ES2960925T3 - Moléculas agonistas de la señalización de WNT - Google Patents

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Abstract

La presente solicitud se refiere a nuevos agentes terapéuticos, particularmente a agentes capaces de activar la señalización Wnt mediada por (GPR)124/RECK/Frizzled/proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas (LRP), en donde dichos agentes no activan la señalización Wnt mediada por Frizzled/LRP. en ausencia de RECK y/o GPR124. Los presentes agentes son particularmente útiles para la prevención o el tratamiento de trastornos neurovasculares o trastornos del sistema nervioso central (SNC) que comprenden disfunción neurovascular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas agonistas de la señalización de WNT
Ámbito
La invención se aplica ampliamente en el ámbito médico y, más precisamente, se refiere a tratamientos de trastornos neurovasculares o trastornos del sistema nervioso central (SNC) que comprenden disfunción neurovascular. La invención da a conocer nuevas moléculas agonistas de la señalización de Wnt útiles en terapias, y particularmente útiles para el tratamiento de trastornos neurovasculares o trastornos del SNC que comprenden disfunción neurovascular, y productos, métodos y usos relacionados.
Antecedentes
Las proteínas Wnt constituyen una gran familia de proteínas muy conservadas, secretadas y modificadas con lípidos que intervienen en las comunicaciones intercelulares durante el desarrollo animal y la homeostasia del tejido adulto. Ejercen funciones pleiotrópicas al regular en las células su proliferación, diferenciación, migración, apoptosis, polaridad y estabilidad genética. La desregulación de la señalización de Wnt está asociada a un amplio espectro de enfermedades humanas, que incluyen cáncer y trastornos del SNC como la neurodegeneración.
Los diez miembros de la familia Frizzled (Fz, ‘rizada’) son proteínas con siete tramos transmembranarios que sirven de receptores para las proteínas Wnt. Las relaciones de unión Wnt/Fz son promiscuas, lo que contribuye en gran medida a la complejidad de la señalización Wnt, en la que numerosas Wnt compiten por la unión a cada Fz y varios son Fz capaces de responder a una Wnt determinada. Los estudios cristalográficos recientes confirmaron que la química de interacción Wnt/Fz es incompatible con el emparejamiento inequívoco de Wnt y Fz, ya que ambos sitios de contacto entre Wnt y Fz están dominados por restos estricta o químicamente conservados (Janda et al.Science2012, vol. 337, 59-64). Estas observaciones plantean la cuestión de cómo las células interpretan los patrones de expresión entremezclados de entradas de señalización simultáneas y a veces conflictivas de múltiples ligandos Wnt. En algunos contextos biológicos, las células pueden integrar todas las señales de entrada de forma no discriminatoria y desencadenar respuestas apropiadas al considerar su equilibrio neto total, así como su interpretación coordinada mediante cascadas de señalización intracelular funcionalmente entrelazadas. Sin embargo, otros procesos biológicos presentan una selectividad por el ligando Wnt sorprendentemente estricta, a pesar de los complejos panoramas de expresión de Wnt/Fz.
El desarrollo cerebrovascular del prosencéfalo y la médula espinal ventral de los mamíferos opera bajo el control exclusivo de Wnt7a y Wnt7b y, por lo tanto, sirve de paradigma para los procesos de respuesta a Wnt altamente selectivos. Para responder al Wnt7 derivado del progenitor neural y activar la señalización de Wnt/p-catenina, las células endoteliales del cerebro deben expresar Gpr124, un miembro huérfano de la clase de adhesión de los receptores acoplados a proteínas G, así como la glucoproteína Reck anclada mediante GPI (Vanhollebeke et al.Elife2015, vol. 4, 1-25). Además, cuando se expresan en las células cultivadas, Gpr124 y Reck interaccionan físicamente y estimulan sinérgicamente respuestas específicas de Wnt7(ibídem).
Es importante destacar que la señalización endotelial de Wnt/p-catenina es un regulador importante de la fisiología de la barrera hematoencefálica (BHE), que controla la expansión y maduración de la red vascular del SNC durante la embriogénesis y contribuye al mantenimiento de la BHE en los adultos. Si bien la disfunción de la BHE se ha implicado durante mucho tiempo en múltiples trastornos neurológicos, las pruebas recientes sugieren que la mera estimulación de la señalización de Wnt/p-catenina en la BHE disfuncional es suficiente para mejorar significativamente el accidente cerebrovascular isquémico y el cáncer de cerebro en los ratones. En consecuencia, los tratamientos capaces de estimular sustancialmente la señalización de Wnt/p-catenina en las células endoteliales del cerebro sin reactividad cruzada con otras vías de Frizzled serían muy ventajosas para el tratamiento de diversos trastornos neurológicos.
Compendio
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento y caracterización del primer "módulo de descodificación de Wnt" utilizado por las células para responder selectivamente a los ligandos Wnt7. En concreto, en el módulo de decodificación de Wnt caracterizado en la presente memoria, la selectividad la confiere RECK, que interviene en la unión específica de Wnt7 de una manera independiente de Frizzled. La disponibilidad de Wnt7 para la señalización de Frizzled se debe a GPR124, un compañero de unión de RECK que actúa como contacto transmembranario deficiente en la señalización entre el Wnt7 unido a RECK y los armazones intracelulares Dishevelled (Dvl, ‘despeinados’). Al conectar Frizzled y GPR124, los polímeros de Dvl ensamblan los señalosomas RECK/Gpr124/Frizzled/LRP específicos de ligando. Por lo tanto, los presentes inventores proponen un modelo en el que se forman complejos receptores RECK/GPR124/Frizzled/LRP de orden superior dentro de los señalosomas de Wnt específicos de ligando por la unión simultánea de Frizzled y GPR124 mediante polímeros de Dvl y la unión específica de Wnt7 a RECK.
Al descubrir este nuevo mecanismo, otras investigaciones revelaron inesperadamente que se podrían diseñar nuevos agonistas capaces de activar selectivamente la señalización de Wnt en las células que expresan RECK y GPR124, en las que dichos agonistas son útiles como medicamentos, tal como particularmente para el tratamiento de los trastornos del SNC con afectaciones neurovasculares, que incluyen, entre otros, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, cáncer cerebral, epilepsia y trastornos neurodegenerativos
Por consiguiente, un aspecto da a conocer un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, como se describe en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Según la invención, dicho agente es un polipéptido. Por consiguiente, otro aspecto da a conocer un ácido nucleico que codifica dicho agente, en el que dicho agente es un polipéptido.
Un aspecto adicional da a conocer un casete de expresión de ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico unido operativamente a un promotor y/o señales reguladoras transcripcionales y traduccionales. También se da a conocer un vector que comprende dicho ácido nucleico o casete de expresión de ácido nucleico.
Otro aspecto da a conocer una composición farmacéutica que comprende dicho agente, dicho ácido nucleico o casete de expresión de ácido nucleico o dicho vector, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto adicional da a conocer dicho agente, dicho ácido nucleico o casete de expresión de ácido nucleico, dicho vector o dicha composición farmacéutica, para su uso como un medicamento.
También se da a conocer dicho agente, dicho ácido nucleico o casete de expresión de ácido nucleico, dicho vector o dicha composición farmacéutica, para su uso en la prevención o tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del sistema nervioso central (SNC) que comprende disfunción neurovascular.
Según se describe en la presente memoria, solo con fines ilustrativos y no de acuerdo con la invención, es un métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento, tal como en concreto útil para la prevención o el tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular, en donde dicho método comprende determinar si un agente en estudio activa a través de GPR124/RECK/Frizzled/LRP la señalización de Wnt, pero no la señalización de Wnt a través de Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124.
Cualquier referencia a los métodos de tratamiento se considera una referencia a los compuestos y composiciones de la presente invención para su uso en un método de tratamiento practicado en el cuerpo.
Estos y otros aspectos y realizaciones se describen en las siguientes secciones y en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones, aspectos y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas, cuando se interpretan de acuerdo con el artículo 69 de la CPE y el Protocolo de Interpretación del artículo 69 de la CPE, no se consideran parte de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se ilustra (A) la inmunotinción con anti-V5 de Wnt7a-V5 o Wnt3a-V5 expresados transitoriamente en las células WT,FZi-io'/', LRP5'/-;LRP6/'yGPR124'/';RECK'/'no permeabilizadas. (B) Igual que (A) en las célulasGPR124I ;RECK1'que coexpresan transitoriamente Wnt7a-V5 y los (co)receptores indicados. (C) Ensayo de captura de ligando en cocultivos triples (1:1:1). Actividad luciferasa supertop-flash (STF) de las células indicadoras HEK293-STF transfectadas con Fz5 y estimuladas de manera paracrina mediante células emisoras de Wnt7a o Wnt3a cocultivadas en presencia de células competidoras HEK293TFZ1-101'transfectadas con varios (co)receptores como se indica. (D) Cuantificación de señales PLA del PLAin situque utiliza anticuerpos primarios anti-V5 y anti-HA dirigidos contra Wnt7a-V5 y HA-Reck o sus variantes coexpresadas en las célulasGPR124I ;RECK1'.(E) Cuantificación de señales PLA del PLAin situque utiliza anticuerpos primarios anti-V5 y anti-HA dirigidos contra Wnt7a-V5 y los (co)receptores marcados con HA indicados coexpresados en las célulasGPR124I';RECKI\Barra de escala: 10 pm. (F) Cuantificación de las señales<p>L<a>con anti-V5/anti-HA de las célulasGPR124I ;RECK'1'cotransfectadas con Wnt7a-V5 o Wnt3a-V5 y las variantes de Reck marcadas con HA indicadas con (ejey) o sin (eje x) Gpr124. (G) Esquemas de Reck y sus motivos de unión a Gpr124 y Wnt7. *p < 0,05, ***p < 0,001; los datos representan la media ± DE.
En la figura 2 se ilustra (A) la representación esquemática de Wnt7a, las variantes y parálogos de Wnt7a etiquetados con V5 evaluados mediante cuantificación por PLA en (B) utilizando anticuerpos primarios anti-V5 y anti-HA en las célulasGPR124I ;RECK'1'que coexpresan HA-Reck. (C) Actividad luciferasa STF relativa dependiente de Gpr124/Reck en las células HEK293-STF de la señalización de 101 variantes diferentes de un solo resto de Wnt7a y su posición en la estructura de Wnt7a (ejexy modelos de estructura debajo). La actividad luciferasa relativa está normalizada por los valores de Wnt7a WT. Todos los restos de Wnt7a están mutados a alanina, y los restos de alanina esperados están cambiados a arginina. (D) Alineamiento del dominio conector de Wnt7 en todo el clado de vertebrados. Mm,Mus musculus;Gg,Gallus gallus;Xl,Xenopus laevis;Dr,Danio rerio.Están subrayadas las ocho variantes de Wnt7a (que se encuentran dentro de la región de aminoácidos 238-266 de pWnt7a), que redujeron la señalización dependiente de Gpr124/Reck a menos del 10%. La actividad de las correspondientes variantes de un solo resto y su clase de actividad se determinan en (C). La secuencia de las regiones conectoras de las variantes Mm Wnt3a y cuádruple Wnt7a (Wnt74A) aparecen debajo. (E) PLA con anti-V5/HA entre Wnt7a-V5 o Wnt7a4A-V5 y HA-Reck. La secreción del ligando se evaluó mediante el análisis semicuantitativo con anti-V5 por transferencia puntiforme del diluciones seriadas del sobrenadante de las células. Se utilizó la tinción de Ponceau S como control de carga. Barras de escala, 10 gm. *P < 0,05, ***P < 0,001; los datos representan la media ± DE. (F) Sondeo de la interacción entre Reck-CK-Fc recombinante purificado y el péptido pWnt7a sintético utilizando la calorimetría isotérmica de titulación (ITC). ITC de pWnt7a, pWnt7a4A y pWnt3a en Reck-CK-Fc recombinante (paneles superiores). ITC de Reck-CK-Fc, Reck-CKñCK1-Fc, Reck-CKñCK2-Fc, Reck-CKñCK3-Fc, Reck-CKñCK4-Fc y Reck-CKñCK5-Fc por pWnt7b (paneles medio e inferior). (G) Sondeo de la interacción Reck-CK-Fc/pWnt7b mediante el uso de SMFS. Se muestra el principio del microscopio de fuerza atómica basado en las curvas de fuerza contra distancia (AFM basada en FD). Una punta del AFM funcionalizada con un espaciador de polietilenglicol (PEG) fusionado al péptido pWnt7b se acerca y se retira de una superficie recubierta con Reck-CK-Fc.
En la figura 3 se muestra (A) la ilustración esquemática del sitio del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) de CRISPR/Cas9 en Lrp5/6 (panel izquierdo) y la actividad luciferasa en las células HEK293T WT o clones de células HEK293TLRP5-/-, LRP6-/-o doble mutanteLRP5-/-;LRP6-/-48 h después de la transfección con plásmidos indicadores con STF y las combinaciones indicadas de plásmidos que estimulan la señalización de Wnt7a dependiente de Reck/Gpr124 o la señalización de Wnt1 independiente de Gpr124/Reck. (B) Actividad STF de la señalización dependiente e independiente de Gpr124/Reck en las células HEK293T WT en presencia o ausencia de coexpresión de Dkk-1. (C) Actividad luciferasa en las células HEK293T WT o clones de células HEK293T mutantesFZ48 h después de la transfección con los plásmidos indicadores con STF y las combinaciones indicadas de los plásmidos de expresión, que estimulan la señalización de Wnt7a dependiente de Reck/Gpr124 o la señalización de Wnt1 independiente de Gpr124/Reck. (D) Representación esquemática del sitio del PAM de CRISPR/Cas9 dentro del CRD de Fz. (E) Actividad STF de la señalización dependiente de Gpr124/Reck en las HEK293TFZ1-10-/- después de la cotransfección con la variante Fz o CRD de Fz indicada. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; los datos representan la media ± DE.
En la figura 4 se muestra (A) una representación esquemática de Gpr124 y sus variantes de dominio. (B) Diagrama de alambres 3D representativo de la vasculatura cerebral 60 hpf de los embriones WT y mutantesgpr124inyectados con 100 pg del ARN indicado. Los vasos negros representan las CtA intracerebrales dependientes de Gpr124/Reck que brotan de los canales grises perineurales primordiales del rombencéfalo (PHBC). (C) Arterias centrales (CtA) del rombencéfalo de embriones morfantesgpr12460 hpf que recibieron una inyección en la etapa de una célula con 100 pg del ARNm indicado. (D) Actividad luciferasa relativa de las células HEK293-STF cotransfectadas con Reck, Fz1, Wnt7a y las variantes de Gpr124 indicadas. ***p < 0,001; los datos representan la media ± DE. (E) CtA del rombencéfalo de embriones morfantesgpr12460 hpf que recibieron una inyección en la etapa de una célula con 100 pg de los ARNm indicados. ***p < 0,001; los datos representan la media ± DE.
En la figura 5 se ilustran (A) ensayos de coinmunoprecipitación con anti-FLAG en los lisados totales de las células que coexpresan versiones marcadas Dvl-GFP y con FLAG en el extremo amino de Gpr124 o sus variantes ICD. (B) Inmunotransferencia de DVL2 y p-DVL2 (T224) en los lisados de células completas de células HEK293TFZ1-10'1'y WT transfectadas con la combinación indicada de plásmidos. El DVL2 fosforilado (T224) pudo detectarse como una banda que migraba lentamente con anticuerpos anti-DVL2 (punta de flecha) o mediante un anticuerpo fosfoespecífico que reconoce la fosfotreonina 224 (p-DVL2) en los extractos de células completas obtenidos al cabo de 48 h de la transfección con las diferentes combinaciones de construcciones según se indica. (C) Distribución intracelular de Fz4-GFP y Gpr124-tagRFP expresadas individualmente o en presencia de Dvl en las células de la capa profunda de la blástula (DEL) de pez cebra. (D) Distribución intracelular de Dvl-GFP coexpresada con Fz4 o Gpr124 en las células DEL de la blástula de pez cebra. (E) Distribución intracelular de Fz4-GFP y Gpr124-tagRFP coexpresadas en ausencia o presencia de Dvl en las células DEL de la blástula de pez cebra. Las células marcadas con un asterisco se magnifican en los paneles de la derecha y a continuación se representa la intensidad de los píxeles de los canales verde y rojo a lo largo de una trayectoria virtual en el sentido de las agujas del reloj que sigue la corteza celular entre a y b. (F) Igual que (E) en las células EVL. (G) Señales BiFC en las células DEL de pez cebra que expresan Gpr124-VN155 (I152L) y Fz1-VC155 en presencia o ausencia de sobreexpresión de Dvl. ***P < 0,001; los datos representan la media ± DE.
En la figura 6 se representa un modelo integrado ejemplar para la señalización de Fz específica de Wnt7, dependiente de Gpr124/Reck.
En la figura 7 se muestra (A) la actividad luciferasa relativa en las células HEK293-STF de vías dependientes de Fz5 (gris claro, transfección con Fz5) o vías dependientes de Gpr124/Reck (negro, transfección con Gpr124, RECK y Fz1) estimuladas con diferentes variantes de Wnt7. (B) Actividad luciferasa STF relativa dependiente de Gpr124/Reck y Fzd5 en las células HEK293-STF de la señalización de 101 variantes diferentes de un solo resto de Wnt7a y su posición en la estructura de Wnt7a. La actividad relativa de la luciferasa está normalizada por los valores de Wnt7a WT. 42 variantes diferentes de un solo resto de Wnt7a activan la señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP en al menos el 35 % de la actividad de señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP del Wnt7a de tipo silvestre (caja rectangular). (C) Actividad luciferasa STF relativa de Fzd5 y dependiente de Gpr124/Reck en las células HEK293-STF de la señalización de 42 variantes diferentes de un solo resto de Wnt7a que muestran la activación selectiva de la vía Gpr124/Reck. (D) Actividad luciferasa relativa en las HEK-STF después de la cotransfección de Wnt7a o Wnt7a1-278 o Wnt7aK190A con los 10 genes de Fz. (E) Vistas laterales de larvas de 3 dpf inyectadas en la etapa unicelular con el ARNm dewnt7aownt7a1-278ownt7aK190Aa las dosis indicadas. (F) Puntuación fenotípica de las larvas 3 dpf de (D). (G) Vistas dorsales de la etapa 36 de embriones deXenopus laevisinyectados en un blastómero ventral del embrión de 4 células con 15 pg del ARNm indicado. La fracción de formación del eje secundario (punta de flecha) está indicada para cada condición. (H) DRG troncal de larvas morfantes 72 hpfwnt7aainyectadas en la etapa unicelular con el ARNm indicado. Imágenes representativas deTg(neurog1:GFP)DRG se muestran a la derecha. ***P < 0,001; los datos representan la media ± DE.
En la figura 8 se muestran las secuencias de aminoácidos de las variantes de Wnt7a humanas que se dan a conocer en la presente memoria. Las sustituciones de aminoácidos frente al dominio NTD de Wnt7a de tipo silvestre o Wnt7a completa están en negrita y subrayadas.
En la figura 9 se muestra que la expresión endotelial transgénica de Wnt7aK190A y Wnt7a1-278 desencadena la angiogénesis cerebral dependiente de GPR124/RECK y restaura la barrera hematoencefálica en el pez cebra Wnt7aa-/-. (A) Vistas dorsales de la vasculatura cerebral 60 hpf de embriones WT o Wnt7aa-/-Tg(kdrl:EGFP).En los mutantes Wnt7a-/- faltan las CtA intracerebrales. Wnt7, Wnt7aK190A o Wnt7a1-278 se expresaron transitoriamente en el endotelio de los embriones Wnt7aa-/- bajo el control del promotor específico del endoteliokdrl(receptor de tipo kdr del factor de crecimiento del endotelio vascular). Los ligandos de Wnt7 se expresaron como una construcción biscistrónica con BFP (proteína fluorescente azul) utilizada como marcador de la transgénesis. A diferencia de los embriones no inyectados, Wnt7, Wnt7aK190A o Wnt7a1-278 restauran la formación de CtA en el rombencéfalo en los mutantes Wnt7aa-/- cuantificados en (B). (C) Tinción con anti-GLUT 1 de las CtA después de la expresión transgénica de Wnt7, Wnt7aK190A y Wnt7a1-278 en los embriones Wnt7aa-/- 60 hpf. La expresión transgénica se logró como en (A). En conjunto, estos datos demuestran que los agonistas Wnt7aK190A o Wnt7a1-278 descubiertos son activosin vivoen los procesos dependientes de Gpr124/Reck.
En la figura 10 se representa la genoterapia basada en GPR124/RECK en un modelo de accidente cerebrovascular de ratón. Se utilizaron los virus AVV-PHP.eB para introducir Wnt7aK190A o un control AAV vacío correspondiente (Ctrl) en el cerebro de ratones de 8 semanas de edad. (A) Se usó una GFP codificada en AAV-PHP.eB (AAV-PHP.eB-CAG-EGFP) para demostrar la expresión transgénica generalizada en el cerebro de los ratones (ratones de 8 semanas de edad, 2 semanas después de la inyección). El promotor de CAG es un promotor sintético fuerte utilizado en los vectores de expresión de mamíferos. Panel izquierdo: vista dorsal de un cerebro aislado intacto, sección sagital en el panel derecho. La sección se tiñó con anti-CD31 para marcar la vasculatura. (B) La inyección intravenosa de 1 x 1011 partículas víricas de AAV-PHP.eB-CAG-Wnt7aK190A-p2A-EGFP dos semanas antes de tMCAO (oclusión transitoria de la arteria cerebral media, modelo de accidente cerebrovascular) redujo el volumen del ictus (mm3), lo que demuestra que los agonistas descubiertos mejoraron el accidente cerebrovascular en los modelos preclínicos. Como control se utilizaron los virus AAV-PHP.eB-CAG-EGFP.
Descripción de las realizaciones
Tal como se utilizan en la presente memoria, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes tanto en singular como en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los términos "que comprende", "comprende" y "comprendido por", tal como se utilizan en la presente memoria, son sinónimos de "incluido", "que incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen otros elementos, miembros o pasos del método que no se han citado. Los términos también abarcan "que consiste en" y "que consiste esencialmente en", que gozan de significados bien consolidados en la terminología de patentes.
La citación de los márgenes numéricos por puntos finales incluye todos los números y fracciones subsumidos dentro de los respectivos márgenes, así como los puntos finales citados.
Los términos "unos" o "aproximadamente", tal como se usan en la presente memoria cuando se refieren a un valor medible, tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal y similares, pretenden abarcar las variaciones de y desde el valor especificado, tales como variaciones de /-10 % o menos, preferiblemente /-5 % o menos, más preferiblemente /-1 % o menos, y aún más preferiblemente /-0,1 % o menos, de y desde el valor especificado, en la medida en que dichas variaciones sean apropiadas para realizar la invención descrita. Debe entenderse que el valor al que se refiere el modificador "aproximadamente" también se describe específica y preferiblemente.
Mientras que los términos "uno o más" o "al menos uno", tal como uno o más miembros o al menos un miembro de un grupo de miembros, son claros por sí solos, mediante ejemplificación adicional el término abarca, entre otras cosas, una referencia a cualquiera de dichos miembros, o a dos o más de dichos miembros, tales como, por ejemplo, cualquiera >3, >4, >5, >6 o >7, etc. de dichos miembros, y hasta todos los miembros. En otro ejemplo, "uno o más" o "al menos uno" puede referirse a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o más.
El debate de los antecedentes de la invención en la presente memoria se incluye para explicar el contexto de la invención. Esto no debe considerarse como una admisión de que alguno de los materiales mencionados fue publicado, conocido o parte del conocimiento común general en cualquier país como fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.
A lo largo de esta descripción, se hace referencia a varias publicaciones, patentes y especificaciones de patente publicadas mediante una cita identificativa. Todos los documentos citados en la presente especificación se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. En concreto, las enseñanzas o secciones de dichos documentos a los que se hace referencia específicamente en la presente memoria se incorporan como referencia.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos utilizados en la descripción de la invención, incluidos los términos técnicos y científicos, tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. A modo de orientación adicional, se incluyen definiciones de términos para apreciar mejor la enseñanza de la invención. Cuando se definen términos específicos en relación con un aspecto particular de la invención o una realización particular de la invención, se pretende que dicha connotación se aplique a lo largo de esta especificación, es decir, también en el contexto de otros aspectos o realizaciones de la invención, a menos que se defina lo contrario.
En los siguientes pasajes, se definen con más detalle diferentes aspectos o realizaciones de la invención. Cada aspecto o realización así definidos pueden combinarse con cualquier otro aspecto o realización a menos que se indique claramente lo contrario. En concreto, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización de la presente invención. Por lo tanto, la aparición de las frases "en una realización" o "en 1 realización" en varios lugares a lo largo de esta especificación no necesariamente se refieren todas a la misma realización, pero pueden hacerlo. Además, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada, como resultará evidente para un experto en la técnica a partir de esta descripción, en una o más realizaciones. Además, si bien algunas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen algunas, pero no otras, características incluidas en otras realizaciones, se supone que las combinaciones de características de diferentes realizaciones están dentro del alcance de la invención y forman diferentes realizaciones, como lo entenderán los expertos en la técnica. Por ejemplo, en las reivindicaciones adjuntas, cualquiera de las realizaciones reivindicadas se puede utilizar en cualquier combinación.
Los presentes inventores han caracterizado el primer "módulo de descodificación de Wnt" capaz de discriminar los ligandos Wnt que, por lo demás, son en gran medida sinónimos en su capacidad para unirse a Frizzled, ayudando así a las células a interpretar la complejidad de las entradas de la señalización de Wnt para orquestar el desarrollo del tejido y la homeostasia. En el módulo de descodificación de Wnt caracterizado en la presente memoria, la selectividad la confiere RECK, que interviene en la unión específica de Wnt7 de una manera independiente de Frizzled. El receptor acoplado a proteínas G GPR124, un compañero de unión de RECK, actúa como una proteína transmembranaria con señalización deficiente que es capaz de reclutar la Dishevelled (Dvl) intracelular. Los armazones de Dvl conectan a GPR124 con Frizzled, ensamblando así los señalosomas RECK/GPR124/Frizzled/proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas (LRP) específicos del ligando Wnt7.
Los inventores además demostraron inesperadamente el diseño de nuevos agonistas capaces de activar la señalización de Wnt selectivamente en las células que expresan RECK y GPR124, siendo dichos agonistas útiles como medicamentos, tales como particularmente para el tratamiento de trastornos neurovasculares o trastornos del sistema nervioso central (SNC) que comprenden disfunción neurovascular, incluidos, entre otros, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple y cáncer de cerebro. Por lo tanto, la invención permite dar a conocer, entre otros, nuevos agonistas capaces de estimular la señalización de Wnt/p-catenina en las células endoteliales del cerebro sin reactividad cruzada sustancial con otras vías de Frizzled, y útiles como medicamentos, particularmente para trastornos neurovasculares o trastornos del sistema nervioso central (SNC) que comprenden disfunción neurovascular.
Por consiguiente, un aspecto da a conocer un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, en el que dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124.
Las referencias a cualquier péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico indican los correspondientes péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos que se conocen corrientemente bajo las correspondientes designaciones en la técnica. Más particularmente, las referencias a "receptor 124 acoplado a proteínas G" (GPR124), "proteína rica en cisteínas inductora de reversión con motivos Kazal" (RECK), "Frizzled" (FZD), o "proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas" (LRP) denotan los respectivos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, según se desprende del contexto, como se conocen en la técnica comúnmente bajo dichas designaciones.
Los términos abarcan los péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos cuando forman parte de un organismo, órgano, tejido o célula vivo, cuando forman parte de una muestra biológica, así como cuando están aislados al menos parcialmente de tales fuentes. Los términos también abarcan los péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos cuando se producen por medios recombinantes o sintéticos.
A menos que se desprenda lo contrario del contexto, la referencia en la presente memoria a cualquier péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico también abarca las formas modificadas de dicho péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico, tales como formas que llevan modificaciones posteriores a la expresión que incluyen, por ejemplo, fosforilación, glucosilación, lipidación, metilación, cisteinilación, sulfonación, glutationilación, acetilación, oxidación de metionina a sulfóxido de metionina o sulfona de metionina, y similares.
A modo de orientación adicional, el receptor 124 acoplado a proteínas G también se conoce en la técnica como receptor A2 acoplado a proteínas G de adhesión (ADGRA2) o marcador 5 del endotelio tumoral (TEM5). A modo de un ejemplo, el gen humanoGPR124está anotado en el Genbank del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el Gene ID 25960. El ARNm deGPR124humano está anotado en el NCBI con el número de acceso del Genbank NM_032777.9. Los nucleótidos 387 (codón de inicio) al 4403 (codón de parada) de NM_032777.9 constituyen la secuencia codificante deGPR124.La secuencia de la proteína GPR124 humana está anotada en el NCBI con el número de acceso del Genbank NP_116166.9 y el número de acceso de Uniprot (www.uniprot.org) Q96PE1-1, y se reproduce a continuación (SEQ ID No: 1):
>NP_116166.9 precursor del receptor A2 acoplado a proteínas G de adhesión[Homo sapiens]
MGAGGRRMRGAPARFFFPFFPWFFFFFAPEARGAPGCPFSIRSCKCSGERPKGFSGGVPGP
ARRRVVCSGGDLPEPPEPGLLPNGTVTLLLSNNKITGLRNGSFLGLSLLEKLDLRNNIISTVQ
PGAFLGLGELKRLDLSNNRIGCLTSETFQGLPRLLRLNISGNIFSSLQPGVFDELPALKVVDL
GTEFFTCDCHFRWFFPWAQNRSFQFSEHTFCAYPSAFHAQAFGSFQEAQFCCEGAFEFHT
HHLIPSLRQVVFQGDRLPFQCSASYLGNDTRIRWYHNRAPVEGDEQAGILLAESLIHDCTFI
TSEFTFSHIGVWASGEWECTV SMAQGNASKKVEIVVFETSASY CPAERVANNRGDFRWPR
TFAGITAYQSCFQYPFTSVPFGGGAPGTRASRRCDRAGRWEPGDY SHCFYTNDITRVFYTF
VFMPINASNAFTFAHQFRVYTAEAASFSDMMDVVYVAQMIQKFFGYVDQIKEFVEVMV
DMASNFMFVDEHFFWFAQREDKACSRIVGAFERIGGAAFSPHAQHISVNARNVAFEAYFI
KPHSYV GFTCTAF QRREGGVPGTRPGSPGQNPPPEPEPPADQQFRFRCTTGRPNV SFS SFHI
KNSVAFASIQFPPSFFSSFPAAFAPPVPPDCTFQFFVFRNGRFFHSHSNTSRPGAAGPGKRR
GVATPVIFAGTSGCGVGNFTEPVAV SFRHWAEGAEPVAAWW SQEGPGEAGGWTSEGCQ
FRSSQPNVSAFHCQHFGNVAVFMEFSAFPREVGGAGAGFHPYVYPCTAFFFFCFFATIITY
IFNHS SIRV SRKGWHMFFNFCFHIAMTSAVFAGGITFTNY QMVCQAVGITFHY S SFSTFFW
MGVKARVFHKEFTWRAPPPQEGDPAFPTPSPMFRFYFIAGGIPFIICGITAAVNIHNYRDHS
PYCWFVWRPSFGAFYIPVAFIFFITWIYFFCAGFRFRGPFAQNPKAGNSRASFEAGEEFRG
STRFRGSGPFFSDSGSFFATGSARVGTPGPPEDGDSFYSPGVQFGAFVTTHFFYFAMWAC
GAFAVSQRWFPRVVCSCFYGVAASAFGFFVFTHHCARRRDVRASWRACCPPASPAAPHA
PPRAFPAAAEDGSPVFGEGPPSFKSSPSGSSGHPFAFGPCKFTNFQFAQSQVCEAGAAAGG
EGEPEPAGTRGNFAHRHPNNVHHGRRAHKSRAKGHRAGEACGKNRFKAFRGGAAGAFE
FES SESGSFHNSPTDSYFGS SRN SPGAGFQFEGEPMFTPSEGSDTS AAPFSEAGRAGQRRS A
SRDSFKGGGAFEKESHRRSYPFNAASFNGAPKGGKYDDVTFMGAEVASGGCMKTGFWK
SETTV
A modo de orientación adicional, RECK (proteína rica en cisteínas inductora de reversión con motivos Kazal) también se sabe en la técnica que es la proteína supresora de tumorigenia 15 (ST15). A modo de ejemplo, el genRECKhumano está anotado en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el Gene ID 8434 del Genbank. El ARNm deRECKhumano (variante de transcripción 1) está anotado en el NCBI con el número de acceso del Genbank NM_021111.2. Los nucleótidos 87 (codón de inicio) al 3002 (codón de parada) de NM_021111.2 constituyen la secuencia codificante deRECK.La secuencia de la proteína RECK humana está anotada en el NCBI con el número de acceso de Genbank NP_066934.1 y el número de acceso de Uniprot 095980-1, y se reproduce a continuación (SEQ ID NO: 2):
>NP_066934.1 Precursor de la isoforma 1 de la proteína rica en cisteínas inductora de reversión con motivos Kazal [Homo sapiens]
MATVRASLRGALLLLLAVAGVAEVAGGLAPGSAGALCCNHSKDNQMCRDVCEQIFSSKS
ESRLKHLLQRAPDYCPETMVEIWNCMNSSLPGVFKKSDGWVGLGCCELAIALECRQACK
QASSKNDISKVCRKEYENALFSCISRNEMGSVCCSYAGHHTNCREYCQAIFRTDSSPGPSQI
KAVENYCASISPQLIHCVNNYTQSYPMRNPTDSLYCCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEM
EIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQCFLESSQSVHPGVTVHPPPSTGLDGAKLHCCSKANTSTC
RELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTCLADVREPCQLGCRNLTYCTNFN
NRPTELFRSCNAQSDQGAMNDMKLWEKGSIKMPFINIPVLDIKKCQPEMWKAIACSLQIKP
CHSKSRGSIICKSDCVEILKKCGDQNKFPEDHTAESICELLSPTDDLKNCIPLDTYLRPSTLG
NIVEEVTHPCNPNPCPANELCEVNRKGCPSGDPCLPYFCVQGCKLGEASDFIVRQGTLIQVP
SSAGEVGCYKICSCGQSGLLENCMEMHCIDLQKSCIVGGKRKSHGTSFSIDCNVCSCFAGN
LVCSTRLCLSEHSSEDDRRTFTGLPCNCADQFVPVCGQNGRTYPSACIARCVGLQDHQFEF
GSCMSKDPCNPNPCQKNQRCIPKPQVCLTTFDKFGCSQYECVPRQLACDQVQDPVCDTDH
MEHNNLCTLYQRGKSLSYKGPCQPFCRATEPVCGHNGETYSSVCAAYSDRVAVDYYGDC
QAVGVLSEHSSVAECASVKCPSLLAAGCKPIIPPGACCPLCAGMLRVLFDKEKLDTIAKVT
NKKPITVLEILQKIRMHVSVPQCDVFGYFSIESEIVILIIPVDHYPKALQIEACNKEAEKIESLI
NSDSPTLASHVPLSALIISQVQVSSSVPSAGVRARPSCHSLLLPLSLGLALHLLWTYN
El término "Frizzled" o "FZD" o "FZ" abarca a todos y cada uno de los miembros de la familia Frizzled. A modo de orientación adicional, en la tabla 1 se presentan los 10 miembros humanos conocidos de la familia Frizzled, según lo anotado en Genbank del NCBI y Uniprot.
Tabla 1
El término "proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas" o "LRP" abarca todas y cada una de las proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas, también conocidas en la técnica como proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad o proteínas relacionadas con el receptor de prolipoproteínas de baja densidad, y denota particularmente las proteínas LPR implicadas en la señalización de Wnt. En ciertas realizaciones particularmente preferidas, los términos indican LRP5 (Gene ID: 4041), LRP6 (Gene ID: 4040) o LRP5 y LRP6 (LRP5/6).
Por lo tanto, también se describe un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP5/6, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP5/6 en ausencia de RECK y/o GPR124.
Además, se describe únicamente con fines ilustrativos y no de acuerdo con la invención, un métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento, tal como en concreto útil para la prevención o el tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular, en donde dicho método comprende determinar si un agente de estudio activa la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP5/6 pero no la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP5/6 en ausencia de RECK y/o GPR124.
A modo de orientación adicional, el ARNm deLRP5humano está anotado con los números de acceso del NCBI para Genbank NM_002335.3 (variante de transcripción 1; los nucleótidos 107 (codón de inicio) a 4954 (codón de parada) de NM_002335.3 constituyen la secuencia codificante deLRP5)o NM_001291902.1 (variante de transcripción 2; los nucleótidos 1872 (codón de inicio) a 4976 (codón de parada) de NM_001291902.1 constituyen la secuencia codificante deLRP5).La secuencia de la proteína LRP5 humana está anotada en el NCBI con los números de acceso de Genbank NP_002326.2 (precursor de la isoforma 1) o NP_001278831.1 (isoforma 2), y el número de acceso de Uniprot O75197-1, y la secuencia de la proteína LRP5 anotada como NP_002326.2 se reproduce a continuación (SEQ ID NO: 3):
>NP_002326.2 Precursor de la isoforma 1 de la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad[Homo sapiens]
MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDYRLVDAGGVKLESTIVVSG
LEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGK
KFYWTDSETNRIEVANFNGTSRKVFFWQDFDQPRAIAFDPAHGYMYWTDWGETPRIERA
GMDGSTRKIIVDSDIYWPNGFTIDFEEQKFYWADAKFSFIHRANFDGSFRQKVVEGSFTHP
FALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEE
DNGGCSHFCFFSPSEPFYTCACPTGVQFQDNGRTCKAGAEEVFFFARRTDFRRISFDTPDF
TDIVFQVDDIRHAIAIDYDPFEGYVYWTDDEVRAIRRAYFDGSGAQTFVNTEINDPDGIAV
DWVARNFYWTDTGTDRIEVTRFNGTSRKIFVSEDFDEPRAIAFHPVMGFMYWTDWGENP
KIECANFDGQERRVFVNASFGWPNGFAFDFQEGKFYWGDAKTDKIEVINYDGTKRRTFF
EDKFPHIFGFTFFGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQFPDFMGFKAVNVAKVVG
TNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNN
NDVAIPLTGVKEASALDFDV SNNHIYWTDV SLKTISRAFMNGS SVEHVVEFGLDYPEGMA
VDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWG
GKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERV
VIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQ
DGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIP
DDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNP
DRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYF
TNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSG
ANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAV
EEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFAC
ATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDR
SDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGP
VIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGI
ACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYN
MDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPY
PPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
A modo de orientación adicional, el ARNm deLRP6humano está anotado en el NCBI con el número de acceso de Genbank NM_002336.2. Los nucleótidos 143 (codón de inicio) al 4984 (codón de parada) de NM_002336.2 constituyen la secuencia codificante deLRP6.La secuencia de la proteína LRP6 humana está anotada en el NCBI con el número de acceso de Genbank NP_002327.2 y el número de acceso de Uniprot O75581 -1, y se reproduce adicionalmente a continuación (SEQ ID No: 4):
>NP_002327.2 Precursor de la proteína 6 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad[Homo sapiens]
MGA VLRSLLAC SF C VLLRAAPLLLY ANRRD LRLVD ATNGKENATIVV GGLED AAA VDFV
FSHGLIYWSDVSEEAIKRTEFNKTESVQNVVVSGLLSPDGLACDWLGEKLYWTDSETNRIE
VSNLDGSLRKVLFWQELDQPRAIALDPSSGFMYWTDWGEVPKIERAGMDGSSRFIIINSEIY
WPNGLTLDYEEQKLYWADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDILYWTD
WSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSHLCLMSPVK
PFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQLEDIRHAIAI
DYDPVEGYIYWTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDWVARNLYWTDTGTD
RIEVTRLN GTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMV GYMYWTDW GEIPKIERAALDGSDRVVLVN
TSLGWPNGLALDYDEGKIYWGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDKIPHIFGFTLLGDYVY
WTDWQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSNPCAEENGGCSHLCLYR
PQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLETNNNNVAIPLTGVKEASALDF
DVTDNRIYWTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPEGMAVDWLGKNLYWADTGTNR
IEVSKLDGQHRQVLVWKDLDSPRALALDPAEGFMYWTEWGGKPKIDRAAMDGSERTTL
VPNVGRANGLTIDYAKRRLYWTDLDTNLIESSNMLGLNREVIADDLPHPFGLTQYQDYIY
WTDWSRRSIERANKTSGQNRTIIQGHLDYVMDILVFHSSRQSGWNECASSNGHCSHLCLA
VPVGGFVCGCPAHYSLNADNRTCSAPTTFLLFSQKSAINRMVIDEQQSPDIILPIHSLRNVR
AIDYDPLDKQLYWIDSRQNMIRKAQEDGSQGFTVVVSSVPSQNLEIQPYDLSIDIYSRYIYW
TCEATNVINVTRLDGRSVGVVLKGEQDRPRAVVVNPEKGYMYFTNLQERSPKIERAALDG
TEREVLFFSGLSKPIALALDSRLGKLFWADSDLRRIESSDLSGANRIVLEDSNILQPVGLTVF
ENWLYWIDKQQQMIEKIDMTGREGRTKVQARIAQLSDIHAVKELNLQEYRQHPCAQDNG
GCSHICLVKGDGTTRCSCPMHLVLLQDELSCGEPPTCSPQQFTCFTGEIDCIPVAWRCDGFT
ECEDHSDELNCPVCSESQFQCASGQCIDGALRCNGDANCQDKSDEKNCEVLCLIDQFRCA
NGQCIGKHKKCDHNVDCSDKSDELDCYPTEEPAPQATNTVGSVIGVIVTIFVSGTVYFICQ
RMLCPRMKGDGETMTNDYVVHGPASVPLGYVPHPSSLSGSLPGMSRGKSMISSLSIMGGS
SGPPYDRAHVTGAS S S S S S STKGTYFP AILNPPP SP ATERSHYTMEFGY S SN SP STHRSY S YR
PYSYRHFAPPTTPCSTDVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDLNYDSEPVPPPPTPRSQYLS
AEENYE S CPP SPYTERS Y SHHLYPPPP SPCTD S S
Un experto puede apreciar que cualquier secuencia representada en las bases de datos de secuencias o en la presente especificación puede ser precursores de los respectivos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, y puede incluir partes que se procesan a partir de moléculas maduras.
El término "proteína", tal como se usa en esta especificación, generalmente abarca macromoléculas que comprenden una o más cadenas polipeptídicas, es decir, cadenas poliméricas de restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. El término puede abarcar proteínas producidas de forma natural, recombinante, semisintética o sintética. El término también abarca proteínas que portan una o más modificaciones de tipo co- o postraduccional de la una o varias cadenas polipeptídicas, tales como, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, sulfonación, metilación, ubicuitinación, eliminación de péptidos señal, eliminación de la Met del extremo amino, conversión de proenzimas o prehormonas en las formas activas, etc. El término también incluye variantes o mutantes de proteínas que portan variaciones de la secuencia de aminoácidos con respecto a las proteínas nativas correspondientes, tales como, por ejemplo, deleciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos. El término contempla tanto las proteínas completas como partes o fragmentos de proteínas, por ejemplo, partes de proteínas de origen natural que resultan del procesamiento de dichas proteínas completas.
El término "polipéptido", tal como se utiliza en esta especificación, generalmente abarca cadenas poliméricas de restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Por lo tanto, especialmente cuando una proteína está compuesta únicamente por una única cadena polipeptídica, los términos "proteína" y "polipéptido" pueden usarse indistintamente en la presente memoria para indicar dicha proteína. El término no está limitado por ninguna longitud mínima de la cadena polipeptídica. El término puede abarcar polipéptidos producidos de forma natural, recombinante, semisintética o sintética. El término también abarca polipéptidos que portan una o más modificaciones de tipo co- o postraduccional de la cadena polipeptídica, tales como, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, sulfonación, metilación, ubicuitinación, eliminación de péptidos señal, eliminación de la Met del extremo amino, conversión de proenzimas o prehormonas en sus formas activas, etc. El término también incluye variantes o mutantes de polipéptidos que portan variaciones de la secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido nativo correspondiente, tales como, por ejemplo, deleciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos. El término contempla tanto los polipéptidos completos como partes o fragmentos de polipéptidos, por ejemplo, partes de polipéptidos naturales que resultan del procesamiento de dichos polipéptidos completos.
El término "péptido" tal como se usa en esta especificación se refiere preferiblemente a un polipéptido como se usa en la presente memoria que consiste esencialmente en 50 aminoácidos o menos, por ejemplo, 45 aminoácidos o menos, preferiblemente 40 aminoácidos o menos, por ejemplo, 35 aminoácidos o menos, más preferiblemente 30 aminoácidos o menos, por ejemplo, 25 o menos, 20 o menos, 15 o menos, 10 o menos, o 5 o menos aminoácidos. Un péptido, polipéptido o proteína puede ser de origen natural, por ejemplo, presente o aislado de la naturaleza, por ejemplo, producido o expresado de forma nativa o endógena por una célula o tejido y opcionalmente aislado del mismo. Un péptido, polipéptido o proteína puede ser recombinante, es decir, producido mediante la tecnología de ADN recombinante, y/o puede sintetizarse, parcial o totalmente, por medios químicos o bioquímicos. Sin limitación, un péptido, polipéptido o proteína puede producirse de forma recombinante mediante un sistema de expresión de célula hospedadora o huésped adecuado y opcionalmente aislarse del mismo (p. ej., un sistema de expresión de célula hospedadora o huésped de tipo bacteria, levadura, hongo, planta o animal adecuado), o producirse de forma recombinante mediante la traducción libre de células o la transcripción y traducción libres de células, o síntesis no biológica de péptidos, polipéptidos o proteínas.
El término "ácido nucleico", tal como se utiliza en esta especificación, normalmente se refiere a un polímero (preferiblemente un polímero lineal) de cualquier longitud compuesto esencialmente de unidades de nucleósidos. Una unidad de nucleósido comúnmente incluye una base heterocíclica y un grupo de tipo azúcar. Las bases heterocíclicas pueden incluir, entre otras, bases purínicas y pirimidínicas tales como adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), que están muy extendidas en los ácidos nucleicos naturales, otras bases naturales (por ejemplo, xantina, inosina, hipoxantina), así como bases modificadas química o bioquímicamente (por ejemplo, metiladas), no naturales o modificadas. Las nucleobases modificadas ejemplares incluyen, sin limitación, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. En concreto, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico y pueden ser sustituciones de bases preferidas, por ejemplo, en agentes antisentido, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones del azúcar de tipo 2'-O-metoxietilo. Los grupos de azúcar pueden incluir, entre otros, grupos de pentosa (pentofuranosa), tales como preferiblemente ribosa y/o 2-desoxirribosa habituales en los ácidos nucleicos naturales, o grupos de azúcar de tipo arabinosa, 2-desoxiarabinosa, treosa o hexosa, así como grupos de azúcar modificados o sustituidos (tales como, sin limitación, azúcares 2'-O-alquilados, por ejemplo, 2'-O-metilados o 2'-O-etilados, tales como ribosa; azúcares 2'-O-alquiloxialquilados, por ejemplo, 2'-O-metoxietilados tales como ribosa; o azúcares unidos por 2'-O,4'-C-alquileno, por ejemplo, azúcares unidos por 2'-O,4'-C-metileno o unidos por 2'-O,4'-C-etileno, tales como ribosa; 2'-fluoro-arabinosa, etc.). Las moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos una unidad de ribonucleósido pueden denominarse típicamente ácidos ribonucleicos o ARN. Dichas unidades de ribonucleósido comprenden un resto 2'-OH, en el que -H puede estar sustituido como se conoce en la técnica para los ribonucleósidos (por ejemplo, por un metilo, etilo, alquilo o alquiloxialquilo). Preferiblemente, los ácidos ribonucleicos o ARN pueden estar compuestos principalmente de unidades de ribonucleósido, por ejemplo, >80 %, >85 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o incluso el 100% (en número) de las unidades de nucleósido que constituyen la molécula de ácido nucleico pueden ser unidades de ribonucleósidos. Las moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos una unidad de desoxirribonucleósido pueden denominarse típicamente ácidos desoxirribonucleicos o ADN. Dichas unidades de desoxirribonucleósidos comprenden 2'-H. Preferiblemente, los ácidos desoxirribonucleicos o ADN pueden estar compuestos principalmente de unidades de desoxirribonucleósidos, por ejemplo, >80 %, >85 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o incluso el 100% (en número) de las unidades de nucleósidos que constituyen la molécula de ácido nucleico pueden ser unidades de desoxirribonucleósidos. Las unidades de nucleósidos pueden estar unidas entre sí mediante cualquiera de los numerosos enlaces entre nucleósidos conocidos, incluidos, entre otros, enlaces fosfodiéster habituales en los ácidos nucleicos naturales, y enlaces con modificaciones adicionales basados en fosfato o fosfonato, tales como fosforotioato, fosforotioato de alquilo tales como fosforotioato de metilo, fosforoditioato, alquilfosfonato tal como metilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster tal como alquilfosfotriéster, fosforamidato, fosforopiperazidato, fosforomorfolidato, fosforamidato con puente, metilenfosfonato con puente, fosforotioato con puente; y además enlaces internucleósidos de siloxano, carbonato, sulfamato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato tales como 3'-N-carbamato, morfolino, borano, tioéter, 3'-tioacetal y sulfona. Preferiblemente, los enlaces entre nucleósidos pueden ser enlaces basados en fosfato que incluyen enlaces basados en fosfato modificados, tales como más preferiblemente enlaces fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato o combinaciones de los mismos. El término "ácido nucleico" también abarca cualquier otra nucleobase que contenga polímeros, tales como miméticos de ácidos nucleicos, que incluyen, sin limitación, ácidos peptidonucleicos (PNA), ácidos peptidonucleicos con grupos fosfato (PHONA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de cadena principal con morfolino fosforodiamidato (PMO), ácidos nucleicos de ciclohexeno (CeNA), triciclo-ADN (tcDNA) y ácidos nucleicos que tienen secciones de cadena principal con enlaces alquilo o enlaces amino (véase, por ejemplo, Kurreck 2003(Eur J Biochem270: 1628-1644)). "Alquilo", tal como se usa en la presente memoria, abarca particularmente restos de hidrocarburos inferiores, por ejemplo, hidrocarburos C1-C4 lineales o ramificados, saturados o insaturados, tales como metilo, etilo, etenilo, propilo, 1-propenilo, 2-propenilo e isopropilo. Los ácidos nucleicos tal como se pretende en la presente memoria pueden incluir nucleósidos naturales, nucleósidos modificados o mezclas de los mismos. Un nucleósido modificado puede incluir una base heterocíclica modificada, un resto de azúcar modificado, un enlace entre nucleósidos modificado o una combinación de los mismos.
El término "ácido nucleico" abarca además preferiblemente ADN, ARN y moléculas híbridas de ADN/ARN, que incluyen específicamente ARNhn, pre-ARNm, ARNm, ADNc, ADN genómico, productos de amplificación, oligonucleótidos, y ADN, ARN o híbridos de ADN/ARN sintéticos (por ejemplo, sintetizados químicamente). El ARN incluye ARNi (a RN inhibidor), ARNbc (ARN bicatenario), ARNpi (ARN pequeño interferente), ARNm (ARN mensajero), miARN (microARN), ARNt (ARN de transferencia, ya sea cargado o descargado con su correspondiente aminoácido acilado) y ARNc (ARN complementario). Un ácido nucleico puede ser de origen natural, por ejemplo, presente o aislado de la naturaleza, por ejemplo, producido de forma nativa o endógena por una célula o un tejido y opcionalmente aislado del mismo. Un ácido nucleico puede ser recombinante, es decir, producido mediante tecnología de ADN recombinante, y/o puede sintetizarse, parcial o totalmente, por medios químicos o bioquímicos. Sin limitación, un ácido nucleico puede producirse de forma recombinante mediante un sistema de expresión de célula hospedadora o huésped adecuado y, opcionalmente, aislarse del mismo (p. ej., un sistema de expresión de célula hospedadora o huésped bacteriano, de levadura, fúngico, vegetal o animal adecuado), o producirse de forma recombinante mediante transcripción acelular o síntesis de ácidos nucleicos no biológica. Un ácido nucleico puede ser bicatenario, parcialmente bicatenario o monocatenario. Cuando es monocatenario, el ácido nucleico puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal.
La referencia a cualquier péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico abarca dichos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos de cualquier organismo donde se encuentren, y particularmente de animales, preferiblemente animales de sangre caliente, más preferiblemente vertebrados, aún más preferiblemente mamíferos, incluidos los humanos. y mamíferos no humanos, aún más preferiblemente de humanos.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, uno o más y preferiblemente cada uno de GPR124, RECK, FZD y LRP que se emplean en la presente memoria es o son de origen animal, preferiblemente de origen animal de sangre caliente, más preferiblemente de origen vertebrado, aún más preferiblemente de origen mamífero, incluido el origen humano y origen mamífero no humano, aún más preferentemente origen humano.
La referencia a cualesquiera péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos puede abarcar particularmente dichos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos con una secuencia nativa, es decir, aquellos cuya secuencia primaria es la misma que la de los péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos que se encuentran en la naturaleza o se derivan de ella. Un experto entiende que las secuencias nativas pueden diferir entre las diferentes especies debido a la divergencia genética entre dichas especies. Además, las secuencias nativas pueden diferir entre o dentro de diferentes individuos de la misma especie debido a la diversidad (variación) genética normal dentro de una especie determinada. Además, las secuencias nativas pueden diferir entre, o incluso dentro de, diferentes individuos de la misma especie debido a las mutaciones somáticas o las modificaciones postranscripcionales o postraduccionales. En la presente memoria se busca cualquier variante o isoforma de péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos. En consecuencia, todas las secuencias de péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos que se encuentran en la naturaleza o se derivan de ella se consideran "nativas".
En determinadas realizaciones, los péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos pueden ser humanos, es decir, su secuencia primaria puede ser la misma que una secuencia primaria correspondiente a, o estar presente en, péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos humanos de origen natural. En determinadas realizaciones, el calificativo "humano" se refiere a la secuencia primaria de los respectivos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, en lugar de a su origen o fuente. Por ejemplo, dichos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos pueden estar presentes, o aislarse de, muestras de sujetos humanos o pueden obtenerse por otros medios (por ejemplo, mediante expresión recombinante, transcripción o traducción sin células, o síntesis no biológica de péptidos o ácidos nucleicos).
En determinadas realizaciones, los péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos pueden ser de tipo silvestre.
Si bien la mayoría de los péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos nativos pueden considerarse de tipo silvestre, los que portan mutaciones naturales que conducen a una pérdida parcial o completa de la función, que pueden contribuir o ser causantes de un fenotipo de enfermedad, generalmente se excluyen del alcance del término
"tipo silvestre".
La referencia a cualquier péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico también puede abarcar variantes o fragmentos de dichos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, particularmente de sus formas naturales, nativas o de tipo silvestre.
El término "fragmento", tal como se utiliza a lo largo de esta especificación con referencia a un péptido, polipéptido o proteína, generalmente denota una porción del péptido, polipéptido o proteína, tal como típicamente una forma truncada en el extremo N y/o C del péptido, polipéptido o proteína. Preferiblemente, un fragmento puede comprender al menos aproximadamente un 30 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 50 % o al menos aproximadamente un 70 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 80 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 %, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el
95 % o incluso aproximadamente el 99 % de la longitud de la secuencia de aminoácidos de dicho péptido, polipéptido o proteína. Por ejemplo, en la medida en que no exceda la longitud del péptido, polipéptido o proteína completos, un fragmento puede incluir una secuencia de >5 aminoácidos consecutivos, o >10 aminoácidos consecutivos, o >20 aminoácidos consecutivos, o >30 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, >40 aminoácidos consecutivos, tales como por ejemplo >50 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, >60, >70, >80, >90, >100, >200, >300, >400, >500, >600,
>700, >800, >900 o >1000 aminoácidos consecutivos del péptido, polipéptido o proteína completos correspondientes.
El término "fragmento" con referencia a un ácido nucleico (polinucleótido) generalmente denota una forma truncada en 5' y/o 3' de un ácido nucleico. Preferiblemente, un fragmento puede comprender al menos aproximadamente un 30
%, por ejemplo, al menos aproximadamente un 50 % o al menos aproximadamente un 70 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 80 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 %, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % o incluso aproximadamente el 99 % de la longitud de la secuencia de ácido nucleico de dicho ácido nucleico. Por ejemplo, en la medida en que no exceda la longitud del ácido nucleico completo, un fragmento puede incluir una secuencia de >5 nucleótidos consecutivos, o >10 nucleótidos consecutivos, o >20 nucleótidos consecutivos, o >30 nucleótidos consecutivos, por ejemplo, >40 nucleótidos consecutivos, tales como por ejemplo >50 nucleótidos consecutivos, por ejemplo, >60, >70, >80, >90, >100, >200, >300, >400, >500, >600, >700, >800, >900, >1000, >3000, >3500 o >4000 nucleótidos consecutivos del correspondiente ácido nucleico completo.
Los términos abarcan fragmentos que surgen por cualquier mecanismo,in vivoy/oin vitro,tales como, sin limitación, mediante transcripción o traducción alternativa, exo- y/o endoproteólisis, exo- y/o endonucleólisis, o degradación del péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico, tal como, por ejemplo, mediante proteólisis o nucleólisis física, química y/o enzimática.
El término "variante" de una proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico generalmente se refiere a proteínas, polipéptidos o péptidos cuya secuencia de aminoácidos, o ácidos nucleicos cuya secuencia de nucleótidos, es sustancialmente idéntica (es decir, en gran medida pero no totalmente idéntica) a la secuencia de la proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico, por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 % idéntica o al menos aproximadamente un 85 % idéntica, por ejemplo, preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % idéntica, por ejemplo, al menos aproximadamente un 91 % idéntica, un 92 % idéntica, más preferiblemente al menos aproximadamente un 93 % idéntica, por ejemplo, al menos un 94 % idéntica, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % idéntica, por ejemplo, al menos un 96 % idéntica, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 97 % idéntica, por ejemplo, al menos un 98 % idéntica, y más preferiblemente al menos un 99 % idéntica a la secuencia de la proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico citado. Preferiblemente, una variante puede mostrar tales grados de identidad con una proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico citado cuando se consulta la secuencia completa de la proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico citado en el alineamiento de secuencias (es decir, identidad de secuencia general). La identidad de secuencia se puede determinar usando algoritmos adecuados para realizar alineamientos de secuencia y determinación de identidad de secuencia como se conoce por sí mismo. Los algoritmos ejemplares pero no limitantes incluyen los basados en la herramienta de búsqueda de alineamiento local básica (BLAST) descrita originalmente por Altschul et al. 1990 (JMol Biol215: 403 10), como el algoritmo "Blast 2 sequences" descrito por Tatusova y Madden 1999(FEMS Microbio! Lett174: 247-250), por ejemplo, utilizando la configuración predeterminada publicada u otras configuraciones adecuadas (como, por ejemplo, para el algoritmo BLASTN: coste de abrir un hueco = 5, coste de ampliar un hueco = 2, penalización por una falta de coincidencia = -2, recompensa por una coincidencia = 1, hueco x_dropoff = 50, valor de lo esperado = 10,0, tamaño de palabra = 28; o para el algoritmo BLASTP: matriz = Blosum62 (Henikoff et al., 1992,Proc. Nati. Acad. Sci.,89:10915-10919), coste de abrir un hueco = 11, coste de ampliar un hueco = 1, valor de lo esperado = 10,0, tamaño de palabra = 3).
Un procedimiento de ejemplo para determinar el porcentaje de identidad entre una secuencia de aminoácidos particular y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de consulta implicará alinear las dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de Blast 2 sequences (Bl2seq), disponible como una aplicación web o como un programa autónomo ejecutable (BLAST versión 2.2.31+) en el sitio web del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), utilizando los parámetros adecuados del algoritmo. Un ejemplo de parámetros adecuados del algoritmo incluye: matriz = Blosum62, coste de abrir un hueco = 11, coste de ampliar un hueco = 1, valor de lo esperado = 10,0, tamaño de palabra = 3). Si las dos secuencias comparadas comparten homología, el resultado presentará las regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el resultado no presentará secuencias alineadas. Una vez alineadas, el número de coincidencias se determinará contando el número de posiciones donde aparece el mismo resto de aminoácido en ambas secuencias. El porcentaje de identidad se determina dividiendo el número de coincidencias por la longitud del polipéptido de consulta, seguido de multiplicar el valor resultante por 100. El valor de porcentaje de identidad puede, aunque no es necesario, redondearse a la décima más cercana. Por ejemplo, 78,11,78,12, 78,13 y 78,14 se pueden redondear hacia abajo a 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 y 78,19 se pueden redondear hacia arriba hasta 78,2. Cabe señalar además que la vista detallada de cada segmento de alineamiento generado por Bl2seq ya incluye por comodidad el porcentaje de identidad.
Una variante de una proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico puede ser un homólogo (por ejemplo, ortólogo o parálogo) de dicha proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "homología" generalmente denota la similitud estructural entre dos macromoléculas de taxones iguales o diferentes, en donde dicha similitud se debe a una ascendencia compartida.
Una variante de una proteína, polipéptido o péptido puede comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a (es decir, en comparación con) la proteína o polipéptido correspondiente. Por ejemplo, una variante (variante de sustitución) de una proteína, polipéptido o péptido puede comprender hasta 70 (por ejemplo, no más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 o 70) sustituciones conservativas de aminoácido con respecto a (es decir, en comparación con) la proteína o polipéptido correspondiente; y/o una variante (variante de sustitución) de una proteína, polipéptido o péptido puede comprender hasta 20 (por ejemplo, no más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) sustituciones no conservativas de aminoácido con respecto a (es decir, en comparación con) la proteína o polipéptido correspondiente.
Una sustitución conservativa de aminoácido es una sustitución de un aminoácido por otro con características similares. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina, cisteína y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (es decir, básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (es decir, ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Cualquier sustitución de un miembro de los grupos polares, básicos o ácidos antes mencionados por otro miembro del mismo grupo puede considerarse una sustitución conservativa. Por el contrario, una sustitución no conservativa es la sustitución de un aminoácido por otro con características diferentes.
Como alternativa, o además, por ejemplo, una variante (variante de deleción) de una proteína, polipéptido o péptido puede carecer de hasta 20 segmentos de aminoácidos (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segmentos) con respecto a (es decir, en comparación con) la proteína o polipéptido correspondiente. Cada uno de los segmentos de deleción puede consistir independientemente en un aminoácido, dos aminoácidos contiguos o tres aminoácidos contiguos. Los segmentos de deleción pueden no ser contiguos, o dos o más o todos los segmentos de deleción pueden ser contiguos.
Una variante de un ácido nucleico puede comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos con respecto (es decir, en comparación con) el ácido nucleico correspondiente.
La referencia a "fragmento o variante" o "variante o fragmento" de cualquier péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico, también abarca los fragmentos de variantes de dicho péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico, y las variantes de fragmentos de dicho péptido, polipéptido, proteína o ácido nucleico.
Se consideran particularmente los fragmentos y/o variantes biológicamente activos de los péptidos, polipéptidos o proteínas citados. El término "biológicamente activo" es intercambiable con términos tales como "funcionalmente activo" o "funcional", lo que indica que el fragmento y/o variante conserva al menos parcialmente la actividad biológica o la funcionalidad prevista del péptido, polipéptido o proteína respectivo o correspondiente. La referencia a la "actividad" de un péptido, polipéptido o proteína puede abarcar generalmente uno o más aspectos de la actividad biológica del péptido, polipéptido o proteína, tal como, sin limitación, uno o más aspectos de su actividad bioquímica, actividad enzimática, actividad señalizadora, actividad de interacción, actividad de ligando y/o actividad estructural, por ejemplo, dentro de una célula, tejido, órgano u organismo.
Preferiblemente, un fragmento o variante funcionalmente activo puede retener al menos aproximadamente el 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 25 %, o al menos el 30 %, o al menos aproximadamente el 40 %, o al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, al menos el 60 %, más preferiblemente al menos aproximadamente el 70 %, por ejemplo, al menos el 80 %, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85 %, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 % y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % o incluso aproximadamente el 100 % de la actividad o funcionalidad biológica prevista en comparación con el péptido, polipéptido o proteína correspondiente. En ciertas realizaciones, un fragmento o variante funcionalmente activo puede incluso mostrar una mayor actividad o funcionalidad biológica en comparación con el péptido, polipéptido o proteína correspondiente, por ejemplo, puede mostrar al menos aproximadamente un 100 %, o al menos aproximadamente un 150 %, o al menos aproximadamente un 200 %, o al menos aproximadamente el 300 %, o al menos aproximadamente el 400 %, o al menos aproximadamente el 500 % de la actividad o funcionalidad biológica prevista en comparación con el péptido, polipéptido o proteína correspondiente. Por medio de un ejemplo, donde la actividad de un péptido, polipéptido o proteína dado puede medirse fácilmente en un ensayo con un resultado cuantitativo, por ejemplo un ensayo enzimático o un ensayo de señalización o un ensayo de unión que produce una señal cuantificable, un fragmento o variante del péptido, polipéptido o proteína funcionalmente activo puede producir una señal que es al menos aproximadamente el 20 %, o al menos aproximadamente el 25 %, o al menos el 30 %, o al menos aproximadamente el 40 %, o al menos aproximadamente el 50 %, o al menos el 60 %, más preferiblemente al menos aproximadamente el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos aproximadamente el 85 %, o al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 100 %, o al menos aproximadamente 150 %, o al menos aproximadamente 200 %, o al menos aproximadamente 300 %, o al menos aproximadamente 400 %, o al menos aproximadamente 500 % de la señal producida por el péptido, polipéptido o proteína correspondiente.
A modo de ejemplo y sin limitación, un fragmento o variante biológicamente activo del polipéptido o proteína GPR124, RECK, FZD o LRP retendrá al menos parcialmente uno o más aspectos de la actividad biológica del correspondiente polipéptido o proteína GPR124, RECK, FZD o LRP nativo o de tipo silvestre, respectivamente. Por ejemplo, la referencia a la actividad biológica del polipéptido o proteína GPR124, RECK, FZD o LRP puede denotar particularmente la capacidad de participar en un complejo GPR124/RECK/FZD/LRP, por ejemplo, la capacidad de unirse a uno o más componentes diferentes de dicho complejo, y/o la capacidad de intervenir en la señalización de Wnt como parte del complejo GPR124/RECK/FZD/LRP.
Por lo tanto, la especificación en concreto describe un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por FZD/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, en donde uno o más o preferiblemente todos los GPR124, RECK, Fz D o LRP es o son GPR124, RECK, FZD o LRP nativos o de tipo silvestre.
La especificación describe además en concreto un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por FZD/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, en donde uno o más o preferiblemente todos GPR124, RECK, FZD o LRP es o son GPR124, RECK, FZD o LRP humano nativo o de tipo silvestre.
La especificación describe además en concreto un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por FZD/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, en donde uno o más o preferiblemente todos GPR124, RECK, FZD o LRP es o son GPR124, RECK, FZD o LRP humano nativo o de tipo silvestre como se indica en las entradas de Genbank o Uniprot presentadas en otras partes de esta especificación. Se recuerda al lector que cuando las entradas de Genbank o Uniprot proporcionan la secuencia de polipéptidos o proteínas precursoras, se esperaría que las formas maduras correspondientes participen en el complejo GPR124/RECK/FZD/LRP.
La especificación describe además en concreto un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD1/LRP5 o LRP6, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por FZD5/LRP5 o LRP6 en ausencia de RECK y/o GPR124, en donde uno o más o preferiblemente todos GPR124, RECK, FZD1, FZD5, LRP5 o LRP6 es o son GPR124, RECK, FZD1, FZD5, LRP5 o L<r>P6 humanos nativos o de tipo silvestre como se indica en las entradas de Genbank o Uniprot presentadas en otros lugares en esta especificación.
La especificación describe además en concreto un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por FZD/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, en donde uno o más de GPR124, RECK, FZD o LRP es o son un fragmento o variante biológicamente activo de GPR124, RECK, FZD o LRP nativo o de tipo silvestre.
La especificación describe además en concreto un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, en donde dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por FZD/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, en donde uno o más de GPR124, RECK, FZD o LRP es o son un fragmento o variante biológicamente activo de GPR124, RECK, FZD o LRP humano nativo o de tipo silvestre.
Los términos "complejo", "complejo proteico" o "complejo polipeptídico" se conocen bien en la técnica. A modo de orientación adicional y sin limitación, los términos denotan en líneas generales un agrupamiento que comprende dos o más proteínas o polipéptidos. El agrupamiento puede estabilizarse mediante enlaces no covalentes, más particularmente interacciones no covalentes entre proteínas, en las que todos o sólo parte de los polipéptidos presentes dentro del grupo interaccionan físicamente. Un complejo proteico puede estar compuesto enteramente por péptidos, polipéptidos o proteínas, o puede incluir otras moléculas o macromoléculas tales como glúcidos, lípidos, glucolípidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, nucleoproteínas, nucleósidos, fosfonucleósidos, cofactores enzimáticos, porfirinas, iones metálicos y similares. Los términos abarcan, sin limitación, complejos proteicos que pueden ser obligados o no obligados, transitorios o permanentes y/o homomultiméricos o heteromultiméricos. Los términos abarcan, sin limitación, complejos proteicos que pueden estar ubicados en la membrana celular (membrana plasmática), extracelularmente, dentro del citoplasma, dentro de orgánulos celulares o en las membranas de orgánulos celulares. Los complejos ubicados en la membrana celular normalmente contienen al menos una proteína transmembranaria o anclada a la membrana. Los términos también abarcan microdominios de membrana y estructuras similares a orgánulos macromoleculares asociadas a la membrana conocidas como "señalosoma" que compartimentan una vía de señalización determinada. Estos complejos proteicos de orden superior pueden estar estabilizados al menos parcialmente por armazones intracelulares. Por lo tanto, los términos también pueden denotar situaciones en las que ciertas proteínas o polipéptidos se concentran o acumulan localmente en un sitio determinado de una membrana celular, tal como para permitir la transducción de señales a través de la membrana celular en dicho sitio mediada por dichas proteínas o polipéptidos.
Un complejo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP denota en líneas generales un complejo proteico, particularmente un complejo proteico asociado a membrana, más particularmente un complejo proteico asociado a la membrana plasmática que comprende al menos un polipéptido GPR124, al menos un polipéptido RECK, al menos un polipéptido FZD y al menos un polipéptido LRP. Un complejo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP, cuando se localiza en la membrana plasmática de una célula que contiene los miembros posteriores de la vía de señalización Wnt/p-catenina (p. ej., Disheveled (Dvl)), es capaz de activar la señalización de Wnt/pcatenina en dicha célula en respuesta al ligando de Wnt7 proporcionado extracelularmente.
Un complejo receptor FZD/LRP denota en líneas generales un complejo proteico, particularmente un complejo proteico asociado a la membrana, más particularmente un complejo proteico asociado a la membrana plasmática que comprende al menos un polipéptido FZD y al menos un polipéptido LRP. Un complejo de receptor FZD/LRP, cuando se localiza en la membrana plasmática de una célula que contiene los miembros posteriores de la vía de señalización de Wnt/p-catenina (por ejemplo, Dvl), es capaz de activar la señalización de Wnt/p-catenina en dicha célula en respuesta al ligando de Wnt proporcionado extracelularmente, tal como, pero sin limitación, el ligando Wnt7.
El término "señalización de Wnt", tal como se usa en la presente memoria, se refiere al mecanismo por el cual un ligando Wnt biológicamente activo ejerce su efecto sobre una célula para modular la actividad y/o acciones de dicha célula. Los ligandos Wnt biológicamente activos modulan la actividad y/o acción celular uniéndose a uno o más receptores de Wnt, tales como el complejo receptor FZD/LRP. Una vez activados por la unión del ligando Wnt, los receptores de Wnt activarán una o más vías de señalización intracelular. Clásicamente se reconocen tres vías de señalización de Wnt: la vía canónica de Wnt (es decir, mediada por la activación de la p-catenina como coactivador transcripcional), la vía de polaridad celular plana no canónica y la vía no canónica de Wnt/calcio. Las tres vías normalmente se activan mediante la unión de un ligando Wnt a un receptor FZD. Sin embargo, el reclutamiento del receptor LRP parece ser un requisito previo para inducir la señalización canónica de Wnt (o dependiente de pcatenina). Como se sabe en la técnica, en ausencia de un complejo Wnt/FZD/LRP ("señalización canónica inactiva de Wnt"), la p-catenina es fosforilada en el citoplasma por la caseína cinasa y la glucógeno sintasa cinasa-3 (GSK-3). La interacción entre estas cinasas y la p-catenina se ve facilitada por las proteínas de armazón, Axin y la poliposis colónica adenomatosa (APC). Juntas, estas proteínas forman un "complejo de degradación", que permite que la p-catenina fosforilada sea reconocida por la proteína que contiene repeticiones de tipo p-transducina (p-TrCP), enviada a la ubicuitinación y degradada por el proteasoma. La señalización canónica de Wnt activa (o dependiente de la p-catenina) implica la unión de los ligandos Wnt a un complejo receptor de FZD y LRP en la superficie celular. Durante la señalización, FZD coopera con LRP de tal manera que la unión de la proteína Wnt conduce a la dimerización de ambos receptores. Se propone que esta dimerización conduce a un cambio conformacional de los receptores FZD y LRP. Como consecuencia, la cola citoplasmática de LRP recluta y se une a la proteína de armazón Axin de una manera dependiente de la fosforilación y conduce a la formación de un complejo que involucra a DVL, Axin y GSK3. Los multímeros de moléculas DVL y Axin unidas al receptor podrían favorecer la formación del dímero LRP-FZD. Como resultado del reclutamiento de GSK a la membrana celular, se inhibe la fosforilación de la p-catenina, liberando la pcatenina del complejo de degradación y permitiendo que la p-catenina se acumule en el citoplasma. La acumulación de la p-catenina en el citoplasma permite que la p-catenina entre en el núcleo e interaccione con los factores de transcripción TCF/LEF.
Los presentes inventores han identificado la señalización mediada por RECK/GPR124/Frizzled/LRP específica de Wnt7, en la que Wnt7 se une específicamente a Reck de una manera independiente de FZD y GPR124, un socio de unión de RECK, une el Wnt7 unido a RECK con el complejo FZD/LRP a través de los armazones de DVL intracelulares, ensamblando así los señalosomas RECK/GPR124/FZD/LRP específicos del ligando Wnt7 y activando la señalización canónica de Wnt.
En vista de lo anterior, el experto entenderá que, como suele ser lo habitual de la señalización de Wnt mediada por los polipéptidos FZD y LRP, es posible que no se forme un complejo FZD/LRP en la membrana de una célula en ausencia o independientemente de un agente extracelular capaz de activar la señalización de Wnt a través de dicho complejo FZD/LRP. En otras palabras, el agente puede desempeñar un papel activo en el ensamblaje u organización de los polipéptidos FZD y LRP en el complejo FZD/LRP, tal como mediante las interacciones proteína-proteína entre el agente y cada una de FZD y LRP. Esto da como resultado la formación del complejo FZD/LRP y la activación de la señalización de Wnt mediada por el complejo.
De manera similar, es posible que no se forme un complejo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP en la membrana de una célula en ausencia o independientemente de un agente extracelular capaz de activar la señalización de Wnt a través de dicho complejo GPR124/RECK/FZD/LRP. En otras palabras, el agente puede desempeñar una función activa en el ensamblaje u organización de dos o más de los polipéptidos GPR124, RECK, FZD y LRP en el complejo GPR124/RECK/FZD/LRP, tal como mediante las interacciones proteína-proteína entre el agente y cada uno de dichos dos o más de GPR124, RECK, FZD y LRP. Esto da como resultado la formación del complejo GPR124/RECK/FZD/LRP y la activación de la señalización de Wnt mediada por el complejo.
En consecuencia, la frase "un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Frizzled/LRP" se refiere a la capacidad del agente para inducir la señalización de Wnt a través de los polipéptidos Gpr124, Reck, Frizzled y LRP. La frase "un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Frizzled/LRP" no implica necesariamente la existencia de un complejo receptor Gpr124/Reck/Frizzled/LRP antes de ponerse en contacto con una célula que expresa Gpr124, Reck, Frizzled y LRP con el agente. Por ejemplo, y sin limitación, el agente puede contribuir o facilitar la formación o ensamblaje de un complejo de señalización Gpr124/Reck/Frizzled/LRP, activando así la señalización de Wnt mediada por dicho complejo. De manera similar, una frase "un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP" se refiere a la capacidad del agente para inducir la señalización de Wnt a través de los polipéptidos Frizzled y LRP. La frase "un agente capaz de activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP" no implicaría necesariamente la existencia de un complejo receptor Frizzled/LRP antes de poner en contacto una célula que expresa Frizzled y LRP con dicho agente. Por ejemplo, y sin limitación, dicho agente podría contribuir o facilitar la formación o el ensamblaje de un complejo de señalización Frizzled/LRP, activando así la señalización de Wnt mediada por dicho complejo. La frase "dicho agente no activa la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de Reck y/o Gpr124" no implica necesariamente la existencia de un complejo receptor Frizzled/LRP en una célula que expresa Frizzled y LRP pero no Reck y/o Gpr124. Por ejemplo, y sin limitación, el agente puede no contribuir ni facilitar la formación ni el ensamblaje de un complejo de señalización Frizzled/LRP en dicha célula, no consiguiendo así activar la señalización de Wnt mediada por dicho complejo.
El experto apreciará además que un complejo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP como se contempla en la presente memoria puede incluir uno o varios componentes adicionales, que pueden o no modular funcionalmente el complejo. Por ejemplo, el complejo puede incluir Disheveled (Dvl), formando armazones intracelulares capaces de unirse a GPR124 y Frizzled.
En realizaciones concretas, la célula que expresa los polipéptidos GPR124, RECK, FZD y LRP en su membrana plasmática y que contiene los miembros posteriores de la vía de señalización de Wnt/p-catenina es una célula que expresa de forma natural todos los polipéptidos GPR124, RECK, FZD y LRP en la superficie celular, como una célula endotelial del cerebro. En realizaciones adicionales, la célula que expresa los polipéptidos GPR124, RECK, FZD y LRP en su membrana plasmática y que contiene los miembros posteriores de la vía de señalización de Wnt/p-catenina es una célula modificada (por ejemplo, genéticamente modificada) de tal manera que expresa todos los polipéptidos GPR124, RECK, FZD y LRP en su superficie. Por ejemplo, la célula puede ser una célula cultivada que expresa de forma natural FZD y l Rp , pero que no expresa de forma natural GPR124 y RECK, y manipulada genéticamente para expresar los polipéptidos GPR124 y RECK, por ejemplo, transfectada de manera estable o transitoria con uno o más ácidos nucleicos expresables que codifican dichos polipéptidos GPR124 y RECK. Preferiblemente, la célula es una célula de mamífero, más preferiblemente una célula humana.
En realizaciones concretas, la capacidad que tiene el agente para activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, denota la capacidad del agente para activar la señalización canónica de Wnt en presencia de RECK y GPR124, pero no en ausencia de RECK y/o GPR124.
La frase "la presencia de RECK y GPR124" se refiere a la aparición de los polipéptidos RECK y GPR124 en, o cerca de, la membrana celular, preferiblemente en estrecha proximidad mutua con los polipéptidos Frizzled y LRP. La estrecha proximidad mutua puede facilitar la formación del complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP en condiciones propicias para ello, tal como cuando un agente como el dado a conocer en la presente memoria se suministra externamente a una célula. Por otro lado, la frase "la ausencia de RECK y/o GPR124" se refiere a la falta o no aparición de los polipéptidos RECK y/o GPR124 en la membrana celular. La ausencia de RECK y/o GPR124 en, o cerca de, la membrana celular puede ocurrir cuando una célula no expresa, traduce o transloca correctamente RECK y/o GPR124. La ausencia de RECK y/o GPR124 no necesita denotar la ausencia completa del polipéptido RECK y/o GPR124 en la membrana celular, pero puede, por ejemplo, referirse a una cantidad de polipéptido RECK y/o GPR124 que no es detectable o cae por debajo del margen de sensibilidad de los ensayos de detección o cuantificación de proteínas convencionales conocidos por el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, inmunotransferencia, inmunocitoquímica o inmunofluorescencia.
En realizaciones concretas, la capacidad del agente para activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, denota la capacidad del agente para activar la señalización de Wnt en las células capaces de mediar la señalización de Wnt mediante el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no en las células capaces de montar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP que no expresan GPR124 y/o RECK.
Las células capaces de mediar la señalización de Wnt mediante el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP pueden ser células que expresan de forma natural todos los componentes celulares necesarios para la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, tales como las células o líneas celulares de endotelio cerebral. Las células capaces de mediar la señalización de Wnt mediante el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP también pueden ser células que naturalmente no expresan ninguno o no todos los componentes celulares necesarios para la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, que pueden modificarse, tal como por modificación genética, para compensar los componentes celulares que faltan pero se necesitan para la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP. Dichas modificaciones se conocen en la técnica y se describen en otra parte de la presente memoria.
Las células capaces de mediar la señalización de Wnt mediante el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP pueden ser células o líneas celulares de vertebrados. Los ejemplos no limitantes incluyen riñón embrionario humano 293 T (HEK239T), células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), células endoteliales microvasculares de la dermis humana (HDMVEC), células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAEC), células endoteliales aórticas de humano (HAEC), células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC), células Bend3, células Bend5 o células hCMEC/D3. Las células HEK293T pueden obtenerse de colecciones públicas mantenidas, por ejemplo, por la American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Blvd. Manassas, Virginia 20110-2209, EE. Uu .), que incluyen, entre otras, HEK293T con ATCC de n.° de acceso CRL-3216.
En realizaciones concretas, la capacidad del agente para activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, denota la capacidad del agente para activar la señalización de Wnt en las células que expresan GPR124, RECK, FZ y LRP, pero no en las células que expresan FZ y LRP pero que no expresan GPR124 y/o RECK, en donde las células que expresan GPR124, RECK, FZ y LRP y las células que expresan FZ y LRP pero que no expresan GPR124 y/o RECK son por lo demás sustancialmente idénticas.
En realizaciones concretas, la capacidad del agente para activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, denota la capacidad que tiene el agente para activar la señalización de Wnt en las líneas celulares o células endoteliales vasculares de cerebro humano o de ratón, mientras que no activa la señalización de Wnt en las líneas celulares o células endoteliales vasculares de cerebro humano o de ratón en las que se ha eliminado el gen RECK y/o GPR124. La determinación de la activación de la señalización de Wnt se conoce en la técnica y se puede realizar como se describe en otra parte de la presente memoria. Las células endoteliales adecuadas incluyen, por ejemplo, células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC), células Bend3, células Bend5 o células hCMEC/D3. Las HBMEC se pueden obtener de colecciones públicas mantenidas, por ejemplo, por la ATCC, incluidas, entre otras, HBEC-5i con n.° de acceso en la ATCC CRL-3245. Las células Bend3 se pueden obtener de colecciones públicas mantenidas, por ejemplo, por la ATCC, incluidas, entre otras, bEnd.3 con n.° de acceso en la ATCC CRL-2299.
En realizaciones concretas, la capacidad del agente para activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, denota la capacidad del agente para restaurar la vasculatura cerebral y/o la barrera hematoencefálica en el pez cebra(Danio rerio)Wnt7aa-/- cuando se expresa transgénicamente en el endotelio de dicho pez cebra, mientras que la microinyección de ARNm que codifica el agente en un embrión de pez cebra de tipo silvestre no induce un fenotipo de posteriorización, preferiblemente en el que el ARNm se inyecta a una dosis de 1 pg a 100 pg, o mientras la microinyección de ARNm que codifica el agente en un embrión deXenopusde tipo silvestre no induce la duplicación del eje.
La capacidad del agente para restaurar la vasculatura cerebral y/o la barrera hematoencefálica en el pez cebra Wnt7aa-/- cuando se expresa transgénicamente en el endotelio de dicho pez cebra se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la restauración de la vasculatura cerebral y/o la barrera hematoencefálica se puede evaluar determinando la cantidad de arterias centrales (CtA) del rombencéfalo, la longitud total de los capilares cerebrales, el tamaño medio de los vasos y/o el promedio de ramificaciones capilares. La determinación de la expresión de GLUT1 en la región cerebral del pez cebra Wnt7aa-/- que expresa transgénicamente el agente que se da a conocer en la presente memoria (por ejemplo, usando hibridaciónin situo inmunohistoquímica) se puede usar para visualizar la vasculatura cerebral en dicho pez cebra. Posteriormente, el patrón de expresión de GLUT1 en la región cerebral del pez cebra Wnt7aa-/- que expresa transgénicamente el agente que se da a conocer en la presente memoria se puede comparar con el patrón de expresión de GLUT 1 en la región del cerebro de un control, tal como un pez cebra de tipo silvestre.
En realizaciones concretas, la vasculatura cerebral y la barrera hematoencefálica del pez cebra Wnt7aa-/- que expresa transgénicamente el agente que se da a conocer en la presente memoria se considera restaurado si la cantidad de CtA del rombencéfalo en el pez cebra Wnt7aa-/- que expresa transgénicamente el agente que se da a conocer en la presente memoria es al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 99% de la cantidad de CtA del rombencéfalo de un pez cebra de tipo silvestre.
Los métodos para generar el pez cebra Wnt7aa-/- y la expresión transgénica de un agente en el endotelio de un pez cebra se conocen bien en la técnica, por ejemplo, usando la edición de genes dirigida por CRISPR/Cas, tal como se describe en Shankaran et al., “CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens”,Curr Protoc Mol Biol.,119:31.9.1-31.9.22 (2017).
La microinyección de ARNm en un embrión de pez cebra, preferiblemente un embrión de pez cebra en una etapa de una a cuatro células, así como la evaluación de la aparición o ausencia de un fenotipo en el pez cebra se conocen bien en la técnica, por ejemplo véase Rosen et al., ”Microinjection of zebrafish embryos to analyse gene function”,J Vis Exp.(25): 1115 (2009)). El fenotipo de posteriorización en el pez cebra incluye la posteriorización del neuroectodermo anterior durante la gastrulación, la pérdida del prosencéfalo y la pérdida de la estructura ocular en el pez cebra (van de Water et al.,”Ectopic Wnt signal determines the eyeless phenotype of zebrafish masterblind mutant”.Development128(20):3877-3888 (2001)).
La evaluación de la aparición o ausencia de duplicación del eje tras la inyección de un agente en un embrión deXenopusse conoce bien en la técnica, por ejemplo, véase Kühl et al., “Dorsal axis duplication as a functional readout for Wnt activity”Methods Mol Biol.469:467-476 (2008).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "agente" se refiere en líneas generales a cualquier sustancia, molécula o macromolécula química (por ejemplo, inorgánica u orgánica), bioquímica o biológica (por ejemplo, macromolécula biológica), una combinación o mezcla de las mismas, una muestra de composición indeterminada, o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos, tales como bacterias, hongos, plantas, o células o tejidos animales. Los "agentes" preferidos, aunque no limitantes, incluyen ácidos nucleicos, oligonucleótidos, ribozimas, péptidos, polipéptidos, proteínas, peptidomiméticos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, armazones de proteínas similares a anticuerpos, aptámeros, fotoaptámeros, espiegelómeros, sustancias químicas, preferiblemente moléculas orgánicas, más preferiblemente moléculas orgánicas pequeñas, lípidos, glúcidos, polisacáridos, etc., y cualquiera de sus combinaciones. En función del contexto, el término "agente" puede indicar un "medicamento" o "fármaco", útil o utilizado en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad.
El agente según la invención que se describe en la presente memoria es un polipéptido.
La capacidad de activar la señalización de Wnt se refiere a la capacidad del agente que se describe en la presente memoria para imitar, reproducir o aproximar el efecto de transducción de señales y/o la actividad de un ligando Wnt natural que se une a FZD y LRP, tal como a un complejo FZD/LRP.
La activación de la señalización de Wnt puede determinarse y/o cuantificarse adecuadamente midiendo la expresión de uno o más genes diana de Wnt, la expresión del gen indicador TCF, la estabilización de la p-catenina, la fosforilación de LRP y/o la translocación de Axin desde el citoplasma a la membrana celular, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, la activación de la señalización de Wnt puede determinarse y/o cuantificarse adecuadamente midiendo la expresión del gen TCF (por ejemplo, mediante RT-PCR o cualquier otro método de detección de transcritos), un resultado principal de la señalización de Wnt(Nature,1997, vol. 385(6619), 829-33). Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo indicador de TCF (también conocido como TOP/FOP o TOPflash) para evaluar los cambios en la transcripción de los genes controlados por TCF/LEF. El ensayo indicador de TCF puede ser un ensayo indicador con luciferasa. Además, por ejemplo, la activación de la señalización de Wnt se puede determinar y/o cuantificar adecuadamente midiendo la expresión de c-myc (He et al., 1998,Science,281(5382), 1509-12.), n-myc (Ten Berge et al., 2008,Development,135(19), 3247-57), L<e>F1 (Hovanes et al., 2001,Nat Genet,28(1), 53-7; Filali et al., 2002,J Biol Chem,277(36), 33398-410), o c-jun (Mann et al., 1999,Proc Natl Acad SciUSA, 96(4), 1603-8).
Como alternativa, la activación de la señalización de Wnt se puede determinar midiendo la ubicación, el nivel y/o el estado de fosforilación de la p-catenina. Un ejemplo no limitante de tal ensayo es el "ensayo de redistribución de la pcatenina" (Thermo Scientific) que proporciona células U20S recombinantes que expresan de manera estable la pcatenina humana fusionada al extremo carboxilo de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP). El ensayo permite la visualización y el seguimiento de la translocación de una proteína de fusión GFP-p-catenina desde la membrana al núcleo. Otra forma de determinar la activación de la señalización de Wnt es la visualización de la translocación de Axin, por ejemplo, con una proteína de fusión GFP-Axin.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria puede considerarse capaz de activar la señalización de Wnt (canónica) si el agente mejora la señalización de Wnt/p-catenina al menos 10 veces más, al menos 20 veces más, al menos 30 veces más, al menos 40 veces más, al menos 50 veces más, al menos 100 veces más, al menos 250 veces más, al menos 500 veces más, al menos 750 veces más, al menos 1000 veces más, al menos 1 x 104 veces más, o al menos 1 x 105 veces más en comparación con la línea de base o el ruido de fondo de la señalización de Wnt/p-catenina inducida por una sustancia neutra o un control negativo, por ejemplo, medido en un ensayo que se describe en otra parte de la presente memoria.
En realizaciones concretas, se puede considerar que el agente descrito en la presente memoria no activa la señalización de Wnt (canónica) si el agente mejora la señalización de Wnt/p-catenina menos de 10 veces más, tal como particularmente como mucho 5 veces más o como máximo 2,5 veces más, o si el agente no mejora o incluso reduce (p. ej., 2 veces menos, 5 veces menos o 10 veces menos) la señalización de Wnt/p-catenina en comparación con la señalización de Wnt/p-catenina inicial o de fondo inducida por una sustancia neutra o un control negativo, por ejemplo, medido en un ensayo que se describe en otra parte de la presente memoria.
En realizaciones concretas, se puede considerar que el agente que se describe en la presente memoria activa la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero no activa la de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, si la actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP inducida por dicho agente es al menos 3,5 veces más, al menos 5 veces más, al menos 10 veces más, al menos 15 veces más, al menos 20 veces más, al menos 25 veces más, al menos 50 veces más, al menos 100 veces más, al menos 500 veces más, al menos 1000 veces más, al menos 1 x 104 veces más, o al menos 1 x 105 veces más, preferiblemente al menos 50 veces más, que la actividad de señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP inducida por dicho agente, en ausencia de RECK y/o GPR124. Antes de comparar la actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP (denominada "actividad 1" en este párrafo) y la actividad de señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124 (denominada "actividad 2" en este párrafo), la actividad 1 y la actividad 2 inducidas por el agente pueden normalizarse por la actividad 1 y la actividad 2 inducidas por la Wnt7a de tipo silvestre, respectivamente, esta última, por ejemplo, configurada para representar el 100 % de actividad.
A modo de ejemplo, en un sistema de ensayo celularin vitrooin vivoque comprende 1) células que expresan GPR124, RECK, FZ y LRP y por separado 2) células que expresan FZ y LRP pero que no expresan GPR124 y/o RECK, en el que las células de 1) y 2) son por lo demás sustancialmente idénticas, el agente se considerará que activa la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, pero que no activa la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, cuando la actividad de señalización de Wnt inducida por la misma cantidad de dicho agente en condiciones sustancialmente idénticas es al menos 3,5 veces más, 5 veces más, al menos 10 veces más, al menos 15 veces más, al menos 20 veces más, al menos 25 veces más, al menos 50 veces más, al menos 100 veces más, al menos 500 veces más, al menos 1000 veces más, al menos 1 x 104 veces más, o al menos 1 x 105 veces más en las células en 1) que en las células en 2). Por ejemplo, las células indicadas en 1) y 2) pueden ser de la misma fuente celular primaria, o pueden ser de la misma línea celular, y pueden modificarse genéticamente para diferir en la expresión de GPR124 y/o RECK.
La activación de la vía de señalización de Wnt puede ocurrir promoviendo la estrecha asociación o proximidad mutua de los polipéptidos Frizzled y LRP en la membrana celular, formando así heterooligómeros asociados a la membrana que comprenden los polipéptidos Frizzled y LRP. Tras la formación impulsada por ligando del heterooligómero Frizzled-LRP, la porción intracelular del polipéptido LRP se vuelve accesible a la fosforilación, por ejemplo, por CK1 y GSK-3, lo que aumenta en gran medida su afinidad por Axin. En segundo lugar, cuando está presente en un heterooligómero con el polipéptido LRP, la porción intracelular del polipéptido Frizzled es capaz de inducir la fosforilación y el reclutamiento de DVL. El ensamblaje resultante de un complejo LRP-FZD-DVL-Axina activado conduce indirectamente a la disociación del complejo de destrucción de la p-catenina, permitiendo así que la pcatenina se acumule en el citoplasma y se transloque al núcleo celular donde la p-catenina puede inducir la transcripción génica.
Por consiguiente, en realizaciones concretas, el agente que se describe en la presente memoria es capaz de inducir la heteromerización (tal como, preferiblemente, heterodimerización) de los polipéptidos Frizzled y LRP en una membrana celular en presencia de RECK y GPR124, pero no en ausencia de RECK y/ o GPR124.
Para lograr la heteromerización o asociación estrecha de los polipéptidos Frizzled y LRP en la membrana celular, se puede utilizar un agente que sea capaz de unirse simultáneamente tanto al polipéptido Frizzled como al LRP, por ejemplo al unirse a las porciones extracelulares tanto del polipéptido Frizzled como del LRP.
La heteromerización de los polipéptidos Frizzled y LRP en la membrana celular se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica para determinar la heteromerización de las proteínas de membrana, tal como visualizar la heteromerización de las proteínas de membrana marcadas fluorescentemente mediante tinción de inmunofluorescencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) o determinar la aparición de eventos posteriores de heteromerización de los polipéptidos Frizzled y LRP, tales como detectar la presencia y fosforilación de Dvl.
Por consiguiente, en realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse simultáneamente a los polipéptidos Frizzled y LRP en una membrana celular, en presencia de RECK y GPR124, pero no en ausencia de ReCk y/o GPR124.
Los términos "unir", "interaccionar", "unir específicamente" o "interaccionar específicamente", tal como se usan en esta especificación, significan que un agente se une o influye sustancialmente en una o más moléculas o analitos deseados con la exclusión de otras moléculas que son aleatorias o no relacionadas, y, opcionalmente, sustancialmente con la exclusión de otras moléculas que están estructuralmente relacionadas. Los términos no requieren necesariamente que un agente se fije exclusivamente con su una o varias dianas previstas. Por ejemplo, se puede decir que un agente se une específicamente a una o varias dianas de interés si su afinidad por dichas dianas previstas en las condiciones de unión es al menos aproximadamente 2 veces mayor, preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces mayor, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces mayor, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 25 veces mayor, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces mayor, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces o más grande, tal como, por ejemplo, al menos aproximadamente 1000 veces o más, al menos aproximadamente 1 x 104 veces o más, o al menos aproximadamente 1 x 105 veces o mayor que su afinidad por una molécula no diana.
La unión o interacción entre el agente y sus dianas previstas puede ser covalente (es decir, mediada por uno o más enlaces químicos que implican el intercambio de pares de electrones entre átomos) o, más típicamente, no covalente (es decir, mediada por fuerzas no covalentes, como por ejemplo puentes de hidrógeno, interacciones dipolares, interacciones de Van der Waals y similares). Preferiblemente, el agente puede unirse o interaccionar con su una o varias dianas previstas con una constante de afinidad (K<a>) de dicha unión K<a>s 1 x 106 M-1, más preferiblemente K<a>s 1 x 107 M-1, aún más preferiblemente K<a>s 1 x 108 M-1, incluso más preferiblemente K<a>s 1 x 109 M-1, y aún más preferiblemente K<a>s 1 x 1010 M-1 o K<a>s 1 x 1011 M-1, en donde K<a>= [A_T]/[A][T], A indica el agente, y T indica la diana prevista. La determinación de K<a>se puede llevar a cabo mediante métodos que se conocen en la técnica, tales como, por ejemplo, usando diálisis de equilibrio y análisis con el diagrama de Scatchard.
La unión de un agente que se describe en la presente memoria a una diana y la afinidad y especificidad de dicha unión se pueden determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Los ejemplos no limitantes de los mismos incluyen coinmunoprecipitación, complementación de fluorescencia bimolecular, electroforesis de afinidad, transferencia de etiquetas, presentación en fagos, ensayo de ligación en proximidad (PLA), purificación por afinidad en tándem (TAP), acoplamientoin silicoy cálculo de la energía de unión de Gibbs predicha y ensayos de unión competente.
En realizaciones concretas, el agente que se describe en la presente memoria es capaz de unirse a uno o más polipéptidos Frizzled diferentes, tales como uno o más polipéptidos Frizzled seleccionados del grupo que consiste en Fzd1, Fzd2, Fzd3, Fzd4, Fzd5, Fzd6, Fzd7, Fzd8, Fzd9 y Fzd10. Preferiblemente, el agente que se describe en la presente memoria puede ser capaz de unirse específicamente a al menos Fzd4, y opcionalmente a uno o más Fzd diferentes; o puede ser capaz de unirse específicamente a Fzd4 sustancialmente con exclusión de otros Fzd. Se cree que Fzd4 es el miembro dominante de la familia Fzd en las células endoteliales del sistema nervioso central. Más preferiblemente, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse específicamente al Fzd4 humano. El agente como el descrito en la presente memoria puede ser selectivo para uno o más polipéptidos Frizzled preferidos, por ejemplo teniendo una especificidad por uno o más polipéptidos Frizzled preferidos de al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, al menos 1 x 104- veces, o al menos 1 x 105 veces, en comparación con otros polipéptidos Frizzled no preferidos.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse a uno o más polipéptidos LRP diferentes implicados en la señalización de Wnt. Preferiblemente, el agente que se describe en la presente memoria es capaz de unirse a LRP5 y/o LRP6, por ejemplo, a uno cualquiera o cada uno de LRP5 y LRP6. Más preferiblemente, el agente que se describe en la presente memoria es capaz de unirse a LRP5 y/o LRP6 humanos, por ejemplo, a uno cualquiera o cada uno de LRP5 humano y LRP6 humano. El agente que se describe en la presente memoria puede ser selectivo para uno o más polipéptidos LRP preferidos, por ejemplo, teniendo una especificidad por uno o más polipéptidos LRP preferidos de al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, al menos 1 x 104 veces, o al menos 1 x 105 veces, en comparación con otros polipéptidos LRP no preferidos.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al polipéptido GPR124 y/o RECK.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse simultáneamente a los polipéptidos Frizzled y LRP, y además al polipéptido GPR124 y/o RECK.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al polipéptido RECK.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse simultáneamente a los polipéptidos Frizzled, LRP y RECK.
El RECK está compuesto por cinco motivos o regiones de nudos de cisteínas (CK) en el extremo amino (es decir, CK1, CK2, CK3, CK4 y CK5), un dominio rico en cisteínas (CRD) y tres motivos de Kazal que preceden a un sitio de anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI). Los motivos CK, los CRD y los motivos de Kazal se encuentran fuera de la célula. Por consiguiente, el agente capaz de unirse al polipéptido RECK como se describe en la presente memoria puede unirse al motivo CK1, al motivo CK2, al motivo CK3, al motivo CK4, al motivo CK5, al CRD y/o a uno o más de los motivos de Kazal del polipéptido RECK.
Los presentes inventores encontraron que, especialmente, la unión del agente capaz de unirse al polipéptido RECK que se describe en la presente memoria a las regiones CK4 y/o CK5 del polipéptido RECK parece importante para confirmar la activación de la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP.
Por consiguiente, en realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse a las regiones CK4 y/o CK5 del polipéptido RECK.
El motivo CK4 abarca desde el aminoácido C216 al C263, y el motivo CK5 abarca desde el aminoácido C292 al C338 de la secuencia de aminoácidos de la proteína RECK humana anotada en el NCBI con el número de acceso de Genbank NP_066934.1, que se describe en otra parte de la presente memoria. Por consiguiente, el motivo CK4 del RECK humano comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos CCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQC (SEQ ID No: 5) y el motivo CK5 de RECK humano comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos CCSKANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTC (SEQ ID No: 6).
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 5 y/o a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 6.
El receptor Frizzled es una proteína receptora acoplada a proteínas G y su longitud varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 700 aminoácidos. Se predice que el extremo amino será extracelular y comprende un dominio rico en cisteínas (CRD) de aproximadamente 120 aminoácidos seguido de una región conectora hidrófila de aproximadamente 40-100 aminoácidos. El receptor Frizzled también comprende siete dominios hidrófobos que se predice que formen hélices a transmembranarias. El dominio del extremo carboxilo es intracelular y tiene una longitud variable y, aunque en general el dominio intracelular no está bien conservado entre diferentes miembros de la familia, comprende un motivo aminoacídico KTXXXW proximal (SEQ ID No: 7), en el que X puede ser cualquier aminoácido, que está muy conservado en los polipéptidos Frizzled y que es necesario para la señalización canónica de Wnt.
El dominio CRD de Frizzled comprende un motivo de 10 cisteínas espaciadas invariablemente y está conservado en gran medida entre los miembros conocidos de la familia Frizzled, pero también en varias otras proteínas, tales como RECK, proteínas secretadas relacionadas con Frizzled (SFRP), receptores con actividad tirosina cinasa (RTK) y colágenoa1XVIII. El dominio CRD es importante para la unión del ligando (por ejemplo, Wnt) al polipéptido Frizzled, por ejemplo, mediante el reconocimiento y/o la unión de grupos acilo grasos c/'s-insaturados presentes en el sitio de contacto del ligando 1 o los restos localizados en el sitio “índice” 2 de contacto del ligando Wnt.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al dominio rico en cisteínas (CRD) del polipéptido Frizzled. En ciertas realizaciones, el agente que se describe en la presente memoria es capaz de unirse al dominio de unión al grupo acilo graso insaturado encisubicado dentro del dominio CRD del polipéptido Frizzled o al sitio "índice" de contacto dentro del CRD.
El dominio extracelular en el extremo amino de LRP está compuesto por cuatro dominios repetidos (o dominios de tipo propulsor p) YWTD (SEQ ID No: 8), cuatro dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un dominio similar a LDLR (LDLRLD). Un único dominio de repeticiones YWTD comprende seis secuencias YWTD en tándem. Se predice que los dos primeros dominios de repeticiones YWPD más al extremo amino se unirán a ligandos Wnt, y se predice que los dos segundos conjuntos de dominios de repeticiones YWPD se unirán a Dickkopf (DKK). El dominio extracelular en el extremo amino está seguido por un único segmento que atraviesa la membrana y una cola citoplasmática que alberga entre uno y tres motivos NPXY (SEQ ID No: 9), en donde X puede ser cualquier aminoácido (por ejemplo, en LRP1, LRP2, LRP4, APOER2, LDLR, LRP9), o entre uno y cinco motivos PPPSP (SEQ ID No: 10) (por ejemplo, en LRP5 y LRP6).
El término "Dickkopf" o "DKK" abarca todos y cada uno de los miembros de la familia DKK, tales como, entre otros, las proteínas DKK humanas conocidas que incluyen DKK1 (Proteína RefSeq: NP_036374.1; Gene ID: 22943), DKK2 (Proteína RefSeq: NP_055236. 1; Gene ID: 27123), DKK3 (Proteína RefSeq: NP_001317149.1; Gene ID: 27122) y DKK4 (Proteína RefSeq: NP_055235.1; Gene ID: 27121). En determinadas realizaciones, los términos pueden indicar particularmente DKK1.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al dominio extracelular del polipéptido LRP.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al sitio de unión a DKK del polipéptido LRP. En realizaciones más concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al sitio de unión a DKK1 del polipéptido LRP5 y/o LRP6.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al sitio de unión de Wnt del polipéptido LRP. En realizaciones más concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al sitio de unión de Wnt del polipéptido LRP5 y/o LRP6.
En realizaciones concretas adicionales, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse al sitio de unión a DKK y al sitio de unión a Wnt del polipéptido LRP.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es capaz de unirse a los dominios 1 y 2 de tipo propulsor p similares al EGF (P1E1P2E2) y/o a los dominios 3 y 4 de tipo propulsor p similares al EGF (P3E3P4E4) del polipéptido LRP.
En realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria comprende un dominio de unión a RECK y un dominio de unión a Frizzled, y opcionalmente un dominio de unión a LRP. En realizaciones más concretas, el agente descrito en la presente memoria comprende un dominio de unión a RECK, un dominio de unión a Frizzled y un dominio de unión a LRP.
El dominio de unión a RECK procede de un polipéptido Wnt7a como se describe en otra parte de la presente memoria, más preferiblemente de un polipéptido Wnt7 humano o murino, incluso más preferiblemente de un polipéptido Wnt7a humano. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el dominio de unión a RECK puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un fragmento de unión a RECK de Wnt7a, preferiblemente de Wnt7a humano o de ratón, más preferiblemente de Wnt7a humano o una variante del mismo. En un ejemplo adicional, en ciertas realizaciones, el dominio de unión a RECK puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos al menos el 95 %, o al menos el 99 %, preferiblemente el 100 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT (SEQ ID No: 18) o VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET (SEQ ID No: 19).
El término "Wnt", "ligando Wnt" o "polipéptido Wnt" abarca todos y cada uno de los miembros de la familia Wnt. A modo de orientación adicional, en la tabla 2 se presentan los 19 miembros conocidos de la familia Wnt humana, según lo anotado en el Genbank del NCBI y Uniprot.
Tabla 2
En ciertas realizaciones, el polipéptido Wnt tal como se emplea en la presente memoria es de origen animal, preferiblemente de un animal de sangre caliente, más preferiblemente de origen vertebrado, aún más preferiblemente de origen mamífero, que incluye origen humano y origen de mamífero no humano, aún más preferiblemente de origen humano.
El dominio de unión a Frizzled del agente que se describe en la presente memoria puede ser cualquier dominio que sea capaz de unirse a uno o más polipéptidos Frizzled. El dominio de unión a Frizzled del agente que se describe en la presente memoria procede de un polipéptido Wnt7a que se describe en otra parte de la presente memoria, más preferiblemente de un polipéptido Wnt7a humano.
La región de unión Frizzled de un polipéptido Wnt se puede determinar modelizando una estructura tridimensional del polipéptido Wnt basada en el análisis cristalográfico de Wnt8a deXenopus(C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. García,Science.337, 59-64 (2012)).
Se demostró que XWnt8 se une Frizzled en dos sitios discontinuos. Uno se llama pulgar (sitio 1) y el otro índice (sitio 2). Los restos críticos del pulgar de XWnt8 parecen ser K182, I186, S187, G188 y W196. S187 alberga un ácido palmitoleico que es fundamental para la unión en el sitio 1. Los contactos del sitio 2 parecen estar dominados por F317, W319, C321, T322 y V323. Además, XWnt8 podría formar multímeros Wnt/Fz de orden superior a través del pseudositio 3 compuesto por: P34, Y37, L38, S41, A42, A45, V46, T70, L71, A74, F147, G150, L151 y T153. Parece que los restos de aminoácidos críticos en el sitio 1 (especialmente K182, S187, G188 y W196) y el sitio 2 (especialmente W319, C321 y V323) están muy conservados entre los diferentes polipéptidos Wnt, mientras que los restos del pseudositio 3 presentan más divergencias. En vista de esto, el experto entenderá que la región de unión a Frizzled de un polipéptido Wnt se puede determinar usando el alineamiento de secuencias con XWnt8.
En realizaciones concretas, el dominio de unión a Frizzled del agente que se describe en la presente memoria comprende, consiste esencialmente en o consiste en el "pulgar" (sitio 1) de un ligando Wnt, preferiblemente el dominio de unión a Frizzled comprende una secuencia de aminoácidos XKXXXXSGXXXXXXXW (SeQ ID No: 11), en donde X puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente en donde dicha secuencia de aminoácidos muestra al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 99 %, preferiblemente el 100 %, de identidad de secuencia con CKCHGVSGSCTTKTCW (SEQ ID No: 12).
En realizaciones preferidas, la serina en la posición de aminoácido 7 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 está unida a un resto de ácido graso, preferiblemente en donde dicha serina en la posición de aminoácido 7 de SEQ ID No: 11 o SEQ ID No: 12 está palmitoilado.
En realizaciones preferidas, el dominio de unión a Frizzled del agente que se describe en la presente memoria no comprende el "índice" (sitio 2) de un ligando Wnt. Más en particular, el dominio de unión a Frizzled del agente que se describe en la presente memoria preferiblemente no comprende una secuencia de aminoácidos WXCXV (SEQ ID NO: 13), en la que X puede ser cualquier aminoácido.
El dominio de unión a LRP del agente descrito en la presente memoria puede ser cualquier dominio que sea capaz de unirse a uno o más polipéptidos LRP. El dominio de unión a LRP del agente descrito en la presente memoria procede de un polipéptido Wnt7a, más preferiblemente de un polipéptido Wnt7a humano o una variante del mismo.
Sin limitarse a ningún mecanismo o teoría, la afinidad del dominio de unión a Frizzled y del dominio de unión a LRP que tiene el agente puede ser colectivamente lo suficientemente alta como para activar la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP (es decir, cuando se une el agente a RECK, de RECK a GPR124 y de GPR124 a Frizzled a través de la red DVL, garantiza la proximidad o presentación del agente y más en particular su dominio de unión LRP a LRP), pero en conjunto lo suficientemente bajo para evitar la activación (por ejemplo, falta de activación o como máximo una activación mínima, tal como un grado o cierta activación fisiológicamente intrascendente) de la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124.
En realizaciones concretas, el agente que se describe en la presente memoria comprende un dominio de unión a RECK, un dominio de unión a Frizzled y un dominio de unión a LRP, en donde dicho dominio de unión a RECK, dicho dominio de unión a Frizzled y dicho dominio de unión a LRP proceden de un polipéptido Wnt7a, preferiblemente el polipéptido Wnt7a humano.
A modo de ejemplo, el genWNT7Ahumano está anotado en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el Gene ID 7476 del Genbank. El ARNmWNT7Ahumano (variante de transcripción 1) está anotado en el NCBI con el número de acceso de Genbank NM_004625.3. Los nucleótidos 306 (codón de inicio) a 1355 (codón de parada) de NM_004625.3 constituyen la secuencia codificante deWNT7A.La secuencia de la proteína WNT7A humana está anotada en el NCBI con el número de acceso de Genbank NP_004616.2 y el número de acceso de Uniprot 000755.2, y se reproduce a continuación (SEQ ID No: 15):
> NP_004616.2 precursor de la proteína Wnt-7a[Homo sapiens]
MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVALGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIG
EGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAAC
TQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMN
LHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEP
VRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQ
ASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK.
A modo de ejemplo, la forma madura de la proteína Wnt7a humana (que no comprende el péptido señal) comprende una secuencia de aminoácidos como se reproduce adicionalmente a continuación (SEQ ID No: 51):
A modo de ejemplo, el genWNT7Bhumano está anotado en el NCBI como Gene ID 7477 en el Genbank. El ARNm deWNT7Bhumano (variante de transcripción 1) está anotado en el NCBI con el número de acceso de Genbank NM_058238.2. Los nucleótidos 375 (codón de inicio) a 1424 (codón de parada) de NM_058238.2 constituyen la secuencia codificante deWNT7B.La secuencia de la proteína WNT7B humana está anotada en el NCBI con el número de acceso de Genbank NP_478679.1 y el número de acceso de Uniprot P56706.2, y se reproduce a continuación (SEQ ID No: 16):
> NP_478679.1 precursor de la proteína Wnt-7b[Homo sapiens]
Dicho dominio de unión a RECK procede de un polipéptido Wnt7a, y el dominio de unión a Frizzled y el dominio de unión a LRP proceden de un polipéptido Wnt7a.
Los presentes inventores han demostrado que ciertas variantes del polipéptido Wnt7a humano o murino son tan efectivas o más efectivas a la hora de activar la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mientras que no activan la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, en comparación con el polipéptido Wnt7a humano o murino de tipo silvestre, respectivamente.
Por consiguiente, en realizaciones concretas, el agente descrito en la presente memoria es una variante de un polipéptido Wnt7a.
Según la invención, en tal variante del polipéptido Wnt7a,
• el resto de glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 17 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
• el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 20 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
• el resto de prolina (P) en la posición correspondiente a la posición 25 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
• el resto de alanina (A) en la posición correspondiente a la posición 27 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de arginina (R); o
• el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 28 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
• el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 33 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
• el resto de metionina (M) en la posición correspondiente a la posición 37 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de leucina (L) en la posición correspondiente a la posición 39 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 41 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de fenilalanina (F) en la posición correspondiente a la posición 44 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 50 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de asparagina (N) en la posición correspondiente a la posición 52 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de glutamina (Q); o
el resto de valina (V) en la posición correspondiente a la posición 68 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 129 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de fenilalanina (F) en la posición correspondiente a la posición 131 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 133 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de fenilalanina (F) en la posición correspondiente a la posición 135 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 141 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 146 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 158 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 159 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A), serina (S) o leucina (L); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 181 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 191 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 198 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 200 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de valina (V) en la posición correspondiente a la posición 205 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 208 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 214 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 216 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de prolina (P) en la posición correspondiente a la posición 218 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 222 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 223 en la SEQ ID No: 24 o la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de tirosina (Y) en la posición correspondiente a la posición 229 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de prolina (P) en la posición correspondiente a la posición 232 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de treonina (T) en la posición correspondiente a la posición 235 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 248 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 289 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de triptófano (W) en la posición correspondiente a la posición 291 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de treonina (T) en la posición correspondiente a la posición 307 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 318 en la SEQ ID No: 51 se sustituye por un resto de alanina (A).
En concreto, el agente que se describe en la presente memoria comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos como se presenta en las SEQ ID n.os 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 o 121, preferiblemente las SEQ ID n os 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 47, 48, 49, 53, 54, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 118, 119 o 121, más preferiblemente las SEQ ID n.os 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 47, 48, 49, 53, 54, 68, 69, 70, 71,72, 74, 76, 80, 81 u 83 (figura 8).
En realizaciones concretas, la variante del polipéptido Wnt7 tiene al menos el 35 %, preferiblemente al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % al menos el 99 %, preferiblemente el 100 %, de la actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP del polipéptido Wnt7 completo de tipo silvestre. En realizaciones preferidas, la variante del polipéptido Wnt7 tiene al menos el 70 % de la actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP del polipéptido Wnt7 completo de tipo silvestre. En realizaciones concretas, la variante del polipéptido Wnt7 tiene una actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP que es mayor (por ejemplo, 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces o 2 veces mayor o incluso mayor) que la actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP del polipéptido Wnt7 completo de tipo silvestre.
Un aspecto adicional se refiere a un ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, en el que el agente es un polipéptido.
Por "codificar" se entiende que una secuencia de ácido nucleico o una o varias partes de la misma corresponde, en virtud del código genético de un organismo en cuestión, a una secuencia de aminoácidos en concreto, p. ej., la secuencia de aminoácidos de una o más proteínas o polipéptidos deseados, o a otra secuencia de ácido nucleico en una relación de producto de transcripción en función de la plantilla (p. ej. ARN o análogo de ARN).
Para permitir la expresión del ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, en donde el agente es una proteína, polipéptido o un péptido, el ácido nucleico puede insertarse en un casete y/o vector de expresión de ácido nucleico, como se conoce bien en la técnica.
Por consiguiente, un aspecto adicional se refiere a un casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, unido operativamente a un promotor y/o señales reguladoras transcripcionales y traduccionales.
El término "casetes de expresión de ácido nucleico", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de ácido nucleico, típicamente ADN, en las que se pueden insertar fragmentos de ácido nucleico, preferiblemente la molécula de ácido nucleico recombinante que se define en la presente memoria, para ser expresados, en donde dichas moléculas de ácido nucleico comprenden una o más secuencias de ácido nucleico que controlan la expresión de los fragmentos de ácido nucleico. Los ejemplos no limitantes de tales secuencias de ácido nucleico que controlan la expresión de los fragmentos de ácido nucleico incluyen secuencias promotoras, marcos abiertos de lectura y terminadores de la transcripción. Preferiblemente, el casete de expresión de ácido nucleico puede comprender uno o más marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican dichas una o más proteínas, polipéptidos o péptidos. Un "marco abierto de lectura " u "ORF" se refiere a una sucesión de tripletes de nucleótidos codificantes (codones) que comienzan con un codón de inicio de la traducción y terminan con un codón de terminación de la traducción conocido de por sí, y no contiene ningún codón interno de terminación de la traducción en fase, y es potencialmente capaz de codificar una proteína, polipéptido o péptido. Por tanto, el término puede ser sinónimo de "secuencia codificante" tal como se utiliza en la técnica.
Una "conexión operable" es una conexión en la que las secuencias reguladoras y las secuencias que se desea expresar están conectadas de tal manera que permitan dicha expresión. Por ejemplo, secuencias como, p. ej., un promotor y un ORF, se puede decir que están operativamente unidos si la naturaleza de la conexión entre dichas secuencias no: (1) da como resultado la introducción de una mutación por cambio de fase, (2) interfiere con la capacidad del promotor para dirigir la transcripción del ORF, (3) interfiere con la capacidad del ORF para ser transcrito desde la secuencia del promotor. Por lo tanto, "unido operativamente" puede significar incorporado en una construcción genética de modo que las secuencias de control de la expresión, tales como un promotor, controlen eficazmente la transcripción/expresión de una secuencia de interés.
La naturaleza precisa de las secuencias o elementos reguladores transcripcionales y traduccionales necesarios para la expresión puede variar entre entornos de expresión, pero normalmente incluyen un terminador de la transcripción y, opcionalmente, un potenciador.
La referencia a un "promotor" debe tomarse en su contexto más amplio e incluye secuencias reguladoras de la transcripción necesarias para un inicio de transcripción preciso y, cuando corresponda, un control espacial y/o temporal preciso de la expresión génica o su respuesta a, p. ej., estímulos internos o externos (p. ej., exógenos). Más en particular, "promotor" puede representar una región en una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ADN, a la que se une una ARN polimerasa e inicia la transcripción. Preferiblemente, pero no necesariamente, un promotor está colocado por delante, es decir, en 5', de la secuencia cuya transcripción controla. Normalmente, en los procariotas, una región promotora puede contener tanto el promotor de por sí y secuencias que, cuando se transcriben en ARN, señalarán el inicio de la síntesis de proteínas (p. ej., secuencia de Shine-Dalgarno). Una secuencia promotora también puede incluir "regiones potenciadoras", que son una o más regiones de ADN a las que pueden unirse proteínas (es decir, los factores que actúan entrans)para estimular los niveles de transcripción de los genes en un agrupamiento de genes. El potenciador, aunque normalmente se encuentra en el extremo 5' de una región codificante, también puede estar separado de una secuencia promotora, por ejemplo, puede estar dentro de una región intrónica de un gen o en 3' con respecto a la región codificante del gen.
En realizaciones, los promotores contemplados en la presente memoria pueden ser constitutivos o inducibles. Se entiende por promotor constitutivo un promotor cuya expresión es constante en las condiciones de cultivo estándar. Los promotores inducibles son promotores que responden a una o más señales de inducción. Por ejemplo, un promotor inducible puede estar regulado químicamente (por ejemplo, un promotor cuya actividad transcripcional está regulada por la presencia o ausencia de un agente inductor químico, tal como un alcohol, tetraciclina, un esteroide, un metal u otra molécula pequeña) o regulado físicamente (por ejemplo, un promotor cuya actividad transcripcional está regulada por la presencia o ausencia de un inductor físico tal como luz o temperaturas altas o bajas). Un promotor inducible también puede estar regulado indirectamente por uno o más factores de transcripción que a su vez están regulados directamente por señales químicas o físicas. Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen T7, U6, H1, el promotor de la LTR del retrovirus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor de SV40, el promotor de la dihidrofolato reductasa, el promotor de la p-actina, el promotor de la fosfoglicerol cinasa (PGK) y el promotor del EF1 a.
Los términos "terminador" o "terminador de la transcripción" se refieren en general a un elemento de secuencia al final de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Por ejemplo, normalmente se coloca un terminador detrás de, es decir, en 3', de los ORFs que codifican un polipéptido de interés. Por ejemplo, cuando un ácido nucleico recombinante contiene dos o más ORF, p. ej., ordenados sucesivamente y formando juntos una unidad de transcripción multicistrónica, se puede colocar ventajosamente un terminador de transcripción en 3' con respecto al último ORF.
En realizaciones concretas, el casete de expresión de ácido nucleico comprende el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria unido operativamente a uno o más promotores, potenciadores, ORF y/o terminadores de la transcripción.
Un aspecto adicional se refiere al vector que comprende el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, o el casete de expresión de ácido nucleico que se describe en la presente memoria, tal como un vector vírico.
Los términos "vector de expresión" o "vector", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a moléculas de ácido nucleico, típicamente ADN, en las que se pueden insertar y clonar, es decir, propagar, fragmentos de ácido nucleico, preferiblemente la molécula de ácido nucleico recombinante que se define en la presente memoria. Por lo tanto, un vector contendrá típicamente uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicarse de forma autónoma en una célula u organismo vehículo definido de manera que la secuencia clonada sea reproducible. Un vector también puede contener preferiblemente un marcador de selección, tal como, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos, para permitir la selección de células receptoras que contienen el vector. Los vectores pueden incluir, sin limitación, plásmidos, fagémidos, bacteriófagos, vectores derivados de bacteriófagos, PAC, BAC, ácidos nucleicos lineales, por ejemplo, ADN lineal, transposones, vectores víricos, etc., según corresponda (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel 1992). Los vectores víricos pueden incluir, entre otros, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos o vectores dependovíricos, por ejemplo, vectores basados en VIH, SV40, EBV, HSV o BPV. Los vectores de expresión generalmente están configurados para permitir y/o efectuar la expresión de ácidos nucleicos o marcos de lectura abiertos introducidos en los mismos en un sistema de expresión deseado, por ejemplo,in vitro,en una célula, órgano y/u organismo. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden comprender ventajosamente secuencias reguladoras adecuadas.
Los factores relevantes en la selección de un vector concreto incluyen, entre otros: elección de la célula receptora, facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector pueden reconocerse y seleccionarse entre las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector deseadas en determinadas células receptoras; si se desea que el vector se integre en el cromosoma o permanezca extracromosómico en las células receptoras; y si es deseable poder "transferir" el vector entre células receptoras de diferentes especies.
Los vectores de expresión pueden ser autónomos o integrativos. Un ácido nucleico puede introducirse en una célula en forma de un vector de expresión tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido o partícula de virus. El ácido nucleico recombinante puede mantenerse extracromosómicamente o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. Los vectores de expresión pueden contener genes marcadores de selección que codifican proteínas necesarias para la viabilidad celular en las condiciones seleccionadas (por ejemplo,URA3,que codifica una enzima necesaria para la biosíntesis del uracilo, oLEU2,que codifica una enzima necesaria para la biosíntesis de la leucina, oTRP1,que codifica una enzima necesaria para la biosíntesis del triptófano) para permitir la detección y/o selección de las células transformadas con los ácidos nucleicos deseados. Los vectores de expresión también pueden incluir una secuencia de replicación autónoma (ARS). La ARS puede comprender un centrómero (CEN) y un origen de replicación (ORI). Por ejemplo, la ARS puede ser ARS18 o ARS68.
Los vectores integrativos generalmente incluyen una secuencia dispuesta en serie de al menos un primer fragmento de ADN insertable, un gen marcador seleccionable y un segundo fragmento de ADN insertable. El primer y segundo fragmentos de ADN insertables tienen cada uno aproximadamente 200 (por ejemplo, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500 o aproximadamente 1000 o más) nucleótidos de longitud y tienen secuencias de nucleótidos que son homólogas a porciones del ADN genómico de la especie celular a transformar. En este vector se inserta entre el primer y el segundo fragmentos de ADN insertables una secuencia de nucleótidos que contiene un ácido nucleico de interés para la expresión, ya sea antes o después del gen marcador. Los vectores integrativos pueden linealizarse antes de la transformación para facilitar la integración de la secuencia de los nucleótidos de interés en el genoma de la célula.
Antes de introducir los vectores en una célula de interés, los vectores pueden cultivarse (por ejemplo, amplificarse) en células bacterianas tales comoEscherichia coli (E. coli).El ADN del vector puede aislarse de las células bacterianas mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, que dan como resultado la purificación del ADN del vector a partir del medio bacteriano. El ADN del vector purificado se puede extraer a fondo con fenol, cloroformo y éter, para garantizar que ninguna proteína de E.coliesté presente en la preparación del ADN plasmídico, ya que estas proteínas pueden ser tóxicas para las células de mamíferos.
Como se indica en otra parte, un agente puede comprender una proteína, polipéptido o péptido. Estos pueden obtenerse adecuadamente mediante la expresión por células hospedadoras u organismos hospedadores, transformados con una construcción de expresión que codifica, y está configurada para ello, la expresión de dicha proteína, polipéptido o péptido en dichas células hospedadoras u organismos hospedadores, seguido de la purificación de la proteína, polipéptido o péptido.
Dicho polipéptido puede aislarse adecuadamente. El término "aislado" con referencia a un componente concreto (tal como por ejemplo un ácido nucleico, proteína, polipéptido o péptido) generalmente denota que dicho componente existe separado de —por ejemplo, se ha separado de o se ha preparado y/o mantenido separado de— uno o más componentes de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína o complejo humano o animal aislado puede existir separado de un cuerpo humano o animal donde se produce de forma natural. El término "aislado", tal como se utiliza en la presente memoria, también puede abarcar preferiblemente el calificativo "purificado". Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "purificado" con referencia a péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos no requiere ninguna pureza absoluta. En cambio, indica que dichos péptidos, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos se encuentran en un entorno bien definido concreto en el que su abundancia (convenientemente expresada en términos de masa, peso o concentración) en relación con otros analitos es mayor que en la composición o muestra inicial. Un entorno bien definido denota un medio único, tal como por ejemplo una única solución, gel, precipitado, liofilizado, etc. Los ácidos nucleicos, proteínas, polipéptidos o péptidos purificados pueden obtenerse mediante métodos conocidos que incluyen, por ejemplo, síntesis de laboratorio o recombinante, cromatografía, electroforesis preparativa, centrifugación, precipitación, purificación por afinidad, etc. Los péptidos, polipéptidos o proteínas purificados pueden constituir preferiblemente en peso > 10 %, más preferiblemente > 50 %, tal como > 60 %, aún más preferiblemente > 70 %, tal como > 80 %, y aún más preferiblemente > 90 %, tal como > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 % o incluso el 100 %, del contenido de proteínas de cada entorno bien definido. El contenido de proteínas puede determinarse, por ejemplo, mediante el método de Lowry (Lowry et al. 1951.J. Biol Chem.193: 265), opcionalmente como se describe en Hartree 1972(Anal Biochem48: 422-427). La pureza de péptidos, polipéptidos o proteínas se puede determinar mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, la tinción con plata. La cantidad de ácidos nucleicos puede determinarse midiendo la absorbancia a 260 nm (A260). La pureza de los ácidos nucleicos puede determinarse midiendo la relación de absorbancias A260/A280, o mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida y tinción con bromuro de etidio o similar.
En realizaciones concretas, el vector que comprende el ácido nucleico que se describe en la presente memoria es un vector vírico, preferiblemente un vector vírico dirigido específicamente hacia el sistema nervioso central y/o periférico (por ejemplo, un vector vírico específico del cerebro). En realizaciones concretas adicionales, el vector vírico es un mutante del serotipo 9 del virus adenoasociado (AAV9) específico de neuronas del sistema nervioso central (SNC). Por ejemplo, el vector vírico es el vector vírico AAV-PHP.B o AAV-PHP.eB específico de células del SNC que presenta el péptido SAQTLAVPFKA (SEQ ID No: 55) o SDGTLAVPFKA (SEQ ID No: 56) como se describe en Deverman et al. (Deverman et al.,NatBiotechnol,34:204-209 (2016) y Chan et al. (Chan et al.,NatNeurosci,20(8): 1172-1179 (2017)).
En realizaciones preferidas, el vector vírico es un vector vírico específico de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica. En realizaciones preferidas adicionales, el vector vírico es un mutante del serotipo 2 del virus adenoasociado (AAV2) con cápsida específico de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, el vector vírico es el vector vírico AAV-BR1 específico de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica que muestra el péptido NRGTEWD (SEQ ID NO: 57) como se describe en Korbelin et al. (Korbelin et al.,EMBO Molecular Medicine,8, 609-625 (2016)).
Un aspecto adicional se refiere a una composición farmacéutica que comprende el agente que se describe en la presente memoria, el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, el casete de expresión de ácido nucleico que se describe en la presente memoria o el vector que se describe en la presente memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones o composiciones farmacéuticas pueden estar comprendidas en un kit de partes.
El término "farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en la presente memoria, es coherente con la técnica y significa compatible con los otros ingredientes de una composición farmacéutica y no perjudicial para el receptor de la misma.
Tal como se usa en la presente memoria, "vehículo" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, diluyentes, tampones (tales como, por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), solubilizantes, coloides, medios de dispersión, vehículos, cargas, quelantes (tales como como, por ejemplo, EDTA o glutatión), aminoácidos (como, por ejemplo, glicina), proteínas, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes, aromatizantes, espesantes, agentes para lograr un efecto de liberación prolongada, recubrimientos, antimicóticos, conservantes, antioxidantes, controladores de la tonicidad, retardantes de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la sustancia activa, se puede contemplar su uso en las composiciones terapéuticas.
Los vehículos ilustrativos y no limitantes para usar en la formulación de las composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, composiciones acuosas con o sin inclusión de codisolventes orgánicos adecuados para el uso intravenoso (i.v.), liposomas o vesículas con tensioactivos, microesferas, microperlas y microsomas, polvos, comprimidos, cápsulas, supositorios, suspensiones acuosas, aerosoles y otros vehículos evidentes para un experto en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas según lo previsto en la presente memoria pueden formularse para esencialmente cualquier vía de administración, tal como, sin limitación, administración oral (tal como, por ejemplo, ingestión o inhalación oral), administración intranasal (tal como, por ejemplo, inhalación intranasal o aplicación mucosa intranasal), administración parenteral (tal como, por ejemplo, inyección o infusión subcutánea, intravenosa (i.v.), intramuscular, intraperitoneal o intraesternal), administración transdérmica o transmucosa (tal como, por ejemplo, oral, sublingual, intranasal), administración tópica, rectal, vaginal o instilación intratraqueal, y similares. De esta manera, los efectos terapéuticos que se pueden conseguir mediante los métodos y composiciones pueden ser, por ejemplo, sistémicos, locales, específicos del tejido, etc., en función de las necesidades específicas de una aplicación determinada.
Por ejemplo, para la administración oral, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en forma de píldoras, comprimidos, comprimidos lacados, comprimidos recubiertos (por ejemplo, recubiertos de azúcar), gránulos, cápsulas de gelatina duras y blandas, soluciones acuosas, alcohólicas u oleosas, jarabes, emulsiones o suspensiones. En un ejemplo, sin limitación, la preparación de formas de dosificación oral se puede lograr adecuadamente mezclando uniforme e íntimamente una cantidad adecuada del agente que se describe en la presente memoria en forma de polvo, que incluye opcionalmente también uno o más vehículos sólidos finamente divididos y formular la mezcla en una pastilla, comprimido o cápsula. Los vehículos sólidos ejemplares pero no limitantes incluyen fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares (tales como, por ejemplo, glucosa, manosa, lactosa o sacarosa), alcoholes de azúcar (tales como, por ejemplo, manitol), dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico. Los comprimidos que contienen la composición farmacéutica se pueden preparar mezclando uniforme e íntimamente el agente que se describe en la presente memoria con un vehículo sólido como el descrito anteriormente para proporcionar una mezcla que tenga las propiedades de compresión necesarias, y luego compactando la mezcla en una máquina adecuada para darle la forma y tamaño deseado. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla de compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los vehículos adecuados para cápsulas de gelatina blanda y supositorios son, por ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales o endurecidos, etc.
Por ejemplo, para la administración por inhalación o aerosol oral o nasal, se pueden formular composiciones farmacéuticas con vehículos ilustrativos, tales como, por ejemplo, en solución con solución salina, polietilenglicol o glicoles, DPPC, metilcelulosa o en mezcla con agentes dispersantes en polvo, además empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración en forma de aerosoles o pulverizaciones son, por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones de los agentes que se dan a conocer en la presente memoria o sus sales fisiológicamente tolerables en un solvente farmacéuticamente aceptable, tal como etanol o agua, o una mezcla de tales solventes. Si es necesario, la formulación también puede contener otros coadyuvantes farmacéuticos, tales como tensioactivos, emulsionantes y estabilizantes, así como un propulsor. De manera ilustrativa, la administración puede realizarse mediante el uso de un dispositivo de administración de un solo uso, un nebulizador de niebla, un inhalador de polvo activado por la respiración, un inhalador de dosis medida (MDI) en aerosol o cualquier otro de los numerosos dispositivos de administración de tipo nebulizadores disponibles en la técnica. Además, también se pueden utilizar tiendas de nebulización o administración directa a través de tubos endotraqueales.
Los ejemplos de vehículos para la administración en superficies mucosas dependen de la vía concreta, por ejemplo, oral, sublingual, intranasal, etc. Cuando se administran por vía oral, los ejemplos ilustrativos incluyen grados farmacéuticos de manitol, almidón, lactosa, estearato de magnesio, sacárido de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares, prefiriéndose el manitol. Cuando se administra por la vía intranasal, los ejemplos ilustrativos incluyen polietilenglicol, fosfolípidos, glicoles y glucolípidos, sacarosa y/o metilcelulosa, suspensiones en polvo con o sin agentes de carga, tales como lactosa y conservantes, tales como cloruro de benzalconio, EDTA. En una realización particularmente ilustrativa, el fosfolípido 1,2 dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) se usa como vehículo acuoso isotónico a aproximadamente el 0,01-0,2 % para la administración intranasal del compuesto de la presente invención a una concentración de aproximadamente 0,1 a 3,0 mg/ml.
Por ejemplo, para la administración parenteral, las composiciones farmacéuticas pueden formularse ventajosamente como soluciones, suspensiones o emulsiones con disolventes, diluyentes, solubilizantes o emulsionantes adecuados, etc. Los disolventes adecuados son, sin limitación, agua, solución salina fisiológica o alcoholes, p. ej., etanol, propanol, glicerina, además también soluciones de azúcar tal como soluciones de glucosa, azúcar invertido, sacarosa o manitol o, como alternativa, mezclas de los distintos solventes mencionados. Las soluciones o suspensiones inyectables se pueden formular según la técnica conocida, usando diluyentes o disolventes no tóxicos, aceptables por vía parenteral, tales como manitol, 1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer o solución isotónica de cloruro de sodio, o dispersantes o humectantes y agentes de suspensión, tales como aceites no volátiles, suaves y estériles, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos, y ácidos grasos, incluido el ácido oleico. Los agentes y sus sales farmacéuticamente aceptables de la invención también se pueden liofilizar y los liofilizados obtenidos se pueden usar, por ejemplo, para la producción de preparaciones para inyección o para infusión. Por ejemplo, un ejemplo ilustrativo de un vehículo para el uso intravenoso incluye una mezcla de etanol USP al 10 %, propilenglicol USP al 40 % o polietilenglicol 600 y el resto de agua para inyección (WFI) USP. Otros vehículos ilustrativos para el uso intravenoso incluyen etanol USP al 10 % y WFI u Sp ; el 0,01 -0,1 % de trietanolamina en WFI USP; o el 0,01 -0,2 % de dipalmitoildifosfatidilcolina en WFI USP; y el 1-10 % de escualeno o emulsión parenteral de aceite vegetal en agua. Ejemplos ilustrativos de vehículos para el uso subcutáneo o intramuscular incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS), dextrosa al 5 % en WFI y trietanolamina al 0,01-0,1 % en dextrosa al 5 % o cloruro de sodio al 0,9 % en WFI USP, o una dosis de 1 a 2 o de 1 a 4 mezcla de etanol USP al 10 %, propilenglicol al 40 % y el resto una solución isotónica aceptable tal como dextrosa al 5 % o cloruro de sodio al 0,9 %; o el 0,01-0,2 % de dipalmitoildifosfatidilcolina en USP WFI y del 1 al 10 % de escualeno o emulsiones parenterales de aceite vegetal en agua.
Cuando se prefieren formulaciones acuosas, éstas pueden comprender uno o más tensioactivos. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de una dispersión micelar que comprende al menos un tensioactivo adecuado, por ejemplo, un tensioactivo fosfolipídico. Los ejemplos ilustrativos de fosfolípidos incluyen diacilfosfatidilgliceroles, tales como dimiristoilfosfatidilglicerol (DPMG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y distearoilfosfatidilglicerol (DSPG), diacilfosfatidilcolinas, tales como dimiristoilfosfatidilcolina (DPMC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y distearoilfosfatidilcolina (DSPC); ácidos diacilfosfatídicos, tales como ácido dimiristoilfosfatídico (DPMA), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA) y ácido distearoilfosfatídico (DSPA); y diacilfosfatidiletanolaminas tales como dimiristoilfosfatidiletanolamina (DPME), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) y distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE). Típicamente, una relación molar de tensioactivo:sustancia activa en una formulación acuosa será de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10, más normalmente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5, aunque se puede usar cualquier cantidad eficaz de tensioactivo en una formulación acuosa que mejor se adapte a los objetivos específicos de interés.
Cuando se administran por vía rectal en forma de supositorios, estas formulaciones se pueden preparar mezclando los compuestos según la invención con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos o polietilenglicoles, que son sólidos a las temperaturas normales, pero que se licuan y/o disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco.
Los vehículos adecuados para microcápsulas, implantes o varillas son, por ejemplo, copolímeros de ácido glicólico y ácido láctico.
Un experto en esta técnica reconocerá que la descripción anterior es ilustrativa más que exhaustiva. De hecho, los expertos en la técnica conocen bien muchas otras técnicas de formulación y excipientes y soluciones de vehículo farmacéuticamente aceptables, al igual que el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones concretas descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento.
En realizaciones preferidas, el agente, el ácido nucleico que codifica el agente, el casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico, el vector que comprende el ácido nucleico o el casete de expresión de ácido nucleico, la célula hospedadora o la composición farmacéutica que se da a conocer en la presente memoria se administra por vía parenteral. Más preferiblemente, el agente, el ácido nucleico que codifica el agente, el casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico o el vector que comprende el ácido nucleico, el casete de expresión de ácido nucleico, la célula hospedadora o la composición farmacéutica que se da a conocer en la presente memoria se administra por vía intravenosa, por ejemplo mediante infusión.
En realizaciones concretas, el agente, el ácido nucleico que codifica el agente o el casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que se da a conocer en la presente memoria se usa en genoterapia. En otras realizaciones concretas, el agente, el ácido nucleico que codifica el agente o el casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que se da a conocer en la presente memoria se usa en genoterapia dirigida al sistema nervioso central y/o periférico, tal como genoterapia dirigida al cerebro, más particularmente la genoterapia dirigida a las células endoteliales de la barrera hematoencefálica.
Por consiguiente, también se da a conocer en la presente memoria un método para la genoterapia, en concreto la genoterapia dirigida al sistema nervioso central y/o periférico, en un sujeto que necesita dicha genoterapia que comprende: introducir en el sujeto, en concreto en el sistema nervioso central y/o periférico del sujeto, un casete de expresión de ácido nucleico o un vector que se describe en la presente memoria; y expresar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente codificado por el ácido nucleico que se da a conocer en la presente memoria en el sujeto, en concreto en el sistema nervioso central y/o periférico del sujeto.
El término "genoterapia", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la introducción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora con fines terapéuticos o profilácticos, independientemente del método utilizado para la introducción. Dichos métodos incluyen una variedad de técnicas bien conocidas, tales como la transferencia de genes mediada por vectores (mediante, por ejemplo, infección/transfección vírica, o varios otros complejos de introducción de genes basados en proteínas o lípidos) tal como se describe en otra parte de la presente memoria. El polinucleótido introducido puede mantenerse estable o transitoriamente en la célula hospedadora. El mantenimiento estable normalmente requiere que el polinucleótido introducido contenga un origen de replicación compatible con la célula hospedadora o se integre en un replicón de la célula hospedadora, tal como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Se sabe que varios vectores son capaces de mediar la transferencia de genes a las células de mamíferos, como se sabe en la técnica. Por ejemplo, la transferencia génica mediada por vector del agente, el ácido nucleico que codifica el agente, el casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que se da a conocer en la presente memoria se puede realizar usando un vector vírico dirigido específicamente hacia el sistema nervioso central y/o periférico (p. ej., vector vírico AAV-PHP.B y AAV-PHP.eB) o un vector vírico específico para las células endoteliales de la barrera hematoencefálica (p. ej., vector vírico AAV-BR1), tal como se describe en otra parte de la presente memoria.
En realizaciones concretas, el ácido nucleico que codifica el agente, el casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico, el vector que comprende el ácido nucleico o el casete de expresión de ácido nucleico o la composición farmacéutica que se da a conocer en la presente memoria se administra al sujeto mediante inyección (p. ej., por vía intravenosa) o trasplante de células alógenas transformadas con el vector que comprende el ácido nucleico o el casete de expresión de ácido nucleico que se da a conocer en la presente memoria. Cuando se administran, las células alógenas inyectadas o trasplantadas transcribirán y traducirán el ácido nucleico que codifica el agente que se da a conocer en la presente memoriain vivo.La dosificación o cantidad del agente que se da a conocer en la presente memoria, opcionalmente en combinación con uno o más compuestos activos diferentes a administrar, depende del caso individual y, como es habitual, debe adaptarse a las circunstancias del individuo para lograr un efecto óptimo. Así, la dosis unitaria y el régimen dependen de la naturaleza y la gravedad del trastorno a tratar, y también de factores tales como la especie del sujeto, el sexo, la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el modo y el momento de la administración, estado inmunitario y capacidad de respuesta del individuo humano o animal a tratar, eficacia, estabilidad metabólica y duración de la acción de los compuestos utilizados, de si la terapia es aguda o crónica o profiláctica, o de si otros compuestos activos se administran además del agente de la invención. Para optimizar la eficacia terapéutica, el agente que se da a conocer en la presente memoria puede administrarse primero en diferentes regímenes de dosificación. Típicamente, la concentración del agente en un tejido se puede controlar usando ensayos de detección apropiados como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. La frecuencia de la dosificación está dentro de las habilidades y el criterio clínico del personal sanitario (por ejemplo, médicos, veterinarios o enfermeras). Típicamente, el régimen de administración se establece mediante ensayos clínicos que pueden establecer los parámetros de administración óptimos. Sin embargo, el personal sanitario puede variar dichas pautas de administración según uno o más de los factores antes mencionados, por ejemplo, edad, salud, peso, sexo y estado médico del sujeto. La frecuencia de dosificación puede variar en función de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.
La toxicidad y eficacia terapéutica del agente descrito en la presente memoria o de las composiciones farmacéuticas que lo comprenden pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos conocidos, por ejemplo, en cultivos celulares o animales de experimentación. Estos procedimientos se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL50/DE50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos elevados. Si bien se pueden usar composiciones farmacéuticas que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células normales (por ejemplo, células que no son la diana) y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden utilizar para formular una variedad de dosis para usar en sujetos apropiados. La dosificación de tales composiciones farmacéuticas se encuentra generalmente dentro de un margen de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este margen en función de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para una composición farmacéutica utilizada como la descrita en la presente memoria, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un margen de concentración en el plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración de la composición farmacéutica que logra una inhibición de los síntomas de la mitad del máximo) según se determina en el cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor exactitud las dosis útiles en los humanos. La concentración en el plasma se puede medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Sin limitación, en función del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosis típica (por ejemplo, una dosis diaria típica o una dosis intermitente típica, por ejemplo, una dosis típica cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, cada semana, cada 1,5 semanas, cada dos semanas, cada tres semanas, cada mes u otra) del agente que se da a conocer en la presente memoria puede oscilar entre aproximadamente 10 pg/kg y aproximadamente 500 pg/kg de la masa corporal del sujeto, por dosis, en función de los factores mencionados anteriormente, por ejemplo, tales como 20-400 pg/kg o 20-200 pg/kg o 20-100 pg/kg o 40-80 pg/kg de peso corporal del sujeto.
A modo de ejemplo y sin limitación, el agente que se da a conocer en la presente memoria se puede administrar a aproximadamente 5 pg/kg, o a aproximadamente 10 pg/kg, o a aproximadamente 15 pg/kg, o a aproximadamente 20 pg/kg, o a aproximadamente 25 pg/kg, o a aproximadamente 30 pg/kg, o a aproximadamente 35 pg/kg, o a aproximadamente 40 pg/kg, o a aproximadamente 45 pg/kg, o a aproximadamente 50 mg/kg, o a aproximadamente 60 pg /kg, o a aproximadamente 70 pg/kg, o a aproximadamente 80 pg/kg, o a aproximadamente 90 pg/kg, o a aproximadamente 100 pg/kg, o a aproximadamente 200 pg/kg, o a aproximadamente 300 pg/kg, o a aproximadamente 400 pg/kg, o a aproximadamente 500 pg/kg por dosis.
En realizaciones concretas, el agente que se da a conocer en la presente memoria se administra usando un sistema de administración sostenida, tal como un sistema de administración sostenida (parcialmente) implantado. El experto entenderá que dicho sistema de administración sostenida puede comprender un depósito para contener el agente que se da a conocer en la presente memoria, una bomba y medios de infusión (por ejemplo, un sistema de tubos). Por ejemplo, el sistema de administración sostenida puede ser un sistema de minibomba osmótica implantado en el cerebro.
En una realización en concreto, el agente descrito en la presente memoria es el principal o único ingrediente activo de la composición farmacéutica.
Un aspecto adicional se refiere al agente que se describe en la presente memoria, el ácido nucleico que codifica el agente como el descrito en la presente memoria, el casete de expresión de ácido nucleico como el descrito en la presente memoria, el vector como el descrito en la presente memoria o la composición farmacéutica como la descrita en la presente memoria, para su uso como un medicamento.
Un aspecto adicional se refiere al agente que se describe en la presente memoria, el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, el casete de expresión de ácido nucleico que se describe en la presente memoria, el vector que se describe en la presente memoria o la composición farmacéutica que se describe en la presente memoria, para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del sistema nervioso central (SNC) que comprende disfunción neurovascular.
Los términos "tratar" o "tratamiento" abarcan tanto el tratamiento terapéutico de una enfermedad o afección ya desarrollada, como por ejemplo el tratamiento de un trastorno neurovascular ya desarrollado o un trastorno del sistema nervioso central (SNC) que comprende disfunción neurovascular, así como profiláctico o medidas preventivas, en las que el objetivo es prevenir o disminuir las posibilidades de incidencia de una afección no deseada, tal como prevenir la aparición, el desarrollo y la progresión de un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, entre otros, alivio de uno o más síntomas o uno o más marcadores biológicos, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o desaceleración de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y similares. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento.
Los términos "trastorno neurovascular" o "enfermedad neurovascular", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a una enfermedad o alteración o afección patológica que afecta al sistema vascular cerebral y/o el sistema vascular que irriga la médula espinal. Los términos abarcan cualquier anomalía de los vasos sanguíneos que irrigan o se encuentran dentro del cerebro y/o la médula espinal. Las anomalías pueden ser, entre otras, (i) estrechamiento de las arterias que reduce el flujo sanguíneo al cerebro y que puede provocar hipoxia, isquemia o accidente cerebrovascular y/o (ii) debilitamiento de las arterias que puede provocar aneurismas cerebrales y aumentar el riesgo de hemorragia intracraneal. Los ejemplos no limitantes de enfermedades neurovasculares son accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular hemorrágico, lesión por isquemia/reperfusión, aneurismas cerebrales, malformaciones arteriovenosas (MAV), malformaciones cavernosas, vasculitis, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnoidea, malformaciones vasculares medulares, estenosis de la arteria carótida, enfermedad de Moyamoya y aterosclerosis intracraneal.
Las frases "trastorno del sistema nervioso central (SNC) que comprende disfunción neurovascular" o "enfermedad del SNC que comprende disfunción neurovascular", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a un grupo de trastornos neurológicos que afectan a la estructura y/o función del cerebro y/o la médula espinal, que forman colectivamente el SNC, que son causados, contribuidos o tipificados por una disfunción neurovascular, o que conducen a una anomalía de la estructura y/o función de los vasos sanguíneos dentro del cerebro y/o la médula o que los irrigan. Los ejemplos no limitantes de trastornos del sistema nervioso central (SNC) que comprenden disfunción neurovascular son esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular isquémico, cáncer cerebral, epilepsia, demencia, demencia vascular, demencia asociada al VIH-1, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades cerebrales infecciosas, lesiones cerebrales traumáticas, migraña y encefalopatía traumática crónica.
Excepto cuando se indique lo contrario, los términos "sujeto" o "paciente" pueden usarse indistintamente y referirse a animales, preferiblemente animales de sangre caliente, más preferiblemente vertebrados, incluso más preferiblemente mamíferos, aún más preferiblemente primates, e incluye específicamente pacientes humanos y mamíferos y primates no humanos. Los sujetos preferidos son sujetos humanos. Los términos "sujeto" o "paciente" incluyen sujetos que necesitan tratamiento, más particularmente sujetos que se beneficiarían del tratamiento de una afección determinada, particularmente un trastorno neurovascular o un trastorno del sistema nervioso central (SNC) que comprende disfunción neurovascular. Dichos sujetos pueden incluir, entre otros, aquellos a los que se les ha diagnosticado dicha afección, los propensos a desarrollar dicha afección y/o aquellos en quienes dicha afección se debe prevenir.
Los productos y los métodos que se dan a conocer en la presente memoria permiten administrar una cantidad terapéutica y/o profilácticamente eficaz de un agente que se da a conocer en la presente memoria, un ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, un casete de expresión de ácido nucleico que se describe en la presente memoria, un vector que se describe en la presente memoria o una composición farmacéutica que se describe en la presente memoria, en los sujetos que tienen un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que se beneficiarán de dicho tratamiento. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cantidad de compuesto activo o sustancia farmacéutica que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sujeto que está el cirujano, investigador, veterinario, médico u otro clínico desea observar, que puede incluir, entre otras cosas, el alivio de los síntomas de la enfermedad o afección que se está tratando. La expresión "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto activo o agente farmacéutico que inhibe o retrasa en un sujeto la aparición de un trastorno que desea un investigador, veterinario, médico u otro clínico. Se conocen métodos en la técnica para determinar las dosis terapéuticas y/o profilácticamente eficaces de un agente, un ácido nucleico que codifica el agente, un casete de expresión de ácido nucleico o una composición farmacéutica, como se da a conocer en la presente memoria.
El término "dosis terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad de un agente, un ácido nucleico que codifica el agente, un casete de expresión de ácido nucleico o una composición farmacéutica, como se da a conocer en la presente memoria, que cuando se administra provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente que tiene un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC.
Un médico cualificado puede determinar las dosis terapéuticamente eficaces apropiadas de un agente, un ácido nucleico que codifica el agente, un casete de expresión de ácido nucleico o una composición farmacéutica, como se da a conocer en la presente memoria, teniendo debidamente en cuenta la naturaleza de la enfermedad y su gravedad y la edad, tamaño y estado del paciente.
Un aspecto adicional da a conocer un método para tratar un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular en un sujeto que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que se describe en la presente memoria, el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, el casete de expresión de ácido nucleico que se describe en la presente memoria, el vector que se describe en la presente memoria o la composición farmacéutica que se describe en la presente memoria, al sujeto.
Un aspecto adicional da a conocer el uso de un agente que se describe en la presente memoria, el ácido nucleico que codifica el agente que se describe en la presente memoria, el casete de expresión de ácido nucleico que se describe en la presente memoria, el vector que se describe en la presente memoria o la composición farmacéutica que se describe en la presente memoria, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular.
En realizaciones concretas, dicho trastorno neurovascular se selecciona del grupo que consiste en accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular hemorrágico, lesión por isquemia/reperfusión, aneurismas cerebrales, malformaciones arteriovenosas (MAV), malformaciones cavernosas, vasculitis, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnoidea, malformaciones vasculares medulares, estenosis arterial de la carótida, enfermedad de Moyamoya y aterosclerosis intracraneal y combinaciones de las mismas.
En realizaciones concretas, dicho trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular isquémico, cáncer cerebral, epilepsia, demencia, demencia vascular, demencia asociada al VIH-1, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades cerebrales infecciosas, lesiones cerebrales traumáticas, migraña, encefalopatía traumática crónica y combinaciones de las mismas.
Un aspecto adicional que no es según la invención y presente sólo con fines ilustrativos, es un métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento, tal como útil para la prevención o el tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del SNC que comprende disfunción neurovascular, en donde dicho método comprende determinar si un agente en estudio activa la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP pero no la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124. El término"in vitro"generalmente denota fuera o externo a un cuerpo, por ejemplo, un cuerpo animal o humano. El término también abarca"ex vivo".Un ejemplo de"in vitro"es el cultivo de células tisulares.
El término "agente en estudio", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia, molécula o macromolécula química (por ejemplo, inorgánica u orgánica), bioquímica o biológica (por ejemplo, macromolécula biológica), una combinación o mezcla de las mismas, una muestra de composición indeterminada, o un extracto hecho de materiales biológicos, tales como bacterias, hongos, plantas o células o tejidos animales de los cuales se desea determinar si activa la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP pero no la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en el ausencia de RECK y/o GPR124.
La determinación de la activación o falta de activación de la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP y la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor Frizzled/LRP se puede determinar como se describe en otra parte de la presente memoria. Por ejemplo, las células transfectadas transitoriamente con un plásmido Super TOPFlash (p. ej., plásmido Super 8x TOPFlash, plásmido Addgene #12456) o una línea celular indicadora Super Top Flash transfectada de manera estable (p. ej., línea celular STF HEK293) podrían (co)transfectarse con plásmidos que codifican polipéptidos Frizzled, LRP, GPR124 y/o Reck, y usarse para determinar la actividad luciferasa de las células en respuesta a la adición del agente en estudio como una indicación de la actividad de señalización de Wnt en dichas células.
El métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento que se describe en la presente memoria comprende poner en contacto el agente en estudio con una célula capaz de realizar la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP y medir dicha señalización de Wnt, y poner en contacto el agente en estudio con una célula capaz de la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor Frizzled/LRP pero no por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, y medir dicha señalización de Wnt. El término "contactar" o "poner en contacto", tal como se usa en la presente memoria, significa poner uno o más primeros componentes (tales como una o más moléculas, entidades biológicas, células o materiales) junto con uno o más segundos componentes (tales como una o más moléculas, entidades biológicas, células o materiales) de tal manera que el primer componente pueda, si es capaz de hacerlo, unirse o modularse al segundo componente o que el segundo componente pueda, si es capaz de hacerlo, unirse o modular los primeros componentes. Tal modulación puede ocurrir directamente, es decir, mediante la interacción directa entre el primer y el segundo componente(s); o indirectamente, por ejemplo, cuando los primeros componentes interaccionan o modulan uno o más componentes adicionales, uno o más de los cuales a su vez interacciona o modula los segundos componentes, o viceversa. El término "poner en contacto" puede, en función del contexto, ser sinónimo de "exponer", "incubar", "mezclar", "hacer reaccionar", "tratar" o similares.
El agente en estudio puede ponerse en contacto con la célula capaz de la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP y/o con la célula capaz de la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP pero no con la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP transfectando dicha célula con un ácido nucleico que codifica el agente, un casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico o el casete de expresión de ácido nucleico que se da a conocer en la presente memoria. La medición de la señalización de Wnt típicamente denota la determinación de la activación de la señalización de Wnt, preferiblemente la activación de la señalización de Wnt canónica o dependiente de la p-catenina como se describe en otra parte de la presente memoria, por ejemplo mediante la detección de un aumento en los genes que responden a Wnt o la localización nuclear de la p-catenina. Otra forma de determinar la activación de la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP es estudiar el establecimiento de la duplicación del eje dorsal durante el desarrollo embrionario enXenopustras la microinyección del agente en estudio en un blastómero ventral del embrión en la etapa de cuatro células como se conoce en la técnica. Otra forma más de determinar la activación de la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP es estudiar la consolidación del prosencéfalo y las estructuras oculares durante el desarrollo embrionario en el pez cebra(Danio rerio)tras la microinyección del agente en estudio en el embrión en la etapa de una a cuatro células como se conoce en la técnica. El nivel de actividad de la señalización de Wnt se puede comparar con un valor inicial. El valor de referencia puede ser un valor para una muestra de control (por ejemplo, una muestra de una población de células no estimuladas o una población de células en contacto con un agente de control).
Las células capaces de realizar la señalización de Wnt mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP son típicamente células que comprenden GPR124, RECK, Frizzled y LRP en su membrana plasmática y que contienen los miembros posteriores de la vía de señalización de Wnt/p-catenina. Las células capaces de emitir señales de Wnt mediadas por el complejo receptor Frizzled/LRP, pero no por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, son típicamente células que comprenden Frizzled y LRP en su membrana plasmática y que contienen los miembros posteriores de la vía de señalización de Wnt/p-catenina, pero que no comprenden un polipéptido GPR124 y/o un polipéptido RECK en su membrana plasmática.
Las células capaces de mediar la señalización de Wnt mediante el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP pueden ser células que expresan de forma natural todos los componentes celulares necesarios para la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, tales como las células o líneas celulares de endotelio cerebral. Las células capaces de mediar la señalización de Wnt mediante el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP también pueden ser células que no expresan de forma natural ninguno o no todos los componentes celulares necesarios para la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, que pueden modificarse como por manipulación genética, para compensar los componentes celulares faltantes necesarios para la señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, como las células 293 del riñón embrionario humano (HEK293). Dichas modificaciones se conocen en la técnica e incluyen la transfección de las células con ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, el polipéptido GPR124 y/o RECK.
Tal como se describe en otra parte de la presente memoria, la ausencia, o que no comprendan o contener, un polipéptido receptor en este contexto no se refiere por sí solo a la ausencia completa de dicho polipéptido receptor en la membrana celular, sino que puede referirse a una cantidad del polipéptido receptor que no es detectable mediante los ensayos de proteínas conocidos por el experto en la técnica, o está por debajo del intervalo de sensibilidad de los mismos.
Se pueden realizar exploraciones preliminares examinando el agente en estudio para determinar su capacidad de unirse a un polipéptido RECK, a un polipéptido Frizzled y/o un polipéptido LRP.
El métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento que se describe en la presente memoria comprende determinar si el agente en estudio es capaz de unirse al polipéptido RECK y, opcionalmente, determinar si el agente en estudio es capaz de unirse al polipéptido Frizzled y/o a un polipéptido LRP.
El ensayo de unión puede implicar poner en contacto un polipéptido RECK, un polipéptido Frizzled y/o un polipéptido LRP con el agente en estudio y dejar tiempo suficiente para que el agente en estudio y el polipéptido RECK, el polipéptido Frizzled y/o el polipéptido LRP formen un complejo de unión. La formación de un complejo de unión se puede detectar usando cualquier técnica analítica establecida para determinar la unión proteína-proteína que se describe en otra parte de la presente memoria, tal como coinmunoprecipitación, complementación de fluorescencia bimolecular, transferencia de etiquetas, purificación por afinidad en tándem, entrecruzamiento químico y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Los ensayos de unión a proteínas se pueden realizar en un sistema libre de células o en un lisado celular o en células aisladas o cultivadas, o en un tejido aislado o cultivado, como se describe en otra parte de la presente memoria.
En un ensayo de unión, uno o más del agente, polipéptido RECK, polipéptido Frizzled y/o polipéptido LRP pueden unirse a un marcador, donde el marcador puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable. Los ejemplos no limitantes de dichos marcadores o señales incluyen radioisótopos, marcadores o señales fluorescentes, marcadores o señales quimioluminiscentes, enzimas, moléculas de unión específicas o partículas (por ejemplo, partículas magnéticas).
El métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento que se describe en la presente memoria puede comprender además el uso de uno o más reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, facilitan la unión proteínaproteína óptima y/o reducen las interacciones inespecíficas o de fondo. Los ejemplos no limitantes de tales reactivos son sales, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas y agentes antimicrobianos.
El métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento que se describe en la presente memoria comprende poner en contacto el agente en estudio con una célula de 1 hora a 48 h, de 6 h a 36 h, de 12 h a 24 h, de 0,5 a 120 min, de 1 a 90 min, de 5 a 60 min, o de 10 a 30 min.
El métodoin vitropara identificar un agente útil como medicamento que se describe en la presente memoria comprende poner en contacto el agente en estudio con una célula a una temperatura de 4°C a 40°C.
El contacto puede realizarse en células aisladas o cultivadas o en un tejido aislado o cultivado. El término "aislado", tal como se usa en esta especificación con referencia a un componente concreto, generalmente denota que dicho componente existe separado de —por ejemplo, ha sido separado o preparado y/o mantenido separado de— uno o más de otros componentes de su entorno natural. Más en particular, el término "aislado", tal como se usa en la presente memoria en relación con células o tejidos, denota que dichas células o tejidos no forman parte de un cuerpo animal o humano. Las células o tejidos aislados pueden cultivarse adecuadamente o cultivarsein vitro.Los términos "cultivo" o "cultivo celular" son corrientes en la técnica y se refieren en términos generales al mantenimiento de células y potencialmente a la expansión (proliferación, propagación) de célulasin vitro.Típicamente, las células animales, tales como las células de mamíferos, tales como las células humanas, se cultivan exponiéndolas (es decir, poniéndolas en contacto con) un medio de cultivo celular adecuado en un recipiente o contenedor adecuado para el fin (por ejemplo, una placa de 96, 24, o 6 pocillos, un matraz T-25, T-75, T-150 o T-225, o una fábrica de células), en las condiciones conocidas en la técnica propicias para el cultivo celularin vitro,tal como una temperatura de 37 °C, 5 % v/v de CO2 y >95 % de humedad.
El término "medio", tal como se utiliza en la presente memoria, abarca en sentido amplio cualquier medio de cultivo celular que conduzca al mantenimiento de las células, preferiblemente que conduzca a la proliferación de las células. Típicamente, el medio será un medio de cultivo líquido, que facilita su fácil manipulación (por ejemplo, decantación, pipeteo, centrifugación, filtración y similares).
Típicamente, el medio comprenderá una formulación de medio basal como se conoce en la técnica. Se pueden usar muchas formulaciones de medios basales (disponibles, por ejemplo, de la American Type Culture Collection, ATCC; o de Invitrogen, Carlsbad, California), que incluyen, entre otras, el Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM), el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo modificado alfa (alfa-MEM), medio basal esencial (BME), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medio BGJb, mezcla de nutrientes F-12 (Ham), Liebovitz L-15, Dm EM/F-12, Medio de Eagle modificado esencial (Em EM), RPMI-1640, Medio 199, MB 752/1 de Waymouth o Medio Williams E, y modificaciones y/o combinaciones de los mismos. Las composiciones de los medios basales son generalmente conocidas en la técnica y está dentro de la habilidad de un experto en la técnica modificar o modular las concentraciones de medios y/o suplementos de medios según sea necesario para las células en cultivo.
Tales formulaciones de medios basales contienen los ingredientes necesarios para el desarrollo de las células de mamíferos, que son conocidos por sí mismos. A modo de ilustración y sin limitación, estos ingredientes pueden incluir sales inorgánicas (en particular, sales que contienen Na, K, Mg, Ca, Cl, P y posiblemente Cu, Fe, Se y Zn), tampones fisiológicos (por ejemplo, HEPES, bicarbonato), nucleótidos, nucleósidos y/o bases de ácidos nucleicos, ribosa, desoxirribosa, aminoácidos, vitaminas, antioxidantes (p. ej., glutatión) y fuentes de carbono (p. ej., glucosa, piruvato de sodio, acetato de sodio), etc.
Para su uso en cultivo, los medios basales pueden suministrarse con uno o más componentes adicionales. Por ejemplo, se pueden utilizar suplementos adicionales para suministrar a las células los oligoelementos y sustancias necesarios para un crecimiento y expansión óptimos. Además, se pueden añadir suplementos antioxidantes, por ejemplo, p-mercaptoetanol. Si bien muchos medios basales ya contienen aminoácidos, algunos aminoácidos pueden complementarse más adelante, por ejemplo, la L-glutamina, que se sabe que es menos estable en solución. Se puede suministrar además un medio con compuestos antibióticos y/o antimicóticos, tales como, típicamente, mezclas de penicilina y estreptomicina, y/u otros compuestos ejemplificados por, pero no limitados a ellos, anfotericina, ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, kanamicina, mitomicina, ácido micofenólico, ácido nalidíxico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina y zeocina.
También se pueden utilizar lípidos y vehículos de lípidos para complementar los medios de cultivo celular. Dichos lípidos y vehículos pueden incluir, entre otros, ciclodextrina, colesterol, ácido linoleico conjugado a la albúmina, ácido linoleico y ácido oleico conjugados a la albúmina, ácido linoleico sin conjugar, ácido linoleico-oleico-araquidónico conjugado a la albúmina, ácido oleico sin conjugar y conjugado a la albúmina, entre otros. La albúmina se puede utilizar de manera similar en las formulaciones sin ácidos grasos.
También se contempla la suplementación de medios de cultivo celular con plasma o sueros de mamíferos. El plasma o el suero suelen contener factores y componentes celulares que facilitan la viabilidad y expansión celular. Opcionalmente, se puede inactivar por calor el plasma o el suero. La inactivación por calor se utiliza en la técnica principalmente para eliminar el complemento. La inactivación por calor normalmente implica incubar el plasma o suero a 56 °C durante 30 a 60 min, por ejemplo, 30 min, con una mezcla constante, después de lo cual se deja que el plasma o suero se enfríe gradualmente hasta la temperatura ambiente. Un experto en la materia conocerá cualquier modificación y requisito corrientes del procedimiento anterior. Opcionalmente, se puede esterilizar plasma o suero antes de su almacenamiento o uso. Los medios habituales de esterilización pueden implicar, por ejemplo, filtración a través de uno o más filtros con un tamaño de poro inferior a 1 gm, preferentemente inferior a 0,5 gm, por ejemplo, inferior a 0,45 gm, 0,40 gm, 0,35 gm, 0,30 gm o 0,25 gm, más preferentemente 0,2 gm o menor, por ejemplo, 0,15 gm o menor, 0,10 gm o menor. Los sueros o plasmas adecuados para su uso en medios que se dan a conocer en la presente memoria pueden incluir suero o plasma humano, o suero o plasma de animales no humanos, preferiblemente mamíferos no humanos, tales como, por ejemplo, primates no humanos (por ejemplo, lémures, monos, simios), suero o plasma bovino fetal o de adulto, de caballo, porcino, de cordero, de cabra, de perro, de conejo, de ratón o de rata, etc., o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones preferidas, un medio como se da a conocer en la presente memoria puede comprender suero o plasma bovino, preferiblemente suero o plasma fetal bovino (ternera), más preferiblemente suero fetal bovino (ternera) (FCS o FBS). Cuando se cultivan células humanas, los medios pueden comprender preferiblemente suero o plasma humano, tal como suero o plasma humano autólogo o alógeno, preferiblemente suero humano, tal como suero humano autólogo o alógeno, más preferiblemente suero o plasma humano autólogo, incluso más preferiblemente suero humano autólogo.
El suero o el plasma se pueden sustituir en los medios por reemplazos de suero, tales como para proporcionar medios libres de suero (es decir, medios químicamente definidos). El suministro de los medios sin suero puede ser ventajoso particularmente con vistas a la administración de los medios o fracciones de los mismos a sujetos, especialmente a sujetos humanos (por ejemplo, bioseguridad mejorada). El término "reemplazo de suero" se entiende ampliamente que es cualquier composición que pueda usarse para reemplazar las funciones (por ejemplo, función de mantenimiento celular y de apoyo al crecimiento) del suero animal en un medio de cultivo celular. Un reemplazo de suero convencional normalmente puede comprender vitaminas, albúmina, lípidos, aminoácidos, transferrina, antioxidantes, insulina y oligoelementos. Muchos aditivos de reemplazo de suero comercializados, tales como KnockOut Serum Replacement (KOSR), N2, B27, Suplemento de Insulina-Transferrina-Selenio (ITS) y G5 se conocen bien y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. El plasma o suero o el reemplazo de suero pueden estar comprendidos en los medios que se dan a conocer en la presente memoria en una proporción (volumen de plasma o suero o reemplazo de suero / volumen de medio) entre aproximadamente el 0,5 % v/v y aproximadamente el 40,0 % v/v, preferiblemente entre aproximadamente el 5,0 % v/v y aproximadamente el 20,0 % v/v, por ejemplo, entre aproximadamente el 5,0 % v/v y aproximadamente el 15,0 % v/v, más preferiblemente entre aproximadamente el 8,0 % v/v y aproximadamente el 12,0 % v/v, por ejemplo, aproximadamente el 10,0 % v/v.
Las células aisladas o cultivadas adecuadas pueden ser, sin limitación, células bacterianas, células fúngicas, incluidas células de levadura, células vegetales, células animales, células de mamíferos, células humanas o células de mamíferos no humanos. Se prefieren células animales, tales como células de mamíferos, células humanas o células de mamíferos no humanos. Las células pueden incluir células primarias, secundarias, terciarias, etc., o pueden incluir líneas celulares inmortalizadas, incluidas las líneas celulares clonales. Los ejemplos no limitantes de células bacterianas incluyenEscherichia coli, Yersinia enterocolitica, Brucella sp., Salmonella tymphimurium, Serratia marcescens,oBacillus subtilis.Los ejemplos no limitantes de células fúngicas incluyenYarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae,oSchizosaccharomyces pombe.Los ejemplos no limitantes de células de insecto incluyen las células derivadas deDrosophila melanogaster,tales como las células Schneider 2, líneas celulares derivadas del gusano cogolleroSpodopterafrugiperda,como las células Sf9 y Sf21, o células derivadas del gusano de la colTríchoplusia ni,como las células High Five™. Un ejemplo no limitante de células humanas incluye la línea celular humana HeLa (cáncer de cuello uterino). Otras líneas celulares humanas habituales en la práctica del cultivo de tejidos incluyen, entre otras, células 293 de riñón embrionario humano (células HEK), DU145 (cáncer de próstata), Lncap (cáncer de próstata), MCF-7 (cáncer de mama), MDA-MB-438 (cáncer de mama), PC3 (cáncer de próstata), T47D (cáncer de mama), THP-1 (leucemia mieloide aguda), U87 (glioblastoma), SHSY5Y (neuroblastoma) o células Saos-2 (cáncer de huesos). Un ejemplo no limitante de células de primate son las células Vero (línea celular epitelial renal deChlorocebus,el mono verde africano) y las células COS. Los ejemplos no limitantes de células de roedor son las líneas celulares de rata GH3 (tumor pituitario), CHO (ovario de hámster chino), PC12 (feocromocitoma), o la línea celular MC3T3 (bóveda craneal embrionaria de ratón). Dichas células se pueden obtener de una variedad de fuentes comerciales e instalaciones de recursos de investigación, tales como, por ejemplo, la American Type Culture Collection (Rockville, MD).
Las células pueden tener una membrana celular intacta. En otras realizaciones, la membrana celular puede permeabilizarse (transitoria o permanentemente) para permitir la difusión de componentes a través de la membrana celular que no se transportan o se transportan de manera menos eficaz a través de una membrana celular intacta. Los detergentes adecuados para la permeabilización de la membrana celular incluyen, entre otros, saponinas (por ejemplo, digitonina), T riton™ X-100 o polisorbato 20. Las células pueden estar vivas o viables, o pueden ser no viables.
Los expertos en la técnica conocen los métodos para introducir polipéptidos y/o ácidos nucleicos en las células viables, y pueden incluir coprecipitación con fosfato cálcico, electroporación, microinyección, fusión de protoplastos, lipofección, transfección mediada por exosomas, transfección con reactivos de transfección de tipo poliamina, bombardeo de células mediante microproyectiles de tungsteno recubiertos de ácido nucleico, introducción de partículas virales, etc. Dicha introducción también puede denominarse administración, transfección o transformación. También se pueden emplear péptidos penetrantes en las células (CPP) para introducir polipéptidos o ácidos nucleicos al interior de las células. La translocación de los CPP se puede clasificar en tres mecanismos de entrada principales: penetración directa en la membrana, entrada mediada por endocitosis y translocación mediante la formación de una estructura transitoria. Los CPP normalmente tienen una composición de aminoácidos que contiene una alta abundancia relativa de aminoácidos cargados positivamente, tales como lisina o arginina, o bien tiene secuencias que contienen un patrón alternante de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos hidrófobos no polares. Estos dos tipos de estructuras se denominan policatiónicas o anfipáticas, respectivamente. Una tercera clase de CPP son los péptidos hidrófobos, que contienen sólo restos apolares, con carga neta baja o tienen grupos de aminoácidos hidrófobos que son cruciales para la captación celular. Uno de los CPP iniciales descubiertos fue el activador transcripcional transactivador (Tat) del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), que se descubrió que era captado eficientemente desde los medios circundantes por numerosos tipos de células en cultivo. Desde entonces, el número de CPP conocidos se ha ampliado considerablemente y se han generado moléculas pequeñas que son análogos sintéticos con propiedades más eficaces de transducción de proteínas. Los CPP incluyen, entre otros, Penetratin, Tat (48-60), Transportan y (R-AhX-R4) (Ahx = aminohexanoílo). La patente de los EE. UU. Us 8372951, da a conocer un CPP derivado de la proteína catiónica de eosinófilos (ECP) que exhibe una alta eficiencia de penetración celular y poca toxicidad. También se dan a conocer aspectos de la administración de CPP con su carga a un sujeto vertebrado. Otros aspectos de los CPP y su ejecución se describen en las patentes de los EE. UU. US 8575305; US 8 614 194 y US 8044019. Los CPP pueden conjugarse o formar complejos con la carga como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante un enlace tioéter o mediante la formación de partículas.
Se pueden proporcionar moléculas de ácido nucleico expresables, tales como por ejemplo casetes de expresión o vectores de expresión, que codifican polipéptidos o ARN de interés, como se conoce en líneas generales en la técnica. Una molécula de ácido nucleico expresable normalmente puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés y/o una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de ARN de interés y uno o varios promotores unidos operativamente a dichas moléculas de ácido nucleico. El promotor puede seleccionarse o configurarse para efectuar la expresión del polipéptido y/o ARN de interés en una célula de interés, tal como una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula animal, una célula de mamífero, una célula humana o célula de mamífero no humano.
Las células pueden ponerse en contacto con el agente en estudio añadiendo el agente en estudio al medio de cultivo en el que se cultivan las células. Los ácidos nucleicos que codifican el agente en estudio se pueden proporcionar a las células comprendidos dentro de un vector en las condiciones conocidas por el experto en la técnica y como se describe en otra parte de la presente memoria. Como alternativa, se pueden proporcionar a las células ácidos nucleicos que codifican el agente en estudio a través de un vector vírico, es decir, las células se ponen en contacto con partículas víricas que comprenden ácidos nucleicos que codifican el agente en estudio. Los vectores víricos generalmente se han modificado para que carezcan de la capacidad de producir las proteínas víricas necesarias para una infección productiva. En realizaciones concretas, el agente en estudio puede identificarse como un agente útil como medicamento según se describe en la presente memoria si el agente mejora la señalización de Wnt/p-catenina mediada por el complejo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP al menos 10 veces más, al menos 20 veces más, al menos 30 veces más, al menos 40 veces más, al menos 50 veces más, al menos 100 veces más, al menos 250 veces más, al menos 500 veces más, al menos 750 veces más, al menos 1000 veces más, al menos 1 x 104 veces más, o al menos 1 x 105 veces más en comparación con la línea base o el fondo de señalización de Wnt/p-catenina mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP inducida por una sustancia neutra o control negativo, por ejemplo, medido en un ensayo que se describe en otra parte de la presente memoria.
El agente en estudio puede identificarse como un agente útil como medicamento según se describe en la presente memoria si la actividad de señalización de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP inducida por dicho agente es al menos 3,5 veces más, al menos 5 veces más, en al menos 10 veces más, al menos 15 veces más, al menos 20 veces más, al menos 25 veces más, al menos 50 veces más, al menos 100 veces más, al menos 500 veces más, al menos 1000 veces más, al menos 1 x 104 veces más, o al menos 1 x 105 veces más que la actividad de señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP inducida por dicho agente, en ausencia de RECK y/o GPR124.
Los agentes en estudio que inicialmente se identifican que son útiles como medicamentos según se describe en la presente memoria mediante cualquiera de los métodos de detección anteriores se pueden analizar adicionalmente para validar la actividad aparentein vitro, in vivooex vivo,mediante modelos animales adecuados que imitan trastornos neurovasculares o trastornos del sistema nervioso central (SNC) que comprenden disfunción neurovascular en los humanos.
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Los aspectos y realizaciones de la invención aquí descritos están respaldados adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Un mecanismo molecular para la señalización específica del ligando Wnt
1. Material y métodos
1.1. Líneas de pez cebra
El pez cebra(Danio rerio)se mantuvo a 28 °C en un ciclo de 14 h de luz y 10 h de oscuridad. Los embriones se obtuvieron y criaron en condiciones estándares de acuerdo con las directrices éticas y de bienestar animal europeas y nacionales (número de aprobación del protocolo: CEBEA-IBMM-2017-22:65). La estadificación se realizó según Kimmel et al. (C. B. Kimmel, W. W. Ballard, S. R. Kimmel, B. Ullmann, T. F. Schilling,Dev. Dyn.203, 253-310 (1995)). Las líneas transgénicas y mutantes caracterizadasTg(kdrl:GFP)s843, Tg(kdrl:ras-mCherry)s896ygpr124s984 (Danio rerio)se utilizaron en este estudio (B. Vanhollebeke et al.,Elife.4, 1-25 (2015); S-W. Jin, D. Beis, T. Mitchell, J.-N. Chen, D. Y. R. Stanier,Development.132, 5199-209 (2005); N. C. Chi et al.,Genes Dev.22, 734-739 (2008)).
1.2. Morfolinos, construcciones de ARN y microinyección.
Los Morfolinos bloqueadores del ayuste contragpr124(5’-ACTGATATTGATTTAACTCACCACA-3’) (B. Vanhollebeke y col.,Elife.4, 1-25 (2015)) se obtuvieron de Gene Tools (Eugene, OR) y se inyectaron 2 ng en la etapa de una célula. Los ARNm sintéticos se transcribieron a partir de plásmidos pCS2 después de la digestión con NotI utilizando el kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, Carlsbad, CA) y se inyectaron en un embrión de pez cebra en la etapa de una célula.
1.3. Construcciones de plásmidos de expresión
Todos los componentes de señalización de Wnt y otras construcciones se expresaron a partir del promotor del CMV del vector pCS2 después de la recombinación usando la clonación In-Fusion (Takara, Mountain View, CA) excepto Fz1 (addgene #42253) y Fz5 (addgene #42267). Se generaron variantes por mutación puntual, deleciones y quimeras mediante la clonación In-Fusion y solapamiento de los productos de PCR en tándem. Todas las construcciones se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. Las deleciones de variantes de Reck corresponden a los siguientes aminoácidos: ReckACK1: 46-93; ReckACK2: 113-150; ReckACK3: 160-206; ReckACK4: 225-272; ReckACK5: 301 -347; ReckACK1-5: 46-347; ReckACRD: 352-484 y ReckAKAZAL: 636-798. La etiqueta HA se insertó después del resto 22 en Reck, del resto 49 en Gpr124 y del resto 22 en Fz5. La etiqueta FLAG se insertó después del resto 49 en Gpr124.
1.4. Cultivo celular y líneas celulares mutantes de HEK293 (T)
Las células HEK293T se obtuvieron de la ATCC (CRL-3216) y Jeremy Nathans (John Hopkins) proporcionó amablemente la línea celular HEK293 STF. Las células WT y mutantes se cultivaron en el medio DMEM/F12 (Lonza, Basilea, Suiza) suplementado con suero bovino fetal al 10 % y se mantuvieron en una incubadora humidificada equilibrada con CO2 al 5 %.GPR124yRECKfueron invalidados genéticamente utilizando estrategias CRISPR/Cas9 en las células HEK293 STF, yLRP5, LRP6yFZfueron invalidados de manera similar en las células HEK293T. Las secuencias guía de CRISPR/Cas9 se diseñaron utilizando el sitio web http://crispr.mit.edu/ y se clonaron en pSpCas9(BB)-2AGFP (F. A. Ran et al.,Nat. Protoc.8, 2281-308 (2013)). El 1 % superior de las células GFP+ se aisló mediante FACS (AriaIII, BD Biosciences, San José, CA) 48 h después de la transfección y se distribuyó en placas de 96 pocillos para la expansión clonal. Para facilitar la caracterización genética de las líneas celulares mutantes, se contraseleccionaron clones que generaban curvas de fusión derivadas con picos múltiples en el análisis de fusión de alta resolución. Para cada sitio diana, se identificaron las mutaciones mediante secuenciación de Sanger de ambos productos de PCR de ~1000 pb centrados en el sitio del motivo adyacente al protoespaciador (PAM), así como al menos ocho subclones del producto de PCR en pCRTM-Blunt II-TOPO® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Las líneas celulares mutantes se obtuvieron mediante mutagénesis iterativa mediada por CRISPR/Cas9.
1.5. Ensayos duales de luciferasa STF
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se transfectaron después de 24 h por triplicado con Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). La cantidad de ADN plasmídico transfectado por pocillo se optimizó para cada vector de expresión: luciferasa deRenilla(0,5 ng) (fue proporcionada amablemente por Jeremy Nathans (John Hopkins)), ligandos Wnt (20 ng), receptores Fz (5 ng), Lrp (2,5 ng), Gpr124 (10 ng), Reck (5 ng) y Dkk-1 (10 ng) a menos que se indique lo contrario. La cantidad total de ADN se ajustó a 100 ng por pocillo con el vector pCS2 vacío. Se realizaron ensayos de luciferasa duales utilizando la línea celular STF o cotransfectando 20 ng de plásmido M50 Super 8x TOPFlash (plásmido Addgene n.° 12456). Las células se recolectaron en tampón de lisis pasivo (E1960, Promega, WI) y la actividad de las luciferasas de luciérnaga yRenillase midió secuencialmente utilizando el sistema de ensayo dual del indicador de luciferasa (E1960, Promega, Madison, WI) 48 h después de la transfección. Los ensayos de competición de la fig. 1C se realizaron sembrando las células como una mezcla 1:1:1 con una confluencia del 90 % en placas de 96 pocillos 24 h después de la transfección. La actividad luciferasa se midió 24 h después del cocultivo.
1.6. Ensayo de inmunofluorescencia y ligación en proximidad.
Las células se cultivaron en cámaras recubiertas de vidrio (IBIDI, Martinsried, Alemania) y se transfectaron después de 24 h con Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 10 min a la temperatura ambiente (RT) 48 h después de la transfección. Para la tinción por inmunofluorescencia (IF), las células se bloquearon en BSA al 1 % en PBS durante 30 min antes de exponerlas a anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Para la tinción de ligandos Wnt con anti-V5, las células se lavaron adicionalmente durante 10 min en Tween 20 al 0,1 % en PBS antes de la incubación con la solución de anticuerpo secundario. Para el ensayo de ligación en proximidad (PLA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), las células se bloquearon durante 30 min a 37 °C con la solución de bloqueo proporcionada por el fabricante antes de incubarlas con los anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces y se incubaron con las sondas de PLA anti-conejo PLUS y anti-ratón MINUS durante 1 h a 37 °C. Después de dos lavados con PBS, las células se incubaron con la solución de ligación Duolink durante 30 min a 37 °C. Después de dos lavados con PBS, las células se incubaron con la solución de amplificación Duolink durante 100 min a 37 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-V5 monoclonal de ratón (R96025, Life Technologies, Carlsbad, CA) a 1:500 para IF y PLA, anti-HA policlonal de conejo purificado (H6908, St. Louis, MO) a 1:400 para IF y PLA, y anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa488 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a 1:5000. Las células se tiñeron durante 2 min con Hoechst diluido a 10 pg ml-1 en PBS.
1.7. Transferencia de tipo Western, transferencia puntiforme y coinmunoprecipitación
Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-DVL2 de conejo (1:1000, 3216, Cell Signaling Technology, Leiden, Países Bajos), anti-DVL2-fosfo T224 de conejo (1:1000, ab124941, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y anti-p-actina de ratón (1:50000, A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), anti-GFP de pollo (1:5000, G<f>P-1010, Aves, Tigard, OR) y anti-FLAG M2 monoclonal de ratón (1:1000, F1804, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los análisis de transferencia puntual se realizaron de acuerdo con los protocolos estándares con un aparato BioDot SF (Bio-Rad, Munich, Alemania). Se colocaron diluciones en serie del sobrenadante sobre una membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Después del secado, la membrana se incubó con los anticuerpos como se describió anteriormente para las transferencias de tipo Western. Para la coinmunoprecipitación, las células HEK293T transfectadas de placas de 6 pocillos se lavaron dos veces y se despegaron de la placa con PBS. Las células se sedimentaron por centrifugación y se lisaron en tampón de lisis (NaCl a 150 mM, Tris a 25 mM (pH 7,5), NP40 al 1 %) que contenía el inhibidor de proteínas (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) durante 30 min a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se incubó con gel de afinidad por el anti-FLAG M2 (A2220, Sigma, St. Louis, MO) durante 3 h a 4 °C. Las perlas se lavaron cinco veces con el tampón de lisis y se hirvieron en una cantidad igual de tampón de muestras de Laemmli a 2x.
1.8. Microscopía y procesamiento de imágenes.
Se tomaron imágenes de células y embriones de pez cebra con un microscopio confocal LSM710 y las imágenes se procesaron en el programa ImageJ. Se tomaron imágenes de fenotipos de fusión ocular con una Leica M165 FC. Las representaciones de la vasculatura cerebral se generaron con el programa Imaris (BitPlane, Zurich, Suiza). El porcentaje de áreas positivas para PLA (PLA+) y áreas positivas para DAPI (DAPI+) se calculó con ImageJ con las imágenes que contenían aproximadamente de 50 a 100 células. El área PLA+ se midió después de aplicar manualmente un umbral fijo. El área DAPI+ se midió después de aplicar el método de umbral "predeterminado" en ImageJ.
1.9. Modelización estructural
La estructura de Wnt8a deXenopus(ID de PDB: 4F0A) (C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. García,Science.337, 59-64 (2012)) se utilizó como modelo inicial para Wnt7a. Los restos faltantes y las sustituciones se modelizaron con el programa Modeller (B. Webb, A. Sali,Current Protocols in Bioinformatics(John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU., 2016), vol. 54, págs. 5.6.1-5.6.37). La estrategia de modelización incluyó tener en cuenta los puentes disulfuro existentes como se observaban en Wnt8. Los mejores modelos iniciales se sometieron a una minimización de energía en gradiente conjugado al vacío con el Ca restringido y luego liberado en un segundo paso de minimización. Luego, estos modelos se incluyeron en una caja de agua y se logró la neutralidad eléctrica agregando contraiones de Na+ a 150 mM. A todo el sistema se le minimizó nuevamente la energía en 3000 pasos. La simulación de dinámica molecular se realizó durante 0,5 ns con el programa NAMD 2.7 a una temperatura constante (310 K) y una presión constante (1 atm), con límites periódicos y utilizando CHARMM36 como campo de fuerza (JC Phillips et al.,J. Comput. Chem.26, 1781-1802 (2005). Se utilizó un salto de tiempo de 2 fs para integrar las ecuaciones de movimiento. Las interacciones de corto alcance se cortaron a 12 Á y se utilizó el método de Ewald de malla de partículas lisas para calcular las interacciones electrostáticas. Los átomos de hidrógeno se restringieron mediante el algoritmo SHAKE. El modelo resultante es una representación promedio de la simulación estable.
1.10. Proteínas recombinantes y péptidos sintéticos
Las proteínas de fusión Reck-CK-Fc se recuperaron en el medio de expresión FreeStyle 293 sin suero (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a partir del sobrenadante de cultivos de células HEK293T 72 h después de la transfección con Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Después de la recogida, los sobrenadantes se concentraron 50 veces por centrifugación (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) o se sometieron a la purificación por afinidad con proteína G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La pureza de la proteína se calculó mediante tinción con azul de Coomassie después de PAGE. Los péptidos conectores de Wnt sintéticos se obtuvieron de Chinapeptide Co., Ltd con purezas superiores al 90 %.
1.11. Calorimetría isotérmica de titulación
Las titulaciones por ITC se llevaron a cabo en un Affinity ITC (TA Instruments). Antes de la medición, Reck-CK-Fc y todas las fusiones de Reck-CK-Fc se dializaron contra un tampón de Tris-NaCl (Tris a 50 mM, pH 8, NaCl a 300 mM). En cada caso, los péptidos derivados de Wnt se prepararon con el tampón del último paso de la diálisis de proteínas. Las muestras se filtraron y desgasificaron antes de ser evaluadas en el calorímetro y las titulaciones se realizaron a 25 °C. Todos los experimentos consistían en la inyección de volúmenes constantes de 2 gl de reactivo de valoración en la celda (200 gl) con una velocidad de agitación de 75 rpm. La concentración nominal de la muestra estaba entre 20 gM y 40 gM en la celda y entre 400 gM y 1,0 mM en la jeringa. La concentración real de las muestras se determinó después de la diálisis o el intercambio de tampón midiendo su absorción a 280 nm o el método BCA. Todos los datos se analizaron utilizando los paquetes de programas MicroCal Origin ITC 7.0 y NanoAnalyze.
1.12. Microscopia de fuerza atómica
Se limpiaron cubreobjetos de vidrio recubiertos con una fina capa de oro en un limpiador de radiación ultravioleta y ozono (UV-O) (Jetlight) durante 15 min y posteriormente se sumergieron durante la noche en una solución de etanol que contenía ácido 16-mercaptododecahexanoico a 1 mM y 1-mercapto-1-undecanol en una relación volumétrica de 1:99. Luego se enjuagaron los sustratos con etanol, se secaron con N2 y se agregaron a una solución que contenía volúmenes iguales de 20 mg ml-1 de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 50 mg ml-1 de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) durante 30 min. Las superficies activadas por NHS que se obtuvieron se enjuagaron con agua ultrapura y se incubaron con 100 gl de una solución de proteína G de 10 gg ml-1 durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se lavaron las muestras con tampón de lavado (3 x 5 min) y se incubaron adicionalmente con 100 gl del tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, 50 gl de una solución de Reck-CK-Fc a 0,2 gg ml-1 se añadieron a los sustratos durante 1 h, se enjuagó con el tampón de lavado y posteriormente se usó para los experimentos de AFM. Las mediciones de espectrometría de fuerza de moléculas sueltas (SMFS) se realizaron en el tampón PBS a temperatura ambiente con un AFM multimodo Nanoscope VIII (Bruker). Se utilizaron unos voladizos triangulares de AFM (MSCT, Bruker) con puntas de nitruro de silicio y una constante elástica nominal de entre 0,01 y 0,06 N m-1. Los voladizos se calibraron al final de cada experimento utilizando el método de ruido térmico como se describe en Butt et al.'Calculation of termal noise in atomic force microscopy”.Nanotechnology6, 1-7 (1995). Las puntas funcionalizadas se modificaron utilizando un conector NHS-PEG27-Malemida, siguiendo un protocolo que se describe en Wildling et al.,”Probing binding pocket of serotonin transporter by single molecular force spectroscopy on living cells”.J. Biol. Chem.287, 105-113 (2012), para unir covalentemente el Pep7b que une el resto de cisteína agregado en el extremo carboxilo. Después de la funcionalización, los voladizos se lavaron con PBS (3 x 5 min) y se almacenaron en pocillos individuales de una placa multipocillo que contenían 2 ml de PBS por pocillo a 4 °C hasta su uso en experimentos de AFM. Las curvas de fuerza en función de la distancia se registraron como matrices de 32 x 32 píxeles en áreas de 1 x 1 gm2, utilizando una fuerza aplicada de 250 pN, un tiempo de contacto de 0,25 s y una velocidad constante de aproximación y retracción de 1 gm s-1. Para las mediciones de espectroscopía de fuerza dinámica, la velocidad de retracción del voladizo se varió de la siguiente manera: 20 nm s-1, 100 nm s-1, 200 nm s-1, 1 gm s-1, 2 gm s-1, 10 gm s-1 y 20 gm s-1. Típicamente, se realizaron al menos 2000 curvas de fuerza en función de la distancia para cada voladizo a una velocidad de retracción concreta. Los datos recogidos se analizaron con el programa Nanoscope Analysis (Bruker). Se analizó el segmento de retracción de cada curva y los eventos de desvinculación se consideraron específicos si se producían a una distancia de entre 5 y 50 nm desde el punto de contacto. La fuerza de adhesión mínima se utilizó además para calcular las probabilidades de unión y para construir histogramas de distribución de fuerza. Para reconstruir el panorama energético de las interacciones medidas, las tasas de carga se calcularon a partir de la curva fuerza frente al tiempo, como la pendiente del evento de adhesión antes de que la punta del voladizo salte a la superficie. Luego se representó la dependencia de la fuerza con la tasa de carga en gráficos de espectroscopía de fuerza dinámica.
I . 13. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa GraphPad. Los datos representan la media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante ANOVA unilateral (prueba de Dunnetta posteriori)y la prueba de latde Student para comparaciones múltiples y únicas de datos con distribución normal (ensayos STF y PLA) y mediante la prueba de Kruskal-Wallis (prueba de Dunna posteriori)para comparaciones múltiples de datos que no siguen una distribución normal (cuantificaciones de CtA); *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.
2. Resultados
2.1. Reck es un receptor específico de Wnt7 independiente de Frizzled
Las relaciones de unión Wnt/Fz son promiscuas, pues múltiples Wnt compiten por unirse a cada Fz y varias Fz son capaces de responder a una sola Wnt. Los estudios cristalográficos recientes confirmaron que la química de la interacción de Wnt/Fz es incompatible con el emparejamiento inequívoco de Wnt y Fz, en donde el contacto de Wnt/Fz está dominado por restos conservados o las mismas modificaciones químicas (C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia,Science.337, 59-64 (2012)). Estas observaciones plantean la cuestión de cómo interpretan las células los patrones de expresión solapantes espacial y temporalmente de múltiples ligandos Wnt que a veces tienen funciones biológicas opuestas.
Un ejemplo pertinente es el control exclusivo del desarrollo vascular del prosencéfalo y la médula espinal ventral de los mamíferos por parte de Wnt7a y Wnt7b (JM Stenman et al.,Science.322, 1247-1250 (2008); R. Daneman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci..USA. 106, 641-646 (2009); S. Liebner et al.,J. CellBiol.183, 409-417 (2008)). Específicamente, para responder al Wnt7 derivado del progenitor neural y activar la señalización de la WntIp-catenina, las células endoteliales del cerebro (CE) deben expresar Gpr124, un miembro huérfano de la clase de adhesión de los receptores acoplados a proteínas G. (M. Cullen et al.,Proc. Nati. Acad. Sci.U. S. A. 108, 5759-5764 (2011); F. Kuhnert et al.,Science.330, 985-989 (2010); K. D. Anderson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 108, 2807-2812 (2011); Y. Zhou, J. Nathans,Dev. Cell.31,248-256 (2014); E. Posokhova et al.,Cell Rep.10, 123-130 (2015); B. Vanhollebeke et al.,Elife.4, 1-25 (2015)) así como la glicoproteína Reck anclada a GPI (B. Vanhollebeke et al., 2015; F. Ulrich et al.,Development.143, 147-159 (2015)). Gpr124 y Reck interaccionan físicamente y estimulan sinérgicamente respuestas específicas de Wnt7 (B. Vanhollebeke et al., 2015; C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans,Neuron.95, 1056-1073 (2017)), pero se desconoce cómo este módulo de señalización puede discriminar Wnt7 de otros ligandos Wnt expresados localmente.
Se determinó cómo se reconoce específicamente Wnt7 dentro de este módulo de señalización, una cuestión inherentemente complicada por la expresión ubicua de los receptores Frizzled y sus correceptores Lrp5/6 en las células de los vertebrados. Por lo tanto, se generó un primer conjunto de líneas celulares con eliminación genética de los componentes del complejo receptor en los nodos definidos actuando selectivamente sobre (i) los diez genesFZ (FZ1-10-1-),(ii)LRP5yLRp 6 (LRP5-/-;LRP6-/-)o (iii)GPR124yRECK (GPR124-I-;RECK-1-),mediante mutagénesis multiplexada con CRISPR/Cas9 en las células HEK293. Para identificar los determinantes de la unión de Wnt7, se expresaron transitoriamente los ligandos Wnt etiquetados con V5 en estas líneas celulares. Wnt7a-V5, pero no Wnt3a-V5, se pudo inmunodetectar en la membrana plasmática de las células WT,FZ1-10-1-yLRP5-/-;LRP6-/-,pero no en las célulasGPR124-I-;RECK-1-(figura 1A). La restauración ectópica de la expresión de Reck, sola o en combinación con Gpr124, era suficiente para restaurar específicamente el etiquetado de la membrana con Wnt7a-V5 en estas células, mientras que la expresión de Gpr124 sola no lo fue (figura 1B). Como se esperaba, Fz5 era competente para la unión de Wnt7a-V5, lo que refleja la competición de este receptor Frizzled para intervenir en la señalización basal de Wnt7.
Utilizando experimentos de competición celular, se descubrió que Reck recluta a Wnt7a en ausencia de Fz, dado que el cocultivo de células FZ<m>0'/' que expresan ectópicamente Reck pero no Gpr124ñICD no pudo reducir drásticamente la señalización Wnt7a-Fz5 en las células indicadoras vecinasGPR124-I-;RECK-1-Super Top Flash (STF) (figura 1C). Es de destacar que, en este ensayo de captura de ligando, a Gpr124 le faltaba su dominio ICD del extremo carboxilo para restringir el análisis a las partes expuestas a la superficie del complejo Gpr124IReck. A continuación, se utilizó PLA para mapear los dominios de Reck necesarios para la unión de Wnt7a. Reck contiene cinco motivos de nudos de cisteína (CK) en el extremo amino, un dominio rico en cisteínas (CRD) y tres motivos Kazal intercalados con los motivos similares a EGF que preceden al sitio de anclaje de GPI. Se generó una colección de variantes de deleción marcadas con epítopos HA para cada dominio de Reck y se cuantificaron las señales de PLA. Este análisis reveló que el dominio del nudo de cisteínas del extremo amino, y más en particular CK4 y CK5, eran necesarios para la unión (figura 1D). De acuerdo con estos resultados, la expresión de ReckñCK4 también fue inactiva en los ensayos de competición (figura 1C).
Aunque Reck parece ser el determinante dominante de la unión de Wnt7, se sabe que su función en la señalización de Wnt depende de su capacidad para formar un complejo con Gpr124 a través de su dominio CK del extremo amino (Y. Zhou, J. Nathans,Dev. Cell.31,248-256 (2014); B. Vanhollebeke et al.,Elife.4, 1-25 (2015)), un dominio que en la presente memoria se muestra implicado adicionalmente en la unión de Wnt7a. A diferencia de HA-Reck y HA-Fz5, HA-Gpr124 no genera señales de PLA cuando se expresa con Wnt7a-V5 (figura 1E). Sin embargo, se detectó un aumento de 4 veces en las señales de PLA de Wnt7a-V5/HA-Reck tras la coexpresión de Gpr124 sin etiquetar (figura 1F). Esta estimulación de la unión por Gpr124 dependía de CK1 y CK2 de Reck, de acuerdo con la función de los motivos CK1 del extremo amino en la formación del complejo Gpr124/Reck (C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans,Neuron.95, 1056-1073 (2017)). En resumen, con la suposición tácita de que los PLA actúan como una aproximación válida para la interacción directa entre un ligando extracelular que puede difundir y su receptor de membrana, estos resultados sugieren que Reck constituye el primer receptor descrito que es específico del ligando Wnt e independiente de Fz, cuya unión a Wnt7 está reforzada por la unión proximal de Gpr124 dentro del dominio CK (figura 1G).
2.2. El reconocimiento de Wnt7 implica una región conectora de ligandos Wnt muy divergente y dúctil
Los ligandos Wnt son notoriamente refractarios a la producción recombinante de alto nivel, lo que impide los estudios de interacción bioquímica o biofísica sin células entre el Wnt7 recombinante completo y Reck.
Los ligandos Wnt adoptan una estructura de dos dominios que recuerda a una mano humana que pellizca el dominio globular rico en cisteínas (CRD) de Fz a través del 'pulgar' palmitoilado del dominio del extremo amino (NTD) del ligando y los restos hidrófobos del dominio 'índice' del extremo carboxilo (CTD). Las estructuras implicadas en la unión de Fz se localizan principalmente en los extremos del "pulgar" y del "índice". Los dos dominios están conectados a través de una región conectora flexible entre los dominios del NTD.
Se generó una colección de variantes de Wnt7 en las que se habían delecionado determinados dominios o restos, o que se manipularon genéticamente para que llevaran determinados dominios de otros ligandos Wnt (figura 2A). Cada uno de estos ligandos quiméricos se sometió a un PLA, lo que reveló que la unión de Reck se produce exclusivamente en el NTD de Wnt7a. Sorprendentemente, el Wnt7aETD por sí solo se une a Reck tan potentemente como el Wnt7a completo, mientras que Wnt7aCTD no lo hizo (figura 2B). El ácido palmitoleico implicado en la unión de Fz no participó en la interacción de Reck como el mutante Wnt7aS206A incapaz de ser palmitoilado en la serina 206 unida a Reck de manera eficiente. El modo de reconocimiento de NTD de Wnt7a por Reck se confirmó mediante ligandos Wnt7a quiméricos en los que los CTD se intercambiaron con dominios equivalentes de Wnt8a deXenopus(XWnt8a) y Wnt4 y Wnt16 murinos. Estos ensayos de unión revelan que Reck discrimina entre los ligandos Wnt al reconocer un motivo incluido en el NTD de Wnt7a, en sitios distintos de los comprometidos por Fz.
Las variantes de NTD más pequeñas que carecen de la región conectora, Wnt7a1-212 y Wnt71-237, no se unían a Reck. Este análisis mutacional combinado con la segregación espacial de la región conectora de Wnt7a lejos de los sitios de unión de Fz sugiere que Reck descodifica el Wnt7a, al menos en parte, a través de este motivo conector. La región conectora, que es el motivo más variable de toda la familia de ligandos Wnt, exhibe una fuerte conservación evolutiva entre los ortólogos de Wnt7 en todo el clado de los vertebrados (figura 2D). Para mapear con precisión el sitio de interacción, los presentes inventores analizaron la señalización de STF dependiente de Gpr124/Reck de una colección de 101 variantes de un solo resto de Wnt7a (figura 2C). Los restos mutados correspondieron a restos de NTD expuestos en la superficie estricta o químicamente conservados entre Wnt7a y Wnt7b, pero que no se encontraban en XWnt8a ni en ninguno de los otros ligandos Wnt. Como se muestra en la figura 2C, mientras que aproximadamente el 80 % de las variantes examinadas eran tan activas como el Wnt7a WT, solo ocho variantes de Wnt7a (subrayadas) redujeron la señalización dependiente de Gpr124/Reck a menos del 10 %. Todos los restos críticos menos uno (I37) se agrupaban en la parte superior o posterior de la estructura de Wnt7a predicha, con seis mapeos adicionales en el dominio conector. Todos los restos críticos se conservan estrictamente entre los ortólogos de Wnt7, desde humanos hasta peces, y están ausentes en cualquier otro Wnt, incluido Wnt3a (figura 2D). Los presentes inventores investigaron más a fondo si la inactividad de las variantes del conector Wnt7 podría resultar de una unión defectuosa a LRP5/6, Reck o ambos. De acuerdo con una función en la unión de Reck, Wnt7a4A, en la que varían cuatro restos de Wnt7a (V241A, F251A, L252A, K262A; en la que las sustituciones indican la posición de los aminoácidos en el polipéptido precursor de mWnt7a) dentro de una región conectora, mostró señales reducidas de Reck en el PLA en comparación con las de Wnt7a WT. Esta menor actividad se produjo a pesar de que la tasa de secreción mejoró ligeramente (figura 2E).
Para investigar la unión de Reck y Wnt7 en un sistema sin células, se recuperaron las proteínas de fusión Reck-CK-Fc de gran pureza (y variantes de las mismas, a saber, HA-Reck-CKñCK1-Fc, HA-Reck-CKñCK2-Fc; HA-Reck-CKñCK3-Fc; HA-Reck-CKñCK4-Fc; y HA-Reck-CKñCK5-Fc) de sobrenadantes de las células HEK293T y se titularon con péptidos conectores de Wnt7a y Wnt7b sintéticos purificados de 29 aminoácidos de longitud (pWnt7a y pWnt7b) mediante la calorimetría isotérmica de titulación (ITC). La ITC confirmó que pWnt7a y pWnt7b se unen directamente a Reck con afinidades de 7 pM y 1,2 pM, respectivamente (figura 2F). Como controles, los péptidos sintéticos correspondientes a Wnt7a4A (pWnt7a4A) así como los péptidos conectores equivalentes de Wnt3a (pWnt3a) no mostraron ninguna unión a Reck-CK-Fc. La unión de pWnt7b requirió CK4 y CK5 de Reck, pero no CK1, CK2 ni CK3, lo que repite sorprendentemente los resultados de PLA en las células cultivadas. Para corroborar los resultados proporcionados por el análisis de la ITC, los presentes inventores utilizaron la espectroscopia de fuerza de moléculas sueltas (SMFS) para medir la afinidad de unión a nivel de una sola molécula (figura 2G). La unión de pWnt7b a Reck-CK-Fc se detectó con una constante de disociación medida (K<d>) de 5 |uM. A pesar de las diferencias fundamentales entre las dos técnicas, la ITC y la SMFS proporcionaron una estrecha coincidencia entre los valores de afinidad de unión medidos.
En conjunto, estos datos demuestran que Reck reconoce a Wnt7, al menos en parte, a través de su motivo conector "distintivo". Sin embargo, Wnt7 unido a Reck debe integrarse funcionalmente en las maquinarias eficientes de transducción y activación de señales para que las células muestren respuestas celulares potenciadas específicas de Wnt7.
2.3. Gpr124 no actúa como una señal clásica transductora de GPCR durante la señalización de Wnt7 y la angiogénesis cerebral
La propia Reck, en virtud de su modo de anclaje con GPI a la única lámina externa de la membrana plasmática, tiene un potencial limitado para transducir las señales de Wnt7 a través de la bicapa de la membrana y, por lo tanto, la transducción de señales debe depender de otros componentes del complejo receptor, a saber, Gpr124 y/o Fz/Lrp5/6.
Para descubrir este mecanismo de transducción de señales, se evaluó la relación funcional entre los complejos Gpr124 y Fz/Lrp5/6 en células cultivadas. Con el uso de las células "sin Fz" y "sin Lrp5/6", se confirmó genéticamente que la función de Gpr124/Reck depende estrictamente de la función de Fz y Lrp5/6 (figura 3A-E). Además, se confirmó que sus respectivos dominios de unión al ligando Wnt sensibles a CRD y DKK1 son esenciales para la señalización, lo que implica que Wnt7 se une y activa Fz/Lrp5/6 de una manera clásica.
Se ha demostrado que el desarrollo de la vasculatura del SNC del pez cebra depende estrictamente de la señalización de Reck/Gpr124, en un proceso de brote angiogénico que puede cuantificarse fácilmente. Por tanto, constituye un escenario privilegiado para realizar análisis estructura y funciónin vivoen respuesta a los niveles de entrada fisiológicos de Wnt7 (B. Vanhollebeke et al.,Elife.4, 1-25 (2015); N. Bostaille, A. Gauquier, L. Twyffels, B. Vanhollebeke,Biol. Open.5, 1874-1881 (2016)). Mediante inyecciones de ARNm sintético en los embriones de la etapa unicelular WT ogpr124-/-, los presentes inventores comenzaron evaluando la actividad de tres variantes de Gpr124 (figura 4A) que carecían de la parte extracelular del extremo amino (Gpr124ñECD), de la parte con siete tramos transmembranarios (Gpr124ñ™2-7) o de la extensión citoplasmática del extremo carboxilo (Gpr124ñICD). Mientras que la expresión ectópica de Gpr124ñECD y Gpr124ñICD no restauró la angiogénesis cerebral en los mutantesgpr124,la actividad de Gpr124ñ™2-7 fue suficiente para desencadenar la angiogénesis cerebralin vivo(figura 4B, C) y la actividad de Wnt en los ensayos STFin vitro(figura 4D).
Que Gpr124ñ™2-7 mantuviera su la capacidad de competir no se había previsto: Gpr124 es un GPCR, una superfamilia de receptores que clásicamente transmite los estímulos extracelulares al interior de la célula mediante la remodelación conformacional inducida por ligando de los siete tramos transmembranarios, que están ausentes en la proteína mutante por modificación genética Gpr124ñ™2-7. Según estos resultados, parece que Gpr124 no actuaría como un GPCR clásico cuando promueve la señalización de Wnt7, ya que no requiere la transducción de señales a través de la membrana. En cambio, Gpr124 aparentemente actúa en este módulo como una proteína transmembranaria incapaz de transducir la señal cuya actividad depende del dominio extracelular de unión a Reck (ECD) y del dominio intracelular conformacionalmente desacoplado (ICD). Los inventores actuales plantearon la hipótesis de que el ICD de Gpr124 podría operar a través de Dishevelled, el efector crucial de la señalización de Wnt que interacciona con Fz. Esta "hipótesis de Dvl" se basa en los hallazgos en los que se veía que Gpr125, un GPCR de adhesión estrechamente relacionado con Gpr124, interaccionaba físicamente con Dvl a través de su dominio ICD del extremo carboxilo (X. Li et al.,Development.140, 3028-3039 (2013)) y que los híbridos Gpr124/125 en los que el ICD de Gpr124 está reemplazado por el ICD de Gpr125 son capaces de promover la angiogénesis cerebral en el pez cebra (B. Vanhollebeke et al.,Elife.4, 1-25 (2015)) (véase también la figura 4E). De manera similar, los híbridos Gpr124/Fz2 (Gpr124ICDFz2) en los que se sustituyó el ICD de Gpr124 por el ICD de Fz2, que se sabe que se une a Dvl, eran competentes. Por el contrario, el Fz2 completo no lo era. En especial, la actividad de Gpr124ICDFz2 dependía de los sitios de unión a Dvl con los motivos KTxxW y ETTV dentro del ICD de Fz2 (figura 4E).
2.4. Los polímeros de Dvl ensamblan los señalosomas de Wnt específicos de ligando al conectar Fz y Gpr124
Los experimentos de coinmunoprecipitación realizados entre Gpr124 marcado con FLAG en el extremo amino y Dvl-GFP en las células HEK293TFZ1-10'1'confirmaron la interacción entre Gpr124 y Dvl (figura 5A), incluso en ausencia del ETTV del extremo carboxilo. A diferencia de Fz, Gpr124 no producía ningún aumento detectable en los niveles de Dvl fosforilados, un indicador precoz de la activación de la señalización de Wnt antes de la estabilización de la pcatenina (S. I. Yanagawa, F. Van Leeuwen, A. Wodarz, J. Klingensmith, R. Nusse,Genes Dev.9, 1087-1095 (1995); X. Huang et al.,Science.339, 1441-1445 (2013)) (figura 5B). Esta ausencia de activación de Dvl inducida por Gpr124 es coherente con los experimentos de la figura 4 que identificaron que Gpr124 era una proteína con una deficiencia de señalización. En conjunto, estos experimentos identifican a Dvl como un compañero de unión constitutivo de Gpr124 que podría intervenir en la actividad de señalización de Wnt7.
Se ha propuesto que Gpr124, Reck y Fz/Lrp5/6 forman complejos receptores de orden superior en las células cultivadas (C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans,Neuron.95, 1056-1073 (2017)). Los inventores actuales razonaron que el ICD de Gpr124 podría ensamblar este complejo a través de Dvl. De hecho, las moléculas de Dvl ensamblan los señalosomas mediante la polimerización dinámica a través de autoensamblajes de cabeza a cola de sus dominios Dix del extremo amino. Estas autoasociaciones permiten la concentración local de varias proteínas citoplasmáticas reguladoras de la señalización de Wnt, entre ellas cinasas y componentes de la maquinaria endocítica (M. Gammons, M. Bienz,Curr. Opin. Cell Biol..51, 42-49 (2018), M. Bienz,Trends Biochem. Sci.39, 487-495 (2014)). Como Dvl interacciona físicamente con Gpr124 y Fz, Gpr124 y el Wnt7 asociado a Reck podrían quedar atrapados en los señalosomas dinámicos de Wnt, aumentando así la concentración local de los ligandos Wnt7 disponibles para la señalización de Fz.
Los señalosomas de Wnt se detectan fácilmente mediante microscopía óptica como estructuras puntiformes grandes enriquecidas en Dvl que se forman en la membrana plasmática o debajo de ella (M. Bienz,Trends Biochem. Sci.39, 487-495 (2014); J. Bilic et al.,Science.316, 1619-1622 (2007); M. V. Gammons, M. Renko, C. M. Johnson, T. J. Rutherford, M. Bienz,Mol. Cell.64, 92-104 (2016)). Para determinar si Fz y Gpr124 se codistribuyen en los señalosomas de Wnt de una manera dependiente de Dvl, primero se examinó la localización de Fz-GFP y Gpr124-tagRFP expresados individualmente en las células de la capa profunda de la blástula (DEL). Fz4 decoró toda la periferia de la membrana plasmática mientras que, en cambio, Gpr124-tagRFP se acumulaba en los contactos celulares. Esta localización diferencial de la membrana se mantuvo tras la expresión de Dvl (figura 5C). De acuerdo con su capacidad de unión a Dvl, ambos receptores reclutaron a Dvl en su respectivo compartimento de membrana (figura 5D). Sin embargo, cuando se coexpresaban Gpr124-tagRFP y Fz4-GFP, la Gpr124-tagRFP permaneció anclada en las uniones intercelulares, pero Fz4-GFP se relocalizó cuantitativamente en los subdominios de membrana de Gpr124 de una manera dependiente de Dvl (figura 5E), en donde las proteínas colocalizadas en estructuras puntiformes que recuerdan a los señalosomas de Wnt, particularmente evidentes en las membranas celulares de EVL (figura 5F). Los presentes inventores utilizaron la complementación de fluorescencia bimolecular como ensayo para comprobar la interacción Fz/Gpr124 dependiente de Dvl en las células DEL. La coinyección de Gpr124-VN155 (I152L) y Fz1-VC155 de hecho generó señales de unión brillantes de una manera dependiente de Dvl (figura 5G), lo que demuestra que Fz y Gpr124 interaccionan indirectamente a través de la proteína de armazón Dvl. Esto proporciona un mecanismo molecular para la agrupación espacial de Fz/Lrp5/6 y Gpr124 junto con el Wnt7 asociado a Reck dentro de los señalosomas de Wnt dotados de potencial de discriminación del ligando Wnt, explicando así las respuestas específicas de Wnt7 de las células positivas para Gpr124/Reck (véase el modelo final, figura 6).
En resumen, este trabajo arroja los primeros conocimientos estructurales y mecanicistas sobre las capacidades de descodificación de Wnt que tienen las células de los vertebrados. También demuestra que la estructura de Wnt evolutivamente constreñida retuvo suficiente diversidad y plasticidad intrínseca para permitir las respuestas celulares específicas del ligando, una propiedad que hasta ahora se pensaba que requería ligandos de Frizzled estructuralmente no relacionados, como Norrin (M. B. Lai et al.,Cell Rep.19, 2809-2822 (2017)). Estos conocimientos estructurales sobre la evolución y función de Wnt sugieren inmediatamente que existen otros módulos de descodificación de Wnt, lo que permite ajustar con precisión los comportamientos celulares en respuesta a otros miembros de las familias Wnt o Fz.
Ejemplo 2: El reconocimiento molecular de Wnt7 por Reck disminuye al mínimo los requisitos de interacción Wnt/Fz
1. Materiales y métodos
1.1. Líneas de pez cebra
El pez cebra(Danio rerio)se crio y manipuló en las condiciones estándares siguiendo las normas del Estado de Bélgica (número de autorización de protocolo: CEBEA-IBMM-2017-22:65). Se utilizó la siguiente línea:Tg(-17.0neurog 1 :EGFP)w61(McGraw et al.,J. Neurosci28(47): 12558-69 (2008)).
1.2. Morfolinos, construcciones de ARN y microinyección
Se inyectaron los siguientes morfolinos (MO) bloqueadores del ayuste (GeneTools, Eugene, OR) en embriones en la etapa de una sola célula:wnt7aa(TTCCATTTGACCCTACTTACCCAAT, 6 ng). Los ARNm sintéticos se transcribieron a partir de plásmidos pCS2 después de la digestión con NotI utilizando el kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, Carlsbad, CA) y se inyectaron en un embrión de pez cebra en la etapa unicelular. Para la microinyección deXenopus laevis,se inyectaron 15 pg de ARNm dewnt7aownt7aK190Aownt7a1-278en un blastómero ventral del embrión en etapa de cuatro células.
1.3. Construcciones de plásmidos de expresión
Todos los componentes de señalización de Wnt y otras construcciones de expresión se expresaron a partir del promotor CMV del vector pCS2 después de la recombinación con la clonación In-Fusion (Takara, Mountain View, CA) excepto Fz1 (addgene #42253) y Fz5 (addgene #42267). Se generaron variantes con mutación en un solo sitio y delecciones mediante la clonación In-Fusion y productos de PCR solapantes en tándem. Todas las construcciones se confirmaron por secuenciación.
1.4. Cultivo celular y líneas celulares mutantes de HEK293.
Las células HEK293T se obtuvieron de la ATCC (CRL-3216) y Jeremy Nathans (John Hopkins) proporcionó amablemente la línea celular HEK293 STF. Las células se cultivaron en el medio DMEM/F12 (Lonza, Basilea, Suiza) suplementado con suero bovino fetal al 10% y se mantuvieron en una incubadora humidificada equilibrada con CO2 al 5 %. 7B.
1.5. Ensayos duales de luciferasa STF
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se transfectaron al cabo de 24 h por triplicado con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La cantidad de ADN plasmídico transfectado por pocillo se optimizó para cada vector de expresión: luciferasa deRenilla(0,5 ng), Wnt (20 ng), Fz (5 ng), LRP (2,5 ng), Gpr124 (10 ng), Reck (10 ng) a menos que se indique lo contrario. La cantidad total de ADN se ajustó a 100 ng por pocillo con el vector pCS2 vacío. Las células se recogieron en el tampón de lisis pasivo (E1960, Promega, Wisconsin) y la actividad luciferasa de luciérnaga yRenillase midió secuencialmente con el sistema Dual-Luciferase Reporter Assay (E1960, Promega, Madison, Wisconsin) 48 h después de la transfección.
1.6. Microscopía y procesamiento de imágenes
Se tomaron imágenes de embriones de pez cebra con un microscopio confocal LSM710 y las imágenes se procesaron en el programa ImageJ. Se tomaron imágenes de los fenotipos del desarrollo del pez cebra con una Leica M165 FC. Se tomaron imágenes de las larvas deXenopuscon una Olympus SZX16.
1.7. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa GraphPad. Los datos representan la media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante ANOVA unilateral (prueba de Dunnetta posteriori)y la prueba de latde Student para las comparaciones múltiples y únicas de datos que siguen una distribución normal (ensayos STF), y mediante la prueba de Kruskal-Wallis (prueba de Dunna posterior!)para las comparaciones múltiples de datos que no siguen una distribución normal (cuantificaciones de DRG); *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.
2. Resultados
Los presentes inventores identificaron en el experimento 1 que Reck discrimina entre los ligandos Wnt al reconocer un conector dentro de Wnt7a, en sitios distintos de los comprometidos por Fz. Por lo tanto, el mecanismo de unión parece compatible con la formación de un complejo Wnt7/Reck/Gpr124/Fz/LRP5/6 de orden superior que mantienen unido los armazones intracelulares, en el que Wnt7 se compromete simultáneamente por Fz, Reck y LRP5/6. Los presentes inventores revelaron además que el dominio del extremo amino de Wnt7a (Wnt7a1-278) sigue uniéndose a Reck.
A continuación, se evaluó la actividad de STF de estas variantes truncadas de Wnt7a para la señalización de Fz5 y Gpr124/Reck/Fz/LRP (figura 7A). La señalización de Wnt a través de Fz5 requirió la preservación de ambos sitios de contacto de Wnt/Fz y todas las variantes de Wnt7a que carecían de uno de ellos, mediante truncamiento o ausencia de ácido palmitoleico, no consiguieron estimular la señalización de Fz5 (figura 7A). La señalización de Gpr124/Reck/Fz1 fue igualmente sensible a los truncamientos o mutaciones de Wnt7a, con una excepción notable: el dominio único de Wnt7a1-278 mantuvo ~40 % de la capacidad de señalización a través de Gpr124/Reck/Fz1 (figura 7A, punta de flecha). Los presentes inventores propusieron que dentro de un complejo formado por Wnt7, Fz, LRP5/6 y Reck, el punto de contacto adicional proporcionado por Reck compensa la interacción faltante de Wnt/Fz en el índice del ligando.
Para diferenciar los restos que son esenciales dentro de Wnt7a para la señalización de Gpr124/Reck/Fz/LRP de la señalización de Fz5, se analizó la señalización de Gpr124/Reck/Fz/LRP o STF dependiente de Fz5 de una colección de variantes de restos únicos de Wnt7a (figura 7B, 7C). Se identificaron cuarenta y dos variantes de mWnt7a completa (en el recuadro de 7B) que son inactivas para la señalización de Fz5, pero aún activan la señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP, más en particular activan la señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP hasta al menos el 35 % de la actividad de señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP del Wnt7a maduro completo de tipo silvestre (figura 7B-7C, véase la tabla 3). Treinta y una de estas variantes, más en particular, las variantes Wnt7a Q48A (Q17A), I51A (I20A), P56A (P25A), A58R (A27R); I59A (I28A); E64A (E33A); M68A (M37A), L70A (L39A), E72A (E41A); F75A (F44A); V99A (V68A); I160A (I129A); F162A (F131A); K164A (K133A); I172A (I141A); R189A (R158A); K190A (K159A); K190L (K159L); K212A (K181A); R222A (R191A); K229A (K198A); K231A (K200A); V236A (V205A); E239A (E208A); P249A (P218A); Y260A (Y229A); P263A (P232A); T266A (T235A); W322A (W291A); T338A (T307A) y N83Q (N52Q) (en donde las sustituciones indican la posición de los aminoácidos en el polipéptido precursor de mWnt7a (y en donde las sustituciones entre paréntesis indican la posición de los aminoácidos en el polipéptido maduro mWnt7a, véase la tabla 3) consiguieron activar la señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP hasta al menos el 70 % de la actividad de señalización de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP del Wnt7a maduro completo de tipo silvestre (figura 7 B-C).
In vitro,Wnt7a1-278 y Wnt7aK190A (una de las treinta y una variantes selectivas para la señalización de Gpr124/Reck/Fz/LRP) no conseguían enviar señales a través de ningún Fz en ausencia de Gpr124/Reck (figura 7D). En consecuencia, tras la inyección de ARNm en el cigoto del pez cebra, Wnt7a1-278 y Wnt7aK190A se toleraban bien y no revelaban posteriorización ni alteraciones anatómicas macroscópicas de hasta 1 ng y 100 pg, respectivamente (figura 7D-E). Por el contrario, 3 pg del ARNm dewnt7aindujeron la pérdida de las estructuras del prosencéfalo y del ojo mediante la activación ectópica de la señalización de Wnt (Kim et al.,Nature407(6806):913-6 (2000)) y dan lugar a embriones dismórficos con dosis por encima de 10 pg (figura 7E-F).
De manera similar, cuando se inyecta en los embriones deXenopus,Wnt7a provocó la duplicación del eje, un resultado de señalización clásica de Wnt/p-catenina, mientras que Wnt7a1-278 y Wnt7aK190A no lo hicieron (figura 7G). La falta de defectos del desarrollo discernibles inducidos por Wnt7A1-278 y Wnt7aK190A permitió importantes rescates de DRG en morfantes dewnt7aadespués de inyecciones de 100 pg del ARNm, mientras que el ARNm dewnt7aainyectado en su dosis más alta tolerada de 10 pg, reveló solo una restauración marginal de las neuronas DRG (figura 7H). Juntos, estos experimentos identifican a Wnt7a1-278 y Wnt7aK190A como agonistas selectivos de Gpr124/Reck/Fz/LRP que provocan respuestas dependientes de Gpr124/Reck/Fz/LRPin vivosin demostrar actividad inespecífica sobre las vías alternativas de Fz, proporcionando así una demostración preliminar de que las vías de señalización de Fz específicas del ligando se pueden adaptar para desarrollar nuevos agonistas de Wnt con una selectividad drásticamente aumentada. La posición de las sustituciones de aminoácidos en las variantes del polipéptido de Wnt7a en la sección experimental se indica con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido precursor de Wnt7a (es decir, incluido el péptido señal). En la tabla 3 se muestra la posición de las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido precursor de Wnt7a y su posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido Wnt7a maduro.
La expresión endotelial transgénica de Wnt7aK190A o Wnt7a1-278 de ratón desencadenó la angiogénesis cerebral dependiente de GPR124/RECK y restauró la barrera hematoencefálica (según lo evaluado por la expresión de GLUT1) en el mutante del pez cebra Wnt7aa-/- (figura 9 A-C). Los Wnt7, Wnt7aK190A y Wnt7a1-278 de ratón se expresaron transitoriamente en el endotelio de embriones Wnt7aa-/- bajo el control del promotor dekdrl(rececptor de tipo kdr del factor de crecimiento del endotelio vascular) específico de endotelio. Los ligandos Wnt7 se expresaron como una construcción biscistrónica con BFP (Proteína Fluorescente Azul) como marcador de transgénesis. A diferencia de los embriones no inyectados, los tres ligandos restauran la formación de CtA. La tinción de inmunofluorescencia con anti-GLUT 1 de las CtA después de la expresión transgénica de Wnt7, Wnt7aK190A y Wnt7a1-278 en los embriones Wnt7aa-/- 60 hpf revelaron la maduración de la barrera hematoencefálica.
En vista de lo anterior, las variantes de Wnt7a son agonistas selectivos de GPR124/RECK que provocan respuestas dependientes de GPR124/RECKin vivosin mostrar actividad inespecífica sobre las vías alternativas de Fz.
Tabla 3
Se observa que las secuencias de aminoácidos primarias de Wnt7a maduro completo de tipo silvestre de ratón y humano son idénticas.
Ejemplo 3: Administración del vector vírico de Wnt7aK190A de ratón en los ratones sometidos a un modelo de accidente cerebrovascular (oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO))
1. Materiales y métodos
1.1. Generación de las construcciones del plásmido AAV (AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFP)La variante mWnt7aK190A completa se clonó en el vector transgénico pAAV que contiene las secuencias ITR flanqueantes bajo los elementos reguladores del promotor pCAG. La variante de Wnt7 se expresó como una fusión con EGFP mediante el intermediario del péptido p2A autoescindible. El vector AAV se produjo y purificó como se describe en Korbelin et al., 2016 mediante la cotransfección triple de células HEK293 con los plásmidos pAAV-transgén, el plásmido auxiliar (que codifica la variante de cápsida AAV-PHP.eB rep secuencias de inserción) y el plásmido auxiliar adenovírico.
Se observa que K190A de "Wnt7aK190A" indica la posición del aminoácido en el polipéptido precursor mWnt7a.
1.2. Estudios en animales
A diez ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía intravenosa en la vena periorbitaria 50 pl de vectores concentrados (1 x 1011 vg/ratón) que contenían el vector AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFP o el de control AAV-PHP.eB (1 x 1011 vg/ratón). Dos semanas después de la infección, se evaluó la señal de EGFP en las células endoteliales del SNC para confirmar la expresión del transgén.
Los ratones se sometieron a una tMCAO durante 1 h y el tamaño del infarto se midió mediante tinción con TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio) 5 días después de la tMCAO. Se realizaron ensayos de fuga a nivel de la barrera hematoencefálica (BHE) 1 h después de la reperfusión midiendo la fuga de las proteínas plasmáticas endógenas (inmunoglobulina y fibrinógeno). La supervivencia de los ratones se evaluó 5 días después de la perfusión después de la tMCAO.
2. Resultados
Se utilizó una construcción que codifica la GFP para demostrar la expresión transgénica generalizada en el cerebro del ratón (figura 10 A).
Para evaluar el efecto del Wnt7aK190A de ratón en el accidente cerebrovascularin vivo,se generaron vectores adenoasociados específicos del cerebro que expresan el Wnt7aK190A de ratón.
A todos los ratones a los que se les inyectó un vector que comprende Wnt7aK190A mostraron una reducción del volumen del ictus (figura 10 B).
Ejemplo 4: Administración del vector vírico de Wnt7aK190S o Wnt7aK190L en los ratones sometidos a un modelo murino de accidente cerebrovascular (oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO))
1. Materiales y métodos
1.1. Generación de las construcciones del plásmido AAV (AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190S-p2A-EGFP y AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190L-p2A-EGFP)
Las construcciones de plásmido AAV se generan como se describe en el ejemplo 3, sección 1.1.
Cabe señalar que el K190S de "Wnt7aK190S" y el K190L de "Wnt7aK190L" indican la posición del aminoácido en el polipéptido precursor mWnt7a.
1.2. Estudios en animales
Los estudios en animales se realizan como se describe en el ejemplo 3, sección 1.1.
2. Resultados
La reducción del volumen del ictus se mide en ratones inyectados con un vector que comprende Wnt7aK190S o Wnt7aK190L de ratón.
Ejemplo 5: Administración de vectores víricos de agonistas de la variante de Wnt7a en los ratones sometidos a un modelo de ictus en ratón (oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO))
1. Materiales y métodos
Las construcciones del plásmido AAV se generan como se describe en el ejemplo 3, sección 1.1 y los estudios en animales se realizan como se describe en el ejemplo 3, sección 1.1.
2. Resultados
La reducción del volumen del ictus se mide en los ratones inyectados con un vector que comprende Wnt7aQ48A, Wnt7aI51A, Wnt7aP56A, Wnt7aA58R, Wnt7aI59A, Wnt7aE64A, Wnt7aM68A, Wnt7aL70A, Wnt7aE72A, Wnt7aF75A, Wnt7aR81A, Wnt7aN83Q, Wnt7aV99A, Wnt7aI160A, Wnt7aF162A, Wnt7aK164A, Wnt7aF166A, Wnt7aI172A, Wnt7aR177A, Wnt7aR189A, Wnt7aK212A, Wnt7aR222A, Wnt7aK229A, Wnt7aK231A, Wnt7aV236A, Wnt7aE239A, Wnt7aR245A, Wnt7aK247A, Wnt7aP249A, Wnt7aK253A, Wnt7aI254A, Wnt7aY260A, Wnt7aP263A, Wnt7aT266A, Wnt7aE279A, Wnt7aR320A, Wnt7aW322A, Wnt7aT338A o Wnt7aK349A de ratón.
Como control negativo, se mide la reducción del volumen del ictus en los ratones inyectados con un vector que comprende Wnt7aR49A, Wnt7aE103A o Wnt7aL192A de ratón.
Cabe señalar que las sustituciones se refieren a la posición del aminoácido en el polipéptido precursor mWnt7a.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un agente, en donde dicho agente es una variante de un polipéptido Wnt7a, capaz de activar la señalización de Wnt mediada por el receptor acoplado a proteínas G (GPR)124/RECK/Frizzled/proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas (LRP), sin activar la señalización de Wnt mediada por Frizzled/LRP en ausencia de RECK y/o GPR124, y en donde dicho agente comprende una secuencia según la SEQ ID No: 51 en la que:
- el resto de glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 17 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 20 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de prolina (P) en la posición correspondiente a la posición 25 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de alanina (A) en la posición correspondiente a la posición 27 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de arginina (R); o
- el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 28 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 33 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de metionina (M) en la posición correspondiente a la posición 37 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de leucina (L) en la posición correspondiente a la posición 39 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 41 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de fenilalanina (F) en la posición correspondiente a la posición 44 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 50 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de asparagina (N) en la posición correspondiente a la posición 52 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de glutamina (Q); o
- el resto de valina (V) en la posición correspondiente a la posición 68 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 129 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de fenilalanina (F) en la posición correspondiente a la posición 131 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 133 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de fenilalanina (F) en la posición correspondiente a la posición 135 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 141 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 146 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 158 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 159 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A), serina (S) o leucina (L); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 181 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 191 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 198 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 200 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de valina (V) en la posición correspondiente a la posición 205 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 208 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 214 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 216 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de prolina (P) en la posición correspondiente a la posición 218 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 222 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de isoleucina (I) en la posición correspondiente a la posición 223 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de tirosina (Y) en la posición correspondiente a la posición 229 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de prolina (P) en la posición correspondiente a la posición 232 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de treonina (T) en la posición correspondiente a la posición 235 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de glutamato (E) en la posición correspondiente a la posición 248 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 289 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de triptófano (W) en la posición correspondiente a la posición 291 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de treonina (T) en la posición correspondiente a la posición 307 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A); o
- el resto de lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 318 en la SEQ ID No: 51 está sustituido por un resto de alanina (A).
2. Un ácido nucleico que codifica el agente según la reivindicación 1.
3. Un casete de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 2, unido operativamente a un promotor y/o señales reguladoras transcripcionales y traduccionales.
4. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 2 o el casete de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 3, tal como un vector vírico.
5. Una composición farmacéutica que comprende el agente según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 2, el casete de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 3 o el vector según la reivindicación 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. El agente según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 2, el casete de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 3, el vector según la reivindicación 4 o la composición farmacéutica según la reivindicación 5, para su uso como medicamento.
7. El agente según la reivindicación 1, el ácido nucleico según la reivindicación 2, el casete de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 3, el vector según la reivindicación 4 o la composición farmacéutica según la reivindicación 5, para su uso en la prevención o tratamiento de un trastorno neurovascular o un trastorno del sistema nervioso central (SNC) que comprende disfunción neurovascular; opcionalmente en donde dicho trastorno neurovascular se selecciona del grupo que consiste en accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular hemorrágico, lesión por isquemia/reperfusión, aneurismas cerebrales, malformaciones arteriovenosas (MAV), malformaciones cavernosas, vasculitis, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnoidea, malformaciones vasculares medulares, estenosis de la arteria carótida, enfermedad de Moyamoya y aterosclerosis intracraneal, y combinaciones de las mismas, o dicho trastorno del SNC se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular isquémico, cáncer cerebral, epilepsia, demencia, demencia vascular, demencia asociada al VIH-1, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades cerebrales infecciosas, lesiones cerebrales traumáticas, migraña y encefalopatía traumática crónica, y combinaciones de las mismas.
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