JP2021519574A - Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する多価結合分子およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本明細書に記載されるのは、細胞上でＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体に対する多価結合分子によって結合に影響を及ぼす方法であって、その方法では、ＦＺＤ受容体と共受容体との両方に対する多価結合分子による結合が、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する。また本明細書に記載されるのは、Ｆｃドメインの両端にＦＺＤ受容体結合ドメインとＷｎｔ共受容体結合ドメインとを含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する多価結合分子、およびそれらを使用するための方法である。【選択図】 図６Ｂ

Description

関連出願
本願は、全てが参照により本明細書に組み込まれる２０１８年２月１４日出願の米国仮特許出願第６２／６３０，７７２号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を請求するものである。
本出願は配列表を含み、この配列表は、ＡＳＣＩＩ形式にて電子提出されており、参照によりその全体がここに組み込まれる。２０１９年２月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、１１５７７３＿ＰＡ８９５ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、サイズ２２０，３６０バイトである。
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、成人における胚の発生および組織の恒常性維持に決定的に重要である。Ｗｎｔリガンドは、増殖、分化、生存、および遊走などの様々な細胞プロセスを調節する分泌型成長因子である。Ｗｎｔリガンドは、組織幹細胞の自己再生を制御し多数の前駆細胞集団を調節するために、普遍的に重要である。Ｗｎｔタンパク質の疎水性および感受性三次構造によって、その生化学的精製の試みならびにそのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの使用は実現不能となっている。
ヒトには１９種のＷｎｔリガンドが存在し、それらは、異なる細胞内シグナル伝達の分枝の選択的な係合を導く、１０種のＦｒｉｚｚｌｅｄ細胞表面受容体（ＦＺＤ）と複数の共受容体の１つとのネットワークに相互作用する（Wodarz, A. and Nusse, R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14 , 59−88 (1998)； Angers, S and Moon , R.T., transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 , 468−477 (2009)）。ＦＺＤは、７つの疎水性膜貫通ドメインとシステインリッチなリガンド結合ドメインとを含む、保存された構造的特徴を有する。ＦＺＤは、３つの別個のシグナル伝達経路における機能で知られており、それらの経路は、Ｗｎｔ平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路、古典的Ｗｎｔ／β−カテニン経路、およびＷｎｔ／カルシウム経路として知られる。Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化には、Ｗｎｔ共受容体の存在も必要であり、これらの共受容体は、異なる細胞内シグナル伝達カスケードの係合を規定し、このカスケードは、上記に挙げた細胞プロセスの根底にある細胞機構に作用する遺伝子の発現を制御する。例えば、Ｗｎｔリガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体と、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化する低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５および６（ＬＲＰ５／６）共受容体ファミリーのメンバーとに結合するか；またはＷｎｔ／ＰＣＰ経路もしくは代替のβ−カテニン非依存的シグナル伝達経路を惹起する受容体チロシンキナーゼ（ＲＹＫ）もしくはタンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）共受容体に関連のある、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１および２（ＲＯＲ１／２）に結合する。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、場合によって古典的経路とよばれ、転写エフェクターであるβ−カテニンの翻訳後蓄積の際に最高点に達し、β−カテニンは、状況特異的な遺伝子の発現を調節する転写因子のＴ細胞因子／リンパ球エンハンサー因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ファミリーと相互作用する。
Ｗｎｔは、機能するために脂質修飾を必要とするが（Janda et al., Science. 337 , 59−64 (2012)； Kadowaki et al,. Genes Dev. 10 , 3116−3128 (1996)）、それらの疎水的な性質は、生化学的操作を複雑なものとし、それゆえＷｎｔは少量が精製されているに過ぎない（Willert et al., Nature 423, 448−452 (2003)）。さらに、Ｗｎｔは本質的に、複数の受容体に対する交差反応性を有し、特に過剰発現または高用量を適用した際に示す（He et al. Science. 275 , 1652−1654 (1997)；Andres et al. Systematic mapping of Wnt-Frizzled interactions reveals functional selectivity by distinct Wnt-Frizzled pairs. Journal of Biological (2015)（http://www.jbc.org/content/ early/2015 /01/20/jbc.M114. 12648.shortで入手可能である）；Holmen et al., J. Biol. Chem. 277 , 34727−34735 (2002)）。その結果、異なる状況におけるそれぞれの特異的な機能を決定するために、または変性状態のそれらの治療上の可能性を評価するために、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の複合体を選択的に活性化するということができていない。本明細書に記載された多価結合分子および方法は、予め選択されたＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体−共受容体の複合体を選択的に活性化する。本明細書に記載された多価結合分子の投与は、適切なＦｒｉｚｚｌｅｄ共受容体の複合体を活性化することによって、変性状態を治療することが想定される。
本明細書に記載されるのは、細胞上のＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体に対するペプチドによって結合に影響を及ぼす方法であって、本方法では、ＦＺＤ受容体と共受容体との両方に対するペプチドによる結合が、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する。
また本明細書に記載されるのは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する多価結合分子と、それらを使用する方法である。本多価結合分子は、ＦＺＤ受容体とＷｎｔ共受容体との両方に結合し、それによってＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する。本発明の多価結合分子はまた、本明細書では「ＦＺＤアゴニスト」または「ＦＺＤａｇ」とも称する。本発明の分子がＦＺＤおよびＬＲＰ５／６を結合する特定の実施形態では、この分子は、「ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ５／６アゴニスト」または「ＦＬＡｇｓ」と称することがある。本多価結合分子は、ＦｃドメインまたはそのＣＨ３ドメインを含む断片と、ＦＺＤ受容体を結合する第１の結合ドメインと、Ｗｎｔ共受容体を結合する第２の結合ドメインとを含み、その場合、ＦＺＤ結合ドメインは、Ｆｃドメインの一方の末端に連結され、共受容体結合ドメインは、Ｆｃドメインの他方の末端に連結される。そのため、ＦＺＤ受容体に対する結合ドメインと共受容体に対する結合ドメインとは、直接的に連結されるというよりも、ＦｃドメインまたはＣＨ３ドメインを含むその断片によって隔てられる。この立体配置の結合ドメインは、予想外に高いレベルのＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を生じる。ＦＺＤ結合ドメインは、一価であって、ＦＺＤ受容体に対する単一の結合部位（パラトープ）を有していてもよいし、多価であって、ＦＺＤ受容体に対する１つを超える結合部位を有していてもよく、例えば、この結合ドメインは、二価、三価、または四価であってもよい。Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、Ｗｎｔ共受容体に対する単一の結合部位（パラトープ）を有する一価であってもよいし、１つを超える結合部位を有するＷｎｔ共受容体に対する多価であってもよく、例えば、この結合ドメインは、二価、三価、または四価であってもよい。
本明細書に記載される、多価結合分子生産するための方法は、任意のＦＺＤ受容体の複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで選択的かつ堅固に活性化することを可能にする。ＦＺＤとそれらの共受容体とを標的とする何百もの合成抗体のパネルを活用して、我々は、１種、２種、または複数種のＦＺＤ受容体を選択的かつ合理的に活性化するための多価結合分子を生成した。本発明の多価結合分子は、大規模生産および手軽な精製に非常に適しかつなじみやすく、予測可能な薬物動態を有し、低い免疫原性を示すものと想定される。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載される多価結合分子の結合ドメインは、１つまたは複数のＦＺＤ受容体とＬＲＰ、例えばＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６とに結合し、代替的に本明細書ではＦＬＡｇと称される。特定のＦＺＤとそれらのＬＲＰ共受容体とを標的とするＦＬＡｇは、定方向性分化および細胞療法を改善し、組織オルガノイドの成長を持続させ、内在性の幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで動員して創傷後の組織の修復を促進し、組織の変性に続いて機能を回復させるものとなる。
ＦＺＤアゴニストのＦｃドメインは、イムノグロブリンのＦｃドメインであってもよい。このイムノグロブリンは、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１であることがある。本発明の一実施形態では、本多価結合分子はペプチド二量体であり、その場合、ペプチドは、Ｆｃドメインの持つ内在的な二量体化の能力を介して、または異なる２つのペプチドの特異的なアセンブリを可能にするＦｃ内のｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ立体配置を介して、二量体化されて多価結合ドメインを生じる。ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ立体配置を介してペプチドを二量体化するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる発明者Ｖａｎ ＤｙｋらのＷＯ２０１８／０２６９４２に記載されている。
本明細書に記載されるＦＺＤアゴニストの多価結合ドメインのうち一方または両方は、二価かつ単一特異性であって、それらのそれぞれの受容体標的または共受容体標的の同じエピトープに対して２つの結合部位を有していてもよい。結合ドメインの一方または両方は、二価のかつ二重特異性であって、各部位がそのそれぞれの標的上の異なるエピトープを結合する２つの結合部位を有していてもよい。
本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤ受容体上の同じまたは異なるエピトープに結合するための２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むことがある。本発明の他の実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤを結合する１つもしくは複数の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）断片および／または１つもしくは複数の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）断片を含む。本発明の他の実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤに結合する１つまたは複数の単一のドメイン抗体断片からなる。本発明の他の実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤリガンド、またはＦＺＤ受容体を結合するその断片を含む。本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤを結合する合成ペプチド、例えばアフィボディ（アフィボディ）、アンキリン反復タンパク質、フィブロネクチン反復タンパク質、フィノマー（フィノマー）、アンチカリン（アンチカリン）を含む。本発明の一実施形態では、ＦＺＤ多価結合ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。ＦＺＤリガンドは、例えば、ＦＺＤ受容体を結合するＷｎｔタンパク質のもしくはＮｏｒｒｉｎの断片であってもよいし、１つまたは複数のＦＺＤ受容体と相互作用するように親和性の成熟した別の天然または合成のペプチドであってもよい。Ｎｏｒｒｉｎは、ＦＺＤ４特異的なリガンドであり、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との複合体では、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に関連がある。
本発明の一実施形態では、共受容体結合ドメインは、共受容体上の同じまたは異なるエピトープに結合するための２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むことがある。本発明の他の実施形態では、Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、Ｗｎｔ共受容体を結合する１つまたは複数の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）断片および／または１つまたは複数の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）断片を含む。本発明の他の実施形態では、共受容体結合ドメインは、共受容体に結合する１つまたは複数の単一ドメイン抗体断片からなる。本発明の一実施形態では、Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、Ｗｎｔ共受容体を結合するペプチドを含み、その場合、ペプチドは、Ｗｎｔ共受容体を結合する天然のリガンドの断片であるか、またはＷｎｔ共受容体を結合する合成ペプチドであり、例えば、アフィボディ、アンキリン反復タンパク質、フィブロネクチン反復タンパク質、フィノマー、またはアンチカリンである。本発明の別の実施形態では、共受容体結合ドメインは、共受容体を結合する共受容体リガンドもしくはその断片（例えば、共受容体ＬＲＰ５／６に対するリガンドＤｋｋ１）、または１つまたは複数の共受容体と相互作用するように親和性の成熟した別の天然または合成のペプチドを含む。
本発明の一実施形態では、共受容体の多価結合ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載される分子の各結合ドメインは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドによって形成されることがあり、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬは、ダイアボディを形成する他方のペプチドのＶＬおよびＶＨと対合する。この立体配置では、結合ドメインは、その標的に結合する２つの結合部位を有し、すなわち、ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤ受容体に対する２つの結合部位を有し、共受容体結合ドメインは、共受容体に対する２つの結合部位を有する。ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−ｈｏｌｅのＦｃ立体配置を用いて、ＶＨおよびＶＬを含むペプチドを工学的に作製することができ、その結果、それらのペプチドは、同一ではないが対合して、ＦＺＤ受容体または共受容体上の異なる２つの部位に結合できる二重特異性結合ドメインを形成する（図３Ａを参照）。
本発明の一実施形態では、本多価結合ドメインの一方または両方は、Ｆｃドメインの各末端上でダイアボディを形成する２つのペプチドを含む。各ダイアボディは、それらのそれぞれのＦＺＤ受容体標的または共受容体標的上の１つのエピトープに対し２つの結合部位を有する。ダイアボディは、単一特異性であることがあり、その場合、結合部位は、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体上の同じエピトープを結合し、またはダイアボディは、二重特異性であることがあり、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体上の異なる２つのエピトープに結合する。
ｓｃＦｖまたはダイアボディを形成するペプチドは、ＦＺＤ受容体に結合する抗体に由来することも、Ｗｎｔ共受容体に結合する抗体に由来することもある。ＦＺＤ結合ドメインについては、上記抗体は、１つもしくは複数のＦＺＤ受容体に結合して、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するか、もしくは所与のＦＺＤ受容体（複数可）へのＷｎｔの結合を阻害する抗体であってもよいし、または、上記抗体は、ＦＺＤ受容体へのＷｎｔの結合を阻害することなく１つもしくは複数のＦＺＤ受容体に結合する抗体であってもよい。共受容体結合ドメインについては、上記抗体は、共受容体に結合して、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するか、もしくは共受容体へのＷｎｔの結合を阻害する抗体であってもよいし、または上記抗体は、共受容体へのＷｎｔの結合を阻害することなく共受容体に結合する抗体であってもよい。
ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤ受容体ファミリーの１つまたは複数のメンバーに、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体１（ＦＺＤ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体２（ＦＺＤ２）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体３（ＦＺＤ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体４（ＦＺＤ４）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体５（ＦＺＤ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体６（ＦＺＤ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体＆（ＦＺＤ７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体１Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体８（ＦＺＤ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体９（ＦＺＤ９）、またはＦｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体１０（ＦＺＤ１０）に結合することがある。共受容体結合ドメインは、任意のＷｎｔ共受容体に、例えばＬＲＰ５／６、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１／２、ＲＹＫ、ＧＰＲ１２４、ＴＳＰＡＮ１２、またはＣＤ１３３に結合することがある。本発明の一実施形態では、共受容体結合ドメインは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する。本発明の一実施形態では、共受容体結合ドメインは、共受容体上の単一のエピトープに、例えば、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａを結合するＬＲＰタンパク質のエピトープに結合する。本発明の一実施形態では、共受容体結合ドメインは、共受容体上の２つのエピトープに、例えば、Ｗｎｔ１に結合するＬＲＰ上の１つのエピトープと、Ｗｎｔ３ａに結合する１つのエピトープとに結合する。
本発明の一実施形態は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生産するための方法を含み、この方法は、有効量の本明細書に記載される多価結合分子の存在下、体細胞を初期化するのに適した条件下で体細胞を培養することを含む。本多価結合分子は、本多価結合分子を含まない同じ培養条件でｉＰＳ細胞を生成する場合に比べてｉＰＳ細胞の生成を加速する量で、含まれることがある。
また本発明の一実施形態は、有効量の本明細書に記載される多価結合分子の存在下でｉＰＳまたは他の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養することによって、これらの細胞の分化を様々な系列へと方向付けるための方法である。
本発明の一実施形態は、組織オルガノイドを生成するための方法を含み、この方法は、培養カクテルの一部としての有効量の本明細書に記載される多価結合分子の存在下、オルガノイドの生成に適した条件下で組織試料を培養することを含む。一実施形態または本発明では、本多価結合分子を含む培地中で培養された組織オルガノイドの生成の頻度は、本多価結合分子を含まない同じ培地中で培養されたオルガノイドに比べて亢進される。一実施形態または本発明では、組織オルガノイドは、本多価結合分子を含む培地中で培養される際には、本多価結合分子を含まない同じ培地中で培養された組織試料に比べて、さらに速く生成される。
本発明の一実施形態は、組織オルガノイドの維持を亢進するための方法を含み、この方法は、培養カクテルの一部としての有効量の本明細書に記載される多価結合分子の存在下、オルガノイドを培養することを含む。本明細書に記載されるように、本多価結合分子を含む培地中で培養される組織オルガノイドの生存は、本多価結合分子を含まない同じ培地中で培養されるオルガノイドに比べて延長される。
本発明の一態様は、本明細書に記載される多価結合分子を作製するための方法である。本発明の一実施形態では、多価結合分子は、
ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有するＦｃドメインを選択すること、
ｂ）１つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する抗体を特定すること、
ｃ）１つまたは複数のＷｎｔ共受容体に結合する抗体を特定すること、
ｄ）（ｉ）ステップａのＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ステップｂの抗体のＶＬおよび／もしくはＶＨ、または１つもしくは複数のＦＺＤを結合するステップｂの抗体に由来するＶＬおよび／もしくはＶＨをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉｉ）ステップｃの抗体のＶＬおよびＶＨ、またはステップｃの１つまたは複数のＷｎｔ受容体に結合する抗体に由来するＶＬおよびＶＨをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を生成すること、
ｅ）（ｄ）の核酸分子を発現してポリペプチドを生産することであって、ポリペプチドは、二量体化して、Ｆｃドメイン、ＦＺＤ結合ドメイン、およびＷｎｔ共受容体結合ドメインを含む多価結合分子を形成し、ＦＺＤ結合ドメインは、ステップｂの抗体の、もしくはステップｂの抗体に由来するＶＬとＶＨとから構成され、Ｆｃドメインの一方の末端に連結され、Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、ステップｃの抗体の、またはステップｃの抗体に由来するＶＬとＶＨとを含み、Ｆｃドメインの他方の末端に連結され、それによって多特異的な結合分子を形成すること
によって生成される。
ステップ（ｂ）の抗体は、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するか、または受容体へのＷｎｔの結合を阻害する、抗体または抗体断片であることがある。ステップ（ｂ）の抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達を拮抗することも受容体へのＷｎｔの結合を阻害することもなく、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する、抗体または抗体断片であることがある。ステップ（ｃ）の抗体は、Ｗｎｔ共受容体のうちの１つまたは複数に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するかもしくは共受容体へのＷｎｔの結合を阻害するか、またはＷｎｔシグナル伝達を拮抗することも共受容体へのＷｎｔの結合を阻害することもなく、共受容体に結合する、抗体または抗体断片であることがある。結合ドメインは、リンカーを介してＦｃドメインに連結されてもよい。本発明のモジュール態様は、Ｆｃドメインの末端で、任意の所与のＦＺＤ受容体および共受容体について抗体の結合ドメインを混合し適合させて、複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体−共受容体の複合体を係合できる多価結合分子を生成することを、またはＷｎｔシグナル伝達を活性化する単一のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体−共受容体の複合体を選択的に係合することを可能にする。
本多価結合分子は、Ｆｃドメインと、１つまたは複数のＦＺＤ受容体を結合する結合ドメインと、１つまたは複数のＷｎｔ共受容体を結合する第２の結合ドメインとを有するように構成されるペプチド二量体を含み、この二量体では、ＦＺＤ結合ドメインは、Ｆｃの一方の末端に連結され、共受容体結合ドメインは、Ｆｃの他方の末端に連結されている。各結合ドメインは、一価であっても多価であってもよく、例えば二価、三価、または四価であることがある。
また、本発明の一実施形態は、本多価結合分子を用いる方法であって、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生産するための、多能性幹細胞の定方向性分化のための、ならびに組織オルガノイドを生成および／もしくは維持するための、またはそれを必要とする対象において組織の再生を亢進するための、方法である。
本発明の追加の実施形態は、再生医薬に用いるおよび不充分なＷｎｔシグナル伝達に関連する障害または疾患に用いる内在性の幹／前駆細胞のプールを動員するために、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するための方法である。
ヒトＬＲＰ６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合について選択された５つの抗体の結合特異性を示す図である。ヒトＬＲＰ６の組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する抗体について選択することによって、ＬＲＰ６結合抗体を合成抗体ライブラリーから選択した。これらの抗体をヒトＬＲＰ６、マウスＬＲＰ６、およびマウスＬＲＰ５への結合についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。Ｆｃペプチドおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する結合を陰性対照として含めた。
ルシフェラーゼレポーターアッセイによりＷｎｔシグナル伝達の活性化をモニタリングした結果、Ｗｎｔ１（一過的トランスフェクション）およびＷｎｔ３ａ（０．５μｇ／ｍＬ精製タンパク質）の刺激に逆の効果が及ぼされることから、ＩｇＧ ２５３９およびＩｇＧ ２５４２（１００μＭ）が、ＬＲＰ６ ＥＣＤ上の異なる部位に結合することが実証されたことを示す図である。抗ＭＢＰ抗体は対照として役割を果たす。
代表的な二重特異性ＩｇＧ（Ｂｉ−ＩｇＧ）および二重特異性ダイアボディ（ｂｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）が、Ｆｃドメインの同じ末端においてＦＺＤ結合ドメイン（５０１９）とＬＲＰ６−Ｗ１（２９４２、Ｌ６１）または−Ｗ３（２５３９、Ｌ６３）結合ドメインとから構成されることを示す図である。
ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイで決定した際に、二重特異性ＩｇＧ（５０１９−２５３９Ｂｉ−ＩｇＧおよび５０１９−２５４２Ｂｉ−ＩｇＧ）がＷｎｔシグナル伝達を活性化するのではなく、Ｗｎｔシグナル伝達のアンタゴニストの役割を果たすことを実証する図である。
二重特異性ダイアボディの結合を示す図であり、この場合、Ｆｃドメインはｋｎｏｂ／ｈｏｌｅ立体配置（Ｋ／Ｈ）である。毛かとして得られる２つのダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ１）は、非常に弱いながらも元のＩｇＧのＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持する。図２Ｃは、精製ＦＺＤ−ＬＲＰ６ダイアボディ：５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈおよび５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈを示す。 二重特異性ダイアボディの結合を示す図であり、この場合、Ｆｃドメインはｋｎｏｂ／ｈｏｌｅ立体配置（Ｋ／Ｈ）である。毛かとして得られる２つのダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ１）は、非常に弱いながらも元のＩｇＧのＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持する。図２Ｄは、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、およびＦＺＤ７への５０１９−ダイアボディのＦＺＤ受容体結合プロファイルを示す。５０１９ＦＺＤ ＩｇＧは、以前にＦＺＤ１、２、４、５、７、８に結合することが特徴付けされた。 二重特異性ダイアボディの結合を示す図であり、この場合、Ｆｃドメインはｋｎｏｂ／ｈｏｌｅ立体配置（Ｋ／Ｈ）である。毛かとして得られる２つのダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ１）は、非常に弱いながらも元のＩｇＧのＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持する。図２Ｅは、二重特異的ＦＺＤ／ＬＲＰ６ダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／ＨのＦＺＤ受容体結合プロファイルを示す。 二重特異性ダイアボディの結合を示す図であり、この場合、Ｆｃドメインはｋｎｏｂ／ｈｏｌｅ立体配置（Ｋ／Ｈ）である。毛かとして得られる２つのダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ１）は、非常に弱いながらも元のＩｇＧのＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持する。図２Ｆは、二重特異的ＦＺＤ／ＬＲＰ６ダイアボディ５０１９−２５４２−Ｋ／ＨのＦＺＤ受容体結合プロファイルを示す。 二重特異性ダイアボディの結合を示す図であり、この場合、Ｆｃドメインはｋｎｏｂ／ｈｏｌｅ立体配置（Ｋ／Ｈ）である。毛かとして得られる２つのダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ１）は、非常に弱いながらも元のＩｇＧのＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持する。図２Ｇは、Ｆｃドメインの一方の末端に結合ドメインを有するホモ−ダイアボディ（２５３９−Ｆｃおよび２５４２−Ｆｃ）およびヘテロ−ダイアボディ（５０１９−２５３９−Ｆｃおよび５０１９−２５４２−Ｆｃ）がＬＲＰ６細胞外ドメインに相互作用することを実証する。 二重特異性ダイアボディの結合を示す図であり、この場合、Ｆｃドメインはｋｎｏｂ／ｈｏｌｅ立体配置（Ｋ／Ｈ）である。結果として得られる２つのダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ６−Ｗ１）は、非常に弱いながらも元のＩｇＧのＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持する。図２Ｈは、生体相干渉（Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ））アッセイで決定した際に、溶液中でＦＺＤ ＣＲＤおよびＬＲＰ６ ＥＣＤにダイアボディ５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈおよび５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈが共結合することを実証する。
結合ドメインを形成するＦＺＤ受容体およびＬＲＰ６受容体のダイアボディがＦｃの同じ側に存在する、５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈと５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈのどちらも、Ｗｎｔ媒介経路を活性化するＦＺＤアゴニストではないことを実証する図である。結果は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて明らかにした場合に、５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈダイアボディ（ＬＲＰ６上のＷｎｔ３部位に選択的）が１０ｎＭおよび５０ｎＭでＷｎｔ３媒介経路の活性化を完全に遮断するのに対して、５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈは効果が低いことを実証するものである。
ダイアボディまたはｓｃＦｖを含む結合ドメインを有する四価結合分子のルシフェラーゼ活性の比較を示す図である。抗ＦＺＤｓｃＦｖおよび抗ＬＲＰダイアボディ（ＦＰ＊＋Ｐ＊−Ｌ６１＋３）を含む結合ドメインを有する分子は、抗ＦＺＤダイアボディおよび抗ＬＲＰダイアボディ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）を含む結合ドメインを有する分子と同様の活性を呈した。これに対し、抗ＦＺＤダイアボディを含有するが抗ＬＲＰ６ｓｃＦｖを含有した分子（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＊＋３＊）または両末端にｓｃＦｖを含有する分子（ＦＰ＊＋Ｐ＊−Ｌ６１＊＋３＊）は、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３分子に比べて活性が大幅に低下した。
ＢＬＩ測定により、パラトープがダイアボディまたはｓｃＦｖの形式に提示されていたか否かに関わらず、ＬＲＰ６およびＦＺＤアイソフォームへの同等の高い親和性の結合性が示されたことから、ダイアボディまたはｓｃＦｖを含む結合ドメインを有する四価結合分子間の活性の差が、親和性の差に起因しなかったことを実証する図である。 ＢＬＩ測定により、パラトープがダイアボディまたはｓｃＦｖの形式に提示されていたか否かに関わらず、ＬＲＰ６およびＦＺＤアイソフォームへの同等の高い親和性の結合性が示されたことから、ダイアボディまたはｓｃＦｖを含む結合ドメインを有する四価結合分子間の活性の差が、親和性の差に起因しなかったことを実証する図である。
四価結合分子の概略図であり、図中、ホモ（同じエピトープを認識する）ダイアボディまたはヘテロ（別々のエピトープを認識する）ダイアボディから構成される２つのＦＺＤ結合ドメインは、Ｆｃドメインの一方の末端に連結され、ホモダイアボディまたはヘテロダイアボディから構成される２つのＬＲＰ６結合ドメインは、Ｆｃドメインの他方の末端に連結されている。
多価結合分子５０１９−Ｆｃ−２５３９（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６３＋３）および５０１９−Ｆｃ−２５４２（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋１）によるＦＺＤ４、ＦＺＤ５、およびＦＺＤ７のＥＣＤへの結合を示す図である。ＦＺＤ受容体への結合は、ＢＬＩアッセイを用いて検出する。
四価結合分子５０１９−Ｆｃ−２５３９（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６３＋３）、５０１９−Ｆｃ−２５４２（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋１）、５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）、および精製Ｗｎｔ３Ａ（０．５μｇ／ｍＬ）による、Ｗｎｔ−β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を示す図である。上記分子の濃度は標示されている。上記四価結合分子は、ｐＢＡＲルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて測定した際に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＷｎｔ−βカテニン経路を堅固に活性化するアゴニストである。５０１９−Ｆｃ−２５３９ホモダイアボディは、複数のＦＺＤ受容体に（５０１９：ＦＺＤ１、２、４、５、７、８）、およびＬＲＰ６上のＷｎｔ３ａ部位に（２５３９）結合し、精製Ｗｎｔリガンドと同等のレベルにレポーターを活性化する。５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２ヘテロダイアボディは、ＬＲＰ６上の両方のＷｎｔ結合部位に結合し、さらに効果的である。
単一特異性のＬＲＰ６ホモダイアボディ（５０１９−Ｆｃ−２５３９、５０１９−Ｆｃ−２５４２）または二重特異性ＬＲＰ６ヘテロダイアボディ（５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０１９ＡｇもしくはＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３としても知られる）のどちらかにＦｃを介してＦＺＤホモダイアボディ（５０１９）を連結された多価結合分子による、Ｗｎｔ−β−カテニン経路の活性化を示す図である。
ＦＺＤ受容体またはＬＲＰ６共受容体のどちらかに対する一価の結合ドメインを含む分子による、Ｗｎｔ−β−カテニンシグナル伝達の活性化を示す図である。Ｗｎｔ−β−カテニン経路の活性化は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実施されたｐＢＡＲルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて検出した。５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２は、ＦＺＤに対する一価結合ドメインの一方を含有し、やはりＷｎｔ経路を活性化するが、（同じエピトープに対する２つのＦＺＤ結合ドメインを含有する）５０１９Ａｇに対し８倍の効能の減少を示す。５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−ＭＢＰは、Ｃ末端にＬＲＰ６−Ｗ３結合ドメインを１つのみ保持し、はるかに低い効能を呈する。重要なことは、２つの単ＦＺＤ：単ＬＲＰ６ダイアボディの５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−２５３９−ＭＢＰおよび５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−ＭＢＰ−２５４２、ならびにＬＲＰ６−Ｗ１部位が１つであるダイアボディ５０１９−Ｋ／Ｈ−ＭＢＰ−２５４２について、最小限のアゴニスト活性が検出されたことである。
四価結合分子によるＷｎｔ−β−カテニン経路の活性化を示す図であり、図中、ＷＮＴ３Ａ結合部位を標的とする抗ＬＲＰ５パラトープは、ＷＮＴ１結合部位を標的とする抗ＬＲＰ６パラトープに置換されて、両方の共受容体を動員できる分子（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ５／６３）を生成し、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３と同様の活性が観察された（ＥＣ５０＝４ｎＭ）。
ＦＺＤ４に特異的なＦＺＤ結合ドメイン（この場合はホモダイアボディ）をＦｃドメインの一方の側に、ＬＲＰ６に対する共受容体結合ドメイン（２５３９および２５４２）をＦｃドメインの他方の側に有する多価結合分子（ＦＺＤ４Ａｇ：５０３８Ａｇ／５０３８−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０４４Ａｇ／５０４４−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０４８Ａｇ／５０４８−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０６３Ａｇ／５０６３−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０８０Ａｇ／５０１８０−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０８１Ａｇ／５０８１−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２）によって、内在性のＦＺＤ４受容体（−ＦＺＤ４）を有さないかまたはＦＺＤ４受容体（＋ＦＺＤ４）を発現するように改変されたレポーター細胞における、Ｗｎｔ−β−カテニン経路の活性化を示す図である。対照を、多価結合分子５０１９Ａｇ（５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２）、およびＦＺＤ４の内在性のアゴニストであるＮｏｒｒｉｎとする。その結果、５０１９Ａｇ／５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２（パンＦＺＤアゴニスト）内の５０１９ＦＺＤ結合ドメイン（ＦＺＤ１、２、４、５、７、８を認識する）をＦＺＤ４に選択的な結合ドメインへ置き換えることによって、選択的なＦＺＤ４アゴニストの開発が可能となったことが実証されている。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＢＡＲＬ（Ｗｎｔ−βカテニンルシフェラーゼレポーター）およびＲｌｕｃ（正規化対照）、挙げられたＦＺＤアゴニストをコードするプラスミドを、ＦＺＤ４およびＬＲＰ６のｃＤＮＡのある場合とない場合とでトランスフェクトした。ＮｏｒｒｉｎをＦＺＤ４の活性化のための陽性対照として使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、殆どまたは全く検出不能なレベルのＦＺＤ４を発現し、それゆえＦＺＤ４アゴニストは、トランフェクトされたＦＺＤ４ ｃＤＮＡの存在時に初めてレポーター遺伝子を活性化できる。これに対して、パンＦＺＤａｇ５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２は、これらの細胞で、他の内在的に発現されるＦｒｉｚｚｌｅｄの活性化を介して、ＦＺＤ４の不在または存在下時に、Ｗｎｔ−βカテニンシグナル伝達を堅固に活性化する。
Ｆｃの一方の側にＦＺＤ２（２８７６、２８９０）、ＦＺＤ２／７（２８８６）、ＦＺＤ６（２７４７）、またはＦＺＤ９／１０（２９６９、２９７４）に特異的な結合ドメイン（ホモダイアボディ）を有し、Ｆｃの他方の側に２５３９および２５４２の抗体断片によって形成されたＬＲＰ６ヘテロダイアボディを有する多価結合分子による、Ｗｎｔ−β−カテニン経路の活性化を示す図である。Ｗｎｔ−β−カテニン経路の活性化は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｐＢＡＲＬアッセイを用いて評価した。
ＦＺＤ結合ドメインを有する多価結合分子によるＷｎｔ経路の活性化を示す図であり、このＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤにパン特異的であり、ＦＺＤへのＷｎｔの結合とＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達とを遮断するＩｇＧに由来するものである。これらの分子内のＬＲＰ６結合ドメインは、ＦｃのＣ末端にあり、抗体２５３９と２５４２とから形成されるダイアボディからなるが、それらの抗体は、ＬＲＰ６上のＷｎｔ３結合部位およびＷｎｔ１結合部位をそれぞれ認識するパラトープを有するものである。
ＦＺＤ結合ドメインを有する多価結合分子によるＷｎｔ経路の活性化を示す図であり、このＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤにパン特異的であり、ＦＺＤへのＷｎｔの結合を遮断せずかつＷｎｔ３誘導性経路の活性化に拮抗しないＩｇＧに由来する。これらの分子のＬＲＰ６結合ドメインは、ＦｃのＣ末端にあり、抗体２５３９および２５４２によって形成するダイアボディからなるが、これらの抗体は、ＬＲＰ６上のＷｎｔ３結合部位およびＷｎｔ１結合部位をそれぞれ認識するパラトープを有するものである。
本発明の３つの四価結合分子のＦＺＤ／ＬＲＰ６結合の挙動の比較を示す図である。５０１９−Ｆｃ−２５３９、５０１９−Ｆｃ−２５４２、５０１９−Ｆｃ−２５３９−２５４２は、ＦＺＤに強固に結合するが、弱いＬＲＰ６相互作用（左のグラフ）またはＦＺＤ／ＬＲＰ６共結合（中間のグラフ）を呈する。５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２のＦＺＤ結合のプロファイル（右のグラフ）は、それがＦＺＤ４、ＦＺＤ５、およびＦＺＤ７を認識することを示している。
Ｗｎｔ１との結合を媒介することが知られているＬＲＰ５／６の上部の２つのプロペラ（Ｅ１−Ｅ２）と、形質膜近位にありＷｎｔ３との相互作用を媒介することが知られているＬＲＰ５／６の下部の２つのプロペラ（Ｅ３−Ｅ４）の結合との図説である。図６Ａはまた、Ｗｎｔ１がＬＲＰ５／６およびＦＺＤ受容体と相互作用し、Ｗｎｔ３がＬＲＰ５／６およびＦＺＤ受容体と相互作用することを図説する。
多価結合分子５０１９−Ｆｃ−２５３９、５０１９−Ｆｃ−２５４２、および５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２による、ＦＺＤ受容体とＬＲＰ５／６受容体との起こりうる相互作用の図説である。
ｐＢＡＲルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて測定された際に、多価結合分子がＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＷｎｔ−βカテニン経路を堅固に活性化するアゴニストであることを実証する図である。５０１９−Ｆｃ−２５３９ホモダイアボディは、複数のＦＺＤ受容体と（５０１９はＦＺＤ１、２、４、５、７、８を結合する）、ＬＲＰ６上のＷｎｔ３ａ部位（２５３９）とに結合して、精製Ｗｎｔリガンドと同等のレベルにレポーターを活性化する。５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２ヘテロダイアボディは、ＬＲＰ６上のＷｎｔ３ａ結合部位およびＷｎｔ１結合部位の両方に結合し、さらに効果的である。
５０１９−Ｋ／Ｈ−２４５９：２４６０もＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＷｎｔ−βカテニン経路を活性化することを実証する図であり、この分子は、ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ立体配置でＦｃドメインを有し、パンＦＺＤ特異的な（５０１９）ＦＺＤ結合ドメイン（ホモダイアボディ）と、ＬＲＰ５上の２つの部位に二重特異性の（２４５９はＷｎｔ１結合部位を結合し、２４６０はＷｎｔ３結合部位を結合する）共受容体結合ドメイン（ヘテロダイアボディ）とを有する、四価結合分子である。
５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２（ＦＺＤ１、２、４、５、７、８を認識するパンＦＺＤアゴニスト）内のＦＺＤ結合ドメインをＦＺＤ５（＃２９２８）に特異的なＦＺＤ結合ドメインに置き換えることによって、選択的なＦＺＤ５アゴニストが生成されたことを実証する図である。ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞がその増殖について、ＦＺＤ５シグナル伝達に依存することが示されている。Ｗｎｔ分泌阻害剤ＬＧＫ９７４（アシルトランスフェラーゼＰｏｒｃｕｐｉｎｅを標的とする）を用いてＷｎｔ−ＦＺＤ５シグナル伝達を遮断することによって、細胞周期の停止と増殖の阻害に至る。増殖は、外因性Ｗｎｔ３ａ条件培地の添加により、またはＦＺＤ５選択的なアゴニストｓ（２９２８−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２）もしくは本明細書に記載されるパンＦＺＤアゴニスト（５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２）の添加により、レスキューすることができる。ＦＺＤ４選択的なアゴニスト５０３８−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２は、中程度のレスキュー能を有するに過ぎない。
ＦＺＤ２特異的なＦＬａｇによるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の刺激が、骨形成マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）の堅固な誘導を、パンＦＺＤ ＦＬＡｇにより達成された場合と同様のレベルに生じるのに対し、ＦＺＤ５特異的なＦＬＡｇが最小限の活性を呈することを実証する図である。
本発明のパンＦＺＤａｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）が、外因性Ｗｎｔ３Ａ条件培地に完全に取って代わって、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅの小分子阻害剤であるＬＧＫ９７４によりＷｎｔ分泌を遮断すると腸オルガノイドの成長阻害をレスキューする（左下の写真）ことを示す図である。マウスから単離された腸オルガノイドは、組換えＲ−スポンジンの存在下で成長し、パネート細胞によって分泌されるＷｎｔリガンドの存在を必要とする。図８Ａは、ＬＧＫ９７４を用いたＷｎｔ産生の阻害がオルガノイドの死をもたらす（右上の写真）ことを図示する。Ｗｎｔ３Ａ条件培地（右下の写真）またはＦＺＤａｇ（左下の写真）の外因的な添加によって、ＬＧＫ９７４の存在下でオルガノイドの成長がレスキューされる。左上の写真は、対照としてＬＧＫ９７４を含まずＤＭＳＯにより処理されたオルガノイドを図示する。 オルガノイドの死をもたらすＬＧＫ９７４によるＷｎｔ産生の阻害が、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ（登録商標）アッセイ、プロメガを用いて定量化された際に、Ｗｎｔ３Ａ調整培地またはＦＺＤａｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）の添加によってレスキューされうることを実証している図である。
ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ立体配座で二量体化してパンＦＺＤａｇ ５０１９−ＫＨ−２５３９−２５４２（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）を形成するペプチドをコードする、プラスミドの一例を示す図である。図９Ａは、「ｋｎｏｂ」変異を含むＦｃ領域と、パンＦＺＤ抗体＃５０１９のＶＨおよびＶＬと、ＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＬと、ＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＨとを含むペプチドをコードする、プラスミドを図示する。 ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ立体配座で二量体化してパンＦＺＤａｇ ５０１９−ＫＨ−２５３９−２５４２（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）を形成するペプチドをコードする、プラスミドの一例を示す図である。図９Ｂは、「ｈｏｌｅ」変異を含むＦｃ領域と、パンＦＺＤ抗体＃５０１９のＶＨおよびＶＬと、ＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＨと、ＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＬとをコードする核酸を含むペプチドをコードする、プラスミドを図示する。これらのプラスミドによってコードされるペプチドは、四価結合ドメインを有するヘテロ二量体を形成し、このドメインは、パン特異的なＦＺＤ抗体＃５０１９のＶＨとＶＬとの対合によって生じるホモダイアボディ；ならびに一方のペプチド由来のＬＲＰ６抗体＃２５３９のＶＬおよびＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＨと、他方のペプチド由来のＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＨおよびＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＬとの対合によって生じる二重特異性ヘテロダイアボディを含む。
ヘテロ二量体のｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ立体配置である５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）の概略図である。Ｆｃ内でｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ立体配置を用いて、分子のモジュール性を最大４つの異なる結合部位に増加させることができる。この分子（５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２）について、パンＦＺＤホモダイアボディをＦｃドメインの一方の側に工学的に作出し、Ｗｎｔ３（２５３９）およびＷｎｔ１（２５４２）ＬＲＰ６結合部位を含有するヘテロダイアボディをＦｃドメインの他方の側に作出する。
５０１９−ｋｎｏｂ−２５３９：２５４２多価結合分子の核酸配列（配列番号２１プラス追加の３’ＴＧＡ、およびその相補配列）のドメインのアノテーションである。 ５０１９−ｋｎｏｂ−２５３９：２５４２多価結合分子の核酸配列（配列番号２１プラス追加の３’ＴＧＡ、およびその相補配列）のドメインのアノテーションである。 ５０１９−ｋｎｏｂ−２５３９：２５４２多価結合分子の核酸配列（配列番号２１プラス追加の３’ＴＧＡ、およびその相補配列）のドメインのアノテーションである。 ５０１９−ｋｎｏｂ−２５３９：２５４２多価結合分子の核酸配列（配列番号２１プラス追加の３’ＴＧＡ、およびその相補配列）のドメインのアノテーションである。
Ｗｎｔ−βカテニン経路の活性化因子としてＦＺＤとＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位およびＷｎｔ３結合部位（ＦＬＡｇ）とに結合する、四価結合分子の設計およびバリデーションを示す図である。図１１Ａは、抗ＦＺＤＦａｂに阻害的な（上部）および特異的な活性（下部）を図示する。 Ｗｎｔ−βカテニン経路の活性化因子としてＦＺＤとＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位およびＷｎｔ３結合部位（ＦＬＡｇ）とに結合する、四価結合分子の設計およびバリデーションを示す図である。図１１Ｂは、標示されたｉｎダイアボディ−Ｆｃ形式中のＬＲＰ６Ａｂによる、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３Ａのシグナル伝達の阻害を図示する。 Ｗｎｔ−βカテニン経路の活性化因子としてＦＺＤとＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位およびＷｎｔ３結合部位（ＦＬＡｇ）とに結合する、四価結合分子の設計およびバリデーションを示す図である。図１１Ｃは、四価のＦＬＡｇの分子構造物を図示する。 Ｗｎｔ−βカテニン経路の活性化因子としてＦＺＤとＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位およびＷｎｔ３結合部位（ＦＬＡｇ）とに結合する、四価結合分子の設計およびバリデーションを示す図である。図１１Ｄは、パン特異的なＦＬＡｇタンパク質（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋１、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６３＋３、およびＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）の系列希釈物（ｘ軸）による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＬＥＦ／ＴＣＦレポーター遺伝子の活性化（ｙ軸）についての用量応答曲線を示す。 Ｗｎｔ−βカテニン経路の活性化因子としてＦＺＤとＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位およびＷｎｔ３結合部位（ＦＬＡｇ）とに結合する、四価結合分子の設計およびバリデーションを示す図である。図１１Ｅは、標示された濃度のパンＦＬＡｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）による処理の３０分後のＲＫＯ細胞におけるβカテニンタンパク質のレベルを図示する。 Ｗｎｔ−βカテニン経路の活性化因子としてＦＺＤとＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位およびＷｎｔ３結合部位（ＦＬＡｇ）とに結合する、四価結合分子の設計およびバリデーションを示す図である。図１１Ｆは、１０ｎＭのパンＦＬＡｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）により処理されたＲＫＯ細胞におけるβカテニンおよびリン酸化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−２（ｐ−Ｄｖｌ２）タンパク質レベルの経時変化を図示する。
ＦＬＡＧ ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の結合および活性の特性解析および精査を示す図である。図１２Ａは、１０種のヒトＦＺＤ ＣＲＤのうち９種およびヒトＬＲＰ６ ＥＣＤに対するＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の結合カイネティクスを図示する。 ＦＬＡＧ ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の結合および活性の特性解析および精査を示す図である。図１２Ｂは、１０種のヒトＦＺＤ ＣＲＤのうち９種およびヒトＬＲＰ６ ＥＣＤに対するＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の結合カイネティクスを図示する。 ＦＬＡＧ ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の結合および活性の特性解析および精査を示す図である。図１２Ｃは、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３が従来のＩｇＧと同様の挙動を示し、用量およびｐＨに依存的な様式でＦｃＲｎと相互作用することを実証しいている。 ＦＬＡＧ ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の結合および活性の特性解析および精査を示す図である。図１２Ｄは、補体（Ｃ１ｑ）、ナチュラルキラー細胞マーカーＣＤ１６ａ、Ｂ細胞マーカーＣＤ３２ａ、および単球およびマクロファージマーカーＣＤ６４を含めた他のＦｃエフェクターとの相互作用について、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３もまた上記ＩｇＧと同様の挙動を示すことを実証している。
３０ｎＭのＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３ｆｏｒによる３日間の処理により、６μＭのＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１による処理と同等のレベルに、中胚葉マーカーＢＲＡＣＨＹＵＲＹの堅固な誘導と多能性マーカーＯＣＴ４発現の減少とが引き起こされたことを実証する図である。 ３０ｎＭのＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３ｆｏｒによる３日間の処理により、６μＭのＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１による処理と同等のレベルに、中胚葉マーカーＢＲＡＣＨＹＵＲＹの堅固な誘導と多能性マーカーＯＣＴ４発現の減少とが引き起こされたことを実証する図である。
ビヒクル、Ｃ５９、またはパンＦＬＡｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）＋Ｃ５９により処置されたＬＧＲ５−ＧＦＰマウス由来の小腸切片の代表的な蛍光イメージを示す図である。ＬＧＲ５−ＧＦＰは、陰窩の下部の幹細胞に発現される。細胞核をＤＡＰＩにより対比染色した。
本明細書に記載されるのは、Ｆｃドメインと、ＦＺＤ結合ドメインと、Ｗｎｔ共受容体に対する結合ドメインとを含む多価結合分子であって、上記結合ドメインは、Ｆｃドメインの反対側の末端に付加される。本発明の多価結合分子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストであって、本明細書では互換的にＦＺＤアゴニストまたはＦＺＤａｇと称される。Ｗｎｔリガンドは、ＦＺＤ受容体と共受容体とのクラスター化を促進することによって機能する。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される多特異性分子は、ＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体に同時に結合して、それによってＷｎｔシグナル伝達経路を活性化することが想定される。
本明細書に記載されるＷｎｔシグナル伝達経路を活性化するための多価結合分子のモジュール性および有効性は、先行文献に記載されているＷｎｔサロゲートとは対照的であり、そのＷｎｔサロゲートは、一価のＦＺＤ結合リガンドとＬＲＰ５／６結合リガンドとからなり、Ｆｃドメインの反対側の末端に結合リガンドが付加されていない。本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合する抗体またはポリペプチドに由来する結合部分を含み、共受容体結合ドメインは、共受容体、例えばＬＲＰ５／６、ＲＯＲ１／２、ＲＹＫ、またはＰＴＫ７に結合する結合部分を含む。本発明の一実施形態では、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合する抗体またはポリペプチドは、１つまたは複数のＦＺＤ受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する。
ＦＺＤ受容体のアミノ酸配列およびをＦＺＤ受容体コードするヌクレオチド配列、ならびにＦＺＤまたはＷｎｔ共受容体ＬＲＰ５／６、ＲＯＲ１／２、ＲＹＫ、またはＰＴＫ７を結合する抗体および抗体のライブラリーは、容易に入手できるか、または、当技術分野に周知の方法を用いて生成することができる（例えば、発明者Ｇｕｒｎｅｙらの米国特許出願公開公報第２０１５／０２３２５５４号、および発明者Ｓｉｄｈｕらの米国特許出願公開公報第２０１６／０１９４３９４号、および発明者Ｐａｎらの米国特許出願公開公報第２０１９００４０１４４号；発明者Ｗｕらの米国特許出願公開公報第２０１７／０１６６６３６号；発明者Ｃｈｅｎらの米国特許出願公開公報第２０１６／０２０８０１８号；発明者Ｍａｃｈｅｄａらの米国特許出願公開公報第２０１６／００５３０２２号；発明者Ｄａｍｅｌｉｎらの米国特許出願公開公報第２０１５／０３１２９３号を参照）。
選択された標的に結合するペプチドまたはポリペプチドを生成するための方法は、当技術分野に周知であり、例えば Sidhu et al. Methods in Enzymology (2000) 328: 333-336を参照されたい。例えば、ＦＺＤまたはＷｎｔ共受容体に結合するアフィボディのライブラリーは、当技術分野に公知のプロトコール（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号およびLofblom et al., FEBS Letters 584 (2010) 2670-2680) に従って取得されてもよく；ＦＺＤまたはＷｎｔ共受容体を結合するペプチドの選択に用いられるアンキリン反復タンパク質のライブラリーは、当技術分野に公知のプロトコール（例えば、発明者ＳｔｕｍｐｐらのＷＯ０２／０２０５６５を参照）に従って取得されてもよく、ＦＺＤまたはＷｎｔ共受容体を結合するペプチドの選択に用いられるフィブロネクチン反復タンパク質のライブラリーもまた、当技術分野に公知のプロトコール（例えば、発明者ＤｉｅｍおよびＪａｃｏｂｓの米国特許第９，２００，２７３号を参照）に従って取得されてもよい。また、ＦＺＤまたはＷｎｔ共受容体に結合するペプチドは、ヒトＦｙｎのＳＨ３ドメインを由来とする小さな結合タンパク質であるフィノマーとしてもよいし、ヒトのアポリポタンパク質Ｄに基づく人工受容体タンパク質である「アンチカリン」が、当技術分野に公知の方法を用いて生成されてもよく、例えばSilacci et al., J. Biol. Chem (2014) 289(20):14392-8およびVogt and Skerra, ChemBioChem (2004) 5, 191-199を参照されたい。
本明細書に記載される抗原結合ペプチドの供給源として適した抗体は、所望の１つまたは複数の活性を有するポリペプチドについてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離されてもよい。例えば、所望の結合特性を有する抗体について、ファージディスプレイライブラリーを生成し、そのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当技術分野に公知である。そのような方法は、例えばHoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37（O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001）に概括され、例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)にさらに記載されている。ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬの遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングして、ファージライブラリー内にランダムに組み換え、次いで、このライブラリーを、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のどちらかとして提示する。免疫された供給源から得られたライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要することなく、免疫原に対する高親和性抗体を与える。あるいは、ナイーブレパートリーをクローニングして（例えばヒトから）、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)により記載される任意の免疫を行うことなく、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する単一の供給源の抗体を与えることができる。最後に、ナイーブライブラリーは、合成により作製することもでき、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)によって記載されるように、再編成されていないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、ならびに高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードするためのかつｉｎ ｖｉｔｒｏでの再編成を達成するためのランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを用いることによって、この作製を行う。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開公報第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、および第２００９／０００２３６０号が挙げられる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書のヒト抗体またはヒト抗体断片であるものと考えられる。
そのため、当業者は、Ｆｃドメインを容易に調製し、所望の特異性を有する多価のＦＺＤ結合ドメインおよびＷｎｔ共受容体結合ドメインをＦｃドメインのＮ末端およびＣ末端上で混合し適合させて、所望のＦＺＤ受容体および共受容体を結合しそれによって特異的なＷｎｔ経路を活性化する多価結合分子を調製するものとなる。これらの特異的なアゴニストは、細胞の増殖、分化、オルガノイドの生存および維持、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの組織の再生を亢進する際の強力なツールとして役割を果たすものとなる。これらの特異的なアゴニストはまた、これらのプロセスに含まれるＦＺＤ特異性をプロファイリングするための強力なツールとして役割を果たす。例えば、本明細書に記載されるように、ＦＺＤ４ＡｇではなくＦＺＤ５Ａｇが、ＬＧＫ９７４処理されたＲＮＦ４３変異体ＰＤＡＣ細胞株の成長欠陥をレスキューするが、このことは、このプロセスにおいてＦＺＤ５がＦＺＤ４受容体を超える重要性を有することを強調するものである。
本発明の一実施形態は、細胞上のＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体に対するペプチドによって結合に影響を及ぼす方法であって、本方法では、ＦＺＤ受容体と共受容体との両方に対するペプチドによる結合が、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する。本方法は、Ｃ末端およびＮ末端を有するＦｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片を選択すること、ＦＺＤ受容体を結合する第１の多価結合ドメインをＦｃドメインの一方の末端で連結すること、Ｗｎｔ共受容体に結合する第２の多価結合ドメインをＦｃドメインの他方の末端で連結すること、それによって多価結合分子を形成すること、および次いで、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する条件下で、前記ＦＺＤ受容体および共受容体を発現する細胞に多価結合分子を接触させることを含む。
本発明の一実施形態では、本多価結合ドメインは、１つもしくは複数のＦＺＤ受容体に結合する単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体のリガンド、またはＦＺＤ受容体もしくは共受容体に結合するその断片を含むことがある。別の実施形態では、結合ドメインは、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体のリガンド、またはＦＺＤ受容体もしくは共受容体に結合するその断片を含まない。
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのＦＺＤまたは共受容体の多価結合ドメインは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドを有するダイアボディを含み、その場合、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬは、他方のペプチドのＶＬおよびＶＨと対合し、その結果、結合ドメインは２つのエピトープ結合部位を有する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＦＺＤ受容体または共受容体上のＷｎｔ結合部位に結合する抗体のＶＨおよびＶＬであることがある。ある抗体、すなわち元の抗体に由来するＶＨまたはＶＬは、元の抗体のＶＨおよびＶＬと５０％、５５％、６０％、７５％．８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有することがあり、抗体の結合するＦＺＤ受容体または共受容体部位への結合性を依然として保持する。
本発明の一実施形態では、本発明の多価結合分子は、表１の多価結合分子を含む（表１は表１Ａおよび表１Ｂを含む：表１Ａは本発明の例示的な多価結合分子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を標示する；表１Ｂは例示的な多価結合分子の様々なドメインのヌクレオチド配列を標示する）。本発明の一実施形態では、本発明の多価結合分子は、表１の多価結合分子から本質的になる。本発明の一実施形態では、本発明の多価結合分子は、表１の多価結合分子からなる。
本発明の一実施形態では、本多価結合ドメインは、表１の分子の１つまたは複数のＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。本発明の一実施形態では、本多価分子の多価結合ドメインは、表１の分子の１つまたは複数のＶＬドメインおよびＶＨドメインから本質的になる。本発明の一実施形態では、本多価分子の多価結合ドメインは、表１の分子の１つまたは複数のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる。本発明の一実施形態では、本明細書に記載される多価分子の結合ドメインは、表１に規定される分子のＶＨおよびＶＬと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有し、かつ表１に規定された分子の結合する抗原への結合性を保持する、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載される多価分子の結合ドメインは、表１に規定される分子の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の一実施形態では、本明細書に記載される多価分子の結合ドメインは、表１に規定される分子のＣＤＲと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有し、かつ表１に規定される分子の結合する抗原への結合性を保持する、ＣＤＲを含む。
本発明の多価結合分子の結合するＦＺＤ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、またはＦＺＤ１０であることがある。ＦＺＤ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７、またはＦＺＤ８であることがある。多価結合分子は、唯一つのＦＺＤ受容体に結合してもよいし、１つを超えるＦＺＤ受容体へのパン特異的な結合であってもよい。ＦＺＤ多価結合ドメインは、例えばＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７、およびＦＺＤ８に結合してもよい。ＦＺＤ多価結合ドメインは、１つのＦＺＤ受容体、例えばＦＺＤ２、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、またはＦＺＤ６に特異的に結合してもよい。
本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、単一特異性であり、ＦＺＤ受容体上の単一のエピトープに結合する。本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、二重特異性であり、ＦＺＤ受容体上の２つのエピトープに結合する。
共受容体結合ドメインは、任意のＷｎｔ共受容体、例えばＬＲＰ５／６またはＲＯＲ１／２に結合することがある。多価の共受容体結合ドメインは、例えばＬＲＰ５／６、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１／２、ＲＹＫ、ＧＰＲ１２、ＴＳＰＡＮ１２、またはＣＤ１３３に結合することがある。本発明の一実施形態では、共受容体多価結合ドメインは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に結合する。
本発明の一実施形態では、共受容体多価結合ドメインは、共受容体上の単一のエピトープ、例えばＷｎｔ１またはＷｎｔ３を結合するＬＲＰ５／６のエピトープに結合する。本発明の一実施形態では、共受容体多価結合ドメインは、共受容体内の２つのエピトープ、例えばＷｎｔ１に結合するＬＲＰ５／６上のエピトープおよびＷｎｔ３に結合するエピトープに結合する。本発明の多価結合分子の結合するＷｎｔ共受容体は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＧＰＲ１２４、ＴＳＰＡＮ１２、またはＣＤ１３３であることがある。
本発明の一実施形態では、本多価結合分子はＦｃドメインを含み、その場合、Ｆｃドメインは、イムノグロブリンのＦｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片である。本発明の一実施形態では、イムノグロブリンはＩｇＧである。本発明の一実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ１である。
本発明の一実施形態は、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する方法であって、本方法は、ＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体を有する細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するのに有効な量で本発明の多価結合分子に接触させることを含む。
本発明の一実施形態では、少なくとも１つの多価結合ドメインは、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体を結合するｓｃＦｖを含むか、またはＦＺＤ受容体もしくは共受容体のリガンドもしくは前記リガンドの断片を含む。本発明の一実施形態では、少なくとも１つの多価結合ドメインは、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体を結合するｓｃＦｖを含まないか、またはＦＺＤ受容体もしくは共受容体のリガンドもしくは前記リガンドの断片を含まない。
本発明の一実施形態では、ＦＺＤ多価結合ドメインはＦＺＤダイアボディを含み、共受容体多価結合ドメインは共受容体ダイアボディを含み、その場合、ダイアボディは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドを含み、結合ドメインは、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬを他方のペプチドのＶＨおよびＶＬと対合させ、それにより結合ドメインを形成させることによって、形成される。
ＦＺＤ結合ドメインのＶＨおよびＶＬは、ＦＺＤ受容体を結合し、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するかまたはＦＺＤ受容体へのＷｎｔリガンドの結合を阻害する、抗体に由来することがある。ＦＺＤ結合ドメインのＶＨおよびＶＬは、ＦＺＤ受容体へのＷｎｔリガンドの結合に拮抗または阻害することなくＦＺＤ受容体を結合する、抗体に由来することがある。
共受容体結合ドメインのＶＨおよびＶＬは、共受容体を結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を拮抗するかまたは共受容体へのＷｎｔリガンドの結合を阻害する、抗体に由来することがある。共受容体結合ドメインのＶＨおよびＶＬは、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するかまたは共受容体へのＷｎｔリガンドの結合を阻害することなく共受容体を結合する、抗体に由来することがある。
本発明の多価結合分子では、結合ドメインの一方または両方は、二価であってもよく、二価の結合ドメインの一方または両方は、ＦＺＤ受容体または共受容体について二重特異性であってもよい。本発明の一実施形態では、両方の結合ドメインが二価かつ二重特異性であり、各結合ドメインは、それらのそれぞれの標的であるＦＺＤ受容体または共受容体上の２つの異なるエピトープに結合する。例えば、結合分子は、ＦＺＤ受容体に対する二価かつ二重特異性のＦＺＤ結合ドメイン（２つの異なるエピトープに結合）を含んでいてもよいし、結合分子は、共受容体に対する二価かつ二重特異性の共受容体結合ドメインを含んでいてもよい。
本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、本多価結合分子のＦｃドメインのＮ末端に付加されており、共受容体結合ドメインは、ＦｃドメインのＣ末端に付加されている。本発明の一実施形態では、ＦＺＤ結合ドメインは、本多価結合分子のＦｃドメインのＣ末端に付加されており、共受容体結合ドメインは、ＦｃドメインのＮ末端に付加されている。
また、本発明の一実施形態は、本明細書に記載される多価結合分子をコードする核酸分子であり、そのようなものとしては、多価結合分子をコードする核酸分子を含む発現カセットおよびベクターが挙げられる。この核酸分子は、ベクター内に挿入して、適切な宿主細胞で発現することができ、次いで、当技術分野に周知の方法を用いて、その細胞から本多価結合分子を単離することができる。本発明に使用される際に、用語「ベクター」とは、核酸分子、例えば本明細書に記載される多価結合分子をコードする核酸配列を含有するように工学的に作製できる、核酸送達ビヒクルまたはプラスミドを指す。ポリヌクレオチドを挿入されるとタンパク質を発現することのできるベクターは、発現ベクターとよばれる。ベクターは、形質転換、形質移入、またはトランスフェクションによって宿主細胞内に挿入することができ、その結果、持ち込まれた遺伝子物質を宿主細胞で発現することができる。ベクターは、当技術分野の技術者に周知であり、そのようなものとしては、以下に限定されないが：プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；ファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージなど、および動物ウイルスなどが挙げられる。動物ウイルスとしては、以下に限定されないが、逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えばヘルペス単純ウイルス）、水痘ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（ＳＶ４０など）が挙げられよう。ベクターは、本明細書に記載される多価結合分子の発現を制御する複数の構成成分を含有することができ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、プロモーター、例えばウイルスもしくは真核生物のプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、シグナルペプチド、例えばＴＲＹＰ２シグナルペプチド、転写開始因子、エンハンサー、選択エレメント、およびレポーター遺伝子が挙げられる。さらに、ベクターは、複製開始部位（複数可）も含有することがある。
本発明に使用される際に、用語「宿主細胞」とは、ベクターを移送できる細胞を指し、そのようなものとしては、以下に限定されないが、大腸菌や枯草菌などの原核細胞；酵母やアスペルギルスなどの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９などの昆虫細胞、または、ヒト細胞、例えば繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、またはＨＥＫ２９３細胞を含む動物細胞が挙げられる。
本発明の一実施形態は、本明細書に記載されるＦＺＤアゴニストを含む医薬組成物および医薬的に許容可能な賦形剤である。本医薬組成物はさらに、Ｗｎｔ経路を活性化する追加の剤、例えばＮｏｒｒｉｎまたはＲ−スポンジンを含むことがある。本医薬組成物は、本明細書に記載される多価結合分子および医薬的に許容可能な担体または賦形剤からなるか、または本質的になることがある。適した担体およびそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995に記載されている。典型的には、適切な量の医薬的に許容可能な塩が、製剤を等張にするように製剤に使用される。医薬的に許容可能な担体の例としては、以下に限定されないが、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８までであり、さらに好ましくは約７から約７．５である。さらに、担体には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれ、そのようなマトリックスは、成形品、例えばフィルム、リポソーム、または微小粒子の形態である。例えば、投与されているＦＺＤアゴニストの投与経路および濃度に応じて、ある特定の担体がより好ましい場合があることが、当業者には明らかとなる。
Ｗｎｔシグナル伝達は、細胞および組織の分化を調節するユビキタスな経路である。例えば、眼の発生に関しては、ある特定のＷｎｔ経路、すなわちＮｏｒｒｉｎ−ＦＺＤ４経路が、網膜の血管新生で役割を果たすものとして特定されている。Ｎｏｒｒｉｎ−ＦＺＤ４経路を介したシグナル伝達は、網膜の脈管構造の発生および維持に必要である。この経路の遺伝子に影響を及ぼす変異は、いくつかの小児性硝子体網膜症、例えばノリエ病、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、および偽神経膠腫・骨粗鬆症症候群を結果として生じることがある。さらに、未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、この経路内の変異に関連があり、Ｗｎｔ経路の変異は、コーツ病および胎児循環遺残（Persistent Fetal Vasculature （ＰＦＶ））において報告されている。Ｎｏｒｒｉｎ−ＦＺＤ経路はまた、ＣＮＳの血管の発生にも関連がある。Ｎｏｒｒｉｎ、ＦＺＤ４、Ｌｒｐ５、および共受容体テトラスパニン１２（Ｔｓｐａｎ−１２）を遺伝子的に除去すると、結果として、網膜血管と小脳血管との両方において不完全な血管新生と関門の崩壊とを生じる（Cho et al. (2017) Neuron 95, 1056-1073；Zhou et al., (2014) J Clin Invest 124:3825−3846）。本発明のＦＺＤ４アゴニスト、具体的にはＦＺＤ４結合ドメインをＦｃ受容体の一方の末端に、ならびにＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６をＦｃドメインの他方の結合ドメインに含むＦＺＤ４ ＦＬＡｇは、関門機能を強化し、血管新生を推進するものとなること、例えば、ＦＺＤ４ ＦＬＡｇによる治療は、網膜の脈管構造および／または 血液網膜関門（ＢＲＢ）および血液脳関門（ＢＢＢ）の発生および維持を推進するものとなることが、本明細書に具体的に想定される。そのため、本発明の態様は、局所または全身投与を介して眼組織、例えば網膜組織を有効量のＦＺＤ４ ＦＬＡｇにより治療することによって、網膜脈管構造を促進および／または維持する方法である。また本発明の一態様は、全身投与に従ってＢＢＢを有効量のＦＺＤ４ ＦＬＡｇにより治療することによって、ＢＢＢ脈管構造を促進および／または維持するための方法である。本発明のさらに別の態様は、網膜または脳の血管新生の低減という特徴がある障害を有する対象に有効量のＦＺＤ４ ＦＬＡｇを投与することによって、そのような対象を治療するための方法であって、この有効量は、そのような対象で網膜または脳の血管新生を増加させるのに十分な量である。対象は胎仔である場合がある。
病理学的に低いレベルのＷｎｔシグナル伝達は、骨粗鬆症、多発性嚢胞腎疾患、および神経変性疾患に関連している。Ｗｎｔ経路の活性化の制御は、組織の修復や創傷治癒などの再生のプロセスを促進することが示されている。Zhao J, Kim KA, and Abo A, Trends Biotechnol. 27(3):131-6 (Mar. 2009)。また、Logan CY and Nusse R, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781-810 (2004)；Nusse R., Cell Res. 15(1):28-32 (Jan. 2005)；Clevers H, Cell 127(3):469-80 (3 Nov. 2006)も参照されたい。概念実証（proof-of-concept）実験が行われ、骨粗鬆症または粘膜炎におけるＷｎｔシグナル伝達の役割が示されている。さらに、Ｗｎｔシグナル伝達の増加は、糖尿病および他の代謝疾患の治療に有益である可能性があることが示唆されている。Ｗｎｔシグナル伝達の減少は、代謝疾患に関連している。機能喪失性のＬＲＰ６Ｒ６１１Ｃ変異は、ヒトに初期の冠動脈疾患、代謝症候群、および骨粗鬆症をもたらす。Main A et al, Science 315:1278 (2007)。「ＬＲＰ５の機能喪失性変異は、ヒトにおいて骨粗鬆症、グルコース代謝不全、および高コレステロール血症に関連する」。Saarinnen et al., Clin Endocrinol 72:481 (2010)。ＬＲＰ５とａｐｏＥとの両方を欠失したマウスにおける、重度の高コレステロール血症、脂肪耐性の不全、およびアテローム性動脈硬化の進行。Magoori K. et al., JBC 1 1331 (2003)。ＬＲＰ５は、マウスにおいて、正常なコレステロール代謝とグルコ−ス誘発性のインスリン分泌に必須である。Fujino et al., PNAS 100:229 (2003)。ＴＣＦ７Ｌ２バリアントは、２型糖尿病のリスクをもたらす。Grant et al., Nat Genet 38:320 (2006)；Florez et al., N Engl J Med 355:241 (2006)。Ｗｎｔシグナル伝達の増加は、代謝疾患を治療するために有益となりうる。したがって、代謝疾患に罹った対象に本発明の多価結合分子を投与することは、対象の代謝疾患を治療するために有用である。
炎症性腸疾患（ＩＢＰ）は、結腸および小腸の炎症状態の一群である。ＩＢＤの主なタイプは、クローン病および潰瘍性大腸炎である。ＲＳＰ０１タンパク質は、動物モデルで炎症性腸疾患を寛解させることが示されている。Zhao J et al., Gastroenterology 132:1331 (2007)。したがって、ＩＢＤに罹った対象に本発明の多価結合分子を投与することは、対象のＩＢＤを治療するために有用である。
そのため、本発明の一実施形態は、Ｗｎｔシグナル伝達の低減に関連した状態を有する対象を治療するための方法であり、この方法は、有効量の本発明のＦＺＤアゴニストを、それを必要とする対象に投与することを含む。上記の状態は、例えば骨粗鬆症、多発性嚢胞腎疾患、神経変性疾患、粘膜炎、短小腸症候群、胃腸粘膜の細菌移行、腸内毒素原性または腸疾患性の感染性下痢、セリアック病、非熱帯性スプルー、乳糖不耐症、および食物への曝露が粘膜繊毛の平滑化および吸収不良を引き起こす他の状態、萎縮性胃炎および糖尿病、骨折、組織の再生、例えば組織の修復および創傷治癒、ならびに糖尿病などの代謝疾患、および黒色腫であることがある。本発明の方法を用いて治療できる損傷組織の例としては、以下に限定されないが、腸組織、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、骨格筋、脳組織、骨組織、結合組織、および皮膚組織が挙げられる。本発明の多価結合分子は、Ｗｎｔシグナル伝達が低いという特徴を有した疾患または状態に罹った対象に投与することができる。本発明の多価結合分子は、Ｗｎｔシグナル伝達を増加し対象内の疾患または状態を寛解するのに有効な量で対象に投与される。
粘膜炎は、がん療法の臨床合併症である。粘膜炎は、高速増殖性細胞への放射線照射または化学療法の細胞毒性作用によって引き起こされる。粘膜炎は、主に腸内および口腔の粘膜に影響を及ぼす上皮の損傷からなる。臨床徴候は、口腔の激しい痛み、悪心、下痢、栄養不良であり、重度の場合には、敗血症および死亡である。これらの症状は、多くの場合、がん療法の用量制限に繋がることがある。固形腫瘍に対する化学療法または放射線照射療法に付随する口腔または胃腸の粘膜炎に対し、現在のところ利用可能な治療はない。
口腔粘膜炎は、がん治療の一般的な、そして多くの場合に衰弱させる合併症である。頭頸部がんの放射線療法を受けた患者の５０％と、５−ＦＵにより治療された患者の１０〜１５％が、グレード３〜４の口腔粘膜炎に罹る。ＲＳＰ０１は、動物モデルで口腔粘膜炎を寛解させることが示されている。Zhao J et al., PNAS 106:2331 (2010)。
短小腸症候群（ＳＢＳ）は、小腸の広範なセグメントの機能的または解剖学的な喪失の結果として生じ、それゆえに、消化能力および吸収能力が激しく損なわれる。毎年、多数の人々が、外傷、炎症性腸疾患、悪性病変、腸間膜虚血などを含めた様々な障害に対し、小腸の長いセグメントの切除を受ける。放射線照射などの様々な非手術性手順が、機能性短小腸症候群を引き起こす可能性がある。短小腸症候群に対する現在の療法としては、食物アプローチ、完全非経口栄養（ＴＰＮ）、腸の移植、および非移植の腹部手術が挙げられる。これらの治療は、ＳＢＳ患者のアウトカムの向上に寄与しているものの、小腸機能の低減という根本的な問題を部分的に正すに過ぎない。ＳＢＳ患者において残りの小腸の回復を加速することができる現行の療法はない。Seetharam and Rodrigues, The Saudi Journal of Gastroenterology 17, 229-235 (2011)を参照されたい。
成体の哺乳動物の消化管は、最も迅速に自己再生する組織の１つを構成し、そこでは、小腸粘膜は、増殖性の陰窩内および分化した絨毛内に折り込まれた連続的な構造を含む。粘膜の崩壊に応答して、宿主は、治癒応答を開始し、結果として粘膜の完全性の回復と粘膜の構造物の再生とをもたらす。この過程は、腸の幹細胞の増殖に大きく依存する。Neal et al., Journal of Surgical Research 167, 1-8 (2010)；van der Flier and Clevers, Annual Review of Physiology 71, 241-261 (2009)。
ゆえに、腸の幹細胞の活性を調節する因子は、宿主が腸管内の創傷に応答する能力において優勢な役割を果たす。Ｗｎｔタンパク質は、腸の幹細胞の増殖を支持する最も重要な成長因子であり、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することによって、腸上皮の増殖が増加するものとなる。これによって、小腸絨毛の数の増加と粘膜吸収表面積の増加とがもたらされるものとなる。
そのため、一実施形態では、本発明の多価結合分子は、短小腸症候群に罹った者に投与される。本多価結合分子は、胃腸の粘膜吸収の表面積を増加させるのに十分な量で投与される。偶発的な短小腸症候群に罹った者が経腸栄養に適応する際に、または一般的なＳＢＳに罹った者が経腸栄養から栄養を吸収する際に、またはその者にとって体重を維持するために毎日必要な非経口栄養の総量がその者で減少する際に、本発明の多価結合分子の投与は、成功したアウトカムを有する。
細菌移行の予防。一実施形態では、本発明の抗体は、腸内細菌によって敗血症を引き起こされるリスクにある者に投与される。多価結合分子は、胃腸粘膜の完全性を増加させて、それゆえに腸内細菌がその者の血流内を通過するのを防止するのに十分な量で投与される。胃腸粘膜の完全性の減少（ヒト集団では正常である胃腸粘膜の完全性に比較した際に）は、重体の病気患者における血流感染および敗血症の主な根源である。集中治療施設（ＩＣＵ）患者で観察された菌血症および敗血症の症例が、本発明の多価結合分子を投与されていない患者よりも少ない際に、本多価結合分子の投与は、成功したアウトカムを有する。
腸内毒素原性または腸疾患性の感染性下痢の間または後の回復の加速。感染性下痢は、小児の主要な問題である。一実施形態では、本発明の多価結合分子は、下痢の終わるまでの時間または正常な腸管運動までの時間を短縮するのに十分な量で投与される。本発明の多価結合分子は、標準治療に追加して投与することができ、この標準治療は、口腔または非経口の補水と、場合によっては抗生物質とを含む。本発明の多価結合分子を投与されていない小児患者に比べて、入院を減少させるか、入院期間を短縮するか、または脱水および電解質の異常という合併症の発生率の減少が小児患者に観察された際に、本多価結合分子の投与は、成功したアウトカムを有する。
セリアック病、非熱帯性スプルー、乳糖不耐症、および食物への曝露が粘膜繊毛の平滑化および吸収不良を引き起こす他の状態。一実施形態では、本発明の多価結合分子は、粘膜吸収の表面積を増加させるのに十分な量で投与される。本発明の多価結合分子は、標準治療に追加して投与することができ、この標準治療は、主には有害な食物と、場合によっては栄養補助食品とを避ける。セリアック病、非熱帯性スプルー、乳糖不耐症、または他の状態に罹った者が経腸栄養に抵抗するか、または上記状態のいずれかに罹った者が経腸栄養から栄養を吸収するか、またはその者にとって体重を維持するために毎日必要な非経口栄養の総量がその者で減少する際に、本発明の多価結合分子の投与は、成功したアウトカムを有する。
萎縮性胃炎、具体的には環境性異形成萎縮性胃炎と称する形態。萎縮性胃炎は、中高年層によくみられる状態であり、現状ではビタミンＢ１２注射により治療されている。患者では、カルチノイド腫瘍および腺癌のリスクが増加する。カルチノイドの場合に、異形成Ｇ細胞からのガストリン産生を減少させることによって、腫瘍の発生率の減少が医療専門家により観察された際に、本多価結合分子の投与は、成功したアウトカムを有する。Ｗｎｔ経路の増強によって腫瘍が活性化されていることを医療専門家が決定した場合に、本多価結合分子を対象に投与するべきではない。
本発明のＦＺＤ アゴニストは、例えば注射によって（例えば皮下、静脈内、腹腔内など）、局所的に、または経口で投与されてもよい。投与経路に応じて、活性化合物を素材に被覆して、化合物を不活化する酸および他の自然条件の作用から化合物を保護してもよい。本明細書に記載される多価結合分子は、医薬的に許容可能な、好ましくは水性の担体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、組成物は、賦形剤、例えば緩衝剤、結合剤、噴射剤、希釈剤、香料、潤滑剤などを含有することができる。そのような組成物に使用できる賦形剤の広範な一覧は、例えば、Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000)から引用することができる。本多価結合分子はまた、免疫刺激物質、例えばサイトカインなどと共に投与することができる。
本発明の一実施形態は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生産するための方法を含み、この方法は、体細胞を初期化するのに適した条件下で体細胞を培養することを含み、その場合、前記培養条件は、本明細書に記載される多価結合分子をさらに含む。多能性幹細胞を生成するための方法は、当技術分野に周知であり、例えば Takahashi and Yamanaka, (2006), Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast 培養s by Defined Factors, Cell 126, 663−676；Takahashi et al. (2007) Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors Cell 131, 861−872；Yu et al. (2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920；米国特許第８，５４６，１４０号および；米国特許第８，２６８，６２０号を参照されたい。本発明の一実施形態では、本発明の多価結合分子は、ｉＰＳ細胞の生成を加速するのに十分な量で培養培地に含まれる。
本発明の一実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の分化を方向付けるための方法を含み、この方法は、定方向分化に適した条件下で細胞を培養することを含み、その場合、前記培養条件は、本明細書に記載される有効量の多価結合分子をさらに含む。マウスおよびヒトのＰＳＣの研究では、成長因子を添加するための特異的なアプローチが特定されており、そのような因子としては、各種系譜にＰＳＣの分化を誘導できるＷｎｔが挙げられる。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を含むＰＳＣの定方向分化のための方法は、当技術分野に公知であり、例えばLam et al. (2014) Semin Nephol 34(4)； 445-461； Yucer et al. (September 6, 2017) Scientific Reports 7, Article number 10741を参照されたい。本明細書に記載される多価結合分子を用いてＷｎｔシグナル伝達経路の活性化をもたらし、ＰＳＣの分化を方向付けできることが想定される。
本発明の一実施形態は、それを必要とする対象で組織の再生を亢進するための方法であり、この方法は、有効量の本明細書に記載の多価結合ペプチドを対象に投与することによって、そのような対象でＷｎｔシグナル伝達を活性化することによるものである。
本発明の一実施形態は、それを必要とする対象、例えば骨粗鬆症または骨折を負った対象で骨の治癒および／または 再生を亢進するための方法を含み、この方法は、有効量の本明細書に記載される多価結合分子を投与することによるものである。特定の一実施形態では、本発明の多価結合分子は、ＦＺＤ２に結合する結合ドメインとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する結合ドメインとを含む。これらの結合ドメインは、一価であっても多価であってもよく、例えば二価、三価、または四価であることがあり、単一特異性であっても多特異性であってもよく、例えば二重特異性であることがある。
対象は、任意の動物（例えば哺乳動物）としてよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、などが挙げられる。典型的には、対象はヒトである。
本明細書に記載される多価結合分子を投与するための有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定を行うことは、当技術分野の技能の内にある。当業者 は、投与されるべきそのようなＦＺＤアゴニストの投薬量が、例えば抗体を受ける対象、投与経路、使用される具体的なＦＺＤアゴニストのタイプ、および投与されている他の薬物に応じて変わることを、認識するものとなる。ＦＺＤアゴニストの適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えばHandbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone, eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357； Smith, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber, eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見出される。本組成物の投与の投薬量の範囲は、所望の効果を生じるのに十分なものである。投薬量は、有害な副作用、例えば、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど多くあるべきではない。一般に、投薬量は、年齢、状態、性別、および患者の炎症の程度により変わるものとなり、当業者により決定することができる。投薬量は、任意の禁忌のイベントの際に個々の医師によって調整することができる。投薬量は変わることがあり、１日または何日かにわたって、毎日、１回または複数回の用量投与の際に、投与することができる。個々の必要性が変わるのに対し、ベクターの有効量の最適な範囲を決定することは、当技術分野の技能の内にある。
近年、異なる組織の肉眼解剖学的および細胞型の組成物をまとめた「オルガノイド」とよばれる小器官を培養するための方法が開発されている。意外なことに、完全オルガノイドは、単一の組織幹細胞から生成することができ、それはマウスから単離された腸のＬＧＲ５＋幹細胞を用いて最初に実証された通りである。Ｗｎｔ−β−カテニン経路を活性化する培地内の構成成分は、オルガノイドの誘導、成長、生存、および維持に必要であることが知られている。そのため、条件培地として精製または準備されたＲ−スポンジンおよびＷｎｔリガンドは、異なる組織からオルガノイドを成長させるために普遍的に必要である。しかし，精製Ｗｎｔタンパク質は、一般に特異的な活性が低く、オルガノイドの成長を持続させることができない。ゆえに、当業者は、オルガノイドを生成するために、Ｗｎｔ３Ａ条件培地の添加、または小分子、例えばＧＳＫ３阻害剤の添加に頼る。しかし、Ｗｎｔ３Ａ条件培地の生産は労働集約的であり、条件培地の特徴は一貫せず、小分子であるＧＳＫ３阻害剤は、経路を毒性のレベルに堅固に活性化することがある。本明細書に記載される多価結合分子は、生産および精製が容易であり、一貫した再現性のある特徴を有し、所望のＦＺＤ受容体（複数可）と共受容体（複数可）との組合せを選択的に係合することによって特異的にＷｎｔを活性化することから、上記の問題を解決するものである。
本発明の一実施形態は、組織オルガノイドを生成するための方法を含み、この方法は、有効量の本明細書に記載される多価結合分子中で組織を培養することを含む。オルガノイドとは、その相当するｉｎ ｖｉｖｏ器官を模した３Ｄの多細胞性のｉｎ ｖｉｔｒｏ組織構築物であり、それゆえに、組織培養ディッシュ中でその器官の様相を研究するために使用することができる。オルガノイドを生成するための方法は、当技術分野に周知であり、例えば胃腸管などの様々な器官にある成体の幹細胞に由来する上皮オルガノイドはほぼ全て、細胞を維持しかつ細胞型のｉｎ ｖｉｖｏ様の補完物を生成するという両方のために、Ｗｎｔシグナル伝達のアゴニストを必要とする（他のシグナル伝達因子の中でも、マトリゲルに包埋することを含めて）。Wntシグナル伝達はまた、3D 培養において内耳オルガノイドの発生を亢進し、腎臓 オルガノイドの生成に使用されており、例えば Natalie de Souza (2018) Nature 方法ｓ 15(1): 23；DeJonge et al. (2016) PLosOne 11(9), e0162508；Akkerman and Defize, (2017) Bioessays 39, 4, 1600244を参照されたい。本発明の多価結合分子は、オルガノイドの培養培地に、それらの成長、生存、および維持を培養にて亢進するのに十分な量で含めることができる。そのため、本発明の一実施形態は、組織オルガノイドの培養を亢進するための方法を含み、この方法は、有効量の本明細書に記載される多価結合分子を含む培養培地を含む。
また、本発明の一態様は、本明細書に記載される多価結合分子を作製するための方法である。本発明の一実施形態では、本多価結合分子は、
ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有するＦｃドメインを選択すること、
ｂ）１つもしくは複数のＦＺＤ受容体に結合する抗体を特定すること、または１つもしくは複数のＦＺＤ受容体に結合する抗体を特定すること、
ｃ）１つもしくは複数のＷｎｔ共受容体に結合する抗体を特定すること、または１つもしくは複数のＷｎｔ共受容体に結合する抗体を特定すること、
ｄ）（ｉ）ステップａのＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ステップｂのペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはステップｂの抗体のＶＬおよび／もしくはＶＨをコードするヌクレオチド配列、または１つもしくは複数のＦＺＤ受容体を結合するステップｂの抗体に由来するＶＬおよび／もしくはＶＨをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉｉ）ステップｃのペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはステップｃの抗体のＶＬおよび／もしくはＶＨコードするヌクレオチド配列、または１つもしくは複数のＷｎｔ共受容体に結合するステップｃの抗体に由来するＶＬおよび／もしくはＶＨをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を生成すること、
ｅ）（ｄ）の核酸分子を発現してポリペプチドを生産することであって、ポリペプチドは、二量体化して、（ｉ）Ｆｃドメイン、（ｉｉ）ＦＺＤ結合ドメイン、および（ｉｉｉ）Ｗｎｔ共受容体結合ドメインを含む四価結合分子を形成し、ＦＺＤ結合ドメインは、ステップｂのペプチドまたはステップｂのＶＬおよび／もしくはＶＨを含み、かつＦｃドメインの一方の末端に連結され、Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、ステップｃのペプチドまたはステップｃのＶＬおよび／もしくはＶＨを含み、かつＦｃドメインの他方の末端に連結され、それによって多特異的な結合分子を形成すること
によって生成される。
上記ＦＺＤ受容体の１つまたは複数に結合するペプチドは、合成のポリペプチド、例えば合成ペプチド、アフィボディ、アンキリン反復タンパク質、フィブロネクチン反復タンパク質、フィノマー、アンチカリンであってもよいし、ＦＺＤ受容体を結合する天然のタンパク質のペプチドであってもよい。天然のタンパク質は、例えばＷｎｔであることがあり、例えばＷｎｔ−１、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ａ／ｂ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６ｂであることがある。ステップｂのペプチドは、多価であってＦＺＤ上の１つを超える部位に結合するものであってよく、例えば二価、三価、または四価であることがあり、単一特異性であって単一のエピトープに結合するものであってもよいし、多特異性であってＦＺＤ上の１つを超えるエピトープに結合するものであってもよい。
Ｗｎｔ共受容体のうち１つまたは複数に結合するペプチドは、合成ペプチド、例えばアフィボディ、アンキリン反復タンパク質、フィブロネクチン反復タンパク質、フィノマー、もしくはアンチカリンであってもよいし、Ｗｎｔ共受容体を結合する天然のタンパク質のペプチドであってもよい。天然のタンパク質は、例えばＷｎｔであることがあり、例えばＷｎｔ−１、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ａ／ｂ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−１１、もしくはＷｎｔ−１６ｂ、またはＤｉｃｋｋｏｐｆ−１であることがある。
ステップｃのペプチドは、多価であってＷｎｔ共受容体上の１つを超えるエピトープに結合するものであってよく、例えば二価、三価、または四価であることがあり、単一特異性であって単一のエピトープに結合するものであってもよいし、多特異性であってＷｎｔ共受容体上の１つを超えるエピトープに結合するものであってもよい。
ＦＺＤ受容体を結合する天然のタンパク質とＷｎｔ共受容体を結合する天然のタンパク質とは、同じタンパク質であることがある。
一実施形態では、ステップｂのペプチドまたは抗体は、ＦＺＤ２を結合することがあり、ステップｃのペプチドは、Ｗｎｔ５ａのペプチドであることがあり、ステップｃの抗体は、Ｗｎｔ５ａに結合する共受容体上の部位に結合する抗体であることがある。
一実施形態では、ステップｂのペプチドまたは抗体は、ＦＺＤ４を結合することがあり、ステップｃのペプチドは、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ８、またはＷｎｔ５ａのうち１つまたは複数のペプチドであることがあり、ステップｃの抗体は、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ８、またはＷｎｔ５ａに結合する共受容体上の部位に結合する抗体であることがある。
一実施形態では、ステップｂのペプチドまたは抗体は、ＦＺＤ５を結合することがあり、ステップｃのペプチドは、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、またはＷｎｔ２のうち１つまたは複数のペプチドであることがあり、ステップｃの抗体は、共受容体上の部位に結合する抗体であることがあり、その場合、この部位は、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、またはＷｎｔ２のうち１つまたは複数に結合する。
一実施形態では、ステップｃのペプチドまたは抗体は、ＬＲＰ６および／またはＬＲＰ５を結合することがあり、例えば、このペプチドは、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ１および／またはＷｎｔ３ａのペプチドであることがあり、ステップｃの抗体は、ＬＲＰ６／ＬＲＰ５上の部位に結合する抗体であることがあり、その場合、この部位は、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ１および／またはＷｎｔ３ａを結合する。
一実施形態では、ステップｃのペプチドまたは抗体は、ＬＲＰ６を結合することがあり、例えば、このペプチドは、Ｗｎｔ１もしくはＷｎｔ３ａ、または両方のペプチドであることがあり、抗体は、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３ａを結合するＬＲＰ６上の部位を結合する抗体であることがある。
一実施形態では、ステップｃのペプチドまたは抗体は、ＲＯＲ１および／またはＲＯＲ２を結合する。
一実施形態では、ステップｃのペプチドまたは抗体は、ＲＹＫを結合することがある。
一実施形態では、ステップｃのペプチドまたは抗体は、ＰＴＫ７を結合することがある。
一実施形態では、ステップ（ｂ）のペプチドまたは抗体は、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するかまたは受容体へのＷｎｔの結合を阻害する、ペプチドまたは抗体であることがある。一実施形態では、ステップ（ｂ）のペプチドまたは抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達を拮抗することまたは受容体へのＷｎｔの結合を阻害することなく、１つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する、ペプチドまたは抗体であることがある。一実施形態では、ステップ（ｃ）のペプチドまたは抗体は、Ｗｎｔ共受容体のうち１つまたは複数に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するかまたは共受容体へのＷｎｔの結合を阻害する、ペプチドまたは抗体であることがある。一実施形態では、ステップ（ｃ）のペプチドまたは抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗することまたは共受容体へのＷｎｔの結合を阻害することなく、Ｗｎｔ共受容体に結合する、ペプチドまたは抗体であることがある。結合ドメインは、リンカーを介してＦｃドメインに連結されることがある。本発明のモジュール態様によって、Ｆｃドメインの反対側の末端にある任意の所与のＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体に結合する、ペプチドまたは抗体のＶＨおよびＶＬを混合するかまたは適合させて、複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体−共受容体複合体を係合できる多価結合分子を生成するか、または単一のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体−共受容体複合体を選択的に係合してＷｎｔシグナル伝達を活性化することが可能になる。
本発明の一実施形態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する多価結合分子を作製する方法であって、本方法は、
ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有するＦｃドメインを選択すること
例えばＣＨ３ドメインを含むイムノグロブリンのＦｃドメイン、例えばＩｇＧ、例えばＩｇＧ１を選択すること、
ｂ）１つまたは複数のＦＺＤ受容体に対する結合特異性を有する抗体を特定すること、
ｃ）Ｗｎｔ共受容体に対する結合特異性を有する抗体を特定すること、
ｄ）（ｉ）選択されたＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ステップｂの抗体に由来するＶＬおよび／またはＶＨをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）ステップｃの抗体に由来するＶＬおよび／またはＶＨをコードするヌクレオチド配列と
を含む核酸分子を生成すること、
ｄ）（ｄ）の核酸分子を発現してポリペプチドを生産することであって、ポリペプチドは、Ｆｃドメインを介して二量体化して、（ｉ）Ｆｃドメイン、（ｉｉ）ＦＺＤ結合ドメイン、および（ｉｉｉ）Ｗｎｔ共受容体結合ドメインを含む多価結合分子を形成し、その結果、ＦＺＤ結合ドメインは、Ｆｃドメインの一方の末端に連結され、Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、Ｆｃドメインの他方の末端に連結されそれによって多特異的な結合分子を形成すること、を含む。好適な実施形態では、本多価結合分子は、Ｆｃドメインがｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ立体配置である核酸分子をコードする、２つのポリペプチドの二量体である。結合ドメインの一方または両方は、多価結合ドメインであることがある。ステップｂの抗体は、ＦＺＤ受容体を結合する抗体断片であることがある。ステップｄ）（ｉｉ）のＶＨおよび／またはＶＬは、ステップｂ）の抗体のＶＨおよび／またはＶＬと同一であることがある。ステップｃの抗体は、Ｗｎｔ共受容体を結合する抗体断片であることがある。ステップｄ）（ｉｉｉ）のＶＨおよび／またはＶＬは、ステップｃ）の抗体のＶＨおよび／またはＶＬと同一であることがある。
本発明の多価分子は、２つのポリペプチドを「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」立体配置で二量体化することによって生成されることがある。ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ立体配置は、ＦＺＤ受容体もしくは共受容体上の異なるエピトープを結合するか、または同じＦＺＤ受容体もしくは共受容体ファミリーの異なるメンバーに結合する、結合部分を含むペプチドの会合を推進することによって、本発明のモジュール性を増加させるものであり、例えば図３Ａを参照されたい。ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ設計を介してＦｃ分子を工学的に作製する方法は、当技術分野に周知であり、例えば、発明者Van DykらのＷＯ２０１８／０２６９４２、Carter P. (2001) J. Immunol. Methods 248, 7−15；Ridgway et al. (1996) Protein Eng. 9, 617−621；Merchant A. M., et al.. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 677−681および； et al., (1997) J. Mol. Biol. 270, 26−35を参照されたい。
本発明の別の実施形態は、細胞上でＦＺＤ受容体と共受容体との相互作用を推進し、それによって細胞でＷｎｔシグナル伝達経路を活性化するための方法であり、この方法は、ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有するＦｃドメイン、またはＣＨ３ドメインを含むその断片を選択すること；ｂ）ＦＺＤ受容体を結合する第１の多価結合ドメインをＦｃドメインの一方の末端に連結し、Ｗｎｔ共受容体に結合する第２の結合ドメインをＦｃドメインの他方の末端に連結し、それによって結合分子を形成すること；ｃ）条件下で前記ＦＺＤ受容体とＷｎｔ共受容体とを発現する細胞に前記多価結合分子を接触させることであって、ＦＺＤ受容体と共受容体との両方が本多価結合分子に結合し、それによってＷｎｔシグナル伝達経路を活性化することを含む。結合ドメインの一方または両方は、一価であっても多価であってもよく、例えば二価、三価、または四価であってよい。ＦＺＤ結合ドメインは、ＦＺＤを結合する天然のタンパク質のペプチド；ＦＺＤを結合する合成ペプチド、例えばアフィボディ、アンキリン反復タンパク質、フィブロネクチン反復タンパク質、フィノマー、もしくはアンチカリン；ＦＺＤを結合するＶＨ断片および／もしくはＶＬ断片；ＦＺＤを結合するｓｃＦＶ；またはＦＺＤを結合するダイアボディを含むことがある。Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、Ｗｎｔ共受容体を結合する天然のタンパク質のペプチド、；Ｗｎｔ共受容体を結合する合成ペプチド、例えばアフィボディ、アンキリン反復タンパク質、フィブロネクチン反復タンパク質、フィノマー、またはアンチカリン；Ｗｎｔ共受容体を結合するＶＨおよび／もしくはＶＬ断片；Ｗｎｔ共受容体を結合するｓｃＦＶ；またはＷｎｔ共受容体を結合するダイアボディを含むことがある。
本発明の一実施形態は、Ｆｃドメインと２つの結合ドメインとを含む分子であり、第１のドメインは、ＦＺＤ受容体に結合し、第２のドメインは、Ｗｎｔ共受容体に結合し、これら２つの部分は、Ｆｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片によって合わせて連結されるが、その場合、一方のドメインは、Ｆｃ受容体のＮ末端に連結され、他方のドメインは、Ｆｃ受容体のＣ末端に連結される。結合ドメインは、直接的に、またはペプチドリンカー、例えばポリペプチドリンカーもしくは非ペプチド性リンカーを介して、Ｆｃ受容体に連結されることがある。適したリンカーは、当技術分野に周知であり、例えばＸＴＥＮリンカーである（発明者ＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒらのＷＯ２０１３１２０６８３を参照）。
本発明の一実施形態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するための方法であり、ＦＺＤ受容体およびその共受容体を発現する細胞を有効量の本発明の多価分子に接触させることを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される多価分子は、ＦＺＤ受容体とその共受容体との両方を結合して、それによってＦＺＤ受容体および共受容体（複数可）へのＷｎｔ分子の結合を模した複合体を形成し、次いでＷｎｔシグナル伝達経路を活性化することが想定される。
本発明の多価結合分子は、組換えによって、例えばギブソン・アセンブリ（Gibson et al. (2009).. Nature Methods. 6 (5): 343−345 and Gibson DG. (2011). Methods in Enzymology. 498: 349−361を参照）によって作製されてもよいし、この分子は、合成によって、例えば市販の合成装置、例えばアプライドバイオシステムズ社、ベックマンなどの自動合成機などを用いて、作製されてもよい。合成機を使用することによって、天然のアミノ酸を、非天然アミノ酸に置換してもよい。調製の具体的な配列および様式は、簡便性、経済性、必要な純度などによって決定されるものとなる。必要に応じて、様々な基が、合成の間または発現の間にペプチド内に導入され、それらの基によって、他の分子または表面への連結が可能になる。
実施形態によっては、結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばＸＴＥＮリンカーを介してＦｃドメインに付加している。実施形態によっては、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸、４０アミノ酸、４１アミノ酸、４２アミノ酸、４３アミノ酸、４４アミノ酸、４５アミノ酸、４６アミノ酸、４７アミノ酸、４８アミノ酸、４９アミノ酸、５０アミノ酸、５１アミノ酸、５２アミノ酸、５３アミノ酸、５４アミノ酸、５５アミノ酸、５６アミノ酸、５７アミノ酸、５８アミノ酸、５９アミノ酸、６０アミノ酸、６１アミノ酸、６２アミノ酸、６３アミノ酸、６４アミノ酸、６５アミノ酸、６６アミノ酸、６７アミノ酸、６８アミノ酸、６９アミノ酸、７０アミノ酸、７１アミノ酸、７２アミノ酸、７３アミノ酸、７４アミノ酸、７５アミノ酸、７６アミノ酸、７７アミノ酸、７８アミノ酸、７９アミノ酸、８０アミノ酸、８１アミノ酸、８２アミノ酸、８３アミノ酸、８４アミノ酸、８５アミノ酸、８６アミノ酸、８７アミノ酸、８８アミノ酸、８９アミノ酸、９０アミノ酸、９１アミノ酸、９２アミノ酸、９３アミノ酸、９４アミノ酸、９５アミノ酸、９６アミノ酸、９７アミノ酸、９８アミノ酸、９９アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。実施形態によっては、ペプチドリンカーは、５アミノ酸から７５の間、５アミノ酸から５０アミノ酸の間、５アミノ酸から２５アミノ酸の間、５アミノ酸から２０アミノ酸の間、５アミノ酸から１５アミノ酸の間、または５アミノ酸から１０アミノ酸の長さである。リンカーを有するかまたは有さないＦｃドメインは、本多価結合分子がＦＺＤ受容体とその共受容体との両方に結合してそれによってＷｎｔシグナル伝達経路を活性化することを可能にする長さおよび可撓性を有する。本発明の一実施形態では、リンカーを含むかまたは含まないＦｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片は、１００アミノ酸超、１２５アミノ酸超、１５０アミノ酸超、１７５アミノ酸超、または２００アミノ酸超である。
本明細書に記載される際に、および添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に文脈が明確に述べない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。そのため、例えば、「細胞（a cell）」という言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド（the peptide）」という言及は、１つまたは複数のペプチドおよびそれらの等価物、例えば、当業者に公知のポリペプチドなどへの言及を含む。
「親和性成熟」抗体または「抗体の成熟」とは、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）内に１つまたは複数の変更を、そのような変更のない親抗体または供給源抗体に比べて有する抗体を指し、そのような変更は、抗原に対する抗体の親和性の向上、または分子の他の望ましい性質の向上をもたらす。
「含む」は、言及された要素が組成物／方法／キットに必要であるが、特許請求の範囲内で他の要素が組成物／方法／キットなどを形成するために含まれてもよいことを意味する。例えば、多価結合分子を含む組成物は、多価結合分子に加えて他の要素、例えば、多価結合分子に例えば共有結合で結合したポリペプチド、小分子、または核酸などの機能的部分；多価結合分子組成物の安定性を促進する剤、多価結合分子組成物の溶解性を促進する剤、アジュバントなどを含む場合がある組成物であり、任意の負の条件によって包含される要素を除いて、当技術分野に容易に理解される通りである。
「から本質的になる」は、主題の発明の基本的なおよび新規の特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない指定された物質またはステップに対する、記載された組成物または方法の範囲の限定を意味する。例えば、開示された配列「から本質的になる」多価結合分子は、開示された配列のアミノ酸配列が、その由来とした配列に基づき配列の境界で約５アミノ酸残基をプラスまたはマイナスされており、例えば、言及された境界のアミノ酸残基よりも約５残基、４残基、３残基、２残基、または約１残基少ないか、または言及された境界のアミノ酸残基よりも約１残基、２残基、３残基、４残基、または５残基多い。
「からなる」は、特許請求の範囲に指定されない任意の要素、ステップ、または成分を組成物、方法、またはキットから排除することを意味する。例えば、開示された配列「からなる」多価結合分子は、その開示されたアミノ酸配列のみからなる。
値の範囲が示される場合に、各介在値はまた、別段にコンテクストが明確に述べない限り下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値との間で、具体的に開示されることが理解される。記述された範囲内の記述値または介在値と記述された範囲内の任意の他の記述値または介在値との間にある小さな範囲はそれぞれ、本発明の内に包含される。これらの小さな範囲の上限値および下限値は、上記範囲に独立して含まれるかまたは除外され、その小さな範囲に極限値のどちらかまたは両方が含まれるかまたはどちらも含まれない範囲もそれぞれ、記述された範囲内の任意の具体的に除外された極限値に従って、本発明の内に包含される。記述された範囲が極限値の一方または両方を含む場合、それらの含めた極限値のどちらかまたは両方を除外した範囲も、本発明に含められる。
基本的な抗体の構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各対は、１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００から１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。概して、ヒトから取得された抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかのクラスに関連し、それらは分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。ある特定のクラスは、さらにサブクラスを、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他を有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であることがある。
相補性決定領域（ＣＤＲ）と称された重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖可変ドメインＶＬのそれぞれの中にある３つの高度に多様なストレッチが、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるさらに保存された側面ストレッチの間に介在している。そのため、用語「ＦＲ」とは、イムノグロブリンのＣＤＲの間または隣に天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ＶＨドメインは、典型的には４つのＦＲを有し、それらは本明細書では、ＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）、ＶＨフレームワーク領域２（ＦＲ２）、ＶＨフレームワーク領域３（ＦＲ３）、およびＶＨフレームワーク領域４（ＦＲ４）と称する。同様に、ＶＬドメインは、典型的には４つのＦＲを有し、それらは本明細書では、ＶＬフレームワーク領域１（ＦＲ１）、ＶＬフレームワーク領域２（ＦＲ２）、ＶＬフレームワーク領域３（ＦＲ３）、およびＶＬフレームワーク領域４（ＦＲ４）と称する。一抗体分子では、ＶＬドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）ならびにＶＨドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）が、三次元空間に互いに関連して配置されて、抗体の可変領域．内に抗原結合部位を形成する。抗原結合部位の表面は、結合された抗原の３次元面に相補的である。ＶＬドメインおよびＶＨドメインのアミノ酸配列は、付番されてもよく、その中のＣＤＲおよびＦＲは、カバット付番体系（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）または国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ付番体系；Lefranc et al., 2003, Development and Comparative Immunology 27:55-77）に従って特定／画定されてもよい。当業者は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインアミノ酸残基を付番し、その中のＣＤＲおよびＦＲをＩＭＧＴ付番体系、カバット付番体系などの定型的に採用される付番体系に従って特定するための知識を有するものとなる。
抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」（または単純に「抗体部分」または「抗体断片」）という用語は、本明細書に使用される際には、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片、部分、またはドメインを指す。完全長抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を実施できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬ１ドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦ（ａｂ）’断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなる、Ｆｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬドメインとＶＨドメインとからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ward et al. (1989) Nature 241:544-546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、単一の連続した鎖としての作製を可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することができ、その場合、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される（例えばHolliger et al. (1993) PNAS. USA 90:6444-6448を参照）。
「アフィボディ」は、モノクローナル抗体を模して多数の標的タンパク質またはペプチドに高い親和性で結合するように工学的に改変された、小さな単一のドメインタンパク質である。それらは、ブドウ球菌タンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインのうち１つのスキャフォールドに基づく３つのヘリックスの束から構成される。このスキャフォールドドメインは、５８アミノ酸からなり、そのうち１３個が無作為化されて、多数のリガンドバリアントを含むアフィボディライブラリーが生成される。例えば、米国特許第５，８３１，０１２号およびLofblom et al. FEBS Letters 584 (2010) 2670-2680を参照されたい。アフィボディ分子の模倣抗体は、約６ｋＤａの分子量を有する。
本明細書に使用される際の「ダイアボディ」は、二量体の抗体 断片である。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の各ポリペプチドは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されるが、単鎖Ｆｖ断片とは異なって、ＶＬとＶＨとの間のリンカーは分子内で対合するには短く、それゆえに各抗原結合部位は、一方のポリペプチドのＶＨおよびＶＬと他方のポリペプチドのＶＨおよびＶＬとの対合によって形成され、例えば図３Ａを参照されたい。そのため、ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有し、単一特異性または二重特異性とすることができる（例えばHolliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123；Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5を参照)。
本明細書に使用される際に、剤、例えば多価結合分子またはその分子を含む医薬組成物の「有効量」とは、必要な投薬量でおよび期間にわたって、所望の結果を達成するのに有効な量を指す。実施形態によっては、治療有効量は、疾患、障害、および／もしくは状態の１つまたは複数の症状の発生率および／もしくは重症度を低減し、１つまたは複数の特徴を安定化し、ならびに／または発症を遅延させるものである。
本明細書に使用される際に、用語「エピトープ」は、イムノグロブリンもしくはその断片またはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のタンパク質決定子である。用語「エピトープ」は、イムノグロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のタンパク質決定子を含む。エピトープ決定子は、通常は分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸側鎖または糖側鎖からなり、通常は特異的な三次元構造、ならびに特異的な電荷の特徴を有する。抗体は、解離定数が≦１０μＭ、例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、さらに好ましくは≦１ｎＭ．である際に、抗原に特異的に結合すると言われる。
イムノグロブリン分子の定常領域は、断片結晶化可能領域、「Ｆｃ領域」、または「Ｆｃドメイン」とも呼ばれる。Ｆｃドメインは、２つの同一のタンパク質断片からなり、それらの断片は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来し、ＩｇＧのＦｃドメインは、高度に保存されたＮ型糖鎖修飾部位を担持する。Ｆｃ断片の糖鎖修飾は、Ｆｃ受容体により媒介される
活性に必須である。本発明の一実施形態では、多価分子のＦｃドメインは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣに依存した死滅に向かって多価分子を結合する細胞を標的としないように、工学的に改変される。本発明の一実施形態では、多価結合分子のＦｃドメインは、ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ立体配置のペプチド二量体である。このペプチド二量体は、ヘテロ二量体であってもよい。
用語「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は、互換的に本明細書に使用され、診断、治療、または療法が望まれている任意の哺乳動物対象、具体的にはヒトを指す。
「ＬＲＰ」、」「ＬＲＰタンパク質」および「ＬＲＰ受容体」は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ファミリーのメンバーを指すために本明細書に使用される。これらの受容体は、受容体媒介性エンドサイトーシスのプロセスにおいてリガンドを結合し内在化する単回膜貫通タンパク質である。ＬＲＰタンパク質ＬＲＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ００２３３５．２）およびＬＲＰ６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ００２３３６．２）は、Ｗｎｔ−β−カテニンシグナル伝達経路上での活性化に必要なＷｎｔ受容体複合体内に含まれている。
本明細書に使用される際の用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指すが、その場合、残りのアミノ酸配列は、例えば全長ｃＤＮＡ配列から推定される、天然の配列内の対応する位置に一致する。
本明細書に使用される際に、用語「パラトープ」は、エピトープに結合する抗体の可変領域内の抗原結合部位を含む。
用語「治療」、「治療する」などは、概して、所望の薬理学的および／または生理学的作用を得ることを意味するために本明細書に使用される。この作用は、その疾患もしくは症状を完全もしくは部分的に防止するという観点では予防的であることがあり、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用に対し部分的もしくは完全に治癒させるという点では治療的であることがある。本明細書に使用される際の「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療をカバーし、以下を含む：（ａ）その疾患に罹り易い可能性があるがまだそれに罹っていることを診断されていない対象で疾患が起こるのを防止すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発達を阻止すること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退縮を引き起こすこと。治療剤は、疾患または創傷の前、間、または後に投与されてよい。進行中の疾患の治療は、その治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減する場合に、特に興味深いものである。そのような治療は、望ましくは、患部組織で機能が完全に失われる前に実施される。主題の療法は、疾患の症候段階の間に、場合によっては疾患の症候段階の後に投与されてもよい。
本発明の多価結合分子がＷｎｔシグナル伝達を活性化する能力は、複数のアッセイによって確認することができる。本発明の多価結合分子は、典型的には、ＦＺＤ受容体の天然のリガンドにより開始されるものに類似のまたは同じ反応または活性を開始する。本発明の多価結合分子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路、例えば古典的Ｗｎｔ−βカテニンシグナル伝達経路を活性化する。本明細書に使用される際に、用語「活性化する」とは、本発明のＦＺＤアゴニストの不在下でのレベルに比べて、Ｗｎｔシグナル伝達経路、例えばＷｎｔ−βカテニンシグナル伝達経路の細胞内レベルが測定可能に増加することを指す。
Ｗｎｔ−βカテニン活性化のレベルを測定するための様々な方法が、当技術分野に公知である。これらには、以下に限定されないが、以下を測定するアッセイが含まれる：Ｗｎｔ−βカテニン標的遺伝子の発現；ＬＥＦ／ＴＣＦレポーター遺伝子の発現（例えばＴｏｐＦＬＡＳＨ、ｓｕｐｅｒＴｏｐＦＬＡＳＨ、ｐＢＡＲなど）；βカテニンの安定化；ＬＲＰ５／６のリン酸化；細胞質から細胞膜へのアキシンの転置およびＬＲＰ５／６への結合。古典的Ｗｎｔ−βカテニンシグナル伝達経路は、最終的には、転写因子ＴＣＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦ７Ｌ２、およびＬＥＦを介した遺伝子発現の変化をもたらす。Ｗｎｔ活性化に対する転写応答は、複数の細胞および組織で特徴が明らかにされている。そのため、当技術分野に周知の方法による包括的な転写プロファイリングを使用して、Ｗｎｔ−βカテニンシグナル伝達活性化を評価することができる。
Ｗｎｔ応答性遺伝子の発現の変化は、一般に、転写因子ＴＣＦおよびＬＥＦによって媒介される。ＴＣＦレポーターアッセイは、ＴＣＦ／ＬＥＦ制御性遺伝子の転写の変化をアッセイして、Ｗｎｔ−βカテニンシグナル伝達のレベルを決定する。ＴＣＦレポーターアッセイは、Korinek, V. et al., 1997によって最初に記載された。ＴＯＰ／ＦＯＰとしても知られるこの方法は、ルシフェラーゼ発現を駆動する最小ｃ−Ｆｏｓプロモーターの上流に３コピーの最適型ＴＣＦモチーフＣＣＴＴＴＧＡＴＣまたは３コピーの変異型モチーフＣＣＴＴＴＧＧＣＣ（それぞれｐＴＯＰＦＬＡＳＨおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨ）を使用して、内在性のβカテニン／ＴＣＦのトランス活性化活性を決定することを含む。これらの２つのレポーターの活性の比率（ＴＯＰ／ＦＯＰ）が高いことは、β−カテニン／ＴＣＦ活性が高いことを標示する。このレポーターのさらに新しく高感度のバージョンは、ｐＢＡＲとよばれ、１２個のＴＣＦモチーフの反復を含有する（Biechele and Moon, 方法ｓ Mol Biol. 2008；468:99-110, PMID: 19099249）。
分子細胞生化学における一般的な方法は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., CSH Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)；Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996)；Nonviral vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999)；Viral vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997)；およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)などの標準的な教科書に見出すことができる。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、その場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。概して、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の 構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖおよび他の抗体断片を概観するために、James D. Marks, Antibody Engineering, Chapter 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.）を参照されたい。
別段に定義のない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者の一般に理解する意味を有するものとする。さらに、別段にコンテクストにより要求のない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される用語体系および手法は、当技術分野に周知であり、一般に使用されるものである。標準的な手法が、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養、および形質転換(例えばエレクトロポレーション、リポフェクション)に使用される。酵素反応および精製の手法は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載されるように、実施される。前述の手法および手順は、概して、当技術分野に周知の従来の方法に従って、ならびに本願明細書を通じて引用および議論されている種々の全般的なおよびさらに具体的な参考文献に記載されるように、実施される。例えばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬薬化学に関連して利用される用語体系ならびに実験室での手順および手法は、当技術分野に周知であり一般に使用されるものである。標準的な手法が、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、ならびに患者の治療に使用される。
［実施例］
実施例Ｉ
１．多価のＦＺＤアゴニストの開発
ＦＺＤダイアボディを含む第１の結合ドメインと共受容体ダイアボディを含む第２の結合ドメインとを有する多価結合分子を作製するために、我々は、合成Ｆａｂファージライブラリー（ライブラリーＦ；発明者Ｓｉｄｈｕらの米国特許出願公開公報第２０１６／０１９４３９４号を参照）から、従来のファージディスプレイ技術を用いてＦＺＤ受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合したものについて選択することによって、ＦＺＤ特異的な抗体を特定した。親和性または特異性の成熟を必要に応じて実施した。例えば、ＦＺＤ４ ＣＲＤを抗原として用いて、パンＦＺＤ結合抗体＃５０１９（ＦＺＤ１、２、４、５、７、および８を認識）をＦＺＤ７由来抗体から成熟させた。我々の以前の研究でも、ＦＺＤ４（５０３８、５０４４、５０４８、５０６２、５０６３、５０８０、５０８１）またはＦＺＤ５（２９２８）に完全に特異的ないくつかの抗体を特定した（例えば、発明者Ｓｉｄｈｕらの米国特許出願公開公報第２０１６０１９４３９４号、および発明者ＰａｎらのＷＯ２０１７１２７９３３Ａ１を参照）。
これらのＦＺＤ抗体を、ＦＺＤ特異的なダイアボディを作製するために使用した。ダイアボディは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に類似した抗体形態であるが、ＶＬおよびＶＨをそのそれぞれがコードする２つのペプチドの二量体である。しかし、ｓｃＦｖとは異なり、ポリペプチド内のＶＨとＶＬとの間のリンカーは非常に短いために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の分子内相補性を付与することができない。そのため、２つの抗原結合パラトープを機能的に再構成するように、一方のポリペプチドのＶＨ−ＶＬ断片は、別のポリペプチドのＶＨ−ＶＬ断片と二量体化する。同じＶＬおよびＶＨを有するポリペプチドの二量体を形成して、それによりホモダイアボディを形成することによって、または異なるＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する２つのポリペプチドから二量体を形成し、それによりここにダイアボディを形成することによって、同一のまたは同一でないパラトープを有するダイアボディを生成した。
合成抗体ライブラリーから、ヒトＬＲＰ６の組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を結合したものを選択することによって、ＬＲＰ６抗体も選択した。固有のＣＤＲ領域を有する５つのＦａｂを特定した。ＩｇＧ体に変換した後、それらは全て、ヒトＬＲＰ６結合ならびにマウスＬＲＰ６結合を呈した。ＥＬＩＳＡを介して検出されたＬＲＰ５結合はなく、このことは、これらの抗体がＬＲＰ６特異的であることを実証している（図１Ａ）。ＬＲＰ６ ＥＣＤは、４つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様の反復と交互に並ぶ４つのβ−プロペラモチーフを含有する。第１の２つのβ−プロペラモチーフは、Ｗｎｔ１結合に関与するものと考えられ、残りの２つは、Ｗｎｔ３結合に関与するものと考えられ、ゆえに抗体結合のための潜在的な２つのエピトープを作り出す。図６Ａを参照されたい。エピトープ結合の結果は、これら５つの抗体がＬＲＰ６上の２つの別々の部位を結合すること、ならびにＬＲＰ６上のＷｎｔ１結合部位に結合する抗体２５３８、２５４２、および２５４３と、Ｗｎｔ３結合部位に結合する２５３９および２５４０という２つの群に分けることができたことを示唆している。概して、ＬＲＰ６−Ｗｎｔ１部位に結合する抗体は、Ｗｎｔ１により誘導されるＷｎｔ経路の活性化を遮断することが期待されよう。
ＦＺＤに特異的なホモダイアボディを含有するＦｃのＮ末端結合ドメインを調製するために、選択されたＦＺＤ抗体のＶＨ断片およびＶＬ断片であるＶＨ−１、ＶＨ−２、ＶＬ−１、およびＶＬ−２を、対応のファージミドテンプレートからＰＣＲによって増幅し、単離した。次いで、ギブソン・アセンブリを利用して、単離した断片（ＶＨ−１およびＶＬ−２）を、Ｆｃ−ｋｎｏｂ領域を含有するＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断済みベクター（ｐＳＣＳＴ骨格）内に導入した（Gibson et al. (2009). Nature Methods. 6 (5): 343−345および Gibson DG. (2011) Methods in Enzymology. 498: 349−361を参照）。また、ギブソン・アセンブリを利用して、断片（ＶＨ−２およびＶＬ−１）も、Ｆｃ−ｈｏｌｅ領域を含有するＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断済みベクター内に導入した。正しくアセンブリされることを、ＤＮＡシーケンシングを用いて確認した。次いで、上記２つのプラスミド（１対、Ｆｃ−ｋｎｏｂおよびＦｃ−ｈｏｌｅ）を使用して、第２の結合ドメインをＦｃドメインのＣ末端に導入した。
Ｆｃ−ｋｎｏｂおよびＦｃ−ｈｏｌｅの立体配置は、多価結合ドメインを生成するために必要であり、その場合、結合ドメインの一方はヘテロダイアボディとした。しかし、Ｆｃ−ｋｎｏｂおよびＦｃ−ｈｏｌｅの立体配置は、ＦｃドメインのＮ末端とＣ末端との両方にホモダイアボディを含む結合分子を調製するためには必要ではなく、そのため、そのような結合分子については、ＶＨおよびＶＬを野生型Ｆｃ領域に連結し、１つのみのプラスミドを使用してＶＨ−ＶＬ含有ポリペプチドを生成し、ホモ二量体を形成した。任意選択的に、リンカー、例えばペプチドリンカー、または非ペプチド性リンカーが、結合ドメインとＦｃドメインとの間に存在することがある。
Ｃ末端結合ドメインを生成するために、ＬＲＰ５／６抗体を特定し、ＦＺＤダイアボディを生成するための上記と同じプロトコールに従ってＬＲＰ５／６ダイアボディを生成した。Ｃ末端結合ドメインは、ＬＲＰ抗体について対応のファージミドテンプレートからＶＨ−３断片、ＶＨ−４断片、ＶＬ−３断片、ＶＬ−４断片をＰＣＲ増幅し、次いで増幅断片を単離することによって生成した。上に記載されたように、次いで、ギブソン・アセンブリを利用して、ＶＨ−３断片およびＶＬ−４断片を上記のＦｃ−ｋｎｏｂプラスミドのＰｐｕＭＩ／ＢａｍＨＩ部位に導入した。ギブソン・アセンブリを使用して、他方のＶＨ−４断片およびＶＬ−３断片をＦｃ−ｈｏｌｅプラスミドのＰｐｕＭＩ／ＢａｍＨＩ切断点に挿入した。
異なるＶＬ配列およびＶＨ配列を有する２つのプラスミド（１対、Ｆｃ−ｋｎｏｂおよびＦｃ−ｈｏｌｅ）を使用して、二重特異性の、すなわち２つの異なる部位に結合可能なＦＺＤ結合ドメインまたは共受容体結合ドメインを生成した。ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ立体配置は、単一特異性の結合ドメインを有する二量体を生成するためには必要ではなかったため、各結合ドメインが単一特異性となる場合には、野生型Ｆｃ配列を含有する単一のプラスミドのみを使用した。
図９Ａは、「ｋｎｏｂ」変異を含むＦｃ領域と、パンＦＺＤ抗体＃５０１９のＶＨおよびＶＬと、ＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＬと、ＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＨとを含むペプチドをコードするプラスミドを図示する。図９Ｂは、「ｈｏｌｅ」変異を含むＦｃ領域と、パンＦＺＤ抗体＃５０１９のＶＨおよびＶＬと、ＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＨと、ＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＬとをコードする核酸を含むペプチドをコードするプラスミドを図示する。これらのプラスミドによってコードされるペプチドは、パン特異的なＦＺＤ抗体＃５０１９に由来するホモダイアボディを含む多価の結合部位と；ＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＨを有する一方のペプチドと他方のペプチドのＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＬとに由来する、ＬＲＰ抗体＃２５３９のＶＬとＬＲＰ抗体＃２５４２のＶＨとの対合によって産生された、二重特異性のヘテロダイアボディを含む多価の結合部位と；を有するヘテロ二量体を形成する。
結果として得られたプラスミドを、次いでシーケンシングし、シーケンシングにより確認されたプラスミドを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて製造業者の指示書に従って調製した。次いで、プラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にトランスフェクトし、ＦｅｃｔｏＰＲＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（ポリプラス）を用いて製造業者の指示書に従って抗体を発現した。典型的には、２００ｍＬのスケールの細胞を、少量バッチの抗体生産に使用した。
典型的には、トランスフェクションの８０時間後に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の培養培地を、遠心分離により細胞および細胞細片をペレットにすることによって採集した。上清を清潔なボトルに移し、１０×ＰＢＳ緩衝液により緩衝した。適切な量のプロテインＡベッド（ＧＥヘルスケア）と共に１時間インキュベートした後、製造業者の指示書に従って、ベッドを洗浄し、結合分子を溶出した。最後に、ＰＢＳ中で緩衝液を交換した。
２．ヘテロ二量体の多価結合分子
上に記載された方法を用いて、我々はまた、Ｆｃドメイン（Ｋｎｏｂ／Ｈｏｌｅ）のＮ末端とＣ末端のそれぞれに融合された無傷の二重特異性ダイアボディを含有する、四価のヘテロ二量体分子も生成した（図２Ａおよび図３Ａ）。具体的には、我々は、抗体５０１９由来のＦＺＤ結合ホモダイアボディをＦｃドメインのＮ末端に、ＬＲＰ６−Ｗ１抗体２５４２（５０１９−Ｆｃ−２５４２）またはＬＲＰ６−Ｗ３抗体２５３９（５０１９−Ｆｃ−２５３９）由来のホモダイアボディをＦｃドメインのＣ末端に有する、四価結合分子を生成した。驚くべきことに、両方の四価分子は、Ｗｎｔ経路を活性化したが、５０１９−Ｆｃ−２５４２は、効能がはるかに少なかった（図３Ｃ）。理論に拘束されることを望むものでないが、この差は、ＬＲＰ６−Ｗ１およびＬＲＰ６−Ｗ３の結合のＷｎｔシグナル伝達を活性化する能力の差を反映するものと思われる。ＬＲＰ６−Ｗ３部位のＷｎｔ結合は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化において、ＬＲＰ６−Ｗ１部位へのＷｎｔ結合よりも効果的であることが観察されている。
我々はまた、抗体５０１９由来のＦＺＤ結合ホモダイアボディをＦｃドメインのＮ末端に、ＬＲＰ６−Ｗ１抗体２５４２およびＬＲＰ６−Ｗ３抗体２５３９由来のＬＲＰヘテロダイアボディをＦｃドメインのＣ末端に有する、四価の三重特異性の結合分子を生成した（５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２、５０１９Ａｇと称する）（図５）。５０１９Ａｇは、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化において、単一特異性のＬＲＰ６ホモダイアボディを有する分子に比べて予想外に効果的である（図３Ｃ）。ナノモル量の３つ全ての形態が、ｐＢＡＲルシフェラーゼレポーターアッセイにより決定されるＷｎｔシグナル伝達を活性化し（図３Ｄ）、このことは、それらが有効なＷｎｔ模倣体であることを標示している。理論に拘束されることを望むものではないが、強いＷｎｔ３Ａ部位と弱いＷｎｔ１部位とを共に係合させることは、２つの強いＷｎｔ３Ａ部位を係合させるよりも効果的であることが想定される。ＦＺＤ結合ドメインとＬＲＰ結合ドメイン、すなわち「ＦＬＡｇ」を有する最も良い２つの多価結合分子は、１桁のナノモルの力価（ＥＣ５０〜５ｎＭ）を有し、この値は、精製Ｗｎｔ３Ａの力価とほぼ同一であり、釣り鐘型の用量応答プロファイルを提示した（図１１Ｄ）。我々はこれを、最大の刺激にはＦＬＡｇの多価の結合が必要であること、ならびに高濃度での効能の減少がＦＺＤまたはＬＲＰ６のどちらかとの一価の結合に起因する可能性があることを標示するものと解釈した。我々は、低いレベルのβカテニンを発現するＲＫＯ細胞（Major et al. Science. 316, 1043−1046 (2007)）をＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３により処理し、その結果、用量依存的および時間依存的なβカテニンタンパク質レベルの増加とＤＶＬ２のリン酸化、すなわちＷｎｔ−ＦＺＤ経路の活性化の目印が生じた（図１１Ｅおよび図１１Ｆ）。このように、四価のＦＬＡｇは、ＦＺＤおよびＬＲＰ６の合成アゴニストとして機能する、モジュール式の工学的に作製可能なヒトＡｂモダリティである。
最適なＦＬＡｇ ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３の工学的に作り出された親和性および特異性を確認するために、我々は、生体層干渉法（ＢＬＩ）を使用して、１０種のヒトＦＺＤ ＣＲＤのうち９種およびヒトＬＲＰ６ ＥＣＤとのその結合カイネティクスを測定した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＦＬＡｇは、親のパンＦＺＤパラトープ（Pavlovic et al. 2018）由来のＦＺＤダイアボディによって認識される６種のＦＺＤに、ピコモルの範囲（ＫＤ＝１０〜８００ｐＭ）の親和性で結合したが、他方の３種のＦＺＤには検出可能には結合しなかった。さらに、ＬＲＰ６への親和性は、ナノモルの範囲であった（ＫＤ＝１２ｎＭ）（図１２Ｂ）。次いで、我々は、ＢＬＩを使用して、様々なＦｃ受容体とのＦＬＡｇの結合を評価した。
ＦＬＡｇは、従来のＩｇＧに類似した挙動を示し、用量依存的およびｐＨ依存的にＦｃＲｎに相互作用した（図１２Ｃ）。天然のＩｇＧは、ＦｃＲｎにｐＨ６で結合するがｐＨ７．４では結合せず、これによってｉｎ ｖｉｖｏでは、飲作用の間の再利用とその結果として長い半減期とがもたらされる。ＦＬＡｇはまた、補体（Ｃ１ｑ）、ナチュラルキラー細胞マーカーＣＤ１６ａ、Ｂ細胞マーカーＣＤ３２ａ、ならびに単球およびマクロファージマーカーＣＤ６４を含めた他のＦｃエフェクターとの相互作用について、ＩｇＧに類似した挙動を示す（図１２Ｄ。我々は、ｉｎ ｖｉｖｏでエフェクター機能および長い半減期を付与するべき機能的なＦｃ部分をＦＬＡｇが含有するものと結論付けた。
四価のＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３ＦＬＡｇのモジュール設計によって、我々は、４つの各パラトープの内在的なアゴニスト活性への寄与を切り分けることが可能になり、それぞれを、無関係の抗原であるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と結合するヌルのパラトープに置き換えることによって行った。我々は、Ｆｃドメインと、一方のＦｃドメイン末端に付加されたＦＺＤ結合ドメインと、他方のＦｃドメイン末端に付加されたＬＲＰ結合ドメインとを含む、「単結合」分子を生成したが、ダイアボディ内にＦＺＤまたはＬＲＰに対する２つの結合部位を有するというよりも、結合ドメインは、単一結合部位または単結合部位のみと、１つの対照用マルトース結合タンパク質結合部位「ＭＢＰ」とを有する。１つのＭＢＰ結合部位を上記分子の少なくとも１つの結合ドメインに導入して、５種の単結合分子を生成した。１つのＦＺＤ結合部位と１つのＭＢＰ結合部位とをＮ末端に含有する５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２は、やはりＷｎｔ経路を活性化するが、５０１９Ａｇに比べて効能が８倍減少した（図３Ｅ）。同様に、ＬＲＰ６−Ｗ３部位を１つのみＣ末端に保持する５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−ＭＢＰは、５０１９Ａｇに比べてはるかに少ないＷｎｔ活性化を呈する（図３Ｅ）。最小限のアゴニスト活性は、２種のＭＢＰ−ＦＺＤ／ＭＢＰ−ＬＲＰ６分子である５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−２５３９−ＭＢＰおよび５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−ＭＢＰ−２５４２、ならびに１つのＬＲＰ６−Ｗ１ダイアボディを有する分子である５０１９−Ｋ／Ｈ−ＭＢＰ−２５４２について検出された（図３Ｅ）。これらのβカテニンシグナル伝達アッセイの結果では、最大の刺激が、ＷＮＴ１結合部位に対する１つの抗ＦＺＤパラトープまたは抗ＬＲＰ６パラトープを無力化することによって大きく低減され、ＷＮＴ３Ａ結合部位に対する抗ＬＲＰ６パラトープを無力化することによって、または１つの抗ＦＺＤパラトープとどちらかの抗ＬＲＰ６パラトープとを同時に無力化することによって、完全に除去されたことが示された。我々はまた、ＷＮＴ３Ａ結合部位を標的とする抗ＬＲＰ５パラトープを、ＷＮＴ１結合部位を標的とする抗ＬＲＰ６パラトープに置換して、分子（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ５／６３）を生成したが、この分子は、両方の共受容体を動員することができ、観察された活性はＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３と同様であった（図３Ｆ、ＥＣ５０＝４ｎＭ）。以上をまとめると、これらのデータでは、最適なアゴニスト活性が、共通のエピトープを介して２つのＦＺＤと、２つの別個のエピトープを介してＬＲＰ６とを動員できる分子により達成されるが、活性は、抗ＦＺＤパラトープまたは抗ＬＲＰ６パラトープのうちの１つを無力化することによって、中程度のレベルに調整できることが示された。さらに、ＦＺＤと２つの異なる共受容体とを動員できる分子が、２つの抗ＦＺＤパラトープをＬＲＰ５およびＬＲＰ６それぞれに対する１つのパラトープに組み合わせることによって生成された。
我々はまた、ダイアボディの対を制約の少ない分子内の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の対に置換することによって、分子間ダイアボディ形式により課される幾何学的および空間的な制約についての要件を探索した（図２Ｊ）。ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３に比べて、抗ＦＺＤ ｓｃＦｖ（ＦＰ＊＋Ｐ＊−Ｌ６１＋３）を含有するＦＬＡｇは、類似の活性を呈したのに対し、抗ＬＲＰ６ ｓｃＦｖ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＊＋３＊）を含有するかまたは両端にｓｃＦｖ（ＦＰ＊＋Ｐ＊−Ｌ６１＊＋３＊）を含有するＦＬＡｇについては、活性が大幅に低減した。これらの活性の差は、親和性の差に起因しておらず、それは、パラトープが提示されていたのがダイアボディかｓｃＦｖ形式かに関わらず、ＢＬＩ測定では、ＬＲＰ６およびＦＺＤアイソフォームとの同等の高親和性の結合が示されたことによる（図２Ｋおよび図２Ｌ）。以上をまとめると、これらの結果では、最適なＦＺＤ／ＬＲＰ６シグナル伝達複合体のアセンブリには、特定の化学量論および幾何学的配置が必要であり、制約は、ダイアボディ形式によって規定される特異的な幾何学的配置での２つの別個のエプトープの係合を要するＬＲＰ６について、特に明確であることが示された。注目すべきは、ＦＺＤの係合についての制約が緩いことによって、単一の抗ＦＺＤパラトープによる著しい活性化が可能となり（図２Ｄ）、このことは、ヘテロ二量体ＦｃのＮ末端の抗ＦＺＤパラトープと連動した追加的なパラトープを介して異なる細胞表面タンパク質を動員することによって、特異性をさらに増強するか、またはシグナル伝達を変更させるための扉を開く。
３．他の二重特異性抗体の形態
Ｆｃドメインの同じ末端上に抗体＃５０１９のＦＺＤ結合ドメインと抗体＃２９４２（５０１９／２９４２）のＬＲＰ６−Ｗ１結合ドメインまたは抗体＃２５３９（５０１９／２５３９）のＬＲＰ６−Ｗ３結合ドメインとを含む二重特異性分子を構築し、対応するタンパク質を精製し（図２Ａ）、ｐＢＡＲルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてＷｎｔシグナル伝達の活性化をアッセイした。これらの分子は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化できなかった。注目すべきことに、どちらの二重特異性分子も、Ｗｎｔリガンドの活性に拮抗した（図２Ｂ）。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの二重特異性分子の２つのパラトープ間の距離および可撓性により、活性化に適した幾何学的配置でＦＺＤおよびＬＲＰ６受容体が動員されない可能性がある。
Ｆｃドメインの同じ末端に付加されたＦＺＤダイアボディとＬＲＰダイアボディとを含む二重特異性分子も、ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ立体配置を用いて生成した。５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ−Ｗ１）と命名したこれらのダイアボディを、ＦＺＤおよびＬＲＰとの結合ならびにＷｎｔ経路の活性化についてアッセイした。どちらのダイアボディも、元の抗体のＦＺＤ結合プロファイルならびにＬＲＰ６結合活性を保持した。（図２Ｄ〜図２Ｇ）。どちらの分子も個々にＦＺＤ受容体およびＬＲＰ共受容体を結合した。５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈは、ＢＬＩアッセイにより決定した際に、溶液中でＦＺＤおよびＬＲＰの両方との共結合を呈したが（図２Ｈ）、５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈでは顕著な共結合は観察されなかった。５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈと５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈのどちらも、ｐＢＡＲルシフェラーゼレポーターアッセイで決定した際にＷｎｔシグナル伝達を活性化せず、ＦＺＤ受容体（５０１９−Ｆｃ）または共受容体（２５３９−Ｆｃ）に結合するホモダイアボディにより得られた結果と同様であった（図２Ｉ）。さらに、５０１９−２５３９−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ−Ｗ３）および５０１９−２５４２−Ｋ／Ｈ（ＦＺＤ／ＬＲＰ−Ｗ１）は、Ｗｎｔ３ａ媒介性経路の活性化を効果的に阻害した（図２Ｉ）。
４．Ｗｎｔ経路シグナル伝達アッセイ
Ｗｎｔ経路の活性化を、β−カテニンの転写活性化を忠実にモニタリングするｐＢＡＲルシフェラーゼレポーター系（Biechele and Moon, Metods Mol Biol. 2008; 468:99-110, PMID: 19099249）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞でアッセイした。端的に述べれば、ｐＢＡＲＬＳおよびｐＳＬ９ Ｅｆ１α−ウミシイタケルシフェラーゼ構築物を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに１．５Ｅ４細胞個／ウェルで播種した。播種の２４ 時間後、細胞を、標示されたＦＺＤアゴニストにより標示濃度にて３連で、またはＰＢＳビヒクル対照により処理した。処理の１６．５時間後、細胞を溶解して、発光をデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ１９６０）により、製造業者のプロトコールに従って測定した。各ウェルについてホタル発光をウミシイタケ発光に正規化して、細胞数を考慮した。
我々は、ＦｃドメインのＣ末端上のＬＲＰ結合ドメインにＦｃドメインを介して結合した、いくつかのＦＺＤ受容体（ＦＺＤ１、２、４、５、７、および８）を認識する抗体断片（抗体＃５０１９）由来のＮ末端ＦＺＤダイアボディを含有する多価分子のアゴニスト活性をアッセイした。Ｃ末端ＬＲＰ結合ドメインは、Ｗｎｔ３部位およびＷｎｔ１部位にそれぞれ結合する２つのＬＲＰ６抗体＃２５３９および＃２５４２のうち１つに由来するダイアボディからなる（図６Ｂ）。ナノモル量の５０１９−Ｆｃ−２５３９および５０１９−Ｆｃ−２５４２と命名されたこれらの多価結合分子は、Ｗｎｔ−β−カテニン経路を活性化したが（図６Ｃ）、Ｗｎｔ３部位を標的とするＬＲＰ６抗体５０１９−Ｆｃ−２５３９を担持する分子を用いて細胞を処理することによって、５０１９−Ｆｃ−２５４２に比べて、およそ１０倍高い活性化が生じる（バックグラウンドをそれぞれ２００倍ｖｓ２０倍上回る）（図６Ｃ）。
重要なことに、Ｆｃ部分内に工学的に作製されたｋｎｏｂ−ｈｏｌｅ系を使用して、我々は、パンＦＺＤ結合ドメインに対する（＃５０１９）ホモダイアボディを一端に含有し、Ｗｎｔ１（＃２５４２）およびＷｎｔ３（＃２５３９）に対する結合部位を含むＬＲＰ６結合ドメインを形成するヘテロダイアボディ５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２を他端に含有する、多価結合分子（図１Ｃ）を生成した（図６Ｂ）。この立体配置は、異なる選択性および親和性のプロファイルを有する、すなわち四価および三重特異性である分子内に、４つの異なる結合部位を組み込むことを可能にした。ＨＥＫ２９３細胞におけるβ−カテニンルシフェラーゼレポーターアッセイに供試すると、この分子は、５０１９−Ｆｃ−２５３９より２倍高い、またはバックグラウンドをおよそ４００倍上回る活性化を示す（図６Ｃ）。
我々はまた、ＦＺＤ１、２、４、５、７、８を結合する同じパンＦＺＤダイアボディ（５０１９）を併せて有するｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ系内にあるＬＲＰ６に対する結合部位を、同等のＬＲＰ５結合部位（どちらもＬＲＰ５を結合する２４５９抗体および２４６０抗体に由来するダイアボディ）に置き換えた。この分子５０１９−Ｋ／Ｈ−２４５９：２４６０もまた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＬＲＰ６ダイアボディを担持するアゴニストよりも低い効能ではあるものの、Ｗｎｔ−β−カテニン経路を活性化することが可能であった（図６Ｄ）。
５．結合ドメインを有する選択的なＦＺＤアゴニスト（選択的なＦＺＤ抗体断片および共受容体抗体断片に由来するアゴニストモジュール性の特性解析）
我々の単一特異性のＦＺＤアゴニストの活性を評価するために、特定のＦＺＤアイソフォームに依存するセルベースアッセイを使用した。我々は、１０種のＦＺＤ受容体のうちの１つにのみ結合する多価結合分子を調製した。我々の以前の研究では、ＦＺＤ４に完全に特異的ないくつかの抗体（５０３８、５０４４、５０４８、５０６２、５０６３、５０８０、５０８１）が特定された（例えば、発明者Ｓｉｄｈｕらの米国特許出願公開公報第２０１６０１９４３９４号、および発明者ＰａｎらのＷＯ２０１７１２７９３３Ａ１を参照）。ＦＺＤ４特異的なＦＺＤ結合ドメインと、抗体２５３９および２５４２に由来する二重特異性のヘテロダイアボディを含むＬＲＰ６結合ドメインとからなる多価結合分子を、Ｆｃのｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ系を用いて生成した。これらの分子は、β−カテニン経路を介してＦＺＤ４シグナル伝達を活性化することができたが、それはＦＺＤ４ ｃＤＮＡと共にＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトしたときのみであった。これらのＦＺＤ４結合分子は、低いレベルのＦＺＤ４を発現する非改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＦＺＤ４シグナル伝達またはβ−カテニン経路を活性化することができなかった。ゆえに、この実験は、FZD4に対する分子の特異性を実証している。５０１９−Ｋ／Ｈ−２５３９−２５４２（上に記載されたパンＦＺＤアゴニスト）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるシグナル伝達を、ＦＺＤ４の不在下であっても活性化することができる（図４Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるβ−カテニンシグナル伝達のＷｎｔ媒介性の活性化がＦＺＤ１、２、および７を介して発生し（Voloshanenko et al. FASEB 2017 FASEB J. 2017 Nov；31(11):4832-4844；PMID:28733458）、５９１９ ＦＺＤ抗体が３つ全ての受容体に結合することから、上記の結果は驚くべきことではない。
さらに、我々は、ＦＺＤ５のみに結合するという特徴を以前に明らかにしたＦＺＤ５特異的な抗体２９２８の結合ドメイン（Steinhart et al. Nat Med. 2017 Jan；23(1):60-68, PMID:27869803；発明者ＰａｎらのＷＯ２０１７１２７９３３Ａ１）を用いて、ＦＺＤ５特異的な多価結合分子を生成した。我々は以前に、複数のＲＮＦ４３変異膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞株がその増殖をＦＺＤ５シグナル伝達のみに依存することを実証した(Steinhart et al. 2017, PMID:27869803）。実際には、３つのＲＮＦ４３変異ＰＤＡＣ株におけるゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ不可欠性／適応性スクリーニングでは、ＦＺＤ５がその成長に最も不可欠な遺伝子の１つであったのに対し、ＷＴ ＲＮＦ４３を有するＰＤＡＣ細胞株がＦＺＤ５に対するこの要求性を示さないことが示された。パルミトイル化とＷｎｔリガンドの活性とを阻害するＰｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤（ＰＯＲＣＮｉ；例えばＬＧＫ−９７４など）を用いてＲＮＦ４３変異細胞を処理した際に、ＲＮＦ４３変異細胞は増殖を停止する。
パンFZDag 5019-K/H-2539-2542を用いて、または選択的な FZD5 アゴニスト 2928-K/H-2539-2542を用いて、RNF43 変異 細胞を共処理することにより、 LGK974により遮断される細胞 増殖の堅固なレスキューを生じた。 これらの 結果は、これら２つの分子がFZD5を活性化することができ、これらの 細胞にWntシグナル伝達を誘導し、それによって内在性の Wnt リガンドの作用を模倣することを実証する (図 7B)。これに対して、FZD4 特異的な アゴニスト 5038-K/H-2539-2542 またはFZD2 特異的な アゴニストの追加は、LGK974増殖の阻害をレスキューすることができなかったof 培地ted by.
ＲＮＡ配列解析は、ＦＺＤ２が間葉系幹細胞株ＣＨ３Ｈ１０Ｔ１／２（マウスＥＮＣＯＤＥ）において優勢のアイソフォームであることを示しており、このことは、ＦＺＤ２が間葉系細胞の骨形成分化の間のＷｎｔタンパク質の確立した役割（Day et al. Dev. Cell. 8, 739−750 (2005)）に関与している可能性があることを示唆する。ＦＺＤ２特異的なＦｌａｇによるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の刺激によって、パンＦＺＤＦＬＡｇにより達成されたものと同様のレベルに骨形成マーカーのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）の堅固な誘導が生じたのに対し、ＦＺＤ５特異的なＦＬＡｇは最小限の活性を示した（図７Ｂ）。
６．四価結合分子を用いる共標的化
ＦＺＤ多価結合ドメインと共受容体結合ドメインとをＦｃドメインに混合し適合させて所望の組合せを達成することに加えて、現行の系における四価のパラトープの存在は、ｉｎ ｖｉｖｏで適用された際に、２つのＦＺＤ受容体と２つの共受容体とを１分子により同時に標的させ、確実に共局在化させる機会をもたらす。上記に示された５０１９−ＭＢＰ−Ｋ／Ｈ−２５３９：２５４２のアゴニスト活性を考慮すると、ＦｃドメインのＮ末端でヘテロダイアボディ内において結合領域を組み合わせることによって、選択的なＦＺＤ受容体に対する結合ドメインを有する多価結合分子の生成。例えば、抗体５０３８（ＦＺＤ４を結合する）および２９２８（ＦＺＤ５を結合する）に由来する結合ドメインは、ＦＺＤ４およびＦＺＤ５を共に標的とする分子を産生するものとなる。この結合分子はまた、特異的なまたは複数の共受容体に対する共受容体結合ドメイン有するように生成することができる。例えば、ＬＲＰ６／ＬＲＰ５を共に標的とする結合ドメインは、ＦｃドメインのＣ末端上で２４５９（ＬＲＰ６のＷｎｔ１結合部位を結合する）抗体および２５３９（ＬＲＰ６のＷｎｔ３ａ結合部位を結合する）抗体に由来する結合ドメインを組み合わせることによって作製することができた。同様に、共受容体結合ドメインは、単一の細胞で古典的および非古典的の両方のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を開始するために、別の共受容体、例えばＲＯＲ１／２との組合せで、ＬＲＰ６に対する結合部位を含むことがある。
また本明細書に想定されるのは、多価結合分子を所望の組織に動員するものとなる、組織特異的な抗体に由来する組織特異的な結合ドメインを有する多価結合分子であって、上記組織では、この分子は、次いで、ＦＺＤ受容体および共受容体を結合することによって、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するものとなる。このことは、再生治療に多価結合分子を使用する際に、所望の効果を特異的な組織に制限することが求められるような場合に、特に有用であるものと想定される。まとめると、四価の様式は、多用途の機能的な要件を満たすためのさらに設計上の柔軟性をもたらす。
７．ＦＺＤ結合ドメインと共受容体結合ドメインとを有する多価結合分子は、Ｗｎｔリガンドを代替して、腸のオルガノイド培養を持続させることができる。
オルガノイドの生存および維持に及ぼされる本明細書に記載されるＦＺＤアゴニストの効果を、以下のようにアッセイした。８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、小腸陰窩をオルガノイドの単離用に採取した（O'Rourke et al. 2016. Isolation, Cuture, and Maintenance of Mouse Intestinal Stem Cells. Bio Protoc. 20:4）。オルガノイド培養物を機械的解離（O’Rourke 2016）に通し、４８ウェルプレート中、２５μＬの成長因子低減型マトリゲル（コーニング、３５６２３１）に包埋した。オルガノイドを各実験条件に対し３連で播いた。実験条件（１μＭ ＬＧＫ−９７４＋／−４０％ Ｗｎｔ３ａ条件培地または＋／−５０ｎＭ パンＦｚｄ−５０５６（ＦＺＤ１、２、４、６、７、８を標的とするが、Ｗｎｔリガンドに競合しないエピトープに結合するＦＺＤａｇ））を含む完全オルガノイド培地（O’Rourke 2016）を、各ウェルに継代日に添加し、２〜３日毎に交換した。１週間後、１５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ３Ｄ（プロメガ）を各ウェル中、１５０μＬの培地に添加した。オルガノイドを揺動攪拌機上、ＲＴで３０分間溶解した。発光の読取りを、各ウェル由来の２０μＬの溶解物について２連で測定した。各条件由来の発光の読取りの平均を、ＤＭＳＯ条件に正規化して、生存率を計算した。
広汎性の幹細胞のニッチ因子であることから、ＷｎｔおよびＲ−スポンジンは、多くの組織由来の三次元培養オルガノイドの誘導体化および維持に必要とされる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、パネート細胞によって分泌されたＷｎｔタンパク質は、Ｒ−スポンジンの存在下でマウスの小腸オルガノイドの成長を支持するのに充分である。しかし、Ｗｎｔが放出し、活性がＰＯＲＣＮｉ ＬＧＫ９７４により遮蔽された場合、オルガノイドは増殖することができず、遂には死滅する。本明細書では、我々は、本発明のパンＦＺＤ多価結合分子であるＦＺＤａｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）が、ＬＧＫ９７４の存在下でオルガノイドの成長をレスキューし持続させることができることを実証し、このことは、この分子がＷｎｔリガンドを機能的に模倣し（図８）、Ｗｎｔタンパク質を代替して組織オルガノイドの成長を支持できることを示唆する。Ｗｎｔリガンドは、多くのヒト組織オルガノイドを成長させるのに必要な培地の不可欠な成分であることから、本発明の抗体由来のＦＺＤアゴニストは、培養培地に含まれる場合に、異なる組織のオルガノイドの誘導体化、生存、および維持を促進し、それによって条件培地または精製Ｗｎｔタンパク質の使用に伴う制限を軽減することが予想される。
８．骨再生を促進する多価結合分子
ラット非観血的大腿骨骨折モデルを使用して、ＦＺＤ２を結合する第１の多価結合ドメインと、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に結合する共受容体結合ドメインとを有する本発明の多価結合分子の再生特性を評価する。第１の多価結合ドメインは、ＦＺＤ２を特異的に結合してもよいし、ＦＺＤ２と他のＦＺＤ受容体とを結合してもよい。
片側の非観血的な大腿骨の骨幹中央部骨折に続いて、ラットにビヒクルまたは多価結合分子を投与する（Bonnarens, and Einhorn, J. Orthop. Res. 2, 97−101 (1984)を参照）。端的に述べれば、骨顆を通じて髄管内に１８ゲージのシリンジ針を挿入する。次いで、大腿の前面（外側面）で鈍い衝撃をかけることによって、大腿部の横断骨折を作り出す。骨折の１日後、ラットに生理食塩水ビヒクルまたは多価結合分子のどちらかを、７週間にわたって週２回、皮下注射する。終了時に、髄内のピンを取り出し、骨折した大腿骨をマイクロＣＴによって分析するものとする。
ＦＺＤ２を結合する多価ドメインと、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に結合する第２の多価結合ドメインとを有する多価結合分子は、ビヒクルのみによる骨再生に比べて、このモデルにおける骨の再生を大幅に増加させる。
実施例ＩＩ−ＦＺＤおよびＬＲＰ６を標的とする合成抗体
我々は既に、９種の組換えＦＺＤ ＣＲＤを抗原として使用して（ＦＺＤ３ ＣＲＤは精製できなかった）、ファージディスプレイを適用して、何百もの合成Ａｂを取得した（Steinhart et al. Nat. Med. 23 , 60 (2016)； Pavlovic et al. MAbs (2018), doi: 10.1080/19420862.2018. 1515565）。体系的な特性解析により、特異性プロファイルの連続性が明らかになり、そのプロファイルでは、いくつかのＡｂが、ＦＺＤ１／２／４／５／７／８を認識したパンＦＺＤ Ａｂ（ＦＰ）に例示される広い特異性を提示し（図１１Ａ）、他のものは、さらに限定された特異性を提示し、いくつかは単一特異性であった（図１１Ｂ）。機能的特性解析により、いくつかの抗体がＷｎｔに競合し、βカシグナル伝達を阻害するのに対して、他のものは、非競合的であり、Ｗｎｔシグナル伝達に干渉しないことが明らかになった（図１１Ｂ）。総じて、我々は、４７種のＷｎｔシグナル伝達阻害剤を含めて１６１種の抗ＦＺＤ抗体の特性を完全に明らかにした。本明細書に議論されるように予想外にも、Ｗｎｔに競合しＷｎｔシグナル伝達を阻害するか否かに関わらず、これらの抗ＦＺＤ抗体をＦＺＤ結合ドメインの供給源として、ＬＲＰ結合ドメイン、例えば、ＬＲＰ５／６上のＷｎｔ１結合部位および／またはＷｎｔ３ａ結合部位に結合する結合ドメインと連動して使用することによって、我々が生成した全ての多価結合分子が、Ｗｎｔ経路のアゴニストであった。
実施例ＩＩＩ−細胞、オルガノイド、動物におけるＦＬＡｇの表現型作用
ＦＬＡｇが選択的にＦＺＤおよびＬＲＰを係合してＷｎｔ関連シグナル伝達経路を活性化することが確立されたことから、我々は、前駆幹細胞（ＰＳＣ）、オルガノイド、および動物におけるこれらのシグナルの表現型作用を探索した。Ｗｎｔ−βカテニンシグナル伝達活性の調節は、殆どのＰＳＣの分化のプロトコールに不可欠である（Huggins et al. Methods Mol. Biol. 1481 , 161−181(2016)）。ＷＮＴ３Ａ条件培地またはＧＳＫ３の小分子阻害剤によるヒトＰＳＣの処理は、βカテニンシグナル伝達を活性化し、原始線条の誘導を生じ、中胚葉の運命特定を促進する（Davidson et al. PNAS U.S.A. 109 , 4485−4490 (2012)）。我々は、この状況でのＦＬＡｇ活性を評価し、ヒトＰＳＣを３０ｎＭ ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３により３日間処理することにより、６μＭでのＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１による処理と同等のレベルに、中胚葉マーカーＢＲＡＣＨＹＵＲＹの堅固な誘導が引き起こされ、多能性マーカーＯＣＴ４の発現が減少することを見出した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３は、マウスＦＺＤおよびＬＲＰ６を認識し、ＦｃＲｎに相互作用するＦｃを含有する。Ｆｃはこの分子にｉｎ ｖｉｖｏでＡｂ様の長い半減期を付与することが想定される。そのため、我々は、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３がマウスにおいて内在性の受容体に相互作用できるか、βカテニンシグナル伝達を活性化するのに十分となるレベルに蓄積できるか、内在性の幹細胞活性を動員できるか否かを試験した。腸の幹細胞のニッチ内では、間葉細胞によって分泌されたＷｎｔタンパク質は、陰窩の下部の幹細胞におけるβカテニン標的遺伝子の発現を誘導してそれらの自己再生を方向付けるため、標的遺伝子ＬＧＲ５は、様々な組織における幹細胞のマーカーとしてしばしば使用される。ＬＧＲ５−ＧＦＰマウスをＬＧＫ９７４により処理することによって、陰窩幹細胞においてＷｎｔ産生が消散され、ＬＧＲ５発現および連結ＧＦＰシグナルの速やかな減衰が引き起こされた。注目すべきことに、腹腔注射によりＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３を共処理すると、ＧＦＰ発現はレスキューされた（図１４、右パネル。我々は、ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３が、内在性のＷｎｔの不在下で腸の幹細胞の自己再生を促進するレベルでβカテニン活性化を可能にするのに十分な半減期と生物学的利用性とを有するものと結論付けた。
実施例ＩＶ−材料および方法：
１．Ａｂの選択およびスクリーニング
記載されたように（Persson et al. J. Mol. Biol. 425 , 803−811 (2013)）、ファージディスプレイ合成ライブラリーＦを使用して、Ｗｎｔ受容体に結合するＦａｂを選択した。端的に述べれば、Ｆｃタグ化ＥＣＤタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ）をＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（サーモフィッシャー、カタログ番号 １２−５６５−１３５）に固相化し、ライブラリーファージプールによる陽性結合性選択に使用した。上記プールは、最初に、同様に固相化されたＦｃタンパク質に曝露して、非特異的なバインダーを枯渇させたものであった。４ラウンドの結合性選択の後、クローンファージを調製し、ファージＥＬＩＳＡ（Birtalan et al. J. Mol. Biol. 377 , 1518−1528 (2008)）によって評価した。Ｆｃに比べて抗原との結合について少なくとも１０倍大きなシグナルを提示したクローンを、さらに進んだ特性解析に供する特異的なバインダーであるものとした。
２．組換えタンパク質および試薬
ＦＺＤ１（５９８８−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ２（１３０７−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ４（５８４７−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ５（１６１７−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ７（６１７８−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ８（６１２９−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ９（９１７５−ＦＺ−０５０）、ＦＺＤ１０（３４５９−ＦＺ−０５０）のＦｃタグ化融合体は、Ｒ＆Ｄシステムズから購入した。ＦＺＤ６（残基１９〜１３２、ＵｎｉｐｒｏｔＯ６０３５３−１）のＦｃタグ化ＥＣＤは、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（インビトロジェン）を用いてＥｘｐｉ２９３細胞で発現して精製し、凝集タンパク質からＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１０／３００）カラム（ＧＥヘルスケア）上でサイズ排除クロマトグラフィーによって単一のプロトマー種を分離した。ヒト（１５０５−ＬＲ−０２５）およびマウス（２９６０−ＬＲ−０２５）のＬＲＰ６ならびにマウスのＬＲＰ５（７３４４−ＬＲ−０２５／ＣＦ）のＦｃタグ化ＥＣＤ融合タンパク質は、Ｒ＆Ｄシステムズから購入した。ＷＮＴ１（ＳＲＰ４７５４−１０ｕｇ）、ＷＮＴ２ｂ（３９００−ＷＮ−０１０／ＣＦ）、ＷＮＴ５ａ（６４５−ＷＮ−０１０／ＣＦ）、およびＷＮＴ３Ａ（５０３６−ＷＮ−０１０／ＣＦ）は、Ｒ＆Ｄシステムズから購入し、ＷＮＴ３Ａ条件培地は、記載（ＰＭＩＤ：１２７１７４５１）された通りに調製した。他のタンパク質および化学物質は、以下の供給業者から購入した：ＦｃＲＮ（Ｒ＆Ｄ、８６９３−ＦＣ）、Ｃ１ｑ（シグマ、Ｃ１７４０）、ＣＤ１６ａ（Ｒ＆Ｄ、４３２５−ＦＣ）、ＣＤ３２ａ（Ｒ＆Ｄ、１３３０−ＣＤ／ＣＦ）、ＣＤ６４（Ｒ＆Ｄ、１２５７−ＦＣ）、ＬＧＫ９７４（ケイマンケミカルズ）、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤Ｃ５９（ダルリアダ・セラピューティクス）、およびＣＨＩＲ９９０２１（シグマ・アルドリッチ）。
３．ＦＺＤおよびＬＲＰに対する四価結合分子「ＦＬＡｇ」ならびに抗体のクローニング
抗体（Ａｂ）可変ドメインをコードするＤＮＡ断片は、ファージミドＤＮＡ鋳型からＰＣＲによって増幅されるか、または化学合成に（ツイストバイオサイエンス）によって構築されるかのどちらかである。カッパ軽鎖とヒトＩｇＧ１重鎖とを生産するように設計された哺乳類発現ベクター（ｐＳＣＳＴａ）に、ＤＮＡ断片をクローニングした。二重特異性ダイアボディおよびＩｇＧは、「ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−ｈｏｌｅｓ」のヘテロ二量体Ｆｃの最適化されたバージョンを含有していた（Ridgway et al. Protein Eng. 9, 617−621 (1996))。ＦＬＡｇおよびダイアボディ−Ｆｃ融合体をＶＨ−ＶＬ配向に配列し、可変ドメインを短いＧＧＧＧＳ（例えば配列番号２のアミノ酸１２１〜１２５）リンカーによって隔てたが、このリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の分子間会合を選好し、それゆえにダイアボディの形成を選好するものである。ダイアボディ−Ｆｃ融合構築物を生産するために、ダイアボディ鎖をヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合した。ＦＬＡｇタンパク質をＶＨ−ｘ−ＶＬ−ｙ−［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ］−ｚ−ＶＨ−ｘ−ＶＬとして構築し、式中、リンカーをｘ＝ＧＧＧＧＳ（例えば配列番号２のアミノ酸１２１〜１２５）、ｙ＝ＬＥＤＫＴＨＴＫＶＥＰＫＳＳ（配列番号４のアミノ酸２３２〜２４５）、ｚ＝ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＧＧ（配列番号４のアミノ酸４７３〜５０１）とした。この方式では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃまたはｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅのＩｇＧ１ Ｆｃ断片は、２３４位から４７８位（カバット付番則）に広がっていた。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体については、可変ドメインをＶＬ−ＶＨ配向に配列し、長いＧＴＴＡＡＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧＡ（配列番号７５）リンカーによって接続したが、このリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の分子内会合を選好し、それゆえにｓｃＦｖの形成を選好するものである。全ての構築物について、コード領域全体を分泌シグナルペプチドと併せてインフレームで哺乳類発現ベクターにクローニングした。
４．タンパク質の発現および精製
抗原、Ａｂ、およびＦＬＡｇタンパク質を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（サーモフィッシャー）細胞で一過的トランスフェクションによって生産した。端的に述べれば、細胞をバッフル付細胞培養フラスコでＥｘｐｉ２９３発現培地（ギブコ）中、およそ２．５×１０６細胞個／ｍＬの密度に成長させ、標準的な製造プロトコール（サーモフィッシャー）を用いて、ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬（ポリプラス・トランスフェクション）を用いて適切なベクターによりトランスフェクトした。１２５ｒｐｍで攪拌しながら３７℃および８％ＣＯ２にて５日間、発現を進めた。発現後、細胞を遠心分離により除去し、ｒ−プロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア）を用いてタンパク質を条件培地から精製した。精製タンパク質をＰＢＳまたは保存用の配合安定化緩衝液（３６．８ｍＭクエン酸、６３．２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％トレハロース、０．２Ｍ Ｌ−アルギニン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ６．０）のどちらかにバッファー交換した。タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度で決定し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。
５．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（フォルテバイオ）を用いて、ＢＬＩアッセイを実施した。抗原との結合を測定するために、ＦＺＤ受容体のＦｃタグ融合体（ＦＺＤ−Ｆｃタンパク質）をＡＨＱＢＬＩセンサ（１８−５００１、フォルテバイオ）上で捕捉してＢＬＩ応答０．６〜１ｎｍに到達させ、残りのＦｃ結合部位をヒトＦｃ（００９−０００−００８、ジャクソンイムノリサーチ）により飽和させた。ＦＺＤ被覆または対照（Ｆｃ被覆）のセンサをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中１００ｎＭ ＡｂまたはＦＬＡｇに移し、会合を３００秒間モニタリングした。次いで、センサをアッセイ緩衝液中に移し、解離をさらに３００秒間モニタリングした。攪拌スピードを１０００ｒｐｍとし、温度を２５℃とした。２９５秒後の会合時間に終点の応答値を取得した。終点のデータは、ＦｃシグナルをＦＺＤ−Ｆｃシグナルから減算し、次いでデータを最も高い結合シグナルに正規化することによって解析した。
Ｆｃ受容体との結合を測定するために、ＡｂｓまたはＦＬＡｇをＡＲ２Ｇセンサ（１８−５０９２、フォルテバイオ）上にアミンカップリングにより固相化してＢＬＩ応答０．６〜３ｎｍに到達させ、残りの部位をエタノールアミンにより消失させた。被覆センサをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で平衡化し、Ｆｃ受容体溶液中に移した。会合を６００秒間モニタリングし、センサをアッセイ緩衝液に移して、解離を６００秒間モニタリングした。ＣＤ６４および他の全てのＦｃ受容体を、標示のない限りはそれぞれ５０ｎＭまたは３００ｎＭでｐＨ７．４でアッセイした。攪拌スピードを１０００ｒｐｍとし、温度を２５℃とした。終点の応答値を会合相の終了時に取得し、アイソタイプ対照に正規化した。定常状態ＦｃＲＮ結合アッセイは、ＦｃＲＮを固相化してＡｂまたはＦＬＡｇの希釈系列（０．１〜２２５ｎＭ）を溶液中で評価することを除いて、同様に実施した。会合時間および解離時間はそれぞれ、６００秒間または１２００秒間とした。
ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６システム（バイオラッド）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを実施した。標準的なアミンカップリング化学を用いて、ＦＺＤ−Ｆｃタンパク質またはＬＲＰ−Ｆｃタンパク質をＧＬＣセンサ表面（１７６−５０１１）に固相化した。アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＢＳＡ）中ＡｂまたはＦＬＡｇを４０μＬ／分で注入し、会合を１５０秒間モニタリングした。次いで、アッセイ緩衝液を１００μＬ／分で注入し、解離を９００秒間モニタリングした。アッセイは２５℃で実施した。１：１ラングミュアモデルおよびグローバルフィットを用いて解析を実施し、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いてｋｏｎ値およびｋｏｆｆ値を決定した。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比としてＫＤを算出した。
６．エピトープビニング
Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ計器（フォルテバイオ）を用いて、ＢＬＩエピトープビニング実験を実施した。ＦＺＤ（ＦＺＤ−Ｆｃ）またはＬＲＰ６（ＬＲＰ６−Ｆｃ）タンパク質とのＦｃ融合体をＡＨＱ（１８−５００１、フォルテバイオ）またはＡＲ２Ｇ（１８−５０９２、フォルテバイオ）ＢＬＩセンサにそれぞれ固相化した。被覆されたセンサをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中１００ｎＭ Ａｂに２４０秒間にわたって移し、結合部位の飽和を達成した。次いで、センサをアッセイ緩衝液中１００ｎＭ競合Ａｂに１８０秒間にわたって移した。競合Ａｂへの曝露後２０秒での応答を測定して、非ブロッキング抗原被覆センサ上の結合シグナルに正規化した。攪拌スピードを１０００ｒｐｍ、温度を２５℃とした。
７．細胞株
ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞株およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、４．５ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン（サーモフィッシャー＃１２４３０−０５４）を含有しかつ１０％ＦＢＳ（サーモフィッシャー）およびペニシリン／ストレプトマイシン（サーモフィッシャー＃１５１４０−１６３）を補充されたＤＭＥＭ中で維持した。ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（サーモフィッシャー＃１１３２０−０３３）中で維持した。細胞は３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
８．フローサイトメトリー
細胞の間接的な免疫蛍光染色を、以前に記載されたように（Steinhart et al. 2017 Nat Med. Jan；23(1):60-68, PMID: 27869803）、ＣＨＯ細胞株に対し１０ｎＭ抗ＦＺＤ Ｆａｂを用いて実施した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２を二次抗体として使用した（ジャクソンイムノリサーチ、１０９−５４５−０９７）。抗ｃ−Ｍｙｃ ＩｇＧ１ ９Ｅ１０（一次抗体、サーモフィッシャー、ＭＡ１−９８０）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＩｇＧ（二次抗体、ライフテクノロジーズ、Ａ１１００１）を発現の対照として使用した。全ての試薬を、製造業者の指示書に従って使用した。
９．ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ｐＢＡＲｌｓレポーター（Biechele and Moon in Wnt Signalling: Pathway Methods and Mammalian Models, E. Vincan, Ed. (Humana Press, Totowa, NJ, 2008), pp. 99−110）をコードするレンチウイルスおよび対照としてウミシイタケルシフェラーゼを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入し、Ｗｎｔ−βカテニン シグナル伝達レポーター細胞株を生成した。トランスフェクションまたは刺激の前に、１２０μＬ中１〜２×１０３細胞個を、９６ウェルプレートの各ウェルに２４時間播種した。翌日、ＦＬＡｇまたはＡｂタンパク質を添加し、刺激の１５〜２０時間後、細胞を溶解し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー）を用いてデュアルルシフェラーゼのプロトコール（プロメガ）に従って発光を測定した。ＦＺＤ４特異的なアゴニストアッセイについては、ＦＺＤ４ ｃＤＮＡを６時間トランスフェクトした後、ＦＬＡｇタンパク質を添加した。Ｗｎｔ阻害アッセイについては、Ｗｎｔ１をｃＤＮＡのトランスフェクションによって導入するか、またはＷＮＴ３Ａタンパク質を６時間適用した後に、Ａｂタンパク質を添加した。全てのアッセイを少なくとも３回繰り返した。
１０．ウェスタンブロットアッセイ
Ｈ１ ＥＳＣを溶解緩衝液（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１％デオキシコール酸、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、１：５００プロテアーゼ阻害剤（シグマ）、および１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４））に可溶化した。溶解物を４℃で３０分間インキュベートし、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜上に転写し、標示のＡｂを用いてウェスタンブロットに供した。Ａｂ検出を、化学発光ベース検出系（ＥＣＬ；サーモフィッシャー）によって実施した。
１１．クリスタルバイオレット増殖アッセイ
ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞をウェル当たり５００細胞個で播種し、２４時間後、１００ｎＭ ＬＧＫ９７４を１００ｎＭ ＦＬＡｇの存在または不在下に添加した。培地を交換し、薬剤処理を隔日で更新した。７日間の処理後、細胞を氷冷メタノール中で固定した。細胞を２５％メタノール中０．５％クリスタルバイオレット溶液により染色し、１０％酢酸中で脱染し、５９０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。
１２．免疫蛍光
ＦＬＡｇおよびＣＨＩＲ９９０２１により３日間処理されたＨ１ ｈＥＳを冷ＰＢＳにより洗浄し、４％ＰＦＡ．により２０分間固定した。固定された細胞をＰＢＳによりリンスし、０．３％ｔｒｉｔｏｎにより１０分間透過化処理し、１％ＢＳＡにより１時間ブロッキングした。細胞を１％ＢＳＡ中、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹに対する一次Ａｂ（Ｒ＆ＤシステムズＡＦ２０８５；ヤギ；希釈率１：１００）またはＯＣＴ３／４（サンタクルズｓｃ５２７９；マウス；希釈率１：１００）共に２時間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ロバ抗ヤギまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識ロバ抗マウスＡｂと共に１時間、インキュベートした（図１３Ａ）。カバースリップを、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（シグマ・アルドリッチ）を用いてマウントし、６０×油浸対物レンズを用いてＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡上で分析した（図１３Ｂ）。ＩｍａｇｅＪおよびＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６（アドビシステムズ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて画像をアセンブルした。
13.腸陰窩自己再生アッセイ
８〜１０週齢のＬｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｌｇｒ５ｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ｃｌｅ／Ｊ）マウスをジャクソンラボラトリー（バーハーバー、メイン州）から購入した。全ての実験は、トロント大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って実施し、カナダ動物保護協議会の規制およびＡＲＲＩＶＥガイドライン（動物試験：ｉｎ Ｖｉｖｏ実験の報告）に適合するものであった。ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３または陰性対照Ａｂを、３７ｍＭクエン酸、６３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％トレハロース、０．２ＭＬ−アルギニン、０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０中で再構成した。Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤Ｃ５９を、ｄｄＨ２Ｏ中０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に混合した０．５％メチルセルロースを用いて再構成した。マウス（雄および雌）を以下の３群（５〜７頭／群）に分けた：ビヒクル、対照（Ｃ５９および対照Ａｂ）またはＦＬＡｇ（Ｃ５９およびＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）。１日目に、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇの対照ＡｂもしくはＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３による腹腔内注射によってマウスを処理した。この処理は、実験の終了まで研究者に対し盲検とし、計３回の処理にわたって２日毎に繰り返した。２日目に開始し、ビヒクルまたは５０ｍｇ／ｋｇのＣ５９を、胃管栄養によりそれぞれビヒクル群または２つの実験群に、１日２回、８時間間隔で４日間にわたって投与した。６日目にマウスを屠殺した。腸組織全体を採取し、冷ＰＢＳで清掃し、ＰＢＳ、３０％スクロースにより脱水し、４％パラホルムアルデヒドにより固定し、最適な切断温度の化合物（optimal cutting temperature compound）（ＯＣＴ）に包埋した。８μｍのＯＣＴ凍結切片を免疫組織学試験に使用した。共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を使用して、腸のＥＧＦＰ陰窩を分析した。ビヒクル、Ｃ５９、またはパンＦＬＡｇ（ＦＰ＋Ｐ−Ｌ６１＋３）＋Ｃ５９により処理されたＬＧＲ５−ＧＦＰマウス由来の小腸切片の代表的な蛍光画像を図１４に図示する。ＬＧＲ５−ＧＦＰは、陰窩の下部の幹細胞で発現している。細胞の核をＤＡＰＩにより対比染色した。
当業者は、通常の実験を超えるものを用いることなく、本明細書に記載の具体的な手順の非常に数多くの等価物を認識するか、または確かめることができるものとなる。そのような等価物は、本発明の範囲内にあるものと考えられる。様々な置換、変更、および改変が、本は爪の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明に対し行われることがある。他の態様、利点、および改変は、本発明の範囲内にある。本願を通じて引用されている全ての参照文献、発行された特許、および公開された特許出願の内容は、参照によりここに組み込まれる。それらの特許、出願、および他の文書の適切な構成要素、プロセス、および方法は、本発明およびその実施形態のために選択されることがある。
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Claims (19)

  1. 細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する方法であって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体およびＷｎｔ共受容体を有する細胞を多価結合分子に接触させることを含み、前記多価結合分子は、
    （ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有する、Ｆｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片、
    （ｂ）少なくとも２つの結合部位を有し、少なくとも１つの結合部位が前記ＦＺＤ受容体に結合する、ＦＺＤ結合ドメイン、および
    （ｃ）少なくとも２つの結合部位を有し、少なくとも１つの結合部位が前記Ｗｎｔ共受容体に結合する、Ｗｎｔ共受容体ドメイン
    を含み、
    前記ＦＺＤ結合ドメインは、前記Ｆｃドメインの一方の末端またはその断片の一方の末端に付加されており、前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、前記Ｆｃドメインの他方の末端またはその断片の他方の末端に付加されている、方法。
  2. 前記ＦＺＤ結合ドメインは、
    （ａ）前記ＦＺＤ受容体を結合するダイアボディであって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドを含み、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬが他方のペプチドのＶＬおよびＶＨと対合しそれによって前記ダイアボディを形成する、ダイアボディ、または
    （ｂ）前記ＦＺＤ受容体を結合するＶＬ領域とＶＨ領域とを含むｓｃＦｖ、または
    （ｃ）前記ＦＺＤ受容体の内在性リガンド
    を含み、
    前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、
    （ｄ）前記Ｗｎｔ共受容体を結合するダイアボディであって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドを含み、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬが他方のペプチドのＶＬおよびＶＨと対合しそれによって前記ダイアボディを形成する、ダイアボディ、または
    （ｅ）前記共受容体を結合するＶＬ領域とＶＨ領域とを含むｓｃＦｖ、または
    （ｆ）前記共受容体の内在性リガンド、もしくは前記共受容体に結合するそのようなリガンドの断片
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＦＺＤ結合ドメインが、前記ＦＺＤ受容体のＷｎｔリガンド結合部位に結合するか、または前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインが、前記Ｗｎｔ共受容体のＷｎｔリガンド結合部位に結合する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、Ｗｎｔ３結合部位および／またはＷｎｔ１結合部位に結合する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＶＨおよびＶＬは、表１に挙げられた多価結合分子に由来する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ＦＺＤ結合ドメインは、１つまたは複数のＦＺＤ受容体を結合する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＦＺＤ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７、またはＦＺＤ８であり、前記Ｗｎｔ共受容体は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＰＴＫ７、ＧＰＲ１２４、またはＴＳＰＡＮ１２である、上述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
  9. （ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有する、Ｆｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片、
    （ｂ）少なくとも２つの結合部位を有し、少なくとも１つの結合部位が前記ＦＺＤ受容体に結合する、ＦＺＤ結合ドメイン、および
    （ｃ）少なくとも２つの結合部位を有し、少なくとも１つの結合部位が前記Ｗｎｔ共受容体に結合する、Ｗｎｔ共受容体ドメイン
    を含み、
    前記ＦＺＤ結合ドメインは、前記Ｆｃドメインの一方の末端に付加されており、前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、前記Ｆｃドメインの他方の末端に付加されている、多価結合分子。
  10. 前記ＦＺＤ結合ドメインは、
    （ａ）前記ＦＺＤ受容体を結合するダイアボディであって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドを含み、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬが他方のペプチドのＶＬおよびＶＨと対合しそれによって前記ダイアボディを形成する、ダイアボディ、または
    （ｂ）前記ＦＺＤ受容体を結合するＶＬ領域とＶＨ領域とを含むｓｃＦｖ、または
    （ｃ）前記ＦＺＤ受容体の内在性リガンド
    を含み、
    前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインは、
    （ｄ）前記Ｗｎｔ共受容体を結合するダイアボディであって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を各ペプチドが含む２つのペプチドを含み、一方のペプチド由来のＶＨおよびＶＬが他方のペプチドのＶＬおよびＶＨと対合しそれによって前記ダイアボディを形成する、ダイアボディ、または
    （ｅ）前記共受容体を結合するＶＬ領域とＶＨ領域とを含むｓｃＦｖ、または
    （ｆ）前記Ｗｎｔ共受容体の内在性リガンド、もしくは前記Ｗｎｔ共受容体に結合するそのようなリガンドの断片
    を含む、請求項９に記載の多価結合分子。
  11. 前記結合ドメインのうち少なくとも１つが二重特異性である、請求項９に記載の多価結合分子。
  12. 前記ＶＨおよびＶＬは、前記ＦＺＤ受容体を結合する抗体に由来し、任意選択的に前記ＦＺＤ受容体へのＷｎｔリガンドの結合を阻害するか、または前記ＶＨおよびＶＬは、前記Ｗｎｔ共受容体に結合する抗体に由来し、任意選択的に前記共受容体へのＷｎｔリガンドの結合を阻害する、請求項１０に記載の多価結合分子。
  13. 前記ＶＨおよびＶＬは、表１に挙げられた多価結合分子に由来する、請求項１０に記載の多価結合分子。
  14. （ａ）前記ＦＺＤ結合ドメインが、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、もしくはＦＺＤ１０受容体のうち１つまたは複数を結合するか、または
    （ｂ）前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインが、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＰＴＫ７、ＧＰＲ１２４、もしくはＴＳＰＡＮ１２のうち１つまたは複数を結合するか、または
    （ｃ）前記ＦＺＤ結合ドメインが、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、もしくはＦＺＤ１０受容体のうち１つまたは複数を結合し、かつ前記Ｗｎｔ共受容体結合ドメインが、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＰＴＫ７、ＧＰＲ１２４、もしくはＴＳＰＡＮ１２のうち１つまたは複数を結合する、
    請求項９から１３のいずれか１項に記載の多価結合分子。
  15. 請求項９から１４のいずれか１項に記載の多価結合分子と医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  16. それを必要とする対象において組織の再生を亢進させるか、またはＷｎｔシグナル伝達の低減に関連する状態を有する対象を治療する方法であって、組織の再生を亢進するか、または前記状態に関連する症状を軽減するのに充分な量で、請求項９から１４のいずれか１項に記載の多価結合分子を前記対象に投与することを含む方法。
  17. 細胞上でＦＺＤ受容体とＷｎｔ共受容体との相互作用を推進しそれによって細胞でＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する方法であって、
    ａ）Ｃ末端とＮ末端とを有する、Ｆｃドメイン、またはそのＣＨ３ドメインを含む断片を選択すること、
    ｂ）前記Ｆｃドメインの一方の末端に二価のＦＺＤ受容体結合ドメインを連結し、前記Ｆｃドメインの他方の末端に二価のＷｎｔ共受容体結合ドメインを連結し、それによって四価結合分子を形成すること；
    ｃ）前記四価結合分子が前記ＦＺＤ受容体および前記Ｗｎｔ共受容体に結合しそれによって前記Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する条件下で、前記ＦＺＤ受容体およびＷｎｔ共受容体を発現する前記細胞に前記四価結合分子を接触させること
    を含む方法。
  18. 前記二価のＦＺＤ受容体結合ドメインは、ＦＺＤ受容体を結合するダイアボディを含み、前記二価のＷｎｔ受容体結合ドメインは、Ｗｎｔ共受容体を結合するダイアボディを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. Ｗｎｔ共受容体を結合する前記ダイアボディは、前記Ｗｎｔ共受容体上のＷｎｔ１結合部位またはＷｎｔ３ａ結合部位のうちの一方または両方を結合する、請求項１８に記載の方法。

JP2020543927A 2018-02-14 2019-02-14 Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する多価結合分子およびその使用 Active JP7550647B2 (ja)

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