CN116003619B - 人源化抗Ang-2和VEGF双功能抗体及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域,具体而言,涉及一种人源化抗Ang‑2和VEGF双功能抗体及其医药用途。该双功能抗体包含位于N端的VEGF结合功能区和为于C端的Ang‑2结合功能区。具有非常高的亲和力及特异性,且具有中和活性,因而具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体而言,涉及一种人源化抗Ang-2和VEGF双功能抗体及其医药用途。
背景技术
氨酸激酶受体-2(tyrosinekinase receptors withimmunoglobulin andEGFhomologydomains-2,Tie-2)为Ang-1和Ang-2的特异性受体。由于Ang-1和Ang-2具有相似的结构,两者对Tie-2亦具有相似的结合力。Tie-2除了在血管内皮细胞表达,在造血干细胞、单核细胞、神经细胞、肌肉卫星细胞和肿瘤细胞中也有表达。Tie-2的过度表达已在许多疾病中被观察到,包括银屑病、肺动脉高压、婴儿血管瘤。
Ang-2作为新发现的内皮细胞特异性表达的血管生成因子,可诱导血管内皮细胞的重新活跃,触发血管新生的过程,与多种疾病相关。其中最严重的,就是肿瘤的形成与肿瘤血管新生。除此之外,Ang-2引起的血管新生,还与眼底等疾病相关。尤其是在老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DEM)、糖尿病视网膜病变(DR)中。AMD又称年龄相关性黄斑变性,为视网膜黄斑区结构出现退行性病变引起,在早期主要表现为视力下降,中晚期则是中心视力丧失;DEM指由于糖尿病引起的黄斑中心的细胞外液积聚所致的视网膜增厚或硬性渗出沉积。糖尿病患者引起黄斑水肿一般持续存在,治疗以后复发率极高。DR是指糖尿病导致的视网膜微血管损害所引起的一系列典型病变,是一种影响视力甚至致盲的慢性进行性疾病。大量的研究已证实,Ang-2表达水平与眼底疾病AMD、DEM、DR的发展密切相关。目前,Ang-2被认为是下一个眼底疾病治疗的重要药物靶点。
血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor,VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,在胚胎发育、骨骼生长和生殖等生理过程中的对血管生成起关键调节作用,同时与肿瘤相关的病理性血管生成有关。
临床上有很多新生血管性眼病都是因为眼内VEGF过表达使得新生血管生长,继而发生大量出血、纤维增殖、牵拉性视网膜脱离、新生血管性青光眼等严重并发症。争性抑制VEGF-R2,能够有效抑制血管生成并促进已有新生血管消退,减轻血管渗漏引起的渗出、水肿和炎性反应,从而减缓眼底新生血管的进展。在眼科,使用抑制VEGF药物有助于阻断病变新生血管的生长,从而治疗眼科疾病。
发明内容
本发明涉及抗Ang-2和VEGF的双功能抗体,其包含位于N端的VEGF结合功能区和为于C端的Ang-2结合功能区;
所述VEGF结合功能区包含SEQ ID NO:1~3所示的重链CDR以及SEQ ID NO:4~6所示的轻链CDR;
所述Ang-2结合功能区包含SEQ ID NO:7~9所示的重链CDR以及SEQ ID NO:10~12所示的轻链CDR。
本发明还涉及如上所述双功能抗体相关的药用组合物及应用。
该抗体对双功能抗体具有非常高的亲和力及特异性,且具有中和活性,因而具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为h31B10scFv与重组人Ang-2蛋白的ELISA结果图;其中Commerciallizedantibody为Nesvacumab抗体,其同样为一种人源化Ang-2抗体;
图2为竞争法检测h31B10scFv的中和活性;
图3为h24V5与重组人VEGF蛋白的ELISA结果图;其中Commerciallized antibody为Bevacizumab抗体,其同样为一种人源化VEGF抗体;
图4为h24V5对C6胶质瘤细胞的抑制活性;*p<0.05,vs 0μg/ml;**p<0.01,vs 0μg/ml;
图5为h24V5/h31B10scFv双功能抗体结构示意图;
图6为h24V5/h31B10scFv双功能抗体对C6胶质瘤细胞的抑制活性;*p<0.05,vsh24V50μg/ml;**p<0.01,vs h24V50μg/ml;#p<0.05,vs h24V5/h31B10scFv 0μg/ml;##p<0.01,vs h24V5/h31B10scFv 0μg/ml;vs h24V50.1μg/ml。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明,用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导,随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本发明中,“抗体”此技术术语是结合特定抗原的蛋白,其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段,特别是全长抗体或抗体功能片段。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体,术语“抗体功能片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质,其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性,因为其结合至靶抗原,且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。
在一些特定的实施方式中,抗体专指双功能抗体或双特异抗体(BiAb)。术语“双功能”在本文中是指特异性地结合两种不同抗原。
本发明中,术语“人源化抗体(humanized antibody)”,也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody),是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架,即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体;术语“人源化抗体(humanized antibody)”亦包括表面重塑抗体及全人源化抗体等人源化抗体。
术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区,如Kabat等人所定义(Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,5thEd"US Department ofHealth and Human Services,NIH,1991,和后来的版本)。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处,取决于情况,术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在另一具体实施方式中,CDR区或CDR是指IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。
本发明涉及抗Ang-2和VEGF的双功能抗体,其包含位于N端的VEGF结合功能区和为于C端的Ang-2结合功能区;
所述VEGF结合功能区包含SEQ ID NO:1~3所示的重链CDR以及SEQ ID NO:4~6所示的轻链CDR;
所述Ang-2结合功能区包含SEQ ID NO:7~9所示的重链CDR以及SEQ ID NO:10~12所示的轻链CDR。
在一些实施方式中,所述VEGF结合功能区包含SEQ ID NO:13所示的重链可变区以及SEQ ID NO:14所示的轻链可变区。
在一些实施方式中,所述Ang-2结合功能区包含SEQ ID NO:15所示的重链可变区以及SEQ ID NO:16所示的轻链可变区。
在一些实施方式中,所述VEGF结合功能区还包括轻链恒定区以及重链恒定区Fc,所述Fc优选为人的IgG。
本发明尤其包括抗Ang-2抗体的单链可变结构域片段(“scFv”)和包括其的多特异性结合分子。通过使用短的连接肽连接轻链和/或重链可变结构域而制备单链可变结构域片段。Bird等(1988)(“Single-ChainAntigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)描述了连接肽的例子,其在一个可变结构域的羧基端和另一可变结构域的氨基端之间横桥接约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的连接体(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。连接体可进而被修饰,用于另外的功能,比如药物的附着或附着至固体载体。可经重组或合成产生单链变体。为了合成产生scFv,可使用自动合成仪。为了重组产生scFv,可将包含编码scFv的多核苷酸的适当的质粒引入到适当的宿主细胞中,所述宿主细胞是真核细胞,比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞,或原核细胞,比如大肠埃希氏菌(E.coli)。可通过常规操作比如多核苷酸的连接制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
术语“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域;VH)和抗体轻链可变结构域(或区域;VL)的分子,其保留结合抗原的能力。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-连接肽-VH-COOH或NH2-VH-连接肽-VL-COOH。
术语“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域;VH)和抗体轻链可变结构域(或区域;VL)的分子,其保留结合抗原的能力。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-连接肽-VH-COOH或NH2-VH-连接肽-VL-COOH。
连接肽通常是柔性的,柔性的连接肽可以减少融合蛋白与目的蛋白之间的空间位阻,从而更有利于蛋白正确折叠。在另外的实施方案中,连接肽是刚性接头肽;即相对非柔性肽接头。刚性连接肽不要求完全缺乏柔性,而是比柔性接头肽如富甘氨酸肽接头柔性少。由于其相对缺乏柔性,刚性连接肽降低通过刚性连接肽连接在一起的两个蛋白结构域(在当前情况下是稳定剂蛋白和热稳定逆转录酶)的运动。
在一些实施方式中,所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n,其中n选自1,2,3,4,5或6。
在一些实施方式中,所述Ang-2结合功能区为SEQ ID NO:17所示的sc-Fv。
根据本发明的再一方面,还涉及分离的核酸,其编码如上所述的双功能抗体。
术语“分离的核酸”在本文中是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物。所述分离的核酸包括RNA基因组序列,DNA(gDNA和cDNA)或从DNA转录的RNA序列,而且,除非特别指明,所述多肽还包括天然多核苷酸、糖、或碱基改变的类似物。根据本发明一个方面,所述多核苷酸是轻链多核苷酸。
所述分离的核酸包括编码蛋白复合物氨基酸序列的核苷酸序列,也包括与其互补的核苷酸序列。所述互补序列包括完全互补的序列和基本上互补的序列,这是指能在本领域已知的严谨条件下与编码蛋白复合物氨基酸序列的核苷酸序列杂交的序列。
本发明还涉及载体,其包含如上所述的核酸。
术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中,本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件,例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号,或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
在本发明中,载体可以为组合物,例如为多种质粒的混合物,不同质粒负载抗体或其抗原结合片段的一部分。
本发明还提供宿主细胞,其包含如上所述的核酸或如上所述的载体。
适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括:哺乳动物细胞诸如NS0、Sp2/0、CHO、COS、HEK、成纤维细胞和骨髓瘤细胞。可以使用人细胞,因而允许分子用人糖基化模式来修饰。或者,可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择,以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法,是本领域已知的。
可以证明,细菌细胞可用作宿主细胞,其适合表达本发明的双功能抗体或其他实施方案。但是,由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式,必须筛选在细菌细胞中产生的任何人源化抗体,以保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以适当地折叠的形式产生,该细菌细胞将是期望的宿主,或者,在可替代的实施方案中,可以在细菌宿主中表达分子,随后进行重新折叠。例如,用于表达的各种大肠杆菌菌株,是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种菌株,也可以用于该方法中。
如果需要,本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞,例如果蝇和鳞翅目昆虫和病毒表达系统,也可用作宿主细胞。
本发明还涉及药物组合物,其包含如上所述的双功能抗体和药学上可接受的载体,赋形剂,或稳定剂。
本发明的双功能抗体可以应用于制备药物组合物或无菌组合物,例如,将双功能抗体与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合。
术语“药学上可接受的”指当分子本体、分子片段或组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体示例包括磷酸,柠檬酸,和其它有机酸;抗氧化剂(例如,抗坏血酸和甲硫氨酸);抗菌剂(例如,十八烷基二甲基苯氯化铵,氯化六烃季铵,苯扎氯铵,酚,丁醇或苯甲醇,烷基尼泊金,邻苯二酚,间苯二酚,环己醇,3-戊醇,或间甲酚);低分子量(不到约10kDa)多肽;蛋白,例如,血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如,聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸(例如,甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸);单糖,二糖和其它碳水化合物(包括例如,葡萄糖,甘露糖,或葡聚糖);螯合剂(例如,EDTA);糖(例如,蔗糖,甘露醇,海藻糖,或山梨醇);成盐反离子;金属复合物;和/或非离子型表面活性剂(例如,包括TWEENTM,PLURONICSTM,或聚乙二醇)。此外,根据配制方法,可以由本领域普通技术人员适当选择常用的填充剂,稀释剂,结合剂,增湿剂,崩解剂,和/或表面活性剂。
根据本发明的又一方面,还涉及如上所述的双功能抗体在制备用于治疗Ang-2和/或VEGF所引起的眼科疾病中的应用。
所述眼科疾病优选为血管生成性眼病。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以参考本领域已知的其它实验方法,或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1Ang-2抗体的制备
1.抗原免疫及单克隆制备
以自行表达的可溶性人Ang-2重组蛋白在293细胞瞬转表达,获得编码本发明抗原及检测用蛋白并进行纯化。
将人Ang-2重组蛋白与小鼠抗体Fc片段(Fragment crystallizable)的缀合物腹腔注射BALB/c小鼠,每周一次,每次100μg/200μl/只,免疫3周后每周取小鼠尾血并检测血清中Ang-2抗体的表达;选择血清中Ang-2抗体表达量高(dotblot检测)的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成融合子。
用分子量为1450的50%PEG作融合剂进行细胞融合,细胞融合按常规方法进行。
2.培养杂交瘤细胞
复苏杂交瘤细胞株后培养,待细胞数扩增至约1×109时,1000rpm×5min,离心收集细胞。
3.提取细胞RNA
超净工作台环境下,将1ml Trizol试剂加入离心细胞,静置5min,加入氯仿2mL,剧烈摇晃15sec,室温静置3min,12000rpm×15min,移取上层水样层至新的EP管,加入0.5mL异丙醇,室温静置10min。12000rpm×10min。弃上清,加入1mL 75%乙醇,7500rpmx5 min,干燥沉淀,加入50μL双蒸水。琼脂糖电泳鉴定纯度并定量,保存于-70℃备用。
4.反转录制备cDNA
用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech,Cat No:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。细胞总RNA1μL,RNase Free ddH2O 6μL,oligo dT Primer 0.5μL,PRIMEScript RT Enzyme Mix I 0.5μL,5×Prime Script Buffer 2μL,混匀,37℃15min,85℃5s。
5.扩增cDNA
以cDNA为模板,用简并引物通过PCR方法(Kettleborough et al.(1993)Eur JImmunology 23:206-211;Strebe et al.(2010)Antibody Engineering1:3-14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后,转化DH5a感受态细胞,涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆,扩大培养后抽提质粒,测定抗体的基因序列。
所得抗体命名为31B10,测序得到Ang-2抗体重链可变区(HCVR)氨基酸序列:
QVQLQQSLSQSVKPGYSVKISGPLVRTNKAMDCLWWVKYYPEQHVPWIGAEFNTPKSLSQSKMRFKGKATVPDKSKSTAYVQKSLLTSEDSIVLFC CENIWIQGSGQGCRDTVSS
Ang-2抗体轻链可变区(LCVR)氨基酸序列:
DIVMSQSPSSMVISVGECVGLSCKWTCRHAHVVPGAGGYPWYQQKPGQRRMLLGYQSEKTMTGVPDFTGSGQCCYFTLSISHVKIEDLDVWWSSGSDCAARAAVAGTKLVLKR
抗体类型为IgG。
实施例2Ang-2抗体的人源化
采用互补决定簇嫁接法进行31B10杂交瘤抗体的人源化改造。首先,在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源抗体的轻、重链可变区序列同源性最高的人胚系抗体(germlineantibody)序列。重链可变区人源化选取IGHV1-18*01和IGHV3-48*01,抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV1-33*01和IGKV6-21*02。保留鼠源抗体的CDR区,将鼠源抗体的骨架区(FR区)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。建立鼠源抗体的结构模型,逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体框架区中每个位点的氨基酸,如果框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变,则该位点使用人的氨基酸序列,否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。
根据结构模拟进行人源化,人源化处理抗体重链的可变区氨基酸序列号为SEQ IDNO:15,人源化程度为79.4%;人源化处理抗体轻链的可变区氨基酸序列号为SEQ ID NO:16,人源化程度为87.2%。
实施例3Ang-2sc-Fv的构建
采用全序列合成方法,利用实施例2的人源化序列信息,合成靶向Ang-2的scFv人源化的核苷酸片段(其对应的蛋白质序列如SEQ ID NO:17所示);
QVGPQQSLSQSVKYGYSVWISGTTVRTNKAMDCLWWVKHYPEQHFPWMGAEFNTPKSLSQSKMRFKGKKTVPDTSKSTAEVQKSLMTSEDSLSLECCENIWIQGSGQGLRSTVASSGGGSDIVMDDSPSVGVISVGECVGLKCKLPCRHAHVVPGAGGYPWYQQYNGQNRDLLGYQSEKTMTGVPDFTVSGQCCDGLMSISHVKIEDLSVYWSSGSDCAARAAVAGTHLVLKR(SEQ IDNO:17)
将其命名为h31B10scFv,采用常规方法插入构建质粒过表达载体。将构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞,接种抗性LB平板培养基,生长过夜;挑选转化平板的5个单克隆,分别接种抗性液体培养基培养至OD600nm 0.5-0.6,加入0.5mM IPTG 20℃诱导表达4小时;离心收集菌体,超声破碎,SDS-PAGE检测表达情况。小样表达结果分析:蛋白质在上清和包涵体中均有表达,可继续进行可溶性表达纯化。
选择小样表达良好的菌株进行大样表达。接种菌种至抗性培养基中,37℃,200RPM培养至OD600nm 0.5-0.6。加入200ul的1M IPTG(28℃或37℃)诱导表达4小时。4℃离心收集菌体,弃上清,加入30ml PBST悬浮菌体,加入终浓度1mM PMSF,冰浴条件下超声波200W破碎6min。摇床4℃孵育1h。4℃高速离心,133转/秒×15min,取上清,加入400ul镍柱4℃结合过夜。收集镍柱(33转/秒×5min),用20mM imidazole洗涤液洗涤beads,洗去杂蛋白(1ml×3次)。加入300ul 300mM imidazole洗脱液,让洗脱液与beads充分结合1h,离心收集上清。向beads中再次加入300ul的洗脱液,洗脱1h,离心收集上清,两次洗脱液合为一管。对PBS缓冲液透析换液。SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量,纯度及浓度。大样表达结果分析:目标蛋白质为可溶性上清表达,总量2mg。
实施例4VEGF抗体的制备
抗原免疫及单克隆制备
免疫抗原采用human VEGF165蛋白(Sigma-Aldrich公司),将人VEGF重组蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,每周一次,每次150μg/200μl/只,免疫4周后每周取小鼠尾血并检测血清中VEGF抗体的表达;选择血清中VEGF抗体表达量高(dotblot检测)的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成融合子。
用分子量为1450的50%PEG作融合剂进行细胞融合,细胞融合按常规方法进行。
其余步骤同实施例1中的步骤2~5
所得抗体命名为24V5,测序得到VEGF抗体重链可变区(HCVR)氨基酸序列:
QVQLQQSGYDEVRPGSSVCCSCKFTMKWTFWNRMNWVKQRPQQMLECYSITCDGMTRSSKWGKKGKATLAPHKSSATVYMQLSSPVSEQNAVRFCLITGTIWALHMDGTQVTCPA
VEGF抗体轻链可变区(LCVR)氨基酸序列:
DIVMWQSHNFMSLSVHDRVTIDCSPDDIPWFIGGWYQQKPGSSPKYLIYSICAMYNGVPDRFTHSGSHTDYTATNTSGQWSDRTVVMCTGECFCVFTPCWSTKFELK
抗体类型为IgG。
实施例5VEGF抗体的人源化
采用互补决定簇嫁接法进行24V5杂交瘤抗体的人源化改造。首先,在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源抗体的轻、重链可变区序列同源性最高的人胚系抗体(germlineantibody)序列。重链可变区人源化选取IGHV1-3*01,抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV4-1*01和IGKV1-39*01。保留鼠源抗体的CDR区,将鼠源抗体的骨架区(FR区)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。建立鼠源抗体的结构模型,逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体框架区中每个位点的氨基酸,如果框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变,则该位点使用人的氨基酸序列,否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。
根据结构模拟进行人源化,人源化处理抗体重链的可变区氨基酸序列号为SEQ IDNO:13,人源化程度为83.2%;人源化处理抗体轻链的可变区氨基酸序列号为SEQ ID NO:14,人源化程度为80.5%。改造后抗体称之为h24V5。
QVQLQQKGYVEVRPGSDVCFSCKIWMKWTFWNRMNWVKNRPQF MLECYSITCDGMTRSSKWGIKGKASLAPHKVSATVYMQLSSPVSCQNA WRFCLITGTIWALHMDFFQVTCPA(SEQ ID NO:13)
DIVEWQSHNFMSDPVHDRHTIDCSPDDIPWFIGGWYQDFPGSSRKY LIYSICAMYNGVPDRFTHWGSHTDYTATVTSGQWSDPTVVMCTGECFC VFTPCWNTKFEIK(SEQ ID NO:14)
实施例6h31B10scFv抗体活性测定
1)抗体活性的测定
采用表面等离子体共振分析(BiacoreX)方法测试可溶性h31B10scFv和Ang-2的结合动力学,并且计算h31B10scFv的KD值;使用同样的方法分析h31B10scFv和Ang-1是否能结合。
使用Biacore分析了纯化后h31B10scFv抗体与Ang-1和Ang-2的亲和力。如下表所示:
Affinityanalyses ofanti-Ang-2scFvby surfaceplasmonresonance
从结果可知,h31B10scFv对于Ang-2蛋白的KD值能够达到1.95×10-11(M),这对于人源化的sc-Fv属于非常高的亲和力;同时,其对于Ang-1蛋白基本不结合。
2)Elisa方法比较与商品化Ang-2抗体的活性
通过倍比稀的方法对scFv进行稀释并与重组人Ang-2蛋白(R&D Systems,623-AN-01M/CF)进行结合。具体做法为:用ELISA包被液稀释重组人Ang-2蛋白至1ug/ml,4℃过夜包被96孔板。次日吸去液体,每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔用2%FBS的PBS溶液室温封闭30分钟。加入scFv及商品化人源化ANG-2抗体(Nesvacumab,购自MCE公司)。通过倍比稀释的方法进行2倍稀释。浓度梯度,5、2.5、1.25、0.625、0.03、0.015、0.08、0.04、0.02、0.01ug/ml。每孔100ul,室温孵育1小时。弃上清,每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul 1:1000稀释的HRP标记的小鼠抗人H+L抗体(abcam),室温孵育1h。弃上清,每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul ELISA显影剂(solarbio),室温避光15分钟,加入100ul ELISA终止液(solarbio),450nm波长下检测吸光度。实验结果如图1所示。可见h31B10scFv的亲和力优于商品化Ang-2抗体。
3)竞争法检测h31B10scFv的中和活性
ECV304细胞株强表达Tie-2受体,可通过其对h31B10scFv的中和活性进行检测。
人脐静脉内皮细胞株ECV304购自中国典型培养物保藏中心,其培养和传代方法:
ECV304细胞以含10%胎牛血清的M199为培养基,进行常规培养。待内皮细胞融合80%~90%后,吸出培养液,用温PB溶液洗一遍,然后加入0.25%胰蛋白酶+1M EDTA溶液,轻轻地向不同方向倾斜培养皿,使消化液均匀分布。边消化边倒置显微镜下观察,细胞皱缩、变圆、彼此分离或呈片状分离即可加入细胞生长液来终止消化反应。用加样器反复吹打,使仍贴壁细胞脱落下来,收集细胞-酶溶液,1000rpm离心5分钟。用含10%胎牛血清的M199完全培养基洗一遍,除去残存的酶溶液。重悬细胞,并反复吹打制成单细胞悬液,以血细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为(2~5)×105个/mL,以3×104个/mL的密度接种,加入完全培养基培养。每2~3天换液一次,3~4天传代一次。
检测方法如下:
①用100ul PBS重悬细胞,将ECV304细胞包被到板上;
②将梯度稀释的h31B10scFv和biotinylated重组人Ang-2蛋白(R&D Systems,623-AN-01M/CF)0.2ug混合;
③将混合物加到孔板中;
④清洗并加入Streptavidin Protein,HRP二抗;
⑤TMB显色。
检测结果如图2所示,可见随着h31B10scFv浓度升高,重组人Ang-2蛋白与Tie-2受体的结合逐渐减少,表明h31B10scFv具有阻断Ang-2与Tie-2受体结合的能力。
实施例7h24V5抗体活性测定
1)抗体活性的测定
1.将表面偶联Protein A蛋白的探针在250μL的buffer K(PBS+0.002%吐温20+0.02%BSA)中浸润10分钟;
2.将抗体用bufferK配置为5μg/mL的工作液;
3.将重组humanVEGF165蛋白(Sigma-Aldrich公司)、humanVEGF121蛋白(abcam公司)、重组人VEGFB蛋白(abcam公司)、重组人VEGFC蛋白(abcam公司)、重组人VEGFD蛋白(MCE)、重组人EG-VEGF蛋白(abcam公司)、重组人PIGF蛋白(abcam公司)分别用缓冲液配置为四个浓度的工作液,浓度分别为10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,0μg/mL;
4.根据Gator非标记分析仪(星童医疗技术,CAT#:Gator)指示添加试剂。
Affinity analyses ofanti-VEGFA antibody
注:“-”代表KD值大于9.99E-2。
从上表可知,h24V5对于VEGF-A型蛋白的表达最多的VEGF-A亚型VEGF-A165和VEGF-A121均能高亲和力表达,KD值最高能够达到1.15×10-12(M),且与其他几种VEGF亚型基本不发生交叉反应,具有优秀的特异性。
2)Elisa方法比较与商品化VEGF抗体的活性
通过倍比稀的方法对h24V5及对照的商品化抗体进行稀释并与human VEGF165蛋白(Sigma-Aldrich公司)进行结合。具体做法为:用ELISA包被液稀释重组人VEGF蛋白至1ug/ml,4℃过夜包被96孔板。次日吸去液体,每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔用2%FBS的PBS溶液室温封闭30分钟。加入h24V5及商品化人源化VEGF抗体(Bevacizumab,冻干粉购自安进制药)。通过倍比稀释的方法进行2倍稀释。浓度梯度,5、2.5、1.25、0.625、0.03、0.015、0.08、0.04、0.02、0.01ug/ml。每孔100ul,室温孵育1小时。弃上清,每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul 1:1000稀释的HRP标记的小鼠抗人IgG抗体(abcam),室温孵育1h。弃上清,每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul ELISA显影剂(solarbio),室温避光15分钟,加入100ul ELISA终止液(solarbio),450nm波长下检测吸光度。实验结果如图3所示。可见h24V5在绝大部分浓度下的亲和力均优于商品化VEGF抗体。
3)h24V5对C6胶质瘤细胞的抑制活性
大鼠C6胶质瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞生长至70%~80%时,弃去原培养基,加入无血清培养基培养8h后再加入含VEGF单抗的培养基,h24V5抗体以不同终浓度加入,每组4个重复,48h后MTT法检测细胞增殖情况。
结果如图4所示,0.1μg/ml~10μg/ml的h24V5抗体均能显著性抑制C6胶质瘤细胞的增值。
实施例8双功能抗体的构建
构建h24V5/h31B10scFv双功能抗体。
构建中,h31B10scFv的N端通过Linker(G4S)2连接在h24V5重链C末端(如图5所示,采用人IgG2抗体的重链和轻链恒定区),与h24V5轻链载体共转染到293细胞。在37℃摇瓶振摇培养6天,离心收集上清液,用ProteinA纯化,纯化后进行各种检测,包括结合与功能活性。
实施例9双功能抗体的功能验证
按照实施例7中方法验证双功能抗体对C6胶质瘤细胞的抑制活性。
结果如图6所示。双功能抗体对于C6胶质瘤细胞仍然具有明显的抑制活性,其中,对于0.1μg/ml的双功能抗体,其相对于h24V5也产生显著性差异,表明h31B10scFv受体能够协调h24V5产生更强的抗胶质瘤效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.抗Ang-2和VEGF的双功能抗体,其特征在于,包含位于N端的VEGF结合功能区和位于C端的Ang-2结合功能区;
其中,所述VEGF结合功能区为包含恒定区的完整抗体,其重链CDR1-CDR3分别依次如SEQ ID NO:1-3所示,轻链CDR1-CDR3分别依次如SEQ ID NO:4-6所示;
所述Ang-2结合功能区为scFv,其重链CDR1-CDR3分别依次如SEQ ID NO:7-9所示,轻链CDR1-CDR3分别依次如SEQ ID NO:10-12所示;
所述scFv的N端连接在所述完整抗体中重链的C端。
2.根据权利要求1所述的双功能抗体,其特征在于,所述VEGF结合功能区包含SEQ IDNO:13所示的重链可变区以及SEQ ID NO:14所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的双功能抗体,其特征在于,所述Ang-2结合功能区包含SEQ IDNO:15所示的重链可变区以及SEQ ID NO:16所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1-3任一项所述的双功能抗体,其特征在于,所述VEGF结合功能区为人的IgG。
5. 根据权利要求1-3任一项所述的双功能抗体,其特征在于,所述Ang-2结合功能区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
6.核酸,其特征在于,其编码权利要求1-5任一项所述的双功能抗体。
7.载体,其特征在于,含有权利要求6所述核酸。
8.宿主细胞,其特征在于,包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的载体。
9.药物组合物,其特征在于,包含权利要求1-5任一项所述的双功能抗体和药学上可接受的载体。
10.药物组合物,其特征在于,包含权利要求1-5任一项所述的双功能抗体和赋形剂或稳定剂。
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