KR20140053974A - 항-알파 시누클레인 결합 분자 - Google Patents

항-알파 시누클레인 결합 분자 Download PDF

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Abstract

항-인간 α-시누클레인-특이적 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체가 이들과 관련된 방법으로서 제공된다. 추가로 인간 α-시누클레인 상의 특이적 N-말단 및 C-말단 에피토프에 결합된 항-인간 α-시누클레인 결합 분자가 추가로 제공된다. 본 명세서에 기재된 결합 분자는 각각 α-시누클레인 표적화된 면역치료 및 진단을 위한 약제학적 및 진단적 조성물에 사용될 수 있다.

Description

항-알파 시누클레인 결합 분자{ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES}
전자적으로 제출된 서열목록에 대한 참조
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(파일명: sequencelisting_ascii.txt; Size: 23KB; 생성일: 2011년 6월 23일)의 전자적으로 제출된 서열목록의 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 발명은 신규한 일반적으로 α-시누클레인-특이적 결합 분자, 특히 α-시누클레인 및 α-시누클레인의 응집된 형태를 각각 인식하는 인간 항체뿐만 아니라 이의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 혈장 및 CSF 중에서 α-시누클레인의 독성 종을 확인하기 위한 진단 도구로서, 그리고 또한 α-시누클레인의 응집에 관련된 장애, 예컨대 파킨슨 병(Parkinson’s disease: PD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies: DLB) 및 알츠하이머병(Alzheimer’s disease: AD)의 루이소체 변형 및 기타 시누클레인 병증을 치료하기 위한 수동적 면역에서, 이러한 결합 분자, 이의 항체 및 모방체를 포함하는 약제학적 및 진단적 조성물에 관한 것이다.
단백질 미스폴딩 및 응집은 수많은 신경퇴행성 질병의 병리적 양태이다. α-시누클레인의 응집물은 파킨슨병(PD)과 관련된 루이소체 및 루이 신경돌기의 주요 구성성분이다. 본래부터 미폴딩된 단백질인 α-시누클레인은 올리고머, 원섬유 및 피브릴을 포함하는 상이한 응집된 형태를 채택할 수 있다. 작은 올리고머 응집물은 특히 독성이 되는 것으로 나타났다.
α-시누클레인에 대해 자연적으로 생기는 자가항체는 건강한 사람에게서 검출되었고, 환자에서 변경된 수준은 특히 신경퇴행성 장애와 관련되었다; 검토를 위해 문헌[Neff et al ., Autoimmun. Rev. 7 (2008), 501-507] 참조. 따라서 파킨슨 병에 걸린 환자에서, 특히 건강한 환자에서 동시에 또는 예방접종 시 자연적으로 생기는 항체는 α-시누클레인 응집에 대해 보호적 역할을 할 수 있다; 예를 들어, 문헌[Woulfe et al ., Neurology 58 (2002), 1435-1436 및 Papachroni et al ., J. Neurochem. 101 (2007), 749-756] 참조. 지금까지, 자가항체의 치료적 중요성은 평가가 어려웠다. 이는 주로 그것의 단리 및 후속적인 시험관내 특성규명에 대해 간단한 실험적 접근이 없기 때문이다.
최근에, α-시누클레인의 올리고머 종은 혈장 및 CSF 중의 세포 밖에서 보고되었고(El-Agnaf et al ., FASEB J. 20 (2006), 419-425) PD의 마우스 모델에서 면역화 연구는 α-시누클레인에 대한 세포밖 마우스 단클론성 항체가 세포내 α-시누클레인 응집물의 축적을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내는데(Masliah et al ., Neuron, 46 (2005), 857-868), 이는 단량체 α-시누클레인의 유리한 작용을 방해하지 않고 신경독성 응집물을 중화하는 항체가 유용한 치료제가 될 수 있다는 생각을 뒷받침한다. 그러나, 인간에서 뮤린계 항체의 치료적 이용성은 그것의 비인간 유래의 관점에서 인간 항마우스 항체(human anti-mouse antibody: HAMA)에 의해 방해된다.
문헌[Emadi et al . J. Mol. Biol. 368 (2007), 1132-1144]은 α-시누클레인에 대해 인간 서열을 기반으로 파지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 단일쇄 항체 단편(single chain antibody fragment: scFv)의 단리를 기재하는데, 이는 α-시누클레인의 올리고머 형태에만 결합되고, 시험관내 α-시누클레인의 응집과 독성을 둘 다 저해한다. 그러나, 파지 디스플레이로부터 scFv의 생성은 오히려 단순함에도 불구하고, 이 기법은 심각한 단점을 가지는데, 이렇게 생성된 항체가 자기-항원에 대해 원치않는 교차반응성의 위험을 함유하고, 인간 면역계에 의해 생성된 진화의 최적화된 천연 인간 항체의 특징을 결여하기 때문이다. 더 나아가, 이러한 항체는 정상 생리적 환경 및 작용에 대해서 다른 단백질 및/또는 표적 단백질과 교차반응성 때문에, 충분히 특이적이지 않을 수 있다. 파킨슨병의 경우에, 예를 들어, α-시누클레인의 생리적 유도체와 교차반응하는 항체는 또한 생리적 표적 구조의 정상 작용과 관련된 부작용을 야기할 가능성을 함유한다. 이 점에서, 원치않는 자가면역 질병이 노골적으로 유발된다 - 변이체 형태에서 생리적으로도 생기는 단백질 구조를 사용하는 활성 면역화 실험의 개념 설계에서 거의 계산가능하지 않은 위험.
더 최근에, Seitz 등(81. Kongress der Deutschen Gesellschaft fur Neurologie mit Fortbildungsakademie Hamburg 10.-13.09.2008)은 친화도 크로마토그래피를 통해 상이한 면역글로뷸린 용액 및 단일 혈액 도너(donor)의 샘플로부텅 항-α-시누클레인 단클론성 자가항체의 단리를 보고하였다. 그러나, 이 접근이 원하는 항체의 제한된 양만을 제공한다는 사실 외에, 다클론성 항체는, 예를 들어 그것의 이질성, 및 원치않는 부작용을 갖는 다른 α-시누클레인 관련 분자에 의해 오염될 위험 때문에, 치료적 적용에 대해 단지 제한된 용도를 가진다. 마찬가지로, 항체의 조성물의 가변성이 전반적인 특이성 및 반응성에 영향을 미치기 때문에 다클론성 항체의 진단 값은 감소된다. 이는 미스폴딩에 기인하는 응집 및 침착의 단백질 대상에 대해 항체에 대해 모두 더 적용된다.
따라서, 상기 기재된 제한을 극복하고, α-시누클레인에 대해 치료적 및 진단적 인간 항체를 제공하기 위한 필요가 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)의 아미노산 4 내지 15 내의 에피토프에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 결합 분자는 α-시누클레인에 대한 기준 단클론성 항체 NI-202.12F4의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 분자는 인간 단클론성 항체 NI-202.12F4, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체가 아니다.
다른 실시형태는 α-시누클레인(서열번호 1)의 아미노산 113 내지 123 내에서 또는 아미노산 117 내지 123 내에서 에피토프에 대해 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 결합 분자는 기준 단클론성 항체 NI-202.22D11로서 동일한 인간 α-시누클레인 에피토프에 대해 특이적으로 결합되거나, 또는 인간 α-시누클레인에 대한 기준 단클론성 항체 NI-202.22D11의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명의 특정 결합 분자는 인간 단클론성 항체 NI-202.22D11, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체이다.
본 발명은 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 추가로 제공하되, VH는 서열번호 15 또는 서열번호 20과 적어도 90% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또한 VH 및 VL을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되되, VL은 서열번호 22 또는 서열번호 26과 적어도 90% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 유사하게, 본 발명은 VH 및 VL을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 추가로 제공하되, VH 및 VL은 각각 기준 폴리펩타이드 서열번호 15와 서열번호 22, 서열번호 15와 서열번호 26, 서열번호 20과 서열번호 22, 또는 서열번호 20과 서열번호 26과 적어도 90%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
VH의 CDR1 영역이 기준 중쇄 CDR1 서열 서열번호 16과 동일하거나 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드, VH의 CDR2 영역이 기준 중쇄 CDR2 서열 서열번호 17과 동일하거나 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드, VH의 CDR3 영역이 기준 중쇄 CDR3 서열 서열번호 18과 동일하거나 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드, VL의 CDR1 영역이 기준 중쇄 CDR1 서열 서열번호 23과 동일하거나 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드, VL의 CDR2 영역이 기준 중쇄 CDR2 서열 서열번호 24와 동일하거나 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드, 및 VL의 CDR3 영역이 기준 중쇄 CDR3 서열 서열번호 25와 동일하거나 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드가 추가로 제공된다. 상기 언급한 폴리펩타이드의 각각에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 단편은 인간 α-시누클레인의 비선형 입체구조 에피토프에 우선적으로 결합된다. 다른 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 단편은 올리고머 또는 응집된 형태로 인간 α-시누클레인에 우선적으로 결합된다. 추가 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 단편은 인간 β-시누클레인 또는 인간 γ-시누클레인에 특이적으로 결합되지 않고/않거나 뮤린 α-시누클레인에 특이적으로 결합되지 않는다.
상기 기재한 바와 같은 항체 또는 이의 단편 및 담체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 조성물은 치료적 또는 진단적 조성물일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 결합 분자를 발현시키기 위한 벡터 및 숙주 세포가 추가로 제공된다.
본 발명의 특정 목적은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 파킨슨병 (PD), 루이소체 치매(DLB) 및 다계통 위축증(multiple systems atrophy: MSA)과 같은 시누클레인병증을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 해당 방법은 항-인간 α-시누클레인 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 효과적인 농도를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항체는 α-시누클레인을 표적화한다.
또한 본 발명의 목적은 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 의해 진단된 피험체에서 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합을 평가하는 단계 및 피험체에서 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합을 하나 이상의 대조군 샘플로부터 유래된 하나 이상의 기준 표준과 비교하는 단계를 포함하는, 피험체에서 시누클레인병증의 진단방법을 제공하는 것이되, 피험체에서 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합과 기준 표준 사이의 차이 또는 유사성은 피험체가 시누클레인병증을 가지는지 여부를 나타낸다.
본 발명의 진단 방법은 환자 샘플의 시험관내 분석을 통하거나 또는 생체내 영상화 기법에 의할 수 있다.
본 발명의 추가 실시형태는 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명확하게 될 것이다.
도 1 가변 영역의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열, 즉, 인간 항체 NI-202.21D11의 중쇄 및 카파 경쇄를 도시한 도면. 프레임워크(framework: FR) 및 상보적 결정 영역(complementarity determining region: CDR)은 밑줄이 있는 CDR로 표시된다. 클로닝 전략에 기인하여, 중쇄 및 경쇄의 N-말단에서 아미노산 서열은 FR1에서 프라이머-유도된 변성(alteration)을 함유할 수 있는데, 그러나 이는 항체의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 공통 인간 항체를 제공하기 위해, 본래 클론의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 정렬되고, 데이터베이스 내 적절한 인간 생식 계열 가변 영역 서열에 따라 조절된다; 예를 들어, MRC Centre for Protein Engineering(영국 캠브릿지에 소재)에 의해 관리되는 Vbase(vbase . mrc - cpe . cam . ac . uk) 참조. 공통 생식계열 서열로부터 잠재적으로 일탈되는 것으로 고려되고, 따라서 PCR 프라이머에 기인할 수 있는 해당 아미노산은 볼드체로 표시된다.
도 2 재조합 인간 NI-202.21D11이 직접적 ELISA에서 β-, γ-시누클레인 및 뮤린 α-시누클레인에 걸쳐 인간 α-시누클레인과 선택적으로 결합됨을 도시한 도면. 재조합 인간 α-, β-, γ- 시누클레인 및 재조합 인간 및 뮤린 His-태그된 α-시누클레인을 동일 농도(2㎍/㎖)로 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 그 다음에 플레이트를 재조합 인간 NI-202.21D11, 인간 NI-202.12F4으로 그리고 pan-시누클레인 항체로 프로빙하였다. (A) 재조합 NI-202.21D11은 α-시누클레인에 선택적으로 결합되는 반면, pan-시누클레인 항체는 재조합 단백질의 동일 코팅을 확인하는 모두 3가지의 시누클레인 단백질에 결합된다. (B) 재조합 NI-202.21D11은 인간 대 뮤린 α-시누클레인에 대해 선택적이다. 반면에 NI-202.12F4는 직접적 ELISA에서 인간과 뮤린 둘 다에 결합된다.
도 3 재조합 NI-202.21D11이 고밀도로 코팅된 α-시누클레인에 우선적으로 결합됨을 도시한 도면. 재조합 인간 α-시누클레인은 표시된 농도에서 ELISA 플레이트 상에 코팅되었고, ELISA에 의해 다양한 농도의 NI-202.21D11로 프로빙되었다(□ 20㎍/㎖; ▲ 5㎍/㎖; ◆ 1㎍/㎖; ■0.25㎍/㎖; ▼0.1㎍/㎖). 항체의 효능을 나타내는 절반의 최대 유효 농도(EC50)는 각 코팅 농도에 대해 결정되었다.
도 4 NI-202.21D11의 면역조직화학 결합 분석이 (A) 인간 α-시누클레인 A53T를 과발현시키는 유전자이식 마우스로부터 및 (C) 루이소체 치매 환자의 인간 뇌 조직으로부터 파라핀 부문 내 루이소체 및 루이 신경돌기 유사 포함을 포함하는, α-시누클레인 병리의 현저한 염색을 나타낸다는 것을 도시한 도면. (B) 야생형 마우스 조직에서 및 (하부 우측) 대조군 만의 제2 항체에서 염색은 관찰되지 않았다. HC=해마, CTX=피질, BS=뇌줄기.
도 5 에피토프 맵핑이 NI-202.21D11에 대해 인간 α-시누클레인 내의 C-말단 결합 에피토프(aa 117-123)를 나타냄을 도시한 도면. (A) 재조합 NI-202.21D11은 직접적 ELISA에서 인간 α-시누클레인의 C-말단 도메인에 결합된다. α-시누클레인 절단을 동일 농도(2ug/㎖)로 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. NI-202.21D11은 절단된 α-시누클레인 aa 61-140 및 95-140에만 결합되었지만, aa 1 내지 60, 1 내지 95를 절단하지 않았다. (B) 펩스캔 분석은 인간 α-시누클레인의 중복 펩타이드 B08(aa 109 내지 123), B09(aa 113 내지 127) 및 B10(aa 117 내지 131)에 NI-202.21D11의 결합을 나타내는데, 이는 NI-202.21D11 결합에 필요한 최소 서열이 인간 α-시누클레인 내의 PVDPDNE(aa 117 내지 123)라는 것을 시사한다. (C) 재조합 NI-202.21D11은 직접적 ELISA에서 인간 α-시누클레인 D121G/N122S에 대해 감소된 결합을 나타내었다. 재조합 wt 및 돌연변이된 α-시누클레인 단백질을 ELISA 플레이트에 대해 동일한 농도(2ug/㎖)로 코팅하였고, 재조합 NI-202.21D11 결합에 대해 시험하였다.
도 6 NI-202.12F4이 α-시누클레인의 바로 N-말단에 선택적으로 결합됨을 도시한 도면. (A) 펩스캔 분석은 최소 인식 서열이 α-시누클레인의 잔기 1 내지 15 내에 있음을 나타내는 펩타이드 A01에 NI-202.12F4의 결합을 나타낸다. (B) 잔기 1 내지 30, 4 내지 30 및 5 내지 30으로부터의 합성 α-시누클레인 펩타이드를 용액 중의 ELISA에서 NI-202.12F4 결합에 대해 시험하였다. NI-202.12F4는 aa 1 내지 30 및 4 내지 30에 결합되었지만, 5 내지 30에는 결합되지 않았다. 이는 NI202.12F4 에피토프 서열이 α-시누클레인의 잔기 4에서 시작한다는 것을 나타내었다. (C) NI-202.12F4 에피토프 내의 잔기 K10은 β-시누클레인 이상으로 α-시누클레인에 대한 NI-202.12F4의 민감성에 대해 중요한 아미노산이다. 재조합 wt 및 돌연변이체 α- 및 β-시누클레인 단백질은 NI-202.12F4 결합에 대해 직접적 ELISA에 의해 시험되었다. NI-202.12F4는 wt α-시누클레인 및 돌연변이체 β-시누클레인 M10K에 결합되었지만, wt β-시누클레인 및 돌연변이체 α-시누클레인 K10M에 결합되지 않았다. 이는 잔기 K10이 NI-202.12F4 α-시누클레인 선택성을 초래한다는 것을 나타낸다.
I. 정의
시누클레인 병증 또는 시누클레인증은 뉴런 및 신경교의 선택적으로 취약한 집단에서 불용성인 α-시누클레인 단백질의 응집물의 흔한 병적 병변을 공유하는 신경퇴행성 장애의 다양한 그룹이다. 이들 장애는 파킨슨병(PD), 파킨슨병 치매(PDD), 루이소체 치매(DLB), 청소년기 발생 신경축삭퇴행위축(할러포르덴-스파츠병), 순수 자율신경계 부전(pure autonomic failure: PAF), 다계통 위축증(MSA) 및 뇌에 철 축적을 가진 신경변성 1형(NBIA-I)을 포함한다. 임상적으로, 그들은 병변의 분포에 따라서 운동, 인지, 행동 및 자율신경 기능에서 만성 및 진행성 쇠퇴를 특징으로 한다.
파킨슨병은 알려지지 않은 병인을 지니는 노인성 신경퇴행성 질병이다. 산발적 파킨슨병은 유전적 취약성 및 환경적 발작의 조합으로부터 초래되는 것으로 믿어진다. 이질적인 메커니즘에 의해 촉발되는 동안 파킨슨병(PD)은 공유된 병리 생리학적 경로를 따르는 것으로 추가로 믿어진다. 하나의 공유점은 α-시누클레인의 연루이다. 파킨슨병 발병과 이 단백질의 관련은 익숙한 경우에 유전자의 돌연변이와 3중화 둘 다의 확인, 루이소체에 대한 α-시누클레인의 국소화, 피킨슨병의 전형적인 병리학적 특징 중 하나 및 파킨슨병의 신경독성 모델에서 α-시누클레인 발현과 질병 병리의 상관관계에 의해 확립되었다. 추가 증거는 α-시누클레인의 특정 형태(예를 들어, 변형되고 α-시누클레인 결합된 도파민)가 산발적 질병에 연루된다는 것을 나타낸다.
시누클레인은 신경 조직에서 및 특정 종양에서 주로 발현된 작은 가용성 단백질이다. 패밀리는 3가지의 공지된 단백질을 포함한다: α-시누클레인, β-시누클레인 및 γ-시누클레인. 모든 시누클레인은 보통 교환 가능한 아포리포단백질의 클래스-A2 지질-결합 도메인과 유사하게 고도로 보존된 α-나선형 지질-결합 모티프를 가진다. 시누클레인 패밀리 구성원은, 그것이 식물 '후기-배아가 풍부한' 단백질과 일부 보존된 구조적 유사성을 가지지만, 척추동물 외에 발견되지 않는다. α- 및 β-시누클레인 단백질은 뇌 조직에서 주로 발견되는데, 그들은 주로 시냅스 전(presynaptic) 말단에서 보인다. γ-시누클레인 단백질은 말초신경계 및 망막에서 주로 발견되지만, 유방 종양에서 그것의 발현은 종양 진행에 대한 마커이다. 일부 데이터는 막 안정성 및/또는 전환율의 조절에서 역할을 시사하지만, 정상 세포 기능은 임의의 시누클레인 단백질에 대해 결정되지 않았다. α-시누클레인에서 돌연변이는 조기 개시 파킨슨병의 희귀 가족성 경우와 관련되며, 단백질은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 몇몇 다른 신경퇴행성 질병에서 비정상적으로 축적된다. 검토를 위해, 예를 들어, 2001년 12월 20일 온라인으로 공개된 문헌[George, Genome Biol. 3 (2002), reviews3002.1-reviews3002.6]을 참조하며, 여기서 표 1은 현재 GenBank에 열거된 시누클레인 패밀리의 독특한 구성원을 범주화하고, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
α-시누클레인은 본래 알츠하이머병 (AD) 플라크의 비-β-아밀로이드 성분(NAC)의 전구체 단백질로서 인간 뇌에서 확인되며; 예를 들어, 문헌[Ueda et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 1282-1286]을 참조한다. AD 아밀로이드의 비-Aβ 성분의 전구체(NACP)로도 칭해지는 α-시누클레인은 140 아미노산의 단백질이다. α-시누클레인은 무작위 코일로서 그것의 본래 형태로 존재하지만; 그러나, pH의 변화, 분자 군집, 중금속 함량 및 도파민 수준은 모두 단백질 입체구조에 영향을 미친다. 올리고머로 입체구조의 변화, 원섬유, 피브릴 및 응집물 모이어티는 단백질 독성을 조절하는 것으로 생각된다. 도파민-첨가된 α-시누클레인이 미첨가 단백질에 비해 피브릴 형성에 더 빠른 시간 과정을 가진다는 것을 나타내는 증거는 증가된다. 더 나아가, α-시누클레인 과발현의 배경에서 도파민은 독성이다.
본 명세서에서, 용어 "α-시누클레인", "알파-시누클레인", "a-시누클레인" 및 "aSyn"은 α-시누클레인의 천연 단량체 형태를 구체적으로 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 용어 "α-시누클레인"은 또한 α-시누클레인의 다른 형태이성질체, 예를 들어, 도파민-퀴논(DAQ)에 결합된 α-시누클레인 및 α-시누클레인의 올리고머 또는 응집물을 일반적으로 확인하기 위해 사용된다. 용어 "α-시누클레인"은 또한 모든 유형 및 형태의 α-시누클레인을 총괄적으로 지칭하기 위해 사용된다. 인간 α-시누클레인에 대한 단백질 서열은 MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(서열번호 1)이다. α-시누클레인의 아미노산 서열은 문헌 및 적절한 데이터베이스로부터 검색될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Ueda et al ., ibid .; GenBank swissprot: locus SYUA_인간, 등록 번호 P37840] 참조. AD 아밀로이드의 비Aβ성분(NAC)은 α-시누클레인으로부터 유래된다. NAC, 즉, α-시누클레인 내에서 고도로 소수성인 도메인은 적어도 28개 아미노산 잔기(잔기 60 내지 87) 및 선택적으로 35개 아미노산 잔기(잔기 61 내지 95)로 이루어진 펩타이드이다. NAC는 베타-시트 구조를 형성하는 경향을 나타낸다(Iwai, et al ., Biochemistry, 34 (1995) 10139-10145). NAC의 아미노산 서열은 문헌[Jensen et al ., Biochem. J. 310 (1995), 91-94]; GenBank 등록번호 S56746 및 문헌[Ueda et al ., PNAS USA 90 (1993), 1282-11286]에 기재되어 있다.
NAC를 포함하는 분해된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 단량체 펩타이드 단위를 의미한다. 분해된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 일반적으로 가용성이며, 자기 응집되어 가용성 올리고머를 형성할 수 있다. α-시누클레인 및 이의 단편의 올리고머는 보통 가용성이며, 대개 α-나선으로서 존재한다. 단량체 α-시누클레인은 초음파 처리와 함께 순수 DMSO 중에서 동결건조된 펩타이드를 용해시킴으로써 시험관내에서 제조될 수 있다. 얻어진 용액은 임의의 불용성 미립자를 제거하기 위해 원심분리된다. NAC를 포함하는 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 불용성 β-시트 조립체로 결합된 α-시누클레인 또는 이의 단편의 올리고머를 의미한다. NAC를 포함하는 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 또한 피브릴 중합체를 의미한다. 피브릴은 보통 불용성이다. 일부 항체는 가용성 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편 중 하나에 결합된다. 일부 항체는 단량체 형태 또는 피브릴 형태보다 α-시누클레인의 올리고머에 더 강하게 결합된다. 일부 항체는 가용성이며 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편 둘 다에 결합되며, 선택적으로 올리고머 형태에도 결합된다.
본 명세서에 개시된 인간 항-α-시누클레인 항체는 α-시누클레인 및 이의 에피토프에 및 α-시누클레인 및 이의 에피토프의 다양한 입체구조에 특이적으로 결합된다. 예를 들어, α-시누클레인, 즉, 그것의 천연 단량체 형태로 α-시누클레인, 전장 및 절단된 α-시누클레인 및 α-시누클레인 응집물에 특이적으로 결합되는 항체가 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 α-시누클레인에 "특이적으로 결합되는", "선택적으로 결합되는" 또는 "우선적으로 결합되는" 항체에 대한 언급은 다른 관련되지 않은 단백질에 결합되지 않는 항체를 지칭한다. 일 예에서, 본 명세서에 개시된 α-시누클레인 항체는 α-시누클레인 또는 이의 에피토프에 결합될 수 있고, 다른 단백질에 대해 약 1.5배로 배경에 결합이 없음을 나타낸다. α-시누클레인 형태이성질체에 "특이적으로 결합되는" 또는 "선택적으로 결합되는" 항체는 α-시누클레인의 모든 입체구조에 결합되지 않는 항체를 지칭하며, 즉, 적어도 하나의 다른 α-시누클레인 형태이성질체에 결합되지 않는다. 예를 들어, α-시누클레인, 인간 및 마우스 α-시누클레인; 전장 α-시누클레인 및 절단된 형태뿐만 아니라 인간 α-시누클레인 대 β- 및 γ-시누클레인의 단량체 및 응집된 형태를 구별할 수 있는 항체가 본 명세서에 개시된다. 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체는 파킨슨 증상의 징후가 없고, α-시누클레인-특이적 면역 반응을 나타내는 노인 피험체의 풀로부터 단리되었기 때문에, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는 또한 해당 항체가 사실 피험체에 의해 발현되고, 예를 들어 인간 면역글로뷸린 발현 파지 라이브러리로부터 단리되지 않는다는 것을 강조하기 위해 "인간-자가-항체"로서 지칭되며, 지금까지 인간 유사 항체를 제공하는 노력을 위한 한 가지 흔한 방법을 표현한다.
단수 독립체의 용어는 하나 이상의 독립체를 지칭한다는 것이 주목되어야 하며; 예를 들어, "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 단수의 용어, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포함하는 것으로 의도되며, 아마이드 결합(또한 펩타이드 결합으로서 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)으로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하며, 생성물의 구체적 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 둘 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 이들 용어와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 또한 글라이코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단밸질분해 절단 또는 비자연적으로 생기는 아미노산에 의한 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭한다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기법에 의해 생성될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 필수적으로 번역되지 않는다. 이는 화학적 합성에 의하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해 만들어진다.
본 발명의 폴리펩타이드는 약 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상 또는 2,000 이상의 아미노산 크기를 가질 수 있다. 폴리펩타이드는, 그들이 이러한 구조를 필수적으로 갖지 않는다고 해도, 정해진 3차원 구조를 가질 수 있다. 정해진 3차원 구조를 갖는 폴리펩타이드는 폴딩으로서 지칭되며, 정해진 3차원 구조를 갖지 않는 폴리펩타이드는 오히려 다수의 상이한 입체구조를 채택할 수 있지만, 미폴딩으로서 지칭된다. 본 명세서에 사용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예를 들어 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티에 결합된 단백질을 지칭한다.
"단리된" 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 그것의 천연 환경에 없는 폴리펩타이드로 의도된다. 특정 수준의 정제가 필요하지는 않다. 예를 들어, 단리된 폴리펩타이드는 그것의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩타이드와 같이 본 발명의 목적을 위해 단리된 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질이 고려된다.
또한 앞서 언급한 폴리펩타이드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 이의 임의의 조합물이 본 발명의 폴리펩타이드로서 포함된다. 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩타이드를 지칭할 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 대응되는 천연 결합 분자, 항체 또는 폴리펩타이드의 항원 결합 특성 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편은 본 발명의 다른 곳에서 논의되는 항체 특이적 항체 단편에 추가로 단백질분해 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩타이드의 변이체는 상기 기재한 바와 같은 단편을 포함하고, 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 기인하는 변성된 아미노산 서열을 지니는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 자연적으로 생기거나 또는 비자연적으로 생길 수 있다. 비자연적으로 생기는 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. α-시누클레인 특이적 결합 분자의 유도체, 예를 들어 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드에서 발견되지 않는 추가적인 특징을 나타내기 위해 변성된 폴리펩타이드이다. 예는 융합 단백질을 포함한다. 변이체 폴리펩타이드는 또한 "폴리펩타이드 유사체"로서 본 명세서에서 지칭된다. 본 명세서에서 사용되는 결합 분자 또는 이의 단편, 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 "유도체"는 기능적 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상 폴리펩타이드를 지칭한다. 또한 20가지 표준 아미노산 중 하나 이상의 자연적으로 발생되는 아미노산 유도체를 함유하는 해당 펩타이드의 "유도체"가 포함된다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린으로 치환될 수 있고; 5-하이드록시리신은 리신으로 치환될 수 있으며; 3-메틸히스티딘은 히스티딘으로 치환될 수 있고; 호모세린은 세린으로 치환될 수 있으며; 오르니틴은 리신으로 치환될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 핵산뿐만 아니라 다수의 핵산을 포함하도록 의도되며, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들어, 아마이드 결합, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는 것)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리펩타이드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 그것의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된 벡터에 함유된 항체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가 예는 이종성 숙주 세포 중에 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중에서 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전자를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 추가로, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 구성요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "암호 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈으로 이루어진 핵산의 부분이다. "종결 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않음에도 불구하고, 아미노산의 부분으로 고려될 수 있지만, 임의의 측접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 암호 영역의 부분이 아니다. 본 발명의 2 이상의 암호 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물 내에, 예를 들어 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물 내에, 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더 나아가, 임의의 벡터는 단일 암호 영역을 함유할 수 있거나, 또는 2 이상의 암호 영역을 포함하고, 예를 들어, 단일 벡터는 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 개별적으로 암호화할 수 있다. 추가로, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 핵산에 융합되거나 또는 미융합된 이종성 암호 영역을 암호화할 수 있다. 이종성 암호 영역은 제한 없이 구체화된 구성요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩타이드 또는 이종성 기능적 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우에, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및/또는 하나 이상의 암호 영역과 작동가능하게(operably) 연결된 다른 전사 또는 번역 제어 구성요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 연결은 유전자 산물에 대한 암호 영역, 예를 들어 폴리펩타이드가 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에서 유전자 산물의 발현이 일어나는 방법으로 하나 이상의 조절 서열과 연결된다. 두 DNA 단편(예컨대, 폴리펩타이드 암호 영역 및 이와 관련된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유발이 원하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 초래한다면, 그리고 두 DNA 단편 사이의 결합의 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는다면 "작동가능하게 연결되거나" 또는 "작동가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 해당 핵산의 전사에 달성할 수 있다면 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 사전결정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 구성요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호는 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결되어 세포-특이적 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역은 본 명세서에 개시된다.
다양한 전사 제어 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은, 예컨대 거대세포 바이러스(인트론-A과 함께 급속 초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서이지만, 이들로 제한되지 않는 척추동물 세포 내에서 기능하는 전사 제어 영역을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자, 예컨대 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 ß-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 추가적인 적합한 전사 제어 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도성인 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 구성요소는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래된 구성요소(특히, 내부 리보솜 유입 부위 또는 CITE 서열로도 지칭되는 IRES)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 암호 영역은 분비 또는 단일 펩타이드를 암호화하며, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 추가적인 암호 영역과 연결될 수 있다. 신호 가설(signal hypothesis)에 따라, 일단 조면 소포체를 가로지르는 성장 단백질 쇄의 내보냄이 개시되면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 성숙 단백질로부터 절단된 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 가진다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드가 일반적으로, 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어 폴리펩타이드의 분비된 형태 또는 "성숙 형태를" 생성하는, 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가진다는 것을 인식한다. 특정 실시형태에서, 천연 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로뷸린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드 또는 그것과 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 해당 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩타이드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator: TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "장애" 및 "질병"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
본 발명의 내용에서 사용되는 "결합 분자"는 주로 항체 및 이의 단편에 관한 것이지만, 또한 호르몬, 수용체, 리간드, 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 분자, 샤페론, 예컨대 열충격 단백질(HSP)뿐만 아니라 세포-세포 접합 분자, 예컨대 카데린의 구성원, C형 렉틴, 면역글로뷸린(Ig) 슈퍼패밀리 및 합성 결합 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 α-시누클레인에 결합된 다른 비항체 분자를 지칭할 수 있다. 따라서, 단지 명확함을 위해서, 본 발명의 범주를 제한하지 않고, 다음의 실시형태의 대부분은 치료적 작용제 및 진단적 작용제의 개발을 위해 예시적인 결합 분자를 나타내는 항체 및 항체 유사 분자에 대해 논의된다.
용어 "항체" 및 "면역글로뷸린"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로뷸린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하며, 보통 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 α-시누클레인-결합 분자이다. 척추동물계에서 기본적 면역글로뷸린 구조는 상대적으로 잘 이해된다; 예를 들어, 문헌[Harlow et al ., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)] 참조.
이하에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 용어 "면역글로뷸린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 폴리펩타이드의 다양한 광범위한 분류를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론,
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으로서 분류되고, 그 중에 일부는 하위분류(예를 들어, γ1 내지 γ4)를 지닌다는 것을 인식할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로서 항체의 "분류"를 결정하는 것은 이 쇄의 특성이다. 면역글로뷸린 서브클래스(아이소타입) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특성규명되어 있고, 기능적 특수화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 각각의 이들 분류 및 아이소타입의 변형된 형태는 본 개시내용에 비추어 당업자에게 용이하게 인식될 수 있고, 따라서 명확하게 본 발명의 범주 내이다. 모든 면역글로뷸린 분류는 명확하게 본 발명의 범주 내이며, 다음의 논의는 일반적으로 면역글로뷸린 분자의 IgG 분류에 관한 것일 것이다. IgG에 대해, 표준 면역글로뷸린 분자는 분자량 대략 23,000 달톤 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드 및 분자량 53,000 내지 70,000의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 쇄는 전형적으로 "Y" 배치에서 이황화 결합에 의해 결합되되, 경쇄는 "Y"의 입구에서 출발하고 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 같이 묶어 생각한다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ) 중 하나로서 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄 중 하나와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 면역글로뷸린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 만들어질 때, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유적 이황화 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 각 쇄의 바닥에서 Y 배치의 포크형 단부에서 N-말단으로부터 C 말단으로 이어진다.
경쇄와 중쇄는 둘 다 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. 용어 "일정한" 및 "가변적"은 기능적으로 사용된다. 이에 대해서, 경쇄(VL)와 중쇄(VH) 부분 둘 다의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것으로 인식될 것이다. 정반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 가변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 통상적으로, 불변 영역 도메인이 항원-결합 부위 또는 항체의 아미노-말단으로부터 원위로 됨에 따라 불변 영역 도메인의 수는 증가된다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 부분에서 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다.
상기 논의한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원의 에피토프를 선택적으로 인식하게 하고, 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하게 한다. 즉, VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 항체의 상보적 결정 영역(CDR)의 서브세트는 3차원 항원 결합 부위를 나타내는 가변 영역을 형성하도록 조합된다. 이 4차 항체 구조는 Y의 각 암(arm)의 단부에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로는, 항원-결합 부위는 VH 및 VL 쇄의 각각에서 3개의 CDR에 의해 정해진다. α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 충분한 구조를 함유하는 임의의 항체 또는 면역글로뷸린 단편은 "결합 단편"으로서 또는 "면역특이적 단편"으로서 본 명세서에 나타난다.
자연적으로 생기는 항체에서, 항체는 짧은 각 항원-결합 도메인에 존재하는 때때로 "상보적 결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 6개의 초가변 영역을 포함하며, 항체로서 항원-결합 도메인을 형성하도록 특별하게 위치된 아미노산의 불연속적 서열은 수성 환경에서 그것의 3차원 배치를 추정한다. "CDR"은 분자내 가변성을 덜 나타내는 4개의 상대적으로 보존된 "프레임워크" 영역 또는 "FR"에 측접된다. 프레임워크 영역은 β-시트 입체구조를 채택하며, CDR은 연결되는 루프를 형성하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 부분을 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄 간, 비공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR의 위치를 제공하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 나타낸다. 이 상보적 표면은 항체의 동족 에피토프에 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있는데, 그들은 정확하게 정의되었기 때문이다; 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al ., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917] 참조.
당업계에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우, 본 명세서에 사용되는 용어의 정의는 달리 명확하게 반대로 언급되지 않는다면, 이러한 의미를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 구체적 예는 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드의 가변 영역 내에서 발견되는 불연속적 항원 결합 부위를 설명하는 용어 "상보적 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이 특정 영역은 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌[Kabat et al ., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917]에 의해 기재되어 있으며, 정의는 서로에 대해 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하는 정의 중 하나의 적용은 본 명세서에 정의되고 사용되는 바와 같은 용어의 범주 내인 것으로 의도된다. 상기 인용 문헌의 각각에 의해 정의되는 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 표 1에서 이하에 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 순서 및 크기에 따라 다를 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 제공한 항체의 인간 IgG 서브세트의 특정 초가변영역 또는 CDR을 포함하는 잔기를 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
카바트( Kabat ) 초티아( Chothia )
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1의 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat et al . (이하 참조)에 의해 제시된 넘버링 관례에 따른다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 그 자체를 이상의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 "카바트 넘버링"의 이 시스템을 분명하게 부여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "카바트 넘버링"운 문헌[Kabat et al ., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되지 않는다면, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체 내 구체적 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 기준은 카바트 넘버링 시스템에 따른다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 면역특이적 단편, 변이체, 또는 이들의 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 뮤린화된 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 이황화 결합 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-유전자형(항-Id) 항체(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체를 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국특허 제5,892,019호에 기재되어 있다. 본 발명의 면역글로뷸린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로뷸린 분자의 서브클래스를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 5가 구조를 지니는 IgM 또는 이의 유도체가 아니다. 특히, 본 발명의 구체적 적용에서, 특히 치료적 용도에서, IgM은 IgG 및 다른 2가의 항체 또는 대응되는 결합 분자보다 덜 유용한데, IgM이 그것의 5가 구조 및 친화도 성숙의 결여 때문에 종종 비특이적 교차반응성 및 매우 낮은 친화도를 나타내기 때문이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 다클론성 항체가 아니며, 즉, 혈장 면역글로뷸린 샘플로부터 얻은 혼합물보다는 하나의 특정 항체 종으로 실질적으로 이루어진다.
단일쇄 항체를 포함하는 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 다음의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 또한 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 지니는 가변 영역(들)의 임의의 조합을 포함하는 α-시누클레인-결합 단편이 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 또는 이의 면역특이적 단편은 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 인간, 뮤린, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마, 말 또는 닭 항체이다. 다른 실시형태에서, 가변 영역은 콘드로이틴으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 상어 유래).
일 양태에서, 본 발명의 항체는 인간으로부터 단리된 인간 단클론성 항체이다. 선택적으로, 인간 항체의 프레임워크 영역은 데이터베이스 내 적절한 인간 생식 계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고, 채택된다; 예를 들어, 단백질 조작을 위한 MRC 센터(MRC Centre for Protein Engineering)(영국 캠브릿지에 소재)에 의해 호스팅된 Vbase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) 참조. 예를 들어, 실제 생식계열 서열로부터 잠재적으로 벗어나는 것으로 고려되는 아미노산은 클로닝 과정 동안 포함된 PCR 프라이머 서열에 기인한다. 파지 디스플레이 항체 라이브러리 또는 이종 마우스로부터의 단일 쇄 항체 단편(scFv)과 같은 인공적으로 발생된 인간 유사 항체와 비교하여, 본 발명의 인간 단클론성 항체는 (i) 동물 대용보다는 인간 면역 반응을 사용하여 얻어지는 것, 즉, 항체가 인간 신체에서 그것의 적절한 입체구조로 천연 α-시누클레인에 대해 반응하여 만들어지는 것, (ii) 개체를 보호하는 것 또는 α-시누클레인의 존재에 대해 최소로 유의할 것, 및 (iii) 항체가 인간 유래이기 때문에, 자기 항원에 대한 교차 반응성의 위험이 최소화되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명에 따른 용어 "인간 단클론성 항체", "인간 단클론성 자가항체", "인간 항체" 등은 인간 유래의, 즉 B 세포 또는 이의 하이브리도마와 같은 인간 세포로부터 단리된 α-시누클레인 결합 분자 또는 인간 세포, 예를 들어 인간 기억 B 세포의 mRNA로부터 직접 클로닝된 cDNA를 나타내기 위해 사용된다. 인간 항체는 또한 아미노산 치환이, 예를 들어 결합 특징을 개선시키기 위해 항체에서 만들어진다 하더라도 여전히 "인간"이다.
인간 면역글로뷸린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로뷸린에 대한 동물 이식 유전자로부터 유래되고, 이하에, 그리고 예를 들어 Kucherlapati 등의 미국특허 제5,939,598호에 기재된 바와 같이 내인성 면역글로뷸린을 발현시키지 않는 항체는 본 발명의 진정한 인간 항체로부터 이들을 구별하기 위한 인간 유사 항체를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "뮤린화된 항체" 또는 "뮤린화된 면역글로뷸린"은 본 발명의 인간 항체로부터 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체; 및 마우스 항체 서열에 기반한 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 함유하는 인간 프레임워크 영역을 지칭한다. CDR을 제공하는 인간 면역글로뷸린은 "모(parent)" 또는 "억셉터(acceptor)"로 불리며, 프레임워크 변화를 제공하는 마우스 항체는 "도너"로 불린다. 불변 영역은 존재할 필요는 없지만, 그들이 있다면, 그들은 보통 마우스 항체 불변 영역과 실질적으로 동일하며, 즉, 적어도 약 85 내지 90%, 또는 약 95% 이상 동일하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 전장 뮤린화된 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로뷸린은 마우스 불변 영역, 인간 CDR, 및 다수의 "뮤린화된" 아미노산 치환을 갖는 실질적으로 인간 프레임워크를 함유한다. 전형적으로, "뮤린화된 항체"는 뮤린화된 가변 경쇄 및/또는 뮤린화된 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 뮤린화된 항체는 전형적인 키메라 항체를 포함하지 않는데, 예를 들어 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비-마우스이기 때문이다. "뮤린화" 과정에 의해 "뮤린화된" 변형된 항체는 CDR을 제공하는 모 항체와 동일한 항체에 결합되고, 보통 모 항체에 비해 마우스에서 덜 면역원성이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로뷸린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중간, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용을 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄, 또는 CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 추가로, 본 발명에서 사용을 위한 결합 폴리펩타이드는 적어도 일부의 CH2 도메인(예를 들어, CH2 도메인의 모두 또는 일부)이 없을 수 있다. 상기 제시한 바와 같이, 이들 도메인(예를 들어, 중쇄 부분)은 그들이 자연적으로 생기는 면역글로뷸린 분자로부터의 아미노산 서열에서 변하도록 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서에 개시된 특정 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체, 멀티머 중 하나의 폴리펩타이드쇄의 중쇄 부분은 멀티머의 제2 폴리펩타이드에 대한 것과 동일하다. 대안적으로, 본 발명의 중쇄 부분-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는, 예를 들어 이중특이성 항체 또는 다이아바디를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 scFv와 같은 단일 폴리펩타이드 쇄로 구성되며, 잠재적인 생체내 치료적 및 진단적 용도를 위해 세포내로(내부체(intrabody))로 발현된다.
본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 사용을 위한 결합 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로뷸린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 및, 부분적으로, IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로뷸린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개의 아미노산이 되는 것으로 생각된다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는, 예를 들어, 적어도 7개, 적어도 9개, 또는 적어도 약 15개 내지 약 30개 아미노산을 함유할 수 있다. CDR은 그것의 3차 형태로 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 연속적일 필요가 없고, 일부 경우에, 심지어 동일 펩타이드 쇄 상에 있을 필요도 없다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 α-시누클레인의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속적 또는 불연속적 아미노산의 서열을 함유한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체가 아미노산의 주어진 범위 "내에서" 결합되는 것으로, 예를 들어 "α-시누클레인의 아미노산 4 내지 15 내의" 에피토프에 대한 결합으로 언급될 때, 에피토프는 언급된 아미노산의 전체 범위를 포함하거나 또는 더 작은 것을 의미한다. 다시 말해서, "α-시누클레인의 아미노산 4 내지 15 내에서" 에피토프에 대해, 해당 에피토프는 4 내지 15개의 전체 12-아미노산 펩타이드 쇄를 포함할 수 있지만, 또한 아미노산 4 내지 12, 아미노산 4 내지 10 또는 아미노산 4 내지 8과 같이 더 작을 수 있다. 당업자는 또한 표준 범위 밖의 아미노산이 입체구조적 에피토프의 더 양호한 결합 친화도 또는 증가된 인식에 기여할 수 있지만, 결합에 필요하지는 않다.
본 명세서에서 상호호환적으로 사용되는 "특이적으로 결합되는" 또는 "특이적으로 인식되는"은, 일반적으로 결합 분자, 예를 들어 항체가 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합되고, 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에 일부 상보성을 수반하는 것을 의미한다. 본 정의에 따라, 항체는 그것이 관련없는 에피토프에 무작위로 결합되는 것보다 더 용이하게 그것의 항원-결합 도메인을 통해 해당 에피토프에 결합될 때, 에피토프에 "특이적으로 결합되는 것"으로 언급된다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 에피토프에 결합되는 상대적 친화도에 부합하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 큰 특이성을 갖는 것으로 여겨질 수 있거나 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 더 큰 특이성을 갖는 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.
해당되는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항원과 항체의 다른 결합 특징은 그것의 문법적 형태 모두에서, 항체의 특이성, 친화도, 교차반응성 및 다른 결합 특징을 지칭한다.
"우선적으로 결합되는"은 결합 분자, 예를 들어, 항체가 관련된, 유사한, 상동성 또는 유사한 에피토프에 결합되는 것보다 더 용이하게 에피토프에 특이적으로 결합되는 것을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합되는" 항체는, 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차반응될 수 있지만, 관련된 에피토프보다 해당 에피토프에 결합할 가능성이 더 크다.
비제한적 예로서, 결합 분자, 예를 들어 항체는, 그것이 제2 에피토프에 대해 항체의 KD 미만인 해리 상수(KD)로 제1 에피토프에 결합한다면, 제1 에피토프에 우선적으로 결합된다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대해 항체의 KD 미만의 적어도 10배인 친화도로 제1 에피토프에 결합된다면, 우선적으로 제1 항체에 결합된다. 다른 비제한적 예에서, 항체는, 그것이 제2 에피토프에 대해 항체의 KD 미만의 적어도 102인 친화도로 제1 에피토프에 결합된다면, 우선적으로 제1 항체에 결합된다.
다른 비제한적 예에서, 결합 분자, 예를 들어, 항체는, 그것이 제2 항체에 대해 항체의 오프 속도(k(off)) 미만의 k(off)로 제1 에피토프에 결합된다면, 우선적으로 제1 에피토프에 결합된다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 제2 항체에 대해 항체의 k(off)보다 적어도 10배 미만인 친화도로 제1 에피토프에 결합된다면 우선적으로 제1 에피토프에 결합된다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 그것이 제2 항체에 대해 항체의 k(off)의 적어도 102 미만인 친화도로 제1 에피토프에 결합된다면 우선적으로 제1 에피토프에 결합된다.
일부 실시형태에서 결합 분자, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 또는 l0-3 sec- 1이하의 오프 속도(k(off))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프 속도(k(off))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1 이상의 온 속도(k(on))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1 이상의 온 속도(k(on))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합될 수 있다.
항체에 기준항체의 결합을 일정한 정도로 차단하는 정도로 해당 에피토프에 항체가 우선적으로 결합된다면, 결합 분자, 예를 들어 항체는, 주어진 에피토프에 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 언급된다. 경쟁적 저해는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 예로서, 항체는 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%만큼 주어진 에피토프에 기준항체의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "친화도"는 결합 분자, 예를 들어, 면역글로뷸린 분자의 CDR과 개개 에피토프의 결합 강도의 측정을 지칭한다; 예를 들어, [Harlow et al ., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) 페이지 27-28] 참조. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "결합활성"은 면역글로뷸린과 항원 사이의 복합체의 전반적인 안정성, 즉, 면역글로뷸린 혼합물과 항원의 강도를 합한 작용을 지칭한다; 예를 들어, 문헌[Harlow 페이지 29-34] 참조. 결합활성은 집단 내 개개의 면역글로뷸린 분자와 특이적 에피토프의 친화도와 또한 면역글로뷸린 및 항원의 원자가와 관련된다. 예를 들어, 2가의 단클론성 항체와 고도로 반복적인 에피토프 구조, 예컨대 중합체를 지니는 항원 사이의 상호작용은 높은 결합활성 중 하나일 수 있다. 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합활성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Berzofsky et al ., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)], 및 본 명세서에 기재된 방법 참조. 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하기 위한 일반적 기법은 ELISA, RIA, 및 표면 플라스몬 공명을 포함한다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정 친화도는, 상이한 조건, 예를 들어 염 농도, pH 하에 측정된다면 다를 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 변수, 예를 들어, KD, IC50의 측정은 항체 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 완충제로 만들어질 수 있다.
결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 그것의 교차 반응성에 대해 기재되거나 또는 구체화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "교차 반응성"은 제2 항원과 반응되는 한 항원에 대해 특이적인 항체의 능력; 두 상이한 항원 물질 사이의 관련성의 측정을 지칭한다. 따라서, 항체가 그것의 형성을 유발한 것 이외의 에피토프에 결합된다면, 항체는 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유발 에피토프와 다수의 동일한 상보적 구조 특징을 함유하며, 일부 경우에 본래보다 사실상 더 양호하게 맞춰질 수 있다.
예를 들어, 특정 항체는 일정 정도의 교차 반응성을 가지며, 즉, 그들은 관련되지만, 동일하지 않은 에피토프, 예를 들어 기준 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 및 적어도 50% 동일성(당업계에 공지되고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 계산된 바와 같음)을 갖는 에피토프를 가진다. 일부 실시형태에서, 항체는, 그것이 기준 에피토프에 대해 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만 및 50% 미만의 동일성(당업계에 공지되고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 계산된 바와 같음)으로 에피토프에 결합되지 않는다면, 교차 반응성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 언급될 수 있다. 항체가 임의의 해당 에피토프의 다른 유사체, 오솔로그 또는 상동체에 결합되지 않는다면, 특정 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 여겨질 수 있다.
본 발명의 결합 분자, 예를 들어, 이의 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 α-시누클레인에 대한 그것의 결합 친화도에 대해 기재되거나 또는 구체화될 수 있다. 결합 친화도는 5 x 10-2M, 10-2M, 5 x 10-3M, 10-3M, 5 x 10-4M, 10-4M, 5 x 10-5M, 10-5M, 5 x 10-6M, 10-6M, 5 x 10-7M, 10-7M, 5 x 10-8M, 10-8M, 5 x 10-9M, 10-9M, 5 x 10-10M, 10-10M, 5 x 10-11M, 10-11M, 5 x 10-12M, 10-12M, 5 x 10-13M, 10-13M, 5 x 10-14M, 10-14M, 5 x 10-15M 또는 10-15M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 지니는 것을 포함한다.
앞서 표시한 바와 같이, 다양한 면역글로뷸린 분류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 배좌는 잘 공지되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "VH 도메인"은 면역글로뷸린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하며, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로뷸린 중쇄의 제1(대부분의 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며, 면역글로뷸린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CH2 도메인"는 통상적인 넘버링 계획을 사용하여 항체의 잔기 대략 244로부터 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 부분을 포함한다(잔기 244 내지 360, 카바트 넘버링 시스템; 및 잔기 231 내지 340, EU 넘버링 시스템; 문헌[Kabat EA et al . op. cit]참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 짝지어지지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결 분지 탄화수소 쇄는 무결함 천연 IgG 분자의 두 CH2 도메인 사이에 개재된다(interpose). 또한 CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인으로부터 C-말단까지 연장되고, 대략 108개의 잔기를 포함한다는 것이 잘 기록되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "힌지 영역"은 CH2 도메인에 CH1 도메인을 결합시키는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하며, 가요성이고, 따라서 두 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 이동되게 한다. 힌지 영역은 3개의 개별 도메인: 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인으로 다시 분할될 수 있다; 문헌[Roux et al ., J. Immunol. 161 (1998), 4083] 참조.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "이황화 결합"은 두 황 원자 간에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 이황화 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 가장 자연적으로 생기는 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연결되고, 두 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 239 내지 242에 대응되는 위치(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 이황화 결합에 의해 연결된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호호환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합 수단을 포함하는 어떤 수단에 의해 둘 이상의 구성요소 또는 성분을 함께 결합하는 것을 지칭한다. "프레임내 융합"은 본래의 ORF의 정확한 번역 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 연속적으로 더 긴 ORF를 형성하는 2 이상의 폴리뉴클레오타이드 오픈 리딩 프레임(ORF)의 결합을 지칭한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 본래의 ORF에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대응되는 2이상의 세그먼트를 함유하는 단일 단백질이다(세그먼트는 사실상 보통 이렇게 결합되지 않음). 따라서 리딩 프레임은 융합된 세그먼트 전체적으로 연속적으로 만들어지지만, 세그먼트는, 예를 들어 프레임내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로뷸린 가변 영역의 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 프레임내에서 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속적 폴리펩타이드의 부분으로서 공동번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로뷸린 프레임워크 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 분리된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학적 물질, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생성하는 과정을 지칭한다. 해당 과정은 유전자 녹다운뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현을 제한 없이 포함하는, 세포 내 유전자의 기능적 존재의 어떤 표현을 포함한다. 이는 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로 유전자의 전사 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로 번역을 제한 없이 포함한다. 최종의 원하는 산물이 생화학적 물질이라면, 발현은 해당 생화학적 물질 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사물로부터 번역된 폴리펩타이드 중 하나일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 산물은 전사 후 변형에 의해 핵산을 추가로 포함한다, 예를 들어, 폴리아데닐화, 또는 번역 후 변형에 의한 폴리펩타이드, 예를 들어, 메틸화, 글라이코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과 결합, 단백질 분해 절단 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "샘플"은 피험체 또는 환자로부터 얻은 임의의 생물학적 물질을 지칭한다. 일 양태에서, 샘플은 혈액, 뇌척수액("CSF") 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈액 샘플로부터 풍부화된 B 세포, 및 배양된 세포(예를 들어, 피험체로부터의 B 세포)를 포함할 수 있다. 샘플은 또한 신경조직을 포함하는 생검 또는 조직 샘플을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 샘플은 전 세포 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 당업계에 공지된 방법에 의해 수집될 수 있다. 일 양태에서, 펠렛은 200㎕ 완충제(20mM Tris, pH. 7.5, 0.5% Nonidet, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.1M NaCl, IX 시르마 프로테아제 저해제, 및 IX 시그마 포스파타제 저해제 1 및 2) 중에서 4℃에서 교반시킴으로써 재현탁될 수 있다. 현탁액은 간헐적 교반에 의해 20분 동안 얼음 상에서 유지할 수 있다. 15,000 x g에서 5분 동안 약 4℃에서 교반시킨 후, 상청액의 알리쿼트를 약 -70℃에서 저장할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치와 예방적 또는 방지적 측정을 지칭하되, 파킨슨 증상의 발생과 같은 원치않는 생리적 변화 또는 장애를 예방하거나 또는 늦추기 위한(줄이기 위한) 목적이다. 유리한 또는 원하는 임상적 결과는 검출가능하든 또는 검출가능하지 않든, 증상의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태 및 관해(remission)(부분적이든 또는 전체적이든)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는다면 예상되는 생존율과 비교하여 연장된 생존율을 의미할 수 있다. 치료의 필요에서 이들은 질환 또는 장애를 이미 가지는 것뿐만 아니라 질환 또는 장애를 가지기 쉬운 것 또는 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 것을 포함한다.
"피험체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 “포유류”는 진단, 예후, 예방 또는 치료가 요망되는 임의의 피험체, 특히 포유류 피험체, 예를 들어 인간 환자를 의미한다.
II. 항체
본 발명은 일반적으로 인간 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것인데, 이들은 실시예에 예시되는 항체에 대해 약술되는 바와 같은 면역학적 결합 특징 및/또는 생물학적 특성을 증명할 수 있다. 본 발명에 따라 α-시누클레인에 특이적인 인간 단클론성 항체는 노인 피험체의 풀(pool)로부터 클로닝되었다.
본 발명에 따라 수행된 실험 과정에서, 초기 시도는 α-시누클레인 특이적 항체를 클로닝하지 못했지만, 거의 항상 위양성(false-positive) 클론을 야기하였다. 이들 클론의 추가적인 조사는 그들이 이콜라이(E. coli)의 항체 인식 단백질을 생성한다는 것을 나타내었다. 이 문제를 피하기 위해, 인간 기억 B 세포 배양물의 조건화된 배지 내 항체는 코팅된 전장 알파 시누클레인 단량체에 결합과 동시에 이콜라이 단백질 및 소 혈청 알부민(BSA)에 결합 없이 스크리닝되었다. 특히, B 세포 조건화된 배지는 α-시누클레인 결합 인간 항체의 스크리닝을 위한 ELISA 분석에 대한 배지에서 실시 전 이콜라이 단백질에 의해 사전흡수되었다.
특이적 항체를 단리시키는 것의 초기 시도는 α-시누클레인에 대해 높은 혈장 결합 활성을 지니는 인간 피험체의 풀에 초점을 두었는데, 이는 순환 α-시누클레인 항체 혈장의 상승된 수준을 시사한다. 이들 시도는 α-시누클레인 특이적 인간 기억 B세포를 생성하지 못했고, 본 발명에 기재된 항체는 α-시누클레인에 대해 낮은 혈장 반응성을 지니는 피험체의 풀로부터 단리되었다.
이 측정 때문에, 몇몇 항체가 단리되었다. 선택된 항체는 분류 및 경쇄 하위분류 결정을 위해 추가로 분석되었다. 그 다음에 기억 B 세포 배양물로부터 선택된 적절한 항체 메세지는 RT-PCR에 의해 전사되고, 클로닝되며, 재조합 생성을 위한 발현 벡터에 조합된다; 국제특허출원 공개 WO 2010/069603 A1호 참조. 예시적인 항-인간 α-시누클레인 항체 NI-202.12F4, NI-202.3G12, 및 NI-202.3D8은 국제특허출원 공개 WO 2010/069603 A1호에 개시되어 있다.
인간 단클론성 항체 NI-202.22D11가 본 명세서에 개시된다. HEK293 또는 CHO 세포에서 NI-202.22D11의 재조합 발현 및 인간 α-시누클레인에 대한 그것의 결합 특이성의 후속 특성규명(도 2A 내지 B)이 결정되었다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 단리된 인간 단클론성 항-α-시누클레인 항체 NI-202.22D11 및 항원-결합 이의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체로 회수되며, 여기서 항체는 서열번호 14 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 지니는 VH 및 서열번호 22 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 지니는 VL, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 포함한다. 일 실시형태에서, NI-202.22D11뿐만 아니라 이의 변이체, 단편 또는 유도체는 인간 β-시누클레인 및 인간 γ-시누클레인에 비해 인간 α-시누클레인에, 그리고 뮤린 α-시누클레인에 비해 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 것을 특징으로 한다. NI-202.22D11은 올리고머 또는 응집된 형태로 α-시누클레인에 우선적으로 결합된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체에 관한 것이며, 항체는 기준 항체 NI-202.22D11로서 α-시누클레인의 동일 에피토프에 특이적으로 결합되는 항체이다. 실시예에서 예시되는 바와 같이, 항체 NI-202.22D11는 직접적 ELISA 분석에서 C-말단의 산성 영역(아미노산 96 내지 140)을 함유하는 α-시누클레인 절단부에, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 113 내지 123 내에 결합되고, 아미노산 PVDPDNE 내의 에피토프(서열번호 1의 아미노산 117 내지 123)에 특이적으로 결합된다.
항체 NI-202.22D11은 실시예 2에 나타내는 바와 같은 α-시누클레인의 단량체 형태를 거쳐서 α-시누클레인 응집물 또는 피브릴에 우선적으로 결합된다. 더 나아가, 항체 NI-202.22D11은 뇌에서 α-시누클레인의 병리적 형태, 예를 들어 실시예 3에 기재된 면역조직화학적 염색에 의해 예시되는 바와 같은 α-시누클레인의 병리학적 응집물에 결합된다. 따라서, 본 발명은 진단적 및 치료적 목적에 유용한 새로운 인간 항-α-시누클레인 항체를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 국제특허출원 공개 WO 2010/069603 A1에 기재된 바와 같은 예시적인 NI-202.12F4 항체의 정확한 결합 특성을 나타내는 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 제공한다. 본 발명은 α-시누클레인의 N-말단에서 에피토프에 결합되는 결합 분자, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 4 내지 15 내에 결합되는 결합 분자를 제공한다. 특정 실시형태는 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 제공하는데, 이는 NI-202.12F4의 서열번호 1의 아미노산 4 내지 15에 결합하지만, VH(서열번호 5 또는 서열번호 9), VL(서열번호 10 또는 서열번호 14), VHCDR1(서열번호 6), VHCDR2(서열번호 7), VHCDR3(서열번호 8), VLCDR1(서열번호 11), VLCDR2(서열번호 12) 및/또는 VLCDR3(서열번호 13) 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 항체를 제외한다.
본 발명은 결합 분자, 예를 들어 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 추가로 제공하는데, 이들은 도 1에 도시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 NI-202.22D11 VH 및/또는 VL 가변 영역의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보적 결정 영역(CDR)을 포함한다. 상기 확인된 가변 영역을 암호화하는 대응되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부하는 서열목록에서 제시된다. 도 1에 도시되는 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 상기 아미노산 서열의 CDR의 예시적인 설정은 또한 첨부되는 서열 목록에 표시된다. 그러나, 다음에서 논의되는 바와 같이 당업자는 추가로 또는 대안적으로 CDR이 사용될 수 있고, 도 1에 제시되는 것과 그것의 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5개 이상만큼 아미노산이 다르다는 것을 잘 인식한다. NI-202.22D11의 VH는 아미노산 서열 서열번호 15 및 DNA 서열 서열번호 19에 의해 표시되고, 그것의 GL-수정 형태는 아미노산 서열 서열번호 20 및 DNA 서열 서열번호 21로서 표시된다. NI-202.22D11의 VL은 아미노산 서열 서열번호 22 및 DNA 서열 서열번호 28에 의해 표시되고, 그것의 GL-수정 형태는 아미노산 서열 서열번호 26 및 DNA 서열 서열번호 27로서 표시된다. VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3의 중쇄 CDR 아미노산 서열은 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시된다. VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3의 경쇄 CDR 아미노산 서열은 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 도 1에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중 어느 하나이다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 도 1에 도시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체와 α-시누클레인에 대한 결합에 경쟁하는 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체이다. 해당 항체는 마찬가지로 특히 치료적 용도에 대해 인간일 수 있고, 것일 수 있다. 대안적으로, 항체는 동물에서 진단적 방법 및 연구에 특히 유용한 뮤린, 뮤린화된 및 키메라 뮤린-인간 항체이다.
상기 언급한 바와 같이, 인간 면역 반응에 대한 생성에 기인하여, 본 발명의 인간 단클론성 항체는 특정 생리학적 적절성을 가지며, 예를 들어 마우스 단클론성 항체의 생성을 위한 면역화 과정의 경우에 그리고 파지 디스플레이 라이브러리의 시험관내 스크리닝에서 접근가능하지 않거나 또는 덜 면역원성일 수 있는 에피토프를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체의 에피토프는 독특할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 α-시누클레인에 특이적인 결합에 대해 본 발명의 인간 단클론성 항체와 경쟁하는 항-α-시누클레인 항체 및 α-시누클레인 결합 분자로 연장된다. 본 발명은 더 구체적으로는 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체에 관한 것이며, 항체는 기준 항체 NI-202.22G11로서 α-시누클레인의 동일 에피토프에 특이적으로 결합된다.
항체 사이의 경쟁은, 예를 들어 시험 하의 면역글로뷸린이 α-시누클레인과 같은 보통의 항원에 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정될 수 있다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석은, 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석법(enzyme immunoassay (EIA), 샌드위치 경쟁 분석(문헌[Stahli et al ., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253] 참조), 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al ., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 및 Cheung et al ., Virology 176 (1990), 546-552] 참조), 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(문헌[Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)]), I125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 및 Moldenhauer et al ., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82] 참조)가 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 이들 미표지 시험 면역글로뷸린 및 표지된 기준 면역글로뷸린, 즉, 본 발명의 인간 단클론성 항체를 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 α-시누클레인 또는 이의 응집물의 사용을 수반한다. 경쟁적 저해는 시험 면역글로뷸린의 존재에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 시험 면역글로뷸린은 과량으로 존재한다. 경쟁적 결합 분석은 첨부되는 실시예에서 ELISA 분석에 대해 기재된 바와 같은 조건 하에 수행될 수 있다. 경쟁 분석에 의해 확인되는 항체(경쟁적 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합되는 항체 및 입체 장애가 일어나는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 대해 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합된 항체를 포함한다. 보통, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 적어도 50% 또는 75% 만큼 보통의 항원에 기준 항체의 특이적 결합을 저해할 것이다. 따라서, 본 발명은 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체로 추가로 회수되며, 여기서 항체는 α-시누클레인에 대한 결합으로부터 기준 항체 NI-202.22G11를 경쟁적으로 저해한다.
서열번호 15 또는 서열번호 20에 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 또한 개시된다.
서열번호 15 또는 서열번호 20과 동일하거나 또는 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 추가로 개시된다.
또한 서열번호 22 또는 서열번호 26과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다.
일부 실시형태는 서열번호 22 또는 서열번호 26과 동일하거나 또는 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 개시한다.
다른 실시형태에서, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 각각 서열번호 15 및 서열번호 22, (b) 각각 서열번호 15 및 서열번호 26, (c) 각각 서열번호 20 및 서열번호 22, (d) 각각 서열번호 20 및 서열번호 26과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다.
또한 중쇄 가변 영역의 적어도 1, 2 또는 모두 3의 VH-CDR은 도 1의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하고, 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 표시되는, 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다. 따라서, 본 실시형태에 따라, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩타이드 서열을 가진다. 도 1은 Kabat 시스템에 의해 정의되는 VH-CDR를 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예를 들어 Chothia 시스템에 의해 정의되는 VH-CDR이 또한 본 발명에 포함되며, 제시된 서열 데이터를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
또한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 표시되는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는, 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다.
또한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 표시되는 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 동일하거나 또는 어느 하나의 VH-CDR에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는, 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다. 또한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20개의 전체 CDR 치환을 제외하고 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH)이 제공된다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
또한 적어도 1, 2 또는 모두 3의 경쇄 가변 영역의 VL-CDR이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시되는 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 또는 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어 이의 항체 또는 항원-결합 단편이 개시된다. 따라서, 본 실시형태에 따라, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타내고, 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시되는 폴리펩타이드와 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩타이드 서열을 가진다. 도 1은 Kabat 시스템에 의해 정의되는 VL-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예를 들어 Chothia 시스템에 의해 정의되는 VL-CDR이 또한 본 발명에 포함된다.
또한 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 도 1에 나타내고, 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 나타내는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3와 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진, 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다
또한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시되는 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 동일하거나 또는 어느 하나의 VL-CDR에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는, 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다. 또한 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 전체 CDR 치환을 제외하고 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)이 제공된다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
면역글로뷸린 또는 그것의 암호화 cDNA는 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 뮤린화된 항체, 단일쇄 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 어느 하나의 유사체를 생성하는 단계(들) 중 어느 하나를 포함한다. 대응되는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988)]에 기재되어 있다. 상기 항체의 유도체가 파지 디스플레이 기법에 의해 얻어질 때, BIAcore 시스템에서 사용되는 바와 같은 표면 플라스몬 공명은 본 명세서에 기재된 항체 중 어느 하나의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합된 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 키메라 항체의 생성은, 예를 들어 국제특허출원 WO89/09622에 기재되어 있다. 인간화된 항체의 생성을 위한 방법은, 예를 들어 유럽특허 EP-A1 0 239 400호 및 국제특허 WO90/07861호에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 이용되는 항체의 추가 공급원은 소위 이종 항체이다. 마우스 내 인간-유사 항체와 같은 이종 항체의 생성을 위한 일반적 원칙은, 예를 들어 국제특허출원 WO91/10741호, WO94/02602호, WO96/34096호 및 WO 96/33735호에 기재되어 있다. 상기 논의한 바와 같은, 본 발명의 항체는, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 scFv와 같은 단일 쇄를 포함하는, 완전한 항체 이외의 다양한 형태로 존재할 수 있다; 국제특허출원 WO88/09344호 참조.
본 발명의 항체 또는 이의 대응되는 면역글로뷸린 쇄(들)는 당업계에 공지된 통상적인 기법을 사용하여, 예를 들어 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 첨가(들) 및/또는 재조합(들) 및/또는 단독으로 또는 조합으로 당업계에 공지된 임의의 다른 변형(들)을 사용함으로써 추가로 변형될 수 있다. 면역글로뷸린 쇄의 아미노산 서열의 근본이 되는 DNA 서열에서 이러한 변형의 도입을 위한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌[Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)] 참조. 본 발명의 항체의 변형은 측쇄 변형, 백본 변형 및 아세틸화, 하이드록실화, 메틸화, 아마이드화 및 탄수화물 또는 지질 모이어티, 보조인자 등의 부착을 포함하는 N- 및 C-말단 변형을 포함하는, 하나 이상의 구성요소 아미노산에서 화학적 및/또는 효소적 유도체화를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 카복실 말단에서 이종성 분자, 예컨대 면역조절 리간드에 융합된 아미노 말단에서 상기 설명된 항체 또는 이의 일부 단편을 포함하는 키메라 단백질의 생성을 포함한다; 예를 들어, 대응되는 기술적 세부사항에 대해 국제특허출원 WO00/30680호 참조.
추가적으로, 본 발명은 상기 언급된 항체 중 어느 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히 중쇄의 CDR3를 함유하는 상기 기재된 바와 같은 결합 분자를 함유하는 것을 포함하는 펩타이드를 포함하는데, 중쇄 CDR3(HCDR3)은 항원-항체 상호작용에서 더 큰 정도의 가변성 및 우세한 참여를 갖는 영역이라는 것이 빈번하게 관찰되었기 때문이다. 이러한 펩타이드는 본 발명에 따라 유용한 결합제를 생성하기 위한 재조합 수단에 의해 용이하게 합성되거나 또는 생성될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 펩타이드는, 예를 들어 상업적으로 이용가능한 자동 펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 펩타이드는 또한 발현 벡터 내로 펩타이드를 발현시키는 DNA를 포함시키고, 펩타이드를 생성하기 위해 발현 벡터로 세포를 형질전환시킴으로써 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 임의의 결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체 쪽으로 배향되고 언급된 특성을 나타내는, 즉, α-시누클레인을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 항체 및 결합 분자는 본 명세서, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA 및 웨스턴 블롯 및 면역조직화학에 의해 이들의 결합 특이성 및 친화도에 대해 시험될 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따라 수행되는 후속 실험의 예비 결과는 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체, 특히 항체 NI-202.22D11이 루이소체 치매 (DLB) 또는 파킨슨병(PD)에 걸린 환자의 인간 뇌 부문에 존재하는 α-시누클레인 봉입체를 인식한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 인간 항체 또는 이의 결합 단편, 유도체 또는 변이체는 인간 DLB 또는 PD 뇌 부문 상의 α-시누클레인을 인식한다(예를 들어, 도 4c 참조).
불멸 B 세포 또는 B 기억 세포는 후속 발현 및/또는 유전자 조작에 대해 재배열된 중쇄 및 경쇄 좌위의 공급원으로서 사용될 수 있다. 재배열 항체 유전자는 cDNA를 생성하기 위한 적절한 mRNA로부터 역전사될 수 있다. 원한다면, 중쇄 불변 영역은 상이한 아이소타입의 중쇄 불변 영역으로 교환되거나 또는 함께 제거될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 원치않는 모티프(예컨대, 스플라이스 부위 또는 제한 부위)를 제거하기 위해 유전자조작될 수 있고, 코돈 사용빈도(codon usage)는 항체 또는 이의 단편이 발현되는 세포에 대해 최적화될 수 있다. 추가로, 가변 영역 내 아미노산을 변성시키는 하나 이상의 돌연변이는, 예를 들어 친화도를 증가시키기 위해 또는 안정성을 개선시키기 위해 만들어 질 수 있다. 가변 영역은 단일 쇄 Fv 영역을 암호화하도록 연결될 수 있다. 다수 Fv 영역은 하나 이상의 표적에 결합 능력을 부여하도록 연결될 수 있거나 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 사용될 수 있다. 일단 유전자 물질이 이용가능하다면, 원하는 표적에 결합되는 능력을 둘 다 보유하는 상기 기재된 바와 같은 유사체의 설계는 간단하다. 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Gilliland et al ., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al ., Leukemia 11 (1997), 1787-1792]에 기재되어 있다.
일단 적절한 유전자 물질이 얻어지고, 원한다면 유사체를 암호화하도록 변형된다면, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 최소로 암호화하는 것을 포함하는 암호 서열은 표준 재조합 숙주 세포에 형질감염될 수 있는 벡터 상에 함유된 발현 시스템에 삽입될 수 있다. 다양한 이러한 숙주 세포가 효율적인 처리를 위해 사용될 수 있다. 본 목적에 유용한 전형적인 포유류 세포주는, CHO 세포, HEK 293 세포 또는 NSO 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
그 다음에 항체 또는 유사체의 생성은 숙주 세포의 성장 및 암호 서열의 발현에 적절한 배양 조건 하에 변형된 재조합 숙주를 배양시킴으로써 착수된다. 그 다음에 항체는 배양물로부터 이들을 단리시킴으로써 회수된다. 발현 시스템은 단일 펩타이드를 포함하도록 설계될 수 있고, 따라서 얻어진 항체는 배지 내로 분비되지만; 그러나, 세포내 생성이 또한 가능하다.
상기에 따라, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 동등한 결합 분자, 상기 기재한 항- α-시누클레인 항체의 면역글로뷸린 쇄의 하나 이상의 CDR, 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 이들의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
당업자는 항체의 가변 도메인 또는 이의 임의의 부분이 원하는 특이성 및 생물학적 기능의 다른 폴리펩타이드 또는 항체의 구성에 유용할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 1, 2, 3, 4 이상의 아미노산 치환에 의해, 첨부되는 실시예에 기재되는 NI-202.22D11와 실적적으로 동일한 또는 유사한 결합 특성을 가질 수 있는 항체 NI-202.22D11의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR, 또는 이러한 CDR을 포함하는 폴리펩타이드 및 항체를 제공한다. 당업자는 결합 친화도가 Kabat에 의해 정의되는 CDR과 부분적으로 중첩되는 CDR 내에서 또는 초가변 루프 내에서 아미노산 치환을 만드는 것에 의해 향상될 수 있다는 것을 안다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917); 예를 들어, 문헌[Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327] 참조. 따라서, 본 발명은 또한 항체에 관한 것이되, 언급된 CDR 중 하나 이상이 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 도 1에 제시되는 바와 같은 가변 영역의(본래의 또는 수정된) 2 또는 모두 3개의 CDR을 항체의 면역글로뷸린 쇄 중 하나 또는 둘 다에 포함한다.
당업자에게 공지된 바와 같은 본 발명의 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 불변 영역에 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 옵소닌 작용 및 세포 병원균의 용균에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하며, 또한 자가면역 과민증에 수반될 수 있다. 추가로, 항체는 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합되는 항체 Fc 영역 상에서 Fc 수용체 결합 부위를 지니는 Fc 영역을 통해 다양한 세포 상에서 수용체에 결합된다. IgG(감마 수용체), IgE(엡실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하는 상이한 분류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅 입자의 빨아들임(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 클리어런스, 킬러 세포에 의한 항체-코팅 입자의 용균(항체-의존적 세포-매개 세포독성 또는 ADCC로 불림), 염증 매개자의 방출, 태반 통과 및 면역글로뷸린 생성의 제어를 포함하는, 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
따라서, 본 발명의 특정 실시형태는 전체의 거의 동일한 면역원성으로 변성된 항체와 비교할 때, 적어도 불변 영역 도메인의 하나 이상의 분획이 원하는 생화학적 특징, 예컨대 감소된 효과기 기능, 비공유적으로 이합체화되는 능력, α-시누클레인 응집 및 침착의 부위에서 국소화되는 증가된 능력, 감소된 혈청 반감기, 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하도록 결실되거나 또는 달리 변성된, 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 진단적 및 치료적 방법에서 사용을 위한 특정 항체는 면역글로뷸린 중쇄와 유사한 폴리펩타이드 쇄를 포함하지만, 적어도 일부의 하나 이상의 중쇄 도메인이 없는 도메인 결실 항체이다. 예를 들어, 특정 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인은 결실될 것이고, 예를 들어 CH2 도메인의 모두 또는 부분은 결실될 것이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 진단적 및 치료적 방법에서 사용을 위한 특정 항체는 글라이코실화를 제거하기 위해 변성되며, 본 명세서의 다른 곳에서 비글라이코실화(aglycosylated) 또는 "agly" 항체로 지칭되는 불변 영역, 예를 들어 IgG 중쇄 불변 영역을 가진다. 이러한 "agly" 항체는 효소적으로뿐만 아니라 불변 영역 내 공통 글라이코실화 부위(들)를 유전자 조작함으로써 제조될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, "agly" 항체는 생체내에서 개선된 안전성 및 안정성 프로파일을 가질 수 있는 것으로 믿어진다. 원하는 효과기 기능을 갖는 비글라이코실화 항체의 생성 방법은, 예를 들어 전문이 본 명세서에 참조로서 포함되는 국제특허 출원 WO2005/018572호에서 발견된다.
본 명세서에 기재되는 특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체에서, Fc 부분은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 효과기 기능을 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해)는 순환되는 변형 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시키고, 이에 의해 α-시누클레인 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명과 일치되는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시키며, 따라서 혈청 반감기 및 컨쥬게이트된 세포독소의 비특이적 결합을 감소시킨다. 불변 영역의 또 다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성 때문에 국소화를 향상시킨 이황화 결합 또는 올리고당 모이어티를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 얻어진 생리적 프로파일, 생물학적 이용가능성 및 변형의 다른 생화학적 효과, 예컨대 α-시누클레인 국소화, 생분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 잘 공지된 면역학적 기법을 사용하여 용이하게 측정되고, 정량화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체에서, Fc 부분은, 예로서 Fcγ 수용체, LRP, 또는 Thy1 수용체를 통해 항체의 수용체-매개 엔도사이토시스를 향상시킴으로써 또는 살아있는 세포를 손상시키지 않고 그 안에 항체가 셔틀링되게 할 수 있는 것으로 언급되는 '초항체 기법(SuperAntibody Technology)'에 의해 항체의 세포내 섭취를 증가시키는 대안의 단백질 서열로 돌연변이되거나 또는 교환될 수 있다(Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). 예를 들어, 항체 결합 영역의 융합 단백질의 생성 및 세포 표면 수용체의 동족 단백질 리간드 또는 α-시누클레인에 결합되는 특이적 서열을 지니는 이중- 또는 다중-특이적 항체뿐만 아니라 세포 표면 수용체는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 유전자조작될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체에서, Fc 부분은 대안의 단백질 서열로 돌연변이되거나 또는 교환될 수 있고, 또는 항체는 화학적으로 변형되어 그것의 혈액 뇌 장벽 침투를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체의 변형된 형태는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 전체 전구체 또는 모 항체로부터 만들어질 수 있다. 대표적인 기법은 본 명세서에서 더욱 상세하게 논의된다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 만들어지거나 또는 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체 분자 또는 이의 단편은 "재조합적으로 생성되고", 즉, 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성된다. 항체 분자 또는 이의 단편을 만들기 위한 대표적인 기법은 본 명세서의 다른 곳에서 더욱 상세하게 논의된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 또한, 예를 들어 항체에 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형되는 유도체를 포함하므로, 공유적 부착은 항체가 그것의 동족 에피토프에 특이적으로 결합되는 것을 방지하지 않는다. 예를 들어, 제한되지 않고, 항체 유도체는, 예를 들어 글라이코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 결합에 의해 변형된 항체를 포함한다. 수많은 화학적 변형 중 어떤 것은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 치료되는 동물, 예를 들어 인간에서 해로운 면역 반응을 유발하지 않을 것이다. 특정 실시형태에서, 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 환자, 예를 들어 인간 환자로부터 유래되고, 그들이 유래된 동일 종, 예를 들어 인간에서 후속적으로 사용되어 유해한 면역 반응의 발생을 완화시키거나 또는 최소화한다.
항체의 면역원성을 감소시키기 위해 탈면역화가 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "탈면역화"는 T 세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변성을 포함한다; 예를 들어, 국제특허출원 WO98/52976호 및 WO00/34317호 참조. 예를 들어, 시작 항체로부터 VH 및 VL 서열이 분석되고, 인간 T 세포 에피토프는 상보적 결정 영역(CDR)에 대한 에피토프의 위치를 나타내는 각각의 V 영역 및 서열 내의 다른 중요한 잔기로부터 "맵핑"된다. T 세포 에피토프 맵으로부터의 개개의 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성을 변성시키는 낮은 위험을 지니는 대안의 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함 대안의 VH 및 VL 서열의 범위가 설계되며, 이들 서열은 후속적으로 본 명세서에 개시된 진단적 및 치료적 방법에서 사용을 위해 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 α-시누클레인-특이적 항체 또는 이의 면역특이적 단편의 범위 내로 포함된 다음, 기능에 대해 시험된다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 만들어지고, 시험된다. 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 그 다음에 발현 벡터 내로 클로닝되고, 후속 플라스미드는 전체 항체의 생성을 위해 세포주 내로 도입된다. 그 다음에 항체는 적절한 생화학적 및 생물학적 분석과 비교되고, 최적의 변이체가 확인된다.
단클론성 항체는 하이브리도마, 재조합체 및 파지 디스플레이 기법 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체는 당업계에 공지되고, 예를 들어 문헌[Harlow et al ., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al ., in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)]에 교시된 것을 포함하는 하이브리도마 기법을 사용하여 생성될 수 있으며, 상기 참고문헌은 전문이 참조로서 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기법을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 용어 "단클론성 항체"는 임의의 진핵세포, 원핵세포 또는 파지 클론을 포함하며, 그것에 의해 생성된 방법이 아닌, 단일 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 따라서, 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기법을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 엡스타인-바르 바이러스에 의한 형질전환을 통해 불멸인 인간 B 세포로부터 유래된다.
잘 공지된 하이브리도마 과정에서(Kohler et al ., Nature 256 (1975), 495), 상대적으로 짧게 생존하거나 또는 사멸되는 포유류로부터의 림프구, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 피험체로부터 유래된 B 세포는 불멸 종양 세포주 내에 융합되고(예를 들어, 골수종 세포주), 따라서 불멸이며, B 세포의 유전적으로 암호화된 항체를 생성할 수 있는 혼성 세포 또는 "하이브리도마"를 생성한다. 얻어진 혼성체는 단일 항체의 형성을 위해 특이적인 유전자를 포함하는 각 개체의 균주에 의한 선별, 희석 및 재성장에 의해 단일 유전자 균주로 분리된다. 그들은 원하는 항원에 대해 동종인 항체를 생성하며, 그것의 순수한 유전적 혈통에 대해 "단클론성"으로 칭해진다.
따라서 제조된 하이브리도마 세포는 비융합, 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유할 수 있는 적합한 배양 배지 내에 씨딩되고 성장된다. 당업자는 하이브리도마의 형성, 선별 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하고, 표준화된 프로토콜이 잘 확립되어 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장되는 배양 배지는 원하는 항원에 대해 단클론성 항체의 생성을 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단클론성 항체의 결합 특이성은 본 명세서에 기재된 바와 같은 시험관내 분석, 예컨대 면역침전법, 방사면역측정법(RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 시험관내 분석에 의해 결정된다. 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝될 수 있고, 표준 방법에 의해 성장된다; 예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)] 참조. 서브클론에 의해 분비되는 단클론성 항체는 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 통상적인 정제 과정, 예컨대 단백질-A, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다.
다른 실시형태에서, 림프구는 미세조작 및 단리된 가변 유전자에 의해 선별될 수 있다. 예를 들어, 말초혈액 단핵세포는 면역화되거나 또는 자연적 면역 포유류, 예를 들어 인간으로부터 단리될 수 있고, 시험관내에서 약 7일 동안 배양될 수 있다. 배양물은 스크리닝 기준을 충족시키는 특이적 IgG에 대해 스크리닝될 수 있다. 양성 세포로부터의 세포가 단리될 수 있다. 개개의 Ig-생성 B 세포는 FACS에 의해 또는 보체-매개 용혈성 플라그 분석에서 그들을 확인함으로써 단리될 수 있다. Ig-생성 B 세포는 튜브 내로 미세조작될 수 있고, VH 및 VL 유전자는, 예를 들어 RT-PCR을 사용하여 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 발현을 위해 세포(예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포) 내로 형질감염될 수 있다.
대안적으로, 항체-생성 세포주는 당업자에게 잘 공지된 기법을 사용하여 선별되고, 배양될 수 있다. 이러한 기법은 다양한 실험 메뉴얼 및 1차 간행물에 기재되어 있다. 이 점에서, 이하에 기재되는 본 발명에서 사용에 적합한 기법은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 부록을 포함하는 문헌[Current Protocols in Immunology, Coligan et al ., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기재되어 있다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기법에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로뷸린의 단백질 분해 절단에 의해 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 이러한 단편은, 예를 들어 방사성동위원소와 같은 검출 시약에 면역글로불린의 면역특이적 부분을 결합시키는 단계를 수반하는 면역진단적 절차에서 사용에 충분하다.
전적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 본 발명의 인간 항체는 연령 때문에 장애, 예를 들어 파킨슨병이 발생할 위험이 있는 것으로 의심될 수 있는 노인 피험체 또는 장애를 지니지만, 대단히 안정한 질병 과정에 있는 환자로부터 단리된다. 그러나, 노인 건강체 및 무증상 피험체가 각각 더 정기적으로 더 젊은 피험체보다 보호적 항-α-시누클레인 항체가 발생될 것으로 예상하는 것은 신중하여야 하지만, 더 젊은 피험체가 본 발명의 인간 항체를 얻기 위한 공급원으로도 사용될 수 있다. 이는 특히 시누클레인병증의 가족성 형태가 발생할 성향을 가지지만, 그들의 면역계 및 반응이 더 나이든 성인에서 더 효율적으로 기능하기 때문에 무증상으로 남아있는 더 젊은 환자에 대해 특히 적용된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 대상 항체에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 예시적인 항체 분자는 본 명세서에 기재된다.
본 발명의 항체는 항체의 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 화학적 합성에 의해 또는 본 명세서에 기재된 재조합 발현 기법에 의해 생성될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 합성 불별 영역을 포함하되, 하나 이상의 도메인은 부분적으로 도는 전체적으로 결실된다("도메인-결실 항체"). 특정 실시형태에서, 양립가능한 변형된 항체는 도메인 결실 작제물 또는 변이체를 포함할 것이되, 전체 CH2 도메인은 제거되었다(DCH2 작제물). 다른 실시형태에 대해, 짧은 연결 펩타이드는 가변 영역에 대한 이동의 자유 및 가요성을 제공하기 위해 결실 도메인으로 치환될 수 있다. 도메인 결실 작제물은 IgG1 인간 가변 도메인을 암호화하는 벡터를 사용하여 유래될 수 있다, 예를 들어, 국제특허출원 WO02/060955 및 WO02/096948A2 참조. 이 벡터는 CH2 도메인을 결실시키도록 유전자조작되고, 도메인 결실 IgG1 불변 영역을 발현시키는 합성 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 미니바디이다. 미니바디는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 만들어질 수 있다, 예를 들어, 미국 특허 제5,837,821호 또는 국제특허출원 WO 94/09817호 참조.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는, 그것이 단량체 서브유닛 사이의 결합을 허용하는 한, 소수의 또는 심지어 하나의 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로뷸린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선별 영역에서 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시키는데 충분할 수 있고, 이에 의해 α-시누클레인 국소화를 증가시킬 수 있다. 유사하게, 효과기 기능(예를 들어, 보체 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인이 검출될 수 있다. 불변 영역의 이러한 부분적 결실은 항체의 선별된 특징(혈청 반감기)을 개선시킬 수 있는 반면, 대상 불변 영역 도메인 무결함과 관련된 다른 바람직한 기능을 남겨둔다. 게다가, 상기 시사한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 얻어진 작제물의 프로파일을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 합성될 수 있다. 이 점에서 보존된 결합 부위(예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공된 활성을 파괴할 수 있는 반면, 변형된 항체의 구성 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지할 수 있다. 또 다른 실시형태는, 효과기 기능과 같은 바람직한 특징을 향상시키거나 또는 더 많은 세포독성 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 하나 이상의 아미노산의 첨가를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 구체적 서열을 삽입하거나 또는 복제하는 것은 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 항체 또는 이의 단편이 α-시누클레인에 면역특이적으로 결합된, 본 명세서에 기재된 항체 분자(예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체를 포함)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 항체를 제공한다. 부위 지정 돌연변이유발 및 아미노산 치환을 야기하는 PCR-매개 돌연변이 유발을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 표준 기법이 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 변이체(유도체를 포함)는 기준 VH 영역, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL 영역, VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3에 대해 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 지니는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하를 지니는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 알기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스팔트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 지니는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 포화 돌연변이유발에 의하는 것과 같은 암호 서열의 모두 또는 부분을 따라 무작위로 도입될 수 있고, 얻어진 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위한 생물학적 활성(예를 들어, α-시누클레인에 결합하는 능력)에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, 항체 분자의 프레임워크 영역에서만 또는 CDR 영역에서만 돌연변이를 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이일 수 있으며, 예를 들어 항원에 결합하는 항체의 능력에 대한 효과를 전혀 또는 거의 갖지 않고, 사실 일부 이러한 돌연변이는 어떤 아미노산 서열도 변성시키지 않는다. 이들 유형의 돌연변이는 코돈 사용빈도를 최적화하거나 또는 하이브리도마의 항체 생성을 개선시키는데 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 암호화하는 코돈-최적화된 암호 영역은 본 명세서의 다른 곳에 개시되어 있다. 대안적으로, 비-중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변성시킬 수 있다. 대부분의 침묵 및 중성 미스센스 돌연변이의 위치는 프레임워크 영역 내에 있을 가능성이 있지만, 대부분의 비중성 미스센스 돌연변이의 위치는, 이것이 절대적으로 필요하지 않음에도 불구하고 CDR 내에 있을 가능성이 있다. 당업자는 항원-결합 활성 내 변성 없음 또는 결합 활성의 변성과 같은 원하는 특성(예를 들어, 항원-결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화)을 지니는 돌연변이체 분자를 설계하고, 시험할 수 있다. 돌연변이유발 후, 암호화된 단백질은 일상적으로 발현될 수 있고, 암호화된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예를 들어, α-시누클레인의 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합되는 능력)은 본 명세서에 기재된 기법을 사용하거나 또는 당업계에 공지된 기법을 일상적으로 변형시킴으로써 결정될 수 있다.
III. 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 미변형 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 더 전형적으로는 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 혼성체 분자로 구성될 수 있다. 추가로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 둘 다 포함하는 삼중-가닥 영역으로 구성될 수 있다. 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 변형된 염기 또는 안정성 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 백본을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화된 염기 및 흔치 않은 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA로 만들어질 수 있고; 따라서, "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
면역글로뷸린(예를 들어, 면역글로뷸린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)으로부터 유래된 폴리펩타이드의 비천연 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 면역글로뷸린의 뉴클레오타이드 서열 내로 첨가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있으므로, 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실은 암호화된 단백질 내로 도입된다. 돌연변이는 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 표준 기법에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 만들어질 수 있다.
잘 공지된 바와 같이, RNA는 본래 B 세포, 하이브리도마 세포로부터 또는 표준 기법, 예컨대 가돌리늄 아이소티오시아네이트 추출 및 침전 후 원심분리 또는 크로마토그래피에 의한 다른 형질전환된 세포로부터 단리될 수 있다. 바람직하다면, mRNA는 올리고 dT 셀룰로스 상의 크로마토그래피와 같은 표준 기법에 의해 전체 RNA로부터 단리될 수 있다. 적합한 기법은 당업계에서 친숙하다. 일 실시형태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 잘 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 사용하여 동시에 또는 개별적으로 만들어질 수 있다. PCR은 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반한 더 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 거대한 상동성 프로브, 예컨대 인간 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 세포로부터 단리되고, 상세한 설명에 제시된 표준의 잘 공지된 기법, 예를 들어 재조합 DNA 기법에 관해 앞서 언급한 기준에 따라 제한 맵핑되고, 시퀀싱될 수 있다. 물론, DNA는 단리 과정 또는 후속 분석 동안 임의의 시점에 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
일 실시형태는 서열번호 15 또는 서열번호 20과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 15 또는 서열번호 20과 동일하거나 또는 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VH 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 실시형태는 중쇄 가변 영역의 CDR 중 적어도 1, 2 또는 모두 3개가 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 표시되는 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한, 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서, 본 실시형태는 도 1에 나타내는 바와 같이 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 표시되는 것에 관한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 도 1에 나타내는 바와 같이 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 표시되는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 기와 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
추가 실시형태는 인간 α-시누클레인에 특이적으로 또는 우선적으로 결합되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 VH를 포함하는 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 22 또는 서열번호 26과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
추가 실시형태는 서열번호 22 또는 서열번호 26과 동일하거나 또는 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 VL 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 실시형태는 경쇄 가변 영역의 적어도 1, 2 또는 모두 3개의 VL-CDR이 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시되는 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한, 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서, 이 실시형태는 도 1에 나타내는 바와 같은 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 의해 표시되는 것과 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 도 1에 나타내는 바와 같은 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 의해 각각 표시되는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 기와 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는, 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
추가 실시형태는 인간 α-시누클레인에 특이적으로 또는 우선적으로 결합되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 VL을 포함하는 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩타이드 또는 두 폴리뉴클레오타이드 간의 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 또는 핵산 서열을 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본 명세서에서 논의될 때, 임의의 특정 폴리펩타이드가 다른 폴리펩타이드에 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지 여부는, 이하로 제한되지 않지만, BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 위스콘신주 53711 메디슨 사이언스 드라이브 575에 소재)과 같은 당업계에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 사이의 최고 상동성 세그먼트를 발견하기 위해 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489]의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과, 예를 들어 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 변수는 물론 동일성 백분율이 기준 폴리펩타이드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 기준 서열 내 아미노산의 전체 수의 5%까지의 상동성 갭이 허용되도록 설정된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 19 또는 서열번호 21에서 제시된 VH 또는 서열번호 27 또는 서열번호 28에서 제시된 VL의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 이 점에서, 당업자는 적어도 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 면역글로뷸린 쇄 둘 다의 또는 단지 하나의 가변 도메인을 암호화할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서의 다른 곳에서 기재되는 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함한다. 추가적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 폴리뉴클레오타이드, Fab 단편, 및 다른 유도체를 암호화하는 폴리뉴틀레오타이드가 또한 본 발명에 의해 생각된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성되거나 또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지된다면, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 문헌[Kutmeier et al ., BioTechniques 17 (1994), 242]에 기재된 바와 같은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있는데, 이는 간략하게, 항체를 암호화하는 서열의 부분을 함유하는 중복 올리고뉴클레오타이드의 합성, 해당 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 결찰, 그 다음에 결찰된 올리고뉴클레오타이드의 PCR에 의한 증폭을 수반한다.
대안적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 만들어질 수 있다. 특정 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론이 이용가능하지 않지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 항체를 암호화하는 핵산은 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리 또는 항체를 발현시키기 위해 선별된 하이브리도마 세포와 같은 α-시누클레인-특이적 항체를 발현시키는 임의의 조직 또는 세포로부터 단리된 polyA+ RNA와 같은 핵산으로부터 생성된 cDNA 라이브러리)으로부터 서열의 3' 및 5' 단부에 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 또는, 예를 들어 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 확인하기 위한 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 클로닝시킴으로써 화학적으로 합성되거나 또는 얻어질 수 있다. 그 다음에 PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업계에 잘 공지된 임의의 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일단 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체의 뉴클레오타이드 서열 및 대응되는 아미노산 서열이 결정되면, 그것의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열의 조작을 위해 당업계에 잘 공지된 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기법, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) 및 Ausubel et al ., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)]에 기재된 기법 참조)을 사용하여 조작되어 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 갖는 항체를 만들 수 있고, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 만들 수 있다.
IV. 항체 폴리펩타이드의 발현
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체를 제공하기 위한 단리된 유전적 물질의 조작 후, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 원하는 양의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포 내로 도입을 위해 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 유도체 또는 유사체의 재조합 발현, 표적 분자에 결합된 항체의 중쇄 또는 경쇄는 본 명세서에 기재된다. 일단 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 항체 또는 이의 부분의 중쇄 또는 경쇄(예를 들어 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유)가 얻어지면, 항체 분자의 일부에 대한 벡터는 당업계에 잘 공지된 기법을 사용하여 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 항체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법은 본 명세서에 기재된다. 당업자에게 잘 공지된 방법은 항체 암호 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 국제특허출원 WO 86/05807호 및 WO 89/01036호; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조)을 포함할 수 있으며, 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포 내에 원하는 유전자를 도입하거나 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 양립가능한 벡터는 원하는 유전자의 클로닝을 가능하게 하는 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 세포에 들어가고/가거나 복제되는 능력, 선별 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 수많은 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터 중 한 분류는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래되는 DNA 구성요소를 이용한다. 다른 것은 내부 리보솜 결합 부위에 의한 다시트론성(polycistronic) 시스템의 사용을 수반한다. 추가적으로, DNA를 그것의 염색체 내로 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포를 선별시키는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주, 살생물제 내성(예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성에 대해 원영양성(prototrophy)을 제공할 수 있다. 선별가능한 마커는 발현되는 DNA 서열에 직접 연결되거나 또는 공동 형질전환에 의해 동일 세포 내로 도입될 수 있다. 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 추가적인 구성요소가 첨가될 수 있다. 이들 구성요소는 신호 서열, 분할 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의한 바와 같은 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(예를 들어, 인간)와 함께 발현 벡터 내로 삽입된다. 일 실시형태에서, 이는 미국 특허 제6,159,730호에 개시된 NEOSPLA로서 지칭되는 Biogen IDEC, Inc.의 등록상표 발현 벡터를 사용하여 달성된다. 이 벡터는 거대세포 바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제원점, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 다이하이드로엽산 환원효소 유전자 및 리더서열을 함유한다. 이 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 포함 시 항체의 매우 고수준의 발현, CHO 세포 내 형질감염 그 다음에 배지 및 메토트렉세이트 증폭을 함유하는 G418 내 선별을 야기하는 것으로 발견되었다. 물론, 진핵 세포 내 발현을 유발할 수 있는 임의의 발현 벡터는 본 발명에서 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는, 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 및 pZeoSV2(캘리포니아주 샌디에고에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능), 및 플라스미드 pCI(위스콘신주 메디슨에 소제한 프로메가(Promega)로부터 입수가능)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 면역글로뷸린 중쇄 및 경쇄가, 예를 들어 로봇식 시스템에 의해 수행될 수 있는 일상적인 실험이라면 적합하게 고수준을 발현시키는 것에 대해 매우 다수의 형질전환된 세포를 스크리닝한다. 벡터 시스템은 또한 미국 특허 제5,736,137호 및 제5,658,570호에서 교시되며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다. 이 시스템은 고발현 수준, 예를 들어 > 30 pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은, 예를 들어 미국특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 본 명세서에 전문이 포함된 미국특허 출원 공개 제2003-0157641 A1호에 개시되어 있는 것과 같은 다시스트론성 작제물을 사용하여 발현될 수 있다. 이들 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 관심 대상의 다중 유전자 산물은 단일 다시트론성 작제물로부터 생성될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site: IRES)를 사용하여 상대적으로 고수준의 항체를 제공한다. 양립가능한 IRES 서열은 또한 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다. 당업자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 개시되어 있는 항체의 전체 범위를 효과적으로 만들기 위해 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
더 일반적으로는, 일단 항체의 단량체 서브유닛을 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되었으면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 내로 플라스미드의 도입은 당업계에 잘 공지된 다양한 기법에 의해 수행될 수 있다. 이들은, 예를 들어, Fugene 또는 리포펙타민을 사용하는 지질형질감염(lipotransfection)을 포함하는 형질감염, 프로토플라스트 융합, 인산칼슘 침전, DNA로 피복된 세포 융합, 미세주입법 및 무결함 바이러스로 감염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 전형적으로, 숙주 내로 플라스미드 도입은 표준 인산칼슘 공동 침전 방법을 통한다. 발현 작제물을 은닉하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적절한 조건 하에 성장되고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성을 위해 분석된다. 대표적인 분석 기법은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 형광-활성화 세포 선별 분석법(FACS), 면역조직화학법 등을 포함한다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포 내로 전달되고, 그 다음에 형질감염된 세포는 통상적인 기법에 의해 배양되어 본 명세서에 기재된 방법에서 사용을 위한 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항체를 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중쇄 항체의 발현을 위해, 중쇄와 경쇄를 둘 다 암호화하는 벡터는 이하에 상술하는 바와 같은 전체 면역글로뷸린 분자의 발현을 위해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 두 발현 벡터, 즉 중쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터와 경쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터 내로 공동형질감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선별가능한 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드를 둘 다 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 유리하게는 중쇄 앞에 위치되어 과량의 독성 유리 중쇄를 피한다; 문헌[Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197] 참조. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 사용하고 적어도 하나의 이종성 유전자를 암호화하여 구성된 벡터를 은닉하는 세포를 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 항체의 단리를 위한 공정의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 명확하게 구체화되지 않는다면, 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호호환적으로 사용된다. 다시 말해서, "세포"로부터 폴리펩타이드의 회수는 스핀다운된 전체 세포로부터 또는 배지와 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 명세서에 기재된 방법에서 사용을 위해 항체 분자를 발현시키는데 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 대상의 암호 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 암호 서열로 형질전환되거나 또는 형질감염될 때 인시츄로 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 박테리오 파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질감염된 박테리아(예를 들어, 이콜라이, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis))로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물유기체; 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염된 효모(예를 들어, 사카로마이세소 피키아(Saccharomyces, Pichia)); 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포계; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포계; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 작제물을 은닉하는 포유류 세포계(예를 들어, COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 에스캐리키아 콜라이와 같은 박테리아 세포 또는 진핵 세포는 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포 바이러스로부터의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 구성요소와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포와 같은 포유류 세포는 항체에 대해 효과적인 발현 시스템이다; 예를 들어, 문헌[Foecking et al ., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al ., Bio/Technology 8 (1990), 2] 참조.
단백질 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 종종 포유류 유래이며; 당업자는 원하는 유전자 산물이 발현되는데 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 결정하는 능력을 신뢰한다. 예시적인 숙주 세포주는, CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 계열, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁 암종), CVI(원숭이 신장 계열), COS(SV40 T 항원을 지니는 CVI의 유도체), VERY, BHK(새끼 햄스터 신장), MDCK, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 계열), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및293(인간 신장)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스 기관인 미국 미생물보존센터(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 입수가능하다.
추가로, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 원하는 특이적 형식으로 유전자 산물을 변형하고, 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글라이코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 번역 후 처리 및 단백질 및 유전자 산물의 변형을 위한 특징적 및 특이적 메커니즘을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보장하도록 선택될 수 있다. 이를 위하여, 유전자 산물의 1차 전사, 글라이코실화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기작을 소유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 안정한 발현이 사용된다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현시키는 세포주는 유전자 조작될 수 있다. 바이러스 복제원점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 구성요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 유전자조작된 세포는 풍부한 배지 내에서, 예를 들어 1 내지 2일 동안 성장된 다음, 선별적 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드 내 선별가능한 마커는 선별에 내성을 부여하며, 세포는 플라스미드를 그것의 염색체 내로 안정하게 도입되게 하며, 차례로 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있는 좌위를 형성하도록 성장한다. 이 방법은 항체 분자를 안정하게 발현시키는 세포주를 유전자 조작하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.
단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al ., Cell 11 (1977), 223), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al ., Cell 22 (1980), 817) 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있으며, 이들은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있다. 또한, 항-대사산물 내성은 다음의 유전자에 대한 선별 기준으로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al ., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); 마이코페놀산에 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); 아미노글라이코사이드 G-418에 내성을 부여하는 neo 문헌[Goldspiel et al ., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215]; 및 하이그로마이신에 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기법의 당업계에 흔히 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al . (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al ., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있으며, 검토를 위해 문헌[Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)]을 참조한다. 항체를 발현시키는 벡터 시스템 내 마커가 증폭가능할 때, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 저해제의 수준 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 관련되기 때문에, 항체의 생성은 또한 증가될 것이다; 문헌[Crouse et al ., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257] 참조.
시험관내 생성은 원하는 매우 다량의 폴리펩타이드를 제공하도록 정률증가를 허용한다. 조직 배양 조건 하의 포유류 세포 배양을 위한 기법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 에어리프트(airlift) 반응기 내 또는 연속 교반 반응기 또는 고정 또는 갇힌 세포 배양물 내, 예를 들어 중공섬유, 마이크로캡슐 내, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서 균일한 현탁 배양물을 포함한다. 필요하고/하거나 원한다면, 폴리펩타이드의 용액은 관례적 크로마토그래피 방법에 의해, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스에 걸친 크로마토그래피 또는 면역 친화도 크로마토그래피, 예를 들어 합성 힌지 영역 폴리펩타이드의 우선적인 생합성 후 또는 본 명세서에 기재된 HIC 크로마토그래피 전에 또는 후속적으로 정제될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 암호화하는 유전자는 또한 박테리아 또는 곤충 또는 효모 또는 식물 세포와 같은 비포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 핵산을 용이하게 취하는 박테리아는 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae)의 구성원, 예컨대 에스캐리키아 콜라이 또는 살모넬라(Salmonella)의 균주; 바실라세아에(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스; 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 박테리아에서 발현될 때, 이종성 폴리펩타이드는 전형적으로 봉입체의 부분이 된다는 것이 추가로 인식될 것이다. 이종성 폴리펩타이드는 단리되고, 정제된 다음 기능적 분자 내로 조립되어야 한다. 항체의 4가 형태가 요망된다면, 그 다음에 서브유닛은 4가 항체로 자기 조립될 것이다; 예를 들어, 국제특허 출원 WO02/096948호 참조.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 항체 분자가 발현되도록 의도되는 사용에 의존하여 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 단백질이 생성될 때, 항체 분자의 약제학적 조성물의 생성을 위해, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 지시하는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는, 이콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al ., EMBO J. 2 (1983), 1791)(여기서 항체 암호 서열은 lacZ 암호 영역을 지니는 프레임 내 벡터에 개별적으로 결찰될 수 있고, 따라서 융합 단백질이 생성됨); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509); 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase: GST)에 의해 융합 단벡질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비드의 매트릭스에 흡착 및 결합에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제된 후 유리 글루타티온의 존재에서 용해될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되며, 따라서 클로닝된 표적 유전자 산물은 GST 모이어티로부터 방출될 수 있다.
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물이 또한 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 흔한 빵 효모는, 다수의 다른 균주, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 흔히 이용가능함에도 불구하고, 진핵생물 미생물유기체 중에서 가장 흔히 사용된다. 사카로마이세스에서 발현을 위해, 플라스미드 YRp7, 예를 들어(Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al ., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al ., Gene 10 (1980), 157)이 흔히 사용된다. 이 플라스미드는 트립토판 내에서 성장하는 능력을 결여하는 효모의 돌연변이체 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, Genetics 85 (1977), 12)을 이미 함유한다. 효모 숙주 게놈의 특징으로서 trpl 병변의 존재는 그 다음에 트립토판이 없을 때 성장에 의한 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다.
곤충계에서, 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다면체 바이러스(AcNPV)는 전형적으로 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 바이러스는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 암호 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어, 다면체 유전자) 내로 개별적으로 클로닝될 수 있고, AcNPV 프로모터(예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓인다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 전체 항체, 이들의 이합체, 개개의 경쇄 및 중쇄 또는 다른 본 발명의 다른 면역글로뷸린 형태는, 예를 들어, 크로마토그래피에 의해(예를 들어, 이온 교환, 친화도에 의해, 특히 단백질 A 후 특이적 항원에 대한 친화도 및 크기 컬럼 크로마토그래피에 의해), 원심분리, 차별적인 용해도, 예를 들어 황산 암모늄 침전에 의해 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의하는 것을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)] 참조. 대안적으로, 본 발명의 항체의 친화도를 증가시키는 방법은 미국 특허 공개 제2002-0123057 A1호에 개시되어 있다.
V. 융합 단백질 및 컨쥬게이트
특정 실시형태에서, 항체 폴리펩타이드는 항체에 보통 결합되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적인 변형은 이하에 더욱 상세하게 기재된다. 예를 들어 일부 실시형태에서, 본 발명의 단일쇄 fv 항체 단편은 가요성 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티(예를 들어, PEG, 약물, 독소 또는 표지, 예컨대 형광체, 방사성물질, 효소, 핵 자기, 중금속 등)를 첨가하도록 변형될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 융합 단백질을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 융합 단백질은, 예를 들어 적어도 하나의 표적 결합 부위, 및 적어도 하나의 이종성 부분, 즉, 본래 자연적으로 연결되지 않은 부분을 지니는 면역글로뷸린 α-시누클레인-결합 도메인을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 보통 융합 폴리펩타이드에서 함께 초래되는 별개의 단백질 내에 존재할 수 있거나 또는 그들은 보통 동일 단백질에 존재할 수 있지만 융합 폴리펩타이드 내 새로운 배열로 위치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해 또는 펩타이드 영역이 원하는 관계에서 암호화되는 폴리뉴클레오타이드를 만들고, 번역함으로써 만들어질 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 적용되는 바와 같은 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 그것이 비교되는 독립체의 나머지와는 별개의 독립체로부터 유래된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유사체에 융합되는 "이종성 폴리펩타이드"는 동일 종의 비면역글로뷸린 폴리펩타이드로부터 또는 상이한 종의 면역글로뷸린 또는 비면역글로뷸린 폴리펩타이드로부터 유래된다.
본 명세서의 다른 곳에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩타이드에 대해 재조합적으로 융합되거나 또는 폴리펩타이드 또는 다른 조성물에 대해 화학적으로 컨쥬게이트(공유적 및 비공유적 컨쥬게이션을 포함)될 수 있다. 예를 들어, 항체는 검출 분석에서 표지로서 유용한 분자 및 효과기 분자, 예컨대 이종성 폴리펩타이드, 약물, 방사성핵종 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 또는 컨쥬게이트될 수 있다; 예를 들어, 국제특허출원 WO92/08495; WO91/14438; WO89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 유럽 특허 EP 0 396 387호 참조.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합, 즉, 펩타이드 등배전자체에 의해 서로 결합된 아미노산으로 구성될 수 있고, 20개 유전자-암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 항체는 자연적 처리, 예컨대 번역후 처리에 의해 또는 당업계에 잘 공지된 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본적 문헌에 잘 기재되어 있고, 논문뿐만 아니라 방대한 연구 문헌에 더 상세하게 기재되어 있다. 펩타이드 백본 및 아미노 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는 항체 내 어디에서나 또는 탄수화물과 같은 모이어티 상에서 변형이 일어날 수 있다. 동일 유형의 변형이 주어진 항체 내 몇몇 부위에서 동일 또는 다른 정도로 존재할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 또한 주어진 항체는 다수 유형의 변형을 함유할 수 있다. 항체는, 예를 들어 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 그들은 분지와 함께 또는 분지되지 않고 고리화될 수 있다. 고리형, 분지형 분지된 고리형 항체는 번역 후 자연적 처리로부터 초래될 수 있거나 또는 합성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아마이드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴 모이어티의 공유적 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유적 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유적 가교의 형성, 시스테인의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마-카복실화, 글라이코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질 분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이션, 아르기닐화와 같이 단백질에 아미노산의 전달-RNA 매개 첨가, 및 유비퀴틴화를 포함한다; 예를 들어, 문헌[Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al ., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al ., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62)] 참조.
본 발명은 또한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체, 및 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 VH 영역 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체의 VL 영역 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열 또는 이들의 단편 또는 변이체 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 사용을 위한 융합 단백질은 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 VH-CDR 중 어느 1, 2, 3의 아미노산 서열, 또는 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및 이종성 폴리펩타이드 서열의 VL-CDR의 어느 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체의 VH-CDR3의 아미노산 서열, 및 융합 단백질이 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 이종성 폴리펩타이드 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 VH 영역의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 본 발명의 항체의 적어도 하나의 VL 영역 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 사용을 위한 융합 단백질은 항체의 VH CDR 중 어느 1, 2, 3의 아미노산 서열 및 항체의 VL CDR 중 어느 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH-CDR(들) 또는 VL-CDR(들) 중 2, 3, 4, 5, 6 이상은 본 발명의 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응된다. 이들 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 본 발명에 의해 포함된다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질은 T 세포 수용체(Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4(Capon et al ., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al ., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al ., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; 및 Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-셀렉틴(귀소 수용체)(Watson et al ., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; 및 Watson et al ., Nature 349 (1991), 164-167); CD44(Aruffo et al ., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 및 B7(Linsley et al ., J. Exp. Med. 173 (1991),721-730); CTLA-4(Lisley et al ., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al ., Cell 66 (1991), 1133-1144); TNF 수용체(Ashkenazi et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al ., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; 및 Peppel et al ., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991); 및 IgE 수용체(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448)의 융합을 포함한다.
본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 면역분석에서 사용을 위해 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, PEG는 그것의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 항체에 컨쥬게이트될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Leong et al ., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; 또는 Weir et al ., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512] 참조.
게다가, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 그것의 정제 또는 검출을 가능하게 하는 펩타이드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩타이드(HIS), 예컨대 pQE 벡터에 제공되는 태그(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)이며, 이중 다수는 상업적으로 입수가능하다. 문헌[Gentz et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는, "HA" 태그를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않으며, 이는 인플루엔자 혈구응집소 단백질(Wilson et al ., Cell 37 (1984), 767) 및 "플래그" 태그로부터 유래되는 에피토프에 대응된다.
융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며; 예를 들어 미국 특허 제5,116,964호 및 제5,225,538호를 참조한다. 융합이 만들어지는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하도록 경험적으로 선택될 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 DNA는 그 다음에 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질감염된다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 분자의 치료적 특성을 개선시키기 위해, 표적 검출을 가능하게 하기 위해 또는 환자의 영상화 또는 치료를 위해, 비컨쥬게이트 형태로 사용될 수 있거나 또는 다양한 분자 중 적어도 하나에 컨쥬게이트될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 정제가 수행될 때 정제 전 또는 정제 후 표지되거나 또는 컨쥬게이트될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 치료적 작용제, 프로드러그, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제학적 작용제 또는 PEG에 컨쥬게이트될 수 있다.
통상적인 항체를 포함하는 면역독소인 컨쥬게이트는 당업계에 널리 기재되어 있다. 독소는 통상적인 결합 기법에 의해 항체에 결합될 수 있거나 또는 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 얻기 위한 대응되는 방법으로 사용될 수 있다. 예시적인 이러한 면역독소는 문헌[Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 및 Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54]에 의해 기재된 것이다.
당업자는 또한 선택된 작용제가 컨쥬게이트되는 것에 따라서 컨쥬게이트가 다양한 기법을 사용하여 조립될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 바이오틴과의 컨쥬게이트는, 예를 들어 α-시누클레인 결합 폴리펩타이드를 바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스터와 같은 바이오틴의 활성화된 에스터와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 컨쥬게이트는 결합제, 예를 들어 본 명세서에 열거된 것의 존재에서 또는 아이소티오시아네이트, 예컨대 형광-아이소티오시아네이트와 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체의 컨쥬게이트는 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이트된 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 추가로 포함한다. 항체는, 예를 들어 주어진 치료 및/또는 예방 요법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 부분으로서, 예를 들어 신경계 질환의 존재를 증명하기 위해, 신경계 질병에 걸릴 위험을 나타내기 위해, 신경계 질병, 즉, 시누클레인병증의 발생 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출 물질에 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 결합시킴으로써 검출이 가능하게 될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는, 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다; 예를 들어, 본 발명에 따른 진단제로서 사용을 위한 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호 참조. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하며; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 염화단실 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하며; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 또한 화학발광성 화합물에 그것을 결합시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 그 다음에 화학발광성 태그 항체의 존재는 화학적 반응의 과정 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광성 표지 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 써모매틱(theromatic) 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 검출가능하게 표지되는 한 방법은 효소에 동일물을 연결하고, 효소 면역 분석법(EIA)에서 연결된 산물을 사용하는 것에 의한다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al ., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al ., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). 항체에 결합된 효소는, 예를 들어 분광광도법적, 형광계에 의해 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성하기 위한 방법에서 발색 기질과 같은 적절한 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소는, 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 아이소머라제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글라이세로포스페이트, 탈수소효소, 트라이오스 포스페이트 아이소머라제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스터라제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적으로, 검출은 효소에 대해 발색 기질을 사용하는 비색 방법에 의해 수행될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과 비교하여 기질의 효소적 반응의 시각적 비교에 의해 수행될 수 있다.
검출은 또한 임의의 다양한 다른 면역분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체를 방사성으로 표지함으로써, 방사면역측정법(RIA)의 사용을 통해 항체를 검출할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로서 포함되는, 문헌[Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)] 참조). 방사성 동위원소는 감마 계측기, 신틸레이션 계측기 또는 자기방사법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 수단에 의해 검출될 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체는 형광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 란탄 계열의 다른 것을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜트아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)로서 이러한 금속 킬레이트 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체에 다양한 모이어티를 컨쥬게이트하기 위한 기법은 잘 공지되어 있다, 예를 들어 문헌[Arnon et al ., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al . (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al ., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al . (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al . (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al ., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158] 참조.
언급한 바와 같이, 특정 실시형태에서, 결합 분자, 예를 들어 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 이의 면역특이적 단편의 안정성 또는 효능을 향상시키는 모이어티가 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, PEG는 본 발명의 결합 분자에 컨쥬게이트되어 그것의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 문헌[Leong et al ., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; 또는 Weir et al ., Biochem. Soc. Transaction 30 (2002), 512].
VI. 조성물 및 사용방법
본 발명은 앞서 언급한 α-시누클레인 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 유도체 또는 변이체, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도된 사용에 따라서 인터류킨 또는 인터페론과 같은 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 파킨슨 병의 치료에서 사용을 위해, 추가적인 작용제는 작은 유기 분자, 항-α-시누클레인 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 본 발명은 폴리뉴클레오타이드, 시누클레인병증의 예방적 및 치료적 처치, 시누클레인병증의 진행의 모니터링 또는 피험체에서 시누클레인병증 치료에 대한 반응 또는 시누클레인병증이 발생될 위험에 있는 피험체의 결정을 위한 약제학적 또는 진단적 조성물의 제조를 위한, α-시누클레인 결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 벡터 또는 세포의 사용에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서 본 발명은 뇌 및 신경계에서 각각 α-시누클레인의 비정상적 축적 및/또는 침착을 특징으로 하는 신경학적 장애를 치료하는 방법에 관한 것이되, 해당 방법은 본 발명의 항-α-시누클레인 결합 분자, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포의 치료적 유효량을 치료가 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서 NI-202.22D11 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체가 전달된다. 용어 "신경학적 장애"는 시누클레인 병증, 예컨대 파킨슨병(PD), 루이소체 치매(DLB) 및 다계통 위축증(MSA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 달리 언급되지 않는다면, 용어 신경퇴행성, 신경학적 또는 신경정신병학적은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
본 발명의 치료적 접근의 특정 이점은 본 발명의 항체가 파킨슨 증상의 징후가 없는 노인 피험체로부터의 B세포 또는 B 기억 세포로부터 유래되고, 따라서 어떤 개연성을 지니거나, 임상적으로 명백한 시누클레인병증을 방지할 수 있거나, 또는 임상적으로 명백한 질병의 발생 위험을 감소시킬 수 있거나 또는 임상적으로 명백한 질병의 개시 또는 진행을 지연시킬 수 있다는 사실에 놓여있다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 이미 성공적으로 체성 성숙(somatic maturation), 즉, 항체의 가변 영역의 체성 변화에 의한 표적 α-시누클레인 분자에 높은 친화도 결합에서 선택성 및 유효성에 대한 최적화를 고려하였다.
생체내, 예를 들어 인간에서 이러한 세포가 자가면역적 또는 알레르기성 반응의 의미에서 관련된 또는 다른 생리학적 단백질 또는 세포 구조에 의해 활성화되지 않는다는 지식은 또한 큰 의학적 중요성을 가지는데, 이것이 임상적 시험 단계를 통해 성공적으로 생존하는 상당히 증가된 기회를 의미하기 때문이다. 말하자면, 허용가능성 및 내약성은 적어도 하나의 인간 피험체에서 예방적 또는 치료적 항체의 임상전 및 임상적 개발 전 이미 증명되었다. 따라서 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체는 치료제로서 그것의 표적 구조 특이적 효율성과 그것의 감소된 부작용의 가능성은 둘 다에서 그것의 임상적 성공 확률을 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 성분, 예를 들어 본 발명의 항-α-시누클레인 항체, 이의 결합 단편, 유도체 또는 변이체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 및 진단적 팩 또는 키트를 각각 제공한다. 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 처방되는 형태에서 이러한 용기(들)와 관련된 경고가 있을 수 있으며, 경고는 제조기관에 의한 승인, 인간 투여용의 용도 또는 판매를 반영한다. 추가로 또는 대안적으로, 키트는 적절한 진단 분석에서 사용을 위한 시약 및/또는 설명서를 포함한다. 조성물, 예를 들어 본 발명의 키트는 물론 α-시누클레인의 존재를 수반하는 장애의 위험 평가, 진단, 예방 및 치료에 특히 적절하고, 파킨슨병(PD), 루이소체 치매 (DLB) 및 다계통 위축증(MSA)의 치료에 특히 적절하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472] 참조. 적합한 약제학적 담체의 예는 당업계에 잘 공지되어 있고, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 적합한 용량으로 피험체에게 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 다양한 방법, 예를 들어 정맥내, 복막내, 피하, 근육내, 비강내, 국소 또는 피내 투여 또는 척추 또는 뇌 전달에 의해 달성될 수 있다. 비강 분무 제형과 같은 에어로졸 제형은 정제수 또는 보존제 및 등장제를 지니는 활성제의 다른 용액을 포함한다. 이러한 제형은 pH 및 비강 점막과 양립가능한 등장 상태로 조절될 수 있다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체와 함께 좌약으로서 제공될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명의 약물의 투여를 위해 두개골에 작은 구멍을 뚫는 현재의 표준(다행히 빈번하지 않음에도 불구하고) 과정을 포함하는 반면, 일 양태에서, 결합 분자, 특히 본 발명의 항체 또는 항체 기반 약물은 정맥내 또는 경구 투여를 허용하는 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있다.
투약 요법은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학적 기술에서 잘 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여되는 다른 약물에 의존한다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레이트이다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 식염수와 완충 매질을 포함하는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락트산 링거액 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제(예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것) 등을 포함한다. 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 비활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도된 사용에 따라서 도파민 또는 정신약리학적 약물과 같은 추가적인 작용제를 포함할 수 있다.
더 나아가, 예를 들어 본 발명의 약제학적 조성물이 수동면역을 위해 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 결합 단편, 유도체 또는 변이체를 포함한다면, 약제학적 조성물은 백신으로서 제형화될 수 있다. 배경기술 부문에서 언급한 바와 같이, α-시누클레인의 올리고머 종은 혈장 및 CSF에서 세포 밖에 있는 것으로 보고되었고(El-Agnaf et al ., FASEB J. 20 (2006), 419-425), 파킨슨병의 마우스 모델에서 수동면역 연구는 α-시누클레인에 대한 세포밖 마우스 단클론성 항체가 세포내 α-시누클레인 응집물의 축적을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다(Masliah et al ., Neuron, 46 (2005), 857-868). 따라서, 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체 및 동일한 α-시누클레인 결합 분자가 PD, DLB 및 MSA와 같은 시누클레인 병증의 예방 또는 완화를 위한 백신으로서 특히 유용하다는 것을 예상하는 것은 조심스럽다.
일 실시형태에서, 세포막을 더 용이하게 침투하는 본 발명의 재조합 Fab(rFab) 및 단일 쇄 단편(scFvs)을 사용하는 것은 유리하다. 예를 들어, 앞서 온라인에 공개된 문헌[Robert et al ., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134]은 Aβ의 N-말단 영역에서 에피토프를 인식하는 단클론성 항체 WO-2의 키메라 재조합 Fab(rFab) 및 단일쇄 단편(scFvs)의 사용이 기재되어 있다. 유전자 조작된 단편은 (i) 아밀로이드 피브릴화를 방지할 수 있고, (ii) 사전형성된 Aβ1-42 피브릴을 분해할 수 있으며, (iii) 전체 IgG 분자와 효율적으로 시험관내 Aβ1-42 올리고머-매개 신경독성을 저해할 수 있다. 효과기 기능이 없는 작은 Fab 및 scFv 유전자조작 항체 형식을 사용하는 것의 인식된 이점은 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 더 효율적인 통과 및 염증 부반응을 촉발시킬 위험의 최소화를 포함한다. 더 나아가, scFv 및 단일-도메인 항체가 전장 항체의 결합 특이성을 보유하는 것 이외에, 그들은 그것의 표적의 폴딩, 상호작용, 변형 또는 하위세포 국소화의 변성에 대한 가능성을 지니는 내부체로서 포유류 세포에서 세포내로 및 단일 유전자로서 발현될 수 있다; 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401] 참조.
상이한 접근에서, 문헌[Muller et al ., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241]는 살아있는 세포 내로 그들을 손상시키지 않고 항체가 셔틀링되게 할 수 있는 것으로 언급되는, '초항체 기법'으로 불리는 기술 플랫폼을 기재한다. 이러한 세포-침투 항체는 새로운 진단적 및 치료적 창을 개방한다. 용어 '트랜스맵스(TransMabs)'는 이들 항체에 대해 만들어졌다.
추가 실시형태는 시누클레인병증을 치료하는데 유용한 다른 신경보호제의 공동투여 또는 순차적 투여를 포함한다. 일 실시형태에서, 추가적인 작용제는 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된다. 피험체를 치료하기 위해 사용될 수 있는 신경보호제의 예는 아세틸콜린에스터라제 저해제, 글루타민산성 수용체 길항물질, 키나제 저해제, HDAC 저해제, 항염증제, 다이발프로엑스 나트륨, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물과 동시에 사용될 수 있는 다른 신경보호제의 예는 당업계에 기술되어 있다; 예를 들어 국제특허출원 WO2007/011907호 참조. 일 실시형태에서, 추가적인 작용제는 도파민 또는 도파민 수용체 작용물질이다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 본 발명의 특정 항체인 α-시누클레인 결합 분자는 또한 시누클레인병증을 치료하는데 유용한 신경 이식체 또는 줄기 세포 치료제로 이식 치료 전 또는 후 투여되거나 또는 공동투여될 수 있다. 배아 중뇌 뉴런의 이식물에 의한 이러한 접근은 질병에서 손실된 뉴런을 대체하고, 선조체(striatum)에서 도파민 작동성 신경전달을 강화하는 목적으로 파킨슨병을 지니는 환자에서 수행되었다. 번역 후 11 내지 16년 후, 접합 뉴런은 루이소체 및 루이 신경돌기를 함유하는 것으로 발견되었다. 숙주로부터 접합 조직까지 α-시누클레인 병리의 이러한 퍼짐은 α-시누클레인 결합 분자, 특히 본 발명의 특정 항체의 공동 투여에 의해 방지될 수 있다.
치료적 유효 용량 또는 유효량은 증상 또는 질환을 완화하는데 충분한 활성 성분의 양을 지칭한다. 이러한 화합물의 치료적 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차, 예를 들어, ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유요한 용량) 및 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료적 효과와 독성 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비로서 표현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물 내 치료제는 PD, DLB 또는 다른 시누클레인 병증의 경우에 정상 거동 및/또는 인지 특성을 회복하거나 또는 보존하는데 충분한 양으로 존재한다.
앞의 언급으로부터, 본 발명은 특히 상기 언급한 바와 같은 시누클레인병증의 진단 및/또는 치료를 위해, NI-202.22D11 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체 중 적어도 하나의 CDR을 포함하는 α-시누클레인 결합 분자의 어떤 사용을 포함한다. 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 이의 면역글로뷸린 쇄일 수 있다. 추가로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 언급된 항체 중 어느 하나의 항-유전자형 항체에 관한 것이다. 이들은 항원-결합 부위 근처의 항체 가변 영역에 위치된 독특한 항원 펩타이드 서열에 결합되고, 예를 들어 피험체의 샘플에서 항-α-시누클레인 항체의 검출에 대해 유용한 항체 또는 다른 결합 분자이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재된 본 발명의 α-시누클레인 결합 분자, 항체, 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포 및 선택적으로 면역 또는 핵산 기반 진단 방법에서 통상적으로 사용되는 시약과 같은 검출에 적합한 수단 중 어느 하나를 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 면역분석법에서 사용에 적합하며, 이들은 액체상에서 이용될 수 있거나 또는 고체상 담체에 결합될 수 있다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역분석법의 예는 직접적 또는 간접적 형식인 경쟁적 및 비경쟁적 면역분석법이다. 이러한 면역분석법의 예는 방사면역측정법(RIA), 샌드위치(면역계수 분석법), 유세포분석기 및 웨스텃 블롯 분석법이다. 본 발명의 항원 및 항체는 다수의 상이한 담체에 결합될 수 있고, 그것이 특이적으로 결합된 세포를 단리하기 위해 사용된다. 잘 공지된 담체의 예는 유리, 폴리스타이렌, 염화폴리비닐, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 특성은 본 발명의 목적을 위해 가용성이거나 또는 불용성일 수 있다. 다수의 상이한 표지 및 당업자에게 공지된 표지 방법이 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 유형의 예는 효소, 방사성동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광성 화합물을 포함하며; 본 명세서에서 상기 논의한 실시형태를 참조한다.
추가적인 실시형태에 의해, α-시누클레인 결합 분자, 특히 본 발명의 항체는 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 임의의 다른 체액 샘플일 수 있는 시험 개체로부터 체액 샘플을 얻고, 항체-항원 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 본 발명의 항체와 체액 샘플을 접촉시킴으로써 개체 내 장애의 진단을 위한 방법이 사용된다. 그 다음에 이러한 복합체의 수준은 당업계에 공지된 방법에 의해 대조군 샘플에서 형성된 것보다 상당히 더 높은 수준으로 결정되며, 이는 시험한 개체에서 질병을 나타낸다. 동일한 방법으로, 본 발명의 항체에 의해 결합되는 특이적 항원이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 결합분자를 포함하는 시험관내 면역분석, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
이 내용에서, 본 발명은 또한 이 목적을 위해 구체적으로 설계된 수단에 관한 것이다. 예를 들어, α-시누클레인을 특이적으로 인식하는 본 발명의 항체 또는 동일한 항원-결합 분자와 함께 부하되는, 항체 기반 분석이 사용될 수 있다. 마이크로어레이 면역분석법의 설계는 문헌[Kusnezow et al ., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696]에서 요약된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인되는 α-시누클레인 결합 분자와 함께 부하되는 마이크로어레이에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 피험체에서 시누클레인병증을 진단하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은,
(a) 본 발명의 어느 하나의 항체 또는 이의 단편에 의해 진단된 피험체 내 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합을 평가하는 단계 및
(b) 피험체 내 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합을 하나 이상의 대조군 샘플로부터 유래된 하나 이상의 기준 표준과 비교하는 단계를 포함하되,
피험체 내 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합과 기준 표준 간의 차이 또는 유사성은 피험체가 시누클레인병증을 가지는지 여부를 표시한다.
진단되는 피험체는 질병에 대해 무증상이거나 또는 잠복기일 수 있다. 기준 표준은 시누클레인병증, 예를 들어 PD, DLB 또는 MSA를 지니는 환자로부터 유래될 수 있으며, 피험체 내 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합과 기준 표준 사이의 유사성은 진단되는 피험체가 시누클레인병증을 가진다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 또는 추가로 기준 표준은 시누클레인병증을 갖지 않는 피험체로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 진단되는 피험체 및 기준 표준(들)은 연령-매칭된다. 분석은 생체내에서 또는 진단되는 피험체로부터 단리되는 샘플, 예를 들어 α-시누클레인, 예를 들어 혈액, CSF 또는 소변 샘플을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 체액을 통해 행해질 수 있다.
α-시누클레인의 수준, 국소화 및/또는 입체구조는, 예를 들어 웨스턴 블롯, 면역침전법, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 형광-활성화 세포 선별 분석법(FACS), 2차원 겔 전기영동, 질량 분석법(MS), 기질-보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간-MS(MALDI-TOF), 표면-향상 레이저 탈착 이온화-비행시간(SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피(LC) 다음에 이중질량 분석법(MS/MS) 및 레이저 덴시토메트리로부터 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 α-시누클레인을 분석하는 것을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. α-시누클레인의 생체내 이미징은 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET), 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission tomography: SPECT), 근적외선(near infrared: NIR) 광학 영상화 또는 자기 공명 영상화(magnetic resonance imaging: MRI)를 포함할 수 있다.
PD, DLB 또는 MSA와 같은 시누클레인 병증을 진단하고, 시누클레인병증 진행을 모니터링하며, 본 발명에 따라 적합할 수 있는 항체 및 관련된 수단을 사용하여 시누클레인병증 치료를 모니터링하는 방법은 또한 국제특허출원 WO2007/011907호에 기재되어 있다. 유사하게, α-시누클레인에 대한 항체 기반 검출 방법은 국제특허출원 WO99/50300, WO2005/047860, WO2007/021255 및 WO2008/103472에 기재되어 있으며, 이들의 모든 개시내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 해당 방법은 기재된 바와 같이 적용될 수 있지만, 본 발명의 α-시누클레인 특이적 항체, 결합 단편, 유도체 또는 변이체에 의한다.
이들 및 다른 실시형태는 본 발명의 설명 및 실시예에 의해 개시되고 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 물질, 방법, 용도 및 화합물 중 어느 하나에 관한 추가 문헌은, 예를 들어 전자적 장치를 사용하여 공공 도서관 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들어 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information) 및/또는 미국 국립보건원의 국립 의학 도서관에 의해 호스팅되는, 공공 데이터베이스 "Medline"이 이용될 수 있다. 추가 데이터베이스 및 웹 주소, 예컨대 유럽 분자 생물학 연구소(European Molecular Biology Laboratory: EMBL)의 부서인 유럽 생물학 정보학 연구소(European Bioinformatics Institute: EBI)의 것은 당업자에게 공지되어 있고, 또한 인터넷 검색 엔진을 사용하여 얻어질 수 있다. 생물공학의 특허 정보의 검토 및 기존의 검색 및 현존하는 인식에 유용한 특허 정보의 적절한 공급원의 조사는 문헌[Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364]에 제공된다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명의 설명한다. 달리 언급되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 용어는 문헌[Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 개정판 2000 및 재인쇄 2003, ISBN 0 19 850673 2]에 제공되는 것과 같은 정의로 주어진다. 몇몇 문헌은 본 명세서의 내용을 통해 인용된다. 모든 인용된 참고문헌의 내용(본 출원 및 제조업자의 명세서, 설명서 등을 통해 인용된 바와 같은 참고문헌, 인용된 특허, 공개된 특허출원을 포함)은 본 명세서에 참조로서 명확하게 포함되지만; 인용되는 어떤 문헌이 사실 본 발명에 대한 선행 기술이라는 용인은 아니다.
더 완전한 이해가 단지 예시의 목적을 위해 본 명세서에 제공되는 다음의 구체적 실시예를 참고로 하여 얻어질 수 있으며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 본 발명의 범주를 임의의 방법으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예 1 및 2의 다음의 실험을 클로닝한, 즉, 프레임워크 1 Ig-가변 영역의 바로 N-말단에서 프라이머 유발 돌연변이를 함유하고, 인간 가변 중쇄 및 경쇄의 생식계열(GL) 서열로 조절되지 않은, 항체 NI-202.3G12, NI-202.12F4 및 NI-202.3D8에 대해 예시하며, 설명한다; 도 1 참조. 그러나, NI-202 계열의 다른 항체, 특히 조절된 GL 서열을 지니는 것은 구조적으로 유사하고, 따라서 비슷한 결과를 제공할 것으로 예상할 수 있다. 이들 항체를 인간 IgG1 분자로서 발현시켰다. 실시예 3 및 4의 실험은 인간 가변 중쇄 및 경쇄의 생식 계열(GL) 서열로 조절된 Ig-가변 영역의 N-말단에서 프라이머 유발된 돌연변이를 지니는 항체 NI-202.12F4에 대해 예시하고, 설명한다; 도 1 참조. 이 항체를 키메라 분자로서 발현시켰고, 여기서 조절된 인간 가변 도메인은 마우스 항-인간 면역 반응을 유발하지 않고 유전자이식 마우스 모델에서 만성 투약 연구를 허용하도록 마우스 IgG2a 불변 영역에 융합시켰다.
재료 및 방법
본 명세서에 사용된 것과 같은 통상적인 방법의 상세한 설명은 인용 문헌에서 찾을 수 있다. 이하에 달리 표시하지 않는다면, α-시누클레인-특이적 B 세포의 확인 및 관심 대상의 특이성을 나타내는 α-시누클레인 항체의 분자 클로닝뿐만 아니라 이들의 재조합 발현 및 기능적 특징은 WO2008/081008로서 공개된 국제특허출원 PCT/EP2008/000053호 및 WO2010/069603로서 공개된 PCT/EP2009/009186호의 실시예 및 보충 방법 부문에 기재되어 있는 바와 같거나, 기재되어 있는 바와 같이 수행될 수 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
항원의 정제
재조합 His -α- 시누클레인을 에스캐리키아 콜라이에서 재조합 발현 및 열 유발 침전, 니켈 친화도-음이온 교환- 및 크기 배제-크로마토그래피를 사용하는 후속 정제에 의해 얻었다.
예를 들어, T7 프로모터의 제어 하에 α- 시누클레인을 암호화하는 cDNA를 포함하는 DNA 작제물을 사용하여 적절한 에스캐리키아 콜라이 균주, 예컨대 BL21( DE3 )을 형질전환시켰고, 200㎖ 세포 배양물의 발현을 1 mM 아이소프로필 β-D- 티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유발하였다. 37℃에서 4시간 유발 후 세포를 채취한 다음, 20㎖ 50 mM Tris , 150 mM NaCl pH 8 중에서 재현탁시킨 후 초음파처리하였다. 15분 동안 비등시킨 후, 내열성 17000g 상청액을 수집하였다. 유사하게, 모의( mock ) 에스캐리키아 콜라이로부터 내열성 17000g 상청액을 수집하였다. His - 태그된 α- 시누클레인을 발현시키는 에스캐리키아 콜라이로부터 내열성 17000g 상청액(20㎖)을 50 mM Tris, 300 mM NaCl , 20 mM 이미다졸 , pH 8로 조절한 후, 이를 HisTrap HP 1㎖( GE Life Science ) 컬럼 상에 부하하였고 , HIS -α- 시누클레인을 30 내지 500mM 이미다졸 구배로 용리시켰다 . HIS -α- 시누클레인을 함유하는 분획을 풀링시킨 다음, 50 mM Tris pH 8로 1:10으로 희석시켰다. 희석시킨 풀링 분획을 HiTrap Q HP 1㎖( GE Life Science ) 컬럼에 적용하였고, 결합된 단백질을 30 내지 1000 mM NaCl 구배로 용리시켰다 . 최종적으로, HIS -α- 시누클레인을 함유하는 용리액을 고성능 겔 여과( Superdex 200 10/300 GL )를 사용하여 추가로 정제하였다. 이 정제 과정으로 SDS - PAGE 및 쿠마씨 염색에 의해 추정하는 바와 같이 약 99%의 순도로 HIS -α- 시누클레인을 수득한다. 정제한 단백질의 농도를 BCA 분석( Pierce )을 사용하여 결정하였다.
α- 시누클레인 항체 스크리닝
96 웰 절반 영역 마이크로플레이트( 코닝 ( Corning ))를 2㎍/㎖의 표준 농도로 코팅 완충제( PBS pH 9.6) 중에서 밤새 4℃에서 정제 HIS -α- 시누클레인 또는 α- 시누클레인(rPeptide)으로 코팅하였다. 플레이트를 PBS -T pH 7.6으로 세척하였고, 비특이적 결합 부위를 2% BSA(스위스 부츠에 소재한 시그마( Sigma ))를 함유하는 PBS -T로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. B 세포 조건화된 배지를 실온에서 1시간 동안 1% BSA 중의 10% 내열성 이콜라이 단백질로 사전흡수시켰다. ELISA 스크리닝의 시도의 몇번의 이전의 시도가 인간 α- 시누클레인 특이적 항체를 확인하는데 성공하지 못한 후, 이 사전흡수 단계를 진행하였다. 따라서, 운 좋게도, 내열성 이콜라이 단백질을 지니는 ELISA 플레이트의 사전흡수는 정제된 재조합 α- 시누클레인 샘플에 존재할 가능성이 있는 이콜라이 단백질 오염과 관련된 끈적거리는 항체 및 항체들과 같은 위양성 판단을 위한 스크리닝 단계를 배제하는 것으로 판명하였다. 그 다음에 사전흡수 배지를 기억 B 세포 배양물 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮겼고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다 . ELISA 플레이트를 PBS -T로 세척한 다음, 호스 래디쉬 퍼옥시다제 ( HRP )- 컨쥬게이트된 당나귀 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적) 다클론성 항체와 함께 인큐베이션시켰다 . PBS -T로 세척 후, 인간 항체의 결합을 표준 비색 분석법에서 HRP 활성의 측정에 의해 결정하였다.
α- 시누클레인 항체의 분자 클로닝
기억 B 세포를 함유하는 샘플을 60세 초과의 지원자로부터 얻었다. 모든 지원자는 어떤 파킨슨 증상도 없이 평범하였다. 선택한 기억 B 세포 배양물의 살아있는 B 세포를 채취하였고, mRNA 를 제조한다. 그 다음에 면역글로뷸린 중쇄 및 경쇄 서열을 3' 프라이머로서 모든 인간 J 세그먼트( 중쇄 및 카파 경쇄 ) 및 C 세그먼트(람다 경쇄)에 특이적인 프라이머와 조합하여 5' 프라이머로서 모든 인간 가변 중쇄 및 경쇄 패밀리에 대해 Ig - 프레임워크 1 특이적 프라이머를 사용하여 얻는다( Marks et al . , Mol . Biol . 222 (1991), 581-597; de Haard et al . , J. Biol . Chem . 26 (1999), 18218-18230).
원하는 특이성을 지니는 항체 클론의 확인을 완전한 항체의 재조합 발현 시 ELISA 에 대한 재스크리닝에 의해 수행한다. 적절한 불변 도메인(들)을 암호화하는 서열을 지니는 5' 말단과 3' 말단에서 리더 펩타이드를 암호화하는 서열을 지니는 가변 영역 서열을 보충하는 발현 벡터 내로 "정확한 리딩 프레임 내" 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 삽입 시 완전한 인간 IgG1 항체 또는 키메라 IgG2a 항체의 재조합 발현을 달성한다. 이것을 위해서, 항체 발현 벡터 내로 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 클로닝을 가능하게 하도록 프라이머 함유 제한 부위를 설계하였다. 중쇄 면역글로뷸린을 인간 면역글로뷸린 감마 1 또는 마우스 면역글로뷸린 감마 2a의 가변 도메인 및 신호 펩타이드를 함유하는 중쇄 발현 벡터 내로 면역글로뷸린 중쇄 RT - PCR 산물을 삽입함으로써 발현시킨다. 신호 펩타이드 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린의 불변 도메인을 제공하는 경쇄 발현 벡터 내로 프레임 내 NI -202.3 D8 의 카파 경쇄 RT - PCR -산물을 삽입함으로써 카파 경쇄 면역글로뷸린을 발현시킨다. 신호 펩타이드 및 인간 또는 마우스 람다 경쇄 면역글로뷸린의 불변 도메인을 제공하는 람다 경쇄 발현 벡터 내로 프레임 내 람다 경쇄 RT - PCR -산물을 삽입함으로써 NI -202.12F4 및 NI -202.3 G12 람다 경쇄 면역글로뷸린을 발현시킨다.
Ig - 중쇄 발현 벡터 및 카파 또는 람다 Ig - 경쇄 발현 벡터의 HEK293 또는 CHO 세포(또는 인간 또는 마우스 유래의 임의의 다른 적절한 수용 세포주) 내로 공동형질감염시 기능성 재조합 단클론성 항체를 얻었다. 재조합 인간 단클론성 항체를 표준 단백질 A 컬럼 정제를 사용하여 조건화된 배지로부터 후속적으로 정제하였다.
항체
Pan 시누클레인 항체 Syn211 (시그마)을 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 재조합 인간 α- 시누클레인 항체 NI202 .22 G11 및 NI202 .12F4는 본 발명의 항체이다. 그들을 HEK293 또는 CHO 세포에서 발현시킨 다음, 달리 언급되지 않는다면, 조건화된 배지를 후속 적용에서 직접 사용하였다.
직접 ELISA
항원을 96웰 절반 면적의 마이크로플레이트(코닝) 상에 PBS pH 9.6 중의 표시 농도로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS-T pH 7.6에서 세척하였고, 비특이적 결합 부위를 2% BSA(시그마)를 함유하는 PBS-T로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 그 다음에 프로브(1차 항체)를 웰에 옮겼고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS-T pH 7.6에서 세척 후, 웰을 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 다클론성 항-인간(재조합 인간 항체에 대해), 항-토끼(pan 시누클레인 항체에 대해) 또는 항-마우스(LB509 또는 Syn211) 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS-T 중에서 철저한 세척 후, 비색 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸바이페닐-4,4'-다이아민(시그마)을 사용하여 표준 비색분석법으로 HRP 활성의 측정에 의해 프로브의 결합을 결정하였다.
에피토프 맵핑을 위한 펩타이드 스캔
인간 α- 시누클레인의 전체 서열을 15 아미노산( aa )의 길이 및 11 aa 의 중복을 지니는 중복된 펩타이드로서 합성하였고, 셀룰로스 막(독일 베를린에 소재한 JPT )에 가요성 링커를 통해 결합시켰다. 전체 33개의 펩타이드를 포함하는 막을 메탄올 중에서 세정한 다음, 로티블록( Rotiblock )(독일 카를스루에에 소재한 로스( Roth )) 으로 차단시켰다. 막을 차단 용액 중에서 희석시킨 표시 항체와 함께 인큐베이션시킨 다음, 호스 래디쉬 퍼옥시다제( HRP )- 표지된 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다 . 인큐베이션 사이에, 막을 PBS -T로 5분 동안 3x 세척하였다. 그 다음에 막을 ECL + 웨스턴 블롯팅 검출 시약( GE 헬스케어 ( GE Healthcare ))을 사용하여 진행하였다.
용액 내 ELISA
중탄산나트륨 완충제 ( pH 9.6) 중에서 희석시킨 NI -202.12F4(2㎍/㎖)를 ELISA 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 그 다음에 플레이트를 2% BSA PBS-T로 차단시켰고, 후속적으로 PBS -T로 세척하였다. 표시한 바이오틴화된 α- 시누클레인 펩타이드를 첨가하였고, 2시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS-T로 세척하였다. HRP 표지된 스트렙타비딘과 함께 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 표준 비색분석법으로 HRP 활성의 측정에 의해 결합을 결정하였다.
실시예 1: 인간 유래 α- 시누클레인 항체 NI -202.21 D11 는 인간 α- 시누클레인에 대해 선택적이다
α-,β- 및 γ- 시누클레인은 신경계, 골격 근육 및 심장에서 대부분 발현된 고도로 상동성인 단백질이다. α- 시누클레인은 CNS 질병의 넓은 범위에 강하게 연관된 반면 , β- 시누클레인은 신경보호 단백질일 수 있다. 따라서 본 발명은 β- 및 γ- 시누클레인과 교차반응되지 않는 병리적 α- 시누클레인 변이체에 대해 치료적 항체를 제공한다. NI -202.21 D11 의 가능한 치료적 용도를 뒷받침하기 위해, 항체를 직접 ELISA 에서 α-, β- 및 γ- 시누클레인에 결합에 대해 시험하였다. 재조합 α-,β 및 γ- 시누클레인을 동일한 농도에서 ELISA 플레이트 상에 코팅한 다음, 재조합 NI -202.21 D11 또는 대조군 pan 시누클레인 항체 중 하나와 함께 인큐베이션시켰다 . pan - 시누클레인 항체는 모두 3가지의 시누클레인 단백질을 검출하지만, NI -202.21 D11 은 α- 시누클레인에 선택적인 결합을 나타낸다(도 2a).
인간 및 마우스 α- 시누클레인은 고도로 보존된 단백질이다. 재조합 NI-202.21D11이 인간 대 뮤린 α- 시누클레인에 우선적으로 결합되는지 여부를 프로빙하기 위해, 재조합 His -태그 인간 또는 뮤린 α- 시누클레인을 동일한 농도로 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰고, 그 다음에 NI -202.21 D11 및 NI -202.12F4 결합에 대해 시험하였다( Fig 2b). NI -202.21 D11 은 인간 α- 시누클레인만을 검출한 반면 , NI -202.12F4는 이 직접적 ELISA 에서 인간과 뮤린 α-시누클레인을 둘 다 검출한다(국제특허출원 공개 WO 2010/069603 A1 참조). 이들 발견은 함께 NI -202.21 D11 은 인간 α- 시누클레인에 대해 고도로 선택적이라는 것을 보여준다.
실시예 2: NI -202.21 D11 은 입체구조적 에피토프를 지시하는 높은 코팅 농도에서 인간 a- 시누클레인에 우선적인 결합을 나타낸다
NI -202.21 D11 의 효능을 나타내는 절반의 최대 유효 농도( EC50 )를 직접적 α- 시누클레인 ELISA 를 사용하여 재조합 α- 시누클레인의 낮은 코팅 농도와 높은 코팅 농도에 대해 결정하였다. ~200 pM 의 EC50 으로 재조합 NI -202.21D11의 고친화도를 α- 시누클레인 단백질(20㎍/㎖)의 높은 코팅 농도에 대해 관찰하였다. 더 낮은 농도의 α- 시누클레인에서 , 친화도에서 급격한 감소를 관찰하였다(도 3). 이들 특징은 α- 시누클레인의 C-말단의 도메인 내 에피토프를 또한 검출하는 상업적으로 입수가능한 항체 syn211 과 강하게 반대된다 . 이 발견은 NI -202.21 D11 이 α- 시누클레인의 고분자량 종에서 발견되는 것과 같은 고밀도 조건 하에 형성되거나 또는 노출된 에피토프를 선호한다는 것을 시사한다.
실시예 3: 재조합 NI -202.22 D11 은 뇌에서 병리학적 α- 시누클레인종에 결합된다.
인간 α- 시누클레인에 NI -202.21 D11 의 결합은 α- 시누클레인 유전자이식 마우스로부터의 그리고 신경병리학적으로 확인된 시누클레인병증( 루이소체 치매)을 지니는 환자로부터의 뇌 부문의 면역조직화학적 염색을 추가로 특징으로 한다. NI -202.21 D11 은 인간 α- 시누클레인 A53T를 과발현시키는 유전자이식 마우스의 뇌 조직으로부터의 프로테이나제 K 처리된 파라핀 부문 상에서 루이소체 및 루이 신경돌기 유사물 포함의 두드러진 염색을 나타낸다(도 4a). No NI202 -21 D11 염색은 야생형 마우스로부터의 뇌 부분에서 검출되었는데, 이는 NI -202.21 D11 이 인간 α- 시누클레인에 특이적이라는 것을 뒷받침한다(도 4b). NI -202.21 D11 은 또한 루이소체에 의해 치매를 지니는 환자의 인간 뇌 조직에서 병리학적 α- 시누클레인을 검출하였다(도 4c). 이들 결과는 인간-유래 항체 NI -202.21 D11 이 뇌에서 병리학적 α- 시누클레인을 검출한다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 인간 α- 시누클레인의 C-말단 도메인 내에서 에피토프에 대한 인간 유래 α- 시누클레인 -특이적 항체 NI -202.22 D11 의 에피토프의 맵핑 .
α- 시누클레인은 3개의 도메인으로 구성된 140개 아미노산( aa ) 길이의 본래 미폴딩된 단백질이다. 이들은 N-말단의 양친매성 반복 영역( aa 1-60), 중심 영역( aa 61-95) 및 산성 C-말단 영역( aa 96-140)이다. (A) NI -202.21D11 결합 도메인에 대한 초기 이해를 얻기 위해, 재조합 α- 시누클레인 절단을 직접 ELISA 에서 NI -202.21 D11 결합에 대해 시험하였다. 잔기 1-60, 1-95, 61-140 및 96-140로부터 재조합 α- 시누클레인 절단을 ELISA 플레이트 상에 코팅시킨 다음, 재조합 NI -202.21 D11 로 인큐베이션시켰다 . NI -202.21D11의 결합을 α- 시누클레인 절단 61-140 및 96-140에 대해서만 관찰하였는데, 이는 NI -202.21 D11 이 α- 시누클레인의 C-말단의 산성 도메인에 결합된다는 것을 보여준다(도 5a).
더 상세하게는 NI -202.21 D11 의 인식 서열을 이해하기 위해, NI -202.21D11을 전체 인간 α- 시누클레인 아미노산 서열을 포괄하는 중복 선형 15-량체 펩타이드에 결합에 대해 시험하였다. 인접한 펩타이드는 11개 잔기의 중복을 공유하며, 펩타이드는 셀룰로스 지지막에 C-말단으로 스팟팅된다 . NI-202.21D11을 3개의 중복 펩타이드 , 즉, 인간 α- 시누클레인의 잔기 109-123(B08), 113-127(B09) 및 117-131(B10)에 결합시켰다(도 5b). 이 결과는 NI-202.21D11 결합에 필요한 α- 시누클레인의 C-말단 내에서 최소 인식 서열이 PVDPDNE (117 내지 123)라는 것을 시사한다. 현저하게는, NI -202.21 D11 은 펩타이드 B08 및 B09보다 적은 펩타이드 B10에 결합된다 . 따라서, a- 시누클레인 내의 잔기 113 내지 117은 NI -202.21 D11 결합에 영향을 미칠 수 있다.
마우스 α- 시누클레인에 NI -202.21 D11 의 결합은 직접적 ELISA 에서 거의 관찰되지 않았다(도 2B). 대응되는 뮤린 서열( PVDPGSE)에 NI-202.21D11(PVDPDNE)의 결정된 에피토프 서열의 서열 정렬은 D121 및 N122가 인간 대 뮤린 α-시누클레인에 대해 NI-202.21D11의 선택성에 대해 중요한 아미노산이라는 것을 시사한다. D121/N122의 중요한 역할을 확인하기 위해, 재조합 돌연변이 인간 α-시누클레인 D121G/N122S를 생성하였고, 직접 ELISA에서 NI202.21D11 결합에 대해 시험하였다. 도 5c에서 나타낸 바와 같이, NI-202.21D11은 wt 인간 α-시누클레인과 비교하여 인간 α-시누클레인 D121G/N122S에 대한 결합을 거의 나타내지 않았다. 대조군 pan-시누클레인 항체룰 시누클레인 단백질의 동일 코팅에 대한 정상 대조군으로서 사용하였다.
이들 결과는 NI-202.21D11이 인간 α-시누클레인 내의 C-말단 에피토프(잔기 117 내지 123)를 검출하는 인간-유래 α-시누클레인 항체이며, 아미노산 D121/N122이 인간 대 뮤린 α-시누클레인 선택성에 기여한다는 것을 나타낸다.
실시예 5: NI-202.12F4는 α-시누클레인 4-15 내의 에피토프를 검출하고, α-시누클레인 내 K10은 NI-202.12F4의 α-시누클레인 선택성에 대해 중요한 아미노산이다
더 상세하게 NI-202.12F4의 인식 서열(에피토프)을 이해하기 위해, 전체 인간 α-시누클레인 아미노산 서열을 포괄하는 중복 선형 15-량체 펩타이드를 면역블롯팅에 의해 NI-202.12F4 결합에 대해 시험하였다. 인접한 펩타이드는 11개 잔기의 중복을 공유하며, 펩타이드는 셀룰로스 지지막에 C-말단으로 스팟팅시켰다. NI-202.12F4는 바로 N-말다나 펩타이드(A01)에만 결합되었는데, 이는 에피토프가 잔기 1 내지 15 내에 있다는 것을 나타낸다(도 6a). NI-202.12F4는 펩타이드(A02) 잔기 5 내지 20에 결합되지 않기 때문에, 에피토프는 잔기 1 내지 5에서 시작된다. 에피토프의 정확한 시작 잔기를 결정하기 위해, 합성 α-시누클레인 펩타이드를 용액내 결합 ELISA에서 NI-202.12F4 결합에 대해 시험하였다. 용액내 결합 ELISA를 우선 입증하기 위하여, 합성 펩타이드 α-시누클레인 1 내지 30 및 5 내지 30을 NI-202.12F4 결합에 대해 시험하였다. NI-202.12F4은 α-시누클레인 1 내지 30에 결합되었지만, 5 내지 30에는 결합되지 않았고, 이는 에피토프를 확인하는 것에 의한 분석이 잔기 1 내지 5에서 시작된다는 것을 입증한다(도 6b). 다음에, α-시누클레인 4 내지 30을 NI-202.12F4 결합에 대해 시험하였다. 도 6b에서 나타내는 바와 같이 NI-202.12F4는 α-시누클레인 4 내지 30에 결합된다. 이들 결과는 NI-202.12F4 에피토프가 잔기 4에서 시작된다는 것을 나타낸다.
NI-202.12F4는 α-시누클레인에 선택적으로 결합되었지만, β- 및 γ-시누클레인에는 결합되지 않았다. 대응되는 β-시누클레인 서열과 함께 NI-202.12F4 에피토프 함유 서열(α-시누클레인 4 내지 15)의 서열 정렬은 이들 서열이 하나의 아미노산에서만 다르다는 것을 나타내었다. α-시누클레인 내 위치 10에서 리신은 β-시누클레인 내 메티오닌으로 대체된다. 따라서 NI202.12F4는 β-시누클레인 M10K에 결합되어야 하지만, α-시누클레인 K10M에는 결합되지 않는다. 실험적 확인을 위해, 재조합 wt와 K10M α-시누클레인, 및 wt와 M10K β-시누클레인을 직접 ELISA에서 NI-202.12F4 결합에 대해 시험하였다. 예측한 바와 같이, NI202.12F4는 단지 wt α-시누클레인과 β-시누클레인 M10K에 결합되었지만, wt β-시누클레인과 α-시누클레인 K10M에는 결합되지 않았다(도 6c). pan-시누클레인 항체는 모두 4개의 재조합 단백질에 동일하게 잘 결합되었는데, 이는 ELISA 플레이트 상에 동일한 코팅을 보여준다.
모두 함께 이들 실험은 NI202.12F4에 대한 에피토프가 α-시누클레인의 잔기 4 내지 15 내에서 국소화된다는 것을 나타낸다. 에피토프는 잔기 4에서 시작되고, 잔기 11 내지 15에서 끝난다. α-시누클레인 내 위치 10에서 리신은 α- 대 β-시누클레인에 대한 NI-202.12F4의 특이성을 설명한다.
SEQUENCE LISTING <110> Biogen Idec International Neuroscience GmbH University of Zurich <120> ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES <130> WO/2012/177972 <140> PCT/US2012/043701 <141> 2012-06-22 <150> US61/500,580 <151> 2011-06-23 <160> 28 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> alpha-synuclein <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> alpha-synuclein <400> 2 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> beta-synuclein <400> 3 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val 35 40 45 Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser 50 55 60 His Leu Gly Gly Ala Val Phe Ser Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Glu Val Ala Gln Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met 100 105 110 Glu Pro Glu Gly Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln 115 120 125 Glu Tyr Glu Pro Glu Ala 130 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> gamma-synuclein <400> 4 Met Asp Val Phe Lys Lys Gly Phe Ser Ile Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Gly Ala Val Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Met Tyr Val Gly Ala Lys Thr Lys Glu Asn Val 35 40 45 Val Gln Ser Val Thr Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Asn 50 55 60 Ala Val Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Val Asn Thr Val Ala Thr Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Glu Ala Glu Asn Ile Ala Val Thr Ser Gly Val Val Arg 85 90 95 Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala Ser 100 105 110 Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp 115 120 125 <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.12F4-VHA1b (variable heavy chain sequence VHA1b) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(68) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(102) <223> CDR3 <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.12F4-VHA1b 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<220> <223> NI-202.12F4-VLa1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(55) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(98) <223> CDR3 <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.12F4-VLa1 CDR1 <400> 11 Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala His 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.12F4-VLa1 CDR2 <400> 12 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.12F4-VLa1 CDR3 <400> 13 Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr Glu Val 1 5 10 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.12F4-VLa1-GL (aligned to the Germ Line Sequence) <400> 14 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 15 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(66) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(113) <223> CDR3 <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ile Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH CDR1 <400> 16 Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH CDR2 <400> 17 Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH CDR3 <400> 18 Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 19 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH <400> 19 gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ccggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacgctg gcaatggtaa gagaaaatat 180 tcacagaagt tccaggacag agtcaccatt aacagggaca catccgcgag cacaatctac 240 atggagctga gcagcctggg atctgaagac acggctgtat attactgtgc gagagaggag 300 gatcacgctg gttcggggag ttacctcagt atggacgtct ggggccaagg aaccctggtc 360 accgtctcct cg 372 <210> 20 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH-GL (corrected according to the Germ Line Sequence) <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ile Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VH-GL <400> 21 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ccggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacgctg gcaatggtaa gagaaaatat 180 tcacagaagt tccaggacag agtcaccatt aacagggaca catccgcgag cacaatctac 240 atggagctga gcagcctggg atctgaagac acggctgtat attactgtgc gagagaggag 300 gatcacgctg gttcggggag ttacctcagt atggacgtct ggggccaagg aagcacggtc 360 accgtctcct cg 372 <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(40) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(63) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(103) <223> CDR3 <400> 22 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK CDR1 <400> 23 Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK CDR2 <400> 24 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK CDR3 <400> 25 Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK-GL (corrected according to the Germ Line Sequence) <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 27 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK-GL <400> 27 gatattgtga tgactcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gaatgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acatcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaccagct tgcagactga agatgtggcg gtctattact gtcagcagta ttatagtagt 300 cctctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339 <210> 28 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NI-202.21D11-VK <400> 28 gatgttgtga tgactcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gaatgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acatcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaccagct tgcagactga agatgtggcg gtctattact gtcagcagta ttatagtagt 300 cctctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339

Claims (81)

  1. 인간 α-시누클레인(서열번호 1)의 아미노산 4 내지 15 내의 에피토프에 대해 특이적으로 결합되는, 단리된 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, α-시누클레인에 대한 기준 단클론성 항체 NI-202.12F4의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것인 단리된 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 단클론성 항체 NI-202.12F4, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체가 아닌 것인 단리된 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것인 단리된 결합 분자.
  5. α-시누클레인(서열번호 1)의 아미노산 113 내지 123 내의 에피토프에 대해 특이적으로 결합되는, 단리된 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 117 내지 123 내의 에피토프에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 결합 분자.
  7. 기준 단클론성 항체 NI-202.22D11과 동일한 인간 α-시누클레인 에피토프에 특이적으로 결합되는, 단리된 결합 분자.
  8. α-시누클레인에 특이적으로 결합되는 단리된 결합 분자로서, 인간 α-시누클레인에 대한 기준 단클론성 항체 NI-202.22D11의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것인 단리된 결합 분자.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것인 단리된 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 인간 단클론성 항체 NI-202.22D11, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 혹은 유도체인 것인 항체 또는 이의 단편.
  11. 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 VH는 서열번호 15 또는 서열번호 20과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 상기 VH 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 15 또는 서열번호 20을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  13. VH 및 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 VL은 서열번호 22 또는 서열번호 26과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 상기 VH 영역을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 상기 VL는 서열번호 22 또는 서열번호 26을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  15. VH 및 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 VH 및 VL은 각각 기준 폴리펩타이드 서열번호 15와 서열번호 22, 서열번호 15와 서열번호 26, 서열번호 20과 서열번호 22, 또는 서열번호 20과 서열번호 26과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 상기 VH 및 VL을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 VH 및 VL은 각각 서열번호 15와 서열번호 22, 서열번호 15와 서열번호 26, 서열번호 20과 서열번호 22, 또는 서열번호 20과 서열번호 26을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VH의 CDR1 영역은, 기준 중쇄 CDR1 서열 서열번호 16과, 동일하거나 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 상기 VH를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  18. VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VH의 CDR2 영역은, 기준 중쇄 CDR2 서열 서열번호 17과, 동일하거나 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 상기 VH를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  19. VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VH의 CDR3 영역은, 기준 중쇄 CDR3 서열 서열번호 18과, 동일하거나 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 상기 VH를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  20. VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VL의 CDR1 영역은 기준 경쇄 CDR1 서열 서열번호 23에 대해 동일하거나 또는 5개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하고, 상기 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  21. VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VL의 CDR2 영역은, 기준 중쇄 CDR2 서열 서열번호 24와, 동일하거나 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 상기 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  22. VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VL의 CDR3 영역은, 기준 중쇄 CDR3 서열 서열번호 25와, 동일하거나 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 상기 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  23. VH를 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은, 기준 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 18과, 각각 동일하거나 또는 20개 미만의 전체 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 상기 VH를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이들에 대해 융합된 이종성 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  25. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 치료제, 프로드러그, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제학적 작용제 또는 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제에 컨쥬게이트된 것인 단리된 폴리펩타이드.
  26. 제17항 내지 제25항 및 제79항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  27. 제4항, 제9항 내지 제16항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 5 x 10-2M, 10-2M, 5 x 10-3M, 10-3M, 5 x 10-4M, 10-4M, 5 x 10-5M, 10-5M, 5 x 10-6M, 10-6M, 5 x 10-7M, 10-7M, 5 x 10-8M, 10-8M, 5 x 10-9 M, 10-9M, 5 x 10-10M, 10-10M, 5 x 10-11M, 10-11M, 5 x 10-12M, 10-12M, 5 x 10-13M, 10-13M, 5 x 10-14M, 10-14M, 5 x 10-15M 또는 10-15M 이하의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화도로 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  28. 제4항, 제9항 내지 제16항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 선형 에피토프에 우선적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  29. 제4항, 제9항 내지 제16항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 비선형 입체구조 에피토프에 우선적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  30. 제4항, 제9항 내지 제16항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머 또는 응집된 형태로 인간 α-시누클레인에 우선적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  31. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 β-시누클레인(서열번호 3) 또는 인간 γ-시누클레인(서열번호 4)에 특이적으로 결합되지 않는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  32. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤린 α-시누클레인(서열번호 2)에 특이적으로 결합되지 않는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  33. 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 α-시누클레인(서열번호 1)의 아미노산 113 내지 123 내의 에피토프에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  34. 제33항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 117 내지 123 내의 에피토프에 특이적으로 결합되는 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  35. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH에 융합된 신호 펩타이드를 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  36. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL에 융합된 신호 펩타이드를 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  37. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH에 융합된 CH1 도메인을 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  38. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH에 융합된 CH2 도메인을 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  39. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH에 융합된 CH3 도메인을 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  40. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH에 융합된 힌지 영역을 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  41. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL에 융합된 CK 도메인을 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  42. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL에 융합된 CL 도메인을 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  43. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  44. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라인 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  45. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 완전히 인간인 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편인 것인 항원-결합 단편.
  47. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, Fab' 단편인 것인 항원-결합 단편.
  48. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, F(ab)2 단편인 것인 항원-결합 단편.
  49. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fv 단편인 것인 항원-결합 단편.
  50. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 항체인 것인 항원-결합 단편.
  51. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 이들에 융합된 이종성 폴리펩타이드를 더 포함하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  52. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 치료제, 프로드러그, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제학적 작용제 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제에 컨쥬게이트된 것인 단리된 항체 또는 이의 단편.
  53. 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제52항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 및 담체를 포함하는 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 진단 조성물인 것인 조성물.
  55. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 제4항, 제9항 내지 제16항, 및 제26항 내지 제52항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  56. 제55항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  57. 제56항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오타이드는 이종성 폴리펩타이드를 암호화하는 것인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  59. VH 암호화 폴리뉴클레오타이드(VH encoding polynucleotide) 및 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드(VL encoding polynucleotide)를 포함하는 조성물로서, 상기 VH 암호화 폴리뉴클레오타이드 및 상기 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드는 각각 기준 폴리펩타이드 서열번호 15와 서열번호 22, 서열번호 15와 서열번호 26, 서열번호 20과 서열번호 22, 또는 서열번호 20과 서열번호 26과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 VH 및 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드는 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함께 암호화하는 것인 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 VH 암호화 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 19 또는 서열번호 21을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 27 또는 서열번호 28을 암호화하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  61. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게(operably) 결합된 것인 벡터.
  63. 제62항에 있어서, 상기 VH 암호화 폴리뉴클레오타이드 및 상기 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드는 이들과 작동가능하게 결합된 단일 프로모터로부터 공동전사되지만, 개별적으로 번역되는 것인 벡터.
  64. 제63항에 있어서, 상기 VH 암호화 폴리뉴클레오타이드와 상기 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드 사이에 배치된 IRES 서열을 더 포함하는 벡터.
  65. 제62항에 있어서, 상기 VH 암호화 폴리뉴클레오타이드와 상기 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드는 개별적으로 전사되되, 각각은 별개의 프로모터와 작동가능하게 결합된 것인 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 상기 별개의 프로모터는 동일한 프로모터의 복제물인 것인 벡터.
  67. 제65항에 있어서, 상기 별개의 프로모터는 동일하지 않은 것인 벡터.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  69. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 VH 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 VL 암호화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 조성물.
  70. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  71. 적어도 제1 및 제2 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 제1 및 제2 벡터는 동일하지 않고, 상기 제1 벡터는 VH를 암호화하는 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 제2 벡터는 VL을 암호화하는 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 숙주 세포.
  72. 항-인간 α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 제70항 또는 제71항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 이의 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 α-시누클레인 항체 또는 항원 결합 단편의 생산방법.
  73. 제72항의 방법에 의해 생산되는 항-인간 α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  74. 피험체에서 시누클레인병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제4항, 제9항 내지 제16항, 제26항 내지 제52항 및 제73항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편, 제53항, 제54항, 제58항 내지 제60항 및 제69항 중 어느 한 항의 조성물, 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제70항 또는 제71항의 숙주 세포를 치료가 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시누클레인병증의 치료 또는 예방 방법.
  75. 피험체에서 시누클레인병증을 진단하는 방법으로서,
    (a) 제4항, 제9항 내지 제16항, 제26항 내지 제52항 및 제73항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 이용해서, 진단될 피험체에서의 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합을 평가하는 단계, 및
    (b) 상기 피험체에서의 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합을 하나 이상의 대조군 샘플로부터 유래된 하나 이상의 기준 표준과 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 피험체 및 상기 기준 표준에서의 α-시누클레인의 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합 사이의 차이 또는 유사성은, 상기 피험체가 시누클레인병증을 지니는지의 여부를 표시하는 것인, 시누클레인병증의 진단 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병(PD), 루이소체 치매(DLB), 다계통 위축증(MSA), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체는 포유류인 것인방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 것인 방법.
  79. VL을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은, 기준 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25와, 각각 동일하거나 또는 20개 미만의 전체 보존적 아미노산 치환을 제외하고 동일하며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 α-시누클레인(서열번호 1)에 특이적으로 결합되는 VH를 포함하는 것인 단리된 폴리펩타이드.
  80. 제75항에 있어서, 상기 피험체에서의 α-시누클레인의 상기 수준, 국소화, 입체구조 또는 이들의 조합은 생체내 영상화에 의해 측정되는 것인, 시누클레인병증의 진단 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 생체내 영상화는 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET), 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission tomography: SPECT), 근적외선(near infrared: NIR) 광학 영상화 또는 자기 공명 영상화(magnetic resonance imaging: MRI)를 포함하는 것인, 시누클레인병증의 진단 방법.
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