BR112013033258B1 - Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a alfasinucleína, composição e seus usos - Google Patents
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Abstract
ANTICORPO ISOLADO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO E USOS. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação específicas à (alfa)-sinucleína anti-humana, por exemplo, anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno, variantes ou derivados do mesmo, como métodos relacionados a estes. São fornecidas ainda moléculas de ligação (alfa)-sinucleína anti-humana que se ligam a epítopos específicos N-terminal e C-terminal em (alfa)- sinucleína humana. As moléculas de ligação aqui descritas podem ser usadas em composições farmacêuticase de diagnóstico para imunoterapia e diagnóstico direcionados à (alfa)-sinucleína, respectivamente.
Description
[001] A presente invenção refere-se de forma geral às novas moléculas de ligação de a-sinucleína-específica, particularmente anticorpos humanos, bem como seus fragmentos, derivados e variantes que reconhecem a-sinucleína e formas agregadas da α- sinucleína, respectivamente. Além disso, a presente invenção refere- se a composições farmacêuticas e de diagnóstico, compreendendo tais moléculas de ligação, anticorpos e seus mímicos valiosos tanto como uma ferramenta diagnóstica para identificar espécies tóxicas de α-sinuclefna no plasma e CSF quanto, também, em estratégias de vacinação passiva para o tratamento de distúrbios relacionados a agregados de α-sinuclefna, tais como mal de Parkinson (PD), demência com corpos de Lewy (DLB) e variante do corpo de Lewy de mal de Alzheimer (AD) e outras doenças sinucleinopáticas.
[002] O dobramento incorreto e a agregação de protefnas são aspectos patológicos de inúmeras doenças neurodegenerativas. Os agregados de α-sinuclefna são os principais componentes dos corpos de Lewy e neuritos de Lewy associados à mal de Parkinson (PD). Uma protefna nativamente desdobrada, α-sinuclefna pode adotar diferentes morfologias agregadas, incluindo oligômeros, protofibrilas e fibrilas. Os agregados oligoméricos pequenos foram mostrados serem particularmente tóxicos.
[003] Anticorpos de ocorrência natural contra a α-sinuclefna foram detectados em pessoas saudáveis e nfveis alterados em pacientes foram associados a doenças neurodegenerativas especfficas; ver, para revisão, Neff et al., Autoimmun. Rev. 7 (2008), 501-507. Assim, os anticorpos de ocorrência natural em pacientes que sofrem do mal de Parkinson, espontaneamente ou após a vacinação, em particular em pacientes saudáveis podem servir como um papel protetor em relação à agregação de a-sinucleína; ver, por exemplo, Woulfe et al., Neurology 58 (2002), 1435-1436 e Papachroni et al., J.Neurochem. 101 (2007), 749-756. Até então, o significado terapêutico de auto-anticorpos tinha sido difícil de avaliar. Isto é principalmente devido à falta de abordagens experimentais diretas para seu isolamento e subsequente caracterização in vitro.
[004] Recentemente, espécies oligoméricas de a-sinucleína foram relatadas extracelularmente no plasma e no CSF (El-Agnaf et al., FASEB J. 20 (2006), 419-425) e estudos de imunização em modelos de camundongo de PD mostram que os anticorpos monoclonais extracelulares de camundongo contra a a-sinucleína podem reduzir o acúmulo de agregados intracelulares de a-sinucleína (Masliah et al., Neuron, 46 (2005), 857-868) apoiando a ideia de que os anticorpos que neutralizam os agregados neurotóxicos, sem interferir com as funções benéficas da a-sinucleína monomérica, podem ser terapêuticos úteis. No entanto, a utilidade terapêutica dos anticorpos de base murina em humanos é dificultada pela resposta do anticorpo humano anti-camundongo (HAMA) em vista de sua origem não humana.
[005] Emadi et al. in J. Mol. Biol. 368 (2007), 1132-1144, descreve o isolamento de fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFvs) a partir de uma biblioteca de anticorpo exibida por um fago baseada em sequências humanas contra a a-sinucleína, que se ligam apenas a uma forma oligomérica da a-sinucleína e inibem a agregação e a toxicidade da a-sinucleína in vitro. No entanto, embora a geração de scFvs a partir da exibição do fago é bastante simples, esta técnica tem desvantagens graves uma vez que os anticorpos produzidos assumem o risco de reatividade cruzada indesejada contra auto- antígenos e faltam as características de anticorpos humanos naturais otimizados evolutivos produzidos pelo sistema imune humano. Além disso, tais anticorpos podem não ser específicos o suficiente devido à reatividade cruzada com outras proteínas e/ou com a proteína alvo no contexto com o ambiente e a função fisiológica normais. No caso do mal de Parkinson, por exemplo, os anticorpos que também reagem cruzadamente com os derivados fisiológicos da a-sinucleína assumem o potencial para provocar efeitos colaterais relacionados com as funções normais das estruturas fisiológicas alvo. A este respeito, uma doença autoimune indesejada seria completamente induzida - um risco dificilmente calculável, também no projeto conceitual, de experimentos de imunização ativa empregando estruturas de proteína que, de forma variante, também ocorrem fisiologicamente.
[006] Mais recentemente, Seitz et al. (81. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Neurologie mit Fortbildungsakademie Hamburg 10.-13.09.2008), relatou o isolamento de um auto-anticorpo policlonal anti-a-sinucleína a partir de diferentes soluções de imunoglobulina e amostras de doadores de sangue únicos através de cromatografia de afinidade. No entanto, além do fato de que esta abordagem fornece simples quantidades limitadas do anticorpo desejado, os anticorpos policlonais são de uso limitado apenas para aplicação terapêutica, por exemplo, devido à sua heterogeneidade e ao risco de ser contaminado com outras moléculas associadas à α- sinucleína que têm efeitos colaterais indesejados. Da mesma forma, o valor diagnóstico de anticorpos policlonais é reduzido, uma vez que a variabilidade da composição dos anticorpos irá influenciar a especificidade e a reatividade globais. Isso é mais verdade para o tema de anticorpos contra proteínas de agregação e deposição devido ao dobramento incorreto.
[007] Assim, há uma necessidade de superar as limitações descritas acima e de fornecer um anticorpo humano terapêutico e de diagnóstico contra a a-sinucleína.
[008] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente a um epítopo nos aminoácidos 4 a 15 da a-sinucleína humana (SEQ ID NO:1). Em determinados aspectos, a molécula de ligação inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal de referência NI-202.12F4 à a- sinucleína. Uma molécula de ligação da invenção pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Em modalidades específicas, a molécula de ligação não é o anticorpo monoclonal humano NI-202.12F4, ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado deste.
[009] Outra modalidade fornece uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente a um epítopo nos aminoácidos 113 a 123 ou nos aminoácidos 117 a 123 da a-sinucleína (SEQ ID NO:1). Em determinados aspectos, a molécula de ligação se liga especificamente ao mesmo epítopo humano da a-sinucleína como o anticorpo monoclonal de referência NI-202.22D11, ou inibe competitivamente o anticorpo monoclonal de ligação de referência NI-202.22D11 à a- sinucleína humana. Uma molécula de ligação da invenção pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Uma molécula de ligação específica da invenção é o anticorpo monoclonal humano NI-202.22D11 ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado deste.
[0010] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) da imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve (VL) da imunoglobulina, em que a VH compreende uma sequência polipeptídica pelo menos 90% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:20. Também é fornecido um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma VH e uma VL, em que a VL compreende uma sequência polipeptídica pelo menos 90% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:26. De forma similar, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma VH e uma VL, em que a VH e a VL compreendem, respectivamente, as sequências polipeptídicas pelo menos 90% ou 100% idênticas às SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:22, ou SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:26 polipeptídicas de referência.
[0011] São fornecidos ainda polipeptídeos isolados, incluindo um polipeptídeo isolado que compreende uma VH, em que a região CDR1 da VH é idêntica, ou idêntica exceto por menos de 3 substituições de aminoácidos conservativas, à sequência de referência SEQ ID NO:16 da CDR1 da cadeia pesada, um polipeptídeo isolado que compreende uma VH, em que a região CDR2 da VH é idêntica, ou idêntica exceto por menos de 5 substituições de aminoácidos conservativas, à sequência de referência SEQ ID NO:17 da CDR2 da cadeia pesada, um polipeptídeo isolado que compreende uma VH, em que a região CDR3 da VH é idêntica, ou idêntica exceto por menos de 5 substituições de aminoácidos conservativas, à sequência de referência SEQ ID NO:18 da CDR3 da cadeia pesada, um polipeptídeo isolado que compreende uma VL, em que a região CDR1 da VL é idêntica, ou idêntica exceto por menos de 5 substituições de aminoácidos conservativas, à sequência de referência SEQ ID NO:23 da CDR1 da cadeia leve, um polipeptídeo isolado que compreende uma VL, em que a região CDR2 da VL é idêntica, ou idêntica exceto por menos de 3 substituições de aminoácidos conservativas, à sequência de referência SEQ ID NO:24 da CDR2 da cadeia pesada, e um polipeptídeo isolado que compreende uma VL, em que a região CDR3 da VL é idêntica, ou idêntica exceto por menos de 3 substituições de aminoácidos conservativas, à sequência de referência SEQ ID NO:25 da CDR3 da cadeia pesada. Em cada um dos polipeptídeos indicados acima, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende o polipeptídeo se liga especificamente à a-sinucleína humana.
[0012] Em determinadas modalidades da invenção, o anticorpo isolado ou seu fragmento se liga preferencialmente a um epítopo conformacional não linear da a-sinucleína humana. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento se liga preferencialmente à a-sinucleína humana na forma oligomérica ou agregada. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento não se liga especificamente à β-sinucleina humana ou à Y- sinucleína humana, e/ou não se liga especificamente à a-sinucleína murina.
[0013] Também é fornecido uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento deste, conforme descrito acima, e um veículo. A composição pode ser uma composição terapêutica ou de diagnóstico.
[0014] São fornecidos ainda um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo ou uma molécula de ligação, conforme descrito neste documento, e vetores e células hospedeiras para a expressão de tais moléculas de ligação.
[0015] É um objetivo específico da presente invenção fornecer métodos para o tratamento ou prevenção de uma doença sinucleinopática, tal como, mas da não limitada a, mal de Parkinson (PD), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Os métodos compreendem a administração de uma concentração eficaz da molécula de ligação anti-humana à α- sinucleína, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado ao indivíduo, em que o anticorpo se direciona à a-sinucleína.
[0016] Também é um objetivo da invenção fornecer um método de diagnóstico de uma doença sinucleinopática em um indivíduo, compreendendo a avaliação do nível, localização, sua conformação ou combinação da a-sinucleína em um indivíduo a ser diagnosticado com um anticorpo ou seu fragmento da invenção e comparando o nível, a localização, sua conformação ou combinação da a-sinucleína no indivíduo a um ou mais padrões derivados de uma ou mais amostras controles, em que uma diferença ou semelhança entre o nível, localização, sua conformação ou combinação da a-sinucleína no indivíduo e o padrão de referência indicam se o indivíduo tem uma doença sinucleinopática.
[0017] Os métodos de diagnóstico da invenção podem ser através de ensaio in vitro de amostras de pacientes, ou por técnicas de imagem in vivo.
[0018] Outras modalidades da presente invenção estarão evidentes a partir da descrição e dos Exemplos que se seguem.
[0019] Figura 1 Sequências de aminoácidos e de nucleotídeos da região variável, isto é, cadeia pesada e cadeias leves kappa do anticorpo humano NI-202.21D11. As regiões de estrutura (FR) e determinantes de complementaridade (CDRs) são indicadas com as CDRs estando sublinhadas. Devido à estratégia de clonagem, a sequência de aminoácidos no N-terminal da cadeia pesada e da cadeia leve pode potencialmente conter alterações induzidas pelo iniciador na FR1, que, no entanto, não afetam substancialmente a atividade biológica do anticorpo. A fim de fornecer um anticorpo humano consenso, as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do clone original foram alinhadas e ajustadas em conformidade com as sequências de região variável da linha germinativa humana pertinente no banco de dados; ver, por exemplo, Vbase ((vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk), hospedado pelo MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK)). Estes aminoácidos, que são considerados por se desviarem potencialmente da sequência consenso da linha germinativa e, assim, poderia ser devido ao iniciador da PCR, estão indicados em negrito.
[0020] Figura 2 NI-202.21D11 recombinante humano se liga seletivamente à α-sinucleina humana sobre a β-, Y-sinucleína e α- sinucleína murina num ELISA direto. A α-, β-, Y-sinucleína recombinante humana e α-sinuclefna direcionada a His murina foram revestidas em placas de ELISA em concentrações iguais (2 μg/mL). As placas foram, então, analisadas com NI-202.21D11 recombinante humano, NI-202.12F4 humano e com um anticorpo pan-sinucleína. (A) O NI-202.21D11 recombinante liga seletivamente a α-sinuclefna, considerando que o anticorpo pan-sinuclefna se liga a todas as três protefnas sinuclefnas, confirmando o revestimento igual das protefnas recombinantes. (B) O NI-202.21D11 recombinante é seletivo para α- sinuclefna humana vs murina. Por outro lado, o NI-202.12F4 se liga à α-sinuclefna humana e murina num ELISA direto.
[0021] Figura 3 NI-202.21D11 recombinante se liga preferencialmente à α-sinucleina revestida de alta densidade. A α- sinuclefna humana recombinante foi revestida em placas de ELISA em concentrações indicadas e analisada com diversas concentrações de NI- 202.21D11 por ELISA direto (X 20 μg/mL;A 5μg/mL;>1 μg/mL;- 0,25 μg/mL; ▼ 0,1 μg/mL). A meia concentração máxima eficaz (EC50), que indica a potência do anticorpo, foi determinada para cada concentração de revestimento.
[0022] Figura 4 A análise de ligação imuno-histoquímica do NI- 202.21D11 mostrou uma coloração proeminente da patologia de α- sinucleína, incluindo corpo de Lewy e inclusões similares a neuritos de Lewy em cortes de parafina (A) de camundongos transgênicos superexpressando a α-sinucleina humana A53T e (C) de tecido cerebral humano de um paciente com Demência com Corpos de Lewy. (B) Nenhuma coloração foi observada no tecido de camundongo do tipo selvagem e (canto inferior direito) em um único anticorpo secundário controle. HC = hipocampo, CTX = córtex, BS = tronco cerebral.
[0023] Figura 5 O mapeamento do epítopo revelou um epítopo de ligação C-terminal na α-sinucleina humana (aa 117-123) para NI- 202.21D11. (A) O NI-202.21D11 recombinante ligado ao domínio C- terminal da a-sinucleína humana num ELISA direto. Os truncamentos da a-sinucleína foram revestidos em placas de ELISA em concentrações iguais (2ug/mL). O NI-202.21D11 ligado apenas aos aa 61-140 e 95-140 da a-sinucleína truncada, mas não aos truncamentos aa 1-60, 1-95. (B) A análise pepscan mostrou a ligação do NI- 202.21D11 aos peptídeos sobrepostos B08 (aa 109-123), B09 (aa 113127) e B10 (aa 117-131) da a-sinucleína humana, sugerindo que a sequência mínima necessária para a ligação do NI-202.21D11 é a PVDPDNE (aa 117-123) na a-sinucleína humana. (C) O NI-202.21D11 recombinante mostrou uma ligação reduzida à a-sinucleína humana D121G/N122S num ELISA direto. O wt recombinante e as proteínas a- sinucleínas mutantes foram revestidas em concentrações iguais (2ug/mL) em placas de ELISA e testadas para a ligação do NI- 202.21D11 recombinante.
[0024] Figura 6 O NI-202.12F4 se liga seletivamente ao N-terminal da a-sinucleína. (A) A análise pepscan mostra a ligação do NI- 202.12F4 ao peptídeo A01, mostrando que a sequência de reconhecimento mínima está no resíduo 1-15 da α-sinucleina. (B) Os peptídeos sintéticos da a-sinucleína do resíduo 1-30, 4-30 e 5-30 foram testados para a ligação do NI-202.12F4 em um ELISA em solução. O NI-202.12F4 está ligado aos aa 1-30 e 4-30, mas não aos 5-30. Isto mostrou que a sequência do epítopo do NI202.12F4 começa no resíduo 4 da a-sinucleína. (C) O resíduo K10 no epítopo do NI- 202.12F4 é um aminoácido chave para a seletividade do NI-202.12F4 para a a-sinucleína sobre a e-sinucleína. O wt recombinante e as proteínas a- e e-sinucleínas mutantes foram testadas por ELISA direto para a ligação do NI-202.12F4. O NI-202.12F4 está ligado à a- sinucleína wt e à e-sinucleína M10K mutante, mas não à e-sinucleína wt e à a-sinucleína K10M mutante. Isto mostra que aquele resíduo K10 é responsável pela seletividade da a-sinucleína ao NI-202.12F4.
[0025] As doenças sinucleinopáticas ou sinucleinopatias são um grupo diverso de distúrbios neurodegenerativos que compartilham uma lesão patológica comum composta de agregados de populações seletivamente vulneráveis da proteína a-sinucleína insolúvel de neurônios e da glia. Esses distúrbios incluem o mal de Parkinson (PD), Demência do Mal de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), distrofia neuroaxonal generalizada de início juvenil (doença de Hallervorden-Spatz), insuficiência autonômica pura (PAF), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo-1 (NBIA-I). Clinicamente, eles são caracterizados por um declínio crônico e progressivo das funções motora, cognitiva, comportamental e autonômica, dependendo da distribuição das lesões.
[0026] O mal de Parkinson é uma doença neurodegenerativa dependente da idade com etiologia desconhecida. Acredita-se que o mal de Parkinson esporádica resulte de uma combinação de vulnerabilidade genética e insultos ambientais. Acredita-se ainda que o mal de Parkinson (PD), uma vez desencadeada por mecanismos distintos, segue um caminho fisiopatológico compartilhado. Um nó compartilhado é o envolvimento da a-sinucleína. A ligação desta proteína com a patogênese do mal de Parkinson foi estabelecida pela identificação de mutações pontuais e da triplicação do gene em casos familiares, a localização da a-sinucleína para os corpos de Lewy, uma das características patológicas marcantes do mal de Parkinson e a correlação da expressão da a-sinucleína e a patologia da doença em modelos neurotóxicos do mal de Parkinson. Outras evidências indicam que formas específicas da a-sinucleína (por exemplo, dobrada incorretamente e dopamina ligada à a-sinucleína) estão envolvidas na doença esporádica.
[0027] As sinucleínas são proteínas pequenas, solúveis, expressas primariamente no tecido neural e em determinados tumores. A família inclui três proteínas conhecidas: a-sinucleína, β-sinuclefna e Y-sinucleína. Todas as sinuclefnas têm em comum um motivo de ligação a lipídeos a-helicoidal altamente conservado com similaridade aos domínios de ligação a lipídeos de classe-A2 das apolipoproteínas permutáveis. Os membros da família da sinucleína não são encontrados fora de vertebrados, embora eles tenham alguma semelhança estrutural conservada com proteínas vegetais 'abundantes na embriogênese tardia'. As proteínas α- e β-sinuclefna são encontradas primariamente no tecido cerebral, em que elas são vistas principalmente em terminais pré-sinápticos. A proteína Y-sinuclefna é encontrada primariamente no sistema nervoso periférico e na retina, mas sua expressão em tumores de mama é um marcador para a progressão do tumor. As funções celulares normais não foram determinadas para qualquer uma das protefnas sinuclefnas, embora alguns dados sugiram um papel na regulação da estabilidade da membrana e/ou renovação. As mutações na a-sinucleína estão associadas a raros casos familiares do mal de Parkinson de início precoce, e a proteína se acumula anormalmente no mal de Parkinson, no mal de Alzheimer e várias outras doenças neurodegenerativas. Para revisão, ver, por exemplo, George, Genome Biol 3 (2002), reviews3002.1-reviews3002.6published online 20 de dezembro de 2001, no qual a Tabela 1 cataloga os membros exclusivos da família da sinucleína que estão atualmente listados no GenBank, o conteúdo da divulgação o qual está incorporado neste documento para referência.
[0028] A a-sinucleína foi originalmente identificada em cérebros humanos, como a proteína precursora do componente não β-amiloide de (NAC) das placas do mal de Alzheimer (AD); ver, por exemplo, Ueda et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 1282-1286. A a- sinucleína, também denominada a precursora do componente não Aβ da AD amiloide (NACP), é uma proteína de 140 aminoácidos. A a- sinucleína existe em sua forma nativa, como uma espiral aleatória; no entanto, as alterações no pH, na aglomeração molecular, no teor de metais pesados e nos níveis de dopamina, todos afetam a conformação da proteína. Pensa-se que as alterações na conformação para as frações oligoméricas, protofibrilares, fibrilares e agregadas regulam a toxicidade da proteína. Uma evidência crescente indica que a a-sinucleína aduzida pela dopamina tem um curso de tempo mais rápido para a formação de fibrila em comparação com a proteína não aduzida. Além disso, a dopamina no fundo da superexpressão da a- sinucleína é tóxica.
[0029] Nesta especificação, os termos "a-sinucleína", "alfa- sinucleína", "a-sinucleína" e "aSin" são usados de forma permutável para se referir especificamente à forma do monômero nativo da a- sinucleína. O termo "a-sinucleína" também é usado para identificar, de forma geral, outros confôrmeros da a-sinucleína, por exemplo, a- sinucleína ligada à dopamina-quinona (DAQ) e oligômeros ou agregados da a-sinucleína. O termo "a-sinucleína" também é usado para se referir coletivamente a todos os tipos e formas da a-sinucleína. A sequência da proteína para a a-sinucleína humana é MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKE GVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAAT GFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEP EA (SEQ ID NO: 1). A sequência de aminoácidos da a-sinucleína pode ser obtida a partir da literatura e de bancos de dados pertinentes; ver, por exemplo, Ueda et al., ibid.; GenBank swissprot: locus SYUA_HUMAN, número de acesso P37840. O componente não Aβ da AD amiloide (NAC) é derivado da a-sinucleína. O NAC, um domínio altamente hidrofóbico dentro da a-sinucleína, é um peptídeo consistindo em pelo menos 28 resíduos de aminoácidos (resíduos 6087) e, opcionalmente, 35 resíduos de aminoácidos (resíduos 61-95). O NAC exibe uma tendência para formar uma estrutura em folha-beta (Iwai, et al., Biochemistry, 34 (1995) 10139-10145). As sequências de aminoácidos do NAC são descritos em Jensen et al., Biochem. J. 310 (1995), 91-94; GenBank número de acesso S56746 e Ueda et al., PNAS USA 90(1993), 1282-11286.
[0030] A a-sinucleína desagregada ou seus fragmentos, incluindo o NAC, significa unidades de peptídeo monomérico. A a-sinucleína desagregada ou seus fragmentos são geralmente solúveis e são capazes de se auto-agregarem para formar oligômeros solúveis. Os oligômeros da a-sinucleína e seus fragmentos são geralmente solúveis e existem predominantemente como a-hélices. A a-sinucleína monomérica pode ser preparada in vitro, dissolvendo o peptídeo liofilizado em DMSO puro com sonicação. A solução resultante é centrifugada para remover quaisquer particulados insolúveis. A α- sinucleína agregada ou seus fragmentos, incluindo o NAC, significa oligômeros da α-sinucleina ou seus fragmentos que se associam em montagens de folha-β insolúveis. A a-sinucleína agregada ou seus fragmentos, incluindo o NAC, significa também polímeros fibrilares. As fibrilas são geralmente insolúveis. Alguns anticorpos se ligam à α- sinucleína solúvel ou a seus fragmentos ou à a-sinucleína agregada ou a seus fragmentos. Alguns anticorpos se ligam a oligômeros da α- sinucleína mais fortemente do que as formas monoméricas ou formas fibrilares. Alguns anticorpos se ligam à a-sinucleína solúvel e a agregada ou a seus fragmentos e, opcionalmente, às formas oligoméricas também.
[0031] Os anticorpos humanos anti-a-sinucleína divulgados neste documento se ligam especificamente à a-sinucleína e a seus epítopos e a diversas conformações da a-sinucleína e a seus epítopos. Por exemplo, são divulgados neste documento anticorpos que se ligam especificamente à a-sinucleína, à a-sinucleína na sua forma de monômero nativo, à a-sinucleína de comprimento total e truncada e aos agregados da a-sinucleína. Conforme usado neste documento, a referência a um anticorpo que "se liga especificamente", "se liga seletivamente" ou "se liga preferencialmente" à a-sinucleína refere-se a um anticorpo que não se liga a outras proteínas não relacionadas. Em um exemplo, um anticorpo da a-sinucleína divulgado neste documento pode se ligar à a-sinucleína ou a um epítopo seu e não mostrar nenhuma ligação acima de cerca de 1,5 vez de base para outras proteínas. Um anticorpo que "se liga especificamente" ou "se liga seletivamente" a um confôrmero da a-sinucleína refere-se a um anticorpo que não se liga a todas as conformações da a-sinucleína, isto é, não se liga a pelo menos outro confôrmero da a-sinucleína. Por exemplo, são divulgados neste documento anticorpos que podem distinguir entre as formas monoméricas e agregadas da a-sinucleína, a-sinucleína humana e de camundongo; formas da a-sinucleína de comprimento total e truncada, bem como a a-sinucleína humana versus a β- e Y-sinucleína. Uma vez que os anticorpos humanos anti-α- sinucleína da presente invenção foram isolados a partir de um agrupamento de indivíduos idosos sem sinais de Parkinsonismo e exibindo uma resposta imune específica para a a-sinucleína, os anticorpos anti-a-sinucleína da presente invenção também são referidos como "auto-anticorpos humanos" a fim de enfatizar que aqueles anticorpos foram, de fato, expressos pelos indivíduos e não foram isolados, por exemplo, de uma imunoglobulina humana que expressa uma biblioteca do fago, que até então representava um método comum para tentar fornecer anticorpos similares aos humanos.
[0032] Deve ser observado que a entidade do termo "um" ou "uma" refere-se a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, "um anticorpo", entende-se por representar um ou mais anticorpos. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usado de forma permutável neste documento.
[0033] Conforme usado neste documento, o termo "polipeptídeo" destina-se a abranger um "polipeptídeo" no singular bem como no plural "polipeptídeos", e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro da definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de, ou de forma permutável, com qualquer um desses termos.
[0034] O termo "polipeptídeo" destina-se também a se referir aos produtos das modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, a glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer forma, incluindo por síntese química.
[0035] Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente essa estrutura. Os polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e os polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas, em vez disso, podem adotar um grande número de diferentes conformações, e são referidos como não dobrados. Conforme usado neste documento, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de carboidrato que está anexada à proteína através de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
[0036] Por um polipeptídeo "isolado" ou fragmento, variante ou derivado deste, pretende-se um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível específico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos produzidos de forma recombinante e as proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente, ou substancialmente, purificados por qualquer técnica adequada.
[0037] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção estão fragmentos, derivados, os análogos ou variantes dos polipeptídeos anteriores, e qualquer combinação destes. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo", quando se referem aos anticorpos ou polipeptídeos de anticorpo da presente invenção, incluem quaisquer polipeptídeos que mantém pelo menos algumas das propriedades de ligação ao antígeno da molécula, anticorpo ou polipeptídeo de ligação nativo correspondente. Os fragmentos dos polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpo específicos discutidos em outro lugar neste documento. As variantes dos anticorpos e polipeptídeos dos anticorpos da presente invenção incluem fragmentos, conforme descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes podem ocorrer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. As variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas, usando técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Os polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas. Os derivados de moléculas de ligação específica à a-sinucleína, por exemplo, anticorpos e polipeptídeos de anticorpo da presente invenção, são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Os exemplos incluem as proteínas de fusão. Os polipeptídeos variantes também são referidos neste documento como "análogos de polipeptídeo". Conforme usado neste documento, um "derivado" de uma molécula de ligação ou fragmento seu, um anticorpo, ou um polipeptídeo de anticorpo refere-se um polipeptídeo do indivíduo tendo um ou mais resíduos quimicamente derivados pela reação de um grupo lateral funcional. Também incluído como "derivados" são aqueles peptídeos que contêm um ou mais aminoácidos derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída pela prolina; a 5-hidroxilisina pode ser substituída pela lisina; a 3-metilhistidina pode ser substituída pela histidina; a homosserina pode ser substituída pela serina; e a ornitina pode ser substituída pela lisina.
[0038] O termo "polinucleotídeo" destina-se a abranger um ácido nucleico no singular, bem como os ácidos nucleicos no plural, e se refere a uma molécula isolada de ácido nucleico ou construto, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, como a encontrada em ácidos nucleicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou de RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo "isolado" pretende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um anticorpo contido em um vetor é considerado isolado para as finalidades da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados, de acordo com a presente invenção, incluem ainda essas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulatório, como um promotor, sítio de ligação ao ribossomo, ou um terminador de transcrição.
[0039] Conforme usado neste documento, uma "região de codificação" é uma porção do ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado ser parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons e similares, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em um único construto de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construtos de polinucleotídeos separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um único vetor pode separadamente codificar uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação, um anticorpo, ou fragmento, variante, ou derivado deste. As regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo.
[0040] Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é o DNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico o qual codifica um polipeptídeo pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou de tradução operacionalmente associados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associado a uma ou mais sequências regulatórias de tal forma a colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle das sequências regulatórias. Dois fragmentos de DNA (como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associados a esta) estão "operacionalmente associados" ou "operacionalmente ligados", se a indução da função do promotor resultar na transcrição do mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir com a capacidade das sequências regulatórias de expressão para direcionar a expressão do produto do gene ou interferir com a capacidade do modelo de DNA a ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codificasse um polipeptídeo, se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor de célula-específico que direciona a transcrição substancial do DNA apenas nas células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, sinais potenciadores, operadores, repressores e de terminação da transcrição, podem ser operacionalmente associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição célula-específica. Os promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são divulgados neste documento.
[0041] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida por aqueles versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam nas células de vertebrados, tais como, mas não limitado a, promotor e segmentos potenciadores de citomegalovírus (o primeiro promotor imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o primeiro promotor) e retrovírus (como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como a actina, proteínas de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adicionais adequadas incluem promotores tecido-específicos e potenciadores, bem como promotores induzíveis por linfocinas (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).
[0042] De forma similar, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados aos sítios de ligação ao ribossomo, códons de iniciação e de terminação da tradução e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio interno de entrada do ribossomo, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).
[0043] Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente invenção é o RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mRNA).
[0044] As regiões de codificação do polinucleotídeo e ácido nucleico da presente invenção podem ser associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos sinais ou secretores, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese do sinal, as proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência líder secretora que é clivada a partir da proteína madura, uma vez que a exportação da cadeia da proteína em crescimento pelo retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Aqueles versados na técnica estão cientes que os polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido ao N-terminal do polipeptídeo, o qual é clivado a partir do polipeptídeo de "comprimento total" ou completo para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobulina ou peptídeo sinal da cadeia leve é usado, ou um derivado funcional dessa sequência que mantém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associado a ele. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional deste, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.
[0045] A menos que indicado o contrário, os termos "distúrbio" e "doença" são usados de forma permutável neste documento.
[0046] Uma "molécula de ligação", como usado no contexto da presente invenção, refere-se primariamente a anticorpos e seus fragmentos, mas pode também se referir a outras moléculas não anticorpos que se ligam à a-sinucleína, incluindo, mas não se limitando a hormônios, receptores, ligantes, moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), chaperonas, tais como proteínas de choque térmico (HSPs), bem como moléculas de adesão célula- célula, como os membros da caderina, intergrina, lectina tipo C, superfamílias das imunoglobulinas (Ig) e moléculas de ligação sintéticas. Assim, apenas por razões de clareza e sem restringir o escopo da presente invenção, a maior parte das seguintes modalidades é discutida em relação a anticorpos e moléculas similares a anticorpo que representam moléculas de ligação exemplares para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e de diagnóstico.
[0047] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados de forma permutável neste documento. Um anticorpo ou imunoglobulina é uma molécula ligação à a-sinucleína que compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve. As estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas de vertebrados são relativamente bem compreendidas; ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).
[0048] Como será discutido mais detalhadamente abaixo, o termo "imunoglobulina" compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica irão apreciar que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (y, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, Y1-Y4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. estão bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. As versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos são facilmente discerníveis para a pessoa versada na técnica, em vista da divulgação do momento e, nesse sentido, estão dentro do escopo da invenção do momento. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dento do escopo da presente invenção, a discussão seguinte será direcionada de forma geral para a classe IgG das moléculas de imunoglobulina. No que se refere à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular 53.000-70.000. As quatro cadeias são normalmente unidas por pontes dissulfeto em uma configuração em "Y", em que as cadeias leves agrupam as cadeias pesadas, começando na boca do "Y" e continuando através da região variável.
[0049] As cadeias leve são classificadas como kappa ou lambda (K, À). Cada classe de cadeia pesada pode estar ligada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas estão covalentemente ligadas umas às outras, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes, quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas, células B ou células hospedeiras projetadas geneticamente. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm de um N-terminal nas extremidades em forquilha da configuração em Y para o C-terminal na parte inferior de cada cadeia.
[0050] Ambas as cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis das porções das cadeias leves (VL) e pesadas (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade ao antígeno. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação do complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que eles se tornam mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou amino-terminal do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e na porção C-terminal está uma região constante; os domínios CH3 e CL compreendem, na verdade, o carbóxi-terminal das cadeias pesada e leve, respectivamente.
[0051] Conforme indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente aos epítopos nos antígenos. Ou seja, o domínio VL e o domínio VH, ou subconjunto das regiões determinante de complementaridade (CDRs), de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tridimensional. Esta estrutura quaternária do anticorpo forma o sítio de ligação ao antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VL. Qualquer anticorpo ou fragmento de imunoglobulina que contém estrutura suficiente para se ligar especificamente à α- sinucleína está indicado neste documento, de forma permutável, como um "fragmento de ligação" ou um "fragmento imunoespecífico".
[0052] Nos anticorpos de ocorrência natural, um anticorpo compreende seis regiões hipervariáveis, às vezes chamadas de "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação ao antígeno, que são sequências não contíguas curtas de aminoácidos que são especificamente posicionados para formar o domínio de ligação ao antígeno, conforme o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. As "CDRs" são flanqueadas por quatro regiões de estrutura relativamente conservadas ou "FRs" que mostram menos variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura adotam largamente uma conformação de folha-β e as CDRs formam voltas que se conectam, e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha-β. Assim, as regiões de estrutura agem para formar um andaime que proporciona o posicionamento das CDRs na orientação correta por interações intercadeias, não covalentes. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente de um anticorpo a seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser facilmente identificados por qualquer região variável da cadeia leve ou pesada determinada por um versado na técnica, uma vez que eles foram precisamente definidos; ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901917, que estão incorporados em sua totalidade neste documento para referência.
[0053] No caso em que há duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo conforme usado neste documento é destinado a incluir todos esses significados, a menos que explicitamente indicado o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região determinante de complementaridade" ("CDR") para descrever os sítios de combinação de antígeno não contíguos, encontrados dentro da região variável dos polipeptídeos de cadeia leve e pesada. Esta região específica foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196 (1987), 901917, que estão incorporados neste documento para referência, em que as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparados uns contra os outros. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou a suas variantes destina-se a estar dentro do escopo do termo, conforme definido e usado neste documento. Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências citadas acima, são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números de resíduo exatos que abrangem uma CDR específica irão variar dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica determinam rotineiramente quais resíduos compreendem uma região hipervariável específica ou CDR do subtipo de IgG humana do anticorpo, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. Tabela 1: Definições da CDR1
1A numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração apresentada por Kabat et al.(ver abaixo).
[0054] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa versada na técnica pode atribuir sem ambiguidade este sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais além da sequência em si. Conforme usado neste documento, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que especificado o contrário, as referências à numeração das posições de resíduo de aminoácido específico em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo da presente invenção estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[0055] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos imunoespecíficos, variantes ou derivados dos mesmos da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), fragmentos que compreendem o domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para os anticorpos divulgados neste documento). As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019. As moléculas de imunoglobulina ou de anticorpo da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina.
[0056] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção não é a IgM ou um derivado desta com uma estrutura pentavalente. Particularmente, em aplicações específicas da presente invenção, especialmente no uso terapêutico, as IgMs são menos úteis que a IgG e outros anticorpos bivalentes ou moléculas de ligação correspondentes, uma vez que as IgMs, devido à sua estrutura pentavalente e falta de maturação de afinidade, frequentemente mostram reatividades cruzadas inespecíficas e afinidade muito baixa.
[0057] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção não é um anticorpo policlonal, isto é, substancialmente consiste em uma espécie de anticorpo específico ao invés de ser uma mistura obtida a partir de uma amostra de imunoglobulina do plasma.
[0058] Fragmentos de anticorpo, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) sozinhas ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Também incluídos na invenção estão os fragmentos de ligação à a-sinucleína que também compreendem qualquer combinação de região(ões) variável(is) com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos ou seus fragmentos imunoespecíficos da presente invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. Em determinadas modalidades, os anticorpos são anticorpos humanos, murinos, de burro, de coelho, de cabra, de porco da Guiné, de camelo, de lhama, de cavalo ou de frango. Em outra modalidade, a região variável pode ser similar a dos condrictes na origem (por exemplo, de tubarões).
[0059] Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano, isolado de um humano. Opcionalmente, a região de estrutura do anticorpo humano é alinhada e adotada em conformidade com as sequências de região variável da linha germinativa humana pertinente no banco de dados; ver, por exemplo, Vbase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk), hospedado pelo MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK). Por exemplo, os aminoácidos considerados por se desviarem potencialmente da sequência da linha germinativa verdadeira poderiam ser devido às sequências do iniciador de PCR incorporadas durante o processo de clonagem. Comparado aos anticorpos similares aos dos humanos gerados artificialmente, tais como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFvs) de uma biblioteca de anticorpo exibida por um fago ou camundongos xenogênicos, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção é caracterizado por (i) ser obtido, usando a resposta imune humana ao invés daquela de substitutos animais, isto é, o anticorpo foi gerado em resposta à a-sinucleína natural em sua conformação relevante no corpo humano, (ii) ter protegido o indivíduo ou ser pelo menos significativo para a presença da a- sinucleína, e (iii) uma vez que o anticorpo é de origem humana, os riscos de reatividade cruzada contra auto-antígenos são minimizados. Assim, em conformidade com a presente invenção, os termos "anticorpo monoclonal humano", "auto-anticorpo monoclonal humano", "anticorpo humano" e similares são usados para denotar uma molécula de ligação à a-sinucleína que é de origem humana, isto é que tenha sido isolada de uma célula humana, como uma célula B ou hibridoma desta ou o cDNA do qual foi diretamente clonada a partir do mRNA de uma célula humana, por exemplo, uma célula B de memória humana. Um anticorpo humano ainda é "humano" mesmo que substituições de aminoácidos sejam feitas no anticorpo, por exemplo, para melhorar as características de ligação.
[0060] Os anticorpos derivados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito infra e, por exemplo, na patente US N°. 5.939.598 por Kucherlapati et al., são denotados anticorpos similares aos dos humanos a fim de distingui-los dos anticorpos verdadeiramente humanos da presente invenção.
[0061] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo murinizado" ou "imunoglobulina murinizada" refere-se a um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs de um anticorpo humano da presente invenção; e uma região de estrutura humana que contém substituições e/ou deleções e/ou inserções de aminoácidos que são baseadas em uma sequência de anticorpo de camundongo. A imunoglobulina humana que fornece as CDRs é chamada de "pai" ou "aceptor" e o anticorpo de camundongo que fornece as mudanças de estrutura é chamado de "doador". As regiões constantes não precisam estar presentes, mas se elas estiverem, elas são geralmente substancialmente idênticas às regiões constantes do anticorpo de camundongo, isto é, pelo menos cerca de 85-90%, ou cerca de 95%, ou mais idêntica. Consequentemente, em algumas modalidades, uma imunoglobulina humana de cadeia leve ou pesada murinizada de comprimento total contém uma região constante de camundongo, CDRs humanas e um estrutura substancialmente humano que tem uma série de substituições de aminoácidos de "murinização". Normalmente, um anticorpo "murinizado" é um anticorpo que compreende uma cadeia leve variável murinizada e/ou uma cadeia pesada variável murinizada. Por exemplo, um anticorpo murinizado não abrangeria um anticorpo quimérico típico, por exemplo, porque toda a região variável de um anticorpo quimérico não é de camundongo. Um anticorpo modificado que foi "murinizado" pelo processo de "murinização" se liga ao mesmo antígeno, como o anticorpo pai que fornece as CDRs e é geralmente menos imunogênico em camundongos, em comparação com o anticorpo pai.
[0062] Conforme usado neste documento, a termo "porção da cadeia pesada" inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção da cadeia pesada compreende pelo menos um dos: um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, mediana e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento do mesmo. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para uso na invenção pode compreender uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH2; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH3, ou uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de ligação para uso na invenção pode carecer de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Conforme apresentado acima, será compreendido por uma pessoa versada na técnica que esses domínios (por exemplo, as porções da cadeia pesada) podem ser modificados, tal que eles variam na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.
[0063] Em determinados anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos divulgados neste documento, as porções da cadeia pesada de uma cadeia polipeptídica de um multímero são idênticas a uma segunda cadeia polipeptídica do multímero. Alternativamente, os monômeros contendo uma porção da cadeia pesada da invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico ou diacorpo.
[0064] Em outra modalidade, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos divulgados neste documento são compostos de uma única cadeia polipeptídica, tal como scFvs e devem ser expressas de forma intracelular (intracorpos) para aplicações terapêuticas e de diagnóstico in vivo.
[0065] As porções da cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento divulgados neste documento podem ser derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção da cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e de uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção da cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção da cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.
[0066] Conforme usado neste documento, o termo "porção da cadeia leve" inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, a porção da cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio VL ou CL.
[0067] O tamanho mínimo de um polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo para um anticorpo é pensado ser de cerca de quatro a cinco aminoácidos. O peptídeo ou epítopos de polipeptídeo pode conter, por exemplo, pelo menos sete, pelo menos nove ou entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que uma CDR pode reconhecer um peptídeo antigênico ou polipeptídeo em sua forma terciária, os aminoácidos que compreende um epítopo não precisam ser contíguos e, em alguns casos, pode nem mesmo estarem na mesma cadeia peptídica. Na presente invenção, um peptídeo ou epítopo de polipeptídeo reconhecido pelos anticorpos da presente invenção contém uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não contíguos da a-sinucleína. Conforme usado neste documento, quando um anticorpo é dito se ligar "dentro" de uma determinada faixa de aminoácidos, por exemplo, se liga a um epítopo "dentro dos aminoácidos 4 a 15 da a-sinucleína", significa que o epítopo abrange toda a faixa de aminoácidos indicados ou é menor. Em outras palavras, para um epítopo "dentro dos aminoácidos 4 a 15 da a- sinucleína", o epítopo pode incluir a cadeia peptídica de 12 aminoácidos inteira de 4 a 15, mas também pode ser menor, por exemplo, aminoácidos 4 a 12, aminoácidos 4 a 10 ou aminoácidos 4 a 8. A pessoa versada na técnica também reconhecerá que os aminoácidos de fora da faixa indicada podem contribuir para uma melhor afinidade de ligação ou maior reconhecimento de um epítopo conformacional, mas não são necessários para a ligação.
[0068] Por "ligando-se especificamente", ou "reconhecendo especificamente", usado de forma permutável neste documento, significa geralmente que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo se liga a um epítopo através de seu domínio de ligação ao antígeno, e que a ligação implica alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito "se ligar especificamente" a um epítopo quando este se liga a esse epítopo, através de seu domínio de ligação ao antígeno mais facilmente do que este se ligaria a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo "especificidade" é usado neste documento para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo. Por exemplo, um anticorpo "A" pode ser considerado ter uma maior especificidade para um determinado epítopo do que um anticorpo "B", ou o anticorpo "A" pode ser dito se ligar ao epítopo "C", com uma maior especificidade do que este tem para o epítopo relacionado "D".
[0069] Quando presente, o termo "características de ligação imunológicas", ou outras características de ligação de um anticorpo com um antígeno, em todas suas formas gramaticais, refere-se à especificidade, afinidade, reatividade cruzada e outras características de ligação de um anticorpo.
[0070] Por "se ligando preferencialmente", significa que a molécula de ligação, por exemplo, anticorpo se liga especificamente a um epítopo mais facilmente do que este se ligaria a um epítopo relacionado, similar, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que "se liga preferencialmente" a um determinado epítopo mais provavelmente se ligaria a esse epítopo do que a um epítopo relacionado, mesmo que tal anticorpo pudesse reagir de forma cruzada com o epítopo relacionado.
[0071] À título de exemplo não limitante, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo preferencialmente se este se ligar ao primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD) menor que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro antígeno preferencialmente se este se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo preferencialmente se este se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo.
[0072] Em outro exemplo não limitante, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo preferencialmente se este se liga ao primeiro epítopo com uma taxa de dissociação (k(dissociação)) menor que a k(dissociação) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo preferencialmente se este se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a k(dissociação) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo preferencialmente se este se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que a k(dissociação) do anticorpo para o segundo epítopo.
[0073] Em algumas modalidades, a molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivada divulgados neste documento pode se ligar a uma α- sinucleína ou a um fragmento ou variante da mesma com uma taxa de dissociação (k(dissociação)) menor ou igual a 5 X 10-2sec-1, 10-2sec-1, 5 X 10-3sec-1 ou 10-3sec-1. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção pode se ligar à a-sinucleína, um fragmento ou variante da mesma com uma taxa de dissociação (k(dissociação)) menor ou igual a 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, or 10-5 sec-1 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 ou 10-7 sec-1.
[0074] Em determinadas modalidades, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado divulgada neste documento pode se ligar à α- sinucleína ou a um fragmento ou variante da mesma com uma taxa de associação (k(associação)) maior ou igual a 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 ou 5 X 104 M-1 sec-1. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção pode se ligar à a-sinucleína ou a um fragmento ou variante da mesma com uma taxa de associação (k(associação)) maior ou igual a 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, ou 5 X 106 M-1 sec-1 ou 107 M-1 sec-1.
[0075] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo é dito inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência a um determinado epítopo se este se liga preferencialmente a esse epítopo na medida em que ele bloqueia, em algum grau, a ligação do anticorpo de referência ao epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA de competição. Como um exemplo, um anticorpo pode inibir competitivamente a ligação do anticorpo de referência a um determinado epítopo em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60% ou pelo menos 50%.
[0076] Conforme usado neste documento, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina; ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) nas páginas 27-28. Conforme usado neste documento, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geral do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, a força de combinação funcional de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno; ver, por exemplo, Harlow nas páginas 29-34. A avidez está relacionada à afinidade das moléculas individuais de imunoglobulina na população com epítopos específicos, e também as valências das imunoglobulinas, e ao antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo altamente repetitiva, tal como um polímero, seria uma de alta avidez. A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente, usando qualquer método adequado; ver, por exemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), e os métodos descritos neste documento. As técnicas gerais para a medição da afinidade de um anticorpo para antígeno incluem ELISA, RIA e ressonância de plasmon de superfície. A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno específica pode variar se medida sob condições diferentes, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antígeno, por exemplo, KD, IC50, podem ser feitas com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno e um tampão padronizado.
[0077] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção também podem ser descritas ou especificadas em termos de sua reatividade cruzada. Conforme usado neste documento, o termo "reatividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, em reagir com um segundo antígeno; uma medida de parentesco entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, um anticorpo é reativo de forma cruzada se este se liga a um epítopo diferente daquele que induziu sua formação. O epítopo reativo de forma cruzada geralmente contém muitas das mesmas características estruturais complementares, como o epítopo de indução e, em alguns casos, pode realmente se adaptar melhor que o original.
[0078] Por exemplo, determinados anticorpos têm algum grau de reatividade cruzada, em que eles se ligam de forma relacionada, mas epítopos não idênticos, por exemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos, 55% e pelo menos 50% de identidade (conforme calculado usando os métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento) a um epítopo de referência. Em algumas modalidades, um anticorpo pode ser dito ter pouca ou nenhuma reatividade cruzada, se ele não ligar os epítopos com menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% e menos de 50% de identidade (conforme calculado usando os métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado "altamente específico" para um determinado epítopo, se ele não ligar qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo desse epítopo.
[0079] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção também podem ser descritas ou especificadas em termos de sua afinidade de ligação à a-sinucleína. As afinidades de ligação incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd menor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 1012 M, 5 x 10-13 M, 10-13M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M.
[0080] Conforme indicado anteriormente, as estruturas de subunidade e a configuração tridimensional das regiões constantes a diversas classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Conforme usado neste documento, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável amino terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro domínio da região constante (maior parte amino terminal) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino terminal para a região de dobradiça de uma molécula da cadeia pesada de imunoglobulina.
[0081] Conforme usado neste documento, o termo "domínio CH2" inclui a porção de uma molécula da cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca do resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo, usando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 ao 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração da UE; ver Kabat EA et al.op. cit). O domínio CH2 é o único em que não é estreitamente pareado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 se estende do domínio CH2 ao C-terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.
[0082] Conforme usado neste documento, o termo "região de dobradiça" inclui a porção de uma molécula da cadeia pesada que junta o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo, assim, que as duas regiões de ligação ao antígeno N-terminal se movam independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, mediano e inferior; ver Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083.
[0083] Conforme usado neste documento, o termo "ligação dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CL estão ligadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas ligações dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242, usando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da UE).
[0084] Conforme usado neste documento, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" são usados de forma permutável. Estes termos se referem à junção de dois ou mais elementos ou componentes, por quaisquer meios, incluindo a conjugação química ou meios recombinantes. Uma "fusão in-frame" refere-se à junção de dois ou mais quadros de leitura aberta de polinucleotídeo (ORFs) para formar um ORF maior contínuo, de forma que mantém o quadro de leitura translacional correta dos ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelos ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente tão unidos na natureza). Embora o quadro de leitura seja assim feito contínuo por todos os segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, por uma sequência ligante inframe. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, in-frame, mas ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de estrutura de imunoglobulina ou regiões CDR adicionais, desde que as CDRs "fundidas" sejam cotraduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.
[0085] O termo "expressão", conforme usado neste documento, se refere a um processo pelo qual um gene produz um produto bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, knockdown do gene, bem como a expressão transiente e expressão estável. Este inclui, sem limitação, a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA veículo (tRNA), RNA hairpin pequeno (shRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradução desse mRNA em polipeptídeo(s). Se o produto desejado final for um produto bioquímico, a expressão inclui a criação desse produto bioquímico e quaisquer precursores. A expressão de um gene produz um "produto de gene". Conforme usado neste documento, um produto de gene pode ser tanto um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de um transcrito. Os produtos de gene descritos neste documento incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídeos, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica e similares.
[0086] Conforme usado neste documento, o termo "amostra" se refere a qualquer material biológico obtido a partir de um indivíduo ou paciente. Em um aspecto, uma amostra pode compreender sangue, líquido cefalorraquidiano ("CSF") ou urina. Em outros aspectos, uma amostra pode compreender todo o sangue, plasma, células B enriquecidas de amostras de sangue e células em cultura (por exemplo, células B de um indivíduo). Uma amostra também pode incluir uma amostra de biopsia ou tecido, incluindo o tecido neural. Ainda em outros aspectos, uma amostra pode compreender células inteiras e/ou um lisado das células. Amostras de sangue podem ser coletadas por métodos conhecidos na técnica. Em um aspecto, o pélete pode ser ressuspendido, colocando em vórtex a 4°C em 200 μl de tampão (20 mM Tris, pH. 7,5, Nonidet 0,5%, 1 mM de EDTA, 1mM de PMSF, NaCl 0,1M, Inibidor de Protease Sigma IX e Inibidores de Fosfatase Sigma IX 1 e 2). A suspensão pode ser mantida no gelo por 20 minutos com utilização intermitente do vórtex. Após girar a 15.000 x g por 5 minutos em cerca de 4°C, as alíquotas do sobrenadante podem ser armazenadas em cerca de -70°C.
[0087] Conforme usado neste documento, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se ao tratamento terapêutico e profilático ou a medidas preventivas, em que o objetivo é impedir ou diminuir (reduzir) uma mudança ou distúrbio patológico indesejado, tal como o desenvolvimento do Parkinsonismo. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado da doença estabilizado (isto é, não piora), retardamento ou diminuição da progressão da doença, melhora ou mitigação do estado da doença e remissão (tanto parcial quanto total), se detectável ou indetectável. "Tratamento" pode significar também o prolongamento da sobrevida, em comparação à sobrevida esperada se não receber tratamento. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio, bem como aqueles mais propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a manifestação da condição ou do distúrbio deve ser prevenida.
[0088] Por "indivíduo" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero", entende-se qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamífero, por exemplo, um paciente humano, para o qual o diagnóstico, prognóstico, prevenção ou terapia é desejada.
[0089] A presente invenção refere-se de forma geral a anticorpos humanos anti-a-sinucleína e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que podem demonstrar as características de ligação imunológicas e/ou propriedades biológicas, conforme delineado para os anticorpos ilustrados nos Exemplos. Em conformidade com a presente invenção, os anticorpos monoclonais humanos específicos para a a-sinucleína foram clonados de um agrupamento de indivíduos idosos.
[0090] No curso dos experimentos realizados em conformidade com a presente invenção, tentativas iniciais falharam em clonar anticorpos específicos da a-sinucleína, mas quase sempre resultaram em clones falso-positivos. Outras investigações desses clones revelaram que eles produziram anticorpos que reconheciam as proteínas de E. coli. A fim de contornar este problema, os anticorpos em meios condicionados de culturas de células B de memória humanas foram triados em paralelo para a ligação ao monômero de alfa sinucleína revestido de comprimento total e para a ausência de ligação a proteínas de E. coli e à albumina de soro bovino (BSA). Em particular, o meio condicionado de células B foi pré-absorvido com proteínas de E. coli antes de submeter o meio a um ensaio ELISA para a triagem de anticorpos humanos de ligação à a-sinucleína.
[0091] As tentativas iniciais de isolar anticorpos específicos se concentraram em agrupamentos de indivíduos humanos com alta atividade de ligação plasmática à a-sinucleína, sugestivo de níveis elevados de anticorpos da a-sinucleína circulantes no plasma. Essas tentativas falharam em produzir células B de memória humana específica para a a-sinucleína e os anticorpos descritos a atual invenção foram isolados dos grupamentos de indivíduos com baixa reatividade plasmática à a-sinucleína.
[0092] Devido a esta medida, vários anticorpos foram isolados. Os anticorpos selecionados foram analisados ainda mais por classe e determinação da subclasse da cadeia leve. As mensagens de anticorpo relevantes selecionadas de culturas de células B de memória são, em seguida, transcritas por RT-PCR, clonadas e combinadas em vetores da expressão para a produção recombinante; ver Publicação PCT N° WO 2010/069603 A1. Os anticorpos anti-humanos da a- sinucleína exemplares NI-202.12F4, NI-202.3G12, e NI-202.3D8 são divulgados na Publicação PCT N°. WO 2010/069603 A1
[0093] É divulgado neste documento um anticorpo monoclonal humano NI-202.22D11. A expressão recombinante de NI-202.22D11 em células HEK293 ou CHO e subsequente caracterização de sua especificidade de ligação para a a-sinucleína humana (Fig. 2A-B) foi determinada. Assim, um aspecto da presente invenção relaciona-se ao anticorpo humano monoclonal anti-a-sinucleína isolado NI-202.22D11 e fragmentos de ligação ao antígeno, derivados e variantes do mesmo. A presente invenção também é traçada para uma molécula de ligação, como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados do mesmo, em que o anticorpo compreende uma VH com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:20 e uma VL com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:26 ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos. Em uma modalidade, o NI-202.22D11, bem como suas variantes, fragmentos, ou derivados são caracterizados como se ligando especificamente à a-sinucleína humana, em comparação com a β-sinucleina humana e Y-sinucleína humana, e à a-sinucleína humana, em comparação com a a-sinucleína murina. O NI-202.22D11 se liga preferencialmente à a-sinucleína na forma oligomérica ou agregada.
[0094] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada para um anticorpo anti-a-sinucleína, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo da a-sinucleína que o anticorpo de referência NI-202.22D11. Conforme ilustrado nos Exemplos, o anticorpo NI-202.22D11 se liga aos truncamentos da a-sinucleína que contêm a região ácida C-terminal (aminoácidos 96-140) em um ensaio de ELISA direto, por exemplo, dentro dos aminoácidos 113 a 123 da SEQ ID NO: 1, e se liga especificamente a um epítopo dentro dos aminoácidos PVDPDNE (aminoácidos 117-123 da SEQ ID NO: 1).
[0095] O anticorpo NI-202.22D11 se liga preferencialmente a agregados da a-sinucleína ou fibrilas sobre a forma monomérica da a- sinucleína, conforme mostrado no Exemplo 2. Além disso, o anticorpo NI-202.22D11 se liga a formas patológicas da a-sinucleína no cérebro, por exemplo, agregados patológicos da a-sinucleína, conforme exemplificado pela coloração imuno-histoquímica descrita no Exemplo 3. Portanto, a presente invenção fornece um novo anticorpo humano anti-a-sinucleína útil para fins de diagnóstico e terapêuticos.
[0096] Em uma modalidade, a presente invenção fornece moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, que exibem as propriedades de ligação precisas do anticorpo NI-202.12F4 exemplar, conforme descrito na Publicação PCT N°. WO 2010/069603 A1. A presente invenção fornece moléculas de ligação que se ligam a um epítopo no N-terminal da a-sinucleína, por exemplo, moléculas de ligação que se ligam dentro dos aminoácidos 4 a 15 da SEQ ID NO:1. Determinadas modalidades fornecem moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, que se ligam dentro dos aminoácidos 4 a 15 da SEQ ID NO:1, mas excluem os anticorpos que compreendem uma VH (SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:9), VL (SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:14), VHCDR1 (SEQ ID NO:6), VHCDR2 (SEQ ID NO:7), VHCDR3 (SEQ ID NO:8), VLCDR1 (SEQ ID NO:11), VLCDR2 (SEQ ID NO:12) e/ou VLCDR3 (SEQ ID NO:13) do NI-202.12F4, ou fragmentos, variantes ou derivados do mesmo.
[0097] A presente invenção fornece ainda moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, que compreendem pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável VH e/ou VL do NI- 202.22D11 compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos representadas na Fig. 1. As sequências de nucleotídeos correspondentes que codificam as regiões variáveis identificadas acima são apresentadas na listagem sequência anexada. Um conjunto exemplar de CDRs das sequências de aminoácidos acima da região VH e/ou VL, conforme representado na Fig. 1, também está indicado na listagem sequência anexada. No entanto, conforme discutido a seguir, a pessoa versada na técnica está bem ciente do fato de que, adicionalmente ou alternativamente, as CDRs podem ser usadas, que diferem em sua sequência de aminoácidos daquelas apresentadas na Fig. 1 em um, dois, três, quatro, cinco ou mais aminoácidos. A VH do NI-202.22D11 é representado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO:15 e pela sequência de DNA SEQ ID NO:19, e sua forma GL- corrigida é representada como a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 20 e sequência de DNA SEQ ID NO: 21. A VL do NI-202.22D11 é representado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 22 e pela sequência de DNA SEQ ID NO: 28, e sua forma GL-corrigida é representada como sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 26 e sequência de DNA SEQ ID NO: 27. As sequências de aminoácidos da CDR da cadeia pesada de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 são representadas pela SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, respectivamente. As sequências de aminoácidos da CDR da cadeia leve de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 são representadas pela SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25, respectivamente.
[0098] Em uma modalidade, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo da presente invenção é qualquer um dos anticorpos que compreendem uma sequência de aminoácidos da região VH e/ou VL, conforme representado na Fig. 1. Alternativamente, um anticorpo da presente invenção é uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo que compete pela ligação à a-sinucleína com anticorpo tendo uma região VH e/ou VL, conforme representado na Fig. 1. Esses anticorpos também podem ser humanos, em particular para aplicações terapêuticas. Alternativamente, o anticorpo é um anticorpo murino, murinizado e murino-humano quimérico, que são particularmente úteis para métodos de diagnóstico e estudos em animais.
[0099] Como mencionado acima, devido à sua geração após uma resposta imune humana, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção reconhecerá os epítopos que são relevância fisiológica específica e que podem não ser acessíveis ou menos imunogênicos, no caso de processos de imunização para a geração, por exemplo, de anticorpos monoclonais de camundongo e em triagem in vitro de bibliotecas de exibição de fago, respectivamente. Nesse sentido, um epítopo de um anticorpo humano anti-a-sinucleína da presente invenção pode ser exclusivo. Portanto, a presente invenção também se estende de forma geral para os anticorpos anti-a-sinucleína e moléculas de ligação à a-sinucleína, que competem com o anticorpo monoclonal humano da presente invenção para a ligação específica à a-sinucleína. A presente invenção é direcionada mais especificamente para uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo da a- sinucleína que o anticorpo de referência NI-202.22G11.
[00100] A competição entre os anticorpos pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio no qual a imunoglobulina sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como a a-sinucleína. Inúmeros tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio de fase sólida direto ou indireto (RIA), imunoensaio enzimático de fase sólida direto ou indireto (EIA), ensaio de competição em sanduíche; ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; solid phase direct biotin-avidin EIA; see Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 36143619 e Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; ensaio marcado de fase sólida direto, ensaio em sanduíche marcado de fase sólida direto; ver Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); solid phase direct label RIA using I125 label; ver Morel et al, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 e Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Normalmente, tal ensaio envolve o uso da a-sinucleína purificada ou seus agregados ligados a uma superfície sólida ou células carregando qualquer um desses, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada, isto é, um anticorpo monoclonal humano da presente invenção. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade da marca ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Um ensaio de ligação competitivo pode ser realizado sob condições, conforme descrito para o ensaio ELISA nos Exemplos anexados. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o bloqueio estérico ocorra. Geralmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, este irá inibir a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50% ou 75%. Portanto, a presente invenção é delineada ainda para uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados do mesmo, em que o anticorpo inibe competitivamente o anticorpo de referência NI-202.22G11 de se ligar à a-sinucleína.
[00101] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:20.
[00102] É divulgada ainda uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH idêntica, ou idêntica exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácidos, à SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:20.
[00103] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:26.
[00104] Algumas modalidades divulgam uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos de VL idêntica, ou idêntica exceto para uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácidos, à SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:26.
[00105] Em outras modalidades, um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à α- sinucleína humana compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em sequências de aminoácidos de VH e VL pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas a: (a) SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:22, respectivamente, (b) SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:26, respectivamente, (c) SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:22, respectivamente, (d) SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:26, respectivamente.
[00106] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável da cadeia pesada (VH) de imunoglobulina, em que pelo menos uma, duas ou todas as três VH-CDRs da região variável da cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos da cadeia pesada de referência VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 na Fig. 1, e representadas pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente. Assim, de acordo com esta modalidade, uma região variável da cadeia pesada da invenção tem sequências polipeptídicas de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH -CDR3 relacionadas às sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 representadas pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente. Enquanto a Fig. 1 mostra as VH-CDRs definidas pelo sistema de Kabat, outras definições da CDR, por exemplo, VH-CDRs definidas pelo sistema de Chothia, também estão incluídas na presente invenção e podem ser facilmente identificadas por uma pessoa versada na técnica, usando os dados de sequência apresentados.
[00107] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável da cadeia pesada (VH) de imunoglobulina, na qual as regiões VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas às sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 representadas pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente.
[00108] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável da cadeia pesada (VH) de imunoglobulina, na qual as regiões VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas, ou idênticas exceto por uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis substituições de aminoácidos em qualquer VH-CDR, para as sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 representadas pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente. Também é fornecida uma região variável da cadeia pesada (VH) de imunoglobulina, na qual as regiões VH-CDR1, VH- CDR2 e VH-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas, ou idênticas exceto por cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze ou vinte substituições totais de CDR, às sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente. Em determinadas modalidades, as substituições de aminoácidos são conservativas.
[00109] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável da cadeia leve (VL) de imunoglobulina, em que pelo menos uma, duas ou todas as três VL-CDRs da região variável da cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos da cadeia leve de referência VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL- CDR3 representadas pelas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente. Assim, de acordo com esta modalidade, uma região variável da cadeia leve da invenção tem sequências polipeptídicas de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 relacionadas com os polipeptídeos mostrados na Fig. 1, e representadas pelas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente. Enquanto a Fig. 1 mostra as VL-CDRs definidas pelo sistema de Kabat, outras definições da CDR, por exemplo, VL-CDRs definidas pelo sistema de Chothia, também estão incluídas na presente invenção.
[00110] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável da cadeia leve (VL) de imunoglobulina, na qual as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostrados na Fig. 1, e representados pelas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente.
[00111] Também é divulgada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à a-sinucleína humana, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável da cadeia leve (VL) de imunoglobulina, na qual as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas, ou idênticas exceto por uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis substituições de aminoácidos em qualquer VL-CDR, às sequências de aminoácidos VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 representadas pelas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente. Também é fornecida uma região variável da cadeia leve (VL) de imunoglobulina, na qual as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas, ou idênticas exceto por cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze ou quinze substituições totais de CDR, às sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente. Em determinadas modalidades, as substituições de aminoácidos são conservativas.
[00112] Uma imunoglobulina ou seu cDNA de codificação pode ser ainda modificado. Assim, em outro modalidade, o método da presente invenção compreende qualquer(quaisquer) etapa(s) da produção de um anticorpo quimérico, anticorpo murinizado, anticorpo de cadeia única, fragmento Fab, anticorpo biespecífico, anticorpo de fusão, anticorpo marcado ou um análogo de qualquer um desses. Métodos correspondentes são conhecidos para uma pessoa versada na técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual",CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Quando os derivados dos referidos anticorpos são obtidos pela técnica de exibição de fago, ressonância de plasmon de superfície, conforme empregada no sistema BIAcore, pode ser usado para aumentar a eficiência dos anticorpos de fago que se ligam ao mesmo epítopo como aquele de qualquer um dos anticorpos descritos (Schier,Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). A produção de anticorpos quiméricos é descrita, por exemplo, no pedido internacional WO89/09622. Os métodos para a produção de anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, no pedido Europeu EP-A1 0 239 400 e no pedido internacional WO90/07861. Uma outra fonte de anticorpos a serem utilizados em conformidade com a presente invenção são chamados anticorpos xenogênicos. O princípio geral para a produção de anticorpos xenogênicos, como os anticorpos similares aos de humanos em camundongos é descrito, por exemplo, nos pedidos internacionais WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 e WO 96/33735. Como discutido acima, um anticorpo da invenção pode existir em uma variedade de formas, além de anticorpos completos; incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab) 2, bem como em cadeias únicas, tais como scFvs; ver, por exemplo, o pedido internacional WO88/09344.
[00113] Os anticorpos da presente invenção ou sua(s) cadeia(s) de imunoglobulina correspondente(s) podem ser ainda modificados, usando técnicas convencionais conhecidas na técnica, por exemplo, usando deleção(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões), e/ou recombinação(ões) de aminoácidos e/ou qualquer(quaisquer) modificação(ões) conhecida(s) na técnica, sozinha ou em combinação. Os métodos para a introdução de tais modificações na sequência de DNA subjacente à sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina são bem conhecidos para o versado na técnica; ver, por exemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). As modificações do anticorpo da invenção incluem derivatizações químicas e/ou enzimáticas em um ou mais aminoácidos constitutivos, incluindo modificações de cadeia lateral, modificações de estrutura principal e modificações N- e C-terminal, incluindo acetilação, hidroxilação, metilação, amidação e a anexação de frações de carboidratos ou lipídeos, cofatores e similares. Da mesma forma, a presente invenção abrange a produção de proteínas quiméricas que compreendem o anticorpo descrito ou algum fragmento do mesmo no amino terminal fundido a uma molécula heteróloga, como um ligante imunoestimulatório no terminal carboxila; ver, por exemplo, o pedido internacional WO00/30680 para os detalhes técnicos correspondentes.
[00114] Adicionalmente, a presente invenção abrange peptídeos, incluindo aqueles contendo uma molécula de ligação, conforme descrito acima, por exemplo, contendo a região CDR3 da região variável de qualquer um dos anticorpos mencionados, em particular a CDR3 da cadeia pesada, uma vez que esta tem sido frequentemente observada que a cadeia pesada CDR3 (HCDR3) é a região com um maior grau de variabilidade e uma participação predominante na interação antígeno-anticorpo. Esses peptídeos podem facilmente ser sintetizados ou produzidos por meios recombinantes para produzir um agente de ligação útil, de acordo com a invenção. Esses métodos são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Os peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando sintetizadores de peptídeo automatizados que estão comercialmente disponíveis. Os peptídeos também podem ser produzidos por técnicas recombinantes, incorporando o DNA que expressa o peptídeo em um vetor de expressão e transformando as células com o vetor de expressão para produzir o peptídeo.
[00115] Consequentemente, a presente invenção refere-se a qualquer molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação que é orientado em direção aos anticorpos humanos anti-a-sinucleína da presente invenção e exibem as propriedades mencionadas, isto é, que reconhecem especificamente a a-sinucleína. Tais anticorpos e moléculas de ligação podem ser testados por sua especificidade de ligação e afinidade por ELISA e Western Blot e imuno-histoquímica, conforme descrito neste documento, ver, por exemplo, os Exemplos. Além disso, os resultados preliminares de experimentos subsequentes realizados em conformidade com a presente invenção revelaram que o anticorpo humano anti-a-sinucleína da presente invenção, em particular, o anticorpo NI-202.22D11 reconhece corpos de inclusão da a-sinucleína presentes em seções de cérebro humano de pacientes que sofriam de demência com corpos de Lewy (DLB) ou de mal de Parkinson (PD). Assim, em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo humano ou fragmento de ligação, derivado ou variante do mesmo reconhece a a-sinucleína nas seções de cérebro de DLB ou PD humanas (ver, por exemplo, a Fig. 4c).
[00116] As células B imortalizadas ou células B de memória podem ser usadas como uma fonte de loci de cadeia pesada e de cadeia leve rearranjados para a subsequente expressão e/ou manipulação genética. Os genes do anticorpo rearranjados podem ser transcritos de forma reversa a partir de mRNAs apropriados para produzir o cDNA. Se desejado, a região constante da cadeia pesada pode ser trocada por aquela de um isotipo diferente ou eliminada completamente. As sequências nucleotídicas podem ser projetadas para remover motivos indesejados (tais como sítios de recombinação ou sítios de restrição), e o uso de códon pode ser otimizado para a célula na qual o anticorpo ou seu fragmento deve ser expresso. Além disso, uma ou mais mutações que alteram os aminoácidos nas regiões variáveis pode ser feita, por exemplo, para aumentar a afinidade ou melhorar a estabilidade. As regiões variáveis podem ser ligadas para codificar regiões Fv de cadeia única. Múltiplas regiões Fv podem ser ligadas para conferir capacidade de ligação a mais de um alvo ou combinações de cadeia pesada e leve quiméricas podem ser empregadas. Uma vez que o material genético está disponível, o projeto de análogos, conforme descrito acima, que mantêm sua capacidade de se ligar ao alvo desejado é simples. Os métodos para a clonagem das regiões variáveis de anticorpo e geração de anticorpos recombinantes são conhecidos para uma pessoa versada na técnica e são descritos, por exemplo, em Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.
[00117] Uma vez que o material genético apropriado é obtido e, se desejado, modificado para codificar um análogo, as sequências de codificação, incluindo aquelas que codificam, no mínimo, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, pode ser inserido em sistemas de expressão contidos em vetores que podem ser transfectados em células hospedeiras recombinantes padrão. Uma variedade dessas células hospedeiras pode ser usada; para o processamento eficiente. Linhagens de células de mamíferos típicas úteis para esta finalidade incluem, mas não estão limitadas a células CHO, células HEK 293 ou células NSO.
[00118] A produção do anticorpo ou análogo é, então, realizada pelo cultivo da hospedeira recombinante modificada em condições de cultura apropriadas para o crescimento de células hospedeiras e para a expressão das sequências de codificação. Os anticorpos são, em seguida, recuperados, isolando-os da cultura. Os sistemas de expressão podem ser projetados para incluir peptídeos sinais para que os anticorpos resultantes sejam secretados no meio; no entanto, a produção intracelular também é possível.
[00119] Em conformidade com o acima exposto, a presente invenção também se refere a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou molécula de ligação equivalente da presente invenção, uma ou mais CDRs, uma ou mais regiões variáveis de cadeia pesada ou de cadeia leve ou variantes dos mesmos de uma cadeia de imunoglobulina dos anticorpos anti-α-sinucleina descritos acima.
[00120] A pessoa versada na técnica compreenderá facilmente que o domínio variável de um anticorpo, ou qualquer porção deste pode ser usado para a construção de outros polipeptídeos ou anticorpos de especificidade e função biológica desejadas. Assim, a presente invenção fornece também os polipeptídeos e anticorpos que compreendem pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou de cadeia leve, ou tal CDR com 1, 2, 3, 4 ou mais substituições de aminoácidos, do anticorpo NI-202.22D11, que pode ter substancialmente propriedades de ligação iguais ou similares do NI-202.22D11, descrito nos exemplos anexados. A pessoa versada na técnica sabe que a afinidade de ligação pode ser reforçada, fazendo as substituições de aminoácidos dentro das CDRs ou dentro das voltas hipervariáveis (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se sobrepõem parcialmente com as CDRs, conforme definido por Kabat; ver, por exemplo, Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327. Assim, a presente invenção também se refere a anticorpos em que uma ou mais das CDRS mencionadas compreende uma ou mais substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção compreende, em uma ou nas duas de suas cadeias de imunoglobulina, duas ou todas as três CDRs das regiões variáveis (originais ou corrigidas), conforme apresentado na Fig. 1.
[00121] As moléculas de ligações, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção, como conhecido por aqueles versados na técnica, podem compreender uma região constante que medeia uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complemento a uma região constante do anticorpo pode ativar o sistema complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise de patógenos de célula. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e também pode estar envolvida em hipersensibilidade autoimune. Além disso, os anticorpos se ligam a receptores em várias células através da região Fc, com um sítio de ligação do receptor Fc sobre a ligação da região Fc do anticorpo a um receptor Fc (FcR) em uma célula. Há um número de receptores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores de épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação dos anticorpos aos receptores Fc nas superfícies da célula desencadeia uma série de respostas biológicas importantes e diversas, incluindo o engolfamento e a destruição de partículas revestidas por anticorpo, depuração de complexos imunes, lise de células alvo revestidas por anticorpo por células assassinas (chamadas de citotoxicidade mediada por células depende de anticorpo ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulina.
[00122] Neste sentido, determinadas modalidades da presente invenção incluem um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, em que pelo menos uma porção de um ou mais dos domínios da região constante foi deletado ou, de outra forma, alterado de modo a proporcionar as características bioquímicas desejadas, tais como funções efetoras reduzidas, a capacidade de dimerizar não covalentemente, capacidade aumentada para se localizar no sítio de agregação e deposição da a-sinucleína, meia-vida sérica reduzida, ou meia-vida sérica aumentada quando comparada com um anticorpo inteiro, inalterado com aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, determinados anticorpos para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento descritos neste documento são anticorpos de domínio deletado que compreendem uma cadeia polipeptídica similar a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que falta pelo menos uma porção de um ou mais domínios da cadeia pesada. Por exemplo, em determinados anticorpos, um domínio inteiro da região constante do anticorpo modificado será deletado, por exemplo, todo ou parte do domínio CH2 será deletado. Em outras modalidades, determinados anticorpos para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento descritos neste documento têm uma região constante, por exemplo, uma região constante da cadeia pesada de IgG, que é alterada para eliminar a glicosilação, referida em outra parte neste documento como anticorpos aglicosilados ou "agli". Esses anticorpos "agli" podem ser preparados enzimaticamente, bem como, pela projeção de sítio(s) consenso(s) de glicosilação na região constante. Enquanto não estando ligado, em teoria, acredita-se que os anticorpos "agli" podem ter um perfil de segurança e estabilidade melhoradas in vivo. Os métodos de produção de anticorpos aglicosilados, tendo desejado uma função efetora desejada, são encontrados, por exemplo, no pedido internacional WO2005/018572, que está incorporado em sua totalidade para referência.
[00123] Em determinados anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos descritos neste documento, a porção Fc pode ter uma mutação para diminuir a função efetora, usando as práticas conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação ao receptor Fc do anticorpo modificado circulante, aumentando, desse modo, a localização da α-sinucleina. Em outros casos, as modificações da região constante consistentes com a invenção do momento moderam a ligação do complemento e, assim, reduzem a meia-vida sérica e a associação não específica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar as ligações dissulfeto ou frações de oligossacarídeo que permitem a localização avançada, devido à especificidade antigênica aumentada ou à flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico resultante, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como a localização da a-sinucleína, biodistribuição e meia-vida sérica, podem ser facilmente ser medidos e quantificados, usando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação indevida.
[00124] Em determinados anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos descritos neste documento, a porção Fc pode ter sequências de proteínas alternativas trocadas ou com mutações para aumentar a absorção celular de anticorpos, a título de exemplo, intensificando a endocitose mediada por receptor de anticorpos através de receptores FCY, LRP, ou receptores de Thy1 ou pela 'SuperAntibody Technology', que é dita permitir que os anticorpos sejam transportados em células vivas sem danificá-las (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Por exemplo, a geração de proteínas de fusão da região de ligação do anticorpo e os ligantes de proteína cognatos dos receptores de superfície celular ou anticorpos bi- ou multiespecíficos com sequências específicas que se ligam à a-sinucleína, bem como um receptor de superfície celular pode ser projetado usando as práticas conhecidas na técnica.
[00125] Em determinados anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos descritos neste documento, a porção Fc pode ter sequências de proteína alternativas trocadas ou com mutação ou anticorpo pode ser quimicamente modificado para aumentar sua penetração na barreira hematoencefálica.
[00126] Formas modificadas de anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção podem ser feitas a partir de um precursor inteiro ou anticorpos pais, usando as práticas conhecidas na técnica. As técnicas exemplares são discutidas em mais detalhes neste documento. Os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção podem ser feitos ou fabricados, usando as práticas que são conhecidas na técnica. Em determinadas modalidades, as moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são "produzidos de forma recombinante", isto é, são produzidos usando a tecnologia do DNA recombinante. As técnicas exemplares para fabricar moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são discutidas em mais detalhes em outro lugar neste documento.
[00127] Os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção também incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela anexação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a anexação covalente não impede que o anticorpo se ligue especificamente a seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou a outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[00128] Em determinadas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção não irão provocar uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um humano. Em determinadas modalidades, as moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção são derivados de um paciente, por exemplo, de um paciente humano, em são subsequentemente usados na mesma espécie da qual eles derivam, por exemplo, humano, atenuando ou minimizando a ocorrência de respostas imunes deletérias.
[00129] A deimunização também pode ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Conforme usado neste documento, o termo "deimunização" inclui a alteração de um anticorpo para modificar os epítopos de célula T; ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO98/52976 e WO00/34317. Por exemplo, as sequências de VH e VL do anticorpo de partida são analisadas e um epítopo da célula T humana "mapeia" cada região V, mostrando a localização dos epítopos em relação às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e outros resíduos chaves dentro da sequência. Os epítopos de célula T individuais do mapa do epítopo de célula T são analisados a fim de identificar substituições de aminoácidos alternativas com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma gama de sequências de VH e VL alternativas são projetadas, compreendendo as combinações de substituições de aminoácidos e essas sequências são subsequentemente incorporadas em uma variedade de polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos a-sinucleína-específicos ou seus fragmentos imunoespecíficos para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento divulgados neste documento que são, em seguida, testados para função. Normalmente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados. Os genes completos da cadeia pesada e da cadeia leve que compreendem as regiões C e V humanas modificadas são, então, clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes introduzidos em linhagens celulares para a produção de um anticorpo inteiro. Os anticorpos são, em seguida, comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados, e a variante ótima é identificada.
[00130] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados, usando uma ampla variedade de práticas conhecidas da técnica, incluindo o uso de hibridoma, tecnologias recombinantes e de exibição de fago ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos, usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinada, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), as referidas referências incorporadas em sua totalidade para referência. O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridomas. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucarionte, procarionte, ou de fago, e não ao método pelo qual ele é produzido. Assim, o termo "anticorpo monoclonal" não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridomas. Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção são derivados de células B humanas que foram imortalizadas através da transformação com o vírus Epstein-Barr, conforme descrito neste documento.
[00131] No processo de hibridoma bem conhecido (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495) os linfócitos relativamente de vida curta ou mortais, de um mamífero, por exemplo, células B derivados de um indivíduo humano, conforme descrito neste documento, são fundidas com uma linhagem de células tumorais imortais (por exemplo,. uma linhagem celular de mieloma), produzindo, assim, células híbridas ou "hibridomas", que são imortais e capazes de produzir o anticorpo geneticamente codificado da célula B. Os híbridos resultantes são segregados em cepas genéticas únicas por seleção, diluição e recrescimento com cada cepa individual compreendendo genes específicos para a formação de um único anticorpo. Eles produzem anticorpos, que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em referência a sua ascendência genética pura, são denominados "monoclonais".
[00132] As células do hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em meio de cultura adequado que pode conter uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Aqueles versados na técnica apreciarão que os reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, seleção e crescimento de hibridomas estão comercialmente disponíveis a partir de uma série de fontes, e protocolos padronizados estão bem estabelecidos. Geralmente, o meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é analisado para a produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. A especificidade da ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro, tais como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoaborsorvente ligado a enzima (ELISA), conforme descrito neste documento. Após as células do hibridoma serem identificadas, que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados, limitando os procedimentos de diluição e cultivados pelos métodos padrões; ver, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986). Será apreciado ainda que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por procedimentos de purificação convencionais, tais como, por exemplo, proteína-A, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[00133] Em outra modalidade, os linfócitos podem ser selecionados por micromanipulação e os genes variáveis, isolados. Por exemplo, células mononucleares do sangue periférico podem ser isoladas a partir de um mamífero imunizado ou naturalmente imune, por exemplo, um humano e cultivadas por cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser triadas para IgGs específicas que atendem os critérios de triagem. As células de poços positivos podem ser isoladas. As células B produtoras de Ig individuais podem ser isoladas por FACS ou identificando-as em um ensaio de placa hemolítica mediada pelo complemento. As células B produtoras de Ig podem ser micromanipuladas em um tubo e os genes da VH e VL podem ser amplificados, usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes da VH e VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpo e transfectados em células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) para a expressão.
[00134] Alternativamente, as linhagens de células produtoras de anticorpos podem ser selecionadas e cultivadas, usando técnicas bem conhecidas para os versados na técnica. Essas técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. A este respeito, as técnicas adequadas para o uso na invenção, conforme descrito abaixo, são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds.,Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991), o qual está incorporado neste documento em sua totalidade para referência.
[00135] Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos de forma recombinante ou por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas, como a papaína (para produzir os fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir os fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, região constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. Esses fragmentos são suficientes para o uso, por exemplo, em procedimentos de imunodiagnóstico, envolvendo o acoplamento das porções imunoespecíficas das imunoglobulinas para detectar reagentes, tais como radioisótopos.
[00136] Os anticorpos completamente humanos, tal como descritos neste documento, são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos da presente invenção são isolados, por exemplo, de indivíduos idosos que, devido à sua idade, podem ser suspeitos de estar em risco de desenvolver um distúrbio, por exemplo, mal de Parkinson, ou um paciente com o distúrbio, mas com um curso de doença excepcionalmente estável. No entanto, embora seja prudente esperar que indivíduos idosos saudáveis e sem sintomas, respectivamente, terão desenvolvido anticorpos protetores anti-a-sinucleína mais regularmente do que indivíduos mais jovens, os últimos podem ser usados como fonte para a obtenção de um anticorpo humano da presente invenção. Isto é particularmente verdadeiro para pacientes mais jovens que são predispostos a desenvolver uma forma familiar de uma doença sinucleinopática, mas permanecem sem sintomas, uma vez que seu sistema imunológico e funções de resposta são mais eficientes do que em adultos mais velhos.
[00137] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. As moléculas de anticorpo exemplares que compreendem pelo menos uma CDR que pode ser incluída em anticorpos do indivíduo é descrita neste documento.
[00138] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido da técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante, conforme descrito neste documento.
[00139] Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo da invenção compreende uma região constante sintética, em que um ou mais domínios são parcialmente ou inteiramente deletados ("anticorpos de domínio deletado"). Em determinadas modalidades, os anticorpos modificados compatíveis irão compreender construtos de domínio deletado ou variantes, em que o domínio CH2 inteiro foi removido (Δconstrutos de CH2). Para outras modalidades, um peptídeo de curta ligação pode ser substituído para o domínio deletado para proporcionar flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Os construtos de domínio deletado podem ser derivados, usando um vetor que codifica um domínio humano constante de IgG1, ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO02/060955 e WO02/096948A2. Este vetor é projetado para deletar o domínio CH2 e fornecer um vetor sintético que expressa uma região constante IgG1 de domínio deletado.
[00140] Em determinadas modalidades, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da presente invenção são minicorpos. Os minicorpos podem ser feitos, usando os métodos descritos na técnica, ver, por exemplo, patente US 5.837.821 ou pedido internacional WO 94/09817.
[00141] Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo da invenção compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina tendo uma deleção ou substituição de alguns ou até mesmo de um único aminoácido, desde que este permita a associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação do Fc e, assim, aumentar a localização da α-sinucleina. De forma similar, um ou mais domínios da região constante que controla a função efetora (por exemplo, ligação do complemento) pode ser deletado. Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas do anticorpo (meia-vida sérica), enquanto deixa outras funções desejáveis associadas ao domínio da região constante intacto do indivíduo. Além disso, conforme aludido acima, as regiões constantes dos anticorpos divulgados podem ser sintéticas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que aprimoram o perfil do construto resultante. A este respeito, pode ser possível interromper a atividade proporcionada por um sítio de ligação conservado (por exemplo ligação do Fc) enquanto mantém substancialmente a configuração e o perfil imunogênico do anticorpo modificado. Ainda, outras modalidades, compreendem a adição de um ou mais aminoácidos à região constante para melhorar as características desejáveis, tais como a função efetora ou proporcionar mais anexação de carboidrato ou citotoxina. Em tais modalidades, pode ser desejável inserir ou replicar sequências específicas derivadas dos domínios da região constante selecionados.
[00142] A presente invenção também fornece anticorpos que compreendem, consistem essencialmente, ou consistem em variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) descritas neste documento, cujos anticorpos ou fragmentos se ligam imunoespecificamente à α- sinucleína. As técnicas padrões conhecidas por aqueles versados na técnica podem ser usadas para introduzir as mutações na sequência nucleotídica que codifica um anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR que resultam em substituições de aminoácidos. As variantes (incluindo derivados) podem codificar menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos, ou menos de 2 substituições de aminoácidos, em relação à região VH de referência, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, região VL, VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga similar. As famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas ( por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados para a atividade biológica para identificar os mutantes que mantêm a atividade (por exemplo, a capacidade de se ligar à a-sinucleína).
[00143] Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas em regiões de estrutura ou apenas em regiões CDR de uma molécula de anticorpo. As mutações introduzidas podem ser silenciosas ou mutações missense neutras, por exemplo, tem pouco ou nenhum efeito sobre a capacidade de um anticorpo de se ligar ao antígeno, de fato, algumas dessas mutações não alteram a sequência de aminoácidos de qualquer jeito. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso do códon, ou melhorar a produção de anticorpos de um hibridoma. As regiões de codificação otimizadas para o códon que codificam os anticorpos da presente invenção são divulgadas em outro lugar neste documento. Alternativamente, as mutações missense não neutras podem alterar a capacidade de um anticorpo de se ligar ao antígeno. A localização da maioria das mutações silenciosas e missense neutras é provável de estar nas regiões de estrutura, enquanto a localização da maioria das mutações missense não neutras é provável de estar na CDR, embora isto não seja uma exigência absoluta. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de projetar e testar moléculas mutantes com as propriedades desejadas, tais como nenhuma alteração na atividade de ligação ao antígeno ou alteração na atividade de ligação (por exemplo, melhorias na atividade de ligação ao antígeno ou mudança na especificidade do anticorpo). Seguinte à mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa rotineiramente e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada, (por exemplo, capacidade de se ligar imunoespecificamente pelo menos a um epítopo da a-sinucleína) podem ser determinadas, usando as técnicas descritas neste documento ou modificando rotineiramente as práticas conhecidas na técnica.
[00144] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser um RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de um DNA de fita única e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita única e dupla, RNA de fita única e dupla, e RNA que é mistura de regiões de fita única e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita única ou, mais normalmente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita única e dupla. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo pode ser composto de regiões de fita tripla compreendendo RNA ou DNA ou RNA e DNA. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo também pode conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por outras razões. As bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao DNA e RNA; assim, o "polinucleotídeo" envolve quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente as formas modificadas.
[00145] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção da cadeia pesada de imunoglobulina ou porção da cadeia leve) pode ser criado pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo na sequência nucleotídica da imunoglobulina, tal que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como a mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais.
[00146] Como é conhecido, o RNA pode ser isolado das células B originais, células de hibridoma ou de outras células transformadas por técnicas padrão, tais como extração de isotiocianato de guanidínio e precipitação seguida por centrifugação ou cromatografia. Em que desejável, o mRNA pode ser isolado do RNA total por técnicas padrão, como cromatografia em celulose oligo dT. Técnicas adequadas são familiares na técnica. Em uma modalidade, os cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo pode ser feitos, simultanea ou separadamente, usando a transcriptase reversa e a DNA polimerase, em conformidade com os métodos bem conhecidos. A PCR pode ser iniciada por iniciadores consenso de região constante ou iniciadores mais específicos baseados no DNA da cadeia pesada e leve e nas sequências de aminoácidos publicadas. Conforme discutido acima, a PCR também pode ser usada para isolar os clones de DNA que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser triadas por iniciadores consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas da região constante humana.
[00147] O DNA, normalmente o DNA plasmidial, pode ser isolado das células, usando as práticas conhecidas na técnica, restrição mapeada e sequenciada, de acordo com as técnicas padrão, bem conhecidas apresentadas em detalhes, por exemplo, nas referências anteriores em relação às técnicas de DNA recombinante. É claro, o DNA pode ser sintético, de acordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise subsequente.
[00148] Uma modalidade fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada (VH) da imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:20.
[00149] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido da VH idêntica, ou idêntica exceto por uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácidos, à SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:20.
[00150] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada (VH) da imunoglobulina, em que pelo menos uma, duas ou todas as três CDRs da região variável da cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica às sequências de aminoácido da cadeia pesada de referência VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 representadas pela SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente. Assim, esta modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que codifica uma região variável da cadeia pesada da invenção que tem as sequências de aminoácido da VH-CDR1, VH- CDR2 e VH-CDR3 relacionadas àquelas representadas pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente, como mostrado na Fig. 1.
[00151] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada (VH) da imunoglobulina, na qual as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 representados pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente, como mostrado na Fig. 1.
[00152] Uma outra modalidade fornece uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo a VH codificada pelo polinucleotídeo que se liga especificamente ou preferencialmente à a-sinucleína humana.
[00153] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve (VL) da imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:26.
[00154] Uma outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido da VL idêntica, ou idêntica exceto por uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácidos, à SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:26.
[00155] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia leve (VL) da imunoglobulina, em que pelo menos uma, duas ou todas as três as VL- CDRs da região variável da cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácido da cadeia leve de referência VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 representadas pelas SEQ ID NO23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente. Assim, esta modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que codifica uma região variável da cadeia leve da invenção que tem as sequências de aminoácido da VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 relacionadas àquelas representadas pelas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente, como mostrado na Fig. 1.
[00156] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia leve (VL) da imunoglobulina, na qual as regiões VL-CDR1, VL- CDR2 e VL-CDR3 têm sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 representados pelas SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18, respectivamente, como mostrado na Fig. 1.
[00157] Uma outra modalidade fornece uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo a VL codificada pelo polinucleotídeo que se liga especificamente ou preferencialmente à a-sinucleína humana.
[00158] Como conhecido na técnica, a "identidade da sequência" entre dois polipeptídeos ou dois polinucletídeos é determinada, comparando-se a sequência de aminoácido ou um polipeptídeo ou polinucleotídeo à sequência de um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo. Quando discutido neste documento, se qualquer polipeptídeo específico for pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipeptídeo, pode ser determinado, usando métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica, tais como, mas não se limitando a, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). O BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar o BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência específica é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâmetros são definidos, é claro, tal que a porcentagem de identidade é calculada ao longo do comprimento total da sequência polipeptídica de referência e que as lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência sejam permitidas.
[00159] Em uma modalidade da presente invenção, o polinucleotídeo compreende, consiste essencialmente em, consiste em um ácido nucleico tendo uma sequência polinucleotídica da VH apresentada na SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO:21, ou a VL apresentada na SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:28. A este respeito, a pessoa versada na técnica compreenderá facilmente que os polinucleotídeos que codificam pelo menos o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada podem codificar o domínio variável de ambas as cadeias de imunoglobulina ou apenas uma.
[00160] A presente invenção também inclui os fragmentos dos polinucleotídeos da invenção, conforme descrito em outro lugar. Adicionalmente, os polinucleotídeos que codificam polinucleotídeos de fusão, fragmentos Fab e outros derivados, conforme descrito neste documento, são também contemplados pela invenção.
[00161] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência nucleotídica do anticorpo é conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados, por exemplo, conforme descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição contendo porções da sequência codificadora do anticorpo, anelamento e ligação desses oligonucleotídeos, e, em seguida, a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.
[00162] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo pode ser gerado a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo específico não está disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser quimicamente sintetizado ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerado a partir de, ou de ácidos nucleicos, tais como polyA + do RNA, isolado de qualquer tecido ou células expressando o anticorpo α- sinucleína-específico, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação por PCR, usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem, usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência específica do gene para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem, então, ser clonados em vetores de clonagem replicáveis, usando qualquer método bem conhecido na técnica.
[00163] Uma vez que a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácido correspondente do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo é determinada, sua sequência nucleotídica pode ser manipulada, usando os métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências nucleotídicas, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese sítio-dirigida, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) e Ausubel etal., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), que estão incorporados em sua totalidade para referência neste documento), para gerar anticorpos tendo uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.
[00164] Após a manipulação do material genético isolado para fornecer anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos são normalmente inseridos em um vetor de expressão para a introdução nas células hospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de anticorpo. A expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo do mesmo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que se liga a uma molécula alvo é descrita neste documento. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou uma porção do mesmo (por exemplo, contendo o domínio variável da cadeia pesada ou leve), da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido pela tecnologia do DNA recombinante, usando as práticas bem conhecidas na técnica. Assim, os métodos para a preparação de uma proteína pela expressão de um polinucleotídeo contendo uma sequência nucleotídica codificadora de anticorpo são descritos neste documento. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir os vetores de expressão contendo as sequências codificadoras de anticorpo e sinais de controle transcricionais e translacionais apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, assim, fornece vetores replicáveis compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula do anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou um domínio variável da cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligados a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência nucleotídica que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO 86/05807 e WO 89/01036; e patente US n°. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado nesse vetor para a expressão da cadeia pesada ou leve inteira.
[00165] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado neste documento para significar os vetores usados em conformidade com a presente invenção como um veículo para introduzir e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira. Conforme conhecido pelos versados na técnica, tais vetores podem facilmente ser selecionados a partir do grupo consistindo em plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, os vetores compatíveis com a invenção do momento irão compreender um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou procarióticas. Para as finalidades desta invenção, numerosos sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animais, como o vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus vaccínia, baculovirus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação interna do ribossomo. Adicionalmente, as células que integraram o DNA em seus cromossomos podem ser selecionadas, introduzindo um ou mais marcadores que permitem a seleção de células transfectadas. O marcador pode proporcionar prototrofia para um hospedeiro auxotrófico, resistência à biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados, como o cobre. O gene marcador selecionável também pode ser ligado diretamente às sequências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por cotransformação. Elementos adicionais também podem ser adicionados para uma síntese ótima de mRNA. Esses elementos podem incluir sequências sinais, sinais de splice, bem como promotores transcricionais, potenciadores e sinais de terminação.
[00166] Em determinadas modalidades, os genes da região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão juntamente com os genes da região constante da cadeia pesada e leve (por exemplo, humano), conforme discutido acima. Em uma modalidade, isto é efetuado, usando um vetor de expressão proprietário da Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA, divulgado na patente US n°. 6.159.730. Este vetor contém o promotor/potenciador do citomegalovírus, o promotor principal da beta globina de camundongo, a origem do SV40 de replicação, a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, éxon 1 e éxon 2 da neomicina fosfotransferase, o gene da di-hidrofolato redutase a sequência líder. Este vetor foi encontrado resultar em uma expressão de nível muito alto de anticorpos mediante a incorporação dos genes da região variável e constante, transfecção em células CHO, seguido pela seleção no meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. É claro, qualquer vetor de expressão, que seja capaz de provocar a expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Os exemplos de vetores adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 e pZeoSV2 (disponíveis pela Invitrogen, San Diego, CA) e ao plasmídeo pCI (disponível pela Promega, Madison, WI). Em geral, a triagem de grandes números de células transformadas para aqueles que expressam adequadamente altos níveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina é a experimentação de rotina que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos. Sistemas de vetor também são ensinados nas patentes US nos. 5.736.137 e 5.658.570, cada uma das quais está incorporada em sua totalidade neste documento para referência. Este sistema fornece altos níveis de expressão, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetor exemplares são divulgados, por exemplo, na patente US n°. 6.413.777.
[00167] Em outras modalidades, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção podem ser expressos, usando construtos policistrônicos, tais como aqueles divulgados na publicação do pedido de patente US n°. 20030157641 A1 e incorporada neste documento em sua totalidade. Nesses sistemas de expressão, múltiplos produtos do gene de interesse, como as cadeias pesada e leve de anticorpos, podem ser produzidos a partir de um único construto policistrônico. Esses sistemas vantajosamente usam um sítio de entrada interna do ribossomo (IRES) para fornecer níveis relativamente altos de anticorpos. As sequências de IRES compatíveis são divulgadas na patente US n°. 6.193.980 que também está incorporada neste documento. Aqueles versados na técnica compreenderão que tais sistemas de expressão podem ser usados para produzir efetivamente toda a gama de anticorpos divulgada no pedido do momento.
[00168] De forma mais geral, uma vez que o vetor ou sequência de DNA que codifica uma subunidade monomérica do anticorpo foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas para aqueles versados na técnica. Esses incluem, mas não estão limitados a transfecção, incluindo o uso de lipotransfecção, por exemplo, Fugene ou lipofectamina, fusão de protoplasto, precipitação de fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envelopado, microinjeção e infecção com vírus intacto. Normalmente, a introdução do plasmídeo no hospedeiro é através do método padrão de coprecipitação de fosfato de cálcio. As células hospedeiras que abrigam o construto de expressão são cultivadas em condições apropriadas para a produção das cadeias leves e das cadeias pesadas e analisadas para a síntese de proteínas da cadeia pesada e/ou leve. As técnicas de ensaio exemplares incluem o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise de separador de célula ativado por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica e similares.
[00169] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são, então, cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo para uso nos métodos descritos neste documento. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada do mesmo, operacionalmente ligado a um promotor heterólogo. Para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam as cadeias pesada e leve podem ser inseridos em uma célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina inteira, conforme detalhado abaixo.
[00170] A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem a expressão igual dos polipeptídeos da cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser usado um único vetor que codifica os polipeptídeos da cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeias pesadas livres tóxicas; ver Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(1980), 2197. As sequências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender o cDNA ou o DNA genômico.
[00171] Conforme usado neste documento, as "células hospedeiras" referem-se às células que abrigam os vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e que codificam pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições dos processos de isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de célula" são usados de forma permutável para denotar a fonte de anticorpo, a menos que seja claramente especificado o contrário. Em outras palavras, a recuperação do polipeptídeo a partir das "células" pode significar tanto a partir das células inteiras centrifugadas, quanto a partir da cultura de células contendo o meio e as células suspensas.
[00172] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão no hospedeiro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para uso nos métodos descritos neste documento. Tais sistemas de expressão no hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências codificadoras de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências nucleotídicas codificadoras apropriadas, expressam uma molécula do anticorpo da invenção in situ. Estes incluem, mas não estão limitados a micro-organismos, tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmidial ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo sequências codificadoras de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão recombinante de levedura contendo sequências codificadoras de anticorpo; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão recombinante de vírus (por exemplo, baculovírus) contendo sequências codificadoras de anticorpo; sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão recombinante de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão recombinantes de plasmídeo (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências codificadoras de anticorpo; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, COS, CHO, NSO, BLK, 293, células 3T3) que abrigam construtos de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma das células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenovírus; o promotor do vírus vaccínia 7,5 K). As células bacterianas, tais como de Escherichia coli, ou células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula de anticorpo recombinante inteira, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamíferos, tais como as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em conjunto com um vetor, como o elemento do promotor do gene inicial intermediário principal do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos; ver, por exemplo, Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.
[00173] A linhagem de células hospedeiras usadas para a expressão de proteína é frequentemente de origem mamífera; aqueles versados na técnica são creditados com a capacidade de determinar as linhagens de células hospedeiras específicas que são mais adequadas para o produto do gene desejado a ser expresso nelas. As linhagens de células hospedeiras exemplares incluem, mas não estão limitadas a, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chinês, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (um derivado do CVI com o antígeno SV40 T), VERY, BHK (rim de hamster bebê), MDCK, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/O (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). As linhagens de células hospedeiras estão normalmente disponíveis pelos serviços comerciais, a American Tissue Culture Collection ou pela literatura publicada.
[00174] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida, a qual modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto do gene da forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e o processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o processamento pós- translacional e modificação de proteínas e produtos de genes. As linhagens celulares apropriadas ou sistemas de hospedeiro podem ser escolhidos para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína estrangeira expressa. Para este fim, podem ser usadas células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto do gene.
[00175] A longo prazo, a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes, de expressão estável é usada. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam de forma estável a molécula de anticorpo pode ser projetada. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com o DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, potenciador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc) e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA estrangeiro, as células projetadas são permitidas crescer, por exemplo, por 1-2 dias em meios enriquecidos e, então, são trocadas para meios seletivos. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem o plasmídeo de forma estável em seus cromossomos e cresçam para formar os foci que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser usado vantajosamente para projetar linhagens celulares que expressam de forma estável a molécula de anticorpo.
[00176] Um número de sistemas de seleção pode ser usado, incluindo, mas não se limitado aos genes do herpes simplex vírus timidina quinase (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), da hipoxantina- guanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, proc. Natl. Acad. Sci. USA 48(1992), 202) e da adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência ao anti- metabólito pode ser usada como a base da seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; e Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Os métodos comumente conhecidos na técnica da tecnologia do DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13,Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que estão incorporados em sua totalidade neste documento para referência.
[00177] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação do vetor, para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987). Quando um marcador no sistema de vetor expressando anticorpo é ampliável, um aumento do nível do inibidor presente na cultura da célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará; ver Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257.
[00178] A produção in vitro permite aumentar proporcionalmente para gerar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. As técnicas para o cultivo de células de mamíferos em condições de cultura de tecidos são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator de transporte aéreo ou em um reator de agitador contínuo, ou cultura de célula imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microgrânulos de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo, filtração de gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre celulose DEAE ou cromatografia de imunoafinidade, por exemplo, após a biossíntese preferencial de um polipeptídeo de região de dobradiça sintético ou antes ou subsequente à etapa de cromatografia HIC descrita neste documento.
[00179] Genes que codificam anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção também podem ser expressos em células de não mamíferos tais como bactérias ou insetos ou células de levedura ou de plantas. Bactérias que absorvem facilmente os ácidos nucleicos incluem os membros da enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou de Salmonella; Bacillaceae, como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Será apreciado ainda que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólogos normalmente se tornam parte dos corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e, em seguida, montados em moléculas funcionais. Em que as formas tetravalentes dos anticorpos são desejadas, as subunidades serão, então, se automontar em anticorpos tetravalentes; ver, por exemplo, o pedido internacional WO02/096948.
[00180] Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado, dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade dessa proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, os vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser usados. Esses vetores incluem, mas não estão limitados a, o vetor de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), nos quais a sequência codificadora de anticorpo pode estar ligada individualmente no vetor na estrutura com a região codificadora lacZ para que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic acid Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509), e similares. Os vetores pGEX também podem ser usados para expressar os polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação a uma matriz de grânulos de glutationa- agarose seguida por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir a trombina ou os sítios de clivagem da protease do fator Xa para que o produto do gene clonado alvo possa ser liberado da porção GST.
[00181] Além dos procarióticos, os micróbios eucarióticos também podem ser usados. O Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de padeiro comum, é o mais usado entre os micro-organismos eucarióticos embora uma série de outras cepas sejam comumente disponíveis, por exemplo, Pichia pastoris. Para a expressão no Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157) é comumente usado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1 que fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura em que falta a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N°. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula de levedura hospedeira fornece, então, um ambiente eficaz para a detecção da transformação pelo crescimento na ausência de triptofano.
[00182] Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear (AcNPV) de Autographa californica é normalmente usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificadora de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor da poliedrina).
[00183] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção foi expressa de forma recombinante, os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias individuais pesadas ou leves, ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção, podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, de afinidade, particularmente de afinidade para o antígeno específico após a Proteína A, em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, por exemplo, precipitação de sulfato de amônio, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas; ver, por exemplo, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternativamente, um método para aumentar a afinidade dos anticorpos da invenção é divulgado na publicação da patente US 2002-0123057 A1.
[00184] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo do anticorpo compreende uma sequência de aminoácido ou uma ou mais frações normalmente não associada a um anticorpo. Modificações exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. Por exemplo, em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo fv de cadeia única da invenção pode compreender uma sequência ligante flexível, ou pode ser modificado para adicionar uma porção funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina, ou uma marca, como um fluorescente, radioativa, enzima, magnético nuclear, metal pesado e similares).
[00185] Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de anticorpo da invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma proteína de fusão. As proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação à α-sinucleina da imunoglobulina com pelo menos um sítio de ligação alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, uma porção a qual não está naturalmente ligado na natureza. As sequências de aminoácido podem normalmente existir em proteínas separadas que são unidas no polipeptídeo de fusão ou elas podem normalmente existir na mesma proteína, mas são colocadas em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por síntese química, ou por criação e tradução de um polinucleotídeo no qual as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada.
[00186] O termo "heterólogo", como aplicado para um polinucleotídeo ou polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado a partir de uma entidade distinta daquela do restante da entidade à qual está sendo comparado. Por exemplo, conforme usado neste documento, um "polipeptídeo heterólogo" a ser fundido com um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou análogo do mesmo é derivado de um polipeptídio de uma não imunoglobulina da mesma espécie, ou de um polipeptídeo de imunoglobulina ou de não imunoglobulina de uma espécie diferente.
[00187] Conforme discutido em mais detalhes em outro lugar neste documento, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ainda ser fundidos de forma recombinante a um polipeptídeo heterólogo no Nou C-terminal ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipeptídeos ou a outras composições. Por exemplo, os anticorpos podem ser fundidos de forma recombinante ou conjugados a moléculas úteis como marcas em ensaios de detecção e moléculas efetoras, tais como polipeptídeos heterólogos, drogas, radionuclídeos, ou toxinas; ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO92/08495; WO91/14438; WO89/12624; patente US n°. 5.314.995, e pedido de patente Europeia EP 0 396 387.
[00188] Os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser compostos de aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isosteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por gene. Os anticorpos podem ser modificados por processos naturais, tal como o processamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar do anticorpo, incluindo a estrutura principal do peptídeo, as cadeias laterais do aminoácido e os terminais amino ou carboxila, ou em frações tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou variáveis em vários sítios em um dado anticorpo. Além disso, um dado anticorpo pode conter muitos tipos de modificações. Os anticorpos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado da ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os anticorpos cíclicos, ramificados, e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-translacionais ou podem ser feitos por métodos sintéticos. As modificações incluem a acetilação, acilação, ribosilação do ADP, amidação, ligação covalente da flavina, ligação covalente de uma porção de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfatidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama- carboxilação, glicosilação, formação de GPI âncora, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA veículo a proteínas, como arginilação, e ubiquitinação; ver, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, WH Freeman and Company, New York 2a Ed, (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).
[00189] A presente invenção também fornece proteínas de fusão que compreendem um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo, e um polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma ou mais das regiões VH de um anticorpo da invenção ou a sequência de aminoácido de uma ou mais das regiões VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento divulgados neste documento compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três das VH-CDRs de um anticorpo, ou fragmentos, variantes, ou derivados do mesmo, ou a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três das VL- CDRs de um anticorpo, ou fragmentos, variantes, ou derivados do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de uma VH-CDR3 de um anticorpo da presente invenção, ou fragmento, derivado ou variante do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga, cuja proteína de fusão se liga especificamente à a-sinucleína. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de pelo menos uma região VH de um anticorpo da invenção e a sequência de aminoácido de pelo menos uma região VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Em algumas modalidades, as regiões VH e VL da proteína de fusão correspondem a um anticorpo de fonte única (ou scFv ou fragmento Fab) que se liga especificamente à a-sinucleína. Ainda em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento divulgados neste documento compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três ou mais das VH-CDRs de um anticorpo e a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das VL-CDRs de um anticorpo, ou fragmentos ou variantes do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Em determinadas modalidades, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais das VH-CDR(s) ou VL-CDR(s) correspondem a um anticorpo de fonte única (ou scFv ou fragmento Fab) da invenção. As moléculas de ácido nucleico que codificam essas proteínas de fusão também são abrangidas pela invenção.
[00190] Exemplos de proteínas de fusão relatadas na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; e Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-selectina (receptor de direcionamento) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; e Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 13031313); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991),721-730); CTLA-4 (Lisley et al, J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al, Cell 66 (1991.) 1133-1144); receptor TNF (Ashkenazi et al, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; e Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991). e receptor de IgE (Ridgway e Gorman, J. Cell. Biol.115 (1991), Abstract No. 1448).
[00191] Como discutido em outros lugares no presente documento, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser fundidos em polipeptídeos heterólogos para aumentar a meia vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado com os anticorpos da invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo, ver, por exemplo, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.
[00192] Além disso, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser fundidos em sequências marcadoras, como um peptídeo para facilitar a sua purificação ou detecção. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos marcadora é um peptídeo hexa-histidina (HIS), assim como o marcador fornecido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, por exemplo, hexa-histidina fornece uma conveniente purificação da proteína de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis para a purificação incluem, mas não estão limitados ao marcador "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina da influenza (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767) e o marcador "flag".
[00193] Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidas na técnica; ver, por exemplo, patente n° US 5.116.964 e 5.225.538. O local preciso em que a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para otimizar as características de secreção ou ligação da proteína de fusão. O DNA que codifica a proteína de fusão é então transfectado para dentro de uma célula hospedeira para a expressão.
[00194] Anticorpos da presente invenção podem ser usados de forma não conjugada ou podem ser conjugados com pelo menos uma dentre uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção do alvo, ou para geração de imagens ou tratamento do paciente. Anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser marcados ou conjugados, tanto antes ou depois da purificação, quando a purificação é realizada. Em particular, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-drogas, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídeos, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.
[00195] Os conjugados que são imunotoxinas incluindo os anticorpos convencionais têm sido amplamente descritos na técnica. As toxinas podem ser acopladas aos anticorpos por meio de técnicas de acoplamento convencional ou imunotoxinas contendo porções de toxina de proteína podem ser produzidas como proteínas de fusão. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados de forma correspondente para obter tais imunotoxinas. Os exemplos ilustrativos dessas imunotoxinas são aqueles descritos por Byers, Seminars Cells. Biol. 2 (1991), 59-70 e por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
[00196] As pessoas versadas na técnica apreciarão que os conjugados também podem ser montados usando uma variedade de técnicas, dependendo do agente selecionado a ser conjugado. Por exemplo, os conjugados com biotina são preparados, por exemplo, reagindo um polipeptídeo de ligação a-sinucleína com um éster ativado de biotina, como o éster N-biotina hidroxisuccinimida. Da mesma forma, os conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, aqueles listados no presente documento, ou pela reação com um isotiocianato, tal como isotiocianato de fluoresceína. Conjugados de anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção são preparados de maneira análoga.
[00197] A presente invenção abrange ainda os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção conjugados em um diagnóstico ou agente terapêutico. Os anticorpos podem ser usados diagnosticamente para, por exemplo, demonstrar a presença de uma doença neurológica, indicar o risco de contrair uma doença neurológica, monitorar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença neurológica, ou seja, doença sinucleinopática como parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento e/ou prevenção. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado com uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons utilizando diversas tomografias por emissão de pósitrons, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos; ver, por exemplo, patente n° US 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como diagnóstico de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; adequados exemplos de complexos de grupos prostéticos incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos adequados de materiais fluorescentes incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 111In ou 99Tc.
[00198] Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo também pode ser marcado de forma detectável por meio do acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo com marcação quimioluminescente é então determinada por meio da detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Exemplos de compostos particularmente úteis de marcação quimioluminescente são luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio e éster oxalato.
[00199] Uma das maneiras em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado pode ser detectável por meio de marcadores é através da ligação do mesmo com uma enzima e usando o produto ligado em um ensaio imunoenzimático (EIA) (Voller, A. "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). A enzima, que é ligada ao anticorpo, reagirá com um substrato adequado, como um substrato cromogênico, de tal forma a produzir uma molécula química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. Enzimas que podem ser usadas para marcar o anticorpo detectável incluem, mas não estão limitadas a malato desidrogenase, estafilocócicas nuclease, delta-5-esteroide isomerase, álcool de levedura desidrogenase, alfa- glicerofosfato, desidrogenase, fosfato triose isomerase, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, betagalactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenas, glicoamilase, e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. A detecção também pode ser realizada por meio de comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com os padrões similares de preparação.
[00200] A detecção também pode ser feita usando qualquer um dentre uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por meio da marcação radioativa do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado, é possível detectar o anticorpo através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (Março, 1986)), que é incorporado por referência neste documento). O isótopo radioativo pode ser detectado por meio de, incluindo mas não limitado a, um contador gama, um contador de cintilação, ou autorradiografia.
[00201] Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo pode também ser marcado de forma detectável usando metais que emitem fluorescência tais como 152Eu ou outros da série dos lantanídios. Esses metais podem ser anexados ao anticorpo usando tais grupos de quelação de metal, tais como ácido dietilenotriaminepentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
[00202] Técnicas para conjugar várias frações em um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivados do mesmo são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158.
[00203] Como mencionado, em certas modalidades, uma porção que melhora a estabilidade ou a eficácia de uma molécula de ligação, por exemplo, uma ligação polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunoespecífico do mesmo podem ser conjugados. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado com as moléculas de ligação da invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.
[00204] A presente invenção refere-se a composições que compreendem a referida molécula de ligação a-sinucleína, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção ou derivados, ou suas variantes, ou o polinucleotídeo, vetor ou célula da invenção. A composição da presente invenção pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode incluir outros agentes, tais como: interleucinas ou interferons, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica. Por exemplo, para uso no tratamento do mal de Parkinson o agente adicional pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de pequenas moléculas orgânicas, anticorpos anti- a-sinucleína e suas combinações. Assim, em uma modalidade, a presente invenção refere-se ao uso da molécula de ligação de α- sinucleína, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção ou de uma molécula de ligação que tenham substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um dos mesmos, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico para o tratamento profilático e terapêutico de uma doença sinucleinopática, acompanhamento da progressão de uma doença sinucleinopática ou uma resposta de um tratamento para uma doença sinucleinopática em um objeto para determinar o risco de um objeto de desenvolver uma doença sinucleinopática.
[00205] Assim, em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma desordem neurológica caracterizada por acúmulo anormal e/ou deposição de a-sinucleína no cérebro e no sistema nervoso central, respectivamente, em que método compreende administração a um indivíduo com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das moléculas de ligação a-sinucleína, anticorpos, polinucleotídeos, vetores ou células descritos acima na presente invenção. Em determinadas modalidades, o NI-202.22D11 ou um fragmento, variante ou seu derivado é entregue. O termo "distúrbio neurológico" inclui, entre outras, doenças sinucleinopáticas como o mal de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de sistemas múltiplos (MSA). Salvo declaração ao contrário, os termos neurodegenerativos, neurológico ou neuropsiquiátrico são usados indistintamente neste documento.
[00206] Uma vantagem particular da abordagem terapêutica da presente invenção reside no fato de que os anticorpos da presente invenção são derivados de células B ou células de memória B de idosos sem sinais de parkinsonismo e, portanto, são, com uma certa probabilidade, capazes de prevenir uma doença sinucleinopática clinicamente manifesta, ou de diminuir o risco de ocorrência da doença clinicamente manifesta, ou de retardar o início ou progressão da doença clinicamente manifesta. Normalmente, os anticorpos da presente invenção também já passaram por maturação somática com sucesso, ou seja, a otimização com relação à seletividade e eficácia na alta afinidade de ligação para o alvo a-sinucleína molécula por meio de variação somática das regiões variáveis do anticorpo.
[00207] O conhecimento de que tais células in vivo, por exemplo, em um ser humano, não tenham sido ativadas por meio de proteínas relacionadas ou outras proteínas fisiológicas no sentido de uma reação alérgica ou autoimunológica também é de grande importância médica uma vez que isso significa uma chance consideravelmente maior de sucesso de vida através das fases de teste clínico. Por assim dizer, eficiência, aceitabilidade e tolerabilidade já foram demonstradas antes do desenvolvimento pré-clínico e clínico do anticorpo profilático ou terapêutico em pelo menos um objeto humano. Assim, pode-se esperar que os anticorpos humanos anti-a-sinucleína da presente invenção, sua eficiência para alvo de estrutura específica como agente terapêutico e sua probabilidade reduzida de efeitos colaterais aumentam significativamente a sua probabilidade clínica de sucesso.
[00208] A presente invenção também fornece um produto farmacêutico e de diagnóstico, respectivamente, embalagem ou kit composto por um ou mais recipientes com um ou mais dos ingredientes acima descritos, por exemplo, anticorpo anti-a-sinucleína, fragmento de ligação, derivados ou variantes dos mesmos, polinucleotídeo, vetor ou célula da presente invenção. Associado com tal(is) recipientes(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração em seres humanos. Além disso, ou, alternativamente, o kit é composto por reagentes e/ou instruções para o uso em ensaios de diagnóstico apropriados. A composição, por exemplo, kit da presente invenção, é, naturalmente, particularmente adequada para a avaliação de riscos, prevenção, diagnóstico e tratamento de um distúrbio que é acompanhado da presença de a-sinucleína e, em especial, aplicável ao tratamento do mal de Parkinson (PD), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de sistemas múltiplos (MSA).
[00209] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos na técnica; ver, por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) pela University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683306472. Exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas de tampão fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis etc. Composições compreendendo esses transportadores podem ser formuladas por métodos convencionais conhecidos. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo na dose adequada. A administração das composições adequadas pode ser efetuada de diferentes formas, por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, administração tópica ou intradérmica ou distribuição espinhal ou cerebral. Formulações em aerossol, tais como formulações de nasal incluem soluções aquosas purificadas ou de outro agente ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Tais formulações podem ser preferencialmente ajustadas a um pH e estado isotônico compatível com as membranas da mucosa nasal. Formulações para administração retal ou vaginal da podem ser apresentadas como um supositório com um veículo adequado.
[00210] Além disso, enquanto a presente invenção inclui o presente procedimento padrão (embora, felizmente, pouco frequente) de perfuração de um pequeno orifício no crânio para administrar um fármaco da presente invenção, em um aspecto, a molécula de ligação, especialmente de anticorpos ou um fármaco baseado em anticorpos da presente invenção pode atravessar a barreira hemato-encefálica, que permite a administração intravenosa ou oral.
[00211] O regime de dosagem será determinado pelo médico em atendimento e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as doses para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o composto específico a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outras drogas que estão sendo administradas concomitantemente. Preparativos para a administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, emulsões e suspensões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, como azeite, e os ésteres injetáveis orgânicos, tais como oleato de etila. Os transportadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, suspensões ou emulsões incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem a solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Transportadores intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer) e similares. Aditivos e outros conservantes também podem estar presentes, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode incluir adicionais agentes, tais como dopamina ou drogas psicofarmacológicas, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica.
[00212] Além disso, uma composição farmacêutica pode ser formulada como uma vacina, por exemplo, se a composição farmacêutica da invenção compreender um anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação, derivados ou suas variantes para a imunização passiva. Como mencionado na seção de fundamentos, as espécies oligoméricas de a-sinucleína foram relatadas extracelularmente no plasma e CSF (El-Agnaf et al., FASEB J. 20 (2006), 419-425) e estudos de imunização passiva em modelos de camundongos com o mal de Parkinson mostraram que os anticorpos monoclonais extracelulares de camundongos contra a-sinucleína podem reduzir a acumulação de agregados intracelulares de α- sinucleína (Masliah et al., Neuron, 46 (2005), 857-868). De acordo com isso, é prudente esperar que os anticorpos anti-a-sinucleína humanos e moléculas de ligação de a-sinucleína equivalentes da presente invenção são particularmente úteis como uma vacina para a prevenção ou melhora de doenças sinucleinopáticas tais como PD, DLB e MAS.
[00213] Em uma modalidade, é benéfico usar Fab recombinante (rFab) e fragmentos de cadeia simples (scFvs) do anticorpo da presente invenção, que podem mais facilmente penetrar uma membrana celular. Por exemplo, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) 16 de outubro; S1741-0134, publicado online a seguir, descreve o uso de Fab recombinante quimérico (rFab) e fragmentos de cadeia simples (scFvs) de anticorpo monoclonal WO-2 que reconhece um epítopo na região N-terminal de Aβ. Os fragmentos projetados foram capazes de (i) impedir fibrilização amiloide, (ii) desagregar fibrilas pré- formadas Aβ1 - 42 e (iii) inibir a neurotoxicidade de Aβ1-42 mediada por oligômero in vitro de forma tão eficiente quanto a molécula de IgG completa. As vantagens percebidas do uso de formatos de anticorpos engenheirados Fab e scFv pequenos que não possuem a função efetora incluem passagem mais eficiente através da barreira hemato- encefálica e minimizam o risco de desencadear reações colaterais inflamatórias. Além disso, além dos scFv e anticorpos de domínio simples manterem a especificidade de ligação de anticorpos completos, eles podem ser expressos como genes simples e intracelularmente em células de mamíferos como intracorpos, com potencial para alteração da dobradura, interações, modificações ou localização subcelular de seus alvos; ver para revisão, por exemplo, Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.
[00214] Em uma abordagem diferente Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, descrevem uma plataforma de tecnologia, chamada 'Tecnologia de SuperAnticorpo', que permite que os anticorpos sejam empurrados para dentro de células vivas, sem prejudicá-las. Esses anticorpos que penetram células abrem novas janelas terapêuticas e de diagnósticos. O termo "TransMabs" foi designado para estes anticorpos.
[00215] Uma modalidade adicional inclui a coadministração ou administração sequencial de outros agentes neuroprotetores úteis para o tratamento de uma doença sinucleinopática. Em uma modalidade, o agente adicional é compreendido na composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos de agentes neuroprotetores, que podem ser usados para tratar um objeto incluem, mas não são limitados a um inibidor da acetilcolinesterase, um antagonista do receptor glutamatérgico, os inibidores da quinase, inibidores de HDAC, agentes anti-inflamatórios, divalproato de sódio, ou qualquer combinação destes. Exemplos de outros agentes neuroprotetores que podem ser utilizados concomitante com a composição farmacêutica da presente invenção são descritos na técnica, ver, por exemplo, pedido internacional WO2007/011907. Em uma modalidade, o agente adicional é a dopamina ou um agonista do receptor de dopamina.
[00216] Em uma modalidade adicional da presente invenção, as moléculas de ligação de a-sinucleína, em especial anticorpos da presente invenção também podem ser coadministradas ou administradas antes ou após a terapia de transplante com transplantes neurais ou terapia com células-tronco úteis para o tratamento de uma doença sinucleinopática. Tais abordagens com transplantes de neurônios mesencefálicos embrionários têm sido realizadas em pacientes com mal de Parkinson com o objetivo de substituir os neurônios que são perdidos na doença e para o restabelecimento da neurotransmissão dopaminérgica no estriado. Depois de 11-16 anos após o transplante, descobriu-se que os neurônios enxertados continham os corpos de Lewy e neuritos de Lewy. Esta propagação da patologia de α-sinucleina do hospedeiro para os tecidos vazados pode ser impedida por meio da coadministração de moléculas de ligação de α-sinucleina, em anticorpos específicos da presente invenção.
[00217] Uma dose ou quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a essa quantidade de ingrediente ativo suficiente para melhorar os sintomas ou condição. A eficácia terapêutica e toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou com animais experimentais, como, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A relação de dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Em determinadas modalidades, o agente terapêutico na composição está presente em quantidade suficiente para restaurar ou preservar um comportamento normal e/ou propriedades cognitivas em caso de PD, DLB ou outras doenças sinucleinopáticas.
[00218] Pelo exposto, é evidente que a presente invenção engloba qualquer uso de uma molécula de ligação de a-sinucleína compreendendo pelo menos um CDR de NI-202.22D11 ou fragmentos, variantes ou derivados do mesmo, em particular para o diagnóstico e/ou tratamento de uma doença sinucleinopática como mencionado acima. A molécula de ligação pode ser um anticorpo da invenção presente ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo. Além disso, a presente invenção refere-se aos anticorpos anti-idiotípicos de qualquer um dos anticorpos descritos mencionados aqui. Estes são anticorpos ou outras moléculas de ligação que se ligam à única sequência de peptídeo antigênico localizado na região variável de um anticorpo, perto do local de ligação do antígeno, e são úteis, por exemplo, para a detecção de anticorpos anti-a-sinucleína na amostra de um indivíduo.
[00219] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição de diagnóstico envolvendo qualquer uma das moléculas de ligação de a-sinucleína descritas acima, anticorpos, fragmentos de antígeno de ligação, polinucleotídeos, vetores ou células da invenção e meios adequados para a detecção, opcionalmente, como reagentes convencionalmente usados em métodos de diagnóstico imunológicos ou baseados em ácido nucléico. Os anticorpos da invenção são, por exemplo, adequados para uso em imunoensaios em que eles podem ser utilizados na fase líquida ou ligados em um veículo em fase sólida. Exemplos de imunoensaios que podem utilizar o anticorpo da invenção são os imunoensaios competitivos e não competitivos em um formato direto ou indireto. Exemplos de tais imunoensaios são os radioimunoensaios (RIA), o sanduíche (ensaio imunométrico), citometria de fluxo e ensaios de Western Blot. Os antígenos e anticorpos da invenção podem ser ligados em muitos transportadores diferentes e usados para isolar as células especificamente ligadas nestes. Exemplos bem conhecidos de transportadores incluem vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextran, náilon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetitas. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os fins da invenção. Existem muitos marcadores diferentes e métodos de marcação conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser usados na presente invenção incluem enzimas, radioisótopos, metais coloidais, os compostos fluorescentes, compostos quimiluminescentes e compostos bioluminescentes; ver também as modalidades discutidas acima.
[00220] Por meio de uma modalidade adicional, as moléculas de ligação de α-sinucleina, em especial os anticorpos da presente invenção, são utilizados em um método para o diagnóstico de um distúrbio em um indivíduo através da obtenção de uma amostra de fluido corporal do indivíduo testado que pode ser uma amostra de sangue, uma amostra linfática ou qualquer outra amostra de fluido do corpo e colocar essa amostra de fluido corporal em contato com um anticorpo da presente invenção sob condições que permitam a formação de complexos antígeno-anticorpo. O nível de tais complexos é então determinado por meio de métodos conhecidos na técnica, um nível significativamente mais elevado do que aquele formado em uma amostra controle, indicando a doença no indivíduo testado. Da mesma forma, o específico antígeno ligado pelos anticorpos da invenção pode também ser usado. Assim, a presente invenção refere-se a um imunoensaio in vitro que compreende a molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção.
[00221] Neste contexto, a presente invenção também refere-se aos meios especificamente projetados para esta finalidade. Por exemplo, um arranjo baseado em anticorpos pode ser usado, que é carregado, por exemplo, com anticorpos ou equivalentes de moléculas de ligação de antígenos da presente invenção que reconhecem especificamente a α-sinucleina. O projeto de microarranjo de imunoensaios é resumido em Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. De acordo com isso, a presente invenção também se relaciona com microarranjos carregados com moléculas de ligação de α-sinucleina identificados de acordo com a presente invenção.
[00222] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para diagnosticar uma doença sinucleinopática em um indivíduo, o método compreendendo: (a) a avaliação do nível, localização, sua conformação ou combinação da α-sinucleina em um indivíduo a ser diagnosticado com o anticorpo ou seu fragmento de qualquer da invenção e (b) a comparação do nível, da localização, da conformação ou combinação disso da α-sinucleina no indivíduo a um ou mais padrões derivados de uma ou mais amostras controle,
[00223] em que uma diferença ou semelhança entre o nível, localização, conformação ou combinação disso da α-sinucleina no indivíduo e o padrão de referência indicam se o indivíduo tem uma doença sinucleinopática.
[00224] O indivíduo a ser diagnosticado pode estar em estado assintomático ou pré-clínico para a doença. O padrão de referência pode ser de um paciente com uma doença sinucleinopática, por exemplo, PD, DLB ou MSA, em que uma semelhança entre o nível, a localização, conformação ou combinação disso de α-sinucleina no indivíduo a ser diagnosticado e o padrão de referência indica que o individuo a ser diagnosticado tem uma doença sinucleinopática. Como alternativa, ou além disso, um padrão de referência é derivado de um individuo que não tem uma doença sinucleinopática. Em determinadas modalidades, o individuo a ser diagnosticado e os padrões de referência são combinados por idade. A análise pode ser feita in vivo ou através de uma amostra isolada do individuo a ser diagnosticado, por exemplo, qualquer fluido corporal suspeito de conter α-sinucleina, por exemplo, amostra de sangue, CSF ou urina.
[00225] O nível, a localização e/ou a conformação de α-sinucleina podem ser avaliados por qualquer método adequado conhecido na técnica compreendendo, por exemplo, a análise de α-sinucleina por uma ou mais técnicas escolhidas dentre Western Blot, imunoprecipitação, ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), separação de células com fluorescência ativada (FACS), eletroforese em gel bidimensional, espectroscopia de massa (MS), tempo de voo-MS de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF), tempo de voo de dessorção/ionização por superfície melhorada à laser (SELDI-TOF), cromatografia líquida de alta performance (HPLC), cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), cromatografia líquida multidimensional (LC), seguido por espectrometria de massa (MS/MS), e densitometria à laser. Geração de imagens in vivo de α-sinucleina compreende tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia por emissão de fóton único (SPECT), imagens ópticas na região do infravermelho próximo (NIR) ou imagens por ressonância magnética (MRI).
[00226] Métodos para diagnosticar uma doença sinucleinopática como PD, DLB ou MSA, o monitoramento de uma progressão da doença sinucleinopática e monitoramento de um tratamento da doença sinucleinopática utilizando anticorpos e meios relacionados que podem ser adaptados de acordo com a presente invenção também são descritos no pedido internacional WO2007/011907. Da mesma forma, os métodos de detecção de a-sinucleína baseado em anticorpos são descritos nos pedidos internacionais WO99/50300, WO2005/047860, WO2007/021255 e WO2008/103472, cujos conteúdos de divulgação na sua forma integral estão incorporados no presente documento por referência. Esses métodos podem ser aplicados como descritos, mas com um anticorpo específico de a-sinucleína, fragmento de ligação, derivados ou variantes da presente invenção.
[00227] Estas e outras modalidades são divulgadas e abrangidas pela descrição e exemplos da presente invenção. Adicional literatura sobre qualquer um dos materiais, métodos, usos e compostos a serem empregados em conformidade com a presente invenção podem ser recuperadas de bibliotecas públicas e bancos de dados usando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline" pode ser utilizado, que é hospedado pelo Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia e/ou a Biblioteca Nacional de Medicina dos Institutos Nacionais de Saúde. Bases de dados adicionais e endereços da web, como os do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI), que faz parte do European Molecular Biology Laboratory (EMBL) são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e também podem ser obtidos usando as ferramentas de busca na Internet. Uma visão geral de informações sobre patentes em biotecnologia e um levantamento de fontes relevantes de informações sobre patentes úteis para a busca retrospectiva e conhecimento atual é apresentada em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
[00228] A divulgação acima descreve de forma geral a presente invenção. Salvo declaração em contrário, um termo como aqui utilizado é designado coma definição, tal como prevista no Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado em 2000 e reimpresso em 2003, ISBN 0 19 850673 2. Vários documentos são citados ao longo do texto desta especificação. O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo referências bibliográficas, patentes concedidas, pedidos de patente publicados como citados ao longo deste pedido e as especificações do fabricante, instruções etc.) são expressamente incorporadas por referência, no entanto, não há admissão de que qualquer documento citado é de fato do estado da técnica em relação à presente invenção.
[00229] Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência dos seguintes exemplos específicos que são fornecidos neste documento para fins de ilustração somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
[00230] Os exemplos que seguem também ilustram a invenção, mas não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da invenção de qualquer maneira. Os seguintes experimentos nos Exemplos 1 e 2 são ilustrados e descritos com relação ao anticorpo NI- 202.3G12, NI-202.12F4 e NI-202.3D8 como clonados, ou seja, contendo mutações induzidas por iniciadores nas partes N-terminais da estrutura 1 Ig das regiões variável e não sendo ajustado a sequências de linhagem germinal (GL) de cadeias humanas variáveis pesadas e leves; ver Figura 1. No entanto, os outros anticorpos da série NI-202, em particular aqueles com as sequências GL ajustadas são estruturalmente similares e, portanto, se espera que estes possam fornecer resultados comparáveis. Estes anticorpos foram expressos em moléculas IgG1 humanas. Os seguintes experimentos nos Exemplos 3 e 4 são ilustrados e descritos com relação ao anticorpo NI- 202.12F4 com mutações induzidas por iniciador nas terminações N- das regiões variáveis Ig sendo ajustado a sequências de linhagem germinal (GL) de cadeias humanas variáveis pesadas e leves; ver Figura 1. Este anticorpo foi expresso como uma molécula quimérica em que os domínios variáveis ajustados humanos foram fundidos com as regiões constantes de IgG2a de camundongo para permitir os estudos de dosagem crônica em modelos de camundongos transgênicos sem induzir uma resposta imunológica anti-humana do camundongo.
[00231] Descrições detalhadas de métodos convencionais, como os aqui empregados, podem ser encontradas na literatura citada. Salvo indicação em contrário abaixo, a identificação de células B específicas de a-sinucleína e a clonagem molecular de anticorpos de a-sinucleína apresentando a especificidade de interesse, bem como sua expressão recombinante e caracterização funcional foi ou pode ser realizada, conforme descrito na seção de Exemplos e Métodos Suplementares de pedido internacional PCT/EP2008/000053 publicado como WO2008/081008 e PCT/EP2009/009186 publicado como WO2010/069603, cuja divulgação de conteúdo é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00232] His-a-sinucleína recombinante foi obtida pela expressão recombinante em Escherichia coli e posterior purificação utilizando precipitação induzida por calor, afinidade com níquel, troca de ânion e cromatografia de exclusão por tamanho.
[00233] Por exemplo, uma construção de a DNA que compreende cDNA que codifica a-sinucleína sob o controle do promotor T7 foi utilizada para transformar uma adequada cepa de Escherichia coli, tais como BL21 (DE3) e expressão de 200 ml de cultura de células foi induzida pela adição de 1mM isopropil e-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG). As células foram coletadas após 4 horas de indução a 37°C e então ressuspensas em 20 ml de Tris 50mM, NaCl 150 mM pH 8, seguido de sonificação. Após fervura durante 15 minutos, 17000g do sobrenadante resistente ao calor foram recolhidos. Semelhantemente, 17000g de sobrenadante resistente ao calor de Escherichia coli falso foi coletado. Depois que 17000g de sobrenadante resistente ao calor (20 ml) de Escherichia coli expressando a-sinucleína marcada com His foi ajustado para 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8, este foi carregado em uma coluna HisTrap HP 1ml (GE Life Science) e HIS-a-sinucleína foi eluída com um gradiente de imidazol 30-500mm. Frações contendo HIS-a-sinucleína foram reunidas e, em seguida, diluídas 1:10 com 50 mM Tris pH 8. As frações reunidas diluídas foram aplicadas em uma coluna de HiTrap Q HP 1ml (GE Life Science) e as proteínas ligadas foram eluídas em um gradiente de 3-1000 mM de NaCl. Finalmente, eluatos contendo HIS-α-sinucleina foram também purificados utilizando filtração em gel de alto desempenho (Superdex 200 10/300 GL). Este processo de purificação rende HIS-a-sinucleína com um grau de pureza de cerca de 99% estimada pelo SDS-PAGE e coloração Coomassie. A concentração de proteína purificada foi determinada através de um ensaio BCA (Pierce).
[00234] Microplacas com meia área de 96 poços (Corning) foram revestidas com HIS-a-sinucleína purificada ou a-sinucleína (rPeptídeo) em uma concentração padrão de 2μg/mL em revestimento de tampão (PBS pH 9,6) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas em PBS- T pH 7,6 e locais de ligação não específicos foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente com PBS-T contendo BSA 2% (Sigma, Buchs, Switzerland). O meio condicionado com células B foi pré- absorvido por 1 hora em temperatura ambiente com 10% de proteínas de E. coli resistentes ao calor em BSA 1%. Esta etapa de pré- absorção foi desenvolvida depois que várias tentativas anteriores de varredura por ELISA não foram bem sucedidas na identificação de específicos anticorpos de a-sinucleína humana. Assim, felizmente, descobriu-se que a pré-absorção da placa de ELISA com proteínas de E. coli resistentes ao calor exclui a varredura de falsos positivos, tais como anticorpos grudentos e anticorpos direcionados contra contaminações por proteína de E. coli provavelmente presentes em amostras de a-sinucleína purificada recombinante. O meio pré- absorvido foi então transferido das placas de culturas de células B de memória para placas de ELISA e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente. As placas de ELISA foram lavadas em PBS-T e então incubadas com anticorpos policlonais IgG anti-humano de burro conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (específico de fragmento FCY). Após a lavagem com PBS-T, a ligação de anticorpos humanos foi determinada pela medição da atividade de HRP em um ensaio colorimétrico padrão.
[00235] As amostras que contêm células de memória B foram obtidas de voluntários > 60 anos de idade. Todos os voluntários tinham em comum a falta de qualquer sinal de parkinsonismo. Células B vivas das culturas de células de memória B selecionadas são colhidas e mRNA é preparado. Sequências de imunoglobulina de cadeia leve e pesada são então obtidas utilizando iniciadores específicos para a estrutura de Ig 1 para todas as famílias humanas de cadeia variável leve e pesada como 5 'iniciadores em combinação com os iniciadores específicos para todos os segmentos J humanos (cadeia pesada e leve kappa) e segmentos C (cadeia leve lambda) como 3' iniciadores (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).
[00236] A identificação do clone do anticorpo com a especificidade desejada é realizada pela resseleção de ELISA sobre a expressão recombinante de anticorpos completos. A expressão recombinante anticorpos de IgG1 humano completo ou anticorpos quiméricos IgG2a é alcançada após a inserção das sequências variáveis de cadeia pesada e leve "na estrutura de leitura correta" em vetores de expressão que complementam a sequência de região variável com uma sequência de codificação de um peptídeo líder na extremidade 5' e na extremidade 3' com uma sequência que codifica os apropriados domínios constantes. Para essa finalidade, os iniciadores contidos nos locais de restrição designados para facilitar a clonagem das sequências de cadeia variável pesada e leve em vetores de expressão de anticorpos. As imunoglobulinas de cadeia pesada são expressas através da inserção do produto RT-PCR da cadeia pesada de imunoglobulina na estrutura em um vetor de expressão de cadeia pesada tendo um peptídeo de sinal e os domínios constantes de imunoglobulina humana gama 1 ou imunoglobulina de camundongo gama 2a. Imunoglobulina de cadeia leve kappa é expressa pela inserção do produto RT-PCR da cadeia leve kappa de NI-202.3D8 na estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve proporcionando um peptídeo de sinal e o domínio constante da imunoglobulina de cadeia leve kappa humana. As imunoglobulinas de cadeia leve lambda NI- 202.12F4 e NI-202.3G12 são expressas através da inserção do produto RT-PCR da cadeia leve lambda na estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve lambda proporcionando um peptídeo de sinal e o domínio constante da imunoglobulina de cadeia leve lambda humana ou de camundongo.
[00237] Anticorpos monoclonais funcionais recombinantes foram obtidos mediante a cotransfecção em células CHO ou HEK293 (ou qualquer outra linhagem celular recipiente apropriada de origem humana ou de camundongo) de um vetor de expressão Ig de cadeia pesada e um vetor de expressão de cadeia leve de Ig kappa ou lambda. O anticorpo monoclonal humano recombinante foi posteriormente purificado do meio condicionado usando uma coluna de purificação de proteína A padrão.
[00238] O anticorpo sinucleína pan Syn211 (Sigma) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante. Anticorpos humanos recombinantes de α-sinucleina NI202.22G11 e NI202.12F4 são anticorpos desta invenção. Eles foram expressos em HEK293 ou células CHO e, em seguida, o meio condicionado foi diretamente utilizado em aplicações subsequentes, a menos que seja declarado de forma contrária.
[00239] Os antígenos foram revestidos na concentração indicada em PBS pH 9,6 em microplacas de meia área com 96 poços (Corning) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas em PBS-T pH 7,6 e locais não específicos de ligação foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente com PBS-T contendo BSA 2% (Sigma). As sondas (anticorpos primários) foram então transferidas para poços e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após lavagem em PBS-T pH 7,6, os poços foram incubados com anticorpos secundários anti-humano policlonal conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) (para anticorpos recombinantes humanos), anticoelho (para anticorpo sinucleína pan) ou anti-camundongo (para LB509 ou Syn211) por 1 hora em temperatura ambiente. Após a rigorosa lavagem em PBS-T, a ligação das sondas foi determinada pela medição da atividade de HRP em um ensaio padrão colorimétrico usando 3,3 ', 5,5'-tetrametilbifenil- 4, 4'-diamina (Sigma) como substrato cromogênico.
[00240] Toda a sequência de a-sinucleína humana foi sintetizada como peptídeos sobrepostos, com comprimentos de 15 aminoácidos (aa) e uma sobreposição de 11 aa, acoplados através de um flexível vinculador de membrana de celulose (JPT, Berlin, Alemanha). Uma membrana que compreende um total de 33 peptídeos foi lavada em metanol e depois bloqueada com Rotiblock (Roth, Karlsruhe, Alemanha). A membrana foi incubada com anticorpos indicados diluídos em solução de bloqueio e, em seguida, com anticorpo secundário de peroxidase de raiz forte (HRP) marcado por 1 hora. Entre as incubações a membrana foi lavada 3x com PBS-T por 5 min. A membrana foi então desenvolvida usando ECL mais reagentes de detecção Western Blotting (GE Healthcare).
[00241] NI-202.12F4 (2 μg/mL) diluída em tampão de bicarbonato de sódio (pH 9,6) foi revestida a 4°C durante a noite em placas de ELISA. Em seguida, a placa foi bloqueada com 2% BSA PBS-T e posteriormente lavada com PBS-T. Peptídeos de a-sinucleína biotinilados indicados foram adicionados e, após incubação de 2 horas as placas foram lavadas com PBS-T. Após incubação com estreptavidina marcada com HRP por 1 hora, a ligação foi determinada pela medição da atividade de HRP em um ensaio colorimétrico padrão.
[00242] α-, β e Y-sinucleína são proteínas altamente homólogas que são expressas predominantemente no sistema nervoso, músculo esquelético e cardíaco. a-sinucleína está fortemente ligada a um amplo espectro de doenças CNS considerando β-sinucleína pode ser uma proteína neuroprotetora. Assim, a invenção fornece anticorpos terapêuticos contra variantes patológicas de a-sinucleína que não reagem com β e Y-sinucleína. A fim de apoiar o potencial uso terapêutico de NI-202.21D11, o anticorpo foi testado para a ligação com a, β e Y-sinucleína em um ELISA direto. a, β e Y-sinucleína recombinantes foi revestido em placas de ELISA, em concentração igual e então também incubadas com NI-202.21D11 recombinante ou um anticorpo de sinucleína pan de controle. O anticorpo sinucleína pan detecta todas as três proteínas sinucleína mas NI-202.21D11 exibe ligação seletiva para a-sinucleína (Fig. 2a).
[00243] a-sinucleína humana e de camundongo são proteínas altamente conservadas. Para sondar se recombinante NI-202.21D11 vincula preferencialmente a-sinucleína humana vs murino, recombinante com marcação His de a-sinucleína humana ou murino foram revestidas em placas de ELISA, em concentração igual e então testada para NI-202.21D11 e vinculação de NI-202.12F4 (Fig. 2b). NI- 202.21D11 detecta apenas humano a-sinucleína, considerando que NI-202.12F4 detecta a-sinucleína humana e murino neste ELISA direto (ver publicação N° PCT WO2010/069603 A1). Juntos esses resultados demonstram que NI-202.21D11 é altamente seletiva para a-sinucleína humana.
[00244] A meia concentração máxima eficaz (EC50) indica a potência da NI-202.21D11 foi determinada para as concentrações de revestimento de baixa e alta de a-sinucleína recombinante usando um ELISA a-sinucleína direto. Ligação de alta afinidade de NI-202.21D11 recombinante com um EC50 de ~ 200 pM foi observado para as concentrações de revestimento elevado da proteína a-sinucleína (20 μg/mL). Em concentrações menores de α-sinuclema, uma acentuada diminuição da afinidade foi observada (Fig. 3). Essas características estão em forte contraste com syn211 de anticorpos comercialmente disponíveis que também está detectando um epítopo no domínio C- terminal da a-sinucleína. Esta descoberta sugere que o NI-202.21D11 prefere um epítopo que é formado ou exposto sob condições de alta densidade, como os encontrados em espécies de alto peso molecular de a-sinucleína.
[00245] Ligação de NI-202.21D11 de a-sinucleína humana caracterizou-se ainda mais pela coloração imuno-histoquímica de seções de cérebro de ratos transgênicos a-sinucleína e de um paciente com um sinucleinopatia neuropatologicamente confirmado (demência com corpos de Lewy). NI-202.21D11 mostra coloração proeminente do corpo de Lewy e Lewy Neurite como inclusões em seções de Proteinase K de parafina tratada do tecido de cérebro de ratos transgênicos superexpressando a-sinucleína A53T humana (Fig. 4a). Nenhuma mancha de NI202-21D11 foi detectada nas seções de cérebro de ratos tipo selvagem corroborando que NI-202.21D11 é específica para a-sinucleína humana (Fig. 4b). NI-202.21D11 também detectou a-sinucleína patológica no tecido do cérebro humano de uma paciente com demência com corpo de Lewy (Fig. 4C). Esses resultados mostram que os anticorpos derivados de humano NI- 202.21D11 detecta a-sinucleína patológica no cérebro.
[00246] a-sinucleína é uma proteína naturalmente desdobrada com 140 aminoácidos (aa) de comprimento que é composta de três domínios. Estes são a região de repetição anfipática N-terminal (1-60 aa), a região central (61-95 aa) e a região C-terminal ácida (96-140 aa). (A) a fim de obter uma compreensão inicial para o domínio de ligação da NI-202.21D11, truncamentos de a-sinucleína recombinante foram testados para vinculação de NI-202.21D11 em um ELISA direto. Truncamentos de a-sinucleína recombinante de resíduos 1-60, 1-95, 61-140 e 96-140 foram revestidos em placas de ELISA e então incubados com NI-202.21D11 recombinante. Vinculação de NI- 202.21D11 foi observada somente para truncamentos de a-sinucleína 61-140 e 96-140 demonstrando que NI-202.21D11 vincula-se ao domínio C-terminal ácido de a-sinucleína (Fig. 5a).
[00247] A fim de compreender a sequência de reconhecimento de NI-202.21D11 mais detalhadamente, NI-202.21D11 foi testada para a ligação com sobreposição peptídeos lineares 15-mer que cobrem a sequência de aminoácidos de toda a-sinucleína humana. Peptídeos adjacentes compartilham uma sobreposição dos 11 resíduos e peptídeos são C-terminal colocados em uma membrana de suporte de celulose. NI-202.21D11 vincula a três peptídeos sobrepostos nomeadamente resíduos 109-123 (B08), 113-127 (B09) e 117-131 (B10) de α-sinucleina humana (Fig. 5b). Este resultado sugere que a sequência de reconhecimento mínimo dentro do C-terminal da α- sinucleína necessária para ligação de NI-202.21D11 é PVDPDNE (117-123). Notavelmente, NI-202.21D11 vincula peptídeo B10 ligeiramente menos que peptídeos B08 e B09. Assim, resíduos 113117, dentro de uma a-sinucleína podem influenciar na vinculação de NI-202.21D11.
[00248] Quase nenhuma ligação de NI-202.21D11 de a-sinucleína de camundongo foi observada em um ELISA direto (Fig. 2B). Alinhamento da sequência da sequência determinada de epítopo de NI-202.21D11 (PVDPDNE) à correspondente sequência de murino (PVDPGSE) sugere que D121 e N122 são aminoácidos-chaves para seletividade de NI-202.21D11 para a-sinucleína humana vs murino. A fim de confirmar o papel fundamental de N122/D121, a-sinucleína mutante recombinante humana D121G/N122S foi produzida e testada para ligação de NI202.21D11 em um ELISA direto. Como mostrado na Figura 5c NI-202.21D11 mostrou que quase nenhuma ligação para a- sinucleína humana D121G/N122S em comparação com wt de a- sinucleína humana. Um anticorpo de pan-sinucleína de controle foi usado como controle de normalização para revestimento igual de proteínas sinucleína.
[00249] Esses resultados mostram que o NI-202.21D11 é um anticorpo de a-sinucleína derivado de humano, detectando que um epítopo do C-terminal (resíduos 117-123) dentro a-sinucleína humana e aqueles aminoácidos N122/D121 contribuem para seletividade de a- sinucleína humana vs murino.
[00250] A fim de compreender a sequência de reconhecimento (epítopo) de NI-202.12F4 mais detalhadamente, a sobreposição de peptídeos lineares 15-mer que cobrem a sequência de aminoácidos de toda a-sinucleína humana foram testados para NI-202.12F4 vinculando por immunoblotting. Peptídeos adjacentes compartilham uma sobreposição dos 11 resíduos e peptídeos são C-terminal colocados em uma membrana de suporte de celulose. NI-202.12F4 apenas vinculado ao peptídeo N-terminal (A01) mostrando que o epítopo está dentro de resíduos (Fig 1-15. 6a). Uma vez que o NI-202.12F4 não se liga a resíduos de peptídeo (A02) 5-20, o epítopo começa entre resíduos 1 e 5. Para determinar o resíduo de início exato do epítopo, peptídeos sintéticos de a-sinucleína foram testados para vinculação de NI-202.12F4 em um ELISA de vinculação em solução. Primeiro a fim de validar a ligação em solução ELISA, peptídeos sintéticos de a- sinucleína 1-30 e 5-30 foram testados para vinculação de NI-202.12F4. NI-202.12F4 vincula a-sinucleína 1-30, mas não 5-30 validando o ensaio, confirmando que o epítopo começa entre o resíduo 1 e 5 (Fig. 6b). Em seguida, a-sinucleína 4-30 foi testada para vinculação de NI- 202.12F4. Como mostra na figura 6b NI-202.12F4 ligado a a- sinucleína 4-30. Esses resultados mostram que o epítopo NI-202.12F4 começa no resíduo 4.
[00251] NI-202.12F4 seletivamente vinculado a a-sinucleína mas não β - e Y-sinucleína. Alinhamento da sequência do epítopo de NI- 202.12F4, que contém a sequência (a-sinucleína 4-15), com a correspondente sequência de e-sinucleína, mostrou que essas sequências só diferem em um aminoácido. Lisina na posição 10 em a- sinucleína é substituída por metionina no e-sinucleína. Assim, NI202.12F4 deve vincular a e-sinucleína M10K mas não K10M de a- sinucleína. Para confirmação experimental, wt recombinante K10M a- sinucleína e wt e M10K e-sinucleína foram testados para vinculação de NI-202.12F4 em um ELISA direto. Como previsto NI202.12F4 somente vinculado a wt α-sinucleina e β-sinucleina M10K, mas não para wt β- sinucleína e α-sinucleina K10M (Fig. 6C). Um anticorpo pan-sinucleína vinculado a todas as quatro proteínas recombinantes demonstrando igualmente bem revestimento igual em placas de ELISA.
[00252] Todos juntos esses experimentos mostram que o epítopo para NI202.12F4 está localizado dentro de 4-15 de resíduos de α- sinucleína. O epítopo começa no resíduo 4 e termina entre resíduo 1115. Lisina na posição 10 em contas de α-sinucleina para a especificidade de NI-202.12F4 para α-e β-sinucleina.
Claims (16)
1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a α-sinucleina (SEQ ID NO: 1), caracterizado pelo fato de compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende as regiões determinantes de complementaridade de VH (CDRs) 1, 2 e 3, em que: (i) a região VH CDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 16; (ii) a região VH CDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 17; e (iii) a região VH CDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 18; e (b) uma região variável de cadeia pesadaleve (VL) que compreende VH CDRs 1, 2 e 3, em que: (i) a região VL CDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 23; (ii) a região VL CDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 24; e (iii) a região VL CDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 25, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado a um agente selecionado do grupo que consiste em um agente terapêutico, uma pró- droga, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificador de resposta biológica, um agente farmacêutico, uma substância detectável e polietilenoglicol (PEG).
2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) a VH compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 15, e a VL compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22; ou (b) a VH compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 20, e a VL compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 26.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é: (i) humanizado, quimérico ou totalmente humano; (ii) um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv de cadeia única ou um anticorpo de cadeia única; e/ou (iii) fusionado a um polipeptídeo heterólogo.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o agente é uma substância detectável.
5. Anticorpo anti-a-sinucleína isolado ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: (a) a VH compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 e 18, respectivamente; e (b) a VL compreende uma cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24 e 25, respectivamente; e em que o anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo compreende um agente que promove penetração da barreira hematoencefálica.
6. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a- sinucleína do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a VH e a VL compreendem as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs.: 20 e 26, respectivamente.
7. Anticorpo anti-a-sinucleína isolado ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: (a) a VH compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 e 18, respectivamente; e (b) a VL compreende uma cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24 e 25, respectivamente; e em que o anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo compreende um marcador detectável.
8. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a- sinucleína do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é selecionado do grupo que consiste em uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo e um metal pesado.
9. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a- sinucleína do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58, caracterizado pelo fato de que a VH e a VL compreendem as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 20 e 26, respectivamente.
10. Uso de um anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença sinucleinopática em um indivíduo humano, em que o anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que: (a) o VH compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 e 18, respectivamente; e (b) a VL compreende uma cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24 e 25, respectivamente.
11. Uso de um anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para diagnosticar uma doença sinucleinopática em um indivíduo humano, em que o anticorpo anti-a- sinucleína ou fragmento de ligação à a-sinucleína do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) em que: (a) a VH compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 e 18, respectivamente; e (b) a VL compreende uma cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24 e 25, respectivamente.
12. Uso de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o VH e o VL compreendem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 20 e 26, respectivamente.
13. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação à a- sinucleína do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença sinucleinopática em um indivíduo humano.
14. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação à a- sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição para diagnóstico de uma doença sinucleinopática em um indivíduo humano.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a doença sinucleinopática é mal de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB), atrofia de múltiplos sistemas (AMS), ou uma combinação das mesmas.
16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica VH e um polinucleotídeo que codifica VL, em que (a) o polinucleotídeo que codifica VH compreende a sequência de nucleotídeos que codifica VH estabelecida em SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 21, e (b) o polinucleotídeo que codifica VL compreende a sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28.
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