KR20230128233A

KR20230128233A - 신규한 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230128233A
Application number: KR1020230004952A
Authority: KR
Inventors: 조관구; 이진희
Original assignee: 주식회사 큐라티스
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2023-01-12
Publication date: 2023-09-04

Abstract

본 발명은 신규한 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 형광물질을 결합시킨 재조합 단백질을 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)에 처리시, 세균 내부에서 형광물질이 발현됨을 확인하였으며, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 인간 대식세포에 대해 고농도로 처리함에도 세포독성을 보이지 않음을 확인한 바, 이를 마이코박테리움 종 내부로 약물을 전달할 수 있는 약물 전달체로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신규한 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도{Novel cell penetrating peptide, and producing method thereof}

본 발명은 신규한 세포투과성 펩타이드 및 이의 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 투과 활성에 따른 용도에 관한 것이다.

일반적으로, 세포막은 대부분의 외래물질이 세포내로 유입되는 것을 방지하는 장벽으로서의 기능을 나타낸다.

이러한 세포막의 기능은 세포를 보호하기 위한 필수적인 역할이지만, 약학적인 측면에서는 치료를 위한 약물의 전달을 저해하는 주된 요인이 되고 있다. 상기 약물을 세포내로 전달하기 위해 사용되는 방법으로는 세포막에 존재하는 ATP-결합 수송 분자를 통한 능동수송 시스템을 이용하는 방법과, 세포막을 강제적으로 투과하는 방법으로 구분되는데, 능동수송 시스템을 이용하는 방법을 사용할 수 있는 약물은 극히 제한되므로, 대부분 세포막을 강제적으로 투과하는 방법이 사용되고 있다.

상기 세포막을 강제적으로 투과하는 구체적인 방법으로는 양이온성 지질/리포좀, 세포투과성 펩타이드, 마이크로-주사, 바이러스 등을 이용하여 약물을 세포내로 전달하는 방법을 들 수 있는데, 약물에 따라 사용될 수 있는 방법이 제한되고 있어, 세포막을 강제적으로 투과하는 새로운 방법을 개발하기 위한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.

상기 방법 중에서 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 이용하는 방법은 대체로 세포막 투과성을 나타내는 펩타이드인 CPP에 목적하는 약물을 결합시킨 결합체를 이용하여 목적하는 약물을 세포내로 전달하는 방법인데, 이러한 CPP로는 대표적으로 HIV-1 TAT 전좌 도메인(HIV-1 TAT transversion domain), 안테나페디아(Antennapedia) 단백질의 호메오도메인(homeodomain) 등을 들 수 있고, 이들 이외에도 다양한 종류가 알려져 있을 뿐만 아니라, 지속적인 연구를 통하여 개발되고 있다. 이들 CPP는 공통적으로 염기성 아미노산을 비교적 높은 함량으로 포함하고, 양친매성을 나타내며, 대체로 50개 이하의 아미노산 서열로 구성된다는 특징이 있다. 하지만 세포막의 안정성을 저해하여 세포막을 손상시키거나 또는 파괴하여 세포독성을 나타낸다고 알려져 있어 안전성에 대한 우려가 있다.

이처럼 세포독성을 나타내는 CPP의 하나로서 멜리틴(melittin)을 들 수 있다. 봉독(bee venom, apitoxin)의 주성분으로 알려진 멜리틴은 26개의 아미노산으로 구성되고, 나노몰 단위로 사용될 경우에도 심각한 세포독성을 나타내며, 세포투과성을 나타내는 펩타이드로 알려져 있다. 상기 멜리틴은 다른 CPP와는 달리 목적하는 약물과 직접적으로 결합체를 형성할 경우는 물론, 직접적으로 결합체를 형성하지 않고, 목적하는 약물과 혼합하여 비공유 결합적 복합체를 형성한 경우에도, 상기 목적하는 약물을 세포내로 전달할 수 있다는 특징을 나타낸다. 이같은 멜리틴은 목적하는 약물과의 결합이 필요하지 않다는 점에서 종래의 CPP에 비하여 현저한 우수성을 나타내지만, 높은 세포독성으로 인하여, CPP로 사용되지 못하고 있는 실정이다.

한편 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)은 병원성 정도에 따라 절대병원성균인 결핵균 및 나병균을 포함하는 결핵균군과, 이를 제외한 기회감염성 균종인 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM)의 두 그룹으로 구분된다. 상기 결핵균은 감염 후 일정기간 동안 잠복기를 거친 후 발병되거나 또는 잠복기 없이 급성으로 발병하여 폐의 염증과 천식을 동반하는 합병증을 일으켜 감염자를 결국 사망에 이르게 한다. 특히 결핵균을 단순히 보유하고 있는 보균자의 경우에는 자각증상이 없기 때문에 타인에게 쉽게 결핵균이 전염될 수 있어 결핵의 예방에 어려움이 있다.

상기 결핵(Tuberculosis, TB)은 세계보건기구 (WHO; World Health Organization)에서 지정한 인류 건강을 위협하는 3대 감염 질병 중 하나이다. 결핵을 발병시키는 주요 원인균으로는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)가 대표적이고, 전 세계 인구 중 3분의 1정도는 감염된 이력이 있다고 보고되고 있다.

2017년 세계보건기구에서 작성한 Global TB report에서는 2016년 기준으로 전 세계에서 새롭게 결핵에 걸린 환자는 약 1,040만명으로 추산하고 있으며 기존의 결핵환자 중 140만명은 결핵으로 인한 사망, 그리고 추가적으로 40만명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV; Human Immunodeficiency Virus)와의 동시감염으로 인한 사망이 발생하였다고 보고하고 있다. 그러나 최근 결핵 감염 수는 매년 감소 추세에 이르지만 다제내성(Multi-drug resistant, MDR) 및 광범위 내성( Extensively-drug resistant, XDR)을 지닌 결핵균의 증가로 인하여 결핵 치료가 어려워지고 있다. 이로 인해 결핵의 치료 비용도 증가하였고, 치료 효율마저 낮아져 난치성 결핵으로 발전하는 모습을 보여주고 있다. 더욱이 마이코박테리움 종은 그람 음성(Gram negative), 그람 양성(Gram positive) 세균들과는 달리 마이콜산(mycolic acid) 라는 긴사슬지방산(long chain fatty acid) 성분으로 세균벽이 구성되어 있어, 외부 물질인 친수성의(hydrophilic) 항생제 및 화합물의 세균내 유입을 효과적으로 방어하는 것으로 알려져 있다.

따라서 결핵의 치료를 위하여 세포독성이 없으면서도 마이코박테리움 종을 투과할 수 있는 신규한 세포투과성 펩타이드의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 세포독성이 없는 안전한 세포투과성 펩타이드에 대해 연구하던 중, 신규한 아미노산 서열의 세포투과성 펩타이드를 합성하고, 이의 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)에 대한 세포투과능 및 세포독성 여부를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 세포투과성 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포투과성 펩타이드의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 투과 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포내 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약물 또는 검출 시약의 세포 투과능을 증가시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 세포투과성 펩타이드의 생산 방법을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는, 세포 투과 개선용 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는, 세포내 약물전달용 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드에 목적하는 약물 또는 검출 시약을 결합시키는 단계; 및 2) 상기 1) 단계에서 제조된 결합 물질을 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 약물 또는 검출 시약의 세포 투과능을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 세포투과성 펩타이드는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)에 대하여 우수한 세포투과능을 보이며, 인간 대식세포에 대해 고농도로 처리함에도 세포독성을 나타내지 않은 바, 이를 마이코박테리움 종 내부로 약물을 전달할 수 있는 약물 전달체로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 합성을 위한, 세포투과성 펩타이드 및 GFP(Green fluorescent protein)을 포함하는 재조합 단백질 생산에 대한 모식도(A)와 이를 통해 수득한 균주의 GFP 발현 여부를 확인한 결과(B)이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 GFP가 결합된 재조합 단백질의 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)에 대한 투과능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 FAM이 결합된 재조합 단백질의 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)에 대한 투과능을 확인한 결과이다.
도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 FAM이 결합된 재조합 단백질의 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)에 대한 투과능을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드의 세포독성을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

PFPLFSPFPY(서열번호 1).

본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하며, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.

본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH₂)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.

상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 형광단으로서 GFP(green fluorescent protein) 또는 FAM(carboxyfluorescein)가 본 발명의 세포투과성 펩타이드에 연결된 재조합 단백질을 생산하여 상기 형광단의 형광 발현을 통해 세포투과 여부를 확인하였다.

본 발명의 세포투과성 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 세포투과성 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "세포투과성"이란, 펩타이드가 세포막을 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 형광물질과 결합시킨 재조합단백질을 마이코박테리움 종 세균에 처리시, 상기 세균의 세포막을 투과하여 형광물질이 내부에 침투한 것을 확인하였다.

따라서 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)을 투과하는 것을 특징으로 하며, 상기 마이코박테리움 종은 이에 제한되는 것은 아니나 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae), 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus) 및 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

더불어 본 발명은 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 세포투과성 펩타이드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 벡터는 세포투과성 펩타이드의 검출 또는 정제가 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제(endopeptidase)를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광 분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터는 상술한 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 대장균 유래 플라스미드(pET30a, pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에 따른 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트(Dextran Sulfate), 리포펙타민(Lipofectamine) 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소 필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

상기 형질전환체는 또한 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 본 발명의 세포투과성 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는, 세포 투과 개선용 조성물을 제공한다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는, 세포내 약물전달용 조성물을 제공한다.

바람직하게는 본 발명에 따른 세포내 약물전달용 조성물은 목적하는 약물을 더 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 약물은 상호 결합하여 결합체를 형성함으로써, 상기 약물을 세포내로 전달할 수 있다.

이때, 상기 결합체에 있어서, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드에 목적하는 약물이 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다.

본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드에 목적하는 약물이 직접적으로 연결되는 경우, 상기 약물은 세포투과성 펩타이드의 C-말단(C-terminal)에 결합할 수 있다.

상기 링커는 상기 결합체의 활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 화합물을 약물로 사용할 경우, 상기 약물의 결합을 촉진할 수 있는 화합물; 또는 단백질 또는 핵산을 약물로 사용할 경우, 상기 약물의 결합을 촉진시킬 수 있는 펩타이드 등이 될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드는 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 등의 다양한 마이크로박테리움 종에 대해 우수한 세포투과능을 보였다.

더불어 본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 인간 대식세포에 처리시, 고농도로 처리함에도 세포독성을 보이지 않은 바, 안전한 CPP임을 확인하였다.

본 발명에 따른 세포내 약물전달용 조성물은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 내부로 약물을 전달하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 약물은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)에 대한 항균 또는 사멸 효과를 보이는 물질인 것이 바람직하며, 일 예로서 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

더불어, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드에 목적하는 약물 또는 검출 시약을 결합시키는 단계; 및 2) 상기 1) 단계에서 제조된 결합 물질을 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 약물 또는 검출 시약의 세포 투과능을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 조성물을 제공한다.

더불어 본 발명은 세포투과성 펩타이드를 포함하는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), FAM(carboxyfluorescein), 로다민(rhodamine), 사이아닌(Cyanine)3, 피렌(pyrene), 사이아닌5, 칼세인(Calcein), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 알렉사(Alexa)488, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 로다민 팔로이딘(Phodamine PHalloidin), 피로닌Y (Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘 크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red) 또는 티아디카르보시아닌(Thiadicarbocyanine) 등이 있다.

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.

표지물질의 종류에 따라 형광 검출법, 전기화학적 방법, 질량변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법, 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법 등과 같은 잘 알려진 혼성화 검출방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 바이오틴과 결합하는 스트렙트아비딘(streptavidin)에 결합한 형광 염료를 이용한 형광 검출법을 사용할 수도 있고, 바이오틴과 결합하는 스트렙트아비딘에 결합한 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(HRP, Horse Radish peroxydase)를 이용한 효소 발색법을 사용하여 타겟 핵산을 검출할 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는 표지물질로 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP) 또는 FAM(carboxyfluorescein)을 사용하여 마이코박테리움 종 내 형광 신호를 확인하였다.

본 발명의 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 키트에는 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다.

마이코박테리움 종 내부에 침투한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 마이코박테리움 종으로의 침투 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 검출 방법에 있어서, 펩타이드의 표지 또는 검출 방법에 대해서는 상기에 언급한 바와 같다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포투과성 펩타이드 합성 및 이와 형광 단백질이 결합된 재조합 단백질 생성

본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 합성 및 이를 포함하는 재조합 단백질의 생산을 위한 과정은 도 1 중 (A)에 간략한 모식도로 나타내었다.

먼저 GFP(green fluorescent protein)의 N-말단(N-terminal)에 무작위하게 10mer의 펩타이드가 결합된 단백질을 만드는 대장균 시스템(Escherichia coli system)을 구축하였다.

보다 구체적으로 세포투과성 펩타이드 서열 발굴을 위한 스크리닝 시스템 구축을 위해 (KFF)₃K 펩타이드 결합 GFP 단백질을 발현하는 E.coli (BL21(DE3) pET30α(KFF-GFP)) 균주를 사용하였다(강원대학교 수의과대학에서 제공받음).

기존 세균/세포 대상 침습성을 가진 (KFF)₃K 아미노산 서열과 GFP 단백질을 암호화한 벡터(vector)를 토대로 신규한 세포투과성 펩타이드 서열 발굴을 위하여 다음과 같은 유전자 재조합 프라이머(Primer)를 디자인하였다: 정방향 프라이머(Forward Primer)= GAAGGAGATATACATATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC, 역방향 프라이머(Reverse Primer)= TTATTTGTATAGTTCATCCAT.

GFP를 포함하는 세포투과성 펩타이드(QPP-GFP)를 암호화하는 염기서열은 하기 표 1에 기재된 염기서열을 기반으로 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용해 (KFF)₃K 대신 무작위(random)하게 10개의 아미노산이 결합된 GFP 단백질을 발현하도록 합성하였다.

KFF-GFP
sequence

GAAGGAGATATACATATGAAATTCTTCAAATTCTTCAAATTCTTCAAAAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA

E.coli (BL21(DE3) pET30α(KFF-GFP)) 균주를 카나마이신(kanamycin(30μg/ml)) 항생제가 포함된 LB 배지(Luria-Bertani broth)에서 19시간 증균 배양 후, High yield plasmid DNA Mini kit(RBC사, Cat No.[ YPD100)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 추출하였다. 상기 표 1의 QPP-GFP를 암호화한 유전자 증폭을 위해 추출한 플라스미드 DNA를 이용해 하기 표 2에 기재된 조성으로 혼합물(mixture(5x buffer, Biolabs 사, Cat No. B9028A; dNTP, Polymerase, Intron사, Cat No. 25161))을 만들고 하기 표 3의 조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR mixture
5 x buffer	5 μl
10 Mm Dntp	0.5 μl
Forward primer(10pm/ μl)	1.25 μl
Reverse primer(10pm/ μl)	1.25 μl
Polymerase(5U/ μl)	0.25 μl
DNA template(100ng/ μl)	1 μl
Distilled water	15.75 μl
Total	25 μl

온도 (℃)	시간	싸이클(Cycle)
98	3 min	1
98	30 sec	35
55	30 sec
72	45 sec
72	2 min	1

증폭된 PCR 생성물은 Dyne Loading STAR(다인바이오 사, Cat No. A750) 혼합한 후, 아가로즈 겔(Agarose gel)에 로딩(loading)하여 전기영동으로 밴드 크기(band size)를 확인하였다. 약 760 bps의 밴드 크기에 맞춰 아가로즈 겔을 절단하고 NucleoSpin® Gel and PCR Clean up kit(Macherey-Nagel 사, Cat No. 740609.250)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 겔 추출(purification)을 수행하였다.

PCR 증폭 산물의 클로닝(cloning)을 위해 RBC T&A Cloning kit(RBC사, Cat No.RC001)를 사용하여 하기 표 4의 조성으로 라이게이션(ligation)을 수행하였다.

PCR mixture
10 x Ligation buffer A	1 μl
10 x Ligation buffer B	1 μl
T&A cloning vector(25ng/ ul)	2 μl
PCR product	2 μl
T4 DNA Ligase(3U/ ul)	1 μl
Distilled water	3 μl
Total	10 μl

그 후 다음과 같은 방법으로 E.coli 형질전환(transformation)을 수행하였다. 컴피턴트 세포(Competent cell, DH5α) 100 μl에 상기를 통해 수득한 TA 클로닝 산물 10 μl를 혼합하고 얼음에 보관하였다. 이를 42℃로 온도를 맞춘 히팅 블록(heat block)에서 45초 동안 반응시킨 뒤, 얼음에 5분간 보관하였다. 37℃로 미리 보관했던 LB 배지 900 μl를 반응 산물에 넣고 진탕배양기(37℃, 230rpm)에서 1시간 동안 배양하였다. 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 아가 플레이트(agar plate)에 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside) 20 μl를 분주(spreading)하고 37℃에서 약 30분 동안 사전 예열(pre-warming)해주었다. 1시간 동안 배양한 배양액을 100 μl을 취하여 상기에서 준비한 LB 아가 플레이트(X-gal/Am+/LB agar plate)에 분주한 뒤, 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. 남은 배양액 900 μl는 원심분리하여 농축한 뒤, 100 μl의 침전액만 수득하였다. 상기 100 μl 침전액을 X-gal/Am+/LB agar plate에 분주한 뒤, 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. X-gal/Am+/LB agar plate 표면 위에 발현된 하얀색 콜로니(colony) 중 UV 상에서 녹색 형광을 발현하는 후보 균주를 X-gal이 없는 Am+/LB agar plate에 접종하여 밤새 증균 배양하였다. 이로부터 플라스미드를 분리 정제한 후, MPP(Mitochondrial processing peptidase) 염기서열 분석을 통해 최종 확인하였다(코스모진텍에 의뢰). 더불어 UV 일루미네이터(UV illuminator) 및 형광현미경을 통해 확인한 결과, 도 1 중 (B)와 같이 GFP를 발현하는 E.coli는 녹색 형광을 나타냄을 확인하였다.

이를 통해 총 50종의 신규 투과 펩타이드가 결합된 GFP를 발현하는 세균주 구축을 완료하였다. 그 중에서 MPP 서열 분석을 통해 GFP의 N-말단에 무작위하게 연결된 10mer의 펩타이드 중 하기 표 5에 기재된 아미노산 서열의 펩타이드가 연결된 재조합 단백질을 포함하는 균주를 선택하였다.

명칭	펩타이드 서열(5'→3')
QPP-10	PFPLFSPFPY
QPP-35	ASHRGNAAMS

실시예 2. 세포투과성 펩타이드 및 다른 형광단백질이 결합된 재조합 단백질 제작 및 생산

상기 실시예 1을 통해 수득한 세포투과성 펩타이드의 추가 검증을 위하여, 상기 표 5에 기재된 세포투과성 펩타이드에 FAM(carboxyfluorescein)을 인위적으로 합성하였다(QPP-FAM). 상기 QPP-FAM 합성은 ㈜코스모진텍에서 진행하였다. 더불어 양성대조군으로 기존 세포 투과성 펩타이드로 알려진 (KFF)3K(펩타이드 서열(5'-3'):KFFKFFKFFK)를 이용하였으며, 상기 서열에 GFP 또는 FAM을 결합하여 KFF-GFP와 KFF-FAM을 합성하였다.

실시예 3. 세포 투과성 펩타이드의 마이코박테리움 종( Mycobacterium spp.)에 대한 투과능 확인

3-1. 마이코박테리움 투베쿨로시스( Mycobacterium tuberculosis )에 대한 투과능 확인

M. tuberculosis H37Rv(ATCC에서 구입)를 5ml의 배지(Middlebrook 7H9 broth)에 접종하고 37℃에서 배양하였다. 배양한 균주를 13,000 rpm으로 4 분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, PBS에 재현탁하였다(4.4 × 10⁸ CFU/ml 농도).

이를 96 웰 플레이트에 50 μl씩 분주하고 상기 실시예 2를 통해 제조한 CFP가 결합된 재조합 단백질(QPP-10(GFP) 또는 QPP-35(GFP))를 100 μg/well이 되도록 분주한 후, 37℃로 24시간동안 배양하였다. 그 후 형광 리더기를 이용하여 M. tuberculosis H37Rv내 GFP 형광값을 확인하였다.

그 결과 상기 표 6과 같이, 본 발명의 세포 투과성 펩타이드인 QPP-10 및 QPP-35에 결합된 GFP가 세균 내부로 침투한 것을 확인하였다.

3-2. 마이코박테리움 스메그마티스( Mycobacterium smegmatis )에 대한 투과능 확인

M. smegmatis ATCC 700084(ATCC에서 구입)를 4 ml의 배지(ADC(Albumin Dextrose Catalase)를 포함하는 Middlebrook 7H9)에 접종하고 37℃에서 증균 배양하였다. 배양한 균주를 PBS로 세척한 후 1 × 10⁸ CFU/ml의 농도로 준비한 후에 96 웰 플레이트에 50 μl씩 분주하였다. 더불어 상기 실시예 2를 통해 제조한 GFP가 결합된 재조합 단백질(QPP-10(GFP) 또는 QPP-35(GFP))을 100 μg/well이 되도록 분주하고 37℃로 1시간동안 배양하였다. 그 후 GFP 발현을 이미징 시스템(EVOS M500 0 Imaging System(Thermo Fisher)을 이용해 확인하였다.

더불어 상기와 동일한 방법으로 다른 형광물질인 FAM을 이용하여 세포 투과능을 확인하였다. 이때 상기 M. smegmatis ATCC 700084는 Middlebrook 7H9 배지(ADC 및 0.05% 트윈 80(Tween 80)을 포함)를 이용해 증균 배양하였으며, 상기 실시예 2를 통해 제조한 FAM이 결합된 재조합 단백질(QPP-10(FAM) 또는 QPP-35(FAM))을 100 μM이 되도록 분주하고 37℃로 4시간동안 배양한 후, FAM 발현을 확인하였다.

그 결과 도 2 및 도 3과 같이, 본 발명에 따른 세균 투과성 펩타이드, QPP-10 또는 QPP-35로 인해 형광 물질인 GFP 및 FAM이 세균 내부에 침투된 것을 확인하였다.

3-3. 마이코박테리움 보비스( Mycobacterium bovis )에 대한 투과능 확인

M. bovis (ATCC에서 구입, 균주번호:357373)는 Middlebrook 7H9 배지(ADC 및 0.05% 트윈 80을 포함)에 접종하여 37℃에서 증균 배양하였다. 배양한 균주를 0.05% 트윈 80을 포함하는 PBS로 세척한 후, 상기 실시예 2를 통해 제조한 FAM이 결합된 재조합 단백질(QPP-10(FAM) 또는 QPP-35(FAM))을 100 μM이 되도록 분주하고 37℃로 4시간동안 배양하였다. 그 후 FAM 발현을 이미징 시스템(EVOS M500 0 Imaging System(Thermo Fisher)을 이용해 확인하였다.

그 결과 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 세균 투과성 펩타이드, QPP-10 또는 QPP-35로 인해 형광 물질인 FAM이 세균 내부에 침투된 것을 확인하였다.

실시예 4. 세포독성 확인

고효율 투과능을 가진 펩타이드를 약물전달체로 활용하기 위해서는 생체내 독성을 유발하지 않는 것이 필수적이다. 따라서 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 세포독성을 확인하였다. 먼저 인간 대식세포인 THP 1 세포(ATCC에서 구입)를 96 웰 플레이트에 1 ×10⁴ cells/well이 되도록 접종(seeding)한 후 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24 시간 배양하였다. 배양 배지를 제거한 후, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드, QPP-10 또는 QPP-35를 1, 10, 20, 50, 100 μM 농도가 되도록 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24 시간 배양하였다. 그 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 분석(Abcam)을 수행하여 세포독성을 확인하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 공지된 투과성 펩타이드(KFF)₃K는 농도 의존적으로 대식세포주 대상으로 독성을 유발하는 것을 확인하였다. 상기 펩타이드를 100 μM 농도로 처리시 비처리군 대비 약 70% 정도의 세포 생존이 확인되었다. 반면, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드인 QPP-10 및 QPP-35는 고농도(100 μM)로 처리하여도 비처리군과 유사한 세포 성장을 보임을 확인하였다.

종합적으로 본 발명은 마이코박테리움 종을 투과할 수 있는 신규한 세포 투과성 펩타이드에 대한 것으로, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드와 형광물질을 결합시킨 재조합 단백질을 마이코박테리움 종에 속하는 세균에 처리 시, 세균 내부에서 형광물질이 발현됨을 확인하였으며, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 인간 대식세포에 대해 고농도로 처리함에도 세포독성을 보이지 않음을 확인한 바, 이를 마이코박테리움 종 내부로 약물을 전달할 수 있는 약물 전달체로 유용하게 활용할 수 있다.

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)을 투과하는 것을 특징으로 하는, 세포투과성 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)은 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 카사시이(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 오슬로엔시스(Mycobacterium osloensis), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 테라에(Mycobacterium terrae), 마이코박테리움 앱세수스(Mycobacterium abscessus) 및 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포투과성 펩타이드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 세포투과성 펩타이드의 생산 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는, 세포 투과 개선용 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는, 세포내 약물전달용 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 세포내 약물전달용 조성물은 상기 세포투과성 펩타이드에 결합된 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포내 약물전달용 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 세포내 약물전달용 조성물은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 내부로 약물을 전달하는 것을 특징으로 하는, 세포내 약물전달용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 약물은 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)에 대한 항균 또는 사멸 효과를 보이는 물질인 것을 특징으로 하는, 세포내 약물전달용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 약물은 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포내 약물전달용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 약물은 세포투과성 펩타이드의 C-말단(C-terminal)에 결합하는 것을 특징으로 하는, 세포내 약물전달용 조성물.
1) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드에 목적하는 약물 또는 검출 시약을 결합시키는 단계; 및
2) 상기 1) 단계에서 제조된 결합 물질을 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 약물 또는 검출 시약의 세포 투과능을 증가시키는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 포함하는 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출용 키트.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 세포투과성 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) 검출 방법.