JP5997245B2 - 6313/G2(抗アンギオテンシンII1型受容体)モノクローナル抗体可変領域の合成scFvアナログ - Google Patents
6313/G2(抗アンギオテンシンII1型受容体)モノクローナル抗体可変領域の合成scFvアナログ Download PDFInfo
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Description
EDGIKRIQDD
または、代わりに以下のように表される:
(R6313クローン12Dならびにヒト化変異体HuCYおよびvar3)
または
(R6313クローン11B)
または
(ヒト化変異体var4)
[請求項1001]
EDGIKRIQDDのアミノ酸配列を有するペプチドへ特異的に結合し、かつ、免疫グロブリンVHドメインへ連結された免疫グロブリンVLドメインを有するポリペプチドを含む特異的結合分子であって、VLドメインが、相補性決定領域(CDR)VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3を含み、VHドメインが、相補性決定領域(CDR)VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3を含み、各々が、以下の通りのそれぞれのアミノ酸配列、
またはそれに少なくとも70%同一のアミノ酸配列を有する、
前記特異的結合分子。
[請求項1002]
CDRが、以下の通りのアミノ酸配列を有する、請求項1001記載の特異的結合分子。
[請求項1003]
CDRが、以下の通りのアミノ酸配列を有する、請求項1001または請求項1002記載の特異的結合分子。
[請求項1004]
図14に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項1001〜1003のいずれか一項記載の特異的結合分子。
[請求項1005]
請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子を含む、薬学的組成物。
[請求項1006]
薬剤における使用のための請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子。
[請求項1007]
癌の治療における使用のための請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子。
[請求項1008]
請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子を被験体へ投与する工程を含む、被験体における癌の治療のための方法。
[請求項1009]
癌の治療における使用のための医薬の製造における請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子の使用。
[請求項1010]
被験体における癌の治療のための個別、同時または逐次投与のための、請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子およびアンギオテンシンIIの組み合わせ調製物。
[請求項1011]
請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子およびアンギオテンシンIIを含む、組成物。
[請求項1012]
請求項1001〜1004のいずれか一項記載の特異的結合分子およびアンギオテンシンIIを含む、薬学的組成物。
6313/G2マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマを、以前記載された通りに増殖させた(Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993))。mRNA由来のcDNAのプールを使用し、PCRによって重鎖および軽鎖を得た。(Gly4Ser)3をコードするリンカーフラグメントを使用し、挿入物のscFvライブラリーをアセンブリし、ファージディスプレイライブラリーを、これらの挿入物をpCANTAB 5Eファージミドベクター(Amersham Pharmacia, High Wycombe, UK)中へ一方向性にクローニングすることによって作製した。発現される配列GAPVPYPDPLEPRについてのE-タグを、このベクターに含め、続いてのパンニングおよび精製工程において使用した。次いで、前記ファージミドライブラリーを使用し、TG1大腸菌を形質転換し、ファージミドレスキューを、M13KO7ヘルパーファージを使用して行い、続いて数ラウンドのパンニングを行った。オリジナルの抗原性ペプチド(EDGIKRIQDD)がコーティングされた96ウェルプレートと、HRP結合二次抗体を使用して検出される抗E-タグ抗体(Amersham Pharmacia)とを使用して、ELISAによって、陽性発現クローンを同定した。発現および精製、ならびに抗原ELISAにおいて最も高いシグナルを与えることに基づいての機能評価のために、1つの特定のクローンを進めた。
scFv R6313/G2の活性を、以下のアッセイにおいて研究した。
MCF-7、T47DおよびMDA-MB-231乳癌細胞を、The American Tissue Culture Collection(LGC Promochem, Teddington, UK)から得た。ラット大動脈平滑筋細胞(RASMC)を、初代培養物から生じさせた(Barker et al., 1996)。MCF-7細胞を最小必須培地(MEM)に維持し、T47DおよびMDA-MB-231細胞をRPMI 1640培地に維持し、RASMCをダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に維持した。全ての培地に、2mM L-グルタミン、10%ウシ胎仔血清(FBS)、50U/mlペニシリンおよび0.05mg/mlストレプトマイシンを補った。細胞を、加湿雰囲気(95%酸素、5%CO2)中において37℃で維持した。
コンフルエントな細胞単層を、トリプシン/EDTAを使用して組織培養フラスコから除去した。細胞(1ウェル当たり15x103)を、各細胞株について好適な培地を含有する96ウェル組織培養プレート中へ播種した。24時間後、細胞を、アンギオテンシンII(100nM)および0.005〜25μMの濃度範囲でのR6313/G2によって、または同様の濃度範囲でのロサルタンによって処理し、さらに48時間インキュベートした。2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド分子内塩(XTT)を着色ホルマザン生成物へ還元する代謝的に活性な細胞の能力によって、細胞生存度を評価した。450nmの波長および630nmの参照波長でMultiskan Ascentマイクロプレートリーダー(Thermo Labsystem, Helsinki, Finland)を使用して、吸光度を測定した。各測定を3連で行った。GraphPad Prism v4.0ソフトウェア(GraphPad Software Inc, San Diego CA, USA)を使用する非線形回帰式を使用して、IC50を計算した。
細胞をアンギオテンシンII(100nmol/L)の存在または非存在下において24時間増殖させ、次いで、無菌PBS(pH 7.4)中において3回洗浄し、溶解緩衝液(PBS pH 7.4、1%NP-40/Triton X-100、0.1%SDSおよび0.5%デオキシコール酸ナトリウム、ならびにプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチン10μg/ml、アプロチニン30μg/mlおよび0.1mmol/Lフェニルメチルスルホニルフルオリド)中において5分間インキュベートし、採取した。細胞溶解物を、ウルトラソニケーター(2x5秒サイクル;Bandelin Sonoplus, SLS, Hessle UK)を使用してホモジナイズした。ホモジナイゼーション後、サンプルを20,000 gで10分間4℃にて遠心分離した。上澄みを除去し、-80℃で保存した。タンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead UK)を使用して評価した。ウエスタンブロッティングのために、50μgの全細胞溶解物を含有するサンプルを、10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上へロードし、電気泳動へ供した。タンパク質を、120mAで1.5時間4℃にてtransBlotトランスファー装置(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead UK)を使用して、トランスファー緩衝液(39mmol/Lグリシン、48mmol/L Tris塩基、20%メタノール、および0.037%SDS)中のHybond-C膜(Amersham Biosciences Ltd, Chalfont St Giles UK)へ移した。膜を洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液(1X Tris緩衝生理食塩水(TBS)、0.1%Tween 20および5%粉ミルク)中において室温で1時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液(1X TBSおよび0.1%Tween 20)中において10分間3回洗浄した。膜を、ブロッキング緩衝液中において1:500の希釈で、ポリクローナルウサギ抗AT1受容体抗体または抗AT2受容体抗体と共にインキュベートした。4℃で一晩インキュベーションした後、膜を上述したように洗浄し、抗ウサギIgG二次抗体(Amersham Biosciences)(1:2000)と共に室温で1時間インキュベートした。追加の洗浄を行い、ECLウエスタンブロッティング検出試薬(Amersham Biosciences)中において膜を1分間インキュベートすることによって免疫検出を行い、Biomax化学発光検出フィルム(Kodak, Rochester NY, USA)へ露出させた。
アポトーシスの間のカスパーゼの活性化を、製造業者の指示に従って、Apo-ONEホモジニアスカスパーゼ-3/7アッセイ(Promega Corp, Southampton UK)を使用して測定した。簡潔に記載すると、細胞を90%コンフルエンスまで増殖させ、無菌PBSで3回洗浄した。細胞を、トリプシン/EDTAを使用して採取し、カウントした。細胞(1ウェル当たり104)を、96ウェルプレートへ播種し、0.1〜3μMの濃度でのR6313/G2と共に、100nmol/LアンギオテンシンIIの存在または非存在において、総体積150μlで、24および48時間インキュベートした。インキュベーション後、カスパーゼ-3/7 Z-DEVD-R110基質(100μl)を各ウェルへ添加した。ブランクウェルは試薬のみを含有し、対照は、抗体および/またはアンギオテンシンIIを省いた。485nmの励起波長および535nmの発光波長を用い、Fluostar Optima分光蛍光計(BMG Laboratories, Offenburg Germany)を使用して、8時間にわたって2時間ごとに、蛍光を測定した。
中空繊維手順は、Hollingsheadの方法(Hollingshead et al Life Sci 57 131-41(1995))に従った。
ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)中空繊維(500 kDaカットオフ、1mm内径;Spectrum Europe B.V., Breda, Netherlands)を、平滑21ゲージ針および10ml注射器を使用して70%エタノールで洗い流した。次いで、繊維を70%エタノール中に72時間浸漬し、再び70%エタノール、次いで蒸留水で洗い流し、次いで、131℃でオートクレーブ処理した。最後に、細胞懸濁液をロードする前に、繊維をRPMI 1640培養培地で洗い流した。細胞(MCF-7、T47D、およびMDA-MB-231)を、2.5〜3.0 x106細胞/mlの密度で繊維中へ導入した。次いで、繊維を2cm間隔でヒートシールし、細胞に好適な培地3 mlを含有するペトリ皿中に置いた。
細胞がロードされた中空繊維セグメントを、純系5〜6週齢雌性balb/c nu/nuマウスへの移植前に、37℃で培養培地中において一晩インキュベートした。繊維を麻酔(2%イソフルオラン(Isofluorane))下において前記動物へ移植した。細胞株MCF-7、T47D、またはMDA-MB-231の1つを各々が含有する、3個の2cm繊維を、各動物の皮下(s.c.)および腹腔内(i.p.)部位の両方に移植した。i.p.移植片のために、腹壁の皮膚および筋肉組織を通って小切開を作製した。繊維を、腹膜腔中へ配置し、両方の切開を金属性縫合クリップ(Harvard Instruments, Edenbridge UK)で閉じた。s.c.移植片について、小切開を背部に作製した。繊維を頭蓋方向の背側正中線の左側に移植した。小切開を金属性縫合クリップで閉じた。
中空繊維移植片を有するマウス(n=5/群)を、1日当たり2回、6日間、R6313/G2(0.1ml PBS中、0.07mg/kg(2.5nmol/kg)、および0.7mg/kg(25nmol/kg)、皮下的に)で処置した。対照動物(n=5)にビヒクルのみを受容させた。最後の注射の24時間後に、動物を頸椎脱臼によって殺し、繊維を回収し、30分間20%FBSを含有する予熱されたRPMI 1640培地へ移した。
細胞生存度を、改変MTTアッセイを使用して測定した。繊維を、1mg/ml MTTを含有する20%FBSを有するRPMI 1640中においてインキュベートし、4時間、95%O2、5%CO2下で37℃にてインキュベートした。試薬を吸引し、2mlの滅菌濾過された2.5%硫酸プロタミン(水100ml中0.9g NaCl、2.5g硫酸プロタミン)を添加した。試料を暗所において最低24時間4℃で保存し、ホルマザン生成物を固定した。新たな硫酸プロタミン(2.5%)を添加し、繊維を4℃でさらに2〜4時間保存した。各繊維を24ウェルプレート中のウェルへ移し、半分に切断し、光から保護した状態で、一晩空気乾燥した。ジメチルスルホキシド(DMSO)(300μl)を各ウェルへ添加し、ホルマザン生成物を抽出した。各ウェルからのアリコート(190μl)を96ウェルプレートへ移し、Multiskan Ascent測光マイクロプレートリーダー(Thermo labsystem)を使用して540nmで吸光度を読み取った。扱った値を対照のパーセンテージとして計算した。
7.5x106個のMCF-7細胞を含有する無菌PBS 150μlを、マウスの右側腹部にs.c.注射した。腫瘍細胞をホルモンサポート無しで4週間増殖させ、その後、マウスに、さらに8週間、ゴマ油中の17β-吉草酸エストラジオール(0.1 mg/Kg体重)のs.c.注射を毎週受容させた(Kasukabe et al, Breast Cancer Res. 7(6) R1097-110 (2005))。動物を全体的な健康について毎日モニタリングし、体重を週2回測定した。腫瘍サイズをスライドカリパスで週3回測定し、体積を(L X W2)/2として計算し、式中、LおよびWは、それぞれ、大きいほうの直径および小さいほうの直径である。いったん腫瘍体積が150〜200 mm3に達したら、マウスを、1群当たり8〜10匹の処置群および対照群へ無作為化した。7日間1日当たり2回、0.4mg/kg(13nmol/kg)、0.8mg/kg(27nmol/Kg)、および1.36mg/kg(45.3nmol/kg)体重の用量で、無菌PBS(0.1ml)中のR6313/G2の皮下注射によって、マウスを処置した。対照マウスに無菌PBSを受容させた。研究の終了時に、動物を頸椎脱臼によって犠牲にした。相対的な体重(%)を(Wt/Wi)×100として計算し、式中、Wtは任意の所定時間での体重であり、Wiは処置開始時での体重である。正味の腫瘍体積をVt-Viとして計算し、式中、Vtは任意の所定時間での腫瘍体積であり、Viは処置開始時での腫瘍体積であり、Viのパーセンテージとして表される。
ラットを、血圧アッセイにおけるそれらのより高い扱いやすさを考慮して、研究のこのパートについて選択した。雌性Wistarラットを、まず、実験前に4〜5日間、取り扱いおよび血圧機器に順化させた。意識のある動物中の血圧を、Kent Scientific Corporation (Torrington CT, USA) Coda 6+テイルカットオフシステムを使用して測定し、ここで、動物を、血圧を評価する間、加温されたレストレーナーに保持した。まず、動物を安定させ、それらの基礎血圧を処置前に計測した。次いで、それらを、R6313/G2、無菌PBS(0.1ml)中0.4mg/kgのsc注射のためにレストレーナーから一時的に移した。対照にはPBSのみを受容させた。次いで、血圧を、1時間にわたって間隔を置いて計測し、その後、ケージへ戻した。手順を、3日間、毎日繰り返した。
全てのデータを平均値±SEとして示した。統計分析を、ワンウェイANOVAを使用して行った。ANOVAにおいて有意な結果の場合、スチューデントt-検定を用量応答曲線について使用した。0.05未満のP値を統計的に有意と考えた。
使用した方法は、QCM(商標)細胞浸潤アッセイ(Chemiconカタログ番号ECM555)である。これは、Engelbreth-Holm-Swam(EHS)マウス腫瘍(Repesh LA (1989) Invasion Metastasis 9: 192-208)由来の再構成された基底膜基質タンパク質(ECM)を通り抜けた細胞の蛍光測定検出を使用する。
ヒト化変異体は、上述のマウス配列12Dに基づいた。以前に公表されたアプローチとある程度の知的な自由裁量との組み合わせを使用することによって、アミノ酸置換を選択した。最初に、マウスscFv配列を使用し、BLAST検索を使用してNCBIデータベース中において最も相同な可変重鎖および可変軽鎖を見つけ出した。次に、Padlan(Molecular Immunology 28(4/5) 489-498 (1991))によって記載されたアプローチを使用し、どのアミノ酸残基が、全体のscFv分子中において露出された(即ち、親水性)または埋められた(疎水性)残基である可能性が高いかを示した。Padlanによる論文への参照はまた、どのヒト生殖系アミノ酸が、マウス残基の代わりに適切に用い、このようにして、リサーフェイスされたscFvを作製するために使用され得るかについての選択肢を提供し、ここで、一般的に、これらの露出されたマウス残基の置換は、より免疫原性の低い全体のscFvタンパク質を生じさせる。
ヒト化(humaised)変異体の活性を、以下のアッセイにおいて研究した:
全ての遺伝子配列は、Blue Heron Biotechnology(Bothell, WA, USA)によって合成され、T7lacプロモーターの制御下でHisタグコーディング配列から上流に、細菌タンパク質発現ベクター中へ組込まれた。使用したベクターは、細菌宿主中のペリプラズム空間に達した後にシグナルペプチダーゼによって切断されるペリプラズムターゲッティングリーダー配列を含んだ。当業者は、他の好適なベクターもまた本発明のscFvを製造するために使用され得ることを理解する。
酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)を、ペプチド抗原EDGIKRIQDDC-ビオチン(炭酸緩衝液pH 9.6中2〜8ug/ml)でコーティングされたMaxisorp 96-ウェルプレート中において、4または37℃で一晩行った。コーティングされたウェルを、RTで1時間、1%アルカリ性可溶性カゼイン(ブロッキング緩衝液)を使用してブロッキングし、次いで、0.1% v/v Tween 20を含有するPBSで3回洗浄した。PBS-T中に1:1〜1:100で希釈したscFvサンプルを添加し、前述のように、洗浄前にRTで1時間インキュベートした。次いで、HRP結合抗His-Tag二次抗体を、RTで1時間添加した(ブロッキング緩衝液中において1:1000で希釈)。次いで、ウェルを、PBS-T中において3回、次いでPBS(Tween 20無し)で2回洗浄した。100μlのTMB基質溶液を添加し、色を30分間発色させ、この時点で、100μlの2M 硫酸を添加し、反応を停止させた。450 nmでの吸光度を、プレート読み取り分光光度計において読み取った。280 nmでEppendorf Biophotometerリーディングを使用し、上記のように1.7のscFvについての吸光係数を使用して、タンパク質濃度を測定した。結果を図12に示す。
Attana 100水晶振動子マイクロバランスを使用して、固定されたペプチド抗原へのscFv変異体およびIgMの結合の特徴を比較するデータを得た。これは、ストレプトアビジン(0.1mg/ml)がコーティングされたビオチン「チップ」(Attana 100バイオセンサー中の金メッキされた水晶振動子(水晶振動子マイクロバランス(QCM))(Attana AB, Stockholm, Sweden)の使用を含んだ。C末端でビオチン化された、オリジナルのマウスハイブリドーマを惹起するために使用されたその配列に対応するペプチド抗原を、次いで、4μg/mlの濃度でチップにわたってランし、scFvおよびIgMについての結合標的を作製し、続いてこれらをQCMチップの表面上にわたってランした。Attesterソフトウェア(Attana, Sweden)を使用して、抗原へのテスト抗体の結合に応答してのQCMチップの共鳴振動数の変化をモニタリングした。Hz/秒での100秒のサンプル注入の期間にわたるHzでの偏差の大きさを、9μg/mlの濃度での各抗体について測定した。抗体が次いでQCMチップから放出された速度もまた、抗体がチップから徐々に離れるにつれて、およびチップの共鳴振動数が低下するにつれて、バイオセンサートレースの直線部分からHz/秒で決定した。ランニング緩衝液は、0.005%Tween 20(PBST)を含有するPBSであり、これをまた、抗体希釈物を作製するために使用し、各場合において9μg/mlの最終タンパク質濃度が得られた。Attana 100を、50μl注入ループで設定し、20μl/分の一定のポンプ速度でランニングしていた。サンプルおよび対照PBST緩衝液を100秒間にわたって注入し、これは、33μlのチップにわたるサンプル体積を与えた。100mM(6.6μl体積)リン酸溶液を使用し、個々の実験サンプルランの間にストレプトアビジン(strepavidin)−抗原表面を再生させた。
Claims (9)
- EDGIKRIQDDのアミノ酸配列を有するペプチドへ特異的に結合し、かつ、1〜20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーによって免疫グロブリンVHドメインへ連結された免疫グロブリンVLドメインを有するポリペプチドを含む特異的結合分子であって、
SEQ ID NO: 15のアミノ酸9-246, SEQ ID NO: 16のアミノ酸9-246, SEQ IDNO: 27, SEQ ID NO: 28 及び SEQ ID NO: 29からなる群から選択されるアミノ酸配列、または、前記配列と少なくとも90%の配列同一性であるアミノ酸配列、を有するポリペプチドを含み、かつ、
VLドメインが、相補性決定領域(CDR)VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3を含み、VHドメインが、相補性決定領域(CDR)VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3を含み、各々が、以下の通りのそれぞれのアミノ酸配列を有する、
前記特異的結合分子。
VHCDR1 がGYSFTGYNMN または GYSFTGYNMS
VHCDR2 がNIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3 がEVDY
VLCDR1 がRASKSVSTSGYSYMH
VLCDR2 がLVSNLES または LVSDLED
VLCDR3 がQHIRELTRSEG - CDRが、以下の通りのアミノ酸配列を有する、請求項1記載の特異的結合分子。
VHCDR1 がGYSFTGYNMN
VHCDR2 がNIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3 がEVDY
VLCDR1 がRASKSVSTSGYSYMH
VLCDR2 がLVSNLES
VLCDR3 がQHIRELTRSEG
または
VHCDR1 がGYSFTGYNMS
VHCDR2 がNIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3 がEVDY
VLCDR1 がRASKSVSTSGYSYMH
VLCDR2 がLVSNLES
VLCDR3 がQHIRELTRSEG
または
VHCDR1 がGYSFTGYNMN
VHCDR2 がNIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3 がEVDY
VLCDR1 がRASKSVSTSGYSYMH
VLCDR2 がLVSDLED
VLCDR3 がQHIRELTRSEG. - 請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子を含む、薬学的組成物。
- 薬剤における使用のための請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子。
- 癌の治療における使用のための請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子。
- 癌の治療における使用のための医薬の製造における請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子の使用。
- 被験体における癌の治療のための個別、同時または逐次投与のための、請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子およびアンギオテンシンIIの組み合わせ調製物。
- 請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子およびアンギオテンシンIIを含む、組成物。
- 請求項1〜2のいずれか一項記載の特異的結合分子およびアンギオテンシンIIを含む、薬学的組成物。
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