WO2023229053A1 - 코로나바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

코로나바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023229053A1
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WO
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seq
fused
polypeptide
coronavirus
pharmaceutical composition
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PCT/KR2022/007284
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김용태
김혜미
주은빈
김보영
이준성
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주식회사 바이오빛
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Definitions

  • the present invention relates to an antiviral protein having neutralizing activity against a coronavirus, such as Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-Cov-2), also called “COVID-19 virus”, and a composition containing the same. , such as pharmaceuticals, medical products, cosmetics, daily necessities, etc.
  • a coronavirus such as Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-Cov-2), also called “COVID-19 virus”
  • a composition containing the same such as pharmaceuticals, medical products, cosmetics, daily necessities, etc.
  • Severe acute respiratory syndrome type 2 coronavirus is a single-stranded RNA virus that causes respiratory disease and belongs to the coronavirus subfamily. The causative virus was first discovered in December 2019. To avoid confusion with the virus that causes severe acute respiratory syndrome infection, the World Health Organization (WHO) also calls it the '2019 coronavirus infection virus' or '2019 coronavirus infection virus.'
  • WHO World Health Organization
  • Coronavirus disease 2019 (COVID-19) has spread worldwide since its first outbreak in December 2019, causing 6,152,095 deaths and 489,779,062 cumulative infections as of April 4, 2022. It is an infectious disease with a fatality rate of 4.64%.
  • the clinical symptoms of COVID-19 are mainly respiratory symptoms accompanied by fever, and the main vulnerable targets are the elderly and those in their 60s or older suffering from underlying diseases and immune diseases.
  • WHO World Health Organization declared this disease a global pandemic, or pandemic, on March 11, 2020, just over three months after the first report of the outbreak. This was the third declaration in history.
  • infection caused by the COVID-19 virus is mainly spread through small droplets generated when touching, coughing, sneezing, or talking, and the contact range is known to be 1 to 3 m. Signs of infection can range from mild to severe symptoms such as fever, cough, shortness of breath, and diarrhea, and it is very fatal for people with complications or illnesses and the elderly. Because of this, many deaths have occurred, and society and the economy around the world are suffering great damage.
  • the COVID-19 virus belongs to the Coronaviridae ( ⁇ -CoV) family along with SARS-CoV, MERS-CoV, etc., consists of a large single plus-strand RNA genome, and is similar to SARS-CoV. and MERS-CoV with about 79% and about 50% sequence similarity, respectively (Wu F., Zhao S., Yu B. et al. Nature 2020, 579, 265-269).
  • ⁇ -CoV Coronaviridae
  • the COVID-19 virus has an RNA genome surrounded by an outer membrane, and when observed through an electron microscope, a characteristic club-shaped spike was observed on the surface of the virus particle.
  • the virus envelope contains spike proteins and envelope proteins.
  • the spike protein is involved in viral infection and pathogenicity, such as inducing neutralizing antibodies, binding to receptors, and membrane fusion, while the outer membrane protein is involved in the shape formation of viral particles and when the virus is released out of the cell after infection.
  • the COVID-19 virus enters host cells through the cell surface receptor angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2), and shows 10 to 20 times higher ACE2 binding affinity than existing SARS-CoV, resulting in higher infectiousness and infectiousness ( Wrapp, D. et al. Science 2020, 367, 1260-1263).
  • ACE2 cell surface receptor angiotensin-converting enzyme-2
  • Vaccines include Pfizer-BioNTech and Moderna vaccines using mRNA, and Johnson & Johnson's Janssen vaccine using viral vectors.
  • Vaccination using the COVID-19 vaccine reduces the spread of the disease and prevents it from progressing to severe disease. represents.
  • Treatments include PAXLOVID, an oral treatment containing Ritonavir added to Nirmatrelvir developed by Pfizer, Remdesivir, an RNA polymerase inhibitor, and chloroquine, an anti-malarial drug.
  • Antiviral treatments such as retroviral human immunodeficiency I protease inhibitors lopinavir/ritonavir are being used, but there is still no treatment that is safe and easy to use in daily life, and treatments known to be effective so far. However, in actual clinical practice, the effect is minimal or it can cause various side effects, which is problematic (Korean Patent Publication No. 10-2022-0009855).
  • antiviral peptides candidates for COVID-19 treatment, have fewer side effects and almost no drug resistance compared to chemical drugs, and are known to be effective against COVID-19 (Barh D, Tiwari S, Silva Andrade B et al. F1000Research 2020 , 9, 576).
  • the spike protein of the coronavirus penetrates by binding to a human cell surface receptor, such as ACE2.
  • ACE2 human cell surface receptor
  • the virus binds to the alpha-helical structure instead of the ACE2 surface receptor present on human cells. It may bind to and prevent it from penetrating human cells (Jonathan W, Kevin B et al. ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 6, 1076-1078).
  • antiviral peptides can generally be classified into four major groups: (1) inhibition of virus fusion, (2) inhibition of virus entry, (3) inhibition of virus replication, and (4) virus assembly and Inhibition of release (Sabeena M. et al. J Infect Public Health 2018, 11, 9-17).
  • Antiviral peptides not only have a direct bactericidal effect, but also regulate the host's defense function, and actually regulate the recruitment and cell differentiation of various immune cells by regulating the expression of signaling substances.
  • some antiviral peptides have an alpha-helical structure, so they may bind to the coronavirus spike protein and have the effect of preventing virus penetration.
  • the present inventors developed a recombinant polypeptide fused with an antiviral peptide (Korean Patent Publication No. 10-1578522; Korean Patent Publication No. 10-1631704), and the recombinant polypeptide has an excellent inhibitory effect on coronaviruses. By revealing this, the present invention has been completed.
  • the present invention is intended to solve the problems of the prior art as described above, and the object of the present invention is to provide a biocompatible material that has adhesiveness to an antiviral peptide that can bind to the coronavirus spike protein or inhibit virus fusion, penetration, and replication.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases caused by coronavirus infection, including a recombinant polypeptide having a polypeptide-bound structure.
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving diseases caused by coronavirus infection.
  • Another object of the present invention is to provide a coating composition for preventing diseases caused by coronavirus infection.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating diseases caused by coronavirus infection, comprising a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a biocompatible polypeptide.
  • the disease caused by the coronavirus infection may include, but is not limited to, coronavirus infection-19, SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome), MERS (Middle East Respiratory Syndrome), cold, etc., and in particular, coronavirus infection. It may be -19, but is not limited to this.
  • the biocompatible polypeptide may be, but is not limited to, a mussel adhesive protein or a barnacle adhesive protein.
  • the mussel may be Mytilus edulis, Mytilus galloprovincialis, or Mytilus coruscus, but is not limited thereto.
  • the mussel adhesive protein is byssal protein (foot protein)-3 (FP-3) comprising the sequence of any one of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 10, or any one of SEQ ID NO: 12 to 15.
  • the mussel adhesive protein is FP-151 (SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 21) in the form of FP-1 fused to both ends of FP-5; FP-131 (SEQ ID NO: 22), in which FP-1 is fused to both ends of FP-3; FP-251 (SEQ ID NO: 23), in which FP-2 and FP-1 are fused to both ends of FP-5; and FP-353 (SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 24), which is a form in which FP-3 is fused to both ends of FP-5, but is not limited thereto.
  • biocompatible polypeptide and the antiviral peptide may be linked directly or through a peptidic linker or a non-peptidic linker, but are not limited thereto.
  • the antiviral peptide is KLWKKWAKKWLKLWKA (SEQ ID NO: 29), FALALKALKKL (SEQ ID NO: 30), ILRWPWWPWRRK (SEQ ID NO: 31), AKRHHGYKRKFH (SEQ ID NO: 32), KWKLFKKIGAVLKVL (SEQ ID NO: 33), LVKLVAGIKKFLKWK (SEQ ID NO: 34) ), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK (SEQ ID NO: 35), GIGAVLKVLTTGLPALISWI (SEQ ID NO: 36), SWLSKTAKKGAVLKVL (SEQ ID NO: 37), KKLFKKILKYL (SEQ ID NO: 38), GLKKLISWIKRAAQQG (SEQ ID NO: 39), GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQA ANVAATAR (SEQ ID NO: 40), LKKLAKLALAF (SEQ ID NO: 30), I
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving coronavirus disease, comprising a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a biocompatible polypeptide.
  • the present invention provides a coating composition for preventing coronavirus disease, comprising a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a biocompatible polypeptide.
  • the present invention provides a method for preventing, treating, suppressing, and preventing coronavirus diseases, comprising administering to an individual a composition comprising a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to the biocompatible polypeptide disclosed above, such as a pharmaceutical composition or a cosmetic composition. Or provides a method for improvement.
  • composition containing the recombinant polypeptide of the present invention is not only safe for the human body, but also can be widely applied to solve the problem of human infection by suppressing the action of the coronavirus as an antiviral peptide, so it can be used as medicine and medical treatment to suppress coronavirus disease. It can be used in fields such as products, cosmetics, and daily necessities, and can also be used to develop additional new drugs.
  • Figure 1 shows a tertiary structure model of the recombinant polypeptide of the present invention.
  • the recombinant polypeptide has an antiviral peptide bound to the N-terminus and C-terminus of the mussel adhesive protein.
  • MAP stands for mussel adhesive protein.
  • Figure 2 shows the results of expression, isolation and purification of a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to the end of a biocompatible polypeptide in E. coli. Through Western blot, it can be confirmed that a recombinant polypeptide containing an antiviral peptide bound to the end of a biocompatible polypeptide was created.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating coronavirus disease, comprising a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a biocompatible polypeptide.
  • peptide refers to a linear or cyclic molecule formed by linking amino acid residues to each other through peptide bonds.
  • the production of the peptide can be achieved by conventional biological or chemical synthesis methods known in the art, for example, solid-phase synthesis techniques.
  • the peptide may be a variant or fragment of a peptide having a different sequence due to deletion, insertion, and/or substitution of amino acid residues within the range that does not affect function.
  • Amino acid exchanges that do not overall alter the activity of the peptide are known in the art. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, etc.
  • the biocompatible polypeptide and/or antiviral peptide used in the production of the recombinant polypeptide of the present invention may include, but are not limited to, peptides and variants thereof or active fragments thereof having substantially the same amino acid sequence.
  • the substantially identical protein refers to an amino acid sequence of at least 75%, preferably at least 80%, such as at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or It refers to an amino acid sequence having more than 99% sequence homology, but is not limited thereto.
  • the peptide of the present invention may additionally contain a targeting sequence, a tag, a labeled residue, an amino acid sequence prepared for the specific purpose of increasing half-life or peptide stability.
  • a protecting group may be attached to the -terminus or C-terminus.
  • the protecting group may be an acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group, or polyethylene glycol (PEG), but can be used to modify the peptide, especially to improve the stability of the peptide. If there is an ingredient, it can be included without limitation.
  • the term "stability" is used to include not only in vivo stability, which protects the peptide from attack by protein-cleaving enzymes, but also storage stability (eg, storage stability at room temperature).
  • treatment means reversing, alleviating, or inhibiting the progression of the disease or disease to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disease, or It is used in the sense of including prevention without limitation. Additionally, “treatment” or “therapy” of coronavirus disease in mammals may include one or more of the following:
  • the disease caused by the coronavirus infection may include, but is not limited to, coronavirus infection-19, SARS, MERS, cold, etc., and in particular, may be coronavirus infection-19, but is not limited thereto.
  • the biocompatible polypeptide may be an adhesive protein derived from mussels or barnacles, and is preferably an adhesive protein derived from mussels, but is not limited thereto.
  • the mussels may be selected from the group consisting of Mytilus edulis, Mytilus galloprovincialis, and Mytilus coruscus, preferably Mytilus galloprovinci. It may be Allis, but it is not limited to this.
  • the mussel adhesive protein is an adhesive protein derived from mussels and is an adhesive protein capable of self-adhesion in a wet or dry environment, and is preferably a recombinant mussel adhesive protein or a mutant of the mussel adhesive protein. It is not limited, and may preferably include any mussel adhesive protein described in International Publication No. WO2006/107183A1 or WO2005/092920 without limitation.
  • the variant of the mussel adhesive protein preferably contains an additional sequence or some amino acids at the carboxyl terminus (C-terminus) or amino terminus (N-terminus) of the mussel adhesive protein under the premise of maintaining the adhesive force of the mussel adhesive protein. It may be substituted with another amino acid.
  • a polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids containing a physiological antiviral peptide, for example, RGD is linked to the carboxyl terminus or amino terminus of the mussel adhesive protein, or 1 of the total number of tyrosine residues constituting the mussel adhesive protein. to 100%, preferably 5 to 100%, and more preferably 50 to 100% may be substituted with 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine (DOPA).
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine
  • Examples of commercially available mussel adhesive proteins include the BV_Series, a mussel-derived recombinant adhesive protein sold by Biobit Co., Ltd., Gangseo-gu, Seoul, or the mussel adhesive protein sold by Collodis Bioscience, North Augusta, South Carolina, USA. It is not limited to this.
  • the mussel adhesive protein can be used as such or selected from the group consisting of FP-1, FP-2, FP-3, FP-4, FP-5, FP-6, and fragments thereof. there is.
  • the mussel adhesive protein is a fusion protein or fusion polypeptide in which two or more of FP-1, FP-2, FP-3, FP-4, FP-5, FP-6, and fragments thereof are fused to each other. You can.
  • the mussel adhesive protein is used as is, or has the following sequence Mussel adhesion proteins FP-1 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5), FP-2 (SEQ ID NO: 6) Alternatively, it can be used as a fusion protein in which at least one second peptide selected from the group consisting of FP-4 (SEQ ID NO: 11) and fragments of each protein is fused.
  • the protein selected as the second peptide may additionally include a spacer at the carbon or amine terminus, and a preferred spacer may include an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 28.
  • the spacer may be a peptide in which SEQ ID NO: 25, 26, 27, or 28 is repeated multiple times, for example, 2 or more times.
  • the first peptide is FP-5 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 15, and the second peptide is FP-1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
  • the mussel adhesive protein available in the present invention has a spacer of any one of SEQ ID NOs: 25 to 28 bound to the amine or carbon terminus of FP-1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5. It is an adhesive protein.
  • the mussel adhesive protein is FP-151 (SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 21) in which FP-1 is fused to both ends of FP-5, and FP-1 is fused to both ends of FP-3.
  • FP-131 SEQ ID NO: 22
  • FP-251 SEQ ID NO: 23
  • both ends of FP-5 FP-3 may be a fused form of FP-353 (SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 24), but is not limited thereto.
  • the biocompatible polypeptide constituting the recombinant polypeptide such as mussel adhesive protein
  • the biocompatible polypeptide constituting the recombinant polypeptide is an antiviral peptide added to the C-terminus or N-terminus of a mussel adhesive protein that exists in nature or a mussel adhesive protein designed through genetic recombination. It is desirable to have a formed shape.
  • the biocompatible polypeptide such as mussel adhesive protein and antiviral peptide
  • the linker may be a peptidic linker or a non-peptidic linker.
  • the linker when the linker is a peptidic linker, it may contain one or more amino acids, for example, 1 to 10 amino acids, preferably 2 to 6 amino acids, for example, 2 amino acids, but is not limited thereto.
  • the peptidic linker may be a dipeptide of KL.
  • the linker is a non-peptidic linker
  • a biocompatible polymer in which two or more repeating units are linked can be used.
  • the repeating units are linked to each other through arbitrary covalent bonds other than peptide bonds.
  • the non-peptidic linker may be selected from the group consisting of fatty acids, polysaccharides, high molecular weight polymers, low molecular weight compounds, nucleotides, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the antiviral peptide added to the biocompatible polypeptide constituting the recombinant polypeptide may be any peptide derived from nature or artificially synthesized without limitation.
  • the antiviral peptide is KLWKKWAKKWLKLWKA (SEQ ID NO: 29), FALALKALKKL (SEQ ID NO: 30), ILRWPWWPWRRK (SEQ ID NO: 31), AKRHHGYKRKFH (SEQ ID NO: 32), KWKLFKKIGAVLKVL (SEQ ID NO: 33), LVKLVAGIKKFLKWK (SEQ ID NO: 34) ), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK (SEQ ID NO: 35), GIGAVLKVLTTGLPALISWI (SEQ ID NO: 36), SWLSKTAKKGAVLKVL (SEQ ID NO: 37), KKLFKKILKYL (SEQ ID NO: 38), GLKKLISWIKRAAQQG (SEQ ID NO: 39), GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQA ANVAATAR (SEQ ID NO: 40), LKKLAKLALAF (SEQ ID NO:
  • the antiviral peptide is Magainin or Dermaseptin, an ⁇ -helical 23 amino acid peptide isolated from the skin of the African frog Xenopus laevis, or human defensin. defensin, cathelicidin LL-37, histatin, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • the antiviral peptide can be fused to the C-terminus, N-terminus, or both ends of the biocompatible polypeptide, such as mussel adhesive protein.
  • the composition in order to use a composition containing a biocompatible polypeptide, such as a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a mussel adhesive protein, as a treatment for coronavirus disease, the composition is in the form of a lyophilized powder or a lyophilized powder. It can be used in solution state, gel state, etc.
  • the effective concentration for use as a treatment for coronavirus disease can be easily determined by a person skilled in the art through toxicity tests in each application field, such as oral, transdermal, and intravenous.
  • tyrosine residues can be changed to DOPA and further to DOPA quinone through chemical modification.
  • chemical modification of the recombinant polypeptide can be performed using, for example, a mushroom-derived tyrosinase enzyme that can mediate such chemical modification.
  • the biocompatible polypeptide disclosed in the present invention can be mass-produced by genetic engineering methods, preferably by inserting it into a conventional vector designed to express foreign genes to enable expression.
  • the vector can be appropriately selected or newly created depending on the type and characteristics of the host cell for producing the protein.
  • the method of transforming the above vector into a host cell and the method of producing a recombinant protein from a transformant can be easily performed by conventional methods.
  • the above-described methods of vector selection, production, transformation, and recombinant protein expression can be easily performed by anyone skilled in the art, and some modifications of the usual methods are also included in the present invention. do.
  • the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, preferably an E. coli cell, but is not limited thereto.
  • the term “gene” is used to include, without limitation, a nucleic acid (e.g., DNA) sequence containing the coding sequence necessary to produce a polypeptide, precursor, or RNA (e.g., rRNA, tRNA).
  • RNA e.g., rRNA, tRNA
  • the term “gene” includes both cDNA and genomic forms of the gene.
  • a genomic form or clone of a gene contains a coding region interrupted by non-coding sequences called “introns” or “insertion regions” or “insertion sequences.”
  • a polypeptide may be encoded by a full-length coding sequence, or by a portion of the coding sequence, as long as the desired activity or functional properties (e.g., enzymatic activity, ligand binding, signal transduction, immunogenicity, etc.) of the full-length or fragment are maintained. It can be coded.
  • the term also includes the coding region of a structural gene and sequences located adjacent to the coding region at the 5' and 3' ends at a distance of at least about 1 kb from the end such that the gene corresponds to the length of a full-length mRNA. .
  • expression vector refers to a recombinant vector capable of expressing a peptide of interest in a suitable host cell, and refers to a gene construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • the expression vector of the present invention may include expression control elements such as a promoter, operator, and start codon, which are elements that suitable expression vectors generally have.
  • Initiation codons and stop codons are generally considered to be part of the nucleotide sequence that encodes a polypeptide and must be functional in a subject when the genetic construct is administered and must be in frame with the coding sequence.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the vector may contain a signal sequence for release of the fusion polypeptide to facilitate isolation of the recombinant polypeptide of the present invention from cell culture medium.
  • a specific initiation signal may also be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences.
  • an exogenous translation control signal which may include an ATG initiation codon, must be provided. These exogenous translation control signals and initiation codons can be from a variety of natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by introduction of appropriate transcription or translation enhancers.
  • the vector can be any conventional expression vector without limitation.
  • plasmid DNA phage DNA, etc.
  • Specific examples of plasmid DNA include commercial plasmids such as pUC18 and pIDTSAMRT-AMP.
  • Other examples of plasmids that can be used in the present invention include E. coli-derived plasmids (pET-22b(+), pYG601BR322, pBR325, pUC118, and pUC119), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110 and pTP5), and yeast-derived plasmids (pET-22b(+), pYG601BR322, pBR325, pUC118, and pUC119).
  • phage DNA include ⁇ -phages (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, and ⁇ ZAP).
  • animal viruses such as retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, or insect viruses such as baculovirus may be used. Since these expression vectors have different protein expression levels and modifications depending on the host cell, the host cell most suitable for the purpose can be selected and used.
  • the pET22b(+) vector may be used as the vector.
  • the pET22b(+) vector is a vector for protein expression, and the recombinant MGFP-2 mutant is inserted into the Nde I/Hind III restriction enzyme site of the pET22b(+) vector, and the Hind III/Xho I restriction site of the pET22b(+) vector.
  • An antiviral peptide is inserted into the enzyme site.
  • the pET22b(+) vector contains a T7 promoter, so expression can be induced using IPTG (Isopropylthio- ⁇ -D-galactoside), and an affinity ligand (e.g., hexahisitidine) for protein separation and purification using affinity chromatography. )
  • IPTG Isopropylthio- ⁇ -D-galactoside
  • affinity ligand e.g., hexahisitidine
  • a transformant in the present invention, can be obtained by introducing the vector into a suitable host cell.
  • Types of hosts include Genus Esherichia, Pseudomonas, Ralstonia, Alcaligenes, Comamonas, and Burkholderia.
  • genus genus, Agrobacterium genus, Flabobacterium genus, Vibrio genus, Enterobacter genus, Rhizobium genus, Gluconobacter genus, Acineto Acinetobacter genus, Moraxella genus, Nitrosomonas genus, Aeromonas genus, Paracoccus genus, Bacillus genus, Clostridium genus , Lactobacillus genus, Corynebacterium genus, Arthrobacter genus, Achromobacter genus, Micrococcus genus, Mycobacterium genus, Strepto Examples include various bacteria such as Streptococcus, Streptomyces, Actinomyces, Nocardia, and Methylobacterium. In addition, in addition to the above bacteria, yeasts such as Saccharomyces genus and Candida genus, and various fungi may be used as hosts, but are not limited thereto.
  • the recombinant vector when using a bacterium such as Escherichia coli as a host, the recombinant vector is capable of autonomous replication in the host, and also contains a promoter, DNA containing a gene encoding the recombinant polypeptide, and a transcription termination sequence. It is desirable to have the configuration necessary for expression.
  • Methods for introducing recombinant DNA into bacteria include, but are not limited to, the calcium chloride method, electroporation method, spheroplast method, and lithium acetate method.
  • the recombinant polypeptide included in the composition of the present invention may be prepared by (a) preparing a vector containing a gene encoding the recombinant polypeptide of the present invention; (b) preparing a transformant obtained by transforming the vector into a host cell; and (c) culturing the transformant.
  • the production method may further include (d) isolating and purifying the recombinant polypeptide.
  • the transformant may be cultured using a conventional method used for host culture. Additionally, the culture method can be any method used for cultivating ordinary microorganisms, such as batch culture, flow-batch culture, continuous culture, or reactor culture.
  • the medium for the transformant obtained using a bacterium such as Escherichia coli as a host includes complete medium or synthetic medium, such as LB medium and M9 medium. Additionally, the recombinant polypeptide of the present invention can be accumulated and recovered within the bacterial cells by culturing within the above-mentioned optimal temperature range.
  • Carbon sources are necessary for the growth of microorganisms, and include, for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose, galactose, and starch; lower alcohols such as ethanol, propanol, and butanol; polyhydric alcohols such as glycerol; Organic acids such as acetic acid, citric acid, succinic acid, tartaric acid, lactic acid, and gluconic acid; Fatty acids such as propionic acid, butanoic acid, pentanoic acid, hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, nonanoic acid, decanoic acid, undecanoic acid, and dodecanoic acid can be used.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose, galactose, and starch
  • lower alcohols such as ethanol, propanol, and butanol
  • polyhydric alcohols such as gly
  • nitrogen sources include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as those derived from natural products such as peptone, meat juice, yeast extract, malt extract, casein decomposition product, and corn steep liquor.
  • examples of inorganic substances include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • Antibiotics such as kanamycin, ampicillin, tetracycline, chloramphenicol, and streptomycin may be added to the culture medium.
  • an inducing substance suitable for the type of promoter can be added to the medium.
  • an inducing substance suitable for the type of promoter can be added to the medium.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IAA indole acrylic acid
  • Acquisition and purification of the recombinant polypeptide of the present invention involves centrifugal recovery of cells or supernatant from the obtained culture, cell disruption, extraction, affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration, etc., alone or in appropriate combination. It can be done by doing this, but it is not limited to this.
  • the transformant can be cultured in regular LB medium, and IPTG can be added to induce expression of the recombinant polypeptide.
  • a preferred method of expressing a recombinant polypeptide is to culture the transformant in LB (5 g/liter yeast extract, 10 g/liter tryptone, 10 g/liter NaCl) medium, and absorbance of the culture medium at 600 nm for 0.6 to 0.8 days. 0.5 to 4 mM of IPTG can be added and cultured for 3 hours, but it is not limited to this.
  • the recombinant polypeptide expressed by the above method is produced in the form of an inclusion body, and the recombinant polypeptide can be separated and purified by solubilizing the inclusion body.
  • the composition of the present invention may be in the form of a pharmaceutical composition, which contains 0.001 to 10% by weight of a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a biocompatible polypeptide, based on the total weight of the pharmaceutical composition. Or 0.01 to 5% by weight, or 0.01 to 3% by weight, or 0.1 to 2% by weight, or 0.5 to 1.5% by weight, but is not limited thereto.
  • the term "pharmaceutical composition” is used to include, without limitation, not only conventional drugs or quasi-drugs for application to humans, but also animal drugs or animal quasi-drugs for application to animals.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain other ingredients that can have a synergistic effect on the effect of the recombinant polypeptide, within a range that does not impair the effect aimed at by the present invention.
  • it may include conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, or carriers.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition includes oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal, for example, topical application. It can be applied in this way.
  • the parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, and intralesional injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type and severity of the individual, age, gender, type of disease, It can be determined based on factors including the activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be applied without limitation to the tissue, organ, or individual for the purpose of suppressing coronavirus, and can be applied to any.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used not only in humans, but also in non-human animals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, guinea pigs, rats, mice, cows, sheep, pigs, goats, birds, and fish. possible.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more active ingredients that exhibit the same or similar functions in addition to the recombinant polypeptide.
  • the pharmaceutical composition can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods.
  • Preparations for parenteral administration include external preparations such as powders, granules, tablets, capsules, sterilized aqueous solutions, solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, syrups, suppositories, aerosols, etc. and sterilized injection preparations according to conventional methods. It can be formulated and used in the form of a cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent, lotion, liniment agent, pasta agent, or cataplasma agent. It can be prepared and used as a pharmaceutical composition for external use on the skin. It is not limited to this.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • suppositories witepsol, macrogol, Tween 61, cacao, laurin, glycerogenatin, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain preservatives, stabilizers, hydrating agents or emulsification accelerators, auxiliaries such as salts and/or buffering agents for osmotic pressure adjustment, and other therapeutically useful substances, and may be mixed using a conventional method. , can be formulated according to granulation or coating methods.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on various factors, including the subject's age, weight, general health, gender, administration time, administration route, excretion rate, drug combination, and severity of a specific disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and methods using biological response regulators.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a dosage ranging from 1 to 20,000 mg/kg, for example, 1 to 10,000 mg/kg, 1 to 1,000 mg/kg, or 1 to 200 mg/kg, based on adults, and the pharmaceutical composition If the composition is for external use, it is recommended to apply it once to five times a day in an amount of 1.0 to 3.0 ml for adults and continue for more than one month, but the dosage does not limit the scope of the present invention.
  • the pharmaceutical composition composition can be used alone or in combination with surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and methods using biological response regulators.
  • composition of the present invention may be in the form of a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared in liquid or solid form using bases, auxiliaries and additives commonly used in the cosmetics field.
  • Cosmetics in liquid or solid form may include, but are not limited to, forms such as lotions, creams, and lotions.
  • the cosmetic composition of the present invention may contain commonly used ingredients, such as antioxidants, preservatives, stabilizers, solubilizers, vitamins, conventional auxiliaries such as pigments and fragrances, and carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing products. , oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, etc., but is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of softening lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray, or powder.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier ingredient. You can.
  • the formulation of the present invention is a powder or spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder can be used as the carrier ingredient.
  • chlorofluorohydrocarbon and propane may be used as carrier ingredients.
  • May contain propellants such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent, or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 , 3-butylene glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, or fatty acid ester of sorbitan.
  • the carrier ingredients include water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester, and microcrystals.
  • a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • microcrystals such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracant may be used.
  • the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide ether sulfate, and alkyl.
  • Amidobetaine, fatty alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative, or ethoxylated glycerol fatty acid ester can be used.
  • the cosmetic composition of the present invention can be used alone or in multiple applications, or can be used in multiple applications with other cosmetic compositions other than the present invention.
  • the cosmetic composition for cell regeneration or anti-inflammatory according to the present invention can be used according to the usual usage method, and the number of times of use can be varied depending on the user's skin condition or preference.
  • the present invention provides a coating composition for preventing coronavirus disease, comprising a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to a biocompatible polypeptide.
  • the coating composition can be applied to any solid surface, such as, but not limited to, the surface of medical products, daily necessities, etc.
  • the present invention relates to a coronavirus comprising the step of administering to an individual a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to the biocompatible polypeptide disclosed above, or a composition comprising the recombinant polypeptide, such as a pharmaceutical composition or a cosmetic composition.
  • a coronavirus comprising the step of administering to an individual a recombinant polypeptide in which an antiviral peptide is bound to the biocompatible polypeptide disclosed above, or a composition comprising the recombinant polypeptide, such as a pharmaceutical composition or a cosmetic composition.
  • the present inventors confirmed that the antiviral protein composition effectively inhibits coronavirus disease.
  • the composition of the present invention can effectively control coronavirus infection, and cytotoxicity and sub-cytotoxicity were not observed (see Table 1).
  • the composition of the present invention is not irritating to the skin and eyes (see Tables 2 and 3).
  • a gene sequence in which an antiviral peptide sequence was added to the C-terminal or N-terminal region of the mussel adhesive protein was designed, template DNA was synthesized, and PCR was performed. This was inserted into the final pET22b(+) vector.
  • the recombinant polypeptide has a structure in which the mussel adhesive protein of SEQ ID NO: 20, the spacer of SEQ ID NO: 25, and the polypeptide of SEQ ID NO: 29 are fused.
  • the specific form of the vector is a fusion polypeptide in which a mussel adhesion protein/antiviral peptide is inserted into the pET22b(+) vector.
  • the pET22b(+) vector contains a T7 promoter, so expression can be induced using IPTG (isopropylthio- ⁇ -D-galactoside).
  • the recombinant polypeptide was named BV_A1801.
  • the pET22b(+) mussel adhesion protein/antiviral peptide vector prepared in Example 1 was competent in E. coli DH5 ⁇ cells for cloning and E. coli BL21(DE3) cells used for protein expression, respectively, using CaCl 2 buffer. After creating cells, they were transformed by heat shock (standing at 42°C for 1 minute). Selection of transformed colonies was performed using ampicillin (Gold bio), which used E. coli Dh5 ⁇ pET22b(+) mussel adhesion protein/antiviral peptide and E. coli BL21(DE3) mussel adhesion protein/antiviral peptide. A producing transformant was obtained.
  • E. coli BL21/pET22b(+) transformant was cultured in LB medium (5 g/liter yeast extract, 10 g/liter tryptone, 10 g/liter NaCl), and adjusted to the appropriate O.D. When reached, IPTG was added to induce expression of the recombinant polypeptide. After expressing the BV_A1801 recombinant polypeptide, it was separated and purified to obtain the final high-purity protein ( Figure 2).
  • the amino acid sequence of the BV_A1801 recombinant polypeptide was analyzed using an amino acid analyzer (Hewlette Packard, USA) to confirm that it was the same protein, and the structure of the BV_A1801 polypeptide was predicted through PDB (Peptide data bank).
  • the virus analysis protocol followed the standard guideline ASTM E1052-20.
  • the host cells MRC-5 cells, were obtained from ATCC (CCL-171), and the host cells were cultured in EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium. ATCC 30-) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum. Gibco 26140-079, Lot 2347092P). 2003, Lot 80624217) and cultured using a 5% CO 2 incubator at 37 ⁇ 1°C.
  • Coronavirus 229E (HCoV-229E) was provided by KBPV VR-9 and grown in MRC-5 cells (ATCC# CCL-171) for production of stock virus pools. After pre-titrated aliquots of virus were removed from the freezer (-80°C), the aliquots were slowly thawed to room temperature in a biological safety cabinet.
  • Example 5 Coronavirus test conditions and control validation test
  • the coronavirus efficacy test was tested under two conditions: clean conditions and contaminated conditions with the addition of interfering substances.
  • the two conditions for the above interfering substances are as follows.
  • Sample processing conditions were as follows: 0.2 mL of the above two interfering substances were placed in each test tube, and 0.1 mL of virus culture medium was added and mixed. Afterwards, 9.7 mL of sample stock solution (1000ppm-BV_A1801 polypeptide) was added, mixed, and reacted at 20 ⁇ 1°C for 1 hour. Immediately after the reaction was completed, it was diluted 10 times using virus culture medium (dilution times are expressed based on the virus culture medium).
  • host cells previously prepared in a 96-well plate were treated with 0.1 mL of the above-mentioned dilutions in 8 wells, and the 8 wells in the last row (raw) were treated with 0.1 mL of virus culture medium. This was used as a cell culture control group.
  • each host cell was treated with the highest concentration of non-cytotoxic test solution and PBS for 30 minutes to confirm cytotoxicity.
  • the cell monolayer was washed with PBS, and the test virus culture was inoculated to compare virus titers.
  • molecular sieving was sterilized by mixing 10% (w/v) solution of Sephadex LH-20 in PBS. Then, 8 mL was added to a 10 mL syringe and used as a column. Interfering substances and BV_A1801 polypeptide were added to the column. 5 mL of the diluted reaction solution was filtered and neutralized.
  • test solution which is a dilution of the highest concentration of neutralized interfering substance and BV_A1801 polypeptide
  • test virus dilution were mixed and reacted for 10 to 20 minutes, and then inoculated into host cells to compare virus titers.
  • [Table 1] shows the reduction value of coronavirus 229E (HCoV-229E) by BV_A1801 polypeptide
  • the experimental example of the treatment compound is a compound mixed with the interfering substance, dilution of BV_A1801 polypeptide, and coronavirus under each clean condition and contamination. The average value was calculated through three repeated experiments for each condition.
  • test substance 1000ppm-BV_A1801 polypeptide solution
  • test substance 1000ppm-BV_A1801 polypeptide solution

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Abstract

본 발명은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 인체에 안전할 뿐만 아니라, 항바이러스 펩티드가 코로나바이러스를 억제하여 인체 감염문제를 해소하는데 광범위하게 적용될 수 있으므로, 코로나바이러스 질환을 억제하기 위한 의약품, 의료제품, 화장품, 일상용품 등의 분야에 사용할 수 있고, 또한 추가적인 신약의 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

코로나바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 코로나바이러스, 예컨대 "코로나19 바이러스"로도 불리는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-Cov-2)에 중화 활성을 갖는 항바이러스 단백질 및 이의 포함하는 조성물, 예컨대 의약품, 의료제품, 화장품, 일상용품 등에 관한 것이다.
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스는 호흡기 질환을 유발하는 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA) 바이러스로 코로나바이러스 아과(subfamily)에 속하며, 2019년 12월에 처음으로 원인 바이러스가 발견되었다. 중증급성호흡기증후군 감염증의 원인 바이러스와 혼동하지 않도록 세계보건기구(WHO)는 '2019년 코로나바이러스감염증 바이러스' 또는 '2019년 코로나바이러스감염증 유책 바이러스'라 부르기도 한다.
코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19) 질환은 2019년 12월 처음 발생한 이후로 전 세계적으로 확산되어, 2022년 4월 4일 기준 6,152,095명의 사망자와 489,779,062명의 누적 감염자를 초래하고 있으며, 치사율이 4.64%에 달하는 감염병이다. COVID-19의 임상적 증상은 발열을 동반한 호흡기 증상이 주로 나타나며, 주요 취약 대상은 60대 이상의 기저 질환 및 면역 질환 등을 앓고 있는 노약자이다. 이전의 바이러스들과는 다른 강력한 전염성과 빠른 증상 악화를 보임에 따라 세계보건기구(WHO)는 최초 발생 보고 후 3개월 남짓한 2020년 3월 11일 이 질병에 대해 세계적 대유행, 즉 팬데믹(pandemic)을 선포하였으며 이는 역사상 세 번째 선언이었다.
WHO와 미국 질병통제예방센터(CDC)에 따르면 코로나19 바이러스로 인한 감염은 주로 접촉 시, 기침, 재채기, 말할 때 발생하는 작은 방울에 의해 전파되며, 접촉 범위는 1 내지 3 m라고 알려져 있다. 감염 징후는 열, 기침, 호흡 곤란, 설사와 같은 경증에서 중증의 증상을 보일 수 있으며, 합병증이나 병을 가진 사람들, 노인과 같은 노약자에게는 매우 치명적이다. 이 때문에 많은 사망자가 발생하였으며, 전세계적으로 사회와 경제가 큰 피해를 보고 있다.
바이러스 게놈을 기반으로 한 계통발생학적 분석에 따르면, 코로나19 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 등과 함께 Coronaviridae(β-CoV) 과에 속하고, 큰 단일 플러스 가닥 RNA 게놈으로 구성되며, SARS-CoV 및 MERS-CoV와 각각 약 79% 및 약 50%의 염기서열 유사성을 갖는다(Wu F., Zhao S., Yu B. et al. Nature 2020, 579, 265-269).
코로나19 바이러스는 외막이 둘러싸진 RNA 게놈을 갖고 있으며, 전자현미경을 통해 관찰시 바이러스 입자의 표면에 곤봉모형의 스파이크(Spike)가 있는 특징적인 형태가 관찰되었다. 바이러스의 피막에는 스파이크 단백질과 외막(Envelop) 단백질이 존재한다. 스파이크 단백질은 중화 항체 유도, 수용체 결합, 막 융합 등 바이러스의 감염과 병원성에 관여하며, 외막 단백질은 바이러스 입자의 형태 형성과 바이러스가 감염 후 세포 밖으로 방출할 때에 관여한다. 코로나19 바이러스는 세포 표면 수용체 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2)를 통해 숙주 세포로 진입하며, 기존 SARS-CoV에 비해 10배 내지 20배 더 높은 ACE2 결합 친화도를 보여 더 높은 전염성과 감염성을 나타낸다(Wrapp, D. et al. Science 2020, 367, 1260-1263).
현재 COVID-19를 제어하기 위해서 다양한 백신이나 치료제가 개발 및 출시되고 있다. 백신으로는 mRNA를 이용한 화이자-바이오엔텍이나 모더나 백신, 바이러스 벡터를 이용한 존슨앤존슨의 얀센 백신 등이 있으며, COVID-19 백신을 이용한 예방 접종으로 질병 확산을 줄이고, 중증으로 진행되는 것을 막는 효과를 나타낸다. 치료제로는 화이자가 개발한 니르마트렐비르(Nirmatrelvir)에 리토나비르(Ritonavir)가 첨가되어 있는 먹는 치료제인 팍스로비드(PAXLOVID), RNA 중합효소 억제제인 렘데시비르, 말라리아 치료제인 클로로퀸, 항레트로바이러스 인간면역결핍 I 단백질분해효소 억제제인 로피나비르/리토나비르 등의 항바이러스 치료제가 사용되고 있으나, 아직까지 일상생활에서까지 안전하면서도 손쉽게 사용할 수 있는 치료제가 없으며, 현재까지 효과가 있다고 알려진 치료제들도 실제 임상에서는 그 효과가 미미하거나, 다양한 부작용을 야기할 수 있어 문제가 되고 있는 실정이다(대한민국 공개특허공보 제10-2022-0009855호).
한편, COVID-19 치료제 후보인 항바이러스 펩티드는 화학 약물에 비해 부작용이 적고 약물 내성이 거의 없으며, COVID-19에도 효과적일 수 있다고 알려져 있다(Barh D, Tiwari S, Silva Andrade B et al. F1000Research 2020, 9, 576). 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 사람의 세포 표면 수용체, 예컨대 ACE2와 결합하여 침투하는데, 이를 예방하기 위해 알파-나선 구조의 펩티드가 존재하면 바이러스가 인간 세포에 존재하는 ACE2 표면 수용체 대신에 상기 알파-나선 구조에 결합하여 인간 세포에 침투하지 못하게 될 수 있다(Jonathan W, Kevin B et al. ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 6, 1076-1078).
항 바이러스 펩티드의 주요 작용 메커니즘은 일반적으로 다음의 4가지 주요 군으로 분류될 수 있다: (1) 바이러스 융합 억제, (2) 바이러스 진입 억제, (3) 바이러스 복제 억제, 및 (4) 바이러스 조립 및 방출 억제(Sabeena M. et al. J Infect Public Health 2018, 11, 9-17).
항바이러스 펩티드는 직접적인 살균 작용뿐만 아니라 숙주의 방어 기능을 조절하며, 실제로 신호물질들의 발현을 조절함으로써 다양한 면역 세포들의 모집(recruitment), 세포 분화 등을 조절한다. 또한, 일부 항바이러스 펩티드의 경우 알파-나선 구조를 갖고 있어, 코로나바이러스 스파이크 단백질과 결합하여 바이러스의 침투를 방지하는 효능까지 나타낼 가능성이 있다.
이에, 본 발명자들은 항바이러스 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드를 개발하였고(대한민국 등록특허공보 제10-1578522호; 대한민국 등록특허공보 제10-1631704호), 상기 재조합 폴리펩티드가 코로나바이러스에 뛰어난 억제 효과를 갖고 있으을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 코로나바이러스 스파이크 단백질과 결합하거나 바이러스의 융합, 침투 및 복제를 억제할 수 있는 항바이러스 펩티드에 점착성을 갖는 생체적합 폴리펩티드가 결합된 구조를 갖는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 코로나바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 코로나바이러스 감염으로 인한 질환의 예방을 위한 코팅 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
한 구현예에서, 상기 코로나바이러스 감염으로 인한 질환은 코로나바이러스감염증-19, SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome), MERS(Middle East Respiratory Syndrome), 감기 등을 비제한적으로 포함할 수 있고, 특히 코로나바이러스감염증-19일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 생체적합 폴리펩티드는 홍합 접착 단백질 또는 따개비 접착 단백질일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 상기 홍합은 미틸러스 에둘리스, 미틸러스 갈로프로빈시얼리스, 또는 미틸러스 코루스커스일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 7 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 서열을 포함하는 족사 단백질(foot protein)-3(FP-3), 서열번호 12 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-5, 및 서열번호 16의 서열을 포함하는 FP-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 펩티드의 C-말단이나 N-말단, 혹은 양쪽 말단 모두에 서열번호 1 내지 서열번호 5 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-1, 서열번호 6의 서열을 포함하는 FP-2, 및 서열번호 11의 서열을 포함하는 FP-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 펩티드가 융합된 단백질일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 FP-5의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-151(서열번호 17 내지 서열번호 21); FP-3의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-131(서열번호 22); FP-5의 양 말단에 FP-2 및 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-251(서열번호 23); 및 FP-5의 양 말단에 FP-3이 서로 융합된 형태의 FP-353(서열번호 17 내지 서열번호 24);으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 생체적합 폴리펩티드와 항바이러스 펩티드는 직접 결합되거나, 펩티드성 링커(linker) 또는 비-펩티드성 링커를 통해 결합될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 상기 항바이러스 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 29), FALALKALKKL(서열번호 30), ILRWPWWPWRRK(서열번호 31), AKRHHGYKRKFH(서열번호 32), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 33), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 34), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 35), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 36), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 37), KKLFKKILKYL(서열번호 38), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 39), GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 40), LKKLAKLALAF(서열번호 41), KLLLKLLKKLLKLLKKK(서열번호 42), THRPPMWSPVWP(서열번호 43), GWLKKIGKWKIFKK(서열번호 44), ILPWKWPWWPWRR(서열번호 45), RRWWCRC(서열번호 46), KLAKLAKKLAKLAK(서열번호 47), LKKLAKLALAFILRWPWWPWRRK(서열번호 48), RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(서열번호 49), FLKLLKKLAAKLF(서열번호 50), WLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 51), 또는 GTNNWWQSPSIQN(서열번호 52)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 질환의 예방용 코팅 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 개시된 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물 또는 화장료 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 질환을 예방, 치료, 억제, 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 인체에 안전할 뿐만 아니라, 항바이러스 펩티드가 코로나바이러스의 작용을 억제하여 인체 감염 문제를 해소하는데 광범위하게 적용될 수 있으므로, 코로나바이러스 질환을 억제하기 위한 의약품, 의료제품, 화장품, 일상용품 등의 분야에 사용할 수 있고, 또한 추가적인 신약의 개발에도 활용될 수 있다.
본 발명의 상기 기술된 특징들과 또 다른 특징 및 장점들은 예시적인 목적으로 제공되는 하기 구현예들과 도면들을 함께 고려할 때 분명할 것이다.
도 1은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 3차 구조 모델을 나타낸다. 상기 재조합 폴리펩티드는 홍합 접착 단백질의 N-말단 및 C-말단에 항바이러스 펩티드가 결합되어 있다. MAP은 홍합 접착 단백질을 나타낸다.
도 2는 생체적합 폴리펩티드 말단에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 대장균에서 발현하고 분리정제한 결과를 나타낸다. 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 생체적합 폴리펩티드 말단에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드가 만들어졌음을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형 또는 환형의 분자를 의미한다. 상기 펩티드의 제작은 본 기술분야에서 공지된 통상의 생물학적 또는 화학적 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.
상기 펩티드는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 및/또는 치환되어 상이한 서열을 갖는 펩티드의 변이체, 또는 단편일 수 있다. 상기 펩티드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 제조에 사용되는 생체적합 폴리펩티드 및/또는 항바이러스 펩티드는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 비제한적으로 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 생체적합 폴리펩티드 및/또는 항바이러스 펩티드의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 펩티드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩티드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩티드의 개질, 특히 펩티드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "안정성"은 단백질 절단 효소의 공격으로부터 펩티드를 보호하는 생체내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "치료"는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 제한없이 포함하는 의미로 사용된다. 또한, 포유동물에 있어서 코로나바이러스 질환의 "치료" 또는 "치료 요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 코로나바이러스 질환의 발달을 저지시킴;
(2) 코로나바이러스 질환의 확산을 예방함;
(3) 코로나바이러스 질환을 경감시킴;
(4) 코로나바이러스 질환의 재발을 예방함; 및
(5) 코로나바이러스 질환의 증상을 완화함.
본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염으로 인한 질환은 코로나바이러스감염증-19, SARS, MERS, 감기 등을 비제한적으로 포함할 수 있고, 특히 코로나바이러스감염증-19일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생체적합 폴리펩티드는 홍합 또는 따개비 유래의 접착 단백질일 수 있고, 홍합 유래의 접착 단백질인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 한 구현예에서, 상기 홍합은 미틸러스 에둘리스, 미틸러스 갈로프로빈시얼리스, 및 미틸러스 코루스커스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 미틸러스 갈로프로빈시얼리스일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로서, 습한 환경이나 건조한 환경에서 자가 접착이 가능한 접착성 단백질이며, 재조합 홍합 접착 단백질 또는 홍합 접착 단백질의 변이체(mutant)인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 임의의 홍합 접착 단백질을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단(C-말단)이나 아미노 말단(N-말단)에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 생리항바이러스 펩티드, 예를 들어 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%, 보다 바람직하게는 50 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.
시판되는 홍합 접착 단백질의 예로는 서울특별시 강서구 소재 (주)바이오빛에 의해 시판되고 있는 홍합 유래 재조합 접착 단백질인 BV_Series 혹은 미국 사우스캐롤리나주 노스 오구스타 소재 콜로디스 바이오사이언스사가 판매하는 홍합 접착 단백질이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 그 자체로 사용하거나, FP-1, FP-2, FP-3, FP-4, FP-5, FP-6, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 FP-1, FP-2, FP-3, FP-4, FP-5, FP-6, 및 그의 단편 중 2 이상이 서로 융합된 융합 단백질 또는 융합 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 그 자체로 사용하거나, 서열번호 7, 8, 9 또는 10으로 기재되는 FP-3, 서열번호 12, 13, 14 또는 15로 기재되는 FP-5, 또는 서열번호 16으로 기재되는 FP-6에 해당하는 제1 펩티드의 탄소 말단이나 아민 말단 혹은 양쪽 모두에 홍합 접착 단백질 FP-1(서열번호 1, 2, 3, 4, 5), FP-2(서열번호 6) 또는 FP-4(서열번호 11) 및 각 단백질의 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 펩티드가 융합된 융합 단백질로서 사용될 수 있다. 상기 제2 펩티드로 선택되는 단백질은 추가적으로 탄소 또는 아민 말단에 스페이서(spacer)가 포함될 수 있으며, 바람직한 스페이서는 서열번호 25 내지 서열번호 28 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 스페이서는 서열번호 25, 26, 27, 또는 28이 복수회, 예컨대 2회 이상 반복된 펩티드를 사용해도 무방하다.
바람직하게는, 상기 제1 펩티드는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 FP-5이고, 상기 제2 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 FP-1이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 이용가능한 홍합 접착 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 FP-1의 아민 혹은 탄소 말단에 서열번호 25 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 스페이서가 결합된 접착 단백질이다.
다른 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 FP-5의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-151(서열번호 17 내지 서열번호 21), FP-3의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-131(서열번호 22), FP-5의 양 말단에 FP-2 및 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-251(서열번호 23), 및 FP-5의 양 말단에 FP-3이 서로 융합된 형태의 FP-353(서열번호 17 내지 서열번호 24)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드를 구성하는 생체적합 폴리펩티드, 예컨대 홍합 접착 단백질은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 혹은 유전자 재조합적으로 고안된 홍합 접착 단백질의 C-말단 혹은 N-말단에 항바이러스 펩티드가 부가된 형태를 갖는 것이 바람직하다.
한 구현예에서, 상기 생체적합 폴리펩티드, 예컨대 홍합 접착 단백질과 항바이러스 펩티드는 직접 결합되거나, 링커를 통해 결합될 수 있다. 상기 링커는 펩티드성 링커 또는 비-펩티드성 링커일 수 있다.
상기 링커가 펩티드성 링커일 때, 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 10개, 바람직하게는 2 내지 6개, 예컨대 2개의 아미노산을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드성 링커는 KL의 디펩티드일 수 있다.
상기 링커가 비-펩티드성 링커일 때, 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 반복 단위는 펩티드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비-펩티드성 링커는 지방산, 다당류, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드를 구성하는 생체적합 폴리펩티드에 부가되는 항바이러스 펩티드는 자연에서 유래하거나 인공적으로 합성되는 임의의 펩티드를 제한없이 사용할 수 있다.
한 구현예에서, 상기 항바이러스 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 29), FALALKALKKL(서열번호 30), ILRWPWWPWRRK(서열번호 31), AKRHHGYKRKFH(서열번호 32), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 33), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 34), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 35), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 36), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 37), KKLFKKILKYL(서열번호 38), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 39), GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 40), LKKLAKLALAF(서열번호 41), KLLLKLLKKLLKLLKKK(서열번호 42), THRPPMWSPVWP(서열번호 43), GWLKKIGKWKIFKK(서열번호 44), ILPWKWPWWPWRR(서열번호 45), RRWWCRC(서열번호 46), KLAKLAKKLAKLAK(서열번호 47), LKKLAKLALAFILRWPWWPWRRK(서열번호 48), RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(서열번호 49), FLKLLKKLAAKLF(서열번호 50), WLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 51), 및 GTNNWWQSPSIQN(서열번호 52)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 상기 항바이러스 펩티드는 아프리카 개구리 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 피부로부터 분리된 α-나선형 23개 아미노산 펩티드인 마가이닌(Magainin)이나 더마셉틴(Dermaseptin), 인간 디펜신(human defensin), 카세리시딘(cathelicidin) LL-37, 히스타틴(Histatin) 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 항바이러스 펩티드는 상기 생체적합 폴리펩티드, 예컨대 홍합 접착 단백질의 C-말단, N-말단, 또는 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 생체적합 폴리펩티드, 예컨대 홍합 접착 단백질에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 코로나바이러스 질환의 치료제로 사용하기 위하여, 상기 조성물은 동결건조된 분말 형태, 동결건조된 분말을 이용한 용액 상태, 겔 상태 등으로 사용할 수 있다. 코로나바이러스 질환의 치료제로 사용하기 위한 유효 농도는 경구, 경피 및 정맥 등 각 적용분야의 독성 테스트를 거쳐 본 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 정할 수 있다.
본 발명에 개시된 재조합 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 중에서 티로신 잔기는 화학적 수정을 통하여 DOPA, 그리고 더 나아가 DOPA 퀴논으로 바뀔 수 있다. 한 구현예에서, 이러한 화학적 수정을 매개할 수 있는, 예컨대, 버섯 유래의 티로시나아제(tyrosinase) 효소를 이용하여 재조합 폴리펩티드의 화학적 수정을 수행할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명에 개시된 생체적합 폴리펩티드, 예컨대 홍합 접착 단백질은 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.
한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있고, 바람직하게는 대장균 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체, 또는 RNA(예컨대, rRNA, tRNA)를 생산하는데 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예컨대, DNA) 서열을 제한없이 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA와 게놈 형태 모두를 포함한다. 게놈 형태 또는 유전자의 클론은 "인트론" 또는 "삽입 영역" 또는 "삽입 서열"로 불리는 비-코딩 서열에 의해 방해되는 코딩 영역을 포함한다. 폴리펩티드는 완전한 길이의 코딩 서열에 의해 코딩되거나, 완전한 길이 또는 단편의 목적하는 활성 또는 기능적 특성(예컨대 효소적 활성, 리간드 결합, 시그널 도입, 면역원성 등)이 유지되는 한, 코딩 서열의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 용어는 구조 유전자의 코딩 영역 및 상기 유전자가 완전-길이의 mRNA의 길이에 상응하도록 말단에서 약 1 kb 이상의 거리로 5' 및 3' 말단의 코딩 영역에 인접하게 위치된 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, "발현 벡터"란 적당한 숙주 세포에서 목적 펩티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 나타내는 것으로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현 벡터는 적합한 발현 벡터가 일반적으로 갖고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
또한, 상기 벡터는 세포 배양액으로부터 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩티드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시 코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pET-22b(+), pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주 세포를 선택하여 사용하면 된다.
바람직한 구현예에서, 상기 벡터로는 pET22b(+) 벡터가 사용될 수 있다. 상기 pET22b(+) 벡터는 단백질 발현용 벡터이며, pET22b(+) 벡터의 Nde I/Hind III 제한효소 자리에 재조합 MGFP-2 돌연변이체가 삽입되어 있고, pET22b(+) 벡터의 Hind III/Xho I 제한효소 자리에 항바이러스 펩티드가 삽입되어 있다. 상기 pET22b(+) 벡터는 T7 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)를 이용하여 발현을 유도할 수 있으며, 친화 크로마토그래피를 이용한 단백질 분리 정제를 위한 친화성 리간드(예컨대, hexahisitidine) 유전자 서열이 Xho I 제한효소 자리 뒤에 존재한다.
본 발명에 있어서, 형질전환체는 상기 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입함으로써 얻을 수 있다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia) 속(Genus), 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 랄스토니아(Ralstonia) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 코마모나스(Comamonas) 속, 버크홀데리아(Burkholderia) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 플라보박테리움(Flabobacterium) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 리조비움(Rhizobium) 속, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 모라셀라(Moraxella) 속, 니트로조모나스(Nitrosomonas) 속, 아에로모나스(Aeromonas) 속, 파라코커스(Paracoccus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아르트로박터(Arthrobacter) 속, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 칸디다(Candida) 속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 상기 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다. 세균으로의 재조합 DNA의 도입 방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등이 이용가능하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환한 형질전환체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;를 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 제조 방법은 (d) 상기 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다. 또 배양 방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB 배지, M9 배지 등을 들 수 있다. 또, 배양 온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 균체 내에 축적시키고, 회수할 수 있다.
탄소원은 미생물의 증식에 필요하며, 예를 들면 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 말토오스, 갈락토오스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올류; 글리세롤 등의 다가 알코올류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.
질소원으로는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모 추출물, 맥아 추출물, 카제인 분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물 유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로는, 예를 들면 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.
또 프로모터가 유도성의 발현 벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우에는 프로모터의 종류에 적합한 유도 물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상등액을 원심 회수하고, 균체파쇄, 추출, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 형질전환체는 통상의 LB 배지에서 배양할 수 있고, 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위하여 IPTG를 첨가할 수 있다. 바람직한 재조합 폴리펩티드의 발현 방법은 상기 형질전환체를 LB(5 g/리터 효모 추출물, 10 g/리터 트립톤, 10 g/리터 NaCl) 배지에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6 내지 0.8 일 때 IPTG를 0.5 mM 내지 4 mM 첨가하여 3시간 배양할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 방법으로 발현시킨 재조합 폴리펩티드는 봉입체(inclusion body) 형태로 생산되며, 상기 봉입체를 가용화시켜 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 형태일 수 있고, 상기 약학적 조성물은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 또는 0.01 내지 5 중량%, 또는 0.01 내지 3 중량%, 또는 0.1 내지 2 중량%, 또는 0.5 내지 1.5 중량% 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 "약학적 조성물"은 인간에게 적용하기 위한 통상적인 의약품 또는 의약외품뿐만 아니라, 동물에게 적용하기 위한 동물 의약품 또는 동물 의약외품도 모두 제한없이 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 재조합 폴리펩티드 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 상기 재조합 폴리펩티드의 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 또는 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되고, 예컨대 도포에 의한 국부투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있다. 상기 비경구는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 병소내 주사 또는 주입기술을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 코로나바이러스 억제 작용을 목적으로 하는 조직, 기관, 또는 개체 제한없이 적용될 수 있고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 인간뿐만 아니라 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 인간이 아닌 동물, 조류 및 어류 등 어느 것에도 사용가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 재조합 폴리펩티드에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제형화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 성인 기준으로 1 내지 20,000 ㎎/㎏, 예컨대 1 내지 10,000 ㎎/㎏, 1 내지 1,000 ㎎/㎏, 또는 1 내지 200 ㎎/㎏ 범위 내의 투여량으로 투여될 수 있고, 상기 약학적 조성물이 외용제인 경우에는 성인기준으로 1.0 내지 3.0 ㎖의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋으나, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 상기 약학적 조성물 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 형태일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는, 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로션제 등의 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 방부제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포의 재생 또는 항염용 화장료 조성물은 통상적인 사용 방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 질환의 예방용 코팅 조성물을 제공한다.
상기 코팅 조성물은 임의의 고체 표면, 예컨대 의료제품, 일상용품 등의 표면에 비제한적으로 적용될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 상기 개시된 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드 또는 상기 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물 또는 화장료 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 질환을 예방, 치료, 억제, 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에서, 본 발명자들은 상기 항바이러스 단백질 조성물이 코로나바이러스 질환을 효과적으로 저해함을 확인하였다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코로나바이러스의 감염을 효과적으로 제어할 수 있고, 세포독성(cytotoxicity) 및 아세포독성(sub-cytotoxicity)은 보이지 않았다(표 1 참조). 또한, 피부 및 눈에 대한 자극성 및 부식성 시험 결과, 본 발명의 조성물은 피부 및 눈에 자극성인 물질이 아닌 것으로 확인되었다(표2 및 표 3 참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 항코로나바이러스 활성 평가 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명은 예시의 목적으로만 제공되는 하기 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 기능적으로 동일한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 범위에 포함되는 것이 자명하다.
실시예 1. 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 클로닝
본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위하여, 홍합 접착 단백질의 C-말단 또는 N-말단 부위에 항바이러스 펩티드 서열이 부가된 유전자 서열을 설계하여 주형 DNA를 합성한 후 PCR을 진행하였고, 이를 최종 pET22b(+) 벡터에 삽입하였다. 상기 재조합 폴리펩티드는 서열번호 20의 홍합 접착 단백질, 서열번호 25의 스페이서, 및 서열번호 29의 폴리펩티드가 융합된 구조를 갖는다. 벡터의 구체적인 형태는 pET22b(+) 벡터에 홍합 접착 단백질/항바이러스 펩티드가 삽입된 융합 폴리펩티드의 형태이다. 상기 pET22b(+) 벡터는 T7 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 이용하여 발현을 유도할 수 있다. 상기 재조합 폴리펩티드를 BV_A1801로 명명하였다.
실시예 2. 재조합 폴리펩티드를 생산하는 형질전환체의 제조 및 배양
실시예 1에서 제조된 pET22b(+) 홍합 접착 단백질/항바이러스 펩티드 벡터는 클로닝용 대장균 DH5α 세포 및 단백질 발현용으로 사용된 대장균 BL21(DE3) 세포에 각각 CaCl2 버퍼를 사용하여 컴피턴트(Competent) 세포를 만든 후, 열충격(42℃에서 1분간 방치) 방법에 의해 형질전환하였다. 형질전환된 콜로니의 선별은 엠피실린(ampcillin, Gold bio)을 사용하여 수행하였고, 이를 통해 대장균 Dh5α pET22b(+) 홍합 접착 단백질/항바이러스 펩티드 및 대장균 BL21(DE3) 홍합 접착 단백질/항바이러스 펩티드를 생산하는 형질전환체를 수득하였다.
실시예 3: 재조합 폴리펩티드의 생산 및 수득
BV_A1801 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위하여, 대장균 BL21/pET22b(+) 형질전환체를 LB 배지(5 g/리터 효모 추출물, 10 g/리터 트립톤, 10 g/리터 NaCl)에서 배양하고, 적정 O.D 값에 도달했을 때 IPTG를 첨가하여 상기 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하였다. BV_A1801 재조합 폴리펩티드를 발현한 후, 분리 및 정제하여 최종 고순도의 단백질을 확보하였다(도 2).
BV_A1801 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 아미노산 분석기(Hewlette Packard, 미국)로 분석하여 동일한 단백질임을 확인하였으며, PDB(Peptide data bank)를 통해 상기 BV_A1801 폴리펩티드의 구조를 예상하였다.
실시예 4. 세포 및 코로나바이러스 준비
바이러스 분석 프로토콜은 표준 가이드라인인 ASTM E1052-20를 따랐다. 숙주 세포인 MRC-5 세포는 ATCC(CCL-171)로부터 얻었고, 숙주 세포는 10%-FBS(Fetal Bovine Serum. Gibco 26140-079, Lot 2347092P)가 포함된 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium. ATCC 30-2003, Lot 80624217)에서 37±1℃의 5% CO2 배양기를 이용하여 배양하였다.
코로나바이러스 229E(HCoV-229E)는 KBPV VR-9에서 제공받았고, 스톡 바이러스 풀의 생산을 위해 MRC-5 세포(ATCC# CCL-171)에서 성장시켰다. 바이러스의 사전적정된 분취물을 냉동고(-80°C)에서 꺼낸 후, 상기 분취물을 생물학적 안전 캐비닛에서 실온으로 천천히 해동시켰다.
실시예 5: 코로나바이러스 시험 조건 및 제어 확인 시험
코로나바이러스 효능 시험은 간섭물질을 첨가하여 청정 조건, 및 오염 조건의 2가지 조건에서 테스트하였다. 상기 간섭물질의 2가지 조건은 다음과 같다.
1. 청정 조건: BSA 1.5 g을 100 mL의 증류수에 녹인 후, 막 여과를 통해 멸균하여 시험에 사용하였다(최종 농도: 0.3 g/L).
2. 오염 조건: BSA 15 g을 100 mL의 증류수에 녹인 후, 막 여과를 통해 멸균하여 시험에 사용하였다(최종 농도: 3 g/L).
시료 처리 조건은 상기 2가지 간섭물질 0.2 mL를 각각 시험관에 넣고 바이러스 배양액 0.1 mL를 첨가하여 혼합하였다. 그후 시료 원액(1000ppm-BV_A1801 폴리펩티드) 9.7 mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃에서 1시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 즉시 바이러스 배양 배지를 이용하여 10배씩 희석하였다(희석 배수는 바이러스 배양액을 기준으로 표기함).
바이러스 감염량 분석을 위하여, 96-웰 플레이트에 미리 준비한 숙주 세포에 상기 각 단계별 희석액을 0.1 mL씩 8개 웰에 처리하고, 마지막 열(raw)의 8개 웰은 0.1 mL의 바이러스 배양 배지를 처리하여 세포 배양 대조군으로 두었다.
시료 처리로 인해 발생할 수 있는 세포의 형태적 변형을 확인하기 위하여, 상기 2가지 간섭물질 각각을 0.2 mL, 증류수 0.1 mL, 및 시료 원액 9.7 mL를 혼합하고 숙주 세포에 30 내지 60분 동안 처리한 후, 세포독성 양상을 현미경을 통해 육안으로 관찰하였다.
시료 처리가 바이러스 감염에 대한 세포의 민감도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 세포독성을 나타내지 않은 최고 농도의 시험 용액과 PBS를 각각의 숙주 세포에 30분간 처리하여 아세포독성을 확인하였다. 세포 단층을 PBS로 세척하고, 시험 바이러스 배양액을 접종하여 바이러스 역가를 비교하였다.
세포독성의 제거를 위해 분자체(Molecular sieving) PBS에 Sephadex LH-20 10%(w/v) 용액을 섞어 멸균한 뒤, 10 mL 주사기에 8 mL를 넣어 칼럼으로 사용하고, 간섭물질과 BV_A1801 폴리펩티드의 희석액인 반응액 5 mL를 필터하여 중화하였다.
중화(neutralization) 확인을 위하여, 중화된 최고 농도의 간섭물질과 BV_A1801 폴리펩티드의 희석액인 시험 용액과 시험 바이러스 희석액을 동량으로 혼합하여 10 내지 20분 동안 반응시킨 후, 숙주 세포에 접종하여 바이러스 역가를 비교하였다. [표 1]에 BV_A1801 폴리펩티드에 의한 코로나바이러스 229E(HCoV-229E) 감소값을 나타내었으며, 처리 화합물에 대한 실험예는 상기 간섭물질과 BV_A1801 폴리펩티드의 희석액과 코로나바이러스가 섞인 화합물을 각 청정 조건, 오염 조건에 대해 3회 반복 실험을 통해 평균값을 계산하였다.
상기 시험 결과는 로그 감소값(R)으로 계산하여 나타내었다.
처리 화합물 시험 조건 시험 결과
로그 감소값 평균 로그 감소값
실험예 1 청정 조건 2.38 ± 0.37 2.46 ± 0.44
실험예 2 2.50 ± 0.38
실험예 3 2.50 ± 0.55
실험예 4 오염 조건 2.13 ± 0.49 2.25 ± 0.50
실험예 5 2.25 ± 0.44
실험예 6 2.38 ± 0.56
결과의 해석:
로그 감소값 / 감소율 (%)
1 이상 / 90 % 이상
2 이상 / 99 % 이상
3 이상 / 99.9 % 이상
4 이상 / 99.99 % 이상
5 이상 / 99.999 % 이상.
실시예 6: 급성 피부 자극성 및 부식성 시험
본 시험들은 환경부 고시 제2018-23호(2018년 2월 9일) '화학물질 시험기관의 지정기준 및 관리기준 등에 의한 규정', 국립환경과학원 고시 제2019-23호(2019년 6월 13일) '화학물질의 시험방법에 관한 규정' 제5장 제3항, OECD 가이드 라인 ENV/MC/CHEM(98)17, 1998, No. 404 'Acute Dermal Irritation/Corrosion'(July 2015) 지침에 따라 실시하였다.
피부 자극성 및 부식성을 조사하기 위하여, 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 계통의 수컷 토끼 3 마리의 피부에 시험물질인 1000ppm-BV_A1801 폴리펩티드 용액 0.5 ㎖을 4 시간 동안 적용시킨 후, 국립환경과학원 고시 제2019-23호 및 OECD 가이드라인 No. 404에 따라 피부 반응성을 평가하였다. 시험물질 노출 부위를 시험물질을 적용하지 않은 대조 부위와 비교 평가한 결과는 다음과 같다.
(1) 시험 기간 중 시험물질 적용과 관련된 일반 증상 및 사망 동물은 관찰되지 않았다.
(2) 시험 기간 중 시험물질 적용과 관련된 체중 변화는 관찰되지 않았다.
(3) 시험물질 노출 종료 후 1, 24, 48 시간 및 72 시간째 관찰한 결과, 초기 및 확인 시험에서 시험물질에 의한 홍반, 가피 형성 및 부종은 관찰되지 않았으며, 모든 시험 동물에서 홍반/가피 및 부종의 평균점수는 "0.0"으로 산출되었다(표 2).
상기 결과로부터, 뉴질랜드 화이트 계통의 토끼를 이용한 피부 자극성 및 부식성 시험 결과, 시험물질은 피부 자극성 및 부식성이 없는 것으로 판단되었다.
피부 반응의 상태 관찰 시간
(H)		 토끼 번호(형성수) 합계
No. 023-1 No. 023-2 No. 023-3
홍반/가피의 형성 1 0 0 0 0.0
24 0 0 0 0.0
48 0 0 0 0.0
72 0 0 0 0.0
물집, 부종의 형성 1 0 0 0 0.0
24 0 0 0 0.0
48 0 0 0 0.0
72 0 0 0 0.0
전체 홍반/가피 및 부종의 평균점수 0.0
실시예 7: 눈 자극성 및 부식성 시험
본 시험들은 환경부 고시 제2018-23호(2018년 2월 9일) '화학물질 시험기관의 지정기준 및 관리기준 등에 의한 규정', 국립환경과학원 고시 제2019-23호(2019년 6월 13일) '화학물질의 시험방법에 관한 규정' 제5장 제4항, OECD 가이드라인 ENV/MC/CHEM(98)17, 1998, No. 405 'Acute Eye Irritation/Corrosion'(October 2017) 지침에 따라 실시하였다.
눈 자극성 및 심한 눈 손상을 조사하기 위하여, 뉴지랜드 화이트 계통의 수컷 토끼 3마리의 결막낭에 시험물질인 1000ppm-BV_A1801 폴리펩티드 용액 0.1 ㎖을 1 회 투여하였고, 국립환경과학원 고시 제2019-23호 및 OECD 가이드라인 No. 405에 따라 눈자극성을 평가하였다. 시험물질 투여 부위인 좌안과 시험물질을 적용하지 않은 우안을 비교 평가한 결과는 다음과 같다.
(1) 시험 기간 중 시험물질 투여과 관련된 일반 증상 및 사망 동물은 관찰되지 않았다.
(2) 시험 기간 중 시험물질 적용과 관련된 체중 변화는 관찰되지 않았다.
(3) 시험물질 투여 후 초기 시험에서는 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았고, 확인 시험에서는 1 시간째에 결막 발적이 관찰되었고, 24, 48 및 72 시간째에는 아무런 이상 소견이 관찰되지 않았다. 시험 동물에서 안자극 반응에 대한 평균 점수는 모두 "0.0"으로 산출되었다(표 3).
상기 결과로부터, 뉴질랜드 화이트 계통의 토끼를 이용한 눈 자극성 및 심한 눈 손상 시험 결과, 시험물질은 눈자극성 물질이 아닌 것으로 판단되었다.
반응 부위 증상 관찰 시간
(H)		 토끼 번호(형성수) 합계
No. 024-1 No. 024-2 No. 024-3
각막 혼탁도 1 0 0 0 0.0
24 0 0 0 0.0
48 0 0 0 0.0
72 0 0 0 0.0
홍채 자극 1 0 0 0 0.0
24 0 0 0 0.0
48 0 0 0 0.0
72 0 0 0 0.0
결막 발적 1 0 0 1 0.0
24 0 0 0 0.0
48 0 0 0 0.0
72 0 0 0 0.0
부종 1 0 0 0 0.0
24 0 0 0 0.0
48 0 0 0 0.0
72 0 0 0 0.0
전체 안자극 반응에 대한 평균점수 0.0
본 연구는 2020년도 중소벤처기업부의 기술개발사업 지원에 의해 수행된 연구이다.

Claims (15)

  1. 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체적합 폴리펩티드는 홍합 접착 단백질 또는 따개비 접착 단백질인 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 홍합은 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis), 및 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 7 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-3, 서열번호 12 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-5, 및 서열번호 16의 서열을 포함하는 FP-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 펩티드의 탄소 말단이나 아민 말단 혹은 양쪽 말단 모두에 서열번호 1 내지 서열번호 5 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-1, 서열번호 6의 서열을 포함하는 FP-2, 및 서열번호 11의 서열을 포함하는 FP-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 펩티드가 융합된 단백질인 약학적 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 홍합 접착 단백질은 FP-5의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-151(서열번호 17 내지 서열번호 21); FP-3의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-131(서열번호 22); FP-5의 양 말단에 FP-2 및 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-251(서열번호 23); 및 FP-5의 양 말단에 FP-3이 서로 융합된 형태의 FP-353(서열번호 17 내지 서열번호 24);으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 항바이러스 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 29), FALALKALKKL(서열번호 30), ILRWPWWPWRRK(서열번호 31), AKRHHGYKRKFH(서열번호 32), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 33), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 34), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 35), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 36), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 37), KKLFKKILKYL(서열번호 38), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 39), GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 40), LKKLAKLALAF(서열번호 41), KLLLKLLKKLLKLLKKK(서열번호 42), THRPPMWSPVWP(서열번호 43), GWLKKIGKWKIFKK(서열번호 44), ILPWKWPWWPWRR(서열번호 45), RRWWCRC(서열번호 46), KLAKLAKKLAKLAK(서열번호 47), LKKLAKLALAFILRWPWWPWRRK(서열번호 48), RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(서열번호 49), FLKLLKKLAAKLF(서열번호 50), WLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 51), 및 GTNNWWQSPSIQN(서열번호 52)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체적합 폴리펩티드와 항바이러스 펩티드는 직접 결합되거나, 펩티드성 또는 비-펩티드성 링커를 통해 결합되는 약학적 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 펩티드성 링커는 KL의 디펩티드인 약학적 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 비-펩티드성 링커는 지방산, 다당류, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코로나바이러스 질환은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19), SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome), MERS(Middle East Respiratory Syndrome), 및 감기로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  11. 생체적합 폴리펩티드에 항바이러스 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 코로나바이러스 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 생체적합 폴리펩티드는 서열번호 7 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-3, 서열번호 12 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-5, 및 서열번호 16의 서열을 포함하는 FP-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 펩티드의 탄소 말단이나 아민 말단 혹은 양쪽 말단 모두에 서열번호 1 내지 서열번호 5 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FP-1, 서열번호 6의 서열을 포함하는 FP-2, 및 서열번호 11의 서열을 포함하는 FP-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 펩티드가 융합된 단백질인 화장료 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 생체적합 폴리펩티드는 FP-5의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-151(서열번호 17 내지 서열번호 21); FP-3의 양 말단에 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-131(서열번호 22); FP-5의 양 말단에 FP-2 및 FP-1이 서로 융합된 형태의 FP-251(서열번호 23); 및 FP-5의 양 말단에 FP-3이 서로 융합된 형태의 FP-353(서열번호 17 내지 서열번호 24);으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화장료 조성물.
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 항바이러스 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 29), FALALKALKKL(서열번호 30), ILRWPWWPWRRK(서열번호 31), AKRHHGYKRKFH(서열번호 32), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 33), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 34), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 35), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 36), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 37), KKLFKKILKYL(서열번호 38), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 39), GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 40), LKKLAKLALAF(서열번호 41), KLLLKLLKKLLKLLKKK(서열번호 42), THRPPMWSPVWP(서열번호 43), GWLKKIGKWKIFKK(서열번호 44), ILPWKWPWWPWRR(서열번호 45), RRWWCRC(서열번호 46), KLAKLAKKLAKLAK(서열번호 47), LKKLAKLALAFILRWPWWPWRRK(서열번호 48), RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(서열번호 49), FLKLLKKLAAKLF(서열번호 50), WLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 51), 및 GTNNWWQSPSIQN(서열번호 52)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화장료 조성물.
  15. 청구항 11 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코로나바이러스 질환은 COVID-19, SARS, MERS, 및 감기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화장료 조성물.
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