KR20180030303A - α-시뉴클레인으로부터 유래된 신규한 세포막투과성 펩타이드 - Google Patents

α-시뉴클레인으로부터 유래된 신규한 세포막투과성 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 α-시뉴클레인으로부터 유래되고, 세포독성을 나타내지 않으며, 에너지 의존적으로 세포막 투과성을 나타내는 신규한 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 목적하는 약물이 결합된 형태의 복합체를 포함하는 세포내 약물전달용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 세포독성을 나타내지 않으면서도, 다양한 세포에 대하여 세포막 투과성을 나타내므로, 세포내 약물전달용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

α-시뉴클레인으로부터 유래된 신규한 세포막투과성 펩타이드{Novel cell membrane penetrating peptide derived from alpha-synuclein}
본 발명은 α-시뉴클레인으로부터 유래된 신규한 세포막투과성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 α-시뉴클레인으로부터 유래되고, 세포독성을 나타내지 않으며, 에너지 의존적으로 세포막 투과성을 나타내는 신규한 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 목적하는 약물이 결합된 형태의 복합체를 포함하는 세포내 약물전달용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 세포막은 대부분의 외래물질이 세포내로 유입되는 것을 방지하는 장벽으로서의 기능을 나타낸다. 이러한 세포막의 기능은 세포를 보호하기 위한 필수적인 역할이지만, 약학적인 측면에서는 치료를 위한 약물의 전달을 저해하는 주된 요인이 되고 있다. 상기 약물을 세포내로 전달하기 위해 사용되는 방법으로는 세포막에 존재하는 ATP-결합 수송 분자를 통한 능동수송 시스템을 이용하는 방법과, 세포막을 강제적으로 투과하는 방법으로 구분되는데, 능동수송 시스템을 이용하는 방법을 사용할 수 있는 약물은 극히 제한되므로, 대부분 세포막을 강제적으로 투과하는 방법이 사용되고 있다. 상기 세포막을 강제적으로 투과하는 구체적인 방법으로는 양이온성 지질/리포좀, 세포막투과성 펩타이드, 마이크로-주사, 바이러스 등을 이용하여 약물을 세포내로 전달하는 방법을 들 수 있는데, 약물에 따라 사용될 수 있는 방법이 제한되고 있어, 세포막을 강제적으로 투과하는 새로운 방법을 개발하기 위한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.
상기 방법 중에서 세포막투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 이용하는 방법은 대체로 세포막 투과성을 나타내는 펩타이드인 CPP에 목적하는 약물을 결합시킨 복합체를 이용하여 목적하는 약물을 세포내로 전달하는 방법인데, 이러한 CPP로는 대표적으로 HIV-1 TAT 전좌 도메인(Green; M. and Loewenstein, P.M. (1988) Cell 55, 1179-1188), 안테나페디아(Antennapedia) 단백질의 호메오도메인(Joliot; A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868) 등을 들 수 있고, 이들 이외에도 다양한 종류가 알려져 있을 뿐만 아니라, 지속적인 연구를 통하여 개발되고 있다. 이들 CPP는 공통적으로 염기성 아미노산을 비교적 높은 함량으로 포함하고, 양친매성을 나타내며, 대체로 50개 이하의 아미노산 서열로 구성된다는 특징을 나타낼 뿐만 아니라, 세포막의 안정성을 저해하여 세포막을 손상시키거나 또는 파괴하여 세포독성을 나타낸다고 알려져 있다.
이러한 세포막 투과성 펩타이드는 신규하게 합성된 것이 될 수 있으나, 대체로, 세포막 결합성 단백질로부터 유래된 것이 사용되고 있다. 예를 들어, 봉독 유래의 멜리틴은 약물과 직접적으로 복합체를 형성할 경우는 물론, 직접적으로 복합체를 형성하지 않고, 목적하는 약물과 혼합하여 비공유결합적 복합체를 형성한 경우에도, 상기 목적하는 약물을 세포내로 전달할 수 있다는 특징을 나타내기 때문에, 이를 이용하여 다양한 형태의 세포막 투과성 제제가 개발되고 있다(미국공개특허 제2013-0281658호 등).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 세포막투과성 펩타이드를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, α-시뉴클레인으로부터 유래된 신규한 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체가 세포독성을 전혀 나타내지 않으면서도, 비투과성 물질이 결합된 복합체를 형성한 후에도 상기 비투과성 물질을 세포막을 투과하여 전달할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 α-시뉴클레인으로부터 유래된 신규한 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 목적하는 약물이 결합된 형태의 복합체를 포함하는 세포내 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 새로운 세포막투과성 펩타이드를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, α-시뉴클레인으로부터 유래된 펩타이드 또는 그의 변이체가 세포독성을 나타내지 않으면서도, 비투과성 물질(FITC)이 결합된 복합체를 형성한 후에도 상기 비투과성 물질을 세포막을 투과하여 전달할 수 있음을 확인하였다. 이에 상기 펩타이드 또는 그의 변이체의 특성을 분석한 결과, 다양한 종류의 세포에 대하여 세포막 투과성을 나타내고, 펩타이드의 처리농도 및 처리시간에 비례하여 세포막 투과성이 증가하며, 에너지 의존적인 lipid raft 막투과 기전 또는 clathrin-mediated pathway 막투과 기전에 의해 세포막 투과성을 나타냄을 확인하였다.
이처럼, α-시뉴클레인으로부터 유래된 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 제공한다.
YDcpp 3: N-KTKQGVAEAAGK-C(서열번호 1)
본 발명의 용어, "세포막투과성"이란, 펩타이드가 세포막을 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다.
본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 세포막투과성 펩타이드는 α-시뉴클레인을 구성하는 아미노산 서열 중에서 21 내지 32번 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로서 세포독성을 전혀 나타내지 않으면서도, 우수한 세포막투과성을 나타내며, 다양한 종류의 세포에 대하여 세포막 투과성을 나타내고, 펩타이드의 처리농도 및 처리시간에 비례하여 세포막 투과성이 증가하며, 에너지 의존적인 lipid raft 막투과 기전 또는 clathrin-mediated pathway 막투과 기전에 의해 세포막 투과성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "변이체"란, 상기 세포막투과성 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 세포막투과성이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체는 상기 서열번호 1의 세포막투과성 펩타이드의 8번째 아미노산인 글루타민산(E)이 리신(K)으로 치환된 하기 서열번호 2의 변이체 펩타이드가 될 수 있다. 상기 서열번호 2의 변이체는 서열번호 1의 세포막투과성 펩타이드 보다는 다소 낮은 세포독성을 나타내면서도, 동등한 수준의 세포막투과성을 나타낼 수 있다.
YDcpp 4: N-KTKQGVAKAAGK-C(서열번호 2)
상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, α-시뉴클레인(α-synuclein)의 21 내지 32번 아미노산 서열로 구성된 세포막투과성 펩타이드와 상기 펩타이드의 8번째 아미노산을 리신으로 치환시킨 변이체를 각각 합성하고, 이의 특성을 분석하였다. 그 결과, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 세포독성을 나타내지 않고(도 1), 비투과성 물질(FITC)이 결합된 복합체를 형성한 후에도 상기 비투과성 물질을 세포막을 투과하여 전달할 수 있으며(도 2), 다양한 종류의 세포에 대하여 세포막 투과성을 나타내고(도 3), 처리농도 및 처리시간에 비례하여 세포막 투과성이 증가함을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 에너지 의존적으로 세포막 투과성을 나타내고(도 5), macropinocytosis, lipid raft 및 clathrin-mediated pathway 막투과 기전에 의해 세포막 투과성을 나타낼 것으로 분석되었다(도 6).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
아울러, 상기 발현벡터는 세포막투과성 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 세포막투과성 펩타이드을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 세포막투과성 펩타이드을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 세포막투과성 펩타이드을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
상기 형질전환체는 또한 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 세포막투과성 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 본 발명의 세포막투과성 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.
아울러, 배양물로부터 상기 본 발명의 세포막투과성 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 세포막투과성 펩타이드를 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 목적하는 약물이 결합된 형태의 복합체를 포함하는 세포내 약물전달용 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 세포독성을 나타내지 않으면서도, 다양한 세포에 대하여 세포막 투과성을 나타내므로, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체가 목적하는 약물과 결합되어 형성된 복합체는 세포내 약물전달용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
이때, 사용되는 약물은 세포내로 전달되어 세포내 활성을 조절하는 약리학적 활성을 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 화합물, 단백질, 핵산 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 전하를 띤 고분자 화합물, 형광화합물 등의 화합물; 효소, 리간드, 항체, 호르몬, 사이토카인 등의 단백질; siRNA, 플라스미드, 유전자 등의 핵산 등이 될 수 있다.
일 예로서, 상기 약물이 단백질인 경우, 상기 복합체는 융합단백질이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "융합단백질"이란, 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체가 다른 단백질 또는 펩타이드(이하, "융합파트너"라 약칭함)에 결합된 형태가 되도록 인위적으로 합성된 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체가 상기 융합파트너의 N-말단 또는 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된 형태가 될 수 있다.
한편, 상기 복합체는 상기 융합단백질에서 설명한 바와 같이, 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 목적하는 약물이 직접적으로 연결된 형태가 될 수도 있고, 링커를 통해 연결된 형태가 될 수도 있다. 링커를 이용하여 형성된 복합체에 있어서, 상기 링커는 상기 복합체의 활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않는다.
일 예로서, 상기 복합체가 융합단백질의 형태인 경우, 상기 링커는 상기 에스터가수분해효소 융합단백질의 효소활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 약물에 대한 하나의 실시예로서, 본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 형광화합물의 일종인 FITC를 결합시킨 복합체를 제작하고 상기 복합체의 세포막투과성을 평가하는 실험을 실시한 바 있으나, 이는 세포막에 대한 투과성을 나타내지 않는 약물의 하나의 예시로서 FITC를 사용한 것에 불과하고, 상기 FITC에 의하여 본 발명에서 제공하는 약물이 제한되지는 않는다.
본 발명의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 세포독성을 나타내지 않으면서도, 다양한 세포에 대하여 세포막 투과성을 나타내므로, 세포내 약물전달용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드에 세포막 비투과성 물질(FITC)이 결합된 복합체를 이용하여 상기 비투과성 물질을 세포막 내부로 도입한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 3은 HeLa(인간자궁경부암세포), 1321N1(인간뇌성상세포), B12(인간신경아세포) 및 MC3T3-E1(마우스골아세포) 세포에 대한, 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드에 세포막 비투과성 물질(FITC)이 결합된 복합체의 세포막 투과효율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 처리농도에 따른 세포막투과성의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 처리시간에 따른 세포막투과성의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성이 에너지 의존적인지의 여부를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성을 저해할 수 있는, 저해제의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포막투과성 펩타이드의 합성
인간 유래 시냅스전 종말 단백질인 α-시뉴클레인(α-synuclein)으로부터 하기의 펩타이드(서열번호 1) 및 그의 변이체(서열번호 2)를 합성하고, 이를 세포막 비투과성 물질(FITC)과 결합시켜 각각의 복합체 2종(YDcpp 3-FITC 및 YDcpp 4-FITC)을 제조하였다.
YDcpp 3: N-KTKQGVAEAAGK-C(서열번호 1)
YDcpp 4: N-KTKQGVAKAAGK-C(서열번호 2)
실시예 2: 세포막투과성 펩타이드의 특성분석
실시예 2-1: 세포독성 분석
상기 실시예 1에서 합성된 펩타이드의 세포독성을 분석하였다.
구체적으로, 5x103 HeLa 세포주를 96well에 DMEM배지와 24시간 동안 배양한 뒤, 각 펩타이드를 농도별로 100uM까지 처리하였다. 이후, 24시간 동안 37℃에서 반응한 뒤, MTS assay(Cell titer 96® AQueous one solution assay kit, Promega) 용액을 처리하고 1시간 후에 490nm에서 세포의 생존율을 측정하였다(도 1).
도 1은 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드는 100uM의 농도로 처리할 때 까지도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
실시예 2-2: 복합체를 이용한 비투과성 물질( FITC )의 세포내 전달
상기 실시예 1에서 제조된 2종의 복합체(YDcpp 3-FITC 및 YDcpp 4-FITC)를 사용하여 비투과성 물질(FITC)의 세포내 전달능을 평가하였다.
구체적으로, 형광현미경으로 관찰하기 위해 유리 커버슬립 상에 1x105 MC3T3-E1 세포를 접종하고, 상기 세포에 상기 각각의 복합체를 10uM 농도로 처리하고 5시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이후, 세포외부막에 붙어있는 펩타이드를 제거하기 위해, 0.25% 트립신으로 5분간 반응시켜 떼어주었다. 반응이 종료된 세포를 4% PFA(Paraformaldehyde)로 고정시킨 뒤, 형광현미경(Axioimager M1, Carl Zeiss)을 통해 관찰하였다(도 2). 이때, 세포의 핵을 대상으로 DAPI 염색을 수행하였다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드에 세포막 비투과성 물질(FITC)이 결합된 복합체를 이용하여 상기 비투과성 물질을 세포막 내부로 도입한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다. 도 2에서 보듯이, 상기 복합체는 세포막을 투과하여 세포질 뿐만 아니라 핵막의 안쪽으로도 전달되었음을 확인하였다.
실시예 2-3: 다양한 세포에 대한 세포막투과성 분석
상기 실시예 2-2의 결과가 다른 세포에서도 반복재현될 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, MC3T3-E1 세포대신에, HeLa(인간자궁경부암세포), 1321N1(인간뇌성상세포), B12(인간신경아세포) 및 MC3T3-E1(마우스골아세포) 세포를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 실험을 수행하였다(도 3).
도 3은 HeLa(인간자궁경부암세포), 1321N1(인간뇌성상세포), B12(인간신경아세포) 및 MC3T3-E1(마우스골아세포) 세포에 대한, 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드에 세포막 비투과성 물질(FITC)이 결합된 복합체의 세포막 투과효율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, MC3T3-E1 세포 뿐만 아니라, HeLa, 1321N1, B12, MC3T3-E1 세포등과 같은 다양한 세포에서 본 발명의 세포막투과성 펩타이드가 세포막 투과성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-4: 펩타이드의 처리농도가 미치는 영향분석
본 발명의 세포막투과성 펩타이드가 처리 농도에 따라 세포투과 특성에 변화를 나타내는지 확인하고자 하였다.
5x104 HeLa 세포에 상기 펩타이드를 다양한 농도(1 내지 20uM)로 처리하고, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이후, 0.25% 트립신으로 세포외부막에 붙어있는 펩타이드를 제거한 뒤 4% PFA로 고정시키고, FACS 분석을 수행하였다(도 4a).
도 4a는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 처리농도에 따른 세포막투과성의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, 펩타이드에 따라 차이가 있으나, 대체로 펩타이드의 처리농도가 증가함에 따라 세포막투과성이 증가됨을 확인하였다.
실시예 2-5: 펩타이드의 처리시간이 미치는 영향분석
본 발명의 세포막투과성 펩타이드가 처리 시간에 따라 세포투과 특성에 변화를 나타내는지 확인하고자 하였다.
5x104 HeLa 세포에 상기 펩타이드를 처리하고, 다양한 시간(10 내지 120분) 동안 37℃에서 반응시켰다. 이후, 0.25% 트립신으로 세포외부막에 붙어있는 펩타이드를 제거한 뒤 4% PFA로 고정시키고, FACS 분석을 수행하였다(도 4b).
도 4b는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 처리시간에 따른 세포막투과성의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, 펩타이드에 따라 차이가 있으나, 대체로 펩타이드의 처리시간이 증가함에 따라 세포막투과성이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3: 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과기전 분석
실시예 3-1: 에너지 의존성 분석
본 발명의 세포막투과성 펩타이드가 세포막을 투과하는 기전이 에너지 의존적인지의 여부를 규명하고자 하였다.
구체적으로, 5x104 HeLa 세포를 24시간 동안 37℃에서 배양하고, 37℃ 실험군(37℃), ATP depletion 군(-ATP) 및 4℃ 실험군(4℃)으로 분류하였다. 상기 37℃ 실험군은 세포막투과성 펩타이드를 처리한 후 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 세포이고, ATP depletion 실험군은 ATP depletion buffer(10mM sodium azide, 6mM 2-deoxy-D-glucose)로 30분간 반응시킨 뒤 세포막투과성 펩타이드를 처리하여 37℃에서 반응시킨 세포이며, 4℃ 실험군은 세포를 4℃에서 20분간 미리 반응시킨 뒤, 세포막투과성 펩타이드를 처리해 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 세포이다.
상기 각 실험군의 세포에서 세포막 투과성을 분석하였다(도 5).
도 5는 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성이 에너지 의존적인지의 여부를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 에너지 의존적인 기전을 일으키는 37℃ 실험군의 세포와는 달리, ATP depletion 실험군 및 4℃ 실험군의 세포에서는 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성이 감소함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 세포막투과성 펩타이드는 에너지 의존적 세포막 투과기전에 의해 세포막 투과성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 에너지 의존적 세포막 투과기전의 분석
상기 실시예 3-1을 통해, 본 발명의 세포막투과성 펩타이드가 에너지 의존적 세포막 투과기전에 의해 세포막 투과성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 에너지 의존적 세포막 투과기전 중에서 본 발명의 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과기전이 무엇인지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 에너지 의존적인(energy-dependent) 세포막 투과 기전으로는, macropinocytosis, lipid raft, caveolin-mediated pathway, clathrin-mediated pathway, clathrin/caveolin-independent pathway 등이 알려져 있으므로, 하기 표 1에 기재된 상기 각 세포막 투과 기전을 저해하는 저해제를 세포에 선처리한 후, 상기 실시예 1에서 제조된 2종의 복합체를 처리하고, 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, 반응이 종료된 세포를 대상으로 FACS 분석을 수행하였다(도 6).
막투과 기전 및 그에 대한 저해제
막투과 기전 저해제
macropinocytosis
lipid raft
caveolin-mediated pathway
clathrin-mediated pathway
clathrin/caveolin-independent pathway		 EIPA
MßCD
Genistein
Chlorpromazine
Chloroquine/ Filipin/ Heparin
도 6은 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성을 저해할 수 있는, 저해제의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 펩타이드에 따라 차이가 있으나, macropinocytosis 막투과 기전을 억제하는 EIPA, lipid raft 막투과 기전을 억제하는 MßCD, clathrin-mediated pathway 막투과 기전을 억제하는 Chlorpromazine 및 clathrin/caveolin-independent pathway 막투과 기전을 억제하는 Chloroquine에 의하여, 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성이 억제됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, macropinocytosis, lipid raft 및 clathrin-mediated pathway 막투과 기전이 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성에 관여하는 것으로 파악되었다. 다만, clathrin/caveolin-independent pathway 막투과 기전을 억제하는 3가지 억제제 중의 한가지를 처리한 경우에만, 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성이 억제되었으므로, clathrin/caveolin-independent pathway 막투과 기전이 세포막투과성 펩타이드의 세포막 투과성에 관여하는 것인지에 대하여는 불명확하다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 세포막투과성 펩타이드는 적어도 macropinocytosis, lipid raft 및 clathrin-mediated pathway 막투과 기전에 의해 세포막 투과성을 나타낼 것으로 분석되었다.
<110> YD LIFE SCIENCE CO., LTD <120> Novel cell membrane penetrating peptide derived from alpha-synuclein <130> KPA161117-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YDcpp 3 <400> 1 Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YDcpp 4 <400> 2 Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Lys Ala Ala Gly Lys 1 5 10

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  5. 제4항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
  6. 제1항 또는 제2항의 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 목적하는 약물이 결합된 형태의 복합체를 포함하는 세포내 약물전달용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 복합체는 세포막투과성 펩타이드 또는 그의 변이체가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합된 융합단백질인 것인, 조성물.
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