JP2021518151A - Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子 - Google Patents

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Abstract

本出願は、新規の治療剤、具体的には、（ＧＰＲ）１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない、作用物質に関する。本作用物質は、神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の予防または治療に特に有用である。

Description

本発明は、広範には医学分野に入り、より正確には、神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療に関する。本発明は、療法に有用であり、特に神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の治療に有用である新規のＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子、ならびに関連製品、方法および使用を提供する。
Ｗｎｔタンパク質は、動物の発達および成体組織恒常性の間の細胞間コミュニケーションを媒介する、高度に保存された分泌型の脂質修飾されたタンパク質の大きなファミリーを構成する。Ｗｎｔタンパク質は、細胞増殖、分化、遊走、アポトーシス、極性および遺伝的安定性を調節することによって多面的な機能を発揮する。Ｗｎｔシグナル伝達レベルの調節不全は、がんおよび神経変性などのＣＮＳ障害を含めた幅広いヒト病態に関連付けられる。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）ファミリーのメンバー１０種は、Ｗｎｔタンパク質の受容体としての機能を果たす７回膜貫通タンパク質である。Ｗｎｔシグナル伝達の複雑さに大きく寄与するが、Ｗｎｔ／Ｆｚ結合関係は乱雑なものであり、個々のＦｚとの結合について競合する複数のＷｎｔが存在し、所与のＷｎｔに対していくつかのＦｚが応答することができる。最近の結晶学的研究により、Ｗｎｔ／Ｆｚ相互作用化学が明白なＷｎｔとＦｚの対形成とは適合せず、ＷｎｔとＦｚの接触部位はどちらも、厳密にまたは化学的に保存された残基が優位を占めることが確認された（Janda et al. Science 2012, vol. 337, 59-64）。これらの知見から、複数のＷｎｔリガンドからの同時のおよび時には矛盾するシグナル伝達インプットも入り混じった発現パターンを細胞がどのように解釈するのかという疑問が生じる。一部の生物学的状況では、細胞は、全てのシグナル伝達インプットを識別せずに組み込み、機能的に絡み合った細胞内シグナル伝達カスケードによるそれらの全体的な正味の平衡ならびにそれらの調和された解釈を検討することによって適正な応答を誘発する可能性がある。しかし、他の生物学的プロセスでは、驚いたことに、複雑なＷｎｔ／Ｆｚ発現状況にもかかわらず、厳密なＷｎｔリガンド選択性が示される。
哺乳動物の前脳および腹側脊髄の脳血管発達は、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ｂによる排他的制御下で作動し、したがって、高度に選択的なＷｎｔ応答性プロセスに関するパラダイムとしての機能を果たす。神経前駆細胞由来Ｗｎｔ７に応答し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を活性化するために、大脳内皮細胞は、Ｇタンパク質共役型受容体の接着クラスのオーファンメンバーであるＧｐｒ１２４、ならびにＧＰＩ係留糖タンパク質Ｒｅｃｋを発現しなければならない（Vanhollebeke et al. Elife 2015, vol. 4, 1-25）。さらに、培養細胞において発現されると、Ｇｐｒ１２４とＲｅｃｋは、物理的に相互作用し、Ｗｎｔ７特異的応答を相乗的に刺激する（同書）。
重要なことに、内皮Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、血液脳関門（ＢＢＢ）生理機能の重要な調節因子であり、成体において、胚形成の間のＣＮＳ血管ネットワークの増大および成熟化を制御し、ＢＢＢ維持に寄与する。ＢＢＢ機能不全は、長い間、複数の神経性障害に関係付けられてきたが、最近のエビデンスから、機能不全性ＢＢＢにおけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の向きを変える刺激が、マウスにおける虚血性脳卒中および脳がんを顕著に好転させるために十分であることが示唆される。したがって、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ経路との交差反応性を実質的に伴わずに大脳内皮細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を刺激することができる療法が、種々の神経性障害の治療に高度に有利であると思われる。
本発明は、細胞がＷｎｔ７リガンドに選択的に応答するために使用する初の「Ｗｎｔ解読モジュール」の発見および特徴付けに少なくとも一部基づく。具体的には、本明細書で特徴付けられたＷｎｔ解読モジュールでは、ＲＥＣＫにより選択性が付与され、それにより、Ｗｎｔ７特異的結合がＦｒｉｚｚｌｅｄ非依存的に媒介される。Ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナル伝達へのＷｎｔ７利用可能性は、ＲＥＣＫと結合したＷｎｔ７と細胞内ディシェベルド（Ｄｖｌ）足場の間のシグナル伝達欠損膜貫通テザーとして作用するＲＥＣＫ結合パートナーであるＧＰＲ１２４に依拠する。ＤｖｌポリマーがＦｒｉｚｚｌｅｄとＧＰＲ１２４を架橋することにより、リガンド特異的ＲＥＣＫ／Ｇｐｒ１２４／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰシグナロソームがアセンブリーされる。したがって、本発明者らは、ＤｖｌポリマーのＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＧＰＲ１２４への同時結合ならびにＷｎｔ７のＲＥＣＫへの特異的結合によってリガンド特異的Ｗｎｔシグナロソーム内で高次ＲＥＣＫ／ＧＰＲ１２４／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体が形成されるモデルを提唱する。
この新規の機構が明らかになったので、さらなる調査により、ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４を発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を選択的に活性化することができる新規のアゴニストを設計することができ、そのようなアゴニストが、治療薬として、例えば、特に、とりわけ脳卒中、多発性硬化症、脳がん、てんかんおよび神経変性障害を含めた神経血管に関連するＣＮＳ障害を治療するための治療薬として有用であることが予想外に明らかになった。
したがって、ある態様は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない、作用物質を提供する。
ある特定の実施形態では、前記作用物質は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであり得る。したがって、別の態様は、前記作用物質をコードする核酸であって、前記作用物質が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、核酸を提供する。
別の態様は、プロモーターならびに／または転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルに作動可能に連結した前記核酸を含む核酸発現カセットを提供する。前記核酸または核酸発現カセットを含むベクターも提供される。
別の態様は、前記作用物質、前記核酸または核酸発現カセットまたは前記ベクター、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様は、医薬として使用するための、前記作用物質、前記核酸または核酸発現カセット、前記ベクターまたは前記医薬組成物を提供する。
神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の予防または治療における使用のための、前記作用物質、前記核酸または核酸発現カセット、前記ベクターまたは前記医薬組成物も提供される。
別の態様は、特に神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の予防または治療に有用なものなどの、治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における方法であって、試験作用物質が、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することを含む方法を提供する。
本発明のこれらおよび別の態様ならびに好ましい実施形態を以下のセクションおよび添付の特許請求の範囲に記載する。添付の特許請求の範囲の主題はこれにより具体的に本明細書に組み込まれる。
透過処理されていないＷＴ、ＦＺ１〜１０ −／−、ＬＲＰ５−／−；ＬＲＰ６−／−およびＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞中で一過性に発現したＷｎｔ７ａ−Ｖ５またはＷｎｔ３ａ−Ｖ５の抗Ｖ５免疫染色。 ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞において、一過性に同時に発現しているＷｎｔ７ａ−Ｖ５および表示した共受容体の図１Ａと同じ免疫染色。 三連の（１：１：１）共培養におけるリガンド捕捉アッセイ。表示したように、Ｆｚ５によってトランスフェクトし、および様々な共受容体によってトランスフェクトしたＦＺ１〜１０ −／− ＨＥＫ２９３Ｔ競合細胞の存在下で、共培養したＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ３ａ放出細胞によってパラクリン様式で刺激したＨＥＫ２９３−ＳＴＦレポーター細胞のスーパートップフラッシュ（ｓｕｐｅｒ ｔｏｐ−ｆｌａｓｈ）ルシフェラーゼ（ＳＴＦ）活性。 ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞において同時に発現されるＷｎｔ７ａ−Ｖ５およびＨＡ−Ｒｅｃｋを標的とする抗Ｖ５および抗ＨＡ一次抗体またはその変異体を使用する、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ＰＬＡのＰＬＡシグナルの定量。 ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞において同時に発現されるＷｎｔ７ａ−Ｖ５および表示したＨＡ−でタグ付けした共受容体を対象とする抗Ｖ５および抗ＨＡ一次抗体を使用する、インサイチュＰＬＡのＰＬＡシグナルの定量。スケールバー：１０μｍ。 Ｇｐｒ１２４を用いて（ｙ軸）またはＧｐｒ１２４を用いないで（ｘ軸）、Ｗｎｔ７ａ−Ｖ５またはＷｎｔ３ａ−Ｖ５および表示したＨＡでタグ付けしたＲｅｃｋ変異体で同時にトランスフェクトしたＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞の抗Ｖ５／抗ＨＡ ＰＬＡシグナルの定量。 ＲｅｃｋならびにそのＧｐｒ１２４およびＷｎｔ７結合モチーフの概略図。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞を同時に発現するＨＡ−Ｒｅｃｋにおいて抗Ｖ５および抗ＨＡ一次抗体を使用して図１Ｂにおいて定量したＰＬＡにおいて調査したＷｎｔ７ａ、Ｖ５でタグ付けしたＷｎｔ７ａ変異体およびパラログの概略図。 ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞を同時に発現するＨＡ−Ｒｅｃｋにおいて抗Ｖ５および抗ＨＡ一次抗体を使用して定量したＰＬＡ。 Ｗｎｔ７ａの１０１の異なる単一残基変異体のシグナル伝達についてのＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞におけるＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ依存性の相対的ＳＴＦルシフェラーゼ活性およびＷｎｔ７ａ構造におけるその位置（ｘ軸と下の構造モデル）。相対的ルシフェラーゼ活性は、ＷＴ Ｗｎｔ７ａの値に対して正規化されている。アルギニンに変更されるアラニン残基を除いて、全てのＷｎｔ７ａ残基をアラニンに変異させる。 脊椎動物クレードにわたるＷｎｔ７リンカードメインのアライメント。Ｍｍ、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；Ｇｇ、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）；ＸＩ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）；Ｄｒ、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）。１０％未満までＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ依存性シグナル伝達が低減した８つのＷｎｔ７ａ変異体（ｐＷｎｔ７ａの２３８〜２６６のアミノ酸領域内にある）に下線を付している。対応する単一残基変異体の活性およびそれらの活性の種類は図２Ｃで決定される。Ｍｍ Ｗｎｔ３ａおよびクアドラプルＷｎｔ７ａ変異体（Ｗｎｔ７４Ａ）のリンカー領域の配列を下に表す。 Ｗｎｔ７ａ−Ｖ５またはＷｎｔ７ａ４Ａ−Ｖ５とＨＡ−Ｒｅｃｋの間の抗Ｖ５／ＨＡ ＰＬＡ。リガンドの分泌を連続希釈した細胞上清の半定量的な抗Ｖ５ドットブロット分析によって評価した。負荷対照としてポンソーＳ染色を使用した。スケールバー、１０μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用する、精製した組換えＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃと合成ｐＷｎｔ７ａペプチドの間の相互作用の探索。組換えＲｅｃｋ−ＣＫ−ＦｃへのｐＷｎｔ７ａ、ｐＷｎｔ７ａ４ＡおよびｐＷｎｔ３ａのＩＴＣ（上のパネル）。ｐＷｎｔ７ｂに対するＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃ、Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ１−Ｆｃ、Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ２−Ｆｃ、Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ３−Ｆｃ、Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ４−ＦｃおよびＲｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ５−ＦｃのＩＴＣ（真中と下のパネル）。 ＳＭＦＳの使用によるＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃ／ｐＷｎｔ７ｂ相互作用の探索。力−距離曲線に基づく原子間力顕微鏡（ＦＤに基づくＡＦＭ）の原理を示す。ｐＷｎｔ７ｂペプチドに融合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーで機能化したＡＦＭチップをＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃでコーティングした表面に接近させて引き離す。 Ｌｒｐ５／６におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位（左のパネル）と、ＳＴＦレポータープラスミドおよびＲｅｃｋ／Ｇｐｒ１２４に依存するＷｎｔ７ａのシグナル伝達またはＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存しないＷｎｔ１のシグナル伝達のいずれかを刺激する表示したプラスミドの組合せによるトランスフェクションの４８時間後のＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＬＲＰ５−／−、ＬＲＰ６−／−もしくは二重突然変異体ＬＲＰ５−／−；ＬＲＰ６−／−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のクローンにおけるルシフェラーゼ活性の概略図。 同時に発現したＤｋｋ−１の存在下または非存在下において、ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でのＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存するシグナル伝達とＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存しないシグナル伝達のＳＴＦ活性。 Ｒｅｃｋ／Ｇｐｒ１２４に依存するＷｎｔ７ａのシグナル伝達またはＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存しないＷｎｔ１のシグナル伝達を刺激する、ＳＴＦレポータープラスミドおよび表示した発現プラスミドの組合せによるトランスフェクションの４８時間後のＷｔ ＨＥＫ２９３細胞またはＦＺ突然変異体ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のクローンにおけるルシフェラーゼ活性。 Ｆｚ ＣＲＤ内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＰＡＭ部位の概略図。 表示したＦｚ変異体またはＦｚ ＣＲＤ変異体による同時トランスフェクション後のＦＺ１〜１０ −／−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存するシグナル伝達のＳＴＦ活性。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 Ｇｐｒ１２４およびそのドメイン変異体の概略図。 １００ｐｇの表示したＲＮＡを注射したＷＴおよびｇｐｒ１２４突然変異体の胚の６０ｈｐｆの脳血管系の代表的な３Ｄ配線図。黒色の管は、灰色の神経周囲の始原後脳チャネル（ｐｅｒｉｎｅｕｒａｌ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｈｉｎｄｂｒａｉｎ ｃｈａｎｎｅｌ）（ＰＨＢＣ）から生えたＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ依存性脳内ＣｔＡを表す。 １細胞段階において、１００ｐｇの表示したｍＲＮＡを注射した６０ｈｐｆのｇｐｒ１２４モルファント胚の後脳中心動脈（ＣｔＡ）。 Ｒｅｃｋ、Ｆｚ１、Ｗｎｔ７ａおよび表示したＧｐｒ１２４変異体で同時にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞の相対的ルシフェラーゼ活性。＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 １細胞段階において、１００ｐｇの表示したｍＲＮＡを注射した６０ｈｐｆのｇｐｒ１２４モルファント胚の後脳ＣｔＡ。＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 Ｄｖｌ−ＧＦＰとＧｐｒ１２４またはそのＩＣＤ変異体のＮ末端をＦＬＡＧでタグ付けしたバージョンとを同時に発現する全細胞溶解物における抗ＦＬＡＧ同時免疫沈降アッセイ。 表示したプラスミドの組合せによってトランスフェクトしたＦＺ１〜１０−／−およびＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの全細胞溶解物におけるＤＶＬ２およびｐ−ＤＶＬ２（Ｔ２２４）の免疫ブロット。リン酸化ＤＶＬ２（Ｔ２２４）は、表示した異なる組合せのコンストラクトによるトランスフェクションの４８時間後に得た細胞抽出物全体において、抗ＤＶＬ２抗体（矢印）によってゆっくりと移動するバンドとして、またはホスホトレオニン２２４（ｐ−ＤＶＬ２）を認識するリン酸化部位特異的抗体によって検出され得る。 ゼブラフィッシュの胞胚深層（ＤＥＬ）細胞において、個別に発現したかまたはＤｖｌの存在下で発現したＦｚ４−ＧＦＰおよびＧｐｒ１２４−ｔａｇＲＦＰの細胞内分布。 ゼブラフィッシュの胞胚ＤＥＬ細胞において、Ｆｚ４またはＧｐｒ１２４と同時に発現したＤｖｌ−ＧＦＰの細胞内分布。 ゼブラフィッシュの胞胚ＤＥＬ細胞において、Ｄｖｌの非存在下または存在下で、同時に発現したＦｚ４−ＧＦＰとＧｐｒ１２４−ｔａｇＲＦＰの細胞内分布。アスタリスクで注釈を付けた細胞を右のパネルで拡大し、ａからｂまで細胞皮質をたどる仮想の時計回りの経路に沿った緑色と赤色のチャネルのピクセル強度を下にプロットしている。 ＥＶＬ細胞における図１Ｅと同じ細胞内分布。 過剰発現したＤｖｌの存在下または非存在下において、Ｇｐｒ１２４−ＶＮ１５５（Ｉ１５２Ｌ）およびＦｚ１−ＶＣ１５５を発現するゼブラフィッシュのＤＥＬ細胞におけるＢｉＦＣシグナル。＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 図６は、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存するＷｎｔ７に特異的なＦｚシグナル伝達に関する例示的な統合モデルを表す。 異なるＷｎｔ７変異体で刺激したＦｚ５に依存する経路（薄い灰色、Ｆｚ５によるトランスフェクション）またはＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存する経路（黒色、Ｇｐｒ１２４、ＲＥＣＫおよびＦｚ１によるトランスフェクション）のＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞における相対的ルシフェラーゼ活性。 Ｗｎｔ７ａの１０１の異なる単一残基変異体のシグナル伝達についてのＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞におけるＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存する相対的ＳＴＦルシフェラーゼ活性およびＦｚ５の相対的ＳＴＦルシフェラーゼ活性ならびにＷｎｔ７ａ構造におけるそれらの位置。相対的ルシフェラーゼ活性は、ＷＴ Ｗｎｔ７ａの値に対して正規化されている。Ｗｎｔ７ａの４２の異なる単一残基変異体は、野生型Ｗｎｔ７ａのＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔのシグナル伝達活性（長方形のボックス）の少なくとも３５％、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔのシグナル伝達を活性化する。 Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ経路の選択的活性化を示すＷｎｔ７ａの４２の異なる単一残基変異体のシグナル伝達についてのＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞におけるＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存する相対的ＳＴＦルシフェラーゼ活性およびＦｚｄ５の相対的ＳＴＦルシフェラーゼ活性。 Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ａ１〜２７８またはＷｎｔ７ａＫ１９０Ａの１０個全てのＦｚ遺伝子との同時トランスフェクション後のＨＥＫ−ＳＴＦにおける相対的ルシフェラーゼ活性。 １細胞段階において、表示した用量のｗｎｔ７ａまたはｗｎｔ７ａ１〜２７８またはｗｎｔ７ａＫ１９０ＡのｍＲＮＡを注射した３ｄｐｆの幼魚の側面図。 図７Ｄの３ｄｐｆの幼魚の表現型のスコア化。 ４細胞胚の１つの腹側割球において、表示したｍＲＮＡ１５ｐｇを注射したステージ３６のアフリカツメガエルの胚の背面図。各条件に関して、二次軸の形成（矢印）の分率が表示されている。 １細胞段階において、表示したｍＲＮＡを注射した７２ｈｐｆのｗｎｔ７ａａモルファント幼生の胴部分のＤＲＧ。Ｔｇ（ｎｅｕｒｏｇ１：ＧＦＰ）ＤＲＧの代表的な画像を右に示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１；データは平均±ＳＤを表す。 図８は、本明細書に教示されているヒトＷｎｔ７ａ変異体のアミノ酸配列を示す。野生型Ｗｎｔ７ａのＮＴＤドメインまたは全長Ｗｎｔ７ａに対するアミノ酸置換は太字かつ下線を付したフォントにおけるものである。 図９は、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡおよびＷｎｔ７ａ１〜２７８の内皮におけるトランスジェニック発現がＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに依存する脳の血管新生を誘発し、Ｗｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの血液脳関門を復元することを示す。６０ｈｐｆのＷＴまたはＷｎｔ７ａａ−／−Ｔｇ（ｋｄｒｌ：ＥＧＦＰ）の胚の大脳血管系の背面図。Ｗｎｔ７ａ−／−突然変異体では、脳内のＣｔＡは欠如している。Ｗｎｔ７、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡまたはＷｎｔ７ａ１〜２７８は、内皮特異的ｋｄｒｌ（血管内皮成長因子受容体ｋｄｒｌ様）プロモーターの制御下で、Ｗｎｔ７ａａ−／−の胚の内皮において一過性に発現した。Ｗｎｔ７リガンドは、遺伝子組換えマーカーとして使用されるＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）を含むバイシストロニックコンストラクトとして発現した。 図９は、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡおよびＷｎｔ７ａ１〜２７８の内皮におけるトランスジェニック発現がＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに依存する脳の血管新生を誘発し、Ｗｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの血液脳関門を復元することを示す。図９Ａの結果の定量。注射されなかった胚と対照的に、Ｗｎｔ７、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡまたはＷｎｔ７ａ１〜２７８は、Ｗｎｔ７ａａ−／−突然変異体における後脳のＣｔＡ形成を復元する。 図９は、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡおよびＷｎｔ７ａ１〜２７８の内皮におけるトランスジェニック発現がＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに依存する脳の血管新生を誘発し、Ｗｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの血液脳関門を復元することを示す。６０ｈｐｆのＷｎｔ７ａａ−／−の胚におけるＷｎｔ７、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡおよびＷｎｔ７ａ１〜２７８のトランスジェニック発現の後のＣｔＡの抗ＧＬＵＴ１染色。トランスジェニック発現は、図９Ａにおけるように達成された。まとめると、このデータは、明らかになったＷｎｔ７ａＫ１９０ＡまたはＷｎｔ７ａ１〜２７８アゴニストが、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存するプロセスにおいて、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で活性であることを実証する。 図１０は、脳卒中のマウスモデルにおけるＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに基づく遺伝子療法を表す。ＡＶＶ−ＰＨＰ．ｅＢウイルスを使用して、Ｗｎｔ７ａＫ１９０Ａまたは対応する空のＡＡＶ対照（Ｃｔｒｌ）を８週齢のマウスの脳に送達した。ＧＦＰをコードするＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ（ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）を使用して、マウスの脳（８週齢のマウス、注射の２週間後）における広範囲に及ぶトランスジェニック発現を実証した。ＣＡＧプロモーターは、哺乳動物の発現ベクターにおいて使用される強力な合成プロモーターである。左のパネル、単離した無傷の脳に関する背面図、右のパネルは矢状断面。切片を抗ＣＤ３１で染色して、血管系を標識した。 図１０は、脳卒中のマウスモデルにおけるＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに基づく遺伝子療法を表す。ＡＶＶ−ＰＨＰ．ｅＢウイルスを使用して、Ｗｎｔ７ａＫ１９０Ａまたは対応する空のＡＡＶ対照（Ｃｔｒｌ）を８週齢のマウスの脳に送達した。ｔＭＣＡＯ（一過性中大脳動脈閉塞、脳卒中モデル）の２週間前に、１．１０１１ ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−Ｗｎｔ７ａＫ１９０Ａ−ｐ２Ａ−ＥＧＦＰウイルス粒子を静脈内注射することにより１回拍出量（ｍｍ３）が低減し、明らかになったアゴニストが前臨床モデルにおいて脳卒中を軽快したことを実証した。ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−ＥＧＦＰウイルスを対照として使用した。
本明細書で使用される場合、単数形である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、単数の指示対象と複数の指示対象のどちらも含む。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加的な、記載されていないメンバー、要素または方法のステップを排除するものではない。これらの用語は、特許用語法において十分に確立された意味を有する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」も包含する。
終点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に包含される全ての数および分率、ならびに記載されている終点を含む。
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばパラメータ、量、持続時間などの測定可能な値について言及する場合、明記されている値の変動およびその値からの変動、例えば、±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、およびさらに好ましくは±０．１％以下である明記されている値の変動およびその値からの変動を、そのような変動が開示されている発明を実施するために適正なものである限り、包含するものとする。「約」という修飾因子が指す値自体も具体的に開示されることが好ましいことが理解されるべきである。
「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語、例えば、メンバーの群の１つもしくは複数のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーは、それ自体は明白であるが、さらなる例証として、この用語は、とりわけ、前記メンバーのうちのいずれか１つ、または前記メンバーのうちのいずれか２つ以上、例えば、前記メンバーのうちのいずれか３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つ以上など、および最大で前記メンバーの全てへの言及を包含する。別の例では、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上を指し得る。
本明細書における本発明の背景に関する考察は、本発明の状況を説明するために含められている。これは、言及されている材料のいずれも、特許請求の範囲のいずれかの優先日時点でいずれかの国において公開されている、公知である、または共通の一般的知見の一部であることを容認するものと解釈されるべきではない。
本開示全体を通して、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が識別引用によって参照される。本明細書において引用される文書は全て、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で具体的に言及される文書の教示またはセクションが参照により組み込まれる。
特に定義されていなければ、本発明の開示に使用される用語は、科学技術用語を含めて全てが、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。さらなる手引きとして、本発明の教示をよりよく理解するために用語の定義を含める。本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態に関連して特定の用語が定義されている場合、そのような含蓄は、特に定義されていなければ、本明細書全体を通して、すなわち、本発明の他の態様または実施形態に関しても適用されるものとする。
以下の節では、本発明の種々の態様または実施形態をより詳細に定義する。そのように定義された各態様または実施形態を任意の他の態様または実施形態と、相反することが明確に示されていなければ、組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であることが示されている任意の特色を、好ましいまたは有利であることが示されている任意の他の特色と組み合わせることができる。
本明細書全体を通して「一実施形態」、「ある実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載されている特定の特色、構造または特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句が本明細書全体を通して種々の箇所で現れることは、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではないが、その場合もある。さらに、本開示から当業者には明らかになる通り、１つまたは複数の実施形態において、特定の特色、構造または特徴を任意の適切な様式で組み合わせることができる。さらに、当業者には理解される通り、本明細書に記載の一部の実施形態は他の実施形態に含まれる特色のいくつかを含むがその他は含まないが、異なる実施形態の特色の組合せは本発明の範囲内に入るものとし、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲では、特許請求された実施形態のいずれも任意の組合せで使用することができる。
本発明者らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄへの結合能に関して他のやり方では大部分が同義になるＷｎｔリガンドを識別し、それにより、組織発達および恒常性を調整するための細胞によるＷｎｔシグナル伝達インプットの複雑さの解釈を補助することができる初の「Ｗｎｔ解読モジュール」を特徴付けた。本明細書で特徴付けられたＷｎｔ解読モジュールでは、ＲＥＣＫにより選択性が付与され、それにより、Ｗｎｔ７特異的結合がＦｒｉｚｚｌｅｄ非依存的に媒介される。ＲＥＣＫ結合パートナーであるＧタンパク質共役型受容体ＧＰＲ１２４が、細胞内ディシェベルド（Ｄｖｌ）を動員することができるシグナル伝達欠損膜貫通タンパク質として作用する。Ｄｖｌ足場によりＧＰＲ１２４とＦｒｉｚｚｌｅｄが架橋され、それにより、Ｗｎｔ７リガンド特異的ＲＥＣＫ／ＧＰＲ１２４／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）シグナロソームがアセンブリーされる。
本発明者らは、さらに、ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４を発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を選択的に活性化することができる新規のアゴニストの設計を予想外に実証し、そのようなアゴニストは、治療薬として、例えば、特に、とりわけ脳卒中、多発性硬化症および脳がんを含めた、神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害を治療するための治療薬として有用である。したがって、本発明は、とりわけ、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ経路との交差反応性を実質的に伴わずに大脳内皮細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を刺激することができ、治療薬として、特に神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害とに対する治療薬として有用である新規のアゴニストを提供することを可能にするものである。
したがって、ある態様は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達は活性化しない、作用物質を提供する。
任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸への言及は、当技術分野におけるそれぞれの名称の下で一般に知られているそれぞれのペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を示す。より詳細には、「Ｇタンパク質共役型受容体１２４」（ＧＰＲ１２４）、「カザールモチーフを有する復帰誘導性システインリッチタンパク質（Ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｋａｚａｌ ｍｏｔｉｆ）」（ＲＥＣＫ）、「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ」（ＦＺＤ）、または「リポタンパク質受容体関連タンパク質」（ＬＲＰ）への言及は、文脈から明らかであり、当技術分野において前記名称で一般に知られているそれぞれのペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を示す。
これらの用語は、生きている生物体、器官、組織または細胞の一部を形成している場合、生体試料の一部を形成している場合、ならびにそのような供給源から少なくとも部分的に単離されている場合のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を包含する。これらの用語は、組換えまたは合成手段によって作製されたペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸も包含する。
文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書における任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸への言及は、例えばリン酸化、グリコシル化、脂質付加、メチル化、システイニル化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンのメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンへの酸化を含めた発現後修飾を有する形態などの、前記ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の修飾された形態も包含する。
追加的な手引きとして、Ｇタンパク質共役型受容体１２４は、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ａ２（ＡＤＧＲＡ２）または腫瘍内皮マーカー５（ＴＥＭ５）としても当技術分野で公知である。一例として、ヒトＧＰＲ１２４遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）Ｇｅｎｅ ＩＤ２５９６０の下に注釈が付けられている。ヒトＧＰＲ１２４ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２７７７．９の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿０３２７７７．９のヌクレオチド３８７（開始コドン）〜４４０３（終止コドン）がＧＰＲ１２４コード配列を構成する。ヒトＧＰＲ１２４タンパク質配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１１６１６６．９、およびＵｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９６ＰＥ１−１の下に注釈が付けられており、以下にさらに再現される（配列番号１）：
＞ＮＰ＿１１６１６６．９接着Ｇタンパク質共役型受容体Ａ２前駆体［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］
MGAGGRRMRGAPARLLLPLLPWLLLLLAPEARGAPGCPLSIRSCKCSGERPKGLSGGVPGPARRRVVCSGGDLPEPPEPGLLPNGTVTLLLSNNKITGLRNGSFLGLSLLEKLDLRNNIISTVQPGAFLGLGELKRLDLSNNRIGCLTSETFQGLPRLLRLNISGNIFSSLQPGVFDELPALKVVDLGTEFLTCDCHLRWLLPWAQNRSLQLSEHTLCAYPSALHAQALGSLQEAQLCCEGALELHTHHLIPSLRQVVFQGDRLPFQCSASYLGNDTRIRWYHNRAPVEGDEQAGILLAESLIHDCTFITSELTLSHIGVWASGEWECTVSMAQGNASKKVEIVVLETSASYCPAERVANNRGDFRWPRTLAGITAYQSCLQYPFTSVPLGGGAPGTRASRRCDRAGRWEPGDYSHCLYTNDITRVLYTFVLMPINASNALTLAHQLRVYTAEAASFSDMMDVVYVAQMIQKFLGYVDQIKELVEVMVDMASNLMLVDEHLLWLAQREDKACSRIVGALERIGGAALSPHAQHISVNARNVALEAYLIKPHSYVGLTCTAFQRREGGVPGTRPGSPGQNPPPEPEPPADQQLRFRCTTGRPNVSLSSFHIKNSVALASIQLPPSLFSSLPAALAPPVPPDCTLQLLVFRNGRLFHSHSNTSRPGAAGPGKRRGVATPVIFAGTSGCGVGNLTEPVAVSLRHWAEGAEPVAAWWSQEGPGEAGGWTSEGCQLRSSQPNVSALHCQHLGNVAVLMELSAFPREVGGAGAGLHPVVYPCTALLLLCLFATIITYILNHSSIRVSRKGWHMLLNLCFHIAMTSAVFAGGITLTNYQMVCQAVGITLHYSSLSTLLWMGVKARVLHKELTWRAPPPQEGDPALPTPSPMLRFYLIAGGIPLIICGITAAVNIHNYRDHSPYCWLVWRPSLGAFYIPVALILLITWIYFLCAGLRLRGPLAQNPKAGNSRASLEAGEELRGSTRLRGSGPLLSDSGSLLATGSARVGTPGPPEDGDSLYSPGVQLGALVTTHFLYLAMWACGALAVSQRWLPRVVCSCLYGVAASALGLFVFTHHCARRRDVRASWRACCPPASPAAPHAPPRALPAAAEDGSPVFGEGPPSLKSSPSGSSGHPLALGPCKLTNLQLAQSQVCEAGAAAGGEGEPEPAGTRGNLAHRHPNNVHHGRRAHKSRAKGHRAGEACGKNRLKALRGGAAGALELLSSESGSLHNSPTDSYLGSSRNSPGAGLQLEGEPMLTPSEGSDTSAAPLSEAGRAGQRRSASRDSLKGGGALEKESHRRSYPLNAASLNGAPKGGKYDDVTLMGAEVASGGCMKTGLWKSETTV
追加的な手引きとして、ＲＥＣＫ（カザールモチーフを有する復帰誘導性システインリッチタンパク質）は、腫瘍形成能１５タンパク質（ＳＴ１５）の抑制因子としても当技術分野で公知である。一例として、ヒトＲＥＣＫ遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）Ｇｅｎｅ ＩＤ８４３４の下に注釈が付けられている。ヒトＲＥＣＫｍＲＮＡ（転写物変異体１）は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１１１１．２の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿０２１１１１．２のヌクレオチド８７（開始コドン）〜３００２（終止コドン）がＲＥＣＫコード配列を構成する。ヒトＲＥＣＫタンパク質配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６６９３４．１、およびＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｏ９５９８０−１の下に注釈が付けられており、以下にさらに再現される（配列番号２）：
＞ＮＰ＿０６６９３４．１カザールモチーフを有する復帰誘導性システインリッチタンパク質アイソフォーム１前駆体［ヒト］
MATVRASLRGALLLLLAVAGVAEVAGGLAPGSAGALCCNHSKDNQMCRDVCEQIFSSKSESRLKHLLQRAPDYCPETMVEIWNCMNSSLPGVFKKSDGWVGLGCCELAIALECRQACKQASSKNDISKVCRKEYENALFSCISRNEMGSVCCSYAGHHTNCREYCQAIFRTDSSPGPSQIKAVENYCASISPQLIHCVNNYTQSYPMRNPTDSLYCCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQCFLESSQSVHPGVTVHPPPSTGLDGAKLHCCSKANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTCLADVREPCQLGCRNLTYCTNFNNRPTELFRSCNAQSDQGAMNDMKLWEKGSIKMPFINIPVLDIKKCQPEMWKAIACSLQIKPCHSKSRGSIICKSDCVEILKKCGDQNKFPEDHTAESICELLSPTDDLKNCIPLDTYLRPSTLGNIVEEVTHPCNPNPCPANELCEVNRKGCPSGDPCLPYFCVQGCKLGEASDFIVRQGTLIQVPSSAGEVGCYKICSCGQSGLLENCMEMHCIDLQKSCIVGGKRKSHGTSFSIDCNVCSCFAGNLVCSTRLCLSEHSSEDDRRTFTGLPCNCADQFVPVCGQNGRTYPSACIARCVGLQDHQFEFGSCMSKDPCNPNPCQKNQRCIPKPQVCLTTFDKFGCSQYECVPRQLACDQVQDPVCDTDHMEHNNLCTLYQRGKSLSYKGPCQPFCRATEPVCGHNGETYSSVCAAYSDRVAVDYYGDCQAVGVLSEHSSVAECASVKCPSLLAAGCKPIIPPGACCPLCAGMLRVLFDKEKLDTIAKVTNKKPITVLEILQKIRMHVSVPQCDVFGYFSIESEIVILIIPVDHYPKALQIEACNKEAEKIESLINSDSPTLASHVPLSALIISQVQVSSSVPSAGVRARPSCHSLLLPLSLGLALHLLWTYN
「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ」または「ＦＺＤ」または「ＦＺ」という用語は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーのありとあらゆるメンバーを包含する。追加的な手引きとして、表１にＮＣＢＩ ＧｅｎｂａｎｋおよびＵｎｉｐｒｏｔにおいて注釈が付けられている公知のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーメンバー１０種を提示する。
Figure 2021518151
「リポタンパク質受容体関連タンパク質」または「ＬＲＰ」という用語は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質またはプロ低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質としても当技術分野で公知のありとあらゆるリポタンパク質受容体関連タンパク質を包含し、特に、Ｗｎｔシグナル伝達に関与するＬＰＲタンパク質を示す。ある特定の特に好ましい実施形態では、これらの用語は、ＬＲＰ５（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０４１）、ＬＲＰ６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０４０）、またはＬＲＰ５およびＬＲＰ６（ＬＲＰ５／６）を示す。
したがって、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５／６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５／６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない、作用物質も開示される。
特に神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の予防または治療に有用なものなどの、治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法であって、試験作用物質が、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５／６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ５／６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することを含む方法もさらに開示される。
追加的な手引きとして、ヒトＬＲＰ５ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３３５．３（転写物変異体１；ＮＭ＿００２３３５．３のヌクレオチド１０７（開始コドン）〜４９５４（終止コドン）がＬＲＰ５コード配列を構成する）またはＮＭ＿００１２９１９０２．１（転写物変異体２；ＮＭ＿００１２９１９０２．１のヌクレオチド１８７２（開始コドン）〜４９７６（終止コドン）がＬＲＰ５コード配列を構成する）の下に注釈が付けられている。ヒトＬＲＰ５タンパク質配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３２６．２（アイソフォーム１前駆体）またはＮＰ＿００１２７８８３１．１（アイソフォーム２）、およびＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｏ７５１９７−１の下に注釈が付けられており、ＮＰ＿００２３２６．２として注釈が付けられているＬＲＰ５タンパク質配列は、以下に再現される（配列番号３）：
＞ＮＰ＿００２３２６．２低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５アイソフォーム１前駆体［ヒト］
MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
追加的な手引きとして、ヒトＬＲＰ６ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３３６．２の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿００２３３６．２のヌクレオチド１４３（開始コドン）〜４９８４（終止コドン）は、ＬＲＰ６コード配列を構成する。ヒトＬＲＰ６タンパク質配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３２７．２およびＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｏ７５５８１−１の下に注釈が付けられており、以下にさらに再現される（配列番号４）：
＞ＮＰ＿００２３２７．２低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６前駆体［ヒト］
MGAVLRSLLACSFCVLLRAAPLLLYANRRDLRLVDATNGKENATIVVGGLEDAAAVDFVFSHGLIYWSDVSEEAIKRTEFNKTESVQNVVVSGLLSPDGLACDWLGEKLYWTDSETNRIEVSNLDGSLRKVLFWQELDQPRAIALDPSSGFMYWTDWGEVPKIERAGMDGSSRFIIINSEIYWPNGLTLDYEEQKLYWADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDILYWTDWSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSHLCLMSPVKPFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQLEDIRHAIAIDYDPVEGYIYWTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMVGYMYWTDWGEIPKIERAALDGSDRVVLVNTSLGWPNGLALDYDEGKIYWGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDKIPHIFGFTLLGDYVYWTDWQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSNPCAEENGGCSHLCLYRPQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLETNNNNVAIPLTGVKEASALDFDVTDNRIYWTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPEGMAVDWLGKNLYWADTGTNRIEVSKLDGQHRQVLVWKDLDSPRALALDPAEGFMYWTEWGGKPKIDRAAMDGSERTTLVPNVGRANGLTIDYAKRRLYWTDLDTNLIESSNMLGLNREVIADDLPHPFGLTQYQDYIYWTDWSRRSIERANKTSGQNRTIIQGHLDYVMDILVFHSSRQSGWNECASSNGHCSHLCLAVPVGGFVCGCPAHYSLNADNRTCSAPTTFLLFSQKSAINRMVIDEQQSPDIILPIHSLRNVRAIDYDPLDKQLYWIDSRQNMIRKAQEDGSQGFTVVVSSVPSQNLEIQPYDLSIDIYSRYIYWTCEATNVINVTRLDGRSVGVVLKGEQDRPRAVVVNPEKGYMYFTNLQERSPKIERAALDGTEREVLFFSGLSKPIALALDSRLGKLFWADSDLRRIESSDLSGANRIVLEDSNILQPVGLTVFENWLYWIDKQQQMIEKIDMTGREGRTKVQARIAQLSDIHAVKELNLQEYRQHPCAQDNGGCSHICLVKGDGTTRCSCPMHLVLLQDELSCGEPPTCSPQQFTCFTGEIDCIPVAWRCDGFTECEDHSDELNCPVCSESQFQCASGQCIDGALRCNGDANCQDKSDEKNCEVLCLIDQFRCANGQCIGKHKKCDHNVDCSDKSDELDCYPTEEPAPQATNTVGSVIGVIVTIFVSGTVYFICQRMLCPRMKGDGETMTNDYVVHGPASVPLGYVPHPSSLSGSLPGMSRGKSMISSLSIMGGSSGPPYDRAHVTGASSSSSSSTKGTYFPAILNPPPSPATERSHYTMEFGYSSNSPSTHRSYSYRPYSYRHFAPPTTPCSTDVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDLNYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYTERSYSHHLYPPPPSPCTDSS
配列データベースまたは本明細書において表されるあらゆる配列は、それぞれのペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の前駆体の配列の場合もあり、また、処理されて成熟分子から離れた一部分を含む場合もあることが当業者には理解できる。
「タンパク質」という用語は、本明細書全体を通して使用される場合、一般に、１つまたは複数のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマー鎖で構成される巨大分子を包含する。この用語は、天然に産生されたタンパク質、組換えによって産生されたタンパク質、半合成的にまたは合成的に作製されたタンパク質を包含し得る。この用語は、これだけに限定することなく、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Ｍｅｔ除去、プロ酵素またはプレホルモンの活性形態への変換などの、ポリペプチド鎖（複数可）の共発現型または発現後型修飾を１つまたは複数有するタンパク質も包含する。この用語は、さらに、対応するネイティブなタンパク質と比べてアミノ酸配列の変異、例えば、アミノ酸欠失、付加および／または置換などを有するタンパク質変異体または突然変異体も含む。この用語は、全長タンパク質とタンパク質の一部または断片、例えば、そのような全長タンパク質のプロセシングから生じる天然に存在するタンパク質の一部のどちらも含むことが意図されている。
「ポリペプチド」という用語は、本明細書全体を通して使用される場合、一般に、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマー鎖を包含する。したがって、特に、タンパク質が単一のポリペプチド鎖のみで構成されている場合、「タンパク質」という用語と「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、そのようなタンパク質を示すために互換的に使用され得る。この用語は、いかなる最小長のポリペプチド鎖にも限定されない。この用語は、天然に産生されたポリペプチド、組換えによって産生されたポリペプチド、半合成的にまたは合成的に作製されたポリペプチドを包含し得る。この用語は、これだけに限定することなく、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Ｍｅｔ除去、プロ酵素またはプレホルモンの活性形態への変換などの、ポリペプチド鎖の共発現型または発現後型修飾を１つまたは複数有するポリペプチドも包含する。この用語は、さらに、対応するネイティブなポリペプチドと比べてアミノ酸配列の変異、例えば、アミノ酸欠失、付加および／または置換などを有するポリペプチド変異体または突然変異体も含む。この用語は、全長ポリペプチドおよびポリペプチドの一部または断片、例えば、そのような全長ポリペプチドのプロセシングから生じる天然に存在するポリペプチドの一部を含むことが意図されている。
「ペプチド」という用語は、本明細書全体を通して使用される場合、５０アミノ酸以下、例えば、４５アミノ酸以下、好ましくは４０アミノ酸以下、例えば、３５アミノ酸以下、より好ましくは３０アミノ酸以下、例えば、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、１０アミノ酸以下または５アミノ酸以下から本質的になる、本明細書で使用されるポリペプチドを指すことが好ましい。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在する、例えば、自然界において存在するまたは自然界から単離された、例えば、細胞または組織によりネイティブにまたは内在的に産生または発現され、それらから単離されていてもよいものであり得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換え型、すなわち、組換えＤＮＡ技術によって産生されたものであり得、かつ／または、部分的にまたは完全に化学的または生化学的に合成されたものであり得る。これだけに限定することなく、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、適切な宿主または宿主細胞発現系（例えば、適切な細菌、酵母、真菌、植物もしくは動物宿主もしくは宿主細胞発現系）により組換えによって産生させることができ、それらから単離してもよい、または、無細胞翻訳もしくは無細胞転写および翻訳、もしくは非生物学的ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質合成により組換えによって産生させることができる。
「核酸」という用語は、本明細書全体を通して使用される場合、一般には、ヌクレオシド単位から基本的に構成される任意の長さのポリマー（好ましくは直鎖状ポリマー）を指す。ヌクレオシド単位は、一般に、複素環式塩基および糖基を含む。複素環式塩基は、とりわけ、プリン塩基およびピリミジン塩基、例えば、天然に存在する核酸に広くいきわたっているアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、他の天然に存在する塩基（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）ならびに化学的または生化学的に修飾された（例えば、メチル化された）非天然または誘導体化塩基などを含み得る。例示的な修飾された核酸塩基としては、これだけに限定することなく、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めた、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが挙げられる。特に、５−メチルシトシン置換により、核酸２重鎖安定性が増大することが示されており、例えばアンチセンス作用物質に関して、さらにいっそう詳細には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に好ましい塩基置換であり得る。糖基としては、とりわけ、好ましくは天然に存在する核酸に共通するリボースおよび／もしくは２−デオキシリボース、またはアラビノース、２−デオキシアラビノース、トレオースまたはヘキソース糖基、ならびに修飾または置換された糖基（例えば、これだけに限定することなく、リボースなどの２’−Ｏ−アルキル化糖、例えば、２’−Ｏ−メチル化糖もしくは２’−Ｏ−エチル化糖；リボースなどの２’−Ｏ−アルキルオキシアルキル化糖、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル化糖；もしくはリボースなどの２’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキレン連結糖、例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン連結糖もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン連結糖；２’−フルオロ−アラビノースなど）などのペントース（ペントフラノース）基を挙げることができる。少なくとも１つのリボヌクレオシド単位を含む核酸分子は、一般にはリボ核酸またはＲＮＡと称され得る。そのようなリボヌクレオシド単位（複数可）は、２’−ＯＨ部分を含み、ここで、−Ｈは、リボヌクレオシドに関して当技術分野で公知の通り置換されていてもよい（例えば、メチル、エチル、アルキル、またはアルキルオキシアルキルによって）。好ましくは、リボ核酸またはＲＮＡは、主にリボヌクレオシド単位で構成され得る、例えば、核酸分子を構成するヌクレオシド単位（数）の≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％またはさらには１００％がリボヌクレオシド単位であり得る。少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド単位を含む核酸分子は、一般にはデオキシリボ核酸またはＤＮＡと称され得る。そのようなデオキシリボヌクレオシド単位（複数可）は、２’−Ｈを含む。好ましくは、デオキシリボ核酸またはＤＮＡは、主にデオキシリボヌクレオシド単位で構成され得る、例えば、核酸分子を構成するヌクレオシド単位（数）の≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％またはさらには１００％がデオキシリボヌクレオシド単位であり得る。ヌクレオシド単位は、とりわけ天然に存在する核酸に共通するリン酸ジエステル連結、およびさらに修飾されたリン酸に基づく連結またはホスホネートに基づく連結、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホロチオエートなどのアルキルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートなどのアルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステラーゼ、ホスホラミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロモルホリデート、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートなど；およびさらにシロキサン、炭酸、スルファミン酸、カルボアルコキシ、アセトアミデート、３’−Ｎ−カルバミン酸などのカルバミン酸、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、３’−チオアセタール、およびスルホンヌクレオシド間連結を含めた多数の公知のヌクレオシド間連結のうちのいずれか１つによって互いに連結し得る。好ましくは、ヌクレオシド間連結は、より好ましくはリン酸ジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート連結またはこれらの組合せなどの修飾リン酸に基づく連結を含めたリン酸に基づく連結であり得る。「核酸」という用語は、これだけに限定することなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノホスホロジアミデート骨格核酸（ＰＭＯ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う骨格切片を有する核酸を含めた、核酸模倣体などのポリマーを含有する任意の他の核酸塩基も包含する（例えば、Kurreck 2003 (Eur J Biochem 270: 1628-1644)を参照されたい）。「アルキル」は、本明細書で使用される場合、特に、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロピルなどの低炭化水素部分、例えば、Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分枝、飽和または不飽和炭化水素を包含する。本明細書で意図されている核酸は、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはそれらの混合物を含み得る。修飾ヌクレオシドは、修飾複素環式塩基、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間連結またはこれらの組合せを含み得る。
「核酸」という用語は、具体的にはｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチド、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含めたＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子をさらに包含することが好ましい。ＲＮＡは、ＲＮＡｉ（阻害性ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ酸を伴うか伴わないかにかかわらず）、およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を包含する。核酸は、天然に存在する、例えば、自然界において存在するまたは自然界から単離された、例えば、細胞または組織によりネイティブにまたは内在的に産生され、それらから単離されていてもよいものであり得る。核酸は、組換え、すなわち、組換えＤＮＡ技術によって産生されたものであり得、かつ／または、部分的にまたは完全に化学的または生化学的に合成されたものであり得る。これだけに限定することなく、核酸は、適切な宿主もしくは宿主細胞発現系（例えば、適切な細菌、酵母、真菌、植物もしくは動物宿主もしくは宿主細胞発現系）により組換えによって産生させることができ、それらから単離してもよい、または無細胞転写もしくは非生物学的核酸合成により組換えによって産生させることができる。核酸は、二本鎖、部分的に二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。さらに、核酸は環状または直鎖状であり得る。
任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸への言及は、見出されるあらゆる生物体、特に、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物、さらに好ましくはヒトのそのようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を包含する。
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰのうちの１つまたは複数、好ましくは全てが、動物起源、好ましくは温血動物起源、より好ましくは脊椎動物起源、さらにより好ましくはヒト起源および非ヒト哺乳動物起源を含めた哺乳動物起源、さらに好ましくはヒト起源のものである。
任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸への言及は、特に、ネイティブな配列を有する、すなわち、一次配列が自然界で見出されるまたは自然界に由来するペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の一次配列と同じであるペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を包含し得る。ネイティブな配列は、異なる種間で、そのような種間の遺伝的相違に起因して異なり得ることが当業者には理解される。さらに、ネイティブな配列は、同じ種の異なる個体間またはその中で、所与の種内の正常な遺伝的多様性に起因して異なり得る。また、ネイティブな配列は、同じ種の異なる個体間またはさらにはその中で、体細胞突然変異または転写後もしくは翻訳後修飾に起因して異なり得る。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸のあらゆるそのような変異体またはアイソフォームが本明細書で意図されている。したがって、自然界で見出されるまたは自然界に由来するペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の全ての配列が「ネイティブ」とみなされる。
ある特定の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸は、ヒトのものであり得る、すなわち、それらの一次配列が、天然に存在するヒトペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸のまたはそれらの中に存在する対応する一次配列と同じであり得る。ある特定の実施形態では、「ヒト」という限定詞は、それぞれのペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の起源または供給源ではなく、それらの一次配列を指す。例えば、そのようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸は、ヒト対象の試料中に存在し得るもしくはヒト対象の試料から単離することができる、または他の手段によって（例えば、組換え発現、無細胞転写もしくは翻訳、もしくは非生物学的核酸もしくはペプチド合成によって）得ることができる。
ある特定の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸は、野生型であり得る。大多数のネイティブなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸が野生型と考えられるが、疾患表現型に寄与し得るまたはその原因になり得る部分的なまたは完全な機能喪失を導く天然に存在する突然変異を有するものは、一般に、「野生型」という用語の範囲から除外される。
任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸への言及は、そのようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸、特に、それらの天然に存在する形態、ネイティブな形態または野生型形態の変異体または断片も包含し得る。
「断片」という用語は、本明細書全体を通して、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関連して使用される場合、一般には、一般にはペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端が短縮された形態などの、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の一部を示す。断片は、前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列長の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約５０％または少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％またはさらには約９９％を含み得ることが好ましい。例えば、全長ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の長さを超えない限り、断片は、対応する全長ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の５個以上の連続したアミノ酸、または１０個以上の連続したアミノ酸、または２０個以上の連続したアミノ酸、または３０個以上の連続したアミノ酸、例えば、４０個以上の連続したアミノ酸、例えば、５０個以上の連続したアミノ酸、例えば、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、７００個以上、８００個以上、９００個以上または１０００個以上の連続したアミノ酸などの配列を含み得る。
核酸（ポリヌクレオチド）に関連した「断片」という用語は、一般には、核酸の５’短縮形態および／または３’短縮形態を示す。断片は、前記核酸の核酸配列長の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約５０％または少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％またはさらには約９９％を含み得ることが好ましい。例えば、全長核酸の長さを超えない限り、断片は、対応する全長核酸の５個以上の連続したヌクレオチド、または１０個以上の連続したヌクレオチド、または２０個以上の連続したヌクレオチド、または３０個以上の連続したヌクレオチド、例えば、４０個以上の連続したヌクレオチド、例えば、５０個以上の連続したヌクレオチド、例えば、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、７００個以上、８００個以上、９００個以上、１０００個以上、１５００個以上、２０００個以上、２５００個以上、３０００個以上、３５００個以上または４０００個以上の連続したヌクレオチドなどの配列を含み得る。
これらの用語は、これだけに限定することなく、代替的転写もしくは翻訳、エキソおよび／もしくはエンドタンパク質分解、エキソおよび／もしくはエンド核酸分解、または、例えば物理的、化学的および／もしくは酵素的タンパク質分解もしくは核酸分解によるものなどのペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは核酸の分解などの、インビボおよび／またはインビトロにおける機構のいずれかによって生じる断片を包含する。
タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸の「変異体」という用語は、一般に、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、そのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または核酸の配列と実質的に同一である（すなわち、大部分が同一であるが完全に同一ではない）、例えば、記載されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または核酸の配列と少なくとも約８０％同一であるまたは少なくとも約８５％同一である、例えば、好ましくは少なくとも約９０％同一である、例えば、少なくとも９１％同一である、９２％同一である、より好ましくは少なくとも約９３％同一である、例えば、少なくとも９４％同一である、なおより好ましくは少なくとも約９５％同一である、例えば、少なくとも９６％同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９７％同一である、例えば、少なくとも９８％同一である、および最も好ましくは少なくとも９９％同一であるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたは核酸を指す。変異体は、記載されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸に対して、記載されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸の配列全体を配列アラインメントで照会した場合にそのような程度の同一性を示し得ることが好ましい（すなわち、全体的な配列同一性）。配列同一性は、それ自体公知の配列アラインメントおよび配列同一性の決定を実施するための適切なアルゴリズムを使用して決定することができる。例示的であるが非限定的なアルゴリズムとして、元々Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)により記載されたＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）に基づくもの、例えば、例えば公開されたデフォルト設定または他の適切な設定（例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに関しては：ギャップを入れるためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ）＝５、ギャップを延長するためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ）＝２、ミスマッチに対するペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａ ｍｉｓｍａｔｃｈ）＝−２、マッチに対するリワード（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ）＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ（ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ）＝５０、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）＝１０．０、ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）＝２８；またはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに関しては：行列＝Ｂｌｏｓｕｍ６２（Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 10915-10919）、ギャップを入れるためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ）＝１１、ギャップを延長するためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ）＝１、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）＝１０．０、ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）＝３など）を使用した、Tatusova and Madden 1999（FEMS Microbiol Lett 174: 247-250）により記載されている「Ｂｌａｓｔ ２配列」アルゴリズムなどが挙げられる。
特定のアミノ酸配列とクエリポリペプチドのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を決定するための手順の例では、２つのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）においてウェブアプリケーションとしてまたは独立型の実行可能なプログラム（ＢＬＡＳＴバージョン２．２．３１＋）として利用可能なＢｌａｓｔ ２配列（Ｂｌ２ｓｅｑ）アルゴリズムを使用し、適切なアルゴリズムパラメータを使用してアラインメントすることが必要になる。適切なアルゴリズムパラメータの例としては、行列＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップを入れるためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ）＝１１、ギャップを延長するためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ）＝１、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）＝１０．０、ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）＝３）が挙げられる。２つの比較される配列が相同性を共有する場合、アウトプットから、アラインメントされた配列が相同性の領域として示される。２つの比較される配列が相同性を共有しない場合、アウトプットから、アラインメントされた配列は示されない。アラインメントされたら、両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数を計数することによってマッチの数を決定する。マッチの数をクエリポリペプチドの長さで割り、その後、得られた値に１００を掛けることによってパーセント同一性を決定する。パーセント同一性値を少数第２位で四捨五入してもよいが、必要ではない。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４の端数を切り捨てて７８．１にし、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９の端数を切り上げて７８．２にすることができる。Ｂｌ２ｓｅｑによりアウトプットされたアラインメントの各セグメントに関する詳細な見解は同一性のパーセンテージにすでに都合よく含まれていることにも留意する。
タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸の変異体は、前記タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸のホモログ（例えば、オルソロまたはパラロ）であり得る。本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、一般には、同じまたは異なる分類群からの２つの巨大分子間の構造的類似性を示し、前記類似性は、共有される祖先に起因する。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの変異体は、対応するタンパク質またはポリペプチドに対して（すなわち、それと比較して）１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含み得る。例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの変異体（置換変異体）は、対応するタンパク質またはポリペプチドに対して（すなわち、それと比較して）最大で７０カ所（例えば、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、５カ所以下、６カ所以下、７カ所以下、８カ所以下、９カ所以下、１０カ所以下、１２カ所以下、１５カ所以下、２０カ所以下、２５カ所以下、３０カ所以下、３５カ所以下、４０カ所以下、５０カ所以下、６０カ所以下、または７０カ所以下）の保存的アミノ酸置換を含み得、かつ／または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの変異体（置換変異体）は、対応するタンパク質またはポリペプチドに対して（すなわち、それと比較して）最大で２０カ所（例えば、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、５カ所以下、６カ所以下、７カ所以下、８カ所以下、９カ所以下、１０カ所以下、１１カ所以下、１２カ所以下、１３カ所以下、１４カ所以下、１５カ所以下、１６カ所以下、１７カ所以下、１８カ所以下、または１９カ所以下）の非保存的アミノ酸置換を含み得る。
保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸での同様の特徴を有する別のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸置換としては、以下の群内での置換が挙げられる：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（すなわち、塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（すなわち、酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上記の極性群、塩基性群、または酸性群の１つのメンバーの同じ群の別のメンバーによる置換はいずれも保存的置換とみなすことができる。対照的に、非保存的置換は、１つのアミノ酸での同様でない特徴を有する別のアミノ酸の置換である。
その代わりに、またはそれに加えて、例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの変異体（欠失変異体）は、対応するタンパク質またはポリペプチドに対して（すなわち、それと比較して）最大２０アミノ酸セグメント（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０セグメント）を欠き得る。欠失セグメント（複数可）は、それぞれ独立に、１つのアミノ酸、２つの連続したアミノ酸または３つの連続したアミノ酸からなり得る。欠失セグメントは、連続していない場合もあり、欠失セグメントの２つ以上または全てが連続している場合もある。
核酸の変異体は、対応する核酸に対して（すなわち、それと比較して）１つまたは複数のヌクレオチド付加、欠失、または置換を含み得る。
任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の「断片または変異体」または「変異体または断片」への言及は、そのようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の変異体の断片、およびそのようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の断片の変異体も包含する。
特に、記載されているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生物活性のある断片および／または変異体が想定される。「生物活性のある」という用語は、その断片および／または変異体がそれぞれのまたは対応するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生物活性または意図された機能性を少なくとも部分的に保持することを示す「機能的に活性な」または「機能的な」などの用語と交換することができる。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の「活性」への言及は、一般に、これだけに限定することなく、例えば細胞内、組織内、器官内または生物体内でのその生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性、相互作用活性、リガンド活性、および／または構造的活性の任意の１つまたは複数の側面などの、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生物活性の任意の１つまたは複数の側面を包含し得る。
機能的に活性な断片または変異体は、対応するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と比較して、意図された生物活性または機能性の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、例えば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、例えば、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％またはさらには約１００％を保持し得ることが好ましい。ある特定の実施形態では、機能的に活性な断片または変異体は、さらには、対応するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と比較して高い生物活性または機能性を示し得る、例えば、対応するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と比較して、意図された生物活性または機能性の少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％を示し得る。一例として、所与のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性を、定量的アウトプットを伴うアッセイ、例えば、数量化できるシグナルが生じる酵素的アッセイまたはシグナル伝達アッセイまたは結合アッセイにおいて容易に測定することができる場合、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の機能的に活性な断片または変異体は、対応するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質によって生じるシグナルの少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％であるシグナルを生じ得る。
一例として、限定することなく、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰポリペプチドまたはタンパク質の生物活性のある断片または変異体は、それぞれ対応するネイティブなまたは野生型ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰポリペプチドまたはタンパク質の生物活性の１つまたは複数の側面を少なくとも部分的に保持する。例えば、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰポリペプチドまたはタンパク質の生物活性への言及は、特には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体に関与する能力、例えば、前記複合体の１つもしくは複数の他の成分に結合する能力、および／またはＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体の一部としてＷｎｔシグナル伝達を媒介する能力を示し得る。
したがって、本明細書では、具体的には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない作用物質であり、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰのうちの１つもしくは複数または好ましくは全てが、ネイティブなまたは野生型ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰである、作用物質を開示する。
本明細書では、さらに、具体的には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない作用物質であり、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰのうちの１つもしくは複数または好ましくは全てが、ネイティブなまたは野生型ヒトＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰである、作用物質を開示する。
本明細書では、さらに、具体的には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない作用物質であり、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰのうちの１つもしくは複数または好ましくは全てが、本明細書の他の箇所に記載のＧｅｎｂａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔエントリーの下に注釈が付けられているネイティブなまたは野生型ヒトＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰである、作用物質を開示する。ＧｅｎｂａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔエントリーで前駆体ポリペプチドまたはタンパク質の配列が提示されている場合には、対応する成熟形態がＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体に関与することが予測されることを読者には再認識されたい。
本明細書では、さらに、具体的には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ１／ＬＲＰ５またはＬＲＰ６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦＺＤ５／ＬＲＰ５またはＬＲＰ６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない作用物質であり、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ５、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のうちの１つもしくは複数または好ましくは全てが、本明細書の他の箇所に記載のＧｅｎｂａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔエントリーの下に注釈が付けられているネイティブなまたは野生型ヒトＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ５、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６である、作用物質を開示する。
本明細書では、さらに、具体的には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない作用物質であり、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰのうちの１つまたは複数が、ネイティブなまたは野生型ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰの生物活性のある断片または変異体である、作用物質を開示する。
本明細書では、さらに、具体的には、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦＺＤ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない作用物質であり、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰのうちの１つまたは複数が、ネイティブなまたは野生型ヒトＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤまたはＬＲＰの生物活性のある断片または変異体である、作用物質を開示する。
「複合体」、「タンパク質複合体」または「ポリペプチド複合体」という用語は、当技術分野において十分に理解されている。さらなる手引きとして、またこれだけに限定することなく、これらの用語は、広範には、２つ以上のタンパク質またはポリペプチドを含むクラスターを示す。クラスターは、非共有結合、より詳細には非共有結合性タンパク質間相互作用によって安定化し得、その場合、クラスター内に存在するポリペプチドの全てまたは一部のみが物理的に相互作用する。タンパク質複合体は、完全にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合もあり、例えば炭水化物、脂質、糖脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、核タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオシドリン酸、酵素の補因子、ポルフィリン、金属イオンなどの他の分子または巨大分子を含む場合もある。これらの用語は、これだけに限定することなく、絶対的（ｏｂｌｉｇａｔｅ）または非絶対的（ｎｏｎ−ｏｂｌｉｇａｔｅ）、一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）または永続的（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）であり、および／またはホモ多量体またはヘテロ多量体であり得るタンパク質複合体を包含する。これらの用語は、これだけに限定することなく、細胞膜（原形質膜）、細胞外、細胞質内、細胞小器官内、または細胞小器官の膜に位置し得るタンパク質複合体を包含する。細胞膜に位置する複合体は、一般には、膜係留または膜貫通タンパク質を少なくとも１つ含有する。これらの用語は、膜マイクロドメインおよび所与のシグナル伝達経路を区分する「シグナロソーム」として公知の膜結合型高分子細胞小器官様構造も包含する。そのような高次タンパク質複合体は、細胞内足場によって少なくとも部分的に安定化され得る。したがって、これらの用語は、例えば、前記タンパク質またはポリペプチドによって媒介される前記部位における細胞膜を通じたシグナルトランスダクションを可能にするために、ある特定のタンパク質またはポリペプチドが細胞膜の所与の部位に局所的に濃縮されているまたは蓄積している状況も指す。
ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体とは、広範には、少なくとも１つのＧＰＲ１２４ポリペプチド、少なくとも１つのＲＥＣＫポリペプチド、少なくとも１つのＦＺＤポリペプチドおよび少なくとも１つのＬＲＰポリペプチドを含むタンパク質複合体、特に、膜結合タンパク質複合体、より詳細には、原形質膜結合タンパク質複合体を示す。ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の下流のメンバー（例えば、ディシェベルド（Ｄｖｌ））を含有する細胞の原形質膜に位置する場合、前記細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を、細胞外からもたらされたＷｎｔ７リガンドに応答して活性化することができる。
ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体とは、広範には、少なくとも１つのＦＺＤポリペプチドおよび少なくとも１つのＬＲＰポリペプチドを含むタンパク質複合体、特に、膜結合タンパク質複合体、より詳細には、原形質膜結合タンパク質複合体を示す。ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の下流のメンバー（例えば、Ｄｖｌ）を含有する細胞の原形質膜に位置する場合、前記細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を、細胞外からもたらされた、これだけに限定されないがＷｎｔ７リガンドなどのＷｎｔリガンドに応答して活性化することができる。
「Ｗｎｔシグナル伝達」という用語は、本明細書で使用される場合、生物活性のあるＷｎｔリガンドが細胞に対する効果を発揮して前記細胞の活性および／または作用をモジュレートする機構を指す。生物活性のあるＷｎｔリガンドは、ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体などのＷｎｔ受容体（複数可）に結合することによって細胞活性および／または作用をモジュレートする。Ｗｎｔリガンドが結合することによって活性化されたら、Ｗｎｔ受容体（複数可）により１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が活性化される。３つのＷｎｔシグナル伝達経路が古典的に認識されている：標準的（すなわち、転写コアクチベーターとしてのβ−カテニン活性化によって媒介される）Ｗｎｔ経路、非標準的平面内細胞極性経路、および非標準的Ｗｎｔ／カルシウム経路。３つの経路は全て、一般には、ＷｎｔリガンドがＦＺＤ受容体に結合することによって活性化される。しかし、標準的（またはβ−カテニン依存性）Ｗｎｔシグナル伝達の誘導のためにはＬＲＰ受容体の動員が前提条件であると思われる。当技術分野で公知の通り、Ｗｎｔ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体の非存在下では（「不活性標準的Ｗｎｔシグナル伝達」）、β−カテニンが細胞質においてカゼインキナーゼおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）によってリン酸化される。これらのキナーゼとβ−カテニンの相互作用は、足場タンパク質であるアキシン（Ａｘｉｎ）および大腸腺腫症（ＡＰＣ）タンパク質によって容易になる。まとめると、これらのタンパク質は、リン酸化β−カテニンがベータ−トランスデューシンリピート含有タンパク質（β−ＴｒＣＰ）によって認識され、ユビキチン化の標的になり、プロテアソームによって分解されることを可能にする「分解複合体」を形成する。活性な標準的（またはベータカテニン依存性）Ｗｎｔシグナル伝達には、細胞表面におけるＦＺＤとＬＲＰの受容体複合体へのＷｎｔリガンドの結合が伴う。シグナル伝達の間、ＦＺＤとＬＲＰが、Ｗｎｔタンパク質の結合によりこの２つの受容体の二量体化が導かれるように協同する。この二量体化によりＦＺＤ受容体とＬＲＰ受容体のコンフォメーションの変化が導かれることが理論づけられる。結果として、ＬＲＰの細胞質尾部が足場タンパク質であるアキシンをリン酸化依存的に動員し、それに結合し、それにより、ＤＶＬ、アキシン、およびＧＳＫ３が関与する複合体の形成が導かれる。受容体と結合したＤＶＬおよびアキシン分子の多量体により、ＬＲＰ−ＦＺＤ二量体の形成が支持され得る。ＧＳＫが細胞膜に動員された結果として、β−カテニンリン酸化が阻害され、β−カテニンが分解複合体から放出され、β−カテニンが細胞質に蓄積することが可能になる。細胞質へのβ−カテニンの蓄積により、β−カテニンが核に進入することおよびＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子と相互作用することが可能になる。
本発明者らは、Ｗｎｔ７がＲｅｃｋに特異的にＦＺＤ非依存的に結合し、ＲＥＣＫ結合パートナーであるＧＰＲ１２４により、ＲＥＣＫと結合したＷｎｔ７とＦＺＤ／ＬＲＰ複合体が細胞内ＤＶＬ足場を介して架橋し、それにより、Ｗｎｔ７リガンド特異的ＲＥＣＫ／ＧＰＲ１２４／ＦＺＤ／ＬＲＰシグナロソームがアセンブリーされ、標準的Ｗｎｔシグナル伝達が活性化されるＷｎｔ７特異的ＲＥＣＫ／ＧＰＲ１２４／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性シグナル伝達を同定した。
上記を考慮して、一般にはＦＺＤおよびＬＲＰポリペプチドによって媒介されるＷｎｔシグナル伝達の場合と同様に、ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体は、細胞膜において、前記ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体を通じてＷｎｔシグナル伝達を活性化することができる細胞外作用物質の非存在下でまたはそれとは独立しては形成されない可能性があることが当業者には理解されよう。言い換えれば、作用物質は、例えば作用物質とＦＺＤおよびＬＲＰのそれぞれとのタンパク質間相互作用によるものなどの、ＦＺＤポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのＦＺＤ／ＬＲＰ複合体へのアセンブリーまたは編成において積極的な役割を果たし得る。この結果、ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体が形成され、複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達が活性化される。
同様に、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体は、細胞膜において、前記ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体を通じてＷｎｔシグナル伝達を活性化することができる細胞外作用物質の非存在下でまたはそれとは独立しては形成されない可能性がある。言い換えれば、作用物質は、例えば作用物質と前記ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰのうちの２つ以上のそれぞれとのタンパク質間相互作用によるものなどの、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰポリペプチドのうちの２つ以上のＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体へのアセンブリーまたは編成において積極的な役割を果たし得る。この結果、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体が形成され、複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達が活性化される。
したがって、「Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質」という句は、作用物質がＧｐｒ１２４、Ｒｅｃｋ、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰポリペプチドを通じてＷｎｔシグナル伝達を誘導することができることを指す。「Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質」という句は、必ずしもＧｐｒ１２４、Ｒｅｃｋ、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰを発現する細胞に作用物質を接触させる前にＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体が存在することを意味するものではない。例えば、これだけに限定することなく、作用物質は、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰシグナル伝達複合体の形成またはアセンブリーに寄与するまたはそれを容易にし、したがって、前記複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化し得る。同様に、「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質」という句は、作用物質がＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰポリペプチドを通じてＷｎｔシグナル伝達を誘導することができることを指す。「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質」という句は、必ずしもＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰを発現する細胞にそのような作用物質を接触させる前にＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体が存在することを意味するものではない。例えば、これだけに限定することなく、そのような作用物質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰシグナル伝達複合体の形成またはアセンブリーを寄与するまたはそれを容易にし、したがって、前記複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化し得る。「前記作用物は、Ｒｅｃｋおよび／またはＧｐｒ１２４の非存在下ではＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化しない」という句は、必ずしも、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰを発現するが、Ｒｅｃｋおよび／またはＧｐｒ１２４は発現しない細胞においてＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体が存在することを意味するものではない。例えば、これだけに限定することなく、作用物質は、そのような細胞におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰシグナル伝達複合体の形成またはアセンブリーに寄与できないまたはそれを容易にすることができず、したがって、前記複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化することができない可能性がある。
さらに、本明細書において想定されるＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／ＦＺＤ／ＬＲＰ受容体複合体は、複合体を機能的にモジュレートする場合もあるが必ずしもそうではないさらなる成分（複数可）を含み得ることが当業者には理解されよう。例えば、複合体は、ＧＰＲ１２４とＦｒｉｚｚｌｅｄを架橋させることができる細胞内足場を形成するディシェベルド（Ｄｖｌ）を含み得る。
特定の実施形態では、原形質膜においてＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰポリペプチドを発現し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の下流のメンバーを含有する細胞は、細胞表面においてＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰポリペプチドの全てを天然に発現する細胞、例えば、大脳内皮細胞などである。さらなる実施形態では、原形質膜にＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰポリペプチドを発現し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の下流のメンバーを含有する細胞は、表面においてＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺＤおよびＬＲＰポリペプチドの全てを発現するように改変された（例えば、遺伝子操作された）細胞である。例えば、細胞は、ＦＺＤおよびＬＲＰを天然に発現するがＧＰＲ１２４およびＲＥＣＫは天然に発現せず、ＧＰＲ１２４およびＲＥＣＫポリペプチドを発現するように遺伝子操作された（例えば、前記ＧＰＲ１２４およびＲＥＣＫポリペプチドをコードする発現可能な核酸（複数可）が安定にまたは一過性にトランスフェクトされた）培養細胞であり得る。細胞は哺乳動物細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましい。
特定の実施形態では、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するがＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないという作用物質の能力は、標準的Ｗｎｔシグナル伝達をＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下では活性化しないという作用物質の能力を示す。
「ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在」という句は、ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４ポリペプチドが細胞膜またはその近くに、好ましくはＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰポリペプチドと互いに近接して存在することを指す。互いに近接していることにより、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体の形成が、例えば本明細書において教示される作用物質が細胞に外部から供給される場合など、それに貢献する条件下で容易になり得る。他方では、「ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在」という句は、細胞膜においてＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４ポリペプチドを欠くまたはそれが存在しないことを指す。細胞膜またはその近くにおけるＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在は、細胞がＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４を発現しない、翻訳しない、または正確に移動させない場合に起こり得る。ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在は、必ずしも細胞膜におけるＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４ポリペプチドの完全な非存在を示すものではなく、例えば、例えば免疫ブロッティング、免疫細胞化学または免疫蛍光法などの当業者に公知の従来のタンパク質検出または数量化アッセイによって検出可能でない、またはその感度範囲を下回る量のＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４ポリペプチドを指す場合もある。
特定の実施形態では、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するがＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないという作用物質の能力は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によるＷｎｔシグナル伝達を媒介することができる細胞ではＷｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫを発現しないＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことができる細胞ではＷｎｔシグナル伝達を活性化しないという作用物質の能力を示す。
ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によるＷｎｔシグナル伝達を媒介することができる細胞は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達に必要とされる細胞成分の全てを天然に発現する細胞、例えば、大脳内皮細胞または細胞株などであり得る。ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によるＷｎｔシグナル伝達を媒介することができる細胞は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達に必要とされる細胞成分のいずれも天然に発現しないまたはその全てを天然に発現するのではない細胞であってもよく、それらを、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達に必要とされるが欠如している細胞成分を補償するために改変すること、例えば、遺伝子操作することができる。そのような改変は当技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載されている。
ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によるＷｎｔシグナル伝達を媒介することができる細胞は、脊椎動物細胞または細胞株であり得る。非限定的な例としては、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２３９Ｔ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、Ｂｅｎｄ３細胞、Ｂｅｎｄ５細胞、またはｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞が挙げられる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、これだけに限定することなく、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−３２１６のＨＥＫ２９３Ｔを含め、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ）によって維持されている公共の収集物から入手することができる。
特定の実施形態では、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するがＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないという作用物質の能力は、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺおよびＬＲＰを発現する細胞ではＷｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＦＺおよびＬＲＰを発現するがＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫは発現しない細胞ではＷｎｔシグナル伝達を活性化しないという作用物質の能力を示し、ここで、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺおよびＬＲＰを発現する細胞とＦＺおよびＬＲＰを発現するがＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫは発現しない細胞は、他の点では実質的に同一である。
特定の実施形態では、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するがＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないという作用物質の能力は、マウスまたはヒト脳血管内皮細胞または細胞株ではＷｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４遺伝子がノックアウトされたマウスまたはヒト脳血管内皮細胞または細胞株ではＷｎｔシグナル伝達を活性化しないという作用物質の能力を示す。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化の決定に関しては当技術分野で公知であり、明細書の他の箇所に記載の通り実施することができる。適切な内皮細胞としては、例えば、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、Ｂｅｎｄ３細胞、Ｂｅｎｄ５細胞またはｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞が挙げられる。ＨＢＭＥＣは、これだけに限定することなく、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−３２４５のＨＢＥＣ−５ｉを含め、例えばＡＴＣＣによって維持されている公共の収集物から入手することができる。Ｂｅｎｄ３細胞は、これだけに限定することなく、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−２２９９のＢｅｎｄ．３を含め、例えばＡＴＣＣによって維持されている公共の収集物から入手することができる。
特定の実施形態では、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するがＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないという作用物質の能力は、Ｗｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））の内皮において遺伝子導入により発現させた場合には前記ゼブラフィッシュにおける脳脈管構造および／または血液脳関門を回復させるが、野生型ゼブラフィッシュの胚に作用物質をコードするｍＲＮＡを微量注射すること、好ましくは当該ｍＲＮＡを１ｐｇ〜１００ｐｇの用量で注射することにより後方化（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉｚａｔｉｏｎ）表現型は誘導されない、または野生型アフリカツメガエル胚に作用物質をコードするｍＲＮＡを微量注射ことにより軸重複は誘導されないという作用物質の能力を示す。
Ｗｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの内皮において遺伝子導入により発現させた場合には前記ゼブラフィッシュにおける脳脈管構造および／または血液脳関門を回復させるという作用物質の能力は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、脳脈管構造および／または血液脳関門の回復は、後脳中心動脈（ＣｔＡ）の量、凝集した大脳毛細血管の長さ、平均血管サイズおよび／または平均毛細血管枝を決定することによって評価することができる。本明細書において教示される作用物質を遺伝子導入により発現しているＷｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの脳領域におけるＧＬＵＴ１の発現の決定（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学的検査を使用した）を使用して、前記ゼブラフィッシュの脳脈管構造を可視化することができる。その後、本明細書において教示される作用物質を遺伝子導入により発現しているＷｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの脳領域におけるＧＬＵＴ１発現パターンを野生型ゼブラフィッシュなどの対照の脳領域におけるＧＬＵＴ１発現パターンと比較することができる。
特定の実施形態では、本明細書において教示される作用物質を遺伝子導入により発現しているＷｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュの脳脈管構造および血液脳関門は、本明細書において教示される作用物質を遺伝子導入により発現しているＷｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュにおける後脳ＣｔＡの量が、野生型ゼブラフィッシュにおける後脳ＣｔＡの量の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である場合、回復したとみなされる。
Ｗｎｔ７ａａ−／−ゼブラフィッシュを生成し、作用物質をゼブラフィッシュの内皮において遺伝子導入により発現させる方法は当技術分野で周知であり、例えば、Shankaran et al., CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens, Curr Protoc Mol Biol.,119:31.9.1-31.9.22 (2017)に記載のものなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ指向型遺伝子編集を使用する。
ゼブラフィッシュの胚、好ましくは１〜４細胞期のゼブラフィッシュの胚へのｍＲＮＡの微量注射、ならびにゼブラフィッシュにおける表現型の出現または非存在の評価は当技術分野で周知であり、例えば、Rosen et al., Microinjection of zebrafish embryos to analyse gene function, J Vis Exp. (25): 1115 (2009)を参照されたい。ゼブラフィッシュにおける後方化表現型は、ゼブラフィッシュにおける原腸形成の間の前神経外胚葉の後方化、前脳の喪失および眼構造の喪失を含む（van de Water et al., Ectopic Wnt signal determines the eyeless phenotype of zebrafish masterblind mutant. Development. 128 (20): 3877-3888 (2001)）。
アフリカツメガエル胚に作用物質を注射した際の軸重複の出現または非存在の評価は当技術分野において周知であり、例えば、Kuehl et al., Dorsal axis duplication as a functional readout for Wnt activity. Methods Mol Biol. 469: 467-476 (2008) を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「作用物質」という用語は、広範には、任意の化学的（例えば、無機もしくは有機）、生化学的または生物学的物質、分子または巨大分子（例えば、生物学的巨大分子）、それらの組合せまたは混合物、組成が決定されていない試料、または、細菌、真菌、植物、または動物細胞または組織などの生物材料から作製される抽出物を指す。好ましいが非限定的な「作用物質」としては、核酸、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、アプタマー、光アプタマー（photoaptamer）、シュピーゲルマー（spiegelmer）、化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは小有機分子、脂質、炭水化物、多糖など、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。文脈に応じて、「作用物質」という用語は、疾患の治療、治療法、予防、または診断に有用であるまたは使用される「治療剤」または「薬物」を示し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、化学物質、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、タンパク質またはポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、シュピーゲルマーおよび核酸からなる群を含むかまたはそれから選択され、前記作用物質は、タンパク質またはポリペプチドを含むことが好ましい。
本明細書に開示される作用物質は、化学物質、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、タンパク質またはポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、シュピーゲルマーおよび核酸の２つ以上の組合せを含み得る。例えば、本明細書に開示される作用物質は、１つまたは複数のポリペプチド領域と１つまたは複数の非ポリペプチド領域の組合せを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドからなる群を含むかまたはそれから選択される。
本明細書で使用される場合、「化学物質」という用語は、その最も広範な意味で使用され、一般に、一定の化学組成および特徴的な性質を有する任意の実質的に純粋な物質を指す。化学物質は、有機分子、好ましくは小有機分子であり得る。「小分子」という用語は、医薬品に一般に使用される有機分子と同等のサイズを有する化合物、好ましくは有機化合物を指す。この用語は、生物学的巨大分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸など）は除外する。好ましい小有機分子のサイズは、最大約５０００Ｄａ、例えば、最大約４０００、好ましくは最大３０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、なおより好ましくは最大約１０００Ｄａ、例えば、最大約９００、８００、７００、６００または最大約５００Ｄａにわたる。
「抗体」という用語は、本明細書では、その最も広範な意味で使用され、一般に、これだけに限定することなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体、トランスジェニック抗体、移植抗体および単鎖抗体などを含めた全抗体、または目的の抗原に選択的に結合する１つまたは複数のドメインを含有する任意の融合タンパク質、コンジュゲート、断片、またはその誘導体などの任意の免疫学的結合性物質を指す。したがって、抗体という用語は、免疫グロブリン分子全体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはこれらのいずれかの免疫学的に有効な断片を含む。したがって、この用語は、具体的には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多価（例えば、２価、３価、もしくはより多価）および／または多重特異性抗体（例えば、二特異性またはより高次特異性抗体）、ならびに、所望の生物活性（特に、目的の抗原に特異的に結合する能力）を示す限りは抗体断片、ならびにそのような断片の多価および／または多重特異性複合物を包含する。「抗体」という用語は、免疫化を含む方法によって生成される抗体を含むだけでなく、任意のポリペプチド、例えば、目的の抗原のエピトープに特異的に結合することができる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するように作出された、組換えによって発現されたポリペプチドも含む。したがって、この用語は、インビトロで作製されたものであるか、細胞培養物で作製されたものであるか、またはインビボで作製されたものであるかに関わらず、そのような分子に適用される。
「免疫グロブリン配列」という用語は、本明細書において重鎖抗体を指すために使用されているか従来の４本鎖抗体を指すために使用されているかにかかわらず、一般用語として使用され、フルサイズ抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメインまたは断片（これだけに限定されないが、それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合性ドメインまたは断片を含む）のいずれも含む。さらに、「配列」という用語は、本明細書で使用される場合（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語として）、一般に、文脈から限定された解釈が必要な場合を除き、関連性のあるアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列のどちらも含むと理解されるべきである。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定因子を含む。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面群分けを含み得、特定の三次元構造的特徴、および／または特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合するといえる。
「結合性領域」、「結合性部位」または「相互作用部位」という用語は、本明細書では、目的の抗原への結合に関与するアミノ酸残基の特定の部位、部分、ドメインまたはひと続きという意味を有するものとする。そのような結合性領域は、本明細書に記載の抗体の特定のアミノ酸残基から基本的になり、その残基が標的分子と接触する。
「特異性」という用語は、特定の抗原結合性分子または抗原結合性タンパク質分子（例えば、抗体分子など）が結合することができる異なる型の抗原または抗原性決定因子の数を指す。抗原結合性タンパク質の特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。抗原と抗原結合性タンパク質の解離の平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原性決定因子と抗原結合性タンパク質の抗原結合性部位の間の結合強度についての評価基準である：ＫＤの値が小さいほど、抗原性決定因子と抗原結合性分子の間の結合強度が強力である（あるいは、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）として表すこともできる）。当業者には明らかになる通り、親和性は、特定の目的の抗原に応じて、それ自体が公知の様式で決定することができる。結合活性は、抗原結合性分子（例えば、抗体など）と関係する抗原の結合の強度の評価基準である。結合活性は、抗原性決定因子と抗原結合性分子の抗原結合性部位の親和性および抗原結合性分子に存在する関係する結合性部位の数の両方に関連する。一般には、抗原結合性タンパク質（例えば、抗体など）は、１０−５〜１０−１２モル／リットル（Ｍ）以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル（Ｍ）以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）、および／または少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば、少なくとも１０１２Ｍ−１などの会合定数（ＫＡ）で結合する。１０−４Ｍよりも大きなＫＤ値はいずれも、一般に、非特異的結合を示すとみなされる。抗体は、所望の抗原に、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば、５００ｐＭ未満などのＫＤで結合することが好ましい。抗原結合性タンパク質の抗原または抗原性決定因子への特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなど、ならびに当技術分野においてそれ自体が公知のそれらの種々の変形を含めた、それ自体が公知の任意の適切な様式で決定することができる。
天然に存在する全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続した２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は約１００〜１１０アミノ酸の可変領域を含み、この領域は、この領域に含有される相補性決定領域（ＣＤＲ）を介した抗原認識に主に関与する。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。
ＣＤＲの間には、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が散在する。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、重鎖の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原との特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含有する。ＬＣＶＲ領域およびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、周知のＫａｂａｔ番号付け慣習に従い、これは、抗体の重鎖領域および軽鎖領域内の他のアミノ酸残基よりも可変性が大きい（すなわち、超可変）アミノ酸残基を番号付ける方式を指す（Kabat, et al., Ann. NYAcad. Sci. 190: 382-93(1971)；Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)）。抗体の可変領域内のＣＤＲの位置決めは、Ｋａｂａｔ番号付けまたは単に「Ｋａｂａｔ」に従う。
軽鎖は、カッパまたはラムダに分類され、当技術分野で公知の特定の定常領域によって特徴付けられる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それにより抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥと定義される。ＩｇＧ抗体は、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４にさらに分けることができる。各重鎖型は、当技術分野で周知の配列を有する特定の定常領域によって特徴付けられる。
ある特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭクラスのいずれかのものであり得、ＩｇＧクラス抗体であることが好ましい。
ある特定の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、抗血清またはそれから精製された（例えば、親和性精製された）免疫グロブリンであり得る。
他の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物であり得る。モノクローナル抗体は、特定の抗原または抗原内の特定のエピトープをより大きな選択性および再現性で標的とし得る。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、例えば、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含めた単一のコピーまたはクローンに由来する抗体を指し、それが作製される方法を指すものではない。モノクローナル抗体は、均一または実質的に均一な集団内に存在することが好ましい。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片は、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えば、ＣＤＲ移植、またはそのような技術の組合せ、または当技術分野で公知の他の技術によって作製することができる。
例として、限定するものではなく、モノクローナル抗体は、Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495)に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作出することもでき、組換えＤＮＡ法（例えば、ＵＳ４，８１６，５６７におけるものと同様に）によって作出することもできる。モノクローナル抗体はまた、Clackson et al. 1991 (Nature 352: 624-628)およびMarks et al. 1991 (J Mol Biol 222: 581-597)に記載されている技法を使用したファージ抗体ライブラリーを使用して作出することもできる。
これらの後者の技法は、とりわけ、ＵＳ５８３７５００、ＵＳ５５７１６９８、ＵＳ５２２３４０９、ＵＳ７１１８８７９、ＵＳ７２０８２９３およびＵＳ７４１３５３７に記載されているファージディスプレイ技術に基づくものである。簡単に述べると、治療薬候補分子、例えば、ヒト抗体断片（例えば、Ｆａｂ）、ペプチド、および低分子タンパク質をバクテリオファージ（またはファージ）と称される小さな細菌ウイルスの表面にディスプレイさせる。ディスプレイされた分子の収集物はライブラリーとして公知である。ファージディスプレイにより、これらのライブラリーを検索して、目的の標的、例えば、治療標的に、好ましくは高い特異性および／または親和性で結合する分子を同定することが可能になる。ファージ抗体ライブラリーの非限定的な例としては、ＨｕＣＡＬ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、Ｙｌａｎｔｈｉａ（登録商標）（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＷＯ２０００７００２３に記載のヒトＦａｂ断片ライブラリー、およびＷＯ１９９６０４０８７８に記載のマカク抗体ライブラリーが挙げられる。Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）は、ＷＯ１９９７０８３２０に記載されている通り、ヒトゲノムにおいてコードされる抗体の構造レパートリーを網羅する合成コンセンサス配列を使用して調製されたものである。
「抗体断片」または「抗原結合性部分」という用語は、全長抗体の一部分または領域、一般に、その抗原結合性または可変ドメインを含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびＶＨＨドメインなどの単一ドメイン（ｓｄ）Ｆｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、特に、重鎖抗体；ならびに抗体断片（複数可）から形成される多価および／または多重特異性抗体、例えば、ダイボディ（ｄｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、およびマルチボディ（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）が挙げられる。上記のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの名称は、それらの技術分野で確立された意味を有するものとする。
「抗原結合性部分」または「抗原結合性領域」という用語は、抗体の、抗原に特異的に結合する能力を保持する１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。これらはまた、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する二特異性、二重特異性、または多重特異性フォーマットであり得る。抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含される結合性断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨＩドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片で構成される二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨＩドメインで構成されるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ward et al., Nature, 341: 544-546(1989)；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０５１４４号）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子にコードされるが、これらを、組換え方法を使用し、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価の分子を形成した単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）として作出することを可能にする合成リンカーによって接合することができる（Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988)；およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci.、85: 5879-5883 (1988)）。そのような単鎖抗体も抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含されるものとする。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。
ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上に発現させるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用し、それにより、ドメインを別の鎖の相補的なドメインと対合させ、２つの抗原結合性部位を創出させた二価の二特異性抗体である（Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.、90: 6444-6448 (1993)；Poljak, et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)）。そのような抗体結合性部分は当技術分野で公知である（Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp.（ISBN 3-540-41354-5））。
さらに、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドの共有結合性または非共有結合性の結び付きによって形成される大きな免疫接着分子の一部であり得る。そのような免疫接着分子の例としては、ストレプトアビジンコア領域を使用して四量体ｓｃＦｖ分子を作出すること（Kipriyanov, S.M., et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6: 93-101 (1995)）、およびシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを使用して二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作出すること（Kipriyanov, et al., Mol. Immunol., 31: 1047-1058 (1994)）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、全抗体から、それぞれ全抗体のパパイン消化またはペプシン消化などの従来の技法を使用して調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、標準の組換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。
ある特定の実施形態では、抗体断片は、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であり得る。「Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）」および「Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」という用語は、Ａｂｌｙｎｘ ＮＶ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）の商標である。「ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）」という用語は当技術分野で周知であり、本明細書で使用される場合、その最も広範な意味で、（１）天然に存在する重鎖抗体、好ましくはラクダ科の動物に由来する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することによって；（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現させることによって；（３）天然に存在するＶＨＨドメインの「ヒト化」によって、もしくはそのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸を発現させることによって；（４）任意の動物種由来、特に、ヒト由来などの哺乳動物種由来の天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」によって、もしくはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させることによって；（５）当技術分野に記載されている「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」の「ラクダ化」によって、もしくはそのようなラクダ化ｄＡｂをコードする核酸を発現させることによって；（６）それ自体が公知のタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を調製するための合成または半合成技法を使用することによって；（７）それ自体が公知の核酸合成技法を使用してナノボディをコードする核酸を調製し、その後、そうして得られた核酸を発現させることによって；および／または（８）前述の１つまたは複数の任意の組合せによって得られる免疫学的結合性物質を包含する。「ラクダ科の動物」は、本明細書で使用される場合、旧世界のラクダ科の動物（フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）およびヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ））ならびに新世界のラクダ科の動物（例えば、アルパカ（Ｌａｍａ ｐａｃｃｏｓ）、リャマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）およびビクーニャ（Ｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ））を含む。
ナノボディのアミノ酸配列および構造は、これだけに限定することなく、当技術分野および本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」で構成され、フレームワーク領域は、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される３つの相補的決定領域または「ＣＤＲ」によって遮られていると考えることができる。ナノボディのアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０、好ましくは１１２〜１１５の領域内に入り得る。しかし、ナノボディの一部、断片、類似体または誘導体は、そのような一部、断片、類似体または誘導体が本明細書で概説した別の要件を満たし、好ましくは本明細書に記載の目的に適切なものである限りは、長さおよび／またはサイズに関しては特に限定されない。
重鎖抗体およびその可変ドメインに関する一般的な記載については、とりわけ、一般的な背景技術として言及される以下の参考文献を参照されたい：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９およびＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１およびＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６およびＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．および出願人のＷＯ０３／０５０５３１；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ＣａｎａｄａによるＷＯ０１／９０１９０；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１ ４３３ ７９３）；ならびに出願人によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１および出願人による別の公開特許出願；Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8；Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21;339 (3): 285-90；Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep;7 (9): 1129-3；Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May;13 (5): 475-9；Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. 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上記の参考文献において使用されている用語法に従って、天然に存在する重鎖抗体に存在する可変ドメインは、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と称される）と、および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と称される）と区別するために、「ＶＨＨドメイン」とも称される。上で参照した先行技術に関して言及されている通り、ＶＨＨドメインは、いくつもの独特の構造的特徴および機能的性質を有し、これらにより、単離されたＶＨＨドメイン（ならびに、これらの構造的特徴および機能的性質を天然に存在するＶＨＨドメインと共有する、ＶＨＨドメインに基づくナノボディ）およびそれを含有するタンパク質が、機能的な抗原結合性ドメインまたはタンパク質として使用するのに高度に有利なものになる。特に、これだけに限定することなく、ＶＨＨドメイン（元々軽鎖可変ドメインの存在を伴わず、かつ軽鎖可変ドメインとのいかなる相互作用も伴わずに抗原に機能的に結合するように「設計」されたもの）およびナノボディは、単一の比較的小さな機能的な抗原結合性構造単位、ドメインまたはタンパク質として機能し得る。これにより、ＶＨＨドメインが、一般にそれ自体では単一の抗原結合性タンパク質またはドメインとしての実用的な適用に適さず、いずれかの形態と組み合わせて機能的な抗原結合性単位をもたらす必要がある（例えば、Ｆａｂ断片などの従来の抗体断片の場合；ＳｃＦｖ断片はＶＨドメインと共有結合により連結したＶＬドメインとで構成される）従来の４本鎖抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと区別される。
ある特定の実施形態では、抗体断片は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であり得る。「ｄＡｂ」という用語に関しては、例えば、Ward et al. (Nature 1989 Oct. 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21 (11): 484-490；ならびに、例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ ＬｔｄのＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８および他の公開特許出願を参照されたい。単一ドメイン抗体または単一可変ドメインは、ある特定の種のサメに由来するものであり得る（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えばＷＯ０５／１８６２９を参照されたい）。
さらなる実施形態では、抗体または抗体断片は、それぞれが異なる抗原または抗原性決定因子を対象とする少なくとも２つ（例えば、２つ、３つなど）の結合性部位を含む多重特異性（例えば、二特異性、三特異性抗体など）であり得る。
一部の実施形態では、治療剤は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））であり得る。
抗体という用語は、任意の動物種、好ましくは、例えば、鳥類および哺乳動物を含めた脊椎動物種に由来する１つまたは複数の部分を起源とするかまたはそれを含む抗体を含む。これだけに限定することなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラまたはキジの抗体であり得る。また同じくこれだけに限定することなく、抗体は、ヒト、ネズミ科の動物（例えば、マウス、ラットなど）、ブタ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、サル（例えば、カニクイザル）、ラクダ重鎖抗体も含めたラクダ（例えば、フタコブラクダおよびヒトコブラクダ）、ラマ重鎖抗体も含めたラマ（例えば、アルパカ、リャマ、またはビクーニャ）、またはウマの抗体であり得る。
抗体という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの動物種を起源とする「キメラ抗体」も包含する。より詳細には、「キメラ抗体」または「キメラ抗体」という用語は、１つの種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種に由来する定常領域配列とを含む抗体、例えば、ネズミ科の動物の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と連結したヒト、非ヒト霊長類、イヌ科の動物、ウマ科の動物、またはネコ科の動物の定常領域を有する抗体などを指す。キメラ抗体は、一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体由来の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、鎖の残りは別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体に対応する配列と同一であるかまたは相同である重鎖および／または軽鎖、ならびに、所望の生物活性を示すそのような抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)を参照されたい）。キメラ抗体は、１つの種、例えばマウスまたはサル由来のモノクローナル抗体のＦｖ領域などの部分をコードするＤＮＡと、別の種、例えばヒト由来の抗体産生ＤＮＡを１つに合わせることによって作製される。
ある特定の実施形態では、治療剤は、「完全ヒト抗体」であり得る。本明細書で使用される場合、「完全ヒト抗体」という用語は、コード遺伝情報がヒト起源のものである抗体を指す。したがって、「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列のみに由来する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。したがって、「完全ヒト抗体」という用語は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むものではない。完全ヒト抗体は、上記のファージヒト抗体ライブラリーから引き出すこともでき、Lonberg and Husznar 1995（Int. Rev. Immunol. 13 (1): 65-93）に記載されている通り、ネズミ科の動物の免疫グロブリンコード領域が置き換わるように工学的に操作されたトランスジェニックマウスを免疫化することによって得ることもできる。ファージディスプレイを使用して作出される完全ヒト抗体は、ヒトグリコシル化パターンを有する抗体がもたらされるヒト細胞株における組換え発現によって産生させることが好ましい。完全ヒト抗体の非限定的な例は、ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）である。ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体を構築するための遺伝情報をＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体ライブラリー（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）から抽出し、ヒトＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞にベクターの形態で導入する（すなわち、トランスフェクション）。トランスフェクトされた細胞は遺伝情報をタンパク質に翻訳する。このタンパク質がグリコシル化によってさらに修飾され、得られた抗体分子は最終的に細胞により培養培地中に分泌される。
抗体という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性が増大するようにタンパク質配列が改変された、非ヒト種に由来する抗体である「ヒト化抗体」も包含する。より詳細には、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）に由来するが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部分がより「ヒト様」になるように、すなわち、ヒト生殖細胞系列可変配列とより類似するように変更された重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体を指す。ヒト化抗体の１つの型は、非ヒトＣＤＲ配列がヒトＶＨおよびＶＬ配列に導入されて対応するヒトＣＤＲ配列と置き換わったＣＤＲ移植抗体である。
ヒト化抗体は、目的の抗原に免疫特異的に結合する、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域および実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはその変異体、誘導体、類似体もしくは断片である。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）ＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である可変ドメインを実質的に全て、または少なくとも１つ、一般には２つ含む（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）。ヒト化抗体はまた、一般にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。ヒト化抗体は、軽鎖ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有し得る。ヒト化抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域も含み得る。あるいは、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみ、またはヒト化重鎖のみを含有し得る。例示的なヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび重鎖のヒト化可変ドメインを含有する。
また、例えば、ヒト化抗体は、可変ドメインがヒト抗体の可変ドメインに対して高度のアミノ酸配列同一性を示すラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）、特にラマ（例えば、アルパカ、リャマ、またはビクーニャ）由来の従来の抗体（すなわち、ジスルフィド結合によって相互接続した２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子）から引き出すこともできる。そのようなヒト化抗体を産生するための適切なプラットフォームは、ＷＯ２０１１０８０３５０に記載されているＳＩＭＰＬＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）プラットフォーム（ＡｒＧＥＮ−Ｘ）である。
抗体は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換（例えば、保存的置換）を、そのような変更がそれぞれの抗原との結合性を保存するものである限りは含んでよいことが当業者には理解されよう。例えば、米国特許第８，３２３，９６２号に記載されている通り、免疫原性を損なうことなくインビボ半減期を延長するために、抗体、具体的にはＦｃ領域に突然変異を導入することができる。
抗体はまた、その構成物であるアミノ酸残基のネイティブなまたは人工的な修飾（例えば、グリコシル化など）を１つまたは複数含み得る。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を作製する方法は、組換え抗体またはその断片を作製する方法と同様に当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988；Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447；"Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760；"Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229；Methods in Molecular Biology, vol. 248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照されたい）。
動物、例えば、実験動物または農場動物などの非ヒト動物を、提示担体と融合していてもよい、または共有結合により、もしくは非共有結合により連結、結合もしくは吸着していてもよい免疫化抗原を使用して免疫化するための方法、および、免疫血清からの抗体または細胞試薬の調製は、それ自体周知であり、本明細書の他の箇所で参照される文書に記載されている。免疫化される動物は、任意の動物種、好ましくは温血性種、より好ましくは、例えば鳥類および哺乳動物を含めた脊椎動物種を含み得る。これだけに限定することなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラまたはキジの抗体であり得る。また同じくこれだけに限定することなく、抗体は、ヒト、ネズミ科の動物（例えば、マウス、ラットなど）、ブタ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ、ラマまたはウマの抗体であり得る。「提示担体」または「担体」という用語は、一般には、第２の分子に結合すると、後者に対する免疫応答を、通常は追加的なＴ細胞エピトープを提供することを通じて強化する免疫原性分子を示す。提示担体は、とりわけ、例えばグリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模倣体、合成ポリマーなどの（ポリ）ペプチド構造または非ペプチド性構造であり得る。例示的な非限定的な担体としては、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、複数のＣ３ｄドメイン、破傷風毒素断片Ｃまたは酵母Ｔｙ粒子が挙げられる。免疫後、当技術分野で十分に公知の技法を使用して、動物から抗体産生細胞を単離し、それを使用してモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成することができる。
組換え抗体またはその断片を産生させるための方法には、宿主生物体または細胞が必要である。「宿主細胞」および「宿主生物体」という用語は、細菌などの原核生物と酵母、真菌、原生動物、植物および動物などの真核生物のどちらも包含する細胞または生物体を指し得ることが適切である。抗体を産生させるための宿主生物体または細胞として意図されているものとして、とりわけ、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの単細胞生物および（培養された）動物細胞（例えば、哺乳動物細胞またはヒト細胞）が挙げられる。細菌において抗体を産生させることの利点としては、他の利点の中でも、細菌細胞の取扱いが比較的安全かつ簡単であること、および微生物の複製サイクルが迅速であることが挙げられる。細菌は、構造が単純な抗体断片の産生に特に適している。全長免疫グロブリンに関してＷＯ２００９０２１５４８に記載されている通り、全長免疫グロブリンまたはより複雑な抗体断片を原核細胞において産生させるために、細菌細胞を、それぞれが抗体断片または免疫グロブリンの異なる部分、例えば、重鎖または軽鎖をコードする少なくとも２つの核酸で形質転換することができる。細菌細胞において、抗体をコードする遺伝情報が読み取られ、タンパク質に翻訳される。結果生じた抗体はペリプラズム空間に蓄積し、細菌細胞の溶解時に回収することができる。さらなる分離ステップを実施して抗体を精製することができる。ＷＯ２００９０２１５４８には、抗体をコードするコンストラクトへのシグナル配列の導入に起因して細菌が抗体を周囲の培養培地中に放出する、大腸菌に基づく分泌系が記載されている。これにより、細胞培養培地からの抗体の容易かつ都合のよい精製が可能になる。抗体の産生に使用することができる例示的な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。抗体の産生に適した例示的なヒト細胞株としては、ＥＣＡＣ番号９６０２２９４０の下で寄託されており、ＷＯ２００００６３４０３に記載されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株またはその誘導体が挙げられる。ヒト細胞株は、ヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生するので、完全ヒト抗体の産生に特に適している。
別段の指定のない限り、具体的に詳細が記載されていない方法、ステップ、技法および操作は全て、当業者には明らかになる通り、それ自体が公知の様式で実施することができ、また、実施されたものである。例えば、標準のハンドブックならびに本明細書で言及される一般的な背景技術およびさらにそこで引用されている参考文献を再度参照されたい。
Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する能力とは、ＦＺＤおよびＬＲＰへの、例えば、ＦＺＤ／ＬＲＰ複合体などへの天然のＷｎｔリガンド結合シグナルトランスダクション効果および／または活性を模倣する、再現する、または近似する本明細書に開示される作用物質の能力を指す。
Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、当技術分野で公知の通り、１つまたは複数のＷｎｔ標的遺伝子の発現、ＴＣＦレポーター遺伝子発現、ベータカテニン安定化、ＬＲＰリン酸化、および／またはアキシンの細胞質から細胞膜への移行を測定することによって適切に決定し、かつ／または定量化することができる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、Ｗｎｔシグナル伝達の一次アウトプットであるＴＣＦ遺伝子の発現を測定することによって（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは任意の他の転写物検出方法によって）適切に決定し、かつ／または定量化することができる（Nature, 1997, vol. 385 (6619), 829-33）。例えば、ＴＣＦレポーターアッセイ（ＴＯＰ／ＦＯＰまたはＴＯＰｆｌａｓｈとしても公知）を使用して、ＴＣＦ／ＬＥＦに制御される遺伝子の転写の変化を評価することができる。ＴＣＦレポーターアッセイは、ルシフェラーゼレポーターアッセイであってよい。さらに、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、ｃ−ｍｙｃ（He et al., 1998, Science, 281 (5382), 1509-12）、ｎ−ｍｙｃ（Ten Berge et al., 2008, Development, 135 (19), 3247-57）、ＬＥＦ１（Hovanes et al., 2001, Nat Genet, 28 (1), 53-7；Filali et al., 2002, J Biol Chem, 277 (36), 33398-410）、またはｃ−ｊｕｎ（Mann et al., 1999, Proc Natl Acad Sci U S A, 96 (4), 1603-8）の発現を測定することによって適切に決定し、かつ／または定量化することができる。
あるいは、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、β−カテニンの位置、レベルおよび／またはリン酸化の状態を測定することによって決定することができる。そのようなアッセイの非限定的な例は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＣ末端と融合したヒトβ−カテニンを安定に発現する組換えＵ２０Ｓ細胞を準備する「β−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。このアッセイにより、ＧＦＰ−β−カテニン融合タンパク質の膜から核への移行を可視化し、モニタリングすることが可能になる。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を決定する別のやり方は、例えばＧＦＰ−アキシン融合タンパク質を用い、アキシンの移行を可視化することである。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、作用物質により、例えば本明細書の他の箇所に記載のアッセイで測定して、中性物質または陰性対照によって誘導されるベースラインまたはバックグラウンドのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達と比較して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも７５０倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１×１０４倍、または少なくとも１×１０５倍に増強される場合、（標準的）Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができるとみなすことができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、作用物質により、例えば本明細書の他の箇所に記載のアッセイで測定して、中性物質または陰性対照によって誘導されるベースラインまたはバックグラウンドのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達と比較して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、１０倍未満、例えば、特に最大で５倍もしくは最大で２．５倍に増強される場合、または作用物質によりＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が増強されないまたはさらには低減する（例えば、２分の１または５分の１または１０分の１）場合、（標準的）Ｗｎｔシグナル伝達を活性化しないとみなすことができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、前記作用物質によって誘導されるＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性が、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下で前記作用物質によって誘導されるＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性の少なくとも３．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１×１０４倍、または少なくとも１×１０５倍、好ましくは少なくとも５０倍である場合、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔは活性化しないとみなすことができる。ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性（本段落では「活性１」と示される）とＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性（本段落では「活性２」と示される）を比較する前に、作用物質によって誘導される活性１および活性２を野生型Ｗｎｔ７ａによって誘導される活性１および活性２に対して、それぞれ、後者を例えば１００％の活性を表すものと設定して、正規化することができる。
一例として、１）ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、ＦＺおよびＬＲＰを発現する細胞、ならびに別に２）ＦＺおよびＬＲＰを発現するがＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫは発現しない細胞を含み、１）および２）の細胞が他の点では実質的に同一である、インビトロまたはインビボ細胞アッセイ系では、作用物質を、同じ数量の前記作用物質により実質的に同一の条件で誘導されるＷｎｔシグナル伝達活性が、１）の細胞において２）の細胞の少なくとも３．５倍、５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１×１０４倍、または少なくとも１×１０５倍である場合、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するがＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないとみなすことができる。例えば、１）および２）の細胞は、同じ初代細胞供給源に由来するものであってよい、または同じ細胞株のものであってよく、また、ＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫの発現が異なるように遺伝子操作されたものであってよい。
Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化は、細胞膜におけるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドの密接な結び付きまたは相互近接を促進し、それにより、ＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドで構成される膜結合型ヘテロ−オリゴマーを形成することによって生じさせることができる。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ＬＲＰヘテロ−オリゴマーがリガンド駆動的に形成されると、ＬＲＰポリペプチドの細胞内部分が、例えばＣＫ１およびＧＳＫ−３によるリン酸化に利用可能になり、それにより、ＬＲＰポリペプチドのアキシンに対する親和性が著しく増大する。第２に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドの細胞内部分は、ＬＲＰポリペプチドとのヘテロ−オリゴマー内に存在する場合、ＤＶＬのリン酸化および動員を誘導することができる。結果生じる活性化されたＬＲＰ−ＦＺＤ−ＤＶＬ−アキシン複合体のアセンブリーにより、ベータカテニンの破壊複合体の解離が間接的に導かれ、それにより、ベータカテニンが細胞質に蓄積し、細胞核に移行することが可能になり、そこでベータカテニンは遺伝子転写を誘導し得る。
したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では細胞膜におけるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのヘテロマー形成（例えば、ヘテロ二量体形成が好ましい）を誘導することができるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下ではそれを誘導することができない。
細胞膜におけるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのヘテロマー形成または密接な結び付きを実現するために、ＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドの両方に、例えば、ＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドの両方の細胞外部分に結合することによって同時に結合することができる作用物質を使用することができる。
細胞膜におけるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのヘテロマー形成は、蛍光標識された膜タンパク質のヘテロマー形成を免疫蛍光染色、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって可視化すること、またはＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのヘテロマー形成の下流の事象の発生を決定すること、例えば、Ｄｖｌの存在およびリン酸化を検出することなどの、膜タンパク質のヘテロマー形成を決定するための当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では細胞膜においてＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドに同時に結合することができるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下ではそれができない。
「結合する」、「相互作用する」、「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」という用語は、本明細書全体を通して使用される場合、作用物質が、ランダムまたは無関係である他の分子を実質的に除いて、および、適宜、構造的に関連する他の分子を実質的に除いて、１つまたは複数の所望の分子または分析物に結合するまたは影響を及ぼすことを意味する。これらの用語は、必ずしも作用物質がその意図された標的（複数可）に排他的に結合することを要求するものではない。例えば、作用物質は、結合の条件下での目的の標的（複数可）に対する親和性が、非標的分子に対する親和性の少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、さらにより好ましくは少なくとも約２５倍、さらに好ましくは少なくとも約５０倍、およびなおより好ましくは少なくとも約１００倍以上、例えば、少なくとも約１０００倍以上、少なくとも約１×１０４倍以上、または少なくとも約１×１０５倍以上などである場合、そのような意図された標的（複数可）に特異的に結合すると言うことができる。
作用物質とその意図された標的（複数可）の間の結合または相互作用は、共有結合性（すなわち、原子間の電子対の共有を伴う１つまたは複数の化学結合によって媒介される）、またはより一般には非共有結合性（すなわち、例えば水素架橋、双極性相互作用、ファンデルワールス相互作用などの非共有結合性力によって媒介される）であり得る。作用物質は、その意図された標的（複数可）と、結合ＫＡ≧１×１０６Ｍ−１、より好ましくはＫＡ≧１×１０７Ｍ−１、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０８Ｍ−１、なおより好ましくはＫＡ≧１×１０９Ｍ−１、およびさらに好ましくはＫＡ≧１×１０１０Ｍ−１またはＫＡ≧１×１０１１Ｍ−１、などの親和定数（ＫＡ）で結合または相互作用し得ることが好ましく、ここで、ＫＡ＝［Ａ＿Ｔ］／［Ａ］［Ｔ］であり、Ａは作用物質を示し、Ｔは意図された標的を示す。ＫＡの決定は、例えば、平衡透析およびスキャッチャードプロット解析の使用などの、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。
本明細書に記載の作用物質の標的への結合ならびに前記結合の親和性および特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。それらの非限定的な例としては、免疫共沈降、二分子蛍光補完法、アフィニティー電気泳動、標識移行、ファージディスプレイ、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）、予測されるギブズ結合エネルギーのインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）でのドッキングおよび算出、ならびに競合結合アッセイが挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、１つまたは複数の異なるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチド、例えば、Ｆｚｄ １、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、およびＦｚｄ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドなどに結合することができる。本明細書に開示される作用物質は、少なくともＦｚｄ４に特異的に結合することができ、１つまたは複数の他のＦｚｄに結合することができてもよい；または、他のＦｚｄを実質的に除いてＦｚｄ４に特異的に結合することができることが好ましい。Ｆｚｄ４は、中枢神経系の内皮細胞における優性のＦｚｄファミリーメンバーであると考えられている。本明細書に開示される作用物質は、ヒトＦｚｄ４に特異的に結合することができることがより好ましい。本明細書に開示される作用物質は、１つまたは複数の好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドに対して選択的、例えば、１つまたは複数の好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドに対して、他の好ましいものではないＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドと比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１×１０４倍、または少なくとも１×１０５倍の特異性を有し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、Ｗｎｔシグナル伝達に関与する１つまたは複数の異なるＬＲＰポリペプチドに結合することができる。本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６、例えば、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６のいずれか一方またはそれぞれに結合することができることが好ましい。本明細書に開示される作用物質は、ヒトＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６、例えば、ヒトＬＲＰ５およびヒトＬＲＰ６のいずれか一方またはそれぞれに結合することができることがより好ましい。本明細書に開示される作用物質は、１つまたは複数の好ましいＬＲＰポリペプチドに対して選択的、例えば、１つまたは複数の好ましいＬＲＰポリペプチドに対して、他の好ましいものではないＬＲＰポリペプチドと比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１×１０４倍、または少なくとも１×１０５倍の特異性を有し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰポリペプチド、ならびにそれらに加えてＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫポリペプチドに同時に結合することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチ、ＬＲＰポリペプチおよびＲＥＣＫポリペプチドに同時に結合することができる。
ＲＥＣＫは、５つのＮ末端システインノット（ＣＫ）モチーフまたは領域（すなわち、ＣＫ１、ＣＫ２、ＣＫ３、ＣＫ４およびＣＫ５）、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）ならびにグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー部位の前の３つのカザールモチーフで構成される。ＣＫモチーフ、ＣＲＤおよびカザールモチーフは細胞外に位置する。したがって、本明細書に開示されるＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる作用物質は、ＲＥＣＫポリペプチドのＣＫ１モチーフ、ＣＫ２モチーフ、ＣＫ３モチーフ、ＣＫ４モチーフ、ＣＫ５モチーフ、ＣＲＤ、および／またはカザールモチーフの１つまたは複数に結合し得る。
本発明者らは、特に、本明細書に開示されるＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる作用物質の、ＲＥＣＫポリペプチドのＣＫ４および／またはＣＫ５領域への結合が、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達の活性化を確立するために重要であると思われることを見出した。
したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＲＥＣＫポリペプチドのＣＫ４および／またはＣＫ５領域に結合することができるものである。
本明細書の他の箇所で開示されているＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６６９３４．１の下に注釈が付けられているヒトＲＥＣＫタンパク質のアミノ酸配列に関して、ＣＫ４モチーフはアミノ酸Ｃ２１６〜Ｃ２６３にわたり、ＣＫ５モチーフはアミノ酸Ｃ２９２〜Ｃ３３８にわたる。したがって、ヒトＲＥＣＫのＣＫ４モチーフは、アミノ酸配列ＣＣＤＲＡＥＤＨＡＣＱＮＡＣＫＲＩＬＭＳＫＫＴＥＭＥＩＶＤＧＬＩＥＧＣＫＴＱＰＬＰＱＤＰＬＷＱＣ（配列番号５）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、ヒトＲＥＣＫのＣＫ５モチーフは、アミノ酸配列ＣＣＳＫＡＮＴＳＴＣＲＥＬＣＴＫＬＹＳＭＳＷＧＮＴＱＳＷＱＥＦＤＲＦＣＥＹＮＰＶＥＶＳＭＬＴＣ（配列番号６）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、配列番号５のアミノ酸配列および／または配列番号６のアミノ酸配列に結合することができる。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質であり、長さ約５００〜約７００アミノ酸にわたる。Ｎ末端は、細胞外にあり、およそ１２０アミノ酸のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、その後におよそ４０〜１００アミノ酸の親水性リンカー領域を含むことが予測される。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体はまた、膜貫通アルファヘリックスを形成することが予測される７つの疎水性ドメインも含む。細胞内Ｃ末端ドメインは種々の長さを有し、細胞内ドメインは異なるファミリーメンバーの間で全体的には十分には保存されていないが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドにおいて高度に保存されており、標準的Ｗｎｔシグナル伝達に必要とされる近位のＫＴＸＸＸＷアミノ酸モチーフ（配列番号７）を有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ＣＲＤドメインは、１０個の一定の間隔があいたシステインのモチーフを含み、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーメンバー間で広く保存されているだけでなく、ＲＥＣＫ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、およびコラーゲンα１ＸＶＩＩＩなどのいくつかの他のタンパク質においても保存されている。ＣＲＤドメインは、例えばリガンド接触部位１に存在するシス−不飽和脂肪酸アシル基またはＷｎｔリガンド「インデックス」接触部位２に位置する残基の認識および／またはそれへの結合によるリガンド（例えば、Ｗｎｔ）のＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドへの結合のために重要である。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドのＣＲＤドメイン内に位置するシス−不飽和脂肪酸アシル基結合性ドメインまたはＣＲＤ内の「インデックス」接触部位に結合することができる。
ＬＲＰのＮ末端細胞外ドメインは、４つのＹＷＴＤ（配列番号８）リピートドメイン（またはベータ−プロペラドメイン）、４つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインおよびＬＤＬＲ様ドメイン（ＬＤＬＲＬＤ）で構成される。単一のＹＷＴＤリピートドメインは、６つのタンデムなＹＷＴＤ配列を含む。第１の２つの最Ｎ末端ＹＷＰＤリピートドメインがＷｎｔリガンドに結合することが予測され、第２の２セットのＹＷＰＤリピートドメインがディックコプフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）（ＤＫＫ）に結合することが予測される。Ｎ末端細胞外ドメインの後に単一の膜貫通セグメントおよび１つから３つの間のＮＰＸＹモチーフ（配列番号９）（配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）（例えば、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、ＬＲＰ４、ＡＰＯＥＲ２、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ９）、または１つからおよび５つの間のＰＰＰＳＰモチーフ（配列番号１０）（例えば、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６において）を有する細胞質尾部が続く。
「ディックコプフ」または「ＤＫＫ」という用語は、これだけに限定することなく、ＤＫＫ１（ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０３６３７４．１；Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９４３）、ＤＫＫ２（ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０５５２３６．１；Ｇｅｎｅ ＩＤ：２７１２３）、ＤＫＫ３（ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００１３１７１４９．１；Ｇｅｎｅ ＩＤ：２７１２２）、およびＤＫＫ４（ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０５５２３５．１；Ｇｅｎｅ ＩＤ：２７１２１）を含めた公知のヒトＤＫＫタンパク質などの、ＤＫＫファミリーのありとあらゆるメンバーを包含する。ある特定の実施形態では、これらの用語は、特にＤＫＫ１を示し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰポリペプチドの細胞外ドメインに結合することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰポリペプチドのＤＫＫ結合性部位に結合することができる。より詳細な実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６ポリペプチドのＤＫＫ１結合性部位に結合することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰポリペプチドのＷｎｔ結合性部位に結合することができる。より詳細な実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６ポリペプチドのＷｎｔ結合性部位に結合することができる。
別の特定の実施形態では、本明細書に開示される作用物質は、ＬＲＰポリペプチドのＤＫＫ結合性部位およびＷｎｔ結合性部位に結合することができる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、ＬＲＰポリペプチドのβ−プロペラ−ＥＧＦ様ドメイン１および２（Ｐ１Ｅ１Ｐ２Ｅ２）および／またはβ−プロペラ−ＥＧＦ様ドメイン３および４（Ｐ３Ｅ３Ｐ４Ｅ４）に結合することが可能である。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、ＲＥＣＫ結合性ドメインおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメイン、ならびにＬＲＰ結合性ドメインを含んでもよい。より特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメイン、およびＬＲＰ結合性ドメインを含む。
本明細書で開示される作用物質のＲＥＣＫ結合性ドメインは、高親和性でＲＥＣＫポリペプチドに結合することが可能な、例えば、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）でＲＥＣＫポリペプチドに結合することが可能な任意のドメインであり得る。例えば、少なくとも約５×１０−６ＭのＫＤ。
特定の実施形態において、前記ＲＥＣＫ結合性ドメインは、ＲＥＣＫ特異的な抗体を含むか、またはＲＥＣＫ結合性領域、好ましくは１つまたは複数のＲＥＣＫ特異的な抗体または複数の抗体の可変領域配列またはＣＤＲを含む。好ましくは、ＲＥＣＫ特異的な抗体は、ＲＥＣＫポリペプチドの細胞外部分に向けられ、例えば、ＲＥＣＫポリペプチドのＣＫ４および／またはＣＫ５領域に向けられる。ＲＥＣＫ抗体の非限定的な例としては、当業界において公知であり、例えば、Ａｂｃａｍ（例えば、ヒト全長ＲＥＣＫに特異的なａｂ８８２４９およびａｂ８９９１５）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（例えば、ヒト、マウス、ラット、サルＲＥＣＫに特異的な＃３４３３（Ｄ８Ｃ７））、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（例えば、ヒトＲＥＣＫのＣ末端に特異的なｓｃ−３７３９２９）から商業的に入手可能な抗体が挙げられる。
特定の実施形態において、ＲＥＣＫ結合性ドメインは、それぞれ独立して、ＲＥＣＫ特異的な抗体のそれぞれのＣＤＲと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６つのＣＤＲを含む。
特定の実施形態において、ＲＥＣＫ結合性ドメインは、ＲＥＣＫ特異的なｓｃＦｖ、例えば、ＲＥＣＫ特異的な抗体の１つまたは複数の（好ましくは６つ全ての）ＣＤＲを含むｓｃＦｖである。
特定の実施形態において、ＲＥＣＫ結合性ドメインは、ＲＥＣＫ特異的なＶＨＨ、例えばＲＥＣＫ特異的な重鎖抗体の１つまたは複数の（好ましくは３つ全ての）ＣＤＲを含むＶＨＨである。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質のＲＥＣＫ結合性ドメインは、それぞれ独立して、２つまたはそれより多くの異なるＲＥＣＫ特異的な抗体のそれぞれのＣＤＲと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する２つまたはそれより多くのＣＤＲを含んでいてもよい。
特定の実施形態において、前記本明細書で開示される作用物質のＲＥＣＫ結合性ドメインは、ＲＥＣＫ結合性ポリペプチド、例えばＷｎｔリガンドまたはＷｎｔポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、それからなるか、またはそれに由来するものである（例えば、その生物学的に活性な断片および／または変異体である）。ＲＥＣＫ結合性ドメインは、好ましくは、本明細書の他所で記載されるＷｎｔ７ポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂ）に由来し、より好ましくは、ヒトまたはマウスＷｎｔ７ポリペプチドに由来し、さらにより好ましくは、ヒトＷｎｔ７ポリペプチド（例えば、ヒトＷｎｔ７ａまたはヒトＷｎｔ７ｂ）に由来するものである。例えば、ある特定の実施形態において、ＲＥＣＫ結合性ドメインは、Ｗｎｔ７（例えば、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂ）のＲＥＣＫ結合性断片、好ましくはヒトもしくはマウスＷｎｔ７のＲＥＣＫ結合性断片、より好ましくはヒトＷｎｔ７（例えば、ヒトＷｎｔ７ａまたはヒトＷｎｔ７ｂ）のＲＥＣＫ結合性断片またはそれらの変異体を含んでもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。さらなる例において、ある特定の実施形態において、ＲＥＣＫ結合性ドメインは、アミノ酸配列ＶＥＰＶＲＡＳＲＮＫＲＰＴＦＬＫＩＫＫＰＬＳＹＲＫＰＭＤＴ（配列番号１８）またはＶＥＶＶＲＡＳＲＬＲＱＰＴＦＬＲＩＫＱＬＲＳＹＱＫＰＭＥＴ（配列番号１９）に対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。
用語「Ｗｎｔ」、「Ｗｎｔリガンド」または「Ｗｎｔポリペプチド」は、Ｗｎｔファミリーのありとあらゆるメンバーを包含する。追加の指針によって、表２は、ＮＣＢＩ ＧｅｎｂａｎｋおよびＵｎｉｐｒｏｔで注釈が付けられた１９種の公知のヒトＷｎｔファミリーメンバーを提示する。
Figure 2021518151
ある特定の実施形態において、本明細書において採用されるＷｎｔポリペプチドは、動物起源であり、好ましくは温血動物起源であり、より好ましくは脊椎動物起源であり、さらにより好ましくは哺乳類起源であり、例えばヒト起源および非ヒト哺乳類起源であり、さらにより好ましくはヒト起源である。
本明細書で開示される作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、１つまたは複数のＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドに結合することが可能な任意のドメインであり得る。いかなるメカニズムまたは理論にも限定されないが、作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインの親和性は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するのに十分な程度に高く（すなわち、ＤＶＬネットワークを介した、作用物質のＲＥＣＫへの結合、ＲＥＣＫのＧＰＲ１２４への結合、およびＧＰＲ１２４のＦｒｉｚｚｌｅｄへの結合が、作用物質の、より特定にはそのＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインのＦｒｉｚｚｌｅｄへの近接または提示を確実にする場合）、ただしＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を回避するのに十分な程度に低くてもよい（例えば、活性化の喪失、またはあったとしても最小の活性化、例えば、生理学的に取るに足らない度合または程度の活性化）。ある特定の実施形態において、限定されないが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−８Ｍより低い、または約１×１０−７Ｍより低い、または約１×１０−６Ｍより低いＫＤで、例えば、約１×１０−６Ｍから約１×１０−７Ｍの間、または約１×１０−６Ｍから約５×１０−６Ｍの間のＫＤで、１つまたは複数のＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドに結合することが可能であり得る。
特定の実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体を含むか、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性領域、好ましくは、１つまたは複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体または抗体の可変領域配列またはＣＤＲを含む。好ましくは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外部分に向けられ、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のＣＲＤに向けられる。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体の非限定的な例としては、当業界において公知であり、商業的に入手可能な抗体、例えば、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手可能な抗体（例えば、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ４に特異的なクローンＣＨ３Ａ４ａ７、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ９に特異的なクローンＷ３Ｃ４Ｅ１１）、およびＡｂｃａｍより入手可能な抗体（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７に特異的なａｂ６４６３６、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ４に特異的なａｂ８３０４２、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ７に特異的なａｂ７７３７９、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ８に特異的なａｂ７５２３５、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ９に特異的なａｂ１０２９５６）が挙げられる。例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、汎特異的ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ））の６つのＣＤＲ領域を含んでいてもよい。
特定の実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、それぞれ独立して、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体のそれぞれのＣＤＲと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６つのＣＤＲを含む。
特定の実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的なｓｃＦｖ、例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体の１つまたは複数の（好ましくは６つ全ての）ＣＤＲを含むｓｃＦｖである。
特定の実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的なＶＨＨ、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ特異的な重鎖抗体の１つまたは複数の（好ましくは３つ全ての）ＣＤＲを含むＶＨＨである。
特定の実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、それぞれ独立して、２つまたはそれより多くの異なるＦｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体のそれぞれのＣＤＲと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する２つまたはそれより多くのＣＤＲを含んでいてもよい。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ポリペプチド、例えばＷｎｔリガンドまたはＷｎｔポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、それからなるか、またはそれに由来するものである（例えば、その生物学的に活性な断片および／または変異体である）。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、好ましくは、本明細書の他所で記載されるＷｎｔ７ポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂ）に由来し、より好ましくは、ヒトＷｎｔ７ポリペプチド（例えば、ヒトＷｎｔ７ａまたはヒトＷｎｔ７ｂ）に由来するものである。
ＷｎｔポリペプチドのＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性領域は、アフリカツメガエルＷｎｔ８ａの結晶解析に基づき、Ｗｎｔポリペプチドの３次元構造をモデル化することによって決定することができる（C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64 (2012)）。
ＸＷｎｔ８は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄを２つの不連続な部位に結合させることが示された。その１つは、サム（ｔｈｕｍｂ）（部位１）と呼ばれ、他方はインデックス（ｉｎｄｅｘ）（部位２）と呼ばれる。ＸＷｎｔ８サムの重要な残基は、Ｋ１８２、Ｉ１８６、Ｓ１８７、Ｇ１８８およびＷ１９６であると考えられる。Ｓ１８７は、部位１での結合にとって重要なパルミトレイン酸を有する。部位２の接触は、Ｆ３１７、Ｗ３１９、Ｃ３２１、Ｔ３２２およびＶ３２３によって支配されているようである。加えて、ＸＷｎｔ８は、より高次のＷｎｔ／Ｆｚ多量体を形成できるが、偽性部位３は、Ｐ３４、Ｙ３７、Ｌ３８、Ｓ４１、Ａ４２、Ａ４５、Ｖ４６、Ｔ７０、Ｌ７１、Ａ７４、Ｆ１４７、Ｇ１５０、Ｌ１５１およびＴ１５３で構成される。部位１における重要なアミノ酸残基（特に、Ｋ１８２、Ｓ１８７、Ｇ１８８およびＷ１９６）および部位２における重要なアミノ酸残基（特に、Ｗ３１９、Ｃ３２１およびＶ３２３）は、異なるＷｎｔポリペプチド間で高度に保存されているが、偽性部位３の残基は、それより多様であると考えられる。その観点から、当業者は、ＷｎｔポリペプチドのＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性領域は、ＸＷｎｔ８との配列アライメントを使用して決定できることを理解するものと予想される。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、Ｗｎｔリガンドの「サム」（部位１）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、好ましくは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、アミノ酸配列ＸＫＸＸＸＸＳＧＸＸＸＸＸＸＸＷ（配列番号１１）を含み（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）、好ましくは、前記アミノ酸配列は、ＣＫＣＨＧＶＳＧＳＣＴＴＫＴＣＷ（配列番号１２）に対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を示す。
好ましい実施形態において、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸７位におけるセリンは、脂肪酸残基に連結されており、好ましくは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸７位における前記セリンは、パルミトイル化されている。
好ましい実施形態において、本明細書で開示される作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、Ｗｎｔリガンドの「インデックス」（部位２）を含まない。より特定には、本明細書で開示される作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインは、好ましくは、アミノ酸配列ＷＸＣＸＶ（配列番号１３）を含まない（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）。
本明細書で開示される作用物質のＬＲＰ結合性ドメインは、１つまたは複数のＬＲＰポリペプチドに結合することが可能な任意のドメインであり得る。いかなるメカニズムまたは理論にも限定されないが、作用物質のＬＲＰ結合性ドメインの親和性は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するのに十分な程度に高く（すなわち、ＤＶＬネットワークを介した、作用物質のＲＥＣＫへの結合、ＲＥＣＫのＧＰＲ１２４への結合、およびＧＰＲ１２４のＦｒｉｚｚｌｅｄへの結合が、作用物質の、より特定にはそのＬＲＰ結合性ドメインのＬＲＰへの近接または提示を確実にする場合）、ただしＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を回避するのに十分な程度に低くてもよい（例えば、活性化の喪失、またはあったとしても最小の活性化、例えば、生理学的に取るに足らない度合または程度の活性化）。限定されないが、ある特定の実施形態において、ＬＲＰ結合性ドメインは、約１×１０−９Ｍより低い、または約１×１０−８Ｍより低い、または約１×１０−７Ｍより低いＫＤで、例えば、約１×１０−３Ｍから約１×１０−９Ｍの間、または約１×１０−３Ｍから約１×１０−８Ｍの間、または約１×１０−３Ｍから約１×１０−７Ｍの間のＫＤで、１つまたは複数のＬＲＰポリペプチドに結合することが可能であり得る。
特定の実施形態において、前記ＬＲＰ結合性ドメインは、ＬＲＰ特異的な抗体またはＬＲＰ結合性領域、好ましくは、１つまたは複数のＬＲＰ特異的な抗体または抗体の可変領域配列またはＣＤＲを含む。好ましくは、ＬＲＰ特異的な抗体は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６特異的な抗体である。好ましくは、ＬＲＰ特異的な抗体は、ＬＲＰポリペプチドの細胞外部分に向けられ、例えば、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６のＤＫＫ結合性ドメインに向けられる。ＬＲＰ５特異的な抗体の非限定的な例としては、当業界において公知であり、商業的に入手可能な、例えば、Ａｂｃａｍ（例えば、ウサギおよびヒトＬＲＰ５に特異的なａｂ３６１２１）、またはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ（例えば、ヒトＬＲＰ５に特異的なｓｃ−２１３９０）から入手可能な抗体が挙げられる。ＬＲＰ６特異的な抗体の非限定的な例としては、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体（例えば、マウス、ラットおよびヒトＬＲＰ６に特異的なａｂ１３４１４６）、またはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ（例えば、ヒトＬＲＰ６に特異的なｓｃ−２５３１７）が挙げられる。
特定の実施形態において、ＬＲＰ結合性ドメインは、それぞれ独立して、ＬＲＰ特異的な抗体、好ましくはＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的な抗体のそれぞれのＣＤＲと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６つのＣＤＲを含む。
特定の実施形態において、ＬＲＰ結合性ドメインは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的なｓｃＦｖ、例えば、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的な抗体の１つまたは複数の（好ましくは６つ全ての）ＣＤＲを含むｓｃＦｖである。
特定の実施形態において、ＬＲＰ結合性ドメインは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的なＶＨＨ、例えば、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的な重鎖抗体の１つまたは複数の（好ましくは３つ全ての）ＣＤＲを含むＶＨＨである。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質のＬＲＰ結合性ドメインは、それぞれ独立して、２つまたはそれより多くの異なるＬＲＰ特異的な抗体、好ましくはＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的な抗体のそれぞれのＣＤＲと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する２つまたはそれより多くのＣＤＲを含んでいてもよい。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質の前記ＬＲＰ結合性ドメインは、ＬＲＰ結合性ポリペプチド、例えば、ＷｎｔリガンドもしくはＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂ）、ＤＫＫポリペプチド（例えばＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、またはＤＫＫ４）、スクレロスチン（またはＳＯＳＴ）、もしくはＷｉｓｅ（またはＳＯＳＴＤＣ１）、またはそれらの変異体を含むか、それから本質的になるか、それからなるか、またはそれに由来するものである（例えば、その生物学的に活性な断片および／または変異体である）。
例を挙げれば、ヒトＳＯＳＴ遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）Ｇｅｎｅ ＩＤ５０９６４の下に注釈が付けられている。ヒトＳＯＳＴ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２５２３７．２の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿０２５２３７．２のヌクレオチド４８（開始コドン）から６８９（終止コドン）は、ＳＯＳＴコード配列を構成する。ヒトＳＯＳＴタンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７９５１３．１の下に注釈が付けられ、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＢＱＢ４．１の下に注釈が付けられている。
例を挙げれば、ヒトＷＩＳＥ（またはスクレロスチンドメイン含有１（ＳＯＳＴＤＣ１））遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）Ｇｅｎｅ ＩＤ２５９２８の下に注釈が付けられている。ヒトＷＩＳＥ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１５４６４．２の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿０１５４６４．２のヌクレオチド１８２（開始コドン）から８０２（終止コドン）は、ＷＩＳＥコード配列を構成する。ヒトＷＩＳＥタンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５６２７９．１の下に注釈が付けられ、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ６Ｘ４Ｕ４．２の下に注釈が付けられている。
本明細書で開示される作用物質のＬＲＰ結合性ドメインは、好ましくは、Ｗｎｔ７（例えば、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂ）ポリペプチドに由来し、より好ましくは、ヒトＷｎｔ７ポリペプチド（例えば、ヒトＷｎｔ７ａまたはヒトＷｎｔ７ｂ）またはそれらの変異体に由来するものである。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質の前記ＬＲＰ結合性ドメインは、ＤＫＫポリペプチド、好ましくはＤＫＫ１ポリペプチド、またはＷｎｔポリペプチド、好ましくはＷｎｔ７ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、それからなるか、またはそれに由来するものである。好ましい実施形態において、本明細書で開示される作用物質の前記ＬＲＰ結合性ドメインは、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来するものである。
Ａｈｎ Ｖ．Ｅ．ら（Ahn V.E. et al., Dev Cell. 2011 Nov 15 ;21(5):862-873）は、ＤＫＫ１のＣ末端領域がＬＲＰ６への結合に関与することを開示している。したがって、特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質の前記ＬＲＰ結合性ドメインは、ＤＫＫ１のＣ末端ドメインを含むか、それから本質的になるか、それからなるか、またはそれに由来するものである。例えば、ヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメイン（ヒトＤＫＫ１は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７４．１の下に注釈が付けられ、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｏ９４９０７．１の下に注釈が付けられている）は、アミノ酸配列ＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号１４）を含む。
一方で、Ｂｏｕｒｈｉｓ Ｅ．ら（Bourhis, Eric et al., Structure, Volume 19, Issue 10, 1433-1442）は、ＤＫＫ１のＮ末端だけでなく、ＤＫＫ２、ＤＫＫ４、ＷＩＳＥ、およびＳＯＳＴにおいても、ＬＲＰ５／６相互作用モチーフＮＸＩ／Ｖ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）を同定した。その観点から、ＬＲＰ結合性ドメインは、ＮＸＩまたはＮＸＶを含んでいてもよい（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）。
いかなるメカニズムまたは理論にも限定されないが、作用物質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインの親和性は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を集合的に活性化するのに十分な程度に高く（すなわち、ＤＶＬネットワークを介した、作用物質のＲＥＣＫへの結合、ＲＥＣＫのＧＰＲ１２４への結合、およびＧＰＲ１２４のＦｒｉｚｚｌｅｄへの結合が、作用物質の、より特定にはそのＬＲＰ結合性ドメインのＬＲＰへの近接または提示を確実にする場合）、ただしＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を回避するのに集合的に十分な程度に低くてもよい（例えば、活性化の喪失、またはあったとしても最小の活性化、例えば、生理学的に取るに足らない度合または程度の活性化）。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、タンパク質コンジュゲートである。
用語「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」および「タンパク質コンジュゲート」または「ポリペプチドコンジュゲート」は、通常天然に見出されない方式で連結された、接続された、または一体化した少なくとも２つのタンパク質またはポリペプチドを含むハイブリッドまたはキメラ分子を意味する。このような分子は、好適には、アミノ酸ベースの化合物であること、すなわち、主として、必ずしもそうとは限らないが専らアミノ酸残基を含む物質または分子であることを意味する場合がある。あらゆる組換えによって、半合成的に、または合成的に生産された融合体またはコンジュゲートが包含される。融合体またはコンジュゲートは、必要に応じて、グリコシル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、アセチル化、脂質化、ペグ化などによって改変されていてもよい。
より特定には、用語「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、２つまたはそれより多くのタンパク質、ポリペプチドもしくは変異体またはそれらの断片が、融合生成物をコードする単一の連続するポリヌクレオチド分子の遺伝学的発現を介して、それらの個々のポリペプチド主鎖を介した共直線的な共有結合による連結によって合体されている遺伝学的な融合体を意味する。典型的には、融合生成物をコードする連続するポリヌクレオチド分子を生産するために、それぞれ所与のポリペプチドセグメントをコードする２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を合体させて、それぞれ元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する方式で、連続的な、より長いＯＲＦを形成する。得られた組換え融合ポリペプチドにおいて、元のＯＲＦによってコードされた２つまたはそれより多くのポリペプチドセグメントは、同じポリペプチド分子中で合体するのに対して、それらは通常、天然においてそのように合体しない。このようにしてリーディングフレームは、融合した遺伝学的セグメントにわたり連続した状態になるが、そのように融合したポリペプチドセグメントは、例えばフレーム内ポリペプチドまたはペプチドリンカーによって、物理的または空間的に分離されていてもよい。
より特定には、用語「タンパク質コンジュゲート」または「ポリペプチドコンジュゲート」は、２つまたはそれより多くのタンパク質、ポリペプチドもしくは変異体またはそれらの断片が非遺伝学的な手段で合体している物質または分子を意味し、それらは通常、天然においてそのように合体しない。ポリペプチドセグメントは、それらの個々のポリペプチド主鎖を介して、またはそれらそれぞれのアミノ酸側鎖の１つまたは複数を介して合体されていてもよく、または１つのタンパク質セグメントは、そのポリペプチド主鎖を介して別のポリペプチドセグメントのアミノ酸側鎖に合体されていてもよい。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質のＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよび／またはＬＲＰ結合性ドメインは、１つまたは複数のリンカーによってカップリングされていてもよい。
本発明の文脈において、用語「カップリングされる」は、本明細書で使用される場合、「接続」、「結合」、「融合」、「合体」と同義であり、少なくとも２つのエレメントまたは構成要素間の物理的な連結を指す。
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、他のエレメントを連結するのに役立つ接続エレメントを指す。リンカーは、リジッドなリンカーでもよく、またはフレキシブルなリンカーでもよい。特定の実施形態において、リンカーは、共有結合を達成する共有結合リンカーである。用語「共有結合の」または「共有結合」は、２つの原子間で１つまたは複数の電子対を共有することを含む化学結合を指す。多くの分子の場合、電子の共有は、各原子が、安定な電子の立体配置に相当する全外部電子殻の等価状態に達するようにすることができる。共有結合としては、σ結合、π結合、金属間の結合、アゴスチック相互作用、曲がった結合および三中心二電子結合などの様々なタイプの相互作用が挙げられる。
特定の実施形態において、リンカーは、（ポリ）ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカー、例えば非ペプチドポリマー、例えば非生物学的ポリマーである。好ましくは、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよび／またはＬＲＰ結合性ドメイン間の連結は、加水分解安定な連結であってもよく、すなわち、有用なｐＨ値で、特定には生理学的条件下などで、長期間にわたり、例えば数日にわたり水中で実質的に安定であってもよい。特定の実施形態において、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸のペプチドリンカーである。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、天然に存在するアミノ酸に類似した方式で機能する、天然にコードされたアミノ酸、天然にコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣体を包含し、これらは、それらの構造がこのような立体異性体の形態を許容する限り、ＤおよびＬ立体異性体の全ての形態を含む。アミノ酸は、本明細書において、それらの名称、それらの一般的に公知の三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された一文字記号のいずれかによって言及される。用語「天然に存在する」は、一般的に、天然に見出され、ヒトによって操作されていない材料を指す。用語「天然に存在しない」、「非天然」などは、一般的に、天然に見出されない材料、または構造的に改変された、半合成された、もしくはヒトによって合成された材料を指す。「天然にコードされたアミノ酸」は、２０種の共通のアミノ酸の１つであるか、またはピロリシン、ピロリン−カルボキシ−リシンもしくはセレノシステインであるアミノ酸を指す。２０種の共通のアミノ酸は、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）である。「天然にコードされないアミノ酸」は、２０種の共通のアミノ酸またはピロリシン、ピロリン−カルボキシ−リシンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。この用語は、これらに限定されないが、天然にコードされたアミノ酸の改変（例えば翻訳後改変）によって生じるアミノ酸であるが、それ自体は天然に翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に取り込まれないものを含み、このようなものとしては、限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、およびＯ−リン酸化チロシンによって例示される。天然にコードされない、非天然または改変されたアミノ酸のさらなる例としては、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモセリン、ホモシステイン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、またはオルニチンが挙げられる。さらに、１つまたは複数の個々の原子が、異なる原子、同じ原子の同位体、または異なる官能基のいずれかで置き換えられているアミノ酸類似体も挙げられる。また、Ellman et al. Methods Enzymol.1991, vol. 202, 301-36に記載された非天然のアミノ酸およびアミノ酸類似体も含まれる。タンパク質またはポリペプチドへの非天然アミノ酸の取込みは、様々な方法で有利であり得る。例えば、Ｄ−アミノ酸を含有するポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含有する対応物と比較して、インビトロまたはインビボで安定性の増加を呈示する。より具体的には、Ｄ−アミノ酸を含有するポリペプチドは、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに対してより高い耐性を有する可能性があり、それによってインビボにおける作用物質の生物学的利用率の改善および寿命の長期化がもたらされる。
ペプチドリンカーは、より特定には、１から５０アミノ酸の長さ、または２から５０アミノ酸の長さ、または１から４５アミノ酸の長さ、または２から４５アミノ酸の長さ、好ましくは、１から４０アミノ酸の長さ、または２から４０アミノ酸の長さ、または１から３５アミノ酸の長さ、または２から３５アミノ酸の長さ、より好ましくは、１から３０アミノ酸の長さ、または２から３０アミノ酸の長さであり得る。さらに好ましくは、リンカーは、５から２５アミノ酸の長さ、または５から２０アミノ酸の長さであり得る。特定には、好ましくは、リンカーは、５から１５アミノ酸の長さ、または７から１５アミノ酸の長さであり得る。したがって、ある特定の実施形態において、リンカーは、１、２、３または４アミノ酸の長さであり得る。他の実施形態において、リンカーは、５、６、７、８または９アミノ酸の長さであり得る。さらなる実施形態において、リンカーは、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸の長さであり得る。さらに他の実施形態において、リンカーは、１５、１６、１７、１８または１９アミノ酸の長さであり得る。さらなる実施形態において、リンカーは、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸の長さであり得る。ある特定の実施形態において、リンカーは、４〜１０または５〜９または６〜８または７アミノ酸の長さである。他の実施形態において、リンカーは、１２〜１８または１３〜１７または１４〜１６または１５アミノ酸の長さである。
リンカーを構成するアミノ酸の性質は、それによって連結されたポリペプチドセグメントの生物活性が実質的に損なわれず、リンカーが、作用物質のＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよび／またはＬＲＰ結合性ドメインの意図された空間的な分離をもたらす限り、特に重要ではない。好ましいリンカーは、本質的に、非免疫原性であるか、および／またはタンパク質分解による切断を受けにくい。
ある特定の好ましい実施形態において、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニン、スレオニン、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含んでもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。さらにより好ましい実施形態において、リンカーは、グリシン、セリン、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含んでもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。このようなリンカーは、特に優れたフレキシビリティーをもたらす。ある特定の実施形態において、リンカーは、グリシン残基のみからなってもよい。ある特定の実施形態において、リンカーは、セリン残基のみからなってもよい。
特定の実施形態において、リンカーは、非ペプチドリンカーである。好ましい実施形態において、非ペプチドリンカーは、非ペプチドポリマーを含んでもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。用語「非ペプチドポリマー」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を除く共有結合によって互いに連結された２つまたはそれより多くの反復単位を含む生体適合性ポリマーを指す。例えば、非ペプチドポリマーは、２から２００単位の長さ、または２から１００単位の長さ、または２から５０単位の長さ、または２から４５単位の長さ、または２から４０単位の長さ、または２から３５単位の長さ、または２から３０単位の長さ、または５から２５単位の長さ、または５から２０単位の長さ、または５から１５単位の長さであり得る。非ペプチドポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ（乳酸）およびＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸）などの生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。特に好ましくは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。非ペプチドポリマーの分子量は、好ましくは、１から１００ｋＤａの範囲、好ましくは１から２０ｋＤａであり得る。非ペプチドポリマーは、１種のポリマーまたは異なるタイプのポリマーの組合せであり得る。非ペプチドポリマーは、コンジュゲートを形成することになるＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよび／またはＬＲＰ結合性ドメインに結合することが可能な反応性基を有する。好ましくは、非ペプチドポリマーは、各末端に反応性基を有する。好ましくは、反応性基は、反応性アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される。スクシンイミド誘導体は、プロピオン酸スクシンイミジル、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたは炭酸スクシンイミジルであり得る。非ペプチドポリマーの両方の末端における反応性基は、同一でもよく、または異なってもよい。ある特定の実施形態において、非ペプチドポリマーは、両方の末端に反応性アルデヒド基を有する。例えば、非ペプチドポリマーは、一方の末端にマレイミド基を有し、他方の末端に、アルデヒド基、プロピオン酸アルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有していてもよい。非ペプチドポリマーとして、両方の末端に反応性ヒドロキシ基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用される場合、ヒドロキシ基は、公知の化学反応によって様々な反応性基に活性化されてもよく、またはタンパク質コンジュゲートが調製されるように、商業的に入手可能な改変された反応性基を有するＰＥＧを使用してもよい。
１つまたは複数のリンカーの包含は、作用物質のＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよび／またはＬＲＰ結合性ドメイン間の空間的な分離を増加させ、これは、作用物質のＷｎｔシグナル伝達活性に有利に影響を与えることができる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、単一の鎖または多量体として提供される。多量体の形態を達成するために、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよび／またはＬＲＰ結合性ドメインは、例えばデンドリマー、抗体またはポリ−Ｌ−リシンで構成される足場または主鎖に付着させてもよい。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインを含み、前記ＲＥＣＫ結合性ドメイン、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメイン、および前記ＬＲＰ結合性ドメインは、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来し、例えばＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドに由来し、好ましくはヒトＷｎｔポリペプチドに由来し、例えばヒトＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドに由来するものである。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインを含み、少なくとも１、少なくとも２つまたは３つ全ての結合性ドメインは、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来し、例えばＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドに由来し、好ましくはヒトＷｎｔポリペプチドに由来し、例えばヒトＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドに由来するものである。
一例として、ヒトＷＮＴ７Ａ遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）Ｇｅｎｅ ＩＤ７４７６の下に注釈が付けられている。ヒトＷＮＴ７Ａ ｍＲＮＡ（転写変異体１）は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４６２５．３の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿００４６２５．３のヌクレオチド３０６（開始コドン）から１３５５（終止コドン）は、ＷＮＴ７Ａコード配列を構成する。ヒトＷＮＴ７Ａタンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４６１６．２の下に注釈が付けられ、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｏ００７５５．２の下に注釈が付けられ、以下にさらに再現される（配列番号１５）：
＞ＮＰ＿００４６１６．２タンパク質Ｗｎｔ−７ａ前駆体［ヒト］
MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVALGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK
例を挙げれば、ヒトＷｎｔ７ａタンパク質の成熟形態（シグナルペプチドを含まない）は、さらに以下に複写されるアミノ配列を含む（配列番号５１）：LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK
一例として、ヒトＷＮＴ７Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ７４７７の下に注釈が付けられている。ヒトＷＮＴ７ＢｍＲＮＡ（転写変異体１）は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８２３８．２の下に注釈が付けられている。ＮＭ＿０５８２３８．２のヌクレオチド３７５（開始コドン）から１４２４（終止コドン）は、ＷＮＴ７Ｂコード配列を構成する。ヒトＷＮＴ７Ｂタンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４７８６７９．１の下に注釈が付けられ、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ５６７０６．２の下に注釈が付けられ、以下にさらに再現される（配列番号１６）：
＞ＮＰ＿４７８６７９．１タンパク質Ｗｎｔ−７ｂ前駆体［ヒト］
MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVALGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCNRTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK
特定の実施形態において、前記ＲＥＣＫ結合性ドメインは、HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC（配列番号１７）、VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT（配列番号１８）またはVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET（配列番号１９）に記載のアミノ酸配列、または配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号１９のアミノ酸配列に対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来する前記ＲＥＣＫ結合性ドメインは、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
特定の実施形態において、前記ＲＥＣＫ結合性ドメインは、アミノ酸配列XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX（配列番号２０）、VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK（配列番号２１）、XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX（配列番号２２）またはVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK（配列番号２３）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号１８または配列番号１９のいずれか１つに対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を示す。
特定の実施形態において、前記ＲＥＣＫ結合性ドメインは、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来するものであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインは、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来するものではない。
特定の実施形態において、前記ＲＥＣＫ結合性ドメインは、Ｗｎｔ７ポリペプチドに由来するものであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１およびＷｎｔ１６からなる列挙から選択されるＷｎｔポリペプチドに由来するものである。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片、例えばＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドの断片、好ましくはヒトＷｎｔ７ポリペプチドの断片、例えばヒトＷｎｔ７ａまたはヒトＷｎｔ７ｂポリペプチドの断片であるかまたはそれから本質的になる。
特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片は、全長Ｗｎｔ７ポリペプチドのＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性の、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、好ましくは１００％、を有する。
特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片は、全長Ｗｎｔ７ポリペプチドのＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性より高い（例えば、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍もしくは２倍高い、またはそれより高い）ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性を有する。
本発明者らは、Ｗｎｔ７ａのＮ末端ドメインが、ＲＥＣＫに結合し、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化することが可能であるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下においてＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化しないことを実証した。
したがって、特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片は、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下における全長Ｗｎｔ７ポリペプチドのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性の、少なくとも１０分の１、または少なくとも１００分の１、または少なくとも１０００分の１、または少なくとも１×１０４分の１、または少なくとも１×１０５分の１、または少なくとも１×１０６分の１の、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性を有する。
特定の実施形態において、前記Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片は、Ｗｎｔ７ポリペプチドのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、例えばＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドのＮＴＤ、好ましくは、ヒトＷｎｔ７ポリペプチド、例えばヒトＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂのＮＴＤであるかまたはそれから本質的になる。ヒトＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドのＮ末端ドメインは、典型的には、配列番号２４（Ｗｎｔ７ａ）または配列番号２５（Ｗｎｔ７ｂ）における１位に対応する位置におけるロイシン（Ｌ）残基から、配列番号２４（Ｗｎｔ７ａ）または配列番号２５（Ｗｎｔ７ｂ）における２４７位に対応する位置におけるシステイン（Ｃ）残基の範囲である。
特定の実施形態において、前記Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片は、少なくともＷｎｔ７ポリペプチドのＮＴＤを含み、Ｗｎｔ７ポリペプチドのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含まない。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、ヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのＮＴＤの、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５個の連続するアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、より特定には、本明細書で開示される作用物質は、アミノ酸配列
LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC（配列番号２４）または
LGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYC（配列番号２５）、好ましくは配列番号２４の、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５個の連続するアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、配列番号２４もしくは配列番号２５、好ましくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるか、または配列番号２４または配列番号２５、好ましくは配列番号２４のアミノ酸配列に対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなる。
当業者は、本明細書で教示される作用物質を、宿主細胞によって発現させ分泌させることが想定される場合、本明細書で教示される作用物質をコードする核酸は、好ましくは、Ｎ末端シグナルペプチド配列を含む作用物質の前駆体型をコードすることを理解しているものと予想される。したがって、核酸は、Ｗｎｔ７の前駆体ポリペプチド（すなわちシグナルペプチドを含む）の断片、例えばヒトＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂの前駆体ポリペプチドの断片をコードしていてもよい。特定の実施形態において、核酸は、配列番号２４もしくは配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなる作用物質、または配列番号２４または配列番号２５に対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなる作用物質をコードし、前記アミノ酸配列は、Ｎ末端において、それぞれアミノ酸配列ＭＮＲＫＡＲＲＣＬＧＨＬＦＬＳＬＧＭＶＹＬＲＩＧＧＦＳＳＶＶＡ（配列番号２６）またはＭＨＲＮＦＲＫＷＩＦＹＶＦＬＣＦＧＶＬＹＶＫＬＧＡＬＳＳＶＶＡ（配列番号２７）を有するシグナルペプチドが先に存在する。代替として、本明細書で教示される作用物質をコードする核酸は、シグナルペプチドを提供するベクター内に含まれていてもよい。シグナルペプチドは、本明細書で教示される作用物質の生産のために使用される宿主細胞に応じて、相同シグナルペプチドであってもよく、または異種シグナルペプチドであってもよい。さらに、本明細書で教示される作用物質の原核生物による発現ために、プロテアーゼ切断部位モチーフは、前記シグナルペプチドのＣ末端に、および本明細書で教示される作用物質のＮ末端に存在していてもよい。
本発明者らは、それぞれ野生型ヒトまたはマウスＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化せずに、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化することにおいて、ヒトまたはマウスＷｎｔ７ａポリペプチドのある特定の変異体が、同様に有効であるか、またはより有効であることを実証した。
したがって、特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体、例えばＷｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドの変異体である。さらなる特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドのＮＴＤの変異体である。
ある特定の実施形態において、このような変異体において、配列番号２４または配列番号５１における１７位に対応する位置のグルタミン（Ｑ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２５位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２７位に対応する位置のアラニン（Ａ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２８位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３３位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３７位に対応する位置のメチオニン（Ｍ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３９位に対応する位置のロイシン（Ｌ）残基；配列番号２４または配列番号５１における４１位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における４４位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基；配列番号２４または配列番号５１における５０位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における５２位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）残基；配列番号２４または配列番号５１における６８位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１２９位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１３１位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１３３位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１３５位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１４１位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１４６位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１５８位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１５９位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１８１位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１９１位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１９８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２００位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０５位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２１４位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２１６位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２１８位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２２２位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２２３位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２２９位に対応する位置のチロシン（Ｙ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２３２位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２３５位に対応する位置のスレオニン（Ｔ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２４８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２８９位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２９１位に対応する位置のトリプトファン（Ｗ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３０７位に対応する位置のスレオニン（Ｔ）残基；および／または配列番号２４または配列番号５１における３１８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基は、１つまたは複数の（好ましくは３つ以下、好ましくは２つ以下、より好ましくは１つの）他のアミノ酸残基によって、例えば、好ましくは、ただし限定されないが、アラニン（Ａ）残基、アルギニン（Ｒ）残基またはグルタミン（Ｑ）残基によって、より好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されている。ある特定の実施形態において、このような変異体において、配列番号２４または配列番号５１における１７位に対応する位置のグルタミン（Ｑ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２５位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２８位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３３位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３７位に対応する位置のメチオニン（Ｍ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３９位に対応する位置のロイシン（Ｌ）残基；配列番号２４または配列番号５１における４１位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における４４位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基；配列番号２４または配列番号５１における５０位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における６８位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１２９位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１３１位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１３３位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１３５位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１４１位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１４６位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１５８位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１８１位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１９１位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における１９８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２００位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０５位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２０８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２１４位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２１６位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２１８位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２２２位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２２３位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２２９位に対応する位置のチロシン（Ｙ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２３２位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２３５位に対応する位置のスレオニン（Ｔ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２４８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２８９位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基；配列番号２４または配列番号５１における２９１位に対応する位置のトリプトファン（Ｗ）残基；配列番号２４または配列番号５１における３０７位に対応する位置のスレオニン（Ｔ）残基；および／または配列番号２４または配列番号５１における３１８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基は、アラニン（Ａ）残基によって置換されており；および／または配列番号２４または配列番号５１における２７位に対応する位置のアラニン（Ａ）残基は、アルギニン（Ｒ）残基によって置換されており；および／または配列番号２４または配列番号５１における５２位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）残基は、グルタミン（Ｑ）残基によって置換されており；および／または配列番号２４または配列番号５１における１５９位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）残基によって置換されている。
ある特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体は、２つまたはそれより多くの（例えば、好ましくは２つの、好ましくは３つの、より好ましくは４つの）上記で列挙したアミノ酸置換を含む。
より特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ａまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドのＮＴＤは、２つまたはそれより多くの（例えば、好ましくは２つの、好ましくは３つの、より好ましくは４つの）上記で列挙したアミノ酸置換を含む。
したがって、特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、配列番号２４または配列番号５１に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、１７位における残基は、グルタミンではなく、２０位における残基は、イソロイシンではなく、２５位における残基は、プロリンではなく、２７位における残基は、アラニンではなく、２８位における残基は、イソロイシンではなく、３３位における残基は、グルタミン酸ではない、３７位における残基は、メチオニンではなく、３９位における残基は、ロイシンではなく、４１位における残基は、グルタミン酸ではない、４４位における残基は、フェニルアラニンではなく、５０位における残基は、アルギニンではなく、５２位における残基は、アスパラギンではなく、６８位における残基は、バリンではなく、１２９位における残基は、イソロイシンではなく、１３１位における残基は、フェニルアラニンではなく、１３３位における残基は、リシンではなく、１３５位における残基は、フェニルアラニンではなく、１４１位における残基は、イソロイシンではなく、１４６位における残基は、アルギニンではなく、１５８位における残基は、アルギニンではなく、１５９位における残基は、リシンではなく、１８１位における残基は、リシンではなく、１９１位における残基は、アルギニンではなく、１９８位における残基は、リシンではなく、２００位における残基は、リシンではなく、２０５位における残基は、バリンではなく、２０８位における残基は、グルタミン酸ではない、２１４位における残基は、アルギニンではなく、２１６位における残基は、リシンではなく、２１８位における残基は、プロリンではなく、２２２位における残基は、リシンではなく、２２３位における残基は、イソロイシンではなく、２２９位における残基は、チロシンではなく、２３２位における残基は、プロリンではなく、２３５位における残基は、スレオニンではなく、２４８位における残基は、グルタミン酸ではない、２８９位における残基は、アルギニンではなく、２９１位における残基は、トリプトファンではない、３０７位における残基は、スレオニンではなく、および／または３１８位における残基は、リシンではなく；好ましくは、２７位における残基は、アルギニンであり、２８位における残基は、アラニンであり、３３位における残基は、アラニンであり、４１位における残基は、アラニンであり、４４位における残基は、アラニンであり、５０位における残基は、アラニンであり、５２位における残基は、グルタミンであり、６８位における残基は、アラニンであり、１２９位における残基は、アラニンであり、１３１位における残基は、アラニンであり、１３３位における残基は、アラニンであり、１３５位における残基は、アラニンであり、１４１位における残基は、アラニンであり、１４６位における残基は、アラニンであり、１５８位における残基は、アラニンであり、１５９位における残基は、アラニンであり、１８１位における残基は、アラニンであり、１９１位における残基は、アラニンであり、１９８位における残基は、アラニンであり、２００位における残基は、アラニンであり、２０５位における残基は、アラニンであり、２０８位における残基は、アラニンであり、２１４位における残基は、アラニンであり、２１６位における残基は、アラニンであり、２１８位における残基は、アラニンであり、２２２位における残基は、アラニンであり、２２３位における残基は、アラニンであり、２２９位における残基は、アラニンであり、２３２位における残基は、アラニンであり、２３５位における残基は、アラニンであり、２４８位における残基は、アラニンであり、２８９位における残基は、アラニンであり、２９１位における残基は、アラニンであり、３０７位における残基は、アラニンであり、および／または３１８位における残基は、アラニンである。
好ましい実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるヒトＷｎｔ７ａのＮＴＤの変異体であって、１７位における残基は、グルタミンではなく、２０位における残基は、イソロイシンではなく、２５位における残基は、プロリンではなく、２７位における残基は、アラニンではなく、２８位における残基は、イソロイシンではなく、３３位における残基は、グルタミン酸ではなく、３７位における残基は、メチオニンではなく、３９位における残基は、ロイシンではなく、４１位における残基は、グルタミン酸ではなく、４４位における残基は、フェニルアラニンではなく、５０位における残基は、アルギニンではなく、５２位における残基は、アスパラギンではなく、６８位における残基は、バリンではなく、１２９位における残基は、イソロイシンではなく、１３１位における残基は、フェニルアラニンではなく、１３３位における残基は、リシンではなく、１３５位における残基は、フェニルアラニンではなく、１４１位における残基は、イソロイシンではなく、１４６位における残基は、アルギニンではなく、１５８位における残基は、アルギニンではなく、１５９位における残基は、リシンではなく、１８１位における残基は、リシンではなく、１９１位における残基は、アルギニンではなく、１９８位における残基は、リシンではなく、２００位における残基は、リシンではなく、２０５位における残基は、バリンではなく、２０８位における残基は、グルタミン酸ではなく、２１４位における残基は、アルギニンではなく、２１６位における残基は、リシンではなく、２１８位における残基は、プロリンではなく、２２２位における残基は、リシンではなく、２２３位における残基は、イソロイシンではなく、２２９位における残基は、チロシンではなく、２３２位における残基は、プロリンではなく、および／または２３５位における残基は、スレオニンではない、ヒトＷｎｔ７ａのＮＴＤの変異体である。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、６８、６９、７０、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、または１２１、好ましくは、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４７、４８、４９、５３、５４、６８、６９、７０、７１、７２、７４、７６、８０、８１、８３、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１４、１１８、１１９または１２１、より好ましくは、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４７、４８、４９、５３、５４、６８、６９、７０、７１７２、７４、７６、８０、８１または８３に記載のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる（図８）。
好ましい実施形態において、このような変異体において、配列番号２４または配列番号５１における１５９位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基は、１つまたは複数の（好ましくは３つ以下、好ましくは２つ以下、より好ましくは１つの）他のアミノ酸残基によって、例えば、好ましくは、ただし限定されないが、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）残基によって置換されている。より好ましい実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、配列番号２８、８０、８１、８５、１１８または１１９、好ましくは、配列番号２８または８５、より好ましくは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体は、全長野生型Ｗｎｔ７ポリペプチドのＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性の、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、好ましくは１００％を有する。好ましい実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体は、全長野生型Ｗｎｔ７ポリペプチドのＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性の少なくとも７０％を有する。特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体は、全長野生型Ｗｎｔ７ポリペプチドのＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性より高い（例えば１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍もしくは２倍高い、またはそれよりさらに高い）ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性を有する。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、水溶性である。例えば、作用物質の溶解性は、Ｗｎｔポリペプチドのパルミトイル化されたＦｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインの代わりに、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的な抗体またはその断片を使用することによって増加させることができる。
さらなる態様は、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸であって、作用物質は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、核酸に関する。
「コードする」は、核酸配列またはその部分が、問題の生物の遺伝子コードに基づき、特定のアミノ酸配列、例えば、１つまたは複数の望ましいタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列、または鋳型転写産物（例えばＲＮＡまたはＲＮＡ類似体）と関連する別の核酸配列に対応していることを意味する。
本明細書で開示される作用物質をコードする核酸を発現させるために、作用物質がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである場合、核酸は、当業界において周知の通り、核酸発現カセットおよび／またはベクターに挿入されていてもよい。
したがって、さらなる態様は、プロモーターおよび／または転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルに作動可能に連結した、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸を含む核酸発現カセットに関する。
用語「核酸発現カセット」は、本明細書で使用される場合、本明細書において定義される核酸断片、好ましくは組換え核酸分子を、発現されるように挿入することができる核酸分子、典型的にはＤＮＡであって、前記核酸分子は、核酸断片の発現を制御する１つまたは複数の核酸配列を含むものを指す。核酸断片の発現を制御するこのようなより多くの核酸配列の非限定的な例としては、プロモーター配列、オープンリーディングフレームおよび転写ターミネーターが挙げられる。
好ましくは、核酸発現カセットは、前記１つまたは複数のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてもよい。「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、それ自体公知の翻訳開始コドンから始まり翻訳終止コドンで終わり、いかなる内部のフレーム内翻訳終止コドンも含有せず、潜在的にタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードすることが可能な、一連のコードヌクレオチドの三つ組み（コドン）を指す。したがって、この用語は、当業界で使用される「コード配列」と同義であり得る。
「作動可能な連結」は、調節配列および発現させようとする配列が、前記発現が許容されるように接続される連結である。例えば、配列、例えばプロモーターおよびＯＲＦなどは、前記配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入を引き起こさない、（２）ＯＲＦの転写を指示するプロモーターの能力に干渉しない、（３）プロモーター配列から転写されるＯＲＦの能力に干渉しない場合、作動可能に連結したと言うことができる。したがって、「作動可能に連結した」は、発現制御配列、例えばプロモーターが目的の配列の転写／発現を効果的に制御するように、遺伝学的コンストラクトに取り込まれていることを意味する場合がある。
転写および翻訳調節配列または発現に必要なエレメントの正確な性質は、発現環境間で変更し得るが、典型的には、転写ターミネーター、エンハンサーを含んでいてもよい。
「プロモーター」への言及は、その最も広い関係で解釈されるものとし、正確な転写開始、ならびに適用可能であれば、遺伝子発現または例えば内部または外部（例えば、外因性）の刺激に対するその応答の正確な空間的および／または一時的な制御に必要な転写調節配列を含む。より特定には、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始させる、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子上の領域を描写する場合もある。プロモーターは、好ましくは、ただし必ずしもそうとは限らないが、それによって転写が制御される配列の上流に、すなわち５’に位置する。典型的には、原核生物において、プロモーター領域は、プロモーターそれ自体と、ＲＮＡに転写されると、タンパク質合成の開始をシグナル伝達する配列（例えば、シャイン−ダルガノ配列）の両方を含有していてもよい。プロモーター配列はまた、「エンハンサー領域」を含んでいてもよく、これは、遺伝子クラスター中での遺伝子の転写レベルを強化するように、タンパク質と結合できるＤＮＡの１つまたは複数の領域（すなわちトランス作用因子）である。エンハンサーはまた、典型的にはコード領域の５’末端にあるが、プロモーター配列を分離することもでき、例えば、遺伝子のイントロン領域内であってもよく、または遺伝子のコード領域の３’にあってもよい。
実施形態において、本明細書において予期されるプロモーターは、構成的であってもよく、または誘導性であってもよい。構成的プロモーターは、その発現が標準的な培養条件下で一定であるプロモーターと理解される。誘導性プロモーターは、１つまたは複数の誘導のきっかけに応答するプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節されるものでもよく（例えば、その転写活性が、化学的な誘導因子、例えばアルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の小分子の存在または非存在によって調節されるプロモーター）、または物理的に調節されるものでもよい（例えば、その転写活性が、物理的な誘導因子、例えば光または高温もしくは低温の存在または非存在によって調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターはまた、それ自体が化学的または物理的なきっかけによって直接調節される１つまたは複数の転写因子によって間接的に調節されるものでもよい。プロモーターの非限定的な例としては、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。
用語「ターミネーター」または「転写ターミネーター」は、一般的に、転写の終結をシグナル伝達する、転写単位の末端における配列エレメントを指す。例えば、ターミネーターは通常、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦの下流、すなわちその３’に位置する。例えば、組換え核酸が、例えば連続して並べられた２つまたはそれより多くのＯＲＦを含有し、一緒になってマルチシストロン性転写単位を形成する場合、転写ターミネーターは、最も下流のＯＲＦの３’に位置することが有利な場合がある。
特定の実施形態において、核酸発現カセットは、１つまたは複数のプロモーター、エンハンサー、ＯＲＦおよび／または転写ターミネーターに作動可能に連結した、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸を含む。
さらなる態様は、ウイルスベクターなどの、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、または本明細書で開示される核酸発現カセットを含むベクターに関する。
用語「発現ベクター」または「ベクター」は、本明細書で使用される場合、本明細書において定義される核酸断片、好ましくは組換え核酸分子を挿入しクローニングすることができる、すなわち増殖することができる核酸分子、典型的にはＤＮＡを指す。したがって、ベクターは、典型的には、１つまたは複数の固有の制限部位を含有すると予想され、クローニングされた配列が複製可能になるように、規定の細胞または媒体生物中で自律複製することができる。ベクターはまた、好ましくは、ベクターを含有するレシピエント細胞の選択が可能になるように、選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子などを含有していてもよい。ベクターとしては、これらに限定されないが、適宜、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージに由来するベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、線形核酸、例えば、線形ＤＮＡ、トランスポゾン、ウイルスベクターなどを挙げることができる（例えば、Sambrook et al., 1989；Ausubel 1992を参照）。ウイルスベクターとしては、とりわけ、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶベースのベクターを挙げることができる。発現ベクターは、一般的に、所望の発現系中で、例えば、インビトロで、細胞、器官および／または生物中で、そこに導入された核酸またはオープンリーディングフレームの発現が可能になるように、および／またはそれが実行されるように構成される。例えば、発現ベクターは、有利には、好適な調節配列を含んでいてもよい。
特定のベクターの選択における重要な要因としては、とりわけ、レシピエント細胞の選択、容易にベクターを含有するレシピエント細胞を認識して、ベクターを含有しないレシピエント細胞から選択することができること；特定のレシピエント細胞において望ましいベクターのコピーの数；ベクターにとって染色体に組み込まれるのが望ましいか、またはレシピエント細胞中の染色体外に留まるのが望ましいか；および異なる種のレシピエント細胞間でベクターを「シャトル輸送」できることが望ましいかどうかが挙げられる。
発現ベクターは、自律型でもよく、または組み込み型でもよい。核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはウイルス粒子などの発現ベクターの形態で細胞に導入された状態であってもよい。組換え核酸は、染色体外に維持されてもよく、または細胞染色体のＤＮＡに組み込まれていてもよい。発現ベクターは、望ましい核酸で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下で、細胞の生存に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはロイシン生合成に必要な酵素をコードするＬＥＵ２、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含有していてもよい。発現ベクターはまた、自律複製配列（ＡＲＳ）を含んでいてもよい。ＡＲＳは、動原体（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）を含んでいてもよい。例えば、ＡＲＳは、ＡＲＳ１８またはＡＲＳ６８であり得る。
組み込み型ベクターは、一般的に、少なくとも第１の挿入可能なＤＮＡ断片、選択可能マーカー遺伝子、および第２の挿入可能なＤＮＡ断片の連続的に並べられた配列を含む。第１および第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、それぞれ、約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約１０００またはそれより多くの）ヌクレオチドの長さであり、形質転換しようとする細胞種のゲノムＤＮＡの一部に相同なヌクレオチド配列を有する。発現のための目的の核酸を含有するヌクレオチド配列は、このベクター中において、マーカー遺伝子の前かまたはその後かにかかわらず、第１および第２の挿入可能なＤＮＡ断片の間に挿入される。組み込み型ベクターは、細胞ゲノムへの目的のヌクレオチド配列の組み込みを容易にするために、形質転換の前に線形化することができる。
目的の細胞にベクターを導入する前に、ベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞中で増殖（例えば増幅）させることができる。ベクターＤＮＡは、細菌環境からのベクターＤＮＡの精製をもたらす当業界において公知の方法のいずれかによって、細菌細胞から単離することができる。Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質は哺乳類細胞にとって毒性であり得るため、これらのタンパク質がプラスミドＤＮＡ調製物中に存在しないように確実にして、フェノール、クロロホルム、およびエーテルを用いて精製されたベクターＤＮＡを大規模に抽出することができる。
他所で述べたように、作用物質は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含んでいてもよい。このようなものは、好適には、前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードし、前記宿主細胞または宿主生物中での前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現、それに続くタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製のために設計された発現コンストラクトで形質転換された宿主細胞または宿主生物による発現を介して得ることができる。
したがって、さらなる態様は、本明細書で教示される核酸、核酸発現カセットまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、または哺乳類細胞であり得る。
用語「宿主細胞」および「宿主生物」は、好適には、細菌などの原核生物と、酵母、真菌、原生動物、植物および動物などの真核生物の両方を包含する細胞または生物を指す場合がある。宿主細胞としては、とりわけ、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの単細胞生物、（培養された）植物細胞（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｕｍに由来する）および（培養された）動物細胞（例えば、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞または昆虫細胞）が予期される。宿主生物としては、とりわけ、植物および動物などの多細胞生物、好ましくは動物、より好ましくは温血動物、さらにより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類が予期され；特定には、非ヒトである、このような動物および動物のカテゴリーが予期される。
このようなタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、好適には、単離されていてもよい。特定の構成要素（例えば核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなど）に関する用語「単離された」は、一般的に、このような構成要素が、その天然環境の１つまたは複数の他の構成要素から分離された状態で存在すること、例えば、その天然環境の１つまたは複数の他の構成要素から分離されているか、またはそれから分離された状態で調製および／もしくは維持されていることを意味する。例えば、単離されたヒトまたは動物タンパク質または複合体は、それが天然に存在している場合、ヒトまたは動物の体から分離された状態で存在していてもよい。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、好ましくは修飾句「精製された」も包含する場合がある。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸に関する用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、絶対的な純度を必要としない。その代わりに、このようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸が、他の分析物に対するそれらの存在量（都合のよい形態としては、質量または重量または濃度の単位で表される）が、開始時の組成物または試料中より大きい別個の環境にあることを意味する。別個の環境は、単一の培地、例えば、単一の溶液、ゲル、沈殿、凍結乾燥物などを意味する。精製された核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、実験室での、または組換え合成、クロマトグラフィー、予備的な電気泳動、遠心分離、沈殿、親和性精製などを含む公知の方法によって得ることができる。精製されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、別個の環境のタンパク質含量の、≧１０重量％、より好ましくは≧５０重量％、例えば≧６０重量％、さらにより好ましくは≧７０重量％、例えば≧８０重量％、さらにより好ましくは≧９０重量％、例えば≧９５重量％、≧９６重量％、≧９７重量％、≧９８重量％、≧９９重量％を構成していてもよく、またはさらには１００重量％を構成していてもよい。タンパク質含量は、例えば、ローリー法（Lowry et al. 1951. J Biol Chem 193: 265）によって決定してもよく、適宜、Hartree 1972 (Anal Biochem 48: 422-427)によって記載されるようにして決定してもよい。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の純度は、還元または非還元条件下で、クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定することができる。核酸の量は、吸光度Ａ２６０を測定することによって決定することができる。核酸の純度は、吸光度Ａ２６０／Ａ２８０を測定することによって、またはアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドもしくは類似の染色によって決定することができる。
さらに、動物細胞に核酸を導入する数々の他の周知の方法があり、これらのいずれも、本明細書において使用することができる。最も簡単には、核酸は、標的細胞／標的組織に直接注射することができる。他の方法としては、レシピエント細胞と核酸を含有する細菌プロトプラストとの融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン脂質もしくはリポソームのような組成の使用、または受容体媒介性エンドサイトーシス、遺伝子銃粒子衝撃（「ジーンガン」方法）、ウイルスベクター（すなわち、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルスまたは抗ウイルス物質に由来するもの）での感染、電気穿孔のような方法などが挙げられる。標的細胞に核酸分子をデリバリーするのに好適な他の技術または方法としては、ポリ（乳酸−Ｃｏ−グリコール酸）ポリマーマイクロスフェアからのＮＡ分子の連続デリバリー、または生成物をデリバリーするマイクロポンプへの保護された（安定化された）ＮＡ分子の直接注射が挙げられる。別の可能性は、埋め込み可能な薬物放出生分解性マイクロスフェアの使用である。また、様々な種類のリポソーム（イムノリポソーム、ペグ化（イムノ）リポソーム）、カチオン脂質およびポリマー、ナノ粒子またはデンドリマー、ポリ（乳酸−Ｃｏ−グリコール酸）ポリマーマイクロスフェア、埋め込み可能な薬物放出生分解性マイクロスフェアなどへのＮＡのカプセル化；ならびにＮＡとヌクレアーゼ阻害剤であるオーリントリカルボン酸のような保護剤との同時注射も想定される。異なる上述のデリバリー様式または方法の組合せも使用され得ることは、明らかであると予想される。
特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸を含むベクターは、ウイルスベクターであり、好ましくは中枢および／または末梢神経系に特異的に向けられたウイルスベクター（例えば、脳特異的なウイルスベクター）である。さらなる特定の実施形態において、ウイルスベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロン特異的なアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）突然変異体である。例えば、ウイルスベクターは、Ｄｅｖｅｒｍａｎら（Deverman et al., Nat Biotechnol, 34:204-209 (2016)）およびＣｈａｎら（Chan et al., Nat Neurosci, 20(8): 1172-1179 (2017)）に記載された、ペプチドＳＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡ（配列番号５５）またはＳＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡ（配列番号５６）を提示するＣＮＳ細胞特異的ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢウイルスベクターである。
好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、血液脳関門内皮細胞特異的ウイルスベクターである。さらに好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、血液脳関門内皮細胞特異的キャプシドを有するアデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）突然変異体である。例えば、ウイルスベクターは、Ｋｏｒｂｅｌｉｎら（Korbelin et al., EMBO Molecular Medicine, 8, 609-625 (2016)）に記載された、ペプチドＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号５７）を提示する血液脳関門内皮細胞特異的ＡＡＶ−ＢＲ１ウイルスベクターである。
さらなる態様は、本明細書で開示される作用物質、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、本明細書で開示される核酸発現カセットまたは本明細書で開示されるベクター、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。このような医薬製剤または組成物は、パーツのキット中に含まれていてもよい。
用語「薬学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、当業界での使用と一致し、医薬組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害ではないことを意味する。
「担体」または「賦形剤」は、本明細書で使用される場合、様々な溶媒、希釈剤、緩衝剤（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水など）、可溶化剤、コロイド、分散媒、媒体、フィラー、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）、アミノ酸（例えば、グリシンなど）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着香料、芳香剤、増粘剤、デポー剤効果を達成するための作用物質、コーティング、抗真菌剤、保存剤、抗酸化剤、張度制御剤、吸収遅延剤などを含む。このような医薬活性物質のための培地および作用物質の使用は当業界において周知である。従来の培地または作用物質が活性物質と適合しないあらゆる場合を除いて、治療用組成物におけるその使用を予期することができる。
医薬組成物の製剤化における使用のための例示的な非限定的な担体としては、例えば、静脈内（ＩＶ）への使用、リポソームまたは界面活性剤を含有する小胞、マイクロスフェア、マイクロビーズおよびミクロソーム、粉剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、水性懸濁剤、エアロゾル剤に好適な有機共溶媒、および当業者にとって明らかな他の担体などを含有する、または含有しない、水中油または油中水型乳剤、水性組成物が挙げられる。
本明細書において意図される通りの医薬組成物は、本質的に任意の投与経路、例えば、限定されないが、経口投与（例えば、経口摂取または吸入など）、鼻腔内投与（例えば、経鼻吸入または経鼻粘膜適用など）、非経口投与（例えば、皮下、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内、腹膜内または胸骨内注射または輸注など）、経皮または経粘膜（例えば、経口、舌下、経鼻など）投与、局部への投与、直腸、膣または気管内への点滴注入などのために製剤化することができる。この方法において、本方法および組成物によって達成可能な治療作用は、例えば、所与の適用の具体的な必要性によって、全身、局所、組織特異的な作用などであり得る。
例えば、経口投与の場合、医薬組成物は、丸剤、錠剤、表面を滑らかに仕上げた錠剤、コーティングされた（例えば、糖衣）錠剤、顆粒剤、ハードおよびソフトゼラチンカプセル、水性、アルコール性または油性液剤、シロップ剤、乳剤または懸濁剤の形態で製剤化することができる。一例において、限定されないが、経口用剤形の調製は、好適には、粉末の形態で好適な量の本明細書で開示される作用物質を、適宜微粉化した１種または複数の固形担体も含めて、均一かつ密接に一緒にブレンドすること、およびブレンドを丸剤、錠剤またはカプセル剤に製剤化することによって達成することができる。例示的な、ただし非限定的な固形担体としては、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖（例えば、グルコース、マンノース、ラクトースまたはスクロースなど）、糖アルコール（例えば、マンニトールなど）、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン（polyvinylpyrrolidine）、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。医薬組成物を含有する圧縮錠剤は、例えば上述したような固形担体と共に本明細書で開示される作用物質を均一かつ密接に混合して、必要な圧縮特性を有する混合物を提供し、次いで好適な機械で混合物を所望の形状およびサイズに圧縮することによって調製することができる。鋳型成形した錠剤は、不活性液体希釈剤で加湿した粉末化した化合物の混合物を、好適な機械で鋳型成形することによって作製され得る。ソフトゼラチンカプセルおよび坐剤のための好適な担体は、例えば、脂肪、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然油または硬化油などである。
例えば、経口もしくは経鼻エアロゾルまたは吸入投与の場合、医薬組成物は、例示的な担体を用いて、例えば、食塩水、ポリエチレングリコールまたはグリコール、ＤＰＰＣ、メチルセルロースを含む溶液の形態として、または粉末化した分散剤を含む混合物の形態などとして製剤化することができ、さらに、ベンジルアルコールもしくは他の好適な保存剤、生物学的利用率を強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当業界において公知の他の可溶化剤または分散剤を採用してもよい。エアロゾルまたはスプレーの形態での投与に好適な医薬製剤は、例えば、薬学的に許容される溶媒、例えばエタノールもしくは水、またはこのような溶媒の混合物中の、本明細書で教示される作用物質またはその生理学的に許容される塩の液剤、懸濁剤または乳剤である。必要があれば、製剤はまた、加えて、他の医薬助剤、例えば界面活性剤、乳化剤および安定剤、ならびに噴射剤を含有していてもよい。例証として、デリバリーは、使い捨てのデリバリーデバイス、ミストネブライザー、呼吸で活性化する粉末吸入器、エアロゾル定量吸入器（ＭＤＩ）、またはその他の任意の当業界において利用可能な多数のネブライザーデリバリーデバイスの使用によってなされ得る。加えて、ミストテントまたは気管内チューブを介した直接投与も使用される場合がある。
粘膜表面を介した投与のための担体の例は、特定の経路、例えば、経口、舌下、経鼻などに依存する。経口投与される場合、説明に役立つ例としては、医薬品グレードのマンニトール、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカライド（sodium saccharide）、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられ、好ましくはマンニトールである。鼻腔内投与される場合、説明に役立つ例としては、ポリエチレングリコール、リン脂質、グリコールおよび糖脂質、スクロース、および／またはメチルセルロースが挙げられ、ラクトースなどの増量剤および塩化ベンザルコニウム、ＥＤＴＡなどの保存剤含有または非含有の粉末懸濁剤も挙げられる。特に例示的な実施形態において、リン脂質である１，２ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）は、約０．１から３．０ｍｇ／ｍｌの濃度での本発明の化合物の鼻腔内投与の場合、約０．０１〜０．２％での等張水性担体として使用される。
例えば、非経口投与の場合、医薬組成物は、有利には、好適な溶媒、希釈剤、可溶化剤または乳化剤などを含む液剤、懸濁剤または乳剤として製剤化することができる。好適な溶媒は、限定されないが、水、生理的食塩水またはアルコール、例えばエタノール、プロパノール、グリセロールであり、加えて、糖溶液、例えばグルコース、転化糖、スクロースまたはマンニトール溶液、または代替として上述した様々な溶媒の混合物も挙げられる。注射用溶液または懸濁剤は、公知の技術に従って、好適な非毒性の非経口的に許容できる希釈剤もしくは溶媒、例えばマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液もしくは等張塩化ナトリウム溶液、または好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤、例えば、合成モノもしくはジグリセリドなどの滅菌された刺激の少ない不揮発性油、およびオレイン酸などの脂肪酸を使用して製剤化することができる。本発明の作用物質およびその薬学的に許容される塩はまた、凍結乾燥することもでき、得られた凍結乾燥物は、例えば、注射または輸注調製物の生産のために使用される。例えば、静脈内での使用のための担体の１つの説明に役立つ例としては、１０％ＵＳＰエタノール、４０％ＵＳＰプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール６００およびその残部のＵＳＰ注射用水（ＷＦＩ）の混合物が挙げられる。静脈内での使用のための他の例示的な担体としては、１０％ＵＳＰエタノールおよびＵＳＰ ＷＦＩ；ＵＳＰ ＷＦＩ中の０．０１〜０．１％トリエタノールアミン；またはＵＳＰ ＷＦＩ中の０．０１〜０．２％ジパルミトイルジホスファチジルコリン；および１〜１０％スクアレンもしくは非経口用水中植物油型乳剤が挙げられる。皮下または筋肉内での使用のための担体の説明に役立つ例としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、ＷＦＩ中の５％デキストロースおよび５％デキストロース中の０．０１〜０．１％トリエタノールアミン、もしくはＵＳＰ ＷＦＩ中の０．９％塩化ナトリウム、または１０％ＵＳＰエタノール、４０％プロピレングリコールおよびその残部の許容できる等張溶液、例えば５％デキストロースもしくは０．９％塩化ナトリウムの１から２種または１から４種の混合物；またはＵＳＰ ＷＦＩ中の０．０１〜０．２％ジパルミトイルジホスファチジルコリン、および１〜１０％スクアレンまたは非経口用水中植物油型乳剤が挙げられる。
水性製剤が好ましい場合、このような製剤は、１種または複数の界面活性剤を含んでいてもよい。例えば、組成物は、少なくとも１種の好適な界面活性剤、例えば、リン脂質界面活性剤を含むミセル分散液の形態であってもよい。リン脂質の説明に役立つ例としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＭＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、およびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）など、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＰＭＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）など；ジアシルホスファチジン酸、例えばジミリストイルホスファチジン酸（ＤＰＭＡ）、ジパルミトイル（dipahnitoyl）ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、およびジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）など；ならびにジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などが挙げられる。典型的には、水性製剤中の界面活性剤：活性物質のモル比は、約１０：１から約１：１０、より典型的には約５：１から約１：５と予想されるが、対象とする具体的な目的に最も適合するように、任意の有効量の界面活性剤を水性製剤中に使用することができる。
坐剤の形態で直腸投与される場合、これらの製剤は、本発明による化合物を、常温で固体であるが、直腸腔中で液化および／または溶解して薬物放出する好適な非刺激性の賦形剤、例えばカカオバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールと混合することによって調製することができる。
マイクロカプセル、インプラントまたはロッドのための好適な担体は、例えば、グリコール酸と乳酸とのコポリマーである。
当業者は、上記の説明が網羅的というより例示的であることを認識していると予想される。実際に、多くの追加の製剤技術ならびに薬学的に許容される賦形剤および担体溶液が当業者周知であり、例えば、様々な処置レジメンで本明細書に記載される特定の組成物を使用するために、好適な投与および処置レジメンの開発がなされる。
好ましい実施形態において、本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、核酸を含む核酸発現カセット、核酸もしくは核酸発現カセットを含むベクター、宿主細胞または医薬組成物は、非経口投与される。より好ましくは、本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、核酸を含む核酸発現カセット、または核酸、核酸発現カセットを含むベクター、宿主細胞または医薬組成物は、例えば輸注によって、静脈内投与される。
特定の実施形態において、本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、または核酸を含む核酸発現カセットは、遺伝子治療で使用される。さらなる特定の実施形態において、本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、または核酸を含む核酸発現カセットは、中枢および／または末梢神経系に向けられる遺伝子治療、例えば、脳に向けられる遺伝子治療、より特定には、血液脳関門内皮細胞に向けられる遺伝子治療に使用される。
したがって、遺伝子治療が必要な対象における、遺伝子治療、特定には中枢および／または末梢神経系に向けられる遺伝子治療のための方法であって、対象に、特定には対象の中枢および／または末梢神経系に、本明細書に記載される核酸発現カセットまたはベクターを導入すること；および対象において、特定には対象の中枢および／または末梢神経系において、治療有効量の、本明細書で教示される核酸によってコードされた作用物質を発現させることを含む、方法も本明細書で提供される。
用語「遺伝子治療」は、本明細書で使用される場合、導入のために使用される方法に関わりなく、処置または予防目的のための、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。このような方法としては、本明細書の他所で記載されるような、ベクターが媒介する遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々な他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子デリバリー複合体による）などの様々な周知の技術が挙げられる。導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中に安定して維持されてもよく、または一時的に維持されてもよい。安定な維持は、典型的には、導入されるポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合する複製起点を含有すること、または宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外のレプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリアの染色体に組み込まれていることのいずれかを必要とする。当業界において公知のように、遺伝子の哺乳類細胞への移行を媒介することが可能な様々なベクターが公知である。例えば、本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、核酸を含む核酸発現カセットのベクターが媒介する遺伝子移入は、本明細書の他所で記載されるような中枢および／または末梢神経系に特異的に向けられたウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢウイルスベクター）または血液脳関門内皮細胞に特異的なウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ−ＢＲ１ウイルスベクター）を使用して実行することができる。
特定の実施形態において、作用物質をコードする核酸、核酸を含む核酸発現カセット、核酸もしくは核酸発現カセットを含むベクターまたは本明細書で教示される医薬組成物は、本明細書で教示される核酸または核酸発現カセットを含むベクターで形質転換された同種異系細胞の注射（例えば、静脈内）または移植によって対象に投与される。投与のとき、注射または移植された同種異系細胞は、インビボにおいて、本明細書で教示される作用物質をコードする核酸を転写し、翻訳することになる。適宜投与される１種または複数の他の活性化合物と組み合わされた、本明細書で教示される作用物質の投薬または量は、個々のケースに依存し、慣例通りに、最適な作用を達成するために個々の環境に適合させることになる。したがって、単位用量およびレジメンは、処置しようとする障害の性質および重症度に依存し、さらに、対象の種、性別、年齢、体重、全身の健康状態、食事、投与の方法および時間、免疫の状態、処置しようとするヒトまたは動物の個々の応答性、使用される化合物の有効性、代謝的安定性および作用の持続時間などの要因、療法が緊急または長期または予防的であるかどうか、または本発明の作用物質に加えて他の活性化合物が投与されるかどうかにも依存する。治療有効性を最適化するために、本明細書で教示される作用物質はまず、異なる用量レジメンで投与してもよい。典型的には、例えば臨床試験手順の一部として、組織中の作用物質のレベルを適切なスクリーニングアッセイを使用してモニターして、所与の処置レジメンの有効性を決定することができる。投与頻度は、医療技術者（例えば、医者、獣医または看護師）の能力および臨床的な判断の範囲内である。典型的には、投与レジメンは、最適な投与パラメータを確立することができる臨床試験によって確立される。しかしながら、医師は、このような投与レジメンを、上述の要因の１つまたは複数、例えば対象の年齢、健康状態、体重、性別および医学上の状態に従って変更することができる。投与頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変更することができる。
本明細書に記載される作用物質またはそれを含む医薬組成物の毒性および治療有効性は、公知の薬学的手順によって、例えば、細胞培養または実験動物において決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を致死させる致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性作用と治療作用との間の用量比率は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指数を呈示する医薬組成物が好ましい。毒性副作用を呈示する医薬組成物が使用できるが、正常細胞（例えば、非標的化細胞）に対する起こり得るダメージを最小化し、それによって副作用を低減するために、このような化合物を罹患した組織の部位に標的化するデリバリー系を設計することに注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、適切な対象において使用するための様々な投薬量を製剤化するのに使用することができる。このような医薬組成物の投薬量は、一般的に、毒性をほとんど示さない、または全く示さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲にある。投薬量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。本明細書に記載されるように使用される医薬組成物の場合、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推測することができる。用量は、細胞培養で決定される場合、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する医薬組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が達成されるように、動物モデルで決めることができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
限定されないが、疾患のタイプおよび重症度に応じて、本明細書で教示される作用物質の典型的な投薬量（例えば、典型的な１日投薬量または典型的な間欠的な投薬量、例えば、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、１．５週毎、２週間毎、３週間毎、毎月などの典型的な投薬量）は、上述の要因に応じて、１用量当たり、対象の体重に対して約１０μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、例えば、対象の体重に対して、２０〜４００μｇ／ｋｇまたは２０〜２００μｇ／ｋｇまたは２０〜１００μｇ／ｋｇまたは４０〜８０μｇ／ｋｇなどの範囲であり得る。
一例として、限定されないが、本明細書で教示される作用物質は、１用量当たり、約５μｇ／ｋｇ、または約１０μｇ／ｋｇ、または約１５μｇ／ｋｇ、または約２０μｇ／ｋｇ、または約２５μｇ／ｋｇ、または約３０μｇ／ｋｇ、または約３５μｇ／ｋｇ、または約４０μｇ／ｋｇ、または約４５μｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇ、または約６０μｇ／ｋｇ、または約７０μｇ／ｋｇ、または約８０μｇ／ｋｇ、または約９０μｇ／ｋｇ、または約１００μｇ／ｋｇ、または約２００μｇ／ｋｇ、または約３００μｇ／ｋｇ、または約４００μｇ／ｋｇ、または約５００μｇ／ｋｇで投与されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書で教示される作用物質は、持続デリバリー系、例えば（部分的に）埋め込まれた持続デリバリー系を使用して投与される。当業者は、このような持続デリバリー系は、本明細書で教示される作用物質を保持するためのリザーバ、ポンプおよび輸注手段（例えば、チューブ系）を含み得ることを理解しているものと予想される。例えば、持続デリバリー系は、脳中に埋め込まれたミニ浸透圧ポンプ系であってもよい。
特定の実施形態において、本明細書で開示される作用物質は、医薬組成物の主要な、または唯一の活性成分である。
さらなる態様は、医薬として使用するための、本明細書で開示される作用物質、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、本明細書で開示される核酸発現カセット、本明細書で開示されるベクターまたは本明細書で開示される医薬組成物に関する。
さらなる態様は、神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の予防または治療における使用のための、本明細書で開示される作用物質、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、本明細書で開示される核酸発現カセット、本明細書で開示されるベクターまたは本明細書で開示される医薬組成物に関する。
用語「治療する」または「治療」は、すでに発症した疾患または状態の治療的処置の両方、例えば、すでに発症した神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の療法、加えて防止または予防的措置を包含し、この目的は、望ましくない苦しみの発生機会を予防したりまたは小さくしたりすること、例えば神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の出現、発症および進行を予防することである。有益な、または所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、１つまたは複数の症状または１つまたは複数の生物学的なマーカーの軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患の状態の緩和または一時的緩和などを挙げることができる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存と比較して、生存を延長することを意味する場合もある。
用語「神経血管障害」または「神経血管疾患」は、本明細書で使用される場合、脳血管系および／または脊髄に血液供給する血管系に影響を与える疾患または病理学的な変更または状態を指す。この用語は、脳および／または脊柱内の、またはそれに血液供給する血管の任意の異常を包含する。異常は、限定されないが、（ｉ）動脈が狭くなり、脳への血流を低減させることであり得、これは、低酸素、虚血または脳卒中を引き起こす可能性があり、および／または（ｉｉ）動脈が弱くなることであり得、これは、脳動脈瘤が生じたり、頭蓋内出血のリスクが増加したりする可能性がある。神経血管疾患の非限定的な例は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、虚血／再灌流傷害、脳動脈瘤、動静脈奇形（ＡＶＭ）、海綿状血管奇形、血管炎、脳出血、くも膜下出血、脊髄血管奇形、頸動脈狭窄、もやもや病および頭蓋内アテローム性動脈硬化症である。
語句「神経血管機能不全を含む中枢神経系（ＣＮＳ）障害」または「神経血管機能不全を含むＣＮＳ疾患」は、本明細書で使用される場合、神経血管機能不全によって引き起こされる、それに寄与する、またはそれを特徴とする、集合的にＣＮＳを形成する脳および／または脊髄の構造および／または機能に影響を与える神経障害の群、または脳および／または脊柱内の、またはそれに血液供給する血管の構造および／または機能の異常を引き起こす神経障害の群を指す。神経血管機能不全を含む中枢神経系（ＣＮＳ）障害の非限定的な例は、多発性硬化症、虚血性脳卒中、脳がん、てんかん、認知症、血管性認知症、ＨＩＶ−１関連認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、感染性脳疾患、外傷性脳損傷、片頭痛および慢性外傷性脳障害である。
特記される場合を除いて、用語「対象」または「患者」は、同義的に使用でき、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類を指し、具体的には、ヒト患者および非ヒト哺乳動物および霊長類が挙げられる。好ましい対象は、ヒト対象である。用語「対象」または「患者」は、治療が必要な対象、より特定には、所与の状態、特定には神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療によって利益を得ると予想される対象を含む。このような対象としては、これらに限定されないが、前記状態を有すると診断された対象、前記状態を発症させやすい対象、および／または前記状態を予防しようとする対象を挙げることができる。
本明細書で教示される生成物および方法は、このような治療によって利益を得ると予想される神経血管障害またはＣＮＳ障害を有する対象に、治療有効量的および／または予防有効量の、本明細書で教示される作用物質、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、本明細書で開示される核酸発現カセット、本明細書で開示されるベクターまたは本明細書で開示される医薬組成物を投与することを可能にする。用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、外科医、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求める対象における生物学的または医薬的応答を惹起する活性化合物または医薬物質の量を指し、そのような応答としては、とりわけ、治療される疾患または状態の症状の軽減を挙げることができる。用語「予防有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求めるような対象において障害の発症を阻害するかまたは遅延させる活性化合物または医薬物質の量を指す。本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、核酸発現カセット、または医薬組成物の治療有効量および／または予防有効量を決定するための方法は、当業界において公知である。
用語「治療有効用量」は、本明細書で使用される場合、投与されると、神経血管障害またはＣＮＳ障害を有する患者の治療に関して肯定的な治療応答をもたらす、本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、核酸発現カセット、または医薬組成物の量を指す。
本明細書で教示される作用物質、作用物質をコードする核酸、核酸発現カセット、または医薬組成物の適切な治療有効用量は、資格を有する医師により、疾患の状態および重症度の性質、ならびに患者の年齢、サイズおよび状態を考慮することによって決定することができる。
さらなる態様は、このような治療を必要とする対象における神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害を治療する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される作用物質、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、本明細書で開示される核酸発現カセット、本明細書で開示されるベクターまたは本明細書で開示される医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
さらなる態様は、神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の治療のための医薬品を製造するための、本明細書で開示される作用物質、本明細書で開示される作用物質をコードする核酸、本明細書で開示される核酸発現カセット、本明細書で開示されるベクターまたは本明細書で開示される医薬組成物の使用を提供する。
特定の実施形態において、前記神経血管障害は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、虚血／再灌流傷害、脳動脈瘤、動静脈奇形（ＡＶＭ）、海綿状血管奇形、血管炎、脳出血、くも膜下出血、脊髄血管奇形、頸動脈狭窄、もやもや病および頭蓋内アテローム性動脈硬化症、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
特定の実施形態において、神経血管機能不全を含む前記ＣＮＳ障害は、多発性硬化症、虚血性脳卒中、脳がん、てんかん、認知症、血管性認知症、ＨＩＶ−１関連認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、感染性脳疾患、外傷性脳損傷、片頭痛、慢性外傷性脳障害、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
さらなる態様は、例えば神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の予防または治療に有用なものなどの、治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法であって、試験作用物質が、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することを含む方法に関する。用語「インビトロ」は、一般的に、体、例えば動物またはヒトの体の外側または外部であることを意味する。この用語はまた、「エクスビボ」も包含する。「インビトロ」の一例は、組織細胞培養中である。
用語「試験作用物質」は、本明細書で使用される場合、それが、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することが望ましい、任意の化学的（例えば、無機または有機）、生化学的もしくは生物学的な物質、分子もしくは巨大分子（例えば、生物学的な巨大分子）、それらの組合せもしくは混合物、未確認の組成を有する試料、または細菌、真菌、植物、もしくは動物細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製された抽出物を指す。
ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達およびＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達の活性化または活性化の喪失を決定することは、本明細書の他所で記載されるようにして決定することができる。例えば、Ｓｕｐｅｒ ＴＯＰＦｌａｓｈプラスミド（例えばＳｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈプラスミド、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２４５６）で一時的にトランスフェクトされた細胞、または安定してトランスフェクトされたＳｕｐｅｒ Ｔｏｐ Ｆｌａｓｈレポーター細胞株（例えばＨＥＫ２９３ＳＴＦ細胞株）は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＬＲＰ、ＧＰＲ１２４および／またはＲｅｃｋポリペプチドをコードするプラスミドと（コ）トランスフェクトでき、前記細胞中でのＷｎｔシグナル伝達活性を示すものとして、試験作用物質の添加に応答する細胞のルシフェラーゼ活性を決定するのに使用できる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法は、試験作用物質を、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を行うことができる細胞と接触させ、前記Ｗｎｔシグナル伝達を測定することと、試験作用物質を、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を行うことはできるが、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を行うことができない細胞と接触させ、前記Ｗｎｔシグナル伝達を測定することとを含む。
用語「接触させる」または「接触させること」は、本明細書で使用される場合、第１の構成要素が、可能な場合、第２の構成要素と結合するかまたはそれをモジュレートできる、または第２の構成要素が、可能な場合、第１の構成要素と結合するかまたはそれをモジュレートできるような方式で、１つまたは複数の第１の構成要素（例えば１つまたは複数の分子、生物学的な実体、細胞、または材料）を、１つまたは複数の第２の構成要素（例えば１つまたは複数の分子、生物学的な実体、細胞、または材料）と一緒にすることを意味する。このようなモジュレーションは、直接的に、すなわち、第１の構成要素と第２の構成要素との直接的な相互作用の方式か；または間接的に、例えば、第１の構成要素が１つまたは複数のさらなる構成要素と相互作用するかまたはそれをモジュレートする場合、順にそのうち１つまたは複数が第２の構成要素と相互作用するかまたはそれをモジュレートする方式、またはその逆の方式のいずれかで、起こり得る。用語「接触させる」は、文脈に応じて、「曝露する」、「インキュベートする」、「混合する」、「反応させる」、「処理する」などと同義の場合もある。
特定の実施形態において、試験作用物質は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことができる細胞と、および／または本明細書で教示される作用物質をコードする核酸、核酸を含む核酸発現カセットまたは核酸もしくは核酸発現カセットを含むベクターで前記細胞をトランスフェクトすることによって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことはできるが、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことはできない細胞と接触させてもよい。Ｗｎｔシグナル伝達を測定することは、典型的には、例えばＷｎｔ応答遺伝子の増加またはβ−カテニンの核局在化を検出することによって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化、好ましくは、本明細書の他所で記載される基準の、またはβ−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を決定することを意味する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を決定する別の方法は、当業界で公知のように、４細胞期の胚の１つの腹側割球に試験作用物質をマイクロインジェクションしたときのアフリカツメガエルの胚発生中における背側軸の重複の確立を研究することである。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を決定するさらに別の方法は、当業界で公知のように、１〜４細胞期の胚に試験作用物質をマイクロインジェクションしたときのゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）の胚発生中における前脳および目の構造の確立を研究することである。Ｗｎｔシグナル伝達活性のレベルは、ベースライン値と比較することができる。ベースライン値は、対照試料（例えば刺激されていない細胞集団または対照作用物質と接触させた細胞集団の試料）の値であり得る。
ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を行うことができる細胞は、典型的には、その原形質膜に、ＧＰＲ１２４、ＲＥＣＫ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、およびＬＲＰを含み、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の下流要素を含有する細胞である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を行うことはできるが、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達を行うことはできない細胞は、典型的には、その原形質膜にＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰを含み、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の下流要素を含有するが、その原形質膜にＧＰＲ１２４ポリペプチドおよび／またはＲＥＣＫポリペプチドを含まない細胞である。
ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によってＷｎｔシグナル伝達を媒介することができる細胞は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達に必要な全ての細胞構成要素を天然に発現する細胞、例えば脳内皮細胞または細胞株であり得る。ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によってＷｎｔシグナル伝達を媒介することができる細胞はまた、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達に必要な細胞構成要素を天然に発現しないかまたは全てを発現するわけではない細胞であってもよく、このような細胞は、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達に必要な細胞構成要素の喪失を補うために改変されていてもよく、例えば遺伝子操作されていてもよく、例えばヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。このような改変は、当業界において公知であり、その例としては、例えばＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫポリペプチドをコードする核酸での細胞のトランスフェクションが挙げられる。
本明細書の他所で記載されるように、受容体ポリペプチドの非存在、またはそれを含まないこと、またはそれを含有しないことは、この文脈において、それ自体は、細胞膜における前記受容体ポリペプチドの完全な非存在を指さないが、当業者公知のタンパク質アッセイによって検出できないか、またはその感度の範囲に満たない受容体ポリペプチドの量を指す場合もある。
予備的なスクリーニングは、ＲＥＣＫポリペプチド、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドおよび／またはＬＲＰポリペプチドに結合するその能力に関して試験作用物質をスクリーニングすることによって実行することができる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法は、試験作用物質がＲＥＣＫポリペプチドに結合することができるかどうかを決定すること、および適宜、試験作用物質がＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドおよび／またはＬＲＰポリペプチドに結合することができるかどうかを決定することを含む。
結合アッセイは、ＲＥＣＫポリペプチド、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドおよび／またはＬＲＰポリペプチドを試験作用物質と接触させること、および試験作用物質およびＲＥＣＫポリペプチド、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドおよび／またはＬＲＰポリペプチドにとって結合複合体を形成するのに十分な時間そのままにすることを含んでいてもよい。結合複合体の形成は、本明細書の他所で記載されるようにタンパク質−タンパク質結合を決定するための任意の確立された分析技術を使用して検出することができ、このような技術としては、共免疫沈降反応、二分子の蛍光補完、標識の移動、タンデム親和性精製、化学的な架橋および蛍光共鳴エネルギー移動などが挙げられる。タンパク質結合アッセイは、本明細書の他所で記載されるように、無細胞系もしくは細胞溶解産物において、または単離された細胞もしくは培養細胞において、または単離された組織もしくは培養された組織において実行することができる。
結合アッセイにおいて、作用物質、ＲＥＣＫポリペプチド、Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドおよび／またはＬＲＰポリペプチドの１つまたは複数は、標識に合体させてもよく、この場合、標識は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供することができる。このような標識またはシグナルの非限定的な例としては、放射性同位体、蛍光標識もしくはシグナル、化学発光標識もしくはシグナル、酵素、特異的な結合分子、または粒子（例えば磁気粒子）が挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法は、アッセイの効率を改善する、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進する、および／または非特異的な、またはバックグラウンドの相互作用を低減する１つまたは複数の試薬の使用をさらに含んでいてもよい。このような試薬の非限定的な例は、塩、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、および抗微生物剤である。
特定の実施形態において、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法は、試験作用物質を、１時間から４８時間、６時間から３６時間、１２時間から２４時間、０．５から１２０分、１から９０分、５から６０分、または１０から３０分、細胞と接触させることを含む。
特定の実施形態において、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法は、試験作用物質を、４℃から４０℃の温度で細胞と接触させることを含む。
ある特定の実施形態において、接触は、単離もしくは培養された細胞において、または単離もしくは培養された組織において実行することができる。用語「単離された」は、本明細書にわたり特定の構成要素を参照しながら使用される場合、一般的に、このような構成要素が、その天然環境の１つまたは複数の他の構成要素から、分離された状態で存在すること、例えば、それから分離されている、分離された状態で調製および／または維持されることを意味する。より特定には、用語「単離された」は、本明細書で細胞または組織に関して使用される場合、このような細胞または組織が動物またはヒトの体の一部を形成しないことを意味する。単離された細胞または組織は、好適には、インビトロで培養または繁殖させることができる。用語「培養する」または「細胞培養」は、当業界において一般的であり、概して、インビトロにおける細胞の維持および場合により細胞の拡張（増殖、繁殖）を指す。典型的には、動物細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞は、目的に十分な容器またはコンテナー（例えば、９６−、２４−、もしくは６−ウェルプレート、Ｔ−２５、Ｔ−７５、Ｔ−１５０もしくはＴ−２２５フラスコ、またはセルファクトリー）中で、当業界で公知のインビトロでの細胞培養を助長する条件で、例えば３７℃の温度、５％ｖ／ｖＣＯ２および＞９５％湿度で、それらを好適な細胞培養培地に曝露すること（すなわち、それらを接触させること）によって培養される。
用語「培地」は、本明細書で使用される場合、概して、細胞の維持を助長する、好ましくは細胞の増殖を助長する任意の細胞培養培地を包含する。培地は、典型的には、その簡単な操作（例えば、デカンテーション、ピペッティング、遠心分離、濾過など）を容易にする液体培養培地と予想される。
典型的には、培地は、当業界で公知の基礎培地配合物を含むと予想される。多くの基礎培地配合物（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣから；またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）を使用することができ、その例としては、これらに限定されないが、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ改変最小必須培地（アルファ−ＭＥＭ）、基礎必須培地（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ；ＢＭＥ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＢＧＪｂ培地、Ｆ−１２栄養混合物（Ｈａｍ）、ライボビッツＬ−１５、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、必須改変イーグル培地（ＥＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、１９９培地、ウェイマウスＭＢ７５２／１またはウィリアムス培地Ｅ、ならびにそれらの改変物および／または組合せが挙げられる。基礎培地の組成は、一般的に、当業界において公知であり、培養される細胞に応じて必要な培地および／または培地サプリメントの濃度を改変またはモジュレートすることは、当業者の能力の範囲である。
このような基礎培地配合物は、それ自体公知の哺乳類細胞の発達に必要な成分を含有する。例証のために、限定されないが、これらの成分としては、無機塩（特定には、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｃｌ、Ｐ、ならびに場合によってはＣｕ、Ｆｅ、ＳｅおよびＺｎを含有する塩）、生理学的な緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素塩）、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび／または核酸塩基、リボース、デオキシリボース、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤（例えば、グルタチオン）および炭素源（例えば、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）などを挙げることができる。
培養での使用のために、基礎培地に、１種または複数のさらなる構成要素を供給してもよい。例えば、追加のサプリメントは、細胞に最適な増殖および拡張のために必須の微量元素および物質を供給するのに使用することができる。さらに、抗酸化剤サプリメント、例えばβ−メルカプトエタノールが添加されてもよい。多くの基礎培地はすでにアミノ酸を含有するが、一部のアミノ酸は後で補充されてもよく、このようなアミノ酸は、例えば、溶液中にある場合安定性が低いことがわかっているＬ−グルタミンである。培地はさらに、抗生物質および／または抗真菌化合物、例えば、典型的にはペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物、および／または例示として、これらに限定されないが、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシン、およびゼオシンの他の化合物が供給されていてもよい。
脂質および脂質担体も、細胞培養培地に補充するのに使用することができる。このような脂質および担体としては、これらに限定されないが、なかでも、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミン共役リノール酸、アルブミン共役リノール酸およびオレイン酸、非共役リノール酸、アルブミン共役リノール酸−オレイン酸−アラキドン酸、アルブミン非共役およびアルブミン共役オレイン酸を挙げることができる。アルブミンは、脂肪酸非含有の配合物においても同様に使用することができる。
また、細胞培養培地への哺乳類血漿または血清の補充も予期される。血漿または血清はしばしば、細胞の生存および拡張を促進する細胞性の因子および構成要素を含有する。適宜、血漿または血清は、熱で不活性化されていてもよい。当業界において、熱不活性化は、主として補体を除去するために使用される。熱不活性化は、典型的には、血漿または血清を、一定に混合しながら、５６℃で３０から６０分、例えば３０分インキュベートすることを含み、その後、血漿または血清は、そのまま徐々に周囲温度に冷却させる。当業者は、上記の手順のあらゆる一般的な改変および必要条件を認識していると予想される。血漿または血清は、貯蔵または使用の前に滅菌されてもよい。通常の滅菌手段は、例えば、１μｍより小さい、好ましくは０．５μｍより小さい、例えば、０．４５μｍ、０．４０μｍ、０．３５μｍ、０．３０μｍまたは０．２５μｍより小さい、より好ましくは０．２μｍまたはそれより小さい、例えば、０．１５μｍまたはそれより小さい、０．１０μｍまたはそれより小さい孔サイズを有する１つまたは複数のフィルターを介した濾過を含んでいてもよい。本明細書で教示される培地での使用のための好適な血清または血漿は、ヒト血清もしくは血漿、または非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類（例えば、キツネザル、サル、類人猿）からの血清もしくは血漿、胎児もしくは成体のウシ、ウマ、ブタ、子ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウサギ、マウスもしくはラットの血清もしくは血漿など、またはこのようなものの任意の組合せを含んでいてもよい。ある特定の好ましい実施形態において、本明細書で教示される培地は、ウシ血清または血漿、好ましくはウシ胎児（子ウシ）血清または血漿、より好ましくはウシ胎児（子ウシ）血清（ＦＣＳまたはＦＢＳ）を含んでいてもよい。ヒト細胞を培養する場合、培地は、好ましくは、ヒト血清または血漿、例えば自家または同種異系のヒト血清または血漿、好ましくはヒト血清、例えば自家または同種異系のヒト血清、より好ましくは自家ヒト血清または血漿、さらにより好ましくは自家ヒト血清を含んでいてもよい。
ある特定の好ましい実施形態において、例えば無血清培地（すなわち、化学組成が既定の培地）を提供するために、培地中の血清または血漿は、血清代替物で代用することができる。無血清培地の提供は、特定には対象、特にヒト対象への培地またはそれらの画分の投与を目的とする場合（例えば、生物学的安全性の改善）、有利な場合がある。用語「血清代替物」は、概して、細胞培養培地中での動物血清の機能（例えば、細胞の維持および増殖を支持する機能）を代用するのに使用可能な任意の組成物を意味する。従来の血清代用物は、典型的には、ビタミン、アルブミン、脂質、アミノ酸、トランスフェリン、抗酸化剤、インスリンおよび微量元素を含み得る。多くの商品化された血清代用物添加剤、例えばノックアウト血清代用物（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＫＯＳＲ）、Ｎ２、Ｂ２７、インスリン−トランスフェリン−セレニウムサプリメント（ＩＴＳ）、およびＧ５が周知であり、当業者にとって容易に入手可能である。
血漿または血清または血清代用物は、約０．５％ｖ／ｖから約４０．０％ｖ／ｖ、好ましくは約５．０％ｖ／ｖから約２０．０％ｖ／ｖの間、例えば、約５．０％ｖ／ｖから約１５．０％ｖ／ｖの間、より好ましくは約８．０％ｖ／ｖから約１２．０％ｖ／ｖの間、例えば、約１０．０％ｖ／ｖの比率（血漿または血清または血清代用物の容積／培地の容積）で、本明細書で教示される培地中に含まれていてもよい。
好適な単離または培養された細胞は、限定されないが、細菌細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、または非ヒト哺乳類細胞などであり得る。動物細胞、例えば哺乳類細胞、ヒト細胞、または非ヒト哺乳類細胞が好ましい。細胞は、初代細胞、二代細胞、三代細胞などを含む場合もあるし、または細胞は、クローン細胞株を含む不死化細胞株を含む場合もある。細菌細胞の非限定的な例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。真菌細胞の非限定的な例としては、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが挙げられる。昆虫細胞の非限定的な例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来する細胞、例えばＳｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞、アワヨトウのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来する細胞株、例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞、またはイラクサギンウワバＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来する細胞、例えばＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞が挙げられる。ヒト細胞の非限定的な例としては、ヒトＨｅＬａ（子宮頸がん）細胞株が挙げられる。組織培養の実施において一般的な他のヒト細胞株としては、とりわけ、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ細胞）、ＤＵ１４５（前立腺がん）、Ｌｎｃａｐ（前立腺がん）、ＭＣＦ−７（乳がん）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳がん）、ＰＣ３（前立腺がん）、Ｔ４７Ｄ（乳がん）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（神経膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫）、またはＳａｏｓ−２細胞（骨がん）が挙げられる。霊長類細胞の非限定的な例は、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザルのＣｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓの腎臓上皮細胞株）細胞、およびＣＯＳ細胞である。げっ歯類細胞の非限定的な例は、ラットＧＨ３（下垂体腫瘍）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＰＣ１２（クロム親和性細胞腫）細胞株、またはマウスＭＣ３Ｔ３（胎児頭蓋冠）細胞株である。このような細胞は、様々な商業的な供給源および調査資源施設、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）などから得ることができる。
ある特定の実施形態において、細胞は、無傷の細胞膜を有していてもよい。他の実施形態において、細胞膜を透過化して（一時的にまたは永続的に）、無傷の細胞膜を通過して輸送されないかまたはそれほど効果的に輸送されない構成要素を、細胞膜を通過して拡散させることを可能にすることができる。細胞膜の透過化のために好適な界面活性剤としては、これらに限定されないが、サポニン（例えば、ジギトニン）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、またはポリソルベート２０が挙げられる。細胞は、生きた細胞、または生存可能な細胞、または生存可能ではない細胞であってもよい。
生存可能な細胞にポリペプチドおよび／または核酸を導入することための方法は当業者公知であり、その例としては、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エキソゾーム媒介性トランスフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を採用するトランスフェクション、核酸でコーティングされたタングステンマイクロプロジェクタイルによる細胞の衝撃、ウイルス粒子デリバリーなどを挙げることができる。このような導入はまた、デリバリー、トランスフェクションまたは形質転換と称される場合もある。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）もまた、細胞にポリペプチドまたは核酸をデリバリーするために採用される場合がある。ＣＰＰ転移は、３つの主要な侵入メカニズム、すなわち膜中への直接の透過、エンドサイトーシス媒介性の侵入、および一時的な構造の形成を介した転移に分類することができる。ＣＰＰは、典型的には、リシンまたはアルギニンなどの正電荷を有するアミノ酸の高い相対的な存在度を含有するか、または極性／荷電アミノ酸および非極性、疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかのアミノ酸組成を有する。これらの２つのタイプの構造は、それぞれポリカチオン性または両親媒性と称される。ＣＰＰの第３のクラスは、低い正味電荷を有する無極の残基のみを含有する疎水性ペプチドであるか、または細胞内取り込みに重要な疎水性アミノ酸基を有するものである。発見された初期のＣＰＰの１つは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）に由来するトランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）であり、これは、培養物中の多数の細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、多数の公知のＣＰＰをかなり発展させて、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体を生成した。ＣＰＰとしては、これらに限定されないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８−６０）、トランスポータン、および（Ｒ−ＡｈＸ−Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。ＵＳ８，３７２，９５１は、高度に細胞に透過する効率および低い毒性を呈示する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）に由来するＣＰＰを提供する。脊椎動物対象にＣＰＰをそのカーゴと共にデリバリーする態様も提供される。ＣＰＰおよびそれらのデリバリーのさらなる態様は、ＵＳ８，５７５，３０５；ＵＳ８，６１４，１９４およびＵＳ８，０４４，０１９に記載されている。ＣＰＰは、当業界で公知のカーゴと、例えば、チオエーテル結合を介して、または粒子の形成を介して、コンジュゲートまたは複合体化していてもよい。
目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする発現可能な核酸分子、例えば発現カセットまたは発現ベクターは、一般的に当業界において公知の通りに提供することができる。発現可能な核酸分子は、典型的には、目的のポリペプチドをコードする核酸分子および／または目的のＲＮＡ分子をコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子に作動可能に連結したプロモーターを含んでいてもよい。プロモーターは、目的の細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、または非ヒト哺乳類細胞中での目的のポリペプチドおよび／またはＲＮＡの発現が行われるように選択してもよく、またはそのように構成してもよい。
細胞は、細胞が培養されている培養培地に試験作用物質を添加することによって、試験作用物質と接触させてもよい。試験作用物質をコードする核酸は、当業者公知の条件下で、本明細書の他所で記載されるようにして、ベクター内に含まれた状態で細胞に提供することができる。代替として、試験作用物質をコードする核酸は、ウイルスベクターを介して細胞に提供することができ、すなわち細胞は、試験作用物質をコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させる。ウイルスベクターは、典型的には、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を生産する能力を喪失するように改変されている。特定の実施形態において、作用物質が、例えば本明細書の他所で記載されるようなアッセイで測定される場合、中立の物質または陰性対照により誘導された、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のベースラインまたはバックグラウンドと比較して、少なくとも１０倍高く、少なくとも２０倍高く、少なくとも３０倍高く、少なくとも４０倍高く、少なくとも５０倍高く、少なくとも１００倍高く、少なくとも２５０倍高く、少なくとも５００倍高く、少なくとも７５０倍高く、少なくとも１０００倍高く、少なくとも１×１０４倍高く、または少なくとも１×１０５倍高く、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体によって媒介されるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を強化する場合、その試験作用物質は、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質として同定することができる。
特定の実施形態において、作用物質により誘導されたＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性が、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下で前記作用物質により誘導されたＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達活性より、少なくとも３．５倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１５倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも２５倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも１００倍高い、少なくとも５００倍高い、少なくとも１０００倍高い、少なくとも１×１０４倍高い、または少なくとも１×１０５倍高い場合、その試験作用物質は、本明細書で開示される治療薬として有用な作用物質として同定することができる。
前述のスクリーニング方法のいずれかによって本明細書で開示される治療薬として有用であるとして最初に同定された試験作用物質をさらに試験して、ヒトにおける神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害を模倣するのに好適な動物モデルによって、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの見かけの活性を検証することができる。
本出願は、以下のステートメントに記載の態様および実施形態も提供する：
ステートメント１．Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＲ）１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない、作用物質。
ステートメント２．ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では細胞膜におけるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのヘテロマー形成（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導することができるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下での当該ヘテロマー形成を誘導することができない、ステートメント１に記載の作用物質。
ステートメント３．ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では細胞膜においてＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドに同時に結合することができるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下ではＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドに同時に結合することができない、ステートメント２に記載の作用物質。
ステートメント４．ＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる、ステートメント１から３のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント５．ＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる、ステートメント１から４のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント６．ＲＥＣＫポリペプチドのシステインノット４（ＣＫ４）領域、ＣＫ５領域、またはＣＫ４領域およびＣＫ５領域に結合することができる、ステートメント５に記載の作用物質。
ステートメント７．Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合することができる、ステートメント１から６のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント８．ＬＲＰポリペプチドのＤＫＫ結合性部位および／またはＷｎｔ結合性部位に結合することができる、ステートメント１から７のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント９．化学物質、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、タンパク質またはポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、シュピーゲルマーおよび核酸からなる群を含むかまたはそれから選択され、好ましくはタンパク質またはポリペプチドを含む、ステートメント１から８のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント１０．前記作用物質が、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインを含み、前記ＲＥＣＫ結合性ドメイン、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメイン、および前記ＬＲＰ結合性ドメインが、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドなどのＷｎｔ７ポリペプチドに由来する、ステートメント１から９のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント１１．前記ＲＥＣＫ結合性ドメインが、
−アミノ酸配列ＨＶＥＰＶＲＡＳＲＮＫＲＰＴＦＬＫＩＫＫＰＬＳＹＲＫＰＭＤＴＤＬＶＹＩＥＫＳＰＮＹＣ（配列番号１７）に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
−アミノ酸配列ＶＥＰＶＲＡＳＲＮＫＲＰＴＦＬＫＩＫＫＰＬＳＹＲＫＰＭＤＴ（配列番号１８）に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
−アミノ酸配列ＶＥＶＶＲＡＳＲＬＲＱＰＴＦＬＲＩＫＱＬＲＳＹＱＫＰＭＥＴ（配列番号１９）に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
−アミノ酸配列ＸＸＸＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＩＸＸＸＸＸＹＸＫＸＸＸＸ（配列番号２０）、ＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＩＸＸＸＸＸＹＸＫ（配列番号２１）、ＸＸＸＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＸＸＸＸ（配列番号２２）もしくはＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号２３）であって、Ｘが任意のアミノ酸であり、好ましくはアミノ酸配列が配列番号１８または配列番号１９のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を示す、アミノ酸配列
を含む、ステートメント１０に記載の作用物質。
ステートメント１２．Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドの断片などの、Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片であるかまたはそれから本質的になる、ステートメント１から１１のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント１３．前記断片が、Ｗｎｔ７ポリペプチドのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）であるかまたはそれから本質的になる、ステートメント１２に記載の作用物質。
ステートメント１４．Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドの変異体などの、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体である、ステートメント１から１３のいずれか１つに記載の作用物質。
ステートメント１５．− 配列番号２４または配列番号５１の１７位に対応する位置のグルタミン（Ｑ）残基が、グルタミン（Ｑ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２０位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２５位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基が、プロリン（Ｐ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２７位に対応する位置のアラニン（Ａ）残基が、アラニン（Ａ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２８位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の３３位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の３７位に対応する位置のメチオニン（Ｍ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の３９位に対応する位置のロイシン（Ｌ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の４１位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の４４位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基が、フェニルアラニン（Ｆ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の５０位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の５２位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）残基が、アスパラギン（Ｎ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはグルタミン（Ｑ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の６８位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基が、バリン（Ｖ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１２９位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１３１位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基が、フェニルアラニン（Ｆ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１３３位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１３５位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基が、フェニルアラニン（Ｆ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１４１位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１４６位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１５８位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１５９位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１８１位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１９１位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の１９８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２００位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２０５位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基が、バリン（Ｖ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２０８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２１４位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２１６位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２１８位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基が、プロリン（Ｐ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２２２位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２２３位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２２９位に対応する位置のチロシン（Ｙ）残基が、チロシン（Ｙ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２３２位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基が、プロリン（Ｐ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２３５位に対応する位置のトレオニン（Ｔ）残基が、トレオニン（Ｔ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２４８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２８９位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の２９１位に対応する位置のトリプトファン（Ｗ）残基が、トリプトファン（Ｗ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
− 配列番号２４または配列番号５１の３０７位に対応する位置のトレオニン（Ｔ）残基が、トレオニン（Ｔ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており、かつ／または
− 配列番号２４または配列番号５１の３１８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されている、
ステートメント１４に記載の作用物質。
ステートメント１６．ステートメント１から１５のいずれか１つに記載の作用物質をコードする核酸であって、前記作用物質が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、核酸。
ステートメント１７．プロモーターならびに／または転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルに作動可能に連結した、ステートメント１６に記載の核酸を含む核酸発現カセット。
ステートメント１８．ウイルスベクターなどの、ステートメント１６に記載の核酸またはステートメント１７に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
ステートメント１９．ステートメント１６に記載の核酸、ステートメント１７に記載の核酸発現カセットまたはステートメント１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
ステートメント２０．ステートメント１から１５のいずれか１つに記載の作用物質、ステートメント１６に記載の核酸、ステートメント１７に記載の核酸発現カセット、ステートメント１８に記載のベクターまたはステートメント１９に記載の宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
ステートメント２１．医薬として使用するための、ステートメント１から１５のいずれか１つに記載の作用物質、ステートメント１６に記載の核酸、ステートメント１７に記載の核酸発現カセット、ステートメント１８に記載のベクター、ステートメント１９に記載の宿主細胞、またはステートメント２０に記載の医薬組成物。
ステートメント２２．神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の予防または治療における使用のための、ステートメント１から１５のいずれか１つに記載の作用物質、ステートメント１６に記載の核酸、ステートメント１７に記載の核酸発現カセット、ステートメント１８に記載のベクター、ステートメント１９に記載の宿主細胞、またはステートメント２０に記載の医薬組成物。
ステートメント２３．前記神経血管障害が、虚血性脳卒中、出血性卒中、虚血／再灌流傷害、脳動脈瘤、動静脈奇形（ＡＶＭ）、海綿状血管奇形、血管炎、脳出血、くも膜下出血、脊髄血管奇形、頸動脈狭窄、もやもや病および頭蓋内アテローム性動脈硬化症、およびこれらの組合せからなる群から選択されるか、または、前記ＣＮＳ障害が、多発性硬化症、虚血性脳卒中、脳がん、てんかん、認知症、血管性認知症、ＨＩＶ−１関連認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、感染性脳疾患、外傷性脳損傷、片頭痛および慢性外傷性脳障害、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ステートメント２２に記載の使用のための作用物質。
ステートメント２４．例えば神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の予防または治療に有用なものなどの、治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法であって、試験作用物質が、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することを含む方法。
ステートメント２５．− 試験作用物質を、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことができる細胞と接触させ、前記Ｗｎｔシグナル伝達を測定すること、および
− 試験作用物質を、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことはできるがＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことができない細胞と接触させ、前記Ｗｎｔシグナル伝達を測定すること
を含む、ステートメント２４に記載のインビトロにおける方法。
ステートメント２６．試験作用物質がＲＥＣＫポリペプチドに結合することができるかどうかを決定することをさらに含む、ステートメント２４または２５に記載のインビトロにおける方法。
本発明を特定の実施形態と併せて記載しているが、前述の説明を踏まえて多くの代替、改変、および変形形態が当業者には明らかになろうことが明白である。したがって、本発明は、以下の通り添付の特許請求の範囲の主旨および広範囲にそのような代替、改変、および変形形態の全てを包含するものとする。
本明細書において開示されている本発明の態様および実施形態は、以下の非限定的な例によってさらに裏付けられる。
Ｗｎｔリガンドに特異的なシグナル伝達に関する分子メカニズム
１．材料および方法
１．１．ゼブラフィッシュの系統
１４時間明／１０時間暗のサイクルにおいて、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）を２８℃で維持した。胚を得て、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃａｌ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｗｅｌｆａｒｅのガイドライン（プロトコール承認番号：ＣＥＢＥＡ−ＩＢＭＭ−２０１７−２２：６５）に従って標準的条件下で育成した。Ｋｉｍｍｅｌら（C. B. Kimmel, W. W. Ballard, S. R. Kimmel, B. Ullmann, T. F. Schilling, Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995)）に従って段階分けを行った。特徴付けしたトランスジェニック系統および突然変異体系統のＴｇ（ｋｄｒｌ：ＧＦＰ）ｓ８４３、Ｔｇ（ｋｄｒｌ：ｒａｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ）ｓ８９６およびｇｐｒ１２４ｓ９８４（ゼブラフィッシュ）系統をこの研究において使用した（B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)；S.-W. Jin, D. Beis, T. Mitchell, J.-N. Chen, D. Y. R. Stainier, Development. 132, 5199-209 (2005)；N. C. Chi et al., Genes Dev. 22, 734-739 (2008)）。
１．２．モルフォリノ、ＲＮＡコンストラクトおよびマイクロインジェクション
ｇｐｒ１２４（５’−ＡＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡ−３’）に対するスプライスブロッキングモルフォリノ（B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)）を遺伝子ツール（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から得て、１細胞段階において、２ｎｇを注射した。ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ ＳＰ６ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してＮｏｔｌを消化した後、ｐＣＳ２プラスミドから合成ｍＲＮＡを転写し、１細胞段階のゼブラフィッシュの胚中に注射した。
１．４．発現プラスミドコンストラクト
Ｆｚ１（ａｄｄｇｅｎｅ 番号４２２５３）およびＦｚ５（ａｄｄｇｅｎｅ 番号４２２６７）を除いて、全てのＷｎｔシグナル伝達の構成成分および他のコンストラクトは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｔａｋａｒａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用する組換えの後に、ｐＣＳ２ベクターのＣＭＶプロモーターから発現した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングとタンデムに重複するＰＣＲ産物とを使用して、単一点突然変異の変異体、欠失体およびキメラを生成した。全てのコンストラクトをサンガーシーケンシングによって確認した。Ｒｅｃｋ変異体の欠失体は、以下のアミノ酸に対応する：ＲｅｃｋΔＣＫ１：４６〜９３；ＲｅｃｋΔＣＫ２：１１３〜１５０；ＲｅｃｋΔＣＫ３：１６０〜２０６；ＲｅｃｋΔＣＫ４：２２５〜２７２；ＲｅｃｋΔＣＫ５：３０１〜３４７；ＲｅｃｋΔＣＫ１−５：４６〜３４７；ＲｅｃｋΔＣＲＤ：３５２〜４８４およびＲｅｃｋΔＫＡＺＡＬ：６３６〜７９８。Ｒｅｃｋにおける残基２２、Ｇｐｒ１２４における残基４９およびＦｚ５における残基２２の後に、ＨＡタグを挿入した。ＦＬＡＧタグをＧｐｒ１２４における残基４９の後に挿入した。
１．５．細胞培養およびＨＥＫ２９３（Ｔ）突然変異体細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−３２１６）から入手し、ＨＥＫ２９３ ＳＴＦ細胞株は、Ｊｅｒｅｍｙ Ｎａｔｈａｎｓ（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ）によって好意により提供された。ＷＴおよび突然変異体の細胞を１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養し、５％のＣＯ２で平衡化した、加湿したインキュベーター内で維持した。ＨＥＫ２９３ ＳＴＦ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アプローチを使用してＧＰＲ１２４およびＲＥＣＫを遺伝的に無効化し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＦｚを同様に無効化した。http://crispr.mit.edu/のウェブサイトを使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイド配列を設計し、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２ＡＧＦＰ（F. A. Ran et al., Nat. Protoc. 8, 2281-308 (2013)）中にクローニングした。トランスフェクションの４８時間後に、ＧＦＰ＋細胞の上位１％をＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって単離し、クローン増殖のために９６ウェルプレート内に分配した。突然変異体細胞株の遺伝子の特徴付けを容易にするために、高解像度融解分析において複数のピークの誘導体融解曲線を生じるクローンを対抗選択した。各標的部位について、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に集中した約１０００ｂｐのＰＣＲ産物とｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）におけるＰＣＲ産物の少なくとも８つのサブクローンの両方のサンガーシーケンシングによって突然変異を特定した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される反復突然変異誘発によって突然変異体細胞株を得た。
１．６．ＳＴＦのデュアルルシフェラーゼアッセイ
細胞を９６ウェルプレート中にプレーティングし、２４時間後に三連でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によってトランスフェクトした。ウェル当たりのトランスフェクトされるプラスミドＤＮＡの量を各発現ベクターごとに最適化した：別段に指定されていなければ、ウミシイタケルシフェラーゼ（０．５ｎｇ）（Ｊｅｒｅｍｙ Ｎａｔｈａｎｓ（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ）によって好意により提供された）、Ｗｎｔリガンド（２０ｎｇ）、Ｆｚ受容体（５ｎｇ）、Ｌｒｐ（２．５ｎｇ）、Ｇｐｒ１２４（１０ｎｇ）、Ｒｅｃｋ（５ｎｇ）およびＤｋｋ−１（１０ｎｇ）。ＤＮＡの総量を空のｐＣＳ２ベクターを用いてウェル当たり１００ｎｇに調整した。ＳＴＦ細胞株を使用するか、または２０ｎｇのＭ５０ Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号１２４５６）を同時にトランスフェクトすることによって、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。パッシブライシスバッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）中で細胞を収集し、トランスフェクションの４８時間後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ系（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性を連続的に測定した。トランスフェクションの２４時間後に、９６ウェルプレート中９０％のコンフルエンシーで、１：１：１の混合物として細胞をプレーティングすることによって、図１Ｃの競合アッセイを実施した。共培養の２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
１．７．免疫蛍光アッセイおよび近接ライゲーションアッセイ
細胞をガラスコーティングチャンバー（ＩＢＩＤＩ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で成長させ、２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によりトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を室温（ＲＴ）で１０分間、４％のパラホルムアルデヒドにより固定した。免疫蛍光染色（ＩＦ）のために、ＲＴで１時間一次抗体に曝露する前に、細胞を１％のＢＳＡ−ＰＢＳ中で３０分間ブロッキングした。３回ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＲＴで１時間、二次抗体と共にインキュベートした。Ｗｎｔリガンドの抗Ｖ５染色のために、二次抗体溶液とのインキュベーションの前に、細胞を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で１０分間さらに洗浄した。近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のために、ＲＴで１時間一次抗体と共にインキュベートする前に、製造業者によって提供されたＢｌｏｃｋｉｎｇ溶液を用いて、細胞を３７℃で３０分間ブロックした。細胞を３回洗浄し、ＰＬＡプローブ抗ウサギＰＬＵＳと抗マウスＭＩＮＵＳと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＤｕｏｌｉｎｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＤｕｏｌｉｎｋ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ溶液と共に、３７℃で１００分間インキュベートした。以下の抗体を使用した：ＩＦとＰＬＡが１：５００のマウスモノクローナル抗Ｖ５（Ｒ９６０２５、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＩＦとＰＬＡが１：４００の精製したポリクローナルウサギ抗ＨＡ（Ｈ６９０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１：５０００の抗マウスＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに希釈したＨｏｅｃｈｓｔを用いて、細胞を２分間染色した。
１．８．ウエスタンブロッティング、ドットブロットおよび同時免疫沈降
以下の抗体を使用した：ウサギ抗ＤＬＶ２（１：１０００、３２１６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ウサギ抗ＤＬＶ２−ホスホＴ２２４（１：１０００、ａｂ１２４９４１、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）および抗マウスβーアクチン（１：５０，０００、Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：５０００、ＧＦＰ−１０１０、Ａｖｅｓ、Ｔｉｇａｒｄ、ＯＲ）およびマウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２（１：１０００、Ｆ１８０４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。ＢｉｏＤｏｔ ＳＦ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、標準的プロトコールに従い、ドットブロット分析を実施した。上清の連続希釈液をニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上にスポットした。乾燥後、ウエスタンブロットのために、膜を上記のように抗体と共にインキュベートした。同時免疫沈降のために、６ウェルプレートからのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰＢＳにより２回洗浄して、プレートから分離した。遠心分離によって細胞をペレット化させ、タンパク質阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有する溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％のＮＰ４０）中に、４℃で３０分間溶解させた。遠心分離後、上清を抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Ａ２２２０、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に、４℃で３時間インキュベートした。溶解緩衝液を用いて、ビーズを５回洗浄し、等量の２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ緩衝液中で沸騰させた。
１．９．顕微鏡および画像処理
細胞とゼブラフィッシュの胚をＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて画像化し、画像をＩｍａｇｅＪにおいて処理した。眼の融合表現型の画像をＬｅｉｃａ Ｍ１６５ ＦＣで撮影した。Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（ＢｉｔＰｌａｎｅ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、脳血管系の表示を作成した。ＰＬＡ陽性（ＰＬＡ＋）面積とＤＡＰＩ陽性（ＤＡＰＩ＋）面積のパーセンテージを、約５０〜１００個の細胞を含有する画像上でＩｍａｇｅＪを使用して計算した。固定閾値を手動で適用した後に、ＰＬＡ＋面積を測定した。Ｉｍａｇｅ Ｊにおいて「デフォルト」の閾値設定方法を適用した後、ＤＡＰＩ＋面積を測定した。
１．１０．構造のモデル化
アフリカツメガエルのＷｎｔ８ａ（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｆ０Ａ）の構造（C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64 (2012)）をＷｎｔ７ａに関する出発モデルとして使用した。プログラムＭｏｄｅｌｌｅｒ（B. Webb, A. Sali, Current Protocols in Bioinformatics (John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, 2016), vol. 54, p. 5.6.1-5.6.37.）を使用して、欠損している残基と置換基をモデル化した。モデル化戦略には、Ｗｎｔ８において観察したように、既存のジスルフィド架橋を説明することが含まれた。初期の最も良いモデルを真空でＣαを拘束した共役勾配エネルギー最小化に供し、次いで、２回目の最小化工程で解放した。次いで、これらのモデルを水のボックス中に埋め込み、１５０ｍＭのＮａ＋カウンターイオンを添加することによって、電気的中性を達成した。３０００工程において全系のエネルギーを再度最小化した。一定温度（３１０Ｋ）および一定圧力（１ａｔｍ）において、周期的境界を有し、力場としてＣＨＡＲＭＭ３６を使用する、プログラムＮＡＭＤ ２．７を用い、分子動力学シミュレーションを０．５ｎｓの間行った（J. C. Phillips et al., J. Comput. Chem. 26, 1781-1802 (2005)）。２ｆｓの時間工程を使用して、運動方程式を統合した。短い範囲の相互作用を１２Åで切断し、平滑粒子メッシュＥｗａｌｄ法を使用して、静電的相互作用を計算した。ＳＨＡＫＥアルゴリズムを使用して水素原子を拘束した。得られたモデルは、安定したシミュレーションの平均的代表例である。
１．１１．組換えタンパク質および合成ペプチド
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるトランスフェクションの７２時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物の上清から、Ｒｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃ融合タンパク質を無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中に回収した。採取後に、上清を遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）によって５０回濃縮するか、またはプロテインＧアフィニティー精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）にかけた。ＰＡＧＥ後にクマシーブルー染色を使用して、タンパク質の純度を評価した。合成Ｗｎｔリンカーペプチドを９０％を超える純度でＣｈｉｎａｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄから入手した。
１．１２．等温滴定熱量測定
Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩＴＣ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）においてＩＴＣ滴定を行った。測定前に、Ｒｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃと全てのＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃ融合体をＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、３００ｍＭのＮａＣｌ）に透析した。各事例において、タンパク質透析の最終工程から、Ｗｎｔ由来ペプチドを緩衝液を用いて調製した。熱量計で調査される前に、試料を濾過および脱気し、２５℃で滴定を実施した。全ての実験は、２μＬという一定用量の滴定液を７５ｒｐｍの撹拌速度で細胞（２００μＬ）中に注入することからなる。名目上の試料濃度は細胞中で２０μＭから４０μＭの間であり、シリンジ内で４００μＭから１．０ｍＭであった。実際の試料濃度は、透析または緩衝液交換の後に、２８０ｎｍでのそれらの吸収を測定することによって、またはＢＣＡ法によって決定した。ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ＩＴＣ ７．０、およびＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅソフトウェアパッケージを使用して、全てのデータを分析した。
１．１３．原子間力顕微鏡
薄金層でコーティングしたカバーガラスを紫外線照射およびオゾン（ＵＶ−Ｏ）クリーナー（Ｊｅｔｌｉｇｈｔ）中で１５分間清浄化し、次いで、１ｍＭの１６−メルカプトドデカヘキサン酸と１−メルカプト−１−ウンデカノール（１：９９の容積比）を含有するエタノール溶液中に一晩浸漬した。次いで、基質をエタノールで濯ぎ、Ｎ２で乾燥させ、等量の２０ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と５０ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ）を含有する溶液に３０分間添加した。得られたＮＨＳで活性化した表面を超純水で濯ぎ、１０μｇ／ｍｌのプロテインＧ溶液１００μｌで、ＲＴにて１時間インキュベートした。次いで、試料を洗浄緩衝液を用いて（３×５分）洗浄し、１００μｌのブロッキング緩衝液において、ＲＴで１時間さらにインキュベートした。最後に、０．２μｇ／ｍｌのＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃ溶液５０μｌを基質に１時間添加し、洗浄緩衝液で濯ぎ、次いで、ＡＦＭ実験に使用した。Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＶＩＩＩ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ＡＦＭ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して、単一分子力分光法（ＳＭＦＳ）の測定をＲＴにてＰＢＳ緩衝液中で実施した。窒化ケイ素チップと０．０１〜０．０６Ｎ／ｍの間の名目上のばね定数を有する三角のＡＦＭカンチレバー（ＭＳＣＴ、Ｂｒｕｋｅｒ）を使用した。Butt et al. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology 6, 1-7 (1995)に記載されているサーマルノイズ法を使用して、カンチレバーを各実験の終わりに較正した。Wildling et al., Probing binding pocket of serotonin transporter by single molecular force spectroscopy on living cells. J. Biol. Chem. 287, 105-113 (2012)に記載されているプロトコールに従って、機能化したチップをＮＨＳ−ＰＥＧ２７−マレイミドリンカーを使用して誘導体化し、Ｃ末端に付加したＰｅｐ７ｂが連結しているシステイン残基に共有結合させた。機能化後に、カンチレバーをＰＢＳで洗浄し（３×５分）、ＡＦＭ実験において使用するまで、４℃で、ウェル当たり２ｍｌのＰＢＳを含有するマルチウェルディッシュの個々のウェル中に保存した。２５０ｐＮの加力、０．２５秒の接触時間ならびに１μｍ／秒という一定の接近と引き離しの速度を使用して、力−距離曲線を１×１μｍ２の面積に対する３２×３２ピクセルアレイとして記録した。動的分子間力分光法による測定のために、カンチレバーの引き離し速度を以下のように変化させた：２０ｎｍ／秒、１００ｎｍ／秒、２００ｎｍ／秒、１μｍ／秒、２μｍ／秒、１０μｍ／秒および２０μｍ／秒。典型的には、少なくとも２０００の力−距離曲線を、特定の引き離し速度で、各カンチレバーごとに実施した。採取したデータをＮａｎｏｓｃｏｐｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して分析した。各曲線の引き離しセグメントを分析し、非結合事象が接触点から５〜５０ｎｍの間の距離で起こった場合、それらを特異的であると考えた。最小接着力をさらに使用して、結合の確率と構築力分布のヒストグラムを計算した。測定した相互作用のエネルギー地形を再構築するために、チップカンチレバーが表面に降下を開始する前の接着事象の傾きとして、負荷速度を力対時間曲線から計算した。次いで、負荷速度に関する力の依存度を動的分子間力分光法プロットにおいてプロットした。
１．１４．統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して統計分析を実施した。データは平均±ＳＤで表す。正規分布に従うデータ（ＳＴＦアッセイおよびＰＬＡアッセイ）の多重比較および単一比較に関する一元ＡＮＯＶＡ（ポストホックダネット検定）およびスチューデントのｔ検定によって、ならびに非正規分布に従うデータ（ＣｔＡの定量）の多重比較に関するＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ（ポストホックダネット検定）によって、ｐ値を計算した；＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
２．結果
２．１．Ｒｅｃｋは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄに依存しないＷｎｔ７特異的受容体である。
Ｗｎｔ／Ｆｚ結合の関係は乱雑であり、複数のＷｎｔが単一のＷｎｔに対して応答することが可能な個々のＦｚおよびいくつかのＦｚに対する結合に関して競合している。最近の結晶学の研究によって、Ｗｎｔ／Ｆｚ相互作用の化学が、明確なＷｎｔとＦｚの対合と不適合であり、Ｗｎｔ／Ｆｚの接触は、保存された残基または同一の化学修飾によって支配されることが確認された（C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64 (2012)）。これらの観察によって、細胞が、対抗する生物学的機能を有することがある複数のＷｎｔリガンドの空間的かつ時間的な重複する発現パターンを解釈する方法についての疑問が生じる。
関連する例は、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ｂによる哺乳動物の前脳および腹側の脊髄の血管系の発生の排他的制御である（J. M. Stenman et al., Science. 322, 1247-1250 (2008)；R. Daneman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 641-646 (2009)；S. Liebner et al., J. Cell Biol. 183, 409-417 (2008)）。具体的には、神経前駆細胞由来Ｗｎｔ７に応答し、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達を活性化するために、大脳内皮細胞（ＥＣ）は、Ｇタンパク質共役受容体の接着分類のオーファンメンバーであるＧｐｒ１２４（M. Cullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5759-5764 (2011)；F. Kuhnert et al., Science. 330, 985-989 (2010)；K. D. Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 2807-2812 (2011)；Y. Zhou, J. Nathans, Dev. Cell. 31, 248-256 (2014)；E. Posokhova et al., Cell Rep. 10, 123-130 (2015)；B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)）およびＧＰＩアンカー型糖タンパク質であるＲｅｃｋ（B. Vanhollebeke et al., 2015；F. Ulrich et al., Development. 143, 147-159 (2015)）を発現しなければならない。Ｇｐｒ１２４とＲｅｃｋは物理的に相互作用し、Ｗｎｔ７に特異的な応答を相乗的に刺激するが（B. Vanhollebeke et al., 2015；C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056-1073 (2017)）、このシグナル伝達モジュールが、他の、局所的に発現したＷｎｔリガンドとＷｎｔ７を識別可能にする方法は知られていない。
脊椎動物細胞においてＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体とそれらのＬｒｐ５／６共受容体の偏在する発現によって本質的に複雑化した問題である、このシグナル伝達モジュール内でＷｎｔ７が特異的に認識される方法を決定した。したがって、定義した結節における受容体複合体構成成分の遺伝的に枯渇した細胞株の第１のセットを、ＨＥＫ２９３細胞における多重化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による突然変異誘発によって、（ｉ）１０個全てのＦｚ遺伝子（ＦＺ１〜１０ −／−）、（ｉｉ）ＬＲＰ５およびＬＲＰ６（ＬＲＰ５−／−；ＬＲＰ６−／−）または（ｉｉｉ）ＧＰＲ１２４およびＲＥＣＫ（ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−）を標的とすることによって生成した。Ｗｎｔ７結合の決定基を特定するために、これらの細胞株中でＶ５でタグ付けしたＷｎｔリガンドを一過性に発現させた。Ｗｎｔ３ａ−Ｖ５を除くＷｎｔ７ａ−Ｖ５は、ＷＴ、ＦＺ１〜１０ −／−およびＬＲＰ５−／−；ＬＲＰ６−／−細胞の原形質膜において免疫検出することができたが、ＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／−細胞の原形質膜においては免疫検出することができなかった（図１Ａ）。単独またはＧｐｒ１２４と組み合わせたＲｅｃｋ発現の異所性復元は、これらの細胞におけるＷｎｔ７ａーＶ５膜の標識を特異的に復元するために十分であったが、Ｇｐｒ１２４発現単独では十分ではなかった（図１Ｂ）。期待されたように、このＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体がベースラインのＷｎｔ７のシグナル伝達を媒介する適格性を反映して、Ｆｚ５はＷｎｔ７ａ−Ｖ５結合に関して適格であった。
細胞競合実験を使用して、Ｒｅｃｋを異所的に発現するがＧｐｒ１２４ΔＩＣＤを異所的に発現しないＦＺ１〜１０ −／−細胞の共培養によって、隣接するＧＰＲ１２４−／−；ＲＥＣＫ−／− Ｓｕｐｅｒ Ｔｏｐ Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）受容体細胞におけるＷｎｔ７ａ−Ｆｚ５シグナル伝達が大幅に低減され得るため、Ｆｚの非存在下で、ＲｅｃｋがＷｎｔ７ａを動員することが見出された（図１Ｃ）。注目に値するのは、このリガンド捕捉アッセイにおいて、Ｇｐｒ１２４は、そのＣ末端のＩＣＤドメインを欠いており、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ複合体の表面に曝露された部分に対する分析が限定される。次に、ＰＬＡを使用して、Ｗｎｔ７ａ結合に必要とされるＲｅｃｋのドメインをマッピングした。Ｒｅｃｋは、５つのＮ末端のシステイン−ノット（ＣＫ）モチーフ、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）およびＧＰＩアンカー部位の前にあるＥＧＦ様モチーフが散在した３つのＫａｚａｌモチーフから構成される。ＨＡエピトープでタグ付けした欠失変異体のコレクションをＲｅｃｋの各ドメインについて作成し、ＰＬＡシグナルを定量した。この分析によって、Ｎ末端のシステイン−ノットドメイン、より詳細にはＣＫ４およびＣＫ５が結合に必要とされることが明らかとなった（図１Ｄ）。これらの結果と一致して、ＲｅｃｋΔＣＫ４の発現も競合アッセイにおいて不活性であった（図１Ｃ）。
Ｒｅｃｋは、Ｗｎｔ７結合性の主要決定因子であると考えられるが、Ｗｎｔシグナル伝達におけるその機能は、そのＮ末端のＣＫドメインを介してＧｐｒ１２４と複合体を形成する能力に依拠することが知られており（Y. Zhou, J. Nathans, Dev. Cell. 31, 248-256 (2014)；B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)）、このドメインは、Ｗｎｔ７ａの結合にさらに関係することが本明細書において示されている。ＨＡ−ＲｅｃｋおよびＨＡ−Ｆｚ５と対照的に、ＨＡ−Ｇｐｒ１２４は、Ｗｎｔ７ａ−Ｖ５と共に発現した場合にＰＬＡシグナルを生じない（図１Ｅ）。しかし、タグ付けされていないＧｐｒ１２４の同時発現の際に、Ｗｎｔ７ａ−Ｖ５／ＨＡ−Ｒｅｃｋ ＰＬＡシグナルの４倍の増加が検出された（図１Ｆ）。Ｇｐｒ１２４によるこの結合刺激は、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ複合体の形成におけるＮ末端のＣＫ１モチーフの役割と一致して、ＲｅｃｋのＣＫ１およびＣＫ２に依存した（C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056-1073 (2017)）。
まとめると、拡散性細胞外リガンドとその膜受容体の間の直接的相互作用に関する妥当な代理としてＰＬＡが作用するという暗黙の仮定に関して、これらの結果は、Ｒｅｃｋが最初に報告されたＦｚに依存しないＷｎｔリガンドに特異的な受容体を構成し、Ｗｎｔ７に対するその結合がＣＫドメイン内のＧｐｒ１２４の近位の結合によって強化されることを示唆する（図１Ｇ）。
２．２．Ｗｎｔ７の認識は、非常に多岐にわたり、かつ内因的なＷｎｔリガンドの無秩序リンカー領域に関与する
Ｗｎｔリガンドは、高レベルの組換え体産生に対して悪名高く抵抗性であり、全長組換えＷｎｔ７とＲｅｃｋの間の無細胞生化学的または生物物理学的相互作用の研究を妨げる。
Ｗｎｔリガンドは、リガンドのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）のパルミトイル化した「サム」と「インデックス」のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の疎水性残基によって、球状のＦｚシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）をヒトの手でつまむことを連想させる２つのドメイン構造を採用する。Ｆｚ結合に関与する構造は、「サム」と「インデックス」の末端に主に位置する。２つのドメインは、ＮＴＤの可撓性ドメイン内リンカー領域を介して接続されている。
特異的ドメインまたは残基に関して欠失したか、または他のＷｎｔリガンドから選択されたドメインを有するように操作された（図２Ａ）Ｗｎｔ７変異体のコレクションを作成した。これらのキメラリガンドはそれぞれＰＬＡに適用され、Ｒｅｃｋの結合がＷｎｔ７ａ ＮＴＤにおいて排他的に起こることが明らかとなった。際立ったことに、Ｗｎｔ７ａＮＴＤは単独で、全長Ｗｎｔ７ａと同程度に強力にＲｅｃｋに結合したが、Ｗｎｔ７ａＣＴＤは結合しなかった（図２Ｂ）。Ｆｚ結合に関係するパルミトレイン酸は、セリン２０６においてパルミトイル化されることが不可能な突然変異体Ｗｎｔ７ａＳ２０６ＡがＲｅｃｋに有効に効率的に結合するため、Ｒｅｃｋの相互作用に関与しなかった。ＲｅｃｋによるＷｎｔ７ａのＮＴＤ認識方式を、ＣＴＤがアフリカツメガエルのＷｎｔ８ａ（ＸＷｎｔ８ａ）ならびにマウスのＷｎｔ４およびＷｎｔ１６の同等のドメインと交換されたキメラＷｎｔ７ａリガンドによって確認した。これらの結合アッセイによって、Ｒｅｃｋが、Ｆｚによって繋がったリガンドと異なる部位において、Ｗｎｔ７ａ ＮＴＤに埋め込まれたモチーフを認識することによってＷｎｔリガンドを識別することが明らかになる。
リンカー領域を欠くより小さなＮＴＤ変異体である、Ｗｎｔ７ａ１〜２１２およびＷｎｔ７１〜２３７は、Ｒｅｃｋに結合しなかった。Ｆｚ結合部位から離れたＷｎｔ７ａリンカー領域の空間的な分離と組み合わせたこの突然変異分析は、Ｒｅｃｋによって、このリンカーモチーフを介して、少なくとも部分的にＷｎｔ７ａが解読されることを示唆する。Ｗｎｔリガンドファミリーにわたって最も可変性のモチーフであるリンカー領域は、脊椎動物クレード全体にわたって、Ｗｎｔ７オルソログの中でも強力な進化的保存を呈する（図２Ｄ）。相互作用部位を正確にマッピングするために、本発明者らは、Ｗｎｔ７ａの１０１個の単一残基変異体のコレクションのＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存するＳＴＦシグナル伝達を分析した（図２Ｃ）。突然変異した残基は、Ｗｎｔ７ａとＷｎｔ７ｂの間に厳密にまたは化学的に保存されているが、ＸＷｎｔ８ａにも他のＷｎｔリガンドのいずれにも見られなかった、表面に曝露されたＮＴＤ残基に対応した。図２Ｃに示されているように、調査した変異体の約８０％がＷＴ Ｗｎｔ７ａと同程度に活性であったが、８つのＷｎｔ７ａ変異体（下線を付した）のみが１０％未満までＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋに依存するシグナル伝達を低減させた。１つ（Ｉ３７）を除いて全ての重要な残基が、予測したＷｎｔ７ａ構造の上部または背面にクラスター化し、６つをリンカードメインにさらにマッピングした。全ての重要な残基は、ヒトから魚へのＷｎｔ７オルソログの中で厳密に保存され、Ｗｎｔ３ａを含むいずれの他のＷｎｔにも存在しなかった（図２Ｄ）。本発明者らは、Ｗｎｔ７のリンカー変異体の不活性が、Ｌｒｐ５／６、Ｒｅｃｋ、または両方への結合不良から生じ得るかどうかをさらに調査した。Ｒｅｃｋ結合における機能に則して、リンカー領域内での、Ｗｎｔ７ａ４Ａ、すなわち、Ｗｎｔ７ａの４つの残基変異体（Ｖ２４１Ａ、Ｆ２５１Ａ、Ｌ２５２Ａ、Ｋ２６２Ａ；ここで、置換は、ｍＷｎｔ７ａの前駆体ポリペプチドにおけるアミノ酸位置を示す）によって、ＷＴ Ｗｎｔ７ａのものと比較して、Ｒｅｃｋ ＰＬＡシグナルが低減したことが示された。わずかに改善された分泌速度にもかかわらず、このような活性の低下が生じた（図２Ｅ）。
無細胞系におけるＲｅｃｋ−Ｗｎｔ７の結合を調査するために、高度に純粋なＲｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃ融合タンパク質（およびその変異体、すなわち、ＨＡ−Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ１−Ｆｃ、ＨＡ−Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ２−Ｆｃ；ＨＡ−Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ３−Ｆｃ；ＨＡ−Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ４−Ｆｃ；およびＨＡ−Ｒｅｃｋ−ＣＫΔＣＫ５−Ｆｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清から回収し、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって、精製した２９アミノ酸長の合成Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ｂリンカーペプチド（ｐＷｎｔ７ａおよびｐＷｎｔ７ｂ）で滴定した。ＩＴＣによって、ｐＷｎｔ７ａとｐＷｎｔ７ｂが、それぞれ、７μＭと１．２μＭの親和性で、Ｒｅｃｋに直接結合することを確認した（図２Ｆ）。対照として、Ｗｎｔ７ａ４Ａに対応する合成ペプチド（ｐＷｎｔ７ａ４Ａ）およびＷｎｔ３ａの同等のリンカーペプチド（ｐＷｎｔ３ａ）は、Ｒｅｃｋ−ＣＫ−Ｆｃに対する結合を示さなかった。ｐＷｎｔ７ｂの結合にはＲｅｃｋ ＣＫ４およびＣＫ５が必要とされたが、ＣＫ１、ＣＫ２およびＣＫ３は必要とされず、培養細胞におけるＰＬＡの結果を顕著にミラーリングした。ＩＴＣ分析によって得られた結果を確証するために、本発明者らは、単一分子力分光法（ＳＭＦＳ）を使用して、単一分子レベルでの結合親和性を測定した（図２Ｇ）。ｐＷｎｔ７ｂのＲｅｃｈ−ＣＫ−Ｆｃへの結合は、測定した５μＭの解離定数（ＫＤ）に関して検出可能であった。２つの技法の間の根本的な差異にもかかわらず、ＩＴＣとＳＭＦＳは、したがって、測定した結合親和性の値の間に近い一致をもたらした。
全体的に、これらのデータは、「シグネチャー」リンカーモチーフを介して、少なくとも部分的に、Ｗｎｔ７がＲｅｃｋによって認識されることを実証する。しかし、Ｒｅｃｋに結合したＷｎｔ７は、細胞が増強したＷｎｔ７特異的細胞応答を呈するために、効率的なシグナルの活性化および形質導入の機構へと機能的に統合されなければならない。
２．３．Ｇｐｒ１２４は、Ｗｎｔ７のシグナル伝達および脳の血管新生の間にＧＰＣＲを形質導入する古典的なシグナルとして作用しない
Ｒｅｃｋ自体は、原形質膜の唯一の外部のリーフレットに対するそのＧＰＩアンカー方式のために、膜二重層にわたってＷｎｔ７シグナルを変換する可能性が限定されており、したがって、シグナル変換は、受容体複合体の他の構成成分、すなわち、Ｇｐｒ１２４および／またはＦｚ／Ｌｒｐ５／６に依拠しなければならない。
このシグナル変換機序を明らかにするために、Ｇｐｒ１２４およびＦｚ／Ｌｒｐ５／６の複合体の間の機能的関係を培養した細胞内で評価した。「Ｆｚを含まない」および「Ｌｒｐ５／６を含まない」細胞を使用して、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋの機能が、ＦｚおよびＬｒｐ５／６の機能に著しく依拠することが遺伝的に確立された（図３Ａ〜Ｅ）。これらの各ＣＲＤおよびＤＫＫ−１感受性Ｗｎｔリガンド結合ドメインがシグナル伝達に対して必須であり、Ｗｎｔ７が古典的方式でＦｚ／Ｌｒｐ５／６に結合し、これを活性化することを伴うことがさらに確立された。
ゼブラフィッシュのＣＮＳの血管系の発生は、容易に定量され得る血管新生の出芽のプロセスにおいて、Ｒｅｃｋ／Ｇｐｒ１２４シグナル伝達に著しく依拠することが示されている。したがって、これは、生理学的なＷｎｔ７のインプットレベルに応答して、インビボで構造−機能分析を実施するための最良の設定を構成する（B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)；N. Bostaille, A. Gauquier, L. Twyffels, B. Vanhollebeke, Biol. Open. 5, 1874-1881 (2016)）。１細胞段階のＷＴまたはｇｐｒ１２４−／−の胚において合成ｍＲＮＡの注射を使用して、本発明者らは、Ｎ末端の細胞外部分（Ｇｐｒ１２４ΔＥＣＤ）、７つのスパン部分（Ｇｐｒ１２４ΔＴＭ２〜７）またはＣ末端の細胞質内での延長（Ｇｐｒ１２４ΔＩＣＤ）を欠く３つのＧｐｒ１２４変異体（図４Ａ）の活性を評価することによって開始した。Ｇｐｒ１２４ΔＥＣＤおよびＧｐｒ１２４ΔＩＣＤの異所的な発現は、ｇｐｒ１２４突然変異体における脳の血管新生を復元しなかったが、インビボでの脳の血管新生（図４Ｂ、Ｃ）およびインビトロでのＳＴＦアッセイにおけるＷｎｔの活性（図４Ｄ）を誘発するために、Ｇｐｒ１２４ΔＴＭ２〜７活性は十分であった。
このようなＧｐｒ１２４ΔＴＭ２〜７の競合の保持は予期されなかった：Ｇｐｒ１２４は、操作されたＧｐｒ１２４ΔＴＭ２〜７突然変異体タンパク質には存在しない７つの膜貫通型スパンのリガンドに誘導される立体構造のリモデリングによって細胞内で細胞外刺激を古典的に中継する受容体スーパーファミリーであるＧＰＣＲである。これらの結果に基づき、Ｇｐｒ１２４は、膜を通るシグナル変換を必要としないため、Ｗｎｔ７シグナル伝達を促進する場合、古典的ＧＰＣＲとして作用しなくてもよいようである。
代わりに、Ｇｐｒ１２４は、その活性がＲｅｃｋに結合する細胞外ドメイン（ＥＤＣ）と立体構造的に連結していない細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に依拠するシグナル伝達欠損膜貫通型タンパク質として、このモジュールにおいて表面的に作用する。本発明者らは、Ｇｐｒ１２４のＩＣＤが、Ｆｚと相互作用するＷｎｔシグナル伝達の重要なエフェクターであるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄを介して作動すると仮定した。この「Ｄｖｌ仮定」は、Ｇｐｒ１２４に密接に関連する接着ＧＰＣＲであるＧｐｒ１２５が、そのＣ末端のＩＣＤドメインを介してＤｖｌと物理的に相互作用することが示され（X. Li et al., Development. 140, 3028-3039 (2013)）およびＧｐｒ１２４のＩＣＤがＧｐｒ１２５のＩＣＤと置き換えられたＧｐｒ１２４／１２５ハイブリッドが、ゼブラフィッシュにおける脳の血管新生を促進することができる（B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)）という知見を根拠とする（図４Ｅを参照のこと）。同様に、Ｇｐｒ１２４のＩＣＤが、Ｄｖｌに結合することが知られているＦｚ２のＩＣＤと置き換えられたＧｐｒ１２４／Ｆｚ２ハイブリッド（Ｇｐｒ１２４ＩＣＤＦｚ２）が適格であった。対照的に、全長Ｆｚ２は適格ではなかった。注目すべきことに、Ｇｐｒ１２４ＩＣＤＦｚ２の活性は、Ｆｚ２のＩＣＤ内のＤｖｌ結合部位であるＫＴｘｘＷおよびＥＴＴＶモチーフに依存した（図４Ｅ）。
２．４．ＤｖｌポリマーはＦｚとＧｐｒ１２４を連結することによってリガンド特異的Ｗｎｔシグナロソームをアセンブルする
ＦＺ１〜１０ −／− ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｎ末端をＦＬＡＧでタグ付けしたＧｐｒ１２４とＤｖｌ−ＧＦＰの間で実施した同時免疫沈降実験によって、Ｃ末端のＥＴＴＶの非存在下でも、Ｇｐｒ１２４とＤｖｌの間での相互作用が確認された（図５Ａ）。Ｆｚと異なり、Ｇｐｒ１２４は、β−カテニン安定化の上流のＷｎｔシグナル伝達活性化の早期指標である、リン酸化Ｄｖｌレベルにおいて検出可能な増加を得なかった（S. I. Yanagawa, F. Van Leeuwen, A. Wodarz, J. Klingensmith, R. Nusse, Genes Dev. 9, 1087-1095 (1995)；X. Huang et al., Science. 339, 1441-1445 (2013)）（図５Ｂ）。このようなＧｐｒ１２４に誘導されるＤｖｌ活性化の非存在は、シグナル伝達欠損タンパク質としてＧｐｒ１２４を特定した図４の実験と一致した。まとめると、これらの実験は、そのＷｎｔ７シグナル伝達活性を媒介することができる構成的なＧｐｒ１２４の結合パートナーとしてＤｖｌを特定する。
Ｇｐｒ１２４、ＲｅｃｋおよびＦｚ／Ｌｒｐ５／６は、培養された細胞内でより高次の受容体複合体を形成することが提案されている（C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056-1073 (2017)）。本発明者らは、Ｇｐｒ１２４のＩＣＤはＤｖｌを介してこの複合体をアセンブルすると推論した。Ｄｖｌ分子は、Ｎ末端のＤｉｘドメインのヘッドトゥーテールの自己アセンブリーによる動的重合によって、シグナロソームを実際にアセンブルする。これらの自己結合により、キナーゼおよび細胞内機構の構成成分を含む、様々な細胞質内のＷｎｔシグナル伝達調節タンパク質の局所的濃縮が可能となる（M. Gammons, M. Bienz, Curr. Opin. Cell Biol. 51, 42-49 (2018)、M. Bienz, Trends Biochem. Sci. 39, 487-495 (2014)）。Ｄｖｌは、Ｇｐｒ１２４とＦｚの両方と物理的に相互作用するため、Ｇｐｒ１２４と関連するＲｅｃｋに結合したＷｎｔ７は、したがって、動的なＷｎｔシグナロソームにトラップされ、それによって、Ｆｚシグナル伝達に利用可能なＷｎｔ７リガンドの局所濃度を増加させる。
Ｗｎｔシグナロソームは、原形質膜においてまたは原形質膜の下で形成するＤｖｌにおいて濃縮された大きな点状構造として、光学顕微鏡によって容易に検出される（M. Bienz, Trends Biochem. Sci. 39, 487-495 (2014)；J. Bilic et al., Science. 316, 1619-1622 (2007)；M. V. Gammons, M. Renko, C. M. Johnson, T. J. Rutherford, M. Bienz, Mol. Cell. 64, 92-104 (2016)）。ＦｚおよびＧｐｒ１２４が、Ｄｖｌに依存して、Ｗｎｔシグナロソーム内で同時に分散するかどうかを決定するために、個々に発現したＦｚ−ＧＦＰおよびＧｐｒ１２４−ｔａｇＲＦＰの局在化を胞胚の深層（ＤＥＬ）細胞において最初に検査した。Ｆｚ４は原形質膜周辺全体を装飾したが、代わりに、Ｇｐｒ１２４−ｔａｇＲＦＰは細胞接触時に蓄積した。この差示的な膜局在化は、Ｄｖｌ発現の際に保持された（図５Ｃ）。これらのＤｖｌ結合能と一致して、両受容体はＤｖｌをそれらの各膜コンパートメントに動員した（図５Ｄ）。しかし、Ｇｐｒ１２４−ｔａｇＲＦＰとＦｚ４−ＧＦＰが同時に発現された場合、Ｇｐｒ１２４−ｔａｇＲＦＰは、細胞内接合部にアンカーされたままであったが、Ｆｚ４−ＧＦＰは、Ｄｖｌに依存して、Ｇｐｒ１２４膜のサブドメインに量的に再度局在化し（図５Ｅ）、ここで、タンパク質は、ＥＶＬ細胞膜で特に明白なＷｎｔシグナロソームを連想させる点状構造で共存した（図５Ｆ）。本発明者らは、ＤＥＬ細胞におけるＤｖｌに依存するＦｚ／Ｇｐｒ１２４相互作用を試験するためのアッセイとして、生体分子蛍光補完性を使用した。Ｇｐｒ１２４−ＶＮ１５５（Ｉ１５２Ｌ）とＦｚ１−ＶＣ１５５を同時に注射することにより、実際に、Ｄｖｌに依存して明るい接合部シグナルが生じ（図５Ｇ）、ＦｚとＧｐｒ１２４が、Ｄｖｌ足場タンパク質を介して間接的に相互作用することが実証された。これによって、Ｗｎｔリガンド識別能を与えられたＷｎｔシグナロソーム内で、関連するＲｅｃｋに結合したＷｎｔ７とのＦｚ／Ｌｒｐ５／６およびＧｐｒ１２４の空間的クラスター形成に関する分子機序が与えられ、それによって、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ陽性細胞のＷｎｔ７特異的応答が説明される（最終モデル、図６を参照のこと）。
まとめると、この研究によって、脊椎動物の細胞のＷｎｔ解読能に最初の構造的かつ機構的洞察がもたらされる。それは、進化的に拘束されたＷｎｔ構造が、これまで、Ｎｏｒｒｉｎのような構造的に無関係なＦｒｉｚｚｌｅｄリガンドを必要とすると考えられていた特性である、リガンド特異的細胞応答を可能とするのに十分な多様性と固有の柔軟性を保持したことも実証する（M. B. Lai et al., Cell Rep. 19, 2809-2822 (2017)）。Ｗｎｔの進化および機能に関するこれらの構造上の洞察は、追加のＷｎｔ解読モジュールが存在し、他のＷｎｔまたはＦｚファミリーのメンバーに応答した細胞挙動の微調整を可能とすることを直ちに示唆する。
ＲｅｃｋによるＷｎｔ７の分子認識によりＷｎｔ／Ｆｚ相互作用の要件を最小化する
１．材料および方法
１．１．ゼブラフィッシュの系統
Ｓｔａｔｅ ｏｆ Ｂｅｌｇｉｕｍ（プロトコール承認番号：ＣＥＢＥＡ−ＩＢＭＭ−２０１７−２２：６５）の規則に従って、標準的な条件下で、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）を育成し取り扱った。以下の系統を使用した：Ｔｇ（−１７．０ｎｅｕｒｏｇ１：ＥＧＦＰ）ｗ６１（McGraw et al., J. Neurosci 28(47):12558-69 (2008)）。
１．２．モルフォリノ、ＲＮＡコンストラクトおよびマイクロインジェクション
以下のスプライスブロッキングモルフォリノ（ＭＯ）（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を１細胞段階において、胚に注射した：ｗｎｔ７ａａ（ＴＴＣＣＡＴＴＴＧＡＣＣＣＴＡＣＴＴＡＣＣＣＡＡＴ、６ｎｇ）。ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ ＳＰ６ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してＮｏｔｌを消化した後、ｐＣＳ２プラスミドから合成ｍＲＮＡを転写し、１細胞段階のゼブラフィッシュの胚中に注射した。アフリカツメガエルのマイクロインジェクションでは、１５ｐｇのｗｎｔ７ａまたはｗｎｔ７ａＫ１９０Ａまたはｗｎｔ７ａ１〜２７８のｍＲＮＡを４細胞段階の胚の１つの腹側割球中に注射した。
１．３．発現プラスミドコンストラクト
Ｆｚ１（ａｄｄｇｅｎｅ 番号４２２５３）およびＦｚ５（ａｄｄｇｅｎｅ 番号４２２６７）を除いて、全てのＷｎｔシグナル伝達の構成成分および他の発現コンストラクトは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｔａｋａｒａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用する組換えの後に、ｐＣＳ２ベクターのＣＭＶプロモーターから発現した。ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングとタンデムに重複するＰＣＲ産物とを使用して、単一点突然変異の変異体および欠失体を生成した。全てのコンストラクトをシーケンシングによって確認した。
１．４．細胞培養およびＨＥＫ２９３突然変異体細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−３２１６）から入手し、ＨＥＫ２９３ ＳＴＦ細胞株は、Ｊｅｒｅｍｙ Ｎａｔｈａｎｓ（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ）によって好意により提供された。細胞を１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養し、５％のＣＯ２で平衡化した、加湿したインキュベーター内で維持した。７Ｂ。
１．５．ＳＴＦの二重ルシフェラーゼアッセイ
細胞を９６ウェルプレート中にプレーティングし、２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって３連でトランスフェクトした。ウェル当たりのトランスフェクトされるプラスミドＤＮＡの量を各発現ベクターごとに最適化した：別段に指定されていなければ、ウミシイタケルシフェラーゼ（０．５ｎｇ）、Ｗｎｔ（２０ｎｇ）、Ｆｚ（５ｎｇ）、ＬＲＰ（２．５ｎｇ）、Ｇｐｒ１２４（１０ｎｇ）、Ｒｅｃｋ（１０ｎｇ）。ＤＮＡの総量を空のｐＣＳ２ベクターを用いてウェル当たり１００ｎｇに調整した。パッシブライシスバッファー（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中で細胞を収集し、トランスフェクションの４８時間後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ系（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性を連続的に測定した。
１．６．顕微鏡および画像処理
ゼブラフィッシュの胚をＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて画像化し、画像をＩｍａｇｅＪにおいて処理した。ゼブラフィッシュ発生の表現型の画像をＬｅｉｃａ Ｍ１６５ ＦＣで撮影した。アフリカツメガエルの幼生をＯｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６で画像化した。
１．７．統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して統計分析を実施した。データは平均±ＳＤを表す。正規分布に従うデータ（ＳＴＦアッセイ）の多重比較および単一比較に関する一元ＡＮＯＶＡ（ポストホックダネット検定）およびスチューデントのｔ検定によって、ならびに非正規分布に従うデータ（ＤＲＧの定量）の多重比較に関するＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ（ポストホックダネット検定）によって、ｐ値を計算した；＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
２．結果
本発明者らは、実験１において、Ｒｅｃｋが、Ｆｚによって繋がったリガンドと異なる部位で、Ｗｎｔ７ａ内のリンカーを認識することによって、Ｗｎｔリガンドを識別することを特定した。よって、結合の機序は、Ｗｎｔ７が、Ｆｚ、ＲｅｃｋおよびＬＲＰ５／６によって同時に繋がる、細胞内足場によってまとめられた高次のＷｎｔ７／Ｒｅｃｋ／Ｇｐｒ１２４／Ｆｚ／ＬＲＰ５／６複合体の形成と一致しているようである。本発明者らは、Ｗｎｔ７ａのＮ末端ドメイン（Ｗｎｔ７ａ１〜２７８）が依然としてＲｅｃｋに結合することをさらに明らかにした。
次に、Ｆｚ５およびＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰシグナル伝達に関するこれらの切断されたＷｎｔ７ａ変異体のＳＴＦ活性を評価した（図７Ａ）。Ｆｚ５を介するＷｎｔシグナル伝達には、Ｗｎｔ／Ｆｚ接触部位の両方の保存が必要とされ、いずれか一方を欠く全てのＷｎｔ７ａ変異体は、パルミトレイン酸の切断または非存在によって、Ｆｚ５シグナル伝達を刺激することができなかった（図７Ａ）。Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ１シグナル伝達は、１つの注目すべき例外：シングルドメインＷｎｔ７ａ１〜２７８がＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ１によって約４０％のシグナル伝達能を維持したこと（図７Ａ、矢印）を除いて、Ｗｎｔ７ａの切断または突然変異に対して等しく感受性であった。本発明者らは、Ｗｎｔ７、Ｆｚ、ＬＲＰ５／６およびＲｅｃｋによって形成された複合体内で、Ｒｅｃｋによってもたらされる追加の接触点が、リガンドインデックスにおける欠損しているＷｎｔ／Ｆｚ相互作用を補っていることを提案した。
Ｆｚ５シグナル伝達から、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰシグナル伝達に関してＷｎｔ７ａ内で必須の残基を識別するために、Ｗｎｔ７ａの単一残基変異体のコレクションのＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰまたはＦｚ５に依存するＳＴＦシグナル伝達を分析した（図７Ｂ、７Ｃ）。Ｆｚ５シグナル伝達に関して不活性であるが、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔシグナル伝達を依然として活性化する、より詳細には、野生型の成熟した全長Ｗｎｔ７ａのＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔシグナル伝達活性の少なくとも３５％、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化する、４２個の全長ｍＷｎｔ７ａ変異体（７Ｂのボックス内）を特定した（図７Ｂ〜７Ｃ、表３を参照のこと）。これらの変異体のうちの３１個、より詳細には、Ｗｎｔ７ａ変異体Ｑ４８Ａ（Ｑ１７Ａ）、Ｉ５１Ａ（Ｉ２０Ａ）、Ｐ５６Ａ（Ｐ２５Ａ）、Ａ５８Ｒ（Ａ２７Ｒ）；Ｉ５９Ａ（Ｉ２８Ａ）；Ｅ６４Ａ（Ｅ３３Ａ）；Ｍ６８Ａ（Ｍ３７Ａ）、Ｌ７０Ａ（Ｌ３９Ａ）、Ｅ７２Ａ（Ｅ４１Ａ）；Ｆ７５Ａ（Ｆ４４Ａ）；Ｖ９９Ａ（Ｖ６８Ａ）；Ｉ１６０Ａ（Ｉ１２９Ａ）；Ｆ１６２Ａ（Ｆ１３１Ａ）；Ｋ１６４Ａ（Ｋ１３３Ａ）；Ｉ１７２Ａ（Ｉ１４１Ａ）；Ｒ１８９Ａ（Ｒ１５８Ａ）；Ｋ１９０Ａ（Ｋ１５９Ａ）；Ｋ１９０Ｌ（Ｋ１５９Ｌ）；Ｋ２１２Ａ（Ｋ１８１Ａ）；Ｒ２２２Ａ（Ｒ１９１Ａ）；Ｋ２２９Ａ（Ｋ１９８Ａ）；Ｋ２３１Ａ（Ｋ２００Ａ）；Ｖ２３６Ａ（Ｖ２０５Ａ）；Ｅ２３９Ａ（Ｅ２０８Ａ）；Ｐ２４９Ａ（Ｐ２１８Ａ）；Ｙ２６０Ａ（Ｙ２２９Ａ）；Ｐ２６３Ａ（Ｐ２３２Ａ）；Ｔ２６６Ａ（Ｔ２３５Ａ）；Ｗ３２２Ａ（Ｗ２９１Ａ）；Ｔ３３８Ａ（Ｔ３０７Ａ）およびＮ８３Ｑ（Ｎ５２Ｑ）［ここで、置換はｍＷｎｔ７ａの前駆体ポリペプチドにおけるアミノ酸位置を示す（およびここで、括弧内の置換はｍＷｎｔ７ａの成熟ポリペプチドにおけるアミノ酸位置を示す、表３を参照のこと）］は、野生型の成熟した全長Ｗｎｔ７ａのＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔシグナル伝達活性の少なくとも７０％、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに媒介されるＷｎｔシグナル伝達を活性化することができた（図７Ｂ〜Ｃ）。
インビトロでは、Ｗｎｔ７ａ１〜２７８およびＷｎｔ７ａＫ１９０Ａ（Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ Ｆｚ／ＬＲＰシグナル伝達に関する３１個の選択的変異体のうちの１つ）は、Ｇｐｒ１２４／Ｒｅｃｋの非存在下でいずれのＦｚによってもシグナル伝達できなかった（図７Ｄ）。したがって、ゼブラフィッシュの接合体にｍＲＮＡを注射した際に、Ｗｎｔ７ａ１〜２７８およびＷｎｔ７ａＫ１９０Ａは耐性が良好であり、それぞれ、１ｎｇおよび１００ｐｇまで後部化も全体の解剖学的変更も明らかにしなかった（図７Ｄ〜Ｅ）。対照的に、３ｐｇのｗｎｔ７ａのｍＲＮＡは、Ｗｎｔシグナル伝達の異所的活性化によって前脳と眼の構造の損失を誘導し（Kim et al., Nature 407(6806):913-6 (2000)）、１０ｐｇを超える用量で異形胚をもたらした（図７Ｅ〜Ｆ）。
同様に、アフリカツメガエルの胚に注射した場合には、Ｗｎｔ７ａは、古典的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の結果である、軸の重複をもたらし、一方、Ｗｎｔ７ａ１〜２７８およびＷｎｔ７ａＫ１９０Ａはもたらさなかった（図７Ｇ）。Ｗｎｔ７Ａ１〜２７８およびＷｎｔ７ａＫ１９０Ａによって誘導されるいずれかの識別可能な発生異常の欠如によって、１００ｐｇのｍＲＮＡを注射した後のｗｎｔ７ａａモルファントにおいて重要なＤＲＧの救済が可能となるが、その最高耐量である１０ｐｇを注射したｗｎｔ７ａａのｍＲＮＡによっては、ＤＲＧニューロンの周辺的な復元のみが明らかとなった（図７Ｈ）。まとめると、これらの実験によって、代わりのＦｚ経路に関するオフターゲット活性を実証することなく、インビボでＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰに依存する応答を誘発するＧｐｒ１２４／Ｒｅｃｋ／Ｆｚ／ＬＲＰ 選択的アゴニストとして、Ｗｎｔ７ａ１〜２７８およびＷｎｔ７ａＫ１９０Ａが特定され、それによって、リガンド特異的Ｆｚシグナル伝達経路が、大幅に増加した選択性を有する新規Ｗｎｔアゴニストを開発するために適合され得るという概念の証明がもたらされる。この実験セクションにおけるＷｎｔ７ａポリペプチド変異体のアミノ酸置換の位置を、Ｗｎｔ７ａ前駆体ポリペプチド（すなわち、シグナルペプチドを含む）のアミノ酸配列に関して示す。表３は、Ｗｎｔ７ａ前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の位置および成熟したＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列におけるそれらの対応する位置を示す。
マウスのＷｎｔ７ａＫ１９０ＡまたはＷｎｔ７ａ１〜２７８の内皮でのトランスジェニック発現によって、Ｗｎｔ７ａａ−／−突然変異体ゼブラフィッシュにおいて、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに依存する脳の血管新生が誘発され、血液脳関門が復元された（ＧＬＵＴ１発現によって評価した場合）（図９Ａ〜Ｃ）。マウスのＷｎｔ７、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡおよびＷｎｔ７ａ１〜２７８は、内皮特異的ｋｄｒｌ（血管内皮成長因子受容体ｋｄｒｌ様）プロモーターの制御下で、Ｗｎｔ７ａａ−／−胚の内皮において一過性に発現された。Ｗｎｔ７リガンドは、遺伝子組換えマーカーとしてのＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）を含むバイシストロニックコンストラクトとして発現された。注射されていない胚と比較して、３つのリガンドは全て、ＣｔＡ形成を復元する。６０ｈｐｆのＷｎｔ７ａａ−／−胚におけるＷｎｔ７、Ｗｎｔ７ａＫ１９０ＡおよびＷｎｔ７ａ１〜２７８のトランスジェニック発現後のＣｔＡの抗ＧＬＵＴ１免疫蛍光染色により、血液脳関門の成熟が明らかとなった。
上記を鑑みて、Ｗｎｔ７ａ変異体は、代わりのＦｚ経路に関するオフターゲット活性を実証することなく、インビボでＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫに依存する応答を誘発するＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ選択的アゴニストである。
Figure 2021518151
Figure 2021518151
マウスとヒトの野生型成熟Ｗｎｔ７ａの全長の一次アミノ酸配列は同一であることに留意されたい。
脳卒中（一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ））のモデルに供したマウスにおけるマウスＷｎｔ７ａ Ｋ１９０Ａ のウイルスベクターによるデリバリー
１．材料および方法
１．１．ＡＡＶプラスミドコンストラクト（ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−ｍＷｎｔ７ａＫ１９０Ａ−ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ）の生成
ｐＣＡＧプロモーターの調節エレメントの下に隣接するＩＴＲ配列を含有するｐＡＡＶ導入遺伝子ベクター中に、全長ｍＷｎｔ７ａＫ１９０Ａ変異体をクローニングした。Ｗｎｔ７変異体は、自己切断するｐ２Ａペプチドの中間体によってＥＧＦＰへの融合体として発現された。ＡＡＶベクターを産生し、ＨＥＫ２９３細胞のｐＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、ヘルパープラスミド（ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢカプシド変異体＋ｒｅｐ＋挿入配列をコードする）およびアデノウイルスヘルパープラスミドとの三重の同時トランスフェクションによって、Korbelin et al., 2016に記載されているように精製した。
「Ｗｎｔ７ａＫ１９０Ａ」のＫ１９０Ａは、ｍＷｎｔ７ａの前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置を示すことに留意されたい。
１．２．動物実験
ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−ｍＷｎｔ７ａＫ１９０Ａ−ｐ２Ａ−ＥＧＦＰまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ対照ベクター（マウス１匹当たり１×１０１１ｖｇ）を含有する５０μｌの濃縮したベクター（マウス１匹当たり１×１０１１ｖｇ）を１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの眼窩周囲静脈中に静脈内注射した。感染の２週間後に、ＣＮＳ内皮細胞においてＥＧＦＰシグナルを評価し、導入遺伝子の発現を確認した。
マウスをｔＭＣＡＯに１時間供し、ｔＭＣＡＯの５日後に、ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド）染色によって梗塞サイズを測定した。内因性血漿タンパク質の漏出（免疫グロブリンおよびフィブリノーゲン）を測定することによって、再灌流の１時間後に血液脳関門（ＢＢＢ）のレベルにおける漏出アッセイを実施した。ｔＭＣＡＯ後のマウスの生存を灌流の５日後に評価した。
２．結果
ＧＦＰをコードするコンストラクトを使用して、マウスの脳における広範囲のトランスジェニック発現を実証した（図１０Ａ）。
インビボでの脳卒中に関するマウスのＷｎｔ７ａＫ１９０Ａの効果を評価するために、マウスのＷｎｔ７ａＫ１９０Ａを発現する脳に特異的なアデノ随伴ベクターを生成した。
マウスのＷｎｔ７ａＫ１９０Ａを含むベクターを注射した全てのマウスが１回拍出量の低減を示した（図１０Ｂ）。
脳卒中（一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ））のマウスモデルに供したマウスにおけるＷｎｔ７ａ Ｋ１９０Ｓ またはＷｎｔ７ａ Ｋ１９０Ｌ のウイルスベクターによるデリバリー
１．材料および方法
１．１．ＡＡＶプラスミドコンストラクト（ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−ｍＷｎｔ７ａＫ１９０Ｓ−ｐ２Ａ−ＥＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ−ＣＡＧ−ｍＷｎｔ７ａＫ１９０Ｌ−ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ）の生成
ＡＡＶプラスミドコンストラクトを実施例３のセクション１．１に記載したように生成した。
「Ｗｎｔ７ａＫ１９０Ｓ」のＫ１９０Ｓと「Ｗｎｔ７ａＫ１９０Ｌ」におけるＫ１９０Ｌは、ｍＷｎｔ７ａ前駆体ポリペプチドにおけるアミノ酸位置を示すことに留意されたい。
１．２．動物実験
動物実験を実施例３のセクション１．１に記載したように実施する。
２．結果
１回拍出量の低減をマウスのＷｎｔ７ａＫ１９０ＳまたはＷｎｔ７ａＫ１９０Ｌを含むベクターを注射したマウスにおいて測定する。
脳卒中（一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ））のマウスモデルに供したマウスにおけるＷｎｔ７ａ変異体アゴニストのウイルスベクターによるデリバリー
１．材料および方法
ＡＡＶプラスミドコンストラクトを実施例３のセクション１．１に記載したように作成し、動物実験を実施例３のセクション１．１に記載したように実施する。
２．結果
１回拍出量の低減をマウスのＷｎｔ７ａＱ４８Ａ、Ｗｎｔ７ａＩ５１Ａ、Ｗｎｔ７ａＰ５６Ａ、Ｗｎｔ７ａＡ５８Ｒ、Ｗｎｔ７ａＩ５９Ａ、Ｗｎｔ７ａＥ６４Ａ、Ｗｎｔ７ａＭ６８Ａ、Ｗｎｔ７ａＬ７０Ａ、Ｗｎｔ７ａＥ７２Ａ、Ｗｎｔ７ａＦ７５Ａ、Ｗｎｔ７ａＲ８１Ａ、Ｗｎｔ７ａＮ８３Ｑ、Ｗｎｔ７ａＶ９９Ａ、Ｗｎｔ７ａＩ１６０Ａ、Ｗｎｔ７ａＦ１６２Ａ、Ｗｎｔ７ａＫ１６４Ａ、Ｗｎｔ７ａＦ１６６Ａ、Ｗｎｔ７ａＩ１７２Ａ、Ｗｎｔ７ａＲ１７７Ａ、Ｗｎｔ７ａＲ１８９Ａ、Ｗｎｔ７ａＫ２１２Ａ、Ｗｎｔ７ａＲ２２２Ａ、Ｗｎｔ７ａＫ２２９Ａ、Ｗｎｔ７ａＫ２３１Ａ、Ｗｎｔ７ａＶ２３６Ａ、Ｗｎｔ７ａＥ２３９Ａ、Ｗｎｔ７ａＲ２４５Ａ、Ｗｎｔ７ａＫ２４７Ａ、Ｗｎｔ７ａＰ２４９Ａ、Ｗｎｔ７ａＫ２５３Ａ、Ｗｎｔ７ａＩ２５４Ａ、Ｗｎｔ７ａＹ２６０Ａ、Ｗｎｔ７ａＰ２６３Ａ、Ｗｎｔ７ａＴ２６６Ａ、Ｗｎｔ７ａＥ２７９Ａ、Ｗｎｔ７ａＲ３２０Ａ、Ｗｎｔ７ａＷ３２２Ａ、Ｗｎｔ７ａＴ３３８ＡまたはＷｎｔ７ａＫ３４９Ａを含むベクターを注射したマウスにおいて測定する。
陰性対照として、１回拍出量の低減をマウスのＷｎｔ７ａＲ４９Ａ、Ｗｎｔ７ａＥ１０３ＡまたはＷｎｔ７ａＬ１９２Ａを含むベクターを注射したマウスにおいて測定する。
置換は、ｍＷｎｔ７ａ前駆体ポリペプチドにおけるアミノ酸位置を指すことに留意されたい。

Claims (25)

  1. Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＲ）１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しない、作用物質。
  2. ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では細胞膜におけるＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドのヘテロマー形成（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導することができるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下での当該ヘテロマー形成を誘導することができない、請求項１に記載の作用物質。
  3. ＲＥＣＫおよびＧＰＲ１２４の存在下では細胞膜においてＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドに同時に結合することができるが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下ではＦｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドとＬＲＰポリペプチドに同時に結合することができない、請求項２に記載の作用物質。
  4. ＧＰＲ１２４および／またはＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の作用物質。
  5. ＲＥＣＫポリペプチドに結合することができる、請求項１から４のいずれか一項に記載の作用物質。
  6. ＲＥＣＫポリペプチドのシステインノット４（ＣＫ４）領域、ＣＫ５領域、またはＣＫ４領域およびＣＫ５領域に結合することができる、請求項５に記載の作用物質。
  7. Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合することができる、請求項１から６のいずれか一項に記載の作用物質。
  8. ＬＲＰポリペプチドのＤＫＫ結合性部位および／またはＷｎｔ結合性部位に結合することができる、請求項１から７のいずれか一項に記載の作用物質。
  9. 化学物質、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、タンパク質またはポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、シュピーゲルマーおよび核酸からなる群を含むかまたはそれから選択され、好ましくはタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の作用物質。
  10. 前記作用物質が、ＲＥＣＫ結合性ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメインおよびＬＲＰ結合性ドメインを含み、前記ＲＥＣＫ結合性ドメイン、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合性ドメイン、および前記ＬＲＰ結合性ドメインが、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドなどのＷｎｔ７ポリペプチドに由来する、請求項１から９のいずれか一項に記載の作用物質。
  11. 前記ＲＥＣＫ結合性ドメインが、
    −アミノ酸配列ＨＶＥＰＶＲＡＳＲＮＫＲＰＴＦＬＫＩＫＫＰＬＳＹＲＫＰＭＤＴＤＬＶＹＩＥＫＳＰＮＹＣ（配列番号１７）に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
    −アミノ酸配列ＶＥＰＶＲＡＳＲＮＫＲＰＴＦＬＫＩＫＫＰＬＳＹＲＫＰＭＤＴ（配列番号１８）に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
    −アミノ酸配列ＶＥＶＶＲＡＳＲＬＲＱＰＴＦＬＲＩＫＱＬＲＳＹＱＫＰＭＥＴ（配列番号１９）に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
    −アミノ酸配列ＸＸＸＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＩＸＸＸＸＸＹＸＫＸＸＸＸ（配列番号２０）、ＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＩＸＸＸＸＸＹＸＫ（配列番号２１）、ＸＸＸＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＸＸＸＸ（配列番号２２）もしくはＶＸＡＸＲＸＸＸＸＸＦＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号２３）であって、Ｘが任意のアミノ酸であり、好ましくはアミノ酸配列が配列番号１８または配列番号１９のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を示す、アミノ酸配列
    を含む、請求項１０に記載の作用物質。
  12. Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドの断片などの、Ｗｎｔ７ポリペプチドの断片であるかまたはそれから本質的になる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の作用物質。
  13. 前記断片が、Ｗｎｔ７ポリペプチドのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）であるかまたはそれから本質的になる、請求項１２に記載の作用物質。
  14. Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ｂポリペプチドの変異体などの、Ｗｎｔ７ポリペプチドの変異体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の作用物質。
  15. − 配列番号２４または配列番号５１の１７位に対応する位置のグルタミン（Ｑ）残基が、グルタミン（Ｑ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２０位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２５位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基が、プロリン（Ｐ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２７位に対応する位置のアラニン（Ａ）残基が、アラニン（Ａ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２８位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の３３位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の３７位に対応する位置のメチオニン（Ｍ）残基が、グルタミン酸（Ｍ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の３９位に対応する位置のロイシン（Ｌ）残基が、グルタミン酸（Ｌ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の４１位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の４４位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基が、フェニルアラニン（Ｆ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の５０位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の５２位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）残基が、アスパラギン（Ｎ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはグルタミン（Ｑ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の６８位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基が、バリン（Ｖ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１２９位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１３１位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基が、フェニルアラニン（Ｆ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１３３位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１３５位に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）残基が、フェニルアラニン（Ｆ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１４１位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１４６位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１５８位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１５９位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１８１位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１９１位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の１９８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２００位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２０５位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２０５位に対応する位置のバリン（Ｖ）残基が、バリン（Ｖ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２０８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２１４位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２１６位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２１８位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基が、プロリン（Ｐ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２２２位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２２３位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）残基が、イソロイシン（Ｉ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２２９位に対応する位置のチロシン（Ｙ）残基が、チロシン（Ｙ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２３２位に対応する位置のプロリン（Ｐ）残基が、プロリン（Ｐ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２３５位に対応する位置のトレオニン（Ｔ）残基が、トレオニン（Ｔ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２４８位に対応する位置のグルタミン酸（Ｅ）残基が、グルタミン酸（Ｅ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２８９位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）残基が、アルギニン（Ｒ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の２９１位に対応する位置のトリプトファン（Ｗ）残基が、トリプトファン（Ｗ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており；
    − 配列番号２４または配列番号５１の３０７位に対応する位置のトレオニン（Ｔ）残基が、トレオニン（Ｔ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されており、かつ／または
    − 配列番号２４または配列番号５１の３１８位に対応する位置のリシン（Ｋ）残基が、リシン（Ｋ）以外の１つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン（Ａ）残基によって置換されている、
    請求項１４に記載の作用物質。
  16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の作用物質をコードする核酸であって、前記作用物質が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、核酸。
  17. プロモーターならびに／または転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルに作動可能に連結した、請求項１６に記載の核酸を含む核酸発現カセット。
  18. ウイルスベクターなどの、請求項１６に記載の核酸または請求項１７に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
  19. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の作用物質、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載の核酸発現カセットまたは請求項１８に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  20. 医薬として使用するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の作用物質、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載の核酸発現カセット、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害の予防または治療における使用のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の作用物質、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載の核酸発現カセット、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の医薬組成物。
  22. 前記神経血管障害が、虚血性脳卒中、出血性卒中、虚血／再灌流傷害、脳動脈瘤、動静脈奇形（ＡＶＭ）、海綿状血管奇形、血管炎、脳出血、くも膜下出血、脊髄血管奇形、頸動脈狭窄、もやもや病および頭蓋内アテローム性動脈硬化症、およびこれらの組合せからなる群から選択されるか、または、前記ＣＮＳ障害が、多発性硬化症、虚血性脳卒中、脳がん、てんかん、認知症、血管性認知症、ＨＩＶ−１関連認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、感染性脳疾患、外傷性脳損傷、片頭痛および慢性外傷性脳障害、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のための作用物質。
  23. 例えば神経血管機能不全を含む神経血管障害またはＣＮＳ障害の予防または治療に有用なものなどの、治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法であって、試験作用物質が、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＲＥＣＫおよび／またはＧＰＲ１２４の非存在下でのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することを含む方法。
  24. − 試験作用物質を、ＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことができる細胞と接触させ、前記Ｗｎｔシグナル伝達を測定すること、および
    − 試験作用物質を、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことはできるがＧＰＲ１２４／ＲＥＣＫ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を行うことができない細胞と接触させ、前記Ｗｎｔシグナル伝達を測定すること
    を含む、請求項２３に記載のインビトロにおける方法。
  25. 試験作用物質がＲＥＣＫポリペプチドに結合することができるかどうかを決定することをさらに含む、請求項２３または２４に記載のインビトロにおける方法。
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