KR20150043562A - 인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(hiapp) 특이적 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(hiapp) 특이적 항체 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

각각 아밀린 및 IAPP 및 프로IAPP로도 알려져 있는 신규한 인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드, 특이적 항체뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체 및 변이체 그리고 이에 관련된 방법이 제공된다. IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적인 항체에 관련된 분석, 키트, 및 고형 지지체도 개시된다. 항체, 면역글로불린 사슬(들)뿐만 아니라 이들의 결합 단편, 유도체 및 변이체는 각각 IAPP 및/또는 프로IAPP 표적화된 면역치료법 및 진단을 위한 약학적 및 진단 조성물에서 이용될 수 있다.

Description

인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(HIAPP) 특이적 항체 및 이들의 용도{HUMAN ISLET AMYLOID POLYPEPTIDE(HIAPP) SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 아밀린 및/또는 그 전구체 전-섬 아밀로이드 폴리펩티드(proislet amyloid polypeptide, 프로IAPP)로도 공지되어 있는 인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(human islet amyloid polypeptide, hIAPP)에 특이적으로 결합하는 신규한 분자, 특히 IAPP, 프로IAPP 단백질, IAPP의 응집된 형태, 프로IAPP의 응집된 형태, 및/또는 IAPP 섬유를 인식하는 인간 항체뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈장 내에서 IAPP, 프로IAPP, 응집된 IAPP, 프로IAPP 종 및/또는 IAPP 섬유를 확인하기 위한 진단 도구로서 그리고 또한 응집된 IAPP, 응집된 프로IAPP, 및 IAPP 섬유에 관련된 장애, 예컨대 2형 당뇨병(T2D) 및 1형 당뇨병(T1D)이 있는 개인에 임상적 췌장 섬 이식을 한 후 섬 거부(islet rejection)를 치료하기 위한 수동 백신접종 전략에서 모두 귀중한 상기 결합 분자, 항체 및 이들의 모사체를 포함하는 약학적 및 진단 조성물에 관한 것이다.
단백질 축적, 개질 및 응집은 널리 공지된 신경변성 질환, 예컨대 헌팅턴, 알츠하이머(AD) 및 파킨슨 질환(PD)을 포함하는 여러 대사성 질환의 병리적 측면이다(Taylor et al., Science 296 (2005), 1991-1995). 병리적 단백질 응집은 또한 대사성 질환, 예컨대 2형 당뇨병(T2D) 및 1형 당뇨병(T1D)이 있는 개인에 임상적 췌장 섬 이식을 한 후 섬 거부와 관여된다. 단백질의 폴딩오류(misfolding) 및 응집은 아밀로이드 침적(deposit)의 발생으로 이어지며, 이들 질환에서 세포 독성에 직접 관련되는 것으로 보인다. 췌장에서 β-세포에 의해 인슐린과 함께 분비되는 생리적 펩티드인 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP 또는 아밀린)는 T2D 환자의 췌장 섬(랑게르한스 섬으로도 불림)에서 섬유상 응집체를 형성하며, 질환 발생에 역할을 담당하는 것으로 제시되었다(Westermark et al. (2011), Physiol. Rev. 91(3): 795-826). 또한 전술한 바와 같이, IAPP 응집체는 1형 당뇨병(T1D) 환자에서 단리된 섬의 이식시 췌장 섬에서 발견되었다.
인간 IAPP(hIAPP)는 시스테인 잔기 2 및 7 사이 이황화 가교(disulfide bridge) 및 아미드화된 C-말단을 갖는 37개 아미노산으로 구성되는 펩티드 호르몬이다. 췌장 섬은 65 내지 80% β-세포로 이루어지며, 혈중 글루코오스 수준 및 세포 대사의 조절에 필수적인 인슐린 및 IAPP를 생산하고 분비한다. IAPP는 췌장 β-세포에서 생산되는 89개 아미노산 전구체인 프리프로호르몬 프리프로IAPP로부터 가공된다.
프리프로IAPP는 번역 후 67개 아미노산 펩티드인 전-섬 아밀로이드 폴리펩티드로 신속하게 절단되며, 이는 추가적인 단백질분해(proteolysis) 및 번역 후 개질을 거쳐 hIAPP를 생성한다. hIAPP 발현은 인슐린과 함께 조절되며, 증가된 인슐린 생산이 증가된 hIAPP 수준으로 이어진다. hIAPP는 췌장 β-세포로부터 혈액 순환 내로 방출되며, 인슐린과의 상승작용으로 위 배출 및 포만감 제어를 통해 혈당 조절에 관여된다.
hIAPP가 생리적 조건 하에 세포 대사의 조절제로 작용하는 반면, hIAPP는 β-세포 부전, 증가된 β-세포사 및 감소된 β-세포 양(mass)에 연관된 아밀로이드 섬유를 응집시키고 형성할 수 있다(IAPP 아밀로이드증). 몇몇 증거는 hIAPP 아밀로이드증을 T2D 발병기전의 주요 유발자로 지적한다. 첫 번째로, hIAPP 섬유의 침적이 90% 이상의 2형 당뇨병 환자에서 발견된다(Zraika et al. (2010), Diabetologia 53(6): 1046-1056). 두 번째로, hIAPP 응집은 β-세포에 독성이 있으며 인슐린 생산 β-세포의 감소에 연관된다(Butler et al. (2003), Diabetes 52(9): 2304-2314; Ritzel et al. (2007), Diabetes 56(1): 65-71; Jurgens et al. (2011), Am. J. Pathol. 178(6): 2632-2640). 세 번째로, hIAPP를 발현하는 유전자삽입 쥐과 모델(transgenic murine model)은 췌장 섬 아밀로이드 침적을 나타내며 T2D가 자연 발생한다(Janson et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(14): 7283-7288; Hoppener et al. (1999), Diabetologia 42(4): 427-434; Hull et al. (2003), Diabetes 52(2): 372-379; Butler et al. (2004), Diabetes 53(6): 1509-1516; Matveyenko et al. (2006), ILAR J. 47(3): 225-233; Hoppener et al. (2008), Exp. Diabetes Res. 697035). 이들은 T2D 환자의 조직에서 관찰되는 것과 필적하는 β-세포 기능부전, β-세포 양 결핍 및 β-세포 손실로 상기 인간 질환을 재현한다. hIAPP 발현 및 아밀로이드 형성은 이들 모델에서 β-세포 아폽토시스(apoptosis) 및 당뇨병 발생에 직접 연관되므로, 질환 발생에서 인간 IAPP의 기여에 대한 증거를 제공한다. 또한, hIAPP 응집을 방해하는 치료가 당뇨병 표현형을 완화시켰고 동물 수명을 증가시켰다(Aitken et al. (2009), Diabetes 59(1): 161-171). hIAPP 응집 및 아밀로이드증은 독성에 대한 전제조건이다. 6개 아미노산 치환 결과 섬유를 형성할 수 없는 비아밀로이드증 설치류 IAPP(rIAPP)는 β-세포에 독성이 없다. 질환의 발생에서, 인간 췌장 섬에서 발견된 병리적 hIAPP 응집은 인슐린 분비 손상에 연관된 β-세포 기능부전 및 사망을 유도할 수 있다. 또한, 정상 혈중 글루코오스 수준을 유지하기 위한 β-세포 양 및 인슐린과 아밀린 분비의 보상적 증가는 독성 hIAPP 올리고머의 형성 및 hIAPP 섬유의 침적을 선호할 수 있다. 초기 hIAPP 올리고머는 주요 세포독성 종으로 간주되는 반면, hIAPP 섬유 최종 산물도 β-세포 손실에서 역할을 담당할 수 있다(Meier et al. (2006), Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291(6): E1317-1324; Haataja et al. (2008), Endocr. Rev. 29(3): 303-316; Engel et al. (2008), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16): 6033-6038). hIAPP 섬유는 또한 공여자로부터 단리된 췌장 섬에서 관찰되었고, 1형 당뇨병이 있는 개인으로의 임상적 췌장 섬 이식 후 β-세포 손실에 연관되었다(Andersson et al. (2008), Exp. Diabetes Res. 562985; Udayasankar et al. (2009), Diabetologia 52(1): 145-153; Bohman et al. (2012), Amyloid 19(2): 87-93). T2D에서 hIAPP 응집 및 아밀로이드증을 야기하는 정확한 기전을 알려져 있지 않다. T2D에서의 인슐린 내성은 프로IAPP 세포 함량 및 hIAPP 방출과 함께 인슐린 분비 요구를 증가시키며, 이는 아밀로이드증을 야기할 수 있는데, 그 이유는 hIAPP 섬유 형성이 농도 의존적이기 때문이다. 다른 제안된 기전은 프로IAPP의 부분 가공된 형태, 특히 48 잔기 중간체 프로IAPP1 -48이 아밀로이드 침적에서 발견되므로, 인슐린 내성 환경에서 단백질분해 부전으로 야기되는 N-말단 미가공 프로IAPP의 축적 및 응집이다(Marzban et al. (2006), Diabetes 55(8): 2192-2201). 이 맥락에서, 프로IAPP의 비정상적 가공은 hIAPP 아밀로이드증을 위한 핵으로 작용하고 아밀로이드 형성을 증가시킬 수 있다(Paulsson et al. (2005), Diabetes 54(7): 2117-2125; Paulsson et al. (2006), Diabetologia 49(6): 1237-1246; Marzban et al. (2006), Diabetes 55(8): 2192-2201). 따라서 프로IAPP는 또한 적절한 치료 표적으로 간주된다.
T2D의 임상적 특징은 높은 혈중 글루코오스 수준 및 인슐린 내성 및/또는 결핍이다. 당뇨병은 T1D, T2D, 및 임신 당뇨병을 포함하는 일 군의 대사성 질환이다. 성인 개시 당뇨병, 비만 관련 당뇨병 및 비인슐린 의존적 당뇨병(NIDDM)으로도 명명된 T2D는 당뇨병의 가장 일반적인 형태로, 전체 증례의 약 90%를 차지한다(Gerich et al. (1998), Endocr. Rev. 19(4): 491-503). T2D는 기능적 인슐린-생산 β-세포의 수 감소를 특징으로 한다. 병리가 진행됨에 따라, 장기 합병증, 예컨대 심혈관 질환, 실명으로 이어지는 당뇨병성 망막병증, 신장 부전, 빈번한 감염 및 순환 불량으로 유도되는 절단으로 이어질 수 있다. 그 결과, T2D는 더 짧은 예상 수명에 연관된다. 이 질환은 세계적으로 3억 명 이상의 사람에게 영향을 미치며 연간 백만 건 이상의 사망으로 이어진다. 유전적 결정요인 및 환경적 요인이 모두 질환 발생으로 이어지며, 비만, 신체적 무활동 및 노화가 일차적 원인으로 여겨진다(Kahn et al. (2006), Nature 444(7121): 840-846).
T2D에 대한 현재 치료에는 생활습관 관리(식사 및 운동) 및 약리적 개입, 예컨대 인슐린을 방출하기 위한 췌장 자극 또는 인슐린 반응 증가에 의해 혈중 글루코오스 수준을 감소시키기 위한 메트포르민 및 인슐린 공급이 포함된다. 이들 치료는 당뇨병의 증상 개선에 기반하며, 그 결과 내구성이 없다. 실제로, 이용 가능한 치료 중 어느 것도 hIAPP 응집 및 췌장 β-세포 손실을 상쇄하는 것으로 나타나지 않았다. 글루카곤-펩티드 1(GLP-1)의 유사체(Butler et al. (2009), Diabetologia 53(1): 1-6) 및 GLP-1 불활성화 효소 디펩티딜-펩티다제 4(DDP4)의 저해제가 관여되는 새로운 치료 전략은 GLP-1의 강력한 인슐린 자극 효과 및 β-세포 증식을 증강시키는 그 효과에 기반한다. 중요하게는, 증가된 인슐린 방출이 또한 증가된 아밀린 방출에 커플링된다. 실험적으로, 자극된 인슐린 분비는 동물 모델에서 섬 아밀로이드증의 발생을 촉진하는 것으로 나타났고, 인간에서도 유사한 효과가 예상될 수 있다(Aston-Mourney et al. (2011), Diabetologia 54(7): 1756-1765). 따라서 이들 치료는 잠재적으로 섬 아밀로이드증을 악화시킬 수 있다. 보다 최근의 유망한 전략에는 IL-1β 경로를 표적화하는 소염 약물 또는 항체의 개발을 포함한다(Donath et al. (2008), Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 4(5): 240-241; Ehes et al. (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(33): 13998-14003; Owyang et al. (2010), Endocrinology 151(6): 2515-2527; Dinarello et al. (2010), Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17(4): 314-321; Boni-Schnetzler et al. (2011), J. Clin. Endocrinol. Metab. 93(10): 4065-4074; Boni-Schnetzler et al. (2012), Br. J. Clin. Pharmacol.; Cavelti-Weder et al. (2012), Diabetes Care). 중요하게 주지할 것은 최근 연구에서 hIAPP가 특이적으로 인플라마좀(inflammasome) - IL-1β 시스템을 유도하여 선천성 면역계의 활성화를 야기함으로써, hIAPP 응집을 표적화하는 치료 전략을 지지함을 보여준다는 것이다(Masters et al. (2010), Nat. Immunol. 11(10): 897-904; Mandrup-Poulsen et al. (2010), Nat. Immunol. 11(10): 881-883).
이러한 발견은 hIAPP 및/또는 프로IAPP를 표적화하는 능동 또는 수동 면역치료법 접근에 연관된 잠재적 이익을 강조한다.
위 내용을 요약하면, 유효하고 안전한 치료법으로 응집된 hIAPP, 프로IAPP 단백질 및/또는 hIAPP 올리고머 및/또는 섬유를 해결하는 신규한 치료 전략이 긴급히 요구된다.
진화적으로 최적화되고 인간 면역계에 의해 친화도 성숙된 인간 항체를 이용한 수동 면역화는 뛰어난 유효성 및 안전성에 대한 높은 개연성을 가지고 유망한 신규 치료 방법을 제공할 것이다.
본 발명은 천연 항-hIAPP 특이적 인간 모노클로날 항체의 단리를 위해 건강한 인간 대상체의 hIAPP-특이적 면역 반응을 이용한다. 특히, 본 발명에 따라 수행된 실험은 건강한 인간 대상체 풀(pool)로부터 또는 T2D가 발생할 위험이 증강되고, 항체 단리 시에는 T2D의 징후를 나타내지 않은 비만 환자 및 다른 환자군 풀로부터 모노클로날 hIAPP 및/또는 프로IAPP-특이적 항체의 단리에 성공적이었다.
따라서 본 발명은 IAPP 및/또는 프로IAPP를 특이적으로 인식할 수 있는 인간 항체, 항원-결합 단편 및 유사한 항원-결합 분자에 대한 것이다. 달리 나타내지 않는다면, "IAPP 및/또는 프로IAPP를 특이적으로 인식하는", "IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적인 항체" 및 "항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체"는 구체적이고 일반적이고 종합적으로 IAPP의 천연 단량체 형태에 대한 항체; IAPP의 프로IAPP 전구체 형태에 대한 항체; IAPP 및 프로IAPP 중 어느 한 형태에 특이적으로 결합하는 항체; 응집된, 올리고머, 섬유상 및/또는 비섬유상 IAPP 및/또는 프로IAPP 종에 결합하는 항체를 의미한다. 전장(full-length) 및/또는 응집된 형태, 예컨대 IAPP 및/또는 프로IAPP의 올리고머, 섬유상 및 비섬유상 응집된 형태에 선택적인 인간 항체가 제공된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같은 가변 영역 VH 및/또는 VL을 특징으로 하는 항체의 면역학적 결합 특징을 나타낸다.
항체의 항원-결합 단편은 단일쇄 Fv 단편, F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편, 또는 임의의 다른 항원-결합 단편일 수 있다. 아래의 특정 구현예에서, 항체 또는 이들의 단편은 인간 IgG 이소형(isotype) 항체이다. 대안적으로 항체는 키메라 인간-설치류 또는 설치류화된 항체, 예컨대 쥐과 또는 쥐과화된 항체, 래트 또는 래트화된 항체이며, 설치류 버전이 동물에서의 진단 방법 및 연구를 위해 특히 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이들의 활성 단편을 포함하는 조성물 및 IAPP에 관련된 장애, 예컨대 T2D의 예방, 진단 또는 치료에서 이러한 조성물을 이용하는 면역치료 및 면역진단 방법에 관한 것이며, 여기서 유효량의 조성물이 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
자연적으로, 본 발명은 아래 정의된 바와 같이 구별되고 독특한 특징을 갖는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편을 생산하는 불멸화된 인간 B 메모리 림프구 및 B 세포로 각각 연장된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 가변 영역은 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같은 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)을 포함한다.
따라서 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이를 이용해 형질전환된 숙주 세포뿐만 아니라 IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적인 항체 및 동등한 결합 분자의 생산을 위한 이들의 용도를 포괄한다. 항체 및 이들의 모사체의 재조합 생산을 위한 수단 및 방법뿐만 아니라 항체일 수도 항체가 아닐 수도 있는 결합 분자와의 경쟁을 위한 스크리닝 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 그러나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 특히 인간에서의 치료적 적용에 대해 본 발명의 항체는 상기 항체의 적용에서 다른 경우에는 키메라 및 심지어 인간화된 항체에 대해서도 관찰되는 상기 항체에 대한 면역 반응이 실질적으로 없다는 관점에서 인간 항체이다.
또한, 표본 중 및/또는 생체내 IAPP 및/또는 프로IAPP를 확인하기 위해 이용될 수 있는 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 개시된 항-IAPP 및/또는 프로IAPP 항체 또는 이들의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편은, 예를 들어 ELISA-기반 또는 표면 채택된 분석을 이용함으로써 표본 중 IAPP 및/또는 프로IAPP의 존재에 대해 인간 혈액, 혈장, 혈청, 침, 복수, 뇌척수액("CSF"), 및 소변을 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애의 진단 또는 진행 모니터링 방법에 관한 것이며, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 표본 중 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자로 결정하는 것을 포함하고, 여기서 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재는 장애를 시사한다.
또한, 본 발명의 한 구현예에서, 개시된 항-IAPP 및/또는 프로IAPP 항체 또는 이들의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편 및/또는 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자가 인간 또는 동물 신체에서 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 치료 및/또는 진단 제제의 생체내 검출(생체내 조영으로도 불림) 또는 표적화를 위한 조성물의 제조를 위해 제공된다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 IAPP와 관련되고, 예컨대 IAPP 및/또는 프로IAPP의 올리고머, 섬유상 및 비섬유상 응집된 형태의 발생을 특징으로 하는 장애, 예컨대 T2D 진단을 보조할 수 있고, 예를 들어 생체내 조영 관련된 진단 방법에서 대상체에 제공되는 치료법의 치료적 유효성 및 질환 진행을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서 본 발명의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자가 제공되며, 여기서 상기 생체내 검출(조영)은 양성자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 조영 또는 자기 공명 조영(MRI)을 포함한다.
따라서 섬유상 및/또는 비섬유상 올리고머 및/또는 응집된, IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환, 예컨대 2형 당뇨병(T2D)을 치료, 진단 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 특정한 목적이다. 이 방법은 대상체에 인간 항체 또는 항체 유도체의 유효 농도를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 IAPP 및/또는 프로IAPP를 표적으로 한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 에피토프를 갖는 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 상세한 설명 및 실시예에서 아래 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 이들의 개질된 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 추가적으로, 본 발명은 대상체에서 T2D 또는 T2D가 발생할 위험을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체의 생물학적 표본 중 상기 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 구현예는 하기 설명 및 실시예로부터 자명할 것이다.
2형 당뇨병(T2D)에서, 유전적 결정요인 및 환경적 요인이 인슐린 내성의 발생에 이어 정상 혈중 글루코오스 수준을 유지하기 위한 베타-세포 양 그리고 인슐린 및 아밀린(hIAPP) 분비의 보상적 증가를 야기한다. 생성되는 고농도 아밀린은 2형 당뇨병 환자의 90% 이상에서 발견되는 독성 인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(hIAPP) 올리고머의 형성 및 hIAPP 섬유 침적을 선호한다. hIAPP의 침적은 인슐린 생산 베타-세포의 감소에 연관되며, 또한 1형 당뇨병 개인으로 이식된 췌장 섬에서 β-세포의 손실에 역할을 담당하는 것으로 제안되었다. 건강한 공여자 또는 2형 당뇨병 위험이 높지만 질환이 없는 비만 공여자 풀로부터 몇몇 인간-유래 항체가 확인되었고, 국제 출원 WO2008/081008에 상세히 기재되고 본 명세서에 제공된 바와 같이 Neurimmune의 RTM™ 기술에 의해 시험관내 분석되고 클로닝되고 재조합적으로 생산되었다. 선도 후보물이 hIAPP를 발현하고 고지방 식이에 노출된 유전자삽입 마우스에서 검증된다. 치료 유효성은 췌장에서 베타-세포 양 및 hIAPP 아밀로이드 부하뿐만 아니라 hIAPP의 혈장 수준 결정, 그리고 글루코오스 대사 및 인슐린 분비의 기능 시험에 의해 평가된다.
2형 당뇨병은 당뇨병의 가장 일반적인 형태로, 전체 증례의 약 90%를 차지한다. 이 질환은 세계적으로 2억 명을 넘는 사람들에게 영향을 미쳐서 연간 당뇨병으로 백만 건을 넘는 사망이 일어난다. 스위스에서는 300,000명 이상의 환자가 영향을 받는다. 당뇨병의 유병률은 인구 성장, 노화, 도시화 및 증가하는 비만과 신체적 무활동의 우세로 인해 선진국 및 개발도상국에서 모두 극적으로 증가하고 있다. USD 250억에 달하는 세계적인 2형 당뇨병 시장은 2016년에는 USD 350억에 달할 것으로 예측되며, 화합물의 연간 성장률은 2009년과 2016년 사이에 6.4%이다. 현재 치료에는 식사 관리 및 인슐린 감수성의 개선 또는 인슐린을 방출하도록 하는 췌장의 자극에 의해 혈중 글루코오스 수준을 감소시키기 위한 상이한 경로에 작용하는 약리적 개입이 포함된다. 그러나 이용 가능한 치료 중 어느 것도 hIAPP의 응집 및 췌장 베타-세포의 손실을 상쇄시킬 수 없다. 2형 당뇨병에 대한 새로운 치료 전략에는 글루카곤-펩티드 1(GLP-1)의 유사체 및 내인성 GLP-1을 불활성화시키는 효소인 디펩티딜-펩티다아제 4(DPP 4)의 저해제가 관여된다. 이들 전략은 GLP-1의 강력한 인슐린 자극 효과 및 베타-세포 증식을 증강시키는 그 효과에 기반한다. 중요하게는 증가된 인슐린 방출이 또한 증가된 아밀린 방출에 커플링된다. 실험적으로, 자극된 인슐린 분비는 동물 모델에서 섬 아밀로이드증의 발생을 촉진하는 것으로 나타났으며, 유사한 효과가 인간에서 예상될 수 있다. 따라서 본 발명의 IAPP 결합 분자의 특정한 용도에 더하여 추가로 제안된 치료적 접근은 이들 분자 및 상기 나타낸 신규한 치료의 매력적인 조합 치료법일 수 있다.
Ⅰ. 정의
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 용어는 2000년 개정되고 2003년 재인쇄된 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, ISBN 0 19 850673 2]에서 제공되는 바와 같은 정의로 주어진다.
용어 "하나" 또는 "한"의 대상이 하나 이상의 대상을 나타내는 것이 주지된다; 예를 들어 "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나" (또는 "한"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
구체적으로 달리 나타내지 않는 한, 용어 "IAPP"는 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)의 천연 단량체, 올리고머, 비섬유상 및 섬유상 형태를 구체적으로 나타내기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 용어 "IAPP"는 또한 IAPP의 다른 이형태체(conformer), 예를 들어 IAPP의 올리고머 및/또는 응집체, 예컨대 IAPP-섬유를 일반적으로 나타내기 위해 이용된다. 용어 "IAPP"는 또한 모든 유형 및 형태의 IAPP를 종합적으로 나타내기 위해 이용된다. 용어 프로IAPP는 섬 아밀로이드 폴리펩티드의 전구체 펩티드(프로IAPP)의 천연 단량체, 올리고머, 섬유상 및/또는 응집된 형태를 구체적으로 나타내기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 용어 IAPP 또는 프로IAPP의 앞에 첨가된 문자는 특정 오르소로그가 유래된 개체를 나타내기 위해 이용된다, 예컨대 인간 IAPP에 대해서는 hIAPP 또는 쥐과 기원에 대해서는 mIAPP이다.
인간 IAPP에 대한 37개 아미노산의 아미노산 서열은 시스테인 잔기 2 내지 7 사이의 이황화 가교 및 아미드화된 C-말단을 갖는 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(서열번호 1)이다.
IAPP는 췌장 β-세포에서 생산된 89개 아미노산 전구체인 프리프로호르몬 프리프로IAPP로부터 가공된다. 인간 프리프로IAPP에 대한 단백질 서열은 MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(서열번호 2)이며, 이 서열은 관련 데이터베이스, 예컨대 UniProt 데이터베이스: UniProtID: P10997(IAPP_HUMAN)에서도 확인될 수 있다.
프리프로IAPP는 번역 후 신속하게 전-섬 아밀로이드 폴리펩티드로 절단된다. 인간 프로IAPP에 대한 단백질 서열은 TPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(서열번호 3)이고, 이것은 추가적인 단백질분해 및 번역 후 개질을 거쳐서 hIAPP를 생성한다.
"야생형" 또는 재조합 인간 IAPP, 프로IAPP 및 프리프로IAPP 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 3에 따라 전술한 서열로 나타낸다.
본 명세서에 개시된 인간 항-IAPP 및 항-프로IAPP 항체는 IAPP 및/또는 프로IAPP 및 이들의 에피토프에 그리고 IAPP 및/또는 프로IAPP 및 이들의 에피토프의 다양한 입체형태(conformation)에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 병리적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP 형태, 예컨대 비섬유상 올리고머 및/또는 섬유상 올리고머/섬유 및/또는 이들의 혼합 형태로 구성된 응집체에 특이적으로 결합하는 항체가 본 명세서에 개시된다. 용어 IAPP 및/또는 프로IAPP의 (병리적으로) 응집된/응집체는 전술한 형태를 구체적으로 나타내기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 본 명세서에서 이용되는 용어 (병리적) "응집된 형태" 또는 "응집체"는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 서로간 오류적/병리적 상호작용으로 인한 축적 또는 클러스터 형성 산물을 나타낸다. 이들 응집체, 축적 또는 클러스터 형태는 IAPP 및/또는 프로IAPP 모두 및 이들의 비섬유상 올리고머 및/또는 섬유상 올리고머 및 섬유이거나, 실질적으로 이로 구성되거나 또는 이로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 IAPP 및/또는 프로IAPP에 "특이적으로 결합하는", "선택적으로 결합하는", 또는 "우선적으로 결합하는" 항체에 대한 언급은 다른 미관련 단백질에 결합하지 않는 항체를 나타낸다. 한 예에서, 본 명세서에 개시된 IAPP 및/또는 프로IAPP 항체는 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 이들의 에피토프에 결합할 수 있고 다른 단백질에 대해 배경의 약 2배 이상의 결합을 나타내지 않는다. IAPP 및/또는 프로IAPP 이형태체에 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는" 항체는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 모든 입체형태에 결합하지 않는, 즉 적어도 하나의 다른 IAPP 및/또는 프로IAPP 이형태체에 결합하지 않는 항체를 나타낸다. 예를 들어, 시험관내 및 명백한 T2D를 갖거나 T2D가 발생할 위험을 갖는 환자로부터 수득된 조직에서 모두 IAPP 및/또는 프로IAPP의 응집된 형태에 우선적으로 결합할 수 있는 항체가 본 명세서에 개시된다. 본 발명의 인간 IAPP 및/또는 프로IAPP 항체는 건강한 인간 대상체 풀로부터 또는 T2D가 발생할 증강된 위험을 갖고 항체 단리시 T2D의 징후를 나타내지 않는 비만 환자 및 다른 환자군 풀로부터 단리되었고, IAPP 및/또는 프로IAPP 특이적 면역 반응을 나타내므로, 본 발명의 IAPP 및/또는 프로IAPP 항체는 또한 이들 항체가 대상체에 의해 실제로 발현되었으며 예를 들어 여태까지 인간 유사 항체를 제공하기 위해 시도하는 하나의 일반적인 방법으로 제시된 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리로부터 단리되지 않았음을 강조하기 위해 "인간 자가항체"로도 불릴 수 있다.
용어 "펩티드"는 그 의미 내에 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" (때때로 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용될 수 있음)을 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 단백질 및 폴리펩티드의 단편도 고려되며, 본 명세서에서 "펩티드"로 불릴 수 있다. 그럼에도 불구하고, 용어 "펩티드"는 바람직하게는 적어도 5개의 인접 아미노산, 바람직하게는 적어도 10개의 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 15개의 인접 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 20개의 인접 아미노산, 특히 바람직하게는 적어도 25개의 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체를 나타낸다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드는 전형적으로 100개 이하의 인접 아미노산, 바람직하게는 80개 이하의 인접 아미노산 및 보다 바람직하게는 50개 이하의 인접 아미노산을 갖는다.
폴리펩티드:
본 명세서에서 이용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드"도 포괄하려는 것이며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려져 있음)으로 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 나타내며 특정 길이의 산물을 나타내지는 않는다. 따라서 "펩티드", "디펩티드", "트리펩티드", "올리고펩티드", "단백질", "아미노산 사슬" 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내기 위해 이용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"가 임의의 이들 용어 대신에 또는 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화 및 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단 또는 비-천연 생성 아미노산에 의한 개질을 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 개질 산물을 나타내기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 원천에서 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 화학적 합성에 의한 것을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산의 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된 것으로 불리며, 정의된 3차원 구조를 보유하지 않고 다수의 상이한 입체형태를 채용할 수 있는 폴리펩티드는 폴딩되지 않은 것으로 불린다. 본 명세서에서 이용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄, 예컨대 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티(moiety)에 커플링된 단백질을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그 천연 환경에 있지 않는 폴리펩티드에 대한 것이다. 특정한 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그 천연 또는 자연 환경에서 제거될 수 있다. 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이, 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
"재조합 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질"은 재조합 DNA 기법에 의해 생산된, 즉 원하는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 외인성 재조합 DNA 발현 구축물(construct)에 의해 형질전환된 세포, 미생물 또는 포유류로부터 생산된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 대부분의 박테리아 배양에서 발현된 단백질 또는 펩티드에는 전형적으로 글리칸이 없을 것이다. 효모에서 발현된 단백질 또는 폴리펩티드는 포유류 세포에서 발현되는 것과 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합이 또한 포함된다. 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 천연 펩티드의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "충분히 유사한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통 구조 도메인 및/또는 공통 기능적 활성을 갖도록 제2 아미노산 서열에 대해 충분한 또는 최소 수의 동일하거나 동등한 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 공통 구조 도메인을 포함하는 아미노산 서열이 본 명세서에서 충분히 유사한 것으로 정의된다. 바람직하게는 변이체는 본 발명의 바람직한 펩티드, 특히 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 이들 중 어느 하나의 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체의 아미노산 서열과 충분히 유사할 것이다. 이러한 변이체는 일반적으로 본 발명의 펩티드의 기능적 활성을 보유한다. 변이체에는 하나 이상의 아미노산 결실(들), 부가(들), 및/또는 치환(들)에 의해 각각 천연 및 야생형 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 펩티드가 포함된다. 이들은 천연 생성 변이체뿐만 아니라 인공적으로 설계된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩티드를 언급할 때의 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 대응하는 천연 결합 분자, 항체, 또는 폴리펩티드의 적어도 일부 항원-결합 특성을 보유하는 임의의 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 단편에는 본 명세서에서 다른 곳에 논의된 특정 항체 단편에 부가하여 단백질분해 단편뿐만 아니라 결실 단편이 포함된다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체에는 상술된 바와 같은 단편, 및 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 변이체는 천연 생성되거나 천연 생성되지 않을 수 있다. 비-천연 생성 변이체는 본 기술분야에 공지된 돌연변이화 기법을 이용해서 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. IAPP 및/또는 프로IAPP 특이적 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드의 유도체는 천연 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가적 특징을 나타내기 위해 변형된 폴리펩티드이다. 예에는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본 명세서에서 "폴리펩티드 유사체"로 불릴 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 결합 분자 또는 이들의 단편, 항체, 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 기능적 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상체 폴리펩티드를 나타낸다. 또한 "유도체"로서 20가지 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 생성 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린에 대해 치환될 수 있고; 5-히드록시라이신이 라이신에 대해 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린이 세린에 대해 치환될 수 있고; 오르니틴이 라이신에 대해 치환될 수 있다.
분자의 유사성 및/또는 동일성의 결정:
두 펩티드 사이의 "유사성"은 한 펩티드의 아미노산 서열을 제2 펩티드의 서열과 비교하여 결정된다. 한 펩티드의 아미노산은 이것이 동일하거나 보존적 아미노산 치환인 경우, 제2 펩티드의 대응 아미노산과 유사하다. 보존적 치환에는 [Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), 및 Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785]에 기재된 것들이 포함된다. 예를 들어, 하기 군 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화 또는 치환을 나타낸다: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; 및 -Asp, Glu.
두 폴리뉴클레오티드 간의 "유사성"은 한 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열을 폴리뉴클레오티드의 서열과 비교하여 결정된다. 한 폴리뉴클레오티드의 핵산은 이것이 동일한 경우, 또는 핵산이 코딩 서열의 일부인 경우, 제2 폴리뉴클레오티드의 대응 핵산과 유사하며, 핵산을 포함하는 각각의 삼중자(triplet)가 동일한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환을 인코딩한다.
두 서열 사이의 동일성 또는 유사성 백분율의 결정은 바람직하게는 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877]의 수학적 알고리즘을 이용하여 달성된다. 이러한 알고리즘은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)에서 이용 가능한 [Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410]의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램에 도입된다.
동일성 또는 유사성 백분율 결정은 특정 길이 및 조성의 서열에 대해 NCBI 웹페이지 및 "BLAST 프로그램 선택 가이드"에서 권장되는 바와 같은 BLASTn 및 BLASTp 프로그램의 표준 파라미터로 수행된다.
BLAST 폴리뉴클레오티드 검색은 BLASTn 프로그램으로 수행된다.
일반 파라미터에 있어서, "최대 표적 서열" 박스는 100으로 설정될 수 있고, "단축 쿼리" 박스가 확인될 수 있고, "예상 역치" 박스는 1,000으로 설정될 수 있고 "워드 크기" 박스는 NCBI 웹페이지에서 짧은 서열(20개 염기 이하)에 대해 권장된 바와 같이 7로 설정될 수 있다. 더 긴 서열에 있어서, "예상 역치" 박스는 10으로 설정될 수 있고 "워드 크기" 박스는 11로 설정될 수 있다. 스코어링 파라미터에 있어서, "매치/미스매치 스코어"는 1, -2로 설정될 수 있고, "갭 코스트" 박스는 선형으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터에 있어서, "저복잡성 영역" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "종-특이적 반복" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "순람표만 마스크" 박스가 확인될 수 있고, "DUST 필터 설정"이 확인될 수 있고 "소문자 마스크" 박스가 확인되지 않을 수 있다. 일반적으로 "짧고 거의 정확한 매치에 대한 검색"을 이에 대해 이용할 수 있고, 이는 상기 나타낸 설정을 대부분 제공한다. 이에 대한 추가 정보는 NCBI 웹페이지에 공개된 "BLAST 프로그램 선택 가이드"에서 확인할 수 있다.
BLAST 단백질 검색은 BLASTp 프로그램으로 수행된다. 일반 파라미터에 있어서, "최대 표적 서열" 박스는 100으로 설정될 수 있고, "단축 쿼리" 박스가 확인될 수 있고, "예상 역치" 박스가 10으로 설정될 수 있고 "워드 크기" 박스가 "3"으로 설정될 수 있다. 스코어링 파라미터에 있어서, "매트릭스" 박스는 "BLOSUM62"로 설정될 수 있고, "갭 코스트" 박스는 "존재: 11 연장: 1"로 설정될 수 있고, "조성 조정" 박스는 "조건부 조성 스코어 매트릭스 조정"으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터에 있어서, "저복잡성 영역" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "순람표만 마스크" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "소문자 마스크" 박스가 확인되지 않을 수 있다.
예컨대, 검색된 서열 길이에 대한 두 프로그램의 개질은 NCBI 웹페이지에서 HTML 및 PDF 버전으로 공개된 "BLAST 프로그램 선택 가이드"에서의 권장사항에 따라 수행된다.
폴리뉴클레오티드:
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포괄하려는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예컨대 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합(예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예컨대 폴리뉴클레오티드에 존재하는 DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA에 대한 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유된 항체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예에는 이종성 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체가 포함된다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에는 합성적으로 생산된 분자가 추가로 포함된다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종료자이거나 이를 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 이용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산 부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 측면 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종료자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 둘 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예컨대 단일 벡터 상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예컨대 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수도 있고, 또는 둘 이상의 코딩 영역을 함유할 수도 있으며, 예컨대 단일 벡터가 별도로 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역에는 비제한적으로 특화된 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능 도메인이 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드에는 보통 하나 이상의 코딩 영역에 작동가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소가 포함될 수 있다. 작동가능한 연관은 유전자 산물, 예컨대 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 배치하기 위한 방식으로 하나 이상의 조절 서열에 연관되는 경우이다. 두 DNA 단편(예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 이에 연관된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA 전사를 일으키는 경우 그리고 두 DNA 단편 사이의 연결의 성질은 발현 조절 서열이 유전자 산물의 발현을 지시하는 능력을 방해하거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 연관된" 또는 "작동가능하게 연결된" 것이다. 따라서 프로모터 영역은 프로모터가 핵산의 전사를 일으킬 수 있는 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 소정 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 작동유전자, 억제유전자 및 전사 종료 신호가 세포-특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본 명세서에 개시된다.
다양한 전사 제어 영역이 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 더불어 최조기 발현 프로모터), 원숭이 바이러스 40(조기 발현 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편이 포함된다. 다른 전사 제어 영역에는 척추동물 유전자, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈에서 유래된 것들뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 추가적인 적합한 전사 제어 영역에는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예컨대, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)가 포함된다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 피코나바이러스에서 유래된 요소(특히 CITE 서열로도 불리는 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES)가 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 형태이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가적인 코딩 영역에 연관될 수 있으며, 이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 지시한다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 조면 소포체를 통한 성장하는 단백질 사슬의 외수송이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 이것이 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩티드를 생산하는 것을 알고 있다. 특정 구현예에서, 천연 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 이에 작동가능하게 연관된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 그 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이들의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 "결합 분자"는 주로 항체, 및 이들의 단편에 관련되지만, 또한 비제한적으로 호르몬, 수용체, 리간드, 주조직 적합 복합체(MHC) 분자, 샤페론, 예컨대 열 충격 단백질(HSP)뿐만 아니라 세포-세포 접착 분자, 예컨대 카드헤린, 인테그린, C-형 렉틴 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP에 결합하는 다른 비-항체 분자를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 범위를 제한하지 않고 오직 명확성을 위해, 하기 구현예의 대부분은 치료 및 진단 제제의 개발을 위해 바람직한 결합 분자를 나타내는 항체 및 항체-유사 분자에 대해 논의된다.
항체:
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하며, 보통 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP-결합 분자이다. 척추동물계에서 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다; 예컨대, [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)] 참조.
아래에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하고 넓은 범위의 폴리펩티드 클래스를 포함한다. 본 기술분야의 기술자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며 이들 중 일부 서브클래스가 있음(예컨대, γ1-γ4)을 이해할 것이다. 항체의 "클래스", 예컨대 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE를 결정하는 것은 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 서브클래스(이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 분석되어 있고, 기능적 특화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형 각각의 개질된 버전은 본 개시의 관점에서 본 기술분야의 기술자가 쉽게 식별할 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내이다. 모든 면역글로불린 클래스가 명확히 본 발명의 범위 내이며, 하기 설명은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대해 주어질 것이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 약 23,000 달톤의 두 동일한 경쇄 폴리펩티드 및 분자량 53,000-70,000의 두 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개 사슬은 전형적으로 경쇄가 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속 중쇄를 감싸 넣는 "Y" 배치로 이황화 결합에 의해 연결된다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄에 결합될 수 있다. 일반적으로 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 이황화 연결에 의해 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 비공유 연결에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배치의 포크형 말단의 N-말단부터 각 사슬 저부의 C-말단으로 진행된다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조 영역 및 기능적 상동성으로 구분된다. 용어 "불변(constant)" 및 "가변(variable)"은 기능적으로 이용된다. 이와 관련해서, 두 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반통과 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례 상, 불변 영역 도메인의 번호지정은 이들이 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 서브세트가 조합하여 3차원 항원-결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 팔의 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH 및 VL 사슬 상에서 세 CDR에 의해 정의된다. IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적으로 결합하기 충분한 구조를 함유하는 임의의 항체 또는 면역글로불린 단편은 본 명세서에서 "결합 단편" 또는 "면역특이적 단편"으로 상호 교환적으로 표시된다.
천연 생성 항체에서, 항체는 때때로 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 6개의 고가변 영역을 포함하며, 이는 항체가 수성 환경에서 그 3차원 배치를 취할 때 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 배치되는 아미노산의 짧은 비인접 서열이다. "CDR"에는 더 작은 분자간 변동성을 나타내는 4개의 비교적 보존된 "골격" 영역 또는 "FR"이 측면에 있다. 골격 영역은 크게는 β-시트 입체형태를 채용하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서 골격 영역은 사슬 사이의 비공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR의 배치를 제공하는 골격을 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상에서 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 상기 상보적 표면은 그 인지체 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 골격 영역을 포함하는 아미노산이 정확히 정의되었으므로 본 기술분야의 통상의 기술자는 이를 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 쉽게 확인될 수 있다; 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917] 참조.
본 기술분야에서 이용되거나 및/또는 허용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우, 본 명세서에서 이용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하려는 것이다. 구체예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 확인되는 비인접 항원 조합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 이용이다. 상기 특정 영역은 본 명세서에 참조로 포함된 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917]에 기재되었으며, 여기서 정의에는 서로에 대해 비교되는 경우 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이들의 변이체의 CDR을 나타내기 위한 어느 정의의 적용도 본 명세서에서 정의되고 이용된 바와 같은 용어의 범위 내인 것으로 의도된다. 상기 언급된 각각의 참고문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 아래 표 1에 나타낸다. 특정 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 어느 잔기가 항체의 주어진 가변 영역 아미노산 서열에 대해 항체의 인간 IgG 서브타입의 특정한 고가변 영역 또는 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1에서 모든 CDR 정의의 번호지정은 Kabat et al. (아래 참조)에 나타낸 번호지정 관례에 따른다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호지정 시스템을 정의하였다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 서열 자체를 넘는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 도메인 서열에 대해 상기 "Kabat 번호지정" 시스템을 모호하지 않게 지정할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 "Kabat 번호지정"은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 번호지정 시스템을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호지정에 대한 언급은 Kabat 번호지정 시스템을 따르지만, 이는 이론적인 것이며 본 발명의 모든 항체에 동일하게 적용되지 않을 수 있다. 예를 들어, 제1 CDR의 위치에 따라 이후 CDR이 어느 방향으로든 이동될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 면역특이적 단편, 변이체, 또는 이들의 유도체에는 비제한적으로 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 쥐과화된 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 이황화-연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편 및 항-개별특이형(항-Id) 항체(예컨대, 본 명세서에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체)가 포함된다. ScFv 분자는 본 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 US 특허 5,892,019에 기재된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 5가 구조를 갖는 IgM 또는 이들의 유도체가 아니다. 특히 본 발명의 특정 적용, 특히 치료적 이용에서, IgM의 5가 구조 및 친화도 성숙 부재로 인해 IgM은 종종 비특이적 교차 반응성 및 매우 낮은 친화도를 나타내므로, IgM은 IgG 및 다른 2가 항체 또는 대응하는 결합 분자에 비해 덜 유용하다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체가 아니며, 즉 혈장 면역글로불린 표본으로부터 수득된 혼합물이기 보다는 실질적으로 하나의 특정 항체종으로 구성된다.
단일쇄 항체를 포함하는 항체 단편은 단독으로 또는 하기의 전부 또는 일부와의 조합으로 가변 영역(들)을 포함할 수 있다: 힌지(hinge) 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의의 조합을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 또는 이들의 면역특이적 단편은 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원에서 유래될 수 있다. 바람직하게는 항체는 인간, 쥐과, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마, 말 또는 닭 항체이다. 다른 구현예에서, 가변 영역은 기원(예컨대, 상어)에서 콘드릭토이드(condricthoid)일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 인간으로부터 단리된 인간 모노클로날 항체이다. 선택적으로, 인간 항체의 골격 영역은 데이터베이스에서 관련 인간 생식 계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고 채택된다; 예컨대, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅되는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 참조. 예를 들어, 실제 생식 계열 서열에서 잠재적으로 일탈한 것으로 간주되는 아미노산은 클로닝 절차 동안 도입된 PCR 프라이머 서열에 기인할 수 있다. 인공적으로 생성된 인간-유사 항체, 예컨대 파지 디스플레이된 항체 라이브러리 또는 이종발생 마우스로부터의 단일쇄 항체 단편(scFv)에 비해, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 (ⅰ) 동물 대리물에서에 비해 인간 면역 반응을 이용하여 수득됨, 즉 항체가 인체에서 그 관련 입체형태로 천연 IAPP 또는 프로IAPP에 반응하여 생성되었음, (ⅱ) IAPP 및/또는 프로IAPP의 존재 하에 개인을 보호했거나 적어도 유의미함, 및 (ⅲ) 항체가 인간 기원이므로, 자가 항원에 대한 교차 반응성 위험이 최소화됨을 특징으로 한다. 따라서 본 발명에 따르면, 용어 "인간 모노클로날 항체", "인간 모노클로날 자가항체", "인간 항체" 등은 인간 기원인, 즉 인간 세포, 예컨대 B 세포 또는 이들의 하이브리도마로부터 단리되었거나 그 cDNA가 인간 세포, 예를 들어 인간 메모리 B 세포의 mRNA로부터 직접 클로닝된 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자를 표시하기 위해 이용된다. 인간 항체는 항체에서 아미노산 치환이, 예컨대 결합 특징을 개선하기 위해 수행된 경우에도 여전히 "인간"이다.
인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 유전자삽입되고 아래 및 예를 들어 US 특허 번호 5,939,598(Kucherlapati et al.)에 기재된 바와 같이 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 유래된 항체는 본 발명의 실제 인간 항체로부터 이들을 구별하기 위해 인간-유사 항체로 표시된다.
예를 들어, 인간-유사 항체, 예컨대 파지 디스플레이로부터 전형적으로 단리된 합성 및 반-합성 항체의 중쇄 및 경쇄의 페어링이 원래 인간 B 세포에서 일어난 것과 같은 원래 페어링을 반드시 반영하지는 않는다. 따라서 본 기술분야에서 일반적으로 이용된 바와 같은 재조합 발현 라이브러리로부터 수득된 Fab 및 scFv 단편은 면역원성 및 안정성에 대한 모든 가능한 연관 효과를 갖는 인공적인 것으로 간주될 수 있다.
대조적으로 본 발명은 선택된 인간 대상체로부터 단리된 친화도-성숙된 항체를 제공하며, 이는 인간에서 이들의 치료적 유용성 및 이들의 내성을 특징으로 한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "설치류화된 항체" 또는 "설치류화된 면역글로불린"은 본 발명의 인간 항체로부터 하나 이상의 CDR; 및 설치류 항체 서열에 기반한 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 함유하는 인간 골격 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. 설치류를 참조하면, 바람직하게는 마우스 및 래트에서 기원하는 서열이 이용되며, 여기서 상기 서열을 포함하는 항체는 각각 "쥐과화된" 또는 "래트화된" 것으로 불린다. CDR을 제공하는 인간 면역글로불린은 "부모" 또는 "수신체"로 불리며, 골격 변화를 제공하는 설치류 항체는 "공여체"로 불린다. 불변 영역이 존재할 필요는 없지만, 존재하는 경우 보통 설치류 항체 불변 영역과 실질적으로 동일하며, 즉 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일하다. 따라서 일부 구현예에서, 전장 쥐과화된 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 마우스 불변 영역, 인간 CDR, 및 여러 "쥐과화" 아미노산 치환을 갖는 실질적으로 인간 골격을 함유한다. 전형적으로 "쥐과화된 항체"는 쥐과화된 가변 경쇄 및/또는 쥐과화된 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 쥐과화된 항체는, 예컨대 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비-마우스이므로 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않을 것이다. "쥐과화" 절차에 의해 "쥐과화된" 개질된 항체는 CDR을 제공하는 부모 항체와 동일한 항원에 결합하고, 보통 부모 항체에 비해 마우스에서 면역원성이 더 적다. "쥐과화된" 항체에 대한 상기 설명은 "설치류화된" 항체, 예컨대 "래트화된 항체"에 대해서도 유사하게 적용되며, 여기서 래트 서열이 쥐과 대신 이용된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "중쇄 부분"에는 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지(예컨대, 상부, 중앙, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 변이체 또는 단편. 예를 들어, 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드에는 적어도 일부 CH2 도메인(예컨대, CH2 도메인의 전부 또는 일부)이 없을 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 본 기술분야의 통상의 기술자는 이들 도메인(예컨대, 중쇄 부분)이 천연 생성 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열과 다르도록 개질될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 개시된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩티드 사슬에서와 동일하다. 대안적으로, 본 발명의 중쇄 부분-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는, 예를 들어 이중특이적 항체 또는 디아바디를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 단일 폴리펩티드 사슬, 예컨대 scFv로 이루어지며, 가능한 생체내 치료 및 진단 적용을 위해 세포내에서 발현된다(인트라바디).
본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 그리고 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 그리고 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "경쇄 부분"에는 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 적어도 하나의 VL 또는 CL 도메인을 포함한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4개 내지 5개 아미노산으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 바람직하게는 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 9개, 가장 바람직하게는 적어도 약 15개 내지 약 30개 아미노산을 함유한다. CDR이 그 3차 형태로 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있으므로, 에피토프를 포함하는 아미노산이 인접할 필요는 없고, 일부 경우에는 심지어 동일한 펩티드 사슬 상에 있지 않을 수도 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 IAPP 또는 프로IAPP의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 인접 또는 비-인접 아미노산 서열을 함유한다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는 "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적으로 인식하는"은 일반적으로 결합 분자, 예컨대 항체가 그 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합이 항원-결합 도메인 및 에피토프 간의 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 이것이 무작위 미관련 에피토프에 결합하는 것에 비해 더 쉽게 그 항원-결합 도메인을 통해 해당 에피토프에 쉽게 결합하는 경우, 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 것으로 불린다. 용어 "특이성"은 본 명세서에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정량하기 위해 이용된다. 예를 들어, 항체 "A"가 항체 "B"에 비해 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 가지는 것으로 간주될 수도 있고, 또는 항체 "A"가 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것에 비해 더 높은 특이성을 갖고 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항체의 항원과의 다른 결합 특징은 그 모든 문법 형태에서 항체의 특이성, 친화도, 교차 반응성 및 다른 결합 특징을 나타낸다.
"우선적으로 결합하는"이란 결합 분자, 예컨대 항체가 관련된, 유사한, 상동성 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차 반응할 수 있는 경우라도, 관련된 에피토프에 비해 해당 에피토프에 더 잘 결합할 것이다.
비제한적 예로서, 결합 분자, 예컨대 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 작은 해리 상수(KD)로 상기 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 한 단위 크기가 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 2 단위가 작은 크기의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
다른 비제한적 예에서, 결합 분자, 예컨대 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 작은 오프율(k(off))로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 한 단위가 작은 크기의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 2 단위가 작은 크기의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에 개시된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 5×10-2초-1, 10-2초-1, 5×10-3초-1 또는 10-3초-1 이하의 오프율(k(off))로 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 이들의 단편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 항체는 5×10-4초-1, 10-4초-1, 5×10-5초-1, 또는 10-5초-1 5×10-6초-1, 10-6초-1, 5×10-7초-1 또는 10-7초-1 이하의 오프율(k(off))로 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 이들의 단편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
본 명세서에 개시된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 103M-1초-1, 5×103M-1초-1, 104M-1초-1 또는 5×104M-1초-1 이상의 속도(k(on))로 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 이들의 단편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 105M-1초-1, 5×105M-1초-1, 106M-1초-1, 또는 5×106M-1초-1 또는 107M-1초-1 이상의 속도(k(on))로 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 이들의 단편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
결합 분자, 예컨대 항체는 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 해당 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대해 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 불린다. 경쟁적 저해는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대해 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해하는 것으로 불릴 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "친화도"는 결합 분자, 예컨대 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 척도를 나타낸다; 예컨대, [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), pages 27-28] 참조. 본 명세서에서 이용되는 용어 "결합력"은 면역글로불린 모집단 및 항원 사이의 복합체의 전체적 안정성, 즉 항원과 면역글로불린 혼합물의 기능적 조합 강도를 나타낸다; 예컨대, [Harlow, pages 29-34] 참조. 결합력은 특정 에피토프와 모집단 내 개별 면역글로불린 분자의 친화도 및 또한 항원과 면역글로불린의 가수에 모두 관련된다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체 및 고도 반복 에피토프 구조, 예컨대 중합체를 갖는 항원 간의 상호작용이 높은 결합력 중 하나일 것이다. 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다: 예를 들어 [Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)], 및 본 명세서에 기재된 방법 참조. 항원에 대한 항체의 친화도 측정을 위한 일반 기법에는 ELISA, RIA, 및 표면 플라즈몬 공명이 포함된다. 특정한 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예컨대 염 농도, pH 하에 측정되는 경우, 변할 수 있다. 따라서 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예컨대 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 표준화된 항체 및 항원 용액 및 표준화된 완충액으로 수행된다.
본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 이들의 교차 반응성의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "교차 반응성"은 한 항원에 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력; 두 상이한 항원 물질 간의 관련성 척도를 나타낸다. 따라서 항체는 이것이 그 형태를 유도한 것과 다른 에피토프에 결합하는 경우, 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 여러 상보적 구조 특징을 함유하며, 일부 경우 실제로 원래보다 더 잘 맞을 수도 있다.
예를 들어, 특정 항체는 이들이 관련되었지만 동일하지 않은 에피토프, 예컨대 기준 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성(본 기술분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서 어느 정도 교차 반응성을 갖는다. 항체는 이것이 기준 에피토프에 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 및 50% 이하 동일성(본 기술분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않는 경우 교차 반응성이 적거나 없는 것으로 불릴 수 있다. 항체는 이것이 임의의 다른 유사체, 오르소로그, 또는 해당 에피토프의 상동체에 결합하지 않는 경우, 특정 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 이들의 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는 5×10-2M, 10-2M, 5×10-3M, 10-3M, 5×10-4M, 10-4M, 5×10-5M, 10-5M, 5×10-6M, 10-6M, 5×10-7M, 10-7M, 5×10-8M, 10-8M, 5×10-9M, 10-9M, 5×10-10M, 10-10M, 5×10-11M, 10-11M, 5×10-12M, 10-12M, 5×10-13M, 10-13M, 5×10-14M, 10-14M, 5×10-15M, 또는 10-15M 이하의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
이전에 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 널리 공지되어 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "VH 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함되며, 용어 "CH1 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 제1(최아미노 말단) 불변 영역 도메인이 포함된다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "CH2 도메인"에는 통상적인 번호지정 방식을 이용해서 항체의 잔기 약 244 내지 잔기 360으로 연장되는 중쇄 분자 부분이 포함된다(잔기 244 내지 360, Kabat 번호지정 시스템; 및 잔기 231-340, EU 번호지정 시스템; Kabat EA et al., op. cit 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접히 페어링되지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려 두 N-연관된 분기쇄 탄수화물 사슬이 온전한 천연 IgG 분자의 두 CH2 도메인 사이에 배치된다. 또한 CH3 도메인은 CH2 도메인으로부터 IgG 분자의 C-말단으로 연장되며 약 108개 잔기를 포함하는 것이 잘 보고되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "힌지 영역"에는 CH1 도메인을 CH2 도메인으로 연결하는 중쇄 분자 부분이 포함된다. 상기 힌지 영역은 약 25개 잔기를 포함하며 가요성이므로, 두 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 힌지 영역은 3 개별 도메인: 상부, 중앙, 및 하부 힌지 도메인으로 하위 구분될 수 있다; [Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083-4090] 참조.
본 명세서에서 이용되는 용어 "이황화 결합"에는 두 황 원자 간에 형성된 공유 결합이 포함된다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 이황화 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 천연 생성 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연결되며, 두 중쇄는 Kabat 번호지정 시스템을 이용해서 239 내지 242(위치 226 또는 229, EU 번호지정 시스템)에 대응하는 위치에서 두 이황화 결합에 의해 연결된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 교환적으로 이용된다. 이들 용어는 화학적 콘주게이션(conjugation) 또는 재조합 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해서든 둘 이상의 요소 또는 성분을 함께 연결하는 것을 나타낸다. "틀내 융합(in-frame fusion)"은 원래 ORF(open reading frame)의 정확한 번역 해독틀을 유지하는 방식으로 연속적이고 더 긴 ORF를 형성하기 위한 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 개방 해독틀(ORF)의 연결을 나타낸다. 따라서 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대응하는 둘 이상의 절편(이 절편이 보통 자연적으로 이렇게 연결되지 않음)을 함유하는 단일 단백질이다. 따라서 해독틀은 융합된 절편을 통해 연속적으로 제조되지만, 절편은 예를 들어 틀내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 틀내 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속적 폴리펩티드의 일부로 공-번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로불린 골격 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학 물질, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 절차를 나타낸다. 이 절차에는 비제한적으로 유전자 녹다운뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현 모두를 포함하는, 세포 내에서 유전자의 기능적 존재의 임의의 표시가 포함된다. 이는 비제한적으로 유전자의 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 작은 헤어핀(small hairpin) RNA(shRNA), 작은 간섭(small interfering) RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사 및 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역이 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학 물질인 경우, 발현에는 해당 생화학 물질 및 임의의 전구체의 생성이 포함된다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본 명세서에서 이용되는 유전자 산물은 핵산, 예컨대 유전자의 전사에 의해 생산되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 산물에는 전사 후 개질, 예컨대 폴리아데닐화를 갖는 핵산 또는 번역 후 개질, 예컨대 메틸화, 글리코실화, 지질 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 연관, 단백질분해 절단 등을 갖는 폴리펩티드가 추가로 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "표본"은 대상체 또는 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 물질을 나타낸다. 한 측면에서, 표본은 혈액, 복수, CSF, 침 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 표본은 전혈, 혈장, 혈청, 혈액 표본에서 농축된 B 세포 및 배양된 세포(예컨대, 대상체로부터의 B 세포)를 포함할 수 있다. 표본에는 또한 생검 또는 신경 조직을 포함하는 조직 표본이 포함될 수 있다. 다른 측면에서, 표본은 전체 세포 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다. 혈액 표본은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 수집될 수 있다. 한 측면에서, 펠렛은 200㎕ 완충액(20mM Tris, pH 7.5, 0.5% Nonidet, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.1M NaCl, 1× Sigma 프로테아제 저해제, 및 1× Sigma 포스파타아제 저해제 1 및 2) 중 4℃에서 볼텍싱(vortexing)에 의해 재현탁될 수 있다. 현탁액은 간헐적 볼텍싱과 함께 20분 동안 얼음 상에 유지될 수 있다. 약 4℃에서 5분 동안 15,000×g로 회전시킨 뒤 상청액의 분취물을 약 -70℃에 보관할 수 있다.
질환:
달리 언급되지 않는 한, 용어 "장애(disorder)" 및 "질환(disease)"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되며, 대상체, 동물, 단리된 기관, 조직 또는 세포/세포 배양에서 임의의 원하지 않는 생리적 변화를 포함한다.
T2D에서, 유전적 결정요인 및 환경적 요인은 인슐린 내성의 발생에 이어 정상 혈중 글루코오스 수준을 유지하기 위해 베타-세포 양 그리고 인슐린 및 아밀린(hIAPP) 분비의 보상적 증가를 야기한다. 생성되는 고농도 아밀린은 T2D 환자의 90% 이상에서 발견되는 독성 hIAPP 올리고머의 형성 및 hIAPP 섬유의 침적을 선호한다. hIAPP의 침적은 인슐린 생산 베타-세포의 감소에 연관되며, 또한 T1D가 있는 개인으로 이식된 췌장 섬에서 β-세포의 손실에 역할을 담당하는 것으로 제시되었다. 본 출원은 건강한 공여자 또는 T2D의 위험이 높지만 질환이 없는 비만 공여자 풀로부터의 몇몇 인간-유래 항체를 제공하며, 이는 아래에서 본 명세서에 더 상세히 기재된 바와 같이 클로닝되고 재조합적으로 생산되었다.
그러나, 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 항체, 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 1형 당뇨병(T1D), 임신 당뇨병, 전-당뇨병, 성인의 잠복 자가면역 당뇨병(LADA; 1,5형 당뇨병) 및/또는 2형 당뇨병(T2D)을 포함하는 당뇨병 질환군으로부터 질환의 예방적 및 치료적 처치, 진행 또는 치료에 대한 반응 모니터링 및/또는 진단을 위한 약학적 또는 진단 조성물의 제조를 위해 이용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 일반적으로 증상, 예컨대 췌장에 대한 손상을 유도하고 이에 따라 만성 췌장염, 낭성 섬유증, 췌장암을 포함하는 당뇨병으로 이어질 수 있는 질환을 포함하는 T2D에 선행, 유도, 및/또는 이에 결합/연관되거나 연결된 대사성 변화를 특징으로 하는 장애군; 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환을 포함하는 T2D의 위험을 증가시키는 질환에서; 및/또는 비만 및 T2D에 연결되거나 연결되지 않은 심혈관 질환에서 예방적 및 치료적 처치, 진행 또는 치료에 대한 반응 모니터링 및/또는 진단을 위한 약학적 또는 진단 조성물의 제조를 위해 이용된다. 한 바람직한 구현예에서, 일반적으로 전술한 질환을 특징으로 하는 증상은 대상체에서 교란된 인슐린 감수성 및 인슐린 및/또는 hIAPP의 증가된 분비를 포함한다.
한 구현예에서, 장애군에 연관된 전술한 특정 증상은 임신 당뇨병, 전-당뇨병(고혈당증이 T2D 역치 또는 인슐린 내성에 도달하지 않은 경우); 일반적으로 당뇨병이 발생하기 위한 위험 요인으로 또는 기존 당뇨병이 존재할 수 있는 조건으로서의 대사 증후군; 일반적으로 당뇨병이 발생하기 위한 위험 요인으로 또는 기존 당뇨병이 존재할 수 있는 조건으로서의 섬 아밀로이드증; 일반적으로 당뇨병이 발생하기 위한 위험 요인으로 또는 기존 당뇨병 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 베타-세포 부전이 존재할 수 있는 조건으로서의 비만을 포함한다.
또한, 본 발명의 항체, 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 변화된, 즉 1형 당뇨병의 감별 진단에서 건강한 대상체에서의 아밀린 분비에 비해 증가되거나 감소된 아밀린 분비, T2D 형태에 대비한 성인의 잠복 자가면역 당뇨병(LADA, 1,5형 당뇨병), 또는 명백한 T2D에 선행하는 장애, 예컨대 임신 당뇨병 또는 전-당뇨병에서; 췌장에 손상을 유도하고 이에 따라 당뇨병을 일으킬 수 있는 질환, 예컨대 만성 췌장염, 낭성 섬유증, 췌장암에서; T2D의 위험을 증가시키는 질환, 예컨대 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환에서; 및/또는 비만 및 T2D에 연결되거나 연결되지 않은 심혈관 질환에서 검출을 위한 조성물의 제조를 위해 이용된다.
장애, 예컨대 비만 및 인슐린 내성/고인슐린혈증은 종종 T2D의 명백한 형태에 앞서 이미 상승된 수준의 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)로 이어질 수 있는 T2D의 소인 및/또는 증상으로 관찰된다. 아밀린(hIAPP) 올리고머, 섬유, 및 플라크는 췌장 및 신장 내에서뿐만 아니라 비만 및 인슐린 내성이 있는 환자에서 심장 내에 축적하는 것으로 확인되었다. 상기 축적은 다시 이러한 환자에서 심장 기능부전에 기여할 수 있는 변형된 세포 Ca2 + 항상성과 연계되어 관찰되었다.
따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체, 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 T2D에 뒤따르거나 T2D에 선행하거나 및/또는 유도하는 대사성 변화, 즉 전-당뇨병 상태에서 일어나는 대사성 변화로부터 일어나는 장애군의 예방적 및 치료적 처치, 완화, 진행 또는 치료에 대한 반응의 모니터링 및/또는 진단을 위한 약학적 또는 진단 조성물의 제조를 위해 이용되며, 여기서 장애군은 심장 질환, 뇌졸중, 당뇨병성 망막병증, 신장 부전, 신부전, 케토산증 및 비케토산 고삼투압성 혼수를 포함한다.
20가지 이상의 신경변성 장애(예컨대, [M. Ristow, J. Mol. Med 82 (2004), 510-529]에서 페이지 511의 표 1 참조)가 당뇨병, 증가된 인슐린 내성 및 비만, 교란된 인슐린 감수성 및 과도하거나 손상된 인슐린 분비에 연관되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 항체, 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 알츠하이머 질환(AD), 모세관 확장실조(AT), 바르데-비에들(Bardet-Biedl) 증후군(BBS), 프리드리히 실조(FRDA), 헌팅턴 질환, 근육긴장 위축, 기면증, 파킨슨 질환, 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군, 및 워너(Werner) 증후군을 포함하는 신경변성 장애의 예방적 및 치료적 처치, 진행 또는 치료에 대한 반응 모니터링 및/또는 진단을 위한 약학적 또는 진단 조성물의 제조를 위해 이용된다.
손상된 글루코오스 내성은 당뇨병에 대한 특징인 합병증을 거의 유도하지 않지만, 정상 유형에 비해 더 높은 당뇨병 개시 위험을 가지며, 이는 거대혈관 질환에 대한 원인일 수 있다.
"인슐린 내성"은 인슐린에 대해 감소된 감수성 상태를 의미한다. 인슐린은 글루코오스 대사에 대한 효과에 부가하여 더 넓은 범위의 효과, 예컨대 지질 대사에 대한 효과 또는 혈관 및 신장에 대한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 일단 인슐린에 대한 감수성이 감소되면, 혈관 또는 신장에 대한 인슐린 효과의 장애로서 글루코오스 대사 장애뿐만 아니라 지질 대사 장애, 예컨대 고트리글리세리드혈증, 감소된 HDL 혈장 수준, 또는 고혈압이 유도될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "당뇨병"은 인간에서 일반적으로 그리고 현재 무작위 혈장 또는 혈중 글루코오스 농도≥200㎎/㎗(≥11.1m㏖/L) 또는 공복 혈장 글루코오스≥126㎎/㎗(≥7.0m㏖/L) 또는 경구 글루코오스 내성 시험 동안 2시간 로딩 후 글루코오스≥200㎎/㎗(≥11.1m㏖/L)를 의미한다. 부가적으로 또는 대안적으로 용어 "당뇨병"은 증가된 갈증(다음증), 빈뇨(다뇨증), 과도한 배고픔, 설명되지 않는 체중 손실, 피로 및 번진 시야, 느리게 낫는 상처에 대한 취약성 및 방광, 질 및 잇몸에 대한 것들 및/또는 침착된 피부 영역(흑색가시세포증)을 포함하는 빈번한 감염을 포함하는 당뇨병의 하나 이상의 임상적 증상을 나타내는 대상체에 대해 이용된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "비당뇨병"은 인간에서 일반적으로 그리고 현재 공복 혈장 글루코오스 수준 <100㎎/㎗(5.6m㏖/㎗) 또는 경구 글루코오스 내성 시험 동안 2시간 부하 후 글루코오스 <140㎎/㎗(<7.8m㏖/㎗)를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "전-당뇨병"은 인간에서 일반적으로 그리고 현재 공복 혈장 글루코오스 수준 100-125㎎/㎗(5.6-6.9m㏖/L) 또는 경구 글루코오스 내성 시험 동안 2시간 부하 후 글루코오스 140-199㎎/L(7.8-11.1m㏖/L)을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "전-당뇨병", "전구기" 및 "전증상"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되며 T2D의 전임상기를 설명한다.
부가적으로 또는 대안적으로 글리코실화 헤모글로빈(HbA1c) 수준은 대상체에서 당뇨병 진단에 이용될 수 있다. 역치 6.5% 이상의 상승된 HbA1c 수준에서 당뇨병이 진단되며, 즉 용어 "당뇨병"이 일반적으로 그리고 현재 인간에서 이용되는 반면, 5.7% 내지 6.4% 수준은 당뇨병 및 심혈관 질환 모두가 발생할 높은 위험을 나타내고 인간에서 "전-당뇨병" 또는 "전-당뇨병/전증상" 상태의 마커이다. 인간에서 용어 "비당뇨병"은 일반적으로 그리고 현재 역치 5.7% 이하의 HbA1c 수준을 의미한다.
약물 탐색에서의 Ⅱ형 당뇨병의 설치류 모델
Ⅱ형 당뇨병을 자연 발생시키는 통상적으로 보고된 동물 모델의 예에는 KK-Ay 마우스(Nishimura M., Exp. Anim. 18, 147-157, 1969), NSY 마우스(Ueda H., et al., Diabetologia 38, 503-508, 1995), db/db 마우스(Hummel K. P., et al., Science 153, 1127-1128, 1966), ob/ob 마우스(Herberg L. & Kley H K, Horm. Metab. Res. 7, 410-5, 1975), 및 AKITA 마우스(Yoshioka M., et al., Diabetes 46, 887-894, 1997)가 포함된다.
이들 동물 중, KK-Ay 마우스 및 NSY 마우스는 비만이 있는 모델이고, db/db 마우스 및 ob/ob 마우스는 렙틴 수용체 또는 렙틴 생산의 장애로 인해 비만이 있는 모델이다. 반면, AKITA 마우스는 췌장 β 세포에서 장애로 야기되는 당뇨병에 대한 모델이다.
비-비만 Ⅱ형 당뇨병 모델 동물로, 예를 들어 모델 마우스가 일본 특허 출원 번호 2004-65181에 보고되어 있다. 상기 마우스는 비정상적인 인슐린 분비를 나타낸다.
그러나 본 발명의 항체는 바람직하게는 유전자삽입 동물, 예컨대 hIAPP를 발현하는 설치류, 예컨대 [Butler et al., Diabetes 53 (2004), 1509-1516 및 Matveyenko and Butler, Diabetes 55 (2006), 2106-2114]에 기재된 바와 같은 췌장 β-세포(HIP 래트)에서 인간 아밀린에 대해 유전자삽입된 래트가 시험되고 분석된다. 보다 바람직하게는 인간 IAPP를 과발현하는 2형 당뇨병 마우스 모델이 [Matveyenko and Butler (2006), ILAR J. 47(3): 225-233]에 기재되고 여기서 페이지 228의 표 2에 요약된 바와 같이 이용된다. hIAPP-과발현으로 인해, 이러한 모델 동물은 T2D-증상, 예컨대 고혈당 상태를 유효하게 나타낸다. 일반적으로 용어 "고혈당증" 또는 "고혈당 상태"는 상이한 시간 간격에 채취되고 비-유전자삽입 대조군 한배 새끼에 비교되는 경우, 두 연속 측정에서 유의미하게 증가된 공복 혈장 글루코오스 수준을 나타낸다. 고혈당 동물에서 측정된 절대값은 이용된 특정 동물 모델에 의존할 수 있다, 예컨대 h-IAPP(반접합체)/ob/+ 마우스에서는 ≥∼15-20mM 글루코오스; h-IAPP(동종접합)/FVB/N 마우스에서는 ≥∼11mM 글루코오스이다.
당뇨병을 연구하기 위한 방법에는 건강한 비당뇨병 동물에 비해 당뇨병의 혈액 또는 혈장의 생리적 변화 측정 및 분석이 포함된다. 이들 측정에는 비제한적으로 성장 역학, 체질량 지수(BMI), 마른 체중 지수(LMI), 음식 및 물 섭취, 성별 차이, 공복 및 무작위 혈중 글루코오스, 트리글리세리드(TG), 지단백질, 콜레스테롤, 간 중량 및 간 지질, 신장 크기 및 기능, 글루코오스 내성 시험(GTT), 인슐린 내성 시험(ITT), 혈중 인슐린 농도, 췌장 섬 세포 형태, 고지방 식이 및 칼로리 제한이 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "무작위" 및 "비-공복"은 일반적으로 최종 식사 후 시간과 무관하게 낮 또는 밤 동안의 임의의 시간을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "공복"은 일반적으로 적어도 12시간 동안 칼로리 섭취가 없음을 의미한다.
이들 정의는 현재 수용되는 가이드라인임이 이해되며, 개업의는 일반적으로 미국 당뇨병 학회(ADA) 및 독일 당뇨병 학회(GDA)에 따른다. 가이드라인은 시간에 따라 변할 수 있고, 지역 또는 국가에 따라 변하며, 본 기술분야의 기술자에게 공지된 가이드라인을 제공하는 그룹 또는 기관(예컨대, ADA, 세계 보건 기구, NIDDK/NIH, CDC, GDA et al.)에 의존할 수 있다. 의사는 또한 임상 경험, 환자의 과거 의료 이력 및/또는 진단 또는 치료 결정 시의 다른 정보를 이용할 수 있다. 따라서 이들 정의는 과학 및 의학에서의 진보에 따라 경시적으로 변할 수 있다.
치료:
본 명세서에서 이용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 당뇨병의 발생을 예방하거나 완화(경감)시키는 것이다. 유익하거나 원하는 임상적 결과에는 비제한적으로 검출 가능하건 검출 불가능하건, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 진정(부분적이건 전체적이건)이 포함된다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 대비한 생존의 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들에는 이미 상태 또는 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 상태 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 상태 또는 장애의 발현이 예방되어야 하는 자들이 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "약물", "의약" 또는 "약제"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되며, 비제한적으로 모든 (A) 내용 또는 외용을 위한, 인간 또는 다른 동물의 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방을 위해 이용되기 위한 물품, 의약 및 제조물 및 임의의 물질 또는 물질의 혼합물; 및 (B) 인간 또는 다른 동물의 신체 구조 또는 임의의 기능에 영향을 미치기 위한 물품, 의약 및 제조물(음식 이외); 및 (C) 조항 (A) 및 (B)에 명시된 임의의 물품의 성분으로 이용하기 위한 물품이 포함되어야 한다. 용어 "약물", "의약" 또는 "약제"에는 충전제, 붕해제, 윤활제, 활택제, 결합제로서 하나 이상의 "제제", "화합물", "물질" 또는 "(화학적) 조성물"을 또는 일부 다른 맥락에서는 다른 약학적 불활성 부형제를 함유하거나 인간 또는 다른 동물의 신체 내의 의도하는 표적 위치, 예컨대 피부, 위 또는 내장에서 "약물", "의약" 또는 "약제"의 용이한 수송, 붕해, 분해, 용해 및 생물학적 이용 가능성을 보장하는 인간 또는 다른 동물에서의 이용을 위한 제조물의 전체 제형물이 포함되어야 한다. 용어 "제제", "화합물", 또는 "물질"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되며, 보다 구체적인 맥락에서는 비제한적으로 모든 약리 활성 제제, 즉 원하는 생물학적 또는 약리적 효과를 유도하거나 본 발명의 방법에 의해 이러한 가능한 약리적 효과를 유도할 가능성에 대해 연구되거나 평가되는 제제가 포함되어야 한다.
"대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 그에 대한 진단, 예진, 예방, 또는 치료법을 원하는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예컨대 인간 환자를 의미한다.
약학적 담체 :
약학적으로 허용가능한 담체 및 투여 경로는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 해당 문헌에서 취해질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들어 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols. 2nd Edition by Robinson et al., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2nd Edition by Taylor and Francis (2006), ISBN: 0-8493-1630-8] 참조. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 널리 공지되어 있고 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식으로 시행될 수 있다. 예에는 경구, 비강내, 직장, 국소, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경피, 수막내 및 두개내 방법을 통한 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물의 투여가 포함된다. 에어로졸 제형, 예컨대 비강 스프레이 제형에는 활성 제제의 정제된 수성 또는 다른 용액이 보존제 및 등장화제와 함께 포함된다. 이러한 제형은 바람직하게는 비강 점막에 상용성인 pH 및 등장성 상태로 조정된다. 경구 투여를 위한 약학적 조성물, 예컨대 단일 도메인 항체 분자(예컨대, "nanobodies™") 등도 본 발명에서 고려된다. 이러한 경구 제형은 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고형 담체, 예컨대 젤라틴 또는 보강제를 포함할 수 있다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체와의 좌약으로 제공될 수 있다; 또한 [O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735] 참조. 다양한 투여 유형에 적합한 제형에 관한 추가 지침은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)] 및 해당 업데이트에서 찾아볼 수 있다. 약물 전달을 위한 방법의 간략한 리뷰에 대해서는 [Langer, Science 249 (1990), 1527-1533] 참조.
Ⅱ. 본 발명의 항체
본 발명은 일반적으로 인간 항-IAPP 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 이는 바람직하게는 실시예에 예시된 항체에 대해 개요된 바와 같은 면역학적 결합 특징 및/또는 생물학적 특성을 나타낸다. 본 발명에 따르면, IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적인 인간 모노클로날 항체가 건강한 인간 대상체 풀로부터 클로닝되었다.
본 발명에 따라 수행된 실험 과정에서, 인간 메모리 B 세포 배양의 컨디셔닝된 배지 중의 항체가 응집된 올리고머, 섬유상 및/또는 비섬유상 IAPP 및/또는 프로IAPP 단백질-및 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 결합에 대해 병렬로 스크리닝되었다. 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP 단백질에 대해서만 양성이지만 BSA에 대해서는 양성이 아닌 B-세포 배양이 항체 클로닝의 대상이 되었다.
상기 측정으로 인해 몇몇 항체가 단리될 수 있었다. 선택된 항체는 클래스 및 경쇄 서브클래스 결정을 위해 추가 분석되었다. 이어서 메모리 B 세포 배양으로부터 선택된 관련 항체 메시지가 RT-PCR에 의해 전사되고, 클로닝되고, 재조합 생산을 위해 발현 벡터 내로 조합된다; 첨부된 실시예 참조. HEK293 또는 CHO 세포에서 인간 항체의 재조합 발현 및 인간 IAPP 및/또는 프로IAPP 단백질에 대한 이들의 결합 특이성의 후속 특징분석(도 3 및 도 4; 실시예 1), 및 이들의 병리적으로 응집된 형태에 대한 특유한 결합(도 5; 실시예 2)은 IAPP 및/또는 프로IAPP 단백질에 대해 고도로 특이적이고 IAPP 및/또는 프로IAPP 단백질의 병리적으로 응집된 형태, 예컨대 IAPP 섬유를 특유하게 인식하는 인간 항체가 최초로 클로닝되었음을 확인시켰다. 두 번째 라운드의 실험에서는 도 7a 내지 도 7d, 도 8, 도 9 및 실시예 4에 나타낸 바와 같은 상기 발견을 확인시켰다. 또한, 본 발명에 따라 생성되고 본 발명의 인간 항체의 CDR 도메인을 포함하는 마우스 키메라 항체는 인간 IAPP에 대해 도 11 및 도 12 그리고 실시예 6에 나타낸 바와 같은 인간 항체와 동일한 결합 친화도를 나타내었다.
따라서 본 발명은 일반적으로 단리된 천연 생성 인간 모노클로날 항-섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP) 항체 및 이들의 결합 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 한 구현예에서, 항체는 인간 IAPP 및/또는 프로IAPP에 결합할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.11B12, NI-203.205F8, NI-203.9B3, NI-203.19F2, 및 NI-203.15C7로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 IAPP의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프 맵핑은 본 발명의 항체 NI-203.19H8에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로 아미노산 19-SSNNFGA-25(서열번호 4)를 포함하는 인간 IAPP 내의 서열, 본 발명의 항체 NI-203.26C11에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로 아미노산 2-CNTATCA-8(서열번호 5)을 포함하는 인간 IAPP 내의 서열, 및 본 발명의 항체 NI-203.15C7에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로 아미노산 10-QRLANFLVHS-19(서열번호 71)를 포함하는 인간 IAPP 내의 서열을 확인하였다(도 5의 A 및 B 그리고 실시예 3 참조). 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체가 제공되며, 여기서 항체는 아미노산 서열 SSNNFGA(서열번호 4), CNTATCA(서열번호 5) 또는 QRLANFLVHS(서열번호 71)을 포함하는 IAPP 에피토프에 특이적으로 결합한다. 실시예 3에 상세히 기재된 바와 같이, 재조합 IAPP 항체 NI-203.9A2, NI-203.8E3, 및 NI-203.19F2 항체의 에피토프는 현재까지 확인할 수 없었으므로, 이들 항체가 아마도 비선형 에피토프에 결합한다는 것을 시사하였다.
또한 한 구현예에서, 본 발명은 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 항체 NI-203.1D10, NI-203.2A11, NI-203.10C4, NI-203.20H9, NI-203.26D2, NI-203.60H3 및 NI-203.26C11로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 프로IAPP의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또한, 실시예 4에 나타내고 도 7a 내지 도 7d에 나타낸 것과 같은 초기 실험 관찰에 구애받고자 하지 않고, 본 발명의 인간 모노클로날 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항-IAPP 항체는 바람직하게는 병리적 IAPP 응집체(상기 실시예에서는 섬유)에 특이적으로 결합하고 췌장에서 생리적 형태의 IAPP는 실질적으로 인식하지 않는 것을 특징으로 한다. 이는 인간 모노클로날 NI-203.19F2 및 NI-203.15C7 항-IAPP 항체에도 적용될 것으로 예상된다. 따라서 본 발명은 결합 특이성을 갖는 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체 세트를 제공하며, 따라서 특히 진단 및 치료 목적에 유용하다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 IAPP 및/또는 프로IAPP의 병리적으로 응집된 형태에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다(도 5, 도 7a 내지 도 7d, 도 8, 도 9, 그리고 실시예 2 및 실시예 4 참조). 본 발명의 결합 특이성에 대한 추가 상세내용 및 요약 개론에 대해서는 도 7a 내지 도 7d 및 도 8 그리고 아래 설명을 또한 참조.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2, 및 NI-203.15C7 항체의 결합 특성을 나타낸다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체는 특히 실시예 2 내지 실시예 4에 따라 분석되는 경우, 생리적 IAPP 및/또는 프로IAPP 단량체보다는 병리적으로 응집된 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP, 예컨대 IAPP 섬유를 우선적으로 인식한다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 생리적 IAPP를 실질적으로 인식하지 않는다. 용어 "실질적으로 인식하지 않는다"는 본 출원에서 항체, 이들의 단편 또는 특정 표적 분자, 항원 및/또는 표적 분자 및/또는 항원의 입체형태에 특이적인 결합 분자를 포함하는 그룹의 분자의 결합 친화도를 설명하기 위해 이용되는 경우, 전술한 그룹의 분자가 다른 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합하기 위한 전술한 그룹의 분자의 해리 상수(KD)에 비해 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 9배 더 작은 결합 친화도로 상기 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합함을 의미한다. 바람직하게는 용어 "실질적으로 인식하지 않는다"는 본 출원에서 이용되는 경우, 전술한 그룹의 분자가 다른 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합하기 위한 전술한 그룹의 상기 분자의 해리 상수(KD)에 비해 적어도 10배, 20배, 50배, 100배, 1,000배 또는 10,000배 이하인 결합 친화도로 상기 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합함을 의미한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체는 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP의 질환을 유도하는 응집된 형태, 특히 실시예 4에 기재된 것들에 결합한다. 상기 맥락에서, 결합 특이성은 도 4, 각각의 도 5에서 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체에 대해 나타낸 바와 같은 범위일 수 있으며, 즉 NI-203.19H8에 대해 나타낸 바와 같이 인간 IAPP에 대해 약 1pM 내지 500nM의 절반 최대 유효 농도(EC50), 바람직하게는 약 10pM 내지 100nM의 EC50, 가장 바람직하게는 약 100pM 내지 50nM의 EC50을, 또는 NI-203.9A2, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3에 대해 나타낸 바와 같이 인간 IAPP에 대해 약 100pM 내지 10nM의 EC50을 가질 수 있다. 상기 맥락에서, 실시예 4에 제공되고 도 4, 각각의 도 5에 나타낸 바와 같은 실험 결과는 또한 부가적으로 또는 대안적으로 본 발명의 일부 항-IAPP 항체가 예시적인 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.8E3에 대해 나타낸 바와 같이 프로IAPP를 실질적으로 인식하지 않음을 시사한다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 프로IAPP를 실질적으로 인식하지 않는다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-IAPP 항체는 특히 실시예 1에 기재된 바와 같이, 성숙 IAPP에 더하여 IAPP의 전구체 형태, 즉 프로IAPP에도 특이적으로 결합한다. 상기 맥락에서, 결합 특이성은 도 3, 각각의 도 4에서 예시적인 NI-203.26C11 항체에 대해 나타낸 바와 같은 범위일 수 있으며, 즉 NI-203.26C11에 대해 나타낸 바와 같이 응집된 프로-IAPP에 대해 약 1pM 내지 500nM의 절반 최대 유효 농도(EC50), 바람직하게는 약 10pM 내지 400nM의 EC50, 보다 바람직하게는 약 100pΜ 내지 400nM의 EC50 또는 약 100pM 내지 300nM의 EC50, 가장 바람직하게는 약 1nM 내지 300nM의 EC50을 가질 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-IAPP 항체는 특히 실시예 1에 기재된 바와 같이, 성숙 IAPP에 특이적으로 결합하며 IAPP의 전구체 형태, 즉 프로IAPP에는 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다. 상기 맥락에서, 결합 특이성은 도 4, 각각의 도 5에서 그리고 상기 나타낸 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.8E3 항체에 대해 나타낸 바와 같은 범위일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 예시적인 항체 NI-203.1D10, NI-203.2A11, NI-203.10C4, NI-203.20H9, NI-203.26D2 및 NI-203.60H3의 결합 특성, 바람직하게는 프로IAPP 대비 프로IAPP에 대한 결합을 나타낸다. 그러나 프로IAPP 항체는 아밀로이드 형성 및 세포사에서 전장 프로IAPP 펩티드에 비해 N-말단의 미가공된 프로IAPP의 역할에 대한 일부 증거가 있으므로, IAPP에 존재하지 않는 프로IAPP의 N-말단 측면 영역에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 스크리닝에 의해 수득되었다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항-프로IAPP 항체, 예컨대 예시적 항체 NI-203.1D10, NI-203.2A11, NI-203.10C4, NI-203.20H9, NI-203.26D2 및 NI-203.60H3은 IAPP에 실질적으로 결합하지 않거나 결합하지 않는다.
일부 정제된 항체는 광범위한 어레이의 생체분자, 예컨대 단백질에 결합한다. 본 기술분야의 기술자가 이해하는 바와 같이, 용어 특이적은 IAPP 및/또는 프로IAPP 단백질 또는 이들의 단편이 아닌 다른 생체분자가 항원-결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 중 하나에 특이적으로 결합하지 않음을 나타내기 위해 본 명세서에서 이용된다. 바람직하게는 IAPP 및/또는 프로IAPP 이외의 생체분자에 대한 결합 수준은 각각 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 친화도의 단지 최대 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하 또는 단지 1% 이하(즉 적어도 5, 10, 20, 50 또는 100배 더 낮음)인 결합 친화도를 일으킨다; 예컨대, 실시예 1 및 도 3 참조. 또한, 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체는 알츠하이머 질환으로 진단받은 환자의 파라핀-임베딩된 뇌 섹션에서 예시적 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11로 그리고 직접적 ELISA 실험에 의해 나타난 바와 같이, 본 발명의 항체가 알츠하이머 질환 인간 뇌에서 병리적 Αβ 아밀로이드를 인식하지 않으며 폴딩오류/응집 경향을 갖는 몇몇 단백질 후보에 단지 최소의 교차 반응성 결합 성질을 갖는다는 것을 나타내는 실험에 의해 검증된 바와 같이 IAPP 및/또는 프로IAPP 응집체에 특이적으로 결합한다; 실시예 5 및 도 10 참조. 따라서 한 구현예에서, 아밀로이드-β 펩티드(Αβ1-42)를 실질적으로 인식하지 않는 본 발명의 항체가 제공된다.
한 구현예에서, 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체는 바람직하게는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 응집된 형태, IAPP 및/또는 프로IAPP 섬유 및/또는 올리고머에 우선적으로 결합한다; 실시예 2에서의 직접적 ELISA에 의한 그리고 실시예 4에 기재되고 도 7a 내지 도 7d 및 도 9에 각각 나타낸 면역조직화학 염색에 의해 T2D로 진단받은 환자의 췌장에서 그리고 당뇨병 고양이 췌장 상에서의 실험 결과 참조. 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 응집된 형태에 우선적으로 결합하며, 여기서 응집체는 IAPP의 섬유상 형태 및/또는 섬유상 올리고머를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 바람직하게는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 응집된 형태에 우선적으로 결합하며, 여기서 응집체는 IAPP의 비섬유상 형태 및/또는 비섬유상 올리고머를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 응집된 형태에 우선적으로 결합하며, 여기서 응집체는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 섬유상 및 비섬유상 형태 및/또는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 섬유상 및 비섬유상 올리고머를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체는 천연 IAPP 및/또는 프로IAPP 및 IAPP 및/또는 프로IAPP의 병리적으로 응집된 형태에 우선적으로 결합한다; 직접적 ELISA에 의해 실시예 2 및 실시예 3에 예시된 바와 같은 실험 결과 참조.
전술한 바와 같이, IAPP 및/또는 프로IAPP를 포함하는 응집체는 또한 T2D 환자의 췌장 섬에서 아밀로이드 침적에 연관된 것으로 나타날 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 T2D의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체로 이어지며, 여기서 항체는 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.11B12, NI-203.205F8, NI-203.9B3, NI-203.19F2, NI-203.15C7, NI-203.1D10, NI-203.2A11, NI-203.10C4, NI-203.20H9, NI-203.26D2, 및 NI-203.60H3로 구성된 군으로부터 선택되는 항체와 동일한 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 이러한 몇몇 결합 분자, 예컨대 항체 및 이들의 결합 단편을 추가로 예시하며, 이는 이들의 가변 영역, 예컨대 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 도시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 VH 및/또는 VL 가변 영역의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)의 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 확인된 가변 영역을 인코딩하는 대응 뉴클레오티드 서열을 아래의 표 2에 각각의 표 3에 나타낸다. VH 및/또는 VL 영역의 상기 아미노산 서열의 CDR의 예시적인 세트를 도 1a 내지 도 1d 및 도 2a 내지 도 2c에 도시한다. 그러나 아래에서 논의되는 바와 같이, 본 기술분야의 기술자는 부가적으로 또는 대안적으로 도 1a 내지 도 1d에 각각의 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 이들의 아미노산 서열이 1, 2, 3 또는 CDR2 및 CDR3의 경우 더 많은 아미노산만큼 상이한 CDR이 이용될 수 있다는 사실을 잘 인지한다. 따라서 한 구현예에서, 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 하나 이상의 CDR을 그 가변 영역에 포함하는 본 발명의 항체 또는 이들의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편이 제공된다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중 임의의 하나이다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 인간 B-세포에 존재하는 것과 같은 중쇄 및 경쇄의 인지체 페어링의 보존을 특징으로 한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 유도체 또는 변이체이며, 이는 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체의 적어도 하나와 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
실시예 4에 제공된 실험 결과는 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체의 일부가 생리적 형태의 단백질에 비해 질환을 유도하는 응집된 형태의 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP에 우선적으로 결합함을 제시한다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 생리적 IAPP 및/또는 프로IAPP에 비해 IAPP 및/또는 프로IAPP 응집체를 우선적으로 인식한다. 또한 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 생리적 IAPP에 비해 IAPP 올리고머 및/또는 섬유를 포함하는 IAPP 응집체를 우선적으로 인식한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 생리적 IAPP에 비해 비섬유상 IAPP 및/또는 비섬유상 IAPP 올리고머를 포함하는 IAPP 응집체를 우선적으로 인식한다.
이전에 이미 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체의 일부는 IAPP 및 그 전구체 형태 프로IAPP에 모두 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 항체의 일부는 이들의 프로IAPP에 대한 결합능으로 인해 인간 환자로부터 단리되었다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 프로IAPP에 결합할 수 있다.
따라서 상기에 대안적으로 또는 부가적으로, 한 구현예에서 도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 하나 이상의 CDR을 그 가변 영역에 포함하는 본 발명의 항체 또는 이들의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편이 제공된다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중 임의의 하나이다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 인간 B-세포에 존재하는 것과 같은 중쇄 및 경쇄의 인지체 페어링의 보존을 특징으로 한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 유도체 또는 변이체이며, 이는 도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체의 적어도 하나와 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명의 항체는 인간, 특히 치료적 적용을 위한 것일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 특히 동물에서 진단 방법 및 연구에 유용한 설치류, 설치류화된 또는 키메라 설치류-인간 항체, 바람직하게는 쥐과, 쥐과화된 또는 키메라 쥐과-인간 항체 또는 래트, 래트화된 또는 키메라 래트-인간 항체이다. 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 키메라 설치류-인간 또는 설치류화된 항체이다.
또한 한 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 쥐과 키메라 항체의 결합 특성을 나타낸다. 또한 본 발명의 마우스 키메라 항체는 실시예 6에 기재된 바와 같이 인간 IAPP 섬유에 높은 친화도로 결합한다. 바람직하게는 키메라 항체의 결합 친화도는 이들의 인간 대응물과 유사하다. 상기 맥락에서, 결합 특이성은 실시예 6에 기재되고 도 11 및 여기에서 표 C에 나타낸 바와 같이 각각 18.6nM, 23.9nM 및 11.5nM의 EC50으로 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 쥐과 키메라 항체에 대해 나타낸 바와 같은 범위일 수 있다. BSA에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
한 구현예에서, 배양된 단일 또는 올리고클로날 B-세포의 배양에 의해 본 발명의 항체가 제공되며, 상기 B-세포에 의해 생산된 항체를 함유하는 배양 상청액이 내부의 항-IAPP 및/또는 프로IAPP 항체의 존재 및 친화도에 대해 스크리닝된다. 스크리닝 절차는 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열의 합성 전장 hIAPP 펩티드에서 유래된 hIAPP의 천연 단량체, 섬유상 또는 비섬유상 응집체, 예컨대 올리고머에 대한 결합에 대한 스크리닝; 및/또는 서열번호 7로 나타낸 아미노산 서열 TPIESHQVEKRKCNTATCATQR의 인간 프로IAPP(N-말단 단편)에서 유래된 합성 펩티드에 대한 결합에 대한 별도의 독립적인 스크리닝을 포함한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 항-IAPP 및/또는 프로IAPP 항체의 존재 및 친화도에 대한 스크리닝 절차는 감수성 조직 아밀로이드 플라크 면역반응성(TAPIR) 분석의 단계, 예컨대 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2004/095031에 기재되고 여기서 췌장 섬에서의 아밀로이드 침적에 대해 유사하게 수행되는 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항-IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 결합에 대한 췌장 섹션 상의 스크리닝, 예컨대 뇌 및 척추 섹션에 대한 국제 출원 WO2008/081008에 유사하게 기재된 스크리닝이 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 면역 반응시 그 생성으로 인해, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 특정한 병리적 관련성이 있고, 예를 들어 각각 마우스 모노클로날 항체의 생성 및 파지 디스플레이 라이브러리의 시험관내 스크리닝을 위한 면역화 절차의 경우 접근 가능하지 않거나 덜 면역원성일 수 있는 에피토프를 인식할 것이다. 따라서 본 발명의 인간 항-IAPP 및/또는 프로IAPP 항체의 에피토프가 독특하고 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합할 수 있는 다른 항체가 존재하지 않음을 명기하는 것이 신중하다; 또한 본 발명의 항체 NI-203.19H8 각각의 항체 NI-203.26C11의 독특한 에피토프를 나타내는 도 5의 A 참조. 본 발명의 항체의 고유성에 대한 추가 시사는 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 NI-203.9A2 및 NI-203.8E3이 IAPP 응집체의 추정 가능한 입체형태 에피토프에 결합한다는 점이며, 이는 상기 나타낸 바와 같이 특정한 병리적 관련성이 있고, 항체 생성을 위한 일반 절차, 예컨대 면역화 또는 시험관내 라이브러리 스크리닝에 의해 잘 수득가능하지 않을 수 있다.
따라서 한 구현예에서, 본 발명은 또한 일반적으로 IAPP에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 항-IAPP 항체 및 IAPP 결합 분자로 연장된다. 본 발명은 보다 특이적으로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것이며, 여기서 항체는 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2, 및 NI-203.15C7로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 IAPP의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또한 한 구현예에서, 본 발명은 또한 일반적으로 프로IAPP에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체 및 IAPP 및/또는 항-프로IAPP 결합 분자로 연장된다. 따라서 본 발명은 보다 구체적으로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것이며, 여기서 항체는 NI-203.1D10, NI-203.2A11, NI-203.10C4, NI-203.20H9, NI-203.26D2, NI-203.60H3 및 NI-203.26C11로 구성된 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 프로IAPP의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명은 또한 일반적으로 IAPP 및 프로IAPP 둘 다에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 이중특이적 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체 및 IAPP 및/또는 항-프로IAPP 결합 분자에 연장된다. 따라서 본 발명은 보다 구체적으로 또한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것이며, 여기서 항체는 예시적 항체 NI-203.26C11에서와 동일한 IAPP 및 프로IAPP의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 따라서 상기 관점에서, 한 구현예에서 본 발명은 또한 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 분자에 관한 것이다.
항체 간의 경쟁은 시험 하의 면역글로불린이 공통 항원, 예컨대 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정된다. 여러 유형의 경쟁적 결합 분석, 예를 들어 하기가 공지되어 있다: 고상 직접적 또는 간접적 방사선면역분석(RIA), 고상 직접적 또는 간접적 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석; [Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253] 참조; 고상 직접적 바이오틴-애비딘 EIA; [Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 및 Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552] 참조; 고상 직접적 표지 분석, 고상 직접적 표지 샌드위치 분석; [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조; I125 표지를 이용하는 고상 직접적 표지 RIA; [Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 및 Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82] 참조. 전형적으로 이러한 분석에는 정제된 IAPP 및/또는 프로IAPP 또는 응집체, 예컨대 이들 미표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린, 즉 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 보유하는 고형 표면 또는 세포에 결합된 이들의 올리고머 및/또는 섬유의 이용이 관여된다. 경쟁적 저해는 시험 면역글로불린의 존재 하에 고형 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양 결정에 의해 측정된다. 보통 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 바람직하게는 경쟁적 결합 분석은 첨부된 실시예에서 ELISA 분석에 대해 기재된 바와 같은 조건 하에 수행된다. 경쟁적 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)에는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 일어나도록 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 보통 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50% 또는 75% 저해할 것이다. 따라서 본 발명은 추가로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 IAPP에 대한 결합으로부터 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2, 및 NI-203.15C7로 구성된 군으로부터 선택된 기준 항체를 경쟁적으로 저해한다.
또한, 본 발명은 추가로 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 프로IAPP에 대한 결합으로부터 NI-203.1D10, NI-203.2A11, NI-203.10C4, NI-203.20H9, NI-203.26D2, NI-203.60H3 및 NI-203.26C11로 구성된 군으로부터 선택된 기준 항체를 경쟁적으로 저해한다.
또한 부가적으로 또는 대안적으로 본 발명은 추가로 이중특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 IAPP 및 프로IAPP에 대한 결합으로부터 기준 항체, 예컨대 예시적 항체 NI-203.26C11을 경쟁적으로 저해한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 하나 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 둘은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안적으로 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 각각 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 군에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 도 1a 내지 도 1d 및 도 2a 내지 도 2c가 Kabat 시스템에 의해 정의된 VH-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예컨대 Chothia 시스템에 의해 정의된 VH-CDR도 본 발명에 포함되며, 도 1a 내지 도 1d 및 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 데이터를 이용해서 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 임의의 한 VH-CDR에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산 치환을 제외하고는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 VL-CDR의 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR의 적어도 둘은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안적으로 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 각각 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 폴리펩티드에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 도 1a 내지 도 1d 및 도 2a 내지 도 2c가 Kabat 시스템에 의해 정의된 VL-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예컨대 Chothia 시스템에 의해 정의된 VL-CDR도 본 발명에 포함된다.
다른 구현예에서, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 각각 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 임의의 한 VL-CDR에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 각각 도 1a 내지 도 1d 또는 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
면역글로불린 또는 그 인코딩 cDNA는 추가 개질될 수 있다. 따라서 추가 구현예에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 쥐과화된 항체, 단일쇄 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 임의의 하나의 유사체의 생산 단계(들) 중 임의의 하나를 포함한다. 해당 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 예컨대 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988)]에 기재된다. 상기 항체의 유도체가 파지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 경우, BIAcore 시스템에서 채용된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명이 본 명세서에 기재된 항체의 임의의 하나에서와 동일한 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 키메라 항체의 생산은, 예를 들어 국제 출원 WO89/09622에 기재된다. 인간화된 항체의 생산 방법은, 예컨대 유럽 출원 EP-A1 0 239 400 및 국제 출원 WO90/07861에 기재된다. 본 발명에 따라 이용될 항체의 추가 원천은 소위 이종발생 항체이다. 이종발생 항체, 예컨대 마우스에서의 인간-유사 항체의 생산을 위한 일반 원칙은 예컨대 국제 출원 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO96/33735에 기재된다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 완전 항체에 더하여, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다; 예컨대, 국제 출원 WO88/09344 참조. 따라서 한 구현예에서, 단일쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 본 발명의 항체가 제공된다.
본 발명의 항체 또는 이들의 대응하는 면역글로불린 사슬(들)은 본 기술분야에 공지된 통상적 기법을 이용하여, 예를 들어 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 개질(들)을 단독으로 또는 조합으로 이용함으로써 추가 개질될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 근본이 되는 DNA 서열에 이러한 개질을 도입하기 위한 방법은 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다; 예컨대, [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)] 참조. 본 발명의 항체의 개질에는 아세틸화, 히드록실화, 메틸화, 아미드화 및 탄수화물 또는 지질 모이어티, 보조 인자의 부착 등을 포함하는 측쇄 개질, 골격 개질 및 N- 및 C-말단 개질을 포함하는 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화가 포함된다. 마찬가지로, 본 발명은 이종성 분자, 예컨대 카르복실 말단에서의 면역자극 리간드에 융합된 아미노 말단에 기재된 항체 또는 이들의 일부 단편을 포함하는 키메라 단백질의 생산을 포괄한다; 예컨대, 해당하는 기술적 세부사항에 대해서는 국제 출원 WO00/30680 참조.
추가적으로, 중쇄 CDR3(HCDR3)이 항원-항체 상호작용의 우선적 참여 및 더 큰 정도의 변동성을 갖는 영역임이 빈번하게 관찰되었으므로, 본 발명은 상술된 바와 같은 결합 분자를 함유하는, 예를 들어 전술한 항체 중 임의의 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히 중쇄의 CDR3을 함유하는 펩티드를 포괄한다. 이러한 펩티드는 쉽게 합성되거나 본 발명에 따라 유용한 결합 제제를 생산하기 위한 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 펩티드는, 예를 들어 시판되는 자동화된 펩티드 합성장치를 이용해서 합성될 수 있다. 펩티드는 또한 펩티드를 발현하는 DNA를 발현 벡터 내에 도입하고 세포를 펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터로 형질전환함으로써 재조합 기법에 의해 생산될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체에 대해 배향되고 전술한 특성을 나타내는, 즉 IAPP 및/또는 프로IAPP를 특이적으로 인식하는 임의의 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이들의 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 항체 및 결합 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ELISA 및 면역조직화학에 의해 이들의 결합 특이성 및 친화도에 대해 시험될 수 있으며, 예컨대 실시예 참조. 항체 및 결합 분자의 이러한 특징은 웨스턴 블롯으로도 시험될 수 있다. 본 발명에 따라 수행된 후속 실험의 예비 결과는 본 발명의 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체, 특히 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3이 ELISA 시험에서 IAPP-섬유에 차별적으로 결합할 수 있음을 드러내었다. 또한, 본 발명의 203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 티오S 및 콩고 레드 염색에 의해 가시화된 바와 같이 인간에서의 병리, 예컨대 병리적 IAPP 섬유에 대응하는 췌장 섬에서의 큰 아밀로이드 침적에 우선적으로 결합함을 나타내었다(도 7a 참조). 동일한 특성이 항체 NI-203.19F2 및 NI-203.15C7에도 적용될 것으로 예상된다.
인간 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11은 아밀로이드 양성 섹션 상에서 뚜렷한 췌장 섬 염색을 나타내었으나 아밀로이드 침적이 없는 T2D 환자 및 T2D로 진단받지 않은 대조군 환자로부터의 췌장 섬에서는 어떠한 염색도 나타내지 않았다(실시예 4 및 도 7a 내지 도 7d 참조). 본 발명의 항체는 또한 섬 아밀로이드 침적을 나타내는 당뇨병 고양이 췌장에서 양성 결과를 제공하였다; 도 9 참조. 인간 및 동물 조직에서 IAPP 및/또는 프로IAPP의 병리적 형태에 대한 상기 결합 특이성은 본 명세서에서 나타낸 생화학적 실험에 더하여(실시예 2 및 도 5 참조) 췌장에서 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 발생에 연관된 질환의 치료 및 진단에서 본 발명의 항체의 이용 가능성을 강조한다.
B 세포 또는 B 메모리 세포의 배양에서 직접 면역글로불린을 수득하기 위한 대안으로, 세포가 후속 발현 및/또는 유전적 조작을 위해 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자위의 원천으로 이용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA를 생산할 수 있다. 원하는 경우, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소형에 대한 것으로 교환되거나 모두 제거될 수 있다. 가변 영역이 단일쇄 Fv 영역을 인코딩하기 위해 연결될 수 있다. 다중 Fv 영역은 둘 이상의 표적에 대해 결합력을 부여하기 위해 연결될 수 있고, 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 채용될 수 있다. 유전 물질을 이용 가능한 경우, 원하는 표적에 결합하는 이들의 능력을 모두 보유하는 상술된 바와 같은 유사체의 설계가 수월하다. 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성을 위한 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 [Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792]에 기재되어 있다.
적절한 유전 물질이 수득되고 원하는 경우 유사체를 인코딩하기 위해 개질되면, 최소한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 것을 포함하는 코딩 서열이 표준 재조합 숙주 세포 내로 전달감염될 수 있는 벡터 상에 함유된 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다. 다양한 상기 숙주 세포가 이용될 수 있다: 그러나 효율적인 가공을 위해서는 포유류 세포가 바람직하다. 상기 목적을 위해 유용한 전형적인 포유류 세포주에는 비제한적으로 CHO 세포, HEK 293 세포, 또는 NSO 세포가 포함된다.
이어서 항체 또는 유사체의 생산은 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현을 위해 적절한 배양 조건 하에 개질된 재조합 숙주를 배양함으로써 수행된다. 이어서 항체는 이들을 배양으로부터 단리함으로써 회수된다. 발현 시스템은 바람직하게는 생성 항체가 배지 내로 분비되도록 신호 펩티드를 포함하게 설계된다; 그러나 세포내 생산도 가능하다.
상기에 따라, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 동등한 결합 분자를, 항체의 경우에는 바람직하게는 적어도 상술된 항체의 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
본 기술분야의 기술자는 상술된 가변 도메인을 갖는 항체의 가변 도메인이 원하는 특이성 및 생물학적 기능의 다른 폴리펩티드 또는 항체의 구축을 위해 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 또한 상술된 가변 도메인의 적어도 하나의 CDR을 포함하고 유리하게는 첨부된 실시예에 기재된 항체와 실질적으로 동일하거나 유사한 결합 특성을 갖는 폴리펩티드 및 항체를 포괄한다. 본 기술분야의 기술자는 결합 친화도가 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 부분적으로 중복되는 고가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) 내에서 또는 CDR 내에서 아미노산 치환을 수행하여 증강될 수 있음을 안다; 예컨대, [Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323-327] 참조. 따라서 본 발명은 또한 하나 이상의 전술한 CDR이 하나 이상의, 바람직하게는 둘 이하의 아미노산 치환을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 도 1a 내지 도 1d 또는 각각 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같은 가변 영역의 2개 또는 전체 3개의 CDR을 그 면역글로불린 사슬 중 하나 또는 둘 다에 포함한다.
본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 효과인자 기능을 매개하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 불변 영역에 대한 보체의 Cl 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화할 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하며, 자가면역 과민증에도 관여될 수 있다. 또한 항체는 Fc 영역을 통해 다양한 세포 상의 수용체에 결합하고, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(엡실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하는 상이한 항체 클래스에 특이적인 여러 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체 코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해(항체 의존적 세포 매개 세포독성 또는 ADCC로 불림), 염증 매개체의 방출, 태반 수송 및 면역글로불린 생산 제어를 포함하는 여러 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유발한다.
따라서 본 발명의 특정 구현예에는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체가 포함되며, 여기서 불변 영역 도메인의 하나 이상의 적어도 분획은 원하는 생화학적 특징, 예컨대 거의 동일한 면역원성의 전체 미변형된 항체에 비교되는 경우, 감소된 효과인자 기능, 비공유적으로 이량체화하는 능력, IAPP 및/또는 프로IAPP 응집 및 침적 부위에서의 증가된 편재 능력, 감소된 혈청 반감기 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하기 위해 결실되거나 달리 변형되었다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 특정 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하지만 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부가 없는 도메인 결실된 항체이다. 예를 들어 특정 항체에서, 개질된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 것이다, 예를 들어 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 특정 항체는 본 명세서에서 다른 곳에서 비글리코실화된 또는 "agly" 항체로 불리는 글리코실화를 제거하기 위해 변형된 불변 영역, 예컨대 IgG 중쇄 불변 영역을 갖는다. 이러한 "agly" 항체는 효소적으로 뿐만 아니라 불변 영역에서 공통 글리코실화 부위(들)의 조작에 의해 제조될 수 있다. 이론에 구애받지 않고, "agly" 항체는 생체내 개선된 안전성 및 안정성 프로필을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 원하는 효과인자 기능을 갖는 비글리코실화된 항체의 생산 방법은, 예를 들어 그 전문이 참조로 포함된 국제 출원 WO2005/018572에서 확인된다.
본 명세서에 기재된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 본 기술분야에 공지된 기법을 이용하여 효과인자 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 개질된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜서 IAPP 및/또는 프로IAPP 편재를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명에 일치하는 불변 영역 개질은 보체 결합을 완화하고 이에 따라 혈청 반감기 및 콘주게이트된 세포독소의 비특이적 연관을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 다른 개질이 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 증강된 편재를 허용하는 이황화 연결 또는 올리고당 모이어티를 개질하기 위해 이용될 수 있다. 개질의 생성되는 생리적 프로필, 생체이용률 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 IAPP 및/또는 프로IAPP 편재, 생체분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 널리 공지된 면역학적 기법을 이용하여 쉽게 측정되고 정량될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 예로서 Fcγ 수용체, LRP, 또는 Thy1 수용체를 통한 항체의 수용체-매개된 세포내 섭취를 증강시킴으로써, 또는 항체가 살아있는 세포에 해를 끼치지 않고 내부로 들어갈 수 있도록 한다는 'SuperAntibody 기술(Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241)에 의해 항체의 세포 섭취를 증가시키기 위해 대안적인 단백질 서열로 돌연변이되거나 교환될 수 있다. 예를 들어, IAPP 및/또는 프로IAPP에 결합하는 특이적 서열을 갖는 세포 표면 수용체 또는 이중- 또는 다중-특이적 항체뿐만 아니라 세포 표면 수용체의 인지체 단백질 리간드 및 항체 결합 영역의 융합 단백질의 생성은 본 기술분야에 공지된 기법을 이용하여 조작될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 대안적인 단백질 서열로 돌연변이되거나 교환될 수 있고, 또는 항체가 그 혈액 뇌 장벽 침투를 증가시키기 위해 화학적으로 개질될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 개질된 형태는 본 기술분야에 공지된 기법을 이용하여 전체 전구체 또는 부모 항체로부터 제조될 수 있다. 예시적인 기법은 본 명세서에서 보다 상세히 논의된다. 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본 기술분야에 공지된 기법을 이용해서 제조되거나 제작될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 분자 또는 이들의 단편은 "재조합적으로 생산되며", 즉 재조합 DNA 기술을 이용해서 생산된다. 항체 분자 또는 이들의 단편을 제조하기 위한 예시적인 기법은 본 명세서에서 다른 곳에서 보다 상세히 논의된다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에는 또한, 예컨대 공유 부착이 항체의 그 인지체 에피토프에 대한 특이적 결합을 방지하지 않도록 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 개질된 유도체가 포함된다. 비제한적으로 예를 들어, 항체 유도체에는, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 개질된 항체가 포함된다. 임의의 여러 화학적 개질이 비제한적으로 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로 유도체는 하나 이상의 비전통적인 아미노산을 함유할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 치료될 동물, 예컨대 인간에서 해로운 면역 반응을 일으키지 않을 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편은 환자, 예컨대 인간 환자로부터 유래되며, 이후 이들이 유래된 동일한 종, 예컨대 인간에서 해로운 면역 반응의 발생을 완화하거나 최소화하는데 이용된다.
탈면역화가 또한 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "탈면역화"에는 T 세포 에피토프를 개질하기 위한 항체의 변형이 포함된다; 예컨대, 국제 출원 W098/52976 및 WO00/34317 참조. 예를 들어, 출발 항체의 VH 및 VL 서열이 분석되고, 서열 내에서 상보성 결정 영역(CDR) 및 다른 주요 잔기에 대해 에피토프의 위치를 나타내는 각각의 V 영역으로부터 인간 T 세포 에피토프가 "맵핑"된다. T 세포 에피토프 지도로부터의 개별 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성 변형 위험이 낮은 대안적 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 다양한 대안적 VH 및 VL 서열이 설계되며, 이들 서열은 이후 다양한 결합 폴리펩티드, 예컨대 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에 이용하기 위한 IAPP 및/또는 프로IAPP-특이적 항체 또는 이들의 면역특이적 단편 내로 도입되고, 이어서 기능에 대해 시험된다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 생성되고 시험된다. 이어서 개질된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 전체 중쇄 및 경쇄 유전자가 발현 벡터 내로 클로닝되고, 이후 플라스미드가 전체 항체의 생산을 위해 세포주 내로 도입된다. 이어서 항체가 적절한 생화학적 및 생물학적 분석에서 비교되고, 최적 변이체가 확인된다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 이용을 포함하는 본 기술분야에 공지된 매우 다양한 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는, 예를 들어 이들의 전문이 참조로 포함된 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)]에 교시되고 본 기술분야에 공지된 것들을 포함하는 하이브리도마 기법을 이용해서 생산될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하여 단일 클론에서 유래된 항체를 나타내며, 이것이 생산된 방법을 나타내지 않는다. 따라서 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 엡스타인-바 바이러스로의 형질전환을 통해 불멸화된 인간 B 세포로부터 유래된다.
널리 공지된 하이브리도마 절차(Kohler et al., Nature 256 (1975), 495)에서, 상대적으로 짧게 생존하거나 유한한 포유류로부터의 림프구, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 대상체로부터 유래된 B 세포가 불멸 종양 세포주(예컨대, 골수종 세포주)와 융합되고, 이에 따라 불멸이고 B 세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생산한다. 생성되는 하이브리드는 선택, 희석 및 단일 항체의 형성을 위해 특정 유전자를 포함하는 각각의 개인 계통으로의 재성장에 의해 단일 유전 계통으로 분리된다. 이들은 항체를 생산하며, 이는 원하는 항원에 대해 동종성이고, 이들의 순수한 유전적 혈통에 대해 "모노클로날"로 불린다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지로 접종되고 성장된다. 본 기술분야의 기술자는 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 여러 공급원에서 시판되며, 표준화된 프로토콜이 잘 확립되어 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 원하는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 시험관내 분석, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역침전, 방사선면역분석(RIA) 또는 효소-연관된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정된다. 하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 것이 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다; 예컨대, [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)] 참조. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체가 통상적인 정제 절차, 예컨대 단백질-A, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 분리될 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
다른 구현예에서, 림프구가 마이크로조작에 의해 선택되고 가변 유전자가 단리될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵구는 면역화되거나 자연적으로 면역인 포유류, 예컨대 인간으로부터 단리되고, 시험관내에서 약 7일 동안 배양될 수 있다. 배양은 스크리닝 요건에 부합하는 특이적 IgG에 대해 스크리닝될 수 있다. 양성 웰로부터 세포가 단리될 수 있다. 개별 Ig-생산 B 세포는 FACS에 의해 또는 이들을 보체 매개된 용혈 플라크 분석에서 확인함으로써 단리될 수 있다. Ig-생산 B 세포가 튜브 내로 마이크로조작될 수 있고, VH 및 VL 유전자는, 예컨대 RT-PCR을 이용해서 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터 내로 클로닝되고 발현을 위해 세포(예컨대, 진핵 또는 원핵 세포)내로 전달감염될 수 있다.
대안적으로, 항체-생산 세포주는 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 기법을 이용해서 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기법은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 공보에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 아래 기재된 바와 같이 본 발명에서 이용하기 적합한 기법은 그 전문이 보충물을 포함하여 본 명세서에 참조로 포함되는 [Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기재된다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편이 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 효소, 예컨대 (Fab 단편을 생산하기 위한) 파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생산하기 위한) 펩신을 이용해서 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 이러한 단편은, 예를 들어 시약, 예컨대 방사선 동위원소를 검출하기 위해 면역글로불린의 면역특이적 부분의 커플링이 관여되는 면역진단 절차에서 이용하기에 충분하다.
인간 항체, 예컨대 본 명세서에 기재된 것은 인간 환자에서의 치료적 이용을 위해 특히 바람직하다. 본 발명의 인간 항체는, 예컨대 이들의 과체중 또는 비만이 대사성 장애, 예컨대 T2D의 발생 위험이 있는 것으로 추정될 수 있는 건강한 인간 대상체, 또는 장애가 있지만 일반적이지 않은 안정한 질환 경과 또는 일반적이지 않은 온화한 형태의 질환을 갖는 환자로부터 단리된다. 그러나 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같이 항체가 단리될 수 있는 대사성 장애, 예컨대 T2D가 발생할 위험이 있는 것으로 추정된 건강한 인간 대상체는 또한 개인에서 대사성 장애, 예컨대 T2D가 발생할 확률을 증강시키는 것으로 공지된 다른 위험의 존재에 기반하여 선택될 수도 있다. 상기 위험은 대사성 장애, 예컨대 T2D의 발생에 연관된 위험 요인, 예컨대 45세 이상; 과체중 또는 비만; 당뇨병이 있는 가까운 친척; 아프리카계 미국인, 알라스카 원주민, 미국계 인디언, 아시아계 미국인, 스페인/라틴계, 태평양 섬 미국인, 아시아인 또는 아라비아인의 가족 배경; 임신 당뇨병 이력; 체중이 4.5㎏ 이상인 적어도 한 자녀의 출산; 140/90 이상의 혈압; 정상 이상의 콜레스테롤 수준, 예컨대 40㎎/㎗ 이하(1mm/L 이하와 동등)의 고밀도 지단백질(HDL) 수준, 또는 200-499㎎/㎗(2.3-5.6 m㏖/L 이상과 동등) 이상의 트리글리세리드 수준; 좌식 생활습관; 다낭성 난소 증후군(PCOS)의 진단; 이전 평가에서 전-당뇨병의 진단-5.7 내지 6.4%의 A1C(HbA1c 또는 글리코해모글로빈으로도 불림) 수준, 손상된 공복 글루코오스(IFG), 또는 손상된 글루코오스 내성(IGT); 인슐린 내성에 연관된 다른 임상적 상태, 예컨대 흑색가시세포증의 진단; 심혈관 질환 이력에 대한 개인의 검사로부터 유추될 수 있다.
개인의 비만 또는 과체중이 개인에서 대사성 질환, 예컨대 T2D가 발생할 지표로 이용되는 경우, 비만이며 건강하며 증상이 없는 대상체가 각각, 예컨대 비만이지만 과체중으로 분류되지 않으므로 위험이 더 작은 것으로 또는 심지어 정상 체중의 개인으로 진단받은 대상체에 비해 보호성 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체를 더 규칙적으로 생성할 것으로 예상하는 것이 보다 신중하지만, 후자의 두 분류에 속하는 대상체도 본 발명의 인간 항체를 수득하기 원천으로 이용될 수 있다.
대상체는 대상체의 신장 및 체중 측정에 기반하여 그리고 하기 계산에 의해 대상체의 체질량 지수를 계산하여 정상 체중을 갖는 것으로, 과체중인 것으로 또는 비만인 것으로 분류될 수 있다: BMI=체중[㎏]/(신장[m])2. 결과에 기반하여, 대상체는 현재의 국제 보건 기구 기준(World Health Organization (2000) "Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a WHO consultation." World Health Organ Tech Rep Ser 894: 1.253)에 기반하여 정상 체중(BMI 18.5-24.9㎏/㎡), 과체중(25.0-29.9㎏/㎡), 또는 비만(≥30㎏/㎡)으로 분류된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 대상체의 허리 둘레(WC)가 측정되고 [InterAct Consortium, Langenberg et al., PLoS Med. 2012 Jun;9(6): e1001230]에 기재된 바와 같이 성별 특이적 컷오프에 기반하여 WC를 정상(남성에서 <94㎝ [<34.6인치] 및 여성에서 <80㎝ [31.5인치]), 약간 증가됨(남성에서 94-102㎝ [34.6-40인치] 및 여성에서 80-88㎝ [31.5-35인치]), 또는 큼(남성에서 ≥102㎝ [≥40인치] 및 여성에서 ≥88㎝ [≥35인치])으로 정의하는데 이용될 수 있고, 여기서 높은 허리 둘레(큰 WC)를 갖는 건강한 대상체는 T2D가 발생할 위험이 가장 높은 비만으로 분류된 것에 필적하는 보호성 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체를 보다 규칙적으로 생성할 것이며 바람직하게는 이들 항체의 단리를 위해 이용될 수 있으나, 약간 증가되거나 정상 WC를 갖는 개인도 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체의 단리를 위해 이용될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 대상체 항체에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 예시적인 항체 분자가 본 명세서에 기재된다.
본 발명의 항체는 항체의 합성을 위해 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 화학적 합성에 의해 또는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 발현 기법에 의해 생산될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 합성 불변 영역을 포함한다("도메인-결실된 항체"). 특정 구현예에서, 상용성의 개질 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실된 구축물 또는 변이체를 포함할 것이다(ΔCH2 구축물). 다른 구현예에 있어서, 짧은 연결 펩티드가 가변 영역에 대해 가요성 및 이동의 자유를 제공하기 위해 결실된 도메인에 대해 치환될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 이러한 구축물이 항체의 이화 속도에 대한 CH2 도메인의 조절 특성으로 인해 특히 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 도메인 결실된 구축물은, IgG1 인간 불변 도메인을 인코딩하는 벡터를 이용해서 유도될 수 있고, 예컨대 국제 출원 WO02/060955 및 WO02/096948A2 참조. 상기 벡터는 CH2 도메인을 결실시키고 도메인 결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하기 위해 조작된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 미니바디이다. 미니바디는 본 기술분야에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예컨대 US 특허 5,837,821 또는 국제 출원 WO94/09817 참조. 한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이것이 단량체 서브유닛 사이의 연관을 허용하는 한 소수의 또는 심지어 하나의 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산 돌연변이가 실질적으로 Fc 결합을 감소시키고 이에 따라 IAPP 및/또는 프로IAPP 편재를 증가시키기 충분할 수 있다. 유사하게, 조정될 효과인자 기능(예컨대, 보체 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 단순 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분적 결실은 대상체 불변 영역 도메인에 연관된 다른 바람직한 기능은 온전히 놔두면서 항체의 선택된 특징(혈청 반감기)은 개선할 수 있다. 또한, 상기 암시된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성 구축물의 프로필을 증강시키는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 돌연변이를 통해 합성될 수 있다. 상기 측면에서, 개질된 항체의 구조 및 면역원성 프로필을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성(예컨대, Fc 결합)을 손상시키는 것이 가능할 수 있다. 다른 구현예는 바람직한 특징, 예컨대 효과인자 기능을 증강시키거나 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산 부가를 포함한다. 이러한 구현예에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특이적 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 분자(예컨대, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 항체를 제공하며, 이 항체 또는 이들의 단편은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 면역특이적으로 결합한다. 비제한적으로 아미노산 치환을 일으키는 부위 지정된 돌연변이화 및 PCR-매개된 돌연변이화를 포함하는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 표준 기법을 이용하여 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 변이체(유도체 포함)는 기준 VH 영역, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL 영역, VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3에 비해 50개 이하의 아미노산 치환, 40개 이하의 아미노산 치환, 30개 이하의 아미노산 치환, 25개 이하의 아미노산 치환, 20개 이하의 아미노산 치환, 15개 이하의 아미노산 치환, 10개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 치환, 3개 이하의 아미노산 치환, 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 인코딩한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 본 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분기된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 대안적으로, 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이화에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부에 따라 무작위 도입될 수 있고, 생성 돌연변이체는 활성(예컨대, IAPP 및/또는 프로IAPP에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, 항체 분자의 골격 영역에만 또는 CDR 영역에만 돌연변이를 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이일 수 있다, 예컨대, 항원에 결합하는 항체의 능력에 전혀 또는 거의 효과를 갖지 않을 수 있고, 실제로 이러한 돌연변이의 일부는 아미노산 서열을 어떻게든 변형하지 않는다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 이용을 최적화하거나 하이브리도마의 항체 생산을 개선하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 인코딩하는 코돈 최적화된 코딩 영역은 본 명세서에서 다른 곳에 개시된다. 대안적으로, 비중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변형시킬 수 있다. 가장 침묵하며 중성인 미스센스 돌연변이의 위치는 골격 영역에 있을 가능성이 높은 반면 가장 비중성인 미스센스 돌연변이의 위치는 CDR에 있을 가능성이 높지만, 이것이 절대적인 조건인 것은 아니다. 본 기술분야의 기술자는 원하는 특성을 갖는, 예컨대 항원-결합 활성에 변형이 없는 또는 결합 활성에 변형이 있는(예컨대, 항원-결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화) 돌연변이체 분자를 설계하고 시험할 수 있을 것이다. 돌연변이화에 이어, 인코딩된 단백질이 일상적으로 발현될 수 있고, 인코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예컨대, IAPP 및/또는 프로IAPP의 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)이 본 기술분야에 공지된 기법을 일상적으로 개질하여 또는 본 명세서에 기재된 기법을 이용하여 결정될 수 있다.
Ⅲ. 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 이는 개질되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 및 이중쇄 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 RNA, 및 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 RNA, 단일쇄, 또는 보다 전형적으로 이중쇄, 또는 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중쇄 영역으로 이루어질 수 있다. 또한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 안정성 또는 다른 이유를 위해 개질된 DNA 또는 RNA 골격 또는 하나 이상의 개질된 염기를 함유할 수 있다. "개질된" 염기에는, 예를 들어 트리틸화된 염기 및 비일반적인 염기, 예컨대 이노신이 포함된다. 다양한 개질이 DNA 및 RNA에 수행될 수 있다; 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 개질된 형태를 포괄한다.
면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드(예컨대, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)의 비천연 변이체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 인코딩된 단백질 내로 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위 지정된 돌연변이화 및 PCR-매개된 돌연변이화에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 수행된다.
널리 공지된 바와 같이, RNA는 표준 기법, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 침전 후 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 원래 B 세포, 하이브리도마 세포 또는 다른 형질전환된 세포로부터 단리될 수 있다. 원하는 경우, mRNA는 표준 기법, 예컨대 올리고 dT 셀롤로오스 상의 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 단리될 수 있다. 적합한 기법은 본 기술분야에서 친숙하다. 한 구현예에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 동시적으로 또는 별도로, 널리 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소를 이용하여 제조될 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반하여 보다 특이적인 프라이머에 의해 또는 공통 불변 영역 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 경우, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 탐침, 예컨대 인간 불변 영역 탐침에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 본 기술분야에 공지된 기법을 이용해서 세포로부터 단리되고, 예컨대 재조합 DNA 기법에 관련된 상기 참고문헌에서 상세히 나타낸 표준의 널리 공지된 기법에 따라 제한효소 맵핑되고 서열분석될 수 있다. 물론, DNA는 단리 절차 또는 후속 분석 동안의 임의의 시점에 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
상기 맥락에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 CDR 또는 중쇄 가변 영역의 적어도 2개의 VH-CDR은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 도 1a 내지 도 1d에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖거나, 또는 각각 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 VL-CDR 또는 경쇄 가변 영역의 적어도 2개의 VL-CDR은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안적으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 1a 내지 도 1d에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖거나, 또는 각각 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 영역은 도 1a 내지 도 1d에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖거나, 각각 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 그룹과 동일하다.
본 기술분야에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 또는 두 폴리뉴클레오티드 간의 "서열 동일성"은 한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 아미노산 또는 핵산 서열을 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본 명세서에서 논의되는 경우, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지 여부는 본 기술분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대 비제한적으로 BESTFIT 프로그램(Wisconsin 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용해서 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 사이의 최적 상동성 절편을 찾기 위해 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘[Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489]을 이용한다. 특정 서열이, 예를 들어 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터는 물론 동일성 백분율이 기준 폴리펩티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 기준 서열에서 총 아미노산 수의 최대 5%의 상동성 내 갭이 허용되도록 설정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2 또는 표 3에 도시된 바와 같은 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체의 VH 또는 VL 영역의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 상기 측면에서, 본 기술분야의 기술자는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 두 면역글로불린 사슬 모두 또는 하나만의 가변 도메인을 인코딩할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2에 도시된 바와 같은 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체의 VH 및 VL 영역의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 표 3에 도시된 바와 같은 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체의 VH 및 VL 영역의 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
IAPP 항체의 VH 및 VL 영역의 뉴클레오티드 서열.
항체 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL/VK) 사슬의 뉴클레오티드 서열
NI-203.9A2-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACGTTTAGCACCTTTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTGGTAGTGGTGATAATACATACTATGCAGACTCCCTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTATATCTGCAAGTGAACAGCCTGAGACCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAAAAGTCCCTCGTCACTTCTGGCCACCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 11)
NI-203.9A2-VK GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTGAGAGTATTAATAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGGCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCGTCTAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGCACAATAGTTATTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
(서열번호 13)
NI-203.19H8-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGACGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGGTTCACCTTCAGCAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCAATTATATGGTATGATGGAAGTAAGGAATATTATGCAGACTCCCTGAAGGGCCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCGAGAACACTCTCTATCTGCAACTGCACACCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTGTATTTCTGTGCGAGGACAATCGCATCGGCCACCGTGGACCACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 15)
NI-203.19H8-VK GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCTTCGTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCACGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTTTGGAGCATCGAGGTTGCAAAGTGGGGTCTCACCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACTAACAATTTCCCTCCCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
(서열번호 17)
NI-203.26C11-VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGATTGGTGAAGCCTTCTCAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTAATTACTACTGGACCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCATATCTATTCCAGTGGGACCACCAATTACAACCCCTCCCTCGAGAGTCGAGTCACCATTTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGCCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGACCACTGGCTACAGTTCCGGATGCTTTTAATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCG (서열번호 19)
NI-203.26C11-VK GAAATTGTGATGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAAGTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCAATAAGAACTTCTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAATTACTCATTTACTGGGCATCTACTCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATTATAGTAATCCTAACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (서열번호 21)
NI-203.8E3-VH CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAACCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGTAGTCACACTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGGCAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTTCAGGACAGAGTCACGGTTACCGCGGACAAATCCACGAATACAGCCTACATGGAGTTGAGTAGCCTCAGACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAGGGGGAACTGGAACCACGAATCCTCTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCGAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 23)
NI-203.8E3-VK GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCACCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGGCTAATTTATAAGGTTTCTAATCGTGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTTCAAATTGGCCAGGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (서열번호 25)
NI-203.11B12-VH CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAATGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAACTACTATTTACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGTGCTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAAATCTGAAGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGATTCCGCTGGGATACAGATATGGTTCAGGGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCG (서열번호 27)
NI-203.11B12-VL CAGCCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCTGCCTCTGCTTCCCTGGGATCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAACAGTGGGCACAGTAGCTACACCATCGCATGGCATCAGCAGCAGCCAGGGAAGGCCCCTCGGTACTTGATGAAGGTTGAACATAATGGAAACTACAACAAGGGGAGCGGACTTCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGACCGCTACCTCGCCATCTCCAACCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAGACCTGGGACACTAGCACTAGGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (서열번호 29)
NI-203.205F8-VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCCGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGACTCCGTCAGCAGTGGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTATATTCCTGTGCGAGAGTCCCCTATGGTTACGGATATAGGGGCTACGATGGGGCTTGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
(서열번호 31)
NI-203.205F8-VK GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACCGGTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
(서열번호 33)
NI-203.9B3-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCAGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTGGTATGATGGAACTAAGAAGTACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACTCGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTTTAGCAGCAGCTGGGAGTTTGGGTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 35)
NI-203.9B3-VL CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCGGTTACATTTATGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCCGGCAAAGCCCCCAAAGTCATGATTTATGAGGTCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGTTTATTACTGCGCCTCATATGCAGGCAGCAACAATGTAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (서열번호 37)
NI-203.19F2-VH GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAGGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCAACTTCTTGAGCTATTCCATCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCGATCTTTGGTACACCAAACTACGCACAGAAGTTCCAAGGAAGAGTCACAATTACGGCGGACAAATCGACGAGGACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATTTGATGACACGGCCGTCTATTATTGTGCGGATGCGACAAGACCGGGTACAGCAGCCTCTGGTTTCTATTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
(서열번호 63)
NI-203.19F2-VK GAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGACACCCTGTCTGTGTCTCCAGGTGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAACAACAACTTAGCCTGGTTCCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATTCCAGCCAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGAGTCACAATTGGCCCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
(서열번호 65)
NI-203.15C7-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGATGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTATACTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCATTTATATCATATGATGGAAGGGATAAATACTACGCAGATTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGATGAGGACATGGCTGTGTATTACTGTGCGACTCTGCAAGTATGGCAACTCTACGATTACTACGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 67)
NI-203.15C7-VL CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCTTGGTATCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATAACAGTGATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGGCTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGCAACATGGGATACCAGACTGAGTGCTGGGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTT (서열번호 69)
프로IAPP 항체의 VH 및 VL 영역의 뉴클레오티드 서열
항체 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL/VK) 사슬의 뉴클레오티드 서열
NI-203.1D10-VH GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGAGTCTCTCAGAATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGCTTCACCAACTCTTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGACTACGTGGGTATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAAGTATGGCCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCACTATCTCAGCCGACAACTTCGCCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATCTATTATTGTGCGAGACGGGCAGCAGCGGCTATTAACTGGTTCGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 39)
NI-203.1D10-VK GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCCAGAGCCTCCTGCATCCTAATGGAAACGACTATTTGGATTGGTACGTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGATCGTGATCTACATGGGTTCTAATCGGGCCGCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGACTTATTACTGCCTGCAAGCTCTACGCGGGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (서열번호 41)
NI-203.2A11-VH CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCGTCTGGATTCACCTTCAGCAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTGTACGGTATGATGGAAGTAATAAGTACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACTCGCTGTCTCTTCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAAGACACGGCTGTATATTACTGCGCGAAAGAACAGGAGGACCACAAGGAAGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 43)
NI-203.2A11-VK GAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGAGTTACCACCATAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGATATTCCCGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGTCTGAAGACTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAACCAGTGGCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (서열번호 45)
NI-203.10C4-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAAGTGAGGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAGGGTCTCCTGCCAGACATCTGGATACAGCGTCACCGACTACTATCTACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATGGGAGTGATGAACCCGAGCAATGGAAACGTGGGCTACCCACAGAAGTTTCAGGGCCGAGTCACCATGACCGCAGACACGTCCACGGGCACAGTGTACATGGTGTTGACCGGCCTTACGGCTGGGGACACGGCCGTCTACTACTGTGCCAGAGGCGGGTCCACGCCGGGTCAGGAAGTAAGGAGTCCCCACGTCCTTGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
(서열번호 47)
NI-203.10C4-VK GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCCCTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTGATGAGAGCCTCCTGCATAGTGATGGAAGGACCTATTTGTATTGGTATCTACAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTCAGCTCCTGATCTATGAAGTTTCCAACCGGTTCTCGGGAGTGCCAAATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGCGTTTATTACTGCATGCAGGGTGTACACTTTCCTCAGACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (서열번호 49)
NI-203.20H9-VH CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACATCTTCAGTAAACATGGTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATAGGATGGATCAACACCAATACGGGGAACCCAACATATGCCCAGGACTTCACAGGACGATTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAATCAGAGCCGATTTTTGGAGTTATCTATTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
(서열번호 51)
NI-203.20H9-VK GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGCCAGAGCATAAGCACTAATTTAAATTGGTATCAGAAGAAACCAGGACAAGCCCCTACGGTCTTGATCTATGCTGCGTCCAGTTTGCAAGGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGGGGCCGGGGATCTGGGACATATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTTCAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACACAATTACAATGATTTGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (서열번호 53)
NI-203.26D2-VH CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGGTTCACGTTCAGAACCTGTGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAATGGGTGGCATTTGTTCGGTCTGATGGAACTACTAGATATTACGCAGACTCCCTGATGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACTCGCTGTATCTTCAAATGAACAGTCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTTTATTACTGTGCGAGGGAAAAGGAGGATCACAGGGAAGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 55)
NI-203.26D2-VK GAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGCGTGTTAGCACTGTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCACCAGGGCCACTGATATCCCCGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCACTCTGCAATCTGAAGACTCTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAGGTGGCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (서열번호 57)
NI-203.60H3-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCACGCCCTGGAGGCTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCGCTGGATTCACTTTCAGTGGTTATGAAATGAATTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTTCATATATTAGCGGTCCTGGGGATGTGATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTACAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGTACGAGAGTCCCCCCTGACATCAGCTATGGATTTGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 59)
NI-203.60H3-VK GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTACGAGACAGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCCATGATACAGACATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCACTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCCTACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (서열번호 61)
본 발명에는 또한 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편이 포함된다. 추가적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 폴리뉴클레오티드, Fab 단편, 및 다른 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 의해 고려된다.
폴리뉴클레오티드는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 간략하게는 항체를 인코딩하는 서열 부분을 함유하는 중복 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 이어서 결찰된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭이 관여되는 [Kutmeier et al., BioTechnique 17 (1994), 242]에 기재된 바와 같은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다.
대안적으로, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 원천의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없지만 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 항체를 인코딩하는 핵산은 화학적으로 합성되거나 적합한 원천(예컨대, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 바람직하게는 IAPP 및/또는 프로IAPP-특이적 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A+ RNA)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 또는 예컨대 항체를 인코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 클로닝에 의해 수득될 수 있다. 이어서 PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 본 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열이 결정되면, 그 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 조작을 위해 본 기술분야에 널리 공지된 방법, 예컨대 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성하기 위해 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하기 위한 재조합 DNA 기법, 부위 지정된 돌연변이화, PCR 등을 이용해서 조작될 수 있다(예를 들어, 둘 다 이들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 [Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)]에 기재된 기법을 참조).
Ⅳ. 항체 폴리펩티드의 발현
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 제공하기 위한 단리된 유전 물질의 조작 후, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 원하는 양의 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있는 숙주 세포 내로의 도입을 위해 발현 벡터에 삽입된다. 항체, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 유사체, 예컨대 표적 분자에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 일부(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터가 본 기술분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하기 위한 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 방법이 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법에는, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전적 재조합이 포함된다. 따라서 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항체 분자, 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터에는 항체 분자의 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있고(예컨대, 국제 출원 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 US 특허 번호 5,122,464 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 명세서에서 숙주 세포 내로의 도입 및 원하는 유전자의 발현을 위한 운반체로 본 발명에 따라 이용되는 벡터를 의미하기 위해 이용된다. 본 기술분야의 기술자에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로 본 발명과 상용성인 벡터는 원하는 유전자의 클로닝 및 진핵 또는 원핵 세포로의 도입 및/또는 복제 능력을 촉진하기 위해 선택 마커, 적절한 제한효소 부위를 포함할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 여러 발현 벡터 시스템이 채용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 한 클래스는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것에는 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다중시스트론 시스템의 이용이 관여된다. 또한 이들의 염색체 내에 통합된 DNA를 갖는 세포는 전달감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구 숙주에 대한 양성자성, 살생제 내성(예컨대, 항생제) 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수도 있고, 또는 공-형질전환에 의해 동일한 세포 내에 도입될 수도 있다. 추가적인 요소가 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이들 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종료 신호가 포함될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 바와 같이 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게는 인간)에 따라 발현 벡터 내에 삽입된다. 한 구현예에서, 이는 NEOSPLA로 불리고 US 특허 번호 6,159,730에 개시된 Biogen IDEC, Inc.의 독점적 발현 벡터를 이용하여 달성된다. 상기 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 상기 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 도입, CHO 세포에서의 전달감염 후 G418 함유 배지 중에서의 선택 및 메토트렉세이트 증폭시 매우 높은 항체 발현 수준을 일으키는 것으로 나타났다. 물론 진핵 세포에서 발현을 야기할 수 있는 임의의 발현 벡터가 본 발명에서 이용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 비제한적으로 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CA에서 공급), 및 플라스미드 pCI(Promega, Madison, WI에서 공급)가 포함된다. 일반적으로 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가, 예를 들어 로보틱 시스템에 의해 수행될 수 있는 일상적 실험인 경우, 적합하게 고수준을 발현하는 것들에 대해 다수의 형질전환된 세포를 스크리닝한다. 벡터 시스템은 또한 각각 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 US 특허 번호 5,736,137 및 5,658,570에 교시된다. 상기 시스템은 높은 발현 수준, 예컨대 >30pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적 벡터 시스템은, 예컨대 US 특허 번호 6,413,777에 개시된다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 다중 시스트론 구축물, 예컨대 US 특허 출원 공개 번호 2003-0157641 A1에 개시되고 그 전문이 본 명세서에 도입된 것들을 이용해서 발현될 수 있다. 이들 발현 시스템에서, 여러 관심 유전자 산물, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄는 단일 다중 시스트론 구축물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 상대적으로 높은 수준의 항체를 제공하기 위해 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를 이용한다. 상용성 IRES 서열은 또한 본 명세서에 도입되는 US 특허 번호 6,193,980에 개시된다. 본 기술분야의 기술자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 개시된 항체의 전체 범위를 효과적으로 생산하기 위해 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 결합 분자의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 조합으로, 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
보다 일반적으로, 항체의 단량체 서브유닛을 인코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드 도입은 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 여기에는 비제한적으로 예로 Fugene® 또는 리포펙타민을 이용한 지질전달감염을 포함하는 전달감염, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 외피 보유 DNA를 이용한 세포 융합, 마이크로주입 및 온전한 바이러스를 이용한 감염이 포함된다. 전형적으로, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 표준 칼슘 포스페이트 공침전 방법을 통한다. 발현 구축물을 보유하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄 생산에 적절한 조건 하에 성장되며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석 기법에는 효소-연관된 면역흡착 분석(ELISA), 방사선 면역분석(RIA), 또는 형광 활성화된 세포 정렬기 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 전달감염된 세포가 통상적인 기법에 의해 배양되어 본 명세서에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체를 생산한다. 따라서 본 발명에는 바람직하게는 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 면역글로불린의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 포함된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명에는 또한 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 선택적으로 상기 결합 분자의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 조합으로 포함하는 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포가 포함된다. 이중쇄 항체의 발현을 위한 바람직한 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 인코딩하는 단일 벡터 또는 벡터들은 아래에 상세히 나타낸 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공-발현될 수 있다.
숙주 세포는 중쇄 유래된 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래된 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 벡터인 본 발명의 두 발현 벡터로 공-전달감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등 발현을 가능케 하는 동일한 선택 가능 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 모두 인코딩하는 단일 벡터가 이용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 유리하게는 과량의 독소가 없는 중쇄를 배제하기 위해 중쇄 앞에 배치된다; [Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197] 참조. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용해서 구축되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 인코딩하는 벡터를 보유하는 세포를 나타낸다. 재조합 숙주로부터 항체의 단리를 위한 절차의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양"은 이것에 명백히 달리 명시되지 않은 한, 항체 원천을 나타내기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 달리 말하면, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 배지 및 현탁된 세포를 둘 다 함유하는 세포 배양으로부터 또는 전체 세포의 침강으로부터를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 명세서에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체 분자를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산되고 후속 정제될 수 있는 운반체를 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 전달감염되는 경우, 원 위치에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 여기에는 비제한적으로 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예컨대, E. 콜라이 , B. 서브틸리스); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예컨대, 사카로마이세스 , 피치아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예컨대, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유래된 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 세포)이 포함된다. 바람직하게는 박테리아 세포, 예컨대 에스체리키아 콜라이, 및 보다 바람직하게는 진핵 세포, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 것이 재조합 항체 분자의 발현을 위해 이용된다. 예를 들어, 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 벡터, 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주 중기-조기 유전자 프로모터 요소와 함께 항체를 위해 효과적인 발현 시스템이다; 예컨대, [Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2] 참조.
단백질 발현을 위해 이용되는 숙주 세포주는 종종 포유류 유래이다; 본 기술분야의 기술자는 내부에서 발현될 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력이 있다고 믿어진다. 예시적인 숙주 세포주에는 비제한적으로 CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR-), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 이용한 CVI의 유도체), VERY, BHK(아기 햄스터 신장), MDCK, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 포함된다. CHO 및 293 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 공급업체, 미국 조직 배양 은행(American Tissue Culture Collection) 또는 공개 문헌으로부터 이용 가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 개질하고 가공하는 숙주 세포 계통이 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 개질(예컨대, 글리코실화) 및 가공(예컨대, 절단)은 단백질의 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 개질을 위한 특징과 특정 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 발현되는 외래 단백질의 정확한 개질 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 상기 목적을 위해, 일차 전사체의 적절한 가공, 유전자 산물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기전을 보유하는 진핵 숙주 세포가 이용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 가공될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기보다, 숙주 세포가 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종료자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입에 이어, 가공된 세포는 농축 배지 중에 1-2일 동안 성장하도록 둘 수 있고, 이어서 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드 내의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 플라스미드를 이들의 염색체 내로 안정하게 통합하고 다시 세포주 내로 클로닝되고 증식될 수 있는 초점을 형성하도록 클 수 있게 한다. 상기 방법은 유리하게는 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 가공하기 위해 이용될 수 있다.
비제한적으로 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) 유전자를 포함하는 여러 선택 시스템이 이용될 수 있다. 또한, 항-대사물질 내성이 하기 유전자에 대한 선택의 기반으로 이용될 수 있다; dhfr, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, 미코페놀산에 대한 내성을 부여함(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여함(Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; 및 Morgan 및 Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215); 및 hygro, 히그로마이신에 대한 내성을 부여함(Santerre et al., Gene 30 (1984), 147). 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 본 기술분야에서 일반적으로 공지된 방법은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함된 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)]에 기재된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있으며, 리뷰를 위해서는 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)] 참조. 항체를 발현하는 벡터 시스템 중의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포의 배양에 존재하는 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자에 연관되므로, 항체의 생산도 증가할 것이다; [Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257] 참조. 시험관내 생산은 다량의 원하는 폴리펩티드를 제공하기 위해 스케일-업을 허용한다. 조직 배양 조건 하의 포유류 세포 배양을 위한 기법은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서의 동종성 현탁 배양, 또는 예컨대 중공사, 마이크로캡슐, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화되거나 트랩핑된 세포 배양이 포함된다. 필요하고/하거나 원하는 경우, 폴리펩티드 용액은, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스에 걸친 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해, 예컨대 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적 생합성 이후 또는 본 명세서에 기재된 HIC 크로마토그래피 이전에 또는 이후에 정제될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 유전자는 또한 비-포유류 세포, 예컨대 박테리아 또는 곤충 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 쉽게 섭취하는 박테리아에는 엔테로박테리아세애의 구성원, 예컨대 에스체리키아 콜라이 또는 살모넬라 계통; 바실라세애, 예컨대 바실러스 서브틸리스 ; 뉴모코커스 ; 스트렙토코커스, 및 해모필러스 인플루엔재가 포함된다. 박테리아에서 발현되는 경우, 이종성 폴리펩티드가 전형적으로 봉입체의 일부가 됨이 추가로 이해될 것이다. 이종성 폴리펩티드는 단리되고, 정제되고, 이어서 기능적 분자로 조립되어야 한다. 항체의 4가 형태를 원하는 경우, 서브유닛이 4가 항체로 자가 조립할 것이다; 예컨대, 국제 출원 WO02/096948 참조.
박테리아 시스템에서, 여러 발현 벡터는 항체 분자가 발현되기 위한 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학적 조성물의 생성을 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우, 쉽게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 비제한적으로 항체 코딩 서열은 융합 단백질이 생산되도록 lacZ 코딩 영역의 틀에 놓인 벡터 내로 개별적으로 결찰될 수 있는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509) 등이 포함된다. pGEX 벡터가 또한 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로 외래 폴리펩티드를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 글루타치온-아가로오스 비드의 매트릭스에 대한 흡착 및 결합에 의해, 이어서 자유 글루타치온의 존재 하 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
원핵 미생물에 부가하여, 진핵 미생물도 이용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시애 또는 일반 빵 효모가 진핵 미생물 중 가장 일반적으로 이용되지만, 여러 다른 계통, 예컨대 피치아 파스토리스도 일반적으로 이용 가능하다. 사카로마이세 스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157)이 일반적으로 이용된다. 상기 플라스미드는 이미 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이체 계통, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유한다(Jones, Genetics 85 (1977), 12). 이어서 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로 trp1 병소의 존재가 트립토판의 부재 하 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 핵 다면체 형성 바이러스(AcNPV)가 전형적으로 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 이용된다. 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다 세포에서 자란다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 배치될 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현된 경우, 본 발명의 전체 항체, 이들의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는, 예를 들어 크로마토그래피에 의해(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 및 크기분별 칼럼 크로마토그래피 후 특이적 항원에 대한 친화도에 의해), 원심분리, 차별적 용해도, 예컨대 암모늄 설페이트 침전 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법을 포함하는 본 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 예컨대, [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)] 참조. 대안적으로, 본 발명의 항체의 친화도를 증가시키기 위해 바람직한 방법은 US 특허 공보 2002-0123057 A1에 개시된다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 또한 하기를 포함하는, 항-IAPP 또는 항-프로IAPP 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들)의 제조 방법을 제공한다:
(a) 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계로, 세포는 이전에 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 단계; 및
(b) 배양으로부터 상기 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들)을 단리하는 단계.
또한 한 구현예에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 상기 정의된 바와 같거나 항-IAPP 또는 항-프로IAPP 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들)을 제조하기 위한 상기 방법에 의해 수득 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들)에 관한 것이다.
Ⅴ. 융합 단백질 및 콘주게이트
특정 구현예에서, 항체 폴리펩티드는 보통 항체에 연관되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적인 개질이 아래에 보다 상세히 기재된다. 예를 들어, 본 발명의 단일쇄 Fv 항체 단편은 유연한 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티(예컨대, PEG, 약물, 독소, 또는 표지, 예컨대 형광, 방사활성, 효소, 핵 자기, 중금속 등)를 부가하기 위해 개질될 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 적어도 하나의 표적 결합 부위, 및 적어도 하나의 이종성 부분, 즉 자연에서 천연 연결되지 않는 부분을 갖는 면역글로불린 IAPP 및/또는 프로IAPP-결합 도메인을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 보통 융합 폴리펩티드에서 함께 오는 별도의 단백질로 존재할 수 있거나 이들은 보통 동일한 단백질에 존재할 수 있지만 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치된다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 인코딩되는 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교되는 대상의 나머지와 다른 대상으로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어 본 명세서에서 이용되는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유사체에 융합될 "이종성 폴리펩티드"는 동일한 종의 비-면역글로불린 폴리펩티드, 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에서 유래된다.
본 명세서에서 다른 곳에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 콘주게이트될 수 있다(공유 및 비공유 콘주게이션 포함). 예를 들어, 항체는 검출 분석에서 표지 및 효과인자 분자, 예컨대 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사선핵종 또는 독소로 유용한 분자에 재조합적으로 융합되거나 콘주게이트될 수 있다; 예컨대, 국제 출원 WO92/08495; W091/14438; W089/12624; US 특허 번호 5,314,995; 및 유럽 특허 출원 EP 0 396 387 참조.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 서로 펩티드 결합 또는 개질된 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산, 즉 펩티드 동배체로 이루어질 수 있고, 20가지 유전자 인코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 항체는 천연 절차, 예컨대 번역 후 가공에 의해 또는 본 기술분야에 널리 공지된 화학적 개질 기법에 의해 개질될 수 있다. 이러한 개질은 기본 교과서 및 보다 상세한 단행본뿐만 아니라 많은 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 개질은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는 항체 중 또는 모이어티, 예컨대 탄수화물 상 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 개질이 주어진 항체에서 몇몇 부위에 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 주어진 항체는 여러 유형의 개질을 함유할 수 있다. 항체는, 예를 들어 유비퀴틴화의 결과 분기화될 수 있고, 이들은 분기를 포함하거나 포함하지 않고 고리형일 수 있다. 고리형, 분기화 및 분기화 고리형 항체는 번역 후 천연 절차로부터 야기될 수도 있고 또는 합성 방법에 의해 제조될 수도 있다. 개질에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 부착 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, peg화, 단백질분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 전달 RNA 매개된 아미노산의 단백질에 대한 부가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화가 포함된다; 예컨대, [Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62)] 참조.
본 발명은 또한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 임의의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체의 임의의 하나 이상의 VL 영역 또는 이들의 단편 또는 변이체의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 융합 단백질은 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체의 임의의 1, 2, 3개의 VH-CDR의 아미노산 서열 또는 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체의 임의의 1, 2, 3개의 VL-CDR의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 한 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체, 또는 이들의 단편, 유도체, 또는 변이체의 VH-CDR3의 아미노산 서열 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 융합 단백질은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 VH 영역의 아미노산 서열 및 본 발명의 항체, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체의 적어도 하나의 VL 영역의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 특이적으로 결합하는 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 융합 단백질은 항체의 임의의 1, 2, 3개 이상의 VH CDR의 아미노산 서열 및 항체, 또는 이들의 단편 또는 변이체의 임의의 1, 2, 3개 이상의 VL CDR의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 VH-CDR(들) 또는 VL-CDR(들)은 본 발명의 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응한다. 이들 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 본 발명에 포괄된다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질에는 T 세포 수용체(Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4(Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; 및 Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-셀렉틴(귀소 수용체)(Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; 및 Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167); CD44(Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 및 B7(Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 721-730); CTLA-4(Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22(Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); TNF 수용체(Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; 및 Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991); 및 IgE 수용체 a(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448)의 융합이 포함된다.
본 명세서에서 다른 곳에 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 또는 본 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 면역분석에서 이용하기 위해 이종성 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들어 한 구현예에서, PEG는 이들의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 항체에 콘주게이트될 수 있다; 예컨대, [Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; 또는 Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512] 참조.
또한, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이들의 정제 또는 검출을 촉진하게 위해 마커 서열, 예컨대 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 다수가 시판되는 것들 중에서 헥사-히스티딘 펩티드(HIS), 예컨대 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311)에서 제공되는 태그이다. 예를 들어, [Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그에는 비제한적으로 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 대응하는 "HA" 태그(Wilson et al., Cell 37 (1984), 767), GST, c-myc 및 "flag" 태그가 포함된다; 에피토프 태그화 기법의 리뷰에 대해서는, 예컨대 그 요지가 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함되는 [Bill Brizzard, BioTechniques 44 (2008) 693-695] 및 여기서 페이지 694의 표 1에서 본 발명에서 이용 가능한 가장 일반적인 에피토프 태그의 목록 참조.
융합 단백질은 본 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용해서 제조될 수 있다; 예를 들어 US 특허 번호 5,116,964 및 5,225,538 참조. 융합이 일어나는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 실험적으로 선택될 수 있다. 이어서 융합 단백질을 인코딩하는 DNA가 발현을 위해 숙주 세포 내로 전달감염되고, 이는 이전에 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행된다.
본 발명의 항체는 콘주게이트되지 않은 형태로 이용될 수도 있고, 또는 예컨대 분자의 치료적 특성을 개선하기 위해, 표적 검출을 촉진하기 위해, 또는 환자의 조영 또는 치료법을 위해 적어도 하나의 다양한 분자에 콘주게이트될 수도 있다. 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 정제가 수행되는 경우, 정제 이전 또는 이후에 표지되거나 콘주게이트될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 치료 제제, 전구약물, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약학적 제제 또는 PEG에 콘주게이트될 수 있다.
통상적인 항체를 포함하는 면역독소인 콘주게이트는 본 기술분야에서 널리 설명되었다. 독소는 통상적인 커플링 기법에 의해 항체에 커플링될 수도 있고 또는 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소가 융합 단백질로 생산될 수도 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 수득하기 위해 해당 방식에서 이용될 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 [Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 및 Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54]에 기재된 것들이다.
본 기술분야의 기술자는 콘주게이트가 또한 콘주게이트될 선택된 제제에 따라 다양한 기법을 이용해서 조립될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 바이오틴과의 콘주게이트는, 예컨대 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 폴리펩티드를 바이오틴의 활성화된 에스테르, 예컨대 바이오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 콘주게이트는 커플링 제제, 예컨대 본 명세서에 기재된 것들의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레신-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 콘주게이트는 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 진단 또는 치료 제제에 콘주게이트된 본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 추가로 포괄한다. 항체는, 예를 들어 대사성 질환, 예컨대 T2D의 존재를 나타내어 대사성 질환을 얻을 위험을 시사하기 위해, 대사성 질환, 예컨대 주어진 치료 및/또는 예방 방식의 유효성을 결정하기 위한 임상적 평가 절차의 일환으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 발생을 나타내거나 이에 관련된 질환의 발생 또는 질환을 모니터링하기 위해 진단적으로 이용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 검출 가능하게 표지된 항체에 관한 것이다. 또한 한 구현예에서, 본 발명은 약물에 부착된 항체에 관한 것이다. 검출은 검출 가능한 물질에 대한 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 커플링에 의해 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질 또는 표지는 일반적으로 효소; 중금속, 바람직하게는 금; 염료, 바람직하게는 형광 또는 발광 염료; 또는 방사활성 표지일 수 있다. 검출 가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보철기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사활성 물질, 다양한 양성자 방출 단층촬영을 이용한 양성자 방출 금속, 및 비방사활성 상자성 금속 이온이 포함된다; 예컨대, 본 발명에 따른 진단제로 이용하기 위해 항체에 콘주게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 US 특허 번호 4,741,900 참조. 적합한 효소의 예에는 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스터라아제가 포함되며; 적합한 보철기 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 애비딘/바이오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시퍼라아제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되고; 적합한 방사활성 물질의 예에는 125I, 131T, 111In 또는 99Tc가 포함된다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 검출 가능하게 표지된 항체를 제공하며, 여기서 검출 가능한 표지는 효소, 방사선동위원소, 형광단(fluorophore) 및 중금속으로 구성된 군으로부터 선택된다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 이를 화학발광 화합물에 커플링하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이어서 화학발광 태그된 항체의 존재는 화학 반응 과정 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 써로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체가 검출 가능하게 표지될 수 있는 방식의 하나는 이를 효소에 연결하고 연결된 산물을 효소 면역분석(EIA)에서 이용하는 것이다[Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7; Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E.(ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)]. 항체에 결합된 효소는, 예를 들어 분광측정, 형광측정 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생산하는 방식으로 적절한 기질, 바람직하게는 발색 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출 가능하게 표지하기 위해 이용될 수 있는 효소에는 비제한적으로 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트, 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼린 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 유레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스터라아제가 포함된다. 추가적으로, 검출은 효소에 대한 발색 기질을 채용하는 비색 방법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여 기질의 효소 반응 정도의 시각적 비교에 의해 달성될 수 있다.
검출은 또한 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 방사활성적으로 표지함으로써, 방사선 면역분석(RIA)의 이용을 통해 항체를 검출할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)] 참조). 방사활성 동위원소는 비제한적으로 감마 계측기, 신틸레이션 계측기 또는 자가방사선촬영을 포함하는 수단에 의해 검출될 수 있다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 형광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 란탄족 계열의 다른 것들을 이용해서 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트기를 이용해서 항체에 부착될 수 있다.
항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 다양한 모이어티의 콘주게이트션을 위한 기법은 널리 공지되어 있으며, 예컨대 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158] 참조.
전술한 바와 같이, 특정 구현예에서 결합 분자, 예컨대 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 이들의 면역특이적 단편의 안정성 또는 유효성을 증강시키는 모이어티가 콘주게이트될 수 있다. 예를 들어 한 구현예에서, PEG는 이들의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 결합 분자에 콘주게이트될 수 있다[Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; 또는 Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512].
Ⅵ. 조성물 및 이용 방법
본 발명은 전술한 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 또는 유도체 또는 변이체, 또는 이전에 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물이며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도된 이용에 따라 추가 제제, 예컨대 인터류킨 또는 인터페론을 포함할 수 있다. 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 발생을 나타내거나 이에 관련된 대사성 질환, 예컨대 T2D의 치료에서의 이용을 위해, 추가적인 제제는 작은 유기 분자, 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 대사성 질환의 예방적 및 치료적 처치, 대상체에서 대사성 질환의 진행 또는 대사성 질환 치료에 대한 반응을 모니터링, 또는 대상체의 대사성 질환 발생 위험을 결정하기 위한 약학적 또는 진단 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
따라서 한 구현예에서, 본 발명은 랑게르한스 섬에서 IAPP 및/또는 프로IAPP의 비정상적 축적 및/또는 침적을 특징으로 하는 대사성 장애의 치료 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 발명의 상술된 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 중 임의의 하나의 치료적 유효량을 이들을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 용어 "대사성 장애"에는 비제한적으로 일반적으로 증상, 예컨대 췌장에 손상을 유도하고 이에 따라 만성 췌장염, 낭성 섬유증, 췌장암을 포함하여 당뇨병으로 이어질 수 있는 질환을 포함하는 T2D; 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환을 포함하는 T2D의 위험을 증가시키는 질환에서; 비만 및 T2D에 연관되거나 연관되지 않는 심혈관 질환에서; 및/또는 T2D 자체에 선행, 유도, 및/또는 연결/연합되거나 연관된 대사성 변화를 특징으로 하는 장애군이 포함된다.
본 발명의 치료적 접근의 특정한 이점은 본 발명의 항체가 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 발생을 나타내거나 이에 관련된 질환, 예컨대 T2D의 징후를 갖지 않고 따라서 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환을 임상적으로 발현하는 것을 예방하거나 질환의 임상적 발현의 발생 위험을 감소시키거나, 또는 질환의 임상적 발현의 개시 또는 진행을 지연시킬 수 있는 특정한 개연성을 갖는 건강한 인간 대상체로부터의 B 세포 또는 B 메모리 세포로부터 유래된다는 점에 있다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 또한 이미 체세포 성숙, 즉 항체의 가변 영역의 체세포 변이에 의해 표적 IAPP 및/또는 프로IAPP 분자에 대해 고친화도 결합에서 선택성 및 효과에 대해 최적화를 성공적으로 거쳤다.
생체내, 예컨대 인간에서 이러한 세포가 자가면역 또는 알러지 반응의 관점에서 관련되거나 다른 생리적 단백질 또는 세포 구조에 의해 활성화되지 않았다는 지식은 이것이 임상 평가상을 통해 성공적으로 유지될 상당히 증가된 확률을 나타내므로, 또한 커다란 의학적 중요성을 갖는다. 말하자면, 효율성, 허용 가능성 및 내성이 이미 적어도 하나의 인간 대상체에서 예방적 또는 치료적 항체의 전임상 및 임상 개발 전에 이미 드러났다. 따라서 본 발명의 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체는 치료 제제로서의 그 표적 구조-특이적 효율성 및 그 감소된 부작용의 개연성이 모두 그 임상적 성공 개연성을 크게 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 또한 상술된 성분의 하나 이상, 예컨대 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체, 이들의 결합 단편, 유도체 또는 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포가 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 각각의 약학적 및 진단 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)에는 인간 투여를 위한 제조, 이용 또는 판매 에이전시에 의한 승인을 반영하는 고지인 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 에이전시에 의해 처방되는 형태의 고지가 연관될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 적절한 진단 분석에 이용하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 키트는 물론 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 존재에 수반되는 장애의 위험 평가, 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하며, 특히 예를 들어, 일반적으로 증상, 예컨대 췌장에 손상을 유도하고 이에 따라 만성 췌장염, 낭성 섬유증, 췌장암을 포함하는 당뇨병으로 이어질 수 있는 질환을 포함하는 T2D; 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환을 포함하는 T2D의 위험을 증가시키는 질환에서; 비만 및 T2D에 연관되거나 연관되지 않는 심혈관 질환에서; 및/또는 T2D 자체에 선행, 유도, 및/또는 연결/연합되거나 연관된 대사성 변화를 특징으로 하는 장애의 치료에 적용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들어 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472] 참조. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 널리 공지되어 있고, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약학적 조성물은 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식, 예컨대 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 국소 또는 피내 투여 또는 척추 또는 뇌 전달에 의해 수행될 수 있다. 에어로졸 제형, 예컨대 비강 스프레이 제형에는 활성 제제의 정제된 수용액 또는 다른 용액과 보존제 및 등장화제가 포함된다. 이러한 제형은 바람직하게는 비강 점막에 상용성인 pH 및 등장 상태로 조정된다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체와 함께 좌약으로 제공될 수 있다.
투여 요법은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시점 및 경로, 일반 건강 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 여러 요인에 의존한다. 전형적인 용량은, 예를 들어 0.001 내지 1,000㎍ 범위일 수 있다(또는 상기 범위의 핵산 발현을 위해 또는 발현 저해를 위해); 그러나 상기 예시적인 범위 이하 또는 이상의 용량이 특히 전술한 요인을 고려하여 계획된다. 일반적으로 투여량은, 예컨대 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100㎎/㎏, 보다 일반적으로 0.01 내지 5㎎/㎏(예컨대, 0.02㎎/㎏, 0.25㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 0.75㎎/㎏, 1㎎/㎏, 2㎎/㎏ 등)의 범위일 수 있다. 예를 들어 투여량은 체중을 기준으로 1㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏ 또는 1-10㎎/㎏의 범위 내, 바람직하게는 적어도 1㎎/㎏일 수 있다. 상기 범위의 중간 용량도 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 대상체에는 이러한 용량이 매일, 또는 수 일마다, 매주, 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 연장된 기간, 적어도 6개월에 걸친 다중 투여량으로의 투여를 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 요법은 2주마다 또는 1개월마다 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 예시적인 투여 일정에는 연속일로 1-10㎎/㎏ 또는 15㎎/㎏, 수 일마다의 30㎎/㎏ 또는 매주 60㎎/㎏이 포함된다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 둘 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 나타낸 범위 내에 속한다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제조물에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체에는 식염수 및 완충 배지를 포함하는 물, 알코올계/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 운반체에는 나트륨 클로라이드 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 나트륨 클로라이드, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥내 운반체에는 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제(예컨대 링거 덱스트로오스에 기반한 것들) 등이 포함된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도하는 용도에 따라 추가 제제, 예컨대 도파민 또는 정신약리적 약물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 예를 들어 본 발명의 약학적 조성물이 수동 면역화를 위해 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체 또는 이들의 결합 단편, 유도체 또는 변이체를 포함하는 경우, 백신으로 제형화될 수 있다. 배경 섹션에 언급된 바와 같이, 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP종이 T2D 발병기전의 주요 유발자이며(Zraika et al. (2010), Diabetologia 53(6): 1046-1056; Westermark et al. (2011), Physiol. Rev. 91(3): 795-826; Jurgens et al. (2011), Am. J. Pathol. 178(6): 2632-2640; Hoppener et al. (2008), Exp. Diabetes Res. 697035), hIAPP 응집을 방해하는 치료가 당뇨병 표현형을 완화시키고 동물 수명을 증가시켰음을 시사하는 몇몇 증거들이 나타났다(Aitken et al. (2009), Diabetes 59(1): 161-171). 따라서 본 발명의 인간 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체 및 동등한 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자를 이용한 수동 면역화가 배경 섹션에서 이미 논의된 바와 같이 능동 면역화 치료법 개념의 몇몇 역효과 우회를 도울 것임을 예상하는 것이 신중하다. 따라서 본 발명의 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체 및 이들의 균등물은 특히, 예를 들어 일반적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로/IAPP의 존재를 나타내거나 이에 의해 유도되는 질환, 예컨대 췌장에 손상을 유도하고 이에 따라 만성 췌장염, 낭성 섬유증, 췌장암을 포함하여 당뇨병으로 이어질 수 있는 질환을 포함하는 T2D; 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환을 포함하는 T2D의 위험을 증가시키는 질환에서; 비만 및 T2D에 연관되거나 연관되지 않는 심혈관 질환에서; 및/또는 T2D 자체에 선행, 유도, 및/또는 연결/연합되거나 연관된 대사성 변화의 예방 또는 완화를 위한 백신으로 유용할 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체의 재조합 이중특이적 또는 다중특이적 구축물을 이용하는 것이 유익할 수 있다. 참고문헌으로, [Fischer and Leger, Pathobiology 74 (2007), 3-14] 참조. 이러한 이중특이적 분자는 한 결합 팔로 IAPP를 그리고 제2 팔로 당뇨병의 발병기전에서 알려진 또 다른 대상, 예컨대 (예시적인 항체 NI-203.26C11에 대해 상기 나타낸 바와 같이 IAPP 및 프로IAPP에 대해 이중특이적인 본 발명의 항체에 더하여) 프로IAPP를 표적화하도록 설계될 수 있다. 또는 이러한 이중특이적 분자는 제2 결합 팔로 당뇨병의 발병기전에서 알려진 다른 대상, 예컨대 IL-1β 및 IL-6에 결합하거나 그 개입이 적응 제어 T 세포의 유도에 의해 NOD 마우스에서 당뇨병을 역전시키는 것으로 여겨지는 나트륨-글루코오스 공-수송체-2(SGLT2) 또는 CD33을 차단하도록 설계될 수 있다(Ablamunits et al., Diabetes 61 (2012), 145-154; Belghith et al., Nat Med 9 (2003), 1202-1208).
한 구현예에서, 본 발명의 항체의 재조합 Fab(rFab) 및 단일쇄 단편(scFv)를 이용하는 것이 유익할 수 있으며, 이는 세포막을 보다 쉽게 침투할 수 있다. 예를 들어, 온라인에 먼저 공개된 [Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134]는 Αβ의 N-말단 영역에서 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 WO-2의 키메라 재조합 Fab(rFab) 및 단일쇄 단편(scFv)의 이용을 기재한다. 가공된 단편은 효율적으로 (ⅰ) 아밀로이드 섬유화를 예방하고, (ⅱ) 사전 형성된 Αβ1-42 섬유를 분해하고, (ⅲ) 전체 IgG 분자만큼 시험관내 Αβ1-42 올리고머-매개된 신경독성을 저해할 수 있었다. 효과인자 기능이 없는 작은 Fab 및 scFv 가공된 항체 포맷을 이용하는 인지되는 장점에는 혈액-뇌 장벽에 걸친 보다 효율적인 통과 및 염증성 부작용의 유발 위험 최소화가 포함된다. 또한 scFv 및 단일-도메인 항체는 전장 항체의 결합 특이성을 보유하는데 더하여, 이들이 단일 유전자로 그리고 인트라바디로서 포유류 세포에서 세포내 발현될 수 있고, 이들의 표적의 폴딩, 상호작용, 개질 또는 세포하 편재의 변형 가능성을 갖는다; 리뷰에 대해서는, 예컨대 [Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401] 참조.
상이한 접근에서 [Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241]는 소위 'SuperAntibody 기술'이라는 기술 플랫폼을 설명하며, 이는 항체가 살아있는 세포에 해를 끼치지 않고 내부로 들어갈 수 있도록 만든다고 한다. 이러한 세포-침투 항체는 새로운 진단 및 치료 관점을 열어준다. 용어 '트랜스맙(TransMab)'이 이들 항체에 대해 새로 만들어졌다.
추가 구현예에서, 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 발생에 관련된 질환의 치료에 유용한 다른 항체의 공-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 한 구현예에서, 추가적인 항체가 본 발명의 약학적 조성물에 포함된다. 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있는 항체의 예에는 비제한적으로 CD33, SGLT2, IL-6 및 IL-1을 표적으로 하는 항체가 포함된다.
추가 구현예에서, 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환, 및/또는 당뇨병의 치료에 유용한 다른 제제의 공-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 한 구현예에서, 추가적인 제제가 본 발명의 약학적 조성물에 포함된다. 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있는 제제의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 인슐린 및 인슐린 유사체; 인슐린 신호전달 경로 조정제, 예컨대 단백질 티로신 포스파타아제(PTPase) 저해제, 글루타민-프룩토오스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라아제(GFAT)의 비-소분자 모사체 화합물 및 저해제, DPP-IV 저해제, 탈조절된 간 글루코오스 생산에 영향을 주는 제제, 예컨대 글루코오스-6-포스파타아제(G6Pase)의 저해제, 프룩토오스-1,6-비스포스파타아제(F-1,6-BPase)의 저해제, 글리코겐 포스포릴라아제(GP)의 저해제, 글루카곤 수용체 길항제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PEPCK)의 저해제, 피루베이트 탈수소효소 키나아제(PDHK) 저해제, 인슐린 감수성 증강제, 인슐린 분비 증강제, α-글루코시다아제 저해제, 위 배출 저해제; 글루카곤-유사-펩티드-1(GLP-1) 수용체 작동제; 설포닐우레아 제제; 비구아니드 제제, 예컨대 메트포르민; 알파-글루코시다아제 저해제; 페록시솜 증식제-활성화 수용체(PPAR)-작동제; 메글리티니드 제제; 디펩티딜-펩티다아제(DPP) IV 저해제; PDE1, PDE5, PDE9, PDE10 또는 PDE11(PDE-포스포디에스터라아제) 저해제; 아밀린 작동제(예컨대, 프람린티드 및 다른 아밀린 유사체); 신나몬; 글루카곤 수용체 길항제; 글리코겐-포스포릴라아제 저해제; 프룩토오스-1,6-비스포스페이트 저해제; 칸나비노이드(CB1) 수용체 길항제; 항-비만 약물, 예컨대 식욕 억제제, 포만감 증가 물질 및 에너지 소비 증가 약물; 소염 제제 및 이들의 임의의 조합. 임상적 췌장 섬 이식 후 섬 거부를 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있는 제제의 예에는 비제한적으로 시롤리무스(라파마이신), 칼시뉴린 저해제(예컨대, 타크롤리무스), 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, FTY 720, 시클로스포린, 코르티코스테로이드 및 항-IL2-수용체 모노클로날 항체(예컨대, 다클리주맵), 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체 작동제(예컨대, Noguchi et al., Acta Med. Okayama, 60 (2006), 및 국제 출원 WO2012088157 참조)를 포함하는 군의 제제가 포함된다. 따라서 한 구현예에서, 2형 당뇨병(T2D)을 치료하고/하거나 임상적 췌장 섬 이식 후 섬 거부를 치료하거나 예방하는데 유용한 추가적인 제제를 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 약학적 조성물과 동시에 이용될 수 있는 다른 제제의 예는 본 기술분야에 기재되어 있다; 예컨대, 국제 출원 WO2009005672, WO2010128092, WO2012088157 또는 유럽 출원 EP11158212.8 참조.
치료 유효 용량 또는 양은 증상 또는 상태를 완화하기 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 이러한 화합물의 치료적 유효성 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 절차, 예컨대 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50(모집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 간의 용량비는 치료 지수이며, 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 바람직하게는, 조성물 중 치료 제제는 대사성 장애, 예컨대 T2D의 경우 정상 혈당 제어 및/또는 인슐린 반응을 복원하거나 보존하기 충분한 양으로 존재한다.
상기로부터, 본 발명이 특히 전술한 바와 같은 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환, 예컨대 T2D의 진단 및/또는 치료를 위한, 상술된 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자의 임의의 용도를 포괄함이 자명하다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬이다. 또한, 본 발명은 이전에 본 명세서에 기재된 전술한 항체 중 임의의 하나의 항-개별특이형 항체에 관한 것이다. 이들은 항원-결합 부위 근처의 항체의 가변 영역 상에 위치하는 독특한 항원성 펩티드 서열에 결합하며, 예컨대 대상체로부터 수득되는 표본 중 항-IAPP 및/또는 항-프로IAPP 항체의 검출을 위해 유용한 항체 또는 다른 결합 분자이다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애의 예방적 처치, 치료적 처치 및/또는 진행 또는 치료에 대한 반응 모니터링에서 이용하기 위한 상기에서 본 명세서에 그리고 아래에 정의된 바와 같은 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 또는 이들 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 또는 진단 조성물을 제공하며, 바람직하게는 여기서 장애는 모든 유형의 당뇨병, 예컨대 1형 당뇨병, 임신 당뇨병, 전-당뇨병(고혈당증이 T2D 역치 또는 인슐린 내성에 도달하지 않은 경우) 및 성인의 잠복 자가면역 당뇨병(LADA); 췌장에 손상을 유도하고 이에 따라 당뇨병에 이를 수 있는 임의의 질환, 예컨대 만성 췌장염, 낭성 섬유증 및 췌장암; T2D 위험을 증가시키는 임의의 질환, 예컨대 알츠하이머 질환 및 헌팅턴 질환 또는 당뇨병에 연관된 것으로 본 명세서에 정의된 다른 신경변성 질환; 당뇨병 발생에 대한 위험 인자로서 또는 이전 당뇨병이 존재할 수 있는 상태로서의 일반적인 대사성 증후군; 당뇨병 발생에 대한 위험 인자로서 또는 이전 당뇨병이 존재할 수 있는 상태로서의 일반적인 섬 아밀로이드증; 당뇨병 발생에 대한 위험 인자로서 또는 이전 당뇨병이 존재할 수 있는 상태로서의 일반적인 비만; 비만 및 T2D에 연관되거나 연관되지 않는 임의의 심혈관 질환; 당뇨병 발생 위험을 또한 증가시킬 수 있는 T2D의 모든 결과, 예컨대 심장 질환, 뇌졸중, 당뇨병성 망막병증, 신장 부전, 신부전, 케톤산증 및 비케톤성 고삼투압성 혼수를 포함하는 군으로부터 선택된다. 상기 장애군은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애군으로 불릴 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 상술된 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 항체, 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 중 임의의 하나 및 선택적으로 검출에 적합한 수단, 예컨대 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 이들이 액상으로 이용되거나 고상 담체에 결합될 수 있는 면역분석에서 이용하기 적합하다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역분석의 예는 직접적 또는 간접적 포맷의 경쟁적 및 비경쟁적 면역분석이다. 이러한 면역분석의 예는 방사선 면역분석(RIA), 샌드위치(면역계측 분석), 유세포 측정 및 웨스턴 블롯 분석이다. 본 발명의 항원 및 항체는 여러 상이한 담체에 결합되고 이에 특이적으로 결합된 세포를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 널리 공지된 담체의 예에는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 천연 및 개질된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마그네타이트가 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 여러 상이한 표지 및 표지 방법이 존재한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 표지 유형의 예에는 효소, 방사선 동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생체발광 화합물이 포함된다; 또한 상기 본 명세서에 논의된 구현예 참조.
추가 구현예에 의해, IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 특히 본 발명의 항체는 또한 혈액 표본, 혈장 표본, 혈청 표본, 림프 표본 또는 임의의 다른 체액 표본, 예컨대 침 또는 소변 표본일 수 있는 시험된 개인으로부터의 체액 표본을 수득하고 체액 표본을 항체-항원 복합체 형성을 가능케 하는 조건 하에 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 개인에서 장애의 진단 방법에서 이용될 수 있다. 이어서 이러한 복합체의 수준이 당 분야에 공지된 방법에 의해 결정되고, 결정되고, 대조군 표본에서 형성된 것보다 유의미하게 더 높은 수준은 시험된 개인에서 질환을 시사한다. 동일한 방식으로, 본 발명의 항체에 의해 결합된 특정 항원이 또한 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 시험관내 면역분석에 관한 것이다.
상기 맥락에서, 본 발명은 또한 상기 목적을 위해 특이적으로 설계된 수단에 관한 것이다. 예를 들어, 항체-기반 어레이가 이용될 수 있고, 여기에는 예를 들어 IAPP 및/또는 프로IAPP를 특이적으로 인식하는 본 발명의 항체 또는 동등한 항원-결합 분자가 로딩된다. 마이크로어레이 면역분석의 설계는 [Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696]에 요약된다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인된 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자가 로딩된 마이크로어레이에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환의 진단 방법에 관한 것으로, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 표본에서 IAPP 및/또는 프로IAPP 및/또는 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체, 이들의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP-결합 분자로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 병리적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 존재는 대사성 장애, 예컨대 T2D를 시사하며, 생리적 IAPP 및/또는 프로IAPP 단량체 형태의 수준에 비해 병리적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 수준 증가는 상기 대상체에서 대사성 장애의 진행을 시사한다.
진단받을 대상체는 무증상이거나 질환에 대해 임상 전 단계일 수 있다. 바람직하게는, 대조군 대상체는 응집된 IAPP 및/또는 프로/IAPP에 관련된 질환, 예를 들어 췌장에 손상을 유도하고 이에 따라 만성 췌장염, 낭성 섬유증, 췌장암을 포함하여 당뇨병으로 이어질 수 있는 질환을 포함하는 T2D; 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환을 포함하는 T2D의 위험을 증가시키는 질환에서; 비만 및 T2D에 연관되거나 연관되지 않는 심혈관 질환에서; 및/또는 T2D 자체에 선행, 유도, 및/또는 연결/연합되거나 연관된 대사성 변화를 가지며, 여기서 병리적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 수준 및 기준 표준 사이의 유사성은 진단받을 대상체가 대사성 질환을 갖고 있거나 대사성 질환이 발생할 위험이 있다는 것을 시사한다. 제2 대조군으로서 대안적으로, 또는 부가적으로, 대조군 대상체는 대사성 질환을 갖지 않으며, 여기서 생리적 IAPP 및/또는 프로IAPP 단량체 및/또는 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 수준 및 기준 표준 사이의 차이는 진단받을 대상체가 대사성 질환을 갖거나 대사성 질환이 발생할 위험이 있다는 것을 시사한다. 바람직하게는, 진단받을 대상체 및 대조군 대상체(들)는 연령 매치된다. 분석될 표본은 병리적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP를 함유하는 것으로 추정되는 임의의 체액, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 복수, 침 또는 뇌척수액(CSF)일 수 있다.
생리적 IAPP 및/또는 프로IAPP 단량체 및/또는 병리적으로 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP의 수준은, 예컨대 웨스턴 블롯, 면역침전, 효소-연관된 면역 흡착 분석(ELISA), 방사선 면역분석(RIA), 형광 활성화된 세포 정렬(FACS), 2차원 겔 전기영동, 질량 분광측정(MS), 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-비행시간-MS(MALDI-TOF), 표면 증강된 레이저 탈착 이온화-비행시간(SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피(LC)에 이은 직렬 질량 분광측정(MS/MS), 및 레이저 밀도측정에서 선택된 하나 이상의 기법에 의한 IAPP 및/또는 프로IAPP의 분석을 포함하는 본 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게는, IAPP 및/또는 프로IAPP의 상기 생체내 조영은 양성자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 조영 또는 자기 공명 조영(MRI)을 포함한다.
IAPP 및/또는 프로IAPP의 검출 및 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환, 예컨대 T2D의 진단 또는 진행 모니터링 및 본 발명에 따라 채용될 수 있는 항체 및 관련된 수단을 이용한 이러한 질환의 치료 모니터링을 위한 항체 기반 방법은 또한 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함된 국제 출원 WO2003092619에 기재된다. 이들 방법은 기재된 바와 같이 그러나 본 발명의 IAPP 및/또는 프로IAPP 특이적 항체, 결합 단편, 유도체 또는 변이체와 함께 적용될 수 있다.
따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 또는 이들 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 또는 진단 조성물이 IAPP 및/또는 프로IAPP 관련된 장애의 예방적 처치, 치료적 처치 및/또는 진행 또는 치료에 대한 반응의 모니터링에서의 이용을 위해 제공된다. 따라서 일반적으로, 본 발명은 또한 대상체에서 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애(예컨대 섬 아밀로이드증 및 보통 섬 아밀로이드증이 선행되는 T2D)의 진단 또는 진행 모니터링 방법에 관한 것이며, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 표본 중 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재는 장애를 시사한다. 한 구현예에서, 대상체에서 섬 아밀로이드증의 진단 또는 진행 모니터링 방법이 제공되며, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 표본 중 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재는 전증상, 전구기 또는 임상적 2형 당뇨병(T2D) 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 베타-세포 부전을 시사하고, 생리적 IAPP 수준에 비해 또는 건강한 대조군 대상체 또는 동일한 대상체로부터의 대조군 표본에서 유래된 기준 표본에 비해 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 수준 증가는 상기 대상체에서 전증상, 전구기 또는 확립된 2형 당뇨병(T2D)의 진행 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 섬 부전을 시사한다. 본 기술분야의 기술자는 한 구현예에서 상기 방법이 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애군으로부터의 임의의 다른 장애의 진단 또는 진행 모니터링에도 이용됨을 이해할 것이다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체, 이들의 단편 및 항체 및 이들의 단편과 동일한 결합 특이성을 갖는 분자가 시험관내뿐만 아니라 생체내에서도 이용될 수 있으며, 진단에 더하여 치료적 적용도 추구될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 또한 인간 또는 동물 신체에서 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 치료 및/또는 진단 제제의 생체내 검출 또는 표적화를 위한 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자에 관한 것이다. 잠재적인 치료 및/또는 진단 제제는 대사성 질환, 예컨대 T2D의 치료에 유용한 치료 제제 및 이전에 본 명세서에 나타낸 바와 같은 잠재적 표지의 비제한적 열거로부터 선택될 수 있다. 생체내 조영에 대한 한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 상기 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자를 제공하며, 여기서 상기 생체내 조영은 양성자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 조영 또는 자기 공명 조영(MRI)을 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 또한 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은, 대상체에서 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관한 장애의 진단 또는 진행 모니터링 방법에 이용하기 위해 상기 특정된 생체내 조영 방법을 위한 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR, 또는 상기 분자를 포함하는 상기 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자를 제공한다.
Ⅶ. 응집 특이적 IAPP 에피토프를 갖는 펩티드
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 IAPP 및/또는 프로IAPP의 에피토프를 갖는 펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 항체 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 이들의 개질된 서열에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로서 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 71에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 펩티드는 본 발명의 임의의 항체, 바람직하게는 각각 항체 NI-203.19H8, 항체 NI-203.26C11 또는 항체 NI-203.15C7에 의해 인식된다.
본 발명의 한 구현예에서, 이러한 펩티드는 상기 대상체의 생물학적 표본 중 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계, 및 상술된 본 발명의 펩티드를 인식하는 항체 수준을 측정하고 필적하는 연령 및 성별의 건강한 대상체에서 확인되는 수준과 측정을 비교함으로써 상기 대상체에서 이러한 질환의 진단을 위해 이용되는 단계를 포함하여, 대상체에서 응집된 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 질환, 예컨대 T2D의 진단 또는 모니터링에 이용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 대상체의 생물학적 표본 중 상기 정의된 바와 같은 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 전증상 또는 임상적 2형 당뇨병(T2D) 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 베타-세포 부전을 시사하는 섬 아밀로이드증의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따르면, 본 발명의 상기 펩티드에 특이적인 측정된 항체의 상승된 수준은 상기 대상체에서 전증상 또는 임상적 2형 당뇨병(T2D) 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 베타-세포 부전의 진단 또는 상기 대상체에서 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애군으로부터의 임의의 다른 질환의 진단을 시사한다. 본 발명의 펩티드는 이전에 본 명세서에 기재된 바와 같이 각각 어레이, 키트 및 조성물로 제형화될 수 있다. 상기 맥락에서, 본 발명은 또한 섬 아밀로이드증의 진단 또는 진행 모니터링에 유용한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 각각 이전에 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 및/또는 펩티드를 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침과 함께 포함한다.
이들 및 다른 구현예가 본 발명의 설명 및 실시예에 개시되고 포괄된다. 본 발명에 따라 채용될 물질, 방법, 용도 및 화합물 중 임의의 하나에 관한 추가 문헌은, 예를 들어 전자 장치를 이용해서 공공 라이브러리 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들어 공공 데이터베이스 "Medline"이 이용될 수 있고, 이는 국립 위생 연구소(NIH)의 국립 생물공학 정보 센터 및/또는 국립 의약 라이브러리에 의해 호스팅된다. 추가 데이터베이스 및 웹 주소, 예컨대 유럽 분자 생물학 연구소(EMBL)의 일부인 유럽 바이오인포마틱스 연구소(EBI)의 것들은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 인터넷 검색 엔진을 이용해서도 수득될 수 있다. 후행 검색 및 현재 인지를 위해 유용한 관련 특허 정보 출처의 조사 및 생물공학에서 특허 정보의 리뷰가 [Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364]에 제공된다.
상기 개시는 본 발명을 일반적으로 설명한다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 용어는 2000년 개정되고 2003년 재인쇄된 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, ISBN 0 19 850673 2]에 제공된 바와 같은 정의로 주어진다. 몇몇 문헌이 본 명세서의 텍스트에 걸쳐 인용된다. 전체 서지학적 인용은 특허청구범위 바로 앞에 있는 명세서 말단에서 확인될 수 있다. 모든 인용된 참고문헌의 내용(본 출원에 걸쳐 인용된 문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 제조업체의 사양, 지침 등 포함)은 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함된다; 그러나 인용된 임의의 문헌이 본 발명에 대해 실제로 선행 기술임을 승인하는 것은 아니다.
도 1a 내지 도 1d: 가변 영역, 즉 인간 IAPP 항체 NI-203.9A2(A), NI-203.19H8(B), NI-203.26C11(C), NI-203.8E3(D), NI-203.11B12(E), NI-203.205F8(F), NI-203.9B3(G), NI-203.19F2(H), 및 NI-203.15C7(I)의 중쇄 및 카파/람다 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열. 골격(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)을 나타내며, CDR에는 밑줄을 친다. 중쇄 연결 영역(JH) 및 경쇄 연결 영역(JK)도 나타낸다. 클로닝 전략으로 인해, 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 FR1에 프라이머 유도된 변형을 잠재적으로 함유할 수 있으나, 이는 항체의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 공통 인간 항체를 제공하기 위해, 원래 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 데이터베이스의 관련 인간 생식 계열 가변 영역 서열과 함께 정렬하고 이에 따라 조정하였다; 예컨대, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅한 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 참조. N-말단 아미노산이 PCR 프라이머로 인해 공통 생식 계열 서열에서 잠재적으로 일탈한 것으로 간주되어 프라이머 유도된 돌연변이 교정(PIMC)으로 대체되었던 경우의 인간 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. PIMC-개질된 아미노산을 서열에서 진한 글씨로 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c: 가변 영역, 즉 인간 프로IAPP 항체 NI-203.1D10(A), NI-203.2A11(B), NI-203.10C4(C), NI-203.20H9(D), NI-203.26D2(E) 및 NI-203.60H3(F)의 중쇄 및 카파/람다 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열. 골격(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)을 나타내며, CDR에는 밑줄을 친다. 중쇄 연결 영역(JH) 및 경쇄 연결 영역(JK)도 나타낸다. 클로닝 전략으로 인해, 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 잠재적으로 FR1에 프라이머 유도된 변형을 함유할 수 있으나, 이는 항체의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 공통 인간 항체를 제공하기 위해, 원래 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 데이터베이스의 관련 인간 생식 계열 가변 영역 서열과 함께 정렬하고 이에 따라 조정하였다; 예컨대, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅된 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 참조. N-말단 아미노산이 PCR 프라이머로 인해 공통 생식 계열 서열에서 잠재적으로 일탈한 것으로 간주되어 프라이머 유도된 돌연변이 교정(PIMC)으로 대체되었던 경우의 인간 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. PIMC-개질된 아미노산을 서열에서 진한 글씨로 나타낸다.
도 3: 직접적 ELISA로 평가된 인간 재조합 항체의 IAPP-결합 특이성. (A) ELISA 플레이트 코팅에 이용된 IAPP 용액(2㎎/㎖)의 전자 현미경 이미지. 스케일 바는 1㎛를 나타낸다. (B) 재조합 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3은 인간 IAPP(10㎍/㎖)에 대해 특이적 결합을 나타내었다. BSA(10㎍/㎖)를 비특이적 결합을 결정하기 위한 대조군으로 이용하였다. 데이터는 450㎚에서의 OD값으로 표시된다.
도 4: IAPP 및 프로IAPP에 대한 재조합 인간-유래 항-IAPP 항체의 EC50 결정. (A) ELISA 플레이트 코팅에 이용된 IAPP 및 프로IAPP 용액(2㎎/㎖)의 전자 현미경 이미지. 스케일 바는 1㎛를 나타낸다. (B) 플레이트를 나타낸 농도의 재조합 인간-유래 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 또는 NI-203.8E3과 인큐베이션하였다. 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3은 각각 9nM, 22nM, 6nM 및 4nM의 EC50으로 인간 IAPP(■, 10㎍/㎖)에 높은 친화도로 결합한다. NI-203.26C11도 260nM의 EC50으로 프로IAPP(□, 10㎍/㎖)에 결합한다. 측정은 2개씩 수행하였고, BSA 상의 배경 신호를 감산하였다. 데이터는 450㎚에서의 평균 OD값으로 표시된다.
도 5: 인간-유래 항-IAPP 항체는 IAPP 섬유에 특이적이다. (A) ELISA 플레이트 코팅에 이용된 IAPP(2㎎/㎖) 및 비섬유상 IAPP(500㎍/㎖) 용액의 전자 현미경 이미지. IAPP 용액은 섬유를 함유하는 반면, 비섬유상 IAPP 용액에는 IAPP 섬유가 없다. 스케일 바는 1㎛를 나타낸다. (B) 플레이트를 나타낸 농도의 재조합 인간-유래 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 또는 NI-203.8E3과 인큐베이션하였다. NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체는 IAPP 섬유(IAPP 용액, ■, 10㎍/㎖)에 높은 친화도로 그리고 비섬유상 IAPP(Δ, 10㎍/㎖)에는 매우 낮은 친화도로 결합하여 IAPP 섬유에 대한 특이성을 제시한다. 측정은 2개씩 수행하였고, BSA 상의 배경 신호를 감산하였다. 데이터는 450㎚에서의 평균 OD값으로 표시된다.
도 6: Pepscan 분석으로 평가된 인간 재조합 항체의 IAPP 결합 에피토프. (A) 재조합 NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 인간-유래 항체(1㎍/㎖)의 Pepscan 이미지. NI-203.19H8 결합은 아미노산 19-25(펩티드 6: 16-LVHSSNNFGA-25 서열번호 6, 펩티드 7: 19-SSNNFGAILS-28 서열번호 8, 공통 결합 서열: 19-SSNNFGA-25 서열번호 4)를 커버하는 펩티드 6 및 펩티드 7(A열)에서 일어났다. NI-203.26C11 결합은 아미노산 1-10(펩티드 1: 1-KCNTATCATQ-10 서열번호 9)을 커버하는 펩티드 1(A열)에서 일어났지만 아미노산 4-13(펩티드 2: 4-TATCATQRLA-13 서열번호 10)을 커버하는 펩티드 2에서는 일어나지 않았다. 펩티드 33-39 및 41(C열) 상의 잔기 2-8에서의 알라닌 치환 또는 대체는 NI-203.26C11 결합을 손상시켰다(펩티드 33 돌연변이: C2A, 펩티드 34 돌연변이: N3A, 펩티드 35 돌연변이: T4A, 펩티드 36 돌연변이: A5G, 펩티드 37 돌연변이: A5P, 펩티드 38 돌연변이: T6A, 펩티드 39 돌연변이: C7A, 펩티드 41 돌연변이: A8P). 이차 HRP-콘주게이트 당나귀 항-인간 IgG Fcγ 단독(1:20,000; Ilary Ab)을 대조군으로 이용하였다. (B) 인간 IAPP 단백질 서열의 나타낸 아미노산 내 상이한 인간-유래 IAPP-특이적 항체의 확인된 결합 에피토프. 상부 패널: 전장 인간 IAPP의 아미노산 서열(아미노산 1-37). NI: 결합 에피토프가 확인되지 않음.
도 7a 내지 도 7d: NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 2형 당뇨병(T2D)으로 진단받은 환자의 췌장에서 병리적 IAPP 아밀로이드를 특이적으로 인식한다. NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 IAPP 섬유(아밀로이드)가 로딩된 T2D 췌장 섬에서 염색을 나타내지만(도 7a, 도 7b) IAPP 섬유가 없는 T2D 췌장 섬에서는 나타내지 않는다(도 7c, 도 7d). (도 7a) T2D 환자의 췌장 섬에서 아밀로이드의 티오플라빈 S(티오S, 왼쪽 패널) 및 콩고 레드(CR, 오른쪽 패널) 염색. (도 7b) 50nM(큰 패널 및 하부 왼쪽 삽입물) 및 5nM(하부 오른쪽 삽입물)로 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체를 이용한 아밀로이드 양성 T2D 췌장 섬에서의 IAPP 섬유의 검출(갈색-CR). (도 7c) 음성 티오플라빈 S(티오S, 왼쪽 패널) 및 콩고 레드(CR, 오른쪽 패널) 염색으로 나타난 바와 같은 T2D 환자의 췌장 섬에서의 아밀로이드 부재. (도 7d) 50nM로 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체를 이용한 아밀로이드 음성 T2D 췌장 섬에서의 염색 부재. 이차 당나귀 항-인간 항체 단독(Ilary Ab)을 대조군으로 이용하였다. 하부 삽입물: 개별 인간 췌장 섬의 고배율 이미지. 인간 췌장 섬을 항-인슐린 항체(원래(i.o.) 청색, 여기서는 진한 염색)로 염색하고 대조염색을 수행하여 세포 핵을 가시화하였다(i.o. 흐린 청색, 여기서는 흐린 염색).
도 8: NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 인간 대조군 췌장에서 생리적 IAPP를 인식하지 않는다. NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체(50nM)는 IAPP 대조군 항체(1:100; 대조군 Ab)에 비교될 때 인간 대조군 섬에서 약한 염색을 나타낸다. 이차 당나귀 항-인간 항체 단독(Ilary Ab)을 대조군으로 이용하였다. 인간 췌장 섬을 항-인슐린 항체(원래(i.o.) 청색, 여기서는 진한 염색)로 염색하고, 대조염색을 수행하여 세포 핵을 가시화하였다(i.o. 흐린 청색, 여기서는 흐린 염색).
도 9: NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 당뇨병 고양이 췌장에서 병리적 IAPP 섬유를 인식한다. NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체를 이용한 T2D 고양이의 췌장 섬에서의 IAPP 섬유 검출(50nM, 갈색-CR). IAPP 섬유(아밀로이드)를 콩고 레드(CR)로 염색하였다. 이차 당나귀 항-인간 항체 단독(Ilary Ab)을 대조군으로 이용하였다. 하부 왼쪽 삽입물: 개별 고양이 췌장 섬의 고배율 이미지. 고양이 췌장 섬을 항-인슐린 항체(원래(i.o.) 청색, 여기서는 진한 염색)로 염색하고, 대조염색을 수행하여 세포 핵을 가시화하였다(i.o. 흐린 청색, 여기서는 흐린 염색).
도 10: NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 알츠하이머 질환이 있는 인간 뇌에서 병리적 Αβ 침적물을 인식하지 않는다. Αβ-특이적 항체 6E10(1:2,000; 대조군 Ab)와 대비되는 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체(50nM)를 이용한 염색의 부재. 이차 당나귀 항-인간 항체 단독(Ilary Ab)을 대조군으로 이용하였다. 대조염색을 수행하여 세포 핵을 가시화하였다(i.o. 흐린 청색, 여기서는 흐린 염색).
도 11: 재조합 인간 및 마우스 키메라 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11은 인간 IAPP에 동일한 친화도로 결합한다. (A) IAPP(■, 10㎍/㎖) 및 BSA(◇, 10㎍/㎖)에 대한 재조합 인간 및 마우스 키메라 항-IAPP 항체의 EC50 결정. 플레이트를 나타낸 농도의 항체와 인큐베이션하였다. 측정은 2개씩 수행하였다. 데이터는 450㎚에서의 평균 OD값으로 표시된다. (B, C) 인간 및 마우스 키메라 항체의 EC50 값.
도 12: 재조합 마우스 키메라 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11은 2형 당뇨병(T2D)으로 진단받은 환자의 췌장에서 병리적 IAPP 섬유를 인식한다. 50nM로 키메라 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체를 이용한 두 인간 T2D 환자(1 및 2)의 췌장 섬에서의 IAPP 섬유 검출(i.o. 갈색, 여기서는 진한 색 내지 검은색 염색). 인간 췌장 섬을 항-인슐린 항체(i.o. 청색, 여기서는 진한 염색)로 염색하고, 대조염색을 수행하여 세포 핵을 가시화하였다(i.o. 흐린 청색, 여기서는 흐린 염색).
보다 완벽한 이해는 본 발명의 범위를 제한하려 하지 않고 단지 예시적인 목적으로 본 명세서에 제공되는 하기 특정 실시예를 참조하여 수득될 수 있다.
실시예 1: 인간 IAPP 항체의 표적 및 결합 특이성의 검정
단리된 항체의 인식된 표적으로 IAPP를 검증하기 위해, 직접적 ELISA 분석을 수행하였다. 예시적인 재조합 인간 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체에 대해, 96-웰 마이크로플레이트(Costar, Corning, USA)를 카보네이트 ELISA 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.42) 중 10㎍/㎖의 농도로 희석된 인간 IAPP 용액 또는 BSA(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)로 코팅하고, 항체의 결합 효율을 시험하였다. 중요하게는, ELISA 분석을 위해 이용된 인간 IAPP 용액은 전자 현미경에 의해 나타낸 바와 같이 IAPP 섬유를 함유하였다; 도 3의 A 참조. 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체는 ELISA에 의해 인간 IAPP 섬유에 특이적으로 결합한다. BSA에 대한 결합은 관찰되지 않는다; 도 3의 B 참조. 동일한 특징이 항체 NI-203.19F2 및 NI-203.15C7에도 적용되는 것으로 보인다.
예시적인 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3의 절반 최대 유효 농도(EC50)의 결정을 위해, 다양한 항체 농도를 이용하여 추가적인 직접적 ELISA 실험을 수행하였다. 96-웰 마이크로플레이트(Costar, Corning, USA)를 카보네이트 ELISA 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.42) 중에 10㎍/㎖의 농도로 희석된 인간 IAPP 및 인간 프로IAPP 용액으로 코팅하고 항체의 결합 효율을 시험하였다. ELISA 분석을 위해 이용된 인간 IAPP 용액은 IAPP 섬유를 함유하는 반면, 인간 프로IAPP는 전자 현미경에 의해 드러난 바와 같이 용액 중 큰 응집체를 형성하였다; 도 4의 A 참조. HRP가 콘주게이트된 당나귀 항-인간 IgGγ 항체(Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)를 이용한 뒤 표준 비색측정 분석에서 HRP 활성 측정에 의해 결합을 결정하였다.
EC50값은 GraphPad Prism(San Diego, USA) 소프트웨어를 이용해서 비선형 회귀에 의해 산정하였다. 재조합 인간-유래 항체 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3은 각각 9nM, 22nM, 6nM 및 4nM의 EC50으로 인간 IAPP 섬유에 고친화도로 결합한다. 항체 NI-203.26C11은 또한 나노몰 범위(260nM)의 EC50로 응집된 인간 프로IAPP에 결합한다; 도 4의 B 참조.
실시예 2: 비섬유상 인간 IAPP 에 대해서가 아닌 인간 IAPP 섬유에 대한 항체 특이성, 이에 따라 바람직하게는 입체형태 에피토프에 대한 결합
입체형태 에피토프에 대한 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체의 결합능을 결정하기 위해, 직접적 ELISA 실험을 카보네이트 ELISA 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.42) 중 10㎍/㎖의 농도로 희석된 인간 IAPP 및 비섬유상 IAPP 용액으로 수행하고, 항체의 결합능을 시험하였다. ELISA 분석에서 이용된 인간 IAPP 용액은 IAPP 섬유를 함유하지만, 인간 비섬유상 IAPP 용액은 전자 현미경에 의해 드러난 바와 같이 IAPP 섬유가 없고 작은 무정형 응집체만을 나타내었다; 도 5의 A 참조. HRP가 콘주게이트된 당나귀 항-인간 IgGγ 항체(Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)를 이용한 뒤 표준 비색측정 분석에서 HRP 활성 측정에 의해 결합을 결정하였다.
재조합 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체는 이전에 관찰된 바와 같이(도 4), IAPP 용액(도 5의 B)으로의 코팅시 IAPP 섬유에 대해 고친화도 결합을 나타내었다. IAPP 섬유(도 5의 B)에 비교되는 경우 비섬유상 IAPP 상에서 친화도 손실이 관찰되었고, 이에 따라 IAPP 섬유에 대한 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 및 NI-203.8E3 항체의 우선적 결합을 나타내었다. 예비 결과는 항체 NI-203.19F2 및 NI-203.15C7에 대해 상술된 바와 동일한 효과를 나타낸다.
이들 발견은 생리적 인간 IAPP 단백질 입체형태에 존재하는 선형 에피토프와 대조적으로, IAPP 섬유 형성시 주로 노출되고 접근 가능한 것으로 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2 및 NI-203.15C7 항체 결합 에피토프를 강력히 지적한다. 병리적 IAPP 섬유는 T2D 환자의 췌장 섬에서 관찰된다. NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2 및 NI-203.15C7 항체가 치료적으로 관련된 병리적 인간 IAPP 섬유에 대해 뚜렷한 결합을 나타내므로, 이들 인간-유래 항체는 T2D에서 치료적 잠재력을 갖는다.
실시예 3: NI -203.9A2, NI -203.19 H8 , NI -203.26 C11 , NI -203.8 E3 , NI -203.19F2, 및 NI -203.15 C7 항체의 결합 에피토프 평가
예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2, 및 NI-203.15C7 항체의 결합 에피토프를 결정하기 위해, pepscan 및 알라닌 스캔 분석을 전체 인간 IAPP 아미노산 서열을 맵핑하는 중복 펩티드 및 프로IAPP의 첫 번째 22개 아미노산 상의 알라닌 치환으로 수행하였다. 항체 결합능을 니트로셀룰로오스막(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) 상에 스포팅된 이들 펩티드 상에서 HRP-콘주게이트 당나귀 항-인간 IgGγ 이차 항체(Jackson immunoResearch, Newmarket, UK)에 이어 HRP 활성의 검출을 이용해서 시험하였다(도 6의 A).
재조합 NI-203.19H8, NI-203.26C11, 및 NI-203.15C7 항체(1㎍/㎖)는 인간 IAPP(도 6의 A 및 B) 상에서 서열 19-SSNNFGA-25(서열번호 4), 2-CNTATCA-8(서열번호 5), 및 10-QRLANFLVHS-19(서열번호 71)에 대한 결합을 나타내어 이들 항체의 추정 결합 에피토프 서열에 대응하였다. 재조합 NI-203.9A2, NI-203.8E3, 및 NI-203.19F2 항체(1 및 10㎍/㎖)의 에피토프는 확인되지 않았다.
실시예 4: 대조군 환자에서가 아닌 2형 당뇨병으로 진단받은 환자의 췌장에서 병리적 IAPP 섬유에 대한 NI -203.9A2, NI -203.19 H8 및 NI -203.26 C11 항체의 결합
2형 당뇨병(T2D)으로 진단받은 두 환자의 파라핀 임베딩된 췌장 섹션을 티오S 및 콩고 레드 염색시 관찰된 췌장 섬에서의 아밀로이드 부하에 기반하여 선택한 뒤 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체 결합 특징분석을 위해 이용하였다. 2형 당뇨병으로 진단받지 않은 환자의 파라핀 임베딩된 췌장 섹션을 대조군으로 이용하였다. 포름산 전처리 후, 섹션을 인간 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체(5 및 50nM) 또는 마우스 모노클로날 항-IAPP 항체(1:100; Abcam, Cambridge, UK)와 인큐베이션하고, 이어서 바이오티닐화된 당나귀 항-인간 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) 또는 바이오티닐화된 염소 항-마우스 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)와 인큐베이션하였다. 항체 신호를 Vectastain ABC-AP 키트(Vector Laboratories, USA)로 증폭하고 디아미노벤지딘 기질(Thermo Fisher Scientific, USA)로 검출하였다. 애비딘/바이오틴 차단 시(애비딘/바이오틴 차단 키트, Vector Laboratories, USA), 췌장 섬 β-세포를 바이오티닐화된 당나귀 항-기니아 피그 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA)에 커플링된 폴리클로날 기니아 피그 항-인슐린 항체(1:5; Dako, USA)를 이용해서 가시화하고 항체 신호를 Vectastain ABC-AP 키트(Vector Laboratories, USA)로 증폭하여 알칼린 포스파타아제 기질(Vector Laboratories, USA)로 검출하였다.
첫 번째 T2D 환자는 티오S 및 콩고 레드 염색으로 가시화되는 바와 같이, 병리적 IAPP 섬유에 대응하는 췌장 섬 내 큰 아밀로이드 침적을 나타내었다(도 7a). NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 인간 항체는 이들 아밀로이드 양성 섹션에 대해 뚜렷한 췌장 섬 염색을 나타내었다(도 7b). 항체 염색은 5nM에서 관찰되었고 50nM에서 증가되었으며, 이차 항체만으로는 염색이 관찰되지 않아서 인간 IAPP 항체의 특이적 결합을 제시하였다. 이들 발견은 췌장 섬에서 아밀로이드 침적을 나타내는 두 번째 T2D 환자에서 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 인간 항체는 아밀로이드 침적이 없는 세 번째 T2D 환자로부터(도 7c 및 도 7d) 및 T2D로 진단받지 않은 대조군 환자로부터(도 8)의 췌장 섬에서 어떠한 염색도 나타내지 않았다. 시판 마우스 모노클로날 항-IAPP 항체는 비-당뇨병 대조군 환자로부터의 췌장 섬에서 생리적 IAPP를 염색하였다; 도 8 참조. 본 발명의 항체는 또한 섬 아밀로이드 침적을 나타내는 당뇨병 고양이 췌장에서 양성 결과를 제공하였다; 도 9 참조. 동일한 결합 특성이 항체 NI-203.19F2 및 NI-203.15C7에도 적용되는 것으로 보인다.
이들 데이터는 NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.19F2 및 NI-203.15C7 항체가 병리적 IAPP 섬유를 특이적으로 인식하며, 시험관내 IAPP 섬유에 대해 강한 결합 특이성을 나타내는 이들 항체의 생화학적 결합 특성을 따른다는 것을 나타낸다(도 5).
실시예 5: NI -203.9A2, NI -203.19 H8 및 NI -203.26 C11 항체는 알츠하이머 질환으로 진단받은 환자의 뇌에서 병리적 Αβ 아밀로이드와 교차반응하지 않음
알츠하이머 질환으로 진단받은 환자의 파라핀 임베딩된 뇌 섹션을 예시적인 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체의 교차 반응성을 평가하기 위해 이용하였다. 포름산 전처리 후, 섹션을 인간 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체(50nM) 또는 마우스 모노클로날 항-β 아밀로이드 항체 6E10(1:2,000; Covance, Allschwill, Switzerland)와 인큐베이션하고, 이어서 바이오티닐화된 당나귀 항-인간 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) 또는 바이오티닐화된 염소 항-마우스 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)와 인큐베이션하였다. 항체 신호를 Vectastain ABC-AP 키트(Vector Laboratories, USA)로 증폭하고 디아미노벤지딘 기질(Thermo Fisher Scientific, USA)로 검출하였다.
NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체는 항-β 아밀로이드 특이적 항체 6E10과는 대조적으로 알츠하이머 질환 인간 뇌에서 병리적 Αβ 아밀로이드를 인식하지 않았다(도 10). 이는 항체 NI-203.19F2 및 NI-203.15C7에도 동일하게 적용되는 것으로 보인다.
이들 데이터는 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체가 병리적 Αβ 아밀로이드에 교차 반응성이 아님을 나타낸다. 따라서 직접적 ELISA에 의해 비제한적으로 알파-시누클레인, 수퍼옥시드 디스뮤타아제 1(SOD1), Tau 및 TAR-결합 단백질 43(TDP-43)을 포함하는 가장 뚜렷한 아밀로이드 형성 단백질을 포함하여 미스폴딩/응집 경향을 갖는 몇몇 단백질 후보에 대한 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체의 최소 교차 반응 결합이 또한 나타났다.
실시예 6: 마우스 키메라 NI -203.9A2, NI -203.19 H8 및 NI -203.26 C11 항체의 품질 제어
예시적인 마우스 키메라 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체를 검증하기 위해, 직접적 ELISA 분석을 상술된 바와 같이 수행하였다. 키메라 항체를 대응하는 인간 항체와 비교하였다. 예시적인 재조합 키메라 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체, 및 이들의 대응하는 인간 항체에 있어서, 96-웰 마이크로플레이트(Costar, Corning, USA)를 카보네이트 ELISA 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.42) 중 10㎍/㎖의 농도로 희석된 인간 IAPP 용액 또는 BSA(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)로 코팅하고, 키메라 및 인간 항체의 결합 효율을 시험하였다. HRP가 콘주게이트된 당나귀 항-인간 IgGγ 항체(Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)를 이용한 뒤 표준 비색측정 분석에서 HRP 활성 측정에 의해 결합을 결정하였다. 중요하게는, ELISA 분석에 이용된 인간 IAPP 용액이 전자 현미경으로 나타낸 바와 같이 IAPP 섬유를 함유하였다; 도 3의 A 참조. EC50값은 GraphPad Prism(San Diego, USA) 소프트웨어를 이용해서 비선형 회귀로 산정하였다.
NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 마우스 키메라 항체는 각각 18.6nM, 23.9nM 및 11.5nM의 EC50으로 인간 IAPP 섬유에 고친화도로 결합한다. BSA에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 키메라 항체의 결합 친화도는 이들의 인간 대응물과 유사하여, 각각 인간 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체에 대해 EC50 9.4nM, 22.9nM 및 6.8nM이었다; 도 11 참조.
예시적인 마우스 키메라 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체를 2형 당뇨병(T2D)으로 진단받고 섬 아밀로이드 침적을 나타내는 두 선택된 환자의 파라핀 임베딩된 췌장 섹션에서 추가 검증하였다. 포름산 전처리 후, 섹션을 키메라 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체(50nM)와 인큐베이션하고, 이어서 바이오티닐화된 당나귀 항-인간 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)와 인큐베이션하였다. 항체 신호를 Vectastain ABC-AP 키트(Vector Laboratories, USA)로 증폭하고 디아미노벤지딘 기질(Thermo Fisher Scientific, USA)로 검출하였다. 애비딘/바이오틴 차단 시(애비딘/바이오틴 차단 키트, 벡터 Laboratories, USA), 췌장 섬 β-세포를 바이오티닐화된 당나귀 항-기니아 피그 이차 항체(1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA)에 커플링된 폴리클로날 기니아 피그 항-인슐린 항체(1:5; Dako, USA)를 이용해서 가시화하고 항체 신호를 Vectastain ABC-AP 키트(Vector Laboratories, USA)로 증폭하여 알칼린 포스파타아제 기질(Vector Laboratories, USA)로 검출하였다.
NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 키메라 항체는 두 T2D 환자로부터의 아밀로이드 양성 섹션 상에서 뚜렷한 췌장 섬 염색을 나타내었다(도 12). 이들 데이터는 키메라 NI-203.9A2, NI-203.19H8 및 NI-203.26C11 항체가 이들의 인간 대응물에 필적하는 효율로 병리적 IAPP 섬유를 특이적으로 인식함을 나타낸다(도 12).
실시예 7: T2D 동물 모델에서 IAPP 및/또는 프로 IAPP 항체의 치료 효과의 생체내 검증
선도 항체 후보를 hIAPP을 발현하는 두 유전자삽입 마우스 모델 및 래트 모델에서 검증한다: 1) 고지방 식이에 노출된 h-IAPP(반접합체)/C57BL/6/DBA 마우스(Hull et al. (2003), Diabetes 52: 372-379); 2) 표준 식이에 노출된 h-IAPP(반접합체) Avy/A 마우스(Butler et al. (2003), Diabetes 52: 2304-2314); 3) 표준 식이에 노출된 h-IAPP(동종접합)/CD 래트(Butler et al. (2004), Diabetes 53: 1509-1516). 치료 유효성을 췌장에서 베타-세포 양 및 hIAPP 아밀로이드 부하뿐만 아니라 hIAPP의 혈장 수준 결정 및 글루코오스 대사 및 인슐린 분비의 기능적 시험에 의해 평가한다.
1) 생리적 특징
본 출원의 항체의 적용이 예방적 및/또는 치료적 효과를 나타내는지를 확인하기 위해, Ⅱ형 당뇨병 동물 모델의 하기 생리적 특징 (ⅰ) 내지 (ⅶ)을 시험한다.
(ⅰ) 혈중 글루코오스:
T2D 동물 모델의 혈중 글루코오스 수준을 시험하고, 미처리 동물 및 일반(T2D 모델이 아님) 계통 동물과 비교한다.
본 명세서에서 "일반 계통 마우스"는 특별히 제한되지 않으며, 이것이 혈중 글루코오스 수준, 뇨당, 인슐린 분비 등에서 비정상을 나타내지 않는 한 임의의 마우스일 수 있다. "일반 계통 마우스"의 바람직한 예에는 KOR 마우스, NC 마우스, 및 유사유전자형 마우스의 생성에서 반복적 부모로 이용되는 실험실 마우스(예컨대, C3H/He 마우스, BALB/c 마우스, 및 C57BL/6 마우스)가 포함된다.
본 명세서에서 "일반 계통 래트"는 특별히 제한되지 않으며, 이것이 혈중 글루코오스 수준, 뇨당, 인슐린 분비 등에서 비정상을 나타내지 않는 한 임의의 래트일 수 있다.
마우스 및 래트 모델에서 당뇨병이 바람직하게는 hIAPP의 유전자삽입 발현에 의해 유도되므로, 바람직하게는 동일한 계통이 유전자삽입 동물의 생성을 위해 원래 이용된 것의 대조군으로 이용된다.
"일반 계통 마우스/래트에 비해 더 높은 혈중 글루코오스 수준을 갖는"이라는 표현은 공복시 혈중 글루코오스 수준(혈중 글루코오스 농도)이 공복시 일반 계통 마우스/래트보다 높음을 의미한다. 당뇨병 동물의 130㎎/㎗ 이상, 보다 바람직하게는 140㎎/㎗ 이상, 더 바람직하게는 200㎎/㎗ 및 더욱 더 바람직하게는 300㎎/㎗ 이상의 혈중 글루코오스 수준이 더 높은 혈중 글루코오스로 분류된다. 또한 본 명세서에서 이용되는 용어 "공복"은 마우스/래트의 공복 시작 후 약 12시간째의 상태를 의미한다.
본 발명에서, "혈중 글루코오스 수준"은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 이후 본 명세서에서 실시예에 기재된 방법에 따라 시판 측정 장치(예컨대, Medisafe 측정기; Terumo Co., Ltd.)를 이용하여 측정될 수 있다.
혈중 글루코오스 수준 측정의 예시적 방법
대상체 동물의 혈중 글루코오스 수준(혈중 글루코오스 농도)을 시판 측정 장치(Medisafe 측정기, Terumo Co., Ltd.)를 이용해서 측정한다. 상기 장치의 측정 원리가 아래에 설명될 것이다. 측정은 비색측정 분석에 기반한다. 측정 칩을 제조하고, 칩 상에 촉매로 글루코오스 옥시다아제 및 페록시다아제 그리고 발색제로 4-아미노안티피린 및 N-에틸-N(2-히드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘을 배치한다. 모세관 현상을 통해 흡수된 혈액 표본을 상기 칩에 배치하면 혈중 글루코오스가 글루코오스 옥시다아제에 의해 산화된다. 이어서 칩 상의 발색제가 상기 시점에 생성된 과산화수소 및 페록시다아제에 의해 산화되고, 적보라색이 나타난다. 혈중 글루코오스의 양을 상기 색조 정도를 측정하여 계산한다.
여기서 혈액 표본으로 대상체 동물로부터 4㎕의 전혈을 수득하고, 18초 측정 시간을 이용해서 측정한다.
(ⅱ) 글리코실화된 헤모글로빈( HbA1c ) 농도:
Ⅱ형 당뇨병 동물 모델을 증가된 혈중 글리코실화된 헤모글로빈 농도에 대해 시험하고 미처리 T2D 모델 동물 및 일반, 비-T2D 모델 동물과 비교한다. 2.5% 이상, 2.6% 이상, 또한 2.8% 이상, 및 또한 3.0% 이상 농도를 증가된 것으로 분류한다.
본 명세서에서 이용되는 "글리코실화된 헤모글로빈 농도"는 적혈구에서 이들에 부착된 글루코오스를 갖는 헤모글로빈 분자의 비율을 의미한다. 글리코실화된 헤모글로빈 농도는 당뇨병 환자에 대한 치료 제어의 적절성을 판단하기 위한 지수로 이용될 수 있고, 현 시점보다 1 내지 2개월 빠른 시점의 혈당 수준과 더 잘 연관되는 것으로 알려져 있다.
"글리코실화된 헤모글로빈 농도"는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 이후 본 명세서에서 실시예에 기재된 방법에 따라 시판 측정 장치(예컨대, DCA 2000 시스템; Bayer Medical Ltd.)를 이용해서 측정될 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어 전술한 DCA 2000 시스템이 측정 장치로 이용되는 경우, 총 헤모글로빈량은 티오시안-메트헤모글로빈 방법에 의해 측정되며, 글리코실화된 헤모글로빈량은 라텍스 응집 저해 반응에 의해 측정된다.
(ⅲ) 뇨당 :
대조군 동물 및 T2D 모델 동물의 뇨당이 본 명세서에서 시험된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "뇨당에 대한 시험에서 양성"은 동물에 의해 배출되는 소변 중 글루코오스 농도가 100㎎/㎗ 이상임을 의미한다. 소변 글루코오스 농도는 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 시판 키트(예컨대, Pretest; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 이용해서 이후 본 명세서에서 실시예에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 Pretest가 측정 키트로 이용되는 경우, 동물 소변 표본을 먼저 Pretest의 시험지에 놓고, 30초 후 - 부터 +4까지의 범위인 5 등급으로의 분류를 위해 상기 키트에서 특정된 색상표에 따라 판단을 수행한다. 판단 결과로부터 산정된 소변 글루코오스 농도는 +1에 대해 100-250㎎/㎗, +2에 대해 250-500㎎/㎗, +3에 대해 500-2,000㎎/㎗, 및 +4에 대해 2,000㎎/㎗ 이상이다. +1 이상의 판단 결과는 "뇨당에 대한 시험에서 양성"인 것으로 평가된다.
뇨당 측정의 예시적인 방법
대상체 동물의 소변 글루코오스(뇨당)를 본 기술분야의 기술자에게 공지된 방법, 예컨대 시판 키트(Pretest; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 이용해서 측정한다. 먼저 동물 소변 표본을 전술한 Pretest의 시험지 내로 블로팅하고, 30초 후 - 부터 +4까지의 범위인 5 등급으로의 분류를 위해 특정된 색상표에 따라 판단을 수행한다. 판단 결과로부터 산정된 소변 글루코오스 농도는 +1에 대해 100-250㎎/㎗, +2에 대해 250-500㎎/㎗, +3에 대해 500-2,000㎎/㎗, 및 +4에 대해 2,000㎎/㎗ 이상이다. +1 이상의 판단 결과는 "뇨당에 대한 시험에서 양성"인 것으로 평가된다.
(ⅳ) 혈중 인슐린 농도:
Ⅱ형 당뇨병 동물 모델의 혈중 인슐린 농도가 미처리 및 비-당뇨병 대조군 동물(일반 계통 동물)에서와 동등 이상인 수준에 비교되는지를 시험한다.
혈중 인슐린 농도가 "일반 계통 동물에서와 동등 이상"이라는 표현은 공복시 혈중 인슐린 농도가 공복시 일반 계통 동물에서와 동등 이상, 예컨대 90pg/㎖ 이상, 또는 110pg/㎖ 이상임을 의미한다.
본 발명에서, "혈중 인슐린 농도"는 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 이후 본 명세서에서 실시예에 기재된 방법에 따라 Levis 인슐린 분석 키트 U-유형(Shibayagi Co.)을 이용하여 측정할 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어 항-인슐린 모노클로날 항체(마우스)를 플레이트 상에 고정하고, 표본 중의 인슐린을 여기에 결합시킨 뒤 인슐린의 다른 부위를 인식하는 바이오틴-표지된 항-인슐린 모노클로날 항체를 그와 반응시키고, 페록시다아제-애비딘 콘주게이트를 여기에 추가 첨가하여 바이오틴에 결합시키고, 마지막으로 발색 물질을 첨가하여 발색에 의해 인슐린을 측정한다.
혈중 인슐린 농도 측정의 예시적 방법
대상체 마우스의 혈중 인슐린 농도는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 측정된다. 예컨대, 시판 키트(Levis 인슐린 분석 키트 U-유형; Shibayagi Co.) 내로 도입된다. 인슐린 농도는 하기 방식으로 측정된다. 항-인슐린 모노클로날 항체를 플레이트 상에 고정하고, 표본 중의 인슐린을 여기에 결합시킨 뒤 인슐린의 다른 부위를 인식하는 바이오틴-표지된 항-인슐린 모노클로날 항체를 반응시키고, 페록시다아제-애비딘 콘주게이트를 여기에 추가 첨가하여 바이오틴에 결합시키고, 마지막으로 발색 물질을 첨가하여 발색에 의해 인슐린을 측정한다. 측정 범위는 일반적으로 일반 동물(마우스)에 대해 39 내지 2,500pg/㎖이다.
(ⅴ) 글루코오스 내성:
처리 및 미처리 T2D 모델 동물 및 일반 동물을 비정상적인 글루코오스 내성에 대해 시험한다.
동물의 글루코오스 내성이 정상인지 비정상인지 여부는 글루코오스 내성 시험에 의해 확인할 수 있다. 글루코오스 내성 시험은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 절차에 따라, 예를 들어 체중 1g 당 2㎎의 글루코오스를 공복(적어도 12시간째) 동물에 복강내 투여하고 글루코오스 내성 시험 동안 특정 시점에(예를 들어 240분에 걸쳐 15분마다) 동물의 혈중 글루코오스 수준을 측정하여 수행할 수 있다. 결과에서 혈중 글루코오스 수준이 일반 마우스에 대한 것에 비해 경시적으로 감소하는 경향을 나타내지 않는 것으로 나타나면, 글루코오스 내성은 비정상으로 평가된다. 처리 동물에서의 결과가 미처리 동물에 대한 것에 비해 경시적으로 감소하는 경향을 나타내는 경우, 본 발명의 항체 처리가 효과적인 것으로 분류된다.
글루코오스 내성 시험의 예시적 방법
대상체 동물의 글루코오스 내성을 글루코오스 내성 시험으로 평가한다.
글루코오스 내성 시험은 먼저 체중 1g 당 2㎎의 글루코오스를 12시간째 공복 동물에 복강내 투여한 뒤 240분에 걸쳐 15분마다 동물의 혈액(말초 혈액) 중 글루코오스 수준을 측정하여 수행한다. 혈중 글루코오스 수준은 전술한 방법에 의해 측정된다. 결과에서 혈중 글루코오스 수준이 일반 동물에 대한 것에 비해 경시적으로 감소하는 경향을 나타내지 않는 것으로 나타나면, 글루코오스 내성은 비정상으로 평가된다. 미처리 T2D 모델 동물에 비해 처리된 동물에서 경시적으로 더 빠른 감소가 본 발명의 치료 유효성 징후로 평가된다.
(ⅵ) 인슐린 감수성:
처리 및 미처리 T2D 모델 동물 및 일반 동물을 비정상적인 인슐린 감수성에 대해 시험한다.
동물의 인슐린 감수성이 정상인지 비정상인지 여부는 인슐린 감수성 시험에 의해 확인할 수 있다. 인슐린 감수성 시험은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 절차에 따라, 예를 들어 체중 1㎏ 당 0.5-0.85U의 인슐린을 공복 동물에 복강내 투여하고 인슐린 감수성 시험 동안 특정 시점에(예를 들어 240분에 걸쳐 15분마다) 동물의 혈중 글루코오스 수준을 측정하여 수행할 수 있다. 결과에서 혈중 글루코오스 수준이 일반 마우스에 대한 것에 비해 경시적으로 감소하는 경향을 나타내지 않는 것으로 나타나면, 인슐린 감수성은 비정상으로 평가된다. 처리 동물에서의 결과가 미처리 동물에 대한 것에 비해 경시적으로 감소하는 경향을 나타내는 경우, 본 발명의 항체 처리가 효과적인 것으로 분류된다.
인슐린 감수성 평가의 예시적 방법
대상체 동물의 인슐린 감수성을 인슐린 감수성 시험에 의해 평가한다.
인슐린 감수성 시험은 먼저 체중 1㎏ 당 0.5-0.85U의 인슐린을 12시간째 공복 동물에 복강내 투여하고 240분에 걸쳐 15분마다 동물의 혈액(말초 혈액) 중 글루코오스 수준을 측정하여 수행한다. 혈중 글루코오스 수준은 전술한 방법에 의해 측정된다. 결과에서 혈중 글루코오스 수준이 일반 동물에 대한 것에 비해 경시적으로 감소하는 경향을 나타내지 않는 것으로 나타나면, 인슐린 감수성은 비정상으로 평가된다. 미처리 T2D 모델 동물에 비해 처리된 동물에서 경시적으로 더 빠른 감소가 본 발명의 치료 유효성 징후로 평가된다.
(ⅶ) 기타:
다음증 및 다뇨증의 평가
Ⅱ형 당뇨병 모델 동물을 당뇨병 개시 후 및 본 발명의 항체 처리 동안 증가된 물 음용 및 증가된 배뇨 경향을 나타내는지에 대해 시험한다. 증가된 물 음용 경향은, 예를 들어 사육 케이지에 배치된 물병 내 물 부피의 감소 속도를 주의 깊게 모니터링하고 이를 일반 계통 동물 및 미처리 동물에서와 비교하여 확인할 수 있다. 또한 증가된 배뇨 경향은, 예를 들어 사육 케이지의 바닥 시트 습윤 정도를 관찰하고 이를 이전에 나타낸 바와 같이 비교하여 확인할 수 있다.
마우스에서 비만 경향의 존재 또는 부재 판단
처리, 미처리 T2D 모델 동물 및 일반 동물의 체중을 측정하고 비교한다. 미처리 동물 및/또는 필적하는 체중의 처리 및 일반 동물에 비해 처리 동물의 감소된 체중이 본 발명의 처리 유효성 징후로 평가된다.
2) 조직병리학적 검사
Ⅱ형 당뇨병 동물, 미처리 T2D 모델 대조군 및 일반 동물의 췌장 조직을 췌장 섬(랑게르한스 섬) β-세포 상 아밀린의 아밀로이드 침적에 대해 실시예 4의 방법에 따라 고정하고, 파라핀에 임베딩하고, 염색하고, 분석한다. 유사하게 β-세포 아폽토시스 및 β-세포 생존을 적절한 마커(예컨대, 아폽토시스에 대해 TUNEL 및 절단된 카스파아제-3 염색 및 β-세포 영역에 대해 인슐린 염색)를 이용한 면역염색에 의해 평가한다. 미처리 동물 또는 필적하는 수준의 처리 동물 및 일반 동물에 비해 처리 동물에서 췌장 섬에서의 아밀로이드 침적 및/또는 β-세포 아폽토시스 감소 및/또는 β-세포 생존 증가가 본 발명의 예방적 및/또는 치료적 방법의 유효성 징후로 평가된다.
3) 동물의 사육
Ⅱ형 당뇨병 동물 모델은 이전에 기재된 바에 따라 SPF 조건 하에 유지된다(Hull et al. (2003), Diabetes 52: 372-379; Butler et al. (2003), Diabetes 52: 2304-2314; Butler et al. (2004), Diabetes 53: 1509-1516); 6주령에, h-IAPP(반접합체)/C57BL/6/DBA 마우스를 섬 아밀로이드 형성을 촉진하는 것으로 나타난 고지방 식이에 배정한다(Hull et al. (2003), Diabetes 52: 372-379).
<110> Neurimmune Holding AG <120> HUMAN ISLET AMYLOID POLYPEPTIDE (HIAPP) SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 2015-FPA-6942 <150> EP12184134.0 <151> 2012-09-12 <150> US 700,110 <151> 2012-09-12 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> The amino acid sequence of 37 aa of human IAPP with a disulfide bridge between cysteine residues 2 and 7 and an amidated C-terminus <220> <221> DISULFID <222> (2)..(7) <223> Disulfide bridge between cysteine residues 2 and 7 <400> 1 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 2 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(89) <223> 89 amino acid precursor of hIAPP produced in pancreatic beta-cells <300> <308> UniProtID/P10997 <309> 1989-07-01 <313> 1-89 <400> 2 Met Gly Ile Leu Lys Leu Gln Val Phe Leu Ile Val Leu Ser Val Ala 1 5 10 15 Leu Asn His Leu Lys Ala Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys 20 25 30 Arg Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 35 40 45 Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn 50 55 60 Val Gly Ser Asn Thr Tyr Gly Lys Arg Asn Ala Val Glu Val Leu Lys 65 70 75 80 Arg Glu Pro Leu Asn Tyr Leu Pro Leu 85 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(67) <223> PreproIAPP is rapidly cleaved after translation into proislet amyloid polypeptide (proIAPP) <400> 3 Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys Arg Lys Cys Asn Thr Ala 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 35 40 45 Gly Lys Arg Asn Ala Val Glu Val Leu Lys Arg Glu Pro Leu Asn Tyr 50 55 60 Leu Pro Leu 65 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linear epitope recognized by antibody NI-203.19H8 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> unique linear epitope recognized by antibody NI-203.19H8 <400> 4 Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unique linear epitope recognized by antibody NI-203.26C11 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> unique linear epitope recognized by antibody NI-203.26C11 <400> 5 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 6 of the pepscan covering aa 16-25 of IAPP <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> peptide 6 of the pepscan covering aa 16-25 of IAPP <400> 6 Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide derived from human proIAPP (N-terminal fragment) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> synthetic peptide derived from human proIAPP (N-terminal fragment) <400> 7 Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys Arg Lys Cys Asn Thr Ala 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Gln Arg 20 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 7 of the pepscan comprising aa 19-28 of hIAPP <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> peptide 7 of the pepscan comprising aa 19-28 of hIAPP <400> 8 Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 1 of the pepscan comprising aa 1-10 of huamn IAPP <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> peptide 1 of the pepscan comprising aa 1-10 of huamn IAPP <400> 9 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 2 of the pepscan comprising aa 4-13 of huamn IAPP <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> peptide 2 of the pepscan comprising aa 4-13 of huamn IAPP <400> 10 Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> NI-203.9A2-VH variable heavy chain (VH) sequence, wherein Val at position 5 can also be Leu <220> <221> V_region <222> (76)..(93) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(197) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(330) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 11 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg agg ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acg ttt agc acc ttt 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca act att agt ggt agt ggt gat aat aca tac tat gca gac tcc ctg 192 Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca cta tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa gtg aac agc ctg aga ccc gag gac acg gcc gtt tat tac tgt 288 Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa agt ccc tcg tca ctt ctg gcc acc tac ttt gac tac tgg ggc 336 Ala Lys Ser Pro Ser Ser Leu Leu Ala Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-203.9A2-VL variable light chain (VK) sequence, wherein Glu at position 1 can also be Asp, Val at position 3 can also be Gln and Leu at position 4 can also be Met <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (147)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 13 gaa att gtg ttg aca cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct gta gga 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt gag agt att aat agc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Ser Trp 20 25 30 ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa ggc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aag gcg tct agt tta caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gat gat ttt gca act tat tac tgc caa cag cac aat agt tat tgg acg 288 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Ser Tyr Trp Thr 85 90 95 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 318 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <223> NI-203.19H8-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(333) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 15 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg acg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct ggg ttc acc ttc agc agt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggc ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca att ata tgg tat gat gga agt aag gaa tat tat gca gac tcc ctg 192 Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 aag ggc cga gtc acc atc tcc aga gac aat tcc gag aac act ctc tat 240 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa ctg cac acc ctg aga gtc gag gac acg gct gtg tat ttc tgt 288 Leu Gln Leu His Thr Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg agg aca atc gca tcg gcc acc gtg gac cac ggt atg gac gtc tgg 336 Ala Arg Thr Ile Ala Ser Ala Thr Val Asp His Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-203.19H8-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (147)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 17 gat gtt gtg atg act cag tct cct tcg tcc gtg tct gca tct gta gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cac gat att agc acc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Thr Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aga cca ggg aaa gcc cct aac ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 ttt gga gca tcg agg ttg caa agt ggg gtc tca cca agg ttc agc ggc 192 Phe Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag act aac aat ttc cct ccc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Asn Phe Pro Pro 85 90 95 acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> NI-203.26C11-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(111) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(330) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 19 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ttg gtg aag cct tct cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 aat tac tac tgg acc tgg atc cgg cag ccc gcc ggg aag gga ctg gag 144 Asn Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cat atc tat tcc agt ggg acc acc aat tac aac ccc tcc 192 Trp Ile Gly His Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc gag agt cga gtc acc att tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc 240 Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agc ctg aac tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtt tat tac 288 Ser Leu Ser Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga cca ctg gct aca gtt ccg gat gct ttt aat atc tgg ggc 336 Cys Ala Arg Pro Leu Ala Thr Val Pro Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly 100 105 110 caa ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <223> NI-203.26C11-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(114) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (160)..(180) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (277)..(303) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 21 gaa att gtg atg act cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc atc aag tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc 96 Glu Arg Ala Thr Ile Lys Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 aat aag aac ttc tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag cct cct 144 Asn Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa tta ctc att tac tgg gca tct act cgg gaa tcc ggg gtc cct gac 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag cag tat tat 288 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 85 90 95 agt aat cct aac act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gag atc aaa 333 Ser Asn Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> NI-203.8E3-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(339) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 23 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aaa cct ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agt agt cac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 act atc agc tgg gtg cga cag gcc cct ggg caa ggg ctt gag tgg atg 144 Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga ggg atc atc ccc atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttt 192 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag gac aga gtc acg gtt acc gcg gac aaa tcc acg aat aca gcc tac 240 Gln Asp Arg Val Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ttg agt agc ctc aga cct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aag ggg gaa ctg gaa cca cga atc ctc tac tac tac ggt atg gac 336 Ala Lys Gly Glu Leu Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 gtc tgg ggc cga ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 372 Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> NI-203.8E3-VK variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(117) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (163)..(183) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (280)..(306) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 25 gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt caa agc ctc gta tac agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 gat gga aac acc tac ttg aat tgg ttt cac cag agg cca ggc caa tct 144 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca agg cgg cta att tat aag gtt tct aat cgt gac tct ggg gtc cca 192 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac aga ttc agc ggc agt ggg tca ggc act gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc agg gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 tca aat tgg cca ggg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336 Ser Asn Trp Pro Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> NI-203.11B12-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(339) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 27 cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca atg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc acc aac tac 96 Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 tat tta cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa gga ctt gag tgg atg 144 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga ata atc aac cct agt gct ggt agc aca agc tac gca cag aag ttc 192 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc agg gac acg tcc acg agc aca gtc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctg agc agc ctg aaa tct gaa gac acg gcc gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gat tcc gct ggg ata cag ata tgg ttc agg gat gct ttt gat 336 Ala Arg Asp Ser Ala Gly Ile Gln Ile Trp Phe Arg Asp Ala Phe Asp 100 105 110 atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 372 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <223> NI-203.11B12-VL variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (277)..(303) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 29 cag cct gtg ctg act cag cca ccc tct gcc tct gct tcc ctg gga tcc 48 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtc aag ctc acc tgc act ctg aac agt ggg cac agt agc tac acc 96 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Asn Ser Gly His Ser Ser Tyr Thr 20 25 30 atc gca tgg cat cag cag cag cca ggg aag gcc cct cgg tac ttg atg 144 Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45 aag gtt gaa cat aat gga aac tac aac aag ggg agc gga ctt cct gat 192 Lys Val Glu His Asn Gly Asn Tyr Asn Lys Gly Ser Gly Leu Pro Asp 50 55 60 cgc ttc tca ggc tcc agc tct ggg gct gac cgc tac ctc gcc atc tcc 240 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Ser 65 70 75 80 aac ctc cag tct gag gat gag gct gat tat tac tgt gag acc tgg gac 288 Asn Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp 85 90 95 act agc act agg gtc ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 333 Thr Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 31 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> NI-203.205F8-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (157)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(351) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 31 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc ccc gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt gac tcc gtc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 agt tac tac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag 144 Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac aac ccc tcc 192 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gta tat tcc 288 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Ser 85 90 95 tgt gcg aga gtc ccc tat ggt tac gga tat agg ggc tac gat ggg gct 336 Cys Ala Arg Val Pro Tyr Gly Tyr Gly Tyr Arg Gly Tyr Asp Gly Ala 100 105 110 tgg tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 384 Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-203.205F8-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (69)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 33 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac cgg ttc act 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Arg Phe Thr 85 90 95 ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 318 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> NI-203.9B3-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(324) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 35 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tca gga ttc acc ttc agt agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt atc tgg tat gat gga act aag aag tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc acc tcc aga gac aat tcc aag aat acg ctg tct 240 Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac tcg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggc ttt agc agc agc tgg gag ttt ggg ttc tgg ggc cag gga 336 Ala Arg Gly Phe Ser Ser Ser Trp Glu Phe Gly Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> NI-203.9B3-VL variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(300) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 37 cag tct gcc ctg act cag cct ccc tcc gcg tcc ggg tct cct gga cag 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 tca gtc acc atc tcc tgc act gga acc agc ggt tac att tat ggt tat 96 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Gly Tyr Ile Tyr Gly Tyr 20 25 30 aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac ccc ggc aaa gcc ccc aaa gtc 144 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val 35 40 45 atg att tat gag gtc act aag cgg ccc tca ggg gtc cct gat cgc ttc 192 Met Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc gtc tct ggg ctc 240 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 cag gct gag gat gag gct gtt tat tac tgc gcc tca tat gca ggc agc 288 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 aac aat gta gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 330 Asn Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 39 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-203.1D10-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 39 gag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gca gaa gtg aag aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctc aga atc tcc tgt aag gct tct gga tac agc ttc acc aac tct 96 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser 20 25 30 tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gac tac gtg 144 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Tyr Val 35 40 45 ggt atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aag tat ggc ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cac gtc act atc tca gcc gac aac ttc gcc aac acc gcc tac 240 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Phe Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcc gac acc gcc atc tat tat tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga cgg gca gca gcg gct att aac tgg ttc gac tcc tgg ggc cag 336 Ala Arg Arg Ala Ala Ala Ala Ile Asn Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <223> NI-203.1D10-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(117) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (163)..(183) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (280)..(303) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 41 gac atc cag ttg acc cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc acc cct gga 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agc cag agc ctc ctg cat cct 96 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Pro 20 25 30 aat gga aac gac tat ttg gat tgg tac gtg cag aag cca ggg cag tct 144 Asn Gly Asn Asp Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca cag atc gtg atc tac atg ggt tct aat cgg gcc gcc ggg gtc cct 192 Pro Gln Ile Val Ile Tyr Met Gly Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg act tat tac tgc ctg caa gct 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 cta cgc ggg tac act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa 333 Leu Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 43 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-203.2A11-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 43 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg ggg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcg tct gga ttc acc ttc agc agt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca ttt gta cgg tat gat gga agt aat aag tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Phe Val Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac tcg ctg tct 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser 65 70 75 80 ctt caa atg aac agt ctg aga act gaa gac acg gct gta tat tac tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa gaa cag gag gac cac aag gaa gct ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Glu Gln Glu Asp His Lys Glu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-203.2A11-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 45 gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag aga gtt acc acc ata 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Thr Thr Ile 20 25 30 gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat 144 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 ggt gca tcc agc agg gcc act gat att ccc gcc agg ttc agt ggc agt 192 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agt ctg cag tct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu 65 70 75 80 gac ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tat aac cag tgg ccc ctc act 288 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gln Trp Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> NI-203.10C4-VH variable heavy chain (VH) sequence, wherein Glu at positions 1 and 6 can also be Gln <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(345) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 47 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gct gaa gtg agg aag cct ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg agg gtc tcc tgc cag aca tct gga tac agc gtc acc gac tac 96 Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Ser Val Thr Asp Tyr 20 25 30 tat cta cac tgg gtg cga cag gcc cct gga cag ggc ctt gag tgg atg 144 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga gtg atg aac ccg agc aat gga aac gtg ggc tac cca cag aag ttt 192 Gly Val Met Asn Pro Ser Asn Gly Asn Val Gly Tyr Pro Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc cga gtc acc atg acc gca gac acg tcc acg ggc aca gtg tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Gly Thr Val Tyr 65 70 75 80 atg gtg ttg acc ggc ctt acg gct ggg gac acg gcc gtc tac tac tgt 288 Met Val Leu Thr Gly Leu Thr Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aga ggc ggg tcc acg ccg ggt cag gaa gta agg agt ccc cac gtc 336 Ala Arg Gly Gly Ser Thr Pro Gly Gln Glu Val Arg Ser Pro His Val 100 105 110 ctt gac ctc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378 Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 49 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> NI-203.10C4-VL variable light chain (VK) sequence, wherein Val at postion 2 can also be Ile and Ser at position 7 can also be Thr <220> <221> V_region <222> (70)..(117) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (163)..(183) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (280)..(306) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 49 gat gtt gtg atg act cag tct ccc ctc tct ctg tcc gtc acc cct gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct gat gag agc ctc ctg cat agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Glu Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 gat gga agg acc tat ttg tat tgg tat cta cag aag ccc ggc cag cct 144 Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 cct cag ctc ctg atc tat gaa gtt tcc aac cgg ttc tcg gga gtg cca 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 aat agg ttc agt ggc agc ggg tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc cgg gtg gag gct gag gat gtt ggc gtt tat tac tgc atg cag ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 gta cac ttt cct cag acg ttc ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 336 Val His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 51 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <223> NI-203.20H9-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(336) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 51 cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac atc ttc agt aaa cat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Lys His 20 25 30 ggt atc aac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctt gag tgg ata 144 Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg atc aac acc aat acg ggg aac cca aca tat gcc cag gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 aca gga cga ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat 240 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg gag atc agc agc cta aag gct gag gac act gcc gtg tat tac tgt 288 Leu Glu Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gaa tca gag ccg att ttt gga gtt atc tat tac atg gac gtc 336 Ala Arg Glu Ser Glu Pro Ile Phe Gly Val Ile Tyr Tyr Met Asp Val 100 105 110 tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 369 Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-203.20H9-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 53 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agc gtc acc atc act tgc cgg gca agc cag agc ata agc act aat 96 Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asn 20 25 30 tta aat tgg tat cag aag aaa cca gga caa gcc cct acg gtc ttg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Val Leu Ile 35 40 45 tat gct gcg tcc agt ttg caa ggt ggg gtc cca tca agg ttc agg ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 cgg gga tct ggg aca tat ttc act ctc acc atc agc ggt ctt caa cct 240 Arg Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cac aat tac aat gat ttg tgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Tyr Asn Asp Leu Trp 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-203.26D2-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 55 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg ggg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct ggg ttc acg ttc aga acc tgt 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Cys 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gaa tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca ttt gtt cgg tct gat gga act act aga tat tac gca gac tcc ctg 192 Ala Phe Val Arg Ser Asp Gly Thr Thr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 atg ggc cgc ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac tcg ctg tat 240 Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctt caa atg aac agt ctg aga cct gag gac acg gct ctt tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agg gaa aag gag gat cac agg gaa gct ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Arg Glu Lys Glu Asp His Arg Glu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-203.26D2-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 57 gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag cgt gtt agc act gta 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Thr Val 20 25 30 gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat 144 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 gat gca tcc acc agg gcc act gat atc ccc gcc agg ttc agt ggc agt 192 Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc act ctg caa tct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ser Glu 65 70 75 80 gac tct gca gtt tat tac tgt cag cag tat aat agg tgg ccc ctc act 288 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Trp Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-203.60H3-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 59 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gga ttg gca cgc cct gga ggc 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gtc gct gga ttc act ttc agt ggt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ala Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 gaa atg aat tgg gtc cgc cag gca cca ggg aag ggg ctg gag tgg att 144 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 tca tat att agc ggt cct ggg gat gtg ata tac tac gca gac tct gtg 192 Ser Tyr Ile Ser Gly Pro Gly Asp Val Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg ttt 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 cta cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtt tat tat tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 acg aga gtc ccc cct gac atc agc tat gga ttt gat tac tgg ggc cag 336 Thr Arg Val Pro Pro Asp Ile Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-203.60H3-VL variable light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 61 gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc ctg tct gca tct gta cga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Arg 1 5 10 15 gac agc gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc acc tat 96 Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aac ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 cat gat aca gac att ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 His Asp Thr Asp Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 act gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc ggt ctg caa cct 240 Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cct 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 63 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <223> NI-203.19F2-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (76)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(348) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 63 gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg agg aag cct ggg tcc 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc aac ttc ttg agc tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Asn Phe Leu Ser Tyr 20 25 30 tcc atc agt tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga ggg atc atc ccg atc ttt ggt aca cca aac tac gca cag aag ttc 192 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 caa gga aga gtc aca att acg gcg gac aaa tcg acg agg aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga ttt gat gac acg gcc gtc tat tat tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg gat gcg aca aga ccg ggt aca gca gcc tct ggt ttc tat tac tac 336 Ala Asp Ala Thr Arg Pro Gly Thr Ala Ala Ser Gly Phe Tyr Tyr Tyr 100 105 110 ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 381 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 65 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-203.19F2 -VK variable kappa light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 65 gaa att gtg atg aca cag tct cca gac acc ctg tct gtg tct cca ggt 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt aac aac aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asn 20 25 30 tta gcc tgg ttc cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat ggt gca tcc acc agg gcc act ggt att cca gcc aga ttc agt ggc 192 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gag ttc act ctc acc atc agc agc cta cag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat ttc tgt cag cag agt cac aat tgg ccc act 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser His Asn Trp Pro Thr 85 90 95 ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 318 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 67 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <223> NI-203.15C7-VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (73)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(336) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 67 gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg atg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Met 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt acc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 act atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca ttt ata tca tat gat gga agg gat aaa tac tac gca gat tcc gtg 192 Ser Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac atg ttg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gat gag gac atg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg act ctg caa gta tgg caa ctc tac gat tac tac gga atg gac gtc 336 Ala Thr Leu Gln Val Trp Gln Leu Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 369 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> NI-203.15C7-VL variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(171) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (268)..(300) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 69 cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca gga cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg aat aat 96 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 tat gta tct tgg tat cag caa ctc cca gga aca gcc ccc aaa ctc ctc 144 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 att tat aac agt gat aag cga ccc tca ggg att cct gac cga ttc tct 192 Ile Tyr Asn Ser Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 gcc tcc aag tct ggc acg tca gcc acc ctg ggc atc acc ggg ctc cag 240 Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 act ggg gac gag gcc gat tat tac tgc gca aca tgg gat acc aga ctg 288 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Thr Arg Leu 85 90 95 agt gct ggg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc ctt 330 Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110

Claims (37)

  1. 인간 모노클로날 항-섬 아밀로이드 폴리펩티드(anti-islet amyloid polypeptide, IAPP) 항체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    인간 IAPP 및/또는 프로IAPP에 결합할 수 있는 항체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    아밀로이드-β 펩티드(Αβ1-42)를 실질적으로 인식하지 않는 항체.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    생리적 IAPP를 실질적으로 인식하지 않는 항체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    프로IAPP를 실질적으로 인식하지 않는 항체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 아미노산 서열 SSNNFGA(서열번호 4), CNTATCA(서열번호 5), 또는 QRLANFLVHS(서열번호 71)를 포함하는 IAPP 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    가변 영역에 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 또는 이들의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 단편.
  8. 청구항 7에 있어서,
    도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 결합 단편.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    생리적 IAPP보다 IAPP 올리고머 및/또는 섬유를 포함하는 IAPP 응집체를 우선적으로 인식하는 항체.
  10. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    프로IAPP에 결합할 수 있는 항체.
  11. 청구항 10에 있어서,
    가변 영역에 도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같은 적어도 하나의 CDR 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 또는 이들의 프로IAPP 결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서,
    도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 결합 단편.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 설치류-인간 또는 설치류화된 항체인 항체.
  14. IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 특이적 결합을 위해 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 분자.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    단일쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 청구항 16의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 상기 결합 분자의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 인코딩하는 청구항 16의 폴리뉴클레오티드와 조합된 벡터.
  18. 청구항 16의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 17의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 항-IAPP 또는 항-프로IAPP 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들)의 제조 방법으로서,
    (a) 청구항 18의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들)을 배양물로부터 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  20. 청구항 16의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되거나 청구항 19의 방법에 의해 수득 가능한 항체 또는 이들의 면역글로불린 사슬(들).
  21. 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 가능하게 표지된 항체.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 검출 가능한 표지가 효소, 방사선 동위원소, 형광단(fluorophore) 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
  23. 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    약물에 부착된 항체.
  24. 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항의 항체, 청구항 16의 폴리뉴클레오티드, 청구항 17의 벡터 또는 청구항 18의 세포를 포함하는 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서,
    약학적 조성물이고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서,
    백신인 조성물.
  27. 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서,
    2형 당뇨병(T2D)의 치료 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후의 섬 거부를 치료 또는 예방하는데 유용한 추가적인 제제를 추가로 포함하는 조성물.
  28. 청구항 24에 있어서,
    진단 조성물이고, 선택적으로 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 포함하는 조성물.
  29. IAPP 및/또는 프로IAPP에 관련된 장애의 예방적 처치, 치료적 처치 및/또는 진행 또는 치료에 대한 반응의 모니터링에 이용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항의 항체, 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 청구항 16의 폴리뉴클레오티드, 청구항 17의 벡터 또는 청구항 18의 세포 또는 이들 중 어느 하나를 포함하는 약학적 또는 진단 조성물.
  30. 대상체에서 섬 아밀로이드증을 진단 또는 진행을 모니터링하는 방법으로서, 진단받을 대상체 유래의 표본 내의 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재를 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자를 이용하여 결정하는 단계를 포함하며,
    상기 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 존재는 전증상, 전구기 또는 임상적 2형 당뇨병(T2D) 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 베타-세포 부전을 시사하며, 생리적 IAPP 수준에 비해 또는 건강한 대조군 대상체 또는 동일한 대상체 유래의 대조군 표본으로부터 유래된 기준 표본에 비해 IAPP 및/또는 프로IAPP 올리고머, 응집체 또는 섬유의 수준 증가는 상기 대상체에서 전증상, 전구기 또는 구축된 2형 당뇨병(T2D)의 진행 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 섬 부전을 시사하는 방법.
  31. 인간 또는 동물 신체에서 IAPP 및/또는 프로IAPP에 대한 치료 및/또는 진단 제제의 생체내 검출 또는 표적화를 위한 조성물의 제조를 위한 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 생체내 검출은 양성자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 조영 또는 자기 공명 조영(MRI)을 포함하는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자.
  33. 청구항 30의 방법에서 이용하기 위한 청구항 31 또는 청구항 32의 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자.
  34. 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 프로IAPP의 에피토프를 갖는 펩티드.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 펩티드는 청구항 6에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 이들의 개질된 서열을 포함하고, 상기 펩티드는 청구항 6 내지 청구항 15 중 어느 한 항의 항체에 의해 인식되는 펩티드.
  36. 대상체에서 전증상 또는 임상적 2형 당뇨병 및/또는 임상적 췌장 섬 이식 후 베타-세포 부전을 시사하는 섬 아밀로이드증의 진단 방법으로서, 상기 대상체의 생물학적 표본 내에서 청구항 34 또는 청구항 35의 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 섬 아밀로이드증의 진단 또는 진행 모니터링에 유용한 키트로서, 상기 키트는 청구항 1 내지 청구항 15 또는 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 IAPP 및/또는 프로IAPP 결합 분자, 청구항 16의 폴리뉴클레오티드, 청구항 17의 벡터 또는 청구항 18의 세포 및/또는 청구항 34 또는 청구항 35의 펩티드를 포함하고, 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침을 함께 포함하는 키트.
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