EA030777B1

EA030777B1 - Анти-альфа-синуклеинсвязывающие молекулы

Info

Publication number: EA030777B1
Application number: EA201391761A
Authority: EA
Inventors: Андреас Вайхофен; Ян Гримм; Кристоф Хок; Рогер Нитш; Лихэ Су; Пол Вейнреб
Original assignee: Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх; Юниверсити Оф Цюрих
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2018-09-28
Also published as: US9580493B2; JP2014528695A; KR20140053974A; LT2723379T; CY1121392T1; JP6302517B2; ES2699801T3; HUE041391T2; EA030777B9; EP2723379A4; DK2723379T3; US20180355027A1; EA201391761A1; CA2839563C; MX2014000054A; MX357193B; AU2012272790B2; SI2723379T1; BR112013033258B1; BR112013033258A8

Abstract

Описывается получение молекул, специфически связывающих α-синуклеин - против имуноглобулинов человека, например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные этого, а также способы, имеющие отношение к этому. Дополнительно описывается получение молекул, связывающих α-синуклеин - против иммуноглобулинов человека, которые связываются со специфическими N-концевым и C-концевым эпитопами α-синуклеина человеческого организма. Описанные в этой заявке связывающие молекулы могут использоваться в фармацевтических и диагностических композициях для анти-α-синуклеиновой иммунотерапии и диагностики соответственно.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к новым молекулам, специфически связывающимся с асинуклеином, и, в частности, к человеческим антителам, а также к их фрагментам, производным и вариантам из этого, распознающим соответственно а-синуклеин и его агрегированные формы. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим и диагностическим композициям, содержащим такие связывающие молекулы, антитела и мимики из этого, которые полезны как в диагностике в качестве инструментов для идентификации токсических видов а-синуклеина в плазме и С8Р (цереброспинальной жидкости), так и в стратегиях пассивной вакцинации для лечения расстройств, ассоциированных с агрегатами а-синуклеина, таких как болезнь Паркинсона (БП), деменция с тельцами Леви (ТЛ) и ТЛвариант болезни Альцгеймера (БА), а также другие синуклеинопатии.

Нарушенные фолдинг и агрегирование белка являются патологическими аспектами множества нейродегенеративных болезней. Агрегаты а-синуклеина являются главными компонентами телец Леви и нейритов Леви, ассоциированных с болезнью Паркинсона (БП). Исходно несвернутый белок асинуклеин может принимать различные агрегированные морфологии, в том числе олигомеры, протофибрилы и фибрилы. Среди них малые олигомерные агрегаты проявили себя как особо токсичные.

Природные аутоантитела против а-синуклеина были обнаружены у здоровых людей, а их изменяющиеся уровни у пациентов были связаны с особыми нейродегенеративными расстройствами, см. обзор [№£Г е! а1., АШойптип. Кеу. 7 (2008), 501-507]. Таким образом, антитела у пациентов с болезнью Паркинсона, возникающие естественным путем спонтанно или после вакцинации даже у здоровых пациентов, могут выполнять защитную роль, действуя против агрегированного а-синуклеина, см., например, [Аои1Ге е! а1., №ито1оду 58 (2002), 1435-1436 апб РарасЪтош е! а1., 1. ЫеитосЬет. 101 (2007), 749-756]. До сих пор, оценить терапевтическое значение аутоантител было весьма трудно. Это объясняется недостатком прямых экспериментальных способов для их выделения и составления затем их характеристики ш νίίτο.

Сравнительно недавно был обнаружен внеклеточный олигомерный вид а-синуклеина в плазме и С8Р [Е1-АдпаГ е! а1., РА8ЕВ 1. 20 (2006), 419-425], а иммунизационные исследования типовых образцов БП у мышей показали, что внеклеточные мышиные моноклональные антитела против а-синуклеина способны уменьшать аккумулирование его внутриклеточных агрегатов [МазЪаЪ е! а1., Ыеигоп, 46 (2005), 857868], подтверждая предположение о том, что антитела, нейтрализующие нейротоксичные агрегаты без препятствия выполнению благоприятных функций мономерного а-синуклеина, могут быть полезными для терапии. Однако терапевтическому применению мышиных антител в человеческом организме препятствует реакция антител человеческого организма, направленная против мышиных антител (НАМА) ввиду природы последних, отличающихся от природы антител человеческого организма.

В работе [Етаб1 е! а1. ш 1. Мо1. Вю1. 368 (2007), 1132-1144] описано выделение фрагментов одноцепочечных антител (5сР\ъ) из библиотеки отображенных фагами антител, базирующейся на человеческих последовательностях против а-синуклеина, которые связываются только с олигомерной формой асинуклеина и ингибируют как агрегирование, так и токсичность а-синуклеина ш νίΙΐΌ. Однако, хотя образовать 8сРν8 с помощью фагового отображения довольно просто, этот способ имеет и серьезные недостатки, заключающиеся в том, что продуцированные таким образом антитела подвержены риску нежелательной перекрестной реактивности против аутоантигенов и им недостает характеристик оптимизированных эволюционным путем естественных человеческих антител, продуцированных иммунной системой человека. Кроме того, такие антитела не могут быть достаточно специфичными из-за перекрестной реактивности с другими белками и/или с белком-мишенью в контексте нормального физиологического окружения и функционирования. Так, например, в случае болезни Паркинсона, антитела, которые также перекрестно реагируют с физиологическими производными а-синуклеина, в потенциале могут стать причиной побочных эффектов, относящиеся к нормальным функциям физиологических целевых структур. В этом отношении должна быть напрямую вызвана нежелательная аутоиммунная болезнь - также тяжело прогнозируемый риск в концептуальном проекте экспериментов по активной иммунизации с использованием белковых структур, которые в вариантной форме также возникают физиологическим путем.

Совсем недавно Зайтц и др. |8еП/ е! а1. 81. Копдте88 бег ИеийсЪеп СезеИзсЪай Гит Ыеиго1од1е тй РопЫ1бип§8акабет1е НатЪигд 10.-13.09.2008] сообщили о выделении поликлональных аутоантител против а-синуклеина из растворов различных иммуноглобулинов и образцов крови единичных доноров с помощью аффинной хроматографии. Однако, помимо того факта, что этот способ позволяет получить лишь ограниченные количества целевых антител, поликлональные антитела годны только для ограниченного использования в терапевтических целях по причине, например, их гетерогенности и риска оказаться загрязненными другими связанными с а-синуклеином молекулами, имеющими нежелательные

- 1 030777 побочные эффекты. Аналогично диагностическая ценность поликлональных антител является сравнительно низкой, поскольку изменчивость состава антител будет влиять на общую специфичность и реакционную способность. Все это еще более справедливо в отношении субъекта агрегирования и отложения тогда, когда антитела конфликтуют с протеинами, по причине нарушенного фолдинга.

Таким образом, существует необходимость в преодолении вышеописанных ограничений и в создании терапевтического и диагностического антитела человеческого организма против а-синуклеина.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном из вариантов осуществления данного изобретения предлагается выделенная связывающая молекула, которая специфически связывается с эпитопом в интервале от 4 до 15 аминокислоты асинуклеина человеческого организма (8ЕО ГО N0:1). Согласно некоторым особенностям изобретения связывающая молекула конкурентно ингибирует связывание эталонных моноклональных антител N1202.12Р4 с а-синуклеином. Связывающей молекулой в соответствии с изобретением может быть антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В особых вариантах осуществления изобретения связывающей молекулой не является моноклональное антитело человеческого организма ΝΙ-202.12Ρ4 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное.

Изобретение дополнительно обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (или который) специфически связывается с а-синуклеином человеческого организма, содержит вариабельную область тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина, где УН содержит полипептидную последовательность, являющуюся как минимум на 90% или на 100% идентичной последовательности 8Е0 ГО N0:15 или 8Е0 ГО N0:20. Предлагается также выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (или который) специфически связывается с а-синуклеином человеческого организма, содержит УН и УЬ, где УЬ содержит полипептидную последовательность, которая как минимум на 90% или 100% является идентичной последовательности 8Е0 ГО N0:22 или 8Е0 ГО N0:26. Аналогично изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (или который) специфически связывается с человеческим а-синуклеином, содержит УН и УЬ, где УН и УЬ содержат соответственно полипептидные последовательности, являющиеся как минимум на 90% или 100% идентичными эталонным полипептидам 81 У) ГО N0:15 и 81 У) ГО N0:22, 81 У) ГО N0:15 и 81 У) ГО N0:26, 81 У) ГО N0:20 и 81 У) ГО N0:22 или 81 У) ГО N0:20 и 81 У) ГО N0:26.

Дополнительно обеспечиваются выделенные полипептиды, включая: выделенный полипептид, содержащий УН, где область 0ΌΚ1, принадлежащая УН, является полностью идентичной или идентичной, за исключением менее чем 3 консервативных замен аминокислот, эталонной последовательности 8Е0 ГО N0:16, принадлежащей тяжелой цепи 0ΌΚ1; выделенный полипептид, содержащий УН, где область 0ΌΚ2, принадлежащая УН, является полностью идентичной или идентичной, за исключением менее чем 5 консервативных замен аминокислот, эталонной последовательности 8Е0 ГО N0:17, принадлежащей тяжелой цепи 0ΌΚ2; выделенный полипептид, содержащий УН, где область 0ΌΚ3, принадлежащая УН, является полностью идентичной или идентичной, за исключением менее чем 5 консервативных замен аминокислот, эталонной последовательности 8Е0 ГО N0:18, принадлежащей тяжелой цепи 0ΌΚ3; выделенный полипептид, содержащий УЬ, где область 0ΌΚ.1, принадлежащая УЬ, является полностью идентичной или идентичной, за исключением менее чем 5 консервативных замен аминокислот, эталонной последовательности 8Е0 ГО N0:23, принадлежащей легкой цепи 0ΌΚ.1; выделенный полипептид, содержащий УЬ, где область 0ΌΚ2, принадлежащая УЬ, является полностью идентичной или идентичной, за исключением менее чем 3 консервативных замен аминокислот, эталонной последовательности 8Е0 ГО N0:24, принадлежащей тяжелой цепи 0ΌΚ2; и выделенный полипептид, содержащий УЬ, где область 0ΌΚ3, принадлежащая УЬ, является полностью идентичной или идентичной, за исключением менее чем 3 консервативных замен аминокислот, эталонной последовательности 8Е0 ГО N0:25, принадлежащей тяжелой цепи 0ΌΚ3. В каждом из вышеуказанных полипептидов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, специфически связываются с а-синуклеином человеческого организма.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело или его фрагмент предпочтительно связывается с нелинейным конформационным эпитопом а-синуклеина человеческого организма. В других вариантах выделенное антитело или его фрагмент предпочтительно связывается с асинуклеином человеческого организма в олигомерной или агрегированной форме. Возможными есть также варианты, в которых выделенное антитело или его фрагмент не связывается специфически с βсинуклеином или γ-синуклеином человеческого организма и/или не связывается специфически с мышиным а-синуклеином.

Изобретением предлагается также композиция, содержащая антитело или его фрагмент, как описано выше, и носитель. Указанная композиция может быть терапевтической.

Дополнительно обеспечиваются один или несколько выделенных полинуклеотидов, кодирующих полипептид или связывающуюся молекулу так, как описано в данной заявке, а также векторы и клеткихозяева для экспрессии таких связывающих молекул.

- 2 030777

Конкретным объектом настоящего изобретения является обеспечения способов лечения или профилактики синуклеинопатий, какими являются, например, болезнь Паркинсона (БП), деменция с тельцами Леви (ТЛ) и множественная системная атрофия (МСА). Эти способы включают в себя введение пациенту, в организме которого есть α-синуклеин, являющийся мишенью для антитела, эффективной концентрации молекулы, связанной с α-синуклеином, конфликтующим с человеческим организмом, которой может быть, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производная. Прочие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны на основании последующего описания и примеров.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельной области, то есть тяжелая цепь и легкие каппа-цепи антитела человеческого организма ΝΙ-202.21Ώ11. Остов (РК: Ртате^отк) и области определения комплементарности (СЭР) отмечены подчеркиванием СЭР. Благодаря данной стратегии клонирования, аминокислотная последовательность на Ν-конце тяжелой цепи и легкой цепи в принципе может содержать индуцированные затравкой реконструкции в РК1, которые, однако, существенно не влияют на биологическую активность антитела. Для получения консенсусного человеческого антитела нуклеотидные и аминокислотные последовательности исходного клона настраивали и приводили в соответствие с последовательностями вариабельных областей подходящих эмбриональных линий человека в базе данных, например, в УЬаке (уЬа8е.ттс-сре.сат.ас.ик), поддерживаемой в медицинском консультационном центре по белковой инженерии (МКС СеШге Тот Рто1еш Епфпееппд.С’атЬпбде. ИК). Те аминокислоты, которые считаются потенциально отклоняющимися от консенсусной последовательности эмбриональной линии и, следовательно, могли бы возникать из-за воздействия РСК-затравок, выделены жирным шрифтом.

Фиг. 2. В прямом иммуноферментном анализе (ЕЫ8А), рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ό11 человеческого организма селективно связывает α-синуклеин человеческого организма с β-, γ-синуклеином и мышиным α-синуклеином. Рекомбинантный α-, β-, γ-синуклеин человеческого организма и рекомбинантные Ηίδ-меченные α-синуклеины человеческого организма и мыши наносили на ЕЬРЗА пластины в одинаковой концентрации (2 мкг/мл). Затем пластины зондировали рекомбинантными антителами ΝΙ202.21Ό11 и ΝΙ-202.12Ρ4 человеческого организма и антителом к пан-синуклеину. (А) Рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ό11 селективно связывает α-синуклеин, в то время как антитело к пан-синуклеину связывается со всеми тремя синуклеиновыми белками, подтверждая тем самым одинаковость покрытия рекомбинантных белков. (В) Рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ό11 является селективным к αсинуклеину человеческому организму в сравнении с мышиным α-синуклеином. С другой стороны, при проведении прямого анализа ЕЬРЗА антитело ΝΙ-202.12Ρ4 связывается α-синуклеином как человеческого организма, так и мыши.

Фиг. 3. Рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ό11 предпочтительно связывается с высокоплотным αсинуклеиновым покрытием. Рекомбинантный α-синуклеин человеческого организма наносили на пластинки ЕЫ8А в указанных концентрациях и зондировали с использованием различных концентраций антитела N1-202.21011 при проведении прямого анализа ЕЫ§А (П 20 мкг/мл; 5 мкг/мл; ♦ 1 мкг/мл; 0,25 мкг/мл; ▼ 0,1 мкг/мл). Для каждой концентрации покрытия была определена половинная концентрация от максимально эффективной концентрации (ЕС50), которая указала на потенциал антитела.

Фиг. 4. Иммуногистохимический анализ связывания ΝΙ-202.2ΡΟ11 показал ярко выраженное окрашивание α-синуклеиновой патологии с включениями, подобными тельцам и нейритам Леви, на парафиновых срезах, взятых (А) у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих α-синуклеин А53Т человеческого организма, и (С) из ткани человеческого мозга пациента, имеющего деменцию с тельцами Леви. (В) В ткани мыши дикого типа и (внизу справа) во вторичном антителе, служащем в качестве контрольного образца, окрашивание не наблюдалось. НС=(Н1рросатри8) гиппокамп, СТХ=(Сойех) кора и В§=(Вга1П81ет) ствол головного мозга.

Фиг. 5. Картирование эпитопов выявило С-концевой связывающий эпитоп в человеческом αсинуклеине (аа 117-123) для антитела ΝΙ-202.21Ώ11. (А) Рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ώ11 связывалось с С-концевым доменом α-синуклеина человеческого организма при проведении в прямого анализа ЕЬРЗА. Усечения α-синуклеина наносились на пластины ЕЬРЗА в одинаковых концентрациях (2 мкг/мл). Антитело ΝΙ-202.21Ώ11 связывалось только с усеченным α-синуклеином аа 61-140 и 95-140, но не связывалось с аа 1-60, 1-95. (В) Анализ способом пептидного сканирования показал связывание ΝΙ202.21И11 с перекрывающимися пептидами В08 (аа 109-123), В09 (аа 113-127) и В10 (аа 117-131) αсинуклеина человеческого организма, свидетельствуя о том, что минимальной последовательностью в αсинуклеине человеческого организма, требующейся для связывания ΝΙ-202.21Ώ11, является РУОРОИЕ (аа 117-123). (С) Рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ώ11 при проведении прямого анализа ЕЬКА показало пониженное связывание с α-синуклеином человеческого организма Ώ121Ο/Ν122δ. Рекомбинантные немутированные и мутированные α-синуклеиновые белки наносились в одинаковой концентрации (2 мкг/мл) на пластины ЕЬРЗА планшеты и тестировались на предмет связывания с ними рекомбинантного

- 3 030777

ΝΙ-202.21Ό11

Фиг. 6. Антитело ΝΙ-202.12Ρ4 селективно связывается с самым Ν-концом α-синуклеина. (А) Результаты пептидного сканирующего анализа связывания ΝΙ-202.12Ρ4 с пептидом А01 показывают, что минимальная последовательность для распознавания лежит в интервале 1-15 остатков α-синуклеина. (В) Пептиды искусственного α-синуклеина на участках1-30, 4-30 и 5-30 были протестированы на связывание с ΝΙ-202.12Ρ4 в растворе ЕБ-ΙδΑ. Антитело ΝΙ-202.12Ρ4 связывалось с аа 1-30 и 4-30 и не связывалось с 530. Это свидетельствует о том, что последовательность эпитопа антитела ΝΙ202.12Ρ4 начинается с остатка 4 α-синуклеина. (С) Остаток К10 на участке эпитопа антитела ΝΙ-202.12Ρ4 является ключевой аминокислотой для селективности антитела ΝΙ-202.12Ρ4 по отношению к синуклеинам от α до β. Рекомбинантные немутированные и мутантные α- и β-синуклеиновые белки были протестированы проведением прямого анализа ЕБ-ΙδΑ на связывание с ними антитела ΝΙ-202.12Ρ4. Антитело ΝΙ-202.12Ρ4 связывалось с α-синуклеином дикого типа и мутантным β-синуклеином М10К, но не связывалось с β-синуклеином дикого типа и мутантным α-синуклеином К10М. Это свидетельствует о том, что кислотный остаток К10 является ответственным за селективность связывания ΝΙ-202.12Ρ4 с α-синуклеином.

Подробное описание изобретения

Ι. Определения

Заболевания, ассоциированные с синуклеином, или синуклеинопатии составляют группу нейродегенеративных расстройств, объединенных общим патологическим повреждением, состоящим из агрегатов нерастворимого α-синуклеинового белка в селективно уязвимых популяциях нейронов и нервной ткани. В группу этих расстройств входят болезнь Паркинсона (БП), паркинсоническая деменция (ПД), деменция с тельцами Леви (ТЛ), генерализованная нейроаксональная дистрофия (болезнь Галлервордена-Шпатца), начинающаяся в юношеском возрасте, утрата автономности (УА), мультисистемная атрофия (МСА) и нейродегенерация с аккумулированием железа в мозгу 1 типа. Клиническими проявлениями этих заболеваний являются хроническое и прогрессирующее ухудшение моторных, когнитивных, поведенческих и автономных функций в зависимости от распределения повреждений.

Болезнь Паркинсона является независящим от возраста нейродегенеративным расстройством с неизвестной этиологией. Считается, что спорадическая болезнь Паркинсона возникает от двух факторов генетической восприимчивости и влияния окружающей среды. Считается также, что болезнь Паркинсона (БП), однажды возникшая по различным механизмам, продолжает развиваться по общему патофизиологическому пути. Одним из общих ее пунктов является вовлечение α-синуклеина. Связь этого белка с патогенезом болезни Паркинсона была установлена в результате идентификации как точковых мутаций и трипликации гена в семейных заболеваниях, локализации α-синуклеина в тельцах Леви, одного из очевидных проявлений патологических признаков болезни Паркинсона, так и корреляции экспрессии αсинуклеина с патологией болезни в нейротоксических моделях болезни Паркинсона. Известно также, что в спорадические заболевания вовлекаются особые формы α-синуклеина (например, неправильно свернутый и связанный с α-синуклеином допамин).

Синуклеины являются малыми, растворимыми белками, синтезируемыми, главным образом, в нервной ткани и в некоторых видах опухолей. Это семейство включает в себя три известных белка: αсинуклеин, β-синуклеин и γ-синуклеин. Все синуклеины имеют общий высоко-консервативный, αспиральный липидсвязывающий мотив с подобием липидсвязывающих доменов класса А2, которые принадлежат обменным алолипопротеинам. Члены синуклеинового семейства не обнаруживаются у непозвоночных, хотя они сохраняют некоторое структурное подобие с обильными белками поздней эмбриональной стадии растений. α-, β-синуклеиновые белки обнаруживаются, в первую очередь, в тканях мозга, где они находятся, главным образом, в пресинаптических окончаниях. γ-Синуклеиновый белок наблюдается, главным образом, в периферийной нервной системе и сетчатке, однако его экспрессия в опухолях молочных желез является маркером развития опухоли. Нормальные клеточные функции не были определены ни для одного из синуклеиновых белков, хотя имеются данные, свидетельствующие об их роли в регулировании стабильности мембраны и/или метаболизма. Мутации в α-синуклеине редко связываются с семейными случаями болезни Паркинсона, начавшейся в раннем возрасте, а белок, помимо болезни Паркинсона, аномально аккумулируется также при болезни Альцгеймера и нескольких других нейродегенеративных болезнях, см. обзор, например, в публикации [Оеотде, Оепоте ΒίοΙ. 3 (2002), гсОс\У5 3002.1-геОе\У5 3002.6 риЪШЬеД опйпе ИееетЬет 20, 2001], где в ТаЫе 1 даны перечни уникальных членов семейства синуклеинов, которые в настоящее время представлены в базе данных ОепВапк, содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

α-Синуклеин первоначально был идентифицирован в человеческом мозге как белокпредшественник не^-амилоидного компонента (НАК) бляшек болезни Альцгеймера (БА); см., например, [Иеба е1 а1., Ргос. Ναΐΐ. АсаД. δει. υδΑ 90 (1993), 1282-1286]. α-Синуклеин, называемый также предшественником не-Αβ компонента БА амилоида (ГГНАК), является белком, состоящим из 140 аминокислот, α-синуклеин существует в нативной форме случайного клубка; однако изменения рН, молекулярные наслоения, содержание тяжелых металлов и уровни допамина оказывают влияние на конформацию бел- 4 030777 ка. Изменения конформации на олигомерную, прото-фибриллярную, фибриллярную и агрегатную форму регулируют, очевидно, токсичность белка. Все больше фактов указывает на то, что α-синуклеин с присоединенным к нему допамином преобразуется в фибрил быстрее, чем белок без этого присоединения. Кроме того, допамин, вызывая сверхэкспрессию α-синуклеина, является токсичным.

В данном описании термины α-синуклеин, альфа-синуклеин, α-синуклеин и а§уи используются как взаимозаменяемые и означают нативную мономерную форму α-синуклеина. Термин αсинуклеин используется также в обозначениях других конформеров α-синуклеина, например, αсинуклеина, связанного с допамин-хиноном, и олигомеров или агрегатов α-синуклеина. Термин αсинуклеин используется также для обобщенного обозначения всех типов и форм α-синуклеина. Последовательность белка человеческого α-синуклеина имеет вид ΜΌνΡΜΚΟΤδΚΑΚΕοννΑΑΑΕκτκρονΑΕΑΑΟκτκΕοντγνοδκτκΕοννΗΟ νΑτνΑΕκτκΕρντΝνοοΑνντοντΑΥΆΟΙΥΙΛΤΧ,ΆΟδΙΆΆΆΊΟιίΎΚΙΠίΟΙ ,ΟΚΧΕΕΟΆΡ ΟΕΟΙΕΕΙ)\1ΕΥΙ)ΕΙ)\Ί ΥΧΥΊΑΙΕδΕΕΟΥΌΙίΥΤΤΕΆ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1). Аминокислотную последовательность α-синуклеина можно найти в литературе и в соответствующих базах данных, например, [иеба с1 а1., |Ыб.| ОеиВаик δΜδδρτοί: 1оеи8 §ΥυΑ_ΗυΜΑΝ, ассевδίοη иитЬет Ρ37840]. Не-Ар компонент (ηοη-Αρ сотропеШ) БА-амилоида (ΝΑΟ) продуцируется из αсинуклеина. ΝΑΟ, гидрофобный в высокой степени домен в α-синуклеине, является пептидом, состоящим как минимум из 28 аминокислотных остатков (остатки 60-87) и по желанию - из 35 аминокислотных остатков (остатки 61-95). ΝΑΟ склонен к образованию бета-листовой структуры [Ггац е1 аЬ, ВюскепиДгу. 34 (1995) 10139-10145]. Аминокислотные последовательности ΝΑΟ описаны в [беивеи е1 аЬ, ВюсЬет. I. 310 (1995), 91-94; ОеиВаик ассеввюи иитЬет §56746 аиб иеба е! а1., ΡΝΑ§ υδΑ 90(1993), 1282-11286].

Дезагрегированный α-синуклеин и его фрагменты, включая ΝΑΟ, представляют собой мономерные пептидные блоки. Дезагрегированный α-синуклеин и его фрагменты в общем случае являются растворимыми и способны самоагрегироваться с образованием растворимых олигомеров. Олигомеры αсинуклеина и их фрагменты обычно являются растворимыми и существуют предпочтительно в форме αспиралей. Мономерный α-синуклеин может быть приготовлен ш νίίτο путем растворения лиофилизованного пептида в чистом ДМСО с помощью разрушения ультразвуком. Приготовленный таким образом раствор центрифугируют, удаляя из него все нерастворимые частицы. Выражение агрегированный αсинуклеин или его фрагменты, включая ΝΑΟ означает олигомеры α-синуклеина или его фрагменты, собравшиеся в нерастворимые β-листовые агрегаты. Выражение агрегированный α-синуклеин или его фрагменты, включая ΝΑΟ также означает фибриллярные полимеры. Фибрилы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связываются либо с растворимым α-синуклеином или его фрагментами, либо с агрегированным α-синуклеином или его фрагментами. Некоторые антитела связываются с олигомерами α-синуклеина сильнее, чем с его мономерными или фибриллярными формами. Некоторые антитела связываются как с растворимым, так и с агрегированным α-синуклеином или с его фрагментами и по желанию также с его олигомерными формами.

Представленные в данной заявке антитела человеческого организма к α-синуклеину специфически связываются с α-синуклеином и его эпитопами, а также с различными конформациями α-синуклеина и их эпитопами. Например, в данной заявке описаны антитела, которые специфически связываются с αсинуклеином, α-синуклеином в его нативной мономерной форме, а также полноразмерные и усеченные α-синуклеин и α-синуклеиновые агрегаты. Выражениями, касающимися антител, которые специфически связываются, селективно связываются или предпочтительно связываются с α-синуклеином, определяются антитела, которые не связываются с белками, не имеющими отношения к данному соединению. В одном из вариантов описанное в данной заявке антитело к α-синуклеину может связываться с αсинуклеином или его эпитопом, а с другими белками оно демонстрирует связывание не выше приблизительно 1,5 кратного уровня. Антителом, которое специфически связывается или селективно связывается с одним α-синуклеиновым конформером, называется антитело, которое не связываются со всеми конформациями α-синуклеина, то есть не связывается, по меньшей мере, с другим α-синуклеиновым конформером. Так, например, в данной заявке описаны антитела, способные различать мономерные и агрегированные формы α-синуклеина, α-синуклеины человеческого организма и мыши; полноразмерный α-синуклеин и усеченные его формы, а также α-синуклеинчеловеческого организма по отношению к β- и γ-синуклеинам. Так как в соответствии с изобретением антитела человеческого организма к αсинуклеину были получены у группы пожилых субъектов, которые не проявляли признаков паркинсонизма, демонстрирующих α-синуклеинспецифический иммунный отклик, антитела к α-синуклеину в соответствии с изобретением называются в этой работе также аутоантителами человеческого организма с целью подчеркивания того, что эти антитела действительно были экспрессированы живыми людьми, а не были выделены, например, из фаговой библиотеки, экспрессирующей человеческий иммуноглобулин, что до сих пор служило общепринятым способом получения антител, подобных антителам человеческого организма.

- 5 030777

Следует заметить, что термины, обозначающие те или иные объекты в единственном числе, в полной мере представляют такие же объекты во множественном числе. Например, термин антитело следует понимать, как представление одного или более антител. Таким образом, термины, стоящие в единственном числе, термины один или несколько и по меньшей мере один следует рассматривать как взаимозаменяемые.

Используемый в данном описании термин полипептид охватывает собой как одиночный полипептид, так и множество полипептидов и означает молекулу, состоящую из мономеров (аминокислот), прямолинейно соединенных амидными связями (называемыми также пептидными связями). Термин полипептид означает любую цепь или цепи из двух или нескольких аминокислот и не имеет отношения к специфической длине продукта. Таким образом, термины пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или другие термины, используемые для обозначения цепи или цепей из двух или несколько аминокислот, охватываются в данной заявке общим термином полипептид, а термин полипептид может использоваться вместо любого или заменяться любым из этих терминов.

Термин полипептид используется также для обозначения продуктов постэкспрессорных модификаций полипептида, включая, в том числе, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление и модификацию аминокислотами неприродного происхождения. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или создан с помощью рекомбинантного способа, но не обязательно транслирован из заданной нуклеиново-кислотной последовательности. Он может быть создан любым способом, включая химический синтез.

Полипептид в соответствии с изобретением может иметь размер приблизительно в 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 20 или больше, 25 или больше, 50 или больше, 75 или больше, 100 или больше, 200 или больше, 500 или больше, 1000 или несколько или в 2000 или несколько аминокислот. Полипептиды могут иметь, например, трехмерную структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называются свернутыми, а полипептиды, которые не имеют определенной трехмерной структуры и могут принимать большое количество различных конформаций, называются несвернутыми. Используемым в данном описании термином гликопротеин называется белок, связанный по меньшей мере одной углеводной частью, удерживаемой на белке кислородсодержащей или азотсодержащей боковой цепью аминокислотного остатка, например, серина или аспарагина.

Под выражением выделенный полипептид или его фрагмент, вариант либо производное имеется в виду полипептид, который находится не в своей природной среде. Особого уровня его очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть извлечен из его нативного или природного окружения. Выделенными для целей данного изобретения считаются как продуцированные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, так и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы и частично либо полностью очищены с помощью соответствующих способов.

Полипептидами в соответствии с изобретением являются также фрагменты, производные, аналоги и варианты вышерассмотренных полипептидов и любые их сочетания. Термины фрагмент, вариант, производное и аналог по отношению к антителам или полипептидам с антителами в соответствии с изобретением относятся к любым полипептидам, которые обладают, по меньшей мере, некоторыми антигенсвязывающими свойствами соответствующих нативных связывающих молекул, антител или полипептидов. Фрагментами полипептидов в соответствии с изобретением могут быть, в том числе, протеолитические фрагменты, а также, помимо рассмотренных в данном описании специфических фрагментов антител, фрагменты делеций. Вариантами антител и полипептидов-антител в соответствии с изобретением могут быть, в том числе, фрагменты, такие как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными благодаря заменам, делециям или инсерциям аминокислот. Варианты могут возникать естественным или неестественным способом. Варианты, возникающие неестественным способом, могут продуцироваться с помощью известных специалистам способов мутагенеза. В числе вариантов полипептидов можно назвать, например, консервативные и неконсервативные замены аминокислот, делеций и добавления. Производными молекул, специфически связывающими асинуклеин, например, с антителами и полипептидами-антителами в соответствии с изобретением, являются полипептиды, которые были изменены таким образом, чтобы демонстрировать дополнительные особенности, необнаруженные у нативного полипептида. В частности, это могут быть, например, слитые белки. Вариантами полипептидов являются также аналоги полипептидов. Используемый в данной заявке термин производное связывающей молекулы или ее фрагмента, антитела или полипептидаантитела относится к целевому полипептиду, имеющему один или несколько остатков, химически дериватизированных с помощью реакции функциональной боковой группы. Понятие производные охватывает также те пептиды, которые содержат одно или несколько производных двадцати стандартных аминокислот, возникающих естественным образом. Например, 4-оксипролин может заменить пролин, 5оксилизин может заменить лизин, 3-метилгистидин может заменить гистидин, гомосерин может заменить серии, а орнитин может заменить лизин.

- 6 030777

Термин полинуклеотид предназначен для охвата как нуклеиновой кислоты в единственном числе, так нуклеиновых кислот в множественном числе. Он означает выделенную нуклеиново-кислотную молекулу или конструкцию, например, информационную РНК (мРНК) или плазмидную ДНК (пДНК). Понятие полинуклеотида может включать в себя традиционную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, наблюдаемую в пептидонуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота означает любой один или несколько нуклеиновокислотных сегментов, например, фрагменты ДНК или РНК, присутствующие в полинуклеотиде. Выражение выделенная нуклеиновая кислота или выделенный полинуклеотид означает молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была извлечена из ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий содержащееся в векторе антитело, считается выделенным для целей настоящего изобретения. В качестве других примеров выделенного полинуклеотида можно назвать рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологических клетках-хозяевах или очищенные (частично или полностью) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК содержат РНК-транскрипты полинуклеотидов, полученных с помощью настоящего изобретения, ίη νίνο или ίη νίίτο. Понятием выделенных К выделенным полинуклеотидам или нуклеиновым кислотам согласно данному изобретению дополнительно относятся такие молекулы, которые получены путем синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может представлять собой или включать в себя регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.

Используемый в данной заявке термин кодирующая область означает участок нуклеиновой кислоты, состоящий из кодонов, транслированных в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (ТАО, ТОА или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он может рассматриваться как часть кодирующей области, однако никакие фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосомы, транскрипционные терминаторы, интроны и т. д., не являются частью кодирующей области. Две или несколько кодирующих областей в соответствии с изобретением могут присутствовать в единичной полинуклеотидной конструкции, например, на единичном векторе или в индивидуальных полинуклеотидных конструкциях, например, на индивидуальных (разных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать единичную кодирующую область или две и больше кодирующих областей. Например, единичный вектор может обособленно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением могут кодировать гетерологические кодирующие области, слитые или неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающую молекулу, антитело или его фрагмент, вариант или производное. Гетерологическими кодирующими областями могут быть, например, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологический функциональный домен.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой является ДНК. В этом случае полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, может включать в себя промотор и/или другие элементы управления транскрипцией или трансляцией, функционально связанные с одной или несколькими кодирующими областями. Оперативная связь осуществляется, когда область, производящая кодирование на определенный генный продукт, например, полипептид, является связанной с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы ставить экспрессию генного продукта под влияние или управление регуляторной последовательностью (или последовательностями). Два фрагмента ДНК (например, область кодирования полипептида и объединенный с ней промотор) являются функционально связанными или функционально соединенными, если в результате индукции промоторной функции происходит транскрипция мРНК, кодирующей целевой генный продукт, и если природа связи между этими двумя фрагментами ДНК не снижает способности последовательностей регулирования экспрессии направлять экспрессию генного продукта или влиять на способность ДНК-матрицы к ее транскрипции. Таким образом, промоторная область будет функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен к осуществлению транскрипции этой нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеткоспецифическим и направлять значительную транскрипцию ДНК только в определенные клетки. Помимо промотора другие элементы управления транскрипцией, например энхансеры, операторы, репрессор и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связанными с полинуклеотидом для направления клеткоспецифической транскрипции. Подходящие промоторы и другие области управления транскрипцией описаны ниже.

Специалистам в данной области техники известно множество всевозможных областей управления транскрипцией. Среди областей управления транскрипцией, функционирующих в клетках позвоночных, можно назвать, например, промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (быстродействующий ранний промотор в конъюнкции с интроном-А), вирус обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Рауса). Среди других подходящих областей управления транскрипцией можно упомянуть области, получаемые из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и кроличий β-глобин, а также другие последовательности, способные управлять экспрессией генов в эукариотических клетках. Кроме того, подходящими областями управления транс- 7 030777 крипцией являются тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокининдуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).

Специалистам известно также множество различных элементов управления трансляцией. К таким элементам относятся, например, сайт связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции, а также и элементы, полученные из пикорнавирусов (особенно внутренний сайт связывания рибосомы (ΙΚΕ8), известный также под названием последовательности С1ТЕ).

В других вариантах полинуклеотидом в соответствии с изобретением является РНК, например, в форме информационной РНК (мРНК).

Кодирующие области полинуклеотидов и нуклеиновых кислот в соответствии с изобретением могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с изобретением. Согласно гипотезе сигнальной последовательности, протеины, секретированные клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, который (-ая) отщепляется от зрелого протеина, как только инициируется экспорт растущей белковой цепи через гранулярный эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, в общем случае имеют сигнальный пептид, слитый с Ν-концом полипептида и отщепляющийся от полного или полноразмерного полипептида, в результате чего образуется секретированная или зрелая форма полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина или же функциональное производное этой последовательности, сохраняющей способность направлять секрецию полипептида, который функционально с ней связан. В альтернативном осуществлении изобретения может использоваться гетерологический сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть заменена лидерной последовательностью активатора плазминогена из человеческой ткани или β-глюкуронидазы мыши.

Если не указано иное, то используемые в данном описании термины расстройство и болезнь являются взаимозаменяемыми.

Термин связывающая молекула, используемый в контексте данного изобретения, относится, главным образом, к антителам и их фрагментам. Однако этот термин может относиться также к другим молекулам, не антителам, которые связываются с α-синуклеином, то есть, например, к гормонам, рецепторам, лигандам, молекулам главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), шаперонам, таким как белки теплового шока (хитшоковые белки), а также к молекулам межклеточной адгезии, например, к членам кадгеринового, интегринового, лектинового С-типа, иммуноглобулинового (1д) суперсемейств, и к искусственным связывающим молекулам. Таким образом, исключительно в целях обеспечения ясности излагаемого материала без ограничения объема данного изобретения, большинство нижеописанных примеров его осуществления относятся к антителам и антителоподобным молекулам, которые представляют собой типовые связывающие молекулы для разработок терапевтических и диагностических агентов.

Термины антитело и иммуноглобулин используются в данном описании как взаимозаменяемые. Антитело или иммуноглобулин является α-синуклеинсвязывающей молекулой, которая содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи, а также обычно содержит по меньшей мере вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Базовые структуры иммуноглобулинов в системах позвоночных сравнительно хорошо изучены; см., например, [Наг1о№ с1 а1., АийЬоШек: А БаЬогаЮгу Мапиа1, (Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, 2пй ей. 1988).

Как будет описано более подробно ниже, термин иммуноглобулин охватывает своим значением обширные классы полипептидов, различающихся с биохимической точки зрения. Специалисту хорошо известно, что тяжелые цепи подразделяются на классы гамма, мю, альфа, дельта и эпсилон (γ, μ, α, δ, ε), а в некоторых классах еще и на подклассы (например, γ1-γ4). Класс антитела определяется природой именно этой цепи: 1§О, 1дМ, 1дА 1§О или 1дЕ соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например, Ι§01, Ι§02, Ι§03, Ι§04, 1дА1 и т.д., хорошо охарактеризованы и имеют приписанную каждому из них функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов являются в плане данного описания вполне очевидными и, таким образом, входят в объем данного изобретения. Все классы иммуноглобулинов лежат в пределах объема данного изобретения, хотя в нижеследующей части описания рассматривается как общий случай лишь класс 1дС иммуноглобулиновых молекул. Стандартная молекула иммуноглобулина 1дС содержит две идентичные легкие полипептидные цепи молекулярным весом приблизительно 23000 Да и две идентичные тяжелые полипептидных цепи молекулярным весом приблизительно 53000-70000. Эти четыре цепи обычно объединены дисульфидными связями в Υ конфигурации, где легкие цепи охватывают снаружи тяжелые цепи, начиная от устья Υ с продвижением далее через вариабельную область.

Легкие цепи подразделяются на каппа и лямбда (к, λ). Каждая из тяжелых цепей может соединяться либо с каппа либо с лямбда-легкой цепью. В общем случае, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, а хвостовые части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисуль- 8 030777 фидными связями или нековалентными связями тогда, когда иммуноглобулины продуцированы либо гибридомами, β-клетками либо генетически преобразованными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности проходят от Ν-конца на раздвоенном участке Υ конфигурации до С-конца нижнего участка каждой цепи.

Как легкая, так и тяжелая цепи разделены на области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный несут в себе функциональную значимость. В этом смысле ясно, что вариабельные домены обоих типов цепей - легкой (УБ) и тяжелой (УН) - определяют распознавание и специфичность антигена. В противоположность этому, константные домены легкой цепи (СЬ) и тяжелой цепи (СН1, СН2 или СН3) определяют важные биологические свойства - секрецию, трансплацентарную мобильность, связывание Ре-рецепторов, связывание комплемента и т.п. Условно нумерация доменов константных областей возрастает с их удалением от антигенсвязывающего сайта или аминоконца антитела. Ν-концевая часть является вариабельной областью, а на С-концевой части находится константная область; СН3 и СЬ домены фактически включают в себя карбоксиконцы тяжелой и легкой цепи соответственно.

Как указывалось выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать эпитопы на антигенах и специфически связываться с ними. Иными словами, УЪ-домен и УН-домен или подмножество областей определения комплементарности (СБК) антитела объединяются, образуя вариабельную область, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Эта четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт, присутствующий на конце каждой ветви Υ-конфигурации. Еще точнее, антигенсвязывающий сайт определяется тремя СБК-областями на каждой из УН или УГ цепей. Любой фрагмент антитела или иммуноглобулина, содержащий достаточную структуру для специфического связывания с α-синуклеином, фигурирует в данном описании под равнозначными наименованиями связывающий фрагмент и иммуноспецифический фрагмент.

В возникающих естественным образом антителах антитело содержит шесть гипервариабельных областей, называемых иногда областями определения комплементарности или СБК и присутствующих в каждом антигенсвязывающем домене, которые представляют собой короткие, несмежные последовательности аминокислот, специфически размещенные таким образом, чтобы образовывать антигенсвязывающий домен, поскольку антитело в водной окружающей среде принимает трехмерную конфигурацию. СБК-области фланкируются четырьмя относительно консервативными каркасными областями РК, демонстрирующими меньшую межмолекулярную вариабельность. Каркасные области принимают почти совершенную β-листовую конформацию, а СБК-области образуют петли, которые соединяют βлистовую структуру, а в некоторых случаях формируют ее часть. Таким образом, каркасные области исполняют роль строительных лесов, которые межцепочечными нековалентными взаимодействиями обеспечивают СБК-областям правильную пространственную ориентацию. Антигенсвязывающий домен, образованный позиционированными СБК-областями, определяет собой поверхность, комплементарную эпитопу, на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность активирует нековалентное связывание антитела со смежным ему эпитопом. Аминокислоты, содержащие соответственно СБК- и каркасные области, могут быть легко идентифицированы по вариабельной области любой из данных тяжелых или легких цепей, поскольку они были точно определены, см. публикации [Зедиепсек о£ Рго!ешк о£ 1ттипо1од1са1 Шегек! КаЬа!, Е., е1 а1., И.8. Берайтеп! о£ НеаЪЬ апб Нитап §егуюек, (1983); апб СНо1Ыа апб Ьекк, 1. Мо1. Бю1., 196 (1987), 901-917], включенные в данную заявку во всей своей полноте посредством ссылки.

В случае существования двух или нескольких определений того или иного термина, который используется в данной заявке и/или является принятым в данной области техники, определение этого термина, используемое в данном описании, предполагает охват всех его значений, если ясно не указано противоположное. Примером тому может служить использование термина область определения комплементарности (СБК) для описания несмежных антигенобъединяющих сайтов, находящихся внутри вариабельной области как тяжелой, так и легкой полипептидных цепей. Эта особая область была описана в публикациях |КаЬа1 е1 а1., И.8. Бер1. о£ НеаЬН апб Нитап §етуюек, 'Ъесщепсек о£ Рто!ешк о£ 1ттипо1од1са1 Метек! (1983) апб Ьу СНобиа апб Ьекк, 1. Мо1. Бю1., 196 (1987), 901-917], включенных в данную заявку посредством ссылки, где определениями охватываются перекрытия или подмножества аминокислотных остатков при сравнении их между собой. Тем не менее, применение любого из этих двух определений в названии СБК-области антитела или его вариантов не выходит за пределы используемого в данной заявке термина и данного ему определения. Подходящие аминокислотные остатки, которые включают в себя СБК-области в соответствии с определениями, данными в цитированных выше источниках, приведены для сравнения ниже в таблице. Точные номера аминокислотных остатков, входящих в конкретные СБК-области, изменяются в зависимости от последовательности и размера СБК-области. Специалисту в данной области техники не составит труда определить, какие остатки составляют ту или иную гипервариабельную область или СБК-область 1дС-субтипа антитела человеческого организма для данной аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.

- 9 030777

Определения СОК-областей¹

	КаЬа!	СЬоОпа
УНСОК1	31-35	26-32
УНСОК2	50-65	52-58
УНСОКЗ	95-102	95-102
УЬСОК1	24-34	26-32
УЬСОК2	50-56	50-52
УЬСОКЗ	89-97	91-96

¹Нумерация всех приведенных в таблице определений СОК соответствует нумерации по КаЬа! е! а1. (см. ниже).

Кэбет и др. (КаЬа! е! а1.) также предложили систему нумерации для последовательностей вариабельных доменов, применимую к любому антителу. Специалист в данной области техники может применять систему нумерации по Кэбету к последовательности любого вариабельного домена, не прибегая к подтверждению ее экспериментальными данными, полученными за пределами самой последовательности. Используемое в данной заявке выражение нумерация по Кэбету означает систему нумерации, разработанную Кэбетом [КаЬа! е! а1., И.З. Оер1. о£ НеаНИ апб Нитап ЗегИеез, Зециепсе о£ Рго1ет5 о£ 1ттипо1о§1са1 1п1егез1 (1983)]. Если не указано иное, то приводимые в данной заявке нумерации специфических положений аминокислотных остатков в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, осуществлении изобретения или в производном в согласно изобретению полностью соответствуют системе нумерации по Кэбету.

Антителами или антигенсвязывающими фрагментами, иммуноспецифическими фрагментами, вариантами или их производными согласно изобретению могут быть, без каких-либо ограничений, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические, принадлежащие человеческому организму, гуманизированные антитела, антитела, приближенные к антителам приматов, антитела, приближенные к антителам мышей, или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например, РаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')2, Рб, Ρνδ, одноцепочечные Ρνδ СсРу), одноцепочечные антитела, дисульфидсвязанные Ρνδ (δбΡν), фрагменты, содержащие VI. или УН домен, фрагменты, продуцированные библиотекой экспрессии РаЬ, и анти-идиотипические (анти-1б) антитела (включая, например, анти-1б антитела к антителам, представленные в данной работе). δсΡν молекулы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в [патенте США № 5892019]. Молекулы иммуноглобулинов или антител в соответствии с изобретением могут относиться к любому типу (например, 1дС, 1дЕ, 1дМ, 1д1), 1дА и Ι§Υ), классу (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и 1дА2) или подклассу молекулы иммуноглобулина.

В одном из вариантов осуществления изобретения антителом в соответствии с изобретением не является 1дМ или его производное с пентавалентной структурой. В частности, в случаях специфического применения в соответствии с изобретением, особенно в случае терапевтического применения, ΙμΜδантитела менее эффективны, чем ЕС и другие бивалентные антитела или соответствующие связывающие молекулы, поскольку ΙμΜδ по причине их пентавалентной структуры и недостаточного созревания аффинности часто демонстрируют неспецифическую кросс-реактивность и очень низкую аффинность.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело в соответствии с изобретением не является поликлональным, то есть полностью состоит из одного вида антител и не является смесью, полученной из образца иммуноглобулинов плазмы.

Фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут содержать одну вариабельную область (или области) или ее в комбинации со всеми или частью следующего: шарнирной областью, доменами СН1, СН2 и СН3. Изобретение включает в себя также α-синуклеинсвязывающие фрагменты, также содержащие любую комбинацию вариабельной области(-ей) с шарнирной областью, доменами СН1, СН2 и СН3. Антитела или их иммуноспецифические фрагменты в соответствии с изобретением могут происходить от любого животного, включая птиц и млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела принадлежат человеческому организму, мышам, обезьянам, кроликам, козам, морским свинкам, верблюдам, ламам, лошадям или цыплятам. В другом осуществлении вариабельная область может происходить от над отряда хрящевых (например, акул).

В одном из аспектов в соответствии с изобретением антителом является моноклональное антитело человеческого организма, выделенное из него. В случае необходимости каркасную область антитела человеческого организма сопоставляют с последовательностью вариабельной области подходящей эмбриональной линией человеческого организма, взятой из базы данных, например, из [VЪаδе (νЬаδе.т^ссре.сат.ас.ик), сопровождаемой в МКС Сеп1ге £ог Рго1ет Епдшеегтд (СатЬпбде, ИК)], и в случае удовлетворительного соответствия принимают к пользованию. Например, аминокислоты, обнаружившие способность отклоняться от правильной последовательности эмбриональной линии, могли быть обусловлены последовательностями затравки полимеразно-цепной реакции (РСК), встроенными в процессе клонирования. По сравнению с искусственно созданными антителами, подобными антителам человеческого организма, например, фрагментами (δсΡνδ) одноцепочечных антител из библиотеки отображенных

- 10 030777 фагами антител или антителом ксеногенной мыши, моноклональное антитело человеческого организма в соответствии с изобретением отличается следующим: (ί) его получают, используя иммунный отклик человеческого организма, а не отклик сурогатов животного происхождения, то есть это антитело генерируется в ответ на природный а-синуклеин в его реальной конформации в человеческом теле; (ίί) оно защищает индивида или по меньшей мере имеет большое значение для присутствия а-синуклеина; (ίίί) поскольку это антитело происходит от человека, сводится до минимума риск перекрестной реактивности против аутоантигенов. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением термины моноклональное антитело человеческого организма, моноклональное аутоантителочеловеческого организма, антителочеловеческого организма и т.п. используются в данном описании для обозначения асинуклеинсвязывающей молекулы человеческого происхождения, то есть той молекулы, которая была выделена из клетки человеческого организма - β-клетки или ее гибридомы или сДНК, которой та была непосредственно клонирована из мРНК клеткичеловеческого организма, например, β-клетки памяти человека. Антитело человеческого организма остается человеческим даже тогда, когда в нем замещены аминокислот, например, для улучшения связывающих характеристик.

Антитела, полученные из библиотек иммуноглобулинов человеческого организма или животных, которые являются трансгенными по одному или нескольким иммуноглобулинам человеческого организма, и не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины так, как описано ниже и, например, в [патенте США № 5939598, Кисйег1арай с1 а1.], называются антителами, подобными антителам человеческого организма, для того, чтобы отличать их от настоящих антител человеческого организма в соответствии с изобретением.

Используемый в данной заявке термин антитело, приближенное к антителу мыши или иммуноглобулин, приближенный к иммуглобулину мыши означает антитело, содержащее одну или несколько СЭР-областей из антитела человеческого организма в соответствии с изобретением и каркасную область человеческого организма, которая содержит аминокислотные замещения и/или делеции, и/или инсерции, основанные на последовательности мышиного антитела. Иммуноглобулин человеческого организма, обеспечивающий СЭР-областями. называется родительским или акцептором, а мышиное антитело, обеспечивающее изменения опоры, называется донором. Необходимость в константных областях отсутствует, однако если они существуют, то обычно они полностью, то есть по меньшей мере приблизительно на 85-90% или на 95% или более, идентичны константным областям мышиного антитела. В связи с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения полноразмерный, приближенный к мышиному, тяжелоцепочечный или легкоцепочечный иммуноглобулин человеческого организма содержит мышиную константную область, СЭР-области человеческого организма, и полностью остов человеческого организма, имеющий некоторое количество аминокислотных замен, подобным мышиным. Обычно антитело, подобное мышиному антителу, содержит вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь, подобную цепям мышиного антитела. Например, понятие антитела, подобного мышиному антителу, не охватывает понятие типового химерное антитела, например, потому что вся целиком вариабельная область химерного антитела является немышиной. Модифицированное антитело, которое было подобно мышиному антителу с помощью процесса приближения к мыши, связывается с тем же антигеном, что и родительское антитело, которое обеспечивает СЭР-области и обычно является менее иммуногенным для мышей по сравнению с родительским антителом.

Используемый в данной заявке термин тяжелоцепочечная часть предполагает содержание в этой части аминокислотных последовательностей, полученных из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий тяжелоцепочечную часть, содержит по меньшей мере один из следующих компонентов: СН1-домен, шарнирный домен (например, верхнюю, среднюю и/или нижнюю шарнирную области), СН2-домен, СН3-домен или вариант либо фрагмент вышеуказанного. Например, связывающий полипептид для использования в данном изобретении может содержать полипептидную цепь, содержащую СН1домен; полипептидную цепь, содержащую СН1-домен по меньшей мере часть шарнирного домена и СН2-домен; полипептидную цепь, содержащую СН1-домен и СНЗ-домен; полипептидную цепь, содержащую СН1-домен по меньшей мере часть шарнирного домена и СН3-домен; или полипептидную цепь, содержащую СН1-домен по меньшей мере часть шарнирного домена, СН2-домен и СНЗ-домен. В другом осуществлении изобретения полипептид в соответствии с изобретением содержит полипептидную цепь, содержащую СН3-домен. Кроме того, связывающий полипептид для использования в данном изобретении может не иметь по меньшей мере части СН2-домена (например, весь СН2-домен или его часть). Как указывалось выше, специалисту в данной области техники вполне понятно, что эти домены (например, тяжелоцепочечные части) могут быть модифицированы таким образом, чтобы их аминокислотная последовательность отличалась от таковой у молекулы иммуноглобулина, возникающей естественным образом.

В некоторых описанных в данной заявке антителах или антигенсвязывающих фрагментах, их вариантах или производных тяжелоцепочечные части одной полипептидой цепи мультимера являются идентичными тяжелоцепочечным частям второй полипептидной цепи мультимера. В альтернативном осуществлении изобретения содержащие тяжелоцепочечную часть мономеры в соответствии с изобретением

- 11 030777 не являются идентичными. Например, каждый мономер может содержать отличный от других мишеньсвязывающий сайт, образующий, например, биспецифическое антитело или димерное антитело.

В другом осуществлении изобретения описанные в данной заявке антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или их производные состоят из единичной полипептидной цепи, такой как 8сРу8, и должны экспрессироваться внутриклеточно (внутри организма) для целевых терапевтических и диагностических применений ίη νίνο.

Тяжелоцепочечные части связывающего полипептида для своего использования в описанных в данной заявке способах диагностики и лечения могут быть получены из различных иммуноглобулиновых молекул. Тяжелоцепочечная часть полипептида может содержать, например, СН1-домен, полученный из молекулы 1§С1, и шарнирную область, полученную из молекулы 1дС3. В другом примере тяжелоцепочечная часть может содержать шарнирную область, полученную частично из молекулы 1§С1 и частично из молекулы 1§С3. Возможен также вариант, в котором тяжелоцепочечная часть содержит химерный шарнир, образованный частично из молекулы 1§С1 и частично из молекулы 1дС4.

Используемый в данной заявке термин легкоцепочечная часть предполагает наличие в ней аминокислотных последовательностей, полученных из легкой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения легкоцепочечная часть содержит по меньшей мере один У_ъ домен и/или СЬ домен.

Минимальный размер пептидного или полипептидного эпитопа для антитела должен составлять от четырех до пяти аминокислот. Пептидный или полипептидный эпитопы могут содержать, например, по меньшей мере семь, по меньшей мере девять или по меньшей мере приблизительно от 15 до 30 аминокислот. Поскольку СИК-область может распознавать антигенный пептид или полипептид в его третичной форме, то аминокислотам, содержащим эпитоп, не обязательно быть смежными, а в некоторых случаях они могут даже не быть в одной и той же пептидной цепи. В соответствии с изобретением пептидный или полипептидный эпитоп, распознанный антителом в соответствии с изобретением, содержит последовательность по меньшей мере из 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или приблизительно от 15 до 30 смежных или несмежных аминокислот а-синуклеина. В том случае, если в данном описании указывается, что антитело связывается на данном участке аминокислот, например, связывается с эпитопом в интервале от 4 до 15 аминокислот а-синуклеина это означает, что данный эпитоп охватывает весь участок указанных аминокислот или является меньшим. Другими словами, для данного эпитопа в интервале от 4 до 15 аминокислот а-синуклеина этот эпитоп может включать в себя всю 12-аминокислотную пептидную цепь от 4 до 15, но может быть и меньшего размера, например, от 4 до 12 аминокислоты, от 4 до 10 аминокислоты или от 4 до 8 аминокислоты. Кроме того, специалисту в данной области техники хорошо известно, что аминокислоты, лежащие за пределами указанного участка, могут способствовать улучшению аффинности связывания или повышать распознавание конформационного эпитопа, не принимая при этом прямого участия собственно в процессе связывания.

Термины специфическое связывание и специфическое распознавание, являющиеся в данном описании взаимозаменяемыми, в общем случае означают, что связывающая молекула, например антитело, связывается с эпитопом через свой антигенсвязывающий домен, и что это связывание соответствует определенной комплементарности между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с этим определением говорят, что антитело специфически связывается с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом через свой антигенсвязывающий домен легче, чем оно связывалось бы со случайным, несоответствующим эпитопом. Термин специфичность используется в данной заявке как характеристика относительной аффинности, по которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, антитело А может считаться имеющим более высокую специфичность к данному эпитопу, чем антитело В или же можно говорить, что антитело А с более высокой специфичностью связывается с эпитопом С, чем со специфичностью в отношении эпитопа И.

Используемый в данном описании термин иммунологические характеристики связывания или другие характеристики связывания антитела с антигеном во всех его грамматических формах относится к специфичности, аффинности, перекрестной реактивности и другим характеристикам связывания антитела.

Термин предпочтительное связывание означает, что связывающая молекула, например антитело, специфически связывается с эпитопом легче, чем она бы связывалась с соответствующим подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое связывается предпочтительно с данным эпитопом, будет связываться с этим эпитопом с большей вероятностью, чем с родственным ему эпитопом, даже если такое антитело может перекрестно взаимодействать с этим родственным эпитопом.

Так, например, связывающая молекула, например антитело, связывает предпочтительно первый эпитоп, если оно связывает этот первый эпитоп с величиной константы диссоциации (Кб), меньшей чем К_с антитела, со вторым эпитопом. В другом случае, например, антитело связывает предпочтительно пер- 12 030777 вый антиген, если он связывает первый эпитоп с аффинностью, которая, по меньшей мере, на порядок меньше по величине, чем К_с антитела ко второму эпитопу. Можно привести еще один пример, где антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка меньше по величине, чем К_с антитела ко второму эпитопу.

В другом неограничивающем примере связывающая молекула, например антитело, связывает предпочтительно первый эпитоп если оно связывает первый эпитоп со скоростью диссоциации (к(оГГ)), меньшей, чем к(оГГ) антитела ко второму эпитопу. В другом аналогичном примере антитело предпочтительно связывает первый эпитоп если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, величина которой, как минимум, на порядок меньше, чем к(оГГ) антитела к второму эпитопу. И наконец, в еще одном подобном примере антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая, как минимум, меньше на два порядка по величине, чем к(оГГ) антитела ко второму эпитопу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная в данной заявке связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производное, может связываться с α-синуклеином или его фрагментом либо вариантом со скоростью диссоциации (к(оГГ)),

1 21 31 31 меньшей или равной 5x10 с , 10 с , 5x10 с или 10 с . В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело в соответствии с изобретением может связываться с α-синуклеином либо его фрагментом или вариантом со скоростью диссоциации (к(оГГ)), меньшей или равной 5х10^-4 с^-1, 10^-4 с^-1, 5х10^-5с^-1 или 10^-5 с^-1 5х10^-6 с^-1, 10^-6 с^-1, 5х10^-7 с^-1 или 10^-7 с^-1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная в данной заявке связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производное может связываться с α-синуклеином или его фрагментом либо вариантом со скоростью ассоциации (к(оп)), большей или равной 10³ М^-1 с^-1, 5х10³М^-1 с^-1, 10⁴ М^-1 с^-1 или 5х10⁴ М^-1 с^-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело в соответствии с изобретением может связываться с α-синуклеином или его фрагментом либо вариантом со скоростью ассоциации (к(оп)), большей или равной 10⁵ М^-1 с^-1, 5х10⁵ М^-1с^-1, 10⁶ М^-1 с^-1 или 5х10⁶ М^-1 с^-1 или 10⁷ М^-1 с^-1.

Связывающая молекула, например, антитело, называется конкурентно ингибирующей связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом в такой степени, что оно блокирует, в некоторой мере, связывание этого эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может определяться с помощью любого известного способа и, в частности, например, способом конкурентного иммуноферментного анализа (ЕЫ§А). Например, антитело способно конкурентно ингибировать связывание эталонного антитела с данным эпитопом минимум на 90%, минимум на 80%, минимум на 70%, минимум на 60% или минимум на 50%.

Как используется в данной заявке, термин аффинность означает меру прочности связывания индивидуального эпитопа с областью СОК, принадлежащей связывающей молекуле, например, молекуле иммуноглобулина, см., например, [Наг1ои εΐ а1., АпЬЪоФек: А ЬаЪогаФгу Мапиа1, Со1й §ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, 2пй ей. (1988) а1 радек 27-28]. Используемый в данной заявке термин авидность относится к общей стабильности комплекса между популяцией иммуноглобулинов и антигеном, то есть он означает функциональную прочность объединения иммуноглобулиновой смеси с антигеном, см., например, [Наг1ои а1 радек 29-34]. Авидность относится как к аффинности индивидуальной молекулы иммуноглобулина в популяции со специфическими эпитопами, так и к валентностям иммуноглобулинов и антигена. Например, высокая авидность будет характеризовать взаимодействие между бивалентным моноклональным антителом и антигеном с высокоповторяющейся эпитопной структурой, такой как полимер. Аффинность или авидность антитела по отношению к антигену может определяться экспериментально с помощью любого подходящего способа, например, описанного в |Вег/оГкку е1 а1., АиЬЪойу-АиЬдеи 1п1егаеЬопк 1п Ρиийатеиΐа1 1ттипо1оду, Раи1, V. Е., Ей., Кауеп Ргекк №и Уогк, N Υ (1984), КиЪу, Ринк 1ттипо1оду, V. Н. Ргеетап апй Сотрапу Νον Υо^к, N Υ (1992)], и в настоящем документе. В число общеизвестных способов измерения аффинности антитела к антигену входят также ЕЫ§А, К1А и способ поверхностного плазмонного резонанса. Результаты измерений аффинности конкретного взаимодействия между антителом и антигеном могут изменяться, если измерения проводить в различных условиях, например, с изменением концентрации соли, рН. Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров, например, К_с, 1С₅₀, могут проводиться с использованием стандартизированных растворов антитела и антигена, и стандартизированного буферного раствора.

Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть также описаны или охарактеризованы в единицах своей перекрестной реактивности. Используемый в данной заявке термин перекрестная реактивность относится к способности антитела, специфического к одному антигену, взаимодействать со вторым антигеном, и является мерой родства между двумя различными антигенными субстанциями. Таким образом, антитело является кросс-реактивным, если оно связывается с эпитопом, отличным от того, что индуцировал его образование. Кросс-реактивный эпитоп, в общем случае, содержит много таких же самых комплементарных структурных признаков, что и индуцирующий эпитоп, и в некоторых случаях

- 13 030777 фактически может оказаться более подходящим, чем оригинал.

Например, определенные антитела обладают некоторой степенью перекрестной реактивности, благодаря которой они связываются с родственными, но не идентичными эпитопами, например, с эпитопами с идентичностью, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% и по меньшей мере 50% (согласно расчетов с использованием способов известных и описанных в данной заявке способов) относительно эталонного эпитопа. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело может называться имеющим малую кросс-реактивность или не имеющим кросс-реактивности, если оно не связывается с эпитопами с идентичностью менее чем 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% и 50% (согласно расчетов с использованием способов известных и описанных в данной заявке способов) относительно эталонного эпитопа. Антитело может характеризоваться как высокоспецифическое к определенному эпитопу, если оно не связывается ни с одним из других аналогов, ортологов или гомологов этого эпитопа.

Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть также описаны или охарактеризованы в единицах их аффинности связывания с а-синуклеином. Аффинность связывания может быть выражена константой диссоциации и представлена таким рядом ее величин: К_с менее 5х10^-2 М, 10^-2 М, 5х10^-3 М, 10³ М, 5х10^-4 М, 10^-4 М, 5х10^-5 М, 10^-5 М, 5х10^-6 М, 10^-6 М, 5х10^-7 М, 10^-7 М, 5х10^-8 М, 10^-8 М, 5х10^-9 М, 10^-9 М, 5х10^-10 Μ, 10^-10 М, 5х10^-11 М, 10^-11 М, 5х10^-12 М, 10^-12 М, 5х10^-13 М, 10¹³ М, 5х10^-14 М, 10^-14 М, 5х10^-15 М или 10^-15 М.

Как указывалось выше, хорошо известными являются субблочные структуры и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов. Используемый в данной заявке термин УН-домен включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а термин СН1-домен включает первый (наиболее аминоконцевой) домен константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина. СН1-домен прилегает непосредственно к УН-домену и является аминоконцевым к шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулиновой молекулы.

Используемый в данной заявке термин домен СН2 включает часть молекулы тяжелой цепи, длиной, например, приблизительно от 244 до 360 кислотных остатков антитела в обычной системе нумерации (остатки от 244 до 360, в системе нумерации по Кэбету; и остатки 231-340, в системе нумерации ЕС; |КаЬа1 Е.А. с( а1. ор. ей]. домен СН2 является уникальным в том, что он не спаривается плотно с другим доменом. Более того, между этими двумя доменами СН2 интактной нативной 1дО-молекулы включены две Ν-связанные разветвленные углеводные цепи. Также надежно задокументировано, что домен СН3 простирается от домена СН2 до С-конца 1дО-молекулы и содержит приблизительно 108 кислотных остатков.

Используемый в данной заявке термин шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, соединяющей шарнирно СН 1-домен с СН2-доменом. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 кислотных остатков и является гибкой, позволяя, таким образом, двум Ν-концевым антигенсвязывающим областям независимо перемещаться. Шарнирные области могут быть подразделены на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены, см. [Коих с( а1., 1. 1ттипо1. 161 (1998), 4083].

Используемый в данной заявке термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиоловую группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиоловой группой. У большинства 1§Смолекул, возникающих естественным образом, СН1- и СЬ-области соединены одной дисульфидной связью, а две тяжелых цепи соединены двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 согласно нумерации по Кэбету (положение 226 или 229, по системе нумерации ЕС).

Термины соединенный, слитый и лигирование используются в данной заявке как взаимозаменяемые. Все они означают соединение друг с другом двух и более элементов или компонентов с помощью любых средств, включая химическое конъюгирование и рекомбинантные средства. Выражение лигирование с сохранением рамки считывания означает соединение двух или нескольких полинуклеотидных открытых рамок считывания (ОКБ) с образованием непрерывной ОКБ большей длины таким образом, чтобы сохранить правильной трансляционную рамку считывания исходных ОКБ. Таким образом, рекомбинантный слитый белок является единичным белком, содержащим два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодированным оригинальными ОКБ (чьи сегменты в естественных условиях обычно так не объединяются). Хотя в результате рамка считывания получается непрерывной, и проходящей через лигированные сегменты, эти сегменты могут быть разделены физически или пространственно, например, линкерной последовательностью с сохранением рамки считывания. Например, полинуклеотиды, кодирующие СЭК-области вариабельной области иммуноглобулина, могут быть лигированы с сохранением рамки считывания, но быть разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные СЭК-области. пока лигированные СЭК-области совместно транслируются как часть непрерывного полипептида.

- 14 030777

Используемый в данном описании термин экспрессия означает процесс, в котором ген продуцирует биохимический материал, например, РНК или полипептид. Такой процесс охватывает любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая без ограничения нокдаун гена, а также переходную экспрессию и стабильную экспрессию. Он охватывает, без ограничения, транскрипцию гена в информационную РНК (мРНК), транспортную РНК (1РНК), малую РНК, образующую шпильки (8ЙРНК), малую интерферирующую РНК (δίΡΗΚ) и любой другой РНК-продукт, и трансляцию такой мРНК в полипептид (или полипептиды). Если конечный продукт является биохимическим материалом, то в экспрессию входит создание этого биохимического материала и любых предшественников. Экспрессия гена дает генный продукт. Генным продуктом в контексте данного изобретения может быть либо нуклеиновая кислота, например, информационная РНК, полученная путем транскрипции гена или полипептида, который транслируется из транскрипта. Описанными в данной заявке генными продуктами могут быть также нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, сборкой с другими белковыми субблоками, протеолитическим расщеплением и т.п.

Используемый в данной заявке термин образец означает любой биологический материал, полученный у субъекта или пациента. В одном из аспектов образец может содержать кровь, цереброспинальную жидкость (С8Р), мочу. В других аспектах образец может содержать цельную кровь, плазму, βклетки, обогащенные образцами крови, и культивированные клетки (например, β-клетки субъекта). Образцом может быть также образец биопсии или ткани, в том числе нервной ткани. Существуют аспекты, в которых образец может содержать цельные клетки и/или лизат из клеток. Образцы крови берут с помощью обычных способов. В одном из аспектов дебрис подвергают ресуспендированию путем интенсивного перемешивания при 4°С в 200 мл буферного раствора (20 мМ трис-буфера, рН 7,5, 0,5% Ыотбе! (неденатурирующего детергента), 1 мМ ΕΌΤΑ (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1 мМ РМ8Р (фенилметансульфонилфторида), 0,1М ЫаС1, ΙΧ-ингибитор сигма-протеазы, и ΙΧ-ингибиторы сигмафосфатазы 1 и 2). Суспензию выдерживают на льду в течение 20 мин с промежуточными интенсивными перемешиваниями. После центрифугирования 15000 х г в течение 5 мин при приблизительно 4°С отбирают аликвоты супернатанта и сохраняют их при температуре приблизительно -70°С.

В том виде, в котором они используются в данной заявке, термины лечить и лечение означают как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательных физиологических изменений или расстройств, таких как развитие паркинсонизма. Благоприятными или целевыми клиническими результатами могут быть, например, облегчение симптомов, уменьшение степени развития болезни, стабилизация (то есть неухудшение) статуса болезни, задержка или замедление прогрессирования болезни, улучшение или ослабление проявления болезненного состояния, и выявляемая или невыявляемая ремиссия (частичная или полная). Лечение может также означать увеличение продолжительности жизни по сравнению с ожидаемой продолжительностью без лечения. Пациентами, требующими лечения могут быть те, кто уже болен или страдает от расстройства и те, кто склонен к проявлению болезненного состояния или расстройства, как и те, кому следует предотвратить проявление болезненного состояния или расстройства.

В настоящей заявке под терминами субъект, индивид, животное, пациент и млекопитающее имеется ввиду субъект, а конкретнее субъект, относящийся к млекопитающим, например, человек пациент, которому нужно поставить диагноз, дать прогноз, сделать профилактику или провести терапию.

ΙΙ. Антитела

Настоящее изобретение в общем случае, относится к антителам человеческого организма против асинуклеина и к их антигенсвязывающим фрагментам, которые способны демонстрировать иммунологические характеристики связывания и/или биологические свойства, как это в целом описано для антител, проиллюстрированных в Примерах. В соответствии с настоящим изобретением моноклональные антитела человеческого организма, специфические к а-синуклеину, были клонированы из группы субъектов пожилого возраста.

В процессе экспериментальных исследований, проведенных в соответствии с настоящим изобретением, попытки клонировать а-синуклеинспецифические антитела вначале оканчивались неудачами, но почти всегда давали клоны с ошибочной положительной оценкой. Дальнейшее исследование этих клонов выявило, что они продуцировали антитела, распознающие белки Е. сой. Для того чтобы обойти эту проблему, был проведен параллельный скрининг антител в кондиционированных средах культур β-клеток человеческой памяти для связывания с покрытым полномерным альфа-синуклеиновым мономером и для отсутствия связывания с белками Е. соН. и бычьим сывороточным альбумином (В8А). В частности, βклеточную кондиционированную среду предварительно абсорбировали белками Е. сой перед тем как провести для этой среды анализ ЕЬ1§А с целью отбора а-синуклеинсвязывающих антител человеческого организма.

Первые попытки выделить специфические антитела фокусировались на группах субъектов-людей с высокой плазмосвязывающей активностью к а-синуклеину, свидетельствующей о повышенных уровнях

- 15 030777 циркулирования плазмы с антителами к а-синуклеину. В этих опытах не удалось продуцировать асинуклеинспецифические β-клетки человеческой памяти, и описанные в данной заявке антитела в соответствии с изобретением были выделены из групп субъектов с низкой реактивностью плазмы к асинуклеину.

Эти эксперименты позволили выделить несколько антител. Отобранные антитела были подвергнуты дальнейшим анализам для определения класса и легкоцепочечного подкласса. Затем транскрипты отобранных релевантных антител из культур β-клеток памяти были транскрибированы с помощью способа КТ-РСК (амплификации продуктов обратной транскрипции), клонированы и скомбинированы в векторы экспрессии для рекомбинантного продуцирования, [РСТ РиЪБсайоп \УО 2010/069603 А1]. Типовые антитела против а-синуклеина N1-202.12Р4, N1-202.3012 и ΝΙ-202.3Ό8 человеческого организма описаны в [РСТ РиЪйсайоп \УО 2010/069603 А1].

В данной заявке описано моноклональное антитело NΙ-202.22011 человеческого организма. Была проведена рекомбинантная экспрессия ΝΙ-202.22Ό11 в НЕК293 и клетках китайского хомячка СНО с последующим определением характеристик специфичности связывания с а-синуклеином человеческого организма (фиг. 2А-В). Таким образом, один из аспектов данного изобретения относится к выделению моноклонального анти-а-синуклеин-антитела ΝΙ-202.22Ό11 человеческого организма, а также его антигенсвязывающих фрагментов, производных и вариантов. Настоящее изобретение относится также к связывающей молекуле, такой как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, где данное антитело содержит УН с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N014 или 8ЕЦ ГО N020 и УЬ с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:22 или 8ЕЦ ГО N0:26 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные. В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело N[-202.22011. а также его варианты, фрагменты или производные характеризуются как специфически связывающие а-синуклеин человеческого организма в сравнении с β-синуклеином и γсинуклеином человеческого организма, и а-синуклеин человеческого организма в сравнении с мышиным а-синуклеином. Антитело №-202.22011 предпочтительно связывается с а-синуклеином в олигомерной или агрегированной форме.

Настоящее изобретение, в одном из вариантов его осуществления, направлено на антитело против а-синуклеина или на его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, где данное антитело специфически связывается с тем же эпитопом а-синуклеина, что и эталонное антитело №-202.22011. Как проиллюстрировано в примерах, антитело №-202.22011 связывается с усеченным а-синуклеином, содержащим С-концевую кислотную область (аминокислоты 96-140), при проведении прямого анализа ЕЫ8А, например, в интервале от 113 до 123 аминокислоты, принадлежащей последовательности 8ЕЦ ГО N0:1, и специфически связывается с эпитопом на участке аминокислот РУОРОКЕ (аминокислоты 117123 из последовательности 8ЕЦ ГО N0:1).

Как показано в примере 2, антитело № -202.22011 предпочтительно связывается с а-синуклеиновыми агрегатами и фибрилами, преобладая над мономерной формой а-синуклеина. Кроме того, как показало иммуногистохимическое окрашивание, описанное в примере 3, антитело №-202.22011 связывается с патологическими формами а-синуклеина в мозгу, например, с патологическими агрегатами асинуклеина. Таким образом, настоящим изобретением предлагается новое антитело человеческого организма против а-синуклеина для применения в диагностических и терапевтических целях.

Настоящее изобретение в одном из вариантов своего осуществления обеспечивает связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, которые демонстрируют свойства точного связывания типового антитела №-202.12Р4 так, как описано в [РСТ РиЪБсайоп XV0 2010/069603 А1]. Настоящее изобретение обеспечивает связывающие молекулы, которые связываются с эпитопом на №конце а-синуклеина, например, связывающие молекулы, которые связываются в интервале от 4 до 15 аминокислоты из последовательности 8ЕЦ ГО N0:1. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, которые связываются в интервале от 4 до 15 аминокислот из последовательности 8ЕЦ ГО N0:1, но с исключением антител, содержащих УН (8ЕЦ ГО N0:5 или 8ЕС) ГО N0:9), УЬ (81 ГО) ГО N0:10 или 8ЕС) ГО N0:14), УНСОК1 (81 ГО) ГО N0:6), УНСОК2 (81 'ГО) ГО N0:7), УНСОК3 (81 'ГО) ГО N0:8), УЪСОК1 (81 ГО) ГО N0:11), УЪСОК2 (81 'ГО) ГО N0:12) и/или последовательности УЪС0К3 (8ЕС ГО N0:13), принадлежащей антителу №-202.12Р4, или их фрагменты, варианты либо производные.

Кроме того, настоящим изобретением предлагаются связывающие молекулы, например антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, которые содержат по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть областей определения комплементарности (СГОКе) для вариабельных областей УН- и/или УЪ-цепей последовательности №-202.22О1Е содержащих любую из аминокислотных последовательностей, иллюстрированных на фиг. 1. Соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие вышеуказанные вариабельные области, представлены в прилагаемом перечне последовательностей. Типовая группа СОК-областей упомянутых выше аминокислотных последова- 16 030777 тельностей УН- и/или УЪ-областей, иллюстрированных на фиг. 1, представлена также в прилагаемом перечне последовательностей. Однако, как показано ниже, специалисту в данной области техники хорошо известно, что в дополнение к вышеуказанным областям или взамен их могут использоваться СОКобласти, которые отличаются своими аминокислотными последовательностями от областей, проиллюстрированных на фиг. 1, одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или несколькими аминокислотами. Область УН антитела N1-202.22011 представлена аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:15 и ДНКпоследовательностью 8Е0 ГО N0:19, и ее СЬ-скорректированная форма представлена аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:20 и ДНК-последовательностью 8Е0 ГО N0:21. Область УЬ антитела N1-202.22011 представлена аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:22 и ДНК- последовательностью 8Е0 ГО N0:28, а ее СЬ-скорректированная форма представлена аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:26 и ДНК-последовательностью 8Е0 ГО N0:27. Тяжелоцепочечные СОКаминокислотные последовательности областей УН-С0К1, УН-С0К2 и УН-С0К3 представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:16, 8Е0 ГО N0:17 и 8Е0 ГО N0:18. Легкоцепочечные СОКаминокислотные последовательности областей УЬ-С0К1, УЬ-С0К2 и УЬ-С0К3 представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:23, 8Е0 ГО N0:24 и 8Е0 ГО N0:25.

В одном осуществлении изобретения связывающей молекулой, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, является любое антитело, содержащее аминокислотную последовательность областей УН и/или УЬ так, как проиллюстрировано на фиг. 1. В альтернативном осуществлении изобретения антителом в соответствии с изобретением является связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, конкурирующее за связывание а-синуклеина с антителом, которое имеет УН- и/или УЬ-области так, как проиллюстрировано на фиг. 1. Эти антитела также могут быть антителами человеческого организма, особенно для терапевтического применения. В альтернативном осуществлении изобретения антителом является мышиное антитело, антитело, подобное мышиному антителу, и химерное антитело, подобное мышиному антителу и антителу человеческого организма, которые особенно полезны для диагностики и исследований на животных.

Как упоминалось выше, моноклональное антитело человеческого организма в соответствии с изобретением, благодаря его генерированию в ответ на человеческий иммунный отклик, способно распознавать эпитопы, которые обладают особой физиологической релевантностью и могут быть недоступными или менее иммуногенными в случае процессов иммунизации для генерирования, например, мышиных моноклональных антител и скрининга ίη νίΐτο библиотек представленных фагами антител соответственно. В соответствии с этим, эпитоп человеческого антитела против а-синуклеина в соответствии с изобретением может быть уникальным. Следовательно, настоящее изобретение также распространяется, в общем случае, на антитела к а-синуклеину и на а-синуклеинсвязывающие молекулы, которые в соответствии с изобретением конкурируют с моноклональным антителом человеческого организма за специфическое связывание с а-синуклеином. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на связывающую молекулу, например, на антитело или на его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производные, где антитело специфически связывается с тем же эпитопом а-синуклеина, что и эталонное антитело №-202.22С11.

Конкуренция между антителами может определять, например, путем анализа, во время которого исследуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как а-синуклеин. Известно множество типов анализа на конкурентное связывание, например, твердофазный прямой или косвенный радиоиммуноанализ (ΚΙΑ), твердофазный прямой или косвенный иммуноферментный анализ (ΕΙΑ), конкурентный сэндвич-анализ, см. δίαΗΙί е! а1., Ме!1ю45 ίη Εηζνιηοίοβγ 9 (1983), 242-253; твердофазный прямой биотин-авидин ΕΙΑ; см. Ктгк1ап4 е! а1., ί. 1ттипо1. 137 (1986), 3614-3619 ап4 Скеипд е! а1., Уто^ду 176 (1990), 546-552; твердофазный прямой анализ меченых антител, твердофазный прямой сэндвич-анализ меченых антител; см. Наг^т ап4 Ьапе, ΑηΙίόο^δ. Α ΕαΟοπ-ιΙοιν Мапиа1, ^14 Зрппд Нат^т Рте88 (1988); твердофазный прямой радиоиммунный анализ (ΚΙΑ) меченых антител с использованием радиоактивных меток Ι¹²⁵; см. ΜοιόΙ е! а1., ΜοΚα. Iттиηο1. 25 (1988), 7-15 ап4 Μο^πΙιαιΚΓ е! а1., 8сап4. ί. Iттиηο1. 32 (1990), 77-82. Такой анализ, как правило, предполагает использование очищенного а-синуклеина или его агрегатов, связанных с твердой поверхностью или с клетками, несущими на себе одну из этих субстанций, немеченный исследуемый иммуноглобулин и меченный эталонный иммуноглобулин, то есть моноклональное антитело человеческого организма в соответствии с изобретением. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества меченного иммуглобулина, связанного с твердой поверхностью или с клетками в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Обычно исследуемый иммуноглобулин присутствует при этом в избытке. Анализ на конкурентное связывание может проводиться в условиях, рекомендованных для анализа ΕΟ8Α в прилагаемых примерах. Антителами, идентифицированными с помощью конкурентного анализа (конкурирующие антитела), являются антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, и антитела, связывающиеся с прилегающим эпитопом, пространственно достаточно близким к эпитопу, связанному эталонным антителом из-за возникновения стерического барьера. Обычно, когда конкури- 17 030777 рующее антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50% или 75%. Следовательно настоящее изобретение направлено также на связывающую молекулу, например, на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, где это антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела ΝΙ-202.22Ο11 с α-синуклеином.

Также представлена выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с α-синуклеином человеческого организма и содержат аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, идентичную по меньшей мере на 80%, 85%, 90% 95% или 100% последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:15 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ:20.

Также представлена выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с человеческим α-синуклеином и содержат аминокислотную последовательность УН-области, полностью идентичную или идентичную, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или больше аминокислотных замен, последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:15 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ:20.

Также представлена выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с человеческим α-синуклеином и содержат аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (УЪ) иммуноглобулина, идентичную по меньшей мере на 80%, 85%, 90% 95% или 100% последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:22 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ:26.

В некоторых осуществлениях изобретения предлагается выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с αсинуклеином человеческого организма и содержат аминокислотную последовательность УЪ, полностью идентичную или идентичную, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или более аминокислотных замен, последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:22 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ:26.

В других осуществлениях изобретения выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с α-синуклеином человеческого организма, содержит аминокислотные последовательности УН- и УЪ-областей, состоит по существу или из аминокислотных последовательностей УН- и УЪ-областей, по меньшей мере на 80%, 85%, 90% 95% или на 100% идентичных последовательностям (а) δΕΟ ΙΌ ΝΟ:15 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ:22 соответственно, (Ъ) δΕΟ ΙΌ ΝΟ:15 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ:26 соответственно, (с) δΕΟ ΙΌ ΝΟ:20 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ:22 соответственно, (Д) δΕΟ ΙΌ ΝΟ:20 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ:26 соответственно.

Также представлена выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с α-синуклеином человеческого организма, содержащим, состоящим по существу или из вариабельной области тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, где по меньшей мере одна, две или все три УН-СОК-области, принадлежащие вариабельной области тяжелой цепи, являются по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичными иллюстрированным на фиг. 1 аминокислотным последовательностям УН-СОК 1, УН-СОК2 или УН-СОК3 эталонной тяжелой цепи и представлены последовательностями δΕΟ ΙΌ ΝΟ16, δΕΟ ΙΌ ΝΟ:17 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ:18 соответственно. Таким образом, в соответствии с этим осуществлением изобретения вариабельная область тяжелой цепи - предмет изобретения - имеет полипептидные последовательности УН-СОК1, УН-СОК2 и УНСОК3, родственные аминокислотным последовательностям УН-СОК1, УН-СОК2 и УН-СОК3, которые представлены как δΕΟ ΙΌ ΝΟ16, δΕΟ ΙΌ ΝΟ:17 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ:18 соответственно. Тогда как на фиг. 1 показаны области УН-СОК, определенные в системе КаЬаЕ другие определения СОК, например, УН-СОК, определенные в системе С1ю11иа. также включаются в настоящее изобретение и могут легко идентифицироваться специалистом средней квалификации в данной области техники, используя представленные данные о последовательностях.

Также представлена выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с α-синуклеином человеческого организма, содержат, состоят по существу или состоят из вариабельной области тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, в котором области УН-СОК 1, УН-СОК2 и УН-СОК3 имеют полипептидные последовательности, идентичные аминокислотным последовательностям областей УН-СОК1, УН-СОК2 и УН-СОК3, представленных последовательностями δΕΟ ГО ΝΟ:16, δΕΟ ГО ΝΟ:17 и δΕΟ ГО ΝΟ:18 соответственно.

Также представлена выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с α-синуклеином человеческого организма, содержат, состоят по существу или состоят из вариабельной области тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, в которой области УН-СОК1, УН-СОК2 и УН-СОК3 имеют полипептидные последовательности, которые являются полностью идентичными или идентичными, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислотных замен в любой из областей УН-СОК - УН-СОК 1, УН-СОК2 или УНСОК3, аминокислотным последовательностям, представленным последовательностями δΕΟ ГО ΝΟ:16, δΕΟ ГО ΝΟ:17 и δΕΟ ГО ΝΟ:18 соответственно. Также обеспечивается вариабельная область тяжелой

- 18 030777 цепи (УН) иммуноглобулина, в которой области УН-СЭР1. УН-СЭР2 и УН-СЭРЗ имеют полипептидные последовательности. которые являются полностью идентичными или идентичными. за исключением пяти. шести. семи. восьми. девяти. десяти. одиннадцати. двенадцати. тринадцати. четырнадцати. пятнадцати или двадцати суммарных СГОР-замен. аминокислотным последовательностям. представленным последовательностями 8ЕО ГО N0:16. 8Еф ГО N0:17 и 8Еф ГО N0:18 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные аминокислотные замещения являются консервативными.

Также представлена выделенная связывающая молекула. например. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. которые специфически связываются с α-синуклеином человеческого организма и содержат. состоят по существу или состоят из вариабельной области легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина. где по меньшей мере одна. две или все три УЪ-СЭР вариабельные области легкой цепи являются по меньшей мере на 80%. 85%. 90% или 95% идентичными аминокислотным последовательностям эталонной легкой цепи УЪ-СОР1. УЪ-СЭР2 или УЪ-СЭРЗ. представленным последовательностями 8Еф ГО N0:23. 8Е0 ГО N0:24 и 8Еф ГО N0:25 соответственно. Таким образом. в соответствии с этим осуществлением изобретения вариабельная область легкой цепи - предмет изобретения - имеет полипептидные последовательности УЪ-СЭР1. УЪ-С0Р2 и УЪ-СЭРЗ. родственные полипептидам. показанным на фиг. 1 и представленным последовательностями 8Е0 ГО N0:23. 8Еф ГО N0:24 и 8Еф ГО N0:25 соответственно. Тогда как на фиг. 1 показаны области УЪ-СЭР. определенные в системе КаЬа1. другие определения СЭР. например. УЪ-СЭР. определенные в системе Скойиа. также включаются в настоящее изобретение.

В данной заявке описана также выделенная связывающая молекула. например. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. которые специфически связываются с α-синуклеином человеческого организма. содержат. состоят по существу или состоят из вариабельной области легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина. в котором области УЕ-СГОР1. УБ-С0Р2 и УБ-СЭРЗ имеют полипептидные последовательности. идентичные группам УЪ-СЭР I. УЕ-СГОР2 и УБ-СЭРЗ. показанным на фиг. 1 и представленным последовательностями 8Е0 ГО N0:23. 8Еф ГО N0:24 и 8Еф ГО N0:25 соответственно.

В данной заявке описана также выделенная связывающая молекула. например. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. которые специфически связываются с человеческим α-синуклеином. содержат. состоят по существу или состоят из вариабельной области легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина. в которой области УЕ-СГОРЕ УЕ-СГОР2 и УБ-СЭРЗ имеют полипептидные последовательности. являющиеся полностью идентичными или идентичными. за исключением одной. двух. трех. четырех. пяти или шести аминокислотных замен в любой из областей УЪ-СЭР. аминокислотным последовательностям УЪС'ГОР I. УЕ-СГОР2 или УБ-СЭРЗ. представленным последовательностями 8Еф ГО Н0:2З. 8Еф ГО N0:24 и 8Е0 ГО N0:25 соответственно. Также обеспечивается вариабельная область легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина. в которой области УЕ-СГОР1. УЕ-СГОР2 и УБ-СЭРЗ имеют полипептидные последовательности. являющиеся полностью идентичными или идентичными. за исключением пяти. шести. семи. восьми. девяти. десяти. одиннадцати. двенадцати. тринадцати. четырнадцати или пятнадцати суммарных СГОРзамен. аминокислотным последовательностям. представленным последовательностями 8Е0 ГО Н0:2З. 8Е0 ГО N0:24 и 8Еф ГО N0:25 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные аминокислотные замены являются консервативными.

Иммуноглобулин или его кодирующая сДНК могут быть дополнительно модифицированы. Таким образом. в еще одном осуществлении изобретения способ изобретения включает любую из шага (шагов) продуцирования химерного антитела. антитела. подобного антителу мыши. одноцепочечного антитела. РаЬ-фрагмента. биспецифического антитела. слитого антитела. меченного антитела или аналога любого из них. Соответствующие способы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны. например. у [Нат1оте апй Ьаие АийЬоФез. А ЬаЬота1огу Мапиа1. С8Н Ргезз. Со1й Зртшд НагЬог (1988)]. В том случае. когда производные вышеуказанных антител создаются способом фагового отображения. может применяться способ поверхностного плазмонного резонанса. используемый в системе В1Асоге для повышения эффективности фаговых антител. которые связываются с тем же эпитопом. что и любое из описанных в данной заявке антител [(ЗсЫет. Нитаи АийЬоФез Гибриднотаз 7 (1996). 97-105; Ма1тЬог§. 1. 1ттиио1. Ме1коЙ8 18З (1995). 7-1З)]. Продуцирование химерных антител описано. например. в международной заявке на изобретение |\У0 89/09622]. Способы продуцирования гуманизированных антител описаны. например. в европейской заявке на изобретение [ЕР-А102З9400] и в международной заявке на изобретение |\У0 90/07861]. Дополнительным источником антител. подходящих для применения в соответствии с настоящим изобретением. являются так называемые ксеногенные антитела. Общие принципы продуцирования ксеногенных антител. таких как антитела. подобные антителам человеческого организма. в мышах. описаны. например. в международных заявках на изобретение \У0 91/10741. \У0 94/02602. \У0 96/З4096 и \У0 96/ЗЗ7З5. Как указывалось выше. помимо полных антител антитело в соответствии с изобретением может существовать в различных формах.. включая. например. Ρν. РаЬ и Р(аЬ)2. а также в одноцепочечной форме 8сΡν8. как описано. например. в международной заявке на изобретение |\У0 88/09З44].

Антитела в соответствии с изобретением или их соответствующие иммуноглобулиновые цепи могут быть дополнительно модифицированы с помощью обычных способов. известных в данной области

- 19 030777 техники, например, с помощью единичных или множественных аминокислотных делеций, инсерций, замен, добавлений и/или рекомбинаций и/или любых других, известных в данной области техники, модификаций, включая их комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащую в основе аминокислотной последовательности иммуноглобулиновой цепи, хорошо известны специалистам в данной области техники, например, [8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошп§ А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б §ргтд НагЬог ЬаЬогаЮгу (1989) Ν.Υ. апб Аи8иЬе1, Сиггеп! РгоЮсо18 ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, Сгееп РиЬ118Ып§ Л88ос1а1е8 апб Абеу РИегеаепсе. Ν.Υ. (1994)]. Модификации антитела в соответствии с изобретением включают химическую и/или ферментативную дериватизации в отношении одной или нескольких составляющих его аминокислот, включая модификации боковых цепей, модификации остова и Ν- и Сконцевые модификации, в том числе ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и присоединение углеводных или липидных частей, кофакторов и т. д. Подобным образом, настоящее изобретение охватывает продуцирование химерных белков, содержащих описанные антитела или некоторые их фрагменты на аминоконце, слитые с гетерологической молекулой, такие как иммуностимуляторные лиганды на карбоксильном конце, что более подробно описано, например, в международной заявке на изобретение [АО 00/30680].

Кроме того, настоящим изобретением охватываются пептиды, включая, пептиды, содержащие связывающую молекулу, как описано выше, например, содержащие С.НР3 -область вариабельной области любого из вышеупомянутых антител и особенно СОР3-область тяжелой цепи, поскольку довольно часто тяжелая цепь С.НР3 (НСЭР3) является областью с более высокой степенью вариабельности и преобладающего участия во взаимодействии антигена и антитела. Такие пептиды могут быть легко синтезированы или продуцированы рекомбинантными способами в процессах получения связывающего агента для использования в соответствии с данным изобретением. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области техники. Пептиды можно синтезировать, например, с помощью имеющихся в продаже автоматизированных пептидных синтезаторов. Пептиды могут также продуцироваться с помощью рекомбинантных способов путем встраивания ДНК, которая экспрессирует пептид в вектор экспрессии, и с помощью трансформирования клеток вектором экспрессии для продуцирования пептида.

Таким образом, настоящее изобретение относится к любой связывающей молекуле, например, антителу или его связывающему фрагменту, которая ориентирована к антителу человеческого организма против α-синуклеина в соответствии с изобретением и демонстрирует вышеупомянутые свойства, то есть специфически распознает α-синуклеин. Такие антитела и связывающие молекулы могут быть протестированы на свою специфичность связывания и аффинность способами ЕЫ§А, вестерн-блоттинга, и иммуногистохимии так, как описано в настоящей заявке, см., например, к примерам. Кроме того, предварительные результаты последующих экспериментов, проведенных в соответствии с настоящим изобретением, показали, что антитело человеческого организма к α-синуклеину в соответствии с изобретением и, в частности, антитело ΝΙ-202.22Ό11 распознает α-синуклеиновые тельца включений, присутствующие на срезах человеческого мозга пациентов, страдавших на деменцию с тельцами Леви (ТЛ) или болезнью Паркинсона (БП). Таким образом, в одном осуществления настоящего изобретения человеческое антитело или его связывающий фрагмент, производное или вариант распознает α-синуклеин на срезах человеческого мозга с ТЛ или БП (см., например, фиг. 4с).

Иммортализованные β-клетки или β-клетки памяти могут использоваться в качестве источника локусов реаранжированных тяжелых и легких цепей для последующей экспрессии и/или генетической манипуляции. Реаранжированные гены антител для продуцирования сДНК могут быть подвергнуты обратной транскрипции по соответствующим мРНК. В случае необходимости константная область тяжелой цепи может быть заменена областью другого изотипа или полностью удалена. Из нуклеотидных последовательностей могут быть удалены нежелательные мотивы (такие как сайты сплайсинга или сайты рестрикции), а использование кодона может быть оптимизировано к клетке, в которой должна осуществляться экспрессия антитела или его фрагмента. Кроме того, могут быть выполнены одна или несколько мутаций с изменением аминокислот в вариабельных областях, например, для повышения аффинности или улучшения стабильности. Вариабельные области могут быть соединены для кодирования одноцепочечных Ρν-областей. Множественные Ρν-области могут быть соединены для подтверждения своей способности по формированию связей с несколькими мишенями или использоваться химерные комбинации тяжелых и легких цепей. При наличии генетического материала открывается прямой путь к конструированию аналогов, как описано выше, сохраняющих свою способность связываться с мишенью. Способы клонирования вариабельных областей антител и генерирования рекомбинантных антител хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, у [ОбШапб е1 а1., Т188ие Апб§еп8 47 (1996), 1-20; Ооепеске е1 а1., Ьеикет1а 11 (1997), 1787-1792].

Если соответствующий генетический материал получен и, при необходимости, модифицирован для кодирования аналога, то кодирующие последовательности, включая те из них, что кодируют, по меньшей мере вариабельные области тяжелых и легких цепей, могут быть вставлены в системы экспрессии, содержащиеся на векторах, которые могут быть трансфицированы в стандартные рекомбинантные клеткихозяева. В целях эффективного процессинга может использоваться множество разновидностей таких

- 20 030777 клеток-хозяев. Подходящими для этих целей типичными животными клеточными линиями являются, например, клетки СНО, клетки НЕК 293, клетки N80 и др.

Затем приступают к продуцированию антитела или его аналога путем культивирования модифицированных рекомбинантных клеток-хозяев в условиях, отвечающих росту этих клеток и экспрессии кодирующих последовательностей. После этого, антитела извлекают путем отделения их от культуры. Системы экспрессии могут быть рассчитаны на включение сигнальных пептидов, благодаря чему полученные антитела секретируются в культурную среду. Можно применять также внутриклеточное продуцирование.

В соответствии с изложенным выше, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или эквивалентную ему связывающую молекулу - предмет настоящего изобретения, одну или несколько СОК-областей, одну или несколько вариабельных областей тяжелой цепи или легкой цепи или их вариантов иммуноглобулиновой цепи описанного выше антитела, против αсинуклеина.

Специалист в данной области техники легко поймет, что вариабельный домен антитела или любая его часть могут использоваться для конструирования других полипептидов или антител с желаемой специфичностью и биологической функцией. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает полипептиды и антитела, содержащие по меньшей мере одну тяжелую цепь или легкую цепь области СЭК или такую СЭК-область с 1, 2, 3, 4 или несколькими аминокислотными заменами антитела ΝΙ202.22Ό11, которые могут иметь совершенно такие же, как у ΝΙ-202.22Ό11 или подобные им связывающие свойства, описанные в прилагаемых примерах. Квалифицированный специалист в данной области техники знает, что аффинность связывания может быть повышена путем аминокислотных замен в СЭКобластях или в гипервариабельных петлях |С1ю11йа и Ьекк, ί. Мо1. Вю1. 196 (1987), 901-917], которые частично перекрываются СЭК-областями. как было установлено Кэбетом, см., например, [КгесЬтапп, е1 а1., №Лиге 332 (1988), 323-327]. Таким образом, настоящее изобретение относится также к антителам, где одна или несколько вышеупомянутых СЭК-областей содержат одну или несколько аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело в соответствии с изобретением содержит в одной или обеих своих иммуноглобулиновых цепях, два или все три СЭК-области вариабельных областей (оригинальных или скорректированных) так, как показано на фиг. 1.

Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или их производные в соответствии с изобретением, как известно специалисту средней квалификации в данной области техники, могут содержать константную область, которая опосредует одну или несколько эффекторных функций. Например, связывание С1-компонента комплемента с константной областью антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента является важной в опсонизации и лизисе патогенов клетки. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и также может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, антитела связываются с рецепторами различных клеток через Рс-область, с помощью сайта связывания Рс-рецептора из Рсобласти антитела, связывающейся с Рс-рецептором (РсК) в клетке. Существует множество Рсрецепторов, являющихся специфическими для антител различных классов, включая 1дС (гаммарецепторы), 1дЕ (эпсилон-рецепторы), 1дА (альфа-рецепторы) и 1дМ (мю-рецепторы). Связывание антитела с Рс-рецепторами на поверхности клеток запускает множество важных и различных биологических ответных реакций, включая поглощение и деструкцию частиц, покрытых антителами, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней клетками-киллерами (называемый антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью или АОСС), выделение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и контроль продуцирования иммуноглобулина.

В соответствии с этим, некоторые варианты осуществления изобретения включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, в котором по меньшей мере часть одного или нескольких доменов константных областей была утрачена в результате делеции или иначе изменена таким образом, чтобы получить требуемые биохимические характеристики, такие как сниженные эффекторные функции, способность к нековалентной димеризации, повышенную способность к локализации на сайте агрегирования и отложения α-синуклеина, уменьшенное время полужизни в кровяном русле или увеличенное время полужизни в кровяном русле по сравнению с полным, неизмененным антителом приблизительно такой же иммуногенности. Например, некоторые антитела для применения в описанных в данной заявке способах диагностики и лечения являются антителами с делетированными доменами, которые содержат полипептидную цепь, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но у которой недостает по меньшей мере части одного или нескольких доменов тяжелой цепи. Так, в некоторых модифицируемых антителах делетируют один полный домен константной области, например, весь СН2-домен или часть его. В других вариантах некоторые антитела для применения в описанных в данной заявке способах диагностики и лечения имеют константную область, например, область тяжелой цепи Ι§0, измененную таким образом, чтобы исключить гликозилирование; в данном описании такие антитела называются агликозилированными или агли-антителами. Такие агли-антитела могут быть приготовлены ферментативным путем, а также генным реконструированием консенсусного сайта(-ов) гликозилирования в

- 21 030777 константной области. Не обращаясь к теоретическому объяснению, можно сказать, что агли-антитела могут иметь улучшенные характеристики безопасности и стабильности ίη νίνο. Описание способов продуцирования агликозилированных антител, обладающих требуемой эффекторной функцией, можно найти, например, в международной заявке [АО 2005/018572], включенной в данную заявку во всей ее полноте посредством ссылки.

В некоторых описанных в данной заявке антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, Рс-часть может быть мутирована с целью снижения эффекторной функции с помощью хорошо известных способов. Например, делеция или инактивация (путем точковых мутаций или других средств) домена константной области позволяет уменьшить связывание Рс-рецепторов циркулирующих модифицированных антител и тем самым повысить локализацию а-синуклеина. В других случаях, модификации константных областей, согласующиеся с данным изобретением, ослабляют связывание комплемента и, таким образом, сокращают время полужизни в кровяном русле и ослабляют неспецифическую ассоциацию конъюгированного цитоксина. Для модифицирования дисульфидной связи или олигосахаридных компонентов могут использоваться другие способы модификации константной области, которые позволят повысить локализацию благодаря увеличенной антигенной специфичности или гибкости антител. Получаемый в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций, такие как локализация а-синуклеина, биораспределение и время полужизни в кровяном русле, могут быть легко измерены и количественно оценены с помощью хорошо известных иммунологических способов без излишнего экспериментирования.

В некоторых описанных в данной заявке антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных Рс-компонент может быть мутирован или заменен на альтернативные белковые последовательности в целях повышения клеточного поглощения антител, например, путем усиления рецептор-опосредованного эндоцитоза антител через Рс,/-рецепторы, ЬРР- или ТНу1-рецепторы или с помощью технологии суперантитела, которая позволяет антителам проходить в клетки и выходить из них подобно челноку, не причиняя им вреда [Ехрей Ορίη. Βίο1. ТНег. (2005), 237-241]. Например, генерирование слитых белков связывающего участка антитела и родственных белковых лигандов поверхностных рецепторов клеток или би- либо мультиспецифических антител со специфической последовательностью, связывающихся с а-синуклеином, а также генерирование поверхностного рецептора клетки может осуществляться с помощью способов, хорошо известных в данной области техники.

В некоторых описанных в данной заявке антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, Рс-компонент может быть мутирован или заменен на альтернативные белковые последовательности, или антитело может быть химически модифицировано для повышения его способности проникать через гематоэнцефалический барьер.

Модифицированные формы антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных в соответствии с изобретением могут быть получены из полного прекурсора или родительского антитела с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Подходящие для этого типовые способы подробно рассмотрены в данном описании. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть получены или промышленно изготовлены с помощью способов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы антител или их фрагменты продуцируются рекомбинантным способом, то есть с помощью рекомбинантных ДНК. Типовые способы получения молекул антител или их фрагментов более подробно рассмотрены ниже.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением также включают производные, модифицированные, например, путем ковалентного присоединения к антителу молекулы любого типа таким образом, чтобы ковалентное присоединение не мешало антителу специфически связываться с родственным ему эпитопом. Например, производными антителами могут быть антитела, модифицированные путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными и блокирующими группами, протеолитического расщепления, соединения с клеточным лигандом или другим белком и т. д. С помощью известных способов может применяться любая из множества химических модификаций, включая, но не ограничиваясь, специфическим химическим расщеплением, ацетилированием, формилированием, метаболическим синтезом туникамицина и т. д. Кроме того, производное может содержать одну или несколько не-классических аминокислот.

В определенных вариантах осуществления изобретения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные этого, являющиеся предметом изобретения, не вызывают вредного иммунного отклика у животного или, например, у человека, принимающего лечение. В определенных осуществлениях изобретения связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты получены у пациента, например, у человека и в последующем используются в тех же группах, из которых они были получены, например, в группах человеческих существ, с целью облегчения и минимизации появления вредных иммунных откликов.

Для снижения иммуногенности антитела может применяться также деиммунизация. Используемый

- 22 030777 в данной заявке термин деиммунизация включает изменение антитела так, чтобы модифицировать Тклеточные эпитопы, см., например, международные заявки на изобретения [ИО 98/52976 и ПО 00/34317]. Например, выполняется анализ последовательностей УН и УЪ из стартового антитела и по карте человеческого Т-клеточного эпитопа каждой из У-областей определяется размещение эпитопов относительно областей определения комплементарности (СЭК8) и других ключевых остатков в данной последовательности. Индивидуальные Т-клеточные эпитопы из карты Т-клеточных эпитопов анализируются для идентификации альтернативных аминокислотных замен, характеризующихся низким риском изменения активности конечных антител. Проектируется ряд альтернативных последовательностей УН и УЪ, содержащих комбинации аминокислотных замен, и затем эти последовательности встраиваются в ряд связывающих полипептидов, например, в а-синуклеинспецифические антитела или в их иммуноспецифические фрагменты, которые предназначаются для использования в описанных в данной заявке способах диагностики и лечения и тестируются для определения своих функциональных способностей. Как правило, для этих целей генерируют и тестируют 12-24 варианта антител. Полные гены тяжелых и легких цепей, содержащие модифицированные У-области и С-области человеческого организма затем клонируются в векторы экспрессии, и в клеточные линии вводят последующие плазмиды для продуцирования полных антител. Затем проводят сравнение полученных антител путем соответствующих биохимических и биологических анализов, и по их результатам определяется оптимальный вариант.

Моноклональные антитела могут быть приготовлены с помощью самых различных способов, известных в данной области техники, включая использование гибридомы, рекомбинантного способа, способа фагового отображения и их сочетаний. Например, моноклональные антитела могут продуцироваться с помощью гибридомных способов, включая способы, известные в данной области техники, и способы, описанные, например, в публикациях |Наг1о\у с1 а1., ΛηΙίόοάία: А БаЪогаЮгу Мапиа1, Со1б Зрбпд НагЬог ЪаЬогаЮгу Рге88, 2пб еб. (1988); НаттегЬпд с1 а1., ίη: Мопос1опа1 АпЬЪобюх апб Т-Се11 НуЪпбопт ΕΙδβνίβΓ, Ν.Υ., 563-681 (1981)], которые включены в эту заявку во всей своей полноте посредством ссылки. Используемый в данном описании термин моноклональное антитело охватывает не только антитела, продуцированные с помощью гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из единичного клона, включая любой эукариотический, прокариотический и фаговый клон, а не к способу, с помощью которого такое антитело продуцировано. Таким образом, термин моноклональное антитело не ограничивается антителами, продуцированными с помощью гибридомной технологии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела получают из человеческих β-клеток, которые были иммортализованы путем трансформации вирусом ЭпштейнаБарра, как описано в настоящей заявке.

В хорошо известном гибридомном процессе (КоЫег е1 а1., №Щ.1ге 256 (1975), 495) сравнительно короткоживущие или смертные лимфоциты млекопитающего, например, β-клетки, полученные от субъекта-человека так, как описано в настоящей заявке, сливают с иммортальной опухолевой клеточной линией (например, клеточной линией миеломы), продуцируя, таким образом, гибридные клетки или гибридомы, которые являются как иммортальными, так и способными продуцировать генетически кодированное антитело β-клетки. Получаемые в результате гибриды сегрегируют в единичные генетические штаммы путем селекции, разбавления и повторного выращивания с помощью каждого индивидуального штамма, содержащего специфические гены для образования единичных антител. Они продуцируют антитела, которые являются гомогенными против целевого антигена и, принимая во внимание их чистое генетическое происхождение, получили название моноклональные.

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей среде для культивирования, которая может содержать одну или несколько субстанций, ингибирующих рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. Специалисты, квалифицированные в данной области техники, поймут, что реагенты, клеточные линии и среды для формирования, селекции и выращивания гибридом доступны в продаже у многочисленных источников, и в наличии имеются хорошо отработанные стандартизированные протоколы. В общем случае, среду для культивирования, в которой выращиваются гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклонального антитела против целевого антигена. Специфичность связывания моноклонального антитела, продуцированного гибридомными клетками, определяют путем анализа ш νίΙΐΌ с использованием способов иммунопреципитации, радиоиммуноанализа (К1А) или иммуноферментного анализа (ЕЫ§А) так, как описано в настоящей заявке. После того, как подтверждается способность гибридом продуцировать антитела целевой специфичности, аффинности и/или активности, эти клоны могут быть субклонированы путем ограничения процедур разбавления и выращивания стандартными способами, смотрите, например, у [Ообшд, Мопос1опа1 АпбЬоб1е8: Ргтар1е8 апб Ргасбсе, Асабетю Рге88, рр 59-103 (1986)]. В дальнейшем будет понятно, что моноклональные антитела, секретированные субклонами, могут быть отделены от среды для культивирования, асцитической жидкости или сыворотки с помощью обычных процедур очистки, включая, например, белок-А, гидроксиапатитную хроматографию, гель-электрофорез, диализ и аффинную хроматографию.

В другом варианте осуществления изобретения селекцию лимфоцитов проводят путем микромани- 23 030777 пуляций, а вариабельные гены - отделяют. Например, одноядерные клетки периферийной крови отделяют от иммунизированного или естественно иммунного млекопитающего, например, человека, и культивируют ш уйго в течение приблизительно 7 дней. Культуры подвергают скринингу на специфические 1дС. отвечающие критериям скрининга. Клетки из положительных лунок отделяют. Отдельные β-клетки продуцирующие 1д, отделяют с помощью РАС8 (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) или путем идентификации их в анализе комплемент-опосредованных гемолитических бляшек. 1дпродуцирующие β-клетки помещают в микропробирку, и УН- и УЪ-гены могут быть амплифицированы с помощью, например, ΚΤ-РСК (полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией). УН- и УЬгены клонируют в вектор экспрессии антитела и трансфицируют в клетки (например, эукариотическую или прокариотическую клетку) для экспрессии.

В альтернативном осуществлении изобретения антитело-продуцирующие клеточные линии отбирают и культивируют с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Такие способы описаны в большом количестве лабораторных пособий и публикаций ВУЗов. В этом отношении способы, пригодные для использования в данном изобретении, как описано ниже, представлены в публикации [Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, СоНдап е! а1., Ебк., Огееп РиЪНкЫпд АккоааКк апб АПеу-Шегкаепсе, 1ойп Айеу апб 8опк, Ыете Уогк (1991)], включенной в настоящую заявку во всей своей полноте, включая приложения, посредством ссылки.

Фрагменты антител, распознающие специфические эпитопы могут быть созданы с помощью известных способов. Например, РаЪ- и Р(аЪ')2-фрагменты можно продуцировать рекомбинантным способом или путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина используя ферменты, такие как папаин (для получения РаЪ-фрагментов) или пепсин (для получения Р(аЪ')2-фрагментов). Р(аЪ')2фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и СН1-домен тяжелой цепи. Таких фрагментов достаточно для использования, например, в иммунодиагностических процедурах, где привлекается связывание иммуноспецифических частей иммуноглобулинов для детектирования таких реагентов, как радиоизотопы.

Антитела, полностью соответствующие антителам человеческого организма так, как описано в настоящей заявке, являются особенно желательными для терапевтического лечения человека. Антитела человеческого организма в соответствии с изобретением получают, например, от пожилых людей, которые ввиду их возраста могут попадать в группу риска развития таких расстройств как, например, болезнь Паркинсона. Источником антител человеческого организма может быть, например, также пациент с указанным расстройством, которое, однако, протекает необычайно устойчиво. Тем не менее, хотя у пожилых здоровых лиц без симптомов заболевания вероятнее всего можно было бы ожидать наличия развитых защитных антител к а-синуклеину по сравнению с более молодыми людьми, последние все же тоже могут служить источниками антител человеческого организма в соответствии с изобретением. Это особенно справедливо в отношении более молодых пациентов, которые предрасположены к развитию семейной формы синуклеинопатии, но не проявляют ее симптомов, поскольку их иммунная система и ее реакция являются более эффективными, чем у пожилых людей.

В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере одну СЭК-область тяжелой или легкой цепи молекулы антитела. В другом осуществлении изобретения антитело в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере две СЭКобласти из одной или нескольких молекул антитела. В другом осуществлении изобретения антитело в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере три СЭК-области из одной или нескольких молекул антитела. В другом осуществлении изобретения антитело в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере четыре СЭК-области из одной или нескольких молекул антитела. В другом осуществлении изобретения антитело в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере пять СЭКобластей из одной или нескольких молекул антитела. В другом осуществлении изобретения антитело в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере шесть СЭК-областей из одной или нескольких молекул антитела. В данной заявке описаны типовые молекулы антител, содержащие по меньшей мере одну СЭК-область, которая может быть включена в антитела субъекта.

Антитела в соответствии с изобретением могут продуцироваться любым способом, применяемым в синтезе антител, особенно, с помощью химического синтеза или рекомбинантной экспрессии так, как описано в настоящей заявке.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное в соответствии с изобретением содержит искусственную константную область, где один или несколько доменов частично или полностью делетированы (домен-делетированные антитела). В некоторых вариантах осуществления изобретения совместимые модифицированные антитела содержат домен-делетированные конструкции или их варианты, где полный СН2-домен удален (ЛСН2-конструкции). В других вариантах короткий связывающий пептид может заменить делетированный домен, обеспечивая вариабельной области гибкость и свободу перемещения. Доменделетированные конструкции можно получать с помощью вектора, кодирующего человеческий константный домен Ι§Οι, см., например, международные заявки на изобретение [АО 02/060955 и АО

- 24 030777

02/096948А2]. Этот вектор конструируют таким образом, чтобы делетировать СН2-домен и получить искусственный вектор, экспрессирующий константную область домен-делетированного 1дС1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением являются минителами. Минитела могут быть получены с помощью способов, описанных, например, в [американском патенте № 5837821] или в международной заявке на изобретение [АО 94/09817].

В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую делецию или замещение нескольких аминокислот или даже одной аминокислоты, насколько это позволяет связь между мономерными субблоками. Например, мутирование единичных аминокислот в выбранных участках СН2-домена может быть достаточным для того, чтобы полностью ослабить Рс-связывание и, таким образом, повысить локализацию α-синуклеина. Подобным образом, могут быть делетированы один или несколько доменов константной области, контролирующих эффекторную функцию (например, связывание комплемента). Такие частичные делеции в константных областях позволяют улучшить выбранные характеристики антитела (время полужизни в кровяном русле), оставляя при этом нетронутыми другие требуемые функции, связанные с данным доменом константной области субъекта. Более того, как упоминалось выше, константные области описанных в данной заявке антител могут быть синтезированы путем мутации или замены одной или несколькими аминокислотами, что позволяет улучшить профиль характеристик итоговой конструкции. Для этой цели можно прибегнуть к нарушению активности консервативного сайта связывания (например, Рс-связывания), полностью поддерживая при этом конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. Возможен также вариант, включающий добавление одной или несколько аминокислот в константную область для усиления желаемых характеристик, например, эффекторной функции, увеличение количества цитоксинов и присоединение углеводов. В таких вариантах может потребоваться введение или реплицирование специфических последовательностей константных областей, полученных из выбранных доменов.

Настоящим изобретением предлагаются также антитела, которые содержат варианты, состоят по существу из вариантов или состоят из описанных в данной заявке вариантов (включая производные) молекул антител (например, УН-областей и/или УЪ-областей), которые (антитела или их фрагменты) иммуноспецифически связываются с α-синуклеином. Стандартные способы, известные квалифицированным специалистам в данной области техники, могут быть использованы для введения мутаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, включая, но не ограничиваясь, сайт-направленным мутагенезом и РСК-опосредованный мутагенезом, результатом которых является замена аминокислот. Варианты (включая производные) могут кодировать менее 50 аминокислотных замен, менее 40 аминокислотных замен, менее 30 аминокислотных замен, менее 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотных замен, менее 3 аминокислотных замен или менее 2 аминокислотных замен относительно областей УН, УН-СБК1, УН-СБК2, УН-СБК3, УЪ, УЪ-СБК1, УЪ-СБК2 или УЪСБК3. Консервативной заменой аминокислоты является аминокислотная замена, в которой данный аминокислотный остаток замещается на аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь с подобным ему зарядом. Были определены семейства аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи с подобными друг другу зарядами. В эти семейства входят аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепьями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В альтернативном осуществлении изобретения мутации могут вводиться хаотически вдоль всей или части кодирующей последовательности как при насыщающем мутагенезе, а образующиеся мутанты могут отбираться по их биологической активности для определения мутантов, которые сохраняют активность (например, способность связываться с α-синуклеином).

Мутации можно вводить, например, только в области остова или только в СБК-области молекулы антитела. Введенные мутации могут быть молчащими или нейтральными бессмысленными и, например, не влиять совсем или влиять незначительно на способность антител связываться с антигенами. Фактически, некоторые из таких мутаций не изменяют вообще аминокислотные последовательности. Мутации этого типа могут быть полезными для оптимизации использования кодона или для улучшения продуцирования антител гибридом. Кодон-оптимизированные кодирующие области, которые кодируют антитела в соответствии с изобретением, описаны ниже. В качестве альтернативы ненейтральные миссенс мутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Большинство молчащих и нейтральных миссенс мутаций наиболее вероятно размещаются в областях остова, в то время как большинство ненейтральных бессмысленных мутаций наиболее вероятно размещаются в СБК-области, хотя это требование не является абсолютным. Специалист в данной области техники должен уметь конструировать и

- 25 030777 тестировать мутантные молекулы с желательными свойствами, такими как отсутствие изменения антигенсвязывающей активности или изменение связывающей активности (например, улучшение антигенсвязывающей активности или изменение специфичности антител). После мутагенеза кодированный белок можно экспрессировать обычным путем, а функциональную и/или биологическую активность кодированного белка (например, способность иммуноспецифически связываться по меньшей мере с одним эпитопом а-синуклеина) можно задать с помощью описанных в данной заявке способов или обычных хорошо известных способов модификации.

III. Полинуклеотиды, кодирующие антитела

Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, которым может быть немодифицированная РНК или ДНК или модифицированная РНК или ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, смешанной ДНК, состоящей из одноцепочечной и двухцепочечной областей, одноцепочечной и двухцепочечной РНК, и смешанной РНК, представляющей собой комбинацию одноцепочечной и двухцепочечной областей, гибридной молекулы, содержащей ДНК и РНК, которые могут состоять из одной или, как правило, более цепей или представлять собой комбинацию одноцепочечных и двухцепочечных областей. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из трехцепочечных областей, содержащих РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может также содержать один или несколько модифицированных оснований либо остовов ДНК или РНК, модифицированных в целях устойчивости или других целях. Модифицированные основания содержат, например, тритилированные и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК могут вноситься самые различные модификации. Таким образом, термин полинуклеотид охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.

Выделенный полинуклеотид, кодирующий вариант полипептида неестественного происхождения, полученный из иммуноглобулина (например, из тяжелоцепочечной или легкоцепочечной части иммуноглобулина), может быть создан путем введения одного или несколько нуклеотидных замен, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность иммуноглобулина так, чтобы одна или несколько замен, добавлений или делеций аминокислот вносились в закодированный белок. Мутации могут вводиться с помощью стандартных способов, таких как сайт-направленный мутагенез и РСК-опосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот могут проводиться в одном или нескольких несущественных аминокислотных остатках.

Хорошо известно, что РНК может быть выделена из оригинальной β-клетки, гибридомной клетки или из других трансформированных клеток стандартными способами, такими как экстракция гуанидинизоцианатом и преципитацией с последующим отделением с помощью центрифугирования или хроматографии. В случае необходимости, мРНК может быть выделена из общей РНК с помощью стандартной технологии, например, хроматографии на олиго(ДГ)-целлюлозе. Подходящие для этого способы известны в данной области техники. В одном из вариантов осуществления изобретения, с ДНК кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, могут создаваться одновременно или обособленно с помощью обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы в соответствии с хорошо известными способами. РСК можно инициировать консенсусными затравками константных областей или более специфическими затравками на основе опубликованных ДНК тяжелых и легких цепей и аминокислотных последовательностей. Как указывалось выше, РСК может использоваться также для отделения ДНК-клонов, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител. В этом случае скрининг библиотек может проводиться с помощью консенсусных затравок или более крупных гомологичных зондов, например, зондов константных областей человеческого организма.

ДНК, обычно плазмидную ДНК, можно выделить из клетки с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, провести ее рестрикционное картирование и секвенировать в соответствии со стандартом, с помощью хорошо отработанных способов, описанных, например, в предыдущих ссылках, касающихся методик рекомбинантных ДНК. Вполне понятно, что ДНК может быть синтезирована согласно данному изобретению в любой момент процесса отделения или последующего анализа.

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% 95% или 100% идентична последовательности 8ЕО ГО N0:15 или 8Еф ГО N0:20.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность УН-области, полностью идентичную или идентичную, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или нескольких амино- 26 030777 кислотных замен, последовательности δΕΟ ГО N0:15 или δΕΟ ГО N0:20.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, где по меньшей мере одна, две или все три СГОК-области вариабельной области тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичными аминокислотным последовательностям эталонных тяжелых цепей УН-СГОКЕ УН-СГОК2 или УН-СГОК3. представленных последовательностями δΕΟ ГО N016, 5>Е0 ГО N0:17 и δΕΟ ГО N0:18 соответственно. Таким образом, этот вариант осуществления изобретения обеспечивает выделенный полинуклеотид, кодирующий в соответствии с изобретением вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет аминокислотные последовательности цепей УН-СЭК1, УН-СГОК2 и УН-СЭК3, родственных тем последовательностям, которые представлены последовательностями 5>Е0 ГО N0:16, δΕΟ ГО N0:17 и δΕΟ ГО N0:18 соответственно, как показано на фиг. 1.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи (УН) иммуноглобулина, в которой области УН-СЭК.1, УН-СГОК2 и УН-СГОК3 имеют полипептидные последовательности, идентичные группам УН-СИК.1, УН-СЭК2 и УН-СГОКЗ, представленным последовательностями δΕΟ ГО N0:16, 5>Е0 ГО N0:17 и δΕΟ ГО N0:18 соответственно так, как показано на фиг. 1.

В следующем варианте осуществления изобретения предлагается выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий УН, кодированный полинуклеотидом, который специфически или предпочтительно связывается с α-синуклеином человеческого организма.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина, являющуюся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% 95% или 100% идентичной последовательностям δΕΟ ГО N0:22 или δΕΟ ГО N0:26.

В следующем варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность УЬ, полностью идентичную или идентичную, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или нескольких аминокислотных замен, последовательностям δΕΟ ГО N0:22 или δΕΟ ГО N0:26.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина, где по меньшей мере одна, две или все три УЪ-СОК-области вариабельной области легкой цепи являются по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичными аминокислотным последовательностям эталонных легких цепей УЪ-СЭКТ, УЪ-С0К2 или УЪ-СЭКЗ, представленных последовательностями δΕΟ ГО N0:23, 5>Е0 ГО N0:24 и δΕΟ ГО N0:25 соответственно. Таким образом, в этом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи в соответствии с изобретением, который имеет аминокислотные последовательности цепей УЬ-СОК1, УЬ-СОК.2 и УЪ-С0К3, родственные таковым, представленным последовательностями δΕΟ ГО N023, 5>Е0 ГО N0:24 и δΕΟ ГО N0:25 соответственно так, как показано на фиг. 1.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, состоящий по существу из нуклеиновой кислоты или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область легкой цепи (УЬ) иммуноглобулина, где области УЪ-С0К1, УЪ-С0К2 и УР-С0К3 имеют полипептидные последовательности, являющиеся идентичными группам УН-СГОКЕ УН-С0К2 и УН-С0К3, представленным последовательностями δΕΟ ГО N016, 5>Е0 ГО N0:17 и δΕΟ ГО N0:18 соответственно, как показано на фиг. 1.

Следующим вариантом осуществления изобретения предлагается выделенная связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий УЪ-область, кодированную полинуклеотидом, который специфически или предпочтительно связывается с α-синуклеином человеческого организма.

Хорошо известно, что идентичность последовательностей двух полипептидов или двух полинуклеотидов определяется путем сравнения аминокислотной или нуклеинокислотной последовательности одного полипептида или полинуклеотида с соответствующей последовательностью другого полипептида или полинуклеотида. Идентичность того или иного полипептида по меньшей мере приблизительно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% другому полипептиду может определяться с помощью известных способов и компьютерных программ, таких как, например, программа ΒΕδΤΡΙΤ [Αίδεοηδίη Бссщспсс Апа1уз1з Раскаде, Уегзюп 8 ίοτ Ишх, ОепеОсз Сошри1ег Сгоир, ИшуетзНу Кезеатск Рагк, 575 §с1епсе Опте, МаЛзоп, XVI 53711]. Программа ΒΕδΤΡΙΤ использует алгоритм локаль- 27 030777 ной гомологии Смита-Ватермана |διηί11ι аиб ^а!егтаи, Αбνаηсе8 1и ЛррПеб Макетайсв 2 (1981), 482489], позволяющий найти лучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При использовании ΒΕδτΡΙτ или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли данная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности согласно данному изобретению, параметры задают, вполне понятно, таким образом, чтобы процент идентичности вычислялся на полной длине эталонной последовательности аминокислот в полипептидной цепи и чтобы гэпы в гомологии не превышали 5% от общего количества аминокислот в эталонной последовательности.

В одном из вариантов осуществления изобретения полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту, состоит по существу или состоит из нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность νΗцепи, определенную как δΕΟ ΙΌ ΝΟ:19 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ:21, или последовательность УЬ-цепи, определенную как δΕΟ ΙΌ ΝΟ:27 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ:28. Специалисту в данной области техники вполне понятно, что полинуклеотиды, кодирующие, по меньшей мере, вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, может кодировать вариабельный домен обоих цепей или только одной цепи иммуноглобулина.

Настоящим изобретением охватываются также фрагменты описанных в данной заявке полинуклеотидов. Кроме того, изобретение включает в себя описанные в данной заявке полинуклеотиды, кодирующие слитые полинуклеотиды, РаЬ-фрагменты и другие производные.

Полинуклеотиды в соответствии с изобретением можно продуцировать или изготовлять с помощью любого соответствующего способа. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, то полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов, например, способом, описанным в [ΚπΙ^κγ е! а1., В^οΤесЬη^^иеδ 17 (1994), 242], который включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов, осуществляемую с помощью РСК реакции.

В альтернативном осуществлении изобретения полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может быть создан из нуклеиновой кислоты, взятой из подходящего источника. В том случае, если нет клона, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую целевое антитело, однако последовательность молекулы антитела известна, то нуклеинов кислота, кодирующая антитело, может быть синтезирована химическим путем или получена из подходящего источника (например, из библиотеки сДНК антител или библиотеки сДНК, созданной из нуклеиновой кислоты, такой как полиА' РНК, или выделенной из любой ткани или клетки, экспрессирующей αсинуклеинспецифическое антитело, например, гибридомной клетки, отобранной для экспрессии антитела) с помощью РСК-амплификации, использующей искусственные затравки, гибридизируемые к концам 3' и 5' последовательности, или с помощью клонирования, использующего олигонуклеотидный зонд, специфический к конкретной генной последовательности для идентификации, например, клона с ДНК из библиотеки с ДНК кодирующей антитела. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, генерированные с помощью реакции РСК, далее можно клонировать в реплицируемые клонирующие векторы с помощью любого известного способа.

Когда нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного определена, с этой нуклеотидной последовательностью можно манипулировать с помощью хорошо известных способов, включая, например, способы рекомбинантных ДНК, сайт-направленного мутагенеза, РСК и т.д, например, способы, описанные в ^атЬгсюк е! а1., ΜοΚαιΡίΓ Скиту Α ^аЬο^аίο^у Маииа1, 2б Ε6., Со1б δρηπβ ΗηΡογ Ьа^гакгу, Со1б δρππβ Η-ιΛοη Ν.Υ. (1990) и Αυδυ^1 е! а1., ебв., Сштеи! Ргокток 1и ΜοΚαιΡίΓ Вккду, .кЬи \Убеу & δοπβ, ΝΥ (1998)], включенные α настоящую заявку во всей их полноте посредством ссылки, с целью создания антитела, имеющего другую аминокислотую последовательность, например, для осуществления аминокислотных замен, делеций и/или инсерций.

Ιν. Экспрессия полипептидов-антител

После манипуляций с выделенным генетическим материалом в целях получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных в соответствии с изобретением, полинуклеотиды, кодирующие антитела обычно вводятся в вектор экспрессии для внедрения в клетки-хозяева, которые могут использоваться для продуцирования требуемого количества антител. В данной заявке рассматривается рекомбинантная экспрессия антитела или его фрагмента, производного либо аналога, например, тяжелой или легкой цепи антитела, которая связывается с молекулой-мишенью. Когда полинуклеотид, кодирующий молекулу антитела или тяжелую либо легкую цепь антитела, либо его часть (например, содержащую вариабельный домен тяжелой или легкой цепи) в соответствии с изобретением, получен, вектор для производства молекулы антитела может быть продуцирован с помощью известного способа рекомбинантных ДНК. В данной заявке описаны способы приготовления белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело. Для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующие антитела последовательности и соответствующие сигналы транскрипционного и трансляционного контроля, могут использоваться обычные спо- 28 030777 собы, хорошо известные специалистам в данной области техники. В числе таких способов можно назвать, например, технологию рекомбинантных ДНК ίη νίίΓο, способы синтеза и генетическую рекомбинацию ίη νίνο. Таким образом, данное изобретение обеспечивает реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела в соответствии с изобретением или его тяжелую либо легкую цепь или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, и функционально связанную с промотором. Такие векторы могут включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела, см., например, международные заявки на изобретение [АО 86/05807 и АО 89/01036] и [патент США № 5122464], а вариабельный домен антитела может быть клонирован в такой вектор для экспрессии полной тяжелой или легкой цепи.

Используемый в данном описании термин вектор или вектор экспрессии относится к векторам, применяемым в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителя для введения в клеткухозяина и экспрессии в ней требуемого гена. Специалистам в данной области техники хорошо известно, что такие векторы можно легко выбирать из группы, состоящий из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. В общем случае, векторы, совместимые с данным изобретением, содержат маркер селекции, соответствующие сайты рестрикции для облегчения клонирования целевого гена и обладают способностью входить и/или реплицировать в эукариотических или прокариотических клетках. В целях данного изобретения может использоваться множество систем векторов экспрессии. Например, в векторах одного из классов используются элементы ДНК, полученные из вирусов животных, например, бычий папиломавирус, полиома-вирус, аденовирус, вирус осповакцины, бакуловирус, ретровирусы (Р8У, ММТУ или МОМЬУ) или §У40 вирус. В других классах используются полицистронные системы с внутренними сайтами связывания рибосом. Кроме того, клетки, которые интегрировали ДНК в их хромосомы, могут быть выбраны путем введения одного или нескольких маркеров, позволяющих проводить отбор трансфицированных клеток-хозяев Маркер может обеспечить фототрофию ауксотрофному хозяину, резистентность к биоциду, (например, к антибиотикам) или к тяжелым металлам, таким как медь. Селектируемый генмаркер может быть либо непосредственно связанным с экспрессируемой ДНК-последовательностью или введен в ту же самую клетку путем со-трансформации. Для оптимального синтеза мРНК могут быть введены также дополнительные элементы. Такими элементами могут быть сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гены клонированной вариабельной области вставляются в вектор экспрессии вместе с генами (например, человеческими) константных областей тяжелой и легкой цепей, как указывалось выше. В одном из вариантов это осуществляется с помощью запатентованного вектора экспрессии (фирмы Вюден ГОЕС, 1пс.) под наименованием ЯЕОЗРЬА, описанного в [патенте США № 6159730]. Этот вектор содержит цитомегаловирусный промотор/энхансер, главный промотор мышиного бета-глобина, источник репликации - вирус 8У40, последовательность полиаденилирования из бычьего гормона роста, 1-й экзон и 2-й экзон неомицинфосфотрансферазы, ген и лидерную последовательность дигидрофолатредуктаза. Этот вектор продемонстрировал очень высокий уровень экспрессии антител после встраивания генов вариабельных и константных областей, трансфекции в клетки СНО с последующей селекцией в 0418-содержащей питательной среде и амплификацией метотрексатом. Вполне понятно, что в данном изобретении может использоваться любой вектор экспрессии способный вызывать экспрессию в эукариотических клетках. В качестве примеров таких подходящих векторов можно назвать, в том числе: плазмиды рсДНК3, ρНСМУ/Ζеο, рСР3.1, ρΕΡ1/Ηίβ, ρΙΝΏ/Οδ, рРс/НСМУ2, ρδν40^ο2, рТРАСЕР-НСМУ, риВ6/У5-Н1в, рУАХ1 и ρΖеοδУ2 (поставляемые фирмой ΙηνίίΐΌ^η из Сан-Диего, штат Калифорния), и плазмиду рС1 (поставляемую фирмой Рготеда из Мэдисона, штат Висконсин). В общем случае, скрининг больших количеств трансформированных клеток при потребности экспрессировать достаточно высокие уровни, если тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина является рутинным экспериментированием, может выполняться, например, робототехническими системами. Векторные системы описаны также в патентах США [Патенты США № 5736137 и № 5658570], включенных в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Эти системы обеспечиваю высокие уровни экспрессии, например, > 30 пг/клетку/день. Кроме того, типовые векторные системы описаны, например, в [патент США № 6413777].

В других вариантах осуществления изобретения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные могут быть экспрессированы с помощью полицистронных конструкций, таких как те, что описаны в заявке на патент США [публикация заявки на патент США № 2003-0157641 А1], включенной в настоящую заявку путем ссылки. В этих системах экспрессии требуемые множественные генные продукты, такие как тяжелые и легкие цепи антител, могут продуцироваться из единичной полицистронной конструкции. Для обеспечения относительно высоких уровней антител эти системы предпочтительно используют внутренний сайт связывания рибосомы (ΙΡΕδ). Совместимые последовательности ΙΡΕδ описаны в [патенте США № 6193980], включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Вполне понятно, что такие системы экспрессии могут использоваться для эффективного продуцирования всего диапазона антител, представленных в настоящей заявке.

В общем случае, когда векторная или ДНК-последовательность, кодирующая мономерный субблок антитела, приготовлена, вектор экспрессии может быть введен в соответствующую клетку-хозяина. Вве- 29 030777 дение плазмиды в клетку-хозяина может осуществляться с помощью самых различных способов, известных в данной области техники. Это могут быть, например, способы трансфекции, включая липотрансфекцию, с помощью, например, Ридепе или липофектамина, слияние протопластов, преципитации фосфатом кальция, слияния клеток со свернутой ДНК, микроинъекции и инфицирования интактным вирусом. Введение плазмид в организм хозяина осуществляют, как правило, с помощью стандартного способа копреципитации фосфатом кальция. Клетки-хозяева с введенными в них конструкциями экспрессии выращиваются в условиях, соответствующих продуцированию легких и тяжелых цепей, и анализируются на синтез белков этих цепей. Типовыми способами такого анализа являются иммуноферментный анализ (ΕΟδΑ), радиоиммуноанализ (МА), анализ способом клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РΑСδ), иммуногистохимии и т.п.

Вектор экспрессии переносят в клетку-хозяина обычным способом, и трансфицированные клетки культивируют в соответствии с обычными способами для продуцирования антител, предназначенных для использования в описанных в настоящую заявку способах. Таким образом, данное изобретение включает клетки-хозяев, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело в соответствии с изобретением, или его тяжелую либо легкую цепь, которые функционально связаны с гетерологическим промотором. Как подробно описано ниже, для экспрессии двухцепочечных антител, векторы, кодирующие как тяжелые, так и легкие цепи, могут быть введены в клетку-хозяина для экспрессия полной иммуноглобулиновой молекулы.

Клетка-хозяин может быть котрансфицирована двумя векторами экспрессии в соответствии с изобретением, где один вектор кодирует полипептид, полученный из тяжелой цепи, а другой вектор кодирует полипептид, полученный из легкой цепи. Эти два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, позволяющие осуществлять экспрессию полипептидов тяжелых и легких цепей. В альтернативном варианте осуществления изобретения может использоваться один вектор, кодирующий полипептиды как тяжелых, так и легких цепей. В этих случаях, легкая цепь предпочтительно размещается перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка тяжелой цепи, не имеющей токсичности [РгоиДТоо!, Ν;-ιШге 322 (1986), 52; КоЫег, Ргос. Νηΐΐ. АсаД. δει. и$А 77(1980), 2197]. Кодирующие последовательности для тяжелой и легкой цепей могут содержать сДНК или геномную ДНК.

Используемый в настоящей заявке термин клетки-хозяева означает клетки, в которых содержатся векторы и которые сконструированы с помощью технологии рекомбинантных ДНК и кодируют по меньшей мере один гетерологический ген. В описаниях процессов отделения антител от рекомбинантных хозяев, оба термина клетка и клеточная культура, если не указано иного, означают источник антител. Другими словами, извлечение полипептида из таких клеток может означать извлечение либо из центрифугированных цельных клеток, либо из клеточной культуры, содержащей как питательную среду, так и суспендированные клетки.

Для экспрессии молекул антител, предназначенных для использования в способах, описанных в настоящей заявке, могут применяться самые различные векторные системы экспрессии в организме хозяина. Такие системы представляют собой носители, которыми могут продуцироваться и затем очищаться требуемые кодирующие последовательности, а также клетки, которые, будучи трансформироваными или трансфицированными соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессируют молекулу антитела ш 5Йи в соответствии с изобретением. К этим системам относятся, например, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. сой, В. 8иЪйЙ8), трансформированные рекомбинантными бактериофаговыми ДНК-, плазмидными ДНК- или космидными ДНК-векторами экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие антитела; дрожжи (например, δассйа^οтусе8, РюЫа), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие антитела; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными (например, бакуловирусными) векторами экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие антитела; растительные клеточные системы, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, мозаичным вирусом цветной капусты, СаМУ; мозаичным вирусом табака, ТМУ) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Τί-плазмидными), содержащими последовательности, кодирующие антитела; или клеточные системы млекопитающих (например, СΟδ, СНО, ΝδΟ, ВЬК, 293, 3Т3 клетки), вмещающие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеинов) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7.5К вируса осповакцины). В экспрессии рекомбинантной молекулы антитела используются бактериальные клетки, такие как Ε8сйе^^сй^а сой или эукариотические клетки, особенно для экспрессии цельной рекомбинантной молекулы антитела. Например, эффективную систему экспрессии для антитела представляют собой клетки млекопитающих, в частности клетки яичника китайского хомячка (СНО), в конъюнкции с вектором, например, главным промежуточным промоторным элементом ранних генов из человеческого цитомегаловируса; см., например, [Роескшд е1 а1., Оепе 45 (1986), 101; Соскей е1 а1., Вю/Тесйпо1оду 8 (1990), 2].

Клеточная линия хозяина, используемая для экспрессии белков, часто происходит от млекопитающих; специалисты в данной области техники способны определить те конкретные клеточные линии хо- 30 030777 зяина, которые наилучшим образом подходят для данного экспрессируемого генного продукта. Типовыми клеточными линиями хозяина для этих целей являются, например, линия яичника китайского хомячка (СНО), ΌΟ44 и ΌυΧΒ 11 (ЭНРК дефицитные линии СНО), линия НЕЬА (человеческая карцинома шейки матки), СУ1 (линия почки обезьяны), СО8 (производное клеток СУ1 с Т-антигеном вируса 8У40), νΕΚΥ, ВНК (клетки почек новорожденного хомяка), МОСК, ΑΙ38, К1610 (фибробласт китайского хомячка) ВАЬВС/3Т3 (мышиный фибробласт), НАК (линия почек хомячка), 8Р2/0 (линия мышиной миеломы), Р3х63-Ад3.653 (линия мышиной миеломы), ВРА-1с1ВРТ (бычьи эндотелиальные клетки), КАЛ (человеческие лимфоциты) и 293 (почки человека). Клеточные линии хозяина, как правило, поступают в продажу из Американской коллекции тканевых культур и известны из литературных публикаций.

Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, которая модулирует экспрессию введенной последовательности или модифицирует и процессирует данный генный продукт требуемым специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов может иметь большое значение для функции белка. Различные клетки-хозяева имеют характеристические и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или системы хозяина могут быть выбраны для обеспечения правильных модификаций и процессинга инородного экспрессируемого белка. Для этого могут выбираться эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточным аппаратом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта.

Для долговременного, высокопроизводительного продуцирования рекомбинантных белков используют устойчивую экспрессию. Например, способами генной инженерии могут конструироваться клеточные линии, стабильно экспрессирующие молекулу антитела. Вместо использования векторов экспрессии, содержащих вирусные источники репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, управляемой соответствующими элементами контроля экспрессии (например, промотором, энхансером, последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.д.), и селектируемым маркером. После введения чужеродной ДНК реконструируемым с помощью генной инженерии клеткам дают возможность расти в течение, например, 1-2 дней в обогащенной питательной среде, после чего их переключают на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает селекции резистентности и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти, образуя центры, которые, в свою очередь, могут быть клонированы и развиться в клеточные линии. Данный способ предпочтительно может использоваться для генной реконструкции клеточных линий, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела.

Использоваться могут самые различные системы селекции, включая, например, тимидинкиназный ген вируса простого герпеса [А1д1ег е! а1., Се11 11 (1977), 223], гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазный ген [§/уЬаЪка & 5>/уЬаЬкк Ргос. ЫаП. Асаб. 8ск и§А 48(1992), 202] и аденинфосфорибозилтрансферазный ген [Ьо^у е! а1., Се11 22 (1980), 817], в !к-, йдрй- или арй-клетках соответственно. В качестве базиса селекции для нижеперечисленных генов также может быть выбрана стойкость к антиметаболитам: бЬГг-ген, который придает резистентность метотрексату [А1д1ег е! а1., Ν;·ιΐ1. Асаб. 8с1. и§А 77 (1980), 357; О'Наге е! а1., Ргос. №Ш. Асаб. 8ск и§А 78 (1981), 1527]; др!-ген, который придает резистентность микофеноловой кислоте [МиШдап & Вегд, Ргос. Ν;·ι!1. Асаб. 8ск и§А 78 (1981), 2072]; пео-ген, который придает резистентность аминогликозиду С-418 |Со№р1е1 е! а1., Сйтса1 РЬагтасу 12 (1993), 488-505; Аи апб Аи, ВюШегару 3 (1991), 87-95; ТоШовЬ^, Апп. Ке\'. РЬагтасо1. Тохюо1. 32 (1993), 573-596; МиШдап, §с1епсе 260 (1993), 926-932; апб Могдап апб Апбегеоп, Апп. Ке\'. ВюсЬет. 62 (1993), 191-217; Т1В ТЕСН 11 (1993), 155-215]; и Ьудго-ген, который придает резистентность к гигромицину [§ап!егге е! а1., Сепе 30 (1984), 147]. Общеизвестные способы рекомбинантных ДНК, которые могут использоваться в данном изобретении, описаны, например, в публикациях [АшиЬе1 е! а1. ^δ.), Сиггеп! РгоШсоЪ ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп Айеу & §ош, ΝΥ (1993); Кпед1ег, Сепе ТгашГег апб Еxр^еδδ^оп, А ЬаЬогаШгу Мапиа1, 5>!оск!оп ΓϊΌδδ, ΝΥ (1990); апб ш СЬар!еге 12 апб 13, ЭгасороИ е! а1. ^δ), Сиггеп! Рго!осоЬ ш Нитап Сепе!^, ШЬп Айеу & 8ош, ΝΥ (1994); СоШегге-Сагарш е! а1., 1. Мо1. Вю1. 150:1 (1981)], включенных в настоящую заявку во всей их полноте посредством ссылок.

Уровни экспрессии молекулы антитела могут быть повышены вектором амплификации, см. обзор [ВеЬЬшдШп апб Неп1зсЬе1, ТЬе ше оГ \'ес!оге Ьаδеб оп депе атрЬПсайоп Гог !Ье еxр^еδδ^оп оГ с1опеб депеδ ш таттаЪап се1Ш ш ΩΝΛ с1отпд, Асабетю Р^еδδ, Νονν Υо^к, Уо1. 3. (1987)]. Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, поддается амплификации, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клеток-хозяев, увеличит количество копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область связана с геном антитела, продуцирование антитела также будет возрастать [Сгоше е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 3 (1983), 257].

Продуцирование ш \а!го позволяет постепенно наращивать количество требуемых полипептидов. Способы культивирования клеток млекопитающих в условиях тканевой культуры хорошо известны и включают в себя культивирование в гомогенной суспензии, например, в аэролифтном биореакторе или в биореакторе с непрерывным перемешиванием, а также культивирование иммобилизированных (захваченных) клеток, например, в пористых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микрошариках или в ке- 31 030777 рамических кассетах. Очистка растворов полипептидов может производиться с помощью обычной хроматографии, например, гель-фильтрацией, с помощью ионообменной хроматографии, хроматографии на ОЕАЕ-целлюлозе или иммуно-аффинной хроматографии, например, после преференциального биосинтеза искусственного полипептида шарнирной области или перед либо после описанной в настоящей заявке стадии хроматографии гидрофобных взаимодействий (ШС).

Гены, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут экспрессироваться также в клетках организмов, не являющихся млекопитающими, например, бактерий, насекомых, дрожжей или растений. В число бактерий, легко поглощающих нуклеиновые кислоты, входят члены семейств Еп!его бактерии сеае - штаммы Е8сЬепс1на соП или 8а1топе11а; ВасШасеае, такие как ВасШи8 8иМШ8; Рпеитососси8; 81герЮсосси8 и НаеторЫ1и8 1пГ1иеп/ае. Известно, что экспрессированные в бактериях гетерологические полипептиды обычно становятся частью телец включения. Такие гетерологические полипептиды должны быть отделены, очищены и затем собраны в функциональные молекулы. Если требуются тетравалентные формы антител, то субблоки самостоятельно собираются в тетравалентные антитела; см., например, международную заявку на изобретение [АО 02/096948].

В бактериальных системах число векторов экспрессии выбирают, исходя предпочтительно из намеченного использования данной экспрессируемой молекулы антитела. Например, если требуется продуцировать большое количество такого белка для создания фармацевтических композиций молекулы антитела, то могут использоваться векторы, направляющие экспрессию высокого уровня легкоочищаемых слитых белковых продуктов. Такими векторами могут быть, например: вектор экспрессии рИР278 Е. СоН |Ри1Нег е! а1., ЕМВО ί. 2 (1983), 1791], в котором последовательность, кодирующая антитело, может быть лигирована индивидуально в вектор в структуре с кодирующей областью 1ас2, что позволяет продуцировать слитый белок; рЕЫ векторы [Шоиуе & Шоиуе, ШсШс Ааб8 Ре8. 13 (1985), 3101-3109; Уап Нееке & 5>с1ш81ег ί. Вю1. СЬет. 24 (1989), 5503-5509] и т.д. Для экспрессии инородных полипептидов как слитых белков с глутатион-§-трансферазой (О8Т) могут также использоваться векторы рОЕХ. В общем случае такие слитые белки являются растворимыми и могут легко очищаться от лизированных клеток путем адсорбции, связывания с матрицей из глутатион-агарозных шариков и последующего элюирования в присутствии свободного глутатиона. Векторы рОЕХ конструируются таким образом, чтобы включать тромбин или сайты расщепления протеазой фактора Ха, с тем, чтобы клонированный генный продукт-мишень, можно было высвободить от части О8Т (глутатион-§-трансферазной).

Помимо прокариотов могут использоваться также эукариотические микробы. Среди эукариотических микроорганизмов наиболее широко используются §ассЬаготусе8 сеге\а81ае или обычные хлебопекарные дрожжи, хотя также вполне доступно много других штаммов, например, РюЫа ра81оп8. Для экспрессии в §ассЬаготусе8 обычно используют плазмиду Υ^7, например, [8НпсЬсотЬ е! а1., №-Ииге 282 (1979), 39; Кт§8тап е! а1., Оепе 7 (1979), 141; Т8сЬетрег е! а1., Оепе 10 (1980), 157]. Эта плазмида уже содержит ген ТРР1, который обеспечивает маркером селекции дрожжевой мутантный штамм, например, АТСС 44076 или РЕР4-1, неспособный расти в триптофане [1опе8, ОепеНс8 85 (1977), 12]. Наличие повреждения 1гр1 как характеристики генома дрожжевых клеток-хозяев обеспечивает эффективное окружение для обнаружения трансформации по росту в отсутствии триптофана.

В системе насекомых в качестве вектора экспрессии инородных генов обычно используется вирус ядерного полиэдроза (АсМРУ) калифорнийской совки АШодгарЬа саНГогтса. Этот вирус выращивают в клетках 8робор1ега Ггищрегба. При этом антитело-кодирующая последовательность может быть клонирована индивидуально во второстепенные области (например, ген полиэдрина) вируса и поставлена под контроль промотора АсКРУ (например, промотор полиэдрина).

В соответствии с изобретением экспрессированная рекомбинантным способом молекула антитела в форме цельных антител, их димеров, индивидуальных легких и тяжелых цепей или других иммуноглобулинов может быть очищена с помощью стандартных процедур, включая, например, хроматографию (ионообменную, аффинную, особенно аффинную к специфическим антигенам от белка А, и фильтрационную колоночную хроматографию), центрифугирование, дифференциальное растворение, преципитацию сульфатом аммония и другие стандартные способы очистки белков, см., например, [8соре8, Рго1еш РипйсаНоп, §рйп§ег Уег1ад, Ν.Υ. (1982)]. А качестве альтернативы используется способ повышения аффинности антитела в соответствии с изобретением, описанный в [публикации патента США № 20020123057 А1].

У. Слитые белки и конъюгаты

В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид антитела содержит аминокислотную последовательность или одну либо несколько частей, не связанных нормально с антителом. Типовые модификации описаны более подробно ниже. Например, в некоторых осуществлениях изобретения одноцепочечный фрагмент Γν антитела может содержать гибкую линкерную последовательность или модифицирован добавленным функциональным компонентом (например, РЕО, лекарственным средством, токсином или меткой, например, флуоресцентной, радиоактивной, ферментной, ядерно-магнитной, из тяжелого металла и т.п.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид антитела в соответствии с изобре- 32 030777 тением содержит слитый белок, состоит по существу или состоит из слитого белка. Слитые белки являются химерными молекулами, которые содержат, например, иммуноглобулиновый α-синуклеинсвязывающий домен по меньшей мере с одним мишень-связывающим сайтом и по меньшей мере с одной гетерологической частью, то есть частью, с которой он в естественных условиях нормально не связан. Такие аминокислотные последовательности могут нормально существовать в обособленных белках, которые сводятся вместе в слитом полипептиде, или нормально существовать в одном и том же белке, но быть размещены в новом порядке в слитом полипептиде. Слитые белки могут создаваться, например, путем химического синтеза или путем создания и транслирования полинуклеотида, в котором пептидные области кодированы в требуемом соотношении.

Термин гетерологический применительно к полинуклеотиду или полипептиду означает, что данный полинуклеотид или полипептид получен из материала, отличающегося от остального материала, с которым он сравнивается. Например, используемый в настоящей заявке термин гетерологический полипептид, который сливается с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или аналогом, означает, что это не-иммуноглобулиновый полипептид того же самого вида или иммуноглобулиновый либо не-иммуноглобулиновый полипептид другого вида.

Как более подробно показано ниже, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением дополнительно могут быть рекомбинантно слитыми с гетерологическим полипептидом на Ν- либо на С-конце или химически конъюгированными (включая ковалентное и нековалентное конъюгирование) с полипептидами или другими композициями. Например, антитела могут быть рекомбинантно слитыми или конъюгированными с молекулами, используемыми в качестве меток для детектирования, и с эффекторными молекулами, например, гетерологическими полипептидами, лекарственными средствами, радионуклидами или токсинами, см., например, международные заявки на изобретение [νθ 92/08495; νθ 91/14438; νθ 89/12624], [патент США № 5314995] и [заявку на европейский патент № ЕР 0396387].

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, то есть, пептид-изоэфирами, и могут содержать аминокислоты, отличные от 20 аминокислот, кодируемых генами. Антитела могут модифицироваться природными процессами, такими как посттрансляционный процессинг, или с помощью химических технологий, хорошо известных в данной области техники. Такие модификации подробно описаны в базовой литературе и в более подробных монографиях, а также в огромном количестве отчетов о научных исследованиях. Модификации в антителе могут происходить где угодно, включая его пептидный остов, аминокислотные боковые цепи, амино- и карбоксильный концы, а также углеводные и другие части. Должно быть понятно, что в данном антителе могут присутствовать модификации одного и того же типа, представленные в той же самой или изменяющейся степени на различных сайтах. Данное антитело также может содержать модификации многих типов. Антитела могут быть разветвленными, например, в результате убиквитирования, циклическими или не иметь разветвления. Циклические, разветвленные и циклически разветвленные антитела могут быть результатом посттрансляционных природных процессов или же полученными искусственным путем. В число их модификаций входят ацетилирование, ацилирование, АОР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение темной части, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование СР1-анкеров, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, сульфатация, добавление аминокислот к белкам, опосредованное транспортной РНК, например, аргинилирование и убиквитирование; см., например, [РгоШпк - 81гис1иге Апй Мо1еси1аг Ргорегйек, Т. Е. Сге1д1Иоп. V. Н. Ргеетап апй Сотрапу, Νον Υо^к 2пй Ей., (1993); Рок11гапк1а11опа1 Соуа1еп1 МоФПсайоп ОГ Рго1ешк, В. С ЗоИпкоп, Ей., Асайетк Ргекк, №ν Уогк, рдк. 1-12 (1983); 8егйег е1 а1., МеФ. Еп/уто1. 182(1990), 626-646; Кайап е1 а1., Апп. ΝΥ Асай. δα. 663 (1992), 48-62)].

Также настоящее изобретение обеспечивает слитые белки, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, и гетерологический полипептид. В одном из вариантов осуществления изобретения слитый белок содержит полипептид, состоит по существу или состоит из полипептида, который имеет аминокислотную последовательность любой одной или нескольких УНобластей антитела в соответствии с изобретением или аминокислотную последовательность любой одной или нескольких УЪ-областей антитела в соответствии с изобретением или их фрагменты либо варианты, и гетерологическую полипептидную последовательность. В другом осуществлении изобретения слитый белок с целью использования в описанных в настоящей заявке способах диагностики и лечения содержит полипептид, состоит по существу или состоит из полипептида, который имеет аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех из УН-СГОК-областей антитела, или их фрагменты,

- 33 030777 варианты или производные, или аминокислотную последовательность одной, двух, трех из УБ-СЭКобластей антитела, или их фрагменты, варианты или производные, и гетерологическую полипептидную последовательность. В одном из вариантов осуществления изобретения слитый белок содержит полипептид, который имеет аминокислотную последовательность УН-СЭК3-области антитела в соответствии с изобретением или ее фрагмент, производное или вариант, и гетерологическую полипептидную последовательность, где указанный слитый белок специфически связывается с α-синуклеином. В другом осуществлении изобретения слитый белок содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере одной УН-области антитела в соответствии с изобретением и аминокислотную последовательность по меньшей мере одной УЬ-области антитела в соответствии с изобретением или их фрагменты, производные или варианты, и гетерологическую полипептидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления изобретения УН- и УЬ-области слитого белка соответствуют единичному исходному антителу (или его ксРу- или РаЬ-фрагменту), которое (который) специфически связывает α-синуклеин. В другом осуществлении изобретения слитый белок с целью использования в описанных в настоящей заявке способах диагностики и лечения содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех или нескольких из УН СЭК-областей антитела и аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех или нескольких из УЬ СЭК-областей антитела или их фрагменты либо варианты, и гетерологическую полипептидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления изобретения две, три, четыре, пять, шесть или несколько УН-СЭК- или УЬСЭК-областей соответствуют единичному исходному антителу (или ксРу- или РаЬ-фрагменту) в соответствии с изобретением. Изобретение также охватывает нуклеинокислотные молекулы, кодирующие эти слитые белки.

К типовым слитым белкам, описываемых в литературе, относятся также слияния Т-клеточных рецепторов [Оаксощпе е! а1., Ргос. №й1. Асай. δα. И8А 84 (1987), 2936-2940; СЭ4 (Сароп е! а1., №йиге 337 (1989), 525-531; Тгаипескег е! а1., №!иге 339 (1989), 68-70; 2е«те1551 е! а1., Ι3ΝΆ Се11 Вю1. И8А 9 (1990), 347-353; апй Вугп е! а1., №йиге 344 (1990), 667-670); Ь-8е1есйп (Ьоттд гесер!ог) (ЭДа!коп е! а1., 1. Се11. Вю1. 110 (1990), 2221-2229; апй ЭДа!коп е! а1., Уинге 349 (1991), 164-167); СП44 (АгиГГо е! а1., Се11 61 (1990), 1303-1313); СЭ28 апй В7 (Пп51еу е! а1., 1. Ехр. Мей. 173 (1991),721-730); СТЬА-4 (Ь1з1еу е! а1., 1. Ехр. Мей. 174 (1991), 561-569); СП22 (З&тепкоук е! а1., Се11 66 (1991), 1133-1144); ΊΝΕ гесер!ог (Акйкепа/ι е! а1., Ргос. №И. Асай. δοΐ. И8А 88 (1991), 10535-10539; Ье551аиег е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 27 (1991), 28832886; апй Рерре1 е! а1., 1. Ехр. Мей. 174 (1991), 1483-1489 (1991); апй 1дЕ гесер!ог а (Клйцхуау апй Оогтап, 1. Се11. Вю1.115 (1991), АЬ§!гас! 1448].

Как показано в настоящем описании, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть слиты с гетерологическими полипептидами для увеличения времени полужизни полипептидов ш νί\Ό или для использования их в иммуноанализе с помощью известных способов. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения РЕО может быть конъюгирован с антителом согласно изобретению для увеличения их времени полужизни ш у|уо, см., например, [Ьеопд е! а1., Су!окше16 (2001), 106-119; Айу. ш Эгид ЭеПу. Кеу. 54 (2002), 531; или ЭДеп е! а1., Вюсйет. 8ос. Тгапкасйопк 30 (2002), 512].

Кроме того, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть слиты с маркерными последовательностями, например, с пептидом, для облегчения их очистки или детектирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения маркерной аминокислотной последовательностью является гексагистидиновый пептид (Н1 δ), такой как концевая метка в векторе рОЕ Ю1АОЕУ 1пс., 9259 Е!оп Ауепие, СЬак^огШ, Са1й., 91311], которая, наряду с многими другими аналогичными продуктами, имеется в свободной продаже. Как описано в [Оепй е! а1., Ргос. Уй1. Асай. δα. И8А 86 (1989), 821-824], гексагистидин обеспечивает довольно хорошую очистку слитого белка. Среди других пептидных меток, эффективных в очистке, можно назвать, например, метку НА, которая соответствует эпитопу, получаемому из белка гемаглютинина вируса гриппа [ЭДйкоп е! а1., Се11 37 (1984), 767] и флажковый маркер.

Слитые белки могут быть приготовлены с помощью хорошо известных способов, см. например патенты США [№ 5116964 и № 5225538]. Для оптимизации секреции или характеристик связывания слитого белка можно точно эмпирическим путем выбрать сайт для осуществления слияния. После этого ДНК, кодирующую данный слитый белок, трансфицируют в клетку-хозяина для экспрессии.

Антитела в соответствии с изобретением могут использоваться в неконъюгированной форме или же могут быть конъюгированы по меньшей мере с одной из широкого разнообразия молекул, например, для улучшения терапевтических свойств молекулы, облегчения детектирования мишени или для визуализации внутренних структур и лечения пациента. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть помечены или конъюгированы перед очисткой или после нее, если она производится. В частности, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, пролекарственными средствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами или РЕО.

- 34 030777

Конъюгаты, являющиеся иммунотоксинами, включая обычные антитела, широко описаны в литературе. Токсины могут связываться с антителами с помощью обычных средств и способов, либо иммунотоксины, содержащие белковые токсиновые части, могут продуцироваться как слитые белки. Антитела согласно изобретению могут использоваться в соответствующем подходе для получения таких иммунотоксинов. Иллюстрациями таких иммунотоксинов являются работы [Вуеге, 8еттаг8 Се11. ΒίοΙ. 2 (1991), 59-70; Рапдег, ^типоЕ Тойау 12 (1991), 51-54].

Квалифицированные специалисты в данной области техники должны понимать, что сборка конъюгатов может производиться также с помощью различных способов, выбор среди которых зависит от подвергаемого конъюгации агента. Например, конъюгаты с биотином получают путем реакции асинуклеинсвязывающего полипептида с активированным сложным эфиром биотина, например, биотин N-оксисукцинимидным эфиром. Конъюгаты с флуоресцентным маркером могут быть приготовлены подобным образом в присутствии связывающего агента, взятого например, из приведенного в настоящей заявке перечня или путем реакции с изотиоцианатом, таким как флуоресцеин-изотиоцианат. Конъюгаты антител или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные в соответствии с изобретением получают аналогичным образом.

Настоящее изобретение, кроме того, охватывает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Эти антитела могут использоваться в диагностике, например, для демонстрации наличия нейрологической болезни, выявления риска получить нейрологическую болезнь, контроля процесса развития или прогрессирования нейрологической болезни, то есть синуклеинопатии, как части способа клинического тестирования, например, для определения эффективности предложенного лечения и/или профилактического режима. Детектирование можно облегчить путем связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного с детектируемой субстанцией. Детектируемыми субстанциями могут быть, например, различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, позитронэмитирующие металлы, используемые различными позитрон-эмиссионными видами томографии, и нерадиоактивные ионы парамагнитных металлов, см., например, [патент США № 4741900] где описаны ионы металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для использования в диагностике согласно данному изобретению. В числе пригодных ферментов можно назвать, например, пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; подходящими простетическими групповыми комплексами являются, например, стрептавидин/биотин и авидин/биотин; подходящими флуоресцентными материалами являются, например, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; пригодным люминесцентным материалом является, например, люминол; пригодными биолюминесцентными материалами являются, например, люцифераза, люциферин и экворин; подходящими радиоактивными материалами являются, например, ¹²⁵Ι, ¹³¹Ι, “Йп и ⁹⁹Тс.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное также может быть меченным для детектирования путем связывания его с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно-меченного антитела определяют путем детектирования наличия люминесценции, которая возникает в процессе химической реакции. Особенно подходящими соединениями для хемилюминесцентного мечения являются, например, люминол, изолюминол, тероматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалат.

Одним из способов, которыми антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может быть снабжено детектируемой меткой, является поперечное связывание его с ферментом и использование связанного продукта в иммуноферментном анализе (ЕIА) [Уо11ег, А., ТЬе Еп/уте Ыпкей ЬппшпоеогЬеШ Аееау (ЕЫ8А) М1сгоЫо1од1са1 АееоааЮе Опаг1ег1у РиЪЬсайоп, Vа1ке^8ν^11е, Мй., О1адпо8Йс Ноп/опе 2 (1978), 1-7); Уо11ег еί а1., 1. С1ш. РаФо1. 31 (1978), 507-520; ВиЙег, МеШ. Еп/уто1. 73 (1981), 482-523; Маддю, Е. (ей.), Еп/уте Iттиηοа88ау, СКС Рге88, Воса КаФп, Р1а., (1980); !8Шка^а, Е. еί а1., (ейе.), Еп/уте Iттиηοа88ау, Кдаки 8Ьош, Токуо (1981)]. Фермент, связанный с антителом, вступает в реакцию с соответствующим субстратом, например, с хромогенным субстратом, в результате чего продуцируется химическая часть, которая может быть обнаружена, например, спектрофотометрическими, флуорометрическими или визуальными средствами. Ферментами, подходящими для использования в детектируемом мечении антител, могут быть, например, малат дегидрогеназа, нуклеаза стафилококков, дельта-5-стероид изомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфат-дегидрогеназа, триозофосфат-изомераза, пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, бета-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Кроме того, детектирование может осуществляться с помощью колориметрических способов, в которых для фермента используется хромогенный субстрат. Детектирование может осуществляться также путем визуального сравнения степени развития ферментативной реакции субстрата и степени развития аналогичным образом приготовленных стандартных образцов.

Детектирование может осуществляться также с помощью любого из множества других способов

- 35 030777 иммуноанализа. Например, путем радиоактивного мечения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного можно детектировать это антитело с помощью радиоиммуноанализа (ΚΙΑ), см., например, публикацию [^ет!гаиЬ, В., Ргшс1р1е8 ο£ Κа4^ο^ттиηοа88ау8, δеνеηΐЬ Тгапипд СЫтее οη Ка4юНдап4 Α88ау ТесНпищев, ТЬе Επ4ο^ίικ 8ο^^, (МагсЬ, 1986)], включенную в настоящую заявку посредством ссылки. Радиоактивный изотоп можно детектировать такими средствами, как, например, счетчик гамма-излучения, сцинтилляционный счетчик или ауторадиография.

Мечение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного может осуществляться также с помощью испускающих флуоресцентное излучение металлов, таких как ¹⁵²Еи или других металлов из ряда лантанидов. Эти металлы могут прикрепляться к антителу с помощью таких хелатирующих металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота или этилендиаминтетрауксусная кислота.

Способы конъюгирования различных компонентов с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным хорошо известны и описаны, например, в ^г^п е! а1., ΜοποΟοπαϊ Лη!^Ьο4^е8 Ρογ Iттиηο!а^де!^ηд 0£ Эгиде Ш Сапсег ТЬегару, т Μο^Οο^Ι Лη!^Ьο4^е8 Лп4 Сапсег ТЬегару, Ке18£е14 е! а1. (е4в.), рр. 243-56 Щ1ап К. П88, Ιικ. (1985); Не118!гот е! а1., Лη!^Ьο4^е8 Ρογ Эгид Эе1Кегу, ш ^η!γο1Κ4 Эгид Эе1Кегу (2п4 Е4.), ΚοΝτιβοπ е! а1. (е4в.), Магсе1 Эеккег, Шс., рр. 623-53 (1987); Т1югре, Лη!^Ьο4у Сатегв 0£ СуЮЮ.хю Αдеηΐ8 Ш Сапсег ТЬегару: Α ш Μο^Οο^Ι Лη!^Ьο4^е8 '84:

Вюкдюа! Α^ Сйтса1 Лрр1^са!^οη8. РшсЬега е! а1. (е4в.), рр. 475-506 (1985); Αηа1у8^8, КевиЙв, Α^ Ри!иге Рговрес+'е 0£ ТЬе ТЬегареикс Иве 0£ Ка4ю1аЬе1е4 Лη!^Ьο4γ Ιπ Сапсег ТЬегару, т Μο^Οο^Ι Лη!^Ьο4^е8 Ρογ Сапсег Эе!ес!юп Α^ ТЬегару, Ва14\ут е! а1. (е4в.), Αса4ет^с Рге88 рр. 303-16 (1985), ап4 Т1югре е! а1., ТЬе Ргерага!юп Α^ СуЮЮ.хю РгорегРе8 0£ Αηΐ^Ьο4у-Тοx^η Сοη^идаΐе8, ^тиадР Кез. 62 (1982), 119158].

Как упоминалось выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения компонент, повышающий стабильность или эффективность связывающей молекулы, например, связывающий полипептид, антитело или его иммуноспецифический фрагмент, может быть конъюгирован. В одном из вариантов осуществления изобретения, РЕС может конъюгироваться со связывающими молекулами в соответствии с изобретением для увеличения их времени полужизни ш νίνο |Εόοι^ е! а1., СуЮкте 16 (2001), 106; Α4ν. т Эгид ЭеИх. Кех. 54 (2002), 531; \Уей е! а1., ВюсЬет. 8ο^ Тгап8ас1юп5 30 (2002), 512].

Ук Композиции и способы использования

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вышеупомянутую а-синуклеинсвязывающую молекулу, которыми являются, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением или его производное либо вариант или полинуклеотид, вектор или клетку в соответствии с изобретением. Композиция в соответствии с изобретением может, кроме того, содержать фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может содержать дополнительные агенты, такие как интерлейкины или интерфероны, в зависимости от назначения фармацевтической композиции. Например, в том случае, если композиция предназначена для лечения болезни Паркинсона, то дополнительный агент может быть выбран из группы, состоящий из малых органических молекул, антител к а-синуклеину и их комбинаций. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к использованию а-синуклеинсвязывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением или связывающей молекулы, имеющей по существу такую же, что и у них, специфичность связывания, полинуклеотида, вектора или клетки в соответствии с изобретением с целью приготовления фармацевтической или диагностической композиции для профилактического и терапевтического лечения синуклеинопатии, контроля прогрессирования синуклеинопатии или реакции на лечение синуклеинопатии у пациента либо для определения риска развития синуклеинопатии у пациента.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения нейрологического расстройства, характеризующегося аномальным аккумулированием и/или отложением а-синуклеина в мозгу и центральной нервной системе соответственно, где указанный способ включает введение нуждающемуся в излечении пациенту терапевтически эффективного количества анти-а-синуклеинсвязывающей молекулы, антитела, полинуклеотида, вектора или клетки в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления изобретения вводят антитело №-202.22Э11 или его фрагмент, вариант или производное. Термин нейрологическое расстройство означает, без какоголибо ограничения, такие синуклеиноратии, как болезнь Паркинсона (БП), деменция с тельцами Леви (ТЛ) и мультисистемная атрофия (МСА). Если не указано иное, то термины нейродегенеративный, нейрологический и нейропсихиатрический используются в настоящей заявке как взаимозаменяемые.

Особое преимущество терапевтического подхода в соответствии с изобретением заключается в том, что антитела в соответствии с изобретением получают из β-клеток или β-клеток памяти, взятых у субъектов пожилого возраста без признаков паркинсонизма, и, поэтому, с определенной вероятностью, способных предотвращать клиническое проявление синуклеинопатии или снижать риск возникновения клинического проявления такой болезни или задерживать возникновение либо прогрессирование ее клинического проявления. Антитела в соответствии с изобретением, как правило, уже прошли через соматиче- 36 030777 ское созревание, то есть являются оптимизированными по селективности и эффективности высокоаффинного связывания с целевой а-синуклеиновой молекулой посредством соматического изменения вариабельных областей антитела.

Знание того, что такие клетки ш угуо, например, в человеческом организме, не активировались посредством родственных или других физиологических белков либо клеточных структур в смысле аутоиммунологических или аллергических реакций, также является очень важным с точки зрения медицины, поскольку это означает значительное увеличение шансов на успешное прохождение фазы клинических тестов. Такие показатели как эффективность, переносимость и толерантность уже были продемонстрированы до прохождения преклинической и клинической стадий разработок этих профилактических и терапевтических антител по меньшей мере в отношении одного пациента. Это позволяет с полным основанием ожидать положительных клинических результатов применения антител человеческого организма к а-синуклеину в соответствии с изобретением как в отношении их целевой структурно-специфической эффективности в качестве терапевтического средства, так и в отношении снижения вероятности возникновения побочных эффектов.

Настоящее изобретение также обеспечивает соответственно фармацевтический и диагностический комплект или набор, содержащий один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими описанными выше ингредиентами, например, антителом к а-синуклеину, его связывающим фрагментом, производным или вариантом, полинуклеотидом, вектором или клеткой в соответствии с изобретением. Такой контейнер (контейнеры) может снабжаться справкой-разрешением в форме, предписываемой правительственными органами регулирования производства, использования и продаж фармацевтических и биологических продуктов, в котором содержится информация об одобрении этим органом производства, использования или продажи данного продукта для лечебного применения к пациентам. Дополнительно или в качестве альтернативы данный набор содержит реагенты и/или инструкции по применению продукта в соответствующих диагностических тестах. Композиция, например, из набора в соответствии с изобретением особенно подходит для оценки риска, постановки диагноза, проведения профилактики и лечения того или иного расстройства, сопровождаемого присутствием а-синуклеина, и особенно рекомендуется для применения в лечении болезни Паркинсона (БП), деменции с тельцами Леви (ТЛ) и мультисистемной атрофии (МСА).

Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут составляться согласно хорошо известным способам, см., например, [Кетшд!оп: ТЬе 8аепсе и Ргасйсе оГ РЬагтасу (2000) Ъу !Ье Итуегкйу оГ 8с1епсек т РЫ1абе1рЫа, ΙδΒΝ 0-683-306472]. Подходящие фармацевтические носители хорошо известны в данной области техники и включают в свое число забуференные фосфатом физиологические растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии типа масло в воде, смачивающие агенты различного типа, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут составляться обычными способами. Такие фармацевтические композиции могут вводиться пациенту в соответствующей дозе. Введение требуемой композиции может производиться различными путями, например, внутривенным, интраперитонеальным, подкожным, внутримышечным, интраназальным, местным или интрадермальным путем, а также путем инъекции в спинной или головной мозг. Аэрозольные препараты, такие как назальные спреи, могут приготовляться в форме очищенных водных или других растворов активного агента с консервантами и изотониками. Такие препараты могут регулироваться по уровню рН и изотоническому состоянию для приведения в совместимость с носовой слизистой оболочкой. Препараты для ректального или вагинального ввода могут иметь форму суппозитория с подходящим носителем.

Кроме того, тогда как настоящее изобретение включает новейший стандартный (к счастью, нечасто применяемый) способ сверления маленького отверстия в черепе для введения лекарственного средства в соответствии с изобретением, в одном из аспектов связывающая молекула, в частности, антитело или медикамент на основе антитела, в соответствии с изобретением может преодолевать гематоэнцефалический барьер, что позволяет осуществлять введение медикамента внутривенно или перорально.

Схема приема лекарственного средства определяется штатным врачом больницы и клиническими факторами. Хорошо известно, что во врачебной практике дозирование медикаментов для каждого пациента зависит от множества факторов, включая объем тела пациента, площадь поверхности его тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее здоровье и другие лекарственные средства, которые вводятся одновременно. Препаратами для парентерального введения могут быть, например, стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Подходящими неводными растворителями являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Водными носителями могут быть, например, вода, водноспиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологические и буферизованные среды. К числу подходящих парентеральных носителей относятся, например, раствор хлорида натрия, декстроза Рингера, декстроза с хлоридом натрия, лактированный раствор Рингера или фисированные масла. К числу подходящих внутривенных носителей относятся, например, жидкие и питательные добавки, электролитные добавки (например, те, что приготовлены на основе декстрозы Рингера) и т.д. Консервантами и другими добавками могут служить, например, противомикроб- 37 030777 ные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и т.д. Кроме того, фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может содержать дополнительные агенты, такие как допаминовые или психофармакологические лекарственные средства, выбираемые в зависимости от назначения фармацевтической композиции.

Кроме того, фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может быть приготовлена в форме вакцины, например, если она содержит антитело к а-синуклеину или его связывающий фрагмент, производное или вариант для пассивной иммунизации. Как упоминалось в разделе о предпосылках создания изобретения, олигомерный вид а-синуклеина был обнаружен вне клетки, в плазме и С8Б (цереброспинальной жидкости) |Е1-АдпаГ с( а1., БА8ЕВ I. 20 (2006), 419-425], а исследования пассивной иммунизации на мышиных моделях болезни Паркинсона показали, что внеклеточные мышиные моноклональные антитела против а-синуклеина способны снижать аккумулирование внутриклеточных асинуклеиновых агрегатов [МахНаЬ с( а1., ΝουΓοη, 46 (2005), 857-868]. В соответствии с этим, следует ожидать, что человеческие антитела к а-синуклеину и эквивалентные им а-синуклеинсвязывающие молекулы в соответствии с изобретением являются особенно полезными в качестве вакцины для профилактики или улучшения синуклеинопатического состояния, такого как БП, ТЛ или МСА.

В одном из вариантов осуществления изобретения представляется выгодным использовать рекомбинантные БаЬ (гБаЬ) и одноцепочечные фрагменты (8сБу8) антитела в соответствии с изобретением, способные намного легче проникать через мембрану клетки. Например, в работе [КоЬсй с( а1., Рго1ст Епд. Эс8. 8е1. (2008) Ос! 16; 81741-0134], опубликованной в Интернете ранее, описано использование химерного рекомбинантного БаЬ (гБаЬ) и одноцепочечных фрагментов (8сБу§) моноклонального антитела АО-2, которое распознает эпитоп в Ν-концевой области Αβ. Эти генно-реконструированные фрагменты обладали способностью (ί) предотвращать фибриллизацию амилоида, (ΐΐ) дезагрегировать предварительно образовавшиеся фибрилы Αβ1-42 и (ίίί) ингибировать Αβ1-42-олигомер-опосредованную нейротоксичность ίη νίΐΐΌ также эффективно, как и цельная молекула 1дС. Очевидными преимуществами использования не обладающих эффекторной функцией, малых реконструированных форматов БаЬ и 8сБν антител является их более эффективное прохождение через гематоэнцефалический барьер с минимизацией риска запуска воспалительных побочных реакций. Кроме того, помимо способности 8сБν и однодоменных антител сохранять специфичность связывания полноразмерных антител, они могут быть экспрессированы как единичные гены внутриклеточно в клетках млекопитающих как интратела с потенциалом к изменению фолдинга, взаимодействий, модификаций или субклеточной локализации их мишеней; см., например, обзор [МШег апб Мс88сг, Мо1сси1аг ТЬсгару 12 (2005), 394-401].

В другой работе [Ми11сг с( а1., Ехрей Орш. Вю1. ТЬсг. (2005), 237-241] описана технологическая платформа, так называемая технология супер-антител (8ирсгАп11Ьобу ТссЬпо1оду), которая, якобы, позволяет антителам совершать челночные перемещения в живые клетки и назад, не нанося им вреда. Такие антитела, проникающие в клетки, открывают путь к новым возможностям в диагностике и терапии. Эти антитела получили сокращенное наименование ТгапхМаЬх.

Следующий вариант осуществления изобретения включает совместное введение или последовательное введение других нейропротекторов, полезных при лечении синуклеинопатии. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в фармацевтической композиции в соответствии с изобретением содержится дополнительный агент. Нейропротекторами, подходящими для использования в лечении пациента, могут быть, например, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, антагонист глутаматэргических рецепторов, ингибиторы киназ, ингибиторы НОАС, противоопухолевые агенты, дивалпрекс натрия или любое их сочетание. В литературе описаны также другие подходящие нейропротекторы для совместного использования с фармацевтической композицией в соответствии с изобретением, см., например, международную заявку на изобретение [АО 2007/011907]. В одном из вариантов осуществления изобретения дополнительным агентом является допамин или агонист допаминовых рецепторов.

В другом осуществлении изобретения а-синуклеинсвязывающие молекулы, особенно антитела в соответствии с изобретением могут также вводиться до или после трансплантационной терапии совместно с невральными трансплантатами или до или после терапии стволовыми клетками, полезными для лечения синуклеинопатии. Такие способы с использованием трансплантатов из эмбриональных мезенцефалических нейронов применялись к пациентам с болезнью Паркинсона в целях замещения нейронов, утраченных в ходе болезни, и восстановления допаминергической нейротрансмиссии в полосатом теле. Через 11-16 лет после трансплантации трансплантированные нейроны содержали тельца Леви и нейриты Леви. Такое распространение а-синуклеинопатологии от хозяина в пересаженные ткани может быть предотвращено путем совместного введения а-синуклеинсвязывающих молекул, в частности антител предмета изобретения.

Терапевтически эффективной дозой или терапевтически эффективным количеством называется количество активного ингредиента, достаточное для улучшения симптомов или состояния. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений может определяться с помощью стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на подопытных животных, например, ЕО₅₀ (терапевтически эффективная доза в 50% популяции) и ЬП₅₀ (летальная доза для 50% популяции). Отношение

- 38 030777 доз с терапевтическим и токсическим эффектами называется терапевтическим индексом, который, таким образом, может быть представлен отношением: ΕΌ₅₀/ΕΌ₅₀. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтический агент в данной композиции присутствует в количестве, достаточном для восстановления или сохранения нормального поведения и/или когнитивных характеристик в случае БП, ТЛ или других синуклеинопатий.

Из изложенного выше с очевидностью вытекает, что настоящим изобретением охватывается любое использование а-синуклеинсвязывающей молекулы, содержащей по меньшей мере одну СЭК-область антитела ΝΙ-202.22Ό11 или ее фрагментов, вариантов или производных, особенно для диагностирования и/или лечения синуклеинопатий, как упоминалось выше. Указанной связывающей молекулой может быть антитело в соответствии с изобретением или его иммуноглобулиновая цепь. Кроме того, настоящее изобретение относится к анти-идиотипическим антителам любого из описанных в настоящей заявке антител. Это - антитела или другие связывающие молекулы, которые связываются с уникальной антигенной пептидной последовательностью, расположенной в вариабельной области антитела вблизи антигенсвязывающего сайта, и являются полезными, например, при обнаружении антитела к а-синуклеину в образце, взятом у субъекта.

Другое осуществление настоящего изобретения относится к диагностической композиции, содержащей любые из вышеописанных а-синуклеинсвязывающих молекул, антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток в соответствии с изобретением и необязательные средства, подходящие для детектирования, такие как реагенты, обычно используемые в способах диагностики, основанных на иммуно- или нуклеинокислотном анализе. Антитела в соответствии с изобретением являются подходящими, например, для иммуноанализа, в котором они могут использоваться в жидкой фазе или связанными с твердофазным носителем. Антитело в соответствии с изобретением может использоваться, например, в конкурентном и неконкурентном иммуноанализе, в прямом или косвенном формате. Примерами такого иммуноанализа являются радиоиммуноанализ (К1А), иммунометрический «сэндвич»-анализ, проточная цитометрия и вестерн-блоттинг. Антигены и антитела в соответствии с изобретением могут связываться с множеством различных носителей и использоваться для специфически с ними связанных отделения клеток. Среди подходящих для этого известных носителей можно назвать, например, стекло, полистирол, поливинлхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозы, природную и модифицированную целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Используемый в целях данного изобретения носитель по своей сути может быть либо растворимым либо нерастворимым. Существует множество различных меток и способов мечения, известных специалистам в данной области техники. Метками, подходящими для использования в данном изобретении, являются, например, ферменты, радиоизотопы, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, хемилюминесцентные соединения и биолюминесцентные соединения; см. также рассмотренные выше осуществления изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения а-синуклеинсвязывающие молекулы, особенно антитела в соответствии с изобретением используются в способе диагноза расстройства у индивида путем взятия у него образца жидкости из организма, например, образца крови, образца лимфы или любого другого образца жидкости из тела, и проведения взаимодействия этого образца с антителом согласно изобретению в условиях, благоприятных для образования антитело-антигенных комплексов. Уровень таких комплексов определяют с помощью известных способов. При этом, если измеренный уровень значительно выше уровня, образовавшегося в контрольном образце, то это укажет на наличие болезни у обследуемого индивида. Аналогично также могут использоваться специфические антигены, связанные антителами в соответствии с изобретением. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуноанализу ш νίΙΐΌ с использованием связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, в соответствии с изобретением.

В данном контексте, настоящее изобретение также относится к средствам, специально сконструированным для этой цели. Например, в настоящей заявке может использоваться решетка из антител, на которую могут помещаться антитела или эквивалентные им антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению, которые специфически распознают а-синуклеин. Конструкция системы микрорешеточного иммуноанализа вкратце описана у |Ки8пе/о\у е1 а1., Мо1. Се11 Рго1еоппс8 5 (2006), 1681-1696]. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к микрорешеткам с помещенными на них асинуклеинсвязывающими молекулами, идентифицированными в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение в одном из вариантов его осуществления относится к способу диагностирования синуклеинопатии у пациента, влючающему:

(a) оценку с помощью антитела или его фрагмента в соответствии с изобретением уровня, локализации, конформации или их сочетания для а-синуклеина у обследуемого пациента; и (b) сравнение указанного уровня, локализаци, конформации или их сочетания для а-синуклеина у указанного пациента с одним или несколькими эталонными стандартами, приготовленными из одного или нескольких контрольных образцов,

- 39 030777 где различие или подобие между уровнями, локализациями, конформациями или их сочетаниями для α-синуклеина пациента и эталонного стандарта указывает на наличие у данного пациента синуклеинопатии.

Обследуемый пациент может быть бессимптомным или преклиническим по данной болезни. Эталонный стандарт может быть создан на основании образца, взятого у пациента с α-синуклеинопатией, например БП, ТЛ или МСА, где подобие между уровнями, локализациями, конформациями или их сочетаниями для α-синуклеина у обследуемого пациента и эталонного стандарта указывает на то, что обследуемый пациент имеет синуклеинопатию. В альтернативном осуществлении изобретения или дополнительно эталонный стандарт создан на основании образца, взятого у пациента, который не имеет синуклеинопатии. В некоторых вариантах осуществления изобретения обследуемый пациент и эталонный стандарт (стандарты) согласуются по возрасту. Анализ может проводиться ш νί\Ό или по образцу, выделенному у обследуемого пациента, например, по любой жидкости из организма, которая может содержать α-синуклеин, например, по образцу крови, С8Р или мочи.

Оценка уровня, локализации и/или конформации α-синуклеина может проводиться с помощью любого подходящего способа, известного в данной области техники и включающего, например, анализ αсинуклеина одним или несколько способами, выбранными среди вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, иммуноферментного анализа (ЕЫ8А), радиоиммуноанализа (К1А), клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РАС8), двухмерного гель-электрофореза, масс-спектроскопии (М8), матричноактивированной лазерной десорбции/ионизации в сочетании с времяпролетным масс-анализатором (МАЬБ1-ТОР), поверхностно-усиленной лазерной десорбции/ионизации в сочетании с времяпролетным масс-анализатором (8ЕЬБ1-ТОР), жидкостной хроматографии высокого разрешения (РЬРЬС), жидкостной экспресс-хроматографии белков (РРЬС), многоразмерной жидкостной хроматографии (ЬС) с последующей тандемной масс-спектрометрией (М8/М8) и лазерного измерения плотности. Визуализация αсинуклеина ш νί\Ό может включать в себя позитрон-эмиссионную томографию (РЕТ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (8РЕСТ), оптическую визуализацию в ближнем инфракрасном диапазоне (№К) или магниторезонансную визуализацию (МК1).

Способы диагностирования синуклеинопатий, таких как БП, ТЛ и МСА, мониторинг прогрессирования синуклеинопатий и мониторинг лечения синуклеинопатий с помощью антител и соответствующих средств, которые могут быть адаптированы в соответствии с настоящим изобретением, описаны также в международной заявке на изобретение [АО 2007/011907]. Подобным образом, способы детектирования α-синуклеина с помощью антител описаны в международных заявках на изобретения [АО 99/50300, АО 2005/047860, АО 2007/021255 и АО 2008/103472], содержание которых во всей полноте включены в настоящую заявку посредством ссылки. Эти способы могут применяться так, как описано в данных ссылках, но с применением специфического к α-синуклеину антитела, его связывающего фрагмента, производного или варианта в соответствии с изобретением.

Эти и другие варианты осуществления изобретения описаны и охватываются данным описанием и примерами осуществления изобретения. Дополнительные литературные источники, касающиеся тех или иных материалов, способов, использований и химических соединений, требующихся для применения в соответствии с настоящим изобретением, можно найти в открытых библиотеках и базах данных с помощью, например, электронных средств. Например, может использоваться открытая база данных МебНпе при Национальном центре информации по биотехнологии (№цюпа1 СеШег Гог Вю!есНпо1о§у Ыогтайоп) и/или Национальная медицинская библиотека при Национальных институтах здоровья (№Люпа1 ЫЬгагу оГ Мебюше а! 1Не №Цюпа1 МйМек оГ НеаИН). Прочие базы данных и веб-адреса, например, Европейского института по биоинформатике (Еигореап ВютГогтаНск 1пкЫи!е (ЕВ1)), который является частью Европейской лаборатории молекулярной биологии (Еигореап Мо1еси1аг Вю1о§у ЬаЬога!огу (ЕМВЬ)), хорошо известны специалистам в данной области техники, а доступ к ним можно получить с помощью поисковых средств Интернета. Обзор патентных публикаций по биотехнологии и список релевантных патентных источников, полезных для ретроспективных исследований и для текущей информированности, дан в [Вегкк, Т1ВТЕСН 12 (1994), 352-364].

Приведенное в настоящей заявке описание дает общее представление о настоящем изобретении. Если не указано иное, то используемые в нем термины соответствуют данным им определениям в словаре [ОхГогб Бюйопагу оГ ЫосНетЫгу апб Мо1еси1аг Вю1о§у, ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, 1997, гегЬеб 2000 и гергиЛеб 2003, I8ВN 0 19 850673 2]. Некоторые публикации цитируются в тексте данного описания. Содержания процитированных ссылок (включая списки литературных источников, выданных патентов, опубликованных патентных заявок, как цитировалось в настоящей заявке, технических описаниях и в инструкциях изготовителей, и др.) включены в настоящую заявку посредством ссылки; однако, фактически ни один из цитированных документов не признается прототипом настоящего изобретения.

Более полное понимание данного изобретения можно получить из приведенных ниже специфических примеров, которые исключительно иллюстрируют данное изобретение и никоим образом не ограничивают его объем.

- 40 030777

Примеры

Приведенные ниже примеры служат для дополнительной иллюстрации данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем. Описанные в примерах 1 и 2 эксперименты проводились с антителами ΝΙ-202.3Ο12, ΝΙ-202.12Ρ4 и ΝΙ-202.3Ό8 в их состоянии сразу после клонирования, то есть когда они содержали индуцированные затравкой мутации на самых Ν-концах Ιβвариабельных областей остова 1 и не были подогнаны к последовательностям эмбриональной линии (ОЬ) вариабельных тяжелых и легких цепей человеческого организма; см. фиг. 1. Однако другие антитела ряда ΝΙ-202, особенно с подогнанными ОЬ последовательностями, являются структурно подобными и, таким образом, могут давать сравнимые результаты. Эти антитела экспрессировались как молекулы ΙβΟ1 человеческого организма. Эксперименты в примерах 3 и 4 проводились с антителом ΝΙ-202.12Ρ4 при ндуцированнх затравками мутациях на Ν-концах ^-вариабельных областей, подогнанных к последовательности эмбриональной линии (ОЬ) вариабельных тяжелых и легких цепей человеческого организма, см. фиг. 1. Это антитело экспрессировалось как химерная молекула, в которой подогнанные вариабельные домены человеческого организма были слиты с константными областями мышиной молекулы Ι§Ο2η для того, чтобы можно было проводить исследования с хроническим дозированием на трансгенных мышиных моделях без индуцирования иммунного отклика мышиной молекулы, направленной против человеческого организма

Материал и способы

Подробное описание обычных способов, использованных в данных экспериментах, можно найти в литературе, процитированной в настоящей заявке. Если ниже не указано иное, то идентификация асинуклеинспецифических β-клеток и молекулярное клонирование антител к а-синуклеину, проявляющих требуемую специфичность, а также их рекомбинантная экспрессия и анализ функциональных характеристик, выполнялись и могут выполняться так, как описано в данных примерах и разделе дополнительных способов способы международных заявок на изобретения [РСТ/ЕР 2008/000053, опубликованной под номерами АО 2008/081008, РСТ/ЕР 2009/009186 и АО 2010/069603], содержания которых включены в настоящую заявку во всей их полноте посредством ссылки.

Очистка антигенов

Рекомбинантный Шв-а-синуклеин получали путем рекомбинантной экспрессии в ЕвсНепсЫа тоП с последующей очисткой с помощью тепловой преципитации, никель-аффинной, анионообменной и фильтрационной хроматографии.

Например, аДНК-конструкция, содержащая сДНК, кодирующую а-синуклеин под контролем Т7промотора, использовалась для трансформирования соответствующего штамма ЕвсНепсЫа той, такого как ВЬ21(ОЕ3), а экспрессия 200 мл клеточной культуры индуцировалась добавлением 1 мМ изопропилР-Э-тиогалактопиранозида (ГРТО). Клетки собирали через 4 ч индуцирования при 37°С, а затем ресуспендировали в 20 мл 50 мМ-ого триса, 150 мМ-ного №С1 при рН 8 с последующей ультразвуковой обработкой. После кипячения в течение 15 мин было собрано 17000 г теплостойкого супернатанта. Аналогичным образом собрали 17000 г теплостойкого супернатанта из имитатора ЕвсНепсЫа тоП. После того как 17000 г теплостойкого супернатанта (20 мл) из ЕвсНепсЫа тоН, экспрессирующего Шв-меченный асинуклеин, было отрегулировано до 50 мМ-ного триса, 300 мМ-ного, 20 мМ-ного имидазола, рН 8, его поместили в колонку ШвТгар НР емкостью 1 мл (производства компании ОЕ ЫГе Басисе), а Ш§-асинуклеин был элюирован градиентом имидазола на 30-500 тМ. Фракции, содержащие ШБ-а-синуклеин, были пулированы, а затем разбавлены в соотношении 1:10 с помощью триса на 50 мМ, рН 8. Разбавленные пулированные фракции были вложены в колонку ШвТгар НР емкостью 1 мл (производства компании ОЕ ЫГе 8с1Спсс), а связанные белки были элюированы градиентом №С1 на 30-1000 мМ. В завершение, элюаты, содержащие ШБ-а-синуклеин, дополнительно очистили с помощью гель-фильтрации высокого разрешения (Бирегйех 200 10/300 ОЬ). После этой очистки был получен ШБ-а-синуклеин чистотой около 99%, как показал анализ δΌδ-РАОЕ и окрашивание Кумасси. Концентрацию очищенного белка определяли с помощью ВСА-анализа (Р1егсе).

Скрининг антител к а-синуклеину

96-луночные микропластины с половинным объемом лунок (На1Г агеа Мюгор1а1с5, ί',’οΓηίηβ) покрывали очищенным ШБ-а-синуклеином или а-синуклеином (гПептидом) в стандартной концентрации 2 мкг/мл в покрывающем буферном растворе (РВБ рН 9,6) и выдерживали в течение ночи при температуре 4°С. Пластины промывались в РВБ-Т с рН 7,6, а неспецифически связывающие сайты блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре раствором РВБ-Т, содержащим 2% ВБА (Б1дта, ВисНв, Б\\Ц/егкшй). β-клеточную кондиционированную среду предварительно абсорбировали в течение 1 ч при комнатной температуре 10% теплостойкими белками Е. тоП в ВБА с концентрацией в 1%. Этот этап предварительной абсорбции был усовершенствован после того, как начальные попытки проведения ЕЫБА-скрининга для идентификации антител, специфических к человеческому а-синуклеину, оказались безуспешными. Таким образом, к счастью оказалось, что предварительная абсорбция ЕЫБА-пластины теплостойкими белками Е. той исключает скрининг ошибочно положительных результатов, какие были получены из-за наличия клейких антител и антител, направленных против загрязнений белка Е. той, ко- 41 030777 торые по всей вероятности присутствовали в очищенных рекомбинантных образцах α-синуклеина. После этого. предварительно абсорбированную среду перенесли из пластин с культурой β-клеток памяти на пластины ЕЫ8А и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Пластины ЕЫ8А были промыты в РВ8-Т и затем инкубировны вместе с (Рсу-фрагмент-специфическими) поликлональными антителами 1§С осла. направленными против человеческого организма. конъюгированными с пероксидазой ложечницы приморской (НРР). После промывки раствором РВ8-Т. связывание человеческих антител было определено с помощью измерений активности НРР-пероксидазы с использованием стандартного колориметрического анализа.

Молекулярное клонирование антител к α-синуклеину

Образцы. содержащие β-клетки памяти. получали у добровольцев старше 60 лет. Никто из добровольцев не имел каких бы то ни было признаков паркинсонизма. Живые β-клетки выбранных культур βклеток памяти были собраны. после чего была приготовлена мРНК. После этого были получены последовательности тяжелых и легких цепей иммуноглобулина с использованием для этого 1д-остова 1специфических затравок для всех семейств вариабельных тяжелых и легких цепей человеческого организма в качестве 5'-затравок в комбинации с затравками. специфическими ко всем 1-сегментам (тяжелая и каппа-легкая цепь) и С-сегментам (лямбда легкая цепь) человеческого организма в качестве З'-затравок [Магкз е! а1. Мо1. Вю1. 222 (1991). 581-597; йе Наагй е! а1.. 1. Вю1. Скет. 26 (1999). 18218-182З0].

Идентификацию клона антитела с целевой специфичностью осуществляли путем рескрининга на ЕЫ8А-анализаторе после рекомбинантной экспрессии полных антител. Рекомбинантная экспрессия полного человеческого антитела 1дС1 или химерного антитела 1д02а достигалась после инсерции последовательностей вариабельных тяжелых и легких цепей в правильной рамке считывания в векторы экспрессии. которые дополняют последовательность вариабельной области последовательностью. кодирующей лидерный пептид на 5'-конце. а на З'-конце - последовательностью. кодирующей соответствующий константный домен(-ы). Для этой цели затравки содержали сайты рестрикции. служащие для того. чтобы облегчить клонирование последовательностей вариабельных тяжелых и легких цепей в векторы экспрессии антител. Тяжелые цепи иммуноглобулина экспрессировались путем инсерции тяжелоцепочечного иммуноглобулинового продукта РТ-РСР в рамке считывания в вектор экспрессии тяжелой цепи. содержащий сигнальный пептид и константные домены человеческого иммуноглобулин гамма 1 или мышиного иммуноглобулина гамма 2а. Каппа-легкая цепь иммуноглобулина экспрессировалась путем инсерции каппа-легкоцепочечного продукта РТ-РСР антитела N1-202308 в рамке считывания в вектор экспрессии легкой цепи. обеспечивающий сигнальным пептидом и константным доменом каппа-легкой цепи иммуноглобулина человеческого организма. Лямбда-легкие цепи иммуноглобулинов №-202.12Ρ4 и N1-2023012 экспрессировались путем инсерции лямбда-легкоцепочечного РТ-РСР-продукта в рамке считывания в вектор экспрессии лямбда-легкой цепи. обеспечивающий сигнальным пептидом и константным доменом мышиной лямбда-легкой цепи иммуноглобулина или такой же цепи человеческого организма.

Функциональные рекомбинантные моноклональные антитела были получены после котрансфекции в клетки НЕК29З или СНО (или любую другую подходящую реципиентную клеточную линию человеческого или мышиного происхождения). принадлежащие вектору экспрессии 1§-тяжелой цепи и вектору экспрессии каппа- или лямбда-1д-легкой цепи. После этого рекомбинантное моноклональное антитело человеческого организма очищали от кондиционированной среды с помощью стандартной очистки в колонке с протеином А.

Антитела

Антитело Раи 8уиис1еш 8уи211 (§1§та) использовали в соответствии с протоколом изготовителя. Рекомбинантные антитела N1202.22011 и N1202.12Ρ4 к человеческому α-синуклеину являются антителами в соответствии с изобретением. Их экспрессировали в клетках НЕК29З или СНО. и затем. если не указано иного. кондиционированные среды были использованы и непосредственно в последующих применениях.

Прямой анализ ЕЫ8А

Антигены наносились в указанной концентрации в РВ8 рН 9.6 на 96 луночные микропластины с половинным объемом лунок и выдерживались в течение ночи при температуре 4°С. Пластины промывали в РВ8-Т. рН 7.6. а неспецифически связывающие сайты блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью РВ8-Т. содержащего 2% В8А (§1дта). Далее зонды (первичные антитела) переносили в лунки и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки в РВ8-Т. рН 7.6. лунки в течение 1 ч при комнатной температуре инкубировали с конъюгированными ложечницой приморской (НРР) поликлональными вторичными антителами против человеческого организма (для рекомбинантных антител человеческого организма). против кролика (для антитела к пан-синуклеину) или против мыши (для ЬВ509 или 8уи211). После тщательной промывки в РВ8-Т связывание зондов было определено путем измерения активности НРР-пероксидазы с помощью стандартного колориметрического анализа. где в качестве хромогенного субстрата использовался З.З'.5.5'-тетраметилбифенил-4.4'диамин (§1§та).

- 42 030777

Пептидное сканирование для картирования эпитопов

Полную последовательность человеческого α-синуклеина синтезировали в форме перекрывающихся пептидов с длинами 15 аминокислот (аа) и перекрытием 11 аа, соединенным через гибкий линкер с целлюлозной мембраной (бРЕ Вег1ш, Оегтаиу). Мембрану, содержащую в целом 33 пептида, промыли в метаноле и затем блокировали с помощью ^ЧЬ^ск (ΚοίΗ, Κа^18^иЬе, Оегтаиу). Эту мембрану инкубировали указанными антителами, разбавленными в блокирующем растворе, и затем вторичным антителом, меченным пероксидазой из ложечницы приморской (НКР) в течение 1 ч. Между периодами инкубации мембрану промывали с использованием 3 х ΓΒδ-τ в течение 5 мин. Далее мембрану обрабатывали Εί'.Εсубстратами плюс реагентами для детектирования способом вестерн-блотинга (ΟΕ НеаЪЬсаге).

ΕΟδΑ в растворе

Антитело ΝΙ-202.12Ρ4 (2 мкг/мл) разбавленное в натрий-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,6) наносили при температуре 4°С в течение ночи на пластины ΕΟδΑ. После этого планшеты блокировали с помощью 2% раствора ΒδΑ ΓΒδ-τ и затем промывали раствором РВ§-Е Добавили указанные биотинилированные α-синуклеиновые пептиды и через 2 ч инкубирования пластины промыли раствором РВ§-Е После инкубирования НКР-меченным стрептавидином в течение 1 ч было определено связывание путем измерения активности НКР-пероксидазы с помощью стандартного колориметрического анализа.

Пример 1. Полученное от человека антитело ΝΙ-202.21Ό11 против асинуклеина является селективным к человеческому α-синуклеину α-, β- и γ-синуклеины являются высокогомологичными белками, которые экспрессируются предпочтительно в нервной системе, скелетных мышцах и в сердце, α-синуклеин плотно ассоциируется с широким спектром болезней центральной нервной системы, в то время как β-синуклеин может быть нейропротекторным белком. Настоящее изобретение обеспечивает терапевтические антитела против патологических вариантов α-синуклеина, которые не реагируют перекрестно с β- и γ-синуклеинами. Для подтверждения потенциальной возможности терапевтического применения ΝΙ-202.21Ό11, это антитело тестировали на связывание с α-, β- и γ-синуклеинами посредством прямого анализа ΕΟδΑ. Рекомбинантные α-, β и γ-синуклеины наносили на ΕΟδΑ пластины в одинаковой концентрации, а затем инкубировали с рекомбинантным ΝΙ-202.21Ό11 или с контрольным антителом к пан-синуклеину. Антитело к пан-синуклеину детектирует все три синуклеиновых белка, но ΝΙ-202.21Ό11 демонстрирует селективное связывание с α-синуклеином (фиг. 2а).

Человеческий и мышиный α-синуклеины являются высококонсервативными белками. Для проверки того, способно ли рекомбинантное антитело ΝΙ-202.21Ό11 предпочтительно связывать человеческий α-синуклеин по отношению к мышиному α-синуклеину, рекомбинантные Н18-меченные человеческий и мышиный α-синуклеины наносили на отдельные пластины ΕΟδΑ в одинаковой концентрации и затем тестировали на связывание с ними ΝΙ-202.21Ό11 и ΝΙ-202.12Ρ4 (фиг. 2Ь). При проведении этого прямого ΕΕΙδΑ-анализа антитела ΝΙ-202.21Ό11 был обнаружен только человеческий α-синуклеин, в то время как ΝΙ-202.12Ρ4 обнаружило как человеческий, так и мышиный α-синуклеин, см. [РСТ РиЬиса1юи XVΟ 2010/069603 А1]. Эти оба факта свидетельствуют о том, что антитело ΝΙ-202.21Ό11 является высокоселективным к человеческому α-синуклеину.

Пример 2. Антитело ΝΙ-202.21Ό11 демонстрирует предпочтительное связывание с человеческим αсинуклеином при высоких концентрациях покрытия, что указывает на конформационный эпитоп

Полумаксимальную эффективную концентрацию (ЕС50), указывающую на потенциальную способность ΝΙ-202.21Ό11, определяли в области высоких и низких концентраций покрытия рекомбинантного α-синуклеина посредством прямого ΕΕΙδΑ-анализа α-синуклеина. Высокая аффинность связывания рекомбинантного ΝΙ-202.21Ό11 с величиной ΕС50 ~ 200 пМ наблюдалась в области высоких концентраций покрытия α-синуклеинового белка (20 мкг/мл). При более низких концентрациях α-синуклеина наблюдалось резкое снижение аффинности (фиг. 3). Эти характеристики сильно контрастируют с имеющимся в продаже антителом 8уи211, которое также обнаруживало эпитоп в С-концевом домене α-синуклеина. Этот факт свидетельствует о том, что ΝΙ-202.21Ό11 отдает предпочтение эпитопу, который образуется или подвергается внешнему воздействию в условиях высокой плотности, которые имеют место в высокомолекулярном α-синуклеине.

Пример 3. Рекомбинантное тело ΝΙ-202.22Ό11 связывается с патологическим видом α-синуклеина в мозгу.

Связывание ΝΙ-202.21Ό11 с человеческим α-синуклеином было проанализировано также на иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга с α-синуклеином трансгенной мыши и пациента, страдающего синуклеинопатией, подтвержденной нейропатологическим способом (деменцией с тельцами Леви). ΝΙ-202.21Ό11 демонстрировало ясно выраженное окрашивание подобных тельцам Леви и нейритам Леви включений на обработанных протеиназой Κ парафиновых срезах мозговой ткани трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих человеческий α-синуклеин А53Т (фиг. 4а). На срезах мозга мышей дикого типа, окрашивания ΝΙ202-21Ό11 не наблюдалось, что подтверждает специфичность ΝΙ-202.21Ό11 к человеческому α-синуклеину (фиг. 4Ь). ΝΙ-202.21Ό11 детектировало также патологический α-синуклеин

- 43 030777 в мозговой ткани человека, страдающего деменцией с тельцами Леви (фиг. 4с). Эти результаты показывают, что полученное от человека антитело ΝΙ-202.21Ό11 детектирует патологический α-синуклеин в мозгу.

Пример 4. Картирование эпитопа, полученного от человека α-синуклеинспецифического антитела ΝΙ-202.22Ό11 с эпитопом в С-концевом домене α-синуклеина человеческого организма.

α-синуклеин является природно несвернутым белком длиной 140 аминокислот (аа), который состоит из трех доменов. Ими являются Ν-концевая амфмипатическая область повторов (аа 1-60), центральная область (аа 61-95) и кислотная С-концевая область (аа 96-140). (А) С тем, чтобы получить первичное представление о связывающем домене антитела ΝΙ-202.21Ό11, было проведено тестирование посредством прямого анализа ΕυδΛ усечений рекомбинантного α-синуклеина на связывание ΝΙ-202.21Ό11. Усечения рекомбинантного α-синуклеина из остатков 1-60, 1-95, 61-140 и 96-140 наносили на пластины Ε^IδΑ и инкубировали с рекомбинантным ΝΙ-202.21Ό11. Связывание ΝΙ-202.21Ό11 наблюдалось только с усеченным α-синуклеином 61-140 и 96-140, что указывает на связь ΝΙ-202.21Ό11 с С-концевым кислотным доменом α-синуклеина (фиг. 5а).

Для получения более детального представления о последовательности распознавания антитела ΝΙ202.21Ό11, последнее тестировали на связывание с перекрывающимися линейными 15-мерными пептидами, охватывающими всю аминокислотную последовательность человеческого α-синуклеина. Соседние пептиды перекрывали друг друга на участке из 11 остатков, и пептиды выходили своими С-концами на целлюлозную несущую мембрану. Антитело ΝΙ-202.21Ό11 связывалось с тремя перекрывающимися пептидами, а именно с остатками 109-123 (В08), 113-127 (В09) и 117-131 (В 10) человеческого α-синуклеина (фиг. 5Ъ). Этот результат свидетельствует о том, что минимальной последовательностью распознавания на С-конце α-синуклеина, требующейся для связывания ΝΙ-202.21Ό11, является ГУЭРОЙ (117-123). То есть, ΝΙ-202.21Ό11 связывает пептид В10 несколько меньше, чем пептиды В08 и В09. Таким образом, остатки 113-117 в α-синуклеине могут влиять на связывание ΝΙ-202.21Ό11.

Прямой Ε^IδΑ-анализ почти не показал связывания ΝΙ-202.21Ό11 с мышиным α-синуклеином (фиг. 2В). Выравнивание последовательности определяемого эпитопа антитела ΝΙ-202.21Ό11 (ШОРОМ:) с соответствующей мышиной последовательностью (РV^РОδΕ) показывает, что Ό121 и Ν122 являются ключевыми аминокислотами для селективности ΝΙ-202.21Ό11 к α-синуклеину человеческого организма по отношению к мышиному α-синуклеину. Для подтверждения ключевой роли Ό121/Ν122 был продуцирован рекомбинантный мутированный α-синуклеин человеческого организма Ό121Ο/Ν122δ, который был протестирован на связывание антителом ΝΙ202.21Ό11 с помощью прямого Ε^IδΑ-анализа. Как показано на фиг. 5с, антитело ΝΙ-202.21Ό11 почти не показало связывания с αсинуклеином человеческого организма Ό121Ο/Ν122δ по сравнению с α-синуклеином человеческого организма дикого типа. Контрольное антитело к пан-синуклеину использовалось в качестве нормирующего контроля для одинакового покрытия синуклеиновых белков.

Эти результаты свидетельствуют о том, что антитело ΝΙ-202.21Ό11 является полученным от человека антителом к α-синуклеину, детектирующим С-концевой эпитоп (остатки 117-123) в α-синуклеине человеческого организма, и то, что аминокислоты Ό121/Ν122 вносят вклад в селективность его к αсинуклеину человеческого организма по сравнению с мышиным α-синуклеином.

Пример 5. ΝΙ-202.12Ρ4 детектирует эпитоп в α-синуклеине 4-15, а К10 в α-синуклеине является ключевой аминокислотой для селективности ΝΙ-202.12Ρ4 к α-синуклеину

С целью более детального понимания последовательности распознавания (эпитопом) антитела ΝΙ202.12Р4, были, с помощью иммуноблоттинга, протестированы перекрывающиеся линейные 15-мерные пептиды, охватывающие всю аминокислотную последовательность человеческого α-синуклеина для связывания ΝΙ-202.12Ρ4. Соседние пептиды перекрывали друг друга на участке из 11 остатков, и пептиды выходили своими С-концами на целлюлозную несущую мембрану. Антитело ΝΙ-202.12Ρ4 связывалось с самым Ν-концевым пептидом (А01), свидетельствуя о том, что эпитоп находится на интервале из 1-15 остатков (фиг. 6а). Поскольку ΝΙ-202.12Ρ4 не связывается с остатками 5-20 пептида (А02), эпитоп начинается между остатками 1 и 5. Для точного определения стартового остатка эпитопа, искусственные αсинуклеиновые пептиды были протестированы на связывание ΝΙ-202.12Ρ4 при проведении анализа ΕΟδΑ в растворе. Сначала для оценки достоверности выбранного способа Ε^IδΑ-анализа в растворе, были протестированы на связывание с ΝΙ-202.12Ρ4 искусственные пептиды α-синуклеина 1-30 и 5-30. Антитело ΝΙ-202.12Ρ4 связывало α-синуклеин на участке 1-30, но не связывало его на участке 5-30; это подтверждало то, что эпитоп начинается между остатками 1 и 5 (фиг. 6Ъ). Затем на связывание антителом ΝΙ-202.12Ρ4 был протестирован α-синуклеин 4-30. Как показано на фиг. 6Ъ, ΝΙ-202.12Ρ4 связывалось с αсинуклеином 4-30. Эти результаты показывают, что эпитоп антитела ΝΙ-202.12Ρ4 начинается на остатке 4.

ΝΙ-202.12Ρ4 селективно связывалось с α-синуклеином, но не связывалось с β- и γ-синуклеинами. Выравнивание содержащей эпитоп последовательности (α-синуклеин 4-15) антитела ΝΙ-202.12Ρ4 с соответствующей последовательностью β-синуклеина показало, что эти последовательности различаются

- 44 030777 только одной аминокислотой. Лизин в положении 10 а-синуклеина замещен метионином в βсинуклеине. Таким образом, ΝΙ202.12Γ4 должно связываться с β-синуклеином М10К, но не должно связываться с а-синуклеином К10М. Для экспериментального подтверждения с помощью прямого анализа ЕЫ§А были протестированы на связывание с М-202.12Р4 рекомбинантный а-синуклеин дикого типа и а-синуклеин К10М, а также β-синуклеин дикого типа и β-синуклеин М10К. Как и следовало ожидать, ΝΙ202.12Γ4 связывалось только с а-синуклеином дикого типа и β-синуклеином М10К, но не связывалось с β-синуклеином дикого типа и с а-синуклеином К10М (фиг. 6с). Антитело к пан-синуклеину связывалось со всеми четырьмя рекомбинантными белками одинаково хорошо, демонстрируя одинаковые покрытия на пластинах ЕЫ8А планшетах.

Совместно эти эксперименты показывают, что эпитоп для ΝΙ202.12Γ4 локализован в интервале остатков 4-15 а-синуклеина. Этот эпитоп начинается на 4-м остатке и заканчивается между остатками 1115. Лизин в положении 10 в а-синуклеине отвечает за специфичность антитела М-202.12Р4 для отношения между а-синуклеином и β-синуклеином.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> БАЙОДЖЕН АЙДЕК ИНТЕРНЭШНЛ НЕЙРОСАЙЕНЗ ГМБХ Юниверсити оф Цюрих ВАЙХОФЕН, Андреас ГРИММ, Ян

ХОК, Кристоф НИТШ, Рогер СУ, Лихэ ВЕЙНРЕБ, Пол <120> АНТИ-АЛЬФА-СИНУКЛЕИН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ <130> 2159.353РС01 <140> К назначению <141> С настоящим <150> 61/500,580 <151> 2011-06-23 <160> 28 <170> Патент в версии 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> ПРОТЕИН <213> Ното зарФепз <220>

<223> альфа-синуклеин <400> 1

МеЬ 1

Азр

Уа1

Рйе

МеЬ 5

Ьуз

О1у

Ьей

Бег Ьуз 10

А1а

Ьуз

О1и О1у

Уа1 15

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

Тйг

Ьуз

О1п

О1у

Уа1

А1а

О1и

А1а

О1у

Ьуз

20

25

30

Тйг

Ьуз

О1и

О1у

Уа1

Беи

Туг

Уа1

О1у

Бег

Ьуз

Тйг

Ьуз

О1и

О1у

Уа1

35

40

45

- 45 030777

ναι ηϊ3

О1у

Уа1

А1а

ТЪг

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

ТЪг

Ьуз

О1и

О1п

Уа1

ТЪг

50

55

60

Азп ναι

О1у

А1а

Уа1

ТЪг

О1у

Уа1

ТЪг

А1а

Уа1

А1а

О1п

Ьуз

65

70

75

80

ТЪг ναι

О1и

О1у

А1а

О1у

Зег

11е

А1а

ТЪг

О1у

РЪе

Уа1

Ьуз

85

90

95

Ьуз Азр

О1п

Ьеи

О1у

Ьуз

Азп

О1и

О1у

А1а

Рго

О1п

О1и

О1у

11е

100

105

110

Ьеи О1и

Азр

МеЬ

Рго

Уа1

Азр

Рго

Азр

Азп

О1и

А1а

Туг

О1и

МеЬ

Рго

115

120

125

Зег О1и

О1и

О1у

Туг

О1п

Азр

Туг

О1и

Рго

О1и

А1а

130

135

140

<210>

2

<211>

140

<212>

ПРОТЕИН

<213>

Мышь

домовая

<220>

<223>

альфа-синуклеин

<400>

2

МеЬ Азр

Уа1

РЪе

МеЬ

Ьуз

О1у

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1и

О1у

Уа1

1

5

10

15

А1а А1а

А1а

О1и

Ьуз

ТЪг

Ьуз

О1п

О1у

Уа1

А1а

О1и

А1а

О1у

Ьуз

20

25

30

ТЪг Ьуз

О1и

О1у

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

О1у

Зег

Ьуз

ТЪг

Ьуз

О1и

О1у

Уа1

35

40

45

Уа1 НФз

О1у

Уа1

ТЪг

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

ТЪг

Ьуз

О1и

О1п

Уа1

ТЪг

50

55

60

Азп να1

О1у

А1а

Уа1

ТЪг

О1у

Уа1

ТЪг

А1а

Уа1

А1а

О1п

Ьуз

65

70

75

80

ТЪг να1

О1и

О1у

А1а

О1у

Азп

11е

А1а

ТЪг

О1у

РЪе

Уа1

Ьуз

85

90

95

Ьуз Азр

О1п

МеЬ

О1у

Ьуз

О1у

О1и

О1у

Туг

Рго

О1п

О1и

О1у

11е

100

105

110

- 46 030777

Ьеи О1и

Азр

МеБ

Рго

Уа1

Азр

Рго

О1у

Зег

О1и

А1а

Туг

О1и

МеБ

Рго

115

120

125

Зег О1и

О1и

О1у

Туг

О1п

Азр

Туг

О1и

Рго

О1и

А1а

130

135

140

<210>

3

<211>

134

<212>

ПРОТЕИН

<213>

Ното

зар1епз

<220>

<223>

бета-

синуклеин

<400>

3

МеБ Азр

Уа1

РИе

МеБ

Ьуз

О1у

Ьеи

Зег

МеБ

А1а

Ьуз

О1и

О1у

Уа1

1

5

10

15

А1а А1а

А1а

О1и

Ьуз

ТИг

Ьуз

О1п

О1у

Уа1

ТИг

О1и

А1а

О1и

Ьуз

20

25

30

ТИг Ьуз

О1и

О1у

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

О1у

Зег

Ьуз

ТИг

Агд

О1и

О1у

Уа1

35

40

45

Уа1 О1п

О1у

Уа1

А1а

Зег

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

ТИг

Ьуз

О1и

О1п

А1а

Зег

50

55

60

Н1з Ьеи

О1у

А1а

Уа1

РИе

Зег

О1у

А1а

О1у

Азп

11е

А1а

65

70

75

80

ТИг О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Агд

О1и

РИе

Рго

ТИг

Азр

Ьеи

Ьуз

Рго

О1и

85

90

95

О1и Уа1

А1а

О1п

О1и

А1а

О1и

Рго

Ьеи

11е

О1и

Рго

Ьеи

МеБ

100

105

110

О1и Рго

О1и

О1у

О1и

Зег

Туг

О1и

Азр

Рго

О1п

О1и

Туг

О1п

115

120

125

О1и Туг

О1и

Рго

О1и

А1а

130 <210> 4 <211> 127 <212> ПРОТЕИН <213> Ното зар1епз <220>

<223> гамма-синуклеин

- 47 030777 <400> 4

Меб 1

Азр

Уа1

РИе

Ьуз 5

Ьуз

О1у

РИе

Бег

11е 10

А1а

Ьуз

О1и

О1у

Уа1 15

Уа1

О1у

А1а

Уа1

О1и 20

Ьуз

ТИг

Ьуз

Ο1η

О1у 25

Уа1

ТИг

О1и

А1а

А1а 30

О1и

Ьуз

ТИг

Ьуз

О1и 35

О1у

Уа1

Меб

Туг

Уа1 40

О1у

А1а

Ьуз

ТИг

Ьуз 45

О1и

Азп

Уа1

Ο1η 50

Бег

Уа1

ТИг

Бег

Уа1 55

А1а

О1и

Ьуз

ТИг

Ьуз 60

О1и

Ο1η

А1а

Азп

А1а 65

Уа1

Бег

О1и

А1а

Уа1 70

Уа1

Бег

Уа1

Азп 75

ТИг

Уа1

А1а

ТИг

Ьуз 80

ТИг

Уа1

О1и

А1а 85

О1и

Азп

11е

А1а

Уа1 90

ТИг

Бег

О1у

Уа1

Уа1 95

Агд

Ьуз

О1и

Азр

Ьеи 100

Агд

Рго

Бег

А1а

Рго 105

Ο1η

О1и

О1у

О1и 110

А1а

Бег

Ьуз

О1и

Ьуз 115

О1и

Уа1

А1а

О1и 120

О1и

А1а

Ο1η

Бег

О1у 125

О1у

Азр

<210> 5 <211> 113 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> Ы1-202.12Е4-УНА1Ь (вариабельная последовательность тяжелой цепи

УНА1Ь) <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (31)..(35) <223> СБК1 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (50)..(68) <223> СБК2 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (101)..(102) <223> СБК3 <400> 5

О1и Уа1 Οίη Ьеи Уа1 Ο1η Бег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 О1и Рго О1у О1у 1 5 10 15

- 48 030777

Зег Ьеи Агд Ьеи

Зег

Суз

А1а να1

Зег 25

О1у

РИе

Азр

РИе

О1и 30

Ьуз

А1а

20

Тгр

МеЕ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1п

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Агд

11е

Ьуз

Зег

ТИг

А1а

Азр

О1у

ТИг

Зег

Туг

А1а

50

55

60

Рго

Уа1

О1и

О1у

Агд

РИе

11е

Зег

Агд

Азр

Зег

Агд

Азп

МеЕ

65

70

75

80

Ьеи

Туг

Ьеи

О1п

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Ьуз

ТИг

О1и

Азр

ТИг

А1а

Уа1

Туг

85

90

95

Туг

Суз

ТИг

Зег

А1а

Нтз

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТИг

Ьеи

Уа1

ТИг

Уа1

Зег

100

105

110

Зег <210> 6 <211> 5 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.12Ε4-νΗΑ1Β 0ΌΚ1 <400> 6

Ьуз А1а Тгр МеЕ Зег

5 <210> 7 <211> 19 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.12Ε4-νΗΑ1Β 0ΌΚ2 <400> 7

Агд 11е Ьуз Зег ТИг А1а Азр О1у О1у ТИг ТИг Зег Туг А1а А1а Рго 1 5 10 15 να1 О1и О1у <210> 8

- 49 030777 <211> 2 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.12Ε4-νΗΑ1Ε 0ΌΚ3 <400> 8

А1а Ηΐ3 <210> 9 <211> 113 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.12Ε4-νΗΑ1Ε-ΘΕ (выравнено к последовательности зародышевой линии) <400> 9

О1и 1

Уа1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1и

Зег

О1у О1у О1у Ьеи να1 10

О1и

Рго

О1у 15

О1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Уа1

Зег

О1у

РЬе

Азр

РЬе

О1и

Ьуз

А1а

20

25

30

Тгр

Ме5

Зег

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1п

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Агд

11е

Ьуз

Зег

ТЬг

А1а

Азр

О1у

ТЬг

Зег

Туг

А1а

50

55

60

Рго

Уа1

О1и

О1у

Агд

РЬе

11е

Зег

Агд

Азр

Зег

Агд

Азп

Ме5

65

70

75

80

Ьеи

Туг

Ьеи

О1п

Ме5

Азп

Зег

Ьеи

Ьуз

ТЬг

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

85

90

95

Туг

Суз

ТЬг

Зег

А1а

Нтз

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

100

105

110

Зег <210> 10 <211> 108 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

- 50 030777 <223> Ы1-202.12Р4-УЬа1 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (23)..(33) <223> ΟΌΚ1 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (49)..(55) <223> ΟΌΚ2 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (88)..(98) <223> ΟΌΚ3 <400> 10

О1п 1	Зег	Уа1	Ьеи	ТИг 5	О1п	Рго	Рго
ТИг	А1а	Агд	11е 20	ТИг	Суз	Зег	О1у
Ηΐ3	Тгр	Туг 35	О1п	О1п	Агд	Рго	О1у 40
Ьуз	Азр 50	Зег	О1и	Агд	Рго	Зег 55	О1у
Зег 65	Зег	О1у	ТИг	ТИг	А1а 70	ТИг	Ьеи
Азр	О1и	А1а	Азр	Туг 85	Туг	Суз	О1п
О1и	Уа1	РИе	О1у 100	О1у	О1у	ТИг	Ьуз

Зег	Уа1 10	Зег	Уа1	Зег	Рго	О1у 15	О1п
О1и 25	А1а	Ьеи	Рго	Мек	О1п 30	РИе	А1а
Ьуз	А1а	Рго	Уа1	11е 45	Уа1	Уа1	Туг
Уа1	Рго	О1и	Агд 60	РИе	Зег	О1у	Зег
ТИг	11е	ТИг 75	О1у	Уа1	О1п	А1а	О1и 80
Зег	Рго 90	Азр	Зег	ТИг	Азп	ТИг 95	Туг
Ьеи	ТИг	Уа1	Ьеи

105 <210> 11 <211> 11 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> Ы1-202.12Р4-УЬа1 ΟΌΚ1 <400> 11

Зег О1у О1и А1а Ьеи Рго Мек О1п 1 5

РИе А1а Ηΐ3 10 <210> 12

- 51 030777 <211> 7 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> Ы1-202.12Р4-УЬа1 СБК2 <400> 12

Ьуз Азр Бег О1и Агд Рго Бег 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> Ы1-202.12Р4-УЬа1 СБК3 <400> 13

О1п Бег Рго Азр Бег ТЪг Азп ТЪг Туг О1и Уа1

5 10 <210> 14 <211> 108 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> Ы1-202.12Р4-УЬа1-СЬ (выравнено к последовательности зародышевой линии) <400> 14

Бег 1

Туг

О1и

Ьей

ТЪг 5

О1п

Рго

Бег

Уа1 10

Бег

Уа1

Бег

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

Бег

О1у

О1и

А1а

Ьей

Рго

Мер

О1п

РЪе

А1а

20

25

30

НФз

Тгр

Туг

О1п

Агд

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Уа1

11е

Уа1

Туг

35

40

45

Ьуз

Азр

Бег

О1и

Агд

Рго

Бег

О1у

Уа1

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Бег

О1у

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьей

ТЪг

11е

ТЪг

О1у

Уа1

О1п

А1а

О1и

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Суз

О1п

Бег

Рго

Азр

Бег

ТЪг

Азп

ТЪг

Туг

85

90

95

О1и

Уа1

РЪе

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьей

ТЪг

Уа1

Ьей

- 52 030777

100 105 <210> 15 <211> 124 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΗ <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (50)..(66) <223> 0-2 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (99)..(113) <223> 2223 <400> 15

О1и 1	Уа1	О1п	Ьеи	Уа1 5	О1и	Бег	О1у
Бег	Уа1	Ьуз	Уа1 20	Бег	Суз	Ьуз	А1а
А1а	Ме5	Ηΐ3 35	Тгр	Уа1	Агд	О1п	А1а 40
О1у	Тгр 50	11е	Азп	А1а	О1у	Азп 55	О1у
О1п 65	Азр	Агд	Уа1	ТИг	11е 70	Азп	Агд
Ме5	О1и	Ьеи	Бег	Бег 85	Ьеи	О1у	Бег
А1а	Агд	О1и	О1и 100	Азр	Ηΐ3	А1а	О1у
Уа1	Тгр	О1у 115	О1п	О1у	ТИг	Ьеи	Уа1 120

А1а	О1и 10	Уа1	Ьуз	Ьуз	Рго	О1у 15	А1а
Бег 25	О1у	Туг	ТИг	РИе	ТИг 30	Азп	Туг
Рго	О1у	О1п	Агд	Ьеи 45	О1и	Тгр	Ме5
Ьуз	Агд	Ьуз	Туг 60	Бег	О1п	Ьуз	РИе
Азр	ТИг	Бег 75	А1а	Бег	ТИг	11е	Туг 80
О1и	Азр 90	ТИг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Бег 105	О1у	Бег	Туг	Ьеи	Бег 110	Ме5	Азр
ТИг	Уа1	Бег	Бег

<210> 16 <211> 5 <212> ПРОТЕИН

- 53 030777 <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΗ 0ΌΚ1 <400> 16

Азп Туг А1а МеЕ Ηΐ3

5 <210> 17 <211> 17 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΗ 0ΌΚ2 <400> 17

Тгр 11е Азп А1а О1у Азп О1у Ьуз Агд Ьуз Туг Зег О1п Ьуз РНе О1п 1 5 10 15

Азр <210> 18 <211> 15 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΗ 0ΌΚ3 <400> 18

О1и О1и Азр Ηίδ А1а О1у Зег О1у Зег Туг Ьеи Зег МеЕ Азр να1

5 10 15

<210>	19
<211>	372
<212>	ДНК
<213>	Искусственный
<220>
<223>	ΝΙ-202.21Ό11-νΗ
<400>	19
даддЕдсадс ЕддЕддадЕс ЕддддсЕдад	дЕдаадаадс	ссддддссЕс	адЕдааддЕЕ
ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддаЕа сассЕЕсасЕ	аасЕаЕдсЕа	ЕдсаЕЕдддЕ	дсдссаддсс

сссддасааа ддсЕЕдадЕд даЕдддаЕдд аЕсаасдсЕд дсааЕддЕаа дадааааЕаЕ

ЕсасадаадЕ Ессаддасад адЕсассаЕЕ аасадддаса саЕссдсдад сасааЕсЕас аЕддадсЕда дсадссЕддд аЕсЕдаадас асддсЕдЕаЕ аЕЕасЕдЕдс дадададдад

120

180

240

300

- 54 030777 даЕсасдсЕд дЕЕсддддад ЕЕассЕсадЕ аЕддасдЕсЕ ддддссаадд аасссЕддЕс ассдЕсЕссЕ сд

360

372 <210> 20 <211> 124 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΗ-ΘΕ (скорректирована в соответствии с последовательностью зародышевой линии) <400> 20

О1п 1	ν&1	О1п	Ьеи	ν&1 5	О1п	Зег	О1у
Зег	ν&1	Ьуз	ν&1 20	Зег	Суз	Ьуз	А1а
А1а	МеЕ	Ηΐ3 35	Тгр	ν&1	Агд	О1п	А1а 40
О1у	Тгр 50	11е	Азп	А1а	О1у	Азп 55	О1у
О1п 65	Азр	Агд	ν&1	ТЬг	11е 70	Азп	Агд
МеЕ	О1и	Ьеи	Зег	Зег 85	Ьеи	О1у	Зег
А1а	Агд	О1и	О1и 100	Азр	Ηΐ3	А1а	О1у
ν&1	Тгр	О1у 115	О1п	О1у	Зег	ТЬг	ν&1 120

А1а	О1и 10	ν&1	Ьуз	Ьуз	Рго	О1у 15	А1а
Зег 25	О1у	Туг	ТЬг	РЬе	ТЬг 30	Азп	Туг
Рго	О1у	О1п	Агд	Ьеи 45	О1и	Тгр	МеЕ
Ьуз	Агд	Ьуз	Туг 60	Зег	О1п	Ьуз	РЬе
Азр	ТЬг	Зег 75	А1а	Зег	ТЬг	11е	Туг 80
О1и	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Зег 105	О1у	Зег	Туг	Ьеи	Зег 110	МеЕ	Азр
ТЬг	ν&1	Зег	Зег

<210> 21 <211> 372 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΗ-ΘΕ <400> 21 саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадаадс ссддддссЕс адЕдааддЕЕ

ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддаЕа сассЕЕсасЕ аасЕаЕдсЕа ЕдсаЕЕдддЕ дсдссаддсс

120

- 55 030777

сссддасааа	ддсББдадБд даБдддаБдд аБсаасдсБд дсааБддБаа дадааааБаБ	180
БсасадаадБ	Бссаддасад адБсассаББ аасадддаса саБссдсдад сасааБсБас	240
аБддадсБда	дсадссБддд аБсБдаадас асддсБдБаБ аББасБдБдс дадададдад	300
даБсасдсБд	дББсддддад ББассБсадБ аБддасдБсБ ддддссаадд аадсасддБс	360
ассдБсБссБ	сд	372

<210> 22 <211> 113 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΚ <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (26)..(40) <223> СБК1 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (56)..(63) <223> СБК2 <220>

<221> РАЗНООБРАЗНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ <222> (95)..(103) <223> СБК3 <400> 22

Азр 1

Уа1

МеБ

ТИг 5

О1п

Бег

Рго

Азр

Бег 10

Ьеи А1а Уа1

Бег

Ьеи 15

О1у

О1и

Агд

А1а

ТИг

11е

Азп

Суз

Ьуз

Бег

О1п

Азп

Уа1

Ьеи

Туг

Бег

20

25

30

Бег

Азп

Ьуз

Азп

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Н1з

35

40

45

Рго

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Тгр

А1а

Бег

ТИг

Агд

О1и

Бег

О1у

Уа1

50

55

60

Рго

Азр

Агд

РИе

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТИг

Азр

РИе

ТИг

Ьеи

ТИг

65

70

75

80

11е

ТИг

Бег

Ьеи

О1п

ТИг

О1и

Азр

Уа1

А1а

Уа1

Туг

Суз

О1п

85

90

95

Туг

Бег

Рго

Ьеи

ТИг

РИе

О1у

ТИг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

100

105

110

- 56 030777

Ьуз <210> 23 <211> 17 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΚ 0ΌΚ1 <400> 23

Ьуз Зег Зег О1п Азп Уа1 Ьеи Туг Зег Зег Азп Азп Ьуз Азп Туг Ьеи 1 5 10 15

А1а <210> 24 <211> 7 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΚ ΟΌΚ2 <400> 24

Тгр А1а Зег ТИг Агд О1и Зег 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΚ ΟΌΚ3 <400> 25

О1п О1п Туг Туг Зег Зег Рго Ьеи ТИг 1 5 <210> 26 <211> 113 <212> ПРОТЕИН <213> Искусственный <220>

<223> ΝΙ-202.21Ό11-νΚ-ΘΕ (скорректировано в соответствии с последовательностью зародышевой линии) <400> 26

- 57 030777

Азр 1

11е Уа1

МеЬ

ТЬг 5

О1п

Зег

Рго

Азр

Зег 10

Ьеи А1а Уа1

Зег

Ьеи 15

О1у

О1и

Агд

А1а

ТЬг

11е

Азп

Суз

Ьуз

Зег

О1п

Азп

Уа1

Ьеи

Туг

Зег

20

25

30

Зег

Азп

Ьуз

Азп

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Н1з

35

40

45

Рго

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЬг

Агд

О1и

Зег

О1у

Уа1

50

55

60

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

С1у

Зег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

65

70

75

80

11е

ТЬг

Зег

Ьеи

О1п

ТЬг

О1и

Азр

Уа1

А1а

Уа1

Туг

Суз

О1п

85

90

95

Туг

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

100

105

110

Ьуз <210> 27 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Ы1-202.21Ь11-УК-ОЬ <400> 27

даЬаЬЬдЬда	ЬдасЬсадЬс	ЬссадасЬсс	сЬддсЬдЬдЬ	сЬсЬдддсда	дадддссасс	60
аЬсаасЬдса	адЬссадсса	дааЬдЬЬЬЬа	ЬасадсЬсса	асааЬаадаа	сЬасЬЬадсЬ	120
ЬддЬассадс	адааассадд	асаЬссЬссЬ	аадЬЬдсЬса	ЬЬЬасЬдддс	аЬсЬасссдд	180
дааЬссдддд	ЬсссЬдассд	аЬЬсадЬддс	адсдддЬсЬд	ддасадаЬЬЬ	сасЬсЬсасс	240
аЬсассадсЬ	ЬдсадасЬда	адаЬдЬддсд	дЬсЬаЬЬасЬ	дЬсадсадЬа	ЬЬаЬадЬадЬ	300
ссЬсЬсасЬЬ	Ьсддсддадд	дассааддЬд	дадаЬсааа			339

<210>	28
<211>	339
<212>	ДНК
<213>	Искусственный
<220>
<223>	ΝΤ-202.21Ό11-'

- 58 030777

<400> 28
дакдккдкда	кдасксадкс	кссадасксс	скддскдкдк	скскдддсда	дадддссасс	60
аксааскдса	адкссадсса	даакдкккка	касадсксса	асаакаадаа	скасккадск	120
кддкассадс	адааассадд	асакссксск	аадккдскса	кккаскдддс	акскасссдд	180
даакссдддд	кссскдассд	акксадкддс	адсдддкскд	ддасадаккк	сасксксасс	240
аксассадск	кдсадаскда	адакдкддсд	дкскаккаск	дксадсадка	ккакадкадк	300
ссксксаскк	ксддсддадд	дассааддкд	дадаксааа			339

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с асинуклеином человека (8Е0 ГО NΟ:1), содержащее вариабельную область тяжелой цепи (УН) и вариабельную область легкой цепи (УЬ), причем

УН-область содержит первую область определения комплементарности (УНСГОР1) с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО NΟ:16, вторую область определения комплементарности (УНСГОР2) с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NΟ:17 и третью область определения комплементарности (УНСГОР3) с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NΟ:18;

УЬ-область содержит первую область определения комплементарности (УБСГОР1) с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NΟ:23, вторую область определения комплементарности (УБСГОР2) с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NΟ:24 и третью область определения комплементарности (УБСГОР3) с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NΟ:25.
2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающееся тем, что:

(a) УН-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:15;

(b) УН-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:20;

(c) УЬ-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:22;

(ά) УЬ-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:26;

(е) УН-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:15 и УЬобласть по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:22;

(Г) УН-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:15 и УЬобласть по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:26;

(д) УН-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:20 и УЬобласть по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:22 или (Н) УН-область по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:20 и УЬобласть по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕО ГО NΟ:26.
3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающееся тем, что:

(a) УН-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:15 и УЬ-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:22;

(b) УН-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:15 и УЬ-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:26;

(c) УН-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:20 и УЬ-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:22 или (ά) УН-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:20 и УЬ-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:26.
4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что УН-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:20 и УЬ-область идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NΟ:26.
5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент слито с гетерологическим полипептидом.
6. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, отличающееся тем, что гетерологический полипептид представляет собой сигнальный пептид млекопитающего.
7. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6, отличающееся тем, что сигнальный пептид млекопитающего получен из тканевого активатора плазминогена.
8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгировано с агентом, выбранным из группы, состоящей из пептида, белка, фермента, вируса, липида и полиэтиленгликоля.
9. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, отличающее- 59 030777 ся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным, химерным или полностью человеческим.
10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, отличающееся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент является РаЬ-фрагментом, РаЬ'-фрагментом, Р(аЬ)₂-фрагментом, одноцепочечным Ρν-фрагментом или одноцепочечным антителом.
11. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, отличающееся тем, что антитело является полным антителом.
12. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, содержащее сигнальный пептид, слитый с УН-областью, сигнальный пептид, слитый с УЪ-областью, СН1-домен, слитый с УН-областью, СН2-домен, слитый с УН-областью, СН3-домен, слитый с УН-областью, шарнирную область, слитую с УН-областью, и/или С_К-домен, слитый с УЪ-областью, или Сь-домен, слитый с УЪ-областью.
13. Фармацевтическая композиция для профилактики или терапевтического лечения синуклеинопатии, содержащая выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-12, и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-12.
15. Выделенный полинуклеотид по п.14, включающий полинуклеотид, кодирующий УН-область, и полинуклеотид, кодирующий УЪ-область, причем полинуклеотид, кодирующий УН-область, содержит нуклеотидную последовательность 5>ЕО ГО N0:19, а полинуклеотид, кодирующий УЪ-область, содержит нуклеотидную последовательность 5>Е0 ГО N0:27.
16. Выделенный полинуклеотид по п.14, содержащий полинуклеотид, кодирующий УН-область, и полинуклеотид, кодирующий УЪ-область, причем полинуклеотид, кодирующий УН-область, содержит нуклеотидную последовательность 5>Е0 ГО N0:21, а полинуклеотид, кодирующий УЪ-область, содержит нуклеотидную последовательность 5>Е0 ГО N0:28.
17. Вектор для экспрессии антитела к человеческому а-синуклеину или его асинуклеинсвязывающего фрагмента, содержащий выделенный полинуклеотид по любому из пп.14-16.
18. Выделенная клетка-хозяин для экспрессии антитела к человеческому а-синуклеину или его асинуклеинсвязывающего фрагмента, содержащая выделенный полинуклеотид по любому из пп.14-16 или вектор по п.17.
19. Выделенная клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).
20. Способ продуцирования антитела к человеческому а-синуклеину или его антигенсвязывающего фрагмента или цепи(ей) иммуноглобулина, включающий:

(a) культивирование клетки-хозяина по п.18 или 19 и (b) выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или цепи(ей) иммуноглобулина из культуры.
21. Антитело к человеческому а-синуклеину или его а-синуклеинсвязывающий фрагмент, продуцированные способом по п.20.
22. Способ лечения синуклеинопатии у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение пациенту-человеку антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-12 или 21.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что синуклеинопатия выбрана из группы, состоящей из болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и мультисистемной атрофии.
24. Способ по п.22, отличающийся тем, что синуклеинопатия представляет собой болезнь Паркинсона.

- 60 030777

П!-2Ъ?.. ; 1т 1 - 7Я кй:.: ·έ -г? -Б2жг.-=.--_-χ-= -= 4=-.:-...= - · . - ; 516 Ю Ж>: -5;

/Яί' - · .....* *. ~ _ СК1-Ж2..» . С0Я2-... —

Μ-Μ2,Μ311*№01* 101 !3ер.’гбе.^ая лгс.-едозате.-=^.:ст= тя^е.-сГ· цеп- >. суссрастгрсза-^гр б ссс^-вегсзлг с г^-езсзгл-еы-сстг-с ззсод=-’шек;' .ч-иг ’ ЖЦЩ 10 «:»]

Ш- ....... -«СВВ1-Ш.2——СВЙ2-— « — ·..*·..

0адь^5амстж^ет»§сжмттта^жот1®вэййьи№1о<®«вв12к^ _т—-С0ЯЗ- — — —иН— - — 1УТ11ЖГЯМТ1ЖБ1е§Ш5ГОТЖГЯСД1ЖЖШО^ХЬЗ©¥«ад5Т¥1¥В8

ΝΪ-Э2 - 21031 - УХ <Еасрз5&-±^а.= г.-р-еджа-е-=“есть чегсс? с=п- ·,4 ; ®β 10 Ж):22)

Ηΐχ. -------*-СОЙ2---РВЗ-тлшо5ет8музивжт1ж^^та5да.жг^«аекрс№ежмх1^ж||де>а»

--ОЭЯЗ ·’“>-л-- — ^505етатат1т51жшу»¥¥соте55»т^то81к

511*20«21Ю11-Ш“0Ь (бэр рабе.-о«-зр -сс.-адоБагегегосте -ег-сй с£^пи ?Н сюрсес-лссзсг+ад з соотзетс&л-л с -сс-ержачжь-ссуье Зарсдзлгезс л г л игл } ββ ΐδ «0:2«)

ΡΚΐ « * » - — - СЦЙД „ - - - . . ~ ~ .— — ί+ΐ/ 2 _,----- ~ ~ Сих~: ' г/* 3 *⁼

0И^Ш>М»¥5М2ЖТВСИЗ^Ж¥&»8Ж¥1АЙТСШШ1?Жи,О^^0^*Р01Р

........... ...............— ^505СТтаТ1Т^ЬСТ0УАУ¥¥О^гУ8&РЬТРСЭ0ТЮ.^1К