TW202128764A - 用於活化整合素之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文揭示活化整合素雜二聚體之醫藥劑及組合物，該等整合素雜二聚體含有特異性結合層連結蛋白之β-1整合素蛋白。此類藥劑及組合物適用於治療與肌肉功能障礙相關之疾病，包括肌肉營養不良。

Description

用於活化整合素之組合物及方法
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年5月22日申請之美國臨時專利申請案第63/029,070號、2020年4月13日申請之美國臨時專利申請案第63/009,020號及2019年11月15日申請之美國臨時專利申請案第62/935,732號之權益，該等申請案中之每一者之揭示內容特此以全文引用之方式併入。以電子方式提交之正文檔案之說明
以文本格式代替紙張複本提供與本申請案相關之序列表，且特此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之正文檔案之名稱為PLIA_001_05TW_SeqList_ST25.txt。2020年11月13日產生之正文檔案係約150,414位元組且經由EFS-Web以電子學方式提交。
本發明大體上係關於用於活化整合素雜二聚體之組合物及方法，該等整合素雜二聚體含有特異性結合層連結蛋白之β-1整合素蛋白。此類組合物及方法適用於治療與肌肉功能障礙相關之疾病，包括肌肉營養不良。
骨骼肌細胞係由將肌膜(肌纖維膜)橋接至間質細胞外基質之基底膜包圍。基底膜在發育期間及在承認中發揮關鍵作用，支持發育、肌肉完整性、突觸生成及肌肉修復。
影響參與細胞外基質-基底膜-骨胳肌細胞相互作用中之蛋白質之功能性或合成的突變與肌肉營養不良相關。當前不存在肌肉營養不良之任何形式之治癒。已報導可根據受影響基因之功能分類的若干類型。此等可分成若干類別，其中最重要的一者源自肌纖維之質膜細胞骨架複合物(層連結蛋白/營養不良聚糖蛋白/肌聚糖/肌縮蛋白複合物)中之突變。此複合物充當將細胞外基質錨定至骨骼肌細胞之細胞骨架蛋白質之層連結蛋白受體。
表示大致一半病例之肌肉營養不良之最常見形式為由肌縮蛋白基因之突變誘發的形式(PNAS 1984; 81: 1189)。肌縮蛋白之截短部分功能形式之存在導致與貝氏肌肉營養不良(Becker muscular dystrophy) (X性聯隱性病症)相關之症狀。在杜氏肌肉營養不良(Duchenne muscular dystrophy；DMD)患者(代表所有肌肉營養不良病例之一半)中觀測到更嚴重的形式，該等患者具有導致肌縮蛋白缺乏或非功能性形式的突變。在3500名新生男性中DMD之發生率為約1。肌縮蛋白中之突變亦被認為排出回應於肌肉損傷而活化之肌肉幹細胞(衛星細胞)池。肌聚糖基因(肌聚糖病)中之突變導致蛋白質複合物之功能障礙，從而經由層連結蛋白α2 (分區蛋白)-營養不良聚糖蛋白-肌縮蛋白促進細胞外基質與肌肉之間的相互作用。此類突變亦產生常染色體隱性肌肉營養不良，其密切模擬杜氏萎縮症(NEJM 1997;336: 618)。儘管稀少，但層連結蛋白α2-鏈(分區蛋白)中之突變在肌細胞失去其細胞外基質錨定物時產生最嚴重的肌病變形式(Nat Genetics 1995; 11: 216)。
另一蛋白質，即整合素α7β1亦橋接層連結蛋白及細胞骨架蛋白且主動促進肌肉生物學，因為其缺乏亦與肌肉營養不良之形式相關(Nat Genetics 1998; 19:94; Nat Genetics 1997; 17: 318)。兩種其他含有β1之雜二聚體(α3β1，α6β1)與層連結蛋白結合，但尚未有與此等基因突變相關之肌肉營養不良之報導。α7β1為在骨骼、心臟及血管平滑肌細胞中表現之初級層連結蛋白受體，且其缺乏導致發育延遲及活動受損。咸信整合素α7β1在與肌縮蛋白相關蛋白質中之突變相關的肌肉營養不良中起補償性作用。實際上，其表現在肌肉營養不良之人類及動物模型中上調(J Cell Sci 1997; 110: 2873)。與肌縮蛋白、肌營養相關蛋白或肌聚糖缺乏組合之整合素α7β1缺乏引起疾病之甚至更嚴重的形式(Hum Mol Gen 2006; 15: 989、J Cell Sci 2006; 119: 2185、J Cell Biol 2001; 152: 1207)且進一步引起心肌功能障礙、纖維化及鈣化(Circ Res 2008; 102: 1109)。
仍需要一種醫藥劑，其可向缺乏層連結蛋白/營養不良聚糖蛋白/肌聚糖/肌縮蛋白複合物或具有層連結蛋白/營養不良聚糖蛋白/肌聚糖/肌縮蛋白複合物之功能障礙的個體提供治療益處。
本發明提供一種醫藥劑，其為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的促效劑，且其與α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的細胞外域結合。在一些實施例中，如技術方案1之醫藥劑，其中該醫藥劑結合以下中之至少一者：α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者之層連結蛋白結合域；α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者之CALF-1域；以及α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者之CALF-2域。在一些實施例中，醫藥劑為α7β1整合素之促效劑且與α7蛋白特異性結合。在一些實施例中，當向個體投與醫藥劑時，醫藥劑並不增加個體之肌細胞中之α7蛋白的量。
在一些實施例中，作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的醫藥劑為抗體。在一些實施例中，抗體為單株抗體。在某些實施例中，抗體為多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。在一些實施例中，本發明之抗體為人類、人類化或嵌合的。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種活化α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的醫藥劑。在一些實施例中，醫藥劑穩定α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的活性構形。在某些實施例中，醫藥劑並不與β1蛋白特異性結合。在一些實施例中，醫藥劑增加肌母細胞對分區蛋白之黏著力。舉例而言，肌母細胞可為健康人類肌母細胞或健康鼠類肌母細胞。替代地，肌母細胞可為人類肌母細胞或鼠類肌母細胞，該人類肌母細胞或鼠類肌母細胞為肌縮蛋白缺乏的、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。在一些實施例中，醫藥劑增加肌管對分區蛋白之黏著力。舉例而言，肌管可為健康人類肌管或健康鼠類肌管。替代地，肌管可為人類肌管或鼠類肌管，該人類肌管或鼠類肌管為肌縮蛋白缺乏的、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
本發明進一步提供作為α7β1整合素(例如，人類α7β1整合素)之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：(i)SEQ ID NO : 10 或SEQ ID NO : 1 之胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO : 10 或SEQ ID NO : 1 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸；或(iii)SEQ ID NO : 24 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
本發明亦提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含SWWP (SEQ ID NO : 25 )。本發明進一步提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之5-10個或10-15個胺基酸。本發明進一步提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基R958、M976、S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之6-10個或10-15個胺基酸。在一些實施例中，抗原決定基係連續的。在一些實施例中，抗原決定基係不連續的。
本發明進一步提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，該單株抗體或抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，該輕鏈可變(VL)區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，(i)其中HCDR3包含SEQ ID NO : 15 ；及/或其中LCDR3包含SEQ ID NO : 7 ；(ii)其中HCDR3包含SEQ ID NO : 66 ；及/或其中LCDR3包含SEQ ID NO : 7 ；或(iii)其中HCDR3包含SEQ ID NO : 68 ；及/或其中LCDR3包含SEQ ID NO : 7 。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含VH區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；及VL區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR2包含SEQ ID NO : 3 ；及/或其中LCDR2包含SEQ ID NO : 6 。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含VH區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；及VL區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，(i)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 5 ；(ii)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 65 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 5 ；(iii)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 69 ；或(iv)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 71 。
本發明涵蓋作為α7β1整合素(例如，人類α7β1整合素)之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
本發明亦涵蓋作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區，其中VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；其中VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或其中VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中：(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；(ii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；(iii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；(iv) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或(v) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
本發明亦涵蓋抗體或其抗體片段，其中VH區胺基酸序列包含(i)SEQ ID NO : 8 ，或與SEQ ID NO : 8 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或(iii)SEQ ID NO : 67 ，或與SEQ ID NO : 67 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
本發明涵蓋抗體或其抗體片段，其中VL區胺基酸序列包含(i)SEQ ID NO : 9 ，或與SEQ ID NO : 9 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO : 70 ，或與SEQ ID NO : 70 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或(iv)SEQ ID NO : 72 ，或與SEQ ID NO : 72 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
本發明亦涵蓋抗體或其抗體片段，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 8 ，或與SEQ ID NO : 8 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 9 ，或與SEQ ID NO : 9 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(ii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(iii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 67 ，或與SEQ ID NO : 67 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(iv) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 70 ，或與SEQ ID NO : 70 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或(v) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 72 ，或與SEQ ID NO : 72 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體包含重鏈及輕鏈，(i)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 19 ；(ii)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 45 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 53 ；(iii)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 62 ；或(iv)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 63 。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段與α7蛋白特異性結合。在一些情況下，抗體或抗體片段與包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之α7蛋白之抗原決定基特異性結合：(i)SEQ ID NO : 10 之胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO : 10 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸；或(iii)SEQ ID NO : 24 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
在一些實施例中，本發明之抗體片段可為FFab、F(ab')2 、Fab'、scFv、單域抗體、雙功能抗體或單鏈駱駝科抗體。
本發明涵蓋編碼本文所揭示之抗體或抗體片段之經分離之核酸分子。本發明亦提供包含本文所揭示之核酸分子之表現載體。在表現載體之一些實施例中，核酸分子以操作方式連接至適用於在宿主細胞中表現核酸區段之調節序列。另外，本發明提供一種重組宿主細胞，其包含本文所揭示之表現載體。本發明涵蓋一種用於產生作為α7β1整合素之促效劑的抗體或其抗體片段之方法，該方法包含：在表現核酸分子之條件下培養包含本文所揭示之表現載體的重組宿主細胞，由此產生作為α7β1整合素之促效劑的抗體或其抗體片段。
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含醫藥劑；作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的抗體或其抗體片段；及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物進一步包含作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的另一醫藥劑。
本發明涵蓋一種治療個體之病症或疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之醫藥劑；作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的抗體或其抗體片段，由此治療該個體之病症或疾病。病症或疾病之特徵可在於以下中之一或多者：個體中α7β1整合素之功能障礙；個體之肌縮蛋白缺乏；個體之肌縮蛋白突變；個體之非功能肌縮蛋白；或除α7β1功能障礙，或肌縮蛋白缺乏、突變或非功能以外的肌肉功能障礙。
在一些實施例中，肌肉功能障礙係由以下中之一或多者引起或與以下中之一或多者相關：癌症、充血性心臟衰竭、慢性阻塞性肺病、慢性腎病、HIV感染/AIDS、神經性厭食症、貪食症、營養不良、暴露、噁心、I型糖尿病、II型糖尿病、代謝症候群、惡病體質(cachexia)、貧血症、心衰竭、高血壓、橫紋肌溶解症(rhabdomyolysis)、敗血症、肌肉減少症(sarcopenia)、身體活動少(physical inactivity)、由於過量身體活動引起之損傷、低體溫症(hypothermia)、體溫過高(hyperthermia)、損傷、去神經(denervation)、肌肉萎縮性側索硬化、多發性硬化、脊髓性肌萎縮、酒精相關之肌病、燒傷相關之肌病、中風、類固醇療法或類固醇療法之停藥、皮肌炎、格-巴二氏症候群(Guillain-Barré syndrome)、神經病變、骨關節炎、感染、脊髓灰質炎、多發性肌炎、炎症、類風濕性關節炎、低膽固醇血症、電損傷、熱中風、長期不活動、肢體缺少血流或接觸毒液。本發明之治療方法可進一步包含鑑別患有肌肉功能障礙之個體的步驟。
在一些實施例中，疾病為肌肉萎縮病。在一些實施例中，肌肉萎縮病為肌肉營養不良。在某些情況下，肌肉營養不良為杜氏肌肉營養不良(DMD)、貝氏肌肉營養不良、1A型分區蛋白缺乏之先天性肌肉營養不良或肢帶型肌肉營養不良。本發明之治療方法可進一步包含鑑別患有肌肉萎縮病之個體的步驟。在一些實施例中，投與治療有效量之醫藥劑；作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的抗體或其抗體片段逆轉、穩定或減緩個體之肌肉萎縮或肌肉功能障礙。在某些情況下，投與改善個體之肌肉功能。在一些實施例中，投與並不惡化個體之肌肉功能。本發明之治療方法可進一步包含在投與步驟之後量測個體之肌肉功能，其中肌肉功能之惡化速率降低。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑有效上調個體中α7β1整合素之活性及/或量，從而有效治療個體之α7β1整合素之功能障礙。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑有效上調個體中α7β1整合素之活性及/或量，個體中α7β1整合素之上調的活性及/或量至少部分地有效緩解以下中之至少一者的影響：個體之肌縮蛋白缺乏；個體之肌縮蛋白突變；或個體之非功能肌縮蛋白。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑有效緩解個體之肌肉損傷。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑有效緩解個體之離心肌肉損傷。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑有效改善個體之隔膜肌功能。
在一些實施例中，本發明之方法進一步包含向個體投與一或多種其他療法，該一或多種其他療法針對肌肉營養不良或肌肉萎縮。在一些實施例中，一或多種其他療法包含以下中之一或多者：抗驚厥劑；免疫抑制劑；抗生素；奎寧；用於控制充血性心臟衰竭之療法；基因替代療法；外顯子跳過療法；無意義抑制療法；使用經工程改造之核酸酶之療法；使用肌肉前驅細胞或幹細胞之細胞療法；肌營養相關蛋白之上調；抗炎性療法；抗纖維化療法；類固醇療法；肌肉抑制素阻斷劑；胰島素生長因子；磷酸二酯酶-5抑制劑；ACE抑制劑；經由遞送血管內皮生長因子(VEGF)誘導血管生成；1型VEGF誘鉺受體(VEGFR-1或Flt-1)之下調；物理療法；職能治療法；外科手術；矯正干預；言語療法；呼吸療法；心房脈動產生器；以及呼吸輔助裝置。
本發明涵蓋一種活化個體之肌細胞中之α7β1整合素的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之醫藥劑；作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的抗體或其抗體片段，由此活化該個體之肌細胞中的α7β1整合素。本發明亦提供一種增強個體之肌細胞中α7β1整合素與其配位體之結合的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之醫藥劑；作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的抗體或其抗體片段，由此增強α7β1整合素與其配位體在該個體之肌細胞中之結合。
本發明提供一種醫藥劑之醫藥劑、作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的抗體或其抗體片段在製造用於治療個體之特徵在於α7β1整合素功能障礙之病症或疾病的藥劑中之用途。
本發明提供活化含有β-1 (β1)蛋白之整合素雜二聚體之醫藥劑，該整合素雜二聚體特異性結合層連結蛋白。含有β1蛋白之整合素雜二聚體之促效劑可向患有與層連結蛋白/營養不良聚糖蛋白/肌聚糖/肌縮蛋白複合物之蛋白中之一者或層連結蛋白-α2 (分區蛋白)蛋白之功能障礙相關之肌肉營養不良的個體提供治療益處。
整合素雜二聚體係由非共價締合之α及β蛋白次單元構成且充當跨膜黏著受體(Hynes, (2002) Cell 110:673-687)。在一些實施例中，本文所描述之醫藥劑為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的促效劑。在某些情況下，醫藥劑為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素之促效劑。在其他實施例中，醫藥劑為α7β1整合素及α6β1整合素之促效劑。在其他實施例中，醫藥劑為α6β1整合素及α3β1整合素之促效劑。在其他實施例中，醫藥劑為α7β1整合素及α3β1整合素之促效劑。在一個實施例中，醫藥劑為α7β1整合素之促效劑。在另一實施例中，醫藥劑為α6β1整合素之促效劑。在又另一實施例中，醫藥劑為α3β1整合素之促效劑。在一些實例中，整合素蛋白為人類整合素蛋白。在一些實施例中，醫藥劑並不與β1蛋白特異性結合。
本發明提供一種醫藥劑，其為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的促效劑，且其與α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的細胞外域結合。在一些實施例中，醫藥劑結合以下中之至少一者：α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者之層連結蛋白結合域；α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者之CALF-1域；以及α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者之CALF-2域。描繪α7β1整合素及其中之各種域(包括CALF域)之細胞外區之圖示提供於圖 31 。
在某些情況下，醫藥劑與α7蛋白(SEQ ID NO : 11 )、α6蛋白(SEQ ID NO : 12 )及α3蛋白(SEQ ID NO : 13 )中之一或多者的層連結蛋白結合域結合。在一些實施例中，醫藥劑與α7蛋白(SEQ ID NO : 11 )、α6蛋白(SEQ ID NO : 12 )及α3蛋白(SEQ ID NO : 13 )之層連結蛋白結合域結合。
在一些實施例中，醫藥劑與α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的CALF-1域結合。人類CALF-1域之例示性序列提供於表 1B 中。在一些實施例中，醫藥劑與包含SEQ ID NO : 73 之CALF-1域結合。
在一些實施例中，醫藥劑與α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的CALF-2域結合。人類CALF-2域之例示性序列提供於表 1C 中。在一些實施例中，醫藥劑與包含SEQ ID NO : 74 之CALF-2域結合。
本發明係關於作為α7β1整合素之促效劑且與α7蛋白特異性結合的醫藥劑。在一個實施例中，本發明提供一種醫藥劑，其為α7β1整合素之促效劑且與α7蛋白特異性結合，其負限制條件為當向個體投與該醫藥劑時，該醫藥劑並不增加個體之肌細胞中之α7蛋白的量。
在一些實施例中，本發明提供一種賦予α7β1整合素雜二聚體之活化狀態的醫藥劑。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥劑為抗體。抗體
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥劑，其為抗體。在一個實施例中，抗體與α7蛋白特異性結合。在另一實施例中，抗體與α6蛋白特異性結合。在另一實施例中，抗體與α3蛋白特異性結合。
如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)分子及免疫球蛋白分子，亦即含有特異性結合(與抗原免疫反應)抗原(例如，α7蛋白、α6蛋白或α3蛋白)之抗原結合位點之分子的免疫活性部分或片段。「特異性結合」或「與‥‥‥免疫反應」意謂抗體與所需抗原之一或多個抗原決定子反應且不與其他多肽反應。在某些實施例中，在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中，當抗體優先識別其目標抗原時，稱該抗體特異性結合抗原。術語「抗體」廣泛地係指通常包含四個多肽鏈、兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈或保留Ig分子之必需目標結合特徵之其任何功能片段、突變體、變異體或衍生物的免疫球蛋白(Ig)分子。此類突變體、變異體或衍生物抗體形式為此項技術中已知的。
在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH區)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL區)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(complementarity determining region；CDR)，穿插有稱為構架區(framework region；FR)之更保守區。各VH區及VL區係由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)以及類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。IgG、IgD及IgE抗體大體上含有兩個相同重鏈及兩個相同輕鏈以及兩個抗原組合域，各自由重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)構成。一般而言，IgA抗體係由兩種單體構成，各單體由兩個重鏈及兩個輕鏈構成(如同IgG、IgD及IgE抗體)；以此方式，IgA分子具有四個抗原結合域，其各又由VH及VL構成。某些IgA抗體為單體，因為其係由兩個重鏈及兩個輕鏈構成。分泌之IgM抗體一般由五種單體構成，各單體由兩個重鏈及兩個輕鏈構成(如同IgG及IgE抗體)；以此方式，IgM分子具有十個抗原結合域，各自又由VH及VL構成。亦存在IgM之細胞表面形式，且此形式具有類似於IgG、IgD及IgE抗體之兩個重鏈/兩個輕鏈結構。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」(或簡言之，「抗體片段」或「抗體部分」)係指抗體之一或多個片段，其保留與抗原(例如，α7蛋白)特異性結合之能力。已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。抗體及抗體片段實施例亦可為雙特異性、三特異性、雙重特異性或多特異性形式；與兩個或多於兩個不同抗原特異性結合。涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內之結合片段之實例包括(i)Fab片段，即由以下組成之單價片段：VL、VH、CL及CH1域；(ii)F(ab')2片段，即包含兩個藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵鍵聯之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單一組之VL及VH域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341:544-546，Winter等人, PCT公開案WO 90/05144 A1，各自以全文引用之方式併入本文中)，其包含單一可變域；以及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。本發明亦涵蓋Fab'片段。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係藉由獨立基因編碼，但其可使用重組方法，藉由使其能夠製成其中VL及VH區對形成單價分子之單一蛋白質鏈的合成連接子接合(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人 (1988) Science 242:423-426；以及Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合片段」內。在本發明之某些實施例中，scFv分子可併入融合蛋白中。在一些實施例中，本發明包括單鏈駱駝科抗體。亦包括單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使用過短以致於不允許同一條鏈上之兩個結構域之間進行配對的連接子，由此迫使域與另一條鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger, P.等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R.J.等人 (1994) Structure 2:1121-1123)。此類抗體結合片段為此項技術中已知的(Kontermann及Dubel編, Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 第790頁)。在一些態樣中，本發明包括單域抗體。一般而言，當在本文中使用時，術語「抗體」涵蓋「抗體片段」。抗體片段一般保留全長抗體之抗原結合特性。
在某些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑且包含一或多個展示於表2或表3中之胺基酸序列的抗體及抗體片段。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
本發明亦涵蓋作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區，其中VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；其中VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或其中VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；(ii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；(iii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；(iv) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或(v) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含HCDR1序列，該HCDR1序列包含在其八個胺基酸殘基處具有胺基酸取代之SEQ ID NO : 14 ；SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 、SEQ ID NO : 66 或SEQ ID NO : 68 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 、SEQ ID NO : 69 或SEQ ID NO : 71 之LCDR1；SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中VH區胺基酸序列包含(i)SEQ ID NO : 8 ，或與SEQ ID NO : 8 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或(iii)SEQ ID NO : 67 ，或與SEQ ID NO : 67 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 、SEQ ID NO : 14 或SEQ ID NO : 65 之HCDR1；SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 、SEQ ID NO : 15 、SEQ ID NO : 66 或SEQ ID NO : 68 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 、SEQ ID NO : 69 或SEQ ID NO : 71 之LCDR1；SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
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在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
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在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
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在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
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在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3。
在一些實施例中，本發明涵蓋作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區，其中VL區胺基酸序列包含(i)SEQ ID NO : 9 ，或與SEQ ID NO : 9 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO : 70 ，或與SEQ ID NO : 70 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或(iv)SEQ ID NO : 72 ，或與SEQ ID NO : 72 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
本發明進一步提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(i) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 8 ，或與SEQ ID NO : 8 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 9 ，或與SEQ ID NO : 9 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(ii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(iii) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 67 ，或與SEQ ID NO : 67 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；(iv) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 70 ，或與SEQ ID NO : 70 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或(v) VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 72 ，或與SEQ ID NO : 72 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體包含重鏈及輕鏈，(i)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 19 ；(ii)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 45 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 53 ；(iii)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 62 ；(iv)其中重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 63 。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體為hIgG4-1、hIgG4-2、hIgG4-3、hIgG4-4、hIgG4-5、hIgG4-6、hIgG4-7、hIgG4-8、hIgG4-9、hIgG4-10、hIgG4-11、hIgG4-12、hIgG4-13、hIgG4-14、hIgG4-15、hIgG4-16、hIgG4-17、hIgG4-18、hIgG4-19、hIgG4-20、hIgG4-21、hIgG4-22、hIgG4-23、hIgG4-24、hIgG4-25、hIgG4-26、hIgG4-27、hIgG4-28、hIgG4-29、hIgG4-30、hIgG4-31、hIgG4-32、hIgG4-33、hIgG4-34、hIgG4-35、hIgG4-36、hIgG4-37、hIgG4-38、hIgG4-39、hIgG4-40、hIgG4-41、hIgG4-42、hIgG4-43、hIgG4-44、hIgG4-45、hIgG4-46、hIgG4-47、hIgG4-48或hIgG4-49。形成此等抗體之重鏈與輕鏈序列之組合提供於表 10 中。
在一些實施例中，與具有SEQ ID NO : 2 - 9 、14 - 19 及31 - 72 中之一或多者的胺基酸序列之多肽相比，抗α7抗體或α7結合抗體片段包含具有一或多個胺基酸取代、缺失或插入之多肽。舉例而言，抗α7抗體或α7結合抗體片段可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸取代、缺失或插入。取代、缺失或插入可藉由標準技術引入，諸如編碼抗α7抗體或α7結合抗體片段之多肽的核酸分子之定點突變誘發或PCR介導之突變誘發。
在一些實施例中，在本文所揭示之抗體或抗體片段之胺基酸序列中的一或多個位置處進行保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之胺基酸取代。在某些實施例中，保守胺基酸取代僅在抗體或抗體片段之FR序列中進行且不在CDR序列中進行。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，抗α7抗體或α7結合抗體片段之多肽中之胺基酸殘基可經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。在一些實施例中，一串胺基酸可經結構上類似但側鏈家族成員之順序及/或組成不同的一串置換。在一些實施例中，取代可用相對更疏水性胺基酸殘基置換原始胺基酸殘基。在一些實施例中，取代可用相對更不疏水性胺基酸殘基置換原始胺基酸殘基。熟習此項技術者能夠藉由利用此項技術中公認的方法(包括(但不限於)：ELISA、西方墨點、噬菌體呈現等)評估與具有SEQ ID NO : 2 - 9 、14 - 19 及31 - 72 中之一或多者之胺基酸序列的多肽相比，包含具有一或多個胺基酸取代、缺失或插入之抗α7抗體或α7結合抗體片段是否結合α7蛋白。
序列之間的序列同源性或一致性(該等術語在本文中可互換地使用)之計算如下進行。
為了測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之百分比一致性，出於最佳比較目的來比對序列(例如可將間隙引入第一及第二胺基酸或核酸序列中之一或兩者中用於最佳比對且出於比較目的可忽略非同源序列)。在一較佳實施例中，出於比較目的比對之參考序列之長度為參考序列之長度的至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、甚至更佳至少60%且甚至更佳至少70%、75%、80%、82%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。隨後比較對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中對應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在彼位置處一致(如本文所用，胺基酸或核酸「一致性」等同於胺基酸或核酸「同源性」)。在考慮為了兩個序列之最佳比對而需要引入之間隙數目及各間隙長度之情況下，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共用的一致位置之數目的函數。
可使用數學演算法進行序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比。在一個實施例中，兩個胺基酸序列之間的百分比一致性係使用Needleman等人((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)演算法來測定，該演算法已併入GCG軟體包(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式中，該程式使用BLOSUM 62矩陣或PAM250矩陣，且間隙權數為16、14、12、10、8、6或4及長度權數為1、2、3、4、5或6。在又另一實施例中，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比係使用GCG軟體包(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式來測定，該程式使用NWSgapdna.CMP矩陣且間隙權數為40、50、60、70或80及長度權數為1、2、3、4、5或6。一組參數(及在醫師不確定應施加何種參數以確定分子是否在本發明之序列一致性或同源性限制內之情況下可使用之參數)為具有間隙罰分為12、間隙擴展罰分為4及讀框轉移間隙罰分為5之BLOSUM 62計分矩陣。
兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比可使用Meyers等人((1989) CABIOS 4:11-17)之演算法來測定，該演算法已併入ALIGN程式(版本2.0)中，使用PAM120權數殘基表、間隙長度罰分為12且空隙處罰為4。
在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體為多株抗體。術語「單株抗體」係指抗體分子群僅含有一個能夠與抗原之特定抗原決定基免疫反應之抗原結合位點的物種。單株抗體組合物因此通常對與其免疫反應之特定蛋白質呈現單一結合親和力。
在一些實施例中，本發明之抗體為人類化、嵌合或人類的。
在一些實施例中，本發明之抗體為人類化抗體及整合素促效劑。如本文所使用之術語「人類化抗體」係指已經工程改造以在可變區連同重鏈及/或輕鏈之非人類(例如小鼠、大鼠或倉鼠)互補決定區(CDR)中包含一或多個人類構架區之抗體。在某些實施例中，人類化抗體包含除CDR區以外的完全人類之序列。相對於非人類化抗體，人類化抗體通常對人類具有較小免疫原性，且因此在某些情境下提供治療益處。熟習此項技術者將瞭解人類化抗體，且亦將瞭解用於其產生之適合的技術。參見例如Hwang, W. Y. K.等人, Methods 36:35, 2005；Queen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989；Jones等人, Nature, 321:522-25, 1986；Riechmann等人, Nature, 332:323-27, 1988；Verhoeyen等人, Science, 239:1534-36, 1988；Orlandi等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989；美國專利第5,225,539號；第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,761號；第5,693,762號；第6,180,370號；以及Selick等人, WO 90/07861，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含：VH區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3；及VL區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3；以及一或多個人類構架區序列。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含：VH區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3；及VL區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3；以及一或多個人類構架區序列。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含：VH區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3；及VL區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3；以及一或多個人類構架區序列。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含：VH區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3；及VL區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3；以及一或多個人類構架區序列。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含：VH區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3；及VL區胺基酸序列，其包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3；以及一或多個人類構架區序列。
在一些實施例中，本發明之抗體為嵌合抗體及整合素促效劑。如本文所使用之術語「嵌合抗體」係指已經工程改造以包含至少一個人類恆定區之抗體。舉例而言，小鼠抗體(例如小鼠單株抗體)之一或多個輕鏈之一個或所有可變區及/或一或多個重鏈之一個或所有可變區可各自接合至人類恆定區，諸如(但不限於) IgG1人類恆定區。相對於非嵌合抗體，嵌合抗體通常對人類具有較小免疫原性，且因此在某些情境下提供治療益處。熟習此項技術者將瞭解嵌合抗體，且亦將瞭解用於其產生之適合的技術。參見例如Cabilly等人, 美國專利第4,816,567號；Shoemaker等人, 美國專利第4,978,775號；Beavers等人, 美國專利第4,975,369號；以及Boss等人, 美國專利第4,816,397號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含VH區，其包含SEQ ID NO : 8 ；VL區，其包含SEQ ID NO : 9 ；以及人類恆定區。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含VH區，其包含SEQ ID NO : 16 ；VL區，其包含SEQ ID NO : 17 ；以及人類恆定區。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含VH區，其包含SEQ ID NO : 67 ；VL區，其包含SEQ ID NO : 17 ；以及人類恆定區。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含VH區，其包含SEQ ID NO : 16 ；VL區，其包含SEQ ID NO : 70 ；以及人類恆定區。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可包含VH區，其包含SEQ ID NO : 16 ；VL區，其包含SEQ ID NO : 72 ；以及人類恆定區。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段可包含免疫球蛋白恆定區。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區為IgG1、IgG2、IgG3、IgG1null、IgG4(S228P)、IgA1或IgA2。抗體分子或其抗原結合部分可包含免疫惰性恆定區。在一些實施例中，單株抗體或其抗體片段可包含免疫球蛋白恆定區，該免疫球蛋白恆定區包含野生型人類IgG1恆定區；包含胺基酸取代L234A、L235A及G237A的人類IgG1恆定區；或包含胺基酸取代L234A、L235A、G237A及P331S的人類IgG1恆定區。在一些實施例中，單株抗體或其抗體片段可包含免疫球蛋白恆定區，該免疫球蛋白恆定區包含野生型人類IgG2恆定區或野生型人類IgG4恆定區。在一些實施例中，單株抗體或其抗體片段可包含免疫球蛋白恆定區，該免疫球蛋白恆定區包含人類IgG4、人類IgG4(S228P)、人類IgG2、人類IgG1、人類IgG1-3M或人類IgG1-4M之Fc區的胺基酸序列。舉例而言，與野生型人類IgG4 Fc區相比，人類IgG4(S228P) Fc區包含以下取代：S228P。舉例而言，與野生型人類IgG1 Fc區相比，人類IgG1-3M Fc區包含以下取代：L234A、L235A及G237A，而與野生型人類IgG1 Fc區，人類IgG1-4M Fc區包含以下取代：L234A、L235A、G237A及P331S。在一些實施例中，免疫球蛋白分子之恆定區中之胺基酸殘基之位置係根據EU命名法編號(Ward等人, 1995Therap . Immunol . 2:77-94)。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段可包含免疫球蛋白輕鏈恆定區，其為κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區。
在一些實施例中，本發明提供作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中抗體或抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或抗體片段所結合之α7蛋白之抗原決定基係連續的。在一些實施例中，抗體或抗體片段所結合之α7蛋白之抗原決定基係不連續的。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與α7蛋白之細胞外域特異性結合。由於轉錄後修飾，α7蛋白可具有兩個不同的細胞外序列(命名為「X1」及「X2」)。在X1與X2序列之間變化的區域位於靠近推定配位體結合位點之α7蛋白之III與IV同源重複域之間。在某些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與靠近推定配位體結合位點之III與IV同源重複域之間的α7蛋白之區域特異性結合。X1序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：TARVELCAQGSADLAHLDDGPYEAGGEKEQDPRLIPVPANSYFG (SEQ ID NO : 1 )。X2序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：LLFVTNIDSSDPDQLVYKTLDPADRLPGPAGDLALNSYLG (SEQ ID NO : 10 )。X2序列較佳在成人骨骼細胞中表現。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的α7蛋白之抗原決定基特異性結合：SEQ ID NO : 10 。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的α7蛋白之抗原決定基特異性結合：SEQ ID NO : 10 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的α7蛋白之抗原決定基特異性結合：SEQ ID NO : 1 。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的α7蛋白之抗原決定基特異性結合：SEQ ID NO : 1 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40或40-44個胺基酸。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的α7蛋白之抗原決定基特異性結合：SEQ ID NO : 24 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
在一些實施例中，抗體與α7蛋白(例如人類α7蛋白)之CALF-2域結合。
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含SWWP (SEQ ID NO : 25 )。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含SWWP (SEQ ID NO : 25 )，且其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之5-10個或10-15個胺基酸。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合，其中抗原決定基包含S以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之5-10個或10-15個胺基酸。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基R958、M976、S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基R958、M976、S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合，其中抗原決定基包含、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之6-10或10-15個胺基酸。以下
在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含重鏈可變(VH)區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；及輕鏈可變(VL)區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，(i)其中HCDR3包含SEQ ID NO : 15 ；及/或其中LCDR3包含SEQ ID NO : 7 ；(ii)其中HCDR3包含SEQ ID NO : 66 ；及/或其中LCDR3包含SEQ ID NO : 7 ；或(iii)其中HCDR3包含SEQ ID NO : 68 ；及/或其中LCDR3包含SEQ ID NO : 7 。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含VH區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；及VL區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR2包含SEQ ID NO : 3 ；及/或其中LCDR2包含SEQ ID NO : 6 。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含VH區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；及VL區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，(i)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 5 ；(ii)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 65 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 5 ；(iii)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 69 ；或(iv)其中HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中LCDR1包含SEQ ID NO : 71 。在一些實施例中，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與本文所揭示之抗原決定基特異性結合且包含VH區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；以及VL區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中CDR包含以下胺基酸序列中之一或多者：HCDR1：SEQ ID NO : 14 或SEQ ID NO : 65 ，HCDR2：SEQ ID NO : 3 ，HCDR3：SEQ ID NO : 15 、SEQ ID NO : 66 或SEQ ID NO : 68 ，LCDR1：SEQ ID NO : 5 、SEQ ID NO : 69 或SEQ ID NO : 71 ，LCDR2：SEQ ID NO : 6 及LCDR3：SEQ ID NO : 7 。
在一些實施例中，抗體或抗體片段與α7蛋白、α6蛋白及/或α3蛋白之層連結蛋白結合域(或層連結蛋白結合域內之抗原決定基)特異性結合。在一些情況下，作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：α7蛋白、α6蛋白及/或α3蛋白之層連結蛋白結合域之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
如本文所用，術語「抗原決定基」包括能夠與免疫球蛋白或免疫球蛋白片段特異性結合之任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且通常具有特定的三維結構特徵，以及荷質比特徵。術語「抗原決定基」亦指常規地藉由免疫球蛋白重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區對結合之結構的單元。抗原決定基可界定抗體之最小結合位點，且因此表示抗體之特異性的目標。
如本文所用，術語「免疫結合」及「免疫結合特性」係指在免疫球蛋白分子(例如抗體)與對免疫球蛋白具有特異性之抗原之間發生的類型之非共價相互作用。免疫結合相互作用之強度或親和力可以相互作用之解離常數(Kd )表示，其中較小的Kd 表示較大的親和力。所選多肽之免疫結合特性可使用此項技術中熟知的方法定量。一種此類方法需要量測抗原結合位點/抗原複合物形成及解離之速率，其中彼等速率視複合搭配物之濃度、相互作用之親和力及同等影響兩個方向上之速率的幾何參數而定。因此，「締合速率常數」(「Kon 」)及「解離速率常數」(「Koff 」)可藉由計算濃度以及締合及解離之實際速率來確定。(參見Nature 361:186-87 (1993))。Koff /Kon 之比率能夠抵消與親和力無關的所有參數，且等於解離常數Kd 。(通常參見Davies等人 (1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。當如藉由諸如熟習此項技術者已知之放射性配位體結合分析或類似分析之分析所量測，平衡結合常數(Kd )係≤10 μM，較佳≤10 nM、更佳≤10 nM且最佳≤100 pM至約1 pM時，本發明之抗體稱為與PD-L1抗原決定基特異性結合。
在某些態樣中，本發明之抗體為單價或二價的且包含單鏈或雙鏈。在功能上，抗體之結合親和力可在10- 5 M至10- 12 M之範圍內。舉例而言，抗體之結合親和力為10- 6 M至10- 12 M、10- 7 M至10- 12 M、10- 8 M至10- 12 M、10- 9 M至10- 12 M、10- 5 M至10- 11 M、10- 6 M至10- 11 M、10- 7 M至10- 11 M、10- 8 M至10- 11 M、10- 9 M至10- 11 M、10- 10 M至10- 11 M、10- 5 M至10- 10 M、10- 6 M至10- 10 M、10- 7 M至10- 10 M、10- 8 M至10- 10 M、10- 9 M至10- 10 M、10- 5 M至10- 9 M、10- 6 M至10- 9 M、10- 7 M至10- 9 M、10- 8 M至10- 9 M、10- 5 M至10- 8 M、10- 6 M至10- 8 M、10- 7 M至10- 8 M、10- 5 M至10- 7 M、10- 6 M至10- 7 M或10- 5 M至10- 6 M。醫藥劑之作用
本發明涵蓋活化α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的醫藥劑(例如抗體)。在一些實施例中，醫藥劑刺激整合素複合物與層連結蛋白之結合。在一些實施例中，醫藥劑穩定α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的活性構形。
在某些態樣中，醫藥劑增加肌母細胞對層連結蛋白-α2 (分區蛋白)之黏著力。在一些情況下，肌母細胞為健康人類肌母細胞或健康鼠類肌母細胞。在其他情況下，肌母細胞為人類肌母細胞或鼠類肌母細胞，該人類肌母細胞或鼠類肌母細胞為肌縮蛋白缺乏的、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
在一些實施例中，醫藥劑增加肌管對層連結蛋白-α2 (分區蛋白)之黏著力。在一些情況下，肌管為健康人類肌管或健康鼠類肌管。在其他情況下，肌管為人類肌管或鼠類肌管，該人類肌管或鼠類肌管為肌縮蛋白缺乏的、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
在一些態樣中，藉由醫藥劑活化整合素雜二聚體可具有以下作用中之一或多者：i)提高肌細胞、肌母細胞/肌管與其細胞外環境之間存在的鍵的強度；ii)提高肌細胞之細胞外基質之合成；iii)提高肌細胞之存活率；以及iv)提高提供骨胳肌之再生能力的衛星細胞之募集及遷移。核酸分子、載體、宿主細胞及產生醫藥劑之方法
本發明之一個態樣涵蓋編碼本文所描述之抗體或抗體片段(或抗體或抗體片段之VH區、VL區或VH區及VL區兩者)之核酸分子(例如經分離之核酸分子)。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 8 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 8 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 16 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 67 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 67 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 9 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 9 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 17 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 70 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 70 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 72 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 72 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 8 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 8 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 9 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 9 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 16 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 17 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 67 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 67 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 17 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 17 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 16 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 70 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 70 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 16 之VH區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 16 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 72 之VL區胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 72 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
本文進一步提供編碼本文所揭示之抗體或抗體片段之(i)重鏈、(ii)輕鏈或(iii)重鏈及輕鏈兩者的核酸分子(例如，經分離之核酸分子)。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 18 之重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 18 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，編碼重鏈之經分離之核酸分子包含SEQ ID NO : 20 ，或與SEQ ID NO : 20 之核苷酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 45 之重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 45 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 19 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 19 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，編碼輕鏈之經分離之核酸分子包含SEQ ID NO : 21 ，或與SEQ ID NO : 21 之核苷酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 53 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 53 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 62 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 62 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼包含SEQ ID NO : 63 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 63 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 18 之重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 18 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 19 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 19 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子包含(i)SEQ ID NO : 20 或與SEQ ID NO : 20 之核苷酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO : 21 或與SEQ ID NO : 21 之核苷酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 45 之重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 45 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 53 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 53 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 18 之重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 18 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 62 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 62 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子編碼(i)包含SEQ ID NO : 18 之重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 18 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；以及(ii)包含SEQ ID NO : 63 之輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO : 63 之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
本發明亦涵蓋包含本文所描述之核酸分子的表現載體。在某些載體中，核酸分子以操作方式連接至一或多個適用於在宿主細胞中表現核酸區段之調節序列。在一些情況下，表現載體包含介導複製之序列且包含一或多個可選標記。
本發明進一步提供一種包含本文所揭示之表現載體的重組宿主細胞。可藉由標準技術將表現載體轉染至宿主細胞中。非限制性實例包括電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似方法。
在一些態樣中，本發明涵蓋一種用於產生抗體或抗體片段之方法，該抗體或抗體片段為α7β1整合素之促效劑，該方法包含：在表現核酸區段之條件下培養包含本文所描述之表現載體的重組宿主細胞，由此產生作為α7β1整合素之促效劑的抗體或抗體片段。抗α7抗體及其α7結合片段可藉由熟習此項技術者已知之多種方法中之任一者產生。在某些實施例中，抗α7抗體及α7結合抗體片段可以重組方式產生。舉例而言，編碼SEQ ID NO : 2 - 9 、14 - 19 及31 - 72 中之一或多者或其部分之核酸序列可引入至細菌細胞(例如大腸桿菌、枯草桿菌)或真核細胞(例如酵母，諸如釀酒酵母；或哺乳動物細胞，諸如CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉細胞(HeLa cell)、各種骨髓瘤細胞株或經轉型之B細胞或融合瘤)中或引入至活體外轉譯系統中，且經轉譯至多肽可經分離。在一些實施例中，抗體輕鏈蛋白質及重鏈蛋白質產生於具有前導序列(亦稱為信號序列)之細胞中，在產生成熟抗α7抗體或其α7結合片段後，移除該前導序列。在一些實施例中，前導序列為MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYG (SEQ ID NO : 22 )或METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO : 23 )。
熟習此項技術者將能夠使用諸如(但不限於)：西方墨點法、ELISA分析及其類似方法之標準方法判定包含給定多肽序列之抗體或片段是否與α7蛋白結合，而無需不當實驗。醫藥劑之用途
本發明涵蓋本文所描述之用於向患有病症或疾病之個體提供治療益處之醫藥劑的方法及用途。在一些態樣中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述(例如α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1中的至少一者之促效劑)之醫藥劑(例如抗體或抗體片段)，由此治療個體之病症或疾病。病症或該疾病之特徵可在於個體中α7β1整合素之功能障礙。舉例而言，個體可具有α7β1整合素之突變。個體可能不具有足夠的α7β1整合素。病症或疾病之特徵可在於個體之肌縮蛋白缺乏。病症或疾病之特徵可在於個體之肌縮蛋白突變。病症或疾病之特徵可在於個體之非功能肌縮蛋白。病症或疾病之特徵可在於除個體之α7β1功能障礙或肌縮蛋白缺乏、突變或非功能以外的肌肉功能障礙。
在一些實施例中，個體之肌肉功能障礙係由以下中之一或多者引起或與以下中之一或多者相關：癌症、充血性心臟衰竭、慢性阻塞性肺病、慢性腎病、HIV感染/AIDS、神經性厭食症、貪食症、營養不良、暴露、噁心、I型糖尿病、II型糖尿病、代謝症候群、惡病體質、貧血症、心衰竭、高血壓、橫紋肌溶解症、敗血症、肌肉減少症、身體活動少、由於過量身體活動引起之損傷、低體溫症、體溫過高、損傷、去神經、肌肉萎縮性側索硬化、多發性硬化、脊髓性肌萎縮、酒精相關之肌病、燒傷相關之肌病、中風、類固醇療法或類固醇療法之停藥、皮肌炎、格-巴二氏症候群、神經病變、骨關節炎、感染、脊髓灰質炎、多發性肌炎、炎症、類風濕性關節炎、低膽固醇血症、電損傷、熱中風、長期不活動、肢體缺少血流或接觸毒液。在一些實施例中，本發明之方法進一步包含鑑別患有肌肉功能障礙或處於患有肌肉功能障礙之風險下的個體。
在一些實施例中，可藉由本發明之方法及組合物治療之疾病為肌肉萎縮病。在一些情況下，肌肉萎縮病為營養不良聚糖蛋白缺乏、肌聚糖缺乏或分區蛋白缺乏。在一個實例中，肌肉萎縮病可為肌肉營養不良。肌肉營養不良之非限制性實例包括杜氏肌肉營養不良(DMD)、貝氏肌肉營養不良、1A型分區蛋白缺乏之先天性肌肉營養不良或肢帶型肌肉營養不良。在一些實施例中，本發明之方法進一步包含鑑別患有肌肉萎縮病或處於患有肌肉萎縮病之風險下的個體。
在一些實施例中，可藉由使用動物模型分析本發明之組合物對治療肌肉營養不良病之功效。DMD之動物模型之非限制性實例包括小鼠模型Mdx/C57BL/10 (受影響的蛋白質：肌縮蛋白)、小鼠模型Mdx/D2 (受影響的蛋白質：肌縮蛋白)、小鼠模型mdx-utrn-/- (受影響的蛋白質：肌縮蛋白及肌營養相關蛋白)及大鼠模型Mdx基因剔除大鼠(受影響的蛋白質：肌縮蛋白)。肢帶型肌肉營養不良之動物模型之非限制性實例為無Sgca小鼠(受影響的蛋白質：α肌聚糖)。1A型分區蛋白缺乏之先天性肌肉營養不良(MDC1A)之動物模型之非限制性實例為LAMA2dyw/dyw小鼠(受影響的蛋白質：層連結蛋白α2)。
在一些實施例中，向有需要之個體投與本文所描述之醫藥劑逆轉、穩定或減緩個體之肌肉萎縮或肌肉功能障礙。在其他實施例中，向有需要之個體投與本文所描述之醫藥劑並不惡化個體之肌肉功能。本發明之方法可進一步包含在投與步驟之後量測個體之肌肉功能，其中肌肉功能之惡化速率降低。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑可有效上調個體中α7β1整合素之活性及/或量，從而有效治療個體之α7β1整合素之功能障礙。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑可有效上調個體中α7β1整合素之活性及/或量。個體中α7β1整合素之上調的活性及/或量可至少部分地緩解個體之肌縮蛋白缺乏的影響。個體中α7β1整合素之上調的活性及/或量可至少部分地緩解個體之肌縮蛋白突變的影響。個體中α7β1整合素之上調的活性及/或量可至少部分地緩解個體之非功能肌縮蛋白的影響。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量之醫藥劑可有效緩解個體之肌肉損傷。舉例而言，向個體投與治療有效量之醫藥劑可有效緩解個體之離心肌肉損傷。向個體投與治療有效量之醫藥劑可有效改善個體之隔膜肌功能。
在若干實施例中，方法可包括向個體投與一或多種其他療法。一或多種其他療法可針對肌肉營養不良或肌肉萎縮，例如用於肌肉營養不良之任何習知或實驗療法。一或多種其他療法可包括藥物療法、有或無移植之手術、諸如物理療法之物理干預或醫療裝置。舉例而言，一或多種其他療法可包括抗驚厥劑。一或多種其他療法可包括免疫抑制劑。一或多種其他療法可包括抗生素。一或多種其他療法可包括奎寧。一或多種其他療法可包括用於控制充血性心臟衰竭之療法。一或多種其他療法可包括基因替代療法。一或多種其他療法可包括外顯子跳過療法。一或多種其他療法可包括無意義抑制療法。一或多種其他療法可包括使用經工程改造之核酸酶之療法。一或多種其他療法可包括使用肌肉前驅細胞或幹細胞之細胞療法。一或多種其他療法可包括肌營養相關蛋白之上調。一或多種其他療法可包括抗炎劑。一或多種其他療法可包括抗纖維化。一或多種其他療法可包括類固醇療法。在一些實施例中，類固醇療法包含皮質類固醇或同化類固醇。一或多種其他療法可包括肌肉抑制素阻斷劑。一或多種其他療法可包括胰島素生長因子。一或多種其他療法可包括磷酸二酯酶-5抑制劑；ACE抑制劑。一或多種其他療法可包括經由遞送血管內皮生長因子(VEGF)誘導血管生成。一或多種其他療法可包括1型VEGF誘鉺受體(VEGFR-1或Flt-1)之下調。一或多種其他療法可包括物理療法；職能治療法。一或多種其他療法可包括外科手術。一或多種其他療法可包括矯正干預。一或多種其他療法可包括言語療法。一或多種其他療法可包括呼吸療法。一或多種其他療法可包括心房脈動產生器。一或多種其他療法可包括呼吸輔助裝置。
在各種實施例中，方法可進一步包括向個體投與一或多種其他療法。一或多種其他療法可針對緩解肌肉營養不良。一或多種其他療法可針對緩解肌肉萎縮。
在一些實施例中，一或多種其他療法可包括以下中之一或多者，例如：抗驚厥劑；免疫抑制劑，例如強體松(prednisone)及地夫可特(deflazacort)；抗生素；以及奎寧。
在若干實施例中，一或多種其他療法可包括用於控制充血性心臟衰竭之療法，例如擴張型心肌症，例如使用抗充血性藥劑及/或心肌移植。可用於充血性心臟衰竭之療法之實例包括例如：血管收縮素轉化酶(angiotensin-converting enzyme：ACE)抑制劑(ACE-I)；血管收縮素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker；ARB)；β-腎上腺素激導性阻斷劑(β阻斷劑)；聯胺肼；硝酸鹽，諸如異山梨醇二硝酸鹽；醛固酮拮抗劑；地高辛；利尿劑，例如環利尿劑、噻嗪類利尿劑及留鉀利尿劑；抗凝血劑；血管加壓素受體拮抗劑，例如考尼伐坦(conivaptan)；沙庫必曲(sacubitril)/纈沙坦；伊伐布雷定(ivabradine)；鐵補充物；流體限制物；以及鈉限制物。
在各種實施例中，一或多種其他療法可包括一或多種基因療法，例如基因替代療法。舉例而言，一種基因療法涉及使用病毒載體之肌縮蛋白基因替代。舉例而言，包括微型肌縮蛋白之腺相關病毒已注射至DMD之犬模型中，導致針對肌肉病理組織學之實質性益處。臨床試驗正在進行中，使用重組腺相關病毒用DMD替代DMD人類個體中之缺陷基因。實例包括例如rAAV2.5-CMV-微型-營養不良、rAAVrh74.MCK-微型-營養不良及rAAV1.CMV.huFollistatin344。
在一些實施例中，一或多種基因療法可包括例如外顯子跳過，其中合成反義寡核苷酸序列用於更新肌縮蛋白基因突變。在肌縮蛋白基因之前驅信使RNA(前驅mRNA)拼接期間，跳過特定外顯子，其恢復閱讀框架且部分產生內部截短之蛋白質。外顯子跳過療法可包括用於跳過之藥劑，例如：外顯子53，諸如SRP4053 (Serapta)、PRO053 (Prosensa)及NS-065/NCNP-01；外顯子51，諸如PRO051、伊特普森(eteplirsen) (AVI-4658)及屈沙培森(drisapersen) (GSK2402968)；外顯子45，諸如DS-5141、PRO045及SRP4045；以及外顯子44，諸如PRO044。舉例而言，將PRO051，即跳過肌縮蛋白前驅mRNA中之外顯子51之2'-O-甲基-硫代磷酸酯寡核糖核苷酸注射至人類DMD個體中，導致肌縮蛋白之17%-35%恢復。此外，舉例而言，伊特普森(AVI-4658)為胺基磷酸酯N-
Figure 02_image019
啉基寡聚物，其亦在肌縮蛋白前驅mRNA中跳過外顯子51。
在若干實施例中，一或多種基因療法可包括例如無意義抑制療法。約10%-15%之DMD病例係歸因於形成過早終止密碼子之點突變。此類過早終止密碼子通常導致功能蛋白損失。此類過早終止密碼子之識別可藉由有效恢復經修飾之肌縮蛋白之轉譯及產生的無意義突變抑制劑來緩解。無意義突變抑制劑可包括例如胺基糖苷，諸如慶大黴素(gentamicin)、阿他盧侖(Ataluren) (Translarna)及硫酸阿貝卡星(NPC-14)。
在各種實施例中，一或多種基因療法可包括例如使用經工程改造之核酸酶，諸如CRISPR-Cas9。舉例而言，mdx小鼠經藉由腺相關病毒遞送之RNA導引之成簇規律間隔短回文重複序列-Cas9核酸內切酶處理，緩解骨骼肌纖維、心肌細胞即肌肉衛星細胞之營養不良變化。
在一些實施例中，一或多種其他療法可包括一或多種細胞療法，例如使用肌肉前驅細胞或幹細胞，例如人類白血球抗原匹配之同胞供體中成血管細胞、經誘導之多能幹細胞、基於臍帶之同種間質幹細胞以及骨髓自體性及單核幹細胞之肌母細胞轉移、動脈內移植。
在若干實施例中，一或多種其他療法可包括細胞骨架蛋白質之膜穩定及上調。舉例而言，上調肌營養相關蛋白、α7β1整合素、110雙糖鏈蛋白聚糖及肌長蛋白穩定mdx小鼠中之肌纖維膜。舉例而言，展示化合物SMT C1100及SMT022357靶向肌營養相關蛋白-A啟動子且增加肌營養相關蛋白之產生且減少骨骼及心肌之營養不良變化。
在各種實施例中，一或多種其他療法可包括一或多種抗炎性療法。抗炎藥可包括例如：VBP15；吉維司他(givinostat) (HDAC抑制劑)；NEMO-結合域肽；CAT-1004 (愛達洛尼森(Edasalonexent)、NF-κB抑制劑)；類黃酮(flavocoxid)；TAS-205 (PDGD2合成酶抑制劑)；艾地苯醌(idebenone)；己酮可可鹼(pentoxifylline)；輔酶Q10；N-乙醯半胱胺酸；綠茶提取物；褪黑激素；己酮可可鹼；以及奧沙米特(oxatomide)。舉例而言，在肌肉營養不良之小鼠模型中，使用NEMO-結合域肽之NF-κB抑制引起改良之病變及肌肉功能。
在一些實施例中，一或多種其他療法可包括一或多種抗纖維化療法，例如，諸如氯沙坦之TGF-β阻斷劑，降低TGF-β之表現的血管收縮素II-1型受體阻斷劑；賴諾普利(lisinopril)、HT-100 (鹵夫酮(halofuginone))、FG-3019 (針對CTGF之單株抗體)；以及靶向微RNA。
在若干實施例中，一或多種其他療法可包括肌肉再生療法。舉例而言，適合的藥劑可包括：單獨或與間質基質細胞進一步組合之肌肉抑制素阻斷劑，諸如ACE-031、MYO-029、卵泡抑素、PF-06252616；以及BMS-986089；或胰島素生長因子。
在各種實施例中，一或多種其他療法可包括治療肌肉缺血，例如藉由使用使用他達拉非(tadalafil)、西地那非(sildenafil)及伐地那非(vardenafil)之磷酸二酯酶-5抑制；ACE抑制劑；經由遞送血管內皮生長因子(VEGF)誘導血管生成；以及1型VEGF誘鉺受體(VEGFR-1或Flt-1)之下調。
在一些實施例中，一或多種其他療法可包括一或多種物理干預，例如：物理療法、職能治療法、外科手術、矯正干預(例如，踝-足部矯正)、言語療法及呼吸療法。
在若干實施例中，一或多種其他療法可包括一或多種醫療裝置，例如：心房脈動產生器；或呼吸輔助裝置，諸如呼吸器或持續氣道正壓裝置。
本發明進一步提供一種活化個體肌細胞中之α7β1整合素的方法，該方法包含：向個體投與治療有效量之本文所描述之醫藥劑(例如抗體或抗體片段)，由此活化個體肌細胞中之α7β1整合素。
本發明亦提供一種增強α7β1整合素與其在個體之肌細胞中之配位體結合的方法，該方法包含：向個體投與治療有效量之本文所描述之醫藥劑(例如抗體或抗體片段)，由此增強α7β1整合素與其在個體之肌細胞中之配位體的結合。
如本文所用，術語「有需要之患者」或「有需要之個體」係指處於疾病、病症或病狀風險下或罹患疾病、病症或病狀之患者或個體，該疾病、病症或病狀能夠用包含β1蛋白之整合素雜二聚體的促效劑或包含本文所提供之此類促效劑的組合物治療或減輕。有需要之患者或個體可例如為經診斷患有諸如肌肉萎縮病之與α7β1整合素功能障礙相關之疾病的患者或個體。個體在層連結蛋白/營養不良聚糖蛋白/肌聚糖/肌縮蛋白複合物中之蛋白質中之一者中可具有突變或功能障礙。在其他實施例中，個體在層連結蛋白-α2 (分區蛋白)中可具有突變或功能障礙。「個體」及「患者」在本文中可互換地使用。
在某些實施例中，個體可為人類、非人類靈長類動物、豬、馬、牛、狗、貓、小鼠或大鼠。
如本文所用，術語「有效量」或「治療有效量」係指足以降低或減輕病症(例如肌肉營養不良)或其一或多個症狀之嚴重程度及/或持續時間；預防病症進展；引起病症消退；預防與病症相關之一或多個症狀的復發、發展、發作或進展；或提高增強或改良另一療法(例如，預防劑或治療劑)之一或多個預防或治療效果的醫藥劑(例如抗體)之量。有效量之抗體可例如在一定程度上增強肌肉再生、維持或修復及/或減輕與肌肉萎縮病相關之症狀中之一或多者。
在某些態樣中，有需要之個體可用本文所描述之醫藥劑及具有不同作用機制(例如，基因校正、增加肌肉再生或減少發炎及纖維化)用於治療肌肉萎縮病之另一醫藥劑治療。
本發明進一步涵蓋本文所描述之醫藥劑(例如抗體或抗體片段)在製造用於治療個體之特徵在於α7β1整合素功能障礙之病症或疾病的藥劑中之用途。本發明亦包括本文所描述之醫藥劑(例如抗體或抗體片段)用於治療個體之特徵在於α7β1整合素功能障礙之病症或疾病的用途。醫藥組合物
本發明之醫藥劑(在本文中亦稱為「活性化合物」)及其衍生物、片段、類似物及同系物可併入適用於投與之醫藥組合物中。此類組合物通常包含抗體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含作為α7β1整合素之促效劑的醫藥劑。在其他實施例中，醫藥組合物包含至少兩種、至少三種或至少四種不同的醫藥劑，該等醫藥劑為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的促效劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受de 」係指使用此項技術中熟知之途徑投與時，通常不產生過敏性或其他嚴重不良反應之分子實體及組合物。經聯邦政府或洲政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出之用於動物，且更特定言之用於人類之分子實體及組合物視為「醫藥學上可接受的」。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意欲包括與醫藥投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似物。適合的載劑描述於雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)之最新版本中，其為該領域中之標準參考文本，其以引用之方式併入本文中。此類載劑或稀釋劑之一些實例包括(但不限於)：水、鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑，諸如不揮發性油。此類介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中所熟知的。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則考慮將其用於組合物中。補充活性化合物亦可併入組合物中。
本發明之醫藥組合物可經調配以與其預期投與途徑相容。投與途徑之實例包括非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(亦即局部)、經黏膜及經直腸投與。用於非經腸、皮內或皮下施加之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於張力調節的藥劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉調節。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
適用於可注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液，及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合的載劑包括生理鹽水、抑菌水、 Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須為無菌的且流動性應達至存在易於注射性之程度。其必須在製造及儲存條件下穩定，且必須保護其免遭微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合的混合物之溶劑或分散介質。例如，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)及藉由使用界面活性劑來維持適當的流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉。可藉由使組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)實現可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由如下方法來製備：將適當溶劑中之所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一種或組合合併，視需要，接著進行過濾滅菌。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及上文所列舉之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末至情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前經滅菌過濾之溶液產生活性成分加任何其他所需成分的粉末。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載劑。其可封裝於明膠膠囊中或壓縮成錠劑。出於經口治療性投與之目的，活性化合物可併有賦形劑且以錠劑、糖衣錠或膠囊之形式使用。亦可使用適用作漱口水之流體載劑製備口服組合物，其中流體載劑中之化合物經口施加且漱口並且吐出或吞咽。可包括醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑物質作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primojel®或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；滑動劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。
對於藉由吸入之投與，化合物可以氣溶膠噴霧之形式自含有適合的推進劑(例如，諸如二氧化碳之氣體)之加壓容器或分配器或噴霧器遞送。
全身性投與亦可藉由經黏膜或經皮方式。對於經黏膜或經皮投與，在調配物中使用適於待滲透之障壁的滲透劑。此類滲透劑一般為此項技術中已知的，且對於經黏膜投與，包括例如清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投與可經由使用經鼻噴霧或栓劑來實現。對於經皮投與，如此項技術中一般已知，將活性化合物調配成軟膏、油膏、凝膠或乳膏。
醫藥劑亦可以用於經直腸遞送之栓劑(例如，具有習知栓劑基質，諸如可可豆油及其他甘油酯)或保留灌腸劑形式製備。
在一個實施例中，活性化合物係用保護化合物以免自身體快速消除之載劑製備，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解、生物相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法對於一般熟習此項技術者為顯而易見的。物質亦可在商業上獲得。脂質體懸浮液(包括靶向具有針對病毒抗原之單株抗體的經感染細胞的脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等物質可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如如美國專利第4,522,811號中所描述。
為了易於投與及劑量均一性，以單位劑型來調配經口或非經腸組合物為尤其有利的。如本文所用，單位劑型係指適合以單位劑量用於待治療之個體的實體離散單元；各單元均含有預定量之活性化合物，經計算以與所需醫藥載劑聯合產生所要治療效果。本發明之單位劑型之規格由以下因素規定且直接視以下因素而定：活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效果，以及混配用於治療個體之此類活性化合物之此項技術中固有的侷限性。
醫藥組合物可與投與說明書一起包括於容器、包裝或分配器中。
本文所用之章節標題僅出於組織目的且不應視為限制所描述之主題。出於任何目的，本文所引用之所有文獻或文獻之部分(包括(但不限於)：專利、專利申請案、文章、書籍及論文)特此以全文引用之方式明確地併入。在所併入之文獻或文獻之部分中之一或多者定義與本申請案中之術語之定義矛盾之術語的情況下，以在本申請案中出現之定義為準。然而，本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案之提及並非且不應視為承認或任何形式之表明其構成有效的先前技術或形成全球任何國家之公共常識的一部分。
在本說明書中，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。應理解，除非另外指示，否則如本文所使用之術語「一(a/an)」係指所列舉之組分之「一或多個(種)」。應理解，使用替代物(例如，「或」)意謂替代物之一者、兩者或其任何組合。如本文所用，術語「包括」及「包含」同義地使用。
將在以下實例中進一步描述本發明，該等實例並不限制申請專利範圍中所描述之本發明之範疇。表 1A . 例示性整合素 α 蛋白 層連結蛋白 結合頭域序列 整合素α7頭域胺基酸序列
Figure 02_image021
整合素α6頭域胺基酸序列
Figure 02_image023
Figure 02_image025
整合素α3頭域胺基酸序列
Figure 02_image027
表 1B . 例示性整合素 α 蛋白 CALF - 1 域序列
Figure 02_image029
表 1C. 例示性整合素 α 蛋白 CALF - 2 域序列
Figure 02_image031
實例 實例 1 ： β1 蛋白促效劑在具有肌縮蛋白缺乏之細胞中提供補償作用
用β1促效劑抗體TS2/16 (J. Immunol, 1984, 132:3011)處理來自健康及肌縮蛋白缺乏的人類患者之肌母細胞及肌管。使用細胞黏著分析來評估經由整合素將細胞附著至層連結蛋白。微量培養盤在4℃下用10 µg/ml 分區蛋白塗佈隔夜，且在分析之前用2% BSA/PBS阻斷30分鐘。分離肌母細胞或肌管細胞且在PBS中洗滌。此後，將細胞以1.0×106 個細胞/ml再懸浮於IMEM中，向培養盤中添加五十微升細胞懸浮液及五十微升抗體溶液。在37℃下在潮濕的5%二氧化碳中培育培養盤一小時。藉由58g翻轉離心5分鐘來移除非黏附細胞。固定所附著之細胞且用0.5%結晶紫(存在於20%甲醇及1%甲醛中)染色，並且用PBS洗滌孔。將結晶紫溶解於含有2% Triton-X之PBS中。使用微量培養盤讀取器(Tecan)，藉由595 nm處之吸光度評估各孔中之細胞的相對數目。
經TS2/16處理促進人類肌母細胞對健康對照及肌縮蛋白缺乏的肌母細胞(圖 1 )及肌管(圖 2 )兩者中之分區蛋白(層連結蛋白)之黏著力。α7β1整合素在分化至肌管後上調。可藉由β1活化來增強肌管對分區蛋白之黏著力。人類肌母細胞在細胞表面上表現多個層連結蛋白整合素，如藉由FACS所測定(圖 3 及4 )。藉由β1活化介導之增強型細胞黏著主要由整合素α7β1促成(圖 5 )，由於其不被功能性阻斷α3及α6抗體抑制，但被阻斷α7抗體阻斷。
β1促效劑抗體TS2/16在健康鼠類肌母細胞中亦以α7β1-依賴性方式增強肌管對層連結蛋白之黏著力，其中肌縮蛋白表現用siRNA阻斷。C2C12細胞(Nature, 1977, 270:725)為表現多個層連結蛋白整合素之鼠類肌母細胞。C2C12細胞在其表面上表現三個層連結蛋白受體(α3、α6及α7β1) (J Cell Sci, 1996, 109: 3139)。α7A在骨胳肌分化期間上調。C2C12細胞中之α7表現量在肌肉分化期間增加(Xiao等人 (2003) J. Biol. Chem., 278:49780-49788)。C2C12細胞分化至肌管(圖 6 )。使用siRNA阻斷肌管中之肌縮蛋白表現(圖 7 ；Ghahramani Seno等人 (2008) Human Molecular Genetics, 17:2622-2632)。TS2/16增強型鼠類肌管細胞對用對照siRNA及肌縮蛋白siRNA處理之鼠類肌管中之層連結蛋白之黏著力(圖 8A )。TS2/16增強型鼠類肌管細胞對層連結蛋白之黏著力主要由整合素α7β1提供(圖 8B )。實例 2 ：產生 α7β1 促效劑抗體
藉由用人類整合素α7β1蛋白胞外域使小鼠免疫來產生單株抗體。方法之一般示意圖展示於圖 9 中。融合瘤係藉由標準技術產生。自總共9,000個純系選擇110個純系作為整合素α7β1結合子。在功能性生物化學及細胞分析中鑑別多種拮抗劑(阻斷)及四種促效劑(活化)抗體。此等抗體表徵為在固相結合分析及細胞黏著檢定中活化或阻斷。活化抗體稱為M10、M25、M36及M38。圖 10A 展示來自固相結合分析之結果的實例，且圖 10B 展示來自用兩種活化抗體(M10、M25)及一種阻斷抗體(M20)進行之細胞黏著分析之結果的實例。進一步表徵(例如藉由ELISA或流式細胞測量術)活化抗體以確定是否經由α7蛋白或β1蛋白進行活化。發現M10及M25結合β1蛋白，因為兩個抗體不僅可經刺激與α7β1結合，且亦可經刺激結合與α6β1整合素及αvβ1整合素結合(圖 10C )。
發現抗體M36及M38與表現α7β1 (人類(K562/α7X2)及鼠類(C2C12)整合素兩者)之細胞表面結合。參見圖 11A 。M36及M38與人類及鼠類α7β1整合素之結合為劑量依賴性的且不經由雜二聚體之β1次單元介導，因為M36及M38並不與α6β1或α5β1整合素結合(圖 11B )。
由於轉錄後修飾，整合素α7蛋白可具有兩個不同的細胞外序列(命名為「X1」及「X2」)。可變區序列(X1或X2)位於靠近推定配位體結合位點之III與IV同源重複域之間(圖 12A )。X2可變區序列中存在40個胺基酸。抗體M36及M38優先與表現α7β1 X2形式之細胞表面結合(圖 12B )，其較佳在成人骨骼細胞中表現。由於結合對α7X2同功異型物(而非α7X1同功異型物)之特異性，因此可得出結論，M36及M38特異性結合α7β1雜二聚體整合素之α7X2次單元(圖 12B )。
發現抗體M36及M38增強整合素α7β1介導之K562/α7x2β1細胞對層連結蛋白(LN211)之黏著力。抗體M36及M38增強整合素α7β1細胞對人類層連結蛋白211 (EC50：1.09 nM及1.27 nM)之黏著力。參見圖 13A 對照抗體M35不具有作用。抗體M36及M38增強小鼠肌管，其中肌縮蛋白已阻斷，黏著至層連結蛋白。參見圖 13B 。此作用可藉由α7阻斷抗體逆轉。
發現抗體M36及M38經由構形變化活化整合素α7β1。單株抗體9EG7與經活化之β1整合素選擇性結合(Bazzoni等人, J Biol Chem. 1995; 270(43):25570-7)。Mn2+介導β1整合素活化且此可藉由9EG7偵測(白色條柱，圖 14 )。如圖 14 中所示，抗體M36及M38增強9EG7 (深及淺灰色條柱)相對於α7對照(con功能)抗體(白色條柱)之結合，此指示整合素α7β1變成更活化構形。
對M36及M38抗體重鏈及輕鏈可變區進行定序且發現相同。此等序列提供於表 2 中。表 2 . 抗體 M36 及抗體 M38 之胺基酸序列
HCDR1 GYNFTKYW SEQ ID NO: 2
HCDR2 IYPGSSTS SEQ ID NO: 3
HCDR3 VRGDD SEQ ID NO: 4
LCDR1 ESVDNYGISF SEQ ID NO: 5
LCDR2 AAS SEQ ID NO: 6
LCDR3 HQSKEVPYT SEQ ID NO: 7
VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYNFTKYWINWVKQRPGQGLEWIGIIYPGSSTSNYNEKFKTKATLTVEISSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCVRGDDWGQGTTLTVSS SEQ ID NO: 8
VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASDLGSGVPARFTGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCHQSKEVPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 9
實例 3 ：人類化 α7β1 促效劑抗體之產生及表徵
M36/M38抗體之序列隨後經人類化。分析抗體序列之三維結構且藉由同源建模來建構。鑑別支持CDR環結構及VH-VL界面之關鍵位置。多個人類化變異體經設計用於重鏈及輕鏈兩者。藉由描述於Gao等人, (2013)BMC Biotechnology , 13:55中之T20人類化評分來評估人類化變異體之人類化。人類化抗體以及嵌合版本(嚙齒動物可變區、人類恆定區)在CHO細胞(TunaCHO™方法)中以10 mL規模表現且純化。藉由流式細胞測量術及ELISA測試所產生之各抗體之結合親和力。
分離稱為「VL3VHK20TFT」之人類化抗體。VL3VHK20TFT之各種區之胺基酸及核苷酸序列提供於表 3 中。VL3VHK20TFT屬於IgG4同型及S228P子類。VL3VHK20TFT之輕鏈同型為人類κ。表 3 . 抗體 VL3VHK20TFT 之胺基酸及核苷酸序列
HCDR1 GYTFTKYW SEQ ID NO: 14
HCDR2 IYPGSSTS SEQ ID NO: 3
HCDR3 VKNDN SEQ ID NO: 15
LCDR1 ESVDNYGISF SEQ ID NO: 5
LCDR2 AAS SEQ ID NO: 6
LCDR3 HQSKEVPYT SEQ ID NO: 7
VH (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYW INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 16
VL (CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISF MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIK SEQ ID NO: 17
重鏈胺基酸序列(S228P突變為粗體字) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWINWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTSNYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 18
輕鏈胺基酸序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASDLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 19
重鏈核苷酸序列 ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGCCTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAAGAAGCCCGGTGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAAGTACTGGATCAACTGGGTGAGGCAGGCACCCGGCCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCATCATCTACCCCGGCAGCAGCACCAGCAATTACAACGAGAAGTTCAAGACCCGAGTAACCATGACCGTGGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGTGAAGAACGACAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCTCCCTGCAGCCGGAGCACATCCGAGAGCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTCGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTCAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGACATCCGGCGTCCACACATTCCCCGCTGTCCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTCACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGAACAAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCATAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCCAAGTATGGACCCCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAATTTCTCGGAGGCCCCTCCGTCTTCCTGTTTCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACACCCGAAGTCACCTGCGTCGTGGTGGATGTCAGCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCATAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTATCGGGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTGCATCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAACCTCGGGAGCCCCAAGTGTATACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAAGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGATTTTACCCCTCCGACATCGCTGTGGAATGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAATCCCGGTGGCAAGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGAGCCTCGGCTAG SEQ ID NO: 20
輕鏈核苷酸序列 ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCACCGGAGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCCGCTAGCGTAGGCGACAGGGTCACCATCACCTGTAGGGCCAGTGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTTATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATTTACGCCGCCAGCGACCTGGGCAGCGGCGTGCCCAGTAGGTTCAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGACTTCACCCTGACTATCAGCTCTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCACCAGAGCAAGGAGGTCCCCTATACCTTCGGCCAAGGCACCAAGTTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA SEQ ID NO: 21
*應注意，以下序列為一致的：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68。
使用高通量流式細胞測量術及篩選單株抗體及Fab之條件係使用選殖至專用載體中且在HEK-293T細胞中表現之野生型目標蛋白最佳化。目標蛋白為人類整合素α7 (ITGA7；UniProt ID Q13683；SEQ ID NO : 24 )。藉由高通量流式細胞測量術評估VL3VHK20TFT單株抗體及VL3VHK20TFT Fab與經整合素β-1前驅體(ITGB1)與整合素次單元α7 (ITGA7)或單獨載體(陰性對照)共轉染(1:1)之HEK-293T細胞之結合。將抗體3C12、6A11、A1-1a M20及A1-1a M24用作ITGA7結合之陽性對照。此等抗體及高通量流式細胞測量術之參數提供於表 4 中。表 4 . 針對高通量流式細胞測量術最佳化之實驗參數
實驗參數 測試 MAb 對照 MAb 對照 MAb 對照 MAb 對照 MAb
細胞類型 HEK-293T HEK-293T HEK-293T HEK-293T HEK-293T
固定劑 無 無 無 無 無
阻斷緩衝液 10%山羊血清 10%山羊血清 10%山羊血清 10%山羊血清 10%山羊血清
初級抗體
名稱 VL3VHK20TFT MAb 3C12 MAb (MBL) 6A11 MAb (MBL) A1-1a M20 MAb A1-1a M24 MAb
目標 ITGA7 ITGA7 ITGA7 ITGA7 ITGA7
最佳濃度 0.5 µg/ml 0.5 µg/ml 2.0 µg/ml 0.13 µg/ml 0.5 µg/ml
培育(25℃) 60分鐘 60分鐘 60分鐘 60分鐘 60分鐘
二級抗體
目標 人類IgG 小鼠IgG 小鼠IgG 小鼠IgG 小鼠IgG
最佳濃度 1:400 (3.75 µg/ml) 1:400 (3.75 µg/ml) 1:400 (3.75 µg/ml) 1:400 (3.75 µg/ml) 1:400 (3.75 µg/ml)
培育(25℃) 30分鐘 30分鐘 30分鐘 30分鐘 30分鐘
製造商 Jackson ImmunoResearch Jackson ImmunoResearch Jackson ImmunoResearch Jackson ImmunoResearch Jackson ImmunoResearch
目錄號 109-545-003 115-545-003 115-545-003 115-545-003 115-545-003
抗體ID AlexaFluor® 488親和純化山羊抗人類IgG (H+L) AlexaFluor® 488親和純化山羊抗小鼠IgG (H+L) AlexaFluor® 488親和純化山羊抗小鼠IgG (H+L) AlexaFluor® 488親和純化山羊抗小鼠IgG (H+L) AlexaFluor® 488親和純化山羊抗小鼠IgG (H+L)
洗滌緩衝液 PBS (游離Ca2+ 、Mg2+ ) PBS (游離Ca2+ 、Mg2+ ) PBS (游離Ca2+ 、Mg2+ ) PBS (游離Ca2+ 、Mg2+ ) PBS (游離Ca2+ 、Mg2+ )
信號:背景 18:1 16:1 16:1 17:1 16:1
用於具有VL3VHK20TFT Fab之高通量流式細胞測量術之參數提供於表 5 中。表 5 . 針對高通量流式細胞測量術最佳化之實驗參數 .
實驗參數 測試Fab
細胞類型 HEK-293T
固定劑 無
阻斷緩衝液 10%山羊血清
初級抗體
名稱 VL3VHK20TFT Fab
目標 ITGA7
最佳濃度 2.0 µg/ml
培育(25℃) 60分鐘
二級抗體
目標 人類F(ab')2
最佳濃度 1:200 (7.50 µg/ml)
培育(25℃) 30分鐘
製造商 Jackson ImmunoResearch
目錄號 109-546-006
抗體ID AlexaFluor® 488親和純化山羊抗人類IgG F(ab')2片段
洗滌緩衝液 PBS (游離Ca2+ 、Mg2+ )
信號:背景 12:1
如圖 15 及圖 16 所示，VL3VHK20TFT mAb (圖 15 )及VL3VHK20TFT Fab (圖 16 )與含有目標蛋白ITGA7之細胞選擇性結合且不與不含有目標(載體)之細胞結合。圖 15 及圖 16 中之各點表示四個重複實驗之平均值。各抗體或Fab之最佳篩選濃度(在方框中框出)係基於原始信號值及信號對背景計算確定。
為定位VL3VHK20TFT之抗原決定基，構築目標蛋白(ITGA7；SEQ ID NO : 24 )之丙胺酸掃描庫。使用Davidson及Doranz, 2014,Immunology 143, 13-20中所描述之通用程序進行槍式突變誘發抗原決定基定位。簡言之，藉由高通量定點突變誘發產生目標蛋白之突變庫。各殘基個別地突變成丙胺酸，其中丙胺酸密碼子突變成絲胺酸。突變庫排列於384孔微量培養盤中且短暫轉染至HEK-293T細胞中。在轉染之後，細胞與指定抗體(VL3VHK20TFT Fab或6A11單株抗體(mAb))一起以使用獨立免疫螢光滴定曲線預定之濃度在野生型蛋白質上培育。使用Alexa Fluor 488結合之二級抗體偵測抗體，且使用Intellicyt®iQue流式細胞測量術平台測定平均細胞螢光。若突變殘基不支持VL3VHK20TFT Fab之反應性，但支持參考6A11 mAb之反應性，則其經鑑別為對VL3VHK20TFT Fab抗原決定基係至關重要的。此計數篩選策略促進排除局部錯誤摺疊或具有表現缺陷之突變體。
極高親和力MAb之庫篩選有時未能產生用於抗體結合之關鍵殘基。高親和力MAb轉化成Fab通常會充分減弱結合以鑑別用於結合之關鍵殘基。對於在標準條件下Fab篩選仍不足以鑑別用於結合之關鍵殘基的情況，實施高嚴格度條件。此等條件包括pH增加、鹽度增加、溫度增加及/或洗滌時間增加之組合。需要高嚴格度條件之抗體表示為「HS」。
藉由高通量流式細胞測量術一式兩份地測定VL3VHK20TFT Fab及6A11 mAb與ITGA7突變體之丙胺酸掃描庫中之各突變體純系之結合。對於各點，自原始資料減去背景螢光，其隨後針對與野生型(WT)目標蛋白具反應性之抗體(Ab)進行歸一化。對於各突變體純系，將平均結合值繪製為表現(由對照反應性表示)之函數。為鑑別初步初級臨界純系(紅色圓圈)，應用＞70% WT與對照Ab結合及＜20% WT與測試Ab結合之閾值(虛線)。對不符合設定閾值但其減小的結合活性及與臨界殘基接近之純系突出顯示二級純系(藍色圓圈)，表明突變殘基可為抗體抗原決定基之一部分。圖 17 展示含有初級關鍵純系及二級純系之圖式。
抗體結合之關鍵殘基列舉於表 6 中。所有經鑑別之關鍵殘基均列出平均結合反應性(及範圍)。Ab結合之關鍵殘基(S977、W978、W979、P980)為其突變對與測試Ab之結合呈陰性但對與對照抗體結合呈陽性的殘基。鑑別不符合閾值準則之額外二級殘基(R958、M976)，但其減小的結合活性及接近關鍵殘基表明其可為抗體抗原決定基之一部分。
基於如圖 18 中所示之整合素α(x)β(2)結構(於Xie等人, 2010,Embo . J . 29, 666-679中之PDB ID# 3K71)，在目標蛋白之晶體結構模型上觀測到關鍵殘基(紅色球)。亦展示可促成結合之二級殘基(藍色球)。模型上之一個殘基(R958)為不可用的。在表 6 中，突變得到VL3VHK20TFT Fab之最低反應性的關鍵殘基係加下劃線的。經驗證之關鍵殘基表示其側鏈使得對抗體-抗原決定基相互作用之最高高能貢獻的胺基酸(Bogan及Thorn, 1998,J . Mol . Biol . 280 , 1-9；Lo Conte等人, 1999,J . Mol . Biol . 285, 2177-2198.)；因此，突出顯示之殘基(S977、W978、W979、P980)可能為結合之主要高能促成因素。表 6 . 抗體結合之關鍵殘基
結合反應性(% WT)
突變 VL3VHK20TFT Fab HS 6A11 MAb
R958A 27.8 (0) 114.3 (66)
M976A 29.5 (7) 149.4 (45)
S977A 8.0 (1) 97.6 (44)
W978A -0.3 (0) 96.4 (32)
W979A -0.7 (2) 87.9 (17)
P980A 1.1 (0) 111.8 (67)
表 7 . 人類整合素 α - 7 ( ITGA7 ； UniProt ID Q13683 ) 胺基酸序列
Figure 02_image033
Figure 02_image035
實例 4 ：小鼠及人類化抗體對 α7β1 整合素之評估
評估與人類及小鼠整合素α7β1結合之抗體。發現小鼠α7β1抗體VLVH (具有人類IgG4 Fc之嵌合體，在表 10 中亦稱為hIgG4-23)及人類化α7β1抗體VL3VHK20TFT均與人類及小鼠整合素α7β1交叉反應。表 8 中所列出之親和力量測結果的比較展示人類化抗體VL3VHK20TFT對於與人類及小鼠整合素α7β1之結合具有較低KD。人類化抗體對於與人類α7β1之結合的KD降低約3.33倍，且對於與小鼠α7β1整合素之結合的KD降低約11.1倍。此等資料展示人類化抗體VL3VHK20TFT比具有小鼠融合瘤Fab區之嵌合體抗體之總體實質上親和力改良。圖 19 為展示以各種濃度之VL3VHK20TFT；0.25 µg/mL人類整合素α7β1；1:1結合之結果的圖式。圖 20 為展示以各種濃度之VLVH；0.25 µg/mL人類整合素α7β1；1:1結合之結果的圖式。圖 21A 為展示以各種濃度之VL3VHK20 TFT；0.25 µg/mL小鼠整合素α7β1；1:1結合之結果的圖式。圖 21B 為展示以各種濃度之VLVH；0.25 µg /mL小鼠整合素α7β1；1:1結合之結果的圖式。
藉由流式細胞測量術評估與細胞表面整合素α7β1結合之抗體。表現人類整合素α7β1之K562細胞用於VL3VHK20TFT抗體結合。圖 22A 為展示各種濃度下之抗體細胞表面結合之圖式。發現抗體VL3VHK20TFT增強人類α7β1 (圖 22B )及鼠類α7β1 (圖 22C )介導對層連結蛋白之黏著力。表 8 ：小鼠及人類化抗體對 α7β1 整合素之評估
動力學模型 捕捉物 1 溶液 分析物 1 溶液 動力學Chi² (RU²) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1:1結合 0.25 µg/mL人類整合素α7β1 VL3VHK20TFT 1.11E-01 2.58E+05 1.53E-04 5.93E-10
1:1結合 0.25 µg/mL人類整合素α7β1 VLVH 7.36E-03 3.33E+05 6.52E-04 1.96E-09
1:1結合 0.25 µg/mL小鼠整合素α7β1 VL3VHK20TFT 6.85E-03 2.39E+05 4.69E-04 1.96E-09
1:1結合 0.25 µg/mL小鼠整合素α7β1 VLVH 6.70E-03 9.76E+04 2.13E-03 2.18E-08
實例 5 ： α7β1 促效劑抗體增強之 DMD 肌母細胞對層連結蛋白之黏著力
方法：使用具有xCELLigence RTCA SP即時細胞感測裝置之電學阻抗分析量測來自懸浮液之細胞再附著的即時監測。將DMD肌母細胞接種於塗佈有層連結蛋白211之E形培養盤中。細胞分別用抗體處理。附著速率表示為細胞指數，其中值表示為三個重複孔之細胞指數±SD。
結果：圖 23 為展示針對鼠類抗體(VLVH)及人類化抗體(VL3VHK20TFT)增強的肌母細胞對層連結蛋白黏著之抗體濃度(以µg/mL為單位)對細胞指數(整合素α7β1介導之細胞黏著)的圖式。人類化抗體之有效性為鼠類抗體之約5倍。實例 6 ： α7β1 促效劑抗體保護腓腸肌免受損傷
方法：建立四個鼠類測試組：DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照、mdx/促效劑抗體(3 mg/kg)及mdx/促效劑抗體(15 mg/kg)。用305C肌肉槓桿系統活體內量測肌肉效能。使用壓靠脛骨頭及牢固地固定至馬達軸上至踏板之腳的接腳來分隔膝部。對於足底屈肌組，藉由坐骨神經之經皮電刺激誘發收縮。在0.1 Hz頻率下遞送一系列20次強直性刺激(80 Hz，0.2毫秒脈衝，500毫秒持續時間)。歷經250毫秒，腳相對於收縮方向旋轉10°，從而導致離心收縮。
結果：圖 24 為展示針對DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照、mdx/促效劑抗體(3 mg/kg)及mdx/促效劑抗體(15 mg/kg)之收縮對力(歸一化至初始收縮)之圖式。針對mdx小鼠之力比健康對照小鼠(DBAS)下降得多得多。整合素α7β1促效劑抗體處理保護免受兩種劑量(3 mg/kg及15 mg/kg)之離心損傷的影響。實例 7 ：經 α7β1 促效劑抗體促效劑抗體改善之膈膜功能
方法：使用來自實例6之四個鼠類組，使用水平灌注浴調適之305C肌肉槓桿系統(Aurora Scientific公司, Aurora, CAN)活體外量測肌肉效能。將整個隔膜置放於305C肌肉槓桿系統之水平浴中，且灌注有具有95% O2 /5% CO2 氧化之生理緩衝液且保持在37℃下。經由側接肌肉之鉑電極遞送在0.01 Hz頻率下之一系列1 Hz及100 Hz場刺激(0.2毫秒脈衝，100毫秒持續時間)以確保縫合線為緊密的且最大所產生之力為穩定的。
結果：圖 25 為展示針對DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照、mdx/促效劑抗體(3 mg/kg)及mdx/促效劑抗體(15 mg/kg)之刺激頻率(以Hz為單位)對力(歸一化至肌肉寬度，mN/mm)之圖式。mdx小鼠力比健康對照小鼠(DBAS)下降得多得多。整合素α7β1促效劑抗體處理保護免受兩種劑量(3 mg/kg及15 mg/kg)之離心損傷的影響。實例 8 ： α7β1 促效劑抗體處理改良生物標記
方法：在小鼠中量測與肌肉營養不良損傷相關之各種生物標記且發現經治療而得到改良。
圖 26 為展示DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照及用M36促效劑抗體處理中之血清肌酸激酶(用於肌肉損傷之生物標記)之量的條形圖。與mdx/IgG對照相比，用M36促效劑抗體處理實質上減少血清肌酸激酶。
圖 27 為展示DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照及用M36促效劑抗體處理中之骨骼肌鈣蛋白(用於肌肉損傷之生物標記)之量的條形圖。與mdx/IgG對照相比，用M36促效劑抗體處理實質上減少骨骼肌鈣蛋白。
圖 28 為展示DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照及用M36促效劑抗體處理中之O-羥脯胺酸(腓腸肌中之膠原蛋白形成/纖維化之量度)之量的條形圖。與mdx/IgG對照相比，用M36促效劑抗體處理實質上減少膠原蛋白形成/纖維化，如藉由O-羥脯胺酸所測定。實例 9 ：經修飾之 α7β1 促效劑抗體之改良特性
如圖 29 中所示，胺基酸取代係藉由抗體VL3VHK20TFT (表 3 中所提供之初始序列)之序列的定點突變誘發產生且針對降低抗體多特異性之能力來評估。如本文進一步展示，發現在重鏈可變區中包括hIgG-38且在輕鏈可變區中包括hIgG-44、45及46的變異體中之一些保留整合素α7β1結合活性(圖 30 )。將採用呈現於桿狀病毒顆粒(BVP)之表面上之膜蛋白的基於ELISA之方法用作捕捉具有交叉相互作用傾向之抗體的試劑。疏水相互作用層析(hydrophobic interaction chromatography；HIC)使用分析型技術來探測抗體疏水性。hIgG-38、44及45展示具有更有利的生物物理學特性，如表 9 中所示。此等抗體之序列提供於表 11 、表 12 及表 13 中。表 9 ：人類化抗體變異體之 BVP 及 HIC 得分
   BVP HIC
hIgG-36 12.5 16.29
hIgG-38 3.8 12.43
hIgG-44 6.4 8.19
hIgG-45 7.5 8.26
hIgG-46 18.1 12.01
實例 10 ：其他 α7β1 促效劑抗體
表 10 展示由重鏈與輕鏈之組合製備之一系列α7β1促效劑IgG抗體，其胺基酸序列提供於表 10 之後。
重鏈序列VHK2、VHK4、VHK11、VHK12、VHK14、VHK20、VHK22、VHK33、VHK48及VHK51為包含HCDR3序列之變化形式的人類化重鏈序列。重鏈序列VHK20TFT-A至VHK20TFT-F包含HCDR1及HCDR2序列之變化形式。輕鏈序列VL1-VL10為人類化κ鏈序列。輕鏈序列VL11、VL12及VL13包含LCDR1序列之變化形式。命名為「VH」及「VL」之序列為包含鼠類IgG M36可變區及人類IgG4恆定區之嵌合分子。表 10 ： 例示性 α 7 β 1 IgG 抗體
人類IgG 抗體名稱 輕鏈序列 重鏈序列 抗體之其他名稱
hIgG4-1 VL1 VHK33 VL1VHK33
hIgG4-2 VL1 VHK20 VL1VHK20
hIgG4-3 VL1 VHK22 VL1 VHK22
hIgG4-4 VL1 VHK48 VL1 VHK48
hIgG4-5 VL1 VHK14 VL1 VHK14
hIgG4-6 VL1 VHK7 VL1 VHK7
hIgG4-7 VL1 VHK51 VL1 VHK51
hIgG4-8 VL1 VHK11 VL1 VHK11
hIgG4-9 VL1 VHK2 VL1 VHK2
hIgG4-10 VL1 VHK4 VL1 VHK4
hIgG4-11 VL2 VHK33 VL2 VHK33
hIgG4-12 VL2 VHK20 VL2 VHK20
hIgG4-13 VL2 VHK22 VL2 VHK22
hIgG4-14 VL2 VHK48 VL2 VHK48
hIgG4-15 VL2 VHK14 VL2 VHK14
hIgG4-16 VL2 VHK7 VL2 VHK7
hIgG4-17 VL2 VHK51 VL2 VHK51
hIgG4-18 VL2 VHK11 VL2 VHK11
hIgG4-19 VL2 VHK2 VL2 VHK2
hIgG4-20 VL2 VHK4 VL2 VHK4
hIgG4-21 VL1 VHK12 VL1 VHK12
hIgG4-22 VL2 VHK12 VL2 VHK12
hIgG4-23 VL VH VL VH
hIgG4-24 VL1 VH3 VL1 VH3
hIgG4-25 VL2 VH3 VL2 VH3
hIgG4-26 VL VHK20 VL VHK20
hIgG4-27 VL VH3 VL VH3
hIgG4-28 VL3 VHK20 VL3 VHK20
hIgG4-29 VL4 VHK20 VL4 VHK20
hIgG4-30 VL5 VHK20 VL5 VHK20
hIgG4-31 VL6 VHK20 VL6 VHK20
hIgG4-32 VL7 VHK20 VL7 VHK20
hIgG4-33 VL8 VHK20 VL8 VHK20
hIgG4-34 VL9 VHK20 VL9 VHK20
hIgG4-35 VL10 VHK20 VL10 VHK20
hIgG4-36 VL3 VHK20TFT VL3 VHK20TFT
hIgG4-37 VL3 VHK20NTA VL3 VHK20NTA
hIgG4-38 VL3 VHK20TFT-A VL3 VHK20TFT-A
hIgG4-39 VL3 VHK20TFT-B VL3 VHK20TFT-B
hIgG4-40 VL3 VHK20TFT-C VL3 VHK20TFT-C
hIgG4-41 VL3 VHK20TFT-D VL3 VHK20TFT-D
hIgG4-42 VL3 VHK20TFT-E VL3 VHK20TFT-E
hIgG4-43 VL3 VHK20TFT-F VL3 VHK20TFT-F
hIgG4-44 VL11 VHK20TFT VL11 VHK20TFT
hIgG4-45 VL12 VHK20TFT VL12 VHK20TFT
hIgG4-46 VL13 VHK20TFT VL13 VHK20TFT
hIgG4-47 VL13 VHK20TFT-F VL13 VHK20TFT-F
hIgG4-48 VL VHK20TFT VL VHK20TFT
hIgG4-49 VL3 VH VL3 VH
重鏈序列 ( 按次序 ， 各序列中之加下劃線的部分為 HCDR1 、 HCDR2 及 HCDR3 )
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
Figure 02_image043
Figure 02_image045
輕鏈序列 ( 按次序 ， 各序列中之加下劃線的部分為 LCDR1 、 LCDR2 及 LCDR3 )
Figure 02_image047
Figure 02_image049
表 11 . 抗體 hIgG - 38 之胺基酸序列
HCDR1 GYTFTKYH SEQ ID NO: 65
HCDR2 IYPGSSTS SEQ ID NO: 3
HCDR3 VKNDN SEQ ID NO: 66
LCDR1 ESVDNYGISF SEQ ID NO: 5
LCDR2 AAS SEQ ID NO: 6
LCDR3 HQSKEVPYT SEQ ID NO: 7
VH (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYH INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 67
VL (CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISF MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIK SEQ ID NO: 17
重鏈胺基酸序列(IgG4) (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYH INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 45
輕鏈胺基酸序列(CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISF MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC    SEQ ID NO: 53
表 12 . 抗體 hIgG - 44 之胺基酸序列
HCDR1 GYTFTKYW SEQ ID NO: 14
HCDR2 IYPGSSTS SEQ ID NO: 3
HCDR3 VKNDN SEQ ID NO: 68
LCDR1 ESVDNQGTSY SEQ ID NO: 69
LCDR2 AAS SEQ ID NO: 6
LCDR3 HQSKEVPYT SEQ ID NO: 7
VH (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYW INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 16
VL (CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNQGTSY MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIK SEQ ID NO: 70
重鏈胺基酸序列(IgG4) (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYW INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 18
輕鏈胺基酸序列(CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNQGTSY MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 62
表 13 . 抗體 hIgG - 45 之胺基酸序列
HCDR1 GYTFTKYW SEQ ID NO: 14
HCDR2 IYPGSSTS SEQ ID NO: 3
HCDR3 VKNDN SEQ ID NO: 68
LCDR1 ESVDNSGTSY SEQ ID NO: 71
LCDR2 AAS SEQ ID NO: 6
LCDR3 HQSKEVPYT SEQ ID NO: 7
VH (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYW INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 16
VL (CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNSGTSY MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIK SEQ ID NO: 72
重鏈胺基酸序列(IgG4) (CDR序列為加下劃線的) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYW INWVRQAPGQGLEWMGIIYPGSSTS NYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKNDN WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 18
輕鏈胺基酸序列(CDR序列為加下劃線的) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNSGTSY MNWFQQKPGKAPKLLIYAAS DLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSKEVPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 63
包括公開案、專利、專利申請案及公開之專利申請案之本文所引用的各文獻全部以引用之方式併入本文中。
用於清楚理解之目的，儘管前述本發明已藉助於說明及實例較詳細地描述，但是熟習此項技術者顯而易知可實踐某些較小變化及修改。描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。編號實施例
不管隨附申請專利範圍，本發明闡述以下編號實施例：
1.      一種醫藥劑，其為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的促效劑，且其與α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的細胞外域結合。
2.      如實施例1之醫藥劑，其中該醫藥劑結合以下中之至少一者： α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的層連結蛋白結合域； α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的CALF-1域；以及 α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的CALF-2域。
3.      如實施例1之醫藥劑，其為α7β1整合素之促效劑且與該α7蛋白特異性結合。
4.      如實施例1之醫藥劑，其負限制條件為在向個體投與該醫藥劑時，該醫藥劑並不增加該個體之肌細胞中之α7蛋白的量。
5.      如實施例1至4中任一項之醫藥劑，其中該醫藥劑為抗體。
6.      如實施例5之醫藥劑，其中該抗體為單株抗體。
7.      如實施例5之醫藥劑，其中該抗體為多特異性抗體。
8.      如實施例7之醫藥劑，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體。
9.      如實施例5之醫藥劑，其中該抗體為人類、人類化或嵌合的。
10.    如實施例1之醫藥劑，其中該醫藥劑活化α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者。
11.    如實施例1之醫藥劑，其中該醫藥劑穩定α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的活性構形。
12.    如實施例3之醫藥劑，其中該醫藥劑並不與β1蛋白特異性結合。
13.    如實施例1至12中任一項之醫藥劑，其中該醫藥劑增加肌母細胞對分區蛋白之黏著力。
14.    如實施例13之醫藥劑，其中該肌母細胞為健康人類肌母細胞或健康鼠類肌母細胞。
15.    如實施例13之醫藥劑，其中該肌母細胞為人類肌母細胞或鼠類肌母細胞，該人類肌母細胞或該鼠類肌母細胞為以下中之至少一者：肌縮蛋白缺乏、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
16.    如實施例1至12中任一項之醫藥劑，其中該醫藥劑增加肌管對分區蛋白之黏著力。
17.    如實施例16之醫藥劑，其中該肌管為健康人類肌管或健康鼠類肌管。
18.    如實施例16之醫藥劑，其中該肌管為人類肌管或鼠類肌管，該人類肌管或該鼠類肌管為以下中之至少一者：肌縮蛋白缺乏、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
19.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成： (i)胺基酸序列SEQ ID NO : 10 或SEQ ID NO : 1 ； (ii)SEQ ID NO : 10 或SEQ ID NO : 1 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸；或 (iii)SEQ ID NO : 24 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
20.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含SWWP (SEQ ID NO : 25 )。
21.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。
22.    如實施例20或21之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之5-10個或10-15個胺基酸。
23.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與包含SEQ ID NO : 24 之殘基R958、M976、S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。
24.    如實施例23之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO : 24 之6-10個或10-15個胺基酸。
25.    如實施例20至24中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基係連續的。
26.    如實施例20至24中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基係不連續的。
27.    如實施例20至26中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含重鏈可變(VH)區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；以及輕鏈可變(VL)區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3， (i)其中該HCDR3包含SEQ ID NO : 15 ；及/或其中該LCDR3包含SEQ ID NO : 7 ； (ii)其中該HCDR3包含SEQ ID NO : 66 ；及/或其中該LCDR3包含SEQ ID NO : 7 ；或 (iii)其中該HCDR3包含SEQ ID NO : 68 ；及/或其中該LCDR3包含SEQ ID NO : 7 。
28.    如實施例27之抗體或抗體片段，其中該HCDR2包含SEQ ID NO : 3 ；及/或其中該LCDR2包含SEQ ID NO : 6 。
29.    如實施例27或28之抗體或抗體片段， (i)其中該HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO : 5 ； (ii)其中該HCDR1包含SEQ ID NO : 65 ；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO : 5 ； (iii)其中該HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO : 69 ；或 (iv)其中該HCDR1包含SEQ ID NO : 14 ；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO : 71 。
30.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區， 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
31.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區， 其中該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； 其中該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或 其中該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
32.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： (i)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 2 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 4 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1 LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； (ii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 15 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； (iii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 65 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 66 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 5 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； (iv)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 69 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或 (v)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14 之HCDR1、SEQ ID NO : 3 之HCDR2及SEQ ID NO : 68 之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 71 之LCDR1、SEQ ID NO : 6 之LCDR2及SEQ ID NO : 7 之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
33.    如實施例30之抗體或抗體片段，其中該VH區胺基酸序列包含 (i)SEQ ID NO : 8 ，或與SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii)SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (iii)SEQ ID NO : 67 ，或與SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
34.    如實施例31之抗體或抗體片段，其中該VL區胺基酸序列包含 (i)SEQ ID NO : 9 ，或與SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii)SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iii)SEQ ID NO : 70 ，或與SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (iv)SEQ ID NO : 72 ，或與SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
35.    如實施例32之抗體或抗體片段，其中 (i)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 8 ，或與SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 9 ，或與SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 67 ，或與SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 17 ，或與SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iv)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 70 ，或與SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (v)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 16 ，或與SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO : 72 ，或與SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列 至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
36.    一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體包含重鏈及輕鏈， (i)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 19 ； (ii)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 45 ，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 53 ； (iii)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 62 ；或 (iv)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 18 ，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO : 63 。
37.    如實施例30至36中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白特異性結合。
38.    如實施例30至37中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，α7蛋白之該抗原決定基包含以下胺基酸序列、基本上由以下胺基酸序列組成或由以下胺基酸序列組成： (i)SEQ ID NO: 10 ； (ii)SEQ ID NO: 10 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸；或 (iii)SEQ ID NO: 24 之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
39.    如實施例1至18中任一項之醫藥劑或如實施例19至38中任一項之抗體或抗體片段，其中該α7β1整合素為人類α7β1整合素。
40.    如實施例19至39中任一項之抗體片段，其中該抗體片段為Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、單域抗體、雙功能抗體或單鏈駱駝科抗體。
41.    一種經分離之核酸分子，其編碼如實施例30至40中任一項之抗體或抗體片段。
42.    一種表現載體，其包含如實施例41之核酸分子。
43.    如實施例42之表現載體，其中該核酸分子以操作方式連接至適用於在宿主細胞中表現核酸區段之調節序列。
44.    一種重組宿主細胞，其包含如實施例42或43之表現載體。
45.    一種用於產生作為α7β1整合素之促效劑的抗體或抗體片段之方法，該方法包含：在有效表現該核酸分子以產生作為α7β1整合素之促效劑的該抗體或該抗體片段之條件下培養包含如實施例42或43之表現載體的重組宿主細胞。
46.    一種醫藥組合物，其包含：如實施例1至18中任一項之醫藥劑或如實施例19至40中任一項之抗體或抗體片段，及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
47.    如實施例46之醫藥組合物，其進一步包含作為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者之促效劑的另一醫藥劑。
48.    一種治療個體之病症或疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如實施例1至19中任一項之醫藥劑或如實施例19至40中任一項之抗體或抗體片段，由此治療該個之該病症或該疾病； 其中該病症或該疾病之特徵在於以下中之一或多者： 該個體中α7β1整合素之功能障礙； 該個體之肌縮蛋白缺乏； 該個體之肌縮蛋白突變； 該個體之非功能肌縮蛋白；或 除α7β1功能障礙，或肌縮蛋白缺乏、突變或非功能以外的肌肉功能障礙。
49.    如實施例48之方法，其中該肌肉功能障礙係由以下中之一或多者引起或與以下中之一或多者相關：癌症、充血性心臟衰竭、慢性阻塞性肺病、慢性腎病、HIV感染/AIDS、神經性厭食症、貪食症、營養不良、暴露、噁心、I型糖尿病、II型糖尿病、代謝症候群、惡病體質、貧血症、心衰竭、高血壓、橫紋肌溶解症、敗血症、肌肉減少症、身體活動少、由於過量身體活動引起之損傷、低體溫症、體溫過高、損傷、去神經、肌肉萎縮性側索硬化、多發性硬化、脊髓性肌萎縮、酒精相關之肌病、燒傷相關之肌病、中風、類固醇療法或類固醇療法之停藥、皮肌炎、格-巴二氏症候群、神經病變、骨關節炎、感染、脊髓灰質炎、多發性肌炎、炎症、類風濕性關節炎、低膽固醇血症、電損傷、熱中風、長期不活動、肢體缺少血流或接觸毒液。
50.    如實施例48之方法，其中該疾病為肌肉萎縮病。
51.    如實施例50之方法，其中該肌肉萎縮病為肌肉營養不良。
52.    如實施例51之方法，其中該肌肉營養不良為杜氏肌肉營養不良(DMD)、貝氏肌肉營養不良、1A型分區蛋白缺乏之先天性肌肉營養不良或肢帶型肌肉營養不良。
53.    如實施例49之方法，其進一步包含鑑別患有肌肉功能障礙之個體。
54.    如實施例50之方法，其進一步包含鑑別患有肌肉萎縮病之個體。
55.    如實施例49至54中任一項之方法，其中該投與逆轉、穩定或減緩該個體之肌肉萎縮或肌肉功能障礙。
56.    如實施例49至54中任一項之方法，其中該投與改善該個體之肌肉功能。
57.    如實施例49至54中任一項之方法，其中該投與並不惡化該個體之肌肉功能。
58.    如實施例49至54中任一項之方法，其進一步包含在該投與步驟之後量測該個體之肌肉功能，其中肌肉功能之惡化速率降低。
59.    如實施例50至52及54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效上調該個體中α7β1整合素之活性及/或量，從而有效治療該個體之α7β1整合素之該功能障礙。
60.    如實施例50至52及54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效上調該個體中α7β1整合素之活性及/或量，該個體中α7β1整合素之上調的活性及/或量至少部分地有效緩解以下中之至少一者的影響：該個體之肌縮蛋白缺乏；該個體之肌縮蛋白突變；或該個體之非功能肌縮蛋白。
61.    如實施例49至54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效緩解該個體之肌肉損傷。
62.    如實施例49至54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效緩解該個體之離心肌肉損傷。
63.    如實施例49至54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效改善該個體之隔膜肌肉功能。
64.    如實施例49至54中之任一項之方法，其進一步包含向該個體投與一或多種其他療法，該一或多種其他療法針對肌肉營養不良或肌肉萎縮。
65.    如實施例49至54中任一項之方法，其中該一或多種其他療法包含以下中之一或多者：抗驚厥劑；免疫抑制劑；抗生素；奎寧；用於控制充血性心臟衰竭之療法；基因替代療法；外顯子跳過療法；無意義抑制療法；使用經工程改造之核酸酶之療法；使用肌肉前驅細胞或幹細胞之細胞療法；肌營養相關蛋白之上調；抗炎性療法；抗纖維化療法；類固醇療法；肌肉抑制素阻斷劑；胰島素生長因子；磷酸二酯酶-5抑制劑；ACE抑制劑；經由遞送血管內皮生長因子(VEGF)誘導血管生成；1型VEGF誘鉺受體(VEGFR-1或Flt-1)之下調；物理療法；職能治療法；外科手術；矯正干預；言語療法；呼吸療法；心房脈動產生器；以及呼吸輔助裝置。
66.    一種活化個體之肌細胞中之α7β1整合素的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之如實施例1至18中任一項之醫藥劑或如實施例19至40中任一項之抗體或抗體片段，由此活化該個體之肌細胞中之α7β1整合素。
67.    一種增強α7β1整合素與其配位體在個體之肌細胞中之結合的方法，該方法包含： 向該個體投與治療有效量之如實施例1至18中任一項之醫藥劑或如實施例19至40中任一項之抗體或抗體片段，由此增強α7β1整合素與其配位體在該個體之肌細胞中之結合。
68.    一種如實施例1至18中任一項之醫藥劑或如實施例19至40中任一項之抗體或抗體片段的用途，其用於製造用以治療個體之特徵在於α7β1整合素功能障礙之病症或疾病的藥劑。
圖 1 為展示藉由β1促效劑抗體(TS2/16)之整合素β1蛋白活化促進人類肌母細胞黏著至分區蛋白(層連結蛋白)之圖式。「DMD」係指缺乏肌縮蛋白、在肌縮蛋白中具有突變或非功能肌縮蛋白之肌母細胞。
圖 2 為展示藉由β1促效劑抗體(TS2/16)之整合素β1蛋白活化促進人類肌管黏著至分區蛋白(層連結蛋白)之圖式。「DMD」係指缺乏肌縮蛋白、在肌縮蛋白中具有突變或非功能肌縮蛋白之肌母細胞。
圖 3 為展示如藉由FACS分析所量測之肌母細胞表現多個層連結蛋白整合素(α3β1；α6β1；α7β1及α6β4)之一系列圖式。
圖 4 為展示如藉由FACS分析所量測至肌管細胞表現多個層連結蛋白整合素(α3β1；α6β1；α7β1及α6β4)至一系列圖式。
圖 5 為展示藉由β1促效劑抗體(TS2/16)之整合素α7β1雜二聚體活化促進人類肌管黏著至分區蛋白(層連結蛋白)之圖式。「抗a3+a6」係指針對α3β1及α6β1之抑制性抗體之組合。「抗a3+a6+a7」係指針對α3b1、α6β1及α7β1之抑制性抗體之組合。「DMD」係指缺乏肌縮蛋白、在肌縮蛋白中具有突變或非功能肌縮蛋白之肌管。
圖 6 展示描繪在分化之後五天C2C12細胞之肌管形成的顯微照片。
圖 7 為展示在用對照siRNA或肌縮蛋白靶向的siRNA處理之C2C12鼠類細胞中如藉由定量PCR (QPCR)所量測之肌縮蛋白之相對表現的圖式。
圖 8A 為展示藉由β1促效劑抗體(TS2/16)之整合素β1蛋白活化促進鼠類肌管黏著至經對照siRNA或肌縮蛋白靶向的siRNA處理之C2C12鼠類肌管細胞中之層連結蛋白。
圖 8B 為展示在藉由TS2/16刺激時，與層連結蛋白之黏著主要係由α7β1整合素貢獻的圖式。「抗a3+a6」係指針對α3β1及α6β1之抑制性抗體之組合。「抗a3+a6+a7」係指針對α3β1、α6β1及α7β1之抑制性抗體之組合。「DMD(KD)」係指經肌縮蛋白靶向的siRNA處理之肌管細胞。Mn2+用作泛整合素活化劑以達至可達成之與分區蛋白之細胞黏著的最大水準。
圖 9 為產生且表徵與整合素α7β1蛋白結合之單株抗體的方法之示意圖。
圖 10A 為展示兩種活化抗體(M10、M25)及一種阻斷抗體(M20)對α7β1整合素之活性的固相結合分析結果的圖式。
圖 10B 為展示兩種活化抗體(M10、M25)及一種阻斷抗體(M20)對α7β1整合素之活性的細胞黏著分析結果的圖式。
圖 10C 為展示分析M10及M25抗體以及β1促效劑抗體(TS2/16)與含β1整合素之結合的直接ELISA之結果的一系列圖式。
圖 11A 為展示抗體M36及M38與表現α7β1整合素之細胞表面結合的一系列圖式。測試K562/模擬物(經對照空載體轉染)、K562 α7X2 (經編碼整合素α7X2 cDNA之質體轉染)及C2C12細胞之M36、M38及α7 (3C12)之結合。3C12為整合素α7之陽性對照抗體。
圖 11B 為展示抗體M36及M38與人類及鼠類α7β1整合素(Hu_a7b1及Mu_a7b1)選擇性結合的一系列圖式，與人類α6β1 (Hu_a6b1)或α5β1 (Hu_a5b1)整合素相對。
圖 12A 為整合素α7蛋白結構及其域之圖。此圖亦描繪在整合素α7蛋白之細胞外域中發現之可變區序列X1 (SEQ ID NO : 1 )及X2 (SEQ ID NO : 10 )。
圖 12B 為展示抗體M36及M38與表現α7β1整合素之X2形式之細胞表面結合的一系列圖式。將經人類整合素α7X1或α7X2 cDNA穩定轉染之K562細胞株命名為K562/Hu_a7X1或K562/Hu_a7X2。
圖 13A 為展示抗體M36及M38增強整合素α7β1 (K562/a7X2)與人類層連結蛋白211 (LN211)之細胞黏著的圖式。TS2/16為β1促效劑抗體。M35為對與層連結蛋白之黏著無影響之對照抗體。
圖 13B 為展示抗體M36及M38增強小鼠肌管(其中肌縮蛋白已阻斷(KD))與層連結蛋白之黏著的圖式。
圖 14 為展示抗體M36及M38將整合素α7β1轉化成活性構形之圖式。單株抗體9EG7偵測到β1整合素活化。使用不同陽離子調節抗體處理之前的整合素構形(活性較小(Mg2+ 1mM)及活性(Mn2+ 0.125mM))。
圖 15 為展示VL3VHK20TFT單株抗體與經整合素次單位α7 (ITGA7)及整合素β1 (ITGB1)共轉染之細胞結合的一系列圖式。3C12、6A11、A1-1a M20及A1-1a M24為與IGTA7結合之陽性對照抗體。此等抗體描述於表4中。各單株抗體之最佳篩選濃度藉由方框框出。
圖 16 為展示VL3VHK20TFT Fab與經整合素次單位α7 (ITGA7)及整合素β1 (ITGB1)共轉染之細胞結合的一系列圖式。Fab之最佳篩選濃度藉由方框框出。
圖 17 為展示VL3VHK20TFT Fab與經ITGA7突變體之丙胺酸掃描庫共轉染之細胞庫之結合的圖式。
圖 18 為展示VL3VHK20TFT Fab與整合素次單元α7結合之關鍵殘基的晶體結構模型。關鍵殘基展示為紅色球。二級殘基展示為藍色球。
圖 19 為展示來自實例 4 之結果的圖式，以各種濃度之VL3VHK20 TFT；0.25 µg/mL人類整合素α7β1；1:1結合。
圖 20 為展示來自實例 4 之結果的圖式，以各種濃度之VLVH；0.25 µg/mL人類整合素α7β1；1:1結合。
圖 21A 為展示來自實例 4 之結果的圖式，以各種濃度之VL3VHK20 TFT；0.25 µg/mL小鼠整合素α7β1；1:1結合。
圖 21B 為展示來自實例 4 之結果的圖式，以各種濃度之VLVH；0.25 µg /mL小鼠整合素α7β1；1:1結合。
圖 22A 為展示來自VL3VHK20TFT與表現整合素α7β1之細胞表面結合之實例 4 之結果的圖式。
圖 22B 為展示來自VL3VHK20TFT增強之人類α7β1-表現細胞與層連結蛋白黏著之實例 4 之結果的圖式。
圖 22C 為展示來自VL3VHK20TFT增強之鼠類α7β1-表現細胞與層連結蛋白黏著之實例 4 之結果的圖式。
圖 23 為展示來自針對鼠類抗體(VLVH)及人類化抗體(VL3VHK20TFT)增強型肌母細胞對層連結蛋白黏著之抗體濃度(以µg/mL為單位)對細胞指數(整合素α7β1介導之細胞黏著)的實例 5 之結果的圖式。
圖 24 為展示來自針對DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照、mdx/促效劑抗體(3 mg/kg)及mdx/促效劑抗體(15 mg/kg)之收縮對力(歸一化至初始收縮)的實例 6 之結果的圖式。
圖 25 為展示來自針對DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照、mdx/促效劑抗體(3 mg/kg)及mdx/促效劑抗體(15 mg/kg)之刺激頻率(以Hz為單位)對力(歸一化至肌肉寬度，mN/mm)的實例 7 之結果的圖式。
圖 26 為展示DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照及用M36促效劑抗體處理中之血清肌酸激酶(用於肌肉損傷之生物標記)之量的條形圖。
圖 27 為展示DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照及用M36促效劑抗體處理中之骨骼肌鈣蛋白(用於肌肉損傷之生物標記)之量的條形圖。
圖 28 為展示DBA2/IgG對照、mdx/IgG對照及用M36促效劑抗體處理中之O-羥脯胺酸(腓腸肌中之膠原蛋白形成/纖維化之量度)之量的條形圖。
圖 29 展示藉由位於抗體VL3VHK20TFT之重鏈CDR1及CDR2或輕鏈CDR1中之胺基酸上之位點突變誘發產生的各種序列變異體。YGISF：SEQ ID NO: 26 。GYTFTSYYMH：SEQ ID NO: 27 。QGTSY：SEQ ID NO: 28 。SGTSY：SEQ ID NO: 29 。RASQSISSYLN：SEQ ID NO: 30 。
圖 30 為展示藉由抗體序列變異體與細胞表面整合素α7β1結合的條形圖。藉由流式細胞測量術量測結合且歸一化為IgG4同型對照。
圖31為描繪α7β1整合素之細胞外區及其各種域的圖示。此類整合素之α鏈，例如，α3、α6及α7 (如圖所示)，包括四個細胞外域：七葉形β-螺旋槳、大腿及兩個小腿域(CALF-1及CALF-2)。大腿及小腿域具有類似的免疫球蛋白樣β-夾心摺疊。
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Claims (68)

  1. 一種醫藥劑，其為α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的促效劑，且其與α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的細胞外域結合。
  2. 如請求項1之醫藥劑，其中該醫藥劑結合以下中之至少一者： α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的層連結蛋白結合域； α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的CALF-1域；以及 α7蛋白、α6蛋白及α3蛋白中之至少一者的CALF-2域。
  3. 如請求項1之醫藥劑，其為α7β1整合素之促效劑且與該α7蛋白特異性結合。
  4. 如請求項1之醫藥劑，其負限制條件為在向個體投與該醫藥劑時，該醫藥劑並不增加該個體之肌細胞中之α7蛋白的量。
  5. 如請求項1至4中任一項之醫藥劑，其中該醫藥劑為抗體。
  6. 如請求項5之醫藥劑，其中該抗體為單株抗體。
  7. 如請求項5之醫藥劑，其中該抗體為多特異性抗體。
  8. 如請求項7之醫藥劑，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體。
  9. 如請求項5之醫藥劑，其中該抗體為人類、人類化或嵌合的。
  10. 如請求項1之醫藥劑，其中該醫藥劑活化α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者。
  11. 如請求項1之醫藥劑，其中該醫藥劑穩定α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素中之至少一者的活性構形。
  12. 如請求項3之醫藥劑，其中該醫藥劑並不與β1蛋白特異性結合。
  13. 如請求項1至12中任一項之醫藥劑，其中該醫藥劑增加肌母細胞對分區蛋白之黏著力。
  14. 如請求項13之醫藥劑，其中該肌母細胞為健康人類肌母細胞或健康鼠類肌母細胞。
  15. 如請求項13之醫藥劑，其中該肌母細胞為人類肌母細胞或鼠類肌母細胞，該人類肌母細胞或該鼠類肌母細胞為以下中之至少一者：肌縮蛋白缺乏、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
  16. 如請求項1至12中任一項之醫藥劑，其中該醫藥劑增加肌管對分區蛋白之黏著力。
  17. 如請求項16之醫藥劑，其中該肌管為健康人類肌管或健康鼠類肌管。
  18. 如請求項16之醫藥劑，其中該肌管為人類肌管或鼠類肌管，該人類肌管或該鼠類肌管為以下中之至少一者：肌縮蛋白缺乏、包含肌縮蛋白突變或包含非功能肌縮蛋白。
  19. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成： (i)胺基酸序列SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 1； (ii) SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 1之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸；或 (iii) SEQ ID NO: 24之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
  20. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，其中該抗原決定基包含SWWP (SEQ ID NO: 25)。
  21. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與包含SEQ ID NO: 24之殘基S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。
  22. 如請求項20或21之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 24之5-10個或10-15個胺基酸。
  23. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與包含SEQ ID NO: 24之殘基R958、M976、S977、W978、W979及P980的抗原決定基特異性結合。
  24. 如請求項23之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 24之6-10個或10-15個胺基酸。
  25. 如請求項20至24中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基係連續的。
  26. 如請求項20至24中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗原決定基係不連續的。
  27. 如請求項20至26中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含重鏈可變(VH)區，其包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；以及輕鏈可變(VL)區，其包含LCDR1、LCDR2及LCDR3， (i)其中該HCDR3包含SEQ ID NO: 15；及/或其中該LCDR3包含SEQ ID NO: 7； (ii)其中該HCDR3包含SEQ ID NO: 66；及/或其中該LCDR3包含SEQ ID NO: 7；或 (iii)其中該HCDR3包含SEQ ID NO: 68；及/或其中該LCDR3包含SEQ ID NO: 7。
  28. 如請求項27之抗體或抗體片段，其中該HCDR2包含SEQ ID NO: 3；及/或其中該LCDR2包含SEQ ID NO: 6。
  29. 如請求項27或28之抗體或抗體片段， (i)其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 14；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO: 5； (ii)其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 65；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO: 5； (iii)其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 14；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO: 69；或 (iv)其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 14；及/或其中該LCDR1包含SEQ ID NO: 71。
  30. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區， 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 4之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 15之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 65之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 66之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或 其中該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 68之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
  31. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區， 其中該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 5之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； 其中該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 69之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或 其中該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 71之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
  32. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體或該抗體片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中： (i)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 4之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 5之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1 LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； (ii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 15之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 5之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； (iii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 65之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 66之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 5之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體； (iv)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 68之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 69之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；或 (v)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之HCDR1、SEQ ID NO: 3之HCDR2及SEQ ID NO: 68之HCDR3，或在HCDR1、HCDR2及/或HCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 71之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3，或在LCDR1、LCDR2及/或LCDR3中具有5個或更少保守胺基酸取代之其變異體。
  33. 如請求項30之抗體或抗體片段，其中該VH區胺基酸序列包含 (i) SEQ ID NO: 8，或與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii) SEQ ID NO: 16，或與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (iii) SEQ ID NO: 67，或與SEQ ID NO: 67之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
  34. 如請求項31之抗體或抗體片段，其中該VL區胺基酸序列包含 (i) SEQ ID NO: 9，或與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii) SEQ ID NO: 17，或與SEQ ID NO: 17之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iii) SEQ ID NO: 70，或與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (iv) SEQ ID NO: 72，或與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
  35. 如請求項32之抗體或抗體片段，其中 (i)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 8，或與SEQ ID NO: 8之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 9，或與SEQ ID NO: 9之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 16，或與SEQ ID NO: 16之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 17，或與SEQ ID NO: 17之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iii)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 67，或與SEQ ID NO: 67之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 17，或與SEQ ID NO: 17之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iv)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 16，或與SEQ ID NO: 16之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 70，或與SEQ ID NO: 70之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (v)該VH區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 16，或與SEQ ID NO: 16之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；且該VL區胺基酸序列包含SEQ ID NO: 72，或與SEQ ID NO: 72之該胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
  36. 一種作為α7β1整合素之促效劑的單株抗體或其抗體片段，其中該抗體包含重鏈及輕鏈， (i)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 18，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 19； (ii)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 45，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 53； (iii)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 18，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 62；或 (iv)其中該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 18，且該輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 63。
  37. 如請求項30至36中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白特異性結合。
  38. 如請求項30至37中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或該抗體片段與α7蛋白之抗原決定基特異性結合，α7蛋白之該抗原決定基包含以下胺基酸序列、基本上由以下胺基酸序列組成或由以下胺基酸序列組成： (i) SEQ ID NO: 10； (ii) SEQ ID NO: 10之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸；或 (iii) SEQ ID NO: 24之5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或35-40個胺基酸。
  39. 如請求項1至18中任一項之醫藥劑或如請求項19至38中任一項之抗體或抗體片段，其中該α7β1整合素為人類α7β1整合素。
  40. 如請求項19至39中任一項之抗體片段，其中該抗體片段為Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、單域抗體、雙功能抗體或單鏈駱駝科抗體。
  41. 一種經分離之核酸分子，其編碼如請求項30至40中任一項之抗體或抗體片段。
  42. 一種表現載體，其包含如請求項41之核酸分子。
  43. 如請求項42之表現載體，其中該核酸分子以操作方式連接至適用於在宿主細胞中表現核酸區段之調節序列。
  44. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項42或43之表現載體。
  45. 一種用於產生作為α7β1整合素之促效劑的抗體或抗體片段之方法，該方法包含： 在有效表現該核酸分子以產生作為α7β1整合素之促效劑的該抗體或該抗體片段之條件下培養包含如請求項42或43之表現載體的重組宿主細胞。
  46. 一種醫藥組合物，其包含： 如請求項1至18中任一項之醫藥劑或如請求項19至40中任一項之抗體或抗體片段，以及 醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  47. 如請求項46之醫藥組合物，其進一步包含作為以下中之至少一者之促效劑的另一醫藥劑：α7β1整合素、α6β1整合素及α3β1整合素。
  48. 一種治療個體之病症或疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至19中任一項之醫藥劑或如請求項19至40中任一項之抗體或抗體片段，由此治療該個體之該病症或該疾病； 其中該病症或該疾病之特徵在於以下中之一或多者： 該個體中α7β1整合素之功能障礙； 該個體之肌縮蛋白缺乏； 該個體之肌縮蛋白突變； 該個體之非功能肌縮蛋白；或 除α7β1功能障礙，或肌縮蛋白缺乏、突變或非功能以外的肌肉功能障礙。
  49. 如請求項48之方法，其中該肌肉功能障礙係由以下中之一或多者引起或與以下中之一或多者相關：癌症、充血性心臟衰竭、慢性阻塞性肺病、慢性腎病、HIV感染/AIDS、神經性厭食症、貪食症、營養不良、暴露(exposure)、噁心、I型糖尿病、II型糖尿病、代謝症候群、惡病體質(cachexia)、貧血症、心衰竭、高血壓、橫紋肌溶解症(rhabdomyolysis)、敗血症、肌肉減少症(sarcopenia)、身體活動少(physical inactivity)、由於過量身體活動引起之損傷、低體溫症(hypothermia)、體溫過高(hyperthermia)、損傷、去神經(denervation)、肌肉萎縮性側索硬化、多發性硬化、脊髓性肌萎縮、酒精相關之肌病、燒傷相關之肌病、中風、類固醇療法或類固醇療法之停藥、皮肌炎、格-巴二氏症候群(Guillain-Barré syndrome)、神經病變、骨關節炎、感染、脊髓灰質炎、多發性肌炎、炎症、類風濕性關節炎、低膽固醇血症、電損傷、熱中風、長期不活動、肢體缺少血流或接觸毒液。
  50. 如請求項48之方法，其中該疾病為肌肉萎縮病。
  51. 如請求項50之方法，其中該肌肉萎縮病為肌肉營養不良。
  52. 如請求項51之方法，其中該肌肉營養不良為杜氏肌肉營養不良(Duchenne muscular dystrophy；DMD)、貝氏肌肉營養不良(Becker muscular dystrophy)、1A型分區蛋白缺乏之先天性肌肉營養不良或肢帶型肌肉營養不良。
  53. 如請求項49之方法，其進一步包含鑑別患有肌肉功能障礙之個體。
  54. 如請求項50之方法，其進一步包含鑑別患有肌肉萎縮病之個體。
  55. 如請求項49至54中任一項之方法，其中該投與逆轉、穩定或減緩該個體之肌肉萎縮或肌肉功能障礙。
  56. 如請求項49至54中任一項之方法，其中該投與改善該個體之肌肉功能。
  57. 如請求項49至54中任一項之方法，其中該投與並不惡化該個體之肌肉功能。
  58. 如請求項49至54中任一項之方法，其進一步包含在該投與步驟之後量測該個體之肌肉功能，其中肌肉功能之惡化速率降低。
  59. 如請求項50至52及54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效上調該個體中α7β1整合素之活性及/或量，從而有效治療該個體之α7β1整合素之該功能障礙。
  60. 如請求項50至52及54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效上調該個體中α7β1整合素之活性及/或量，該個體中α7β1整合素之上調的活性及/或量至少部分地有效緩解以下中之至少一者的影響： 該個體之該肌縮蛋白缺乏； 該個體之肌縮蛋白之該突變；或 該個體之該非功能肌縮蛋白。
  61. 如請求項49至54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效緩解該個體之肌肉損傷。
  62. 如請求項49至54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效緩解該個體之離心肌肉損傷。
  63. 如請求項49至54中任一項之方法，其中向該個體投與該治療有效量之該醫藥劑有效改善該個體之隔膜肌功能。
  64. 如請求項49至54中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與一或多種其他療法，該一或多種其他療法針對肌肉營養不良或肌肉萎縮。
  65. 如請求項49至54中任一項之方法，其中該一或多種其他療法包含以下中之一或多者：抗驚厥劑；免疫抑制劑；抗生素；奎寧；用於控制充血性心臟衰竭之療法；基因替代療法；外顯子跳過療法；無意義抑制療法；使用經工程改造之核酸酶之療法；使用肌肉前驅細胞或幹細胞之細胞療法；肌營養相關蛋白(utrophin)之上調；抗炎性療法；抗纖維化療法；類固醇療法；肌肉抑制素阻斷劑；胰島素生長因子；磷酸二酯酶-5抑制劑；ACE抑制劑；經由遞送血管內皮生長因子(VEGF)誘導血管生成；1型VEGF誘鉺受體(VEGFR-1或Flt-1)之下調；物理療法；職能治療法；外科手術；矯正干預；言語療法；呼吸療法；心房脈動產生器；以及呼吸輔助裝置。
  66. 一種活化個體之肌細胞中之α7β1整合素的方法，該方法包含： 向該個體投與治療有效量之如請求項1至18中任一項之醫藥劑或如請求項19至40中任一項之抗體或抗體片段，由此活化該個體之肌細胞中之α7β1整合素。
  67. 一種增強α7β1整合素與其配位體在個體之肌細胞中之結合的方法，該方法包含： 向該個體投與治療有效量之如請求項1至18中任一項之醫藥劑或如請求項19至40中任一項之抗體或抗體片段，由此增強α7β1整合素與其配位體在該個體之肌細胞中之結合。
  68. 一種如請求項1至18中任一項之醫藥劑或如請求項19至40中任一項之抗體或抗體片段的用途，其用於製造用以治療個體之特徵在於α7β1整合素功能障礙之病症或疾病的藥劑。
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