KR20150056024A

KR20150056024A - 염기성 섬유모세포성장인자 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150056024A
Application number: KR1020140020771A
Authority: KR
Inventors: 이설훈; 강내규; 이상화
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2015-05-22
Also published as: KR101602689B1; KR20150056023A; KR101602690B1; KR20150056021A; KR20150056022A; KR101608131B1; KR101609041B1

Abstract

본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 bFGF가 결합된 융합단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 및 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 bFGF에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 피부투과성과 피부잔류성이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부에서 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 합성 또한 증대시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

염기성 섬유모세포성장인자 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with bFGF}

본 발명은 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF) 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 bFGF가 결합된 융합단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 및 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 피부의 주름은 근육운동에 의해 만성적인 변형을 받는 부위에 국소적으로 형성, 정착되는 피부의 형태, 구조변화라고 말할 수 있고, 이러한 생리 변화만이 아니라 보다 미세한 피부 내부 구조의 변화나 물성 변화와 함께 주름 형성메커니즘을 검토하는 것도 실제적인 주름형성기구의 이해를 위해서는 중요하다고 말할 수 있다. 이와 관련하여, 광노화에 따른 피부 내부 구조 변화로서는, 표피, 진피의 비후화나 비정상적인 탄력섬유증물질(elastotic material)의 축적, 또는 탄성섬유의 입체구조 변화 등이 보고되고 있다. 또한, 피부구조의 주요 구성 성분인 골격이라는 콜라겐에 대해서는 콜라겐 섬유의 미세섬유화, 섬유형태의 약화 등이 밝혀지고 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포의 간질에 존재하고 생체 단백질 총 중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유 시)의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광 노화에 의해 감소하고, 일반적으로 노화가 진행됨에 따라 피부의 두께가 얇아지며 이러한 현상은 피부의 탄력저하 및 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.

콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 다양한 유효성분, 예를 들어 레티노익산(retinoic acid), TGF(transforming growth factor), 동물태반 유래의 단백질(일본특허공개번호 제1996-231370호), 베튤린산(betulinic acid)(일본특허공개번호 제1996-208424호), 클로렐라 추출물(일본특허공개번호 제1994-040523, 일본특허공개번호 제1998-036283) 등이 알려져 있으나, 상기 유효성분들은 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 또는 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능을 개선하는 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

이러한 문제점은 콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 다양한 유효성분이 정상적으로 피부를 통해 흡수되지 못하는 것이 주된 원인으로 알려져 있기 때문에, 상기 유효성분의 흡수를 촉진시키는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 매우 우수한 IL-10-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타낼 뿐, 다른 약물의 전달용 담체로서 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 이러한 단점은 피부투과성이 우수하는 특성만으로는 약물의 전달에 사용할 수 없다는 것을 암시하는 것으로 분석되었으므로, 콜라겐 합성을 촉진하기 위하여는 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질의 개발이 요구되었으나, 아직까지는 별다른 연구결과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도 피부에 오래 잔류할 수 있는 피부투과 촉진용 펩타이드를 개발하였으며, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드에 bFGF를 융합시킨 융합단백질이 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 특성을 모두 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 피부투과 촉진용 펩타이드에 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF)가 결합된 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 피부투과성 및 피부잔류성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 피부투과 촉진용 펩타이드를 발굴하였다. 또한, 상기 발굴된 피부투과 촉진용 펩타이드를 다양한 성장인자와 융합하여 피부투과성과 콜라겐 합성수준이 우수한 융합단백질을 스크리닝한 결과, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드에 성장인자의 일종인 bFGF가 결합된 형태의 융합단백질이 콜라겐 뿐만 아니라 엘라스틴의 발현수준을 증대시킬 수 있으면서도 피부투과성 및 피부잔류성이 우수함을 확인하였다.

따라서, 상기 융합단백질은 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이에, 상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드가 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF)에 결합된 융합단백질을 제공한다. 바람직하게, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 bFGF의 N-말단에 결합되어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 "피부투과 촉진용 펩타이드"란, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있으며, 피부투과성과 피부잔류성이 우수한 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 용어 "피부투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부내부로 침투할 수 있는 능력을 의미한다.

본 발명의 용어 "피부잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부내의 조직에 결합되어 피부내에 잔류하는 능력을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 발굴된, 피부투과성과 피부잔류성이 우수한 펩타이드가 될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "염기성 섬유모세포성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)"란, FGF2 또는 FGF-β라고도 호칭되고, 약 18kDa의 크기를 갖으며, 등전점 9.0을 나타내고, 헤파린에 결합할 수 있는 특성을 나타내는 2중나선 펩타이드를 의미한다. 상기 bFGF는 대부분 장기의 혈관내피, 상피세포에서 생산되고, 세포외 기질과 결합한 상태로 저장되며, 세포 표면의 염기성섬유모세포 생장인자 수용체에 결합하여 혈관신생, 세포증식 촉진, 분화유도 등의 다양한 기능을 나타낸다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 bFGF는 콜라겐 생성 또는 엘라스틴 생성을 증대시키는 효과를 나타내는 한, 그의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는데, 상기 bFGF의 전체 아미노산 서열을 사용할 수도 있고, 이의 변이된 아미노산 서열을 사용할 수도 있으며, 이의 일부단편을 사용할 수도 있다. 상기 bFGF의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스(GenBank Accession No. NP_001997. NP_032032 등)에서 얻을 수 있다. 예를 들어, bFGF로서 사람 또는 마우스로부터 유래된 bFGF를 사용할 수 있고, 본 발명에서는 bFGF로서 마우스로부터 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 사용하였다. 따라서, 상기 bFGF는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "융합단백질"이란, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 상기 bFGF에 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 상기 bFGF의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 에스터가수분해효소 융합단백질의 효소활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 bFGF의 N-말단을 2개의 펩타이드(GG)로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합단백질을 제조하였다. 상기 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 피부투과 촉진용 펩타이드를 발굴하고, 상기 발굴된 피부투과 촉진용 펩타이드에 성장인자의 일종인 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 bFGF가 결합되어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질(T-bFGF)을 생산하였다. 이어, 상기 생산된 융합단백질(T-bFGF)의 효과를 bFGF의 효과와 비교한 결과, bFGF 보다도 콜라겐 발현수준을 증가시킬 수 있고(표 1), 엘라스틴의 발현수준을 증가시킬 수 있으며(표 2), 피부투과성을 증가시킬 수 있고(표 3) 및 피부잔류성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(표 4).

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 bFGF에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 피부투과성과 피부잔류성이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부에서 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 합성 또한 증대시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 융합단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

상기 형질전환체는 또한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 융합단백질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 콜라겐 및 엘라스틴의 생산량을 증대시킬 수 있으므로, 상기 융합단백질은 증대된 콜라겐 및 엘라스틴으로 인하여 피부를 개선시킬 수 있는 화장료 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "피부개선"이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 피부개선이란, 본 발명의 융합단백질을 피부에 도포함으로써 유도될 수 있는, 피부세포에서 콜라겐 및 엘라스틴 합성의 촉진, 이로 인한 주름개선 등의 효과를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

상기 융합단백질은 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 융합단백질의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 살균제, 산화방지제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이러한 첨가제들은 필요에 따라 적절한 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 피부개선용 화장료 조성물을 포함하는 기능성 화장품을 제공한다.

본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물에 일반 피부용 화장품의 제조시에 사용되는 적절한 담체를 가하여, 기능성 화장품을 제조할 수 있다. 이때, 사용되는 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 기능성 화장품은 콜라겐합성 촉진효과, 엘라스틴합성 촉진효과 등의 피부개선 효과를 나타내고, 그의 제형은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림, 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있고, 바람직하게는 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼 또는 오일젤의 제형으로 제조될 수 있는데, 이때, 사용되는 담체는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용될 수 있다.

예를 들어, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 파우더 또는 스프레이 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더, 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 용액 또는 유탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 현탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 화장비누 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

구체적인 일례로서, 피부외용연고는 본 발명의 융합단백질 이외에 바셀린 50 내지 97중량% 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5중량%를 함유하도록 제조될 수 있고; 유연화장수는 본 발명의 융합단백질 이외에 프로필렌글리콜 또는 글리세린과 같은 다가알콜류 1 내지 10중량% 및 폴리에틸렌올레일에테르 또는 폴리옥시에틸렌 경화피마자유와 같은 계면활성제 0.05 내지 2중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 융합단백질 이외에 스쿠알란, 바셀린 또는 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5 내지 20중량% 및 세탄올, 스테아릴알콜 또는 밀납과 같은 왁스성분 3 내지 15중량%을 함유하도록 제조될 수 있고; 에센스는 본 발명의 융합단백질 이외에 글리세린 또는 프로필렌글리콜과 같은 다가알콜류 5 내지 30중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 마사지크림은 본 발명의 융합펩타이드 이외에 유동파라핀, 바셀린 또는 이소노닐이소노나노에이트와 같은 오일류를 30 내지 70중량% 함유하도록 제조될 수 있고; 팩은 본 발명의 융합단백질 이외에 폴리비닐알콜을 5 내지 20중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩으로 제조되거나 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연 또는 이산화티탄과 같은 안료가 5 내지 30중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공한다.

bFGF는 피부노화 치료, 피부반흔 치료, 피부외상 치료, 피부상태 개선, 치주질환 치료, 세포증식, 혈관재생촉진, 내피세포성장촉진 등의 효과를 나타낸다고 알려져 있는데, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 상기 bFGF의 효과를 향상시킬 수 있음을 확인하였으므로, 상기 융합단백질은 종래의 bFGF에 의해 야기되는 피부노화 치료, 피부반흔 치료, 피부외상 치료, 피부상태 개선, 치주질환 치료, 세포증식, 혈관재생촉진, 내피세포성장촉진 등의 효과를 향상시켜서, 상기 증상의 치료 또는 개선효과를 나타내는 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 용어 "피부외용제"란, 유지류, 바셀린, 라놀린, 글리세롤 등의 다양한 기제에 약품을 혼합하여 쉽게 피부에 바를 수 있도록 한 고형, 반고형 또는 액상의 외용약을 의미한다. 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.

본 발명의 목적상 상기 피부외용제는 본 발명의 융합단백질을 포함하고, 적절한 피부외용제용 담체인 기제를 포함하는 제제로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 융합단백질은 bFGF에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 피부투과성과 피부잔류성이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부에서 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 합성 또한 증대시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 피부투과 촉진 펩타이드의 선발

피부투과 촉진 펩타이드를 선별하기 위해서 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하였다.

먼저, 1% BSA를 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) 용액 500㎕에, Ph.D-12 phage library kit(New England Biolab)로부터 유래된 10⁹개의 파지를 가하여 파지용액을 수득하였다.

다음으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5㎖, Permgear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고 상단에 상기 파지용액을 가하고, 16시간 동안 반응시킨 다음, 상기 돼지 피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 도달된 파지를 수득하고, 이를 증폭시켰다.

상기 증폭은 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)를 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 25㎖의 LB배지에 진탕 배양된 대장균 ER2738 균주에 상기 파지용액 5㎖를 가하고 4시간동안 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 8,000G로 원심 분리하여 파지분획이 포함된 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 6㎖의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 반응시켜서 파지를 침전시키고, 상기 반응액을 8,000G로 원심분리하여 파지를 침전시켰으며, 상기 침전물을 TBS용액에 현탁시켜서, 증폭된 파지용액을 수득하였다.

이처럼, 돼지 피부에 파지를 가하여 피부를 투과시킨 파지를 수득하고, 이를 증폭시키는 과정을 1회 진행하는 것을 1round라고 정의하였으며, 1Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2Round를 진행하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 경쟁하는 방식으로 선별하였고 총 3 Round를 수행하였다.

상기 3 Round를 수행하여 최종적으로 얻어진 파지에 포함된 펩타이드의 서열을 확인하기 위하여, 상기 파지를 포함하는 TBS용액을 대장균 ER2738 균주에 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액에 TOP agar를 가하여 혼합한 다음, 상기 혼합물을 LB/X-gal/IPTG 평판배지의 상단에 가하여 고형화시켰다. 그런 다음, 고형화된 배지를 16시간 동안 배양한 후, 청색의 콜로니를 선별하였다. 상기 선별된 콜로니로부터 유래된 균주를 6시간 동안 배양하고, 이로부터 DNA를 수득한 다음, 파지로부터 유래된 염기서열을 분석함으로써, 돼지 피부를 투과하는 특성을 나타내는 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 1)을 결정하였다.

실시예 2: 피부투과 촉진 펩타이드가 섬유모세포성장인자에 결합된 융합단백질의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF)의 N-말단이 두개의 아미노산(GG)으로 구성된 링커를 매개로 연결된 형태의 융합단백질인 T-bFGF(서열번호 3)를 생산하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 합성하고, 두개의 아미노산(GG)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 중심으로 연결시켜서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 한편, 엔테로키나제(Enterokinase)에 의해 절단될 수 있는 절단부위인 DDDDK(서열번호 4)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 이를 상기 제작된 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 연결하여, 엔테로키나제 절단부위-피부투과 촉진용 펩타이드-bFGF로 구성된 융합단백질을 코딩하는 최종 폴리뉴클레오티드를 수득하였으며, 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 GST 발현 벡터에 도입하여 발현벡터를 제작하였다.

상기 제작된 발현벡터를 대장균에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 수득한 형질전환체를 배양한 다음, 배양물을 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하였으며, 상기 수득한 세포 파쇄물을 GST 친화성 컬럼에 적용하여, GST-엔테로키나제 절단부위-피부투과 촉진용 펩타이드-bFGF로 구성된 융합단백질을 회수하였다. 상기 회수된 융합단백질에 엔테로키나제를 처리하여 GST 부분을 제거한 다음, 상기 반응물을 GPC 컬럼 크로마토그래피에 적용함으로써, 최종적으로 피부투과 촉진용 펩타이드-bFGF로 구성된 융합단백질인 T-bFGF(서열번호 3)를 생산하였다.

실시예 3: 융합단백질의 효과검증

실시예 3-1: 콜라겐 발현에 미치는 효과검증

상기 실시예 2에서 합성된 T-bFGF과 bFGF를 대상으로 하여, 콜라겐 및 엘라스틴 생성에 미치는 효과를 검증하고자 하였다.

구체적으로, 섬유모세포를 DMEM 배지가 담겨진 6웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양하여, 70 내지 80%의 포화도를 나타내는 배양물을 수득하였다. 상기 배양물에 다양한 농도(1, 10 또는 100ng/ml)의 T-bFGF 또는 bFGF를 가하고, 16시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, PBS로 배양된 세포를 세척하고, RNAeasy kit을 이용하여 각 세포로부터 총 RNA를 수득하였다. 상기 수득한 총 RNA를 이용하여 역전사 PCR 반응을 수행하여 cDNA를 수득하고, 상기 수득한 cDNA를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행함으로써, 콜라겐의 발현량을 정량분석하였다. 이때, 대조군으로는 T-bFGF 또는 bFGF를 전혀 처리하지 않고 배양한 섬유모세포를 사용하고, 내부대조군으로는 GAPDH의 mRNA를 사용하였다(표 1).

콜라겐 발현에 미치는 융합단백질의 효과

처리단백질	처리양	발현수준(%)
대조군	-	100±21
bFGF	10ng/ml 100ng/ml	224±15 420±25
T-bFGF	10ng/ml 100ng/ml	250±32 490±26

상기 표 1에서 보듯이, bFGF와 T-bFGF를 처리할 경우, 대조군보다는 콜라겐의 발현수준이 증가하였고, bFGF 보다는 T-bFGF를 처리할 경우 콜라겐의 발현수준이 상대적으로 더욱 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, bFGF를 단독으로 사용할 경우에 비하여 콜라겐의 발현량을 더욱 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 엘라스틴 발현에 미치는 효과검증

콜라겐 대신에 엘라스틴의 발현량을 정량분석하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1의 방법을 사용하여, T-bFGF 또는 bFGF이 엘라스틴 발현에 미치는 영향을 검증하였다(표 2).

엘라스틴 발현에 미치는 융합단백질의 효과

처리단백질	처리양	발현수준(%)
대조군	-	100±14
bFGF	1ng/ml 10ng/ml	95±14 220±24
T-bFGF	1ng/ml 10ng/ml	112±10 290±24

상기 표 2에서 보듯이, bFGF 또는 T-bFGF를 처리할 경우, 대조군보다는 대체로 엘라스틴의 발현수준이 증가하였고, bFGF 보다는 T-bFGF를 처리할 경우 엘라스틴의 발현수준이 상대적으로 더욱 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, bFGF를 단독으로 사용할 경우에 비하여 엘라스틴의 발현량을 더욱 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-3: 피부투과성 검증

Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하여 융합단백질의 피부투과성을 검증하였다.

구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% Tween 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 상기 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 상기 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 bFGF 또는 T-bFGF를 상단에 가하고, 16시간 동안 반응시킨 후, 하단에 존재하는 bFGF 또는 T-bFGF의 농도를 정량분석하고, bFGF의 함량에 대한 T-bFGF의 양의 상대적인 함량을 투과량으로 산출하였다(표 3).

융합단백질의 피부투과성

처리 단백질	투과량(%)
bFGF T-bFGF	100±15 513±19

상기 표 3에서 보듯이, bFGF 보다는 T-bFGF를 처리할 경우 피부투과성이 약 5배 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, 피부투과성이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 피부잔류성 검증

Franz glass cell (Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하여 융합단백질의 피부잔류성을 검증하였다.

구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% Tween 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 상기 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 상기 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 bFGF 또는 T-bFGF를 상단에 가하여 반응시키고, 상기 돼지 피부를 회수한 다음, 상기 돼지 피부를 분쇄하였으며, 이에 포함된 bFGF 또는 T-bFGF의 함량을 정량분석하였다. 그런 다음, bFGF의 함량에 대한 T-bFGF의 양의 상대적인 함량을 잔류량으로 산출하였다(표 4).

융합단백질의 피부잔류성

처리 단백질	잔류량(%)
bFGF T-bFGF	100±25 9,800±210

상기 표 4에서 보듯이, bFGF 보다는 T-bFGF를 처리할 경우 피부투과성이 약 100배 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, 피부잔류성이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with bFGF <130> KPA140078-KR <150> KR 10-2013-0138657 <151> 2013-11-14 <150> KR 10-2013-0138658 <151> 2013-11-14 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transdermal peptide <400> 1 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF <400> 2 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 3 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 3 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Gly Met Ala 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys 35 40 45 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 50 55 60 Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr 85 90 95 Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 100 105 110 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr 115 120 125 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr 130 135 140 Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile 145 150 155 160 Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 165

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF)에 결합된 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 bFGF의 N-말단에 결합된 것인 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 bFGF는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제1항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물.
제1항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부외용제용 약학 조성물.