WO2015125922A1 - 抗ｒａｎｋｌ抗体 - Google Patents

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WO2015125922A1
WO2015125922A1 PCT/JP2015/054806 JP2015054806W WO2015125922A1 WO 2015125922 A1 WO2015125922 A1 WO 2015125922A1 JP 2015054806 W JP2015054806 W JP 2015054806W WO 2015125922 A1 WO2015125922 A1 WO 2015125922A1
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amino acid
acid sequence
rankl
antibody
seq
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雅 本間
洋史 鈴木
嘉顕 苅谷
円香 林
祐樹 池淵
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国立大学法人東京大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an anti-RANKL antibody that acts on both activation of osteoblasts and inhibition of formation of mature osteoclasts, and a pharmaceutical composition containing the same.
  • the bone mass in the living body is maintained constant by the coordinated bone resorption by osteoclasts and bone formation by osteoblasts (bone remodeling).
  • Osteoporosis is a pathological condition in which the bone density is excessively decreased due to the breakdown of the balance between the two, and fractures such as vertebral bodies and femurs resulting from this cause a serious decrease in patient QOL.
  • Bisphosphonates and RANKL neutralizing antibodies (denosumab) which are currently widely used osteoporosis treatments, restore bone mass by strongly suppressing enhanced bone resorption, but this is also coupled with bone resorption. As a result, the bone formation that occurs is suppressed, and the total turnover of the bone is reduced.
  • Osteoporosis and other bone metabolism-related diseases associated with bone destruction are caused by excessive activation of osteoclasts, which have been conventionally performed by ligand molecules expressed in osteoblasts or bone marrow stromal cells.
  • RANK NF- ⁇ B
  • RANKL NF- ⁇ B
  • RANK NF- ⁇ B
  • RANKL-RANK signal pathway which is a receptor molecule expressed in bone marrow macrophages that are osteoclasts or their precursor cells
  • Non-Patent Documents 6 and 7 the physiological role of RANKL molecules (present as homotrimers) expressed in osteoblasts has become unclear.
  • an object of the present invention is to provide a new therapeutic agent for bone metabolism-related diseases.
  • the osteoclast is a membrane vesicle exosome containing RANK in the maturation process (OC exosome), and (2) the exosome binds to RANKL expressed on the surface of osteoblasts, whereby a signal is input into the osteoblast, activation of the PI3K-Akt-mTORC1 pathway, As a result of the promotion of Runx2 nuclear translocation downstream, it has been found that the osteogenic ability of osteoblasts increases.
  • osteoblasts A bifunctional anti-RANKL that not only activates osteoblasts but also inhibits RANKL binding to RANK expressed in osteoclast precursor cells and suppresses the formation of mature osteoclasts
  • the antibody was found to be present. Further, the present inventors have found that the antibody has an action of activating osteoblasts to promote bone formation and inhibiting bone resorption by inhibiting the formation of mature osteoclasts, and thus completed the present invention.
  • the present invention provides the following [1] to [16].
  • An anti-RANKL antibody that binds to the RANKL extracellular domain and exhibits osteoblast activation ability by crosslinking two or more RANKL trimers, and at the same time inhibits the binding of RANKL to RANKL.
  • An anti-RANKL antibody or a functional fragment thereof exhibiting the ability to inhibit the formation of mature osteoclasts.
  • the chain CDR1 is composed of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 28 to 32 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is selected from SEQ ID NOs: 33 to 43 or the amino acid sequence It consists of an amino acid sequence having a homology of 85% or more.
  • Anti-RANKL antibody, or functional fragment thereof according to any one of those having the amino acid sequence or the amino acid sequence and amino acid sequence having 85% or more homology Bareru [1] to [3].
  • [6] The anti-RANKL antibody or the functional fragment thereof according to any one of [1] to [5], wherein the functional fragment is selected from Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, and Fv.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-RANKL antibody or a functional fragment thereof according to any one of [1] to [7].
  • the pharmaceutical composition according to [8] which is a prophylactic / therapeutic agent for abnormal bone metabolism.
  • the bone metabolism abnormality is a disease selected from osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, bone destruction associated with gastric metastasis of cancer, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and relapsing polychondritis
  • the anti-RNAKL antibody or the functional fragment thereof according to any one of [1] to [7] for preventing or treating abnormal bone metabolism.
  • Bone metabolism disorder is a disease selected from osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, bone destruction associated with gastric metastasis of cancer, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and relapsing polychondritis
  • the described anti-RANKL antibody or a functional fragment thereof are used to any one of [1] to [7] for the manufacture of a drug for preventing or treating bone metabolism abnormality.
  • Bone metabolic disorder is a disease selected from osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, bone destruction associated with cancer gastric metastasis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and relapsing polychondritis [13] Use of description. [15] A method for preventing or treating a bone metabolism disorder, comprising administering an effective amount of the anti-RANKL antibody or the functional fragment thereof according to any one of [1] to [7].
  • Bone metabolism disorder is a disease selected from osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, bone destruction associated with gastric metastasis of cancer, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and relapsing polychondritis [15] The method described.
  • the anti-RANKL antibody or functional fragment thereof of the present invention has a function of blocking a conventionally known RANKL-RANK signal pathway, and not only suppresses bone resorption by suppressing the formation of mature osteoclasts.
  • a completely different pathway ie, when RANKL on the OC exosome secreted from osteoclasts binds to RANKL on the osteoblast surface, two or more molecules of RANKL on the osteoblast surface. It also acts on the RANKL osteoblast signal transduction pathway, which was found by bridging the body and inputting an osteoblast activation signal, and simultaneously shows the effect of promoting osteogenesis by osteoblasts . Therefore, it is useful as a novel preventive / therapeutic agent for bone metabolism abnormality exhibiting a stable bone formation effect without losing the balance of bone remodeling, unlike the conventional therapeutic agent for diseases caused by bone metabolism abnormality.
  • the examination result of the osteoblast activation effect (in vitro) by the RANK-Fc recombinant protein immobilized on polystyrene beads is shown.
  • the evaluation of the inhibitory effect of mature osteoclast formation by scFv recombinant protein (in vitro) is shown.
  • the evaluation of the osteoblast activation effect by scFv recombinant protein (in vitro) is shown.
  • the evaluation of the effect on bone resorption and bone formation by administration of scFv recombinant protein (in vivo) is shown.
  • the evaluation (in ⁇ vitro) of the inhibitory effect of mature osteoclast formation by lgG2 full-length recombinant protein is shown.
  • the evaluation (in ⁇ vitro) of the osteoblast activation effect by lgG2 full length recombinant protein is shown.
  • the binding and affinity measurement results for the human RANKL extracellular domain are shown.
  • the evaluation (in ⁇ vitro) of the inhibitory effect of mature osteoclast formation by IgG2 full-length recombinant protein is shown.
  • RANKL reverse signal input ability to human osteoblasts is shown.
  • the evaluation of the effect on bone resorption and bone formation by administration of human full-length IgG2 recombinant protein of clone 15 is shown (in vivo).
  • the anti-RANKL antibody of the present invention is an anti-RANKL antibody that binds to the RANKL extracellular domain, crosslinks two or more RANKL trimers, exhibits osteoblast activation ability, and binds RANKL to RANK. Inhibits and has the ability to inhibit mature osteoclast formation.
  • the unique anti-RANKL antibody of the present invention is based on conventional knowledge, that is, (a) RANKL-RANK signal transduction starting from the binding of RANKL expressed in osteoblasts and RANK (receptor molecule) expressed in osteoclasts.
  • the concept of intercellular contact and (b) the concept that bone cells, not osteoblasts, are the source of RANKL are completely unpredictable. That is, (1) RANK contained in the OC exosome secreted from mature osteoclasts binds to RANKL on the surface of osteoblasts, and a signal is input into osteoblasts, resulting in osteoblast activity. Unless there is a finding that crystallization is stimulated and (2) activation of the osteoblast is triggered by the cross-linking of two or more RANKL trimers on the osteoblast surface, Anti-RANKL antibodies are unpredictable.
  • the RANKL extracellular domain as a site to which the antibody of the present invention binds is already known, and is described in, for example, J. Biol. Chem. 2002, Feb22, (277 (8): 6631-6636 (Non-patent Document 8). ing.
  • the binding site may be any site that can bind to RANK in the extracellular domain, since the antibody can inhibit binding to RANK.
  • the antibody binds to two or more. In view of the need to crosslink the RANKL trimer, the tip portion or its periphery is preferred.
  • the antibody of the present invention also crosslinks two or more RANKL trimers.
  • Anti-RANKL antibody which reacts only with one RANKL trimer, does not stimulate activation in osteoblasts when bound to RANKL molecules on the surface of osteoblasts. Does not show any promoting action.
  • denosumab which is a conventional RANKL neutralizing antibody, suppresses bone formation is thought to be due to this lack of action.
  • Cross-linking of two or more RANKL trimers by an anti-RANKL antibody can be confirmed by, for example, activating the RANKL osteoblast signal transduction pathway using mouse osteoblast cell line ST2.
  • the anti-RANKL antibody of the present invention has an ability to activate osteoblasts and an ability to suppress mature osteoclast formation.
  • the osteoblast activation ability can be determined by measuring one or more of the stimulus transmission mechanisms in the osteoblast. That is, RANKL intracellular signal begins with the interaction between RANKL intracellular domain proline-rich motif (PRM) and Src family kinase (SFKs), and then the nuclear translocation of Runx2 through the activation of PI3K-Akt-mTORC1 pathway. Promotes bone formation as a result. Therefore, the increase in activity in any of these steps may be measured.
  • PRM RANKL intracellular domain proline-rich motif
  • SFKs Src family kinase
  • Akt phosphorylation of Akt
  • S6K1 phosphorylation of S6K1
  • the mature osteoclast formation inhibitory ability may be measured by measuring one or more of the expression level or activity increase of the marker molecule of mature osteoclasts. It is known that TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) activity is markedly increased with differentiation from osteoclast precursor cells to mature osteoclasts, and the TRAP produced after RANKL stimulation is applied to osteoclast precursor cells. What is necessary is just to examine the inhibitory ability with respect to the induction
  • the anti-RANKL antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned characteristics, but it is particularly preferable that the complementarity determining region (CDR) has the following amino acid sequence.
  • the heavy chain CDR1 is composed of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence, and the heavy chain CDR2 is selected from SEQ ID NOs: 5 to 15 or the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR3 comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16 to 27 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR1 comprises An amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 28 to 32 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence, and the light chain CDR2 is 85% or more with the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 33 to 43 or the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is selected from SEQ ID NOs
  • amino acid sequence or the amino acid sequence and amino acid sequence having 85% or more homology are preferred.
  • the homology in each amino acid sequence is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more.
  • one to several amino acids in the amino acid sequence consisting of SEQ ID NOs: 1 to 54 were deleted, substituted and / or added to the antibody consisting of an amino acid sequence having 85% or more homology in each amino acid sequence.
  • Those having an amino acid sequence are included.
  • “several” is preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • the homology of amino acid sequences means the identity.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 16 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 33 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 44, or 85% or more homology with the amino acid sequence
  • Anti-RANKL antibody comprising an amino acid sequence having.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 17 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 34 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 45, or 85% or more homology with the amino acid sequence
  • Anti-RANKL antibody comprising an amino acid sequence having.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 18 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 35 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 46, or 85% or more homology with the amino acid sequence
  • Anti-RANKL antibody comprising an amino acid sequence having.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 47 or 85% or more homology with the amino acid sequence
  • Anti-RANKL antibody comprising an amino acid sequence having.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 20 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 37 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 48, or 85% or more homology with the amino acid sequence Anti-RANKL antibody comprising an amino acid sequence having.
  • Heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 21 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 38 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 23 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 40 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • Heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 13 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 41 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 42 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 53 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 15 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 26, or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 43 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 54 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 42 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 53 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 27 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 42 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 53 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 15 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 26, or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 43 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 54 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • Heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 42 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 53 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 42 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 53 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence and 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 42 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 53 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR1 is composed of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 is composed of amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 18 or the amino acid sequence is 85%
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR3 is the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 47 or the amino acid sequence and 85% or more Anti-RANKL antibody consisting of an amino acid sequence having the same sex.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the heavy chain CDR2 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence and 85% An amino acid sequence consisting of the amino acid sequence having the above homology
  • the heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the light chain CDR2 is composed of the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence
  • the anti-RANKL antibody of the present invention is more preferably the following antibody from the viewpoint of binding affinity to the domain of RANKL cells and stability as an antibody protein.
  • the heavy chain CDR1 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence.
  • the heavy chain CDR2 consists of amino acid sequence 2 consisting of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence.
  • the heavy chain CDR3 consists of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence.
  • the light chain CDR1 is more preferably composed of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 31 and 32, or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence and 85% or more.
  • the light chain CDR2 is more preferably composed of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence.
  • the light chain CDR3 is more preferably composed of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 47 or an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence.
  • the homology of each amino acid sequence is more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more.
  • the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • natural antibodies chimeric antibodies that can be produced using gene recombination techniques, humanized antibodies or single-chain antibodies, human antibodies that can be produced using human antibody-producing transgenic animals, and the like are included. It is not limited.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. In view of ease of purification, etc., IgG is preferable, and IgG1 and IgG2 are more preferable.
  • Functional fragments include low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments) and modified antibodies.
  • specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv and the like.
  • genes encoding these antibody fragments are constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al.). al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A.,. Methods Enzymol.
  • the antibody of the present invention may also be a humanized antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and a human antibody heavy chain, light chain constant region.
  • a humanized antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and a human antibody heavy chain, light chain constant region.
  • Such an antibody can be obtained by ligating DNA encoding the variable region of a mouse antibody with DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • This humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and is a non-human mammal, for example, a CDR of a mouse antibody transplanted to a CDR of a human antibody, and its general gene recombination technique is also known. It has been.
  • oligos were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP239400, International Patent Application Publication No. WO96). / 02576). As the FR of a human antibody linked through CDR, a complementarity determining region that forms a favorable antigen binding site is selected.
  • the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer). Res, 1993, 53, 851-856.).
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to form a desired human antibody having binding activity to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585).
  • WO96 / 34096, WO96 / 33735 ).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence to obtain a human antibody.
  • WO92 / 01047, WO92 / 20791, WO93 / 06213, WO93 / 11236, WO93 / 19172, WO95 / 01438, and WO95 / 15388 can be referred to.
  • two or more RANKL trimers are crosslinked to show osteoblast activation ability, and at the same time,
  • the antibody of the present invention can be obtained by selecting an antibody that inhibits the binding to RANK and has the ability to suppress the formation of mature osteoclasts. Such an antibody can be selected as described above.
  • the anti-RANKL antibody of the present invention or a functional fragment thereof has an action of promoting bone formation by osteoblasts and suppressing bone resorption by inhibiting osteoclast formation, and causes excessive suppression of bone remodeling. And has a stable bone forming action. Therefore, the anti-RANKL antibody of the present invention or a functional fragment thereof is useful as a preventive or therapeutic agent for various abnormal bone metabolism.
  • Bone metabolic abnormalities include osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, cancerous hypercalcemia, bone destruction associated with multiple myeloma and cancer bone metastasis, giant cell tumor, osteopenia, periodontitis Loss, osteolysis around artificial joints, bone destruction in chronic osteomyelitis, Paget's disease of the bones, renal osteodystrophy, and osteogenesis imperfecta, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, relapsing polychondritis And cartilage abnormalities.
  • it is particularly useful for osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, and bone destruction associated with cancer bone transfer.
  • Osteoporosis includes postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, secondary osteoporosis due to the use of therapeutic agents such as steroids and immunosuppressants, and osteoporosis associated with rheumatoid arthritis.
  • the pharmaceutical composition containing the anti-RANKL antibody of the present invention can be formulated by mixing, dissolving, emulsifying, encapsulating, lyophilizing, etc. with a pharmaceutically acceptable carrier well known in the art. .
  • a suitable formulation for oral administration is a solution in which the antibody of the present invention is dissolved in an effective amount in a diluent such as water or physiological saline, a capsule, granule, powder or powder containing an effective amount as a solid or granule. Tablets, suspensions in which an effective amount is suspended in an appropriate dispersion medium, and emulsions in which an effective amount is dissolved and dispersed in an appropriate dispersion medium.
  • the antibody of the present invention together with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants and the like, as well as injection solutions, suspensions, emulsions, creams, ointments It can be formulated into dosage forms such as suppositories, inhalants, and suppositories.
  • the antibodies of the invention can be dissolved in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer.
  • the medicament of the present invention can be in the form of a suspension, solution, emulsion or the like in an oily or aqueous vehicle.
  • the antibody of the present invention may be produced in the form of powder, and an aqueous solution or suspension may be prepared using sterilized water or the like before use.
  • the antibodies of the invention can be powdered and made into a powder mixture with a suitable base such as lactose or starch.
  • a suppository formulation can be produced by mixing the antibody of the present invention with a conventional suppository base such as cocoa butter.
  • the therapeutic agent of the present invention can be encapsulated in a polymer matrix or the like and formulated as a sustained release preparation.
  • components useful for the treatment of abnormal bone metabolism such as bisphosphonate drugs, teriparatide, Romozosumab, etc., can also be added to the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the dose of the anti-RANKL antibody of the present invention varies depending on the patient's symptoms, administration route, body weight, age, etc., but is preferably 1 ⁇ g to 500 mg per day for adults, for example.
  • Reference example 1 (1) First, bone marrow cells collected from the mouse tibia were differentiated and matured into osteoclasts, and the transition of RANK secretion into the culture supernatant was quantitatively evaluated. Since RANK is a membrane protein, it was assumed to be contained in some membrane vesicles. Therefore, fractionation by stepwise centrifugation was performed, and identification of a RANK-containing fraction was attempted at the same time. As a result, an increase in intracellular RANK expression level and an increase in RANK secretion amount were observed with differentiation / maturation into osteoclasts.
  • Tartrate-resistantacid phosphatase (TRAP) enzyme activity which is an index of osteoclast activation It was clarified that these showed the maximum value on the 4th day of the culture in which RA was the maximum, and that RANK was recovered mainly in the exosome precipitation fraction.
  • this fraction was observed with a transmission electron microscope, an exosome-like structure was confirmed, and it was also confirmed that the same result as described above was obtained from an examination using an exosome precipitation reagent.
  • analysis of this fraction using immunoprecipitation revealed coprecipitation of CD9 and RANK, which are exosome surface antigens, suggesting that exosomes containing RANK are secreted during the osteoclast maturation process. It was.
  • osteoclast-derived exosomes were added to mouse osteoblast-like cultured cells ST2 or mouse primary cultured osteoblasts and cultured.
  • OC exosomes significantly increased the mRNA levels of alkaline phosphatase (ALP), osteopontin, and osteocalcin, which are bone formation markers, and by covering RANKL on the exosome surface with RANKL. The effect was strongly suppressed.
  • P29A point mutant knock-in mice were created to confirm in more detail that signals are transmitted through the intracellular domain PRM of RANKL.
  • stimulation with OC exosomes was given to primary cultured osteoblasts collected from this mouse, signal transduction was certainly reduced, and a tendency to suppress the bone formation promoting effect by OC exosomes was also observed. From these results, it was confirmed that stimulation of osteoclast-derived exosomes produced signals in the cell via the intracellular domain PRM of RANKL, suggesting that SFKs that interact with PRM play an important role. It was.
  • each well was washed once with 500 ⁇ L PBS and replaced with 1 mL of serum starvation medium ( ⁇ -MEM medium without FBS).
  • the cells were cultured for 11 hours in a serum-starved state, and again replaced with 1 mL of fresh serum-starved medium, and cultured for 1 hour. Thereafter, 500 ⁇ L of the medium was removed, beads suspended in 100 ⁇ L of the medium were added so as to be 0.1 mg polystyrene beads / well, and the cells were cultured at 37 ° C.
  • the cell culture plate is transferred to ice at predetermined intervals, and the cells are solubilized with a solubilization buffer (PBS, pH 7.4, 1.0% Triton X-100, protease inhibitor, phosphate inhibitor (SIGMA)). And recovered.
  • PBS solubilization buffer
  • Triton X-100 protease inhibitor
  • SIGMA phosphate inhibitor
  • the cells were collected and suspended in a solubilization buffer (50 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA, protease inhibitors (Roche)).
  • a solubilization buffer 50 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA, protease inhibitors (Roche)
  • the microbial cells were crushed by sonication. Thereafter, centrifugation was performed at 15,000 ⁇ g for 20 minutes to precipitate and remove insoluble matters.
  • the GST fusion protein was collected from the collected supernatant using Glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare).
  • GST fusion protein is adsorbed by passing the supernatant through a column packed with beads, and after washing and removing proteins not adsorbed on the beads with a washing buffer (50 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.0, 150 mM NaCl), Elution was performed from the beads using an elution buffer (Tris-EDTA buffer pH 8.0, 20 mM glutathione (Nacalai Tesque)). The obtained sample was subjected to buffer exchange with PBS (pH 7.4) using a PD-10 column (GE Healthcare) and stored frozen at ⁇ 80 ° C. until use. The protein concentration of GST-RANKL was measured using a Mouse RANKL Quantikine ELISA Kit (R & D Systems).
  • phage eluate was mixed with Escherichia coli TG1 in a logarithmic growth phase with a turbidity of 0.4-0.5, and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to infect the E. coli phage.
  • the mixture was applied onto a 2 ⁇ YT plate containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and 1% glucose, and incubated at 37 ° C. for 12 hours.
  • the formed colonies were collected and cultured in 2 ⁇ YT medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and 1% glucose until the turbidity reached 0.4-0.5, and then helper phage 2 ⁇ 10 11 pfu was added.
  • the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the cells were collected by centrifugation at 3,000 ⁇ g for 10 minutes, resuspended in 2 ⁇ YT medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, 125 ⁇ g / mL kanamycin, 0.1% glucose, and 14-16 at 30 ° C. Phage particles were formed by incubation for a period of time. After completion of the culture, the cells were removed by centrifuging at 3,300 ⁇ g for 15 minutes, and 4 times the amount of purification buffer (20% Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl) was added to the supernatant. Let stand for 1 hour.
  • purification buffer 20% Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl
  • the mixture was centrifuged at 3,300 ⁇ g for 30 minutes to precipitate and collect the phage particles, and the resulting pellet was resuspended in PBS.
  • the phage suspension is centrifuged at 11,600 ⁇ g for 10 minutes to remove the precipitate, and the absorbance (Abs260) at a wavelength of 260 nm is measured.
  • a dilution series of the finally obtained phage suspension is prepared and infected with E. coli in the same manner as described above, and contains 100 ⁇ g / mL ampicillin and 1% glucose. Coated on 2 ⁇ YT plates and incubated overnight at 37 ° C. A plate capable of isolating clones and forming the required number of colonies was selected (100-200 colonies / plate), and each colony was cultured and cloned using the same method as described above. Each phage particle was prepared and the gene sequence encoding the scFv region was determined.
  • the constructed Escherichia coli expression vector is introduced into Rosetta TM 2 and in 2 ⁇ YT medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and 40 ⁇ g / mL chloramphenicol at 37 ° C. until the turbidity is 0.8-1.0. Cultured with shaking. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 125 ⁇ M, and the cells were cultured at 25 ° C. for 24 hours. Thereafter, the cells were collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 2 minutes, and the periplasm fraction was isolated by an osmotic shock technique.
  • the cells were suspended in buffer A (100 mM Tris-HCl, 20% sucrose, 5 mM EDTA, pH 8.0) and allowed to stand on ice for 30 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 10,000 ⁇ g for 15 minutes to obtain a supernatant (supernatant A), and the precipitated cells were resuspended in buffer B (5 mM MgCl 2 ) and left on ice for 10 minutes. The supernatant was obtained again by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 15 minutes (supernatant B).
  • buffer A 100 mM Tris-HCl, 20% sucrose, 5 mM EDTA, pH 8.0
  • Supernatant A and supernatant B were combined and replaced with binding buffer (50 mM Na 2 HPO 4 , 300 mM NaCl, 15 mM imidazole, pH 8.0) on a PD-10 column, and then packed with Ni-IMAC (Biorad) resin
  • binding buffer 50 mM Na 2 HPO 4 , 300 mM NaCl, 15 mM imidazole, pH 8.0
  • Ni-IMAC Biorad
  • the constructed expression vector was introduced into 293FT cells using lipofectamine 2000 (Life Technologies), sodium butyrate was added to the medium so that the final concentration was 10 mM the next day, and the cell culture supernatant was added on the third day after gene introduction. It was collected. After centrifuging the cell culture supernatant at 2,380 ⁇ g for 20 minutes to remove the precipitate, rProtein A sepharose beads (GE Healthcare) were added and incubated at 4 ° C. for 12 hours. Subsequently, the beads were washed with a washing buffer (20 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 6.8), and then eluted with an elution buffer (12.5 mM sodium citrate, pH 2.6). The eluate was buffer-exchanged into physiological saline using a PD-10 column, concentrated using a MWCO 100 kDa ultrafiltration membrane (Millipore), dispensed, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • mice Male and female C57 / BL6J wild-type mice were purchased from Japan SLC. All animal experiments were conducted based on an animal experiment plan approved by the Animal Experiment Committee of the University of Tokyo graduate School of Medicine.
  • osteoclast formation inhibitory ability in vitro
  • bone marrow macrophages were used and isolated by the following method.
  • the tibia was isolated from 6-8 week old C57 / BL6J male mice and the bone marrow was collected and then 10 ng / mL macrophage colony-stimulating factor (M-CSF, R & D Systems), 10% fatal bovine serum (FBS, Biowest),
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • FBS Fe-B
  • Biowest ⁇ -MEM
  • PCSM penicillin-streptomycin
  • the obtained bone marrow macrophages were placed in an ⁇ -MEM medium containing 100 ng / mL GST-RANKL, 50 ng / mL M-CSF, 10% FBS, and PCSM to 1.5 ⁇ 10 5 cells against a 48-well cell culture plate. Seeded at a cell density of / well and cultured for 4 days to induce the formation of mature osteoclasts.
  • scFv recombinant protein was added to the medium at various concentrations in advance.
  • the formation of mature osteoclasts was evaluated using the enzyme activity of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) as an index.
  • the TRAP activity was measured using TRACP Assay Kit (TAKARA) and quantified as the degradation rate of p-nitrophenyl phosphate (pNPP) under acid tartaric acid.
  • Primary antibodies used for detection were rabbit anti-phosphorylated Akt (Thr308) antibody (Cell Signaling Technology), rabbit anti-Akt antibody (Cell Signaling Technology), rabbit anti-phosphorylated S6K1 (Thr389) antibody (Cell Signaling Signaling), respectively.
  • An anti-S6K1 antibody (Cell Signaling Technology) and a donkey anti-rabbit IgG antibody labeled with HRP was used as a secondary antibody. Thereafter, bands were detected by chemiluminescence using ECL prime detection reagent (GE Healthcare), and analysis was performed using an image analyzer ChemiDoc XRS (BioRad).
  • Table 1 shows the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy and light chains of the 9 clones obtained.
  • clone 8 was particularly good as an scFv having both osteoblast activation ability and mature osteoclast formation inhibition ability. Therefore, it was decided to use a mouse to verify that the expected action was observed even at the living body level.
  • the scFv trimer recombinant protein was intraperitoneally administered twice a day, and the value of the blood bone metabolism marker was measured at 1 and 2 weeks after the start of administration (FIG. 4).
  • Example 2 In order to obtain antibodies exhibiting higher activity in humans, the following studies were further conducted.
  • (1) Construction of human osteoblast signal evaluation system In order to detect a RANKL reverse signal with high sensitivity, using a human osteoblast model, SaOS2 cells, a cell line stably incorporating human RANKL was constructed. SaOS2 cells were cultured in ⁇ -MEM medium supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and penicillin-streptomycin. A lentiviral expression vector was used for stable introduction of human RANKL.
  • a gene sequence encoding a protein with a FLAG tag added to the N-terminus of human RANKL (FLAG-hRANKL) is incorporated into a pLenti6.3V5-DEST Gateway vector (Life Technologies), and a lentivirus is added according to the protocol attached to the product. Created. Next, the obtained FLAG-hRANKL-expressing lentivirus was infected to SaOS2 cells seeded in a 10 cm cell culture dish, and the medium was replaced with a medium containing 10 ⁇ g / mL blasticidin 48 hours after the infection. And cultured.
  • the cells were detached by trypsin treatment and subcultured to a 3.5 cm cell culture dish.
  • the obtained cells were cultured and grown in a medium containing blasticidin and used as FLAG-hRANKL stably transfected cells for subsequent studies.
  • the obtained candidate clones were recombined into a human full-length IgG2 antibody to obtain a recombinant protein.
  • the RANKL reverse signal input ability was evaluated by the following method using the human osteoblast signal evaluation system constructed in (1) above. That is, FLAG-hRANKL stably introduced SaOS2 cells were compared with 7 ⁇ 10 4 cells against a 12-well cell culture plate previously coated with collagen in ⁇ -MEM medium supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, and penicillin-streptomycin. Seeded at a cell density of / well.
  • each well was washed once with 500 ⁇ L PBS and replaced with 1 mL of serum starvation medium ( ⁇ -MEM medium without FBS). After culturing for 11 hours in a serum-starved state, the medium was again replaced with 1 mL of fresh serum-starved medium, and then cultured for 1 hour. Thereafter, 500 ⁇ L of the medium was removed, 100 ⁇ L of the antibody-diluted medium was added, and incubation was performed at 37 ° C. for 20 minutes.
  • serum starvation medium ⁇ -MEM medium without FBS
  • the beads were collected, and washed repeatedly with 200 ⁇ L of TPBS three times and further with 200 ⁇ L of PBS five times.
  • the finally recovered beads were subjected to a total of 3 elution operations using 100 ⁇ L of TE buffer containing 20 mM glutathione to obtain phage clones that strongly bound to the human RANKL extracellular domain.
  • the obtained phage eluate was infected with the TG1 E. coli strain, seeded on a culture plate, and cultured at 37 ° C.
  • the next day 96 colonies were isolated, phage particles were prepared, and the gene sequence of the clones confirmed to be binding to the human RANKL extracellular domain using an ELISA method was determined.
  • ⁇ -MEM medium containing 50 ng / ml GST-hRANKL, 10 ng / ml M-CSF, 10% FBS, penicillin-streptomycin. Bone cell formation was induced.
  • antibody recombinant proteins were added to the medium at various concentrations when the medium was changed.
  • the formation of mature osteoclasts was evaluated using the enzyme activity of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) as an index.
  • TRAP activity was measured using TRACP Assay Kit (TAKARA) and quantified as the degradation rate of p-nitrophenyl phosphate (pNPP) under tartaric acid acidity (FIG. 8).

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Abstract

　骨代謝関連疾患に対する新たな治療薬の提供。　ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインと結合する抗ＲＡＮＫＬ抗体であって、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することで骨芽細胞活性化能を示し、同時にＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を阻害することで成熟破骨細胞形成抑制能を示す抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。

Description

抗ＲＡＮＫＬ抗体
　本発明は、骨芽細胞の活性化と成熟破骨細胞の形成抑制の両者に作用する抗ＲＡＮＫＬ抗体及びそれを含有する医薬組成物に関する。
　生体内の骨量は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成が協調的に行われること（骨リモデリング）により、一定に維持されている。両者のバランスが破綻することで骨密度が過度に低下した病態が骨粗鬆症であり、これが起因となって生じる椎体・大腿骨などの骨折は、患者ＱＯＬの深刻な低下に繋がる。現在広く使用されている骨粗鬆症治療薬である、ビスホスホネート系薬剤およびＲＡＮＫＬ中和抗体（デノスマブ）は、亢進した骨吸収を強く抑制することで骨量を回復させるが、これは同時に、骨吸収にカップルして生じる骨形成の抑制にも繋がり、骨代謝回転全体の低下を引き起こす。そのため劣化した骨の新陳代謝が十分に行われず、顎骨壊死や大腿骨非定型骨折の頻度増加などに繋がる可能性が指摘されている。一方、骨形成を促進する薬剤として臨床使用可能なものは、現状パラチロイドホルモン製剤（テリパラチド）のみであるが、これは骨吸収を促進する作用も有しており、長期使用によって骨吸収促進が優位となることから、使用期間の制限がある。従って、これら既存の骨粗鬆症治療薬の課題を克服できる、新規治療標的の同定は臨床上の重要性が高い。
　骨粗鬆症をはじめとする骨破壊を伴う骨代謝関連疾患は、破骨細胞の過剰な活性化により惹起されるが、その活性化には従来、骨芽細胞または骨髄間質細胞に発現するリガンド分子であるｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－κＢ（ＲＡＮＫ）ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）と、破骨細胞またはその前駆細胞である骨髄マクロファージに発現する受容体分子であるＲＡＮＫの結合を起点とするシグナル伝達（ＲＡＮＫＬ－ＲＡＮＫシグナル経路）が、破骨細胞の分化および熟成を誘導する中心的な役割を果たしており（非特許文献１～３）、主として細胞間接触を介して伝達されることが示唆されてきた（非特許文献４、５）。しかしながら近年になって、生理的な破骨細胞形成過程においては、骨芽細胞から分化・成熟して形成される骨細胞が生理的なＲＡＮＫＬの供給源として機能し、破骨細胞への分化と成熟化を促進していることが相次いで報告された（非特許文献６、７）。この結果、骨芽細胞に発現するＲＡＮＫＬ分子（ホモ三量体として存在する）の生理的役割が不明瞭となってきた。
Genes Dev. 13(18): 2412-2424(1999) J. Biol. Chem. 277(46): 44347-44356(2002) Genes Cells 4(6): 353-362(1999) J. Dent. Res. 44: 33-41(1965) Endocrinology 137(8): 2187-2190(1996) Nat. Med. 17(10): 1231-1234(2011) Nat. Med. 17(10): 1235-1241(2011) J. Biol. Chem., 277(8):6631-6636
　従って、本発明の課題は、骨代謝関連疾患に対する新たな治療薬を提供することにある。
　そこで本発明者らは、まず破骨細胞の成熟過程に着目して種々検討した結果、本発明者の一部が、（１）破骨細胞は成熟過程において、ＲＡＮＫを含む膜小胞エクソソーム（ＯＣエクソソーム）を分泌すること、（２）そのエクソソームは骨芽細胞表面に発現するＲＡＮＫＬに結合することにより、骨芽細胞内にシグナルが入力され、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲＣ１経路の活性化と、その下流におけるＲｕｎｘ２核内移行の促進が生じる結果、骨芽細胞の骨形成能が上昇することを見出した。また、ＲＡＮＫ細胞外ドメインを表面に固相化したポリスチレンビーズを用いて骨芽細胞を刺激した場合も、ＯＣエクソソームによる刺激と同様のシグナル経路活性化が認められ、骨芽細胞表面に発現する２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することが、骨芽細胞内シグナルを発生させるトリガーとなっていることも示唆された。かかる知見に基づき、本発明者が、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに結合する抗ＲＡＮＫＬ抗体フラグメントをスクリーニングしたところ、当該抗ＲＡＮＫＬ抗体の中に、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することで、骨芽細胞内にシグナルを入力し、骨芽細胞を活性化させるだけでなく、破骨前駆細胞に発現するＲＡＮＫに対するＲＡＮＫＬの結合を阻害し、成熟破骨細胞の形成も抑制する、バイファンクショナルな抗ＲＡＮＫＬ抗体が存在することを見出した。また、当該抗体は骨芽細胞を活性化して骨形成を促進し、かつ成熟破骨細胞の形成を抑制することにより骨吸収を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔１６〕を提供するものである。
〔１〕ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインと結合する抗ＲＡＮＫＬ抗体であって、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することで骨芽細胞活性化能を示し、同時にＲＡＮＫＬのＲＡＮＫＬへの結合を阻害することで成熟破骨細胞形成抑制能を示す抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔２〕骨芽細胞活性化能が、骨芽細胞内のＰＩ３Ｋ活性化能及びｍＴＯＲＣ１活性化能である〔１〕記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔３〕成熟破骨細胞形成抑制能が、ＲＡＮＫＬ刺激を受けた破骨細胞内のＴＲＡＰ活性誘導抑制能である〔１〕又は〔２〕記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔４〕重鎖ＣＤＲ１が配列番号１～４から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号５～１５から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１６～２７から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８～３２から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３～４３から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４４～５４から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものである〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔５〕前記アミノ酸配列の相同性が、９０％以上である〔４〕記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔６〕機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖから選ばれるものである〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔７〕ヒト化抗体である〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片を含有する医薬組成物。
〔９〕骨代謝異常の予防治療薬である〔８〕記載の医薬組成物。
〔10〕骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である〔９〕記載の医薬組成物。
〔11〕骨代謝異常を予防又は治療するための、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の抗ＲＮＡＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔12〕骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である〔11〕記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
〔13〕骨代謝異常の予防又は治療薬製造のための、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片の使用。
〔14〕骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である〔13〕記載の使用。
〔15〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片の有効量を投与することを特徴とする、骨代謝異常症の予防又は治療方法。
〔16〕骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である〔15〕記載の方法。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片は、従来知られていたＲＡＮＫＬ－ＲＡＮＫシグナル経路を遮断する機能を有し、成熟破骨細胞の形成を抑制することで骨吸収を抑制するだけではなく、これとは全く相違する経路、すなわち、破骨細胞から分泌されたＯＣエクソソーム上のＲＡＮＫが骨芽細胞表面上でＲＡＮＫＬに結合する際に、骨芽細胞表面上の２分子以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋し、骨芽細胞活性化シグナルを入力することから見出された、ＲＡＮＫＬ骨芽細胞内シグナル伝達経路に対しても作用し、骨芽細胞による骨形成を促進するという作用を同時に示す。従って、従来の骨代謝異常による疾患の治療薬のように、骨リモデリングのバランスをくずすことなく、安定した骨形成作用を示す新たな骨代謝異常の予防治療薬として有用である。
ポリスチレンビーズに固相化したＲＡＮＫ－Ｆｃ組み換えタンパク質による骨芽細胞活性化効果（in vitro）の検討結果を示す。 ｓｃＦｖ組み換えタンパク質による成熟破骨細胞形成阻害効果の評価(in vitro)を示す。 ｓｃＦｖ組み換えタンパク質による骨芽細胞活性化効果の評価(in vitro)を示す。 ｓｃＦｖ組み換えタンパク質投与による骨吸収および骨形成への影響評価(in vivo)を示す。 ｌｇＧ２全長組み換えタンパク質による成熟破骨細胞形成阻害効果の評価(in vitro)を示す。 ｌｇＧ２全長組み換えタンパク質による骨芽細胞活性化効果の評価(in vitro)を示す。 ヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに対する結合性、親和性の測定結果を示す。 ＩｇＧ２全長組み換えタンパク質による成熟破骨細胞形成阻害効果の評価（in vitro）を示す。 ヒト骨芽細胞に対するＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能を示す。 クローン１５のヒト全長ＩｇＧ２組み換えタンパク質投与による骨吸収および骨形成への影響評価（in vivo）を示す。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインと結合する抗ＲＡＮＫＬ抗体であって、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋し、骨芽細胞活性化能を示すと共に、ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を阻害して、成熟破骨細胞形成抑制能を併せて有する。
　本発明の特有の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、従来の知見、すなわち、（ａ）骨芽細胞に発現するＲＡＮＫＬと破骨細胞に発現するＲＡＮＫ（受容分子）の結合を起点とするＲＡＮＫＬ－ＲＡＮＫシグナル伝達が、細胞間接触を介するという考え方や、（ｂ）骨芽細胞でなく骨細胞がＲＡＮＫＬの供給源であるという考え方では、全く予測できないものである。すなわち、本発明者らの（１）成熟破骨細胞から分泌されたＯＣエクソソームに含まれるＲＡＮＫが骨芽細胞表面上のＲＡＮＫＬと結合して骨芽細胞内にシグナルが入力され、骨芽細胞活性化が刺激されるという知見、及び（２）当該骨芽細胞の活性化は、骨芽細胞表面上の２分子以上のＲＡＮＫＬ三量体の架橋がトリガーとなるという知見がなければ、本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は予測できないものである。
　本発明の抗体が結合する部位としてのＲＡＮＫＬ細胞外ドメインは、既に知られており、例えばJ. Biol. Chem. 2002, Feb22, 277(8): 6631-6636（非特許文献８）に記載されている。当該結合部位は、細胞外ドメインのうち、ＲＡＮＫが結合する可能性のある部位であれば、抗体がＲＡＮＫとの結合を阻害できるのでよいが、本発明においては、抗体が結合し、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋する必要がある点から、先端部位又はその周辺が好ましい。
　また、本発明の抗体は、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋する。１つのＲＡＮＫＬ三量体とのみ反応する抗ＲＡＮＫＬ抗体は、骨芽細胞表面上のＲＡＮＫＬ分子と結合しても、骨芽細胞内の活性化を刺激しないため、骨芽細胞の活性化による骨形成促進作用を示さない。従来のＲＡＮＫＬ中和抗体であるデノスマブが骨形成を抑制してしまうのは、この作用がないためと考えられる。
　抗ＲＡＮＫＬ抗体が、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することは、例えばマウス骨芽細胞系細胞ＳＴ２を用いたＲＡＮＫＬ骨芽細胞内シグナル伝達経路の活性化作用によって確認することができる。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、骨芽細胞活性化能と成熟破骨細胞形成抑制能とを有する。ここで、骨芽細胞活性化能は、骨芽細胞内の刺激伝達機構のうちの一つ以上を測定することにより判定することができる。すなわち、ＲＡＮＫＬ細胞内シグナルは、ＲＡＮＫＬ細胞内ドメインプロリンリッチモチーフ（ＰＲＭ）とＳｒｃ　ｆａｍｉｌｙ　ｋｉｎａｓｅ（ＳＦＫｓ）との相互作用に始まり、以下ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲＣ１経路の活性化を経てＲｕｎｘ２の核内移行が促進し、結果として骨形成が促進される。従って、これらのステップのいずれかの活性の上昇を測定すればよいが、例えばＳＦＫｓ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲＣ１等の活性上昇を測定するのが好ましく、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲＣ１活性上昇を測定するのがより好ましい。これらの活性の測定法は、公知であり、例えばＰＩ３Ｋの指標としてはＡｋｔのリン酸化を、ｍＴＯＲＣ１の指標としてはＳ６Ｋ１のリン酸化を用いればよい。
　成熟破骨細胞形成抑制能は、成熟破骨細胞のマーカー分子の発現量あるいは活性上昇のうちの一つ以上を測定すればよい。破骨前駆細胞から成熟破骨細胞への分化に伴って、ＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）活性が顕著に上昇することが知られており、破骨前駆細胞にＲＡＮＫＬ刺激を加えた後に生じる当該ＴＲＡＰ活性の誘導に対する抑制能を検討すればよい。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、前記の特性を有すれば特に限定されないが、相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。重鎖ＣＤＲ１が配列番号１～４から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号５～１５から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１６～２７から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８～３２から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３～４３から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４４～５４から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものが好ましい。ここで、各アミノ酸配列における相同性は、９０％以上が好ましく、９５％以上がさらに好ましい。また、各アミノ酸配列において、８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗体には、配列番号１～５４からなるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものが含まれる。ここで数個とは、好ましくは１～３個、より好ましくは１又は２個である。ここでアミノ酸配列の相同性は、同一性の意味である。
　本発明抗ＲＡＮＫＬ抗体の好ましい具体例は、次のとおりである。
（１）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（２）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（３）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（４）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（５）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２０からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（６）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１０からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（７）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５０からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（８）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４０からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（９）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１０）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１１）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１２）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１３）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１４）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１５）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１６）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１７）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１８）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（１９）重鎖ＣＤＲ１が配列番号４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１４からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２５からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（２０）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（２１）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
（２２）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号８からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３２からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗ＲＡＮＫＬ抗体。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ＲＡＮＫＬ細胞のドメインに対する結合親和性及び抗体タンパク質としての安定性の点から、次の抗体がより好ましい。重鎖ＣＤＲ１は、配列番号３からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるのがより好ましい。重鎖ＣＤＲ２は、配列番号８からなるアミノ酸配列２又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるのがより好ましい。重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１９からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるのがより好ましい。軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号３１及び３２から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるのがより好ましい。軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号３６からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるのがより好ましい。軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号４７からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるのがより好ましい。
　ここでも、各アミノ酸配列の相同性は９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
　本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良い。また、天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体が含まれるか、これらに限定されない。
　抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。精製の容易性等を考慮すると好ましくはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２である。
　機能的断片としては、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物が挙げられる。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８－２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ　Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６－４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ　Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７－５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２－６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３－６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２－１３７参照）。
　また、本発明の抗体はヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなるヒト化抗体であっても良く、この様な抗体はマウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。このヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６．）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。本発明においては、このようにして得られたＲＡＮＫＬ細胞外ドメインと結合する抗ＲＡＮＫＬ抗体の中から、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋し、骨芽細胞活性化能を示すと同時に、ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を阻害し、成熟破骨細胞形成抑制能を有する抗体を選択することにより、本発明の抗体が得られる。かかる抗体の選択は、前記の如くして行うことができる。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片は、骨芽細胞による骨形成を促進するとともに破骨細胞の形成抑制による骨吸収を抑制する作用を有し、骨リモデリングの過剰な抑制を引き起こすことなく、安定した骨形成作用を有する。従って、本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片は、種々の骨代謝異常の予防又は治療薬として有用である。骨代謝異常としては、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症の他、リウマチ性関節炎、変形性関節症、再発性多発軟骨炎等の軟骨異常が挙げられる。このうち、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の骨移転に伴う骨破壊に特に有用である。また、骨粗鬆症には、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、及び関節リウマチに伴う骨粗鬆症が含まれる。
　本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体を含有する医薬組成物は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
　経口投与用の好適な製剤は、本発明抗体を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
　非経口投与用には、本発明抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、本発明抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、本発明抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
　本発明の医薬組成物には、本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体以外に、骨代謝異常の治療に有用な成分、例えばビスホスホネート系薬剤、テリパラチド、Ｒｏｍｏｓｏｚｕｍａｂ等を配合することもできる。
　本発明抗ＲＡＮＫＬ抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ～５００ｍｇであるのが好ましい。
　次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
参考例１
（１）まず、マウス脛骨より採取した骨髄細胞を破骨細胞に分化・成熟させ、培養上清中へのＲＡＮＫ分泌量の推移を定量評価した。ＲＡＮＫは膜タンパク質であるため、何らかの膜小胞に含まれていることが想定された。そこで、段階的遠心法による分画を行い、ＲＡＮＫ含有画分の同定も同時に試みた。その結果、破骨細胞への分化・成熟に伴って細胞内ＲＡＮＫ発現量の増加、及びＲＡＮＫ分泌量の増加が認められ、破骨細胞活性化の指標であるｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）酵素活性が最大となる培養４日目においてこれらが最大値を示すこと、及び主としてエクソソームの沈殿画分にＲＡＮＫが回収されることが明らかとなった。この画分を透過型電子顕微鏡により観察したところ、エクソソーム様構造が確認され、エクソソーム沈殿試薬を用いた検討からも上述同様の結果が得られることが確認された。さらに、この画分を免疫沈降法を用いて解析したところ、エクソソーム表面抗原であるＣＤ９とＲＡＮＫの共沈降も認められ、破骨細胞成熟過程においてＲＡＮＫを含有するエクソソームが分泌されることが示唆された。
（２）次に、破骨細胞由来エクソソームの骨芽細胞に対する作用の評価を試みた。まず、破骨細胞由来エクソソーム（ＯＣエクソソーム）をマウス骨芽細胞様培養細胞ＳＴ２、或いはマウス初代培養骨芽細胞に添加し、培養を行った。その結果、双方でＯＣエクソソームの添加により骨形成マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオポンチン、オステオカルシンのｍＲＮＡレベルが有意に上昇することが明らかとなり、さらにエクソソーム表面のＲＡＮＫをＲＡＮＫＬで被覆することでその効果は強く抑制された。また、上記ｉｎ　ｖｉｔｒｏで認められた骨芽細胞活性化効果をｉｎ　ｖｉｖｏで確認するため、コラーゲンゲルにＯＣエクソソームを含浸させ、マウス頭蓋骨欠損モデルを用いて評価した。欠損部へのゲルの留置後４週間で、ＯＣエクソソーム群では顕著に骨再生効果が認められる一方で、エクソソーム表面のＲＡＮＫを被覆した場合には、その効果は大きく減弱することが明らかとなり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの結果を支持するものとなった。以上の検討から、破骨細胞由来エクソソームは、ＲＡＮＫ－ＲＡＮＫＬ相互作用を介して骨芽細胞を活性化し、骨形成促進作用を示すことが示唆された。
（３）ＯＣエクソソームが骨芽細胞を活性化し、骨形成促進効果を有することが示されたため、次いでＳＴ２細胞を用い、詳細なシグナル伝達機構の解析を行った。まず、骨芽細胞分化を中心的に制御する転写因子であるｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２（Ｒｕｎｘ２）の核内移行量について検討した。その結果、ＯＣエクソソームの添加によってＲｕｎｘ２の核内移行量が増大し、その結果として骨芽細胞分化が促進する可能性が示唆された。骨芽細胞において、Ｒｕｎｘ２はｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）ｃｏｍｐｌｅｘ　１（ｍＴＯＲＣ１）によってそのタンパク質発現量、及び活性が制御されていることが報告されている。そこで、ＳＴ２細胞に対してＯＣエクソソームを添加し、ｍＴＯＲＣ１活性の推移を評価したところ、ＯＣエクソソームの添加に伴って、持続的なｍＴＯＲＣ１の活性化が認められ、その効果はエクソソーム表面をＲＡＮＫＬで被覆することで減弱することが明らかとなった。また、ｍＴＯＲＣ１の活性化を引き起こす上流シグナル経路として、ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－３－ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）－Ａｋｔの活性化の評価を行ったところ、ＯＣエクソソームの添加によりｍＴＯＲＣ１と同様の活性化推移が認められた。さらに、ｍＴＯＲＣ１阻害剤であるラパマイシンで処理することで、ＯＣエクソソーム添加に伴うｍＴＯＲＣ１の活性化を抑制した場合、Ｒｕｎｘ２の核内移行量が減少することも確認された。ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔに対する阻害剤を用いた検討結果も考慮すると、ＲＡＮＫＬ細胞内シグナル伝達の主経路として、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲＣ１経路が考えられ、その下流においてＲｕｎｘ２の核内移行が促進することが示唆された。
（４）ＯＣエクソソーム刺激に伴い、ＲＡＮＫＬの細胞内ドメインを介してシグナルが伝達されることが想定される。ＲＡＮＫＬの細胞内ドメインにはｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｍｏｔｉｆ（ＰＲＭ）と呼ばれる特徴的な構造が存在する。ＳＨ３ドメインを有するタンパク質はＰＲＭと相互作用する例が多く報告されており、ＳＨ３ドメインを有し、かつＰＩ３Ｋの活性化に影響を与え得る分子として、Ｓｒｃ　ｆａｍｉｌｙｋｉｎａｓｅｓ（ＳＦＫｓ）の関与が考えられた。そこで、ＳＦＫｓに焦点を当て、ＲＡＮＫＬ細胞内シグナルに与える影響を検討した。その結果、ＳＴ２細胞において、ＳＦＫｓの阻害剤であるＰＰ２及びダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）の処理によって、ＯＣエクソソーム刺激によるシグナル伝達は濃度依存的に抑制されることが示された。また、ＳＴ２細胞に、ＲＡＮＫＬのＰＲＭ内にＰ２９ＡまたはＰ３９Ａの点変異を導入した変異体を過剰発現させた際には、ＯＣエクソソーム刺激によるシグナル伝達の減弱が認められた。さらに、ＳＴ２細胞にＲＡＮＫを表面に固相化したビーズで刺激を与え、ビーズ界面タンパク質を回収する検討を行ったところ、ＲＡＮＫビーズ刺激に応答してＲＡＮＫＬ及びＳＦＫｓが集積して回収されることも明らかとなった。最後に、ＲＡＮＫＬの細胞内ドメインＰＲＭを介してシグナルが伝達されることをより詳細に確かめるために、Ｐ２９Ａ点変異ノックインマウスを作出した。このマウスより採取した初代培養骨芽細胞に対してＯＣエクソソームによる刺激を与えたところ、確かにシグナル伝達の減弱が認められ、また、ＯＣエクソソームによる骨形成促進効果においても抑制傾向が認められた。これらの結果から、破骨細胞由来エクソソーム刺激によりＲＡＮＫＬの細胞内ドメインＰＲＭを介して細胞内にシグナルが生じていることが確認され、ＰＲＭと相互作用するＳＦＫｓが重要な役割を担うことが示唆された。
参考例２
　ＲＡＮＫビーズは以下の手順で調製して検討に用いた。ＲＡＮＫ－Ｆｃ組み換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）１μｇとＳＰＨＥＲＯTMプロテイン　Ｇ　ポリスチレン粒子０．５ｍｇ（粒子径６－８μｍ，Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を１００μＬのＰＢＳ中で混合し、４℃にて一晩反応させ、２００μＬのＰＢＳで３回洗浄して以降の検討に使用した。
　マウス骨芽細胞様細胞株であるＳＴ２細胞を、１０％ＦＢＳ、ＰＣＳＭを添加したα－ＭＥＭ培地にて、１２ｗｅｌｌの細胞培養プレートに対し、４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、２４時間培養した後、各ｗｅｌｌを５００μＬＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬの血清飢餓培地（ＦＢＳを含まないα－ＭＥＭ培地）に交換した。血清飢餓状態で１１時間培養し、再度新しい血清飢餓培地１ｍＬに交換し、１時間の培養を行った。その後、培地を５００μＬ除去し、０．１ｍｇポリスチレンビーズ／ｗｅｌｌとなるように１００μＬの培地に懸濁したビーズを添加し、３７℃で培養を行った。その後所定の時間ごとに、細胞培養プレートを氷上に移し、可溶化バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．４，１．０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＳＩＧＭＡ））にて細胞を可溶化して回収した。得られたサンプルに関し、イムノブロット手法を用いてシグナル経路の活性化を評価した。ＰＩ３Ｋの活性化はＡｋｔのＴｈｒ３０８リン酸化を指標とし、ｍＴＯＲＣ１の活性化はＳ６Ｋ１のＴｈｒ３８９リン酸化を指標として用いた。検出に用いた一次抗体はそれぞれ、ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗リン酸化Ｓ６Ｋ１（Ｔｈｒ３８９）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ｓ６Ｋ１抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であり、二次抗体としてはＨＲＰ標識されたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。その後ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた化学発光によってバンドを検出し、イメージアナライザーＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて解析を行った。
　その結果、図１に示すように、ＲＡＮＫビーズで刺激した際には、骨芽細胞内でＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲＣ１の持続的な活性化が生じていることが示された。これはＯＣエクソソームで刺激をした際の、骨芽細胞内シグナル伝達経路の活性化と同等であった。ＯＣエクソソームに関しても、ＲＡＮＫビーズに関しても、粒子の表面に複数のＲＡＮＫが存在する点が共通する特徴であり、個々のＲＡＮＫが骨芽細胞上に発現する個々のＲＡＮＫＬ三量体とそれぞれ結合するため、骨芽細胞表面において粒子が接触している部位に、ＲＡＮＫと結合したＲＡＮＫＬ三量体が複数集積することになる。すなわち、骨芽細胞上に発現する２以上のＲＡＮＫＬ三量体が、架橋されて近接した位置関係をとることが骨芽細胞内シグナルを発生させるトリガーとなっていることが示唆された。
実施例１
Ａ．方法
（１）組み換えタンパク質の調製
　Ｎ末端にｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）を付加したＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン（ＧＳＴ－ＲＡＮＫＬ）の組み換えタンパク質を、大腸菌発現系を用いて取得するため、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインをコードする遺伝子配列をｐＧＥＸ－５Ｘ－２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に組み込んだ（ｐＧＥＸ－ＲＡＮＫＬ）。構築した発現ベクターを、タンパク質発現用大腸菌種であるＲｏｓｅｔｔａTM２（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（ナカライテスク）および４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｗａｋｏ）を含むＬＢ培地において、濁度が０．８－０．９になるまで３７℃で振盪培養した。その後、終濃度が２０μＭとなるようにｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ，ナカライテスク）を添加し、２０℃で２０時間培養した。その後菌体を回収し、可溶化バッファー（５０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ））に懸濁した後、超音波処理を行って菌体を破砕した。その後、１５，０００×ｇで２０分間遠心を行うことで不溶物を沈殿除去した。回収された上清からのＧＳＴ融合タンパク質の回収は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂビーズ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。ビーズを詰めたカラムに上清を通すことでＧＳＴ融合タンパク質を吸着させ、洗浄バッファー（５０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）でビーズに吸着していないタンパク質を洗浄・除去した後に、溶出バッファー（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．０，２０ｍＭ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ナカライテスク））を用いてビーズより溶出した。得られたサンプルは、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、使用時までは－８０℃で凍結保存した。ＧＳＴ－ＲＡＮＫＬのタンパク質濃度はＭｏｕｓｅ　ＲＡＮＫＬ　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
（２）ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに結合するヒト抗体可変領域の取得
　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）の配列がランダム化された、単鎖化ヒト抗体可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ，ｓｃＦｖ）を提示するファージライブラリーを用い、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに結合性を有するクローンの取得を行った。１×１０12ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ（ｐｆｕ）のファージ懸濁液に、ＧＳＴを担持させたｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂビーズを加え、４℃で２時間インキュベーションを行うことで、ＧＳＴに対して反応性を有するクローンを除去した。次いで、回収した上清にＧＳＴ－ＲＡＮＫＬを担持させたｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂビーズを加え、４℃で２時間インキュベーションを行った。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳおよびＰＢＳを用いて、それぞれ３回ずつビーズを洗浄し、最後に溶出バッファー（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．０，２０ｍＭ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ナカライテスク））を用いて、ＧＳＴ－ＲＡＮＫＬおよびそれに結合しているファージ粒子を溶出させ回収した。得られたファージ溶出液を、濁度が０．４－０．５の対数増殖期にある大腸菌ＴＧ１と混合し、３７℃で３０分間静置することでファージを大腸菌へ感染させた。その後、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１％グルコースを含む２×ＹＴプレート上に塗布し、３７℃で１２時間のインキュベーションを行った。形成されたコロニーを回収し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１％グルコースを含む２×ＹＴ培地にて、濁度が０．４－０．５に達するまで培養した後、ヘルパーファージ２×１０11ｐｆｕを加え、３７℃で３０分間静置した。その後、３，０００×ｇで１０分間遠心して菌体を回収し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１２５μｇ／ｍＬカナマイシン、０．１％グルコースを含む２×ＹＴ培地に再懸濁し、３０℃で１４－１６時間培養してファージ粒子を形成させた。培養終了後、３，３００×ｇで１５分間遠心することで菌体を除去し、上清に対して４倍量の精製バッファー（２０％Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　６０００、２．５Ｍ　ＮａＣｌ）を加え、氷上で１時間静置した。その後、３，３００×ｇで３０分間遠心し、ファージ粒子を沈殿・回収し、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁した。このファージ懸濁液を１１，６００×ｇで１０分間遠心することで沈殿物を除去し、２６０ｎｍの波長における吸光度（Ａｂｓ２６０）を測定し、含まれるファージ粒子数を
（数１）
　　　２２．１４×Ａｂｓ２６０×１０10（ｐｆｕ／ｍＬ）
の計算式を用いて算出した。一連のアフィニティパンニング操作を３回繰り返した後、最終的に得られたファージ懸濁液の希釈系列を作製し、上述と同様の方法で大腸菌に感染させ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１％グルコースを含む２×ＹＴプレート上に塗布して３７℃で一晩インキュベーションした。クローンの単離が可能であり、かつ必要数のコロニーが形成されているプレートを選択し（１００－２００コロニー／プレート）、各コロニーを上述と同様の方法を用いて培養し、クローン化されたファージ粒子をそれぞれ調製し、ｓｃＦｖ領域をコードする遺伝子配列を決定した。
（３）ｓｃＦｖ組み換えタンパク質の調製
　上述のスクリーニングで得られた各クローンに関して、ｓｃＦｖの組み換えタンパク質の取得を行った。ｓｃＦｖ単量体の分子量は約２５ｋＤａであり、モデル動物へ投与した場合に糸球体濾過を受け、血中半減期が著しく短くなると想定されたため、ｓｃＦｖのＣ末端側にイソロイシンジッパー（ＩＬＺ：アミノ酸配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲ）（配列番号５５）を導入することで三量体化し、分子量を７５ｋＤａ程度と糸球体濾過を十分に回避できる分子サイズとすることとした。また、組み換えタンパク質の精製を容易とするため、ＩＬＺの外側にＨｉｓタグを融合することとした。さらに、大腸菌において発現した組み換えタンパク質がペリプラズムへ輸送されるよう、シグナルペプチド（アミノ酸配列ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡ（配列番号５６）：タンパク質がペリプラズムへ輸送される際に切断されるため、最終的な組み換えタンパク質には残らない）をＮ末端側に付加することとした。以上のコンストラクトをコードする遺伝子配列をｐＱＥ２ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に組み込んだ。構築された大腸菌発現ベクターをＲｏｓｅｔｔａTM２に導入し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地において、濁度が０．８－１．０になるまで３７℃で振盪培養した。その後、終濃度が１２５μＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２５℃で２４時間培養した。その後、１０，０００×ｇで２分間遠心を行って菌体を回収し、浸透圧ショック手法によってペリプラズム画分を単離した。まずバッファーＡ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％スクロース、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で菌体を懸濁し、氷上で３０分間静置した。その後、１０，０００×ｇで１５分間遠心を行って上清を取得し（上清Ａ）、沈殿した菌体をバッファーＢ（５ｍＭ　ＭｇＣｌ2）に再懸濁し、氷上で１０分間静置した。再び１０，０００×ｇで１５分間遠心を行って上清を取得した（上清Ｂ）。上清Ａと上清Ｂを合わせ、ＰＤ－１０カラムにて結合バッファー（５０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に置換後、Ｎｉ－ＩＭＡＣ（Ｂｉｏｒａｄ）樹脂を詰めたカラムに加え、組み換えタンパク質を吸着させた後、結合バッファーで洗浄し、溶出バッファー（５０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて溶出させた。溶出液を、ＰＤ－１０カラムを用いて生理食塩水へとバッファー置換し、分注して－８０℃で保存した。
（４）ｓｃＦｖの全長抗体ＩｇＧ２への組み換え
　各ｓｃＦｖクローンに関し、Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のそれぞれについて、細胞外へ分泌するためのシグナル配列をＮ末端に、抗体定常領域の配列をＣ末端に融合して発現するよう遺伝子配列を構築し、ｐＥＦ１α－ＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に組み込んだ。この発現ベクターを用いることで、ＩＲＥＳ配列の前後にＨ鎖とＬ鎖が挿入され、両者の共発現が１つのプラスミドで可能となる。構築した発現ベクターを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２９３ＦＴ細胞へ導入し、翌日終濃度が１０ｍＭとなるよう酪酸ナトリウムを培地中へ添加し、遺伝子導入から３日目で細胞培養上清を回収した。細胞培養上清を２，３８０×ｇで２０分間遠心して沈殿物を除去した後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、４℃で１２時間インキュベーションを行った。その後、ビーズを洗浄バッファー（２０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．８）で洗った後に、溶出バッファー（１２．５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ２．６）にて溶出した。溶出液はＰＤ－１０カラムを用いて生理食塩水へバッファー交換し、ＭＷＣＯ　１００ｋＤａの限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した後、分注して－８０℃で保存した。
（５）実験動物
　雌雄のＣ５７／ＢＬ６Ｊ野生型マウスは日本ＳＬＣより購入した。全ての動物実験は、東京大学大学院医学系研究科動物実験委員会による承認を受けた、動物実験計画に基づいて行った。
（６）ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞形成阻害能の評価
　破骨前駆細胞のソースとしては、骨髄マクロファージを用いることとし、以下の方法で単離した。６－８週齢のＣ５７／ＢＬ６Ｊ雄マウスより脛骨を単離し、骨髄を回収した後に１０ｎｇ／ｍＬ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ（Ｍ－ＣＳＦ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０％ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，Ｂｉｏｗｅｓｔ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＣＳＭ，　ナカライテスク）を含むα－ＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）培地中で培養した。２４時間後に細胞培養ディッシュに定着していない浮遊画分に含まれる生細胞を計数し、以降の検討に用いた。得られた骨髄マクロファージを、１００ｎｇ／ｍＬ　ＧＳＴ－ＲＡＮＫＬ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦ、１０％ＦＢＳ、ＰＣＳＭを含むα－ＭＥＭ培地にて、４８ｗｅｌｌの細胞培養プレートに対し、１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種して４日間培養し、成熟破骨細胞の形成を誘導した。ｓｃＦｖあるいは全長抗体組み換えタンパク質による破骨細胞形成抑制を評価するためには、予め種々の濃度で培地中にｓｃＦｖ組み換えタンパク質を添加した。成熟破骨細胞の形成は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の酵素活性を指標として評価した。ＴＲＡＰ活性の測定は、ＴＲＡＣＰ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、酒石酸酸性下でのｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）の分解速度として定量した。
（７）ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける骨芽細胞活性化能の評価
　マウス骨芽細胞様細胞株であるＳＴ２細胞を、１０％ＦＢＳ、ＰＣＳＭを添加したα－ＭＥＭ培地にて、１２ｗｅｌｌの細胞培養プレートに対し、４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、２４時間培養した後、各ｗｅｌｌを５００μＬ　ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬの血清飢餓培地（ＦＢＳを含まないα－ＭＥＭ培地）に交換した。血清飢餓状態で１１時間培養し、再度新しい血清飢餓培地１ｍＬに交換し、１時間の培養を行った。その後、培地を５００μＬ除去し、ｓｃＦｖあるいは全長抗体組み換えタンパク質を希釈した培地を１００μＬ添加し３７℃で２０分間の培養を行った。その後細胞培養プレートを氷上に移し、可溶化バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．４，１．０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＳＩＧＭＡ））にて細胞を可溶化して回収した。得られたサンプルに関し、イムノブロット手法を用いてシグナル経路の活性化を評価した。ＰＩ３Ｋの活性化はＡｋｔのＴｈｒ３０８リン酸化を指標とし、ｍＴＯＲＣ１の活性化はＳ６Ｋ１のＴｈｒ３８９リン酸化を指標として用いた。検出に用いた一次抗体はそれぞれ、ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗リン酸化Ｓ６Ｋ１（Ｔｈｒ３８９）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ｓ６Ｋ１抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であり、二次抗体としてはＨＲＰ標識されたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。その後ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた化学発光によってバンドを検出し、イメージアナライザーＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて解析を行った。
（８）ｉｎ　ｖｉｖｏにおける骨吸収抑制および骨形成促進効果の評価
　１２週齢のＣ５７／ＢＬ６Ｊ雌マウスに対し、ｓｃＦｖ組み換えタンパク質を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１２時間ごとに１４日間腹腔内投与した。コントロール群では、生理食塩水を同様のスケジュールで投与した。各マウスより、投与開始前・投与開始後７日目・１４日目に採血を行い、血清を分離・回収して骨代謝マーカーの測定を行った。骨吸収指標としてはＴＲＡＰ５ｂ値を、骨形成指標としてはＰ１ＮＰ値を、それぞれＭｏｕｓｅ　ＴＲＡＰ　ＥＩＡ　Ｋｉｔ（ＩＤＳ）、ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｐ１ＮＰ（Ｕｓｃｎ）を用いて定量した。
Ｂ．結果
（１）ＲＡＮＫ２細胞外ドメインに選択的に結合する抗体フラグメントの取得
　前記の方法により、Ｎ末端にＧＳＴを付加したＲＡＮＫＬ細胞ドメイン（ＧＳＴ－ＲＡＮＫＬ）の組み換えタンパク質を、大腸菌発現系を用いて調製し、グルタチオンセファロースビーズに担持させたものをベイトとして用い、単鎖ヒト型抗体可変領域（ｓｃＦｖ）を提示したファージディスプレイライブラリーに対してスクリーニングを行った。３回のアフィニティパンニングの後に得られたクローンを単離し、ｓｃＦｖ部位の塩基配列を解析すると同時に、ＧＳＴ－ＲＡＮＫＬとの結合性をＥＬＩＳＡ手法によって評価することで、結合能の確認されたクローン計２０種類を選択した。
（２）骨形成促進・骨吸収抑制作用を有する抗体フラグメントの選択
　ｉ）得られたｓｃＦｖフラグメントのＣ末端側にイソロイシンジッパー（ＩＬＺ）を付加することで三量体化した組み換えタンパク質を用い、ＲＡＮＫＬ骨芽細胞内シグナル入力能の評価を行った。
　マウス骨芽細胞系細胞ＳＴ２にｓｃＦｖ三量体組み換えタンパク質を添加し、一定時間後に細胞を可溶化し、イムノブロットによりＰＩ３Ｋ活性化およびｍＴＯＲＣ１活性化を評価した。それぞれの指標としては、Ａｋｔ　Ｔｈｒ３０８残基のリン酸化、およびＳ６Ｋ１　Ｔｈｒ３８９残基のリン酸化を用いた。その結果９種類のクローン（クローン１～クローン９）がＲＡＮＫＬ骨芽細胞内シグナルを入力可能なものとして同定された（図３）。
　ii）ＲＡＮＫＬが破骨前駆細胞に発現するＲＡＮＫに対してシグナルを入力することで誘導される成熟破骨細胞形成に対する、ｓｃＦｖ三量体組み換えタンパク質の阻害効果を評価することとした。マウス骨髄より単離した破骨前駆細胞をＧＳＴ－ＲＡＮＫＬおよびＭ－ＣＳＦ存在下で培養し、成熟破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を測定することで成熟破骨細胞の形成を評価した。培地中に同時に添加したｓｃＦｖ三量体組み換えタンパク質がＴＲＡＰ活性の誘導に与える影響を解析した結果、上述と同様の９種類のクローン（クローン１～クローン９）に関して強い成熟破骨細胞形成抑制能が認められた（図２）。
　得られた９種類のクローンの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　iii）以上の結果に基づき、骨芽細胞活性化能および成熟破骨細胞形成抑制能の双方を有するｓｃＦｖとして、クローン８が特に良好であると考えられた。そこで、生体レベルでも期待される作用が観察されるかを、マウスを用いて検証することとした。ｓｃＦｖ三量体組み換えタンパク質を１日２回腹腔内投与し、投与開始後１週間および２週間時点で血中骨代謝マーカーの値を測定した（図４）。その結果、クローン８由来のｓｃＦｖ三量体組み換えタンパク質投与群において、骨吸収マーカーＴＲＡＰ５ｂの低下と骨形成マーカーＰ１ＮＰの上昇が同時に認められ、生体レベルでも骨吸収の抑制作用と骨形成の促進作用が同時に発現することが明らかとなった。
（３）完全ヒト型抗体へ組み換えたコンストラクトの評価
　各ｓｃＦｖクローンに関し、ヒトＩｇＧ２由来の定常領域を用いて、抗体全長への組み換えを行った。ＩＲＥＳを用いることで、Ｈ鎖およびＬ鎖を共発現できるよう設計したコンストラクトを作製し、２９３ＦＴ細胞に導入することで各抗体分子を発現させた後、培養上清からｐｒｏｔｅｉｎ　Ａビーズを用いて抗体を精製した。クローン８由来の全長抗体は、ＲＡＮＫＬ骨芽細胞内シグナルを入力できると共に、成熟破骨細胞形成を阻害できることがｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験系で確認された（図５、６）。
実施例２
　ヒトにおいてより高活性を示す抗体を取得するために、さらに以下の検討を行った。
（１）ヒト骨芽細胞シグナル評価系の構築
　ヒト骨芽細胞モデルであるＳａＯＳ２細胞を用い、感度良くＲＡＮＫＬ逆シグナルを検出するため、ヒトＲＡＮＫＬを安定導入した細胞系の構築を行った。ＳａＯＳ２細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ－グルタミンおよびペニシリン－ストレプトマイシンを添加したα－ＭＥＭ培地にて培養した。ヒトＲＡＮＫＬの安定導入には、レンチウィルス発現ベクターを用いた。すなわち、ヒトＲＡＮＫＬのＮ末端にＦＬＡＧタグを付加したタンパク質（ＦＬＡＧ－ｈＲＡＮＫＬ）をコードする遺伝子配列を、ｐＬｅｎｔｉ６．３Ｖ５－ＤＥＳＴ　Ｇａｔｅｗａｙベクター（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に組み込み、製品添付のプロトコールに従って、レンチウィルスを作成した。次いで、１０ｃｍ細胞培養ディッシュに播種したＳａＯＳ２細胞に対し、得られたＦＬＡＧ－ｈＲＡＮＫＬ発現レンチウィルスを感染させ、感染から４８時間後に、培地を１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを含んだ培地へと交換して培養した。細胞数が２割程度まで減少し、残りの細胞がブラストサイジン耐性を獲得した段階で、トリプシン処理によって細胞を剥離し、３．５ｃｍ細胞培養ディッシュへと継代を行った。得られた細胞を、ブラストサイジンを含む培地で培養・増殖させＦＬＡＧ－ｈＲＡＮＫＬ安定導入細胞として以降の検討に用いた。
（２）ヒト骨芽細胞に対して、高いＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能を示す抗体の取得
　ヒト骨芽細胞に対して、より高いＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能を有する抗体を取得するため、スケールを拡大して、再度ファージディスプレイ手法を用いたスクリーニングを行った。ファージディスプレイ・ライブラリーとしては、前回申請時と同様、Ｈ鎖およびＬ鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列が一部ランダム化されたヒトｓｃＦｖを提示するファージライブラリーを用い、持ち込むファージ粒子の量、およびベイトを２倍にしてスクリーニングを実施した。得られた候補クローンに関して、ヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメインを固相化したＥＬＩＳＡ手法によってヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに対して結合性が確認されたクローンを選別した。さらに、得られた候補クローンを全てヒト全長ＩｇＧ２抗体へと組み換えを行い、組み換えタンパク質を取得した。得られた各ヒトＩｇＧ２タンパク質に関して、上記（１）で構築したヒト骨芽細胞シグナル評価系を用いて、ＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能の評価を以下の方法で行った。すなわち、ＦＬＡＧ－ｈＲＡＮＫＬ安定導入ＳａＯＳ２細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌグルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したα－ＭＥＭ培地にて、予めコラーゲンでコートした１２ｗｅｌｌの細胞培養プレートに対し、７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。２４時間培養した後、各ｗｅｌｌを５００μＬ　ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬの血清飢餓培地（ＦＢＳを含まないα－ＭＥＭ培地）に交換した。血清飢餓状態で１１時間培養し、再度新しい血清飢餓培地１ｍＬに交換した後、１時間の培養を行った。その後、培地を５００μＬ除去し、抗体を希釈した培地を１００μＬ添加し３７℃で２０分間の培養を行った。その後、細胞培養プレートを氷上に移し、可溶化バッファー（１．０％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ），ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＳＩＧＭＡ）を含むＰＢＳ，ｐＨ７．４）にて細胞を可溶化して回収した。得られたサンプルに関し、イムノブロット手法を用いてシグナル経路の活性化を評価した。ＰＩ３Ｋの活性化はＡｋｔのＴｈｒ３０８リン酸化を指標とし、ｍＴＯＲＣ１の活性化はＳ６Ｋ１のＴｈｒ３８９リン酸化を指標として用いた。検出に用いた一次抗体はそれぞれ、ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗リン酸化Ｓ６Ｋ１（Ｔｈｒ３８９）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ｓ６Ｋ１抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であり、二次抗体としてはＨＲＰ標識されたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。その後ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた化学発光によってバンドを検出し、イメージアナライザーＦｕｓｉｏｎ　Ｓｏｌｏ４（Ｍ＆Ｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）を用いて解析を行った。その結果、ヒト骨芽細胞に対して高いＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能を有するクローンとして、クローン１０、１１、４が最終的に選択された（表２）。
（３）アフィニティ・マチュレーション手法による、高親和性抗体の取得
　本発明抗体のもう一つの特徴である、破骨細胞形成抑制活性に関しては、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに対する結合親和性と関連性が高いと想定される。そこで、（２）の検討から得られたクローンを基にし、Ｈ鎖およびＬ鎖のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列の一部を、ランダムなアミノ酸配列に置換したファージディスプレイ・ライブラリーを構築し、以下の方法で結合親和性の高いクローンを取得するためのスクリーニングを実施した。まず、ファージ粒子数１×１０１２ｐｆｕのファージライブラリーに対し、大過剰のＧＳＴを結合したグルタチオンセファロース・ビーズ５μＬを添加し、ＴＰＢＳ（０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳ，ｐＨ７．４）１ｍＬ中にて４℃４時間のインキュベーションを行い、ＧＳＴに交叉結合するファージクローンの除去を行った。その後、上清を回収し、Ｎ末端にＧＳＴを融合したヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン組み換えタンパク質（ＧＳＴ－ｈＲＡＮＫＬ）５０μｇを結合したグルタチオンセファロース・ビーズ５μＬを添加し、ＴＰＢＳ　１０ｍＬ中にて、室温２時間のインキュベーションを行った。その後ビーズを回収し、１ｍＭ　ＧＳＴ－ｈＲＡＮＫＬを添加したＴＰＢＳ　１ｍＬに再懸濁し、４℃１時間のインキュベーションを行った。再度ビーズを回収し、０．５ｍＭ　ＧＳＴ－ｈＲＡＮＫＬを添加したＴＰＢＳ　１ｍＬに再懸濁し、４℃１時間のインキュベーションを行った。その後、ビーズを回収し、２００μＬのＴＰＢＳで３回、さらに２００μＬのＰＢＳで５回、繰り返し洗浄を行った。最終的に回収されたビーズに対し、２０ｍＭのグルタチオンを含むＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ　１００μＬを用いて、合計３回の溶出操作を行って、ヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに強く結合するファージクローンの取得を行った。得られたファージ溶出液を、ＴＧ１大腸菌株に感染させ、培養プレートに播種し、３７℃で培養を行った。翌日９６個のコロニーを単離し、ファージ粒子を調製し、ＥＬＩＳＡ手法を用いてヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに対する結合性が確認されたクローンに関して、遺伝子配列の決定を行った。一連のライブラリー・スクリーニングを繰り返して行い、クローン１２～クローン２２のクローンが高親和性クローンとして得られた（表２）。得られた各クローンに関して、ヒト全長ＩｇＧ２タンパク質に組み替えて組み換えタンパク質を取得し、ＥＬＩＳＡ手法を用いてヒトＲＡＮＫＬ細胞外ドメインに対する結合親和性の測定を行った（図７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（４）ヒトＲＡＮＫＬ組み換えタンパク質で刺激した破骨細胞形成を抑制する活性の評価
　これまでの検討の結果得られた１２種類のクローンに関して、ヒト全長ＩｇＧ２組み換えタンパク質として、破骨細胞形成抑制能の評価を以下の手法を用いて行った。すなわち、破骨前駆細胞のモデルであるＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％　ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシンを含むα－ＭＥＭ培地にて、９６ｗｅｌｌの細胞培養プレートに対し、３．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種して２４時間培養した後、５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＳＴ－ｈＲＡＮＫＬ、１０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含むα－ＭＥＭ培地に交換して成熟破骨細胞の形成を誘導した。抗体による破骨細胞形成抑制を評価するためには、培地交換時に、種々の濃度で培地中に抗体組み換えタンパク質を添加した。成熟破骨細胞の形成は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の酵素活性を指標として評価した。ＴＲＡＰ活性の測定は、ＴＲＡＣＰ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、酒石酸酸性下でのｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）の分解速度として定量した（図８）。
（５）ヒト骨芽細胞に対するＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能の確認評価
　最後に、（２）で行った方法と同様の方法を用いて、ヒト骨芽細胞に対するＲＡＮＫＬ逆シグナル入力能の確認を行った（図９）。
　図８及び図９より、新たに得られたクローンも２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することで骨芽細胞活性化能を示し、かつ成熟破骨細胞形成抑制能を示すことがわかる。
（６）ｉｎ　ｖｉｖｏにおける骨吸収抑制および骨形成促進効果の評価
　１４週齢のＣ５７／ＢＬ６Ｊ雌マウスに対し、クローン１５のヒト全長ＩｇＧ２組み換えタンパク質あるいは陰性対照ヒトＩｇＧ２を、３０ｍｇ／ｋｇの投与量で１２時間おきに２回静脈内投与を行った。各マウスより、投与開始前および投与開始後６０，１０８，１５６時間後に採血を行い、血清を分離・回収して骨代謝マーカーの測定を行った。骨吸収指標としてはＴＲＡＰ５ｂ値を、骨形成指標としてはＰ１ＮＰ値を、それぞれＭｏｕｓｅ　ＴＲＡＰ　ＥＩＡ　Ｋｉｔ（ＩＤＳ）、ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｐ１ＮＰ（Ｕｓｃｎ）を用いて定量した。その結果を図１０に示す。
　図１０より、本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ｉｎ　ｖｉｖｏでも優れた骨吸収抑制および骨形成促進効果を有することが確認された。

Claims (16)

  1. 　ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインと結合する抗ＲＡＮＫＬ抗体であって、２以上のＲＡＮＫＬ三量体を架橋することで骨芽細胞活性化能を示し、同時にＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を阻害することで成熟破骨細胞形成抑制能を示す抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  2. 　骨芽細胞活性化能が、骨芽細胞内のＰＩ３Ｋ活性化能及びｍＴＯＲＣ１活性化能である請求項１記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  3. 　成熟破骨細胞形成抑制能が、ＲＡＮＫＬ刺激を受けた破骨細胞内のＴＲＡＰ活性誘導抑制能である請求項１又は２記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  4. 　重鎖ＣＤＲ１が配列番号１～４から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ２が配列番号５～１５から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１６～２７から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２８～３２から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３～４３から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４４～５４から選ばれるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものである請求項１～３のいずれか１項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  5. 　前記アミノ酸配列の相同性が、９０％以上である請求項４記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  6. 　機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖから選ばれるものである請求項１～５のいずれか１項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  7. 　ヒト化抗体である請求項１～６のいずれか１項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片を含有する医薬組成物。
  9. 　骨代謝異常の予防又は治療薬である請求項８記載の医薬組成物。
  10. 　骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である請求項９記載の医薬組成物。
  11. 　骨代謝異常を予防又は治療するための、請求項１～７のいずれか１項記載の抗ＲＮＡＫＬ抗体又はその機能性断片。
  12. 　骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である請求項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片。
  13. 　骨代謝異常の予防又は治療薬製造のための、請求項１～７のいずれか１項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片の使用。
  14. 　骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である請求項１３記載の使用。
  15. 　請求項１～７のいずれか１項記載の抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能性断片の有効量を投与することを特徴とする、骨代謝異常症の予防又は治療方法。
  16. 　骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の胃転移に伴う骨破壊、リウマチ性関節炎、変形性関節症、及び再発性多発軟骨炎から選ばれる疾患である請求項１５記載の方法。
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