BR112020009707A2 - anticorpos para a-sinucleína e usos dos mesmos - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a um anticorpo anti-alfa- sinucleína que reconhece preferencialmente agregados de alfa-sinucleína, e ao uso de detecção, diagnóstico e/ou tratamento ou prevenção de várias doenças causadas pelo acúmulo de agregados de alfa-sinucleína, ou suas doenças sintomáticas relacionadas, pelo uso do anticorpo anti-alfa- sinucleína.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPOS PARA α-SINUCLEÍNA E USOS DOS MESMOS”
[001] A presente invenção se refere a um anticorpo contra alfa-sinucleína e sua utilização.
[002] A alfa-sinucleína (α-sinucleína, α-syn) é expressa principalmente nos terminais pré-sinápticos dos neurônios e é um monômero naturalmente desdobrado em condições normais.
A alfa-sinucleína ajuda a regular a liberação de dopamina, que é um neurotransmissor que controla movimentos voluntários ou involuntários. Particularmente, a função da alfa-sinucleína é importante com o aumento da atividade sináptica e do envelhecimento, e é um importante fator de neurodegeneração.
[003] No entanto, no estado patológico, a alfa- sinucleína sofre alterações estruturais através da ligação e interação com gotículas, bicamadas fosfolipídicas ou membranas lipídicas para formar uma estrutura secundária α- helicoidal dobrada ou dobrada, dividindo assim a quantidade.
Aglomerados compreendendo moléculas na forma de dímeros, oligômeros e/ou fibras são formados.
[004] Sabe-se que esses agregados de alfa-sinucleína induzem toxicidade às células e são o principal componente de um agregado anormal de proteínas nos corpos de Lewy,
encontrados em neurônios da doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), Demência com corpos de Lewy (DLB) e várias doenças. Sabe-se também que modificações pós-traducionais da alfa-sinucleína, como fosforilação ou ubiquitinação, também estão associadas à agregação e neurotoxicidade da alfa- sinucleína. Sabe-se que a alfa-sinucleína mata neurônios da dopamina e causa reações inflamatórias em experimentos com animais e em experimentos com células, além de causar sintomas motores semelhantes à doença de Parkinson em animais experimentais. Além disso, sabe-se que a agregação de alfa- sinucleína está relacionada à etiologia de um grupo de doenças neurodegenerativas chamadas α-sinucleinopatias, incluindo a doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson, demência de corpos de Lewy, atrofia do sistema múltiplo e muitas outras doenças neuro-axonais.
[005] Além disso, foram encontradas formas oligoméricas e monoméricas de alfa-sinucleína em amostras de líquido cefalorraquidiano e plasma de pacientes com doença de Parkinson, indicando que agregados de alfa-sinucleína com pequeno peso molecular podem penetrar na membrana celular e acessar o espaço extracelular. Também foi demonstrado que a alfa-sinucleína dobrada pode ser liberada das células por exocitose e depois transferida de uma região do cérebro para outra região por transferência intercelular como proteínas de príons.
[006] Portanto, a alfa-sinucleína é um alvo para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para α- sinucleinopatia, como a doença de Parkinson. As principais estratégias de desenvolvimento incluem inibição da formação de agregados, silenciamento de genes e remoção de agregados.
No primeiro caso, Epigalocatequina-3-galato (EGCG), 3-(1,3- benzodioxol-bromofenil)-1H-pirazol (anle138b), CLR0120 e KYP-20479 do inibidor da prolil oligopeptidase estão incluídos.
[007] Os compostos com baixo peso molecular devem ser administrados em doses elevadas, devido à baixa capacidade de ligação específica ao alvo e à meia-vida curta. Comparado aos compostos com baixo peso molecular, o anticorpo tem uma especificidade alvo e meia-vida longa. No entanto, para aumentar o potencial terapêutico da doença, são necessários anticorpos que se liguem preferencialmente aos agregados com alta afinidade. Portanto, para o tratamento de doenças associadas ao acúmulo anormal de agregados de alfa- sinucleína, é necessário o desenvolvimento de anticorpos capazes de se ligar preferencialmente à alfa-sinucleína, particularmente a agregados de alfa-sinucleína.
[008] Na presente especificação, é fornecer um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à alfa-sinucleína, particularmente ao agregado de alfa-sinucleína. O anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno contra a alfa-sinucleína pode reconhecer e se ligar especificamente à alfa-sinucleína e, em particular, se ligar à região C-terminal da alfa- sinucleína.
[009] Uma modalidade da presente invenção fornece o anticorpo que se liga especificamente à sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína e reduz o nível de alfa- sinucleína no sistema nervoso de um indivíduo. Mais especificamente, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção tem uma alta afinidade de ligação ao agregado de alfa-sinucleína, particularmente fibrilas amiloides, protofibrilas e oligômeros, ou especialmente fibrilas amiloides, mas tem baixa afinidade de ligação ao monômero alfa-sinucleína.
[010] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção possui pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste em (i) ligação específica à alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína, (ii) redução do nível de alfa-sinucleína ou de agregado de alfa- sinucleína no sistema nervoso de um indivíduo, (iii) redução ou inibição da transmissão célula a célula de alfa-sinucleína ou de agregado de alfa-sinucleína entre as células nervosas e (vi) melhoria da captação fagocítica de uma célula nervosa para alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína. De preferência, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ter todas as propriedades de (i) a (iv).
[011] Uma modalidade da presente invenção se refere a uma composição para prevenção, alívio, melhoria ou tratamento de sinucleinopatias, compreendendo um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antígeno, capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente ao agregado de alfa-sinucleína.
[012] Uma modalidade da presente invenção se refere a um método de prevenção, alívio, melhoria ou tratamento de sinucleinopatias, compreendendo uma etapa de administração a um indivíduo em necessidade, um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sendo capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente ao agregado de alfa-sinucleína. A quantidade administrada do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser uma quantidade eficaz para reduzir o nível de alfa- sinucleína, especialmente alfa-sinucleína agregada no sistema nervoso, mais especificamente região extracelular da célula nervosa no sistema nervoso de um indivíduo.
[013] Uma modalidade da presente invenção se refere a um método para reduzir o nível de alfa-sinucleína, especialmente de agregado de alfa-sinucleína no sistema nervoso, mais especificamente a região extracelular da célula nervosa no sistema nervoso de um indivíduo, ou ao uso de reduzir o nível de alfa-sinucleína, especialmente de agregado de alfa-sinucleína em uma região extracelular da célula nervosa no sistema nervoso, compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, sendo capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente ao agregado de alfa-sinucleína.
[014] Uma modalidade da presente invenção se refere a um método para reduzir ou inibir a transmissão de célula a célula de alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína no sistema nervoso, especialmente entre as células nervosas de um indivíduo, ou ao uso de reduzir ou inibir transmissão de célula a célula de alfa-sinucleína ou agregado de alfa- sinucleína entre as células nervosas no sistema nervoso, compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sendo capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente ao agregado de alfa- sinucleína.
[015] Uma modalidade da presente invenção se refere a um método para aumentar a captação fagocítica da micróglia no sistema nervoso para a alfa-sinucleína ou agregado de alfa-
sinucleína, ou a um uso para aumentar a captação fagocítica da microglia no sistema nervoso para a alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína, compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente ao agregado de alfa-sinucleína.
[016] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes.
[017] A presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à alfa-sinucleína, especialmente ao agregado de alfa-sinucleína. O anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contra a alfa-sinucleína pode reconhecer e se ligar especificamente à alfa-sinucleína sem se ligar à beta(β)-sinucleína ou gama(γ)-sinucleína e reconhecer e se ligar especificamente ao agregado de alfa-sinucleína, sem se ligar ao agregado beta amiloide e agregado tau.
[018] Aqui, o termo "antígeno" ou "imunógeno" significa uma molécula ou uma parte da molécula que, por exemplo, pode ser ligada por uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno imunologicamente funcional) e pode ser usado para a produção de um anticorpo devido à propriedade de ligação a um antígeno em um animal. O antígeno pode incluir um ou mais epítopos que podem interagir com um anticorpo diferente ou seu fragmento. Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, o antígeno pode ser proteína alfa-sinucleína ou agregado de proteína alfa-sinucleína. Especificamente, o agregado de proteína alfa-sinucleína pode ser fibrilas amiloides, protofibrilas e oligômeros, especialmente fibrilas amiloides. O anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno sendo capaz de se ligar especificamente à alfa-sinucleína ou seu agregado de acordo com a presente invenção pode ser especialmente aquele que se liga especificamente à região C-terminal da alfa-sinucleína. Os anticorpos de alfa-sinucleína que reconhecem o terminal N não podem reconhecer agregados de outras doenças, como atrofia de múltiplos sistemas pertencentes a sinucleinopatias, que coletivamente se referem a doenças relacionadas à alfa-sinucleína. Por outro lado, os anticorpos de alfa-sinucleína que reconhecem a região C- terminal têm uma vantagem em reconhecer agregados de outras várias sinucleinopatias, bem como a doença de Parkinson.
[019] Aqui, o termo "neutralização" se refere à inibição ou redução da atividade biológica de um antígeno, quando uma proteína de ligação se liga especificamente ao antígeno. Em uma modalidade, a proteína neutralizante ou anticorpo neutralizante pode se ligar a um antígeno (alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína) e, assim, reduzir o nível do antígeno em pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% no nível extracelular de células nervosas no sistema nervoso de um indivíduo, ou impedir que o nível de antígeno aumente na região extracelular.
[020] Aqui, "alfa-sinucleína" é alfa-sinucleína nativa (NCBI ID: NP_000336) que consiste em 140 aminoácidos codificados pelo gene SNCA e inclui várias formas processadas, bem como proteínas não processadas com comprimento total. Além disso, a alfa-sinucleína inclui variantes naturais de alfa-sinucleína, como mutantes, variantes de junção ("splice variants") ou variantes alélicas. As variantes são formas de proteína de resíduos 126 e 112 nas quais o éxon 3 e o éxon 5 são deletados (CAG3339.1), bem como 140 proteínas de resíduos. Sabe-se também que polimorfismo específico ou mutações missenso do gene SNCA estão associadas à ocorrência da doença de Parkinson, e essas variantes também estão incluídas na alfa- sinucleína. Incluem-se beta-sinucleína e gama-sinucleína dos homólogos à alfa-sinucleína. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção reconhece especificamente a alfa-sinucleína. A sequência de aminoácidos da alfa- sinucleína é mostrada na SEQ ID NO: 225.
[021] Aqui, o "agregado de alfa-sinucleína" se forma devido à alteração conformacional da alfa-sinucleína e inclui um oligômero, uma protofibrila, uma fibrila e/ou a estrutura ou agregado, incluindo pelo menos um selecionado dos mesmos.
[022] A alfa-sinucleína que pode ser reconhecida pelo anticorpo aqui fornecido, pode ser selecionada a partir das alfa-sinucleínas de mamífero da alfa-sinucleína humana, alfa-sinucleína de macaco (por exemplo, alfa-sinucleína de Rhesus), alfa-sinucleína de rato, alfa-sinucleína de camundongo, alfa-sinucleína de rato, e similar. Por exemplo, a alfa-sinucleína humana pode ser alfa-sinucleína (NCBI ID: NP_000336), mas não se limita a isso. Salvo indicação em contrário, a alfa-sinucleína pode se referir à alfa- sinucleína humana, e os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos têm uma propriedade de ligação específica não apenas à alfa-sinucleína humana, mas também à alfa-sinucleína de macaco (por exemplo, alfa-sinucleína de Rhesus), alfa-sinucleína de rato e/ou alfa-sinucleína de camundongo.
[023] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar à região C-terminal da alfa-sinucleína, especificamente à região C-terminal, incluindo o peptídeo composto por pelo menos 11 ou 12 aminoácidos consecutivos, incluindo 110 a 120 resíduos ou 111 a 122 resíduos na SEQ ID NO: 126 da alfa-sinucleína humana. Foi confirmado que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode reconhecer a região de reconhecimento do antígeno e se ligar ao agregado de alfa-sinucleína com uma alta afinidade de ligação.
[024] Aqui, "afinidade" ou "grau de afinidade é a força da interação entre um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno e um antígeno, e pode ser determinado por propriedades do antígeno, como tamanho, forma e/ou carga do antígeno e sequências CDR e/ou propriedades físico-químicas (propriedades hidrofílicas/hidrofóbicas, propriedades eletrostáticas e etc.) do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Os métodos para determinar a afinidade são conhecidos na técnica e geralmente indicados como constante de dissociação (KD), mas não limitados a eles.
[025] Aqui, "ligação específica a alfa-sinucleína ou ao agregado de alfa-sinucleína" significa que a afinidade de ligação à proteína alfa-sinucleína ou ao agregado de alfa- sinucleína é relativamente alta em comparação com outros antígenos e, por exemplo, pode ser a afinidade de 0,1 x 10- 10 M a 2 x 10-10 M ou 0,05 x 10-10 M a 0,3x10-9 M para agregados de alfa-sinucleína, especificamente fibrilas amiloides, protofibrilas e oligômeros, particularmente fibrilas amiloides, conforme medido pela análise do Octet ou Análise de SPR, mas não se limitando a isso.
[026] Os anticorpos de alfa-sinucleína humanizados, incluindo cadeia leve e cadeia pesada de acordo com uma modalidade da presente invenção, por exemplo, Hu11F11_ (ver.1), Hu11F11 (ver.2) e Hu11F11_ABL2-4, exibem uma alta atividade para promover absorção de fagócitos em comparação com os anticorpos quiméricos de alfa-sinucleína. Comparado ao anticorpo quimérico alfa-sinucleína, Hu11F11 (ver.1), Hu11F11 (ver.2), Hu11F11 (ver.3), Hu11F11 (ver.4) e ABL2-4 mostram alta atividade de inibição da ligação de fibrila à membrana das células nervosas em comparação com o anticorpo quimérico alfa-sinucleína. Hu11F11 (ver.2), Hu11F11 (ver.4) e ABL2-4 têm alta atividade de inibir a propagação de alfa- sinucleína secretada pelas células que superexpressam a alfa-sinucleína a outras células nervosas em comparação com o anticorpo quimérico de alfa-sinucleína e mostram a afinidade de ligação ao agregado de alfa-sinucleína, por exemplo, que possui uma atividade semelhante ou superior ao anticorpo quimérico de alfa-sinucleína em um ensaio baseado em células.
[027] O anticorpo alfa-sinucleína de acordo com a presente invenção pode inibir a função dos agregados de alfa- sinucleína secretados para fora das células nervosas no sistema nervoso de um indivíduo para transferir para outras células normais em um espaço extracelular e infectar as células nervosas (inibir a célula transmissão de agregados às células) e têm uma capacidade de promover a ação fagocítica da microglia aos agregados de alfa-sinucleína no espaço extracelular. Os agregados de alfa-sinucleína se propagam de uma célula para outra célula como príons, e a alfa-sinucleína, especialmente os agregados de alfa- sinucleína, se espalham pelo cérebro, resultando em sinucleinopatias nas células normais. Portanto, os agregados de alfa-sinucleína são tóxicos para os neurônios cerebrais e são conhecidos por causar morte de neurônios cerebrais (neurodegeneração) e neuroinflamação. Por conseguinte, à medida que os agregados de alfa-sinucleína se espalham para várias partes do cérebro, a morte das células cerebrais e as reações de neuroinflamação aumentam e resultam na ocorrência da morte das células cerebrais e no comportamento e comprometimentos cognitivos resultantes encontrados com a progressão das sinucleinopatias, como a doença de Parkinson.
[028] Por conseguinte, o anticorpo alfa-sinucleína da presente invenção pode impedir o fenômeno de disseminação de agregados de alfa-sinucleína a várias regiões do cérebro, inibindo a transmissão de alfa-sinucleínas ou de agregados de alfa-sinucleína entre as células nervosas, e reduzir o nível dos agregados de alfa-sinucleína, que é uma importante causa de sinucleinopatias, reduzindo ou eliminando os próprios agregados de alfa-sinucleína na região extracelular das células nervosas do sistema nervoso indivíduo, com a promoção da fagocitose de microglia, resultando na redução da morte de célula nervosa cerebral e da reação neuroinflamatória e, adicionalmente, espera-se que melhorem, aliviem ou previnam os sintomas e o progresso de sinucleinopatias como a doença de Parkinson.
[029] Além disso, o anticorpo alfa-sinucleína de acordo com a presente invenção possui excelentes atividades de executar ambas as duas funções de (i) inibição da transmissão da alfa-sinucleína ou alfa-sinucleína agregada entre as células nervosas (ver o resultado do teste em célula aqui divulgado) e (ii) redução do nível de agregados de alfa- sinucleína no sistema nervoso cerebral através da fagocitose promovida de células microgliais. Em particular, como os anticorpos alfa-sinucleína que estão atualmente em ensaios clínicos ou publicados no artigo científico têm uma das duas atividades (i) e (ii), isso sugere que o anticorpo alfa- sinucleína da presente invenção possui um vantagem na prevenção ou tratamento superior de sinucleinopatias aos anticorpos alfa-sinucleína conhecidos. Portanto, o anticorpo alfa-sinucleína de acordo com a presente invenção tem eficácias mais excelentes de redução e eliminação de agregados de alfa-sinucleína e inibição da ação dos agregados de alfa-sinucleína como etiologia e, portanto, é mais eficaz para sinucleinopatias ou uma doença sintomática relacionada (por exemplo, distúrbio cognitivo).
[030] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, tendo uma alta afinidade para os agregados de alfa-sinucleína, podem reduzir a formação de agregado de alfa-sinucleína, diminuindo assim a concentração de agregados no cérebro.
Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, com alta afinidade pelos agregados de alfa-sinucleína, pode reduzir a formação de agregados de alfa-sinucleína fora do sistema nervoso central e, finalmente, alterar o estado de equilíbrio entre as formas de alfa-sinucleína delimitadas por BBB, trazendo o efeito de diminuir a concentração de agregados de alfa-sinucleína no interior do sistema nervoso central.
[031] Isto tem uma grande vantagem na prática clínica, porque a eficácia pode ser suficientemente obtida mesmo através da administração de uma via mais conveniente, por exemplo injeção subcutânea, mas não limitada a ela. Além disso, como os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, tendo alta afinidade pelos agregados de alfa-sinucleína, podem inibir e/ou reduzir a formação, o acúmulo e/ou a transmissão intercelular de agregados de alfa-sinucleína, podem reduzir a concentração de agregados de alfa-sinucleína no cérebro.
Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, com alta afinidade para os agregados de alfa-sinucleína, pode reduzir a formação de agregados de alfa-sinucleína fora do sistema nervoso central e, assim, alterar o estado de equilíbrio entre as formas de alfa-sinucleína delimitadas por BBB. Pode trazer o efeito de diminuir a concentração de agregados de alfa-sinucleína no interior do sistema nervoso central. Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente aplicação, pode inibir a formação de agregados removendo monômeros ou eliminando ambos monômeros e agregados, mas não se limitando a esta teoria.
[032] Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção que se ligam especificamente a proteínas alfa-sinucleína ou agregados de alfa-sinucleína podem não ser produtos de ocorrência natural (podem ser produtos de ocorrência não natural, por exemplo, por síntese química ou método recombinante). As técnicas de recombinação são bem conhecidas na técnica.
[033] Aqui, "anticorpo" significa uma imunoglobulina completa em qualquer isotipo, ou um fragmento de ligação a antígeno que pode competir com um anticorpo completo pela ligação a um antígeno alvo. Por exemplo, inclui anticorpos quiméricos, humanizados, humanos completos ou de dupla especificidade ou seus fragmentos de ligação a antígeno. O anticorpo é um tipo de proteínas de ligação ao antígeno por si só. Geralmente, o anticorpo completo compreende pelo menos 2 cadeias pesadas de comprimento total e 2 cadeias leves de comprimento total, mas em alguns casos, o anticorpo pode compreender apenas cadeias pesadas.
[034] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de apenas uma fonte ou ser anticorpo quimérico. O anticorpo quimérico compreende uma parte derivada de dois tipos de anticorpos diferentes e é descrito em mais detalhes abaixo. O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser produzido por hibridoma, técnica de DNA recombinante ou corte enzimático ou químico de um anticorpo intacto. Salvo indicação em contrário aqui, o termo anticorpo inclui anticorpos compreendendo 2 cadeias pesadas de comprimento total e 2 cadeias leves de comprimento total, e seus derivados, variantes, fragmentos e mutantes, e seus exemplos são como descritos abaixo.
[035] Em uma modalidade, o anticorpo inclui um anticorpo monoclonal, anticorpo biespecífico, minicorpo, anticorpo de domínio, anticorpo mimético (ou anticorpo sintético), anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo humano, fusão de anticorpos (ou conjugado de anticorpo) e seus fragmentos, e vários tipos de anticorpos aqui divulgados, sem limitação ao mesmos. Em uma modalidade, os fragmentos dos anticorpos aqui divulgados podem ser fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos de cadeia única (scFv), diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia única de uma cadeia única preparada por ligação de uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve através de espaçador.
[036] Aqui, "cadeia leve" inclui uma cadeia leve completa e seus fragmentos tendo uma sequência de região variável para fornecer suficientemente especificidade de ligação a um antígeno ou epítopo. A cadeia leve de comprimento total compreende um domínio de região variável VL e um domínio de região constante CL. O domínio da região variável da cadeia leve está presente no terminal N de um polipeptídeo da cadeia leve. Os tipos de cadeia leve incluem cadeias kappa e lambda.
[037] Aqui, "cadeia pesada" inclui uma cadeia pesada de comprimento completo e seus fragmentos tendo uma sequência de região variável para fornecer suficientemente especificidade de ligação a um antígeno ou epítopo. A cadeia pesada de comprimento total compreende um domínio de região variável VH e três (3) domínios de região constante de CH1, CH2 e CH3. O domínio VH está presente no terminal N de um polipeptídeo de cadeia pesada e o domínio CH está presente no terminal carboxi, e o CH3 está posicionado mais próximo ao terminal C. A cadeia pesada inclui IgG (incluindo os subtipos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo os subtipos IgA1 e IgA2) e isotipos de IgM e IgE.
[038] Aqui, "fragmentos de ligação ao antígeno" significa uma parte do anticorpo com afinidade de ligação específica a um antígeno ou um polipeptídeo incluindo a parte. Por exemplo, o fragmento de ligação ao antígeno pode ser uma parte do anticorpo, incluindo um resíduo de aminoácido que confere especificidade e/ou afinidade pelo antígeno ao anticorpo, interagindo com um antígeno (por exemplo, um epítopo) ou um polipeptídeo incluindo a parte.
Este fragmento de ligação ao antígeno compreende tipicamente uma ou mais "regiões determinantes complementares (CDR)" e mais uma ou mais regiões de "estrutura (FR)". As CDRs são sequências de aminoácidos que contribuem para a especificidade e afinidade do anticorpo para a ligação ao antígeno, e as regiões estruturais são as sequências de aminoácidos que contribuem para a manutenção de uma conformação apropriada dessas CDRs e promovem a ligação entre a região de ligação ao antígeno e um antígeno.
[039] Como usado aqui, "fragmento de ligação ao antígeno" de uma cadeia (cadeia pesada ou cadeia leve) de um anticorpo ou imunoglobulina inclui uma parte de um anticorpo que carece de alguns aminoácidos em comparação com uma cadeia completa, mas pode se ligar especificamente a um antígeno.
Este fragmento pode ser considerado como tendo atividade biológica, em um aspecto que pode se ligar especificamente a um antígeno alvo ou pode competir com outros anticorpos ou um fragmento de ligação a antígeno para ligar um epítopo específico. Em um aspecto, este fragmento compreende pelo menos uma CDR presente em uma cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento total e, em algumas modalidades, compreende uma única cadeia de cadeia pesada e/ou cadeia leve, ou sua parte. Este fragmento biologicamente ativo pode ser produzido por uma técnica de DNA recombinante ou pode ser produzido, por exemplo, cortando um anticorpo intacto enzimaticamente ou quimicamente. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional inclui Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpo de domínio e anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv, scFv-Fc etc.), mas não se limitando a eles, e pode ser derivado de qualquer mamífero incluindo humano, camundongo, rato, camelídeo ou coelho, mas não limitado a eles. A parte funcional do anticorpo, como uma ou mais CDRs descritas aqui, pode ser ligada a uma proteína secundária ou pequeno composto molecular por uma ligação covalente e ser usada como agente terapêutico alvo em um alvo específico.
[040] Aqui, "fragmento Fab" consiste em uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável e apenas CH1. A cadeia pesada da molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra cadeia pesada.
[041] Aqui, a região "Fc" compreende dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Esses 2 fragmentos de cadeia pesada são combinados entre si por duas ou mais ligações dissulfeto e interação hidrofóbica do domínio CH3.
[042] Aqui, o "fragmento Fab'" compreende adicionalmente uma região entre os domínios CH1 e CH2 de uma cadeia pesada, além do fragmento Fab, e pode ser formado pela ligação dissulfeto entre duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab'.
[043] Aqui, "fragmento F(ab')2" compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas compreendendo uma região variável, CH1 e uma parte de uma região constante entre os domínios CH1 e CH2, conforme mencionado acima, e uma ligação dissulfeto inter-cadeia é formada entre 2 correntes pesadas.
Assim, o fragmento F(ab')2 consiste em dois fragmentos Fab' e os dois fragmentos Fab' são combinados entre si pela ligação dissulfeto formada entre eles.
[044] Aqui, "região Fv" é um fragmento de um anticorpo que compreende cada região variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, mas não compreende uma região constante.
[045] Aqui, "anticorpo de cadeia única" é uma cadeia polipeptídica única da região de ligação ao antígeno formada pela conexão da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve via ligante flexível. Por exemplo, o anticorpo de cadeia única pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um scFv no qual a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve estão ligadas em uma forma de cadeia única, um scFv-Fc no qual a cadeia pesada região variável, uma região variável de cadeia leve e Fc estão ligados em uma forma de cadeia única e similares. O anticorpo de cadeia única pode referir-se, por exemplo, à patente U.S. No. 5.260.203.
[046] Aqui, "proteína bivalente de ligação ao antígeno" ou "anticorpo bivalente" compreende dois locais de ligação ao antígeno. Dois locais de ligação ao antígeno compreendidos neste anticorpo bivalente podem ter a mesma especificidade do antígeno ou podem ser um anticorpo de dupla especificidade que se liga a diferentes antígenos, respectivamente. Aqui, "proteína multi-específica de ligação a antígeno" ou "anticorpo multi-específico" tem como alvo dois ou mais antígenos ou epítopos.
[047] Aqui, a proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno "biespecífico" ou "duplo-específico" é uma proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno híbrido que possui dois locais diferentes de ligação ao antígeno. Um tal anticorpo biespecífico é um tipo de proteína de ligação a antígeno multi-específica ou anticorpo multi-específico e pode ser produzido por vários métodos conhecidos, como fusão de hibridomas ou fusão de fragmentos Fab'.
[048] Aqui, a proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno "biespecífico", "duplo-específico" é uma proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno híbrido com 2 locais diferentes de ligação ao antígeno. Este anticorpo biespecífico é um tipo de proteína de ligação a antígeno multi-específica ou anticorpo multi-específico e pode ser produzido por vários métodos conhecidos, por exemplo, métodos como fusão de hibridoma ou ligação do fragmento Fab'.
Por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clin. Exp. Immunol.
1990, 79: 315-321; Kostelny et al., J. Immunol. 1992, 148: 1547-1553 e similares podem ser referidos. Os dois epítopos sendo diferentes entre si, aos quais dois locais de ligação ao antígeno da proteína de ligação ao antígeno biespecífico ou ligação ao anticorpo podem ser posicionados na mesma ou em outra proteína alvo. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção pode estar na forma de um anticorpo biespecífico que compreende adicionalmente a ligação a um transportador de entrega para entregar o anticorpo através da barreira hematoencefálica. Um método para administrar drogas através da barreira hematoencefálica inclui o uso de sistemas de administração, como a transititose mediada por receptor, como transportador de glicose, transportador de aminoácidos, receptor de insulina ou receptor de transferrina em uma célula.
[049] Aqui, "conjugado" significa uma molécula quimérica do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno divulgado aqui com outra molécula, particularmente transportes de barreira hematoencefálica no sangue ou um agente terapêutico descrito abaixo. No conjugado, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é ligado a outras moléculas por uma ligação covalente ou força física, como VAN DEER WAALS ou interação hidrofóbica, capsulação, incorporação ou método de combinação dos mesmos. No conjugado de uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser conectado por um ligante peptídico.
[050] A presente invenção também inclui uma ou mais sequências de aminoácidos possuindo identidade substancial com uma ou mais sequências de aminoácidos aqui divulgadas.
A identidade substancial da sequência significa que a sequência com a variação mantém os efeitos divulgados na presente invenção. Em uma modalidade, a sequência tem cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a região variável da cadeia pesada divulgada. Em uma modalidade, a sequência tem cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a região variável da cadeia leve divulgada.
Por exemplo, no caso de uma variante que mostra 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a sequência do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno divulgada na presente invenção, qualquer variação de sequência ocorre na estrutura da região variável ao invés do CDR.
[051] Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à alfa-sinucleína ou um agregado dos mesmos de acordo com a presente invenção incluem uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes da complementaridade de CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade de CDRL1, CDRL2 e CDRL3.
[052] Em uma modalidade, o anticorpo anti-alfa- sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir as seguintes sequências de CDR: uma CDR1 de cadeia pesada (H-CDR1) selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6 uma CDR2 de cadeia pesada (H-CDR2) selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 a 4 e SEQ ID NOs: 7 a 8, uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 9, uma CDR1 de cadeia leve (L-CDR1) selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:
15.
[053] As sequências de aminoácidos da cadeia pesada CDR1 a CDR3 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve CDR1 a CDR3 estão resumidas nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1: Sequências de aminoácidos de cadeia pesada CDR1 a CDR3 Sequência de Sequência de Sequência de ID do SEQ SEQ SEQ aminoácidos aminoácidos aminoácidos Clone ID NO ID NO ID NO VH_CDR1 VH_CDR2 VH_CDR3 ch11F11 ASRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 2 5 DAHGKPFAY -VH YSASVKG Hu11F11 AIRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 3 5 DAHGKPFAY -VH1 YAASVKG Hu11F11 AIRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 3 5 DAHGKPFAY -VH2 YAASVKG Hu11F11 AIRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 3 5 DAHGKPFAY -VH3 YADSVKG Hu11F11 AIRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 3 5 DAHGKPFAY -VH4 YADSVKG Hu11F11 ATRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 4 5 DAHGKPFAY -VHv3 YSASVKG Hu11F11 - ATRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 4 5 DAHGKPFAY VHv1mu1 YSASVKG newmu Hu11F11
ATRNKANDYTTE -VHv3 1 GFTFSDFYME 4 5 DAHGKPFAY
YSASVKG newmu Hu11F11 ASRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 2 5 DAHGKPFAY -VH-v1 YSASVKG Hu11F11 ASRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 2 5 DAHGKPFAY -VH-v2 YSASVKG Hu11F11 ASRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 2 5 DAHGKPFAY -VH-v3 YSASVKG Hu11F11 ASRNKANDYTTE 1 GFTFSDFYME 2 5 DAHGKPFAY -VH-v4 YSASVKG ch3A9- TISNGGGYTYYP HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 7 9
VH DSVKG Y Hu3A9- TISNGGGYTYYP HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 7 9 VH1 DSVKG Y Hu3A9- TISNGGGYTYYA HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 8 9 VH2 DSVKG Y Hu3A9- TISNGGGYTYYP HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 7 9 VH3 DSVKG Y
Hu3A9- TISNGGGYTYYA HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 8 9 VH4 DSVKG Y Hu3A9- TISNGGGYTYYP HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 7 9 VH-v1 DSVKG Y Hu3A9- TISNGGGYTYYP HITTVRPTKYFD 6 GFTFSSYAMS 7 9 VH-v2 DSVKG Y Tabela 2: Sequências de aminoácidos de cadeia leve CDR1 a CDR3 Sequência de Sequência de SEQ Sequência de ID do SEQ SEQ aminoácidos aminoácidos ID aminoácidos Clone ID NO ID NO VL_CDR1 VL_CDR1 NO VL_CDR1 ch11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT
VL Hu11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT VL1 Hu11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT VL2 Hu11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT VL3 Hu11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT VL4 Hu11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT VL5 Hu11F11- 10 KSSQSLLYSSNQKNYLA 11 WASTRES 12 QQYYSYPWT VLv3 4c ch3A9-VL 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL1 Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL2 Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL3 Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL4 Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL-v1 Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL-v2 Hu3A9- 13 KASQNVGTTVA 14 SASNRYT 15 QQYSNYPLT VL-v2
[054] Em uma modalidade, o anticorpo anti-alfa- sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir uma região variável da cadeia pesada incluindo uma
CDR1 da cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, CDR2 da cadeia pesada (H- CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 a 4 e uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia pesada incluindo uma CDR1 de cadeia leve (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
[055] Além disso, em uma modalidade, o anticorpo anti- alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir uma região variável da cadeia pesada incluindo uma CDR1 da cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, cadeia pesada CDR2 (H-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 a 8 e uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e uma região variável da cadeia pesada incluindo uma CDR1 de cadeia leve (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
[056] Em outra modalidade, o anticorpo anti-alfa- sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir uma estrutura de cadeia pesada (H-FR1) localizada no terminal N do H-CDR1 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 a 17 e SEQ ID NOs: 35 a 40, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) localizada entre H-CDR1 e H-CDR2 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 18 a 19 e SEQ ID NOs: 41 a 44, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) localizada entre H-CDR2 e H-CDR3 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 20 a 31 e SEQ ID NOs: 45 a 50, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) sendo localizada no terminal C do H-CDR3 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 32 a 34 e SEQ ID NOs: 51 a 52, uma estrutura de cadeia leve (L-FR1) localizada no terminal N do L-CDR1 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 53 a 58 e SEQ ID NOs: 71 a 77,
uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) localizada entre L-CDR1 e L-CDR2 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 59 a 61 e SEQ ID NOs: 78 a 81, uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) localizada entre L-CDR2 e L-CDR3 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 62 a 67 e SEQ ID NOs: 82 a 88 e/ou uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) localizada no terminal C de L-CDR3 compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 68 a 70 e SEQ ID NO: 89.
[057] Como as sequências de aminoácidos são úteis como estruturas neste documento, as sequências de estrutura de cadeia pesada são exemplificadas nas Tabelas 3 e 4, e as sequências de estruturas de cadeia leve são exemplificadas nas Tabelas 5 e 6.
Tabela 3: Sequências de aminoácidos de estruturas de cadeia pesada 1 a 2 ID do SEQ ID SEQ ID Sequência VH- Sequência VH-FR1 Clone NO NO FR2 ch11F11- EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSC 16 18 WVRQPPGKRLEWIA
VH ATS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 19 WVRQAPGKGLEWIA VH1 AAS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 19 WVRQAPGKGLEWIA VH2 AAS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 19 WVRQAPGKGLEWIA VH3 AAS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 19 WVRQAPGKGLEWVA VH4 AAS
Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 18 WVRQPPGKRLEWIA VHv3 ATS Hu11F11-
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC VHv1mu1 17 18 WVRQPPGKRLEWIA
ATS newmu Hu11F11-
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC VHv3 17 18 WVRQPPGKRLEWIA
ATS newmu Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 18 WVRQPPGKRLEWIA VH-v1 ATS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 18 WVRQPPGKRLEWIA VH-v2 ATS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 18 WVRQPPGKRLEWIA VH-v3 ATS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC 17 18 WVRQPPGKRLEWIA VH-v4 ATS
EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSC ch3A9-VH 35 41 WVRQTPEKRLEWVA
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC Hu3A9-VH1 36 42 WVRQAPGKGLEWVA
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSC Hu3A9-VH2 37 43 WVRQAPDKGLEWVA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC Hu3A9-VH3 38 42 WVRQAPGKGLEWVA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC Hu3A9-VH4 38 42 WVRQAPGKGLEWVA
AAS Hu3A9-VH- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC 39 44 WVRQTPEKGLEWVA v1 AAS Hu3A9-VH- EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSC 40 44 WVRQTPEKGLEWVA v2 AAS Tabela 4: Sequências de aminoácidos de estruturas de cadeia pesada 3 a 4 SEQ ID SEQ ID Sequência VH- clone Sequência VH-FR3 NO NO FR4 ch11F1 RFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAI 20 32 WGQGTLVTVSA 1-VH YYCAR Hu11F1 RFTVSRDTSKNSLYLQMNSLKTEDTAV 21 33 WGQGTLVTVSS 1-VH1 YYCAR Hu11F1 RFTISRDTSKNSLYLQMNSLKTEDTAV 22 33 WGQGTLVTVSS 1-VH2 YYCAR Hu11F1 RFTVSRDTSQNTLYLQMNSLRAEDTAV 23 33 WGQGTLVTVSS 1-VH3 YYCAR Hu11F1 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV 24 33 WGQGTLVTVSS 1-VH4 YYCSR Hu11F1 RFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAI 25 34 WGQGTTVTVSS 1-VHv3 YYCAR Hu11F1 1-
RFTISRDTSQSSLYLQMNSLKTEDTAV VHv1mu 26 34 WGQGTTVTVSS
YYCAR 1 newmu
Hu11F1
RFTISRDTSQSSLYLQMNSLRAEDTAI 1-VHv3 27 34 WGQGTTVTVSS
YYCAR newmu Hu11F1
RFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAI 1-VH- 28 34 WGQGTTVTVSS
YYCAR v1 Hu11F1
RFTVSRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAI 1-VH- 29 34 WGQGTTVTVSS
YYCAR v2 Hu11F1
RFTISRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAI 1-VH- 30 34 WGQGTTVTVSS
YYCAR v3 Hu11F1
RFTVSRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAI 1-VH- 31 34 WGQGTTVTVSS
YYCAR v4 ch3A9- RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAM 45 51 WGQGTTLTVSS
VH YYCAR Hu3A9- RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDSAM 46 52 WGQGTLVTVSS VH1 YYCAR Hu3A9- RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKAEDSAV 47 52 WGQGTLVTVSS VH2 YYCAR Hu3A9- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV 48 52 WGQGTLVTVSS VH3 YYCAR Hu3A9- RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV 49 52 WGQGTLVTVSS VH4 YYCAR Hu3A9- RFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAM 50 51 WGQGTTLTVSS VH-v1 YYCAR Hu3A9- RFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAM 50 51 WGQGTTLTVSS VH-v2 YYCAR Tabela 5: Sequências de aminoácidos das estruturas de cadeia leve 1 a 2
SEQ SEQ clone Sequência VH-FR1 Sequência VH-FR2
ID NO ID NO ch11F11- 53 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSC 59 WYQQKPGQSPKLLIY
VL Hu11F11- 54 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC 60 WYQQKPGQPPKLLIY VL1 Hu11F11- 55 DIVMTQSPSSLAVSLGERVTITC 60 WYQQKPGQPPKLLIY VL2 Hu11F11- 56 DIVMTQSPSSLAVSLGERATINC 60 WYQQKPGQPPKLLIY VL3 Hu11F11- 57 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 61 WYQQKPGKAPKLLIY VL4 Hu11F11- 53 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSC 60 WYQQKPGQPPKLLIY VL5 Hu11F11- 58 DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSC 59 WYQQKPGQSPKLLIY VLv3 4c ch3A9-VL 71 DIVMTQSPKFMSTSVGDRVSITC 78 WYQQKPGQSPKLLIY Hu3A9- 72 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 79 WYQQKPGKAPKLLIY VL1 Hu3A9- 73 DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITC 80 AWYQQKPGKAPKLLIY VL2
Hu3A9- 74 DIVMTQSPATLSVSLGERATLSC 81 WYQQKPGQAPRLLIY VL3 Hu3A9- 75 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 79 WYQQKPGKAPKLLIY VL4 Hu3A9- 76 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 78 WYQQKPGQSPKLLIY VL-v1 Hu3A9- 77 DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITC 78 WYQQKPGQSPKLLIY VL-v2 Hu3A9- 77 DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITC 78 WYQQKPGQSPKLLIY VL-v2 Tabela 6: Sequências de aminoácidos das estruturas de cadeia leve 3 a 4 SEQ ID SEQ ID Sequência VH- clone Sequência VH-FR3 NO NO FR4 ch11F1 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDL 62 68 FGGGTKLEIK 1-VL AVYYC Hu11F1 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV 63 69 FGGGTKVEIK 1-VL1 AVYYC Hu11F1 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDV 64 68 FGGGTKLEIK 1-VL2 AVYYC Hu11F1 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV 63 68 FGGGTKLEIK 1-VL3 AVYYC Hu11F1 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF 65 70 FGQGTKVEIK 1-VL4 ATYYC Hu11F1 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDL 66 68 FGGGTKLEIK 1-VL5 AVYYC Hu11F1
GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDV 1-VLv3 67 68 FGGGTKLEIK
AVYYC 4c ch3A9- GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDL 82 89 FGAGTKLELR
VL ADYFC Hu3A9- GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF 83 89 FGAGTKLELR VL1 ATYYC Hu3A9- GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDF 84 89 FGAGTKLELR VL2 ASYYC Hu3A9- GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDF 85 89 FGAGTKLELR VL3 AVYYC Hu3A9- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF 86 89 FGAGTKLELR VL4 ATYYC Hu3A9- GVPDRFSGSGSGTDFTFTISSMQSEDI 87 89 FGAGTKLELR VL-v1 ATYFC Hu3A9- GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQSEDL 88 89 FGAGTKLELR VL-v2 ADYYC Hu3A9- GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQSEDL 88 89 FGAGTKLELR VL-v2 ADYYC
[058] Em outra modalidade, o anticorpo anti-alfa- sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo um aminoácido selecionado das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6, uma
CDR2 de cadeia pesada (H-CDR2) compreendendo um aminoácido selecionado de SEQ ID NOs: 2 a 4 e SEQ ID NOs: 7 a 8 e uma
CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo um aminoácido selecionado de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 9,
em que a região variável da cadeia pesada compreende ainda uma estrutura de cadeia pesada (H-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 a 17 e SEQ ID NOs: 35 a 40, uma estrutura de cadeia pesada
(H-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 18 a 19 e SEQ ID NOs: 41 a 44,
uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 20 a 31 e SEQ ID NOs : 45 a 50, e uma estrutura de cadeia pesada (H-
FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 32 a 34 e SEQ ID NOs: 51 a 52. Mais especificamente, a região variável da cadeia pesada compreende uma cadeia pesada estrutura (H-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, uma estrutura de cadeia pesada
(H-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 29 a 31 e uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[059] Além disso, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 da cadeia leve (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 15, em que a região variável da cadeia leve compreende ainda uma estrutura de cadeia leve (L-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 53 a 58 e SEQ ID NOs: 71 a 77, uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 59 a 61 e SEQ ID NOs: 78 a 81, uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 62 a 67 e SEQ ID NOs: 82 a 88 e uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 68 a 70 e SEQ ID NO: 89. Mais especificamente, a região variável da cadeia leve compreende uma estrutura de cadeia leve (L- FR1) compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e uma estrutura de cadeia leve trabalho (L-FR4) compreendendo um fragmento de polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[060] No entanto, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção não inclui um anticorpo de rato ou um anticorpo quimérico, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, incluindo o anticorpo que consiste na cadeia pesada CDR1-CDR3 que consiste no aminoácido sequências de SEQ ID NOs: 1, 2 e 5, CDR1-CDR3 de cadeia leve consistindo em SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, estruturas de cadeia pesada 1 a 4 que consistem em sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16, 18, 20 e 32, e estruturas de cadeia leve 1 a 4 que consistem em sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, 59, 62 e 68. Além disso, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção não incluem um anticorpo de camundongo ou um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno, incluindo o anticorpo que consiste na cadeia pesada CDR1-CDR3 que consiste em sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 7 e 9, CDR1-CDR3 da cadeia leve que consiste em SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, estruturas de cadeia pesada 1 a 4 c envolvimento de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 35, 41, 45 e 51 e estruturas de cadeia leve 1 a 4 consistindo em sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, 78, 82 e 89. Como um exemplo específico, o anti o anticorpo alfa-sinucleína da presente invenção não inclui um anticorpo que consiste na região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 90 (ch11F11-VH) e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 109 (ch11F11-VL), ou anticorpo Ch3A9 que consiste na região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 102 (ch11F11-VH) e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 116 (ch11F11-VL).
[061] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com uma modalidade da presente invenção, pode compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da cadeia pesada (H -CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 2 a 4 e uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma cadeia leve CDR1 (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo um sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma estrutura de cadeia pesada (H-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 a 17, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 18 a 19, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 20 a 31 e uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs : 32 a 34, e em que uma região variável da cadeia leve compreende uma estrutura de cadeia leve (L-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 53 a 58, uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 59 a 61, uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 62 a 67 e uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 68 a 70.
[062] De preferência, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com uma modalidade da presente invenção compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma cadeia pesada CDR1 a CDR3 compreendendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1, 2 e 5 e uma variável da cadeia leve região compreendendo uma CDR1 de cadeia leve a CDR3 compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, nas quais a região variável da cadeia pesada compreende uma estrutura de cadeia pesada1 (H- FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 29 a 31 e uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e a região variável de cadeia leve compreende uma estrutura de cadeia leve1 (L-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34,
[063] O anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com uma modalidade da presente invenção, compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6,
uma CDR2 de cadeia pesada (H-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 7 a 8 e uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. e uma luz região variável de cadeia compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (L-
CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 13, CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15,
em que a região variável da cadeia pesada compreende,
uma estrutura de cadeia pesada1 (H-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 35 a 40,
uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 41 a 44,
uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 45 a 50 e uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 51 a 53 e em que a região variável da cadeia leve compreende uma estrutura de cadeia leve1 (L-FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 71 a 77,
uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 78 a 81,
uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 82 a 88 e uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89.
[064] Nas formas de comprimento total de cadeia leve e cadeia pesada, a região variável e a região constante são unidas por uma região "J" em cerca de 12 ou mais comprimentos de aminoácidos, e a cadeia pesada também inclui uma região "D" em cerca de 10 ou mais comprimento de aminoácido. Por exemplo, Fundamental Immunology, 2ª ed., Cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nova York: Raven Press pode ser consultado.
Tipicamente, as regiões variáveis do par de cadeia leve e cadeia pesada no anticorpo podem formar uma região de ligação ao antígeno.
[065] A região variável da cadeia de imunoglobulina possui tipicamente a mesma estrutura inteira e compreende a região estrutural relativamente conservada (FR) conectada por três regiões hipervariáveis denominadas "região ou domínio determinante de complementaridade" ou CDR. As CDRs das regiões variáveis de cada cadeia que constituem o par cadeia pesada/cadeia leve são tipicamente alinhadas pelas regiões estruturais, de modo a formar uma estrutura que se liga especificamente a um epítopo específico da proteína alvo (alfa-sinucleína). Esses elementos da região variável da cadeia leve natural e da região variável da cadeia pesada são tipicamente incluídos na seguinte ordem, do terminal N ao terminal C: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A posição da sequência de aminoácidos correspondente a cada um desses elementos na região variável é designada de acordo com o Sistema de Numeração Kabat (Sequências Kabat de Proteínas de Interesse Imunológico), de acordo com a divulgação de 1987 e 1991, NIH, Bethesda, MD)), ou Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883.
[066] Várias regiões variáveis da cadeia pesada e regiões variáveis da cadeia leve aqui divulgadas são mostradas nas Tabelas 7 e 8. Cada uma dessas regiões variáveis pode ser acoplada à região constante da cadeia pesada e à região constante da cadeia leve para formar cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos intactos. Além disso, a sequência da cadeia pesada e a sequência da cadeia leve obtidas também podem ser combinadas para formar uma estrutura completa de anticorpos. Por exemplo, o anticorpo anti-alfa- sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, pode incluir uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 90 a 101 ou SEQ ID NOs: 102 a 108, e uma região variável de cadeia leve contendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109 a 115 ou SEQ ID NOs: 116 a 123 e, mais especificamente, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 90 a 101 e uma região variável de cadeia leve compreendendo g uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109 a 115, ou uma região variável de cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 102 a 108 e uma cadeia leve região variável compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 116 a 123.
[067] Em uma modalidade específica da presente invenção, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode incluir uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 98 a 101 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 (por exemplo, Hu11F11_ (ver.1), Hu11F11_ (ver.2), Hu11F11_ (ver.3), Hu11F11_ (ver.4) e etc.) ou pode incluir uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113 (por exemplo, anticorpo Hu11F11_ (ABL2-4)).
[068] No entanto, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno não inclui o anticorpo que consiste em uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 90 e em uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 109 e o anticorpo consiste em um região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 102 e região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 116.
[069] As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com uma modalidade são exemplificadas nas Tabelas 7 e 8.
Tabela 7: Região variável da cadeia pesada clone SEQ Sequência de aminoácidos
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAS ch11F11-VH 90 RNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARDA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAAI Hu11F11-VH1 91 RNKANDYTTEYAASVKGRFTVSRDTSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAAI Hu11F11-VH2 92 RNKANDYTTEYAASVKGRFTISRDTSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAAI Hu11F11-VH3 93 RNKANDYTTEYADSVKGRFTVSRDTSQNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWVAAI Hu11F11-VH4 94 RNKANDYTTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRDA
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAT Hu11F11- 95 RNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDA VHv3
HGKPFAYWGQGTTVTVSS Hu11F11- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAT VHv1mu1 96 RNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSQSSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDA newmu HGKPFAYWGQGTTVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAT Hu11F11- 97 RNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSQSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDA VHv3 newmu
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAS Hu11F11-VH- 98 RNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDA v1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAS Hu11F11-VH- 99 RNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDA v2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAS Hu11F11-VH- 100 RNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDA v3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAAS Hu11F11-VH- 101 RNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDA v4
EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATI ch3A9-VH 102 SNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHITT
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATI Hu3A9-VH1 103 SNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDSAMYYCARHITT
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPDKGLEWVATI Hu3A9-VH2 104 SNGGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKAEDSAVYYCARHITT
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATI Hu3A9-VH3 105 SNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHITT
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATI Hu3A9-VH4 106 SNGGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARHITT
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKGLEWVATI Hu3A9-VH-v1 107 SNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHITT
EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKGLEWVATI Hu3A9-VH-v2 108 SNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAMYYCARHITT
EVQLQESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARI ch9B11-VH 124 RSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRQD
FDYWGQGTTLTVSS Tabela 8: Região variável da cadeia leve clone SEQ Sequência de aminoácidos
DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPK ch11F11- 109 LLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPW
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK Hu11F11- 110 LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPW VL1
DIVMTQSPSSLAVSLGERVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK Hu11F11- 111 LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPW VL2
DIVMTQSPSSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK Hu11F11- 112 LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPW VL3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPK Hu11F11- 113 LLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPW VL4
DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK Hu11F11- 114 LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYPW VL5
DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPK Hu11F11- 115 LLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDVAVYYCQQYYSYPW VLv3 4c
DIVMTQSPKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQSPKLLIYSA ch3A9-VL 116 SNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSNYPLTFGAGT
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGKAPKLLIYSA Hu3A9-VL1 117 SNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSNYPLTFGGGT
DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGKAPKLLIYSA Hu3A9-VL2 118 SNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFASYYCQQYSNYPLTFGQGT
DIVMTQSPATLSVSLGERATLSCKASQNVGTTVAWYQQKPGQAPRLLIYSA Hu3A9-VL3 119 SNRYTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSNYPLTFGGGT
KVEIK DIQMTQSPSSLSAㄴSVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGKAPKLLIY Hu3A9-VL4 120 SASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSNYPLTFGQ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQSPKLLIYSA Hu3A9-VL- 121 SNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSMQSEDIATYFCQQYSNYPLTFGQGT v1
DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQSPKLLIYSA Hu3A9-VL- 122 SNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQSEDIADYYCQQYSNYPLTFGQGT v2
DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQSPKLLIYSA Hu3A9-VL- 123 SNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQSEDLADYYCQQYSNYPLTFGQGT v2
DIVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKL ch9B11-VL 125 LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLT
[070] Além disso, os anticorpos exemplificados que compreendem uma combinação de uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve e uma região constante de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com uma modalidade são descritos na Tabela 9.
Tabela 9 Nome da Cadeia Sequência de aminoácidos amostra hu11F11 pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNK (ver.1) (SEQ ID ANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFA NO: YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN 127) SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK
EALHNHYTQKSLSLSPGK leve DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLI (SEQ ID YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGT NO: 128 KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
RGEC hu11F11 pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNK (ver.2) (SEQ ID ANDYTTEYSASVKGRFTVSRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFA NO: 129 YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
EALHNHYTQKSLSLSPGK leve DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLI (SEQ ID YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGT NO: 130 KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
RGEC hu11F11 pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNK (ver.3) (SEQ ID ANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFA NO: YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN 131) SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK
EALHNHYTQKSLSLSPGK leve DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLI (SEQ ID YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGT NO: 132 KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
RGEC hu11F11 pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNK (ver.4) (SEQ ID ANDYTTEYSASVKGRFTVSRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFA NO: 133 YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
EALHNHYTQKSLSLSPGK leve DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLI (SEQ ID YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGT NO: 134 KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
RGEC hu11F11 Pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAAIRNK (H2L4) (SEQ ID ANDYTTEYAASVKGRFTISRDTSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAHGKPFA NO: 135 YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
EALHNHYTQKSLSLSPGK leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGT NO: 136 KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
RGEC hu3A9(V pesada EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKGLEWVATISNG H5/L3) (SEQ ID GGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARHITTVRPTKY NO: FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS 137) WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK leve DIVMTQSPATLSVSLGERATLSCKASQNVGTTVAWYQQKPGQAPRLLIYSASNR (SEQ ID YTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSNYPLTFGGGTKVEIKR NO: 138 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
[071] Para que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve aqui descritas forneçam a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo intacto, cada região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve podem ser ligadas à região constante da cadeia pesada e à região constante da cadeia leve. Cada cadeia pesada e cadeia leve que são produzidas como descrito acima pode combinar adequadamente para constituir a combinação de cadeia pesada-cadeia leve e a combinação de cadeia pesada- cadeia leve pode formar o multímero (por exemplo, dímero para anticorpo do tipo IgG), resultando na construção da estrutura de anticorpos intacta.
[072] A região constante pode ser adequadamente selecionada a partir de regiões constantes de cadeia pesada e leve de imunoglobulinas (por exemplo, imunoglobulinas humanas). Por exemplo, a região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante da cadeia pesada de IgG1, uma região constante da cadeia pesada de IgG3 ou uma região constante da cadeia pesada de IgG4, e a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou uma região constante lambda, mas não está limitado a isso. Outros tipos de regiões constantes ou regiões constantes modificadas podem ser adequadamente selecionados e utilizados para estabilidade de anticorpo, capacidade de fabricação, afinidade por antígeno e/ou outras características desejadas, que são claramente entendidas pelos especialistas na técnica.
[073] Em outra modalidade, cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e as regiões variáveis da cadeia leve divulgadas nas Tabelas 7 e 8 podem ser livremente combinadas entre si para formar vários anticorpos e são ligadas em uma forma de cadeia única para produzir anticorpos de cadeia única, como scFv.
[074] O anticorpo aqui descrito pode compartilhar uma região ou sequência específica com um anticorpo diferente aqui divulgado. Em uma modalidade, o anticorpo pode compartilhar a região constante do outro anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em outra modalidade, ele pode compartilhar a região Fc.
[075] Em uma modalidade, o anticorpo anti-alfa- sinucleína da presente invenção também inclui um anticorpo monoclonal e um anticorpo policlonal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-alfa-sinucleína pode ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo acionado a partir de animal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-alfa-sinucleína pode ser preparado de forma recombinante ou quimicamente sintetizada.
[076] Os fragmentos de ligação ao antígeno ou fragmentos de anticorpo dos anticorpos aqui descritos podem ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste nas moléculas de anticorpo de cadeia única de scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab', F(ab')2, minicorpo, diacorpo, scFv e similares.
[077] Em outra modalidade, o anticorpo aqui fornecido pode ser um anticorpo humanizado ou anticorpo humano e pode ser vários isotipos (por exemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4, IgE ou IgD), particularmente tipo IgG1-, IgG2- IgG3- ou IgG4-, como tipos IgG1- ou IgG2.
[078] Em outra modalidade, o anticorpo anti-alfa- sinucleína pode compreender apenas cadeia pesada ou cadeia leve descritas acima. Em outra modalidade, o anticorpo anti- alfa-sinucleína possui apenas região variável de cadeia pesada ou apenas região variável de cadeia leve.
[079] Os técnicos no assunto entenderão que quando um anticorpo compreende uma ou mais CDRs divulgadas neste documento, cada uma das CDRs divulgadas pode ser selecionada independentemente uma da outra e combinada. Portanto, os anticorpos podem ser preparados para incluir 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de CDRs selecionadas independentemente. Também será entendido pelos técnicos no assunto que quando uma CDR é selecionada para combinação, o mesmo tipo de CDR não é usado repetidamente e, por exemplo, geralmente não é produzido um anticorpo para incluir duas regiões CDR-H2.
[080] Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou anticorpo policlonal. Os anticorpos aqui divulgados incluem anticorpos monoclonais que se ligam à alfa-sinucleína. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando qualquer técnica conhecida na técnica. Por exemplo, pode ser produzido imortalizando células do baço colhidas de animais transgênicos imunizados. Os anticorpos monoclonais secretados pelas linhagens celulares de hibridoma podem ser purificados utilizando técnicas conhecidas na técnica.
[081] Em outras modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo derivado de animal (por exemplo, anticorpo de camundongo etc.), um anticorpo quimérico (por exemplo, anticorpo quimérico de camundongo humano), um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. O anticorpo também pode ser modificado de várias maneiras para várias finalidades.
Os anticorpos quiméricos e os anticorpos humanizados também são fornecidos. Os anticorpos quiméricos são anticorpos nos quais os fragmentos de polipeptídeo derivados de diferentes anticorpos são ligados covalentemente para formar uma cadeia leve, cadeia pesada ou fragmento do mesmo imunologicamente funcional.
[082] Em tal anticorpo monoclonal, um resíduo de aminoácido específico, que tipicamente constitui a porção de reconhecimento não antigênico do anticorpo, é modificado para ser homólogo ao resíduo correspondente do isotipo correspondente ao anticorpo humano. A humanização pode ser realizada com vários métodos conhecidos, por exemplo, substituindo pelo menos uma porção da região variável do roedor pela região correspondente de um anticorpo humano (patentes US 5.585.089 e 5.693.762; Jones et al., Nature 1986, 321: 522-525; Riechmann et al., Nature 1988, 332: 323- 27; Verhoeyen et al., Science 1988, 239: 1534-1536).
[083] O anticorpo humano completo pode ser produzido imunizando um animal transgênico (geralmente camundongo) que pode produzir um anticorpo humano por falta de produção de uma imunoglobulina endógena. O anticorpo humano completo pode também ser derivado de uma biblioteca de exibição de fagos. Se forem utilizados anticorpos humanos completos, ele pode minimizar as reações alérgicas e imunogênicas que podem ser causadas pela administração de um camundongo ou mAb derivado de camundongo a humanos.
[084] Em uma modalidade, os anticorpos alfa-sinucleína humanos da presente invenção são selecionados através do método de exibição de fagos. Os anticorpos fágicos monoclonais específicos para a alfa-sinucleína, que são selecionados através do método de triagem de fagos, são invertidos para a forma completa de IgG usando o método recombinante. A sequência de cada anticorpo fágico monoclonal é obtida para a produção recombinante de anticorpos anti-alfa-sinucleína. Depois de ligar a sequência da região variável da cadeia pesada à sequência da região constante da cadeia pesada e a sequência da região variável da cadeia leve à sequência da região constante da cadeia leve nas sequências obtidas, as sequências de aminoácidos são convertidas em sequência nucleotídica com o método de otimização de códons. Após as sequências nucleotídicas obtidas serem clonadas em vetores utilizados para uma cultura de células animais, as células hospedeiras usadas para produção de proteínas, como células CHO, são transformadas com os vetores e cultivadas. A fim de purificar os anticorpos contidos no meio de cultura, os anticorpos recombinantes são separados e purificados usando uma técnica de purificação, como cromatografia de afinidade.
[085] Em outra modalidade, o anticorpo pode ter uma estrutura típica de um anticorpo de ocorrência natural ou estrutura modificada.
[086] O anticorpo possuindo a estrutura típica pode ter uma estrutura multimérica incluindo unidades estruturais compreendendo duas cadeias polipeptídicas diferentes (isto é, cadeia pesada e cadeia leve). As duas cadeias polipeptídicas diferentes compreendem uma cadeia leve de comprimento total (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada de comprimento total (cerca de 50 a 70 kDa). Cada cadeia mostra um padrão de dobramento característico e consiste em vários domínios de imunoglobulina, consistindo em cerca de 90 a 110 aminoácidos. Estes domínios são unidades básicas que consistem em um polipeptídeo de anticorpo. A parte amino- terminal de cada cadeia compreende tipicamente uma parte chamada região variável ou região V que é uma parte que reconhece um antígeno. A parte do terminal carboxi é conservada evolutivamente mais do que o terminal amino, e compreende uma parte chamada região constante ou região C.
A cadeia leve humana é comumente classificada como cadeias leves kappa (κ) e lambda (λ), e estas compreendem uma região variável e uma região constante. A cadeia pesada é tipicamente classificada como mu (µ), delta (δ), gama (γ), alfa (α) ou epsilon (ε), e são definidas como isotipos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG inclui IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, além de numerosos subtipos ilimitados, sem limitação aos mesmos. A região constante da cadeia pesada inclui tipicamente um ou mais domínios mostrando uma função efetora. O número de domínios na região constante da cadeia pesada varia de acordo com os isotipos. A cadeia pesada de IgG, por exemplo, compreende três domínios da região C conhecidos como CH1, CH2 e CH3, respectivamente. O anticorpo aqui divulgado pode ser qualquer um desses isotipos e subtipos. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é um subtipo IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgG4.
[087] O anticorpo aqui divulgado também é uma variante do anticorpo aqui divulgado. Por exemplo, uma parte do antígeno compreende a substituição conservadora de aminoácidos em um ou mais resíduos da cadeia pesada ou cadeia leve, região variável ou sequência de CDR divulgada acima.
Os especialistas na técnica determinarão uma variante apropriada do polipeptídeo aqui divulgado usando uma técnica conhecida. Os técnicos no assunto encontrarão uma região capaz de alterar uma proteína sem destruir a atividade, visando uma região que não é considerada uma região importante para a atividade no polipeptídeo.
[088] A presente invenção também fornece um derivado do anticorpo aqui divulgado. O anticorpo derivatizado ou seu fragmento pode compreender qualquer molécula ou material que forneça propriedades desejadas, por exemplo, uma meia-vida aumentada em certas utilizações do anticorpo ou seu fragmento. O anticorpo derivatizado pode compreender, por exemplo, um resíduo detectável (ou marcado) (por exemplo, uma molécula radioativa, colorimétrica, antigênica ou enzimática), uma conta detectável (por exemplo, conta magnética ou densa em elétrons (por exemplo, ouro)), ou uma molécula que se liga a outras moléculas (por exemplo, biotina ou estreptavidina), um resíduo terapêutico ou de diagnóstico (por exemplo, resíduo radioativo, citotóxico ou farmaceuticamente ativo) ou uma molécula que aumenta a adequação do anticorpo para usos especiais (por exemplo, administração a um indivíduo, como um indivíduo humano ou outros usos in vivo ou in vitro).
[089] Outra modalidade se refere a um dímero compreendendo duas proteínas de fusão nas quais a proteína de ligação à alfa-sinucleína é fundida à região Fc de um anticorpo. Por exemplo, o dímero pode ser preparado inserindo um gene de fusão que codifica uma proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, expressando o gene de fusão em uma célula hospedeira transformada por um vetor de expressão recombinante e permitindo que a proteína de fusão expressa se combine de maneira semelhante a um anticorpo molécula, na qual a ligação dissulfeto inter-cadeia é formada entre os resíduos Fc para coletar o dímero.
[090] O termo "polipeptídeo Fc" usado aqui é um polipeptídeo derivado de uma região Fc de um anticorpo e inclui um tipo selvagem ou tipo mutante. A forma de clivagem do polipeptídeo compreendendo uma região de dobradiça que facilita a dimerização também está incluída. A proteína de fusão compreendendo Fc ou oligômero formado a partir dela tem uma vantagem de fácil separação que é realizada com uma cromatografia de afinidade usando uma coluna de proteína A ou proteína G.
[091] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma célula ou linhagem celular procariótica ou eucariótica transformada com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção.
[092] Em outra modalidade, a presente invenção fornece ainda um método de produção de um anticorpo isolado que se liga especificamente à alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo cultivar a célula da presente invenção sob a condição de expressar suficientemente o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e isolar o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da linhagem celular.
[093] Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno divulgado neste documento tem várias aplicações úteis. Por exemplo, pode ser utilizado para análise de ligação específica, purificação de alfa-sinucleína com base na afinidade ou método de triagem para investigação de antagonistas de alfa-sinucleína e similares. Em uma modalidade, o anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno podem ser úteis para inibir a formação de agregados de alfa-sinucleína, remover o agregado de alfa-sinucleína no sistema nervoso, suprimir a transferência intercelular dos agregados de alfa-sinucleína e remover ou reduzir agregados de alfa-sinucleína fora da célula por fagocitose no agregado de alfa-sinucleína.
[094] O anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser utilizados para detecção e/ou tratamento de várias doenças associadas à alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína. Por exemplo, o anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno podem ser úteis para detecção, tratamento, alívio ou melhora das doenças, sintomas ou distúrbios associados ao agregado de alfa- sinucleína. Além disso, os anticorpos de acordo com a presente divulgação podem ser utilizados para o diagnóstico de várias doenças ou sintomas associados aos agregados de alfa-sinucleína ou alfa-sinucleína ou para a presença ou ausência de agregados de alfa-sinucleína ou alfa-sinucleína.
[095] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção tem pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste em (i) ligação específica à alfa-sinucleína ou agregado de alfa-sinucleína, (ii) redução do nível de alfa-sinucleína ou alfa-sinucleína agregada no sistema nervoso de um indivíduo, (iii) redução ou inibição da transmissão de célula a célula de alfa- sinucleína ou alfa-sinucleína agregada entre as células nervosas e (vi) aumento da captação fagocítica de alfa- sinucleína ou alfa-sinucleína agregada nas células nervosas.
De preferência, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção possui todas as propriedades de (i) a (iv).
[096] Uma modalidade da presente invenção se refere a uma composição para prevenção, alívio, melhoria ou tratamento de sinucleinopatias, compreendendo um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antígeno, capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente agregado de alfa-sinucleína.
[097] Uma modalidade da presente invenção se refere a um método de prevenção, alívio, melhoria ou tratamento de sinucleinopatias, compreendendo uma etapa de administração a um indivíduo em necessidade, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo capaz de se ligar especificamente a alfa- sinucleína, especialmente alfa -sinucleína agregada. A quantidade administrada do antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser uma quantidade eficaz para reduzir o nível de alfa-sinucleína, especialmente alfa- sinucleína agregada no sistema nervoso, mais especificamente região extracelular da célula nervosa no sistema nervoso de um indivíduo.
[098] Uma modalidade da presente invenção se refere a um método para reduzir o nível de alfa-sinucleína, especialmente o agregado de alfa-sinucleína no sistema nervoso, mais especificamente a região extracelular da célula nervosa no sistema nervoso de um indivíduo, ou o uso de reduzir o nível de alfa-sinucleína, especialmente agregado de alfa-sinucleína na região extracelular da célula nervosa no sistema nervoso, compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno, sendo capaz de se ligar especificamente a alfa-sinucleína, especialmente agregado de alfa-sinucleína.
[099] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição ou um kit compreendendo um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção. A composição pode ser fornecida como uso farmacêutico ou diagnóstico, e a composição farmacêutica pode incluir ainda um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável e a composição de diagnóstico pode incluir ainda um agente necessário para o diagnóstico ou detecção.
[100] Aqui, o termo "barreira sangue-cérebro" ou BBB é uma barreira formada por junções estreitas na membrana endotelial capilar do cérebro existente entre o cérebro e a coluna vertebral e seu sistema circulatório circundante.
Essa barreira é tão resistente que também limita a passagem de moléculas com baixo peso molecular de cerca de 60 Da para o cérebro. A barreira hematoencefálica do cérebro, a barreira da medula espinhal vascular da coluna vertebral e a barreira retiniana vascular da retina são barreiras capilares contínuas no sistema nervoso central, comumente referido como BBB.
[101] Na presente invenção, o termo "transportador de barreira hematoencefálica" pode passar através da barreira hematoencefálica e entregar um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, e por exemplo, incluir uma proteína incluindo peptídeo g e polipeptídeo, um ácido nucleico, um anticorpo ou um pequeno composto molecular.
[102] Aqui, "agente terapêutico" significa uma molécula a ser administrada a um indivíduo para um efeito terapêutico desejado. O indivíduo inclui um mamífero não humano, como primatas, ou um humano. Os exemplos do agente terapêutico incluem uma proteína compreendendo um peptídeo e um polipeptídeo, um ácido nucleico, um anticorpo ou um pequeno composto molecular. Em outro aspecto, o agente terapêutico pode ser utilizado como agente terapêutico de doenças relacionadas com o agregado de alfa-sinucleína por ligação com o anticorpo da presente invenção.
[103] Embora os mecanismos precisos pelos quais o acúmulo de alfa-sinucleína nas sinucleinopatias induzem propriedades típicas da neurodegeneração e os sintomas inerentes às sinucleinopatias não sejam totalmente compreendidos, os estudos recentes mostraram que a formação e o acúmulo anormal de agregados de alfa-sinucleína estão relacionados à ocorrência de possíveis sinucleinopatias e progressão degenerativa.
[104] De acordo com a presente invenção, o termo "alfa- sinucleinopatias" inclui todos os distúrbios neurodegenerativos caracterizados por agregados patológicos de sinucleínas. Doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpo de Lewy (DLB), doença de corpos de Lewy, demência acompanhada de corpos de Lewy, síndrome de Parkinson com demência, atrofia de múltiplos sistemas (MSA), atrofia de múltiplos sistemas nervosos e neurodegeneração tipo I com acumulação cerebral de ferro (NBIA Tipo I), são coletivamente agrupados como sinucleinopatias. Além disso, as agregações de alfa- sinucleínas também foram encontradas secundárias na doença de Alzheimer (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73).
[105] As sinucleinopatias são diversos grupos de distúrbios neurodegenerativos que compartilham propriedades patológicas comuns: Nos aspectos neuropáticos, as lesões distintas podem ser detectadas como agregação anormal da alfa-sinucleína nos grupos selecionados de neurônios e oligodendrócitos. A alfa-sinucleína (anteriormente conhecida como PARKl e PARK4) é uma proteína composta por 140 aminoácidos que é amplamente expressa no neocórtex, hipocampo, giro dentado, neurosfera posterior, estriado,
tálamo e cerebelo. A alfa-sinucleína também é altamente expressa em células hematopoiéticas, incluindo monócitos, como células B, células T, células NK e plaquetas. O papel exato nessas células é desconhecido, mas associado à diferenciação de megacariócitos (precursores de plaquetas).
[106] O anticorpo alfa-sinucleína que reconhece especificamente o agregado de alfa-sinucleína com alta afinidade de acordo com a presente invenção, pode ser útil para o diagnóstico ou detecção dessas doenças. Além disso, o anticorpo alfa-sinucleína que reconhece especificamente o agregado de alfa-sinucleína da presente invenção inibe a formação de agregados de alfa-sinucleína, degrada os agregados de alfa-sinucleína ou inibe a transmissão intercelular de agregados e, portanto, pode ser usado efetivamente no tratamento de sinucleinopatias como a doença de Parkinson.
[107] Aqui "uma doença associada aos agregados de alfa- sinucleína" é um grupo de doenças neurodegenerativas denominadas sinucleinopatias, nas quais os agregados de alfa-sinucleína são encontrados em lesões incluindo neurônios e glia, e tem características como degeneração do sistema dopamina, alteração da mobilidade, comprometimento cognitivo e formação de corpos de Lewy e/ou Lewy Neurites (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73; McKeith et al., Neurology (1996) 47: 1113-24). Essas doenças incluem a doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson, demência de corpos de Lewy, variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer, doença de Alzheimer e Parkinson combinada, atrofia de múltiplos sistemas e muitas outras doenças neuroaxonais, mas não estão limitadas a. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção é efetivamente utilizado para o tratamento da doença de Parkinson.
[108] Aqui, "dose eficaz" geralmente significa uma quantidade suficiente para reduzir a gravidade e/ou a frequência de ocorrência de sintomas devido a uma doença, particularmente uma doença relacionada à α-syn, remover sintomas devido a uma doença, particularmente uma doença relacionada à alfa-sinucleína e/ou uma causa raiz da ocorrência de uma doença, ou impedir a ocorrência de sintomas devido a uma doença, particularmente uma doença relacionada à alfa-sinucleína e/ou uma causa raiz e/ou melhorar ou corrigir danos devido a uma doença, particularmente, uma doença relacionada à α-syn. Em algumas modalidades, a dose eficaz é uma dose terapêutica eficaz ou uma dose eficaz profilática. A "dose terapêutica eficaz" é uma quantidade suficiente para tratar uma doença, particularmente sintomas ou condições relacionadas à α-syn, ou impedir, retardar uma doença, particularmente sintomas ou condições relacionadas à α-syn, ou reverter seu progresso. A "dose eficaz profilática" é uma quantidade para prevenir ou retardar a ocorrência ou recorrência de uma doença, particularmente uma doença relacionada à alfa-sinucleína ou sintomas da doença, particularmente uma doença relacionada à α-syn e reduzir sua probabilidade. O efeito terapêutico ou profilático completo pode ser causado por várias vezes da administração da dose, e não por uma única administração da dose. Portanto, a dose eficaz terapêutica ou profilática pode ser administrada uma vez ou mais da administração.
[109] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção ou uma composição compreendendo a mesma, para o tratamento das sinucleinopatias de um indivíduo que sofre de sinucleinopatias. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ou a composição compreendendo o mesmo inibe a transmissão intercelular de agregados de alfa- sinucleína, degrada o agregado de alfa-sinucleína, inibe a formação de agregados de alfa-sinucleína ou aumenta os fagócitos por microglia em agregados de alfa-sinucleína em um indivíduo, ou no cérebro do indivíduo.
[110] Aqui, o termo "tratamento" significa todas as ações, incluindo alívio ou remoção de uma doença ou sintoma ou condição da doença, incluindo redução, alívio, alívio ou remoção de doença ou sintoma da doença, tornando o paciente capaz de suportar os sintomas ou condição da doença ou atrasar a taxa de deterioração da doença ou sintoma ou condição mórbida da doença. O termo "indivíduo" ou "paciente" inclui um humano ou paciente humano.
[111] Também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo e um diluente, carreador, solubilizador, emulsificante, conservante e/ou suplemento farmaceuticamente aceitável.
Além disso, por exemplo, está incluído um método para o tratamento de um paciente com câncer, administrando uma composição farmacêutica. O termo "paciente" inclui um paciente humano relacionado com α-syn. Uma vez formulada a composição farmacêutica, esta pode ser armazenada em um frasco estéril como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou pó desidratado ou liofilizado. Esta formulação pode ser armazenada em uma forma imediatamente utilizável ou em uma forma reestruturada imediatamente antes da administração (por exemplo, liofilizada).
[112] A via de administração da composição farmacêutica pode usar métodos conhecidos, por exemplo, injeção por via oral; via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intersticial), intraventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; sistema de liberação sustentada ou dispositivo de implante.
Em uma modalidade específica, a composição pode ser administrada continuamente por injeção em bolus, ou dispositivo de injeção ou implante.
[113] A composição ou kit farmacêutico pode ser utilizado para o tratamento de sinucleinopatias, por exemplo, doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer, doença de Alzheimer combinada e doença de Parkinson e atrofia de múltiplos sistemas.
[114] Em outros aspectos, a presente invenção fornece um método de tratamento de sinucleinopatia em um indivíduo ou modulação de uma concentração de agregado de alfa-sinucleína em um indivíduo, compreendendo uma etapa de administração de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção ou uma composição compreendendo a igual a um indivíduo necessitado de tratar α-sinucleinopatia e/ou modular uma concentração de agregados de alfa-sinucleína.
[115] Em uma modalidade, um anticorpo de acordo com a presente divulgação pode ser usado em uma forma conectada a um transportador para passagem através da barreira sanguínea cerebral (BBB). Muitos métodos para administrar medicamentos através da barreira sanguínea cerebral são divulgados. Por exemplo, existe um método de quebrar a pressão osmótica do BBB usando um método como Brad quinino ou HIGU (a densidade de Hign difunde o ultrassom). Eles também envolvem o uso de sistema de entrega celular, por exemplo, transporte de glicose e aminoácidos, e transititose mediada por receptor de insulina ou transferrina, ou o bloqueio do transportador de efluxo de glicoproteínas.
[116] Em outra modalidade, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos para tratar doenças associadas a agregados de alfa-sinucleína. Também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo e um diluente, carreador, solubilizador, emulsificante, conservante e/ou suplemento farmaceuticamente aceitável.
[117] Um material de formulação aceitável não é tóxico para um destinatário, em capacidade e concentração usadas.
Em uma modalidade específica, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo alfa-sinucleína humana. Em uma modalidade específica, o material de formulação aceitável é preferencialmente não tóxico na capacidade e concentração utilizadas. Em uma modalidade, por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender um material de formulação específico para pH, osmolaridade, viscosidade, transparência, cor, isotonicidade, aroma, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, modificação, manutenção ou conservação de absorção ou penetração, da composição.
[118] Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica ideal pode ser determinada pelos especialistas na técnica de acordo com, por exemplo, uma via de administração de direcionamento, método de entrega e uma capacidade de direcionamento (ver, as CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE REMINGTON acima). Em uma modalidade específica, esta composição pode afetar a condição física, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo do anticorpo aqui divulgado. Em uma modalidade específica, o carreador ou transportador principal na composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso. Por exemplo, um carreador ou transportador apropriado pode ser possivelmente água de injeção, solução salina fisiológica suplementada por outros materiais comuns em uma composição para administração parentérica. Além disso, em uma modalidade específica, o anticorpo alfa-sinucleína humano pode ser formulado como uma liofilização usando um excipiente adequado, por exemplo, sacarose.
[119] A composição farmacêutica pode ser entregue parenteralmente, e a composição terapêutica pode proteína de ligação à alfa-sinucleína humana em um carreador farmaceuticamente aceitável, ou é fornecida na forma de uma solução aquosa aceitável para parenteral que não contém pirogênio.
[120] Uma vez formulada a composição farmacêutica, esta pode ser armazenada em um frasco estéril como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou pó desidratado ou liofilizado. Esta formulação pode ser armazenada em uma forma imediatamente utilizável ou em uma forma reestruturada imediatamente antes da administração (por exemplo, liofilizada). Também é fornecido um kit para a produção de uma unidade de administração de dose única. Este kit compreende um recipiente primário com uma proteína seca e um recipiente secundário com uma formulação aquosa. A frequência de administração pode ser afetada pelos parâmetros farmacocinéticos da formulação utilizada do anticorpo alfa-sinucleína humano.
[121] Além disso, pode ser preferível usar a composição farmacêutica do anticorpo alfa-sinucleína humana ex vivo.
Neste caso, uma célula, tecido ou órgão removido de um paciente pode ser exposto para a composição farmacêutica do anticorpo alfa-sinucleína humano e, em seguida, ser subsequentemente implantado no paciente. Em particular, o anticorpo alfa-sinucleína humano pode ser entregue implantando uma célula específica que é geneticamente modificada usando métodos aqui descritos, a fim de expressar e secretar o polipeptídeo.
[122] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para detectar agregados de alfa-sinucleína em uma amostra biológica, compreendendo fornecer um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção e contatar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com uma amostra biológica a ser detectado para o agregado de alfa-sinucleína. As amostras biológicas incluem várias amostras necessárias para a detecção do agregado de alfa-sinucleína, incluindo, por exemplo, líquido cefalorraquidiano, sangue incluindo plasma ou urina e células, tecidos ou órgãos. O método pode ser realizado in vitro ou in vivo. A imagem in vivo pode ser realizada usando, por exemplo, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia por emissão de fóton único (SPECT), imagem óptica por infravermelho próximo (NIR) ou ressonância magnética (MRI).
[123] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para diagnosticar sinucleinopatia em um indivíduo com necessidade de diagnosticar sinucleinopatia, em que o método compreende medir/detectar uma concentração ou localização intercelular do agregado de alfa-sinucleína no indivíduo usando qualquer anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do presente invento; e comparar a concentração ou a localização intercelular do agregado de alfa-sinucleína medido no indivíduo com o de uma amostra de controle e em que a similaridade ou diferença comparada com o resultado da amostra de controle representa o indivíduo com α-
sinucleinopatia. O grupo controle pode ser uma amostra normal ou uma amostra de paciente com α-sinucleinopatia. Para a detecção ou uso de diagnóstico, o anticorpo pode ser tipicamente marcado por um material de marcação detectável.
[124] O anticorpo aqui divulgado pode ser utilizado de maneira útil para detecção, diagnóstico ou monitoramento de doenças ou sintomas relacionados à alfa-sinucleína. Em uma modalidade, o método da presente invenção é um método para diagnosticar sinucleinopatia em um indivíduo com necessidade de diagnosticar sinucleinopatia, em que o método compreende medir uma concentração ou localização intercelular do agregado de alfa-sinucleína no indivíduo usando o anticorpo e antígeno. fragmentos de ligação de acordo com a presente invenção; e comparar a concentração ou a localização intercelular do agregado de alfa-sinucleína medido no indivíduo com o resultado da amostra de controle e em que a similaridade ou diferença comparada com o resultado da amostra de controle representa o indivíduo com sinucleinopatia.
[125] No método, o indivíduo inclui pacientes que não apresentam sintomas ou estão antes da ocorrência dos sintomas. Em uma modalidade, o grupo controle pode ser paciente com sinucleinopatia, incluindo doença de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB) ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA), e a semelhança com o grupo controle na etapa de comparação representa o diagnóstico indivíduo como paciente com sinucleinopatia. Em outra modalidade, quando o grupo controle é uma amostra derivada de um indivíduo normal, a diferença do grupo controle na etapa de comparação, por exemplo, o aumento do concentrado de agregados representa o diagnóstico do indivíduo como um paciente com sinucleinopatia. Em outra modalidade, a idade do indivíduo e o controle podem ser comparados. O método pode ser realizado in vivo ou em uma amostra biológica separada do indivíduo, como sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR) ou amostras de urina.
[126] Para o diagnóstico, o anticorpo pode ser tipicamente marcado com uma substância marcadora detectável.
As substâncias de rotulagem apropriadas incluem um radioisótopo ou nuclídeo radioativo (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), material fluorescente (por exemplo, FITC, rodamina, substância fluorescente lantanóide), enzima (por exemplo, peroxidase de rabanete, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), um grupo quimioluminescente, um grupo biotinil ou epítopo de polipeptídeo reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequência de pares de zíperes de leucina, local de ligação de anticorpo secundário, domínio de ligação de metal, tag de epítopo), mas não limitado a isso.
[127] Em outro aspecto, o anticorpo da presente invenção pode ser utilizado para identificação de um tecido incluindo agregado de alfa-sinucleína. Em uma modalidade específica, o anticorpo é marcado por uma substância marcadora e a ligação ao agregado de alfa-sinucleína do anticorpo marcado é detectada. Em uma modalidade, a ligação do anticorpo ao agregado de alfa-sinucleína é detectada in vivo.
[128] Em outro aspecto, a presente invenção descreve a detecção ou seleção de materiais de teste que competem com o anticorpo aqui divulgado para ligação ao agregado de alfa- sinucleína. Por exemplo, uma etapa de detecção da quantidade de anticorpos não ligados em uma solução compreendendo agregado de alfa-sinucleína na presença ou ausência de materiais de teste é compreendida.
[129] A concentração aumentada do anticorpo livre, isto é, o anticorpo que não está ligado ao agregado de alfa- sinucleína pode representar que os materiais de teste podem competir com o anticorpo pela ligação à alfa-sinucleína. Em uma modalidade, o anticorpo é marcado por um grupo de marcação. Alternativamente, os materiais de teste são marcados e a quantidade de materiais de teste livres é monitorada pela presença ou ausência do anticorpo.
[130] Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno divulgado neste documento tem várias aplicações úteis. Por exemplo, pode ser usado para análise de ligação específica, purificação de alfa-sinucleína com base na afinidade ou método de triagem para investigar antagonista de alfa-sinucleína e similares.
[131] Os anticorpos aqui divulgados são úteis para a detecção de alfa-sinucleína, particularmente agregados de alfa-sinucleína, como o corpo de Lewy em uma amostra biológica, e a identificação de células ou tecidos contendo agregado de alfa-sinucleína. Por exemplo, um anticorpo anti- alfa-sinucleína pode ser usado para diagnóstico, por exemplo, a detecção e/ou análise quantitativa de agregados de alfa-sinucleína em uma amostra biológica, como sangue contendo soro, líquido cefalorraquidiano (LCR) ou urina, células ou tecidos e o diagnóstico de α-sinucleinopatia com base nos mesmos.
[132] Os anticorpos aqui divulgados se ligam preferencialmente a alfa-sinucleína, especialmente a agregados de alfa-sinucleína, com uma alta afinidade de ligação. O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, com uma alta afinidade de acordo com a presente invenção, pode reduzir a formação de agregados de alfa-sinucleína, diminuindo assim a concentração de agregados no cérebro.
Além disso, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que possui uma alta afinidade pelos agregados de alfa-sinucleína de acordo com a presente invenção pode reduzir a formação de agregados de alfa-sinucleína fora do sistema nervoso central e alterar o estado de equilíbrio das formas alfa-sinucleína limitado pela barreira sangue- cérebro, resultando no efeito de diminuir a concentração de agregados no interior do sistema nervoso central. Além disso, tem a vantagem de poder ser administrado em doses baixas devido à sua alta afinidade. Uma vez que pode ser obtida eficácia suficiente, por exemplo, por injeção subcutânea mais simples, mas não limitada a ela, tem uma grande vantagem na prática clínica.
[133] Os anticorpos aqui divulgados podem remover ou promover efetivamente a degradação de agregados de alfa- sinucleína e inibir a transmissão intercelular de alfa- sinucleína e, portanto, podem ser úteis para o tratamento de doenças associadas ao acúmulo de agregado de alfa- sinucleína.
[134] A Fig. 1 é um resultado de transferência de pontos mostrando que o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção se liga especificamente à alfa-sinucleína nativa na forma agregada.
[135] A Fig. 2 é um resultado da análise ELISA para a afinidade do anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção.
[136] A Fig. 3a é um resultado da análise BIAcore para a especificidade e afinidade da ligação preferencial do anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção ao agregado de alfa-sinucleína. A Fig. 3b é uma tabela que mostra os resultados da Fig. 3a.
[137] A Fig. 4a é um resultado da análise do Octeto para a especificidade de ligação preferencial do anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção ao agregado de alfa-sinucleína. A figura 4b é uma tabela que mostra os resultados da figura 4a.
[138] A Fig. 5 mostra o princípio analisando se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção inibe a transmissão de célula a célula (parte superior) e o resultado experimental.
[139] A Fig. 6a é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral do camundongo usando o anticorpo p-129 α-Syn após a administração do anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode remover o agregado de alfa- sinucleína no modelo de camundongo (TG) que superexpressa a alfa-sinucleína humana. No desenho, HP se refere a Hipocampo, p-129 α-syn se refere a uma forma que possui o 129º resíduo fosforilado e um gerador de agregado, e a seta indica a alfa- sinucleína fosforilada.
[140] A Fig. 6b é um resultado da coloração e medição de acordo com substancialmente a mesma experiência que a Fig.
6a pela coloração com o anticorpo contra todas as alfa- sinucleínas como fabricante. A seta indica alfa-sinucleína humana. Os anticorpos 9B11, 11F4 e 11F11 inibiram o acúmulo de toda a alfa-sinucleína.
[141] A Fig. 7a é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo Iba-1 (microgliose) como marcador após a administração de anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir a microgliose in vivo, e a seta indica a microglia ativada.
[142] A Fig. 7b é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo GFAP (astrogliose) como marcador após a administração de anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir a astrogliose in vivo e a seta indica o astrócito ativado.
[143] A Fig. 7c é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo IL-1 beta (IL- 1β) como marcador após a administração de anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir as citocinas inflamatórias in vivo, e a seta indica as células que expressam IL-1 beta.
[144] A Fig. 7d é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo IL-6 como marcador após a administração de anticorpo para camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir as citocinas inflamatórias em vivo, e a seta indica as células que expressam IL-6.
[145] As Fig. 8a e Fig. 8b mostram o resultado da medição de que os anticorpos monoclonais de 3A9 e 11F11 em uma modalidade da presente invenção podem reconhecer especificamente os corpos de Lewy e os neurites de Lewy no tecido cerebral humano, respectivamente. Mostra que os anticorpos da presente invenção se ligam aos corpos de Lewy (seta) e às neurites de Lewy (forma de fio na parte inferior esquerda).
[146] A Fig. 9 é uma representação esquemática dos resultados do mapeamento de epítopos para os anticorpos de uma modalidade da presente invenção, na qual os anticorpos da presente invenção se ligam principalmente à região C- terminal.
[147] A Fig. 10a e a Fig. 10b são um resultado da análise da atividade do anticorpo quimérico e do anticorpo humanizado para promover a ação fagocítica das células microgliais aos agregados de alfa-sinucleína e a Fig. 10a se refere ao anticorpo humanizado 11F11 e a Fig. 10b se refere para anticorpo humanizado 3A9.
[148] A Fig. 11 é um resultado da análise da atividade do anticorpo quimérico e do anticorpo humanizado para inibir a ligação dos agregados de alfa-sinucleína à superfície das células nervosas.
[149] FIG. 12 é um resultado da análise da eficácia de anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados da presente invenção para inibir a transmissão de célula a célula na qual os agregados de alfa-sinucleína são secretados pelas células nervosas que superexpressam a alfa-sinucleína e transferem para células nervosas normais.
[150] A Fig. 13 é um resultado da análise ELISA da afinidade do anticorpo quimérico e do anticorpo humanizado 11F11 preparado em uma modalidade da presente invenção.
[151] A Fig. 14 é um resultado da análise BIAcore para a especificidade e afinidade da ligação preferencial do anticorpo quimérico e do anticorpo humanizado 11F11 preparado em uma modalidade da presente invenção a agregados de alfa-sinucleína.
[152] As Fig. 15a, Fig. 15b e Fig. 15c são resultados de manchas que mostram que o anticorpo quimérico preparado em uma modalidade da presente invenção se liga especificamente a alfa-sinucleína, especialmente agregado de alfa-
sinucleína, mas não beta-sinucleína, gama-sinucleína ou agregados derivados de amiloide beta1-42 ou tau.
[153] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência a exemplos, mas estes são meramente ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da presente invenção.
Exemplo 1: Preparação de anticorpo alfa-sinucleína Imunização
[154] O monômero alfa-sinucleína com comprimento total (140 resíduos) ou clivado com 21 resíduos C-terminais (119 resíduos) foi colocado em um termomisturador a 37 °C, agregado com agitação a 1050 rpm por 14 dias e sonicado.
Cada um dos 140 resíduos e 119 resíduos da fibrina α-syn a 1 mg/ml foi misturado com o adjuvante na proporção de 1:1 (vol: vol).
alfa- Sequência de aminoácidos sinucleína de Homo sapiens SEQ ID NO:126 MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGS
[155] Em seguida, 200 µL da mistura preparada foram injetados por via subcutânea em camundongos BALB/c de 5 a 7 semanas de idade. Após 2 semanas, 200 µL da mistura preparada foram posteriormente injetados subcutaneamente para aumentar o anticorpo. Após uma semana de reforço, o sangue foi coletado e a titulação da imunização foi realizada pelo método ELISA usando o antígeno administrado. Posteriormente, o terceiro reforço foi realizado por injeção subcutânea de antígeno sozinho.
Produção de hibridoma
[156] O baço do camundongo imunizado foi removido e as células do baço foram obtidas do baço. As células do baço foram suspensas em meio Hybridoma-SFM (Thermo Fisher Scientific, EUA) suplementado com 10% de FBS. Para preparar o hibridoma, as células do baço e SP2/0-Ag14 de uma célula de mieloma murino foram misturadas em meio Hibridoma-SFM sem soro e seguidas de centrifugação para remover o meio. Em seguida, o PEG foi adicionado ao sedimento celular obtido e incubado a 37 °C por 1 minuto para induzir a fusão celular.
Clonagem de célula única
[157] Após 2 semanas na fusão, a fusão com células B de camundongo produzindo anticorpos foi confirmada com um método ELISA usando o antígeno administrado ao camundongo e um meio de cultura celular. Em seguida, a clonagem de célula única foi realizada usando um hibridoma para selecionar 16 hibridomas que produzem anticorpos monoclonais. Os clones 9B11 (IgG1 kappa) foram obtidos usando o agregado de comprimento total (140 resíduos) α-Syn como antígeno, e os clones de 3A9 e 11F11 (IgG2b kappa e IgG2b kappa,
respectivamente) foram obtidos usando agregados α-Syn com clivagem de Resíduos C-terminais 21 como antígenos.
Purificação de anticorpos
[158] Para purificar o anticorpo, cada hibridoma foi cultivado em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS. Para a produção de anticorpos, o meio de cultura foi substituído por meio SFM sem soro e cultivado por cerca de 4 dias. O sobrenadante da cultura de células foi separado, centrifugado, filtrado com um filtro de 0,22 µm e purificado com uma coluna de proteína G para o tipo IgG1 e a coluna de proteína A para os anticorpos restantes.
Determinação da sequência de região variável
[159] A região variável e as sequências de CDR foram determinadas por referência à divulgação de Ahn et al., Mol.
Cells 2004, 18 (2): 237-241. Os hibridomas foram cultivados e centrifugados para isolar apenas as células. O RNA foi isolado do hibridoma isolado pela adição de um triazol e foi utilizado para sintetizar o cDNA como molde. A região variável e a sequência CDR foram confirmadas por sequenciação.
Exemplo 2. Análise da especificidade de ligação ao antígeno e afinidade de ligação usando anticorpo alfa- sinucleína 2-1: Análise de transferência de pontos ("dot blot") usando anticorpo anti-alfa-sinucleína
[160] Foram realizadas experiências de transferência de pontos para analisar se o anticorpo da presente invenção se ligava a monômeros ou agregados no estado nativo. Para o experimento, 50 ng ou 100 ng de monômero α-syn ou proteína de fibrina (fabricados pelo professor Lee Seung-jae da Universidade Nacional de Seul; Bae et al., J. Neurosci 32: 13454, 2012) foram carregados na membrana de nitrocelulose.
As proteínas de monômero ou fibrila diluídas duas vezes foram carregadas sequencialmente do lado direito da membrana para a esquerda (12,5, 25, 50, 100 ng). A membrana foi bloqueada com 5% de leite seco sem gordura da composição de TBST por 1 hora à temperatura ambiente. 1 mg/ml do anticorpo α-syn preparado no Exemplo 1 foi adicionado ao TBST contendo 1% de albumina de soro bovino e foram incubados à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com TBST, os sinais foram analisados usando um substrato de quimioluminescência (NEN) como substrato e anticorpo secundário conjugado com HRP (peroxidase de rabanete de cavalo) de acordo com o manual do fabricante. Os resultados foram fotografados usando um Sistema de Análise de Imagem Luminescente LAS-3000 (FUJIFILM Life Science). Os resultados são mostrados na figura. 1
[161] Como mostrado na Fig. 1, verificou-se que o anticorpo alfa-sinucleína da presente invenção se liga preferencialmente apenas a agregados em comparação com monômeros alfa-sinucleína. Particularmente, 9B11, 3A9 e
11F11 se ligam apenas ao agregado. O anticorpo 274 (Bae et al., J. Neurosci. 2012 Set 26; 32 (39): 13454-13469) foi usado como um anticorpo comparativo que se liga a monômeros e agregados.
2-2: Análise ELISA usando anticorpo monoclonal anti- alfa-sinucleína
[162] A análise ELISA foi realizada para analisar quantitativamente a afinidade de ligação do anticorpo da presente invenção ao antígeno. Para isso, o anticorpo alfa- sinucleína obtido no Exemplo 1 foi revestido em uma placa de 96 cavidades a uma concentração de 1 ug/ml e tratado com agregados de fibrila alfa, sinucleína a 10, 100, 1000 e
10.000 ng/ml. Após lavagem com PBS, a estreptavidina conjugada com HRP e o anticorpo secundário conjugado com biotina foram tratados e depois reagiram com TMB como substrato. A absorbância foi medida e os resultados são mostrados na FIG.2.
[163] Como mostrado na Fig. 2, verificou-se que os anticorpos da presente invenção se ligam preferencialmente a agregados com uma alta afinidade de ligação. Os resultados do ELISA mostraram que os anticorpos que se ligam preferencialmente aos agregados têm uma afinidade de 0,1 x 10-9 M a 2 x 10-9 M, enquanto os anticorpos que se ligam aos monômeros e agregados apresentam uma afinidade maior de ~ 1 x 10-10 M do que esses anticorpos. O anticorpo da presente invenção preferencialmente se liga a agregados de alfa- sinucleína com alta afinidade, mas a afinidade pelo monômero não pôde ser obtida, porque se ligou ao monômero com uma afinidade mais baixa que o agregado ou não se ligou ao monômero. Estes resultados indicam que o anticorpo pode remover efetivamente ou inibir a ação do agente que causa doenças neurodegenerativas associadas à etiologia da alfa- sinucleína, como a doença de Parkinson.
2-3. Análise BIAcore usando anticorpo anti-alfa- sinucleína
[164] A análise quantitativa da ligação do anticorpo alfa-sinucleína preparado no Exemplo 1 a monômeros e antígenos agregados foi realizada usando a análise BIAcore.
[165] O instrumento utilizado foi o T200 (GE Healthcare, S/N: 1565888). A proteína A é usada como chip (GE Healthcare, Cat. 29-1275-56). Glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 (GE Healthcare, Cat. BR-1003-54) foi tampão de regeneração. O tampão de corrida, a diluição do analito e o tampão de diluição da amostra foram HBS-EP. Os anticorpos α-syn (3A9, 9B11 e 11F11) preparados no Exemplo 1 foram diluídos com 1 × HBS-EP (GE Healthcare, Cat. BR-1006-69) e monômero de alfa-sinucleína (1 mg/ml) e fibrila a proteína (3 mg/ml) foi diluída em série em duplicado e analisada em 6 concentrações (0, 0,39, 1,56, 6,25, 25, 100 nM) incluindo 0 nM no total. Para a captura, o monômero foi de RU de 800 (teórico) e uma fibrila foi de
RU de 100 (teórico). A fase de captura foi realizada no tempo de contato de 60 segundos, vazão de 30 µl/min e período de estabilização de 180 segundos. A fase de associação foi realizada no tempo de associação de 120 segundos e a vazão foi de 30 µl/min. A fase de dissociação foi realizada no tempo de dissociação de 360 segundos e na vazão de 30 µl/min.
A fase de regeneração foi realizada duas vezes no tempo de regeneração de 240 segundos (primário) e 60 segundos (secundário) e uma taxa de fluxo de 30 µl/min. O encaixe foi realizado no modelo de ligação 1:1 e o software de avaliação foi o software BIACore T200 Evaluation (GE Healthcare). Os resultados são mostrados nas Figs. 3a e 3b.
[166] A Fig. 3a é um resultado da análise BIAcore da especificidade de ligação preferencial e afinidade do anticorpo monoclonal preparado em um exemplo da presente invenção para os agregados de alfa-sinucleína. Mostra que o anticorpo da presente invenção se liga ao agregado com uma alta afinidade. Estes resultados indicam que o anticorpo pode remover efetivamente ou inibir a ação do agente que causa doenças neurodegenerativas associadas à etiologia da alfa-sinucleína, como a doença de Parkinson. A Fig. 3b é uma tabela que mostra os resultados da Fig. 3a.
[167] Como mostrado nas Fig. 3a e Fig. 3b, 3A9, 9B11 e 11F11, cuja ligação preferencial aos agregados foi confirmada entre os quatro anticorpos alfa-sinucleína analisados pelos outros métodos descritos acima, ligados apenas aos agregados na análise BIAcore como uma alta afinidade de cerca de 1 x 10-9 M a 3 x 10-9 M de alta afinidade.
2-4. Análise de octetos usando anticorpo anti-alfa- sinucleína
[168] A análise quantitativa da ligação dos anticorpos alfa-sinucleína (3A9, 9B11, 11F11) preparada no Exemplo 1 a monômeros e antígenos agregados foi realizada usando Octet.
[169] Especificamente, o tampão em execução era 1 × KB (cat. 18-1092) ou 1 × tampão PBS a 1000 rpm, e o tampão de imobilização era acetato de sódio, pH 5 (10 mM, Cat 18-1068.
Monômeros α-syn imobilizou o antígeno α-syn e as fibrilas foram imobilizadas como anticorpo em teste. As concentrações-alvo foram 20 µg/ml para o monômero e 0,4 µg/ml para a fibrila. A concentração cinética foi diluída sequencialmente duas vezes de 50 nM para monômeros e de 100 nM para fibrilas, totalizando 7 pontos, respectivamente. O tempo de associação/dissociação foi de 5 min/20 min para monômero e 5 min/25 min para fibrila. O biossensor foi ARG2 e o encaixe foi realizado usando o modelo de encaixe 1:1. os resultados são mostrados na Figura 4. A Figura 4a é o resultado da análise do octeto para a especificidade de ligação preferencial do anticorpo alfa-sinucleína de uma modalidade da presente invenção que se liga preferencialmente ao agregado α-Syn.
[170] Como mostrado nas Fig. 4a, 3A9, 9B11 e 11F11, mostrou-se que dificilmente se ligam a monômeros (caixa pontilhada vermelha), mas se ligam bem aos agregados (gráfico de linha ascendente na caixa pontilhada vermelha). Esses resultados são semelhantes ou consistentes com os resultados das análises Dot blot, Octet e ELISA e mostram que 3A9, 9B11 e 11F11 dos quais a ligação preferencial a agregados é confirmada entre os quatro anticorpos alfa-sinucleína analisados pelos outros métodos descritos acima, vincula apenas a agregados na análise do octeto. A Figura 4b é uma tabela que mostra os resultados da Figura 4a. Os resultados da FIG. 4a e FIG. 4b mostra a ligação preferencial a agregados de alfa-sinucleína e são consistentes com os resultados da Fig. 1. Verificou-se que o anticorpo nº 274 usado como um grupo de controle se ligava bem aos monômeros e agregados.
Exemplo 3. Análise do efeito inibitório do anticorpo anti-alfa-sinucleína na transferência intercelular do agregado de alfa-sinucleína
[171] Uma vez que a transferência intercelular de agregados de alfa-sinucleína é apresentada como uma causa patogênica de doenças relacionadas ao agregado de alfa- sinucleína, os anticorpos capazes de inibi-lo podem ser úteis como agentes terapêuticos. Para este fim, a análise de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) foi realizada da seguinte maneira. O princípio BiFC é mostrado esquematicamente na parte superior da Fig.5.
[172] A Fig. 5 mostra o princípio analisando (parte superior) se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção inibe a transmissão de célula a célula e o resultado experimental. No desenho, a cor azul indica o núcleo e a cor verde é o sinal produzido quando a alfa-sinucleína liberada de fora de uma célula se propaga para dentro de outras células e encontra outra alfa- sinucleína para formar agregados.
Cultura de células para análise BiFC
[173] As linhagens celulares de neuroblastoma humano SH- SY5Y que expressam alfa-sinucleína e metade das proteínas fluorescentes de Vênus (Venus 1-αSyn (V1S) e αSyn-Venus2 (SV2)), respectivamente, foram cultivadas como descrito anteriormente (Lee HJ et al., J 2004; 24: 1888-1896), antes da experiência, 180.000 células expressando V1S e SV2 foram misturadas em uma lamínula e cultivadas por 3 dias. A co- cultura foi subcultivada a cada 48 horas para confirmar a migração intercelular contínua da alfa-sinucleína. Como o grau de transferência foi máximo no número de passagens 6 em uma experiência separada (dados não mostrados), o efeito inibitório do anticorpo no transporte de célula a célula foi analisado usando a co-cultura de seis passagens.
Experimento BiFC/tratamento com anticorpos
[174] No dia antes da imagem, 50 µg/ml de IgG ou anticorpo de teste (3A9, 9B11, 11F11) foram adicionados à co-cultura. O sinal no canal Venus em cada co-cultura representa os agregados produzidos pela agregação de alfa- sinucleína, que foi considerado como o agregado formado pela migração de α-syn de uma célula para outra célula. Esses sinais foram analisados automaticamente com o IN Cell Analyzer (configuração do instrumento: tamanho de puncta: 0,1-0,4 µm, intensidade: 4000-7000). Os resultados são mostrados na Fig. 5.
[175] Especificamente, a cor azul indica o núcleo e a cor verde indica que a liberação de fora de uma célula se propaga para dentro de outras células e encontra outra alfa- sinucleína para formar agregados. O gráfico no lado direito mostra a intensidade do sinal. Nos grupos de tratamento 9B11, 11F11 e 3A9, o número de células mostrando um sinal verde diminuiu em comparação com a IgG de controle negativo. O resultado indica que os anticorpos da presente invenção podem inibir efetivamente a transmissão intercelular de alfa- sinucleína.
Exemplo 4. Análise do efeito de remoção in vivo de agregados de alfa-sinucleína por anticorpo anti-alfa- sinucleína
[176] Para analisar o efeito do anticorpo alfa- sinucleína produzido na presente invenção in vivo, 10 mg/kg de alfa-sinucleína humana ou IgG foram administrados por via intraperitoneal a cada semana por 3 meses a camundongos transgênicos que superexpressam a alfa-sinucleína humana (alfa-sinucleína humana mThy-1, UC San Diego). Seis camundongos por grupo foram utilizados e companheiros de ninhada não transgênicos foram usados como grupo controle.
A perfusão foi realizada da seguinte forma.
[177] Para análise patológica do cérebro, após o término da última administração, os animais foram anestesiados com hidrato de cloral de acordo com os regulamentos humanitários e, em seguida, a perfusão cardíaca foi realizada com solução salina a 0,9%. Metade (seção sagital) do cérebro perfundido foi armazenada em paraformaldeído a 4% em tampão fosfato (pH 7,4, 4 °C) até a análise subsequente e a outra metade foi armazenada em congelado (70 °C) imediatamente.
[178] A análise patológica foi realizada da seguinte forma. A meia seção do cérebro fixada em paraformaldeído foi cortada nas seções contínuas com 40 µm de espessura pelo método de flutuação livre usando um vibratome. Para investigar o nível de expressão da alfa-sinucleína no cérebro do grupo administrado, a seção contendo córtex, estriado e hipocampo foi incubada com anticorpos alfa-sinucleína (anticorpo p129 α-syn como criador de agregados, abcam, ab59264 ou todos os alfa anticorpo anti-sinucleína, Cell Signaling Technology, # 2642) durante a noite a 4 °C. Para investigar a atividade dos astrócitos ou a atividade da micróglia, a seção foi tratada com anticorpo GFAP (proteína ácida fibrilar glial) (AB5804, millipore) ou anticorpo Iba1
(019-19741, Wako) (019-19741, Wako), respectivamente.
A fim de dificultar o grau de neuroinflamação, a seção foi tratada com anticorpo IL-6 (NB600-1131, Novus Biologicals) ou anticorpo IL-1β (ab9722, abcam), respectivamente.
Após incubação com os anticorpos primários, IgG anti-coelho de cabra conjugada com biotina (1:100, Vetor Laboratories) e
Avidin D-rábano-peroxidase (1: 200, ABC Elite, Vetor
Laboratories) foram tratados e detectados com diaminobenzidina (DAB). Cada uma das seções imunocoradas foi observada com um microscópio de campo claro para medir a densidade óptica.
Os resultados são mostrados nas Fig. 6a e
6b.
A Fig. 6a é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral do camundongo usando o anticorpo p-129 α-Syn após a administração do anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode remover o alfa- agregado de sinucleína no modelo de camundongo (TG) que superexpressa a alfa-
sinucleína humana.
No desenho, HP se refere a Hipocampo, p-
129 α-syn se refere a uma forma que possui o 129º resíduo fosforilado e um gerador de agregado, e a seta indica a alfa-
sinucleína fosforilada.
[179] A Fig. 6a é um resultado da análise usando o anticorpo p-129 α-Syn como fabricante para detectar agregados de alfa-sinucleína e mostra que o nível agregado diminuiu significativamente em CA1 e CA3 do córtex e hipocampo de camundongos TG (TransGenic) administrados pelo anticorpo preparado em uma modalidade da presente invenção, em comparação com o mouse de controle administrado apenas por IgG (a parte relevante é indicada como ponta de seta na amostra de IgG). Estes resultados representam que o anticorpo da presente invenção pode remover significativamente a alfa- sinucleína. WT e IgG são controles negativos e o anticorpo 274 é um grupo comparativo que se liga ao monômero e ao agregado. Estes resultados representam que o anticorpo da presente invenção pode inibir efetivamente o acúmulo de agregado de alfa-sinucleína e, portanto, pode ser efetivamente utilizado para a prevenção e/ou tratamento de doenças associadas à etiologia da alfa-sinucleína.
[180] A Fig. 6b é um resultado da mesma experiência substancial da Fig. 6a, mas é obtida por coloração com anticorpo contra todas as alfa-sinucleínas como um fabricante. A seta indica alfa-sinucleína humana. O aumento da alfa-sinucleína humana no camundongo TG foi efetivamente removido pela administração dos anticorpos. Estes resultados indicam que o anticorpo de acordo com a presente invenção reduz efetivamente o agregado de alfa-sinucleína e pode ser efetivamente usado para o tratamento de α-sinucleinopatia, como a doença de Parkinson. Os anticorpos 9B11, 11F4 e 11F11 inibiram efetivamente o acúmulo de todas as alfa- sinucleínas. A detecção de toda a alfa-sinucleína indica que o anticorpo de acordo com a presente invenção tem a capacidade de limpar a própria alfa-sinucleína (compensação) e inibir a transferência intercelular (transmissão célula a célula). Em outro aspecto, também pode ser interpretado como inibindo a formação de agregados a partir de monômeros ou removendo todos os monômeros.
Exemplo 5: Análise para a redução da microgliose e astrogliose e redução da liberação de citocinas inflamatórias pelo anticorpo anti-alfa-sinucleína
[181] A gliose é uma reação inespecífica nas células da glia que responde ao dano do sistema nervoso central desencadeado por dano BBB, TGF-beta ou interleucina.
Exemplos representativos incluem microgliose e astrogliose, para os quais cada uma das proteínas Iba-1 e GFAP é usada como marcador, respectivamente. Como descrito no Exemplo 4, o efeito do anticorpo de acordo com a presente invenção na redução da microgliose e astrogliose e a redução da liberação de citocinas inflamatórias que as desencadeiam foram analisados pela administração do anticorpo ao camundongo. Os resultados são mostrados nas Figs. 7a, 7b, 7c e 7d.
[182] A Fig. 7a é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo Iba-1 (microgliose) como marcador após a administração de anticorpo ao camundongo, para testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir a microgliose in vivo, e a seta indica a microglia ativada. Foi confirmado que a ativação da microglia foi significativamente reduzida no camundongo administrado com os anticorpos 3A9, 9B11 e 11F11.
[183] A Fig. 7b é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral do camundongo com anticorpo GFAP (astrogliose) como marcador após a administração de anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir a astrogliose in vivo e a seta indica o astrócito ativado. Foi confirmado que os anticorpos 3A9, 9B11 e 11F11 inibiram efetivamente a astrogliose a um nível significativo.
[184] A Fig. 7c é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo IL-1 beta (IL- 1β) como marcador após a administração de anticorpo ao camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir as citocinas inflamatórias in vivo, e a seta indica as células que expressam IL-1 beta. A IL-1 beta causa inflamação e, portanto, induz a morte e a resposta inflamatória de várias células nervosas. A IL-1 beta foi significativamente reduzida no tecido cerebral do rato administrado com o anticorpo de acordo com a presente invenção.
[185] A Fig. 7d é um resultado da coloração e medição do tecido cerebral de camundongo com anticorpo IL-6 como marcador após a administração de anticorpo para camundongo, a fim de testar se o anticorpo monoclonal preparado em uma modalidade da presente invenção pode reduzir as citocinas inflamatórias em vivo, e a seta indica as células que expressam IL-6. A IL-6 foi reduzida no tecido cerebral do rato administrado com o anticorpo de acordo com a presente invenção.
[186] Como mostrado nos desenhos, verificou-se que os anticorpos da presente invenção reduzem a microgliose e a astrogliose e reduzem a liberação das citocinas inflamatórias da IL-1beta e IL-6, que acionam a microgliose e a astrogliose, em comparação com o grupo controle.
Exemplo 6. Detecção do corpo de Lewy no tecido cerebral humano por anticorpo anti-alfa-sinucleína
[187] O corpo de Lewy e o neurite de Lewy nas seções cerebrais embebidas em parafina em uma espessura de dez micrômetros obtidos de pacientes que morreram da doença de Parkinson (Dr. Halliday, Universidade de Sydney) foram corados usando o anticorpo usado no Exemplo 5 como a seguir.
As seções de tecido foram tratadas com ácido fórmico a 90% por 3 minutos para processar a recuperação de antígeno e, em seguida, a atividade peroxidase do próprio tecido foi inibida por 1% de H2O2 (50% de base de etanol). Tratou-se 10% de soro de cavalo normal para impedir a ligação não específica dos tecidos. Posteriormente, após lavagem com tampão fosfato, as seções adjacentes foram tratadas com anticorpos 3A9, 11F11 e 11F11 da presente invenção a 4 °C durante a noite. Após lavagem com tampão fosfato, o anticorpo IgG anti-humano conjugado com biotina foi tratado a 37 °C por 30 minutos e o complexo avidina-biotina reagiu à temperatura ambiente por 30 minutos (kit Vectastatin Elite; kit Vetor Laboratories).
Em seguida, a cor foi desenvolvida com DAB contendo 0,005% de H2O2 e as seções foram contra-coradas com 0,5% de violeta de cresil, para discriminar cada célula. Os resultados são mostrados nas Figs. 8a e 8b.
[188] As Fig. 8a e Fig. 8b mostram o resultado da medição de que os anticorpos monoclonais de 3A9 e 11F11 de acordo com uma modalidade da presente invenção podem reconhecer especificamente os corpos de Lewy e os neurites de Lewy no tecido cerebral humano, respectivamente. Eles mostram que os anticorpos da presente invenção se ligam aos corpos de Lewy (seta) e às neurites de Lewy (forma de fio na parte inferior esquerda).
[189] Como mostrado nas Fig. 8a e Fig. 8b, mostrou-se que o anticorpo da presente invenção se liga efetivamente ao corpo de Lewy e à neurite de Lewy (indicado por uma seta).
Estes resultados sugerem que é capaz de se ligar efetivamente ao agregado de alfa-sinucleína de um componente do corpo de Lewy no tecido cerebral humano. Demonstra-se que os anticorpos entregues ao cérebro humano podem efetivamente e especificamente se ligar ao agregado de alfa-sinucleína.
Estes resultados indicam que os anticorpos da presente invenção podem se ligar especificamente, especificamente a agregados de alfa-sinucleína no tecido cerebral humano e podem ser efetivamente utilizados para a prevenção e/ou tratamento de doenças associadas à etiologia da alfa- sinucleína.
Exemplo 7. Análise de epítopo do anticorpo anti-alfa- sinucleína
[190] O mapeamento de epítopos para os anticorpos 3A9 e 11F11 da presente invenção foi realizado solicitando PEPSCAN (Holanda) para análise de alelos peptídicos. Os resultados são mostrados na Fig. 9. A Fig. 9 é uma representação esquemática dos resultados do mapeamento de epítopos para os anticorpos de uma modalidade da presente invenção.
[191] Como mostrado na Fig. 9, foi demonstrado que a maioria dos anticorpos da presente invenção se liga à região C-terminal. Os anticorpos alfa-sinucleína que reconhecem o terminal N não conseguiram reconhecer os agregados de outras doenças, como atrofia de múltiplos sistemas pertencentes a sinucleinopatias que coletivamente se referem a doenças relacionadas à alfa-sinucleína. Em contraste, os anticorpos alfa-sinucleína que reconhecem a região C-terminal têm uma vantagem em reconhecer os agregados de outras várias sinucleinopatias, bem como a doença de Parkinson.
Particularmente, como descrito acima, demonstrou-se que os anticorpos que reconhecem a região entre 110 e 122 resíduos se ligam preferencialmente aos agregados.
Exemplo 8. Preparação de anticorpos anti-alfa- sinucleína (quiméricos) Clonagem
[192] Utilizando as sequências nucleotídicas da região variável da cadeia pesada e o anticorpo da região variável da cadeia leve obtido após a humanização, sintetizou-se o gblock (m.biotech) de um pequeno fragmento de nucleotídeo e clonou-se no vetor de cultura de células animais (pcDNA3.4).
O gblock foi sintetizado incluindo cerca de 20 pb de sobreposição de sequências antes e depois da região variável, e a parte do vetor pcDNA3.4 excluindo a região variável foi amplificada por PCR e clonada pelo método de montagem de Gibson.
Transfecção e Expressão
[193] O vetor preparado foi utilizado para maxi-prep (Qiagen) para obter uma grande quantidade de DNA plasmídico e depois introduzido nas células como se segue. No dia anterior à transfecção, a concentração de células ExpiCHO™ (Gibco, Cat: A29127) foi ajustada para a concentração de 3 x 10E6 a 4 x 10E6 células viáveis/mL no meio de expressão ExpiCHO™ (Gibco, Cat: A29100-01) e cultivadas a 8% de CO2, a 37 °C e 120 rpm por 1 dia. No dia da transfecção de DNA, as células que cresceram para 7 x 10E6 a 10 x 10E6 células viáveis/mL e tiveram taxas de sobrevivência de 95% ou mais foram preparadas por diluição usando meio fresco. A 6 x 106 células viáveis/mL.
[194] Para transfectar as células progenitoras, o ExpiFectamine™ CHO e o complexo de DNA do plasmídeo foram preparados usando o kit de transfecção ExpiFectamine™ CHO (Gibco, Cat: A29129). Os reagentes DNA e ExpiFectamine™ CHO foram preparados em concentrações apropriadas dispensando o meio frio OptiPRO™ SFM® (Gibco, Cat: 12309019), foram inoculados respectivamente e misturados para repousar à temperatura ambiente por 5 minutos. O produto foi inoculado nas células progenitoras e cultivado após a transfecção. No dia após a transfecção, o intensificador e a alimentação incluídos no kit de transfecção ExpiFectamine™ CHO foram inoculados em células transfectadas e, após 5 dias, a alimentação foi inoculada adicionalmente, seguida de incubação por 10 dias a 8% de CO2, 37 °C e 120 rpm para produzir as células transfectadas.
[195] Para obter a solução de cultura, o meio de cultura é transferido para um frasco de centrifugação para centrifugação e centrifugado a 4 °C e 6500 rpm por 30 minutos, seguido de filtragem com um filtro de tamanho de 0,2 µm para obter um meio de cultura com remoção de sólidos em suspensão e, em seguida, o meio de cultura foi utilizado para purificação subsequente.
Purificação de anticorpos
[196] A cultura foi purificada usando o HiTrap MabSelectSure (GE Healthcare, 11-0034-94). Depois de equilibrar com um tampão de equilíbrio (Tris-HCl 50 mM, pH 7,2, NaCl 100 mM), a cultura recuperada foi carregada em uma coluna. Quando a carga foi concluída, o meio foi lavado com citrato de sódio 50 mM (pH 5,0) e depois eluído usando citrato de sódio 50 mM (pH 3,4). Tris-HCl 1M pH 9,0 foi adicionado ao eluato para neutralizar para pH 6,0. Em seguida, o eluato foi trocado por tampão e concentrado com PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) e armazenado a 4 °C até o uso subsequente. Quando uma purificação adicional foi necessária, uma segunda purificação foi realizada com base no tamanho da amostra eluída passando o primeiro produto purificado através de tampão 1X PBS na coluna HiLoad 26/600 superdex 200. A sequência de aminoácidos do anticorpo purificado foi analisada por espectrometria de massa e confirmada como consistente com a região variável do anticorpo monoclonal derivado de camundongo.
[197] A porção da região variável da coluna vertebral do isotipo IgG1 humano foi substituída pelas regiões variáveis dos anticorpos 3A9, 9B11 e 11F11 identificados pelo método acima para preparar um anticorpo IgG1 humano quimérico. Entre os anticorpos quiméricos obtidos, especialmente o anticorpo Ch11F11 é um anticorpo na forma de IgG e compreende uma combinação da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 90 (ch11F11-VH) e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO : 109 (ch11F11-VL) e o anticorpo Ch 3A9 é um anticorpo na forma de IgG e compreende uma combinação da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 102 (ch11F11-VH) e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 116 (ch11F11-VL).
Exemplo 9: Preparação do anticorpo humanizado Preparação de fagos para bibliotecas
[198] Uma mini-biblioteca na qual um camundongo ou uma sequência derivada de humanos foi introduzida em cada resíduo de CDR foi construída, enquanto ligava a estrutura humana aos resíduos de CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo quimérico.
[199] As células competentes da biblioteca min produzida foram inoculadas em meio 2X YT [17 g de Tripton (CONDA,
1612,00), 10 g de extrato de levedura (CONDA, 1702,00) e 5 g de NaCl (Sigma, S7653)] contendo 34 µg/ml de cloranfenicol (Sigma, C0857), glicose a 2% (Sigma, G5400) e MgCl2 5 mM (Sigma, C0857) a 30 °C durante 3 horas para ser DO600 de 0,5 a 0,7. Em seguida, as células foram infectadas com um fago auxiliar e cultivadas em meio 2X YT contendo 34 µg/ml de cloranfenicol, 5 mM MgCl2, 70 µg/ml de canamicina (Sigma, K1876) e 1 mM IPTG (ELPISBIO, IPTG025) em 30 °C por 6 horas para induzir a embalagem do fago. A solução de cultura foi centrifugada a 4500 rpm a 4 °C por 15 minutos. O sobrenadante foi adicionado com PEG 6000 a 4% (Fluka, 81253) e NaCl a 3% (Sigma, S7653) e incubado durante 1 hora em gelo. O produto foi centrifugado a 8000 rpm por 20 minutos a 4 °C e, em seguida, o sedimento foi suspenso em PBS e centrifugado novamente a 4 °C e 12.000 rpm por 10 minutos para obter um sobrenadante contendo a biblioteca de fagos. O sobrenadante obtido foi armazenado a 4 °C até o uso subsequente.
Panorâmica de exibição de fagos
[200] Para selecionar anticorpos que se ligam preferencialmente a agregados de alfa-sinucleína aos monômeros, o pan foi realizado usando os agregados de alfa- sinucleína completos preparados no Exemplo 1, e o total de três pan foi realizado da seguinte forma.
[201] A albumina sérica bovina (BSA) foi adicionada às células a uma concentração de 3% em um tubo de ensaio a 4 °C durante a noite, adicionando 10 µg/ml de agregados e monômeros de alfa-sinucleína recombinantes ao PBS em um imunotubo (maxisorp 444202) foi adicionada solução ao tubo de ensaio e a superfície da qual os agregados e monômeros de alfa-sinucleína não foram adsorvidas foi protegida.
Após esvaziar o tubo de ensaio, a biblioteca de fagos de anticorpos de 1012 CFU dispersa em solução de BSA a 3% foi colocada no imunotubo em que os agregados e monômeros de alfa-sinucleína foram absorvidos e reagiram por 1 hora
(seleção negativa). Em seguida, os fagos não foram ligados aos agregados de alfa-sinucleína e os monômeros foram recuperados e reagiram por 2 horas à temperatura ambiente nos agregados de alfa-sinucleína e os monômeros foram adsorvidos.
Solução salina tamponada com fosfato (0,05%
Tween 20) foi usada para recuperar 100 µM de solução de trietilamina, que foi recuperada usando uma solução de PBS-
E. coli a 37 °C por 1 hora, e a E. coli infectada foi pintada em um meio de ágar 2X YT e cultivada a 37 °C durante a noite (pH 7,4), elas foram infectadas por ER2537. No dia seguinte, a E. coli cultivada foi suspensa em 4 ml de solução de cultura 2X YT contendo carbenicilina e 15% de glicerol,
e uma parte foi armazenada a -80 ℃ e o restante foi usado para preparar fagos para as próximas experiências.
Repetindo esse processo em 3 rodadas no total, o pool de fagos específicos para o antígeno alfa-sinucleína foi amplificado e concentrado. À medida que a ronda de panning avançava, o número de lavagens usando PBS-T foi aumentado para amplificar e concentrar o fago específico do antígeno.
Triagem de clone único
[202] Para classificar anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao agregado de alfa-sinucleína do pool de fagos obtido através do pan, foi realizada a experiência a seguir.
[203] Para isolar monoclones da piscina concentrada, após pintar a piscina de fagos em meio de ágar LB- tetraciclina/carbenicilina e cultivar, uma única colônia foi assegurada. Em seguida, após a inoculação de monoclones em uma placa de 96 cavidades, na qual foram colocados 400 µl de meio 2T YT-tetraciclina/carbenicilina por cavidade e crescendo durante a noite, solução de cultura de 10 on foi colocada em uma nova placa de 96 cavidades, na qual 390 µl do meio 2X YT-tetraciclina/carbenicilina foi colocado e foi cultivado a 37 °C por 4 horas. 1 mM de IPTG foi colocado na solução de cultura e cultivado a 30 °C durante a noite. A solução de cultura cultivada durante a noite foi centrifugada para tomar um sobrenadante.
[204] Em seguida, os clones que expressam um scFv solúvel em monoclone que se liga ao agregado de alfa-sinucleína foram selecionados usando o método ELISA da seguinte forma (Steinberger. Rader e Barbas III. 2000. Vetores de exibição de fagos. Em: Manual de Laboratório de Exibição de Fagos.
1sted. Cold Sprin gHarbor Laboratory Press, NY, EUA, pp.11.9-
11.12). especificamente, o anticorpo 7B7 selecionado no Exemplo 1-1 foi colocado em uma placa de 96 cavidades (Nunc- Immuno Plates, NUNC, EUA) e foi revestido a 4 °C durante a noite. BSA a 3% foi adicionado a cada cavidade em uma quantidade de 200 µl, seguido de bloqueio a 37 °C por 2 horas. Em seguida, os agregados de alfa-sinucleína e o monômero foram carregados a uma concentração de 100 ng/cavidade, reagiram a 37 °C por 2 horas e lavados cinco vezes com 300 µl de PBS-T. O sobrenadante de clone único preparado foi misturado com BSA a 3% em uma proporção de volume de 1:1 (vol: vol), e 100 µl da solução foram carregados na placa ligada ao agregado e ao monômero, seguido de reação a 37 °C por 2 horas. As células foram lavadas cinco vezes com 300 µl de PBS-T e incubadas a 37 °C por 1 hora com um anticorpo anti-HA-HRP conjugado, seguido de lavagem com PBS-T cinco vezes. Depois de adicionar 100 µl de TMB (Tetrametilbenzidina, Sigma, T0440), a reação foi interrompida pela adição de 50 µl de H2SO4 1 N para medir a absorbância a 450 nm. Os clones com uma absorbância igual ou superior a 0,5 foram considerados reação positiva por ligação e os clones que se ligam à BSA de maneira não específica foram excluídos.
[205] Os resíduos CDR dos clones encontrados na biblioteca são analisados em silico em paralelo e os clones causam sérios problemas com a ligação à estrutura ou clones que não possuem epítopo de célula T, epítopo de célula B e epítopo MHCII nas partes da estrutura que CDR foram selecionados.
[206] Posteriormente, para cinco anticorpos preparados pela seguinte combinação de regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, a região variável do anticorpo humanizado do isotipo IgG1 humano foi substituída pela porção da região variável do esqueleto para preparar cinco anticorpos humanizados do esqueleto IgG1. Especificamente, Hu11F11_ (ABL2-4) é um anticorpo do tipo IgG e inclui uma combinação da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 92 (Hu11F11-VH2) e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 113 (Hu11F11 -VL4).
Hu11F11_ (ver.1) é um anticorpo do tipo IgG e inclui uma combinação da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 98 (Hu11F11-VH-v1) e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 115 (Hu11F11) -VLv3 4c). Hu11F11_ (ver.2) é um anticorpo do tipo IgG e inclui uma combinação da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 99 (Hu11F11-VH-v2) e variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 115 (Hu11F11-VLv3 4c) Hu11F11_ (ver.3) é um anticorpo do tipo IgG e inclui a sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 100 (Hu11F11-VH-v3) e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 115 (Hu11F11-VLv3 4c).
[207] Hu11F11 (ver.4) é uma combinação da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 101 (Hu11F11- VH-v4) e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 115 (Hu11F11-VLv3 4c).
Exemplo 10. Análise da atividade promotora de fagocitose de anticorpo humanizado
[208] Para testar a eficácia de promover a ação fagocítica das células microgliais aos agregados extracelulares de alfa-sinucleína, para o anticorpo quimérico obtido no Exemplo 8 e os anticorpos humanizados obtidos no Exemplo 9, hu11F11 (ver.1), hu11F11 (ver.2), hu11F11 (ver.3), hu11F11 (ver.4) e ABL2-4, a atividade de promoção da fagocitose foi analisada da seguinte forma.
[209] Especificamente, a linhagem celular de microglia de camundongo BV-2 foi cultivada com RPMI1640 e 10% de FBS, preparada a uma concentração de 2X106 células/ml, e depois distribuída 100 ul em placas de 96 cavidades de fundo em U.
Os agregados de alfa-sinucleína e os anticorpos quiméricos 11F11 ou Hu11F11_11F11 (ver.1) ou Hu11F11_11F11 (ver.2) ou Hu11F11_11F11 (ver.3) ou Hu11F11_11F11 (ver.4) ou Hu11F11_ABL2-4 preparados nos Exemplos 8 e 9 foram incubados em temperatura ambiente por 20 minutos, e sua mistura foi adicionada às linhagens celulares BV-2 em placa de 96 cavidades e reagiu por 15 minutos. Após remover agregados de alfa-sinucleína não ligados e anticorpos com centrífuga a
1.200 rpm por 5 minutos, as células foram fixadas com formaldeído a 4%, lavadas três vezes e permeabilizadas com triton X-100 a 0,5%. A sinucleína que reconhece o anticorpo (Santa Cruz) foi incubada por 1 hora, lavada 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 e depois incubada por 1 hora com o anticorpo anti-coelho-Alexa-488. Em seguida, o resultante foi lavado e analisado pelo calibre FACS. Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 12a e FIG. 12b, que mostram os resultados da análise da capacidade de anticorpos quiméricos e humanizados para promover a fagocitose de células microgliais para agregados de alfa-sinucleína. A Fig. 10a se refere ao anticorpo 11F11 humanizado, e a FIG.
10b se refere a 3A9 humanizado.
[210] Como mostrado na FIG. 10a e Fig. 10b, o anticorpo quimérico descrito na presente invenção aumentou a captação de agregados de alfa-sinucleína em cerca de 2 vezes em comparação com o grupo de controle de IgG, e os anticorpos humanizados aumentaram em até 4 vezes. Entre eles, as variantes de anticorpo humanizado de 11F11, a saber Hu11F11_ABL2-4 (combinação de Hu11F11-VH2 e Hu11F11-VL4), Hu11F11_ (ver.1) (combinação de Hu11F11-VH-v1 e Hu11F11-VLv3 4c) e Hu11F11_ (ver.2) (combinação de Hu11F11-VH-v2 e
Hu11F11-VLv3 4c) teve excelentes atividades para promover a fagocitose de BV-2 em comparação com o anticorpo quimérico 11F11. Hu11F11_ (ver.3) (combinação de Hu11F11-VH-v3 e Hu11F11-VLv3 4c) e hu11F11_ (ver.4) (combinação de Hu11F11- VH-v4 e Hu11F11-VLv3 4c) mostraram atividades para promover fagocitose similares ao do anticorpo quimérico 11F11.
Exemplo 11: Ensaio de ligação à fibrila
[211] Foi realizado um ensaio de ligação às fibrilas para analisar a eficácia de um anticorpo para inibir a ligação dos agregados de alfa-sinucleína às células nervosas, ou seja, o estágio avançado do fenômeno no qual os agregados de alfa-sinucleína foram transmitidos às células nervosas vizinhas através da propagação intercelular.
[212] Especificamente, as células SH-SY5Y, que são linhagens celulares neuronais, foram tratadas por 10 minutos com 1 uM de agregados de alfa-sinucleína e 20 nM de cada anticorpo quimérico 11F11 e variantes 11F11 humanizadas, ou seja, Hu11F11_ver1, Hu11F11_ver2, Hu11F11_ver3, Hu11F11_ver4 e Hu11F11_ABL2-4. Em seguida, as células foram fixadas com formaldeído a 4%. Após a lavagem, o anticorpo alfa-sinucleína (BD) que reconhece todas as formas de alfa-sinucleína em condições não permeáveis foi tratado com 1: 250, lavado e fotografado com um microscópio confocal. Os núcleos celulares foram mostrados pelo tratamento com DAPI imediatamente antes da imagem.
[213] Como resultado, os anticorpos do presente pedido reduziram efetivamente o grau de ligação à membrana celular dos agregados de alfa-sinucleína em comparação com o grupo controle IgG e, especialmente, os anticorpos humanizados de 11F11 reduziram o grau de ligação de maneira semelhante ou mais eficiente que o quimérico 11F11. anticorpo. A Fig. 11 é um resultado da análise da capacidade do anticorpo quimérico e dos anticorpos humanizados da presente invenção para inibir a ligação de agregados de alfa-sinucleína à superfície das células nervosas.
[214] Como mostrado na FIG. 11, os anticorpos da presente invenção reduziram efetivamente o grau de ligação à membrana celular dos agregados de alfa-sinucleína em até 23 vezes em comparação com o grupo de controle IgG e, especialmente, os anticorpos humanizados de 11F11 reduziram o grau de ligação de maneira semelhante ou mais eficiente do que o anticorpo quimérico 11F11. Hhu11F11_ (ver.1) (combinação de Hu11F11- VH-v1 e Hu11F11-VLv3 4c), hu11F11_ (ver.3) (combinação de Hu11F11-VH-v3 e Hu11F11-VLv3 4c) e hu11F11_ (ver.4) (A combinação de Hu11F11-VH-v4 e Hu11F11-VL-v3 4c) mostrou eficácia superior em comparação com o anticorpo quimérico 11F11. ABL2-4 (combinação de Hu11F11-VH2 e Hu11F11-VL4) e hu11F11 (ver.2) (Hu11F11-VH-v2 e Hu11F11-VLv3 4c) apresentaram capacidade de redução semelhante ao anticorpo quimérico 11F11.
Exemplo 12: Ensaio de câmara dupla
[215] O ensaio de dupla câmara foi realizado para analisar mais diretamente a eficácia dos anticorpos humanizados da presente invenção para inibir a propagação intercelular de agregados de alfa-sinucleína. Após o plaqueamento das células SH-SY5Y (células doadoras) que superexpressam a alfa-sinucleína na inserção equipada com membrana permeável, e as células SH-SY5Y normais (células receptoras) em uma lamela em uma placa de 12 cavidades, respectivamente, a inserção incluindo as linhagens celulares cultivadas a sobre expressão alfa-sinucleína foi sobreposta no topo e incubada durante a noite. Ao mesmo tempo, as células receptoras foram tratadas com 20 nM do anticorpo da presente invenção. Em seguida, as células receptoras foram fixadas com formaldeído a 4%, lavadas e depois tratadas com TrtonX-100 a 0,5% para criar uma condição permeável. Após a lavagem, o mesmo anticorpo de detecção e DAPI usado no Exemplo 14 foram tratados e fotografados com um microscópio confocal. A imagem analisada é mostrada na FIG. 12.
[216] Como resultado, os anticorpos humanizados da presente invenção reduziram efetivamente o grau de propagação de agregados de alfa-sinucleína às células receptoras em comparação com o grupo controle IgG e, especialmente, os anticorpos humanizados de 11F11 reduziram a propagação de agregados de alfa-sinucleína ao receptor células semelhantes ou mais eficientemente do que o anticorpo quimérico 11F11.
[217] FIG. 12 é um resultado da análise da eficácia de anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados da presente invenção para inibir a transmissão intercelular na qual os agregados de alfa-sinucleína são secretados a partir de células nervosas que superexpressam a alfa-sinucleína e transferem para células nervosas normais. As linhagens celulares nervosas SH-SY5Y superexpressando alfa-sinucleína banhada na câmara superior secretaram alfa-sinucleínas fora da célula, e as alfa-sinucleínas segregadas foram transferidas para a linhagem celular normal SH-SY5Y banhada na placa inferior de 12 cavidades. Os anticorpos da presente invenção reduziram significativamente a quantidade de alfa- sinucleína inflexa na linhagem celular SH-SY5Y normal da placa de fundo. Em particular, os anticorpos humanizados do clone 11F11 entre os anticorpos humanizados da presente invenção mostraram aumentar ainda mais o grau de redução de alfa-sinucleínas infladas nas células receptoras na placa inferior em comparação com os anticorpos quiméricos. Mais especificamente, hu11F11 (ver.2) (combinação de Hu11F11-VH- v2 e Hu11F11-VLv3 4c) e hu11F11 (ver.4) (combinação de Hu11F11-VH-v4 e Hu11F11-VLv3 4c) apresentaram atividade inibidora superior a anticorpo quimérico e Hu11F11 (ver.1) (combinação de Hu11F11-VH-v1 e Hu11F11-VLv3 4c) e hu11F11
(ver.3) (combinação de Hu11F11-VH-v3 e Hu11F11-VLv3 4c) apresentaram capacidade inibitória semelhante ao anticorpo quimérico.
[218] O grau de propagação dos agregados de alfa- sinucleína foi efetivamente reduzido em até cerca de 22 vezes pelos anticorpos humanizados do clone 11F11, em comparação com o grupo controle IgG. Em particular, os anticorpos humanizados de 11F11 reduziram a propagação de agregados de alfa-sinucleína às células receptoras de maneira semelhante ou mais eficiente que os anticorpos quiméricos 11F11.
Exemplo 13. Análise ELISA do anticorpo humanizado
[219] O ELISA sanduíche foi realizado para analisar quantitativamente a afinidade de ligação do anticorpo quimérico (Ch11F11) obtido no Exemplo 8, e os anticorpos humanizados (Hu11F11) obtidos no Exemplo 9, de acordo com o método substancialmente o mesmo do Exemplo 2-2.
[220] Especificamente, cada anticorpo foi diluído na proporção de 1/10 das concentrações de 0,04 a 400 nM e foi revestido em uma placa de 96 cavidades e, em seguida, cada cavidade foi tratado com agregados de fibrina sinucleína e tratados a 2000 ng/ml. Após lavagem com 1XPBS, a estreptavidina conjugada com HRP e o anticorpo secundário conjugado com biotina foi tratada e depois reagiu com TMB como substrato. A absorbância foi medida. Os resultados são mostrados na FIG.13.
[221] Como mostrado na FIG. 13, foi confirmado que os anticorpos humanizados de acordo com a presente invenção, especialmente os anticorpos humanizados (anticorpos 11F11 humanizados) derivados do anticorpo quimérico 11F11, mostraram a afinidade de ligação equivalente ao clone 11F11 quimérico. Os anticorpos humanizados, especialmente as variantes derivadas do clone 11F11, como hu11F11 (ver.1), incluindo uma combinação de Hu11F11-VH-v1 e Hu11F11-VLv3 4c, hu11F11 (ver.2), incluindo uma combinação de Hu11F11-VH-v2 e Hu11F11-VLv3 4c, hu11F11 (ver.3) incluindo uma combinação de Hu11F11-VH-v3 e Hu11F11-VLv3 4c, hu11F11 (ver.4) incluindo uma combinação de Hu11F11-VH-v4 e Hu11F11-VLv3 4c mostraram a afinidade de ligação equivalente ao clone 11F11 quimérico, e seus valores de EC50 eram de 11,5 a 15,1 nM, que eram semelhantes a 12,5 nM de EC50 de anticorpo quimérico 11F11.
Exemplo 14: Análise BIAcore usando anticorpo anti-alfa- sinucleína
[222] A análise BIAcore foi realizada para analisar quantitativamente a afinidade de ligação dos anticorpos quiméricos (Ch11F11) obtidos no Exemplo 8 e os anticorpos humanizados (Hu11F11) obtidos no Exemplo 9, de acordo com o mesmo método do Exemplo 2-3. Os resultados da análise são mostrados na Fig. 14 e na tabela a seguir.
Tabela 10 Nome do clone KD(nM) Ch11F11 0,02472 Hu11F11_v2 0,0596 Hu11F11_v3 0,0316 Hu11F11_v4 0,0204
[223] Como resultado, os anticorpos humanizados da presente invenção, especialmente as variantes do clone 11F11, que é hu11F11 (ver.2) (combinação de Hu11F11-VH-v2 e Hu11F11-VLv3 4c), hu11F11 (ver.3) (combinação de Hu11F11-VH- v3 e Hu11F11-VLv3 4c) e hu11F11 (ver.4) (combinação de Hu11F11-VH-v4 e Hu11F11-VLv3 4c) apresentaram valores de KD semelhantes aos do clone 11F11 quimérico. Quanto à afinidade de ligação, os clones humanizados apresentaram valores de KD tão baixos quanto 0,02 ~ 0,06 X 10-9 M e o clone quimérico 11F11 mostraram valores de KD tão baixos quanto 0,02 X 10-9 M, o que indicava que eles tinham alta afinidade de ligação ao agregados.
Exemplo 15. Avaliação da produtividade do anticorpo humanizado
[224] O anticorpo quimérico 11F11 e quatro (4) variantes de anticorpo humanizado de 11F11 (Hu11F11 (ver.1), Hu11F11 (ver.2), Hu11F11 (ver.3), Hu11F11 (ver.4)) foram obtidos por transfecção e cultura, primário e purificação secundária de acordo com substancialmente o mesmo método do Exemplo 8, e a quantidade e a pureza do anticorpo nas amostras finalmente purificadas foram analisadas.
[225] A quantidade de anticorpos foi analisada com o espectrofotômetro Thermo Scientific™ NanoDrop™.
Especificamente, após o ajuste do ponto zero carregando 1XPBS, uma certa quantidade de amostra de anticorpo purificada foi carregada e medida no comprimento de onda UV de 280 nm. O rendimento total foi obtido multiplicando a concentração da amostra medida pelo NanoDrop™ com o volume total da amostra e, em seguida, a produtividade (rendimento (g/L)) foi obtida dividindo-se o rendimento total pelo volume total. A pureza do produto finalmente purificado foi analisada com HPLC HLC-001 (Agilent 1200 series).
Especificamente, a pureza foi obtida analisando quantitativamente a razão do pico principal usando 1X PBS e 200 mM de Arginina-HCl (pH 6,8) como fase móvel no gel TSK G3000SWXL. Os resultados da análise de produtividade são mostrados na tabela.
Tabela 11 Amostra de concentração Pureza Produção anticorpo (mg/mL) (% em peso da (g/L) injeção) Ch11F11(-RD) 5,2 99,5 0,282 Hu11F11_v1 5 100 0,155 Hu11F11_v2 15 98,96 0,423 Hu11F11_v3 5 100 0,100 Hu11F11_v4 5 99,87 0,068
[226] Como resultado, o anticorpo quimérico 11F11 e as variantes de anticorpo humanizado de 11F11, como hu11F11 (ver.1) (combinação de Hu11F11-VH-v1 e Hu11F11-VLv3 4c),
hu11F11 (ver.2) (combinação de Hu11F11-VH- v2 e Hu11F11-VLv3 4c), hu11F11 (ver.3) (combinação de Hu11F11-VH-v3 e Hu11F11- VLv3 4c) ou hu11F11 (ver.4) (combinação de Hu11F11-VH-v4 e Hu11F11-VLv3 4c) teve 0,068 ~ 0,423 g/L de produtividade, que foi maior que o rendimento do anticorpo produzido por transfecção transitória em geral. Particularmente, hu11F11 (ver.2) (combinação de Hu11F11-VH-v2 e Hu11F11-VLv3 4c) apresentou 0,423 g/L de produtividade, que foi superior a 0,282 g/L de anticorpo quimérico 11F11.
Exemplo 16. Avaliação da ligação específica à alfa- sinucleína pelo anticorpo quimérico
[227] Depois de produzir três anticorpos quiméricos de 3A9, 9B11 e 11F11 de acordo com o Exemplo 8, as especificidades de ligação dos anticorpos à alfa-sinucleína foram comparadas com os resultados da análise ELISA da beta- sinucleína e gama-sinucleína, que eram homólogos da alfa- sinucleína.
[228] Para realizar a avaliação, cada uma das proteínas beta-sinucleína humana (Uniprot: Q16143) (CUSABIO, Cat: CSB- EP624090HU) e proteínas gama-sinucleína humana (Uniprot: O76070) (CUSABIO, Cat: CSB-EP021915HU) foram revestidas em 96 - bem a placa na concentração de 100 ng/ml, lavada e depois bloqueada com BSA a 5% por 2 horas. Neste momento, o anticorpo pan-Syn (santacruz, Cat: FL-140, sc-10717, coelho) que se liga a todas as alfa-sinucleínas, beta-sinucleínas e gama-sinucleínas foram utilizados como controle positivo.
Após a lavagem, os anticorpos quiméricos (3A9, 9B11, 11F11) diluídos para 1/10 de concentração de 400 nM a 0,04 nM, foram tratados por 2 horas, lavados com PBS e depois tratados com anticorpos anti-hFc de cabra ligados a HRP como anticorpos de detecção. Depois disso, a absorbância foi medida em 450 nm e 650 nm após reagir com o TMB como substrato. Para o controle positivo, anti-coelho de cabra ligado ao HRP foi usado como um anticorpo de detecção.
[229] Os resultados experimentais são mostrados nas Fig.
15a e Fig. 15b. A Fig. 15a e a Fig. 15b são resultados da análise ELISA mostrando que os anticorpos quiméricos (3A9, 9B11, 11F11) tinham afinidades de ligação muito baixas à beta-sinucleína humana e gama-sinucleína humana. Em contraste, o anticorpo pan-Syn como controle positivo mostrou altas afinidades de ligação à beta-sinucleína e gama- sinucleína. A figura 15a se refere a beta-sinucleína humana e a figura 15b se refere a gama-sinucleína humana.
[230] Além disso, os três anticorpos reagiram em Dot blotting com os agregados de amiloide beta1-42 (Uniprot: P05067; número CAS: 107761-42-2) e proteína Tau (Uniport: P10636-8) e, em seguida, a ligação específica as habilidades dos anticorpos para o agregado de alfa-sinucleína foram analisadas. O motivo dessa análise é explicado abaixo. A amiloide beta1-42 e tau formam os agregados que são considerados etiologias importantes para doenças neurodegenerativas, especialmente a doença de Alzheimer, e sabe-se que os agregados possuem estruturas de oligômeros, protofibrilas e fibrilas, tais como os agregados de alfa- sinucleína. Portanto, a análise de transferência de pontos é realizada para investigar que os anticorpos quiméricos 3A9, 9B11 e 11F11 reconhecem sequência específica de alfa- sinucleína e não reconhecem a estrutura comum dos agregados derivados de alfa-sinucleína, beta amiloide e tau.
[231] O método de transferência de pontos deste exemplo foi realizado substancialmente da mesma maneira que no Exemplo 2-3 e a amiloide beta1-42 recombinante, proteína tau e seus agregados foram obtidos do Professor Seung-jae Lee da Universidade Nacional de Seul. Syn-1, 6E10 e Tau5 são os anticorpos que se ligam às proteínas alfa-sinucleína, amiloide beta1-42 e tau, respectivamente. Os resultados da análise são mostrados na Figura 15c.
[232] Os resultados experimentais são mostrados na FIG.
15c, que indica que os anticorpos quiméricos 3A9, 9B11 e 11F11 da presente invenção se ligam especificamente apenas a agregados derivados de alfa-sinucleína e não a agregados derivados de amiloide beta1-42 e tau. Em contraste, os anticorpos 6E10 e Tau5, conhecidos por se ligarem a amiloide beta1-42 e Tau, respectivamente, mostraram a ligação aos agregados correspondentes na transferência de pontos.
[233] De acordo com os resultados acima, nenhuma ligação dos anticorpos quiméricos aos homólogos da alfa-sinucleína e aos agregados derivados de diferentes proteínas representa que os anticorpos se ligam eficientemente apenas à proteína-
alvo e, portanto, podem ter eficácia superior aos anticorpos ou drogas que se ligam aos homólogos e agregados derivados das diferentes proteínas.
Claims (32)
1. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a agregados α-Syn, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1 de cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6, uma CDR2 de cadeia pesada (H-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 a 4 e SEQ ID NOs: 7 a 8, uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 9, uma CDR1 de cadeia leve (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de cadeia leve (L-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 15.
2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia pesada (H-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 a 4 e uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma CDR2 de cadeia leve (L- CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
3. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada (H-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 de cadeia pesada (H-CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 7 a 8 e uma CDR3 de cadeia pesada (H-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (L-CDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de cadeia leve (L- CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de cadeia leve (L-CDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende uma estrutura de região variável de cadeia pesada 1 (H- FR1) localizada no terminal N de H-CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 a 17 e SEQ ID NOs: 35 a 40, uma estrutura de região variável de cadeia pesada (H- FR2) localizada entre H-CDR1 e H-CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 18 a 19 e SEQ ID NOs: 41 a 44, uma estrutura de região variável de cadeia pesada (H- FR3) localizada entre H-CDR2 e H-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 20 a 31 e SEQ ID NOs: 45 a 50, e uma estrutura de região variável de cadeia pesada (H- FR4) localizada no terminal C de H-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 32 a 34 e SEQ ID NOs: 51 a 52.
5. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve compreende uma estrutura de região variável de cadeia leve 1 (L- FR1) localizada no terminal N de L-CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 53 a 58 e SEQ ID NOs: 71 a 77, uma estrutura de região variável de cadeia leve (L-FR2) localizada entre L-CDR1 e L-CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs 59 a 61 e SEQ ID NOs: 78 a 81, uma estrutura de região variável de cadeia leve (L-FR3) localizada entre L-CDR2 e L-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 62 a 67 e SEQ ID NOs: 82 a 88, e uma estrutura de região variável de cadeia leve (L-FR4) localizada no terminal C de L-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 68 a 70 e SEQ ID NO: 89.
6. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende, uma estrutura de cadeia pesada 1 (H-FR1) localizada no terminal N do H-CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 a,
uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) localizada entre H-CDR1 e H-CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 18 a 19, uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) localizada entre H-CDR2 e H-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 20 a 31, e uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) localizada no terminal C de H-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 32 a 34, e uma região variável da cadeia leve compreende, uma estrutura de cadeia leve 1 (L-FR1) localizada no terminal N de L-CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 53 a 58, uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) localizada entre L-CDR1 e L-CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 59 a 61, uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) localizada entre L-CDR2 e L-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 62 a 67, e uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) localizada no terminal C de L-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 68 a 70.
7. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende uma estrutura de cadeia pesada 1 (H-FR1) localizada no terminal N do H-CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 35 a 40,
uma estrutura de cadeia pesada (H-FR2) localizada entre
H-CDR1 e H-CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 41 a 44,
uma estrutura de cadeia pesada (H-FR3) localizada entre
H-CDR2 e H-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 45 a 50 e uma estrutura de cadeia pesada (H-FR4) localizada no terminal C de H-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 51 a 52, e a região variável da cadeia leve compreende,
uma estrutura de cadeia leve 1 (L-FR1) localizada no terminal N do L-CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 71 a 77,
uma estrutura de cadeia leve (L-FR2) localizada entre
L-CDR1 e L-CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 78 a 81,
uma estrutura de cadeia leve (L-FR3) localizada entre
L-CDR2 e L-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 82 a 88, e uma estrutura de cadeia leve (L-FR4) localizada no terminal C de L-CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89.
8. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 90 a 101 ou SEQ ID NOs: 102 a 108; uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência de pelo menos 90% ou mais com a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 90 a 101 ou SEQ ID NOs: 102 a 108; ou uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 90 a 101 ou SEQ ID NOs: 102 a 108.
9. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109 a 115 ou SEQ ID NOs: 116 a 123; uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência de pelo menos 90% ou mais com a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109 a 115 ou SEQ ID NOs: 116 a 123; ou uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109 a 115 ou SEQ ID NOs: 116 a 123.
10. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 90 a 101 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109 a 115.
11. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 102 a 108 e uma região variável da cadeia leve compreendendo um aminoácido sequência selecionada de SEQ ID NOs: 116 a 123.
12. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 127 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 128, uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 129 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 130, uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 131 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 132, uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 133 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 134,
uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 135 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 136, ou uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 137 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 138.
13. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que é isolado e se liga ao agregado de alfa-sinucleína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F (ab'), diacorpo ou scFV.
14. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que é isolado e se liga ao agregado de alfa-sinucleína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é da forma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
15. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que é isolado e se liga ao agregado de alfa-sinucleína, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe uma transmissão intercelular do agregado de alfa-sinucleína; degrada o agregado de alfa- sinucleína; ou inibe a formação de agregado de alfa- sinucleína.
16. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
17. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 16.
18. Célula caracterizada pelo fato de que é transfectada com o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 17.
19. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a composição utilizada para o tratamento de α-sinucleinopatia compreende ainda um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a α-sinucleinopatia inclui a doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença combinada de Alzheimer e Parkinson, ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA).
22. Método para detecção in vivo ou in vitro de agregado de alfa-sinucleína em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, e contatar a amostra biológica a ser detectado agregado de alfa-sinucleína com o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.
23. Método para tratar α-sinucleinopatia de um indivíduo ou modular a concentração de agregado de alfa- sinucleína em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, ou uma composição compreendendo o mesmo em uma quantidade farmaceuticamente efetiva, a um indivíduo em necessidade de tratamento de α- sinucleinopatia e/ou regulação da concentração de agregados de alfa-sinucleína.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia inclui a doença de Parkinson (DP), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença combinada de Alzheimer e Parkinson, ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA).
25. Método para diagnosticar α-sinucleinopatia em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende medir uma concentração e/ou localização intercelular do agregado de alfa-sinucleína no indivíduo, usando um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14; e comparar a concentração e/ou a localização intercelular do agregado de alfa-sinucleína medido no indivíduo com a de uma amostra de controle, em que a similaridade ou diferença comparada com o resultado da amostra de controle representa o indivíduo com α-sinucleinopatia.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia inclui a doença de Parkinson (DP), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença combinada de Alzheimer e Parkinson, ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA).
27. Uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, ou de uma composição compreendendo o mesmo, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento da α-sinucleinopatia em um indivíduo, em que o seu fragmento de ligação ao antígeno inibe uma transmissão intercelular de agregado de alfa-sinucleína; degrada o agregado de alfa- sinucleína; ou inibe a formação de agregado de alfa- sinucleína no cérebro do indivíduo.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia inclui a doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença combinada de Alzheimer e Parkinson, ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA).
29. Uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, ou de uma composição compreendendo o mesmo, caracterizado pelo fato de que é para regular uma concentração de agregado de alfa-sinucleína nas células cerebrais, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno ou uma composição compreendendo o mesmo inibe uma transmissão intercelular de agregado de alfa-sinucleína; degrada o agregado de alfa-sinucleína; ou inibe a formação de agregado de alfa-sinucleína no cérebro do indivíduo.
30. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para uso na regulação de uma concentração de agregado de alfa-sinucleína nas células cerebrais, inibindo uma transmissão intercelular do agregado de alfa-sinucleína; degradando agregado de alfa-sinucleína; ou inibir a formação de agregado de alfa-sinucleína.
31. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de α-sinucleinopatia.
32. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 31, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia inclui a doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença combinada de Alzheimer e Parkinson ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA).
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