TW202227509A - 針對vegf及ang2之雙特異性結合分子 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於針對人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)及針對人類血管生成素-2 (ANG-2)之雙特異性結合分子，包括蛋白質序列、其製備方法，含有該等雙特異性結合分子之醫藥組合物，及其治療性及診斷性用途。
Description
本發明係關於針對人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)及針對人類血管生成素-2 (ANG-2)之雙特異性結合分子，包括蛋白質序列、其製備方法、含有該等雙特異性結合分子之醫藥組合物，及其治療性及診斷性用途。
血管生成牽涉各種病症，包括實體腫瘤、眼內新生血管症候群(諸如增殖性視網膜病或年齡相關之黃斑變性(AMD))、類風濕性關節炎及牛皮癬之發病機理(Folkman, J.等人，J. Biol. Chem.267 (1992) 10931-10934；Klagsbrun, M.等人，Annu. Rev. Physiol.53 (1991) 217-239；及Garner, A., Vascular Diseases, 在以下中：Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, Garner, A.及Klintworth, G. K. (編輯)，第2版，Marcel Dekker, New York (1994)，第1625至1710頁)。
人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)述於(例如) Leung, D.W.等人，Science 246 (1989) 1306-9；Keck, P.J.等人，Science 246 (1989) 1309-12及Connolly, D.T.等人，J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24中。VEGF之表現因回應低氧、藉由經活化致癌基因及藉由各種細胞激素而增強。VEGF涉及調節正常及異常血管生成及與腫瘤及眼內病症相關聯之新生血管形成(Ferrara, N.等人，Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25；Berkman, R.A.等人，J. Clin. Invest.91 (1993) 153-159；Brown, L.F.等人，Human Pathol. 26 (1995) 86-91；Brown, L.F.等人，Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735；Mattern, J.等人，Brit. J. Cancer.73 (1996) 931-934；及Dvorak, H.F.等人，Am. J. Pathol.146 (1995) 1029-1039)。
眼部血管疾病，諸如年齡相關之黃斑變性(AMD)及糖尿病性視網膜病(DR)各自由異常脈絡膜及視網膜新生血管形成引起，及為視力喪失之首要原因。因為視網膜由神經元、神經膠質及血管元件之良好限定之層組成，所以血管增殖或水腫之相對小擾動可導致視覺功能之顯著喪失。遺傳性視網膜退化，諸如色素性視網膜炎(RP)亦與血管異常(諸如小動脈狹窄及血管萎縮)相關聯。其影響多達1/3500個個體及特徵在於進行性夜盲症、視野喪失、視神經萎縮、小動脈衰減及中心視力喪失至完全失明。
於視網膜病中，視網膜之局部或一般缺血伴隨VEGF之過度表現及血管之過度增殖，可導致失明(Aiello, L. P等人，1994. N. Engl. J. Med.331, 1480-1487；Adamis, A. P.等人，Am. J. Ophthalmol. 118, 445-450)。於此等眼科疾病狀態中VEGF表現之抑制可能夠治療或預防所導致之失明。
人類血管生成素-2 (ANG-2或Ang-2或Ang2) (或者稱作ANGPT2或ANG2)述於Maisonpierre等人，Science 277 (1997) 55-60及Cheung, A.H.等人，Genomics 48 (1998) 389-91中。Ang2於血管生成中起著重要作用及其表現程度已與癌症及眼病相關(D. Gerald等人，Cancer Res. 2013, 73(6):1649-57；Watanabe等人，Am. J. Ophthalmol. 2005, 139(3):476-81)。
針對經由玻璃體內施用之眼病，通常使用較小抗體片段，如Fab或F(ab’)2，因為其由於其較短血清半衰期而具有較低全身毒性。此外，此等較小片段通常亦具有較短玻璃體內半衰期(例如，由於較快擴散至血清)及通常更頻繁給藥。
本發明提供能抑制VEGF及/或Ang2之雙特異性結合分子。於一些實施例中，與單特異性抑制劑相比，該等雙特異性結合分子可具有基於更大分子尺寸之更長半衰期。於一些實施例中，該等雙特異性結合分子經設計以抑制血管生成及/或治療眼病。亦揭示用於製備雙特異性結合分子之方法，包括涉及核酸、載體、表現載體及宿主載體系統之方法。本發明包含下列實施例。
[1]一種雙特異性結合分子，其包含含有抗血管生成素2 (ANG2)結合域及血管內皮生長因子(VEGF)結合域之多肽，
其中該抗ANG2結合域為ANG2抗體或其抗原結合片段，其中該VEGF結合域包含結合至VEGF多肽之融合蛋白，該VEGF多肽包含以可操作方式連接至Fc域之VEGF受體之細胞外域，其中該抗ANG2結合域為Fab片段或scFv片段。
[2]如[1]之雙特異性結合分子，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，其中該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中該Fc域為IgG1。
[3]如[2]之雙特異性結合分子，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，其中該IgG1經突變。
[4]如[2]之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有根據EU/Kabat編號方案在選自該IgG1之第235及第309位置之至少一個位點處具有取代、缺失、插入及/或新增之胺基酸序列。
[5]如[4]之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有根據EU/Kabat編號方案在該IgG1之第309位置處具有取代之胺基酸序列。
[6]如[5]之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有取代成K之胺基酸序列。
[7]如[4]之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有根據EU/Kabat編號方案在該IgG1之第235位置處具有取代之胺基酸序列。
[8]如[7]之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有取代成K之胺基酸序列。
[9]如[1]至[6]中任一項之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合域與該ANG2結合域之N端連接。
[10]如[1]至[6]中任一項之雙特異性結合分子，其中該ANG2結合域與該VEGF結合域之N端連接。
[11]如[1]至[10]中任一項之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為Fab片段。
[12]如[1]至[10]中任一項之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段。
[13]如[1]至[12]中任一項之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合域與該ANG2結合域經由連接子連接。
[14]如[1]至[13]中任一項之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
[15]如[14]之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
[16]如[14]之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
[17]如[1]至[13]中任一項之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
[18]如[17]之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
[19]如[17]之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
[20]如[1]至[13]中任一項之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含選自由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群之胺基酸序列。
[21]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為包含抗ANG2結合Fab重鏈及輕鏈之Fab片段，其中該抗ANG2結合Fab重鏈視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該抗ANG2結合Fab重鏈包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列及該抗ANG2結合Fab輕鏈包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[22]如[21]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為包含抗ANG2結合Fab重鏈及輕鏈之Fab片段，其中該抗ANG2結合Fab重鏈視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該抗ANG2結合Fab重鏈包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列及該抗ANG2結合Fab輕鏈包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[23]如[21]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為包含抗ANG2結合Fab重鏈及輕鏈之Fab片段，其中該抗ANG2結合Fab重鏈視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該抗ANG2結合Fab重鏈包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列及該抗ANG2結合Fab輕鏈包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[24]如[21]至[23]之雙特異性結合分子，該肽連接子包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
[25]如[21]至[23]之雙特異性結合分子，該肽連接子包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
[26]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為包含抗ANG2結合Fab重鏈及輕鏈之Fab片段，其中該抗ANG2結合Fab重鏈視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之C端，其中該抗ANG2結合Fab重鏈包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列及該抗ANG2結合Fab輕鏈包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[27]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為包含抗ANG2結合Fab重鏈及輕鏈之Fab片段，其中該抗ANG2結合Fab重鏈視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之C端，其中該抗ANG2結合Fab重鏈包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列及該抗ANG2結合Fab輕鏈包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[28]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為包含抗ANG2結合Fab重鏈及輕鏈之Fab片段，其中該抗ANG2結合Fab重鏈視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之C端，其中該抗ANG2結合Fab重鏈包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列及該抗ANG2結合Fab輕鏈包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[29]如[26]至[28]之雙特異性結合分子，該肽連接子包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
[30]如[26]至[28]之雙特異性結合分子，該肽連接子包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
[31]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段，其中該scFv片段視情況通過第一肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該scFv片段通過第二肽連接子包含VH及VL，該VH及VL各自包含SEQ ID NO: 3及4之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[32]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段，其中該scFv片段視情況通過第一肽連接子融合至該VEGF結合域之C端，其中該scFv片段通過第二肽連接子包含VH及VL，該VH及VL各自包含SEQ ID NO: 3及4之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[33]如[31]至[32]之雙特異性結合分子，該第二肽連接子包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。
[34]如[31]至[33]之雙特異性結合分子，該第一肽連接子包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
[35]如[31]至[33]之雙特異性結合分子，該第一肽連接子包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
[36]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段，其中該scFv片段視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該scFv包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[37]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段，其中該scFv片段視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之C端，其中該scFv包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列及該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[38]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段，其中該scFv片段視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該scFv包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列及該VEG結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[39]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段，其中該scFv片段視情況通過肽連接子融合至該VEGF結合域之C端，其中該scFv包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列及該VEG結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
[40]如[36]至[39]之雙特異性結合分子，該肽連接子包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
[41]如[36]至[39]之雙特異性結合分子，該肽連接子包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
[42]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為Fab片段，其中該Fab片段通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 10之輕鏈胺基酸序列。
[43]如[1]之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為Fab片段，其中該Fab片段通過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 2之輕鏈胺基酸序列。
[44]如[1]至[43]中任一項之雙特異性結合分子，其中該結合分子為其多肽之二聚體。
[45]一種醫藥組合物，其包含如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子及醫藥上可接受之賦形劑。
[46]一種抑制血管生成之方法，其使用如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子。
[47]一種改善及/或治療選自血管生成、血管滲透性、水腫及發炎之臨床病狀之方法，其使用如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子。
[48]一種治療眼病之方法，其投與如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子。
[49]如[48]之方法，其中該眼病係選自由以下組成之群：AMD、黃斑水腫、CNV、DME、病理性近視、血管性青光眼、GA、視網膜靜脈阻塞及ROP及角膜新生血管形成。
[50]一種包含如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子的組合物，其用於抑制血管生成或治療眼病。
[51]如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子，其用於抑制血管生成或治療眼病。
[52]一種如[1]至[44]中任一項之結合分子於製造用於抑制血管生成或治療眼病之藥劑中的用途。
[53]一種核酸，其編碼如[1]至[44]中任一項之雙特異性結合分子。
[54]一種載體，其包含如[53]之核酸。
[55]一種表現載體，其包含如[54]之核酸，其中該核酸以可操作方式連接至表現控制序列。
[56]一種用於於適宜宿主細胞中產生融合多肽之宿主載體系統，該融合多肽包含如[55]之表現載體。
[57]如[56]之宿主載體系統，其中該適宜宿主細胞為細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
[58]如[56]之宿主載體系統，其中該適宜宿主細胞為CHO細胞。
[59]一種製備該雙特異性結合分子之方法，其包括使如[56]至[58]中任一項之宿主載體系統之細胞在允許產生該融合多肽之條件下生長並回收如此製備之融合多肽。
於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子包括(例如)能結合至人類VEGF及人類ANG-2之新穎雙特異性結合分子，其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合域及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合域，其中i)該VEGF結合域係源自阿柏西普(aflibercept) (「陷留」 VEGF之VEGF受體-Fc融合蛋白(本文中稱作「VEGF阱」)及與天然產生之VEGF細胞受體競爭抑制VEGF)，其具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列；及ii)該ANG-2結合域包含如SEQ ID NO: 3中所示之重鏈可變域及如SEQ ID NO: 4中所示之輕鏈可變域。
本文中描述各種態樣及實施例。然而，此等態樣及實施例可以許多不同形式實施且不應解釋為限於本文中所述之特定實施例；而是，本文中所揭示之特定實施例係示例性且經提供以告知一般技術者如何製備及使用本文中所述之雙特異性結合分子、組合物、裝置、治療方法、套組及醫藥產品之製造方法。本文中引用之所有書籍、出版物、專利及專利申請案之全文係以引用的方式併入本文中。
如可自上述及下列描述瞭解，本文中所述之各及每個特徵，及此等特徵中之兩者或更多者之各及每個組合包含於本發明之範圍內，只要包含於此組合中之特徵不互相不一致。例如，考慮其用途與任何其他實施例一致之任何實施例及因此包含於本描述中。於下列描述及申請專利範圍中闡述其他態樣及實施例，及當結合隨附實例及圖考慮時亦然。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另有明確指定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包含複數個提及物。例如，提及「一方法」包含一或多種方法，及/或本文中所述及/或對熟習此項技術者將在閱讀本發明後顯然的類型之步驟。
A. 定義
為了可更容易理解本發明，將如下定義某些術語。整篇實施方式闡述另外定義。
如本文中所用，「核酸」包含DNA及RNA二者，包含含有非標準核苷酸之DNA及RNA。「核酸」含有至少一個多核苷酸(「核酸股」)。「核酸」可為單股或雙股。
如本文中所用，「載體」係指能引入或轉運另一核酸分子之核酸分子。一般將引入之核酸連接至載體核酸分子，(例如)插入於其中。載體可含有誘導細胞之自發複製之序列，或可含有足夠序列以允許其整合至宿主細胞DNA。可用載體包括(例如)質體(例如，DNA或RNA質體)、轉位子、黏粒、細菌人工染色體及病毒載體。可用病毒載體包括(例如)複製缺陷逆轉錄病毒及慢病毒。
如本文中所用，「結合分子」係指包含抗原結合位點之結合蛋白。如本文中所用，術語「結合位點」、「抗原結合位點」或「結合域」表示結合分子之配位體實際上結合之區域。術語「結合位點」、「抗原結合位點」或「結合域」包含重鏈可變域(VH)及/或輕鏈可變域(VL)，或VH/VL之對，及可衍生自全抗體或抗體片段，諸如單鏈Fv、VH域及/或VL域、Fab或(Fab)
2。於一個實施例中，抗原結合位點各者包含重鏈可變域(VH)及/或輕鏈可變域(VL)，及較佳地可藉由由輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)組成之對形成。結合分子可為融合蛋白或結合劑。
結合域，及特別地特異性結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)之重鏈可變域(VH)及/或輕鏈可變域(VL)可衍生自(i)抗VEGF抗體或(ii)抗VEGF結合分子，包含藉由重新免疫方法尤其使用人類VEGF蛋白或核酸或其片段或藉由噬菌體呈現獲得之阿柏西普。
結合域，及特別地特異性結合至人類血管生成素-2 (ANG-2)之重鏈可變域(VH)及/或輕鏈可變域(VL)可衍生自(i) US7521053及WO2003/030833A2中所揭示之抗ANG-2抗體分子；或(ii)例如藉由重新免疫方法尤其使用人類ANG-2蛋白或核酸或其片段或藉由噬菌體呈現獲得之抗ANG-2抗體分子。US7521053中所揭示之抗ANG-2抗體分子包含Ab536，其包含含有SEQ ID NO: 3之VH及包含本申請案之SEQ ID NO: 4之VL。結合分子之特異性係指對抗原之特定抗原決定基之選擇性識別。天然抗體(例如)係單特異性。
如本文中所用，術語「結合」或「特異性結合」係指於活體外檢定中，較佳地於利用經純化之野生型抗原之電漿子共振檢定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)中，分子與抗原(包括人類VEGF或人類ANG-2或任何其他VEGF或ANG-2)之抗原決定基之結合。結合親和力係藉由術語k
a(自結合分子/抗原複合體之結合分子締合速率常數)、k
D(解離常數)及K
D(k
fj/k
a)定義。結合或特異性結合意指10
-8mol/1或更少，較佳地10
-9M至10
-13mol/1，及更佳地10
-10M至10
-13mol/l之結合親和力(K
D)。
根據本發明之「雙特異性結合分子」亦縮寫為「雙特異性結合抗體」，其為具有兩種不同抗原結合特異性之結合分子。在雙特異性結合分子具有超過一種特異性之情況下，經識別之抗原決定基可與單個抗原或超過一個抗原結合。本發明之雙特異性結合分子可對兩種不同抗原，例如，作為第一抗原之VEGF及作為第二抗原之ANG-2具有特異性。
如本文中所用，術語「單特異性」結合分子表示包含一或多個結合位點之分子，該等結合位點各者結合至相同抗原之相同抗原決定基。
如本文中所用，術語「價」表示結合分子中之指定數目之結合位點之存在。因而，術語「二價」、「四價」及「六價」各自表示結合分子中之兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點之存在。根據本發明之雙特異性結合分子係至少「二價」及可係多價，例如，三價、四價、五價或六價。較佳地，根據本發明之雙特異性結合分子係二價、三價或四價。於一個實施例中，該雙特異性結合分子係二價。於另一實施例中，該雙特異性結合分子係三價。於又一實施例中，該雙特異性結合分子係四價。
如本文中等效及可互換使用，術語「Fc片段」、「免疫球蛋白Fc區」或「Fc域」係指含有至少免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)之蛋白質。於一個實施例中，該Fc區排除免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區、重鏈恆定區1 (CH1)及輕鏈恆定區1 (CL1)。該Fc區可在重鏈恆定區處另外包含鉸鏈區。同樣，本文中所揭示之免疫球蛋白Fc區可含有包含重鏈恆定區1 (CH1)及/或輕鏈恆定區1 (CL1)之Fc區之部分或所有，除了重鏈及輕鏈可變區，只要其具有與初始蛋白實質上相似或較之更佳之生理功能。同樣，該免疫球蛋白Fc區可為在CH2及/或CH3之胺基酸序列之相對較長部分中具有缺失的片段。
本文中所揭示之免疫球蛋白Fc區可包含初始胺基酸序列或其序列類似物。胺基酸序列類似物為不同於初始胺基酸序列之序列，由於一或多個胺基酸殘基之缺失、插入、非保守或保守取代或其組合。
術語「拮抗劑」或「抑制劑」如本文中等效及可互換使用及包含能(例如)藉由阻斷蛋白質與其配位體之結合或實質上減少蛋白質與其配位體之結合及因此抑制或減少藉由蛋白質觸發之信號路徑及/或抑制或減少類血管生成之蛋白質介導之細胞反應來抑制及/或中和蛋白質之生物信號傳導活性的結合分子。
如本文中所用，術語「單株單抗」係指單一胺基酸組合物之抗體分子之製劑。術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變區(即，結合區)及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部分之抗體，其通常藉由重組DNA技術製備。
如本文中所用，「可變域」或「輕鏈可變域(VL)」或「重鏈可變區(VH)」表示直接涉及結合分子與抗原之結合之輕鏈及重鏈對各者。可變人類輕鏈及重鏈域具有相同一般結構及各域包含由三個「高可變區」(或互補決定區CDR)連接之四個框架(FR)區，其序列係廣泛保守。該等框架區採用β-片構象及該等CDR可形成連接β-片結構之環。各鏈中之CDR以其三維結構藉由框架區固持及與來自其他鏈之CDR一起形成抗原結合位點。重鏈及輕鏈CDR3區於根據本發明之結合分子之結合特異性/親和力中起著特別重要作用及因此提供本發明之另外目標。
當本文中使用時，術語「高可變區」或「抗原結合部分」係指負責抗原結合之結合分子之胺基酸殘基。高可變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區為除了如本文中所定義之高可變區殘基之彼等可變域區。因此，結合分子之輕鏈及重鏈自N端至C端包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。各鏈上之CDR藉由此等框架胺基酸分離。尤其，重鏈之CDR3為最有助於抗原結合之區域。CDR及FR區係根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)之標準定義確定。
術語「抗原決定基」包含能特異性結合至結合分子之任何多肽決定基。於某些實施例中，抗原決定基包含分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，及於某些實施例中，可具有特定三維結構特徵，及/或特定電荷特徵。抗原決定基為藉由結合分子結合之抗原之區域。於某些實施例中，當結合分子於蛋白質及/或大分子之複合混合物中優先識別其靶抗原時，將其稱作特異性結合抗原。
「Fab」為抗體片段，其包含各自藉由重鏈衍生序列及輕鏈衍生序列之二聚形成之一個恆定域(CH1，CL)及一個可變域(VH，VL)，其中VH及VL之可變域構成抗原結合位點。兩個Fab’片段經由鉸鏈區作為F(ab’)
2片段在N端處結合至Fc部分。
亦縮寫為「sFv」或「scFv」之「單鏈Fv」為抗體片段，其包含連接至單個多肽鏈之VH及VL抗體域。較佳地，該sFv多肽進一步包含VH與VL域之間之多肽連接子，該多肽連接子使sFv能形成用於抗原結合之所需結構。針對sFv之評論，參見Pluckthun之The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269至315頁(1994)。
此外，該單鏈Fv可較佳地經二硫鍵穩定。單鏈抗體之此另外二硫鍵穩定藉由在單鏈抗體之可變域之間引入二硫鍵達成及述於(例如) WO 94/029350，Rajagopal, V.等人，Prot. Engin. 10 (12) (1997) 1453-59；Kobayashi, H.等人，Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393；或Schmidt, M等人，Oncogene 18 (1999) 171 1-1721中。
本文中所用之「VEGF抑制劑」係指減少或抑制VEGF之表現或生物活性之任何化合物。
如本發明內所用，術語「肽連接子」表示具有胺基酸序列之肽，其較佳地具合成起源。根據本發明之此等肽連接子係用於將不同抗原結合位點及/或最終包含不同抗原結合位點之抗體片段(例如，單鏈Fv、全長抗體、VH域及/或VL域、Fab、(Fab)
2、Fc部分)連接在一起以形成根據本發明之雙特異性抗體。
抗Ang2抑制劑述於WO2003/030833A2及美國專利第7,521,053號中，其各者之全文係以引用的方式併入本文中，其包含含有536HC重鏈及536 κ輕鏈之抗Ang2抑制劑之結構、性質、製備及使用方法及其他相關抗體。抗ang2抑制劑及相關抗體等亦述於WO2004/092215A2中，其全文係以引用的方式併入本文中，特定言之關於抗ang2抑制劑及相關肽及蛋白質，其結構及性質，及製備及使用其之方法。
阿柏西普(VEGF抑制劑中之一者)為重組融合蛋白，其由來自融合至人類IgG1免疫球蛋白之Fc部分之人類VEGF受體1及2之細胞外域之VEGF結合部分組成。阿柏西普已於美國及歐洲批准以商標名稱Eylea™用於治療濕性黃斑變性。
B. 雙特異性結合分子之描述
結合部分
本發明之雙特異性結合分子可包含抗Ang-2結合域，其結合至血管生成素2 (Ang-2)且抑制Ang-2結合至其受體。於一個實施例中，該抗Ang-2結合域可包含源自Ang-2抑制劑之VH、VL、CH1及CL之Fab區，如WO2003/030833A2及美國專利第7,521,053號中所述。於一個實施例中，該抗Ang-2結合Fab重鏈及輕鏈係源自Ang-2抑制劑之VH及VL，如SEQ ID NO: 3及4中所示。
於另一實施例中，該抗Ang-2結合域可包含源自抗Ang-2抑制劑之VH及VL之單鏈Fv區，該VH及VL各自具有與SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4至少約70至100%相同之胺基酸序列。於另一實施例中，該抗Ang-2結合域可包含具有與SEQ ID NO: 3至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同之胺基酸序列之VH，及/或具有與SEQ ID NO: 4至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同之胺基酸序列之VL。於另一實施例中，該VL可經由連接子融合至VH之N端。於另一實施例中，該VH可經由連接子融合至VL之N端。
於一個實施例中，該抗Ang-2結合域可包含SEQ ID NO: 24之HCDR1、SEQ ID NO: 25之HCDR2、SEQ ID NO: 26之HCDR3、SEQ ID NO: 27之LCDR1、SEQ ID NO: 28之LCDR2及SEQ ID NO: 29之LCDR3中之任一者或所有。
於一個實施例中，該抗Ang-2結合域包含SEQ ID NO: 5。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 5至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 5至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 5至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 5至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 5至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 5約100%之序列同一性。
於一個實施例中，該抗Ang-2結合域包含SEQ ID NO: 23。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 23至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 23至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 23至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 23至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 23至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該Ang-2結合域包含與SEQ ID NO: 23約100%之序列同一性。
本發明之雙特異性結合分子可包含VEGF結合域，其可「陷留」 VEGF (本文中稱作「VEGF阱」)及與天然產生之VEGF細胞受體競爭以抑制VEGF。於一個實施例中，該VEGF結合域為阿柏西普，其具有如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列。於一些實施例中，該VEGF結合域可包含與SEQ ID NO: 6具有約70%至100%同一性之胺基酸序列。於一個實施例中，該VEGF結合域可包含SEQ ID NO: 6。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6約100%之序列同一性。
於一些實施例中，該VEGF結合域包含於Fc域中具有取代、缺失、插入及/或新增以改善聚集之阿柏西普變異體。於一些實施例中，該VEGF結合域包含具有根據EU/Kabat編號方案在選自IgG1之第235及第309位置之至少一個位點處具有取代、缺失、插入及/或新增之胺基酸之Fc域。於一些實施例中，根據EU/Kabat編號方案在IgG1之第235及第309位置處經離胺酸(K)取代係較佳。於一些實施例中，該VEGF結合域包含具有根據EU/Kabat編號方案在IgG1之第235位置處具有取代、缺失、插入及/或新增之胺基酸之Fc域。於較佳實施例中，該VEGF結合域包含具有根據EU/Kabat編號方案在IgG1之第309位置處具有取代、缺失、插入及/或新增之胺基酸之Fc域。
於一個實施例中，該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。於一些實施例中，該VEGF結合域可包含與SEQ ID NO: 9具有約70%至100%同一性之胺基酸序列。於一個實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 9約100%之序列同一性。
本發明之雙特異性結合分子可包含VEGF結合域，其可「VEGF陷留」及與天然產生之VEGF細胞受體競爭以抑制VEGF。於一個實施例中，該VEGF結合域為阿柏西普，其具有如SEQ ID NO: 20中所示之胺基酸序列。於一些實施例中，該VEGF結合域可包含與SEQ ID NO: 20具有約70%至100%同一性之胺基酸序列。於一個實施例中，該VEGF結合域可包含SEQ ID NO: 6。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 20至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 6或20至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 20至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 20至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 20至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該VEGF結合域包含與SEQ ID NO: 20約100%之序列同一性。
本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之抗ANG2結合域。於一個實施例中，該抗ANG2結合域可融合至VEGF結合域之C端。於另一實施例中，該抗ANG2結合域可融合至VEGF結合域之N端。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之C端之抗ANG2結合域，其中該抗ANG2結合域為單鏈Fv且具有與SEQ ID NO: 5至少約70%至100%之胺基酸序列同一性。於一個實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約95%之序列同一性。於仍另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5約100%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 5。
於另一實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之N端之抗ANG2結合域，其中該抗ANG2結合域為單鏈Fv且具有與SEQ ID NO: 5至少約70%至100%之胺基酸序列同一性。於一個實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5至少約95%之序列同一性。於仍另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5約100%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 5。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之C端之抗ANG2結合域，其中該抗ANG2結合域為單鏈Fv且具有與SEQ ID NO: 23至少約70%至100%之胺基酸序列同一性。於一個實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約95%之序列同一性。於仍另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 5約100%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 23。
於另一實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之N端之抗ANG2結合域，其中該抗ANG2結合域為單鏈Fv且具有與SEQ ID NO: 23至少約70%至100%之胺基酸序列同一性。於一個實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23至少約95%之序列同一性。於仍另一實施例中，該抗ANG2結合域具有與SEQ ID NO: 23約100%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 23。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之C端或N端之抗ANG2結合域，其中該抗ANG2結合域為Fab片段，其包含具有與SEQ ID NO: 1或21至少約70%至100%相同之序列同一性之重鏈胺基酸序列及具有與SEQ ID NO: 2或22或10至少約70%至100%相同之序列同一性之輕鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 1。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1約100%之序列同一性。
於一個實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 21。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段重鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 21約100%之序列同一性。
於一個實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2約100%之序列同一性。
於一個實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 10。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 10約100%之序列同一性。
於一個實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO: 22。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22至少約70%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22至少約75%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22至少約80%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22至少約85%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22至少約90%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22至少約95%之序列同一性。於另一實施例中，該抗ANG2 Fab片段輕鏈胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 22約100%之序列同一性。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之C端或N端之抗ANG2結合域，其中該VEGF結合域包含具有與SEQ ID NO: 6至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%及100%相同之序列同一性之胺基酸序列。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之C端或N端之抗ANG2結合域，其中該VEGF結合域包含具有與SEQ ID NO: 9至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%及100%相同之序列同一性之胺基酸序列。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含融合至VEGF結合域之C端或N端之抗ANG2結合域，其中該VEGF結合域包含具有與SEQ ID NO: 20至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%及100%相同之序列同一性之胺基酸序列。
肽連接子序列
於本發明中，該抗ANG2結合域及VEGF結合域可藉由連接子融合。於一些實施例中，該抗Ang-2結合域可包含單鏈，且Fv區可源自藉由連接子融合之VH及VL。於一個實施例中，該連接子包括包含胺基酸序列(GGGGS)
n 之肽，其中
n可為1至15。於一個實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n可為2至10。於另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n可為3至7。於又一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n可為4至6。於仍另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為1。於另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為2。於另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為3。於又一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為4。於仍另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為5。於仍另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為6。於仍另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為7。於仍另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為8。於仍另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為9。於另一實施例中，該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)
n ，其中
n為10。於另一實施例中，該連接子包含SEQ ID NO: 7。於另一實施例中，該連接子包含SEQ ID NO: 8。於另一實施例中，該連接子包含SEQ ID NO: 17。
連接子考量包括對所得化合物之物理或藥物動力學性質，諸如溶解度、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(或多或少穩定以及計劃之降解)、黏度、硬度、柔性、免疫原性、抗體結合之調節、併入膠束或脂質體之能力及類似者之影響。
雙特異性結合分子實施例
本發明係關於新穎雙特異性結合分子，其包含針對VEGF及Ang-2二者之抗ANG2結合域。於一些實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子可包含一個或兩個抗ANG2結合域及一個或兩個VEGF結合域，其中：
a)該抗ANG2結合域為肽、Fab或scFv；且其中該肽、Fab或scFv包含如源自具有與SEQ ID NO: 2、10或22至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約95%、至少約99%或約100%相同之胺基酸序列之輕鏈之輕鏈CDR，及如源自與SEQ ID NO: 1或21至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約95%、至少約99%或約100%相同之胺基酸序列之重鏈CDR，或源自具有與SEQ ID NO: 5或23至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約95%、至少約99%或約100%相同之胺基酸序列之scFv之CDR；b)該VEGF結合域為VEGF結合分子，其中該VEGF結合分子包含具有與SEQ ID NO: 6、9或20至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約95%、至少約99%或約100%相同之胺基酸序列之結合域。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約70%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約75%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約80%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約85%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於又一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約90%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約95%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約99%序列同一性之重鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列及為SEQ ID NO: 2之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 11具有約70%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 2具有約70%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 11具有約75%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 2具有約75%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 11具有約80%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 2具有約80%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約85%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約85%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約90%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約90%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約95%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約95%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約100%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約100%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列及為SEQ ID NO: 10之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約70%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約70%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約75%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約75%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約80%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約80%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約85%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約85%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約90%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約90%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約95%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約95%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:11具有約100%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約100%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO:12之重鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約70%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約75%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約80%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約85%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於又一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約90%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約95%序列同一性之重鏈胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之C端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約99%序列同一性之重鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO:12之重鏈胺基酸序列及為SEQ ID NO: 2之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約70%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約70%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約75%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約75%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約80%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約80%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約85%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約85%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約90%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約90%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約95%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約95%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約100%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:2具有約100%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO:12之重鏈胺基酸序列及為SEQ ID NO:10之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約70%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約70%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約75%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約75%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約80%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約80%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約85%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約85%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約90%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約90%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約95%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約95%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含視情況通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端中之一者或二者之抗ANG2結合域，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO:12具有約100%序列同一性之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO:10具有約100%序列同一性之輕鏈胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約70%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約75%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約80%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約85%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 13具有至少約99%序列同一性之胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含具有SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約70%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約75%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約80%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約85%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 14具有至少約99%序列同一性之胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含具有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約70%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約75%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約80%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約85%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 15具有至少約99%序列同一性之胺基酸序列。
於一個實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含具有SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約70%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約75%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約80%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約85%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。於另一實施例中，該雙特異性結合分子可包含為單鏈Fv之抗ANG2結合域，其通過肽連接子融合至VEGF結合域之N端或C端，其中該雙特異性結合分子包含與SEQ ID NO: 16具有至少約99%序列同一性之胺基酸序列。
包含VEGF及Ang-2二者之結合域之本發明之雙特異性結合分子具有(而不限於)圖1中由連接子連接之以N端至C端方向之示例性雙特異性結合分子構型。
術語「N端」表示N端之最後一個胺基酸。術語「C端」表示C端之最後一個胺基酸。
於一些實施例中，該雙特異性結合分子可具有源自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM或藉由其組合或其雜交體製得之Fc區。於較佳實施例中，該Fc區係源自IgG。於另一較佳實施例中，該Fc區係源自IgG1。
於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子阻斷Ang-2與其受體Tie-2之間之相互作用，以100 pM或更少、80 pM或更少、50 pM或更少、40 pM或更少、30 pM或更少、28 pM或更少、26 pM或更少、24pM或更少之IC50，如藉由本發明之實例1中所述之方法所測定。於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子結合至VEGF，以500 pM或更少、400 pM或更少、300 pM或更少、200 pM或更少、150 pM或更少、130 pM或更少、120 pM或更少、110 pM或更少、108 pM或更少、105 pM或更少、102 pM或更少之EC50，如藉由本發明之實例1中所述之方法所測定。
於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子結合至VEGF，以1000 pM或更少、500 pM或更少、400 pM或更少、300 pM或更少、250 pM或更少、220 pM或更少、200 pM或更少、190 pM或更少、160 pM或更少、130 pM或更少、100 pM或更少、90 pM或更少、80 pM或更少、70 pM或更少、60 pM或更少、58 pM或更少、56 pM或更少之Kd，如藉由本發明之實例2中所述之BIACORE所測定。於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子結合至Ang2，以1000 pM或更少、800 pM或更少、500 pM或更少、450 pM或更少、400 pM或更少、350 pM或更少、300 pM或更少、250 pM或更少、200 pM或更少、或180 pM或更少、或160 pM或更少、或150 pM或更少、140 pM或更少之Kd，如藉由本發明之實例2中所述之BIACORE所測定。
於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子結合至VEGF，以1000 pM或更少、500 pM或更少、400 pM或更少、300 pM或更少、250 pM或更少、220 pM或更少、200 pM或更少、195 pM或更少、190 pM或更少、188 pM或更少之Kd，如藉由本發明之實例2中所述之BIACORE所測定。於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子結合至Ang2，以1000 pM或更少、800 pM或更少、500 pM或更少、450 pM或更少、400 pM或更少、350 pM或更少、300 pM或更少、280 pM或更少、260 pM或更少、255 pM或更少之Kd，如藉由本發明之實例2中所述之BIACORE所測定。
於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子在1000 pM或更少、700 pM或更少、500 pM或更少、400 pM或更少、350 pM或更少、345 pM或更少、340 pM或更少、337 pM或更少之IC50下抑制HUVEC細胞之增殖，如藉由本發明之實例5-A中所述之抗VEGF細胞增殖功能檢定所測定。於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子在50 nM或更少、20 nM或更少、10 nM或更少、9 nM或更少、8 nM或更少、7 nM或更少、6 nM或更少之IC50下抑制HUVEC細胞之管形成，如藉由本發明之實例5-B中所述之Ang2介導之管形成檢定所測定。於一個實施例中，本發明之雙特異性結合分子在20 nM或更少、10 nM或更少、5 nM或更少、4 nM或更少、3 nM或更少、2.5 nM或更少之IC50下抑制Akt磷酸化，如藉由本發明之實例5-D中所述之磷酸-Akt ELISA檢定所測定。
於一個實施例中，本文中所揭示之雙特異性結合分子與阿柏西普及/或ANG2抗體(諸如Ab536)相比可具有優越效應(諸如血管滲漏抑制能力、滲漏血管消退及更長持續時間)。
製備
/
製造之描述
本文中所揭示之雙特異性結合分子藉由用於製備多特異性抗體或重組蛋白之技術產生，該等技術包括(但不限於)質體製備、細胞培養、瞬時轉染、純化及分析。
1.質體製備
靶DNA序列經設計、最佳化及合成(Genwiz)。將合成之序列次選殖至pcDNA3.4載體。然後，針對Expi HEK 293F (Thermo fisher Scientific)細胞表現，最大製備轉染級質體。
2.細胞培養及瞬時轉染
使Expi HEK 293F細胞於無血清HD 293F™表現培養基(Thermo Fisher Scientific)中生長及在37℃與8% CO
2下，將生長之細胞維持於軌道振盪器(VWR Scientific)上之錐形瓶(Corning Inc.)中。然後，在轉染前一天，將細胞以適宜密度接種於Corning錐形瓶中。在轉染當天，將DNA及轉染試劑以最佳比率混合及添加至具有準備用於轉染之細胞之燒瓶中。將編碼靶抗體之重組質體瞬時共轉染至HD293F細胞培養物之懸浮液中。將在第6天自轉染收集之細胞培養物上清液用於純化。
3.純化及分析
將細胞培養物肉湯離心及過濾。將經過濾之細胞培養物上清液以適宜流率加載至MabSelect SuRe™ LX (GE Healthcare Life Sciences)。於用適宜緩衝液洗滌及溶離後，匯集經溶離之溶離份及將緩衝液交換為PBS 7.2。為提高純度，匯集脫鹽樣品，濃縮及加載至HiLoad16/600 Superdex 200 pg 320 ml管柱。於SEC純化後，匯集目標溶離份及以適宜流率加載至離子交換層析管柱以降低內毒素含量及隨後濃縮。將經純化之蛋白質藉由SDS-PAGE、西方墨點法(Western blot)、HPLC分析來分析以測定分子量及純度。藉由A280方法測定濃度。
本發明之雙特異性結合分子之結合特異性及親和力可藉由諸如免疫沉澱、放射免疫檢定(RIA)或酶聯免疫吸附檢定(ELISA)以及Biacore (GE Healthcare, Chicago, IL)及質譜法(MS, CovalX)之檢定測定。
本發明亦包含編碼雙特異性結合分子的DNA，其可插入適宜表現載體，即，含有用於所插入之蛋白質編碼序列之轉錄及轉譯之必要元件之載體中。所插入之蛋白質編碼序列可以可操作方式連接至表現控制序列。可利用各種宿主-載體系統表現宿主細胞中之蛋白質編碼序列。例如，哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)、昆蟲細胞、酵母細胞及細菌細胞可用作宿主細胞。此等宿主-載體系統包括經病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)感染之哺乳動物細胞系統；經病毒(例如，桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；微生物，諸如含有酵母載體之酵母，或利用噬菌體DNA、質體DNA或黏粒DNA轉形之細菌。取決於所利用之宿主-載體系統，可使用適宜轉錄及轉譯元件中之任一者。
本發明亦包含藉由使宿主-載體系統之細胞在適用於產生融合多肽之條件下生長並回收因此產生之融合多肽所獲得之雙特異性結合分子。
本發明亦提供用於向個體投與之醫藥組合物，其包含本文中所揭示之雙特異性結合分子。本文中所揭示之醫藥組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。如本文中所用，術語「醫藥上可接受」意指該組合物足以達成治療效應而無有害副作用，及可取決於疾病類型、患者之年齡、體重、健康狀況、性別及藥物敏感性、投與途徑、投與模式、投與頻率、治療持續時間、與本文中所揭示之組合物組合或同時使用之藥物及醫學中已知之其他因素容易確定。
包含本文中所揭示之雙特異性結合分子之醫藥組合物可經局部、經區域或經全身投與，諸如，例如，經皮下、玻璃體內、皮內、靜脈內、動脈內、腹膜內或肌肉內注射投與。於眼內注射之情況下，包含本文中所揭示之雙特異性結合分子之醫藥組合物可經玻璃體內或經結膜下投與。
該等醫藥組合物可包含約0.01 mg/mL至約500 mg/mL之本文中所揭示之雙特異性結合分子。
包含本文中所揭示之雙特異性結合分子之醫藥組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑。針對可注射製劑，該載劑可包括緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶劑、等滲劑、稀釋劑及穩定劑。針對用於局部投與之製劑，該載劑可包括基質、賦形劑、潤滑劑、穩定劑及防腐劑。
另外，包含本文中所揭示之雙特異性結合分子之醫藥組合物可經調配成適用於患者之身體之單劑型，及較佳地根據典型方法調配成可用於蛋白質藥物之製劑。
期望包含本文中所揭示之雙特異性抗體之醫藥組合物具有雙特異性抗體效價之功效及治療水平之活體內更長持續時間，從而顯著降低其投與之數目及頻率。
包含本文中所揭示之雙特異性結合分子之醫藥組合物之投與劑量及頻率藉由活性成分之類型連同諸如待治療之疾病、投與途徑、患者之年齡、性別及體重及疾病嚴重度之各種因素確定。
治療方法
本文中所揭示之雙特異性結合分子可用於抑制血管生成。本文中所揭示之雙特異性結合分子可用於改善及/或治療選自血管生成、血管滲透性、水腫及發炎之臨床病狀。本文中所揭示之雙特異性結合分子可用於治療任何血管生成介導之病症或疾病，包括(不限於)慢性創傷、外周動脈疾病、缺血性心臟病、慢性發炎(諸如類風濕性關節炎)、惡性腫瘤、糖尿病性腎病及動脈粥樣硬化。
本文中所揭示之雙特異性結合分子可用於治療任何血管生成介導之眼部病症或疾病，包括(不限於)癌症、增殖性視網膜病、增殖性糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性(AMD)、黃斑水腫、脈絡膜新生血管形成(CNV)、血管性青光眼、地圖狀萎縮(GA)、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病(ROP)、角膜新生血管形成。本文中所揭示之雙特異性結合分子亦可用於治療任何血管生成介導之眼部病症或疾病，包括於視網膜靜脈阻塞(RVO)後之黃斑水腫、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(BRVO)、新生血管(Wet)年齡相關之黃斑變性、乾躁AMD、糖尿病性黃斑水腫(DME)、患有DME之患者之糖尿病性視網膜病(DR)、及新生血管年齡相關之黃斑變性、AMD伴凹下脈絡膜新生血管形成、近視性脈絡膜新生血管形成及新生血管性青光眼。
C. 雙特異性結合分子檢定
開發分子檢定以評估雙特異性結合分子對Ang-2及VEGF之親和力及特異性，及對Ang-2:Tie2相互作用及VEGF:VEGFR相互作用之效應。開發功能檢定以評估藉由雙特異性結合分子處理之細胞活力及雙特異性結合分子對血管生成素-2誘導之Tie-2磷酸化之效應及雙特異性結合分子對血管生成素-2介導之管形成之效應及於持續性視網膜新生血管形成兔模型中藉由IVT注射的雙特異性結合分子之效應。
除非另有指定，否則以下顯示用於下列實例中之試驗樣品。
表
1
| 樣品 | 序列 |
| 雙特異性結合分子(BSP1) | LC: SEQ ID NO: 2 HC: SEQ ID NO: 11 |
| 雙特異性結合分子(BSP2) | LC: SEQ ID NO: 10 HC: SEQ ID NO: 11 |
| 對照1 | LC: SEQ ID NO: 22 HC: SEQ ID NO: 21 |
| 對照2 | SEQ ID NO: 20 |
BSP1或BSP2通過按服務合同付費研究組織(GenScript Biotech)於哺乳動物HEK 293F細胞中合成及表現。一旦確定靶抗原，就將雙特異性結合分子之密碼子基於靶抗原序列使用電腦程式最佳化。於證實正確蛋白質序列後，將經最佳化基因選殖至哺乳動物表現載體pcDNA3.4中。之後，製備超螺旋低內毒素轉染級質體，及使雙特異性結合分子於HEK 293F細胞中表現。將表現之雙特異性結合分子經由一步蛋白A純化、西方墨點法(WB)、高效液相層析法(HPLC)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳系統(SDS-PAGE)及尺寸排阻層析法(SEC)純化，及移除內毒素。如下合成對照1及對照2。
對照1之靶DNA序列(SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2)及對照2 (SEQ ID NO: 6)係參考US75721053B及WO2000/075319藉由Genwitz合成。將合成之序列次選殖至pcDNA3.4載體中。然後，針對Expi HEK 293F (Thermo fisher Scientific)細胞表現最大製備轉染級質體。使Expi HEK 293F細胞於無血清HD293F™表現培養基(Thermo Fisher Scientific)中生長及在37℃與8% CO
2下，將生長之細胞維持於軌道振盪器(VWR Scientific)上之錐形瓶(Corning Inc.)中。然後，在轉染前一天，將細胞以適宜密度接種於Corning錐形瓶中。在轉染當天，將DNA及轉染試劑以最佳比率混合及添加至具有準備用於轉染之細胞之燒瓶中。將編碼靶抗體之重組質體瞬時共轉染至HD293F細胞培養物之懸浮液中。將在第6天自轉染收集之細胞培養物上清液用於純化。將細胞培養物肉湯離心及過濾。將經過濾之培養物上清液以適宜流率加載至MabSelect SuRe™ LX (GE Healthcare Life Sciences)。於用適宜緩衝液洗滌及溶離後，匯集經溶離之溶離份及將緩衝液交換為PBS 7.2。為提高純度，匯集脫鹽樣品，濃縮及加載至HiLoad16/600 Superdex 200 pg 320 ml管柱。於SEC純化後，匯集目標溶離份及以適宜流率加載至離子交換層析管柱以降低內毒素含量及隨後濃縮。將經純化之蛋白質藉由SDS-PAGE、西方墨點法、HPLC分析來分析以測定分子量及純度。藉由A280方法測定濃度。
實例
1
結合特異性
本發明之結合特異性可藉由活體外檢定，諸如免疫沉澱、放射免疫檢定(RIA)或酶聯免疫吸附檢定(ELISA)測定。
方法
ELISA設置示於圖2中。
VEGF塗覆
針對VEGF結合檢定，首先藉由將碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝膠囊(Sigma Aldrich (批號SLBS9151))溶解於100 mL milli-Q水中來創建碳酸鹽緩衝液。將rhVEGF (100 µg/mL；Peptro Tech)用碳酸鹽緩衝液(50 mM，pH 9.6)稀釋以製備1 µg/mL溶液。將MaxiSorp板(96孔板；Thermo Scientific (批號155467))用100 µL之1 µg/mL rhVEGF165塗覆，用板密封劑密封，及在4℃下培育過夜(16至24小時)。
Tie2-Fc塗覆(針對Ang2)
針對Ang2結合檢定，將Tie2-Fc (200 µg/mL，55 µL/管；Fitzgerald Industries)用PBS (Wako批號(KCP7032))稀釋以達成1 µg/mL之濃度，及將MaxiSorp板(96孔板；Thermo Scientific (批號155467))用100 µL之1 µg/mL Tie2-Fc塗覆，用板密封劑密封，及在4℃下培育過夜(16至24小時)。
緩衝液製備
藉由將2個PBS-T錠劑(Takara Bio (批號SLBS9251))溶解於2000 mL milli-Q水中來製備洗滌緩衝液PBS-T。藉由將10% BSA (Secare/PBL (批號10385708))用PBS-T稀釋10倍來製備阻斷液，藉由通過0.22 µm膜過濾滅菌，及儲存在4℃下。藉由將10倍阻斷液與PBS-T混合來製備稀釋液。
分析物製備
如以下所概述，於Protein LoBind板(Eppendorf)中製備各樣品之連續稀釋液。
表
2
| 管 | 來源 ( 濃度 / 管數 ) | 來源之體積 (µL) | 稀釋 劑 (µL) | 最終濃度 (ng/mL) |
| 1 | 10 µg/mL | 200 | 800 | 2,000 |
| 2 | 1 | 200 | 800 | 400 |
| 3 | 2 | 200 | 800 | 80 |
| 4 | 3 | 200 | 800 | 16 |
| 5 | 4 | 200 | 800 | 3.2 |
| 6 | 5 | 200 | 800 | 0.64 |
| 7 | 6 | 200 | 800 | 0.128 |
| 8 | 7 | 200 | 800 | 0.0256 |
阻斷
將板用300 μL/孔PBS-T洗滌三次，及用200 μL BSA/PBS-T阻斷。將其用板密封劑密封，及在室溫下培育1小時。
Ang2+
分析物
如表6中所示，將經FLAG標記之配位體(Ang2-FLAG，30 µg/mL，30 µL/管；BPS Bioscience)用稀釋液稀釋。於阻斷6至8分鐘後，將200 µL Ang2-FLAG (20 ng/mL)於Protein LoBind板(Eppendorf)中用200 µL分析物稀釋2倍，及在板振盪器(200 rpm)上在室溫下培育1小時。
表
3
| 管 | 經 FLAG 標記之配位體 ( 濃度 / 管數 ) | 經 FLAG 標記之配位體之體積 (µL) | 稀釋液 (µL) | 最終濃度 |
| 1 | 30 µg/mL | 20 | 580 | 1000 ng/mL |
| 2 | 1 | 200 | 9,800 | 20 ng/mL |
分析物施覆
於將板用洗滌緩衝液(300 μL/孔PBS-T)洗滌三次後，將100 µL標準物及樣品添加至板中，用板密封劑密封，及在板振盪器(500 rpm)上在室溫下培育1小時。
針對VEGF檢測抗體，如以下所闡述製備抗人類IgG Fc-HRP儲備溶液(0.8 mg/mL；Jackson Immuno Research)以於製備之1小時內使用。
表
4
| 初始稀釋 | 抗人類 IgG 之體積 (µL) | 稀釋 劑 (µL) | 最終稀釋 |
| 1x | 10 | 990 | 100x |
| 100x | 200 | 19,800 | 10,000x (0.08 µg/mL) |
針對抗Ang2檢測抗體，如以下所闡述製備抗FLAG Tag儲備溶液(小鼠-單(M2)，HRP，50 µg/mL，20x；SIGMA)以於製備之1小時內使用。
表
5
| 初始稀釋 | 抗 FLAG 之體積 | 稀釋 劑 | 最終稀釋 ( 濃度 ) |
| 20x | 8 µL | 8 mL | 20,000x (0.05 µg/mL) |
自儲存取出1步Ultra TMB ELISA (Thermo Scientific)及於黑暗中平衡至室溫。
於將板用洗滌緩衝液(300 μL/孔(PBS-T))洗滌三次後，將100 µL以上製備之檢測抗體添加至各孔，及將板用板密封劑覆蓋及在板振盪器(500 rpm，1小時，RT)上培育。
將板再次用洗滌緩衝液(300 µL/孔x 5)洗滌，及將100 µL 1步Ultra TMB ELISA添加至各孔。然後，將板用板密封劑覆蓋及於黑暗(RT)中培育5至15分鐘。於培育後，將100 µL終止液(1M磷酸；Signal Aldrich)添加至各孔。最後，於添加終止液之5分鐘內，根據以下規格使用Benchmark Plus (BioRad)對板進行分析。
表
6
| 讀取 | 405 nm (VEGF)，450 nm (抗Ang2) |
| 參考 | 630 nm |
| 混合時間 | 10秒 |
| 曲線擬合 | 四參數邏輯曲線擬合 |
結果
結果示於表7及圖3(a)及3(b)中。
如表7中所示，BSP2阻斷Ang-2與其受體Tie-2之間之相互作用，以23.8 pM之IC50，然而對照1 (ANG2 mAb)阻斷Ang-2與其受體Tie-2之間之相互作用，以40.3 pM之IC50。BSP2結合至VEGF，以101.1 pM之EC50，然而對照2 (VEGF抑制劑)結合至VEGF，以81.0 pM之EC50。
表
7
| 樣品 | EC50 (pM) | IC50 (pM) |
| VEGF | ANG2 | |
| 對照 1 | - | 40.3 |
| 對照 2 | 81.0 | - |
| BSP2 | 101.1 | 23.8 |
實例
2
結合親和力檢定
本發明之結合親和力可藉由Biacore (GE Healthcare, Chicago, IL)測定。
方法
在25℃下進行該檢定及運行緩衝液為HBS-EP (10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05% Tween 20，pH 7.4；GE Healthcare (批號BCBV7062))。將經稀釋抗體在表面上注射作為捕獲相，將經稀釋抗原在表面上注射作為結合相，接著注射運行緩衝液作為解離相。
根據製造商之所建議協定，利用PBS及0.005% P20表面活性劑(GE Healthcare, Chicago, IL.)作為運行緩衝液在Biacore 8K，29215379-2177839 (GE Healthcare, Chicago, IL)上進行雙特異性結合分子(BSP1)之親和力分析。藉由以下進行結合檢定：首先將約100 Ru之BSP1附接至塗覆有蛋白A之S系列感測器晶片，然後各種濃度之人類重組VEGF蛋白(R&D systems，0至10nM)或人類重組Ang2蛋白(R&D systems，0至100nM)將在BSP結合表面上以30 (Ang2)或100 (VEGF) μl/min之流率注射120秒。藉由使用Biacore 8K評價軟體版本1.1 (Chicago, IL.)測定包含ka (結合速率常數)、kd (解離速率常數)及K
D(解離平衡常數)之抗體結合動力學。於樣品注射後，使用10 mM甘胺酸-HCl PH 1.5 (批號20181221)自感測器晶片解離結合分析物。
結果
BSP1針對ANG2之結合親和力係在不同時間點量測兩次，及BSP1各自具有139 pM及230 pM之Kd (參見圖5)。BSP1針對VEGF具有55pM之Kd。
BSP2及對照1 (抗Ang2 mAb)針對Ang2各自具有254及316 pM之Kd。BSP2及對照2 (抗VEGF)針對VEGF各自具有187及187 pM之Kd (參見圖4、圖5)。表8顯示針對本發明之ANG2及VEGF之結合親和力的結果。
表8
| 底物 | 結合 Kd(pM) VEGF/ 分析物 | 結合 Kd (pM) Ang2/ 分析物 |
| BSP1 | 55 | 平均 184.5 (139 ， 230 ) |
| BSP2 | 187 | 254 |
| 對照 1 | 不結合 | 316 |
| 對照 2 | 187 | 不結合 |
實例
3
Ang2/Tie2
與阻斷
Ang2/Tie2
複合體形成之
Ang2/BSP2
之間之結合親和力的檢定
藉由Biacore測定藉由本發明阻斷後Tie2與Ang2之結合親和力。
方法
使用Biacore 8K (GE Healthcare, Chicago, IL)進行此研究以量測於藉由抗體阻斷後Tie2與Ang2之結合親和力。在25攝氏度下進行人類重組Ang2蛋白(R&D Systems)之固定化，同時使用HBS-EP作為運行緩衝液。藉由最近混合之50 mmol/L N-羥基琥珀醯胺(NHS)及200 mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)將流通槽1及2之感測器晶片表面活化200秒(10 µL/min)。之後，將稀釋於30 mmol/L NaAC (pH 4.5)中之Ang2注射至流通槽2中以各自達成適宜反應單元之結合，而將流通槽1中之一者設為空白。於胺偶合反應後，注射200秒之1 mol/L乙醇胺鹽酸鹽將晶片表面上之剩餘活化偶合位點阻斷。
在25℃下進行檢定及運行緩衝液為HBS-EP。將100 nM BSP1、對照1注射在流通槽2之表面上60秒。然後，將經稀釋之重組Tie2-Fc融合蛋白(R&D systems)在流通槽1及2之表面上注射作為結合相，接著注射運行緩衝液作為解離相。使用單循環動力學模型，其中以單循環依序注射分析物濃度，注射之間不進行再生。使用單循環模型測定Ang2 /Tie2-Fc與(Ang2+BSP2)/Tie2-Fc之間之結合親和力及相互作用。
結果
如表9中所示，Ang2對Tie2-Fc具有4.26 nM之Kd。一旦Ang2結合至BSP2，其就不再能結合至Tie2-Fc以形成Ang2-Tie2複合體。對照1亦產生與BSP2相同結果。
表
9
| 樣品 | Biacore 結合 Kd(nM) |
| Ang2 + Tie2-Fc | 4.26 |
| (Ang2+BSP2) + Tie2-Fc | 無相互作用 |
| (Ang2+ 對照 1) + Tie2-Fc | 無相互作用 |
實例
4
VEGF
及
ANG2
之同時結合
材料及方法
儀器
針對整合性/聚集試驗，使用配備有CovalX之HM4交互模塊之Autoflex II MALDI ToF ToF質譜儀(Bruker)進行量測。CovalX之交互模塊含有經設計以將檢測最佳化上至2 MDa與奈米-莫耳靈敏性之特定檢測系統。
將1 μl所獲得之各稀釋液與包含再結晶之芥子酸基質(10 mg/ml)於乙腈/水(1:1，v/v)、TFA 0.1%中之1 μl基質(K200 MALDI套組)混合。於混合後，將1 μl各樣品點在MALDI板(SCOUT 384)上。於室溫下結晶後，將板引入MALDI質譜儀及立即以高質量MALDI模式分析。以一式三份重複分析。
交聯實驗
交聯實驗允許非共價相互作用藉由高質量MALDI質譜儀之直接分析。藉由將含有非共價相互作用之蛋白質樣品與經特定開發之交聯混合物(Bich, C等人，Anal. Chem., 2010, 82 (1)，第172至179頁)混合，可特定檢測具有高靈敏性之非共價複合體。所產生之共價結合允許相互作用物質在樣品製備過程及MALDI電離中存活。特定高質量檢測系統允許以高質量範圍表徵相互作用。
使用CovalX之K200 MALDI MS分析套組將針對對照實驗製備之各混合物(留下9 μl)提交至交聯。將蛋白質溶液(留下9 μl) (1至1/128)與1 μl K200穩定劑試劑(2 mg/ml)混合及在室溫下培育。於培育時間(180分鐘)後，如針對對照實驗製備樣品用於MALDI分析。於結晶後立即藉由高質量MALDI MS分析樣品。
靶蛋白rhVGEF及rhAng2各自購自Sino Biological (PA, US)及PeproTech (NJ, US)。
表
10
| 初始樣品 | 最終樣品 | ||
| 粉末 | 體積 | 濃度 | |
| rhVEGF | 0.5 mg | 500 µl | 1 mg/ml |
| rhAng2 | 0.5 mg | 500 µl | 1 mg/ml |
對照實驗
針對此實驗，檢測rhVEGF及BSP1，具有MH
+= 39.338 kDa及MH
+= 209.620 kDa。
表
11
| 分子量 觀 測值 (kDa) | |
| rhVEGF | 39.338 |
| BSP2 | 209.620 |
交聯實驗
於與交聯試劑之180分鐘培育時間後完成該交聯實驗。於交聯後，檢測到一個另外峰，具有MH
+= 249.593 kDa。
表
12
| 分子量 觀 測值 (kDa) | |
| [rhVEGF●BSP2] | 249.593 |
對照實驗
針對此實驗，檢測rhAng2及BSP2，具有MH
+= 65.241 kDa及MH
+= 210.432 kDa。
表
13
| 分子量 觀 測值 (kDa) | |
| rhAng2 | 65.241 |
| BSP2 | 210.432 |
交聯實驗
於與交聯試劑之180分鐘培育時間後完成該交聯實驗。於交聯後，檢測到兩個另外峰，具有MH
+= 287.904 kDa及MH
+=352.067 kDa。
表
14
| 分子量 觀 測值 (kDa) | |
| [rhAng2●BSP2] | 287.904 |
| [2rhAng2●BSP2] | 352.067 |
對照實驗
針對此實驗，檢測rhVEGF、rhAng2及BSP，具有MH
+= 39.801 kDa、MH
+=64.451 kDa及MH
+= 220.889 kDa。
表
15
| 分子量 觀 測值 (kDa) | |
| rhVEGF | 39.801 |
| rhAng2 | 64.451 |
| BSP2 | 220.889 |
交聯實驗
於與交聯試劑之180分鐘培育時間後完成該交聯實驗。於交聯後，檢測到兩個另外峰，具有MH
+= 254.016 kDa及MH
+= 388.535 kDa。
表
16
| 分子量 觀 測值 (kDa) | |
| [rhVEGF●BSP2] | 254.016 |
| [2rhAng2●rhVEGF●BSP2] | 388.535 |
結果
如表7、9及11至16中所示，該等表列出獲自上述實驗之結果，如設計之BSP2能同時結合至一個VEGF及兩個Ang2分子。換言之，在結合至一個靶(例如，VEGF或ANG2)後，BSP1另外能同時結合至另一靶，證實其雙特異性結合。
實例
5
A.
抗
VEGF
之細胞功能檢定
本發明之結合親和力可藉由抗VEGF細胞增殖功能檢定測定。
抗
VEGF
生長抑制檢定：
在37℃下，於含有5% CO
2及95%空氣之加濕培育箱(NUAIRE，NU-5831E，MN, USA)中，將HUVEC細胞(C2519A，Lonza，Basel, Switzerland)於具有內皮生長培養基(目錄號cAP-02，Angio-proteomie，MA, USA)之T75 NUNC簡易燒瓶(目錄號156499，Thermo Scientific，MA, USA)中培養及維持直至80%匯合。將自P2至P7傳代之HUVEC細胞用於檢定(P2及P7各自係指代數2及7)。將細胞藉由使用Accutase (目錄12679-54，Naclai tesque，Kyoto, Japan)提升及以5 x 10
3個細胞/平底96孔板(目錄3596，Corning，NY, USA)之孔接種於70 μl培養基中，該培養基由內皮細胞生長培養基(目錄號cAP-02，Angioproteomie，MA, USA)及不含酚紅之內皮細胞無血清定義培養基(113PR-500，Sigma-Aldrich，USA)之1:3混合物製得。將細胞培育過夜。
材料及方法：針對96孔板之4個單元每次新鮮製備含有下列組分之培養基。40 mL培養基113PR-500 (Sigma Aldrich)，400 µL FBS (目錄：F4135，Sigma Aldrich)，400 µL ECGS (目錄：356006，Corning)，400 µL肝素儲備溶液2 mg/ml (目錄：07980，Stemcells)，FBS (目錄：F4153，Sigma Aldrich)，200 µL氫化可的松(Hydrocortisone)儲備溶液96 μg/ml (目錄：07925，Stemcells)，500 µL L-抗壞血酸(目錄：A7631，Sigma)。將培育過夜之96孔板中之培養基輕輕抽吸及用70 μL/孔之以上新鮮製備之培養基置換。於除了對照孔之所有孔中藉由利用15 μL之5 ng/ml之最終濃度之重組人類VEGF-165 (Stemcell Technologies，目錄號78073)各者補足來處理各孔中之細胞。因此以連續稀釋製備抗體(BSP2及對照2)作為所需儲備溶液(15 μL/孔x n)以後來於具有總培養基體積100 µL之孔中達到所需最終濃度。將具有含於85 µL培養基加上VEGF中之HUVEC細胞之經BSP2及對照2處理之孔用15 µL各自連續稀釋抗體溶液各者加滿。將具有含於85 µL培養基中之HUVEC細胞之僅經VEGF處理之孔用15 µL單獨培養基各者加滿。將具有含於70 µL培養基中之HUVEC細胞之未經處理之孔用30 µL各單獨培養基加滿及將96孔板在37℃下於含有5% CO
2及95%空氣之加濕培育箱中培育3天。將各孔添加10 μL WST 8 (CCK-8，Dojindo，Japan)各者/孔及培育4小時，接著藉由使用無限M200 (Tecan，Switzerland)量測在450 nm波長下之吸光度。藉由GraphPad prism軟體(San Diego, CA, USA)測定IC50劑量連同濃度反應曲線。
結果：結果示於表17及圖6中。
表17：顯示來自9個獨立實驗各者之BSP2及對照2之終點平均IC50的比較。
| 樣品 | 增殖抑制： IC50 (pM) |
| BSP2 | 336.93 |
| 對照2 | 339.40 |
B.
抗
Ang2
之細胞功能檢定
該研究目標為評價化合物針對人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中之Ang2介導之管形成之功效。
材料
及方法
管形成檢定可用於將血管生成之組織再生階段建模。該檢定量測經平板接種之亞匯合內皮細胞以利用細胞外基質支持形成類管結構。其為用於評價各種化合物促進或抑制管形成之能力之檢定。能抑制管形成之化合物可用於各種疾病研究。管形成之原理係基於內皮細胞生長，細胞在細胞外支持基質周圍黏附及產生機械力。此等力可創建軌道以促進細胞遷移，繼而此等細胞將形成管結構。
材料：使用EGM
TM-2內皮細胞生長培養基-2 BulletKit
TM(目錄：CC-3162，Lonza)、人類臍靜脈內皮細胞(目錄：C2519A，Lonza)、重組人類血管生成素-2 (rhAng2) (目錄：623-AN/CF，R&D systems)及Geltrex™ 無LDEV減少生長因子基底膜基質(目錄：A1413202，Thermo Fisher Scientific)。
方法 ：將HUVEC再懸浮於不含胎牛血清(FBS)及VEGF之EGM-2培養基中。在rhAng2及增加劑量之BSP2或對照1之存在下，將10,000個細胞/孔接種於含有50 µl基底膜提取物(BME；GeltrexTM，Thermo Fisher Scientific)之96孔板中。(在個別實驗期間所用之樣品濃度示於表22中)。於處理6小時後獲取階段對比影像。
表
22.
| 樣品 | rhAng2 之濃度 (ng/mL) | 化合物 之濃度 (nM) |
| BSP2 | 500 | 0.1、0.3、1、3、10、30 |
| 對照1 | 500 | 0.1、0.3、1、3、10、30 |
結果：使用影像分析軟體(ImageJ；Angiogenesis Analyzer plugin)量測總管長度。在BSP2之最高及最低劑量之存在下，將各量測值針對藉由rhAng2誘導之管長度差異標準化。基於各實驗之標準化之總長度使用科學繪圖及生物統計軟體(GraphPad Prism)分析IC50。於此研究中，分析IC50以量測BSP2及對照1針對rhAng2介導之管形成相對於彼此之抑制功效。基於三個獨立實驗之平均反應之BSP2及對照1之濃度-反應曲線示於圖7中。平均IC50值示於表23中。
表
23.
| 樣品 | 管 形成之效率 ： IC50 (nM) |
| BSP2 | 5.92 |
| 對照1 | 15.98 |
C.
藉由評估
Tie-2
磷酸化，雙特異性抗體之抗
Ang2
功能之細胞功能檢定
該研究目標為藉由測定Tie-2 (HUVEC細胞中之血管生成素-2受體)於血管生成素-2刺激後之磷酸化狀態來研究雙特異性抗體對血管生成素-2信號傳導之選擇性抑制效應。磷酸化之分析係藉由西方墨點法進行。除了雙特異性抗體外，對照1 (抗Ang2 Ab536)係用作陽性對照及對照2 (阿柏西普)係用作陰性對照。
材料
及方法
在正常生理條件下，在不存在血管生成素-1下，血管生成素-2充當Tie-2受體之促效劑。雙特異性抗體對Tie-2之磷酸化狀態之效應係藉由西方墨點法藉由其蛋白質含量之變化捕獲。
原料
藥
| 名稱 | BSP2 | 對照2 | 對照1 |
| 分子量 | 195 kDa | 97.16 kDa | 146.77 kDa |
樣品及試劑製備
| 樣品名稱 | 製備方法 |
| BSP2 (2.35及23.5 nM) | 將BSP2用補充0.8 µg/mL血管生成素-2之CS-C完全培養基稀釋以製備含BSP2之培養基(2.35及23.5 nM)用於檢定 |
| 對照2 (1 µM) | 將對照2用補充0.8 µg/mL血管生成素-2之CS-C完全培養基稀釋以製備含1 µM對照2之培養基用於檢定 |
| 對照1 (3及30 nM ) | 將對照1用補充0.8 µg/mL血管生成素-2之CS-C完全培養基稀釋以製備含對照1之培養基(3及30 nM)用於檢定 |
| FGF1 (10 μg/mL) | 將25 μg酸性重組人類FGF /FGF1 (aa 16-155)蛋白，CF與2.5 mL PBS(-)重新構成以製備FGF1 (10 µg/mL)溶液 |
| 血管生成素-2 (100 μg/mL) | 將25 μg重組人類血管生成素-2蛋白，CF與250 μL PBS(-)重新構成以製備100 μg/mL血管生成素-2溶液 |
試劑
| 名稱 | 製造商 | 目錄號 | |
| CS-C完全培養基 | 含血清之基礎培養基 | Cell systems | CS4Z0500R |
| 培養物加強-R (TM) | |||
| 盤尼西林(Penicillin)-鏈黴素(Streptomycin) (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
| 酸性重組人類FGF /FGF1 (aa 16-155)蛋白，CF | R&D systems | 232-FA-025/CF | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)， 酚紅 | GIBCO | 25300-054 | |
| 重組人類血管生成素-2蛋白，CF | R&D systems | 623-AN-025/CF | |
| 原釩酸鈉 | New England BioLabs | P0758 | |
| 台盼蘭(Trypan blue) | Invitrogen | T10282 | |
| PBS(-) | GIBCO | 10010-049 | |
| D-PBS(+)製備試劑 (Ca+，Mg+溶液) (x100) | Nacalai Tesque | 02492-94 | |
| Biocoa I型膠原6孔板 | Corning | 354400 | |
| 樣品稀釋劑濃縮物(2x) | R&D Systems | DYC002 | |
| 用於哺乳動物細胞及組織提取物之蛋白酶抑制劑混合物 | Nacalai Tesque | 25955-24 | |
| Otsuka蒸餾水 | Otsuka pharmaceutical | ― | |
| 精度加上西方C標準 | Bio Rad | 1610385 | |
| 4 x Laemmli製樣緩衝液 | Bio Rad | 1610747 | |
| 2-巰基乙醇 | FUJIFILM Wako Pure chemical | 131-14572 | |
| 微型PROTEAN TGX凝膠(7.5 %) | Bio Rad | 4561025 | |
| 10 x Tris /甘胺酸/ SDS緩衝液 | Bio Rad | 1610732 | |
| 特厚吸墨紙濾紙 | Bio Rad | 1703966 | |
| 微型Trans-Blot濾紙 | Bio Rad | 1703932 | |
| Immobilon-P膜，PVDF，0.45 µm，7 x 8.4 cm | Millipore | IPVH07850 | |
| 10 x Tris /甘胺酸緩衝液 | Bio Rad | 1610734 | |
| 甲醇 | FUJIFILM Wako Pure chemical | 134-01833 | |
| 用於Can Get信號之PVDF阻斷試劑 | TOYOBO | NYPBR01 | |
| Can Get信號免疫反應增強溶液 | TOYOBO | NKB-101T | |
| 人類Tie-2抗體 | R&D Systems | AF313-SP | |
| 人類/小鼠磷酸-Tie-2 (Y992)抗體 | R&D Systems | AF2720-SP | |
| β-肌動蛋白抗體 | Cell Signaling Technology | 4967S | |
| 預吸附之驢抗山羊IgG H&L (HRP) | abcam | ab97120 | |
| 預吸附之驢抗兔IgG H&L (HRP) | abcam | ab97085 | |
| 精確蛋白質StrepTactin-HRP結合物 | Bio Rad | 1610381 | |
| Chemi-Lumi One Super | Nacalai tesque | 02230-14 | |
| 具有Tween 20之Tris緩衝鹽水(TBS-T) pH：7.6 | Takara Bio | T9142 | |
| 西方墨點法剝離緩衝液 | Thermo Scientific | 21059 |
儀器
| 名稱 | 製造商 | 型號 |
| Countess II FL自動細胞計數器 | invitrogen | AMQAF1000 |
| 分子成像儀 | Bio Rad | ChemiDoc™ XRS+ |
| 乾燥熱單元 | TAITEC | DTU-1B |
細胞
| 名稱： | 人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC) |
| 來源： | Kurabo Industries LTD |
| 在接收時之傳代數： | 2 |
| 在研究開始時之傳代數： | 6 |
培養條件
溫度及CO
2濃度係如下：-37℃，5% CO
2/95%空氣。
生長培養基之組成及製備——將5 mL盤尼西林-鏈黴素(10,000 U/mL)添加至CS-C完全培養基中。在使用之前立即添加1/1000體積之10 µg/mL FDF1以製備完全培養基。
方法
實驗
設計
1.時程表
| 天 | 操作 |
| 0 | 細胞接種 |
| 1 | 藥物處理，細胞收穫 |
| 2至3 | SDS-PAGE，西方墨點法 |
| 3至4 | 剝離，西方墨點法 |
2.研究組
將試驗物質分組及根據下表量測。針對BSP2，在兩點量測相同樣品及各自標記為樣品1及樣品2。
| 組編號 | 0.8 µg/mL 血管生成素-2 | 試驗物質 | 最終濃度 |
| 1 CS-C | ― | ― | 0 |
| 2 Ang-2 | ＋ | ＋ | 0 |
| 3 | ＋ | BSP2 (樣品1) | 2.35 nM |
| 4 | ＋ | 23.5 nM | |
| 5 | ＋ | BSP2 (樣品2) | 2.35 nM |
| 6 | ＋ | 23.5 nM | |
| 7 | ＋ | 對照1 | 3 nM |
| 8 | ＋ | 30 nM | |
| 9 | ＋ | 對照2 | 1 µM |
| 10 | ― | Na 3VO 4 | 1 mM |
3.試驗物質之濃度之基本原理
基於報導之Ab536之IC50值設置BSP2滴定之劑量範圍。作為陰性對照，針對此檢定設置1 µM，對照2之過量濃度以否認抗VEGF活性對該檢定之任何影響。作為此檢定中之陽性對照，基於已知用於Ab536之抗ANG2抗體之報導之IC50值設置對照1之滴度。
實驗
程序
低溫
恢復
將經低溫保存之HUVEC細胞於水浴中在37℃下解凍。將細胞懸浮液及5.5 mL補充有FGF1之生長培養基混合及將細胞接種於經I型膠原塗覆之100 mm盤中。將細胞於CO
2培育箱中培養1天。第二天，將培養基更換為補充有FGF1之新鮮生長培養基。
細胞
傳代
在達到亞匯合後，遺棄培養基及將細胞用PBS (-)沖洗兩次。添加0.05%胰蛋白酶-EDTA及將培養皿放入CO
2培育箱中直至細胞脫離。將脫離之細胞懸浮於3.5 mL生長培養基中。將細胞在230 x g，室溫下離心5分鐘。遺棄上清液及再懸浮於1 mL生長培養基中。將10 μL細胞懸浮液及10 μL 2 x台盼蘭溶液混合及利用Countess II自動細胞計數器量測細胞之數目。基於細胞計數結果，將細胞懸浮液利用生長培養基稀釋至2.5至5.0 x 10
3個細胞/cm
2。將10 mL經製備之補充有FGF1之細胞懸浮液添加至經I型膠原塗覆之100 mm盤中。將細胞於CO
2培育箱中培養。
用於檢定之細胞
接種
獲得細胞懸浮液及將細胞懸浮液之細胞密度利用生長培養基調整至5 x 10
5個細胞/mL。將1 mL經製備之細胞懸浮液添加至6孔板中。添加1 mL補充有FGF1之生長培養基(5 x 10
5個細胞/孔)。將細胞於CO
2培育箱中培養過夜。
藥物滴入
將抗體及血管生成素-2混合及在37℃下培育15分鐘。將舊培養基抽吸及用Ab/血管生成素-2溶液置換。將溶液在37℃下培育15分鐘。
細胞收穫及細胞
裂解物製備
製備具有樣品稀釋劑濃縮物2 (2x)、蒸餾水及蛋白酶抑制劑混合物之裂解緩衝液。製備1 mM原釩酸鈉/ PBS (+)與原釩酸鈉、D-PBS (+)及PBS (-)。於培育後將抗體/血管生成素-2溶液抽吸及將細胞用1 mM原釩酸鈉/ PBS (+)沖洗。藉由刮擦自容器移除細胞及於1.5 mL管中收穫細胞。將細胞在4℃下在15,000 rpm下離心1分鐘。遺棄上清液。添加100 µL裂解緩衝液及將管保持在冰上15分鐘，偶爾渦旋。將緩衝液在4℃下在15,000 rpm下離心1分鐘。將上清液(細胞裂解物)轉移至新管中及將其儲存在-30℃下。
用於
SDS-PAGE
之樣品製備
將1/10體積之2-巰基乙醇添加至4 x Leammli樣品緩衝液4中。將3體積之4 x Leammli樣品緩衝液添加至各1體積之樣品中。將其在95℃下加熱5分鐘。將樣品保持在冰上。進行SDS-PAGE。將10 x Tris /甘胺酸/SDS緩衝液用dd水稀釋以製備1 x Tris /甘胺酸/SDS緩衝液。將微型PROTEAN TGX凝膠(7.5%)設置成微型PROTEAN Tetra系統。將電泳槽用1 x Tris/甘胺酸/SDS緩衝液填充。應用樣品及精度加上西方標準。在150 V下進行電泳。
西方
墨點法
將10 x Tris /甘胺酸緩衝液、甲醇及dd水(1:2:7)混合以製備Towbin緩衝液。將Immobilon-P膜用甲醇凍乾。將纖維墊、凝膠、經凍乾之膜及濾紙於Towbin緩衝液中浸透。將纖維墊、濾紙、凝膠、膜放在盒上。將該盒設置為電泳槽。在100 V下進行電泳45分鐘。將膜用用於Can Get信號之PVDF阻斷試劑阻斷1小時。將膜用TBS-T洗滌三次。製備具有Can Get信號免疫反應增強溶液1之第一抗體反應溶液。將膜在4℃下於第一抗體反應溶液中浸透過夜。將膜用TBS-T洗滌三次。製備具有Can Get信號免疫反應增強溶液2之第二抗體反應溶液。將膜在室溫下於第二抗體反應溶液中浸透1小時。將膜用TBS-T洗滌三次。將膜於在檢測之前立即製備之Chemi-Lumi One Super中浸透。利用ChemiDoc™ XRS剝離及西方墨點法檢測ECL。將膜用TBS-T沖洗。將膜在37℃下至升溫之西方墨點法剝離緩衝液中浸透10至15分鐘。將膜用TBS-T沖洗。根據上述西方墨點法協定進行針對另一抗體之西方墨點法。
用於該研究中之抗體
| 靶 | 抗體 | 宿主 | 稀釋 | |
| 第1抗體 | 磷酸Tie-2 | 人類Tie-2抗體 | 兔 | 1:400 |
| 泛Tie-2 | 人類/小鼠磷酸-Tie-2 (Y992)抗體 | 山羊 | 1:200 | |
| β-肌動蛋白 | β-肌動蛋白抗體 | 兔 | 1:1000 | |
| 第2抗體 | 抗山羊HRP | 預吸附之驢抗山羊IgG H&L (HRP) | 驢 | 1:20000 |
| 抗兔HRP | 預吸附之驢抗兔IgG H&L (HRP) | 驢 | 1:20000 |
數據分析
分析條項——利用分子成像儀(ChemiDoc™ XRS+)獲得之膜影像
分析方法——利用分子成像儀進行對比度調整。
結果：結果示於圖8中。
結論
於此研究中，進行吸附墨點法分析以研究新穎雙特異性抗體對HUVEC中之血管生成素-2誘導之Tie-2磷酸化之選擇性抑制效應。
如圖8中所示，證實Tie-2磷酸化藉由HUVEC中之血管生成素-2刺激之上調及Tie-2磷酸化藉由添加新穎雙特異性抗體抑制。總之，該研究顯示新穎雙特異性抗體可藉由抑制血管生成素-2與Tie-2之間之相互作用來抑制Tie-2之磷酸化。
D.
藉由評估
Akt
磷酸化，雙特異性抗體之抗
Ang2
功能之細胞功能檢定
目的
於此研究中，利用磷酸-Akt ELISA檢定檢查雙特異性抗體對HUVEC中之血管生成素-2誘導之Akt磷酸化之效應。
材料
及方法
原料
藥
| 名稱 | BSP2 | 對照2 | 對照1 |
| 分子量 | 195 kDa | 97.16 kDa | 146.77 kDa |
樣品及試劑製備
| 樣品名稱 | 製備方法 |
| BSP2 | 將BSP2用補充0.8 µg/mL血管生成素-2之CS-C完全培養基稀釋以製備含BSP2之培養基(0.078、0.235、0.78、2.35、7.8及23.5 nM)用於檢定 |
| 對照2 | 將對照2用補充0.8 µg/mL血管生成素-2之CS-C完全培養基稀釋以製備1 µM含對照2之培養基用於檢定 |
| 對照1 | 將對照1用補充0.8 µg/mL血管生成素-2之CS-C完全培養基稀釋以製備含對照1之培養基(0.1、0.3、1、3、10及30 nM)用於檢定 |
| FGF1(10 μg/mL) | 將25 μg酸性重組人類FGF /FGF1 (aa 16-155)蛋白，CF與2.5 mL PBS(-)重新構成以製備FGF1 (10 µg/mL)溶液 |
| 血管生成素-2 (100 μg/mL) | 將25 μg重組人類血管生成素-2蛋白，CF與250 μL PBS(-)重新構成以製備100 μg/mL血管生成素-2溶液 |
試劑
| 名稱 | 製造商 | 目錄編號 | |
| CS-C完全培養基 | 含血清之基礎培養基 | Cell systems | CS4Z0500R |
| 培養物增強-R (TM) | |||
| 盤尼西林-鏈黴素(10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
| 酸性重組人類FGF /FGF1 (aa 16-155)蛋白，CF | R&D systems | 232-FA-025/CF | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)， 酚紅 | GIBCO | 25300-054 | |
| 重組人類血管生成素-2蛋白，CF | R&D systems | 623-AN-025/CF | |
| 原釩酸鈉 | New England BioLabs | P0758 | |
| 台盼藍 | Invitrogen | T10282 | |
| PBS(-) | GIBCO | 10010-049 | |
| Biocoat I型膠原24孔板 | Corning | 354408 | |
| 用於哺乳動物細胞及組織提取物之蛋白酶抑制劑混合物 | Nacalai Tesque | 25955-24 | |
| Otsuka蒸餾水 | Otsuka pharmaceutical | ― | |
| FastScan磷酸-Akt1 (Ser473) ELISA套組 | Cell Signaling Technology | 54336 |
儀器
| 名稱 | 製造商 | 型號 |
| Countess II FL自動細胞計數器 | invitrogen | AMQAF1000 |
| 超音波浴式超音波儀 | HONDA | W-113 |
| 數位微板振盪器 | IKA | MTS 2/4 |
| 微量滴定板引導 | MOLECULAR DEVICES | SpectraMax ABS Plus |
細胞
| 名稱： | 人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC) |
| 來源： | Kurabo Industries LTD |
| 在接收時之傳代數： | 2 |
| 在研究開始時之傳代數 | 6 |
培養條件
溫度及CO
2濃度係如下：37℃，5% CO
2/95%空氣
生長培養基之組成及製備：將5 mL盤尼西林-鏈黴素(10,000 U/mL)添加至CS-C完全培養基中。在使用之前立即添加1/1000體積之10 µg/mL FDF1以製備完全培養基。
方法
實驗設計
1.時程表
| 天 | 操作 |
| 0 | 細胞接種 |
| 1 | 藥物處理，細胞收穫 |
| 2 | ELISA |
2.研究組
根據下表將試驗物質分組及量測。針對BSP2，在兩點量測相同樣品及各自標記為樣品1及樣品2。
| 組編號 | 0.8 µg/mL血管生成素-2 | 試驗物質 | 最終濃度 |
| 1 CS-C | ― | ― | 0 |
| 2 Ang-2 | ＋ | ― | 0 |
| 3 | ＋ | BSP2 (樣品1) | 0.078 nM |
| 4 | ＋ | 0.235 nM | |
| 5 | ＋ | 0.78 nM | |
| 6 | ＋ | 2.35 nM | |
| 7 | ＋ | 7.8 nM | |
| 8 | ＋ | 23.5 nM | |
| 9 | ＋ | BSP2 (樣品2) | 0.078 nM |
| 10 | ＋ | 0.235 nM | |
| 11 | ＋ | 0.78 nM | |
| 12 | ＋ | 2.35 nM | |
| 13 | ＋ | 7.8 nM | |
| 14 | ＋ | 23.5 nM | |
| 15 | ＋ | 對照1 | 0.1 nM |
| 16 | ＋ | 0.3 nM | |
| 17 | ＋ | 1 nM | |
| 18 | ＋ | 3 nM | |
| 19 | ＋ | 10 nM | |
| 20 | ＋ | 30 nM | |
| 21 | ＋ | 對照2 | 1 µM |
| 22 | ― | Na 3VO 4 | 1 mM |
3.試驗物質之濃度之基本原理
基於報導之Ab536之IC50值設置BSP2滴定之劑量範圍。作為陰性對照，針對此檢定設置1 µM，對照2之過量濃度以否認抗VEGF活性對該檢定之任何影響。作為陽性對照，基於已知用於Ab536之抗ANG2抗體之報導之IC50值設置對照1之滴度。
實驗
程序
低溫
恢復
及細胞傳代
HUVEC細胞係使用與實例5-C相同之程序低溫保存及製備。
用於檢定之細胞接種
針對Akt ELISA，收集經製備之HUVEC細胞及將細胞懸浮液之細胞密度利用生長培養基調整至5 x 10
5個細胞/mL及將1 mL經製備之細胞懸浮液添加至6孔板中。然後，將1 mL補充有FGF1之生長培養基(5 x 10
5個細胞/孔)添加至孔中。將細胞於CO
2培育箱中培養過夜。
藥物滴入
將抗體及血管生成素-2混合及在37℃下培育15分鐘。將舊培養基抽吸及用Ab/血管生成素-2溶液置換。將溶液在37℃下培育15分鐘。
細胞收穫及細胞裂解物製備
製備具有5 x細胞提取緩衝液、50 x細胞提取緩衝液及蛋白酶混合物之1 x細胞提取緩衝液。將細胞用PBS (+)沖洗。於6孔板之各孔中添加150 µL 1x細胞提取緩衝液。將細胞懸浮液收穫至1.5 mL管中及在冰上於超音波浴式超音波儀中音波處理15分鐘。將懸浮液在4℃下在15,000 rpm下離心1分鐘。將上清液(細胞裂解物)轉移至新管中及將其儲存在-30℃下。
ELISA
將50 µL細胞裂解物添加至FastScan ELISA微孔板中。將Akt (Pan)兔捕獲抗體及磷酸-Akt (Ser473)兔HRP連接混合以製備抗體混合物。將抗體混合物添加至各孔。將板在400 rpm下在室溫下振盪1小時。將板用1x洗滌緩衝液洗滌三次。添加TMB底物及將板在400 rpm下在室溫下振盪15分鐘。將終止溶液添加至各孔。量測在450及540 nm下之吸光度。
數據分析
分析方法
各組之吸光度值藉由條形圖及S形曲線表示。該S形曲線係使用「Quest Graph™四參數邏輯(4PL)曲線計算器」 AAT Bioquest, Inc自所獲得之各試驗濃度樣品之計算值創建，及計算各試驗物質之IC50。自藉由樣品1、樣品2及對照1滴定所畫之擬合曲線之公式計算IC50。
結果
結果示於表24及圖9至12中。
表24：IC50值(nM)
| 樣品 | 樣品1 | 樣品2 | 對照1 |
| IC50 (nM) | 2.4783 | 2.4091 | 1.9148 |
結論
此研究之目標為測定雙特異性抗體對Akt磷酸化之抑制效應。針對該目的，進行磷酸-Akt之ELISA以研究雙特異性抗體對HUVEC中之血管生成素-2誘導之Akt磷酸化之選擇性抑制效應。Akt磷酸化藉由添加各自具有2.5 nM及2.4 nM之IC50值兩個不同批次之新穎雙特異性抗體各者劑量依賴性抑制。
實例
6
持續性視網膜新生血管形成之動物模型
此研究之目的為評價BSP2與阿柏西普相比藉由IVT注射於持續性視網膜新生血管形成(PRNV/DLAAA)兔模型中之功效。為識別可自藥物或人類疾病之新穎療法受益之適應症，該PRNV/DLAAA模型模擬血管生成視網膜疾病。基於公開之論文(A novel model of persistent retinal neovascularization for the development of sustained anti-VEGF therapies，Li等人，Exp Eye Res Res. 2018 Sep;174:98-106。doi: 10.1016/j.exer.2018.05.027)設計模型誘導、研究協定及血管滲漏評價。
材料及方法：
簡明地，於此研究中使用荷蘭帶兔。針對各動物，僅使用一隻眼建立視網膜損傷模型用於表徵及使用對側眼作為對照。為進一步藥物試驗，在一隻眼上進行視網膜損傷。然而，向兩隻眼投與化合物以研究患有及不患有疾病之藥物毒性/效應。此協定之獨特組分為在意識上而非在麻醉動物上評價眼科終點。此移除在檢查期間來自麻醉劑之潛在干擾，及此外，增加動物將存活持續接近隨訪年數之可能性。
A
，裂隙燈檢查：
裂隙燈檢查為揭示接受試驗物品治療之兔之眼睛之前房中的重要發炎反應。
於第1天及第3天之注射及隨訪後立即由眼科醫生對所有眼睛進行觀察。若存在發炎之徵兆，則基於藥物效應及持續時間繼續隨訪。
於所有吾人研究中應用葡萄膜炎命名法之標準化(SUN)。當以45至60°之角度投射時，使用高度及寬度為1 X 1 mm之裂隙燈束觀察前房中之細胞及耀斑。基於發現，可將發炎歸類為0至4+等級。
B
，持續性視網膜新生血管形成
(PRNV)
兔模型儀器之功效量測
/
評價：
眼底攝影術 (FP) ：連續拍攝之眼底照片可用於監測治療反應、發炎變化及藥物分佈。
螢光素血管造影術 (FA)：FA成像位置係與彩色影像相同。根據下列時程表拍攝FA影像：
光學相干斷層掃描術 (OCT)：OCT為建立之醫學成像技術，其使用光以捕獲視網膜及脈絡膜結構之微米-解析度三維影像，比對及量測其厚度。
C
，藥理學研究之
PRNV
模型之標準
此研究中招募之所有動物在給藥之前之2個月內具有持續性視網膜新生血管形成(PRNV)與FA滲漏。新生血管血管造影滲漏面積及強度係藉由NaF血管造影術(0.5 ml，10%，OCT/FA於3個區域中，55°)定義。此研究中招募之約60至70%之動物具有穩定血管造影滲漏面積＞ 2個圓盤直徑及≥評分2之瀉漏嚴重度(可與研究目的不同)。藉由FA攝影術之定量量測評價治療功效及血管消退定量分析。
D ，安全性：使用裂隙燈記錄於給藥後之前段發炎之觀察及評分。在治療眼睛中之任一者之研究期期間之視網膜毒性效應(諸如玻璃體渾濁及視網膜渾濁)藉由眼底攝影術、OCT以及FA識別。
E ，藥物沉積及分佈：於玻璃體中參考藥物沉積及分佈。對所注射藥物之沉積及清除之調配效應藉由彩色眼底照相機之攝影術觀察持續給藥後之所有時間點。
結果：針對基於FA影像計算之血管滲漏面積百分比(%)之動物模型化合物治療時間點圖示於圖13中。圖14至28為經化合物治療之血管滲漏評價(OD)及經化合物治療之非DLAAA誘導之眼作為對照(OS)在第0、1、12及24週時按照各組之FA影像。
如動物研究圖14至28中所示，BSP2已證實，與對照1已知VEGF抑制劑阿柏西普相比之優越血管滲漏抑制能力、滲漏血管消退及更長持續時間。
下表中簡要解釋本文中所述之序列。
序列表中之序列之簡要描述
*：根據EU/Kabat在IgG1之第235及第309位置處自白胺酸至離胺酸之2個取代
序列 SEQ ID NO: 1EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO: 2DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 3EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 4DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 5DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
GGGGSGGGGS
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 6SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K)
SEQ ID NO: 7(GGGGS)n,n=1-10
SEQ ID NO: 8(GGGGS)n,n=4
SEQ ID NO: 9SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 10DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIKRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 11EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 12SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO: 13DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
GGGGSGGGGS
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 14SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
GGGGSGGGGS
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 15EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
GGGGSGGGGS
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 16SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
GGGGSGGGGS
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 17GGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 18SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIW
DSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSV
GEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLT
IDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHE
SEQ ID NO: 19KDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 20SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 21EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 22DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 23EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
GGGGSGGGGS
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 24GFTFSSYGMHW
SEQ ID NO: 25YISSSGSTIYYADSVKG
SEQ ID NO: 26CARDLLDYDILTGYGYW
SEQ ID NO: 27CRSSQSLLHSNGYNYLDW
SEQ ID NO: 28YLGSNRASG
SEQ ID NO: 29CMQGTHWPPT
| 名稱 | 簡要描述 | SEQ ID NO | 起源 |
| Ab536 HC | 1 | ||
| Ab536 LC | 2 | ||
| Ab536 VH | 3 | ||
| Ab536 VL | 4 | ||
| Ab536 scFv | VL+連接子+VH | 5 | SEQ ID NO: 4+17+3 |
| 阿柏西普 | 6 | ||
| 連接子 | 7 | (GGGGS)n, n=1-10 | |
| 連接子 | 8 | (GGGGS)n, n=4 | |
| 具有兩個L/K *之阿柏西普 | 9 | 具有2個L/K *之SEQ ID NO: 6 | |
| BSP LC1 | Ab536 Fab-阿柏西普 | 2 | 與SEQ ID NO:2相同 |
| BSP LC2 | Ab536 Fab-阿柏西普 | 10 | SEQ ID NO:2，其中在位置113與114之間添加R |
| BSP HC1 | Ab536 Fab-阿柏西普 | 11 | SEQ ID NO:1+8+9 |
| BSP HC2 | 阿柏西普-Ab536 Fab | 12 | SEQ ID NO:9+8+1 |
| BSP3 | Ab536 scFv-阿柏西普 | 13 | SEQ ID NO: 4+17+3+8+9 |
| BSP4 | 阿柏西普-Ab536 scFv | 14 | SEQ ID NO: 9+8+4+17+3 |
| BSP5 | Ab536 scFv -阿柏西普 | 15 | SEQ ID NO: 3+17+4+8+9 |
| BSP6 | 阿柏西普-Ab536 scFv | 16 | SEQ ID NO: 9+8+3+17+4 |
| 連接子 | 17 | (GGGGS)n,n=2 以scFv形式使用 | |
| 阿柏西普之細胞外域 | 18 | ||
| Fc序列 | 19 | ||
| 對照2 (VEGF抑制劑) | 對照 | 20 | SEQ ID NO: 6在3’端無K |
| 對照1 HC (ANG2抑制劑) | 對照 | 21 | |
| 對照1 LC (ANG2抑制劑) | 對照 | 22 | =2 |
| Ab536 scFv | VH+連接子+VL | 23 | 3+17+4 |
| Ab536 HCDR1 | 24 | SEQ ID NO: 3中之HCDR1 | |
| Ab536 HCDR2 | 25 | SEQ ID NO: 3中之HCDR2 | |
| Ab536 HCDR3 | 26 | SEQ ID NO: 3中之HCDR3 | |
| Ab536 LCDR1 | 27 | SEQ ID NO: 4中之LCDR1 | |
| Ab536 LCDR2 | 28 | SEQ ID NO: 4中之LCDR2 | |
| Ab536 LCDR3 | 29 | SEQ ID NO: 4中之LCDR3 |
圖1：圖1(a)顯示VEGF結合域–連接子–Ang-2結合域(scFv)之示意圖。圖1(b)顯示VEGF結合域–連接子–Ang-2結合域(Fab)之示意圖。圖1(c)顯示Ang-2結合域(Fab)–連接子–VEGF結合域之示意圖。圖1(d)顯示ANG-2結合域(scFv)–連接子–VEGF結合域之示意圖。圖1(e)顯示第一單體：ANG-2結合域(Fab)–連接子–VEGF結合域及第二單體：VEGF結合域–連接子–ANG-2結合域(Fab)之示意圖。圖1(f)顯示第一單體：ANG-2結合域(scFv)–連接子–VEGF結合域及第二單體：VEGF結合域–連接子–ANG-2結合域(scFv)之示意圖。圖1 (g)顯示第一單體：ANG-2結合域(Fab)–連接子–VEGF 結合域及第二單體：VEGF結合域–連接子–ANG-2結合域(scFv)之示意圖。圖1 (h)顯示第一單體：ANG-2結合域(scFv) –連接子–VEGF結合域及第二單體：VEGF結合域–連接子–ANG-2結合域(Fab)之示意圖。
圖2：ELISA設置之示意圖。
圖3：(a)針對BSP2之ELISA-ANG2之結果及(b)針對BSP2之ELISA-VEGF之結果。
圖4：針對BSP2之Biacore-VEGF及ANG2之結果。
圖5：針對BSP1之Biacore-VEGF及ANG2之結果。
圖6：推導(A) BSP2及(B)對照2之IC
50之代表性濃度反應曲線。將HUVEC內皮細胞用5 ng/ml重組人類VEGF-165，接著不同濃度之BSP2或對照2處理3天及藉由使用氧化還原染料WST-8量測終點細胞活力。進行總計9個獨立實驗，其中於各實驗中具有最少3次重複。
圖7：推導利用BSP2及對照1處理之管形成之濃度-反應曲線(顯示三個獨立實驗之平均反應)。
圖8：BSP2對HUVEC中Tie-2之血管生成素-2-誘導之磷酸化的效應。
圖9：BSP2對HUVEC細胞中之血管生成素-2-誘導之Akt磷酸化的效應。將HUVEC利用血管生成素-2以指定濃度之雙特異性抗體處理15分鐘。然後，收穫細胞及裂解。之後，在細胞裂解物上進行Akt磷酸化之ELISA。(N=2)
圖10：BSP2 (樣品1)對HUVEC中之血管生成素2誘導之Akt磷酸化之濃度反應曲線。
圖11：BSP2 (樣品2)對HUVEC中之血管生成素2誘導之Akt磷酸化之濃度反應曲線。
圖12：對照1對HUVEC中之血管生成素-2誘導之Akt磷酸化之濃度反應曲線。
圖13：針對基於FA影像計算之血管滲漏面積百分比之動物模型化合物治療時間點圖。基於在開始研究時獲得之初始基線將各處理組之血管滲漏面積標準化。在設計6個月研究期期間無動物因安全性或其他AE而損失。(N=4對照2組；N=6，BSP2 1.0 mg及N=5，3.0 mg)。
圖14至28：經化合物處理之血管滲漏評價(OD)及經化合物處理之非DLAAA誘導之眼睛作為對照(OS)在第0、1、12及24週時按各組之FA影像。圖14：對照2 0.5 mg基線；圖15：對照2 0.5 mg，第1週；圖16：對照2 0.5 mg，第12週；圖17：對照2 0.5 mg，第24週；圖18：BSP2 1.0 mg，基線；圖19：BSP2 1.0 mg，第1週；圖20：BSP2 1.0 mg，第12週；圖21: BSP2 1.0 mg，第24週；圖22：BSP2 3.0 mg，基線；圖23. BSP2 3.0 mg，第1週；圖24：BSP2 3.0 mg，第12週；圖25：BSP2 3.0 mg，第24週；圖26：BSP2 3.0 mg，基線，未誘導之眼睛；圖27. BSP2 3.0 mg，第12週，未誘導；及圖28. BSP2 3.0 mg，第24週，未誘導之眼睛。
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50 55 60
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Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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Cys Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Thr
1 5 10
Claims (38)
- 一種雙特異性結合分子，其包含含有抗血管生成素2 (ANG2)結合域及血管內皮生長因子(VEGF)結合域之多肽，其中該抗ANG2結合域為ANG2抗體或其抗原結合片段，其中該VEGF結合域包含結合至VEGF多肽之融合蛋白，該VEGF多肽包含以可操作方式連接至Fc域之VEGF受體之細胞外域，其中該抗ANG2結合域為Fab片段或scFv片段。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，其中該VEGF結合域包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中該Fc域為IgG1。
- 如請求項2之雙特異性結合分子，該抗ANG2結合域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，其中該IgG1經突變。
- 如請求項2之雙特異性結合分子，其中該Fc域根據EU/Kabat編號方案在選自該IgG1之第235及第309位置之至少一個位點處具有取代、缺失、插入及/或新增之胺基酸序列。
- 如請求項4之雙特異性結合分子，其中該Fc域根據EU/Kabat編號方案在該IgG1之第309位置處具有取代之胺基酸序列。
- 如請求項5之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有取代成K之胺基酸序列。
- 如請求項4之雙特異性結合分子，其中該Fc域根據EU/Kabat編號方案在該IgG1之第235位置處具有取代之胺基酸序列。
- 如請求項7之雙特異性結合分子，其中該Fc域具有取代成K之胺基酸序列。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合域與該ANG2結合域之N端連接。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該ANG2結合域與該VEGF結合域之N端連接。
- 如請求項2之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為Fab片段。
- 如請求項2之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為scFv片段。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合域經由連接子與該ANG2結合域連接。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
- 如請求項14之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
- 如請求項14之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
- 如請求項17之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
- 如請求項17之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該結合分子包含選自由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群之胺基酸序列。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為Fab片段，其中該Fab片段透過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 10之輕鏈胺基酸序列。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該抗ANG2結合域為Fab片段，其中該Fab片段透過肽連接子融合至該VEGF結合域之N端，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 11之重鏈胺基酸序列，其中該雙特異性結合分子包含為SEQ ID NO: 2之輕鏈胺基酸序列。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該結合分子為其多肽之二聚體。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之雙特異性結合分子及醫藥上可接受之賦形劑。
- 一種抑制血管生成之方法，其使用如請求項1之雙特異性結合分子。
- 一種改善及/或治療選自血管生成、血管滲透性、水腫及發炎之臨床病狀之方法，其使用如請求項1之雙特異性結合分子。
- 一種治療眼病之方法，其投與如請求項1之雙特異性結合分子。
- 如請求項27之方法，其中該眼病係選自由以下組成之群：AMD、黃斑水腫、CNV、DME、病理性近視、血管性青光眼、GA、視網膜靜脈阻塞、ROP及角膜新生血管形成。
- 一種包含如請求項1之雙特異性結合分子的組合物，其用於抑制血管生成或治療眼病。
- 如請求項1之雙特異性結合分子，其用於抑制血管生成或治療眼病。
- 一種如請求項1之結合分子於製造用於抑制血管生成或治療眼病之藥劑中的用途。
- 一種核酸，其編碼如請求項1之雙特異性結合分子。
- 一種載體，其包含如請求項32之核酸。
- 一種表現載體，其包含如請求項32之核酸，其中該核酸以可操作方式連接至表現控制序列。
- 一種用於於適宜宿主細胞中產生融合多肽之宿主載體系統，該融合多肽包含如請求項34之表現載體。
- 如請求項35之宿主載體系統，其中該適宜宿主細胞為細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
- 如請求項35之宿主載體系統，其中該適宜宿主細胞為CHO細胞。
- 一種製備該雙特異性結合分子之方法，其包括使如請求項34之宿主-載體系統之細胞在允許產生該融合多肽之條件下生長並回收如此製備之融合多肽。
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