CN113018418B - 微小RNA31前体编码多肽miPEP31在制备高血压药物中的应用 - Google Patents

微小RNA31前体编码多肽miPEP31在制备高血压药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微小RNA31前体编码多肽miPEP31在制备高血压药物中的应用。所述miPEP31多肽在有效降压的同时，对高血压所致的靶器官损害具有显著的保护作用。本发明首次将miPEP31作为高血压的检测或治疗靶点，为高血压的缓解和治疗以及提高高血压患者的生存质量提供了新型药学靶点。

Description

微小RNA31前体编码多肽miPEP31在制备高血压药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地说，本发明涉及微小RNA31编码多肽miPEP31在制备治疗高血压药物中的应用。
背景技术
高血压是最常见的心血管疾病，其在中国患者已超过2.6亿，全球患者总数超过10亿人，高血压所致心、脑、肾等重要脏器损伤的发生是中国总死亡危险的首要因素。虽然各脏器并发症的发生涉及多种因素，但其共同的病理生理学基础是高血压引起的靶器官损伤。
现有的高血压病治疗药物主要有六大类，即利尿剂、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂及α肾上腺能阻滞剂。另外中国也有一些复方制剂及中药制剂在使用。但都需要终生服药且易造成一定程度的毒副作用，并且机体可能对药物产生耐药性。因此，开发靶向性强、远期疗效好、安全性高、价格低廉的新一代治疗高血压的新药势在必行。
多肽类(peptide)药物习惯上常指多肽类激素。一般将50或50以下氨基酸残基组成的化合物列入多肽。现已知生物体内含有和分泌很多种激素和活性多肽，仅脑中就存在近40种，而人们还在不断地发现、分离、纯化新的活性多肽物质。多肽miPEP作为新一类药物，在临床应用和生产制备上均具有很好的优越性。目前，多肽药物在慢病领域(主要用于癌症、心血管疾病、免疫代谢类疾病等)治疗效果愈加显著。全球多肽药物市场规模预计2020年将达到317亿美元，并保持持续递增。由此，多肽类药物具有重要的临床应用价值。
在本发明人的前期研究工作中，已获得了微小RNA31编码多肽miPEP31，该多肽具有显著的防治自身免疫性疾病如银屑病的效果。然而，本发明人的前期工作中，没有发现其对于高血压具有作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微小RNA31前体编码多肽miPEP31在制备高血压药物中的应用。本发明人的实验证实，其能够有效减轻高血压及靶器官损伤，能够通过人工合成或生物学合成大量获得，可应用于制备高血压药物。
在本发明的第一方面，提供一种活性成分在制备缓解或治疗高血压或其并发症的药物组合物中的用途；其中，所述的活性成分选自下组：
(a)miPEP31，其衍生物或类似物；
(b)miR-31前体，所述的miR-31前体能在宿主内加工成miPEP31；
(c)多核苷酸，所述多核苷酸能被宿主转录成(b)中所述的miR-31前体、并加工形成miPEP31，或能在宿主内加工成miPEP31；
(d)表达构建物，所述的表达构建物含有(b)中所述的miR-31前体、或(c)中所述的多核苷酸。
在一个优选例中，所述的表达构建物为表达载体，包括但不限于：质粒、或病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体为腺病毒载体、腺病毒相关载体、或慢病毒载体等。
在另一优选例中，所述的miPEP31的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或，所述miPEP31的衍生物或类似物的序列同源性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥99％。
在另一优选例中，所述miR-31前体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其简并序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第112-246位所示或其简并序列。
在另一优选例中，(a)中所述miPEP3的衍生物具有式(I)所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 (I)
式(I)中，
Seq正向为能在宿主中被加工成miPEP31的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述高血压的并发症包括(但不限于)：血管损伤，肾脏损伤，心脏损伤。
在另一优选例中，所述的肾脏损伤包括(但不限于)：所述血管损伤包括(但不限于)：动脉粥样硬化、脑梗塞、脑出血、脑缺血、主动脉夹层(由于过高的血压引起主动脉内膜撕裂，血液进入主动脉中层)。
在另一优选例中，所述肾脏损伤包括(但不限于)：慢性肾衰竭(由于长期高血压导致肾灌注压增高，肾小球滤过率下降，出现肾衰)、肾小球面积增加、肾纤维化面积增加、内膜和中膜厚度增加、纤维面积增加。
在另一优选例中，所述心脏损伤包括(但不限于)：冠心病(长期的高血压加重动脉粥样硬化，引起冠心病)、心力衰竭、心功能不全(冠心病长期慢性心肌缺血，逐渐出现心功能不全)。
在本发明的另一方面，提供miPEP31或其前体或它们的片段在制备诊断(包括评估、分析、预后；包括以“非诊断”为目的的分析)高血压或其并发症的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
在本发明的另一方面，提供一种特异性识别miPEP31或其前体或它们的片段的试剂的用途，用于制备进行高血压或其并发症的诊断试剂或诊断试剂盒。
在一个优选例中，所述的特异性识别miPEP31或其前体或它们的片段的试剂是应用于PCR、免疫检测、原位杂交、基因芯片检测miPEP31或其前体或它们的片段的试剂。
在另一优选例中，所述的特异性识别miPEP31或其前体或它们的片段的试剂选自：特异性扩增miPEP31前体、多核苷酸的引物；特异性识别miPEP31前体或其多核苷酸的探针；或特异性结合miPEP31或其可溶性多肽片段的抗体。
在本发明的另一方面，所述应用包括采用包括如下的方法：分别检测待测样本和对照样本miPEP31的表达水平，如果与对照样本相比，待测样本的miPEP31的表达水平存在显著性降低，则是潜在的高血压患病样本；其中，所述的对照样本呈现正常的miPEP31表达水平或健康者的miPEP31表达水平。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、外源合成的miPEP31能够有效减轻Ang II诱导的小鼠高血压及靶器官损伤；其中，WT-C表示野生型对照小鼠，WT-A表示经血管紧张素II(AngII)诱导高血压的野生型小鼠，scPEP为miPEP31无关序列小鼠。
A、外源合成的miPEP31能够明显降低高血压模型鼠的血压升高(D1～D14表示第1天～第14天)。
B-E、外源合成的miPEP31能够有效缓解Ang II诱导的高血压模型鼠的血管及肾脏损伤。
图2、内源性敲除的miPEP31(使用miPEP31点突变小鼠-miPEP31-/-)能够有效加重Ang II诱导的小鼠高血压及靶器官损伤。
A、内源性敲除miPEP31能够明显加重高血压模型鼠的血压升高(D1～D14表示第1天～第14天)。
B-E、内源性敲除miPEP31能够有效加重Ang II诱导的高血压模型鼠的血管及肾脏损伤。
具体实施方式
本发明人研究发现，微小RNA31(miPEP31)的前体的部分核苷酸序列能够编码产生一段多肽，并将之称为微小RNA31前体编码多肽(miPEP31)。所述miPEP31多肽在有效降压的同时，对高血压所致的靶器官损害具有显著的保护作用。本发明首次将miPEP31作为高血压的检测或治疗靶点，为高血压的缓解和治疗以及提高高血压患者的生存质量提供了新型药学靶点。
术语
如本文所用，所述的“微小RNA31前体编码多肽”、“miRNA-31前体编码多肽”、“miPEP31多肽”可以互换使用。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。
如本文所用，“有效量”或“有效剂量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量；较佳地，所述量是能被人和/或动物所接受的量。
如本文中所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂、稳定剂、调节剂等。
miPEP31多肽或其前体
本发明人发现微小RNA31的前体的部分核苷酸序列能够编码产生一段多肽，命名为miPEP31。
本发明的miPEP31多肽可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。化学合成的方法对于本领域技术人员而言是熟悉的，例如固相多肽合成方法。
本发明的miPEP31多肽的序列可以是：MRDWASVSSLGSGLWKERLWKSITTKRDGIAPVTRNWRGGKMLA(SEQ ID NO:2)。
本发明还包括miPEP31多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的miPEP31多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：
(i)有一个或多个(如1-10个、1-5个、1-3个或1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或
(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或
(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或
(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，miPEP31多肽可以指具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽。该术语还包括具有与miPEP31多肽相同功能的、在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括miPEP31多肽的活性片段和活性衍生物。
本发明中，也包括为了增加多肽的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还提供了编码本发明miPEP31多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含所述多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或miPEP31多肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞(重组细胞)，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明也包括miPEP31修饰产物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miPEP31进行修饰。多肽修饰可以是多种多样的，根据修饰位点不同，包括：N端修饰、C端修饰、侧链修饰、氨基酸修饰、骨架修饰等。作为一种改变肽链主链结构或侧链基团的重要手段，多肽修饰可有效改变肽类化合物的理化性质、增加水溶性、改变其生物分布状况、延长体内作用时间、降低毒副作用、消除免疫原性等。
所述的修饰的方式包括(但不限于)选自：
环化：相较于线性肽，环肽具有更好的刚性，对消化系统具有极强的抵抗力，根据环化方式可以分为侧链-侧链式、终端-侧链式、终端-终端式(头尾相连式)；
糖基化：糖肽的制备一般利用Fmoc/t-Bu方法；糖基化残基，比如苏氨酸和丝氨酸常通过五氟苯酚酯活化的Fmoc保护糖基化氨基酸引入到多肽中；
磷酸化：磷酸化可以在各种氨基酸残基上观察到，最常见的磷酸化目标是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基，磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸丝氨酸衍生物既可在合成中引入到多肽也可在多肽合成以后形成，使用可选择性移除保护基团的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基可以实现选择性磷酸化，一些磷酰化试剂也可通过后修饰在多肽中引入磷酸基团；
N-甲基化：其通常被用来引入到多肽合成中以阻止氢键的形成，进而使得多肽更加耐受生物降解和清除，利用N-甲基化的氨基酸衍生物(如Fmoc-N-Me-Val-OH，Fmoc-N-Me-Trp(Boc)-OH等)合成多肽是最主要的方法，另外也可利用N-(2-硝基苯磺酰氯)多肽-树脂中间体与甲醇进行Mitsunobu反应；
豆蔻酰化或棕榈酰化：通过多肽N末端脂肪酸酰化可以让多肽或蛋白质与细胞膜结合，N末端上豆蔻酰化的多肽可以使Src家族的蛋白激酶和逆转录酶Gaq蛋白靶向结合细胞膜，利用标准的酰胺缩合反应即可将豆蔻酸连接到树脂-多肽的N末端，生成的脂肽可在标准条件下解离并通过RP-HPLC纯化；
生物素化：生物素可以与亲和素或者链霉亲和素有力结合，结合强度甚至接近共价键，生物素标记的肽通常用于免疫测定，组织细胞化学和基于荧光的流式细胞术，标记的抗生物素抗体也可以用来结合生物素化多肽，生物素标记常连接在赖氨酸侧链或者N末端，通常在多肽和生物素之间使用6-氨基己酸作为纽带，纽带能够灵活结合底物，并且在有空间位阻的情况下能结合地更好；
荧光标记：人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等)，常用的荧光剂有FITC，FAM，TAMRA，CY3，CY5，Rhodamine等；色氨酸(Trp)也带有荧光，因此可以被用于内在标记；丹磺酰氯基团(Dansyl)与氨基结合时具有高度荧光，也常被用于氨基酸或蛋白质的荧光标记；
聚乙二醇(PEG)修饰：PEG修饰可用于改善蛋白水解稳定性、生物分布和肽的溶解度；在多肽上引入PEG链可以改善它们的药理性质，也可以抑制多肽被蛋白水解酶水解；PEG多肽比普通多肽更容易通过肾小球毛细血管截面，大大减少肾清除率；由于PEG多肽在体内的有效半衰期延长，因此使用更低剂量、更低频度的多肽药物便可以维持正常治疗水平
多聚抗原肽(MAP)：短肽不具有免疫性时，可将之与载体蛋白耦合以产生抗体。多聚抗原肽(MAP)由多个连接到赖氨酸核的相同多肽构成，能特异性表达高效免疫原，可用来制备肽-载体蛋白耦联体。
异戊二烯化：其发生在C末端附近侧链上的半胱氨酸残基；蛋白质的异戊二烯化可以提高细胞膜亲和性，形成蛋白质-蛋白质相互作用；异戊二烯化的蛋白质包括酪氨酸磷酸酶、小GTP酶、协同伴侣分子、核纤层和着丝粒结合蛋白。
根据本发明所提供的miR-31前体或miPEP31编码核酸的序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的miRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被宿主(如人细胞)剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的miPEP31多核苷酸构建物含有式(I)所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 (I)
式(I)中，Seq正向为能在宿主中被加工成miPEP31的核苷酸序列；Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
式(I)所示的结构在转入细胞后，形成式(II)所示的二级结构：
Figure BDA0002968391540000091
式(II)中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间的碱基互补配对的关系。
通常，所述的多核苷酸构建位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起始点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
本发明还提供了miPEP31多肽与其它物质融合、偶联或附着后所形成的复合体。例如，所述的miPEP31多肽可以与一些荧光标记(如FITC，GFP或EGFP)偶联，从而便于观察到miPEP31多肽在细胞内的存在情况。
所述的miPEP31多肽可以与一些具有穿膜功能的肽融合，以提高其穿透细胞，进入到细胞内的能力。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(protein derived CPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(model peptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类：①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。
miPEP31多肽的应用
本发明的主要贡献包括论证了miPEP31多肽可以有效地治疗模型小鼠高血压及缓解靶器官损伤。本发明公开的miPEP31多肽合成简易、成本低、未发现免疫排斥性、疗效好。多批次的动物实验显示，本发明的技术方案治疗后，疾病不易复发并且副作用小。
因此，本发明提供了所述的miPEP31多肽在制备治疗高血压药物中的应用。较佳地，所述的高血压药物是：缓解或治疗高血压或相关靶器官损伤的药物。
在本发明的具体实施例中，确定了外源性给予miPEP31或基因敲除miPEP31能够缓解或加重Ang II诱导的高血压模型动物的血压升高，血管及肾脏损伤。这些研究结果表明，miPEP31可用于制备治疗高血压或缓解靶器官损伤的药物。
本发明还提供了一种诊断高血压的方法，在一个优选例中，包括步骤：分别检测待测样本和对照样本miPEP31的表达水平，如果与对照样本相比，待测样本的miPEP31的表达水平存在显著性降低，则是潜在的高血压患病样本；其中，所述的对照样本呈现正常的miPEP31表达水平或健康者的miPEP31表达水平。较佳地，所述的显著性降低是指：与对照样本相比，所述miPEP31的表达水平的降低幅度≥10％，较佳地≥20％，较佳地≥50％，更佳地≥80％，最佳地≥100％。
在得知了miPEP31与高血压的密切相关性后，可以基于该特征来筛选上调miPEP31的表达的物质。可从所述的物质中找到对于缓解或治疗高血压有用的(潜在)物质。因此，本发明提供一种筛选缓解或治疗高血压的潜在物质的方法，所述的方法包括：(1)用候选物质处理表达miPEP31的体系；和(2)检测所述体系中miPEP31的表达情况；其中，若所述候选物质可提高miPEP31的表达，则表明该候选物质是缓解或治疗高血压的潜在物质。
所述的表达miPEP31的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miPEP31的细胞；或可以是重组表达miPEP31的细胞。所述的表达miPEP31的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miPEP31的表达的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miPEP31的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于缓解或治疗高血压真正有用的物质。
本发明对于miPEP31的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的定量或半定量检测技术。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的缓解或治疗高血压的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于上调miPEP31的表达和活性，进而缓解或治疗高血压有用的物质。
药物组合物
本发明提供了一种高血压调节的药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一种或多种活性成分：(a)miPEP31，其衍生物或类似物，或经修饰的miPEP31；(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miPEP31；(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成miPEP31，或能在宿主内加工成miPEP31；(d)表达构建物，所述的表达构建物含有(a)中所述的miPEP31、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸。
作为本发明的优选方式，所述的miPEP31来源于人或非人哺乳动物；较佳地来源于人。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂与给药方式匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领有普通技术人员根据各因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括(但不限于)：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：脂质体、纤维素、纳米凝胶载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备诊断和治疗缓解或治疗高血压或其并发症的药物。所述的高血压或其并发症可以是miPEP31表达下调导致的疾病。
本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的miPEP31多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；或所述的药物组合物。
为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。
本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。
本发明的优异效果主要在于：
本发明首次披露，微小RNA31编码多肽miPEP31，该多肽具有非常显著地减轻高血压及靶器官损伤。本发明的微小RNA31或其编码的多肽miPEP31能够方便地通过人工合成或生物学合成大量获得，具有良好的应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、miPEP31序列分析和体外合成
1、miPEP31序列分析
miR-31前体的序列如下：
Figure BDA0002968391540000131
Figure BDA0002968391540000141
上述序列中，斜体下划线部分为miPEP31预测序列(第112-246位)。翻译为氨基酸的序列为(SEQ ID NO:2)：
MRDWASVSSLGSGLWKERLWKSITTKRDGIAPVTRNWRGGKMLA。
2、miPEP31的体外合成
使用常规的固相多肽合成方法，按照SEQ ID NO:2氨基酸序列合成多肽，质谱分析确定氨基酸正确。纯度达到96％以上，使用前溶于PBS待用。
实施例2、基因敲除miPEP31的小鼠的建立
制备miPEP31点突变(miPEP31-/-)小鼠：利用基因编辑CRISPR/Cas9技术将miPEP31开放读码框起始密码子ATG突变为ATT，获得点突变小鼠,经Western Blot验证获得的点突变小鼠为miPEP31-/-小鼠。
同时设置miPEP31无关序列(scPEP；SEQ ID NO:3)：
TSLRSVTRGLENWGLKIGDISWDPAVKMRGGAMKTAWWRLKSSR。
实施例3、miPEP31能够减轻Ang II诱导的高血压模型鼠的血压升高
按照实施例2步骤诱导高血压小鼠模型，直至14天模型诱导结束；尾套管法在模型诱导前两天，及诱导后的第二天开始，然后隔2天定期测定小鼠血压，直至14天模型诱导结束，统计分析血压的变化。以野生型小鼠、scPEP处理的小鼠为对照。
结果如图1A，与正常(未以AngII诱导)野生型小鼠(WT-C)相比，AngII诱导组小鼠(WT-A)呈现显著的高血压状况；miPEP31的给药使得高血压小鼠的血压发生极为显著的下降；而scPEP处理组则仍呈现高血压的状况。这一结果说明，外源给予miPEP31对小鼠高血压达到治疗效果。
反之，如图2A，与正常(未以AngII诱导)野生型小鼠(WT-C)相比，AngII诱导组小鼠(WT-A)呈现显著的高血压状况；经AngII诱导的miPEP31点突变(miPEP31-/-)小鼠呈现出比野生型高血压小鼠更为严重的高血压状况，而未以AngII诱导的miPEP31-/-小鼠则无此状况。这一结果说明，内源性敲除miPEP31对小鼠高血压起到加重作用。
实施例4、miPEP31能够减轻Ang II诱导的高血压模型鼠的血管及肾脏损伤
按照实施例2步骤诱导高血压小鼠模型，直至14天模型诱导结束；取小鼠胸主动脉及部分肾脏组织，4％多聚甲醛固定24h，常规脱水、包埋，将组织块切成厚度为5μm的组织切片，H&E染色，或者部分OCT包埋，将组织块切成厚度为5μm的组织切片，Masson染色，显微镜下观察AngII诱导的高血压模型鼠血管及肾脏的病理情况。
结果如图1B-E，与正常(未以AngII诱导)野生型小鼠(WT-C)相比，AngII诱导组小鼠(WT-A)肾小球面积、肾纤维化面积、内膜和中膜厚度、纤维面积呈现非常显著的增加；miPEP31的给药使得高血压小鼠的肾小球面积、肾纤维化面积、内膜和中膜厚度、纤维面积发生极为显著的降低；而scPEP处理组则并非如此。这一结果说明，外源给予miPEP31可缓解高血压小鼠的靶器官血管和肾脏损伤。
反之，如图2B-E，与正常(未以AngII诱导)野生型小鼠(WT-C)相比，AngII诱导组小鼠(WT-A)呈现显著的肾小球面积、肾纤维化面积、内膜和中膜厚度、纤维面积呈现非常显著的增加；经AngII诱导的miPEP31点突变(miPEP31-/-)小鼠呈现出比野生型高血压小鼠更为显著的肾小球面积、肾纤维化面积、内膜和中膜厚度、纤维面积增加，而未以AngII诱导的miPEP31-/-小鼠则无此状况。这一结果说明内源性敲除miPEP31对高血压小鼠的血管和肾脏损伤起到加重作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院
<120> 微小RNA31前体编码多肽miPEP31在制备高血压药物中的应用
<130> 211075
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1009
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
acgtaaccta aagctaacag acggggaagc catcaccagg gtttgggttg gattccctac 60
cagtaaaatg aggtaatgat gtgaaattgg tcacgttgtt gaagagttga aatgagagat 120
tgggcatcag tatccagctt aggttccggc ctgtggaagg agagattgtg gaaaagcata 180
acaacgaaga gggatggtat tgctcctgta actcggaact ggagaggagg caagatgctg 240
gcatagctgt tgaactgaga acctgctatg ccaacatatt gccatctttc ctgtctgaca 300
gcagcttggc tacctccgtc ctgttcctcc ttgtcttgct acaagccatc catgatatgt 360
agggccctgt gacttggtct gtctcgccct gacttctctc cagtcctata ccgaatcact 420
cgctctgttc tagccacact ggccttttgg ggatgttctt ggctgcacca ggaatattcc 480
cgcctctact gccctgtctt atcttttggg catcagtgga gaactctttc accatggcac 540
tgtctataaa accttacatg tgcccagcca ccgttcacct catgaccctg ctctgacttg 600
tcagaatcat tgggcactac ctgtccatgt tcatttgctt agttgctgct tgatttactg 660
taccaggttg taagtccttt aagggacacc cgtcttcatt tctgttcacc atacccctaa 720
accctgacgt ttgcaagtcc tcaagtcatg tctttgcgac tctaccctgg acttattgtg 780
caacagaagt gtcaaataat gagattttaa tcatgccatg aatggctgtg atgaaacact 840
ggtttataag taacaaagaa taaacaaatg ctactgattt ctaagcctgc aaacccaaca 900
tcttaaagga gccacaataa agttaccatc aggtctacaa ctcagagaag acaaaatatt 960
gtatggaaaa gagattatat tcaaaataaa agttactttt gcggtttca 1009
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Arg Asp Trp Ala Ser Val Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Trp Lys
1 5 10 15
Glu Arg Leu Trp Lys Ser Ile Thr Thr Lys Arg Asp Gly Ile Ala Pro
20 25 30
Val Thr Arg Asn Trp Arg Gly Gly Lys Met Leu Ala
35 40
<210> 3
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Ser Leu Arg Ser Val Thr Arg Gly Leu Glu Asn Trp Gly Leu Lys
1 5 10 15
Ile Gly Asp Ile Ser Trp Asp Pro Ala Val Lys Met Arg Gly Gly Ala
20 25 30
Met Lys Thr Ala Trp Trp Arg Leu Lys Ser Ser Arg
35 40

Claims (5)

1.miPEP31多肽作为活性成分在制备治疗高血压或其并发症的药物组合物中的用途；其中，所述的miPEP31多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述高血压的并发症为肾脏损伤，所述肾脏损伤选自肾小球面积增加、肾纤维化面积增加、内膜和中膜厚度增加、纤维面积增加的一种或多种。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miPEP31多肽为体外合成的miPEP31多肽。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的体外合成的miPEP31通过固相多肽合成方法合成。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的体外合成的miPEP31纯度达到96%以上。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的体外合成的miPEP31溶于PBS中。
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CN108250277A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 上海交通大学医学院 微小rna31前体编码多肽的截短体在制备免疫调节药物中的应用

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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MicroRNA-31 Regulates Immunosuppression in Ang II (Angiotensin II)–induced Hypertension by Targeting Ppp6C (Protein Phosphatase 6c);Xiangxiao Li等;《Hypertension》;20190531;第73卷;第e14-e24页全文 *

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