CN101228185A

CN101228185A - 促红细胞生成蛋白的重组生产方法

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Publication number: CN101228185A
Application number: CNA2006800264925A
Authority: CN
Inventors: V·莫拉瓦拉帕特尔
Original assignee: Jean-Michel Grinenberger Technology Co Ltd In
Current assignee: Jean-Michel Grinenberger Technology Co Ltd In
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2008-07-23
Also published as: ZA200711011B; EP1888630A2; AP2007004249A0; AU2006250885A1; CA2609473A1; JP2009502117A; KR20080026113A; WO2006126066A2; BRPI0611405A2; US20090029907A1; IL187399A0; RU2007147422A; WO2006126066A3

Abstract

本发明涉及用于生产高度糖基化形式(相对于天然EPO中3个N连接的糖基化，总共5个N连接的糖基化)的促红细胞生成素的重组方法。所增加的糖基化位点将产生更多数目的糖链，以及比人EPO更高的唾液酸含量，这将使得该重组分子的半衰期更长。本发明还涉及包含编码高度糖基化形式的促红细胞生成素的核酸序列表达盒的构建，以及在宿主细胞中的稳定表达。本发明还涉及用于纯化促红细胞生成蛋白的优化方法。本发明的重组EPO及其盐和功能衍生物，可以包含药物组合物中用于增加血细胞比容的活性成分，因此可用于治疗贫血症以及恢复患者的健康状况和生活质量。

Description

促红细胞生成蛋白的重组生产方法

发明领域

本发明涉及用于生产高度糖基化形式(相对于天然EPO中3个N连接的糖基化，总共5个N连接的糖基化)的促红细胞生成素的重组方法。所增加的糖基化位点将产生更多数目的糖链，以及比人EPO更高的唾液酸含量，这将使得该重组分子的半衰期更长。

本发明还涉及表达盒的构建，该表达盒包含编码高度糖基化形式的促红细胞生成素的核酸序列，以及涉及在宿主细胞中的稳定表达。

本发明更涉及用于纯化促红细胞生成蛋白(erythropoiesisstimulating protein)的优化方法。

本发明的重组EPO及其盐和功能衍生物，可以包含药物组合物中用于增加血细胞比容的活性成分，因此可用于治疗贫血症以及恢复患者的健康状况和生活质量。

发明背景

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，是红细胞生成或者将身体红细胞总量维持在最适宜水平的主要调节因子。作为对组织氧合作用减少的反馈，EPO在肾脏中的合成增加。分泌的激素结合到骨髓中红细胞前体表面的特异性受体上，从而调节红细胞前体的存活、增殖、分化以及最终增加血细胞比容(红细胞体积与全血体积的比率)。

自从10多年前，引入重组人EPO(rHuEPO)后，它已成为治疗慢性肾衰竭(CRF)相关的贫血症的治疗标准，在治疗贫血症、恢复能量水平以及提高患者的健康状况和生活质量方面非常有效，还被批准用于癌症、HIV感染相关的贫血症，以及用于外科手术以减少异源输血的需要。

用rHuEPO治疗通常推荐的是通过皮下注射或静脉注射，每周2-3次。对于CRF患者，治疗的持续时间是患者的一生，或者直到成功进行了肾移植，恢复了肾脏功能，包括促红细胞生成素激素产生的功能。对于癌症患者，通常会贯穿整个化学治疗过程，只要贫血症持续，就需要进行rHuEPO治疗。然而，商业化可得到的蛋白疗法例如EPO的生物利用度，由于其血浆半衰期较短、对蛋白酶降解的敏感性而受到限制。

因此，本发明的目的是提供一种重组方法，用于生产分开的和分离的促红细胞生成素同等型，该同等型具有确定的唾液酸含量、更长的半衰期且因此增加的生物活性。

发明概述

本发明还提供的是新颖必需的生物学功能和掺入本发明DNA序列的环状质粒DNA载体，以及用所述载体稳定转化或转染的宿主生物体。

本发明相对提供的是用于生产有用多肽的新方法，该新方法包括在促使携带DNA序列的外源载体大规模表达的条件下，培养生长这些已转化或者已转染的宿主；从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜片段中分离出所需多肽。

本发明的一个方面，涉及包含有编码高度糖基化形式的促红细胞生成素的核酸序列的表达盒的构建。

与未修饰的EPO和常规的EPO-PEG缀合物相比，本发明所述蛋白的循环半衰期和血浆保留时间增加，清除时间减少，临床体内活性增加。本发明的重组EPO及其盐和功能性衍生物，可以包含药物组合物中用于增加血细胞比容值的活性成分，因此可用于治疗贫血症以及恢复患者的健康状况和生活质量。

对于本领域的技术人员来说，结合下文为实施本发明而提供优选实施方案的发明详述，本发明的许多方面和优势将会是显而易见的。

附图和序列详细描述

SEQ ID No.1：编码新的促红细胞生成蛋白(novel Erythropoetinstimulating protein，简写nesp，Nesp，NESP)的核苷酸序列。

SEQ ID No.2：编码新的促红细胞生成蛋白的核苷酸序列的密码子优化形式。

SEQ ID No.3：NESP或者达依泊汀α(Darbepoietin alfa)的氨基酸序列。

图1：编码新的促红细胞生成蛋白的DNA核苷酸序列的未优化形式和密码子优化形式的配对序列比对图。

图2：促红细胞生成蛋白的从头合成的优化cDNA序列(AVCIP-Nesp-Opt)与促红细胞生成蛋白已确立的和进一步优化的序列(合成Nesp-Opt)的序列比对图。

图3：促红细胞生成蛋白的从头合成的cDNA序列(AVCIP-Nesp)与促红细胞生成蛋白的已确立序列(合成Nesp)的序列比对图。

图4：载体和插入片段的限制酶切消化图。

图5：AVCIP-Nesp、AVCIP-Nesp-Opt和pcDNA3.1D/V5-His的限制酶切消化片段的凝胶纯化图。

图6：AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp假定克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt假定克隆的限制酶切消化分析图。

图7：用从内切开AVCIP-Nesp cDNA和AVCIPNesp-Opt cDNA的酶，对AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆的限制酶切消化分析。

图8：AVCIP-Nesp-Opt 4号cDNA克隆(合成Nesp-Opt)与已确立的Nesp-Opt基因序列的序列比对图。

图9：AVCIP-Nesp 9号cDNA克隆(合成Nesp)与已确立的Nesp基因序列的序列比对图。

图10：AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp构建体图谱。

图11：AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt构建体图谱。

图12：pcDNA3.1/NESP(天然序列)。

图13：pcDNA3.1/NESP(优化序列)。

图14：用兔抗人促红细胞生成素抗体(2ug/ml)对用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(优化序列)和Aranesp^TM转染的CHO K1细胞系的总细胞裂解物的蛋白质印迹分析。

图15：稳定细胞系开发的流程图。

图16：挑选用于开发表达达依泊汀α(Darbepoetin alfa)的稳定CHO K1细胞系的集落图快照。

发明详述

本发明提供用于生产促红细胞生成素同等型的可选择的新的重组方法。根据本发明获得的特殊促红细胞生成素同等型及其性质，随原料的来源不同可能有所不同。在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于生产促红细胞生成素同等型的可选择的新的重组方法，该同等型在5个位置(Ala 30 Asn；His 32 Thr；Pro 87 Val；Trp 88 Asn和Pro 90 Thr)上不同于重组人促红细胞生成素(recombinant humanErythropoietin，rHuEPO)和天然的人EPO。

本文使用的术语“促红细胞生成素同等型(erythropoietin isoform)”是指有单一等电点(pI)，以及有相同氨基酸序列的促红细胞生成素制备物。本文所用的术语“促红细胞生成素(erythropoietin)”，包括天然产生的促红细胞生成素、尿源的人促红细胞生成素以及非天然产生的多肽，所述非天然产生的多肽具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学性质，还具有天然产生的促红细胞生成素的氨基酸序列和充分复制的糖基化形式。

依照本发明，通过从头合成方法得到编码高度糖基化形式的人促红细胞生成素的DNA序列。对于将使用的具体哺乳动物细胞，这一方法将能够使密码子得以更好的优化。此外，合成DNA用于真核/原核表达目的，提供可分离数量的、显示天然产生的促红细胞生成素(EPO)生物学特性以及EPO的体内和体外生物活性的多肽。

下面的实施例用于说明本发明，具体涉及在鉴定编码EPO的猴cDNA克隆和人基因组克隆之前所实施的方法，进行所述鉴定的方法，以及测序方法、表达系统的开发和EPO在所述系统中表达的免疫学验证方法。

实施例1：重组促红细胞生成蛋白(NESP)的合成

通过从头合成方法得到编码高度糖基化形式的人促红细胞生成素的DNA序列。对于将使用的具体哺乳动物细胞，这一方法将能够使密码子得以更好的优化。此外，合成DNA用于真核/原核表达目的，提供可分离数量的、显示天然产生的促红细胞生成素(EPO)生物学特性以及EPO的体内和体外生物活性的多肽。

编码促红细胞生成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。与编码促红细胞生成素的人基因的天然产生的转录物相比，在所述促红细胞生成蛋白中因掺入额外的糖基化位点而发生改变的核苷酸残基用大写字母突出显示。

作为密码子优化过程的一部分，已改变促红细胞生成蛋白编码区中的密码子，以保证重组蛋白可在哺乳动物细胞系(例如CHO K1和HEK 293)中最佳化表达。编码促红细胞生成蛋白的密码子优化核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码促红细胞生成蛋白的未优化核苷酸序列和密码子优化核苷酸序列的配对序列比对见图1。

本发明的促红细胞生成蛋白的完整一级氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。与天然产生的人EPO相比，已将发生改变的NESP氨基酸残基突出显示。

实施例2：编码促红细胞生成蛋白的从头合成的cDNA的真实性验证

从头合成的原始cDNA序列(AVCIP-Nesp)和密码子优化cDNA序列(AVCIP-Nesp-Opt)，通过自动化DNA测序法进行真实性验证，所得结果见图2和图3。

实施例3：将AVCIP-Nesp和AVCIP-Nesp-Opt cDNA亚克隆到哺乳动物细胞特异性表达载体pcDNA3.1D/V5-His中

将从头合成的原始cDNA序列(AVCIP-Nesp)和密码子优化cDNA序列(AVCIP-Nesp-Opt)分别亚克隆到哺乳动物细胞特异性表达载体pcDNA3.1D/V5-His中，以产生即用于转染的构建体。所用方法的细节见下文：

A.试剂和酶：

1.QIAGEN凝胶提取试剂盒和PCR纯化试剂盒

2.pcDNA3.1D/V5-His载体DNA(Invitrogen)

所有反应均按照生产商推荐的步骤进行。每个反应都将提供的10x反应缓冲液稀释成1x终浓度。

B.载体和插入片段的限制酶切消化：

方法

使用下列DNA样品和限制性内切酶：

限制性内切酶消化反应：

将反应物混匀，短暂离心并在37℃孵育2小时。用琼脂糖凝胶电泳分析限制酶切消化产物。观察到预期的酶消化谱，可见～600bp的基因片段(对3号反应和4号反应)和一条～5.5kb的载体主链片段(对1号反应和2号反应)为结果特征(图4)。

用连接反应混合物转化JM109感受态细胞

将代表AVCIP-Nesp cDNA和AVCIP-Nesp-Opt cDNA的～600bpDNA片段，用QIAGEN凝胶提取试剂盒，按照凝胶提取的方法分别纯化。哺乳动物表达载体pcDNA3.1D/V5-His已消化的～5.5kb载体主链也用相同的试剂盒纯化。

后续限制酶切消化和凝胶提取必需的cDNA片段和载体DNA片段，每一纯化的DNA样品取小样(1-2μl)，用琼脂糖凝胶电泳分析检查纯度和完整性，见图5。

C.pcDNA3.1D/V5-His主链与AVCIP-Nesp cDNA和AVCIP-Opt-Nesp cDNA的连接

估计已消化和已纯化的载体和插入片段的DNA浓度，并以下列方式建立连接反应：

将反应物轻轻地混匀，短暂离心并在室温孵育2-3小时。用连接反应混合物转化JM109感受态细胞。

D.AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp假定克隆和

AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt假定克隆的限制酶切消化分析

将质粒DNA从含有氨苄青霉素的L.B琼脂平板上获得的菌落中分别纯化出来。并通过限制酶切消化分析分离的质粒DNA，证实所需的cDNA插入片段存在，见图6。

在限制酶切消化含有AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt的几个假定克隆后，根据所得结果，选出一些已显示出所需限制酶谱的克隆，用能从内切开AVCIP-Nesp和AVCIPNesp-Opt cDNA，并产生不同大小片段的限制性内切酶进行进一步的限制酶切消化分析，见图7。

E.通过DNA测序验证所选择的AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆

根据限制酶切分析结果而选择的AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆，通过自动化DNA测序进一步进行验证。

名称	引物描述	序列
名称	引物描述	序列	T7测序引物	Invitrogen试剂盒引物	5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆显示与模板序列具有100％同一性，见图8和图9。

用从头合成的AVCIP-Nesp cDNA和AVCIP-Nesp-Opt cDNA制备的重组表达构建体的图谱，见图10和图11。

实施例4：cDNA融合构建体的维持和繁殖

编码新的促红细胞生成蛋白的cDNA构建体，在标准细菌细胞系例如Top10(Invitrogen)中维持和繁殖。

实施例5：在CHO-K1细胞中瞬时/稳定表达重组蛋白

(a)促红细胞生成蛋白在CHO K1细胞中的瞬时表达：

用优化的质粒DNA转染实验方案，以：

1.pcDNA3.1/NESP(天然序列)

2.pcDNA3.1/NESP(优化序列)

转染CHO细胞。

CHO K1贴壁细胞的瞬时转染

1.转染前一天，将细胞按1ml生长培养基(D-MEM/F 1∶1)1x10⁵个的密度接种到24孔板的各孔内。转染当天，已接种的细胞数量应产生80％汇合。

2.将该细胞在其正常生长条件(通常37℃和5％CO₂)下孵育。

3.转染当天，A管-将2μg溶于TE缓冲液(pH7-pH8)的DNA(DNA最低浓度为：0.1μg/μl)用Opti-MEM^TM稀释，至总体积为100μl。混匀并短暂离心几秒钟以除去试管顶部的液滴。

4.B管-在100μl Opti-MEM^TM中加入6μl Lipofectamine^TM 2000转染试剂，并置于室温5分钟。

5.通过上下吸打5次使A管和B管的内容物混匀。

6.将样品在室温(15-25℃)下孵育1 5分钟，以形成转染复合物。

7.当形成复合物时，从培养皿中轻轻地吸出生长培养基，并用2ml PBS洗涤细胞一次。

8.将0.1ml细胞Opti-MEM^TM加入到含有转染复合物的反应管中。通过上下吸打两次混匀，并立即将全部体积量转移到24孔板的一个孔内。

9.将细胞与转染复合物在其正常生长条件下孵育6小时。

10.通过轻轻地吸取，从细胞中除去含有残留复合物的培养基，并用4ml PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤细胞一次。

11.加入新鲜的细胞生长培养基(含有血清和抗生素)。经过适当的孵育时间后，测定细胞对已转染基因的表达。

将这些转染的细胞用抗促红细胞生成素抗体染色，以评价该蛋白的表达。如图12和图13所示，用两套瞬时转染实验检测所述蛋白的特异性表达。它们代表用pcDNA3.1/NESP(天然序列)和pcDNA3.1/NESP(优化序列)独立转染的CHO K1细胞系。

(b)通过蛋白质印迹法检测促红细胞生成蛋白在转染的CHO K1细胞系中的瞬时表达

从用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(优化序列)独立转染的CHO K1细胞系制备总细胞裂解物。转染后48小时，制备细胞裂解物，在细胞裂解物转印到PVDF膜上之前，用12％SDS-PAGE电泳分离这两个不同量的总蛋白制备物(10μg和20μg)。然后，将该PVDF膜用2μg/ml的兔抗人促红细胞生成素抗体进行探测，所得结果见图14。

从图8显而易见，在用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(优化序列)转染的CHO K1细胞系的总细胞裂解物中，在更高的所用蛋白制备物浓度(～20μg)下，特异性检测到促红细胞生成蛋白的存在。发现经转染的CHO K1细胞系的细胞裂解物中存在的所述促红细胞生成蛋白的电泳迁移率，与在治疗剂Aranesp^TM中观察到的促红细胞生成蛋白的电泳迁移率相匹配，因此说明已表达重组蛋白的预期高度糖基化性质。

(c)表达促红细胞生成蛋白的稳定CHO K1细胞系的开发

DNA整合到染色体上，或者以稳定的附加型载体维持，其中已知报告基因和其它基因将以相对低的频率出现。使用编码对致死药物抗性的基因可以对这些细胞作出选择。这种组合的一个实例是新霉素磷酸转移酶标记基因以及药物Geneticin^TM。药物处理后幸存的个体细胞扩大为可被单独选择、繁殖和分析的克隆类群。描述这些与开发稳定系有关的步骤的流程图见图15。

实验方案2：CHO K1贴壁细胞的稳定转染

2.将该细胞在其正常生长条件(通常37℃和5％CO₂)下孵育。

3.转染当天，A管-将2μg溶于TE缓冲液(pH7-pH8)的DNA(DNA最低浓度为：0.1μg/μl)用Opti-MEM稀释，至总体积为100μl。混匀并短暂离心几秒钟以除去试管顶部的液滴。

4.B管-在100μl Opti-MEM中加入6μl Lipofectamine 2000转染试剂，并置于室温5分钟。

5.通过上下吸打5次使A管和B管的内容物混匀。

6.将样品在室温(15-25℃)下孵育15分钟，以形成转染复合物。

8.将0.1ml细胞Opti-MEM加入到含有转染复合物的反应管中。通过上下吸打两次混匀，并立即将全部体积转移到24孔板的一个孔内。

9.将细胞与转染复合物在其正常生长条件下孵育6小时。

10.通过轻轻地吸取，从细胞中除去含有残留复合物的培养基，并用4ml PBS洗涤细胞一次。

11.加入新鲜的细胞生长培养基(含有血清和抗生素)。在适当的孵育时间后，测定细胞对已转染的基因的表达。

12.将细胞按1∶10-1∶15转到适当的选择培养基中，在其正常生长条件下维持细胞在选择培养基中生长，直到出现集落。

实施例6：表达促红细胞生成蛋白的稳定CHO K1细胞系的选择

用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(优化序列)转染的瞬时表达CHO细胞用胰蛋白酶消化，并用含1mg/mlGeneticin^TM的选择培养基稀释。将该细胞在选择培养基中孵育14天直到可以分离出集落(图2A和2B)。在无菌条件下，总共挑选出89个pcDNA3.1 NESP(天然序列)集落和91个pcDNA3.1 NESP(优化序列)集落，并接种到96孔板中，每孔一个集落。

为开发出过量表达促红细胞生成蛋白的生产细胞系，Avesthagen已选出了89个CHO K1/pcDNA3.1/NESP(天然序列)集落和91个CHO/pcDNA3.1/-NESP(优化序列)集落。所有选出的CHO K1细胞集落将通过免疫荧光、蛋白质印迹、ELISA和基于细胞的功能测定进行分析，以使产生得自单一细胞的CHO K1生产细胞系，稳定表达本发明的促红细胞生成蛋白。

实施例7：新的促红细胞生成蛋白的纯化

生物制药的质量和生物安全性很大程度上取决于用于生产纯化产品的提取方法。一方面，下游处理必须确保能从细胞培养过程获得的培养液或细胞材料中，经济有效地分离出所需产品。然而，另一方面，必须可靠地分离出那些会污染成品的成分。毫无疑问在这些步骤中，要去除那些不同类型的、不应存在于成品制剂中的成分。

第一组包括介质衍生的或工艺过程衍生的杂质，可以是蛋白类或非蛋白类(例如脂质、消泡剂、抗生素)杂质。这一组还包括宿主细胞衍生的杂质，例如可能诱导不必要免疫反应的蛋白质；或者核酸，因为当它们掺入到健康人细胞中时，可能潜在地携带有害的遗传信息，所以成为主要关注方面。第二组由外源因子和污染物组成，并包括病毒、病毒样颗粒(VLP)、细菌、真菌、支原体等。

分离产品的主要方面是去除培养基成分和蛋白杂质。针对去除培养基添加物，例如抗生素或细胞毒物质(例如geniticine或甲氨蝶呤)的分离方法，将组合到纯化策略中，并且将建立适当的测试以验证其效率。通过仔细选择培养或收获条件，将可以减少某些杂质(例如DNA)。因为实际原因，不可能制造100％纯的产品，所以对于成品制剂中可接受的杂质浓度水平已有规定。例如，世界卫生组织(WHO)规定，源于生物工程的蛋白质药物，每一剂量可接受的最大量DNA将为100pg。因此在纯化策略中，可以利用纯化步骤中灭活外源物质的潜能，或者包括额外的灭活步骤。例如病毒和VLP，可通过使用化学灭活药品(例如N-乙酰哌嗪、磷酸三正丁基酯)、有机溶剂、离液盐、极端pH值、辐射等等进行灭活。通过应用微波技术进行温度处理已显示出能够灭活病毒。尽管如上所述，所选择的针对灭活残留物的技术潜力，将进行验证，并且这种验证还必须证明，灭活方法不会损害产品的完整性。

成熟的人EPO蛋白由165个氨基酸不变序列组成，该蛋白是通过两步由193个氨基酸前体衍生而来，其N末端27个氨基酸前导序列在该激素分泌前被切除，并且其C末端的精氨酸通过内源性羧肽酶的蛋白水解被去除。按照管理机构对于过量表达所需重组蛋白的指导方针，后续确定无污染的细胞培养系统，可利用一系列步骤对新的促红细胞生成蛋白进行纯化，包括透析-过滤和柱色谱法(包括阴离子交换和反相基质)。将回收含有最多高度分枝的聚糖和最高唾液酸含量的部分，以使体内活性最大化。

实施例8：纯化方法的最优化

为了从稳定、高表达细胞系最大化重组NESP产量，根据以上提及的受推荐的功能/结合测定，后续确定可重现的生物活性，将努力使所用纯化方法最佳化。纯化策略将针对产品的工艺过程经济学、上市速度、规模性、重复性和最高纯度，以及功能稳定性和结构整体性为主要目的。为实现这一目的，将探索由过滤(常规过滤和切向流过滤)和色谱两者组合的方法。所述方法的合格要求和接受标准研究将实施3批。

一般选择性利用糖蛋白的聚糖成分作为捕获目标，用亲和色谱进行蛋白纯化。最常用的基质是间氨基苯基硼酸琼脂糖和固定化的凝集素、伴刀豆凝集素A琼脂糖凝胶(ConA Sepharose)和麦胚凝集素琼脂糖凝胶(WGA-Sepharose)。当Con A基质特异性结合到在C3、C4和C6位置含有未修饰羟基的甘露糖基和葡糖基残基上时，以上提及的间氨基苯基硼酸基质能够与任一含有1，2-顺-二醇基的分子形成临时性键合。WGA Sepharose基质对于该糖蛋白的N-乙酰葡糖胺(NAG)或者N-乙酰神经氨酸(NANA或者唾液酸)残基是高度特异性的。

因此，纯化过程将包括以下的下游步骤：

a.初步澄清和浓缩，用常规过滤方法和切向流过滤方法；

b.超滤/透析过滤(基于切向流过滤)；

c.色谱步骤I：亲和色谱，用凝集素/基于间氨基苯基的基质。更优选基于间氨基苯基配体的亲和介质；

d.色谱步骤II：离子交换色谱(IEX)，用Q-Sepharose阴离子交换剂；

e.色谱步骤III：疏水作用色谱(HIC)，用丁基Sepharose；

f.去除病毒和过滤除菌；

g.去除内毒素；

h.配制。

注释：在色谱步骤中，为得到高纯度和最大回收量的产品，单元操作的顺序可以变换。在纯化过程的每一阶段，其结果将用物理化学和免疫学方法评价该蛋白结构和功能的完整性。

在另一个优选的实施方案中，纯化过程将针对从粗培养液中直接捕获目标蛋白，与常规的填充床模式相比，使用阴离子交换树脂扩张床吸附模式，并包括下列步骤：

a.阴离子交换色谱，紧接盐梯度洗脱后，用Q-Sepharose XL作为捕获步骤。

b.疏水作用色谱(HIC)，用丁基Sepharose；

c.二次阴离子交换色谱，用Resource Q作为补齐步骤；

d.去除病毒和过滤除菌；

e.去除内毒素；

f.配制。

更优选两步纯化方法，根据产品回收百分比和纯度，使用阴离子交换色谱和HIC作为主要的色谱步骤。然后，将进行上文提及的策略中概述的后续步骤。

注释：根据选择性富集具有高糖基含量和高唾液酸基含量的酸性pI的同等型的捕获效率，在以上概述的两种策略中可任选将酸洗步骤掺入到阴离子交换捕获后步骤中，并用于去除无关的碱性蛋白污染。另外，基于流通的阴离子交换剂，例如硫酸纤维素介质(cellufine sulfate)将用于选择性结合过程污染物、内源性/外源性病毒和柱提取物。

实施例9：用生物化学、免疫学和物理化学方法确定目标蛋白的特性

每一阶段总蛋白的回收百分比，将用BCA (bicinchoninic acid，二辛可宁酸，二羧酸二喹啉)方法/Bradford染料结合法进行定量。每一纯化阶段的目标蛋白浓度将用高度特异性的和高可靠的基于酶的免疫测定法，例如直接或间接夹心ELISA进行探测。更优选，双抗体夹心ELISA将适合用于评价该目标蛋白浓度。因为NESP是一种糖蛋白，将用特异性的染色方法，检测在还原条件下已电泳的SDS凝胶中的糖蛋白，定量评价糖基化程度。定量和目标特异性的蛋白印迹分析将在每一阶段后进行。将应用反相色谱、等电聚焦和双向凝胶电泳评价已纯化的产物。可用远紫外圆二色性进行二级结构分析检测。将用大小排阻和MALDI-TOF进行分子质量和寡聚状态研究。该研究还将集中于在pH和温度变化下该蛋白的稳定性。因为NESP是一种高度糖基化蛋白，所以已纯化蛋白的糖基化谱可用气相色谱法(GC)分析取得证明文件。

实施例10：新的促红细胞生成蛋白体外和体内活性的测定

生物测定检测新的促红细胞生成蛋白体外结合EPO受体，将用以下方法完成：

(a)竞争性结合，用I¹²⁵标记的新的促红细胞生成蛋白；

(b)[H]³-胸苷摄入，用受推荐的人细胞系(例如Ut7/EPO)。

新的促红细胞生成蛋白的临床前体内生物活性(正常的血细胞比容恢复能力)将在受推荐的小鼠细胞系例如BDF1上进行测试。

序列表

<110>阿维斯塔金格兰技术有限公司(Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd)Morawala Patell，Villoo

<120>促红细胞生成蛋白的重组生产方法

<130>1

<150>627/CHE/2005

<151>2005-05-24

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>582

<212>DNA

<213>人

<400>1

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtaa tgaaacgtgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300

gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagg tgaatgagac cctgcagctg 360

catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420

gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480

actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540

aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582

<210>2

<211>582

<212>DNA

<213>人

<400>2

atgggcgtgc acgagtgccc cgcttggctc tggctgctgc tgtccctcct gtccctaccc 60

ctcgggctcc cggtgctggg cgcgccccca cgcctgatct gtgactcccg agtgctcgag 120

cgctacctgc tggaggcgaa ggaggccgag aacatcacca cgggctgtaa cgagacctgt 180

tctctgaacg agaacatcac cgtgcccgac accaaggtga acttctacgc ctggaagaga 240

atggaggtag gccagcaggc cgtcgaggtg tggcagggtc tggcgttgct gtccgaagcc 300

gtgctccgcg gccaggccct gctggtgaac tccagtcagg tgaacgaaac actccagctc 360

catgtggaca aggcggtgtc cggcttgcgg tcgctgacaa ccctcctgcg cgccctggga 420

gcgcagaagg aggccattag tcccccggac gccgcctcgg ctgcccccct gcgaaccatc 480

accgcggaca ccttccggaa gctgttccgc gtctactcga actttctccg cgggaagctg 540

aaattataca cgggggaggc ctgccgcacc ggcgatcgct ga 582

<210>3

<211>193

<212>PRT

<213>人

<400>3

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

100 105 110

Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

130 135 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180 185 190

Arg

Claims

1.一种用于制备有体内生物活性的促红细胞生成蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(a)让已用选自以下的分离的DNA序列转化或者转染的宿主细胞在适当的营养条件下生长：(i)SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA序列，(ii)SEQ ID No.3所示的蛋白编码序列，和(iii)在严谨条件下，能与(i)和(ii)所述的DNA序列或者它们的互补链杂交的DNA序列；和

(b)从中分离出所述促红细胞生成素产品。

2.一种用于制备有体内生物活性的促红细胞生成素产品的方法，该方法包括以下步骤：用编码促红细胞生成素氨基酸序列为SEQ IDNo.3的合成DNA序列转化宿主细胞；从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离出所述促红细胞生成素产品。

3.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

4.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞优选是CHO Kl细胞。

5.一种用于生产有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物特性的糖基化促红细胞生成素多肽的方法，该方法包括以下步骤：

a)让含有以下元件的哺乳动物细胞在适当的营养条件下生长：人促红细胞生成素启动子DNA以外的启动子DNA及与其操作性连接的编码成熟促红细胞生成素氨基酸序列为SEQ ID No.3的DNA；和

b)分离出由所述细胞表达的所述糖基化促红细胞生成素多肽。

6.权利要求5的方法，其中所述启动子DNA是病毒启动子DNA。

7.一种用于制备有体内生物活性的促红细胞生成素产品的方法，该方法包括以下步骤：用图10或图11所示的载体构建体转化宿主细胞；从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离出所述促红细胞生成素产品。

8.权利要求7的方法，其中所述载体是哺乳动物细胞特异性表达载体，最优选的载体如图10和图11所示。

9.一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的人促红细胞生成素和药学上可接受的稀释剂、辅剂或载体，其中所述促红细胞生成素是从培养物中生长的哺乳动物细胞中纯化出来的。

10.一种提高和维持哺乳动物血细胞比容的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求9的药物组合物中所包含的高度糖基化促红细胞生成素类似物，其中该类似物比同等摩尔量的重组人促红细胞生成素给药次数少，但得到相当的目标血细胞比容。