cells using Expi293F TM cells (Gibco), a human embryonic kidney cancer cell line modified for suspension culture. After thawing Expi293F TM cells contained in the Expi293F TM Expression system kit (Gibco), the cells were inoculated into a sterile 125 ml flask containing 30 ml of serum-free media for animal cell culture (Gioco). Was shaken at 37 °C, 5% carbon dioxide incubator at a stirring speed of 125 rpm.
  • Serum Expi293F TM cell line at a cell density of 3 to 5 x 10 6 cells / ml and passaged every 3 to 4 days to stabilize the cells, followed by serum free medium at a cell density of 2 x 10 6 cells / ml for transformation.
  • serum free medium at a cell density of 2 x 10 6 cells / ml for transformation.
  • the cell density was set back to 2 x 10 6 cells / ml, and the cell viability was confirmed to be 96% or more and used in the experiment.
  • the mixture was mixed with 5 x loading dye (Biosesang) in the supernatant and reacted at 95 ° C. for 20 minutes, and then electrophoresed at 160 V for 1 hour at 10% SDS PAGE gel.
  • the gel was separated and washed with purified distilled water and then reacted with a protein staining solution (PageBlue protein staining Solution, Thermo) for 1 hour to develop color.
  • Transferrin was about 75 kDa and the molecular weight of GHC3-P00-Th fused with human growth hormone mutant protein was 97 kDa, confirming that the protein was normally expressed (FIG. 5A).
  • samples were electrophoresed on 10% SDS PAGE gels, and the gels were separated to move the oligoproteins onto the MDFs of Immobilon-P-Transfer Membrane (Milipore). .
  • the mixture was prepared by mixing 5% Skim milk in a phosphate buffer wash (phosphate buffer solution containing 0.05% Tween20), and then reacted with Membrane for 1 hour at room temperature. After the reaction, the solution was washed three times with phosphate buffered washing solution, and then human growth hormone antibody (Santa Cruz) was diluted in 2,000-fold phosphate buffered washing solution and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the resultant was washed three times with phosphate buffered washing solution, and then the horseradish perixidase-conjugated secondary antibody (Santa Crux) was diluted 10,000 times with phosphate buffered washing solution and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the resultant was washed three times with phosphate-buffered washing solution, followed by color development using a substrate (SuperSignal WestPicoChemiluminescentSubstrate, Thermo) to confirm the protein. GH and GHC3-P00-Th were identified via human growth hormone antibodies (FIG. 5B).
  • GHC3-P00-Th culture was dialyzed in 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 solution (dialysis progress time: at least 16 hours at 4 °C).
  • Hitrap Q HP, 5mL column was mounted on AKTA prime plus FPLC, and flowed into 20 mM K 2 HPO 4 , pH7.5 buffer at a flow rate of 3 mL / min.
  • the dialyzed culture solution was injected. Thereafter, the target protein adsorbed on the resin was eluted using a NaCl step gradient (FIG. 6).
  • Size exclusion chromatography was performed to remove the remaining free iron ions. Equilibrate the column with 20 mM Tris, 75 mL NaCl, pH 8.0 buffer at a flow rate of 1 ml / min in a 120 mL column of Hi-load 16/60 sepharcryl, and exchange 5 ml of the iron-bound protein for storage. Free iron ions were removed (FIG. 8). During the removal of iron ions, the purity of the target peak was confirmed by section reverse phase-HPLC (RP-HPLC). A Waters alliance HPLC instrument was equipped with a RP-HPLC column of ZORBAX 300SB-C18 (4.6 X 50 mm) and equilibrated with 0.1% TFA / Water.
  • Purified GHC3-P00-Th protein was quantified using SDS-PAGE. Using human growth hormone protein quantified by ELISA, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 ⁇ g is injected into the wells for standard quantitative curves, and the purified sample is diluted to 5 mL and 10 mL to determine the unknown amount of the sample. Proteins were quantified in comparison to the quantification curves.
  • the target peak was eluted at 4.3 minutes and when the base peak of the buffer was removed, the purity was measured as 99.9%.
  • 50 mL of GHC3-P00-Th protein was injected and the concentration of 0.1% TFA / acetonitrile was gradually increased to 50 minutes.
  • the target peak was eluted at 27 minutes in, and when the base peak of the buffer was removed, the purity was measured as 96.8% (FIG. 10).
  • GHC3-P00-Th protein the 85th serine and 144th serine were substituted with cysteine on the amino acid sequence of the native GH to induce disulfide bonds.
  • the 53rd amino acid and the 165, 182, and 189 cysteine are combined to have a total of two disulfide bonds, and no free cysteine (free cysteine) exists. Therefore, the presence or absence of free cysteine of GHC3-P00-Th protein substituted with cysteine amino acids 85 and 144, indirectly confirmed the disulfide bonds of cysteines 85 and 144.
  • Nb2-11 cells European Collection of Cell Cultures (ECACC) # 97041101
  • ECACC European Collection of Cell Cultures
  • 97041101 a rat nodule lymphoma cell line that has human growth hormone-dependent mitosis.
  • Nb2-11 cells were cultured in Fischer's medium with 10% fetal bovine serum (FBS), 0.075% NaCO 3 , 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamine and 10% horse serum (HS, lactogen). -deficient horse serum) was incubated at 37 ° C., 5% carbon dioxide conditions using medium added and replaced with fresh medium every two to three days. Cells are not adhesion dependent.
  • FBS fetal bovine serum
  • NaCO 3 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol
  • HS horse serum
  • -deficient horse serum was incubated at 37 ° C., 5% carbon dioxide conditions using medium added and replaced with fresh medium every two to three days. Cells are not adhesion dependent.
  • Nb2-11 cells were adjusted to about 2.5 ⁇ 10 5 cells / ml using 1% FBS culture in 10% FBS and then incubated for 24 hours. After 24 hours of culture, the Nb2-11 cell line was harvested by centrifugation, washed with the same medium except for 10% FBS, and then divided into 100 ⁇ l of each well of a 96-well plate to be about 2 ⁇ 10 4 cells per well.
  • Human growth hormone (hGH, GenScript) used as a control and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) were diluted and added to each well containing Nb2-11 cells for 72 hours. The cells were incubated at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator.
  • the cell proliferation activity of the test material was expressed in the same amount of human growth hormone (hGH).
  • hGH human growth hormone
  • 10 ⁇ l of alamarBlue (ThermoFisher SCIENTIFIC) reagent was added to the cell culture medium, and the plate was incubated in the incubator for 4 hours. The plates were slowly shaken to evenly react the cells in each well, and the absorbance at 570 nm was measured to determine and analyze the number of increased cell lines.
  • the absorbance values obtained by the alamarBlue assay were determined as EC 50 (50% effective concentration) to allow 50% of cells to survive.
  • Intracellular activity analysis results of the human growth hormone (hGH) and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) of the present invention is shown in Figure 12.
  • GHC3-P00-Th showed low cell proliferation activity compared to hGH.
  • the value of EC 50 was calculated.
  • the hGH was 0.07 ng / ml
  • GHC3-P00-Th 0.47 ng / ml.
  • the biological efficacy of the hGH-domain was found to be conserved even with increasing molecular weight.
  • the amount of GH remaining in the serum was measured at a predetermined time after the protein was reacted with human serum.
  • human serum SIGMA
  • protein samples 2.8 ⁇ g / ml were reacted with serum at 37 ° C. at a 24: 1 ratio (v / v).
  • the reaction time was 0, 3, 6, 9, 12, 15 hours, and the reaction was terminated by storing the complete protease inhibitor cocktail (Roche) in the sample at -70 °C after each time period.
  • GH ELISA RnDSystems was performed to confirm the amount of remaining protein. The method was carried out with reference to the manufacturer's manual.
  • Concentration conversion according to absorbance was calculated based on the calibration curve of protein concentration-absorbance with respect to the standard solution.
  • the standard curve was created using Excel program.
  • the mean value of absorbance corresponding to each GH and GHC3-P00-Th protein standard solution and the difference between the absorbance values of the wells treated with buffer only were used. Residual GH protein amount (% GH) was expressed based on the protein concentration (pm / ml) of GH when the reaction time is 0 hours as a 100%.
  • the amount of remaining GH (%) of GH and GHC3-P00-Th protein according to time is shown in FIG. 13.
  • the remaining amount decreases with increasing serum and reaction time, and it can be seen that the amount is 15 to 30%, but in the case of GHC3-P00-Th protein, there is no significant change in the amount of protein until 15 hours. have.
  • the formation of disulfide bonds between cysteine 85 and 144 helped to increase the protein's resistance to proteases.
  • the amount of Growth Hormone present in the serum was measured after administration of the protein in mice in order to determine the biological half-life of the protein.
  • the above-described "in vivo half-life” refers to the "half-life of protein in plasma", ie, the time zone in which Growth Hormone protein circulates in the plasma, remaining about 50% of its initial concentration. Pharmacokinetic calculations were performed using the R program.
  • mice 6 weeks old Sprague-Dawley, SPF male mice (Orient Biorotor) was used to purchase. Individual body weights were measured at the end of the quarantine and acclimatization periods after a minimum of 7 days acclimation period. Based on the weights at this time, healthy animals without weight gain and general symptoms were selected and the average body weight of each group was determined. Randomly placed (up to 200 g ⁇ 20% per animal) randomized to constitute 8 animals for each test group.
  • the dose of each individual was converted (5 mL / kg), and then 50 ⁇ g Growth Hormone variant or its transferrin fusion protein per body weight (kg) was used as a disposable syringe (1 mL). , 26 G needle). Dosing date was defined as Day 1 of testing.
  • Blood collection is done at each point (0, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h) using the jugular vein.
  • Cross bleeds were added in mL.
  • heparin tubes were centrifuged at 3.000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant plasma was separated and dispensed.
  • Specimens were stored in a deep freezer set at -70 ° C or below.
  • the amount of active growth hormone in plasma was quantified by ELISA after thawing the sample on ice.
  • the quantification of Growth Hormone in plasma by ELISA was performed by purchasing the R & D Human Growth Hormone ELISA Kit (R & D, Cat. DGH00), and the experimental method was performed according to the manual of the corresponding reagent.
  • a calibration curve of absorbance according to the protein concentration of the standard solution was prepared and the content of Growth Hormone mutant proteins in the sample was determined by regression analysis.
  • Noncompartmental pharmacokinetic analysis from the mean concentration-time profile of each test compound was performed by applying a non-compartment analysis input to the R program.
  • Pharmacokinetic parameters assessed terminal half-life (t 1/2 ).
  • the half-life of the protein in plasma of the growth protein of Growth Hormone is shown in Table 1 below.
  • the GHC3-P00-Th fusion protein showed higher blood half-life than native human growth hormone. This results in a slower filtration rate in the kidney because of its larger protein radius than Growth Hormone.
  • fusion of Growth Hormone mutant protein with increased resistance to protease in blood to transferrin results in the reduction of kidney filtration rate and the improvement of blood stability, thereby maximizing blood half-life in vivo (FIG. 14).
  • a 5-week-old male rat (hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC, Japan) was used as an experimental animal, and the test group was divided into four groups and five rats of each group were used for weight gain test. Group segregation was weighted among the animals determined to be healthy during the 15-day acclimation period and randomly distributed to ensure that the average weight of each group was as evenly distributed as possible according to the ranked weight.
  • mice from which pituitary gland was removed were 30 ⁇ g of human growth hormone (hGH) per rat, 30 ⁇ g of human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) per rat, and one time of solvent control (vehicle), Repeated administration for 10 days, a single dose of the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) at 200 ⁇ g per rat.
  • Subcutaneous injection was carried out at the dosages and methods as shown in Table 2 below, and the weight of rats after injection was measured daily.
  • the weight gain analysis of rats from which the pituitary gland of the GHC3-P00-Th of the present invention was removed is shown in FIG. 15.
  • the rats in which the pituitary gland was removed after administration of the solvent control had almost no weight gain, but the human growth hormone (hGH) and the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) once a day
  • body weight increased continuously until the 10th day after the administration.
  • the growth rate of the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) was 3.53% higher than that of the human growth hormone (hGH). Found to be high.
  • human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th)
  • body weight increased continuously until 3 days after administration, and maintained better than human growth hormone (hGH) group until day 7 .
  • human growth hormone (GHC3-P00-Th)
  • the effect was significantly higher, even when administered once a day it was confirmed that the same as or more effective than human growth hormone (hGH).
  • the body weight gain rate was significantly faster over the first three days in rats receiving a single human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) compared to rats injected daily with human growth hormone (hGH). Was increased (FIG. 15).
  • the GHC3-P00-Th of the present invention has excellent sustained activity compared to hGH, and is expected to solve the limitation of human growth hormone which should be injected every day.
  • the Growth Hormone transferrin fusion protein of the present invention When the Growth Hormone transferrin fusion protein of the present invention was administered in vivo, the amount of IGF-1 protein present in serum was measured. The entire process of purchasing, breeding, administering and administering test animals and analyzing IGF-1 concentrations was performed by requesting the Korea Institute of Science.
  • Blood collection was performed using a syringe in the once / day jugular vein before the test substance administration and for 10 days after the start of administration. Blood was injected into a vacutainer tube containing a Clot activator, left to coagulate for about 15 minutes at room temperature, and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to quantify IGF-1 using an ELISA kit.
  • test substances GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) and hGH 30 ug / rat (Daily) were significantly higher than vehicle (p ⁇ 0.001 or p ⁇ 0.01).
  • GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher by day 5 than vehicle (p ⁇ 0.001 or p ⁇ 0.05).
  • GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) was significantly higher than hGH 30 ug / rat (Daily) by day 10 (p ⁇ 0.001).
  • GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher until the 3rd day compared to hGH 30 ug / rat (Daily) (p ⁇ 0.001) (Fig. 16).
  • the present invention relates to a human growth hormone mutant protein, transferrin fusion protein thereof or a pharmaceutical composition comprising the protein as an active ingredient.
  • SEQ ID NO: 2 VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASD
  • SEQ ID NO: 4 FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQCWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYCKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGSVPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVV
  • SEQ ID NO: 10 CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC
  • SEQ ID NO: 12 CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT
  • SEQ ID NO: 13 AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG
  • SEQ ID NO: 16 ATAGCTAGCTCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC
  • SEQ ID NO: 17 TATGGATCCGAAGCCACAGCTGCCCTCCA

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Abstract

본 발명의 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린(transferrin) 융합 단백질은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 성장호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
본 발명은 인간 성장호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
인간성장호르몬(human growth hormone, hGH, 이하 “hGH”로 표기)은 뇌하수체에서 분비되는 191개의 아미노산으로 표시된 분자량 약 22,000 Da의 폴리펩타이드 호르몬으로 성장기 어린이에게는 뼈 끝 성장판의 연골세포 분화를 자극하여 성장을 촉진시키고, 성인에게는 대사 작용에 영향을 주며 단백질 합성과 축적을 증가시키는 역할을 하여 대사를 조절한다. 성장호르몬에 결핍이 일어나면 근육, 지방, 뼈 등 신체구성 성분의 변화에 많은 영향이 일어나며 골다공증, 관절염, 비만 등의 질환을 초래하게 된다. 또한, 성장호르몬의 자연적인 감소에 의한 결핍증상은 당뇨병이나 고혈압이 유발되는 경우가 있으며 이러한 경우 성장호르몬의 보충 요법이 필요하다.
2010년 인간성장호르몬의 시장 현황을 살펴보면 시중에 판매되고 있는 hGH 약품에는 norditropin(Novo Nordisk)이 30%, genotropin(Pfizer)이 29%, Nutropin(Roche)이 15%, humatrope(Eli Lilly)이 14% 등으로 판매되었으며, 국내에서도 성장호르몬 매출이 2011년과 2012년을 비교하였을 때 4% 이상 증가하여 지속적으로 성장될 것이라고 예측하고 있다. 그러나 성장호르몬 치료가 널리 사용되고 있음에도 불구하고 안정성 및 편의성의 문제로 환자에게 육체적 및 심리적 부담을 야기한다. hGH와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 분자량이 작고 안정성이 낮아 변성이 쉽고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장 및 간을 통해 쉽게 제거되어 인간 성장호르몬의 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 이러한 문제점은 환자에게 육체적 및 심리적 고통을 야기하게 되며 이를 해결하기 위해 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 지속하여 약효를 유지할 수 있는 노력이 계속되어 왔다.
최근에 안정성 증가 및 활성 저하를 최소화할 수 있는 단백질 약물 제제로, 생체 내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체(대한민국 등록특허 제 10-0567902호), 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-0725315호), 지속형 인간 성장 호르몬 제제(대한민국 등록특허 제10-1535681호)등의 면역글로불린 Fc 방법과 폴레에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도(대한민국 등록특허 제 10-1104574호) 및 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-1504824호)등의 당화를 이용한 방법 등이 보고되었다.
트랜스페린(transferrin)은 혈장 단백질 중에서 세 번째로 많은 양으로 존재하며, 혈액에 존재하는 철 이온을 다양한 조직으로 운반하는 역할을 한다. 알부민 (Albumin)이나 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)보다는 짧지만 8일의 비교적 긴 반감기를 가지며, 세포 표면의 트랜스페린 수용체를 통해 세포 내부에 유입되어 철 이온을 공급한 후, 수용체와 결합한 상태로 세포 외부로 유리되어 순환하는 특징이 있다. 이러한 특징을 이용하여, 종래의 반감기가 짧은 단백질을 결합하여 순환 반감기를 증가시키기 위한 융합 파트너로 사용되고 있다.
본 발명은 인간성장호르몬의 85번째와 144번째의 아미노산인 세린(serine)을 시스테인으로 치환하여 helix와 C-term의 loop 사이에 황화결합을 할 수 있도록 유도하였다. 이러한 황화 결합은 단백질의 구조를 안정화하여 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성을 갖도록 하였다. 본 발명의 명칭을 GHC3-P00-Th라 한다.
이를 뇌하수체를 적출한 Sprague-Dawley Rat 모델에 주입하여 인간성장호르몬 융합체의 효력시험을 실시한 결과, 대조군에 비해 체중이 증가하였고, 혈청 중 IGF-1 level을 확인한 결과 양성대조군에 비하여 높은 수준을 유지하였다.
본 발명자들은 인간성장호르몬의 85번과 114번 아미노산을 시스테인으로 치환한 변이체를 트랜스페린과 융합하여, 비 융합된 원형 인간 성장호르몬에 비해 비활성도(specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질 말단에 트랜스페린이 결합된 융합 단백질 또는 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 N-말단에 트랜스페린(transferrin)이 결합된 인간 성장 호르몬 변이 단백질과 트랜스페린의 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 각각의 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 각각의 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 각각의 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 각각의 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 각각의 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 유년기 개시형 결핍증 또는 성인기 개시형 결핍증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린(transferrin) 융합 단백질은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pcDNA3.1(+)/preTf 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 2는 pcDNA3.1(+)/preTf(B) 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 3은 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 4는 pcDNA3.1(+)/GHC3-P00-Th 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 5 (5a, 5b)는 GHC3-P00-Th 플라스미드로 형질전환된 Expi293F 세포주의 GGHC3-P00-Th 발현양을 나타내는 도이다.
도 6 (6a, 6b)은 인간성장호르몬 융합단백질의 정제 과정 중 Q-세파로즈 크로마토그래피를 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Q-세파로즈 정제 후, 인간성장호르몬에 융합된 트랜스페린을 철이 결합된 형태로 만들어 Urea-page로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8 (8a, 8b)은 GHC3-P00-Th 단백질의 철이온 결합 후, 남아있는 자유 철이온을 제거하고 완충액을 갈아주기 위하여 size exclusion 크로마토그래피를 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 size exclusion 크로마토그래피 과정 중, 타겟 단백질 용출구간에 대하여 reverse phase-HPLC를 이용하여 순도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10 (10a, 10b, 10c)은 최종 정제한 단백질에 대하여 SDS-PAGE와 SEC-HPLC, 그리고 RP-HPLC를 이용하여 단백질의 타겟 밴드와 순도 및 불순물을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 단백질 내 Free 시스테인 잔기 유무를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 동물 세포주에서 발현한 GHC3-P00-Th의 세포 내 활성분석을 Nb2-11 세포 증식실험을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 hGH, GHC3-P00-Th 단백질의 단백질분해효소에 의한 분해 저항성 비교를 나타내는 도이다.
도 14는 hGH와 GHC3-P00-Th 단백질들의 생체 내 혈장 반감기의 비교를 나타내는 도이다.
도 15는 뇌하수체가 제거된 랫트에 hGH, GHC3-P00-Th를 투여하여 생체 내 활성 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 hGH 및 GHC3-P00-Th를 SC 주사한 후 뇌하수체 적출된 랫트에서 IGF-1 혈청 농도를 나타내는 도이다.
도 17은 뇌하수체가 제거된 랫트에 hGH, GHC3-P00-Ta, GHC3-P00-Th를 투여하여 무게 증가 결과를 나타낸 도이다:
GHC3-P00-Ta: 철이온이 결합되지 않은 형태;
GHC3-P00-Th: 철이온이 결합된 형태, 자유 철이온 함께 존재; 및
GHC3-P00-Th(free-iron free) : 자유 철이온이 제거된 형태의 재조합 단백질.
본 발명은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 사용된 용어 인간 성장 호르몬(hGH)은 인간 성장 호르몬 및 또한 천연적으로 발생한 폴리펩티드와 동일한 기능을 갖는 hGH의 유사체(analog), 분절(fragment), 동족체(homolog), 유도체 또는 대립 변종(allelic variant)을 포함한다. 본 발명에 따른 성장 호르몬은 인간 또는 동물 근원으로부터 정제될 수 있고, 화학적으로 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. hGH 제제는 상업적으로 입수가능하다.
상기 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된 것이 바람직하나 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 인간 성장 호르몬 단백질을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다.
상기 인간 성장 호르몬 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 소수성 아미노산은 황화결합이 가능한 아미노산인 것이 바람직하며, 상기 소수성 아미노산은 시스테인(Cysteine)인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 말단에 트랜스페린(transferrin)이 결합된 인간 성장 호르몬 변이 단백질과 트랜스페린의 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 트랜스페린이 연결되는 말단은 아미노 말단(5-말단, N-말단) 또는 카복시 말단(3-말단, C-말단) 중 어느 것이라도 가능하다.
상기 트랜스페린은 서열번호 2의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 트랜스페린 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질은 서열번호 3의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 융합 단백질은 서열번호 4로 표시된 것이 바람직하나 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 사용된 인간 성장 호르몬 단백질 또는 트랜스페린은 동물, 식물, 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 인간 유래 성장 호르몬 단백질 또는 트랜스페린인 것이 바람직하나, 인간 유래 성장 호르몬 단백질 또는 트랜스페린과 동등한 활성을 가지는 이종 유래 단백질일 수 있다.
상기 단백질에는 추가적으로 인산화, 아세틸화, 메틸화, 당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며, 다른 단백질과 결합할 수 있으나, 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다.
상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 염기서열로 치환한 것일 수 있고, 유전자 말단 부위의 일부가 제거, 치환, 또는 첨가되어 제한 효소 인식 부위가 삽입된 것일 수 있다. 예를 들어, 단백질 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 제한 효소의 종류에는 EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, XhoⅠ, FokⅠ, Alw26Ⅰ, BbvⅠ, BsrⅠ, EarⅠ, HphⅠ, MboⅠ, SfaNⅠ, Tth111Ⅰ, NaeⅠ, NheI, NgoMⅣ, NheI, Eco57Ⅰ, BcgⅠ, BpⅠ, Bsp24Ⅰ, BaeⅠ, CjeⅠ, EcoPⅠ, HintⅢ, StyLTⅠ 등이 있으며, 사용하고자 하는 유전자, 발현 벡터 또는 유전자 조작 환경에 따라 당업계에서 사용되는 모든 제한 효소가 제한 없이 이용될 수 있다.
상기 발현벡터는 도 1, 2, 3, 4로부터 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개열지도로 표시되는 벡터로부터 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 '발현 벡터'란 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 수단으로서, 플라스미드, 코스미드, BAC, 바이러스 핵산 등의 여러 형태를 포함한다. 상기 벡터에는 목적 유전자가 성공적으로 숙주세포에 도입되었음을 확인할 수 있는 항생제 내성 유전자 등의 선택적 마커를 포함하고 있는 것이 일반적이며, 목적 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열, 인핸서, 코작 서열, 샤인-달가노 서열 등을 목적에 따라 다양하게 포함할 수 있다. 복제 가능한 발현벡터의 경우 복제 기원을 포함한다.
상기 숙주세포는 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포, 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에서 재조합 단백질 생산에 사용되는 모든 숙주세포가 이용 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 경우 천연형 성장 호르몬(GH)의 아미노산 서열상 85번째 세린과 144번째 세린을 시스테인으로 치환하여 서로 이황화 결합을 이루도록 유도하였다. Free 시스테인 유무를 확인하여 간접적으로 85번과 144번 시스테인의 이황화 결합을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 인간 성장호르몬(hGH)과 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 세포 내 활성 분석결과, GHC3-P00-Th는 hGH 에 비하여 낮은 세포 증식 활성도를 보였다. 상기 결과를 바탕으로 EC50의 값을 산출하였다. 각각 계산된 EC50 값의 경우 hGH 0.07 ng/ml, GHC3-P00-Th 0.47 ng/ml 임을 확인하였다(도 12 참조). GHC3-P00-Th의 경우 분자량이 증가하여도 hGH-도메인의 생물학적 효능은 보존되는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 GHC3-P00-Th 단백질의 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성 정도를 측정하기 위하여, 단백질을 인간 혈청(Serum)과 반응 후, 정해진 시간에 혈청 내 잔존하는 GH의 양을 측정하였다. 천연형 GH의 경우 혈청과 반응시간이 증가함에 따라 잔존 양이 감소하며 15시간에서 30%인 것을 확인할 수 있으나, GHC3-P00-Th 단백질의 경우 15시간까지 단백질의 양에 큰 변화 없는 것을 확인할 수 있다(도 13 참조). 시스테인 85와 144 간의 이황화 결합 형성이 단백질의 단백질분해효소에 대한 저항성 증대에 도움을 주는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 단백질의 생체 반감기를 결정하기 위하여 생쥐에서 단백질을 투여 후 혈청 내에 존재하는 Growth Hormone의 양을 측정하였다. 그 결과, GHC3-P00-Th 융합 단백질은 천연형 인간 Growth Hormone보다 높은 혈중 반감기를 보였다(표 1 참조). 이는 Growth Hormone보다 상대적으로 큰 단백질 반경을 갖고 있기 때문에, 신장에서의 여과 속도가 느림을 보여 주는 결과이다. 또한 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성이 증대된 Growth Hormone 변이 단백질을 트랜스페린에 융합시킴으로서, 신장 여과 속도의 감소와 혈중 안정성이 모두 개선됨으로서 생체에서의 혈중 반감기가 극대화되어 나타난 결과이다(도 14 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질의 생체 내 활성 실험을 위해 실험동물로 뇌하수체가 제거된 5주령의 수컷 랫트(hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC사, 일본)를 사용하였으며, 뇌하수체가 제거된 랫트의 무게 증가 분석 결과, 용매 대조군을 투여한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 체중 증가가 거의 일어나지 않았으나, 인간 성장호르몬(hGH)와 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 하루에 1회씩 10일간 투여하였을 경우에는 투여 후 10일 차까지 지속적으로 체중이 증가하였고, 10일 차에서는 인간 성장호르몬(hGH)보다 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 체중 증가율이 3.53% 정도 더 높은 것으로 나타났다(도 15 참조). 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단회 투여하였을 경우에는 투여 후 3일까지는 지속적으로 체중이 증가하였으며, 7일 차까지는 인간 성장호르몬(hGH)을 투여한 군보다 우수한 활성을 유지하였다. 인간 성장호르몬(GHC3-P00-Th)을 단회 투여할 경우에는 효력이 월등하게 높았으며, 하루에 1회 투여하였을 경우에도 인간 성장호르몬(hGH)과 동등 이상의 효력을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 체중 증강 속도에 있어서 인간 성장호르몬(hGH)을 매일 주사 받은 랫트에 비해 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단회 투여 받은 랫트에서 초기 3일에 걸쳐 확연히 더욱 빠른 속도록 체중이 증가되었다. 따라서, 본 발명의 GHC3-P00-Th 은 hGH 와 비교하여 우수한 지속적인 활성을 가지며, 매일 주사를 맞아야 하는 인간 성장호르몬의 한계를 해결할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 Growth Hormone의 트랜스페린 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 혈청 내에 존재하는 IGF-1 단백질의 양을 측정하였다. ELISA 분석 결과, 시험물질 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)와 hGH 30 ug/rat(Daily)은 vehicle보다 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.01). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 vehicle에 비하여 5일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.05). 또한 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)은 10일 차까지 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 3일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001)(도 16 참조).
따라서, 본 발명의 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 트랜스페인 융합 단백질(GHC3-P00-Th)은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 성장부전 또는 성장지연은 뇌하수체 성장호르몬 분비장애, 만성 신장 질환(chronic renal disease), 터너증후군(Turner's syndrome), 악액질(cachexia) 또는 AIDS 소모(AIDS wasting)에 기인한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 유년기 개시형 결핍증 또는 성인기 개시형 결핍증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.
일회 투여량은 단백질의 양을 기준으로 1 내지 100 밀리그램이고, 바람직하게는 3 내지 50 밀리그램이고, 더욱 바람직하게는 6 내지 30밀리그램이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있으며, 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 트랜스페인 융합 단백질(GHC3-P00-Th)은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 플라스미드 제작
<1-1> 트랜스페린 발현 플라스미드 제작
트랜스페린 단백질을 얻기 위해, 인간 간암 세포인 HepG2을 이용하였다. HepG2 세포를 10% 태아 혈청(fetal bovine serum, WelGNE)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 포함된 DMEM(HyClone)을 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 항온기에서 계대배양하였다. 계대배양 후 이틀간 배양한 HepG2 세포의 배지를 제거하고 인산완충액(HyClone)을 이용하여 세척 후, 세포 펠렛을 수거하여 원심분리하여 배지를 제거 후 -70℃에 보관하여 사용하였다. -70℃에 보관되어 있던 세포를 꺼내 해동한 후 RNA 추출 키트(LeGene)을 사용하여 지침서에서 제시한 표준 조건으로 수행하여 총 mRNA를 얻었다. 얻어진 총 mRNA를 cDNA 합성 시스템(LeGene)으로 oligo(dT)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
만들어진 cDNA를 주형으로 DNA 중합효소(Phusion)를 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. 반응에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문제작하여 사용하였으며 트랜스페린 유전자의 5말단에 Nhe I 제한효소 부위, '코작(Kozak) 서열을 위치시키고 3'말단에 Xho I 제한 효소 부위, Stop 코돈(TAA)이 위치하도록 제작하였다. 센스프라이머(5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3', 서열번호 10) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', 서열번호 11)를 10 pmol로 사용하였고 cDNA 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μl로 하였다. PCR 기기를 이용하여 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃에서 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 원하는 부분의 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다.
정제를 통해 얻어진 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+)플라스미드(Invitrogen)를 각각 NheI(Enzynomics)과 XhoI(Enzynomics) 제한효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액(10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA)를 넣고 37℃에서 2 ~ 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 벡터를 T4 DNA 접합효소(Takara)와 함께 16℃에서 16시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환 하였고 엠피실린 항생제가 포함된 한천(Agar) 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다.
pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위해서 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 확인하였다. 대장균 콜로니를 증류수에 희석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머(5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3', 서열번호 10) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3, 서열번호 11)를 이용하였으며 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소 연쇄반응(PCR)이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 16시간 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 추출 키트(GeneAll)을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드의 염기서열 분석은 코스모진텍사에서 진행하여 확인하였다. 이렇게 만들어진 트랜스페린 발현 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/preTf(서열번호 5)로 명명한다(도 1).
플라스미드 제작 시 제한효소 BamHI 부위를 이용하기 위해 트랜스페린 유전자에 존재는 BamHI 부위를 위치선택적 돌연변이(site-direct mutagenesis)를 실시하여 BamHI 제한 효소 부위를 제거하는 작업을 하였다. 트랜스페린 유전자에 존재하는 BamHI 제한 효소 부위를 제거하기 위해 핵산을 타이민(Thymine, T)에서 사이토신(cytosine, C)로 치환하였으나 아미노산 서열은 아스파트산(Aspartic acid)으로 유지된다. BamHI 제한 효소 부위, GGATCC를 GGACCC로 핵산을 치환하기 위해 센스 프라이머(5'-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3', 서열번호 12) 및 안티센스 프라이머(5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3', 서열번호 13)를 코스모진텍사에서 주문 제작하여 사용하였다. 기 제작된 pcDNA3.1(+)/preTf 플라스미드를 주형으로 사용하였으며 위치선택적 돌연변이 키트(iNtRON)을 이용하여 제조사에서 제공하는 지침서대로 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 엠피실린 항생제가 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 추출 키트(GeneAll)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였고, 염기서열 분석을 통해 트랜스페린 유전자에 존재하는 BamHI 제한효소 부위의 핵산이 치환된 것을 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는pcDNA3.1(+)/preTf(B)(서열번호 6)로 명명한다(도 2).
트랜스페린은 분비 단백질로서 N-말단에 합성된 단백질이 세포막으로 전달되도록 도와주는 신호 펩타이드(Signal peptide)를 포함하고 있으며, 아미노산 서열은 MRLAVGALLVCAVLGLCLA(서열번호 14)이다. 인간 성장 호르몬 유전자를 트랜스페린 유전자의 5' 말단에 삽입하기 위하여 트랜스페린에 존재하는 신호 펩타이드를 제거하고 5' 말단에 제한효소 BamHI을 위치시킨 플라스미드를 제조하였다. 3' 말단에는 Xho I과 Stop 코돈(TAA)을 위치시켰다. pcDNA3.1(+)/preTf(B)를 주형으로 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 반응에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문 제작하여 사용하였다. 센스프라이머(5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3', 서열번호 15) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', 서열번호 11)를 10 pmol로 사용하였고 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충용액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μl로 하였다. PCR 기기를 이용하여 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드를 각각 BamHI(Enzynomics)와 XhoI(Enzynomics) 제한 효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액 2 μl(10 mM Tris-HCL pH 7.9,50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA)를 넣고 37℃에서 2 ~ 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 벡터를 다시 1% 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 DNA를 정량하였고, 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드를 T4 DNA 접합효소(Takara)를 첨가하여 16℃에서 16 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린이 포함된 한천 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지는 중합효소 연쇄반응을 통해 실행하였다. 대장균 콜로니를 물에 희석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머(5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3', 서열번호 15) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', 서열번호 11)를 이용하였으며 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였고 유전자삽입이 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 16시간 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 정제 키트(GeneAll)를 이용하여 정제하였다. 정제한 플라스미드는 염기서열분석을 통해 신호 펩타이드가 제거된 트랜스페린 유전자가 성공적으로 pcDNA3.1(+)에 삽입되었는지를 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/Tf(B)(서열번호 7)로 명명하였다(도 3).
<1-2> GHC3 -P00- Th 발현 플라스미드 제조
GH1(untagged)-Human growth hormone 1(GH1), transcript variant 1, NM_000515.3(OriGene, SC300088)을 구매하여 pCMV6-XL5 vector에 들어있는 인간 성장 호르몬을 주형으로 사용하였다. 주형과 함께 센스 프라이머(5'-ATAGCTAGCTCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3', 서열번호 16)와 안티센스 프라이머 (5'-TATGGATCCGAAGCCACAGCTGCCCTCCA-3', 서열번호 17)를 DNA 중합효소(Phusion)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자에는 N-말단에 합성된 단백질이 세포막으로 전달되도록 도와주는 신호 펩타이드가 포함되어 있으며, 아미노산 서열은 MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(서열번호 18)이다. 증폭된 유전자의 5' 말단에는 NheI 제한효소 부위와 코작(Kozak) 서열을, 그리고 3' 말단에는 BamHI 제한효소를 갖도록 유전자 절편을 조작하였다. 증폭된 Human growth hormone 유전자와 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 플라스미드를 각각 NheI과 BamHI 제한효소를 20 unit 넣고 37℃에서 3시간 반응시킨 후, 1% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 유전자를 분리한 후 DNA Clean up 키트(COSMO)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 T4 DNA 접합효소(Takara)를 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린이 포함된 한천 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 플레이트에서 대장균 콜로니를 선택하여 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 진탕배양하였다. 배양된 대장균을 원심 분리하여 상층액과 세포 펠렛으로 분리한 후 세포 펠렛을 ExprepTMPlasmidSV, mini(GeneAll)를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드는 코스모진텍사에서 염기서열분석을 통해 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/GHW-P00-Th(서열번호 8)로 명명하였다.
인간성장호르몬의 85번 아미노산 세린을 시스테인으로 치환하기 위해서 pcDNA3.1(+)/GHW-P00-Th를 주형으로 사용하여 위치선택적 돌연변이를 실시하였다. 센스 프라이머(5'-GCTGCTCATCCAGTGTTGGCTGGAGCCCG-3', 서열번호 19)와 안티센스 프라이머(5'-CGGGCTCCAGCCAACACTGGATGAGCAGC-3', 서열번호 20) 각각과 상기 주형과 및 DNA 중합효소를 넣고 연쇄중합반응 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 DpnI(Enzynomics)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거하였다. 반응이 끝난 후 5 μl를 DH10B에 넣어 형질전환하였고 엠피실린이 들어있는 플레이트에 도포하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 대장균 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지에서 다시 16시간 배양한 후 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛으로 분리한 후 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
85번 세린을 시스테인으로 치환한 DNA를 다시 주형으로 사용하여 144번 아미노산인 세린을 시스테인으로 치환하기 위한 추가적인 위치선택적 돌연변이를 실시하였다. 센스 프라이머(5'-TCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGACACACCC-3', 서열번호 21)와 안티센스 프라이머(5'-GTTTGTGTCGAACTTGCAGTAGGTCTGCTTGA-3', 서열번호 22)를 사용하여 유전자를 증폭하였다. 증폭된DNA를 DpnI(Enzynomics)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거하였다. 반응이 끝난 후 5 μl를 DH10B에 넣어 형질전환하였고 엠피실린이 들어있는 플레이트에 도포하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 대장균 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지에서 다시 16시간 배양한 후 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛으로 분리한 후 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/GHC3-P00-Th(서열번호 9)로 명명하였다(도 4).
< 실시예 2> 일시적 형질 전환을 통한 GHC3 -P00- Th 단백질의 발현
본 발명에 사용되는 단백질들은 부유배양을 위해 변형된 인간 배아 신장암 세포주인 Expi293FTM 세포(Gibco)를 이용하여 세포 밖으로 단백질들을 분비하여 발현하였다. Expi293FTMExpression system kit(Gibco)에 포함되어 있는 Expi293FTM 세포를 해동 후, 30 ml 현탁배양용 무혈청 배지(Serum-free media for animal cell culture, Gioco)가 담긴 멸균 125 ml 플라스크(Corning)에 접종하여 37℃, 5% 이산화탄소 항온 배양기에서 125 rpm의 교반 속도로 진탕배양하였다.
Expi293FTM 세포주를 3~5 x 106 cells/ml의 세포 밀도로 유지하며 3~4일마다 계대 배양하여 세포를 안정화시킨 후 형질전환을 위해 2 x 106 cells/ml의 세포 밀도로 무혈청 배지에 접종하여 24시간 진탕배양하였다. 형질 전환 직전에 세포의 밀도를 다시 2 x 106 cells/ml로 맞추고 세포의 생존능력이 96% 이상인지 확인하고 실험에 사용하였다.
플라스미드 대량 정제를 통해 준비된 pcDNA3.1(+)/GHC3-P00-Th DNA를 22.5 ug을 준비하여 Opti-MEM(Gibco)으로 희석하여 준비하고 ExpiFectaminTM 293Reagent 45 uL역시 Opti-MEM　 배지로 희석하여 실온에서 5분간 방치하였다. 플라스미드와 ExpiFectaminTM293Reagent 혼합물을 잘 섞어준 후 실온에서 20분간 방치하고 준비된 세포에 골고루 넣어 주었다. 형질전환 후 16~18시간 사이에 단백질 발현을 증가시키기 위해, 첨가물 Enhancer 1, 2(Gibco)를 넣고 다시 78시간을 상기 진탕배양 조건에서 배양하였다. 세포배양액을 4℃ 온도 조건에서 2,000 x g에서 10분간 원심 분리하여 상층액과 세포 펠렛을 분리하였다. 분리된 상층액에 단백질분해효소 저해제(Roche)와 80% sucrose를 5%가 되도록 첨가하여 -70℃에 보관하였다.
단백질 발현을 확인하기 위해, 상층액에 5 x loading dye(Biosesang)와 혼합하여 95℃에서 20분간 반응시키고 10% SDS PAGE 겔에 점적하여 160 V에서 1시간 동안 전기영동하였다. Gel을 분리하여 정제된 증류수로 세척한 후 단백질 염색시약(PageBlue protein staining Solution, Thermo)에 1시간 동안 반응하여 발색시킨다. 트랜스페린의 경우 약 75 kDa이며 인간 성장호르몬 변이 단백질과 융합한 GHC3-P00-Th의 분자량은 97 kDa으로 단백질이 정상적으로 발현되었음을 확인하였다(도 5a).
Western blot 방법으로 단백질 발현을 추가 확인하기 위하여 시료를 10% SDS PAGE 겔에 점적하여 전기영동한 후 Gel을 분리하여 PVDF 재질의 Immobilon-P-Transfer Membrane(Milipore)위에 올리고 단백질이 Membrane으로 이동하게 하였다. 인산완충용세척액(0.05% Tween20을 포함하는 인산완충용액)에 5% Skim milk를 혼합하여 준비한 후 Membrane을 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 인산완충 세척액으로 3회 세척한 후 인간 성장호르몬 항체(Santa Cruz)를 2,000배 인산완충 세척액에 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 다시 인산완충 세척액으로 3회 세척한 후 Horseradish perixidase가 결합된 이차 항체(Santa Crux)를 10,000배로 인산완충 세척액에 희석한 후 상온에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 다시 인산완충 세척액으로 3회 세척 후 기질(SuperSignal　WestPicoChemiluminescentSubstrate, Thermo)를 이용하여 발색시켜 단백질을 확인한다. GH와 GHC3-P00-Th를 인간 성장 호르몬 항체를 통해 확인하였다(도 5b).
< 실시예 3> 단백질 정제
<3-1> GHC3 -P00- Th 단백질 Q- 세파로즈 크로마토그래피
GHC3-P00-Th 배양액을 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 용액에 투석(dialysis) 하였다(투석진행시간: 4℃에서 16시간 이상 수행). AKTA prime plus FPLC에 hitrap Q HP, 5mL column을 장착한 후, 유속 3 mL/min으로 20 mM K2HPO4, pH7.5 buffer로 흘려주었다. Column을 평형화 시킨 후, 투석한 배양액을 주입하였다. 이후, NaCl 농도구배(step gradient)를 이용하여 레진에 흡착된 target 단백질을 용출하였다(도 6).
<3-2> 철( Fe 3 + )이 결합된 형태 제조
본 발명의 GHC3-P00-Th의 holo 형태 제조는 문헌[Zhang et al. BMC Biotechnology 2012, 12:92]에 기초하였다. 정제된 GHC3-P00-Th 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 대략적인 농도를 확인한 후, 단백질의 2배가 되는 구연산 철 암모늄을 처리하여 4℃에서 16시간 이상 반응시키고 Urea-PAGE를 통해 결합 형태를 확인하였다(도 7).
<3-3> GHC3 -P00- Th 단백질 size exclusion 크로마토그래피
남아 있는 자유 철 이온을 제거하기 위하여 size exclusion 크로마토그래피를 수행하였다. Hi-load 16/60 sepharcryl 120 mL column에 20 mM Tris, 75 mL NaCl, pH 8.0 완충액을 유속 1 ml/min으로 column 평형화를 한 후, 철 결합이 끝난 단백질을 5 mL loading 하여 저장용액 교환 및 남은 자유 철이온을 제거하였다(도 8). 철이온을 제거하는 도중 타겟 피크에 대해 구간별 reverse phase-HPLC(RP-HPLC)로 순도를 확인하였다. Waters alliance HPLC 장비에 ZORBAX 300SB-C18(4.6 X 50 mm)의 RP-HPLC column을 장착하고 0.1% TFA/Water로 평형화하였다. 평형화가 끝난 column에 GHC3-P00-Th 단백질이 용출된 구간을 40 mL 주입하고 0.1% TFA/acetonitrile의 농도를 점차 높여주며 50 분까지 측정한 결과, 각 구간별마다 27분대에 주 피크 외에 28분대에 불순물로 추정되는 피크가 포함되어 있는 구간도 발견되어 28분대 피크가 나오는 구간을 배제하고 단백질을 수득하였다(도 9).
<3-4> GHC3 -P00- Th 단백질 정량
정제된 GHC3-P00-Th 단백질은 SDS-PAGE를 이용해 정량하였다. ELISA로 정량한 인간성장호르몬 단백질을 이용하여 표준 정량 곡선용으로 well에 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 μg 을 주입하고, 정제한 시료를 희석하여 5 mL, 10 mL 처리하여 시료의 미지의 양을 표준 정량 곡선과 비교하여 단백질을 정량하였다.
<3-5> GHC3 -P00- Th 단백질 순도 확인
정제된 GHC3-P00-Th의 단백질에 대한 reverse phase-HPLC 및 size exclusion 크로마토그래피-HPLC로 불순물 및 순도 측정을 확인하였다. Waters alliance HPLC 장비를 이용하여 측정하였으며, SEC-HPLC column은 ZORBAX GF-250(4.6 X 250 mm)를 사용하였고, RP-HPLC column은 ZORBAX 300SB-C18(4.6 X 50 mm)를 사용하였다. Waters HPLC 장비에 SEC-HPLC column을 장착하고 20 mM tris + 75 mM NaCl, pH 8.0으로 평형화해준 후 GHC3-P00-Th 단백질을 50 mL 주입하여 20 min 동안 측정하였다. 측정한 결과, 4.3분대에서 타겟 피크가 용출되었으며 완충액의 기본 피크를 제거하면, 순도가 99.9%으로 측정되었다. 또한, Waters HPLC 장비에 reverse phase-HPLC column을 장착하고 0.1% TFA/Water로 평형화해준 후 GHC3-P00-Th 단백질을 50 mL 주입하고 0.1% TFA/acetonitrile의 농도를 점차 높여주며 50 분까지 확인한 결과에서는 27분대에서 타겟 피크가 용출되었으며 완충액의 기본 피크를 제거하면, 순도가 96.8%으로 측정되었다(도 10).
< 실시예 4> 단백질 내 Free 시스테인 잔기 유무 확인
GHC3-P00-Th 단백질의 경우 천연형 GH의 아미노산 서열상 85번째 세린과 144번째 세린을 시스테인으로 치환하여 서로 이황화 결합을 이루도록 유도하였다. 천연형 GH의 경우 53번째 아미노산과 165번, 182번과 189번 시스테인이 결합을 이루어 총 2개의 이황화 결합이 존재하며 결합하지 않은 시스테인(free 시스테인)은 존재하지 않는다. 그러므로 85번, 144번 아미노산을 시스테인으로 치환한 GHC3-P00-Th 단백질의 Free 시스테인 유무를 확인하여 간접적으로 85번과 144번 시스테인의 이황화 결합을 확인하였다.
시중에 판매되고 있는 Free 시스테인 또는 Free Thiol기의 유무를 확인할 수 있는 제품(Cayman Chemical)을 구매하여 확인하였다. GHC3-P00-Th, BSA 500 nM을 Thiol Fluorometric detector와 반응시킨 후 형광을 측정하였다. BSA의 경우 66 kDa 크기의 단백질로 하나의 Free 시스테인 잔기를 보유하고 있다. 형광측정은 385 nm에서 광원을 주고 515 nm에서 나오는 형광의 세기를 측정하였다.
각각의 단백질이 형광 Detector와 반응한 결과를 도 11에 나타내었다. Free 시스테인 잔기가 하나 존재하는 BSA와 비교하였을 때 낮은 형광 세기를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. GHC3-P00-Th 단백질 내의 Free 시스테인이 거의 없다는 것을 의미한다.
< 실시예 5> 인간 성장호르몬 변이 단백질의 생물학적 활성 측정
정제된 인간 성장호르몬 변이 단백질의 세포 내 활성을 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 성장호르몬 의존성 유사 분열을 하는 세포인 랫트 결절 림포종(rat node lymphoma) 세포주인 Nb2-11 세포(European Collection of Cell Cultures (ECACC) #97041101)를 이용하여 세포 내 활성을 비교 분석하였다.
Nb2-11 세포는 피셔 배양액(Fischer's medium)에 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 0.075% NaCO3, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 2 mM 글루타민 및 10% 말 혈청(HS, lactogen-deficient horse serum)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였으며, 2일-3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다. 세포는 부착 의존성이지 않다.
분석을 위해서 Nb2-11 세포는 10% FBS에서 1% FBS 배양액을 사용하여 약 2.5 x 105 세포/ml 이 되도록 조정한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후Nb2-11 세포주를 원심분리하여 수확하고 10% FBS를 제외한 동일한 배지로 세척한 다음, 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 μl 씩 넣어 웰 당 약 2 x104 세포가 되도록 분주하였다. 대조군으로 사용되는 인간 성장호르몬(hGH, GenScript), 시험물질인 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 각각 희석하여 Nb2-11 세포가 들어있는 각 웰에 농도별로 첨가한 후 72시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 시험물질의 세포 증식 활성도는 인간 성장호르몬(hGH) 동량으로 농도를 나타내었다. 시험물질 투여에 의한 세포의 증식 정도를 알아보기 위해 세포배양액에 10 ㎕의 alamarBlue (ThermoFisher SCIENTIFIC)시약을 첨가한 후 플레이트를 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 증가한 세포주의 숫자를 측정하고 분석하였다. alamarBlue 분석법으로 얻어진 흡광도 값으로 50%의 세포가 살아남도록 한 시료의 농도를 EC50(50% effective concentration)로 결정하였다.
본 발명의 인간 성장호르몬(hGH)과 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 세포 내 활성 분석결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, GHC3-P00-Th는 hGH 에 비하여 낮은 세포 증식 활성도를 보였다. 상기 결과를 바탕으로 EC50의 값을 산출하였다. 각각 계산된 EC50 값의 경우 hGH 0.07 ng/ml, GHC3-P00-Th 0.47 ng/ml 임을 확인하였다. GHC3-P00-Th의 경우 분자량이 증가하여도 hGH-도메인의 생물학적 효능은 보존되는 것으로 확인되었다.
< 실시예 6> 혈액 내 단백질 분해효소들에 대한 분해 저항성 측정
본 발명의 GHC3-P00-Th 단백질의 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성 정도를 측정하기 위하여, 단백질을 인간 혈청(Serum)과 반응 후, 정해진 시간에 혈청 내 잔존하는 GH의 양을 측정하였다.
구체적으로, 인간 혈청(SIGMA)을 56℃에서 약 30분간 불활성화시킨 후 2.8 μg/ml의 단백질 시료를 혈청과 24 :1 (v/v) 비율로 37℃ 조건에서 반응시켰다. 반응 시간은 0, 3, 6, 9, 12, 15 시간이며, 각 시간대마다 시료에 각각 Complete protease inhibitor cocktail(Roche)을 처리한 후 -70℃에 보관하여 반응을 종료시켰다. 잔존 단백질의 양을 확인하기 위하여 GH ELISA(RnDSystems)를 수행하였다. 수행 방법은 제조사의 매뉴얼을 참조하여 진행하였다.
흡광도에 따른 농도 환산은 표준액에 대한 단백질 농도-흡광도의 검량선에 기준하여 계산하였다. 표준곡선은 엑셀 프로그램을 이용하여 작성하였다. 각 GH, GHC3-P00-Th 단백질 표준액에 해당하는 흡광도의 평균값과 완충액만을 처리한 웰의 흡광도의 차이 값을 이용하였다. 잔존 GH 단백질 양(% GH)은 반응시간이 0 시간 일 때의 GH의 단백질 농도(pm/ml)를 100%로 기준으로 하여 표기하였다.
GH, GHC3-P00-Th 단백질의 시간대별 잔존 GH양(%)을 도 13에 나타내었다. 천연형 GH의 경우 혈청과 반응시간이 증가함에 따라 잔존 양이 감소하며 15시간에서 30%인 것을 확인할 수 있으나, GHC3-P00-Th 단백질의 경우 15시간까지 단백질의 양에 큰 변화 없는 것을 확인할 수 있다. 시스테인 85와 144간의 이황화 결합 형성이 단백질의 단백질분해효소에 대한 저항성 증대에 도움을 주는 것을 확인하였다.
< 실시예 7> hGH 변이 단백질의 생체 내 반감기 측정
본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 단백질의 생체 반감기를 결정하기 위하여 생쥐에서 단백질을 투여 후 혈청 내에 존재하는 Growth Hormone의 양을 측정하였다. 상기 기술된 "생체 내 반감기"는 "혈장 내 단백질의 반감기" 즉, Growth Hormone 단백질이 혈장 내에서 순환하면서 초기 농도에서 약 50% 남아있는 시간대를 수치화하여 나타낸다. 약물동역학적 계산은 R 프로그램을 사용하여 수행하였다.
<7-1> Growth Hormone 변이 단백질의 동물 투여 시험
본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질이 체내에 남아있는 기간을 측정하기 위해 동물실험을 실시하였다. 실험동물의 구입, 사육, 투여 및 혈액 채취 등의 전 과정을 한국의과학연구소에 의뢰하여 수행하였다.
실험동물은 6 주령의 Sprague-Dawley, 특정병원체 부재동물 (SPF) 수컷 생쥐 (mouse)를 오리엔트바이오로터 구입하여 사용하였다. 최소 7일 간의 순응기간을 거쳐 검역 및 순화기간 종료일에 개체 별 체중을 측정하였으며, 이때의 체중을 기초로 하여 체중증가 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동물을 선발하여 각 군의 평균 체중이 가능한 한 균등하도록 (동물 당 200g ± 20 %이내) 무작위로 배치하여 각 시험군당 8마리씩 구성하였다.
시험물질 투여 당일에 투여 직전 측정한 체중에 근거하여 개체 별 투여액량을 환산(5 mL/kg)한 후, 체중(kg) 당 50 ㎍ Growth Hormone 변이체 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 1회용 주사기(1 mL, 26 G needle)를 이용하여 피하 투여하였다. 투여일을 시험 1 일차(Day 1)로 정의하였다.
채혈은 경정맥을 이용하여 각 point 별(0, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h)로 채혈하며, 시험물질 투여 후 각 군당 4 수, 0.5 mL씩 교차 채혈하였다. 채혈 후 헤파린 튜브에 담아 3.000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후, 상층액인 혈장만을 분리하여 분주하였다. 검체는 -70 ℃ 이하로 설정되어 있는 Deep freezer에 보관하였다.
<7-2> Growth Hormone 변이 단백질의 생체 내 혈장 반감기의 측정
혈장 내 활성 Growth Hormone의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 ELISA를 통해 수치화하였다. ELISA를 통한 혈장 내 Growth Hormone의 정량은 R&D Human Growth Hormone ELISA Kit(R&D, Cat. DGH00)을 구입하여 수행하였으며, 실험방법은 해당 시약의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 표준액에 대한 단백질 농도에 따른 흡광도의 검량선을 작성하여 회귀분석을 통해 검액 중의 Growth Hormone 변이 단백질들의 함량을 결정하였다.
각 시험 화합물의 평균 농도-시간 프로파일로부터 비구획 약동학 분석을 R 프로그램에 non-compartment analysis input을 적용하여 수행하였다. 약동학 파라미터는 말단 반감기(t1/2)를 평가하였다.
Growth Hormone의 변이 단백질의 혈장 내 단백질의 반감기를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서 보는 바와 같이 GHC3-P00-Th 융합 단백질은 천연형 인간 Growth Hormone보다 높은 혈중 반감기를 보였다. 이는 Growth Hormone보다 상대적으로 큰 단백질 반경을 갖고 있기 때문에, 신장에서의 여과 속도가 느림을 보여 주는 결과이다. 또한 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성이 증대된 Growth Hormone 변이 단백질을 트랜스페린에 융합시킴으로서, 신장 여과 속도의 감소와 혈중 안정성이 모두 개선됨으로서 생체에서의 혈중 반감기가 극대화되어 나타난 결과이다(도 14).
혈장 내 단백질 반감기
파라미터(H) Growth Hormone GHC3-P00-Th
t1/2 1.62 12.16
< 실시예 8> 본 발명에 따른 GHC3 -P00- Th에 대한 생체 내 활성 실험
실험동물로 뇌하수체가 제거된 5주령의 수컷 랫트(hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC사, 일본)를 사용하였으며, 실험군을 4개 군으로 나누어 각 군당 다 5마리씩 이용하여 몸무게 증가 시험을 수행하였다. 군 분리는 15일간의 순화기간 동안 건강하다고 판정된 동물들의 체중을 측정하고 순위화한 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하였다. 군의 뇌하수체가 제거된 수컷 랫트에 인간 성장호르몬(hGH)를 랫트당 30 ㎍, 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)를 랫트당 30 ㎍, 용매 대조군(vehicle)을 1회/일, 10일간 반복 투여하였으며, 인간 성장호르몬 변이 단백질 (GHC3-P00-Th)을 랫트당 200 ㎍으로 투여하는 경우는 단회 투여하였다. 아래의 표 2와 같은 투여 용량 및 방법으로 피하 주사하였고, 주사 후 랫트의 체중은 매일 측정하였다.
본 발명의 GHC3-P00-Th의 뇌하수체가 제거된 랫트의 무게 증가 분석 결과는 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 용매 대조군을 투여한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 체중 증가가 거의 일어나지 않았으나, 인간 성장호르몬(hGH)와 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 하루에 1회씩 10일간 투여하였을 경우에는 투여 후 10일 차까지 지속적으로 체중이 증가하였고, 10일 차에서는 인간 성장호르몬(hGH)보다 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 체중 증가율이 3.53% 정도 더 높은 것으로 나타났다. 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단회 투여하였을 경우에는 투여 후 3일까지는 지속적으로 체중이 증가하였으며, 7일 차까지는 인간 성장호르몬(hGH)을 투여한 군보다 우수한 활성을 유지하였다. 인간 성장호르몬(GHC3-P00-Th)을 단회 투여할 경우에는 효력이 월등하게 높았으며, 하루에 1회 투여하였을 경우에도 인간 성장호르몬(hGH)과 동등 이상의 효력을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 체중 증강 속도에 있어서 인간 성장호르몬(hGH)을 매일 주사 받은 랫트에 비해 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단 회 투여받은 랫트에서 초기 3일에 걸쳐 확연히 더욱 빠른 속도록 체중이 증가되었다(도 15).
또한, 도 17에 나타낸 바와 같이 유리된 철 이온을 제거한 GHC3-P00-Th의 경우에도 단 회 투여한 경우 초기 3일에 걸쳐 빠른 속도로 체중이 증가하는 것을 확인하였다(도 17).
따라서, 본 발명의 GHC3-P00-Th 은 hGH 와 비교하여 우수한 지속적인 활성을 가지며, 매일 주사를 맞아야 하는 인간 성장호르몬의 한계를 해결할 수 있을 것으로 기대된다.
번호 시험물질 N 경로 투여량 (ug/head) 투여액량 (mL/head) 투여방법
1 Vehicle 5 s.c. 1회/일, 10일간 반복투여
2 hGH(GenScript) 5 s.c. 30 7 1회/일, 10일간 반복투여
3 GHC3-P00-Th 5 s.c. 30 7 1회/일, 10일간 반복투여
4 GHC3-P00-Th 5 s.c. 200 7 1회 투여
<실시예 9> IGF-1 단백질의 생체 내 혈장 농도 측정
본 발명의 Growth Hormone의 트랜스페린 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 혈청 내에 존재하는 IGF-1 단백질의 양을 측정하였다. 실험동물의 구입, 사육, 투여 및 혈액 채취, IGF-1 농도 분석 등의 전 과정을 한국의과학연구소에 의뢰하여 수행하였다.
시험물질 투여 전 및 투여 개시 후 10 일 동안 1 회/일 경정맥에서 주사기를 이용하여 채혈을 실시하였다. 혈액은 Clot activator가 들어 있는 vacutainer tube에 주입하고 약 15 분간 실온에 방치하여 응고시킨 후 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 ELISA kit를 사용하여 IGF-1을 정량하였다.
ELISA 분석 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 시험물질 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)와 hGH 30 ug/rat(Daily)은 vehicle보다 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.01). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 vehicle에 비하여 5일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.05). 또한 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)은 10일 차까지 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 3일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001)(도 16).
본 발명은 인간 성장호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
서열번호 1: FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
서열번호 2: VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP
서열번호 3: FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQCWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYCKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
서열번호 4: FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQCWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYCKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGSVPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP
서열번호 5: GAGAAAATGCTCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCCGTAGACCTTAA
서열번호 6: GAGAAAATGCTCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCCGTAGACCTTAA
서열번호 7: CTGTGAAGTGGTGTGCGCTGAGCCACCACGAGAGGCTCAAGTGTGATGAGTGGAGTGTTAACAGTGTAGGGAAAATAGAGTGTGTATCAGCAGAGACCACCGAAGACTGCATCGCCAAGATCATGAATGGAGAAGCTGATGCCATGAGCTTGGATGGAGGGTTTGTCTACATAGCGGGCAAGTGTGGTCTGGTGCCTGTCTTGGCAGAAAACTACAATAAGAGCGATAATTGTGAGGATACACCAGAGGCAGGGTATTTTGCTGTAGCAGTGGTGAAGAAATCAGCTTCTGACCTCACCTGGGACAATCTGAAAGGCAAGAAGTCCTGCCATACGGCAGTTGGCAGAACCGCTGGCTGGAACATCCCCATGGGCCTGCTCTACAATAAGATCAACCACTGCAGATTTGATGAATTTTTCAGTGAAGGTTGTGCCCCTGGGTCTAAGAAAGACTCCAGTCTCTGTAAGCTGTGTATGGGCTCAGGCCTAAACCTGTGTGAACCCAACAACAAAGAGGGATACTACGGCTACACAGGCGCTTTCAGGTGTCTGGTTGAGAAGGGAGATGTGGCCTTTGTGAAACACCAGACTGTCCCACAGAACACTGGGGGAAAAAACCCTGATCCATGGGCTAAGAATCTGAATGAAAAAGACTATGAGTTGCTGTGCCTTGATGGTACCAGGAAACCTGTGGAGGAGTATGCGAACTGCCACCTGGCCAGAGCCCCGAATCACGCTGTGGTCACACGGAAAGATAAGGAAGCTTGCGTCCACAAGATATTACGTCAACAGCAGCACCTATTTGGAAGCAACGTAACTGACTGCTCGGGCAACTTTTGTTTGTTCCGGTCGGAAACCAAGGACCTTCTGTTCAGAGATGACACAGTATGTTTGGCCAAACTTCATGACAGAAACACATATGAAAAATACTTAGGAGAAGAATATGTCAAGGCTGTTGGTAACCTGAGAAAATGCTCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCCGTAGACCTTAA
서열번호 8: CCCCATGGGCCTGCTCTACAATAAGATCAACCACTGCAGATTTGATGAATTTTTCAGTGAAGGTTGTGCCCCTGGGTCTAAGAAAGACTCCAGTCTCTGTAAGCTGTGTATGGGCTCAGGCCTAAACCTGTGTGAACCCAACAACAAAGAGGGATACTACGGCTACACAGGCGCTTTCAGGTGTCTGGTTGAGAAGGGAGATGTGGCCTTTGTGAAACACCAGACTGTCCCACAGAACACTGGGGGAAAAAACCCTGATCCATGGGCTAAGAATCTGAATGAAAAAGACTATGAGTTGCTGTGCCTTGATGGTACCAGGAAACCTGTGGAGGAGTATGCGAACTGCCACCTGGCCAGAGCCCCGAATCACGCTGTGGTCACACGGAAAGATAAGGAAGCTTGCGTCCACAAGATATTACGTCAACAGCAGCACCTATTTGGAAGCAACGTAACTGACTGCTCGGGCAACTTTTGTTTGTTCCGGTCGGAAACCAAGGACCTTCTGTTCAGAGATGACACAGTATGTTTGGCCAAACTTCATGACAGAAACACATATGAAAAATACTTAGGAGAAGAATATGTCAAGGCTGTTGGTAACCTGAGAAAATGCTCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCCGTAGACCTTAA
서열번호 9: CCCCATGGGCCTGCTCTACAATAAGATCAACCACTGCAGATTTGATGAATTTTTCAGTGAAGGTTGTGCCCCTGGGTCTAAGAAAGACTCCAGTCTCTGTAAGCTGTGTATGGGCTCAGGCCTAAACCTGTGTGAACCCAACAACAAAGAGGGATACTACGGCTACACAGGCGCTTTCAGGTGTCTGGTTGAGAAGGGAGATGTGGCCTTTGTGAAACACCAGACTGTCCCACAGAACACTGGGGGAAAAAACCCTGATCCATGGGCTAAGAATCTGAATGAAAAAGACTATGAGTTGCTGTGCCTTGATGGTACCAGGAAACCTGTGGAGGAGTATGCGAACTGCCACCTGGCCAGAGCCCCGAATCACGCTGTGGTCACACGGAAAGATAAGGAAGCTTGCGTCCACAAGATATTACGTCAACAGCAGCACCTATTTGGAAGCAACGTAACTGACTGCTCGGGCAACTTTTGTTTGTTCCGGTCGGAAACCAAGGACCTTCTGTTCAGAGATGACACAGTATGTTTGGCCAAACTTCATGACAGAAACACATATGAAAAATACTTAGGAGAAGAATATGTCAAGGCTGTTGGTAACCTGAGAAAATGCTCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCCGTAGACCTTAA
서열번호 10: CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC
서열번호 11: AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG
서열번호 12: CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT
서열번호 13: AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG
서열번호 14: MRLAVGALLVCAVLGLCLA
서열번호 15: CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG
서열번호 16: ATAGCTAGCTCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC
서열번호 17: TATGGATCCGAAGCCACAGCTGCCCTCCA
서열번호 18: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA
서열번호 19: GCTGCTCATCCAGTGTTGGCTGGAGCCCG
서열번호 20: CGGGCTCCAGCCAACACTGGATGAGCAGC
서열번호 21: TCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGACACACCC
서열번호 22: GTTTGTGTCGAACTTGCAGTAGGTCTGCTTGA

Claims (19)

  1. 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인간 성장 호르몬 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된 것을 특징으로 하는 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 황화결합이 가능한 아미노산인 것을 특징으로 하는 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 시스테인(Cysteine)인 것을 특징으로 하는 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
  5. 제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자.
  6. 제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제 6항의 발현 벡터가 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포 및 인간을 제외한 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  8. 제 1항의 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 말단에 트랜스페린(transferrin)이 결합된 인간 성장 호르몬 변이 단백질과 트랜스페린의 융합 단백질.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4로 표시된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제 8항의 단백질을 암호화하는 유전자.
  11. 제 8항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 염기서열로 치환한 것인 발현벡터.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민(Thymine)을 사이토신(Cytosine)으로 치환한 것인 발현벡터.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 말단에 제한효소 인식부위를 추가적으로 포함하는 것인 발현벡터.
  15. 제 11항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  16. 제 11항의 발현벡터가 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포 및 인간을 제외한 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  17. 제 1항의 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 제 8항의 융합 단백질, 제 6항의 벡터, 제 11항의 벡터, 제 7항의 형질전환체 또는 제 16항의 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 성장부전 또는 성장지연은 뇌하수체 성장호르몬 분비장애, 만성 신장 질환(chronic renal disease), 터너증후군(Turner's syndrome), 악액질(cachexia) 또는 AIDS 소모(AIDS wasting)에 기인한 것인, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물.
  19. 제 1항의 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 제 8항의 융합 단백질, 제 6항의 벡터, 제 11항의 벡터, 제 7항의 형질전환체 또는 제 16항의 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 유년기 개시형 결핍증 또는 성인기 개시형 결핍증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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WO2023142109A1 (zh) * 2022-01-30 2023-08-03 领诺(上海)医药科技有限公司 一种长效重组人生长激素及其应用
CN116554343A (zh) * 2022-01-30 2023-08-08 领诺(上海)医药科技有限公司 一种长效重组人生长激素及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929273T2 (de) * 1988-08-24 2001-07-05 American Cyanamid Co., Wayne Stabilisierung von Somatotropinen durch Modifikation von Cystein-Resten durch orts-spezifische Mutagenese oder chemische Derivatisierung
JPH1192499A (ja) * 1997-09-22 1999-04-06 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd ヒト成長ホルモン変異体
RU2012134974A (ru) * 2010-01-22 2014-02-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Стабилизированное соединение гормона роста
CN103509102B (zh) * 2012-06-15 2015-07-22 郭怀祖 野生型人生长激素突变体

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023142109A1 (zh) * 2022-01-30 2023-08-03 领诺(上海)医药科技有限公司 一种长效重组人生长激素及其应用
CN116554343A (zh) * 2022-01-30 2023-08-08 领诺(上海)医药科技有限公司 一种长效重组人生长激素及其应用

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