JP7390317B2 - 抗Tie2抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
[2]
[10] 本発明の目的は、新規の抗Tie2抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することである。
[23]
[36] 本発明の詳しい説明および好ましい実施形態
[37] 別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。
[106]実施例
[107] 以下、本発明を、実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、単に、本発明を説明することを意図し、本発明を制限するものではない。
[109] 実施例1. マウスモノクローナル抗Tie2抗体の調製
[110] 1.1 ヒトTie2を用いたマウス免疫
[111] ヒトTie2のIg3-FNIII(1-3)ドメイン(hTie2-Ig3-FNIII(1-3)、配列番号2)を免疫原としてCMVプロモーターを含むベクターにクローニングし、HEK293F細胞株へトランスフェクションすることにより一過性に発現させた。5日間のインキュベーション後に、発現した組換えhTie2-Ig3-FNIII(1-3)タンパク質を、プロテインAを用いたアフィニティーカラムで精製した。5週齢のBALB/cマウスを、アジュバントと混合した精製hTie2-Ig3-FNIII(1-3)(100μg/注射)を用いて、週2回6週間、免疫した。免疫化したマウスの血清中の抗Tie2抗体のタイターは、ヒトTie2(hTie2)ELISAキット(R&D)によって調べた。抗体のタイター(1:5,000希釈)が適切に増加した場合(OD>1.0)、その免疫したマウスから脾臓を摘出し、そこからBリンパ球を分離し、培養した骨髄腫細胞(SP2/0)と融合させた。その融合細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むHAT培地中で培養し、そこから骨髄腫細胞とBリンパ球の融合体のみからなるハイブリドーマ細胞を選択して培養した。生き残ったハイブリドーマ細胞を96ウェルプレートに播種し、その培養上清をhTie2ELISAにより試験した。クローン選択のために、陽性シグナルを示すハイブリドーマプールを限界希釈により選択した。最終的に、37個のモノクローナルハイブリドーマ系統を樹立した。その中から、いくつかのTie2結合抗体が、Tie2活性化作用を示した。候補抗体は、Tie2活性化レベルおよびヒトTie2に対する高い親和性に基づいて選択され、後にヒト化の処理を行った。
[113]表1.ヒトTie2全長(hTie2)およびIg3-FNIII(1-3)配列
[116] 1.2 マウスモノクローナルTie2抗体の産生および精製
ELISA陽性シグナルに基づいて選択された抗Tie2抗体を産生するために、ハイブリドーマ細胞を、T75(75cm2面積)フラスコにて10%FBS含有DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)中で培養した。細胞のコンフルエンシーが約90%に達したときに、細胞をPBSで洗浄し、50mlの無血清培地(SFM、Gibco)を用いてインキュベートし、37℃で3日間培養した。次いで、各モノクローナルハイブリドーマから抗体が分泌された培地を回収し、遠心分離して細胞を除去し、その培養上清を回収して濾過した。次に、抗体を、プロテインGアフィニティーカラム(GEヘルスケア)を備えたAKTA精製装置(GEヘルスケア)を使用して精製した。遠心分離フィルターユニット(Amicon)を用いてその上清をPBSで置換することにより、精製抗体を濃縮した。
[119] 1.3 アンタゴニストTie2抗体の同定およびスクリーニング
[120] マウス抗Tie2抗体が内皮細胞におけるTie2受容体の下流シグナル伝達を誘導するかどうかを調べるために、HUVEC(Lonza)を抗Tie2抗体で処理し、次いで、Aktリン酸化のレベル、主要な下流シグナル伝達タンパク質であるTie2受容体を免疫ブロッティングにより分析した。陽性コントロールとして、COMP-Ang1(CA1)を細胞に処理した。
[124] 1.4.オクテット分析によるhTie2に対する抗Tie2抗体の親和性測定
[125] hTie2に対するマウスモノクローナル抗体の親和性を、ブラック96ウェルプレート(96ウェルF型ブラックプレート、Greiner)を用いたOctetシステム(ForteBio)を使用して測定した。親和性測定に使用するバイオセンサーを、AR2Gチップ(ForteBio Octet)を用いた測定前に10分間、水和させた。水和後、hTie2を10mM 酢酸ナトリウム、pH6.0バッファーで10μg/mlの濃度に希釈し、AR2Gバイオセンサーに固定し、1M エタノールアミンでブロックした。マウスモノクローナル抗Tie2抗体を、1×キネティックバッファーで50、25、12.5、6.25、3.125および0nMに希釈し、300秒間の会合と、900秒間の解離を行った。親和性測定(KD)のために、結合速度(K-on)および解離速度(K-off)を結合曲線(グローバル)により分析し、Octetデータ分析v9.0.0.10プログラムを用いて1:1結合モデルに対してフィッティングした。マウス抗Tie2抗体の親和性を表2に示す。
[127]表2.マウス抗Tie2抗体のhTie2への親和性
[129] 1.5.マウスTie2抗体3H7によって誘導されたTie2リン酸化
本発明において開発された抗Tie2抗体は、Tie2クラスタリングに結合して誘導し、最終的にTie2活性化を誘発することを示す。実験を行い、HUVECを使用してTie2リン酸化に対する抗Tie2抗体の効果を分析した。
[135] 1.6.Tie2抗体(3H7)によるHUVECにおけるクラスター化Tie2エンドサイトーシスおよびFOXO1移行
[136] Tie2局在化および核から細胞質ゾルへのFOXO1移行に対する3H7の効果を、HUVECにて免疫蛍光法によって調べた。具体的には、HUVECを8ウェルスライドチャンバー(Lab-TekII)に播種し、EGM-2培地中で2~3日間維持した。100%コンフルエンスにて、細胞を4時間のEBM-2培地にて血清飢餓にし、1μg/mlの抗Tie2抗体3H7を用いて30分間処理した。その後、細胞を、PBS中4%ホルムアルデヒドを用いて室温(RT)にて10分間固定し、PBS中0.1%TritonX-100で透過処理を行い、PBS中1%BSAを用いてRTにて60分間ブロックし、一次抗体とともにRTにて1時間インキュベートした。hTie2およびFOXO1用の一次抗体を用いた。次に、細胞を、暗所にて室温で1時間二次抗体(Invitrogen社)とともにインキュベートし、DAPIを含むVectashield封入剤(VectorLabs)を用いて封入した。画像を、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSM880、Carl Zeiss社)を用いて撮影した。
[139] 1.7.HUVECにおいて抗Tie2抗体3H7を処理した場合のVEGFまたはTNF-αにより誘発される血管浸透性の阻害。
[140] 血管漏出アッセイは、インビトロ血管浸透性アッセイキット(Millipore社)を用い、その製造元の指示に従って、HUVECにて実施した。HUVECをトランスウェルプレートのインサートに播種し、100%コンフルエンスになるまで3日間培養した。HUVECをAng2(1μg/ml)、Ang2(1μg/ml)と、コントロール抗体(1μg/ml)とともに、または3H7抗体(1μg/ml)のみと30分間プレインキュベートし、次いで、VEGF(500ng/ml)またはTNF-a(100ng/ml)を添加し、細胞を37℃でそれぞれ45分または22時間インキュベートした。FITC-デキストランを上部チャンバーに加え、20分間インキュベートした。HUVEC単層を越えるFITC-デキストランの通過を、それぞれ485および535nmの励起波長および発光波長で蛍光リーダーによって測定した。図4で示されるように、抗Tie2抗体3H7の前処理は、血管漏出促進因子VEGFまたはTNF-aによって誘発される血管漏出を有意に抑制した。
[142] 実施例2.マウス抗Tie2抗体のDNA遺伝子配列分析
[143] 実施例1.3で選択された(ハイブリドーマ細胞に由来する)抗体のDNAヌクレオチド配列を分析した。具体的には、ハイブリドーマ細胞(2×106細胞/ml)を10%FBS含有DMEM中で培養し、次いで、RNeasyミニキット(Qiagen社)を用いて全RNAを得た。次に、RNA濃度を測定し、cDNAを逆転写(RT)反応により合成した。重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子配列を増幅するために、上記のcDNAをテンプレートとして用い、マウスIgプライマーセット(Novagen社)を使用して、以下の条件下でPCRを実施した: 94℃で5分;[94℃で1分、50℃で1分、72℃で2分]×35サイクル;72℃で6分;4℃に冷却。各反応で得られたPCR産物をTAベクターにクローニングし、DNAシーケンシングにかけ、それにより、各抗体のCDR、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得た(表3~表12)。
[145]表3.マウス抗Tie2抗体3B2のCDR配列
[147]表4.マウス抗Tie2抗体3B2の可変領域配列
[149]表5.マウス抗Tie2抗体3E12のCDR配列
[151]表6.マウス抗Tie2抗体3E12の可変領域配列
[153]表7.マウス抗Tie2抗体3H7のCDR配列
[155]表8.マウス抗Tie2抗体3H7の可変領域配列
[157]表9.マウス抗Tie2抗体4A4のCDR配列
[159]表10.マウス抗Tie2抗体4A4の可変領域配列
[161]表11.マウス抗Tie2抗体11C4のCDR配列
[163]表12.マウス抗Tie2抗体11C4の可変領域配列
[165]実施例3.hTie2に対するマウス抗Tie2抗体のエピトープマッピング
[166] マウスモノクローナル抗体3H7によって認識されるhTie2の抗原決定基(エピトープ)を、HDX-MS(水素/重水素交換質量分析)技術によって分析した。HDX-MS分析方法は次の文献に記載されている:HoudeD,Engen JR(2013)Methods Mol.Biol.988:269-89およびHoude等、(2011)J.Pharm.Sci.100(6),2071.
[171]表13.HDX-MSによるhTie2への3H7結合のエピトープマッピング分析
[174]実施例4.マウス抗Tie2抗体のヒト化および全長IgG変換
[175] ヒトに投与した場合のマウス抗Tie2抗体3H7の免疫原性を排除するために、前記抗体を以下のようにヒト化した。
ヒト抗体重鎖可変遺伝子であるIGHV1-46-01は、抗体3H7の重鎖配列と66%の相同性を示した。これらの分析に基づいて、3H7抗体の3つのCDR領域をヒト抗体重鎖可変遺伝子IGHV1-46-01にグラフト化した。このプロセスでは、2つのヒト化重鎖抗体遺伝子を設計した(表14)。グラフト化CDRは、タンパク質配列中では下線が付されている。マウス配列への逆突然変異を、ヒト化3H7の重鎖遺伝子に導入し、表14のタンパク質配列では太字で示す。
[179]4.2 軽鎖のヒト化
[180] ヒト抗体軽鎖可変遺伝子であるIGKV1-17-01は、抗体3H7の軽鎖配列と68%の相同性を示した。これらの分析に基づいて、3H7抗体の3つのCDR領域をヒト抗体軽鎖可変遺伝子IGKV1-17-01にグラフト化した。このプロセスでは、2つのヒト化軽鎖抗体遺伝子を設計した(表14)。グラフト化CDRは、タンパク質配列中では下線が付されている。マウス配列への逆突然変異を、ヒト化3H7の軽鎖遺伝子に導入し、表14のタンパク質配列では太字で示す。
[182]4.3.ヒト化遺伝子合成およびヒト全長IgG抗体へのクローニング
[183] 表14の抗体のヒト化可変領域を、ヒトIgG4アイソタイプバックボーンベクターの重鎖および軽鎖ベクターにクローニングした。抗体のヒト化重鎖可変領域(VH)のDNA断片を「EcoRI-シグナル配列-VH-NheI-CH-XhoI」の配列として合成した(Bioneer社)。抗体のヒト化軽鎖可変領域(VL)のDNA断片も「EcoRI-シグナル配列-VL-BsiWI-CL-XhoI」の配列として合成した。重鎖および軽鎖をコードするDNA断片を、それぞれpOptiVEC(登録商標)またはpcDNA(登録商標)3.3ベクターにクローニングした。
[185]
[189]4.4.ヒト化抗Tie2抗体の産生および精製
[190] ヒト化抗Tie2抗体を産生するために、組換えタンパク質を高効率で産生することができるExpi293F(Gibco)細胞を用いた。Expi293F細胞(2×106細胞/ml)を三角フラスコ中で培養し、重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを、ExpiFectamine293トランスフェクションキットを用いてExpi293F細胞にコトランスフェクトした。細胞を、37℃にて8%CO2下で振盪インキュベーター(オービタルシェーカー、125rpm)にて5日間培養した。得られた培地を回収し、遠心分離して細胞を除去した。分泌された抗体を含む培養上清を単離し、4℃で保存するか、またはアフィニティーカラム(プロテインAアガロースカラム、GEヘルスケア)を備えたAKTA精製システム(GEヘルスケア)を用いて直ちに精製した。精製した抗体を、タンパク質遠心フィルター(Amicon)に通じることにより濃縮しつつ、溶液をPBSに交換した。
[192]実施例5.hTie2に対するヒト化抗Tie2抗体の親和性測定
[193] hTie2に対するヒト化抗Tie2抗体の親和性を、ブラック96ウェルプレート(96ウェルF型ブラックプレート、Greiner)を用いたオクテットシステム(ForteBio)を使用して測定した。親和性測定に使用されるバイオセンサーを、AR2Gチップ(ForteBio Octet)を用いた測定の前に、10分間水和させた。水和後、ヒト化抗Tie2抗体を、10mM 酢酸ナトリウム、pH6.0バッファー中に濃度10μg/mlに希釈し、AR2Gバイオセンサー上に固定し、1M エタノールアミンを用いてブロックした。組換えhTie2を、1×キネティックバッファーを用いて50、25、12.5、6.25、3.125および0nMに希釈し、300秒間の会合および900秒間の解離にかけた。親和性測定(KD)のために、結合速度(K-on)および解離速度(K-off)を結合曲線(グローバル)により分析し、Octetデータ分析v9.0.0.10プログラムを用いて1:1結合モデルに対してフィッティングした。KD値を、下記表15に示した。
[195]表15.hTie2-Ig3-FNIII(1-3)に対するヒト化3H7抗体の親和性
[197]実施例6.選択されたヒト化抗Tie2抗体のインビトロ生物学的特性の分析
[198] 6.1.Aktリン酸化
[199] ヒト化抗Tie2抗体が内皮細胞におけるTie2受容体の下流シグナル伝達を誘導するかどうかを調べるために、HUVEC(Lonza)を、ヒト化抗Tie2抗体を用いて処理した。次に、Tie2受容体の主要な下流シグナル伝達タンパク質であるAktリン酸化のレベルをイムノブロッティングにより測定した。Akt活性化の程度を比較するために、実験では細胞を、陽性コントロールとしてCOMP-Ang1(CA1)を用いて処理した。具体的には、HUVEC細胞(1×105細胞/ml)を60mm培養皿においてEGM-2(Lonza)中で37°Cにて培養した。90%コンフルエンシーの細胞をEBM-2(Lonza)とともに4時間インキュベートした。血清飢餓HUVECを、抗Tie2抗体を用いて処理し、さらに30分間インキュベートした。細胞を冷PBSで洗浄し、溶解バッファーで処理し、4℃で20分間溶解した。次に、細胞溶解物を、13000rpmで15分間の遠心分離によって調製した。5×SDSサンプルバッファーを前記細胞溶解物に加え、その混合物を95℃で5分間ボイルした。次に、前記混合物をSDS-PAGEに供し、続いてウエスタンブロッティングに供した。
[203]実施例7.原発性解放角緑内障マウスモデルにおける3H7H12G4の効果。
[204] 3H7H12G4によるTie2の活性化が退行したSC(シュレム管)およびより低いIOP(眼圧)をレスキューできるかどうかを試験するために、原発性解放角緑内障マウスモデルを用いた。該モデルは、アンジオポエチン-1および-2遺伝子の両方の誘導性欠失のために、タモキシフェンを8週齢の二重アンジオポエチン-1/アンジオポエチン-2欠損(A1:A2iΔ/Δ)マウスに投与することによって作製された(図8A)。3H7H12G4(~5μg、片眼)およびFc(~5μg、反対側の眼)の眼内投与は、12週齢にて実施した(図8A)。指示された試薬を硝子体内投与するために、各試薬5μgを含む~1μl(5mg/ml)を、ガラスキャピラリーピペットを備えたNanoliter2000マイクロインジェクター(World Precision Instruments)を用いて、硝子体内腔に注入した。IOP測定を、12週、13週および14週にリバウンド・トノメーター(TonoLab)を用いて実行した(図8A)。IOPは、マウスに麻酔をかけた直後に、圧力センサーの先端を角膜中央から約1/8インチのところに置くことによって測定した。5回の連続したIOP測定のデジタル読み出し情報はトノメーターから取得した。野生型マウスでは、IOPは、3H7H12G4で処置した眼とFcで処置した眼との間に差異はない(図8C)。他方、A1:A2iΔ/Δマウスでは、IOPが、3H7H12G4で処置した眼においてFcで処置した眼と比較して25.6%有意に減少したことを示した(図8D)。CD144+SC面積と、CD144+SCでのProx1およびTie2免疫染色の強度とを、3H7H12G4投与の2週間後に測定した。抗CD144抗体(1:200、BD Biosciences)、抗Prox1抗体(1:200、ReliaTech)および抗Tie2抗体(1:200、R&Dシステム)を用いた。マウントされた角膜全体のCD144+SC面積は、CD144+面積をそのコントロールの面積で割ったパーセンテージとして計算した。A1:A2iΔ/Δマウスでは、SC領域が、3H7H12G4処置眼においてFc処置眼と比較して114.8%有意に増加したことを示した(図8B、E)。Prox1の相対的な発現を定量化するために、CD144+SCの核領域における強度を測定した。A1:A2iΔ/Δマウスでは、Prox1強度が、3H7H12G4処置眼においてFc処置眼と比較して88.4%有意に増加したことを示した(図8B、F)。Tie2の発現を定量化するために、強度をCD144+SC領域にて測定した。A1:A2iΔ/Δマウスでは、Tie2強度が、3H7H12G4処置眼においてFc処置眼と比較して63.0%有意に増加したことを示した(図8B、F)。全体として、これらの知見は、3H7H12G4によるTie2の活性化が、A1:A2iΔ/Δマウスの障害のあるSCをレスキューすることを示す。
[206]実施例8.レーザー誘導CNVモデルにおける硝子体内注射した3H7H12G4によるCNV退行および血管漏出抑制。
[207] 3H7H12G4を、レーザー誘導脈絡膜血管新生(CNV)モデルを用いて、加齢性黄斑変性症(AMD)の特徴である脈絡膜血管新生(CNV)を阻害する能力について試験した。5mg/mlフェニレフリンおよび5mg/mlトロピカミド点眼薬(Santen Pharmaceutical)を用いて瞳孔を拡張し、局所麻酔のために0.5%塩酸プロパラカイン点眼薬(Alcon)を点眼した後、スリットランプ送達システムを備えたレーザー光凝固装置(Lumenis社)を、コンタクトレンズとしてのガラスカバースリップとともに用いて、網膜を視覚化した。十分なレーザーエネルギー(532nmの波長、250mWの出力、100msの持続時間、50μmのスポットサイズ)を、各眼につき4つ位置所(後極の3時、6時、9時および12時の位置)に送った。レーザー光硬化時に気泡を発生させ、ブルッフ膜の破裂を示す火傷だけをこの研究に含めた。レーザー部位に出血を含むスポットは分析から除外した。臨床状況を要約するために、3H7H12G4(5μg)をレーザー光硬化の7日後にマウスに硝子体内投与した(図9A)。コントロールまたは比較として、FcまたはVEGF-Trap(各5μg)を同じ方法でマウスに投与した。所定の試薬を硝子体内投与するために、ガラスキャピラリーピペットを備えたナノリッター2000マイクロインジェクター(World Precision Instruments)を用いて、各試薬5μgを含む約1μl(5mg/ml)を硝子体内腔に注入した。網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜-強膜フラットマウントのCD31+CNV体積を、レーザー光硬化の14日後に、MATLAB画像処理ツールボックス(MathWorks)を用いて計算した。抗CD31抗体(1:200、ミリポア)をCNVの内皮細胞の検出のために用いた。VEGF-Trapは、Fcと比較して64.4%までCNV退行を効果的に誘発し、3H7H12G4は同様にCNV退行を誘発した(65.7%)(図9B)。フルオレセイン血管造影(FA)とインドシアニングリーン血管造影(ICGA)とを組合せることで、レーザー損傷部位周辺での新生血管の血管漏出を測定することが可能となった。488nmおよび785nmの連続波レーザーモジュールを、それぞれフルオレセインおよびICGの励起源として用いた。励起レーザーのラスタ走査パターンは、回転ポリゴンミラー(MC-5;Lincoln Laser)およびガルバノメーターベースのスキャンミラー(6230H;Cambridge technology)で構成されるスキャナーシステムによって実行され、イメージングレンズのバック開口部に送られた。高い開口数(NA)の対物レンズ(PlanApoλ、NA0.75;Nikon)をイメージングレンズとして使用し、広視野眼底蛍光画像を提供した。光電子増倍管(R9110;浜松ホトニクス)で検出された蛍光シグナルは、フレームグラバーによりデジタル化され、フレームあたり512×512ピクセルサイズの画像にリアルタイムで再構成された。血管造影システムを利用した後期(6分)のFAおよびICGA画像を視覚化するために、10mgのフルオレセインナトリウム(Alcon)および0.15mgのICG(Daiichi Pharmaceutical)をそれぞれ腹腔内および静脈内に投与した。イメージング手順は、画像の品質を向上させるために全身麻酔および瞳孔拡張のもとで実行した。CNVからの漏出面積は、Javaベースのイメージングソフトウェア(ImajeJ;National Institutes of Health)を用い、FA画像にて測定された高蛍光面積の合計をICGA画像にて測定されたCNVの総面積で割ることで計算した。Fcと比較して、VEGF-Trap(37.0%)および3H7H12G4(24.6%)の両方が同様に血管漏出を抑制した(図9C)。注目すべきことに、Fc処置群ではレーザー光硬化後6日から14日の間で血管漏出に有意な差はなかったが、VEGF-Trapおよび3H7H12G4では血管脱出が著しく減少した(それぞれ45.6%および42.5%)(図9C)。したがって、CNVおよび血管漏出の抑制の大きさは、レーザー誘導CNVのマウスモデルでは、VEGF-Trapと3H7H12G4との間で定量的に区別できなかった。
[209]実施例9.CNVの内皮細胞における3H7H12G4およびCD31の共局在。
[210] 皮下注射された3H7H12G4がCNVに対しても治療効果を発揮できるかどうかを調べるために、我々はまず、CNVの内皮細胞における3H7H12G4とCD31の共局在を評価した。3H7H12G4(25mg/kg)の皮下投与は、レーザー光硬化の1日後に行った。コントロールとして、Fc(25mg/kg)を同じ方法でマウスに投与した。CNVの内皮細胞における3H7H12G4と抗CD31抗体(1:200、ミリポア)の共局在を、レーザー光硬化の2日、4日および8日後に抗ヒトIgG抗体(1:1000、Jackson ImmunoResearch Laboratories)により直接検出した(図10A)。投与された3H7H12G4は、CD31+内皮細胞CNVで高度に検出可能であった(図10B-D)。
[212]実施例10.皮下注射された3H7H12G4抗体のCNV阻害効果。
[213] CNV阻害における皮下注射された3H7H12G4の効果を決定するために、3H7H12G4(25mg/kg)の皮下投与をレーザー光硬化の1日後に行った。コントロールとして、Fc(25mg/kg)を同じ方法でマウスに投与した。CNVの内皮細胞の検出のために抗CD31抗体(1:200、Millipore)を用い、レーザー光硬化の8日後にMATLAB画像処理ツールボックス(MathWorks)を使用してRPE-脈絡膜-強膜フラットマウントのCD31+CNV体積を計算した(図11A)。3H7H12G4はFcと比較してCNV形成を69.9%まで効果的に阻害し(図11B、C)、これは3H7H12G4の硝子体内注射だけでなく皮下注射でもCNVに対して阻害効果があることを示す。
産業上の利用可能性
[215] 本発明に係るTie2に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、高い親和性でもってTie2に結合し、ヒトおよびマウスに対する交差反応性を維持し、および所望の抗原反応性を示す。加えて、Tie2のリン酸化およびTie2受容体の活性化を誘導することによって、目的の血管新生疾患を予防または処置するために有用に用いることができる。
[217] これまで、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明してきたが、これらの特定の技術は単なる好ましい実施形態であることは当業者には明らかであろう、したがって、本発明の範囲は、これらの実施形態に限定されない。
[1]
配列番号2を含むTie2 Ig3-FNIII(1-3)ドメインに結合する、抗Tie2抗体またはその抗原結合フラグメント。
[2]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号1の配列を構成するTie2のアミノ酸633~644および/またはアミノ酸713~726に結合する、前記[1]に記載の方法。
[3]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
配列番号3~5のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む重鎖可変領域および配列番号6~8のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域;
配列番号13~15のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む重鎖可変領域および配列番号16~18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域;
配列番号23~25のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む重鎖可変領域および配列番号26~28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域;
配列番号33~35のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む重鎖可変領域および配列番号36~38のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域;または
配列番号43~45のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む重鎖可変領域および配列番号46~48のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域
を含む、前記[1]に記載の方法。
[4]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号11のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号49のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号57のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、前記[1]に記載の方法。
[5]
前記[1]~[4]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
[6]
前記核酸が、配列番号10、12、20、22、30、32、40、42、50、52、55、56、59、60、63、64、67または68を含むことを特徴とする、前記[5]に記載の方法。
[7]
前記[5]の核酸を含む発現ベクター。
[8]
前記[7]の発現ベクターを用いて形質転換された細胞。
[9]
Tie2に結合する抗体または抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
(a)前記[8]の細胞の培養プロセス;および
(b)培養細胞からの抗体またはその抗原結合フラグメントの回収プロセスを含む、方法。
[10]
前記[1]~[4]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、血管新生疾患を予防または処置するための組成物。
[11]
組成物が以下を特徴とする、前記[10]に記載の方法:
血管新生疾患が、がん、転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、黄斑変性症、血管新生緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病関節炎、関連硬化症、アテローム性動脈硬化症プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管接着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、間接リウマチ、猫引っかき傷、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患、および神経変性疾患からなる群より選択される。
[12]
組成物が以下を特徴とする、前記[11]に記載の方法:
がんが、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭のがん、喉頭がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、膀胱がん、腎がん、肝がん、膵臓がん、骨がん、結合組織がん、皮膚がん、脳がん、甲状腺がん、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、および多発性骨髄性血液がんからなる群より選択される。
[13]
前記[1]~[4]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、血管新生疾患用の他の治療薬との併用治療のための組成物。
[218]
[219]
Claims (14)
- 配列番号2の配列を有するTie2 Ig3-FNIII(1-3)ドメインに結合する、抗Tie2抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
(a)配列番号23のアミノ酸配列を含む相補性決定領域-H1(CDR-H1)、
(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H3、を含む重鎖可変領域、ならびに
(d)配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(e)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(f)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L3、を含む軽鎖可変領域、
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号1の配列を構成するTie2のアミノ酸633~644および/またはアミノ酸713~726に結合する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
配列番号29のアミノ酸配列と90%以上の同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号31のアミノ酸配列と90%以上の同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
配列番号57のアミノ酸配列と90%以上の同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号58のアミノ酸配列と90%以上の同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
配列番号57のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項3に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 抗Tie2抗体の親和性(K D )が5.56E -11 Mである請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
- 前記核酸が、配列番号30および/または32、または配列番号59および/または60を含む、請求項6に記載の核酸。
- 請求項6または7の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項8の発現ベクターを用いて形質転換された細胞。
- Tie2に結合する抗体または抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
(a)請求項9の細胞を培養すること;および
(b)培養細胞からの抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む、方法。 - 有効量の請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤または希釈剤を含む、血管新生疾患を予防または処置するための医薬組成物。
- 他の抗体または生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記血管新生疾患が、がん、転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、黄斑変性症、血管新生緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病関節炎、関連硬化症、アテローム性動脈硬化症プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管接着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、間接リウマチ、猫引っかき傷、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患、および神経変性疾患から選択される、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 前記がんが、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭のがん、喉頭がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、膀胱がん、腎がん、肝がん、膵臓がん、骨がん、結合組織がん、皮膚がん、脳がん、甲状腺がん、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、および多発性骨髄性血液がんから選択される、請求項13に記載の医薬組成物。
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