JP5043672B2 - 新規細胞膜透過ペプチド - Google Patents
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Description
(1)下記のアミノ酸配列を有するペプチド。
B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-O1-X-Arg-O2-X-XまたはX-X-O1-Arg-X-O2-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B
ただし、(i)Bはアルギニンまたはリジンであり、(ii)O1またはO2の少なくとも一方がアルギニンであり、(iii)Zが疎水性アミノ酸であり、(iv)Jがセリンまたはアラニンであり、かつ(v)Xが任意のアミノ酸である。
(2)配列表の配列番号1から34のいずれかで表されるアミノ酸配列のうち1個または複数個のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入されることによってなる、(1)記載のペプチド。
(3)配列表の配列番号35から47のいずれかで表されるアミノ酸配列のうち1個または複数個のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入されることによってなるペプチドおよびその逆鎖ペプチド。
(4)配列表の配列番号1から47のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその逆鎖ペプチド。
(5)上記(1)から(4)のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列からなるDNA。
(6)上記(5)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(7)上記(6)に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(8)上記(1)から(4)のいずれかに記載のペプチド及び生理活性物質を含有するペプチド結合物質。
(9)生理活性物質が、生理活性を有するタンパク質、生理活性を有するポリペプチド、薬剤封入リポソーム、ポリエチレングリコール化薬剤封入リポソーム、低分子化合物、核酸、マグネティックビーズ、ナノゲージパーティクルまたはファージである上記(8)に記載のペプチド結合物質。
(10)生理活性を有するタンパク質が約10KDaから約120KDaのタンパク質または4個から30個のポリペプチドである上記(8)に記載のペプチド結合物質。
(11)生理活性を有するタンパク質がmi転写因子(MITF)である上記(8)に記載のペプチド結合物質。
(12)細胞内及び/又は核内に輸送される上記(8)から(11)のいずれかに記載のペプチド結合物質。
(13)細胞内に輸送される上記(8)から(11)のいずれかに記載のペプチド結合物質。
(14)上記(8)に記載のペプチド結合物質を含有する医薬。
(15)抗アレルギー薬として使用する上記(14)に記載の医薬。
本発明においてペプチドとは、B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-O1-X-Arg-O2-X-XまたはX-X-O1-Arg-X-O2-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-Bのアミノ酸配列を有するL体もしくはD体のペプチドが挙げられる。このアミノ酸配列において、Bはアルギニンまたはリジンであり、かつ、O1またはO2の少なくとも一方がアルギニンであり、かつ、Zが疎水性アミノ酸であり、かつJがセリンまたはアラニンであり、かつXが任意のアミノ酸である。ここで、Bは、望ましくはアルギニンである。O1またはO2は、少なくとも一方がアルギニンであれば、もう一方は任意のアミノ酸でよい。また、Zの疎水性アミノ酸とはロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、チロシン、またはトリプトファンのいずれかを指し、望ましいのはロイシン、フェニルアラニン、イソロイシンまたはトリプトファンであり、最も望ましいのはイソロイシンまたはトリプトファンである。
(i)M.Bodanszkyおよび M.A.Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York,(1966年)
(ii)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide, Academic Press, NewYork1965年)
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975年)
(iv)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、205、(1977年)
(v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
(2)塩基配列及びDNA
本発明においてDNAとは、配列表の配列番号1から47のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチドをコードする塩基配列からなるDNAが挙げられ、具体的には、配列表の配列番号48又は49で示される塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これに限定されるものではない。配列表の配列番号 48または49で示される塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号33または34で示されるアミノ酸配列をコードするものである。
(3)組換えベクター及び形質転換体
本発明において使用される組換えベクターとは、大腸菌(Escherichia coli)のような原核細胞において発現可能なベクター(例えば、pBR322、pUC119又はこれらの派生物)を挙げることができる。更に、真核細胞においては、酵母用発現ベクターとしては、例えば、pAUR112(タカラバイオ社)等のプラスミドベクターを挙げることができる。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、pcDNA3.1(Invitrogen社)のようなプラスミドベクター、pDON-AI DNA(タカラバイオ社)等のウイルスベクターを挙げることができる。
本発明において、ペプチド結合物質とは、下記のアミノ酸配列:B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-O1-X-Arg-O2-X-XまたはX-X-O1-Arg-X-O2-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-Bで示されるペプチドまたは配列表の配列番号1から47で示されるアミノ酸配列からなるペプチド及び生理活性物質を含有するものが挙げられる。
(5)医薬
本発明のペプチド結合物質は、医薬として利用することが可能である。さらに、本発明におけるペプチドを、生理活性物質に結合させることにより、目的の生理活性物質を細胞内及び/又は核内に輸送することができるため、結合させる生理活性物質の種類により、様々な疾患の治療薬及び/又は予防薬として利用することができる。本発明のペプチドに結合させる生理活性物質としては、好ましくは、生理活性を有するタンパク質が挙げられる。より好ましくは、本発明のペプチドをMITF変異体に結合させることにより、抗アレルギー薬として利用することができる。
実施例1-1 細胞内移行性ペプチド配列の抽出
細胞内移行性ペプチド配列の濃縮は、特開2005−13073号公報に記載の方法に従い、Jurkat細胞(ATCC.NO.TIB-152)のライブラリーを用いて実施した。即ち、15アミノ酸のランダムペプチドを提示させたインビトロバイラス(以降IVVと略す)ライブラリー(ライブラリースケール1012)を調整した後、HeLa細胞(ATCC.NO.CCL2)またはJurkat細胞にライブラリーを添加した。細胞内に移行したIVVのcDNAをPCR法によって回収した後、再度IVVを調製し、細胞に添加した。添加回収の操作を繰り返すことによって、ライブラリー中に存在する「細胞内に移行するペプチド」の濃縮を行った。各濃縮操作段階のどのライブラリーに細胞内移行ペプチドが濃縮されているか確認するために、濃縮操作5回目から8回目のライブラリーより任意に11種類のアミノ酸配列を選択し、ペプチドの細胞内移行能を調べた。
配列表の配列番号50に記載のHIV TATタンパク質由来のPTDをポジティブコントロール(図1から図3中、「Positive」又は「TAT」と記載する)、配列表の配列番号51に記載のUlo Langel.らによって報告されている(Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications,Series: Pharmacology and Toxicology: Basic and Clinical Aspects Volume:3,2002)TAT由来PTDの変異体をネガティブコントロール(図1中、「Negative」と記載する)として、実施例1-1にて選択された11個の配列のペプチドの評価を行った。
1 mMに調整した各ペプチド溶液を、培地で100μM、50μM、25μMと3段階希釈して細胞に添加した。細胞はCHO細胞、HeLa細胞、Jurkat細胞の3種を用いた。ペプチド溶液を細胞に添加した後、1時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄後、100μLの0.25%トリプシン-1mM EDTA 溶液を加え、トリプシン処理を室温で5分間行った。400μLのPBS(10% FCS)を加え、トリプシン処理をとめた後、1 mLのHBSSで3回洗浄した。洗浄後、細胞を500μLのPBS(10% FCS)に懸濁して、FACS Calibur(Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリー(以下、FACS)解析に供した。
実施例2-1 His-eGFP発現ベクターの構築
PCR法により、eGFP cDNA(eGFP-NII)(アマシャムファルマシア社製)を鋳型にして、His-Tagと制限酵素認識部位を有する「His-eGFP発現ベクター」の構築を行った。
PCR法により、eGFP cDNA(eGFP-NII)を鋳型にして、His-Tag、新規PTD候補配列及び制限酵素認識部位を有する「His-KHS1-eGFP発現ベクター」の構築を行った。
実施例2-1及び2-2でそれぞれ構築した「His-eGFP発現ベクター」及び「His- KSH1-eGFP発現ベクター」で、大腸菌B株由来BL21LysS株をそれぞれ形質転換した後、各形質転換体を20 mLのLBで前培養した(37℃、15時間)。
実施例2-4 KSH1融合タンパク質の細胞内移行の確認
CHO細胞を用いて各融合タンパク質の細胞内移行試験を行った。
以下実施例中および図中において、各ペプチドの名称に対応する配列表の配列番号は、表1−1および表1−2に示す通りである。
KSH1ペプチド(配列表の配列番号33)の一次配列をWheel構造予測(Trends Genet. 16(6): 276-7,2000)したところ、リジン/アルギニンクラスターが形成されること、トリプトファンが2個存在すること、リジッドなアミノ酸であるプロリンが含まれることおよびクラスター形成には関与しないが、トリプトファンの隣に位置するアルギニンの存在が特徴的であった。そこでこれらの特徴的な配列の細胞内移行における意味合いを確認するために、配列表の配列番号1から9を設計した(図5)。それぞれのペプチドを実施例1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶解し、CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析およびFACSによって評価を行った。FACS解析は実施例1-3と同様に行った。KSH1ペプチドと、改変PTD配列であるKSH1-1からKSH1-9のペプチド(配列表の配列番号1から9)について、FACS解析による蛍光強度を図6に示す。ペプチドの添加濃度は50μM、25μM、12.5μMおよび6.5μMであった。
どのアミノ酸が細胞内移行に重要であるかを調べるために、KSH1-1を基本として網羅的なアラニン置換を行い、KSH1-11(配列表の配列番号11)からKSH1-23(配列表の配列番号22)およびKSH1-35(配列表の配列番号32)を設計した(図7)。それぞれのペプチドを実施例1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶解し、CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析およびFACSによって評価を行った。FACS解析は実施例1-3と同様に行った。KSH1と、改変PTD配列であるKSH11-11から23およびKSH1-35について、FACS解析による蛍光強度を図8に示す。ペプチドの添加濃度は50μM、25μM、12.5μMおよび6.5μMであった。
2個のトリプトファンを他の疎水性アミノ酸に置換する試みを行い、KSH11-24(配列表の配列番号23)からKSH1-26(配列表の配列番号25)およびKSH1-28(配列表の配列番号27)からKSH1-30(配列表の配列番号29)を設計した(図9)。
KSH1-27(配列表の配列番号26)、 KSH1-33(配列表の配列番号30)、 KSH1-34(配列表の配列番号31)およびKSH1-36(配列表の配列番号34)を設計した(図11)。
CHO細胞と同様にHeLa細胞でも改変PTD配列の合成ペプチドの細胞内移行実験を、共焦点顕微鏡解析によって行った。CHO細胞と比較すると全体的に細胞内移行は低かったが、傾向はCHO細胞とほぼ同じであった。但し、HeLa細胞ではCHO細胞に比べてKSH1-7の細胞内移行が低く、逆にKSH1-16の細胞内移行が若干高かった。結論としてHeLa細胞で KSH1に比べて良好な細胞内移行が認められた改変体ペプチドはKSH1-1, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-18, KSH1-20およびKSH1-33であった。
実施例4-1 eGFP融合蛋白質発現ベクター構築
eGFP融合タンパク質を用いた細胞内移行の評価に際しては、2種類のインサート(図14におけるCおよびDタイプ)を作成した。
インサート構成C(図14のCタイプ)
フォワードプライマーC-F(配列表の配列番号52) 5’-GCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC-3’
リバースプライマーC-R1(配列表の配列番号53) 5’- CAC CGC GGC GAC GTT GTC GTC GTT TCT TCC TGC CGT AGG ATC CCC CTC CCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C-3’
リバースプライマーC-R2(配列表の配列番号54) 5’- CGC TCA GCG TCG ACT CAC CCG TGA TGA TGG TGG TGA TGA CTC GAG CCG CCA CCG CGG CGA CGT TGT CGT-3’
インサート構成D(図14のDタイプ)
フォワードプライマーD-F(配列表の配列番号55) 5’-AAG CCA TGGGAG GGG GATCCT ACG GCA GGA AGA AAC GAC GAC AAC GTC GCC GCG GTG GCG GCT CGA GTA TGG TGA GCA AGG GCG AGG A-3’
リバースプライマーD-R(配列表の配列番号56) 5’-CCG CTC AGC GTC GAC TCACCC GTG ATG ATG GTG GTG ATG AGA ACC ACC ACC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3’
これによって、PTD部分をBamHIとXhoIで切断し、合成DNAと入れ替えることが可能である。eGFPを鋳型として上記配列表の配列番号52から56を用い、pET14bのNcoIとBpu1102I制限酵素認識配列間に挿入した(図15)。
CHO細胞を用いて融合蛋白質の細胞内移行を調査した。CHO細胞を48穴プレートに1穴当り2x104個植え込み、コンフルエントになった状態で使用した。細胞をMEM培地で3回洗浄後、150μLの蛋白質溶液を添加し、37℃で3時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、0.25%トリプシン/EDTAを100μL/well添加し、10%FCSを含むMEM培地を400μL/well添加し、細胞を回収した。回収した細胞はHBSS 3回洗浄後、10% FCSを含むHBSS 100μLで懸濁し、共焦点顕微鏡観察に供した。なお、添加時の濃度はeGFP由来の蛍光量(Ex485nm/Em535nm)をARVO(パーキンエルマー社)で測定し(測定時間1秒)、蛍光強度が106、5x105、2.5x105となるよう調製した。
実施例5-1 FACS解析による新規PTD配列の選択
KSH1ペプチドはJurkat細胞における7回濃縮ライブラリー中から得られた配列であった。そこで、Jurkat細胞7回濃縮ライブラリーに含まれるIVVを1000個任意にピックアップして塩基配列を確認した。KSH1の解析から、ペプチドの配列をWheel構造に当てはめたときにリジン/アルギニンのクラスターおよびトリプトファンの存在が重要であることが予想されたので、これらの条件をクライテリアとして1000配列の絞込みを行った。その結果、60配列がクライテリアを満たしていた。また、1000配列の中には重複して出現する配列が1種類認められた。これらの配列について蛍光標識したペプチドを合成して、細胞内への移行能を解析した。
KSH2からKSH10(配列表の配列番号35から43)について実施例1-2と同様の方法でCHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析を行った。PositiveコントロールとしてHIV TAT由来のPTD配列(配列表の配列番号50)及びKSH1のペプチド、Negativeコントロールとしては、細胞内移行性のないペプチド配列(配列表の配列番号57)を用いた。
KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7およびKSH10の6種類についてeGFP融合蛋白質を調製し、新規PTD配列とeGFP融合蛋白質を細胞内へ移行させるPTD様活性があるか否かを確認した。融合蛋白質については、可溶化状態の高い分子型を選択することとした。その結果、KSH2およびKSH6については図14におけるCタイプを、残りの4種類については図14におけるDタイプの分子型を選択した。融合蛋白質は実施例4-1と同様に作成した。ここで用いたアニーリングオリゴ配列は、表3の通りである。ネガティブコントロールとしてeGFP-Hisを用い、それぞれの蛍光強度を揃えた後、CHO細胞に添加した。
実施例6-1 共焦点顕微鏡による改変PTD配列ペプチドの細胞内移行試験
実施例5で見出された新規PTD配列のうち、KSH2のペプチドはeGFPを細胞内へ移行させる能力が高いことから、改変を試みた。KSH2-1からKSH2-4(配列表の配列番号44から47)のペプチドを実施例1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶解し、CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析を行った。
KSH2-3およびKSH2-4(配列表の配列番号46および47)についてeGFP融合蛋白質を調製し、新規PTD配列とeGFP融合蛋白質を細胞内へ移行させるPTD様活性についてKSH2とeGFP融合蛋白質の移行性と比較した。融合蛋白質については、 KSH2については図14のCタイプを、 KSH2-3およびKSH2-4については図14のDタイプを作成した。融合蛋白質は実施例4-1と同様に作成した。ここで用いたアニーリングオリゴ配列は、表4の通りである。
Claims (18)
- 下記の(a)または(b)のペプチド。
(a)アミノ酸配列:B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-O1-X-Arg-O2-X-XまたはX-X-O1-Arg-X-O2-X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B
(ただし、(1)Bはアルギニンまたはリジンであり、(2)O1またはO2の少なくとも一方がアルギニンであり、(3)Zが疎水性アミノ酸であり、(4)Jがセリンまたはアラニンであり、かつ(5)Xが任意のアミノ酸である。)
からなるペプチド
(b)(a)に示されるアミノ酸配列のC末端側および/またはN末端側に1個または2個の任意のアミノ酸を有し、かつタンパク質を細胞内および/または核内に輸送し得るペプチド - 前記(a)のペプチドが下記構造:
- 配列表の配列番号1、2、4、5、7から14、17から47のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むペプチド。
- 配列表の配列番号1、2、4、7から11、13、17から20、22、24から30、32から34、35、36、38、39、42、43、45から47のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む請求項3に記載のペプチド。
- 構成するアミノ酸がL体である請求項3または4に記載のペプチド。
- 請求項3または4に記載のペプチドの逆鎖ペプチドであって、細胞移行能を有するペプチド。
- 請求項5に記載のペプチドの逆鎖ペプチドであり、構成するアミノ酸がD体である細胞移行能を有するペプチド。
- 請求項1から7のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列を含むDNA。
- 請求項8記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項9記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項1から7のいずれかに記載のペプチド及びそれに結合した生理活性物質を含有するペプチド結合物質。
- 生理活性物質が、生理活性を有するタンパク質、生理活性を有するポリペプチド、薬剤封入リポソーム、ポリエチレングリコール化薬剤封入リポソーム、低分子化合物、核酸、マグネティックビーズ、ナノゲージパーティクルまたはファージである請求項11記載のペプチド結合物質。
- 生理活性を有するタンパク質が約10KDaから約120KDaのタンパク質または4個から30個のアミノ酸を含むポリペプチドである請求項11記載のペプチド結合物質。
- 生理活性を有するタンパク質がmi転写因子(MITF)である請求項11記載のペプチド結合物質。
- 細胞内及び/又は核内に輸送される請求項11から14のいずれかに記載のペプチド結合物質。
- 細胞内に輸送される請求項11から14のいずれかに記載のペプチド結合物質。
- 請求項11記載のペプチド結合物質を含有する医薬。
- 抗アレルギー薬として使用する請求項17記載の医薬。
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