KR20100118596A - ６３１３/Ｇ２(항 안지오텐신 Ⅱ 제1형 수용체) 모노클로날 항체 가변 영역에 대한 합성의 ｓｃＦＶ 유사체 - Google Patents

６３１３/Ｇ２(항 안지오텐신 Ⅱ 제1형 수용체) 모노클로날 항체 가변 영역에 대한 합성의 ｓｃＦＶ 유사체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EDGIKRIQDD의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하며, 각각 하기 나타낸 바와 같은 각각의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3를 포함하는 면역글로불린 VH 도메인에 연결된, 상보성 결정 영역(CDR) VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3를 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 특이적인 결합 분자를 제공하며, 여기서, VHCDR1은 GYSFTGYNMN이고, VHCDR2는 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며, VHCDR3은 EVDY이고, VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며, VLCDR2은 LVSNLES이고, VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.

Description

６３１３/Ｇ２(항 안지오텐신 Ⅱ 제1형 수용체) 모노클로날 항체 가변 영역에 대한 합성의 ｓｃＦＶ 유사체{Synthetic scFv analogue to the ６３１３/Ｇ２(anti angiotensin Ⅱ type 1 receptor) monoclonal antibody variable regions}
본 발명은 6313/G2 항 안지오텐신 II 제1형 수용체 모노클로날 항체 가변 도메인의 합성 scFv 유사체(R6313/G2)에 관한 것이다.
안지오텐신-II는 포유동물 전해질 항상성 및 혈압 조절에 있어 중요한 역활을 한다[참조: Peach Physiol. Rev 57 313-370 (1977); Vinson et al "The Adrenal Cortex", Prentice Hall, Englefield Heights (1992)]. 제1형 및 제2형(AT1 및 AT2)으로 지정된 안지오텐신-II 수용체의 2개의 주요 유형이 인지되어 있지만, 안지오텐신-II의 잘 공지된 작용의 대부분은 AT1 아형을 통해 일어난다[참조: Herblin et al Am. J. Hypertens. 4 299S-302S (1991); Ouali et al J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 43 271-280 (1992)].
AT1 수용체 아형에 대한 모노클로날 항체 6313/G2[참조: Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993)]는 수용체의 분포를 연구하는데 사용되어 왔다[참조: Vinson et al Mol. Med. Today 1 35-38 (1995)]. 모노클로날 항체는 예를 들면, 고혈압 또는 기타 평활근 세포(예: 자궁) 수축의 치료시, 혈관-수축을 조절하기 위한 치료제로서 사용하도록 제안되어져 왔다.
항체는 각종 조직, 예를 들면, 후두암[참조: Marsigliante et al Cancer Letters 110 19-27 (1996)], 신장[참조: Harrison-Bernard et al Am. J. Physiol. 42 F170-F177 (1997); Cheng et al Am. J. Physiol. 43 F10-F17 (1998)], 및 뇌[참조: Yang et al J. Neuroscience 17 1660-1669 (1997)]에서 특수 영상화제로 사용되어 왔다. 항체는 안지오텐신-II 유도된 AT1 수용체 내재화 및 PKC 활성화를 차단하지만 칼슘 반응을 역으로 촉진하는 것으로 밝혀졌다[참조: Kapas et al Biochem. Biophys. Res. Comm. 204 1292-1298 (1994); Vinson et al J. Endocrinol. 141 R5-R9 (1994)]. 유방 종양에서 AT1 및 AT2 수용체의 존재는 안지오텐신의 국소 생산과 함께 보고되었다[참조: Inwang et al Brit. J. Cancer 75 1279-1283 (1997); Tahmasebi et al Eur. J. Cancer 34 1777-1782 (1998)].
모노클로날 항체 6313/G2는 부다페스트 조약하에, 영국 포톤 다운에 소재하는 동물 세포 배양물의 유럽 수집기관[European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)]에 1993년 7월 22일자로 기탁되어, 수탁번호 제93072117호로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 분비된다. 당해 기탁물은 런던 이 1 4 엔에스 마일 엔드 로드 소재의 퀸 매리 앤드 웨스트피일드 대학(Queen Mary & Westfield College)의 생화학부의 가빈 피 빈슨 박사(Dr Gavin P Vinson) 및 스튜워트 베이커 박사(Dr Stewart Barker)에 의해 제조되었다. 기탁자들은 출원인에게 기탁된 물질을 출원서에 언급하도록 하였으며 유럽 특허 조약의 28(1)(d)의 법률에 따라 기탁된 물질이 공공에 이용가능하도록 자신의 무제한적인 최종적 동의를 제공하여 왔다.
하이브리도마 세포주는 랫트 혈관 평활근 AT1 수용체의 8번 내지 17번 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하며, 당해 서열은 또한 사람 및 소 세포의 AT1 수용체에서 발견된다. 에피토프 서열은 다음과 같다:
EDGIKRIQDD
또는, 달리는 다음과 같이 표시된다:
NH2-Glu-Asp-Gly-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Asp-Asp-COOH
안지오텐신-II 제1형 수용체의 N-말단 서열을 포함하는 펩타이드 서열에 대한 모노클로날 항체가 제조되었다[참조: Barker et al Journal of Molecular Endocrinology 11 241-245 (1993); WO 95/09186]. 이러한 모노클로날 항체는 특정의 의학 상태에서 추가의 치료학적 용도를 가지며 여기서, 이러한 용도는 앞서 제안되거나 밝혀지지 않았다(참조: WO2004/018519). 이러한 치료학적 효과는 관련된 의학 상태에서 안지오텐신-II의 유해한 작용을 차단하면서 분자의 유익한 작용을 보존하기 위한 모노클로날 항체의 능력에서 관측된다.
본 발명에 이르러, AT1 수용체에 대해 특이적인 모노클로날 항체의 합성 scFv 유사체는 질병의 치료요법 또는 치료시 이러한 유사체의 용도를 제공하는 유리하고 예측되지 않는 특성을 지닌 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 쥐 scFv 유사체 및 쥐 scFv 유사체의 인간화된 변이체 둘다를 생산하였다.
본 발명의 제1 측면에 따라, EDGIKRIQDD의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하며 면역글로불린 VH 도메인에 연결된 면역글로불린 VL 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 특이적인 결합 분자가 제공되며, 여기서, VL 도메인은 상보성 결정 영역(CDRs) VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3를 포함하고, 여기서, VH 도메인은 상보성 결정 영역(CDRs) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3를 포함하며, 이들 각각은 다음과 같은 각각의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
VHCDR1은 GYSFTGYNMN이고,
VHCDR2는 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
VHCDR3은 EVDY이고,
VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
VLCDR2은 LVSNLES이고,
VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 EDGIKRIQDD의아니노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하며 면역글로불린 VH 도메인에 연결된 면역글로불린 VL 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 특이적인 결합 분자를 제공하며, 여기서, VL 도메인은 상보성 결정 영역(CDRs) VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하고, 여기서, VH 도메인은 상보성 결정 영역(CDRs) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3을 포함하며, 이들 각각은 다음과 같은 각각의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
VHCDR1은 GYSFTGYNMN 또는 GYSFTGYNMS이고,
VHCDR2은 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
VHCDR3은 EVDY이고,
VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
VLCDR2는 LVSNLES이고
VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.
본 발명의 다른 양태에서, 특이적인 결합 분자의 CDR은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
VHCDR1은 GYSFTGYNMN 또는 GYSFTGYNMS이고,
VHCDR2는 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
VHCDR3은 EVDY이고,
VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
VLCDR2은 LVSNLES 또는 LVSDLED이고,
VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.
CDRs은 보존된 서열 정의[참조: Kabat et al in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Nat'l. Inst. Health, Bethesda, MD (1987)], 및 구조적 정의[참조: Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901-17(1987)]의 조합에 따라 지정된다. 이러한 지정은 또한 문헌[참조: Carter et al, Proc Nat'l Acad Sci U S A. 89:4285-9 (1992)]에 후속적으로 기술되었다.
3 문자 및 1 문자 코드를 사용하여 아미노산을 또한 다음과 같이 언급할 수 있다: 글라이신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 루이신(L 또는 Leu), 이소루이신(I 또는 Ile), 프롤린(P 또는 Pro), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 타이로신(Y 또는 Tyr), 트립토판(W 또는 Trp), 라이신(K 또는 Lys), 아르기닌(R 또는 Arg), 히스티딘(H 또는 His), 아스파르트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 아스파라긴(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gln), 시스테인(C 또는 Cys), 메티오닌(M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser) 및 트레오닌(T 또는 Thr). 잔기가 아스파르트산 또는 아스파라긴인 경우, 기호 Asx 또는 B가 사용될 수 있다. 잔기가 글루탐산 또는 글루타민인 경우, 기호 Glx 또는 Z가 사용될 수 있다. 문맥에서 달리 규정하지 않는 한, 아스파르트산에 대한 참조는 아스파르테이트를 포함하며, 글루탐산은 글루타메이트를 포함한다.
본 발명은 또한 위에서 언급한 펩타이드 서열의 변이체에 확장된다. 본 발명의 변이체의 예는, 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환되어 있다는 것이 다른, 위에서 정의한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 당해 분야의 숙련가들은, 다양한 아미노산이 유사한 특성을 가짐을 인지하고 있다. 물질의 하나 이상의 이러한 아미노산은 흔히 당해 물질의 바람직한 활성을 제거하지 않으면서 하나 이상의 다른 이러한 아미노산으로 치환될 수 있다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신은 흔히 다른 아미노산(지방 측쇄를 갖는 아미노산)으로 치환될 수 있다. 이러한 가능한 치환 중에서, 글리신과 알라닌을 사용하여 하나의 다른 아미노산을 치환하는 것이 바람직하며(이들은 비교적 짧은 측쇄를 갖기 때문이다), 발린, 루이신 및 이소루이신을 사용하여 다른 아미노산을 치환시킨다(이들은 소수성인 보다 큰 지방족 측쇄를 갖기 때문이다). 흔히 하나의 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 기타 아미노산은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
이러한 천연의 치환은 흔히 "보존적인" 또는 "반-보존적인" 아미노산 치환으로 언급된다.
아미노산 결실 또는 삽입은 또한 위에서 언급한 융합 단백질을 위한 아미노산 서열에 대해 상대적으로 제조될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 폴리펩타이드의 활성에 실질적인 효과를 가지지 않거나, 적어도 이러한 활성을 제거하지 않는 아미노산이 결실될 수 있다. 이러한 결실은, 폴리펩타이드의 전체 길이 및 분자량이 감소될 수 있는 반면 활성을 여전히 보유하고 있을 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이는 특수 목적에 요구되는 폴리펩타이드의 양을 감소시킬 수 있는데, 예를 들면, 용량 수준을 감소시킬 수 있다.
상기 융합 단백질의 서열에 대해 아미노산 삽입을 또한 달성할 수 있다. 이는 본 발명의 물질의 특성을 변경시키기 위해(예를 들면, 융합 단백질과 관련하여 위에 설명한 바와 같이, 확인, 정제 또는 발현을 보조하기 위해) 수행할 수 있다.
위에서 제공된 서열에 대해 아미노산 변화는 예를 들면 부위-지시된 돌연변이유발 또는 고체상 합성을 사용함으로써 어떠한 적합한 기술을 사용하여서도 달성할 수 있다.
본 발명의 영역내 아미노산 치환 또는 삽입은 천연적으로 발생하거나 또는 비-천연적으로 발생하는 아미노산을 사용하여 제조할 수 있음은 명백하다. 천연 또는 합성의 아미노산이 사용되는 것에 상관없이, 단지 L-아미노산이 존재하는 것이 바람직하다.
당해 분야에 공지된 것으로서 "동질성"은 서열을 비교하여 측정한 것으로서, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열간의 관계이다. 당해 분야에서, 동질성은 또한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 가닥사이의 일치에 의해 측정되는 것으로서, 당해 경우가 존재하는 경우, 이들 서열사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열사이에 동질성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재한다고 해도, 동질성을 측정하기 위해 일반적으로 사용된 방법은 컴퓨터 프로그램에서 성문화되어 있다. 2개의 서열사이에 동질성을 측정하기에 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지[참조: Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 CDR의 아미노산 서열은, HGMP[인간 게놈 맵핑 계획(Human Genome Mapping Project)]에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램[참조: Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)]의 디폴트(default) 매개변수를 사용한 동질성이 아미노산 수준에서, 상기 기술한 VH 및 VL CDR의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%이다.
보다 바람직하게는, CDR 서열은 위에 나타낸 서열에 대해, 아미노산 수준에서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%의 동질성을 가질 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 특이적 결합 분자는 CDR의 다음 배열 중 하나를 가질 수 있다:
(R6313클론12D 및 인간화된 변이체 HuCY 및 var3)
VHCDR1: GYSFTGYNMN
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSNLES
VLCDR3: QHIRELTRSEG
또는
(R6313클론11B)
VHCDR1: GYSFTGYNMS
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSNLES
VLCDR3: QHIRELTRSEG
또는
(인간화된 변이체 var4)
VHCDR1: GYSFTGYNMN
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSDLED
VLCDR3: QHIRELTRSEG.
본 발명의 하나의 양태에서, 특이적인 결합 분자는 펩타이드 링커에 의해 연결된 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다. 링커는 예를 들면, 1, 2, 3 또는 4개 아미노산, 5, 10 또는 15개 아미노산, 또는 편리하게는 1 내지 20개 범위의 다른 중간체 구성원과 같은 1 내지 20개 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 글리신 및/또는 세린과 같은 어떠한 일반적으로 편리한 아미노산 잔기로부터 형성될 수 있다. 적합한 링커의 하나의 예는 Gly4Ser이다. 이러한 링커의 다량체, 예를 들면, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체, 예를 들면, (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)5가 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 양태에서, 펩타이드 링커는 존재하지 않으며 VL 도메인은 펩타이드 결합에 의해 VH 도메인에 연결될 수 있다.
특이적인 결합 분자는 일본쇄 가변 유사체(scFv)일 수 있다. 특이적인 결합 분자 또는 scFv는 다른 특이적인 결합 분자(예를 들면, 다른 scFvs, Fab 항체 단편, 키메라 IgG 항체(예를 들면, 인간 골격을 갖는 키메라 IgG 항체)에 연결되거나 본 발명의 다른 scFv에 연결되어 다-특이적인 결합 단백질인 다량체, 예를 들면, 이량체, 삼량체 또는 사량체를 형성할 수 있다. 이량체, 삼량체 또는 사량체에서 각각의 scFv가 상이한 특이성을 갖는 경우, 이-특이적인 scFv는 때때로 디아보디로 언급되며, 삼-특이적인 scFv는 트리아보디로 및 사-특이적인 scFv는 테트라보디로 언급된다. 이량체, 삼량체 또는 사량체에서 각각의 scFv가 동일한 특이성을 갖는 경우, 디아보디, 트리아보디 및 테트라보디는 또한 일특이적일 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 특이적인 결합 분자는 R6313/G2로 확인된 모노클로날 항체 유사체일 수 있다. 이러한 scFv는 또한 본원에서 R6313클론12D로 언급되며 도 14에 나타낸 서열을 갖는다. 본 발명의 다른 양태에서, 특이적인 결합 분자는 본원에서 또한 클론 11B로 언급되는, R6313클론11B로 확인된 모노클로날 항체 유사체 scFv일 수 있으며, 이의 서열은 또한 도 14에 나타나 있다.
scFv는 표준 화학 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 어떠한 적합한 기술로도 제조할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 모노클로날 항체 유사체는 천연의 인간 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 scFv로서 제조될 수 있다[참조: McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990); 및 제WO 92/01047호에 기술된 바와 같이).
모노클로날 항체 유사체는 scFv의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 인간화시킬 수 있다. 본 발명의 특이적인 결합 분자의 면역원성을 감소시키는 방법은 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발 또는 다른 일반적으로 사용된 분자 생물학 기술[참조: Roguska et al Protein Eng. 9 895-904 (1996)]에 의해 적합한 항체 골격 스캐폴드(antibody framework scaffold) 또는 가변성 표면 잔기 리모델링에 대한 CDR 이식을 포함한다.
적용가능한 다른 방법은 분자내 강력한 T-세포 에피토프의 확인, 및 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발(탈-면역화)에 의한 이들의 후속적인 제거를 포함할 수 있다. 특이적인 결합 분자의 인간화는, 분자가 치료제로서 사용될 경우 바람직할 수 있다. CDR 영역 또는 주변 골격 서열의 인간화가 경우에 따라 수행될 수 있다.
본 발명자들은 실시예에 기술된 바와 같은, scFv R6313/G2의 인간화된 변이체를 생산하였다.
본 발명의 하나의 양태에서, 특이적인 결합 분자는 HuCY, var3 및/또는 var4로 확인된 특정의 하나 이상의 인간화된 scFv일 수 있다. 이들 인간화된 scFv의 서열은 도 14에 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에서, 위에서 기술한 바와 같은 특이적인 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 당해 측면에 따라 사용된 조성물은 어떠한 편리한 경로에 의해서도 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 의약은 약제학적으로 허용되는 담체를 일반적으로 포함할 멸균의 약제학적 조성물의 일부로서 일반적으로 제공될 것이다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들 또는 약제학적으로 허용되는 면역보강제 및/또는 희석제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 리포좀, 물, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올 및 이의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당해 약제학적 조성물은 어떠한 적합한 형태(이를 환자에게 투여하는 바람직한 방법에 따른 형태)일 수 있다.
이는 단위 용량형으로 제공될 수 있으며, 일반적으로 멸균 용기속에 존재할 것이고, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로(비록 필수적이지는 않지만) 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다. 이는 다수의 상기 단위 용량 형을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 예를 들면, 경구(볼내 또는 설하 포함), 직장, 비강, 국소(볼내, 설하 또는 경피 포함), 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 또는 피내) 경로에 의해 어떠한 적절한 경로로도 투여하도록 조절할 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들면 활성 성분을 멸균 조건하에 담체(들) 또는 부형제(들)과 혼합함으로써 제약 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
경구 투여를 위해 조절된 약제학적 조성물은 캅셀제 또는 정제와 같은 별개의 단위로서; 액제, 시럽제 또는 현탁제(수성 또는 비-수성 액체; 또는 식용가능한 발포제 또는 휘플병(whip); 또는 유제로서)로서 존재할 수 있다.
정제 또는 경 젤라틴 캅셀제용으로 적합한 부형제는 락토즈, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염을 포함한다.
연질 젤라틴 캅셀제와 함께 사용하기에 적합한 부형제는 예를 들면, 야채 오일, 왁스, 지방, 반-고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함한다.
액제 및 시럽제의 제조를 위해, 사용될 수 있는 부형제는 예를 들면, 물, 폴리올 및 당을 포함한다. 현탁제의 제조를 위해, 오일(예를 들면, 야채 오일)을 사용하여 수-중-유(oil-in-water) 또는 유-중-수(water-in-oil) 현탁제를 제공할 수 있다.
경피 투여를 위해 조절된 약제학적 조성물은 연장된 기간 동안 수용체의 표피와 친밀하게 접촉하도록 의도된 별개의 패치제로 존재할 수 있다. 예를 들면, 활성 성분은 문헌[참조: Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986)]에 일반적으로 기술된 바와 같은 이온이동법에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.
국소 투여용으로 조절된 약제학적 조성물은 연고제, 크림제, 현탁제, 로숀제, 산제, 액제, 페이스트제, 겔제, 스프레이제, 에어로졸제 또는 오일제로 제형화될 수 있다. 눈 또는 기타 외부 조직, 예를 들면, 입 및 피부의 감염에 대해, 조성물은 바람직하게는 국소 연고제 또는 크림제로서 적용된다. 연고제로 제형화하는 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수-혼화성 연고제 기재와 함께 사용될 수 있다. 달리는, 활성 성분을 수-중-유 크림 기재 또는 유-중-수 기재와 함께 크림제로 제형화시킬 수 있다. 눈에 국소 투여하기 위해 조절된 약제학적 조성물은 눈 점적제를 포함하며, 여기서, 활성 성분은 적합한 담체, 특히 수성 용매 속에 용해되거나 현탁되어 있다. 입에 국소 투여하기 위해 조절된 약제학적 조성물은 로젠지제, 향정(pastille) 및 구강 세척액을 포함한다.
직장 투여용으로 조절된 약제학적 조성물은 좌제 또는 관장제로 제공될 수 있다.
담체가 고체인 비강 투여용으로 조절된 약제학적 조성물은, 스너프(snuff)가 예를 들면, 코에 가까이 유지시킨 분말의 용기로부터 비강 통로를 통한 빠른 흡입에 의해 취해지는 방식으로 투여되는 입자 크기가 예를 들면 20 내지 500 마이크론인 조악한 분말을 포함한다. 비강 스프레이제 또는 비강 점적제로서 투여하기 위한, 담체가 액체인 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다.
흡입으로 투여하기 위해 조절된 약제학적 조성물은 각종 유형의 계량된 투여량의 가압 에어로졸, 분무기 또는 취분기(insufflator))의 수단으로 생성될 수 있는 미세 입자 분진 또는 미스트(mist)를 포함한다.
질내 투여용으로 조절된 약제학적 조성물은 페서리(pessary), 탐폰(tampon), 크림, 겔, 페이스트, 발포제 또는 분무 제형으로 제공될 수 있다.
비경구 투여용으로 조절된 약제학적 조성물은, 항-산화제, 완충제, 정균제 및 제형이 요구하는 수용체의 혈액과 실질적으로 등장성이 되도록 하는 용질; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제를 포함한다. 주사가능한 액제용으로 사용될 수 있는 부형제는 예를 들면, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 야채 오일을 포함한다. 조성물은 단위-투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 사용 직전에, 멸균 액체 담체, 예를 들면, 주사용 수의 첨가만이 요구되는 동결-건조된(진공건조된) 상태로 저장될 수 있다. 임시처방용 주사 액제 및 현탁제는 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤화제, 유화제, 감미제, 착색제, 향미제, 염(본 발명의 물질은 자체로서 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다), 완충제, 착색제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 물질 외에, 치료학적으로 활성인 제제를 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 활성 약물 농축물의 제형은 약제학적으로 허용되는 강직제, 완충제, 및 약제학적으로 허용되는 표면활성제를 포함할 수 있다.
달리는, 제형은 활성 성분과, 나트륨 포스페이트 일염기성, 나트륨 포스페이트 이염기성, 염화나트륨, 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20(교반-유도된 응집의 위험을 최소화시키기 위한 표면활성제) 및 물(USP/Ph.Eur)을 포함할 수 있으며, 임의로 pH를 약 6.0 내지 7.0, 예를 들면 6.5 근처로 조정할 수 있다.
활성 약물 농축물은 동결건조되거나 동결건조되지 않을 수 있다.
다른 제형은 완충제로서 나트륨 아세테이트 삼수화물, 강직 조절제로서 염화나트륨, pH 조절용의 아세트산 및 주사용수를 포함할 수 있다.
활성 약물 농축물은 또한 투여 전에 0.9% 염화나트륨 속에 희석시킬 수 있다.
본 발명의 물질의 용량은 치료되는 질병 또는 질환, 치료되는 개개인의 연령 및 상태에 따라서 광범위한 제한사이에서 변할 수 있으며, 주치의는 궁극적으로 사용될 적절한 용량을 결정할 것이다.
당해 용량은 경우에 따라 종종 반복될 수 있다. 부작용이 커지는 경우 용량의 양 및/또는 횟수를 정상적인 임상 실시에 따라서, 감소시킬 수 있다.
포유동물, 및 특히 인간에게 투여하기 위해, 활성제의 1일 용량은 체중 kg당 1㎍ 내지 10mg, 통상적으로 10㎍ 내지 1mg일 것이다. 어떠한 경우에도 주치의는 개개인의 연령, 체중, 성별 및 반응을 포함하는 인자들에 의존할 개개인에 대해 가장 적합할 실제 용량을 결정할 것이다. 상기 용량은 평균 경우의 예이다. 이들은 물론, 보다 높거나 적은 용량이 유리한 경우의 예일 수 있으며, 이는 본 발명의 영역내에 있다.
위에서 기술된 바와 같은 특수 결합 분자는 예를 들면, 암의 치료시 의약으로 사용될 수 있다. 이론에 결부되지 않더라도, 안지오텐신 제1형 수용체(AT1R)를 함유하는 암이 본 발명의 특이적인 결합 분자를 사용한 치료요법에 특히 감수적일 수 있다고 여겨진다. 이러한 암은 다수이며 유방 암, 전립샘 암, 난소 암, 자궁 암, 직장결장 암, 췌장 암, 뇌하수체 암, 융모막암종, 호지킨병, 피부병, 신장 암, 부신 종양, 간 암, 폐 암, 백혈병 및 신경모세포종 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 당해 측면은 대상체에게 위에서 기술한 바와 같은 특이적인 결합 분자를 투여함을 포함하여, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 암의 치료시 사용하기 위한 의약의 제조시 위에서 기술한 바와 같은 특이적인 결합 분자의 사용에 까지 확장된다. 치료 방법은 인간 또는 동물 대상체일 수 있으며 본 발명은 인간 및/또는 수의학용 의약에서의 사용으로 동등하게 확장된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 대상체에서 암을 치료하기 위한 별개의, 동시의 또는 연속적인 투여용의 위에서 기술한 바와 같은 특이적인 결합 분자 및 안지오텐신-II의 조합 제제가 제공된다. 암은 위에서 기술한 바와 같을 수 있다.
본 발명은 또한 위에서 기술한 바와 같은 본 발명의 특이적인 결합 분자 및 안지오텐신-II를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 항원보강제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
달리는, 본 발명은 또한 경구 투여용의 정제, 폐 투여용의 흡입제 및 정맥내 투여용의 주사가능한 액제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적 투여용으로 각각 제형화된 본 발명의 특이적인 결합 분자 및 안지오텐신 II를 포함하는 부분의 키트를 제공한다.
안지오텐신 II의 사용과 관련된 본 발명의 양태는 인간 또는 수의학용 의약에 사용하기에 적합한 안지오텐신의 어떠한 일반적으로 편리한 형태도 포함할 수 있다. 적합하게는, 안지오텐신 II는 동결 건조된 제품의 형태로 제공될 수 있으며, 여기서, 잔기는 안지오텐신 II, 트레할로즈, 인간 혈청 알부민 및 아세트산을 함유한 용액으로부터 기원한다. 약제 등급의 안지오텐신 II의 하나의 공급원은 2.5㎍의 안지오텐신 II(Ileu5), 3mg의 트레할로즈, 1mg의 인간 혈청 알부민, 2 x 10-3 mol/l의 아세트산을 포함하는 용액 0.5ml로부터 제조된 동결-건조된 잔기를 함유하는 앰플 형태의 안지오텐신 II를 공급하는 NIBSC사(영국 사우쓰 밈스 소재)이다.
R6313/G2로서 언급된 scFv와 같은, 6313/G2 모노클로날 항체의 가변 영역의 합성 유사체는 특히 원래의 하이브리도마 항체와 비교하는 경우, 독특하고 유리한 특성을 갖는다. 예를 들면:
1. 중공 섬유내 암 세포를 지닌 완전한 nu/nu 마우스에서, R6313/G2는 암 세포 성장을 현저히 억제하였다. 이는 하루에 13nmol/kg 2X의 농도에서이기 때문에 놀라운 것이며, 이는 체중, 순환하는 알도스테론 농도 또는 동물 활성에 영향을 미치지 않았는데, 즉, 작용에 관련된 다른 안지오텐신은 영향을 받지 않았다(주목: 원래의 하이브리도마 항체는 시험관내에서 알도스테론 분비를 증가시켰다).
2. R6313/G2는 단독으로 50 및 250nm/L의 농도에서 엔젤브로쓰-홀름-스완(Engelbroth-Holm-Swam: EHS) 마우스로부터 기원한 재구성된 기저막 매트릭스 단백질(ECM)을 통해 T-47D 세포 침입을 억제한다[참조: 도 9(b)]. 정제된 모노클로날 항체(100nmol/L에서)는 현저한 억제 효과를 갖지 않는다. 또한, 100nmolL의 안지오텐신 II의 존재하에서[도 9(b)], R6313/G2의 효과는 24시간의 검정 기간에 걸쳐 R6313/G2(250nmol/L)의 최대 농도에서 세포 침입의 25% 까지 억제로 보다 현저하게 측정되었다.
3. L당 100nmol 이하의 안지오텐신 II의 존재하에서 R6313/G2는 유방 암 세포 증식을 현저히 억제한다. 이는 안지오텐신 II의 존재가 요구되므로 놀라운 것이며, R6313/G2는 안지오텐신 II의 부재하에 효과를 지니지 않는다.
4. 시험관내 완전한 랫트에서, R6313/G2는 혈압에 있어 스트레스-유도된 증가를 현저히 억제한다. 이는, 혈압을 감소시키지 않고 심지어 안정 혈압을 증가시키지 않기 때문에 놀라운 것이다.
5. L당 100nmol 이하의 안지오텐신 II의 존재하에서, R6313/G2는 유방 암 세포에서 카스파제-유도된 세포자멸사를 증진시킨다. 안지오텐신의 누락은 이의 효과를 차단한다. 따라서, 안지오텐신 II의 존재는 R6313/G2의 활성에 매우 요구된다.
6. 놀랍게도 R6313/G2는 시험관내보다 생체내에서 현저히 보다 효과적이었다. 따라서, 생체내에서 25nmol/Kg의 투여량은 시험관내에서 3.3μM/L에 의해 달성되는 것과 동등한 항-암 세포 효과를 제공한다.
7. 이종이식 암 세포 종양을 지닌 완전한 nu/nu 마우스에서, R6313/G2는 다른 효과없이, 13nmol/kg에서 암 세포 성장을 현저히 억제하였다.
8. 도 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 재표면화된(인간화된) scFv 대 쥐 scFv에 있어서 펩타이드 항원에 대한 결합은 증가하였다. 따라서, 이는 치료당 잠재적인 비용 및 또한 인간에서 면역 반응을 유발할 가능성이 전혀 없다는 잇점을 제공하는 것 둘다의 측면에서 장점을 나타낸다. 또한, 인간화된 변이체 var4는 모(parent) 쥐 scFv와 비교하여 가장 현저히 증가된 결합을 나타내었다. 이는, 당해 변이체의 CDRs(VLCDR2) 중 하나가 모 쥐 scFv와 관련하여 변형되었으므로 놀라운 것이었다.
본 발명의 제2의 및 후속적인 측면을 위한 바람직한 특징들은 제1 측면의 무타티스 무탄디스(mutatis mutandis)에서와 같다.
하나의 양태에서, 본 발명은 도 14에 나타낸 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 특이적인 결합 분자를 제공한다.
도 1은 안지오텐신 II 수용체 아형에 대한 면역블롯팅을 나타낸다. AT1 수용체(A) 및 AT2 수용체(B) 함량을 3개의 유방 암 세포주(레인 B, T47D; 레인 C, MDA-MB-231; 레인 D, MCF-7), 및 평활근 세포(레인 A)의 분해물에서 분석하였다. 3개의 유방 암 세포주(레인 B-D)로부터의 분해물 만이 AT2 수용체를 함유하였으며, MDA-MB-231 세포는 비교적 거의 함유하지 않았고; RASMC(레인 A)에서 AT2 수용체는 검출되지 않았다.
도 2는 (A) 48시간 후 XTT 검정에 의해 측정되었던 L당 100mmol의 안지오텐신 II의 존재하에서 R6313/G2에 의한 세포 생존의 투여량 의존적인 억제를 나타낸다. 3개의 세포주(P <0.05 또는 이상)에 대한 역치값(*)은 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포의 경우 0.05μM이었으며, T47D 세포의 경우 1.25μM이었고; IC50 값은 T47D, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포에 대해 각각 2.8μmol/L, 1.53nmol/L 및 30nmol/L이었다. (B) 로자르탄 만이 25μmol/L에서 T47D 세포를 42% 억제하였으며, 다른 세포 유형은 사용된 모든 농도에서 영향받지 않았다. 결과들은 8개의 샘플의 평균 ± S.D.이다.
도 3은 (A 및 B) 12 및 48시간 후에 100nmmol/L의 안지오텐신 II의 존재 및 부재하에 T47D 세포에서 카스파제-3/7 활성에서의 R6313/G2의 효과를 나타낸다. 12시간 후, 안지오텐신 II는 치료되지 않은 대조군 값과 비교하여 카스파제-3/7 활성을 억제하였으며 당해 억제는 R6313/G2에 의해 차단되었다. R6313/G2의 차단 작용은 사용된 보다 높은 투여량에서 거의 현저하지 않지만, 48시간 후, R6313/G2 단독은 카스파제-3/7 활성의 투여량-의존적인 증가를 제공하였다. (C) MCF7 세포에서, R6313/G2는 단독으로 카스파제-3/7 활성을 감소시켰으나, 안지오텐신 II의 존재하에서 이는 카스파제-3/7 활성을 투여량 의존적으로 증가시켰다. 데이타는 8개 샘플의 평균 ± S.D의 평균이다. *P <0.05, **P <0.01.
도 4는, (A) 시험관내 중공 섬유 검정에서, R6313/G2가 48시간 후 안지오텐신 II의 존재하에서 모든 3개의 유방 세포주(T47D, MCF-7 및 MDA-MB-231)의 생존을 투여량 의존적으로 억제하였음을 나타낸다. (B) 피하 부위에서의 생체내 중공 섬유 검정에서, R6313/G2는 MCF-7 세포에서만 세포 생존을 투여량 의존적으로 억제하였으며, MDA MB231 세포는 최대 투여량에서 억제되었다. (C) 복강 부위에서의 생체내 중공 섬유 검정에서, R6313/G2는 하루에 0.07 및 0.7 mg/kg(2.5 및 25 nmol/kg)으로 2회 치료된 동물, 및 하루에 0.7 mg/kg(25 nmol/kg)으로 2회 처리된 T47D 및 MBA MB 231 세포에서 MCF7 세포 생존을 억제하였다. 값은 평균 ± S.D.로 나타낸다. *P<0.05, **P<0.001. (D) 시험 동물의 체중은 치료 기간 동안 변화가 없었다.
도 5는, MCF7 세포 이종이식 이식체를 제공받은 동물에서 생체내 R6313/G2 치료가 0.4 mg/kg(13 nmol/kg; -■-) 및 0.8 mg/kg (27 nmol/kg; -▲-)의 하루 2회 투여량에서 체중을 감소시키지 않았으며, 치료기간 동안 치사율이 없었으나, 0.8 mg/kg 그룹에서, 4마리가 8일째까지 죽었음을 나타낸다. 체중은 1.36 mg/kg(45.3 nmol/kg; -●- *P<0.05)을 제공받은 동물에서 현저히 감소하였으며 8일째까지 모두 죽었다. 데이타는 평균 ± S.E.M.이며, n은 8이고, 여기서, 달리 나타낸 경우는 제외된다(괄호 안은 n개 수). 대조군(-◆-).
도 6은 MCF-7 세포 이종이식체 상에서 R6313/G2의 생체내 작용을 나타낸다. (A) MCF-7 종양 용적, 평균 ± S.E.M. (B) A에서와 동일한 데이타, 치료된 값은 평균 대조군 값의 퍼센트로 나타낸다. *P<0.05, **P<0.001.
도 7은 도 6에서와 같이, 7일 동안 하루에 0.4 mg/kg R6313/G2를 2회 사용하여 7일 동안 치료한 후 대조군(상단) 및 (하단)에서 샘플 MCF7 세포 이종이식체를 나타낸다.
도 8은 PBS 만을 제공받은 대조군(Con)과 비교하여 R6313/G2 (scFv, 3일 동안 0.4 mg/kg/일)으로 처리한 랫트의 혈압을 나타낸다. *P<0.05, Con 및 ScFv 확장기 압력의 비교.
도 9는 T-47D 유방 암 세포를 사용한 세포 침입 검정에서, 하이브리도마 상층액(Mab; 도 9a) 및 scFv, R6313/G2 클론12D(scFv; 도 9b)로부터의 정제된 모노크로날 항체사이의 비교를 나타낸다. 당해 검정에서, 침입하는 세포는 세포외 매트릭스의 확립된 모델을 통해 차단될 것이다. 도 9b는, scFv 만이 엔젤브레쓰-롤름-스완(EHS) 마우스 종양으로부터 기원한 재구성된 기저막 매트릭스 단백질(ECM)을 통해 50 및 250 nmol/L의 농도(b)에서 T-47D 세포 침입을 현저히 억제함을 나타낸다. 정제된 모노클로날 항체(100nM에서)는 현저한 억제 효과를 갖지 않았다. 또한, at 100nmol/L의 안지오텐신 II(Ang II)의 존재하에서(b에서), scFv 효과는 scFv(250nM)의 최대 농도에서 현저히 보다 결정되어진다.
도 10은 클론 12D 및 11B의 완전한 서열의 정렬을 나타낸다. scFv 변이체에 대한 효과적인 아미노산 서열은 9번 아미노산에서 시작하여 당해 도에 나타낸 서열의 말단으로부터 9번째 잔기에서 끝난다. 각각의 말단에서 추가의 아미노산은 pCANTAB 5E 벡터 리더 서열(scFv 서열에 대해 N-말단), 및 pCANTAB 5E를 사용하여 발현되고 scFv의 친화성 정제에서 사용된 E-tag 발현 펩타이드(scFv 서열에 대해 C-말단)의 일부를 포함하는 펩타이드 서열를 포함한다. 특히, 효과적인 아미노산 서열은 원형질 표적화 리더 서열의 일부인 MA 시그날 펩티다제 분해 부위 이후에서 시작하여 알라닌 브릿징 서열 및 GAPVPY E-tag 서열의 앞에서 끝난다.
도 11은 클론 12D, 11B, 10D, 10E, 4F, 6C, 6E, 7F, 8B, 8C, 8D 및 8E의 완전한 서열의 정렬을 나타낸다.
도 12 패널 a-b는 3회 수행된 4개의 별개의 ELISA 비교를 나타낸다. 이는 펩타이드 항원(AT1-수용체 N-말단 영역으로부터)에 대한 5개의 상이한 scFv 변이체의 결합의 양을 나타낸다. 데이타는 배경을 감한 후 450nm/㎍의 단백질/웰에서의 흡광고 값의 평균 ± S.E.M.을 나타낸다.
도 13은 쥐 scFv(12D) 및 원래의 하이브리도마로부터 정제된 IgM에 대한 가공된 변이체 scFv의 직접적인 비교를 나타낸다. ELISA는 scFv에 대해 항-His 태그 퍼옥시다제 제2 항체 접합체(1:1000), 및 하이브리도마-기원한 IgM에 대한 항-IgM 퍼옥시다제 제2 항체 접합체(1:2500)를 사용하여 수행하였다.
도 14는 클론 12D, 11B 및 인간화된 변이체 HuCY, 변이체 3 및 변이체 4의 서열의 정렬을 나타낸다.
도 15 패널 a)는 IgM 및 scFv 변이체사이의 공명 횟수, 명백한 온-비율(on-rate)에 있어서 변화의 비교를 Hz/초로 나타낸다. 이들 데이타는 아타나(Attana) 100 QCM 바이오센서를 사용하여 수득하였으며 결합 표적으로서 바이오티닐화된 펩타이드가 들어있는 스트렙타비딘-피복된 QCM 칩의 공명 횟수의 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다. ScFv 12D, var3 및 var4는 100초 주입 기간에 걸쳐 공명 횟수에 있어 현저히 큰 변화를 나타내었다. 패널 b)는 유사하게 측정한 각종 항체 단백질의 명백한 오프-율을 비교한다. 이들 말단 오프-율에 있어서의 현저한 차이는 당해 실험 조건하에서는 관측되지 않았다.
본 발명을 이제 나열의 목적으로만 제시한 하기 실시예를 참조하여 실시예의 수단으로 추가로 기술할 것이다. 실시예에서, 참조는 도면의 번호에 대해 이루어진다.
실시예 1: scFv의 제조
6313/G2 마우스 모노클로날 항체 하이브리도마를 앞서 기술한 바와 같이 성장시켰다[참조: Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993)]. mRNA로부터 기원한 cDNA의 혼주물을 사용하여 PCR에 의해 중쇄 및 경쇄를 수득하였다. (Gly4Ser)3를 암호화하는 링커 단편을 사용하여 삽입체의 scFv 라이브러리를 조립하고 이들 삽입체를 pCANTAB 5 E 파아지미드 벡터[제조원: 애머샴 파마시아(Amersham Pharmacia), 영국 하이 와이콤브 소재]내로 직접 클로닝함으로써 파아지 디스플레이 라이브러리를 창조하였다. 발현된 서열 GAPVPYPDPLEPR에 대한 E-태그가 당해 벡터에 포함되어 후속적인 패닝(panning) 및 정제 단계에서 사용되었다. 이후에, 파아지미드 라이브러리를 사용하여 TG1 이. 콜라이를 형질전환시키고, 파아지미드 구제를 M13KO7 헬퍼 파아지를 사용한 후 수회 라운드의 패닝을 사용하여 수행하였다. 양성 발현 클론을 ELISA에 의해 원래의 항원성 펩타이드(EDGIKRIQDD) 및 HRP-결합된 제2 항체를 사용하여 검출된 항-E-태그 항체(제조원: 애머샴 파마시아)가 피복된 96 웰 플레이트를 사용하여 확인하였다. 하나의 특수 클론을 항원 ELISA시 최고 시그날을 제공하는 것을 기초로 하여 발현 및 정제 및 작용 평가를 위해 취하였다.
6313/G2 scFv (R6313/G2, 클론 12D)을 HiTrap E-태그 컬럼(제조원: 애머샴 파마시아)에 이어 scFv를 포함하는 면역글로불린에 결합하는 단백질 L 컬럼[제조원: 비디 클론테크(BD Clontech), 영국 옥스포드 코울리 소재]을 사용한 정제에 의해 정제하였다. 시험관내 및 생체내 실험을 위해서는, 중간 규모의 정제에 이어 PBS에 대한 밤새 투석 및 30 kDa 컷-오프(cut-off) 농축기[제조원: 밀리포어(Millipore), 영국 와트포드 소재]를 사용한 농축을 수행하는 것이 필수적이다. 최종 항체 스톡을 10 mg/ml의 농도에서 PBS에서 통상적으로 재구성하였다.
침입 검정시 비교를 위해 사용된 모노클로날 항체를 고정된 만난 결합 단백질 컬럼[제조원: 퍼바이오 사이언스 유케이 리미티드(Perbio Science UK Ltd)]을 사용한 후 100 kDa 분자량 컷-오프 여과기를 사용한 농축으로 정제하였다.
최대 활성을 나타내는 것으로 보이는 예비 연구는 클론 R6313클론12D(또한 R6313/G2로 기술) 및 R6313클론11B과 관련되어 있으며, 여기서, CDR은 다음과 같다:
R6313클론12D
VHCDR1: GYSFTGYNMN
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSNLES
VLCDR3: QHIRELTRSEG
또는
R6313클론11B
VHCDR1: GYSFTGYNMS
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSNLES
VLCDR3: QHIRELTRSEG
이들은 원래의 하이브리도마 세포 집단으로부터의 RNA로부터 기원한 cDNA 라이브러리의 패닝동안 ELISA 플레이트 검정시 항원에 대한 현저히 강력한 결합인자였다. CDR내 유일한 변화는 VHCDRH1에 있다. 그러나, 또한 N-말단, KLQQ 및 QLQE 각각에서 2개 서열사이에 하나의 다른 차이가 존재한다. 추가의 10개 클론은 CDR에서 및 구조내 어디에서도 다른 변화를 나타내나(참조: 도 11), ELISA 검정에서 이들은 ELISA 항원 플레이트에 덜 강력하게 결합하였다.
클론 12D 및 11B의 전체 서열이 도 10에 나타낸 바와 같이 정렬된다. 처음 6개의 아미노산과 마지막 8개의 아미노산은 pCANTAB 5E 벡터로부터의 리딩 서열이며, 마지막 5개는 당해 실험에서 사용된 발현된 단백질 생성물에 존재하는 E-태그의 일부를 포함한다.
클론 12D 및 11B의 효과적인 아미노산 서열은 도 14에 나타낸다.
실시예 2: 활성 검정
scFv R6313/G2의 활성을 다음 검정에서 연구하였다:
세포 배양 과정:
MCF-7, T47D 및 MDA-MB-231 유방 암 세포를 아메리칸 조직 배양 협회(The American Tissue Culture Collection)(LGC Promochem, 영국 테딩톤 소재)로부터 입수하였다. 랫트 대동맥 평활근 세포(RASMC)를 원시 배양물로부터 발달시켰다(참조: Barker et al., 1996). MCF-7 세포를 최소 필수 배지(MEM) 속에서 유지시키고, T47D 및 MDA-MB-231 세포를 RPMI 1640 배지속에서 유지시키며, RASMC를 둘베코스 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM) 속에 유지시켰다. 모든 배지에 2mM L-글루타민, 10% 태아 소 혈청(FBS), 50U/ml 페니실린 및 0.05mg/ml 스트렙토마이신을 보충시켰다. 세포를 37℃에서 습윤 대기(95% 산소, 5% CO2) 속에 유지시켰다.
세포 생존성 검정:
합치성 세포 단층을 트립신/EDTA를 사용하는 조직 배양 플라스크로부터 제거하였다. 세포(15x103/웰)를 각각의 세포주에 대해 적절함 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트내로 종균배양하였다. 24시간 후, 세포를 안지오텐신 II (100nM) 및 R6313/G2로 0.005 내지 25μM의 농도 범위에서, 또는 로사르탄으로 유사한 농도 범위에서 처리하고, 추가로 48시간 동안 배양하였다. 세포 생존성은 2, 3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-2H-테트라졸륨-5-카복시아닐린 내부 염(XTT)을 착색된 포르마잔 생성물로 환원시키는 대사적으로 활성인 세포의 능력으로 평가하였다. 흡광도를 멀티스칸 애선트 미세플레이트 판독기(Multiskan Ascent microplate reader)[제조원: 터모 랩시스템(Thermo Labsystem), 핀란드 헬싱키 소재]를 사용하여 450nm의 파장 및 630nm의 참조 파장에서 측정하였다. 각각의 측정을 3회 수행하였다. IC50을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v4.0 소프트웨어[제조원: 그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc), 미국 캘리포니아 샌 디에고 소재]를 사용하여 비-선형 회귀 식으로 계산하였다.
단백질 추출 및 웨스턴 블롯팅:
세포를 안지오텐진 II(100nmol/L)의 존재 또는 부재하에서 24시간 동안 성장시킨 후 멸균 PBS(pH 7.4) 속에서 3회 세척하고, 분해 완충액(PBS pH 7.4, 1% NP-40/트리톤 X-100, 0.1% SDS 및 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 및 프로테아제 억제제 류펩틴 10㎍/ml, 아프로티닌 30㎍/ml 및 0.1mmol/L 페닐메틸설포닐플루오라이드) 속에서 5분 동안 배양하고 수거하였다. 세포 분해물을 초음파기[2x5 초 주기; 제조원: 반델린 소노플러스(Bandelin Sonoplus), SLS, 영국 헤슬 소재]를 사용하여 균질화하였다. 균질화한 후 샘플을 20,000 g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 -80℃에서 저장하였다. 단백질 농도를 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 검정[제조원: 바이오-라드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 영국 헴프스테드 헤멜 소재]을 사용하여 평가하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 50㎍의 총 세포 분해물을 함유하는 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고 전기영동하였다. 단백질을 하이본드-C 막(제조원: 애머샴 바이오사이언스 리미티드, 영국 챨폰트 세인트 길스 소재)에 이전 완충액(39mmol/L 글리신, 48mmol/L 트리스-염기, 20% 메탄올 및 0.037% SDS) 속에서, 트랜스블롯 이전 장치(transBlot transfer apparatus)(제조원: 바이오-라드 래보러토리즈, 영국 헤멜 헴프스테드 소재)를 120mA에서 1.5시간 동안 4℃에서 사용하여 이전시켰다. 막을 세척한 후 차단 완충액[1X 트리스-완충된 염수(TBS), 0.1% 트윈 20 및 5% 분유) 속에서 1시간 동안 실온으로 배양한 후 10분 동안 세척 완충액(1X TBS 및 0.1% 트윈 20) 속에서 3회 세척하였다. 막을 폴리클로날 토끼 항-AT1 수용체 또는 항-AT2 수용체 항체와 함께 차단 완충액 속에서 1:500의 희석으로 배양하였다. 4℃에서 밤새 배양한 후, 막을 위에서 기술한 바와 같이 세척하고 항 토끼 IgG 제2 항체(제조원: 애머샴 바이오사이언시스)(1:2000)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 추가의 세척을 수행하고 면역 검출을, 막을 1분 동안 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(제조원: 애머샴 바이오사이언시스) 속에서 배양함으로써 수행하고, 바이오막스 화학발광성 검출 필름(Biomax chemiluminescence detection film)[제조원: 코닥(Kodak), 미국 뉴욕 로체스터 소재]에 노출시켰다.
세포자멸사-카스파제-3/7 활성:
세포자멸사 동안 카스파제의 활성을 Apo-ONE 균질성 카스파제-3/7 검정[제조원: 프로메가 코포레이션(Promega Corp), 영국 사우쓰앰프톤 소재]을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 요약하면, 세포를 90% 합치로 성장시키고 멸균 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 트립신/EDTA를 사용하여 수거하고 계수하였다. 세포(104/웰)을 96웰 플레이트에 종균배양하고 R6313/G2와 함께 0.1 내지 3μM의 농도에서 100nmol/L 안지오텐신 II, 총 용적 150㎕으로 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 카스파제-3/7 Z-DEVD-R110 기질(100㎕)을 각각의 웰에 가하였다. 블랭크 웰은 시약만을 함유하였으며, 대조군은 항체 및/또는 안지오텐신 II를 함유하지 않았다. 형광성은 8시간의 기간에 걸쳐 매 2시간마다 플루오스타 옵티마 분광형광계[Fluostar Optima spectrofluorimeter: 제조원: 비엠지 래보러토리즈(BMG Laboratories), 독일 오펜부르크 소재]를 사용하여, 485nm의 여기 파장 및 535nm의 방사 파장으로 측정하였다.
중공 섬유 검정
중공 섬유 공정은 홀링스헤드(Hollingshead)의 방법[참조: Hollingshead et al Life Sci 57 131-41(1995)]에 따랐다.
중공 섬유의 제조:
폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 중공 섬유(500 kDa 컷-오프, 1mm 내부 직경; 제조원: 스펙트럼 유럽 비. 브이.(Spectrum Europe B.V.), 네덜란드 브레다 소재]를 평활 21 게이지 침 및 10ml 주사기를 사용하여 70% 에탄올을 통과시켜 플러싱하였다. 이후에, 섬유를 70% 에탄올 속에 72시간 동안 침지시키고, 다시 70% 에탄올에 이어서 증류수를 통해 플러싱한 후, 131℃에서 오토클레이브하였다. 최종적으로, 세포 현탁액을 로딩하기 전에, 섬유를 RPMI 1640 배양 배지를 통해 플러싱하였다. 세포(MCF-7, T47D, 및 MDA-MB-231)를 섬유에 2.5 내지 3.0 x106 세포/ml의 밀도로 도입하였다. 이후에, 섬유를 2cm 간격으로 열-밀봉하고 3ml의 세포 선호 배지를 함유하는 페트리 디쉬 속에 두었다.
생체내에서 사용하기 전에 방법의 효능을 시험하기 위하여, 세포-로딩된 섬유를 생체내에서 항체의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 0.33μM 내지 33μmol/L 의 농도 범위에서 안지오텐신 II (100nmol/L)와 함께 배양하였다.
생체내 중공 섬유 검정:
세포-로딩된 중공 섬유 단편을 37℃에서 배양 배지 속에서 밤새 배양한 후 순수한 균주 5-6주령의 암컷 balb/c nu/nu 마우스내로 삽입하였다. 섬유를 동물내로 마취(2% 이소플루오란)하에 삽입하였다. 각각 세포주 MCF-7, T47D, 또는 MDA-MB-231 중 하나를 함유하는 3개의 2cm 섬유를 피하(s.c.) 및 복강내(i.p.) 부위 둘다에서 각각의 동물내로 삽입하였다. 복강내 주입을 위해, 피부 및 배쪽 복벽의 근조직을 통해 작은 절개를 하였다. 섬유를 복강내에 위치시키고, 절개 둘다를 금속성 봉합 클립(metallic suture clips)[제조원: 하바드 인스트루먼츠(Harvard Instruments), 영국 에댄브릿지 소재]으로 봉합하였다. 피하 주입을 위해, 등쪽으로 작은 절개를 만들었다. 섬유를 뇌 방향으로 등쪽 중간의 좌측에 주입하였다. 작은 절개를 금속성 봉합 클립으로 봉합하였다.
항체 처리:
중공 섬유 삽입체를 가진 마우스(n=5/그룹)를 R6313/G2[0.1ml의 PBS 중 0.07mg/kg (2.5nmol/kg), 및 0.7mg/kg (25nmol/kg)]으로 1일당 2회 6일 동안 피하처리하였다. 대조군 동물(n=5)에게는 비히클만을 제공하였다. 마지막 주사한 지 24시간 후, 동물을 목척추뼈 탈구로 사멸시키고 섬유를 회수하여 20% FBS를 함유하는 예비-가온시킨 RPMI 1640 배지에 30분 동안 이전시켰다.
중공 섬유내 종양 세포 성장의 평가:
세포 생존성을 변형된 MTT 검정을 사용하여 측정하였다. 섬유를 1mg/ml MTT를 함유하는 20% FBS와 함께 RPMI 1640 속에서 배양하고, 37℃에서 95% O2, 5% CO2 하에 4시간 동안 배양하였다. 시약을 흡인하고, 2ml의 멸균 여과된 2.5% 프로타민 설페이트(0.9g NaCl, 100ml의 물 중 2.5g 프로타민 설페이트)를 가하였다. 표본을 4℃에서 최소 24시간 동안 암실에서 저장하여 포르마잔 생성물을 고정시켰다. 신선한 프로타민 설페이트(2.5%)를 가하고 섬유를 추가로 2 내지 4시간 동안 4℃에서 저장하였다. 각각의 섬유를 24웰 플레이트내 웰에 이전시키고, 반으로 절단하고 밤새 공기-건조시키고, 광으로부터 보호하였다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)(300㎕)를 각각의 웰에 가하고 포르마잔 생성물을 추출하였다. 각각의 웰로부터의 분취량(190㎕)을 96 웰 플레이트에 이전시키고 흡광도를 540nm에서 멀티스칸 애센트 광도계 미세플레이트 판독기(Multiskan Ascent photometric microplate reader)[제조원: 터모 랩시스템(Thermo labsystem)]을 사용하여 판독하였다. 처리된 값을 대조군의 퍼센트로 계산하였다.
생체내 이종이식체 검정:
마우스에 7.5x106 MCF-7 세포를 함유하는 150㎕의 멸균 PBS를 우측 옆구리 사에 피하 주사하였다. 종양 세포가 호르몬 공급없이 4주 동안 성장하도록 한 후, 마우스에게 참깨 오일[참조: Kasukabe et al., Breast Cancer Res. 7(6) R1097-110 (2005)] 중 17β-에스트라디올 발러레이트(0.1 mg/Kg 체중)의 피하 주사를 추가로 8주 동안 매주 제공하였다. 동물을 일반적인 건강에 대해 매일 모니터링하고 체중을 1주에 2회씩 측정하였다. 종양 크기를 슬라이드 켈리퍼(slide calliper)로 1주당 3회 측정하고, 용적을 (L X W2)/2(여기서, L 및 W는 각각 큰 및 작은 직경이다)로서 계산하였다. 종양 용적이 150 내지 200 mm3에 이르면, 마우스를 그룹당 8 내지 10마리의 처리 및 대조군 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에게 멸균 PBS(0.1ml) 중 R6313/G2를 0.4mg/kg (13 nmol/kg), 0.8mg/kg (27 nmol/Kg), 및 1.36mg/kg (45.3nmol/kg) 체중으로 하루에 2회 7일 동안 피하 주사하여 처리하였다. 대조군 마우스에게는 멸균 PBS를 제공하였다. 연구 말기에, 동물을 목척추뼈 탈구로 희생시켰다. 상대적인 체중(%)를 (Wt/Wi) X 100(여기서, Wt는 특정의 주어진 시간에서의 체중이고 Wi는 치료 개시에서의 체중이다)로 계산하였다. 전체 종양 용적을 Vt-Vi(여기서, Vt는 특정의 주어진 시간에서의 종양 용적이며 Vi는 치료 개시에서의 종양 용적이다)로 계산하여 Vi의 퍼센트로 나타내었다.
랫트 혈압
랫트를 혈압 검정에서 이들의 보다 우수한 취급성 측면에서 연구의 본 부분을 위해 선택하였다. 암컷 위스타 랫트(Wistar rat)를 우선 조작 및 혈압 장치에 실험 전 4 내지 5일 동안 익숙해지도록 하였다. 의식이 있는 동물에서 혈압을 켄트 사이언티픽 코포레이션(Kent Scientific Corporation)(미국 코넥티컷 토링톤 소재)을 사용하여 Coda 6+ 꼬리 띠 시스템(tail cuff system)을 사용하여 측정하며, 여기서, 동물은 혈압을 측정하는 동안 가온한 억제제(retrainer) 속에 유지시켰다. 동물을 우선 안정화시키고 이들의 기본 혈압을 처리 전에 취하였다. 이후에, 이들을 멸균 PBS(0.1ml) 중 0.4mg/kg의 R6313/G2을 피하 주사하기 위해 억제제로부터 제거하였다. 대조군에게는 PBS 만 제공하였다. 이후에, 혈압을 1시간의 기간에 걸쳐 수회 간격으로 우리에 다시두기 전에 측정하였다. 당해 과정을 3일 동안 매일 반복하였다.
통계적 분석:
모든 데이타를 평균 ± SE로 나타내었다. 통계적 분석을 1-방식 ANOVA를 사용하여 수행하였다. ANOVA에서 현저한 결과의 경우, 스튜던트 t-시험을 투여량-반응 곡선에 대해 사용하였다. 0.05 미만인 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
형광성 침입 검정
사용된 방법은 QCMTM 세포 침입 검정[제조원: 케미콘(Chemicon) 제품 번호 ECM555]이다. 이는 엔젤브레쓰-홀름-스완(Engelbreth-Holm-Swam)(EHS) 마우스 종양 단백질으로부터 기원한 재구성된 기저막 매트릭스 단백질을 통해 야기된 세포의 형광성 검출을 사용한다[참조: Repesh LA(1989) Invasion Metastasis 9:192-208].
ECM-피복된 삽입체를 96-웰 플레이트 속에 위치시키고 100㎕의 예비가온시킨 혈청이 없는 배지를 삽입체의 내부에 가하여 ECM 층을 1 내지 2시간 동안 실온에서 수화시켰다. 배지를 제거하고 150㎕의 혈청이 유리된 배지를 삽입체가 들어있는 96-웰 플레이트의 벽에 가하였다. 105 세포/삽입체를 함유하는 100㎕의 배지를 도입하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 5% CO2/95% 공기 습윤화시킨 항온처리기 속에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 삽입체 내부로부터 제거하고 PBS로 세정한 후, 삽입체를 세포 탈착 용액을 함유하는 96-웰 플레이트내로 교체하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. ECM을 통해 삽입체의 바닥으로 침입한 세포를 당해 방식에서, 후속적인 분해 및 플루오스터 옵티마 형광계(제조원: 비엠지 랩테크) 속에서 480/520 여과기 세트를 사용하여 제조업자의 지시에 따른 형광성 측정으로부터 제거하였다.
실시예 3: 인간화된 변이체의 설계
인간화된 변이체는 위에서 기술한 쥐 서열 12D를 기초로 하였다. 아미노산 치환은 앞서 공지된 시도를 지력의 정도와 함께 조합하여 사용함으로써 선택하였다. 첫째로, 쥐 scFv 서열을 사용하여 NCBI 데이타베이스에서 BLAST 조사를 사용하여 가장 동질성인 가변 중쇄 및 경쇄를 발견하였다. 둘째로, 파들란(Padlan)에 의해 기술된 시도[참조: Molecular Immunology 28(4/5) 489-498 (1991)]를 사용하여 어느 아미노산 잔기가 전체 scFv 분자내 노출된(즉, 친수성) 잔기인지 또는 숨겨진(소수성) 잔기인지를 나타내었다. 파들란에 의한 문헌에 대한 참조는 또한 인간 배선(germ-line) 아미노산이 사용되어 쥐 잔기에 대해 적절하게 치환될 수 있으며 이러한 방식으로 재표면화된 scFv를 생성할 수 있는 선택사항을 제공하였으며, 여기서, 일반적으로 이들 노출된 쥐 잔기의 치환은 거의 면역원성이 없는 전체의 scFv 단백질을 생성하였다.
추가의 2개의 치환은, 이들 2개 위치내 인간 배선 잔기가 파들란의 기술(상기 참조)에 따라, 가변 영역의 4개의 아그룹을 통해 완전히 보존되기 때문에 변화에 대해 민감한 것으로 여겨지는 CDR(여기서 CY) 중 한쪽을 포함하였다.
당해 시도에 의해 확인된 인간화된 변이체, HuCY, var3 및 var4 3개 중 모두는 2개의 쥐 scFvs, 12D 및 11B보다 ELISA에 의해 보다 강력하게 펩타이드 항원(AT1-수용체 N-말단 영역으로부터)에 결합한다.
쥐 scFv 단백질 서열을 가변 중쇄 및 가변 경쇄내 함유된 골격 영역내에서만 변형시켜 인간화된 변이체 HuCY 및 var3을 생산하였다. 그러나, 인간화된 변이체 var4는 또한 경쇄의 CDR2내에 2개의 추가의 변화를 갖는다.
인간화된 변이체의 CDR은 다음과 같다:
HuCY 및 var3
VHCDR1: GYSFTGYNMN
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSNLES
VLCDR3: QHIRELTRSEG
var4
VHCDR1: GYSFTGYNMS
VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3: EVDY
VLCDR1: RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2: LVSDLED
VLCDR3: QHIRELTRSEG
클론 12D, 11B 및 인간화된 변이체 HuCY, 변이체 3 및 변이체 4의 서열을 도 14에 나타낸다.
실시예 4: 인간화된 변이체상에서 활성 검정
인간화된 변이체의 활성을 다음 검정에서 연구하였다:
비교 결합 연구를 위한 ScFv 생산 및 정제
모든 유전자 서열을 블루 헤론 바이오테크놀로지(Blue Heron Biotechnology)(미국 워싱톤 보텔 소재)에서 합성하고 T7lac 프로모터의 조절하에서 His-태그 암호화 서열로부터 상부로 세균 단백질 발현 벡터에 통합시켰다. 사용된 벡터는 세균 숙주내에서 원형질 영역에 도달후 시그날 펩티다제에 의해 절단되는 원형질 표적화 리더 서열을 포함하였다. 숙련가는, 다른 적합한 벡터가 또한 본 발명의 scFv를 생산하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
이들 작제물을 제조업자의 프로토콜에 따라서 로제타(Rosetta) 2(DE3) 적격 세포[제조원: 머크-노바겐(Merck-Novagen)]내로 형질전환시켰다. 균주를 통상적으로 LB 브로쓰 또는 LB 아가속에서 37℃로 30 mg/l의 가나마이신 및 34 mg/l의 클로람페니콜을 사용하여 성장시켰다. 단백질 발현을 1L의 세균 배양물을 사용하여 수행하고 24시간 동안 2L의 칸막이가 있는 플라스크 속에 37℃에서 성장시켰다. 이후에, 단백질 생산을 IPTG를 0.4mM의 최종 농도로 5시간 동안 25℃에서 첨가하여 유도시켰다.
세균 세포 펠렛을 벡만 코울터 아반티(Beckman Coulter Avanti) J-30I 원심분리기 속에서 5000 g (rcf)로 20분 동안 4℃에서 수거한 후, 세포 펠렛을 다음 완충액 10ml (배양물 리터당) 속에 재현탁시켰다: 0.4M 트리스-HCl pH 8, 1mM EDTA. 이후에, 수득되는 세포 펠렛을 -20℃에서 정제까지 저장하였다.
원형질 분획을 제조하기 위해, 1L 펠렛을 해동시키고 다음 완충액을 가하였다: 10ml의 1M 슈크로즈 및 30ml의 1/5 TES 완충액(40mM 트리스-HCl pH 8, 0.1mM EDTA, 0.1M 슈크로즈 및 5mM MgSO4). 이후에, 당해 세포 현탁액을 빙상에서 40분 동안 교반한 후, 17418 g (rcf)에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 가용성 원형질 상층액을 분리하였다. 당해 삼투압 쇼크 프로토콜은 문헌[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)]으로부터 입수한 노바겐 매뉴얼에서 제공한 방법의 변형법이다.
이후에, 원형질막 분획을 0.45μM 여과기를 통해 여과하고 NiSO4 (제조원: 머크-노바겐)이 충전된 1ml의 예비-부어진 His-결합 컬럼에 적용하였다. 정제를pET 시스템 매뉴얼 지시에 따라, His-결합 완충액 키트(제조원: 머크-노바겐) 속에 공급된 완충액을 사용하여 수행하였다. 수득되는 용출액은 PD-10 컬럼[제조원: 파마시아(Pharmacia)]을 통과시켜 교환한 완충액이며, 이는 이미 포스페이트 완충된 염수 7.4(PBS; 시그마 P4417)로 평형화시킨 것이다. 이후에, 수득되는 scFv 분획을 10 kDa 분자량 컷 오프 스핀 농축기[제조원: 아미콘(Amicon)]을 사용하여 농축시켰다. PBS중 scFv 분획의 농도를 10-15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 이동시키고, 바이오-라드 단백질 검정을 수행하고 280nm에서 UV 흡광도를 기록함으로써 확인하였으며, 흡광도는 흡광 계수(단백질의 분자량으로 나눈 몰 흡광 계수- ~25.7kDa) 1.7로 나누어서 농도로 전환시킨다.
비교 결합 연구를 위해 IgM을 세포 침입 연구에 대해 앞서 기술한 바와 같이 정제하였다. IgM을 위해 사용된 흡광 계수는 1.18이었다[참조: Johnstone A, Thorpe R. Immunochemistry in practice. 2nd ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications (1987)].
ELISA를 사용한 항원 결합의 시험
효소-결합된 면역흡후 검정(ELISA)을 펩타이드 항원 EDGIKRIQDDC-바이오틴(카보네이트 완충액 pH 9.6 중 2-8㎍/ml)이 피복된 막시소프(Maxisorp) 96-웰 플레이트 속에서 밤새 4 또는 37℃에서 수행하였다. 피복된 웰을 1% 알칼린 가용성 카제인(차단 완충액)을 사용하여 1시간 동안 실온에서 차단시킨 후 0.1% v/v 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. PBS-T 속에서 1:1 내지 1:100으로 희석시킨 ScFv 샘플을 가하고 1시간 동안 실온에서 배양한 후 앞서와 같이 세척하였다. 제2의 HRP-접합된 항-His-Tag 항체(차단 완충액 속에서 1:1000으로 희석시킴)를 1시간 동안 실온에서 가하였다. 이후에, 웰을 PBS-T 속에서 3회에 이어 PBS(트윈 20 비포함)로 2회 세척하였다. 100㎕의 TMB 기질 용액을 가하고 색이 30분 동안 발색되도록 하며, 이때, 100㎕의 2M 황산을 가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 플레이트 판독 분광광도계상에서 판독하였다. 단백질 농도를 280 nm에서 에펜도르프 바이오광도계 판독 및 위에서와 같이 1.7의 scFv에 대한 흡광계수를 사용하여 측정하였다. 결과는 도 12에 나타낸다.
도 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 재표면화된 scFv (HuCY, var3 및 var4) 대 쥐 scFv (12D 및 11B)에서 펩타이드 항원에 대한 결합이 증가하였다. 변화가 동일한 양 및 순도의 쥐 scFv와 비교하여 ELISA에서 50배 더 열성적으로 항원성 펩타이드 EDGIKRIQDDC-바이오틴에 결합한 단백질, HuCY를 생성하는 쥐 scFv의 골격 영역내에서 일어났다는 것은 예측하지 못하게 관측된 것이었다. 또한, 인간화된 변이체 var4는 모 쥐 scFv와 비교하여 항원에 대한 결합을 5 내지 10배 증가시킴을 나타내었다. 이는, var4의 CDR(VLCDR2) 중 하나가 모 쥐 scFv와 관련하여 변형되었으므로 놀라운 것이다.
도 13은 원래의 하이브리도마로부터의 정제된 IgM에 대한 쥐 scFv(12D) 및 가공된 변이체 scFv(HuCY 및 var4)의 간접적인 비교를 나타낸다. 도 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, 변이체 scFv는 쥐 scFv보다 높은 활성을 가졌다.
석영 결정 미세균형을 사용한 결합 특성의 비교
데이타는 scFv 변이체 및 IgM의 고정된 펩타이드 항원에 대한 결합의 특성을 아타나(Attana) 100 석영 결정 미세균형을 사용하여 비교함으로써 수득하였다. 이는 스트렙타비딘(0.1mg/ml)-피복된 바이오틴 "칩"[아타나 100 바이오센내 금-플레이팅된 석영 결정(석영 결정 미세균형: Quartz crystal microbalance(QCM)][제조원: 아타나 에이비(Attana AB), 스웨덴 소톡홀름 소재]의 사용을 포함한다. 이후에, 원래의 쥐 하이브리도마를 생성하기 위해 사용되고 C-말단에서 바이오티닐화된 서열에 상응하는 펩타이드 항원을 칩에 4㎍/ml의 농도에서 수행하여 QCM 칩의 표면을 후속적으로 수행한 scFv 및 IgM에 대한 결합 표적을 생성하였다. 애터스터 소프트웨어(Attester software)(제조원: 아테나, 스웨덴 소재)을 사용하여 항원에 대한 시험 항체의 결합에 대한 반응시 QCM 칩의 공명 횟수에 있어서의 변화를 모니터하였다. 100초의 샘플 주입의 기간에 걸쳐 Hz에 있어서의 편향의 크기(Hz/초)를 각각의 항체에 대해 9㎍/ml의 농도에서 측정하였다. 이후에 항체가 QCM 칩으로부터 방출되었던 속도를 항체가 칩으로부터 서서히 탈착되고 칩의 공명 횟수가 감소함에 따라 바이오센서 트레이스의 직선 부분으로부터 Hz/초로 측정하였다. 수행 완충액은 0.005% 트윈 20 (PBST)을 함유하는 PBS이었고, 이는 또한 각각의 경우에 9㎍/ml의 최종 단백질 농도를 제공하기 위한 항체 희석을 제조하는데 사용하였다. 아타나 100을 50㎕ 주입 루프로 고정시키고 20㎕/분의 고정 펌프 속도로 수행하였다. 샘플 및 PBST 완충액 대조군을 100초에 걸쳐 주입하여 샘플 용적이 33㎕의 칩 용적을 초과하도록 하였다. 100mM(6.6㎕ 용적)의 인산 용액을 사용하여 개개의 실험 샘플 수행사이에 스트렙타비딘-항원 표면을 재생하였다.
결과는 도 15에 나타낸다. ScFvs 12D, var3 및 var4는 IgM에 대한 것과 비교하여 주입 기간에 걸쳐 공명 횟수를 현저히 크게 증가시킴을 나타낸 반면, 항체가 당해 실험 조건하에서 QCM 칩으로부터 방출된 속도에서 현저한 차이는 관측되지 않았다.
<110> QUEEN MARY & WESTFIELD COLLEGE <120> Synthetic scFv analogue to the 6313/G2 (anti angiotensin II type 1 receptor) monoclonal antibody variable regions <130> IPA100496 <150> GB0802931.6 <151> 2008-02-18 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 Glu Asp Gly Ile Lys Arg Ile Gln Asp Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHCDR1 <400> 2 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHCDR2 <400> 3 Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHCDR3 <400> 4 Glu Val Asp Tyr 1 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLCDR1 <400> 5 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLCDR2 <400> 6 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLCDR3 <400> 7 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative VHCDR1 <400> 8 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative VLCDR2 <400> 9 Leu Val Ser Asp Leu Glu Asp 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-tag <400> 10 Gly Ala Pro Val Pro Tyr 1 5 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag <400> 11 Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Pro Leu Glu Pro Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus <400> 12 Lys Leu Gln Gln 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus <400> 13 Gln Leu Gln Glu 1 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cys is added to SEQ1 for combination with biotin <400> 14 Glu Asp Gly Ile Lys Arg Ile Gln Asp Asp Cys 1 5 10

Claims (12)

  1. EDGIKRIQDD의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하며, 각각 하기 나타낸 바와 같은 각각의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR) VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3를 포함하는 면역글로불린 VH 도메인에 연결된 상보성 결정 영역(CDR) VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3를 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 특이적인 결합 분자.
    여기서,
    VHCDR1은 GYSFTGYNMN이고,
    VHCDR2는 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
    VHCDR3은 EVDY이고,
    VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
    VLCDR2은 LVSNLES이고,
    VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.
  2. 제1항에 있어서, CDR이 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 특이적인 결합 분자.
    여기서,
    VHCDR1은 GYSFTGYNMN 또는 GYSFTGYNMS이고,
    VHCDR2은 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
    VHCDR3은 EVDY이고,
    VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
    VLCDR2는 LVSNLES 또는 LVSDLED이고,
    VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CDR이 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 특이적인 결합 분자.
    여기서,
    VHCDR1은 GYSFTGYNMN이고,
    VHCDR2는 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
    VHCDR3은 EVDY이고,
    VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
    VLCDR2은 LVSNLES이고,
    VLCDR3은 QHIRELTRSEG이거나,
    VHCDR1은 GYSFTGYNMS이고,
    VHCDR2은 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
    VHCDR3은 EVDY이고,
    VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
    VLCDR2는 LVSNLES이고,
    VLCDR3은 QHIRELTRSEG이거나,
    VHCDR1은 GYSFTGYNMN이고,
    VHCDR2는 NIDPYYGGTTYNQKFKG이며,
    VHCDR3은 EVDY이고,
    VLCDR1은 RASKSVSTSTSGYSYMH이며,
    VLCDR2는 LVSDLED이고,
    VLCDR3은 QHIRELTRSEG이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 있어서, 도 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 특이적인 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자.
  7. 암 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자.
  8. 대상체에게 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자를 투여함을 포함하여, 상기 대상체의 암을 치료하는 방법.
  9. 암의 치료시 사용하기 위한 의약의 제조에 있어 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자의 용도.
  10. 대상체에서 암을 치료하기 위한 개별의, 동시 또는 연속 투여용의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자 및 안지오텐신-II의 배합 제제.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자 및 안지오텐신-II를 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 특이적인 결합 분자 및 안지오텐신-II를 포함하는 약제학적 조성물.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2777527C (en) 2009-12-23 2020-06-23 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Method for decreasing immunogenicity
CA2830503A1 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Minerva Biotechnologies Corporation Method for making pluripotent stem cells
EA039745B1 (ru) * 2014-03-12 2022-03-05 Нейриммьюн Холдинг Аг Новые соединения, способные противодействовать повреждению -клеток, индуцируемому островковым амилоидным полипептидом, и нарушению толерантности к глюкозе
EP3908603A4 (en) * 2019-01-11 2023-01-11 Minerva Biotechnologies Corporation ANTI-VARIABLE MUC1* ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN112807281A (zh) * 2019-10-31 2021-05-18 南京海维医药科技有限公司 包含血管紧张素ii的稳定组合物及其制备方法、使用方法
WO2021142253A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 President And Fellows Of Harvard College Anti-angiotensin ii type 1 receptor (agtr1) binding proteins

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995009186A1 (en) * 1993-09-27 1995-04-06 Queen Mary And Westfield College Type i angiotensin ii receptor specific monoclonal antibodies and hybridomas
WO2004018519A2 (en) * 2002-08-21 2004-03-04 Queen Mary & Westfield College Therapeutic uses of monoclonal antibodies to the angiotensin-ii type-1 receptor

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5427922A (en) 1992-04-07 1995-06-27 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA encoding a new angiotensin II type 1 receptor subtype and its expression
TW448185B (en) 1993-11-05 2001-08-01 Lilly Co Eli Vaccine design and production
US6280994B1 (en) 1998-11-25 2001-08-28 Zymogenetics, Inc. Zace 1: a human metalloenzyme
CZ293257B6 (cs) * 1998-12-23 2004-03-17 Novartis Ag Farmaceutický přípravek obsahující antagonistu receptoru AT1 pro léčení nemocí spojených s nárůstem receptorů AT1 v subepiteliální vrstvě
US6641811B1 (en) * 2000-02-10 2003-11-04 Cornell Research Foundation, Inc. Use of angiotensin II inhibitors to prevent malignancies associated with immunosuppression
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995009186A1 (en) * 1993-09-27 1995-04-06 Queen Mary And Westfield College Type i angiotensin ii receptor specific monoclonal antibodies and hybridomas
WO2004018519A2 (en) * 2002-08-21 2004-03-04 Queen Mary & Westfield College Therapeutic uses of monoclonal antibodies to the angiotensin-ii type-1 receptor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Am. J. Physiol. 273(1 Pt 2): F170-7(1997. 7.) *
J. Mol. Endocrinol. 11(2): 241-245(1993. 10.) *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2010135976A (ru) 2012-03-27
AU2009216535A1 (en) 2009-08-27
US9422369B2 (en) 2016-08-23
AU2009216535B2 (en) 2014-10-23
JP2015110580A (ja) 2015-06-18
JP5997245B2 (ja) 2016-09-28
RU2512071C2 (ru) 2014-04-10
EP2262833B1 (en) 2013-02-13
BRPI0905964A2 (pt) 2015-08-18
PL2262833T3 (pl) 2013-07-31
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