KR20230100658A - 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 세포투과능을 나타내고, 상기 펩타이드의 아미노산 서열 하나가 다른 아미노산으로 치환되더라도 세포투과능을 유지하며, 상기 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 각 아미노산 사이에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포막을 투과할 수 있음을 확인함으로써, 약물 전달용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도{Novel cell penetrating peptides and uses thereof}
본 발명은 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
고등동물의 세포는 세포 안과 그 밖을 구분하는 세포막(plasma membrane)이 있다. 세포막은 바이러스, 세균 등 외래물질이 세포 내로 유입되는 것을 방지하는 역할을 하여 세포 보호에 필수적이나, 세포막을 구성하는 이중층(phospholipid bilayer)이 가지는 소수성에 의해, 대부분의 펩타이드, 단백질, 뉴클리오타이드, 리포좀 등은 세포 내로 이동하는 것은 거의 불가능하여, 약학적인 측면에서는 오히려 치료를 위한 약물의 전달을 저해할 수 있다.
약물을 세포 내로 전달하기 위해 사용되는 방법으로는 세포막에 존재하는 ATP-결합 수송 분자를 통한 능동수송 시스템을 이용하는 방법 및 세포막을 강제적으로 투과하는 방법으로 구분할 수 있고, 능동수송 시스템을 이용하는 방법을 사용할 수 있는 약물은 극히 제한되므로, 세포막을 강제적으로 투과하는 방법이 주로 사용되고 있다. 구체적으로, 양이온성 지질/리포좀, 세포투과성 펩타이드, 마이크로-주사, 바이러스 등을 통해 통한 약물 전달 방법이 알려져 있으나, 각각 적용 가능한 세포의 제한, 세포 내 독성 등 한계 또는 부작용의 문제점이 있어, 상기 문제점을 극복하기 위한 약물 전달 물질에 대한 연구가 활발히 진행 중인 상황이다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1647804호(2016.08.05. 등록)
본 발명의 목적은 세포투과능이 있는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 각 아미노산 사이에 세포투과능이 없는 펩타이드를 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 및 목적하는 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기의 서열 일반식으로 표시되는 펩타이드를 제공한다.
[일반식]
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7
상기 X1은 글리신(Glycine), 알라닌(Alanine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 발린(Valine), 아스파라긴(Asparagine), 글루타민(Glutamine), 아르기닌(Arginine), 리신(Lysine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 티로신(Tyrosine), 트립토판(Tryptophan), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 프롤린(Proline)으로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
상기 X2는 시스테인(Cysteine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X3은 시스테인(Cysteine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X4는 글리신(Glycine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X5는 글루탐산(Glutamic acid) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X6은 이소류신(Isoleucine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X7은 발린(Valine) 또는 아르기닌(Arginine)이다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 각 아미노산 사이에 세포투과능이 없는 펩타이드를 포함하는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 목적하는 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 세포투과능을 나타내고, 상기 펩타이드의 아미노산 서열 하나가 다른 아미노산으로 치환되더라도 세포투과능을 유지하며, 상기 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 각 아미노산 사이에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포막을 투과할 수 있음을 확인함으로써, 약물 전달용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 비장세포를 공초점 현미경을 통해 세포 내 형광 발현을 관찰한 결과이다.
도 2는 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 복강대식세포를 공초점 현미경을 통해 세포 내 형광 발현을 관찰한 결과이다.
도 3은 마우스 정상 피부 및 스크래치 낸 피부에 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드를 각각 바르고, 1~2시간 경과 후, 조직을 채취하고 냉동절편한 후, 공초점 현미경을 통해 조직 내 형광 발현을 관찰한 결과이다.
도 4는 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 비장세포 및 림프절세포의 유세포분석을 통해, 세포 내 형광 표지된 세포 빈도를 분석한 결과이다.
도 5a~5b는 도 4의 A~D 분석 결과를 나타낸 히스토그램(histogram) 데이터이다.
도 6a~6b는 도 4의 E~H 분석 결과를 나타낸 히스토그램(histogram) 데이터이다.
도 7은 형광 표지된 펩타이드(서열번호 2~15)를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 비장세포의 유세포분석을 통해, 배양시간에 따른 세포 내 형광 표지된 세포 빈도를 분석한 결과이다.
도 8a~8b는 도 7의 배양 72시간 때의 분석 결과를 나타낸 히스토그램(histogram) 데이터이다.
도 9는 형광 표지된 펩타이드(서열번호 16~21)를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 비장세포의 유세포분석을 통해, 배양시간에 따른 세포 내 형광 표지된 세포 빈도를 분석한 결과이다.
도 10은 도 9의 배양 72시간 때의 분석 결과를 나타낸 히스토그램(histogram) 데이터이다.
도 11은 형광 표지된 펩타이드(서열번호 16~21)를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 비장세포의 유세포분석을 통해, 배양 24시간 때 세포 내 형광 표지된 세포 빈도를 분석한 결과이다.
도 12a~12b는 도 11의 분석 결과를 나타낸 히스토그램(histogram) 데이터이다.
도 13은 형광 표지된 펩타이드(서열번호 16~21)를 각각 처리하고 배양한 마우스 유래 비장세포의 유세포분석을 통해, 배양 48시간 때 세포 내 형광 표지된 세포 빈도를 분석한 결과이다.
도 14a~14b는 도 13의 분석 결과를 나타낸 히스토그램(histogram) 데이터이다.
도 15는 형광 표지된 펩타이드(서열번호 16~21)를 각각 처리하고 24시간 배양한 마우스 유래 비장세포를 공초점 현미경을 통해 세포 내 형광 발현을 저배율로 관찰한 결과이다.
도 16은 형광 표지된 펩타이드(서열번호 16~21)를 각각 처리하고 24시간 배양한 마우스 유래 비장세포를 공초점 현미경을 통해 세포 내 형광 발현을 고배율로 관찰한 결과이다.
도 17은 마우스 정상 피부 및 스크래치 낸 피부에 형광 표지된 펩타이드(서열번호 16~21)를 각각 바르고, 4시간 경과 후, 조직을 채취하고 냉동절편한 후, 공초점 현미경을 통해 조직 내 형광 발현을 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기의 서열 일반식으로 표시되는 펩타이드를 제공한다.
[일반식]
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7
상기 X1은 글리신(Glycine), 알라닌(Alanine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 발린(Valine), 아스파라긴(Asparagine), 글루타민(Glutamine), 아르기닌(Arginine), 리신(Lysine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 티로신(Tyrosine), 트립토판(Tryptophan), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 프롤린(Proline)으로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
상기 X2는 시스테인(Cysteine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X3은 시스테인(Cysteine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X4는 글리신(Glycine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X5는 글루탐산(Glutamic acid) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X6은 이소류신(Isoleucine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
상기 X7은 발린(Valine) 또는 아르기닌(Arginine)일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 각 아미노산 사이에 세포투과능이 없는 펩타이드를 포함하는 펩타이드를 제공한다.
상기 세포투과능이 없는 펩타이드는 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 세포투과능이 없는 펩타이드를 포함하는 펩타이드는 서열번호 22 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있고, 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 형질전환기술에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 목적하는 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
상기 약물은 화합물, 단백질, 펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 펩타이드 및 약물이 공유 또는 비공유적인 결합체를 형성할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 펩타이드 및 약물이 상호 공유결합되어 결합체를 형성할 수 있다.
상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagneticparticles)로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표지된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[ 실험예 1] 펩타이드 제조
애니젠 회사에 하기 표 1에 나타난 형광 표지된 펩타이드 제조를 의뢰하여 제조하였고, 상기 펩타이드 중 “GCCGEIV”아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 F1 펩타이드로 명명하였다. 또한, F1 펩타이드가 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있는지 확인하기 위해, F1 펩타이드 중간에 세포투과능이 없는 8개의 아미노산(아스파르트산)으로 구성된 펩타이드(DDDDDDDD; scramble D)를 삽입하여 제조한, “GCDDDDDDDDCGEIV” 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 F2 펩타이드로 명명하였다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열
1 F1 GCCGEIV
2 F1-A ACCGEIV
3 F1-I ICCGEIV
4 F1-L LCCGEIV
5 F1-V VCCGEIV
6 F1-N NCCGEIV
7 F1-Q QCCGEIV
8 F1-R RCCGEIV
9 F1-K KCCGEIV
10 F1-D DCCGEIV
11 F1-E ECCGEIV
12 F1-Y YCCGEIV
13 F1-W WCCGEIV
14 F1-F FCCGEIV
15 F1-P PCCGEIV
16 F1-R2 GRCGEIV
17 F1-R3 GCRGEIV
18 F1-R4 GCCREIV
19 F1-R5 GCCGRIV
20 F1-R6 GCCGERV
21 F1-R7 GCCGEIR
22 F1D2 GDDDDDDDDCCGEIV
23 F2 GCDDDDDDDDCGEIV
24 F1D4 GCCDDDDDDDDGEIV
25 F1D5 GCCGDDDDDDDDEIV
26 F1D6 GCCGEDDDDDDDDIV
27 F1D7 GCCGEIDDDDDDDDV
28 F1D8 GCCGEIVDDDDDDDD
29 DF1 DDDDDDDDGCCGEIV
30 DF1D DDDDDDDDGCCGEIVDDDDDDDD
31 scramble D DDDDDDDD
[ 실시예 1] F1 펩타이드의 세포투과능 분석
1-1. 공초점 현미경을 통한 비장세포투과능 분석
F1 펩타이드의 세포투과능을 확인하기 위해, 4주령 ICR 마우스에서 분리한 비장세포(Splenocyte) 배양액에 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드 1μg/mL를 각각 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양시간(1, 4 및 24시간)에 따른 세포 내 형광 발현을 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다. 대조군으로 펩타이드를 처리하지 않은 무처리군과 세포투과능이 없는 GFP 펩타이드(HKFSVSGEGEGDATC) 처리군 및 scramble D 처리군(음성대조군)을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, F1 및 F2 펩타이드 처리군 모두 비장세포 내에서 형광 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 비장세포에 대한 세포투과능이 있고, 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
1-2. 공초점 현미경을 통한 복강대식세포투과능 분석
F1 펩타이드의 세포투과능을 확인하기 위해, 4주령 ICR 마우스에서 분리한 복상대식세포(Peritoneal macrophages) 배양액에 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드 1μg/mL를 각각 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양시간(1, 4 및 24시간)에 따른 세포 내 형광 발현을 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, F1 및 F2 펩타이드 처리군 모두 복강대식세포 내에서 형광 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 복강대식세포에 대한 세포투과능이 있고, 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
1-3. 공초점 현미경을 통한 피부 조직 침투성 분석
F1 펩타이드의 피부 조직 침투성을 확인하기 위해, 4주령 ICR 마우스의 왼쪽 다리에는 스크래치(scratch)를 내지 않고, 오른쪽 다리에는 주사바늘로 스크래치를 냈다. 그 후, 형광 표지된 펩타이드 F1 및 F2 펩타이드 1μg/mL를 양쪽 다리에 각각 면봉으로 바르고, 1~2시간 후에 피부(표피) 조직을 채취하여 동결절편한 후, 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, F1 및 F2 펩타이드 처리군 모두 조직 내 형광 발현이 나타났고, F2 펩타이드는 특히 모낭(hair)에서 강한 형광 발현을 나타냈으며, 스크래치 유무에 따른 형광 발현 차이는 크게 나타나지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 세포(조직)투과능이 있고, 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포(조직) 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
1-4. 유세포분석을 통한 세포투과능 분석
F1 펩타이드가 세포막을 통과하여 세포 내로 들어갔는지 확인하기 위해, 4주령 ICR 마우스의 비장세포 및 림프절세포(lymph node cell)를 분리하고, 1시간 동안 배양한 후, 형광 표지된 F1 및 F2 펩타이드 1μg/mL를 각각 처리하고, 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 배양시간(1, 4, 24 및 48시간)에 따른 형광 표지된 세포 빈도를 분석하여 펩타이드가 세포 내로 이동한 세포 빈도를 확인하였다.
그 결과, 도 4(A~D) 및 도 5a~5b에 나타난 바와 같이, 비장세포의 경우, 무처리군(control) 및 GFP 펩타이드 처리군에서는 세포 내 형광 발현이 나타나지 않은 반면, F1 펩타이드는 4시간 이상, F2 펩타이드는 48시간 이상에서 전체 세포의 약 30~40%가 positive 세포 빈도를 나타내면서 세포 내 형광 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 비장세포에 대한 세포투과능이 있고, 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 림프절세포의 경우, 도 4(E~H) 및 도 6a~6b에 나타난 바와 같이, 무처리군(control) 및 GFP 펩타이드 처리군에서는 세포 내 형광 발현이 나타나지 않은 반면, F1 펩타이드는 4시간 이상에서 전체 세포의 약 40%가 positive 세포 빈도를 나타냈고, F2 펩타이드는 48시간 이상에서 전체 세포의 약 60%가 positive 세포 빈도를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 림프절세포에 대한 세포투과능이 있고, 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 2] 변형 F1 펩타이드의 세포투과능 분석
상기 실시예 1에서 F1 펩타이드가 세포투과능이 있고, 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다. 이에, F1 펩타이드의 일부 아미노산 서열이 변경되거나, F2 펩타이드 형태 이외의 형태로도 세포투과능이 없는 펩타이드를 세포 내로 투과시킬 수 있는지 확인하기 위해, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, F1 펩타이드의 아미노산 하나를 다른 아미노산으로 치환하거나, F2 펩타이드처럼 F1 펩타이드 아미노산 서열 중간에 세포막을 투과하지 못하는 서열(DDDDDDDD, 서열번호 31)을 삽입하여 제조한 펩타이드의 세포투과능을 확인하였다.
2-1. 유세포분석을 통한 서열번호 2~21의 펩타이드의 세포투과능 분석
F1 펩타이드의 아미노산 하나가 다른 아미노산으로 치환되더라도 세포투과능을 나타내는지 확인하기 위해, ICR 4주령 마우스에서 비장세포를 분리하고, 1시간 동안 배양한 후, 형광 표지된 펩타이드(서열번호 2~21) 1μg/mL을 각각 세포에 처리하고, 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 유세포분석을 통해 배양시간(4, 24 및 48 및 72시간)에 따른 형광 표지된 세포 빈도를 분석하여 펩타이드가 세포 내로 이동한 세포 빈도를 확인하였다.
그 결과, F1 펩타이드의 첫번째 아미노산 서열 하나를 다른 아미노산으로 치환한 펩타이드(서열번호 2~15)의 경우, 도 7 및 도 8a~8b에 나타난 바와 같이, 펩타이드 처리군 모두 비슷한 positive 세포 빈도를 나타냈고, 구체적으로, 4시간에서는 약 25~40%, 24시간 이후부터는 50% 이상 및 48시간 이후부터는 80% 이상의 positive 세포 빈도를 나타내면서, 시간이 경과함에 따라 세포 내 형광 발현이 증가하고, 72시간까지도 높은 형광 발현률을 유지하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드의 첫번째 아미노산 하나가 다른 아미노산으로 치환되더라도 세포투과능을 유지하는 것을 확인하였다.
또한, F1 펩타이드의 중간 아미노산 서열 하나를 다른 아미노산(R)으로 치환한 펩타이드(서열번호 16~21)의 경우, 도 9 및 10에 나타난 바와 같이, 펩타이드 처리군 모두 비슷한 positive 세포 빈도를 나타냈고, 구체적으로, 4시간에서는 약 20%, 24시간에서는 약 40%, 48시간에서는 약 45% 및 72시간에서는 약 50%의 positive 세포 빈도를 나타내면서, 시간이 경과함에 따라 형광 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드의 중간 아미노산 하나가 다른 아미노산(R)으로 치환되더라도 세포투과능을 유지하는 것을 확인하였다.
2-2. 유세포분석을 통한 서열번호 22~30의 펩타이드의 세포투과능 분석
F1 펩타이드가 어떤 아미노산 서열 중간에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포 내로 투과시킬 수 있는지 확인하기 위해, ICR 8주령 마우스에서 비장세포를 분리하고, 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 형광 표지된 펩타이드(서열번호 22~30) 1μg/mL를 세포에 각각 처리하고, 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 유세포분석을 통해 배양시간(24 및 48시간)에 따른 형광 표지된 세포 빈도를 분석하여 펩타이드가 세포 내로 이동한 세포 빈도를 확인하였다. 세포투과능이 있는 cTAT 및 R8 펩타이드에 세포막을 통과하지 못하는 펩타이드(DDDDDDDD)를 각각 연결한 펩타이드(cTATD 및 R8D)를 대조군으로 사용하였다. cTATD 및 R8D의 아미노산 서열은 하기 표 2에 나타난 바와 같다. 각 실험군(그룹) 당 마우스 마리 수는 2마리로 설정하였고, 실험은 2회 반복하여 총 4마리를 수행하였다.
그 결과, 도 11, 도 12a~12b, 도 13 및 도 14a~14b에 나타난 바와 같이, F1D8 펩타이드를 대조군인 cTATD 및 R8D 펩타이드와 비교했을 때, F1 펩타이드는 DDDDDDDD 펩타이드를 cTAT 펩타이드와 비슷한 수준으로 세포 내로 투과시키고, R8 펩타이드보다 DDDDDDDD 펩타이드를 세포 내로 투과시키는 정도가 우수한 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 어떤 아미노산 서열 중간에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
펩타이드 아미노산 서열
cTATD CYGRKKRRQRRRCDDDDDDDD
R8D RRRRRRRRDDDDDDDD
2-3. 공초점 현미경을 통한 서열번호 21~30의 펩타이드의 세포투과능 분석
F1 펩타이드가 어떤 아미노산 서열 중간에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포 내로 투과시킬 수 있는지 확인하기 위해, 8주령 ICR 마우스에서 비장세포를 분리하고, 1시간 동안 배양하였다 그 후, 형광 표지된 펩타이드(서열번호 21~30) 1μg/mL를 세포에 처리하고, 24시간 동안 배양한 후, 세포 내 형광 발현을 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 15 및 16에 나타난 바와 같이, 서열번호 21~30의 펩타이드 처리군 모두에서 세포 내 형광 발현이 나타나는 것을 확인하엿다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드는 어떤 아미노산 서열 중간에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
2-4. 공초점 현미경을 통한 서열번호 1~30의 펩타이드의 피부 조직 침투성 분석
서열번호 1~30의 펩타이드의 피부 조직 침투성을 확인하기 위해, 4주령 ICR 마우스의 왼쪽 다리에는 스크래치(scratch)를 내지 않고, 오른쪽 다리에는 주사바늘로 스크래치를 냈다. 그 후, 펩타이드(서열번호 1~30) 1μg/100μL를 양쪽 다리에 각각 면봉으로 바르고, 4시간 경과 후에 조직을 채취하여 동결절편한 후, 공초점 현미경으로 조직 내 형광 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 서열번호 1~30의 펩타이드 처리군 모두에서 조직 내 형광 발현이 나타났고, 스크래치 유무에 따른 형광 발현 차이는 크게 나타나지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, F1 펩타이드의 중간 아미노산 하나가 다른 아미노산(R)으로 치환되더라도 세포(조직)투과능을 유지하고, F1 펩타이드는 어떤 아미노산 서열 중간에 세포투과능이 없는 펩타이드를 연결하더라도 세포(조직) 내로 투과시킬 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (11)

  1. 하기의 서열 일반식으로 표시되는 펩타이드:
    [일반식]
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7
    상기 X1은 글리신(Glycine), 알라닌(Alanine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 발린(Valine), 아스파라긴(Asparagine), 글루타민(Glutamine), 아르기닌(Arginine), 리신(Lysine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 티로신(Tyrosine), 트립토판(Tryptophan), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 프롤린(Proline)으로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
    상기 X2는 시스테인(Cysteine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
    상기 X3은 시스테인(Cysteine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
    상기 X4는 글리신(Glycine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
    상기 X5는 글루탐산(Glutamic acid) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
    상기 X은는 이소류신(Isoleucine) 또는 아르기닌(Arginine)이며;
    상기 X7은 발린(Valine) 또는 아르기닌(Arginine)임.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 청구항 1에 따른 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 각 아미노산 사이에 세포투과능이 없는 펩타이드를 포함하는 펩타이드.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 뉴클레오타이드.
  5. 청구항 4에 따른 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  6. 청구항 5에 따른 벡터로 전환된 형질전환체.
  7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 및 목적하는 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 약물은 화합물, 단백질, 펩타이드 또는 핵산인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 펩타이드 및 약물이 공유 또는 비공유적인 결합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 펩타이드 및 약물이 상호 공유결합되어 결합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagneticparticles)로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
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