CN102906114A

CN102906114A - 双特异性二价抗vegf/抗ang-2抗体

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Publication number: CN102906114A
Application number: CN2011800251644A
Authority: CN
Inventors: M.贝尔纳; S.英霍夫-琼; A.卡维利; H.凯滕伯杰; C.克莱因; J.T.雷古拉; W.谢弗; J.M.尚茨尔; W.朔伊尔; K-G.斯塔本劳施; M.托马斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: TW201138820A; CR20120464A; MA34172B1; RU2012143793A; AU2011231580A1; TWI426920B; ECSP12012177A; KR20130001291A; UA110932C2; CN102906114B; BR112012024287A2; CA2793402C; WO2011117329A1; US20110236388A1; KR101484383B1; AU2011231580B2; CL2012002662A1; CO6630087A2; EP2552960B1; IL222116A

Abstract

本发明涉及针对人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)且针对人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性二价抗体、其生成方法、含有所述抗体的药物组合物、及其用途。

Description

双特异性二价抗VEGF/抗ANG-2抗体

本发明涉及针对人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)且针对人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性二价抗体、其生成方法、含有所述抗体的药物组合物及其用途。

背景技术

血管发生牵涉多种病症的发病机制，所述病症包括实体瘤、眼内新生血管性综合征诸如增殖性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性、类风湿性关节炎、和银屑病(Folkman,J.等,J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934;Klagsbrun,M.等,Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239;和Garner,A.,Vascular diseases,于：Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner，A.和Klintworth,G.K.(编)，第二版，Marcel Dekker，New York(1994),第1625页-第1710页)。在实体瘤的情况中，新血管化允许肿瘤细胞与正常细胞相比获得生长优势和增殖自主性。因而，已观察到肿瘤切片中微血管的密度与乳腺癌以及几种其它肿瘤中患者存活间的关联(Weidner,N.等,N Engl J Med.324(1991)1-8;Horak,E.R.等,Lancet 340(1992)1120-1124;和Macchiarini,P.等,Lancet 340(1992)145-146)。

VEGF和抗-VEGF抗体

人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No:105)记载于例如Leung,D.W.等,Science 246(1989)1306-9;Keck,P.J.等,Science 246(1989)1309-12和Connolly,D.T.等,J.Biol.Chem.264(1989)20017-24。VEGF牵涉调节正常的和异常的血管发生和与肿瘤和眼内病症有关的新血管化(Ferrara,N.等,Endocr.Rev.18(1997)4-25;Berkman,R.A.等,J.Clin.Invest.91(1993)153-159;Brown,L.F.等,Human Pathol.26(1995)86-91;Brown,L.F.等,CancerRes.53(1993)4727-4735;Mattern,J.等,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934;和Dvorak,H.F.等,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是已经从数种来源分离的同二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。VEGF在胚胎血管生成期间在新血管形成中和在成年期间在血管发生中具有重要的调节功能(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439;Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442;综述见Ferrara,N.等,Endocr.Rev.18(1997)4-25)。已经在研究中证明了VEGF发挥的作用的意义，该研究显示了单个VEGF等位基因的失活由于不能形成血管系统(vasculature)而导致胚胎致死性(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439;Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442)。另外，VEGF对单核细胞具有强化学引诱物活性，能诱导内皮细胞中的血纤维蛋白溶酶原激活剂和血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，而且还能诱导微血管通透性。由于后一种活性，它有时称为血管通透性因子(VPF)。已经综述了VEGF的分离和特性；见Ferrara,N.等,J.Cellular Biochem.,47(1991)211-218和Connolly,D.T.,J.Cellular Biochem.,47(1991)219-223。单个VEGF基因的mRNA可变剪接产生5种VEGF同等型。

抗VEGF中和性抗体抑制多种人肿瘤细胞系在小鼠中的生长(Kim,K.J.等,Nature 362(1993)841-844;Warren,S.R.等,J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797;Borgstrom,P.等,Cancer Res.56(1996)4032-4039;和Melnyk,O.等,Cancer Res.56(1996)921-924)。WO 94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900和WO 00/35956涉及针对VEGF的抗体。人源化单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab)(以商品名阿瓦斯汀

销售)是一种在肿瘤治疗中使用的抗VEGF抗体(WO 98/45331)。

兰尼单抗(ranibizumab)(商品名

)是一种与贝伐单抗(阿瓦斯汀)自同一亲本鼠抗体衍生的单克隆抗体片段。它比亲本分子小得多，并且已经经过亲和力成熟，从而提供更强的对VEGF-A的结合(WO 98/45331)。它是一种已经被批准用于治疗“湿”型年龄相关的黄斑变性(ARMD)(即，一种常见形式的年龄相关的视力丧失)的抗血管生成物。另一种抗VEGF抗体是例如在例如US 2007/0141065中描述的HuMab G6-31。

ANG-2和抗-ANG-2抗体

人血管生成素-2(ANG-2)(或者缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ ID No:106)记载于Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等,Genomics 48(1998)389-91。发现血管生成素-1和-2(ANG-1(SEQ ID No:107)和ANG-2(SEQ ID No:106))为Tie(即，一种在血管内皮内选择性表达的酪氨酸激酶家族)的配体。Yancopoulos,G.D.等,Nature 407(2000)242-48。目前血管生成素家族有四种确定的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可能代表小鼠和人中相同基因座的广泛趋异的对应物。Kim,I.等,FEBS Let,443(1999)353-56;Kim,I.等,J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初是在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂鉴定的(参见，对于ANG-1:Davis,S.等,Cell 87(1996)1161-69;和对于ANG-2:Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60)。所有已知的血管生成素主要结合Tie2，而Ang-1和-2两者都以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2。Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60。显示了Ang-1支持EC存活并促进内皮完整性，Davis,S.等,Cell87(1996)1161-69;Kwak,H.J.等,FEBS Lett 448(1999)249-53;Suri,C.等,Science 282(1998)468-71;Thurston,G.等,Science 286(1999)2511-2514;Thurston,G.等,Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反的效果，并且在缺少存活因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子的情况下，促进血管去稳定化和消退。Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60。然而，ANG-2功能的许多研究已经提示了更复杂的情形。ANG-2可能是血管重塑的一种复杂的调节物，其在血管发芽和血管消退两者中发挥作用。支持ANG-2的此类作用，表达分析揭示了ANG-2在血管生成性发芽的成年背景中与VEGF一起被快速诱导，而ANG-2在血管消退的背景中在没有VEGF的情况中被诱导。Holash,J.等,Science 284(1999)1994-98;Holash,J.等,Oncogene 18(1999)5356-62)。与背景依赖性作用一致，ANG-2特异性结合同一内皮特异性受体Tie-2（其由Ang-1激活），但是对其激活具有背景依赖性影响。Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60。

角膜血管发生测定法已经显示了ANG-1和ANG-2两者都具有类似的效果，与VEGF协同起作用以促进新血管的生长。Asahara,T.等,Circ.Res.83(1998)233-40。由于观察到在体外于高浓度，ANG-2也可以是促血管生成的，从而提出存在剂量依赖性内皮应答的可能性。Kim,I.等,Oncogene 19(2000)4549-52。在高浓度时，ANG-2在血清剥夺凋亡期间经由PI-3激酶和Akt途径经由激活Tie2充当内皮细胞的细胞凋亡存活因子。Kim,I.等,Oncogene 19(2000)4549-52。

其它体外实验提示，在持续暴露期间，ANG-2的效果可以逐渐从Tie2的拮抗剂转换为激动剂，并且在后来的时间点，其可以直接促成血管的管形成和新血管稳定化。Teichert-Kuliszewska,K.等,Cardiovasc.Res.49(2001)659-70。此外，如果在血纤蛋白凝胶上培养EC，那么也观察到用ANG-2激活Tie2，可能提示ANG-2的作用可能取决于EC分化状态。Teichert-Kuliszewska,K.等,Cardiovasc.Res.49(2001)659-70。在三维胶原凝胶中培养的微血管EC中，ANG-2也可以诱导Tie2激活，并且促进毛细管样结构的形成。Mochizuki,Y.等,J.Cell.Sci.115(2002)175-83。使用3-D球形共培养物作为血管成熟的体外模型表明，EC与间充质细胞间的直接接触消除对VEGF的响应性，而VEGF和ANG-2的存在诱导发芽。Korff，T.等,Faseb J.15(2001)447-57。Etoh,T.H.等证明了组成性表达Tie2的EC，MMP-1、-9和u-PA的表达在存在VEGF的情况中被ANG-2强烈上调。Etoh,T.等,Cancer Res.61(2001)2145-53。凭借体内瞳孔膜模型，Lobov，I.B.等显示了在存在内源VEGF的情况中ANG-2促进毛细管直径的快速增加、基底层的重塑、内皮细胞的增殖和迁移，并刺激新血管的发芽。Lobov,I.B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)11205-10。相反，ANG-2在没有内源VEGF的情况中促进内皮细胞死亡和血管消退。Lobov,I.B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)11205-10。类似地，凭借一种体内肿瘤模型，Vajkoczy,P.等证明了多细胞聚集体经由由宿主和肿瘤内皮同时表达VEGFR-2和ANG-2通过血管生成性发芽启动血管生长。Vajkoczy,P.等,J.Clin.Invest.109(2002)777-85。此模型例示了生长中的肿瘤建立的微血管系统的特征在于连续的重塑，推断其由VEGF和ANG-2的表达介导。Vajkoczy,P.等,J.Clin.Invest.109(2002)777-85。

Tie-2和血管生成素-1的敲除小鼠研究显示了类似的表型，并且提示了血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化介导形成中的血管的重塑和稳定化，这促进血管发生期间的血管成熟和内皮细胞支持细胞粘着的维持(Dumont,D.J.等,Genes & Development,8(1994)1897-1909;Sato,T.N.,Nature,376(1995)70-74;Thurston,G.等,Nature Medicine 6(2000)460-463)。血管生成素-1的作用被认为是在成年中保守的，其中它广泛且组成性表达(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50;Zagzag,D.等,Exp Neurology 159(1999)391-400)。比较而言，血管生成素-2表达主要受限于血管重塑部位，认为其在该处阻断血管生成素-1的组成性稳定化或成熟功能，允许血管恢复成并保持于可以更为响应发芽信号的可塑状态(Hanahan,D.,1997;Holash,J.等,Oncogene 18(199)5356-62;Maisonpierre,P.C.,1997)。病理学血管发生中血管生成素-2表达的研究已经发现许多肿瘤类型显示血管的血管生成素-2表达(Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60)。功能性研究提示了血管生成素-2牵涉肿瘤血管发生，并且将血管生成素-2过表达与小鼠异种移植物模型中肿瘤生长增加联系起来(Ahmad,S.A.等,Cancer Res.,61(2001)1255-1259)。其它研究已经将血管生成素-2过表达与肿瘤高血管分布(hypervascularity)联系起来(Etoh,T.等,Cancer Res.61(2001)2145-53;Tanaka,F.等,Cancer Res.62(2002)7124-7129)。

在最近几年中，已经提出了血管生成素-1、血管生成素-2和/或Tie-2为可能的抗癌治疗性靶物。例如，US 6,166,185、US 5,650,490和US 5,814,464各披露了抗-Tie-2配体和受体抗体。报告了使用可溶性Tie-2的研究降低啮齿类中肿瘤的数目和大小(Lin,1997;Lin 1998)。Siemeister,G.等,Cancer Res.59:3(1999)3185-91生成了表达Tie-2的胞外域的人黑素瘤细胞系，将这些注射到裸鼠中，并且报告了可溶性Tie-2导致对肿瘤生长和肿瘤血管发生的显著抑制。鉴于血管生成素-1和血管生成素-2两者都结合Tie-2，通过这些研究不清楚血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否会是抗癌疗法的有吸引力的靶物。然而，有效的抗血管生成素-2疗法被认为对治疗疾病诸如癌症（其中进展依赖于异常的血管发生，其中阻断该过程可以导致阻止疾病进展）是有益的(Folkman,J.,Nature Medicine.1(1995)27-31)。

另外，一些小组已经报告了结合血管生成素-2的抗体和肽的用途。参见例如US 6,166,185和US 2003/10124129、WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134或US 2006/0122370。

血管生成素-2的病灶性表达(focal expression)的效果研究已经显示了，拮抗血管生成素-1/Tie-2信号松弛紧密的血管结构，由此将EC暴露于来自血管发生诱导剂例如VEGF的激活信号(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50)。源自对血管生成素-1的抑制的此促血管生成效果指示抗血管生成素-1疗法不会是有效的抗癌治疗。

ANG-2在发育期间在发生血管重塑的部位表达。Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60。在成年个体中，ANG-2表达限于血管重塑的部位以及高度血管化肿瘤，包括胶质瘤(Osada,H.等,Int.J.Oncol.18(2001)305-09;Koga,K.等,Cancer Res.61(2001)6248-54)、肝细胞癌(Tanaka,S.等,J.Clin.Invest.103(1999)341-45)、胃癌(Etoh,T.等,Cancer Res.61(2001)2145-53;Lee,J.H.等,Int.J.Oncol.18(2001)355-61)、甲状腺肿瘤(Bunone,G.等,Am J Pathol 155(1999)1967-76)、非小细胞肺癌(Wong,M.P.等,LungCancer 29(2000)11-22)、和结肠癌(Ahmad,S.A.等,Cancer 92(2001)1138-43)、和前列腺癌(Wurmbach,J.H.等,Anticancer Res.20(2000)5217-20)。发现了一些肿瘤细胞表达ANG-2。例如，Tanaka,S.等,J.Clin.Invest.103(1999)341-45检测到人肝细胞癌(HCC)的12份标本之10份中的ANG-2mRNA。Ellis的小组报告了ANG-2在肿瘤上皮中遍在表达。Ahmad,S.A.等,Cancer 92(2001)1138-43。其他研究者报告了类似的发现。Chen,L.,等.,J.Tongji Med.Univ.21(2001)228-35。通过检测存档的人乳腺癌标本中的ANG-2mRNA水平，Sfiligoi,C.等,Int.J.Cancer 103(2003)466-74报告了ANG-2mRNA与辅助性淋巴结侵入、短的无疾病时间和不良的总体存活显著有关。Tanaka,F.等,Cancer Res.62(2002)7124-29审查了分别为病理学I至IIIA期的总共236名非小细胞肺癌(NSCLC)患者。使用免疫组织化学，他们发现16.9%的NSCLC患者呈ANG-2阳性。ANG-2阳性肿瘤的微血管密度显著高于ANG-2阴性的。仅在VEGF表达较高时看到ANG-2的此类血管生成效果。此外，ANG-2的阳性表达是预测不良术后存活的重要因子。Tanaka,F.等,CancerRes.62(2002)7124-7129。然而，他们没有发现Ang-1表达和微血管密度间的显著关联。Tanaka,F.等,Cancer Res.62(2002)7124-7129。这些结果提示了ANG-2是数类癌症患者不良预后的指示物。

最近，使用ANG-2敲除小鼠模型，Yancopoulos的小组报告了ANG-2是出生后血管发生需要的。Gale,N.W.等,Dev.Cell 3(2002)411-23。他们显示了ANG-2敲除小鼠不发生眼中玻璃状体(hyaloid)血管系统的发育编程性消退，而且它们的视网膜血管不能从中心视网膜动脉发芽。Gale,N.W.等,Dev.Cell3(2002)411-23。他们还发现了ANG-2的缺失导致淋巴脉管系统的样式形成(patterning)和功能的深刻缺陷。Gale,N.W.等,Dev.Cell 3(2002)411-23。用Ang-1的遗传拯救改正淋巴的，而非血管发生缺陷。Gale,N.W.等,Dev.Cell 3(2002)411-23。

Peters和他的同事报告了可溶性Tie2在作为重组蛋白或在病毒表达载体中投递时抑制小鼠模型中鼠乳腺癌和黑素瘤的体内生长。Lin,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)8829-34;Lin,P.等,J.Clin.Invest.100(1997)2072-78。如此处理的肿瘤组织中的血管密度得到很大地降低。另外，可溶性Tie2阻断由肿瘤细胞条件化培养基刺激的大鼠角膜中的血管发生(Lin,P.等,J.Clin.Invest.100(1997)2072-78)。此外，Isner和他的小组证明了，向VEGF添加ANG-2比单独的VEGF促进显著更长的且更为环绕的新血管分布。Asahara,T.等,Circ.Res.83(1998)233-40。过量的可溶性Tie2受体排除通过ANG-2调控VEGF诱导的新血管化。Asahara,T.等,Circ.Res.83(1998)233-40。Siemeister,G.等,Cancer Res.59:3(1999)3185-91用裸鼠异种移植物显示了，异种移植物中Flt-1或Tie2的胞外配体结合域的过表达导致对途径的显著抑制不能由另一途径补偿，提示应当认为VEGF受体途径和Tie2途径是对于体内血管发生过程必需的两种独立的介导物。Siemeister,G.等,Cancer Res.59:3(1999)3185-91。这得到新近White,R.,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(2003)5028-33的出版物证明。在他们的研究中，证明了特异性结合并抑制ANG-2的核酸酶抗性RNA适体显著抑制大鼠角膜微袋(micropocket)血管发生模型中由bFGF诱导的新血管化。

双特异性抗体

最近已经开发出极其多种重组抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链域得到的四价双特异性抗体(参见，例如Coloma,M.J.等,NatureBiotech 15(1997)159-163;WO 2001/077342；和Morrison,S.L.,Nature Biotech25(2007)1233-1234)。

还已经开发了能够结合两种或更多种抗原且不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的几种其它新形式，诸如双抗体、三抗体或四抗体、微型抗体、几种单链形式(scFv、双-scFv)(Holliger,P.等,Nature Biotech23(2005)1126-1136;Fischer，N.,Léger，O.,Pathobiology 74(2007)3-14;Shen,J.等,Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74;Wu,C.等,NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。

所有此类形式使用接头来将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与别的结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。必须牢记的是，可能想要通过维持与天然存在的抗体的高度相似性来保留经由Fc受体结合介导的效应器功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。

在WO 2007/024715中报告了双重可变域免疫球蛋白工程化为多价且多特异性的结合蛋白。在US 6,897,044中报告了用于制备生物学活性抗体二聚体的方法。在US 7,129,330中报告了具有经由肽接头彼此连接的至少四个可变域的多价FV抗体构建物。在US 2005/0079170中报告了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6,511,663中报告了包含通过连接结构彼此共价结合的三或四个Fab片段的三或四价单特异性抗原结合蛋白，该蛋白质并非天然的免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报告了四价双特异性抗体，其可以在原核和真核细胞中有效表达的，并且在治疗和诊断方法中是有用的。在US 2005/0163782中报告了一种自包含两类多肽二聚体的混合物相对于未经由至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成经由至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报告了双特异的四价的受体。在WO 2001/077342中报告了具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体。

在WO 1997/001580中报告了多特异性且多价的抗原结合多肽。WO 1992/004053报告了同缀合物，其通常通过合成交联共价连接结合相同抗原决定簇的IgG类单克隆抗体制备。在WO 1991/06305中报告了对抗原具有高亲合力的寡聚单克隆抗体，其中分泌通常为IgG类的寡聚体，其具有连接在一起的两个或更多个免疫球蛋白单体以形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报告了绵羊衍生的抗体和工程化抗体构建物，其可以用于治疗干扰素γ活性病原性疾病。在US 2005/0100543中报告了作为双特异性抗体的多价载体的靶向性构建体，即靶向性构建体的每个分子可以充当两个或更多个双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报告了遗传上工程化的双特异的四价的抗体。在WO 2007/109254中报告了由稳定化的scFv组成或包含稳定化的scFv的稳定化的结合分子。

VEGF和ANG-2抑制剂的组合

WO 2007/068895涉及ANG-2拮抗剂和VEGF、KDR和/或FLTL拮抗剂的组合。WO 2007/089445涉及ANG-2和VEGF抑制剂组合。

WO 2003/106501涉及结合血管生成素并含有多聚化域的融合蛋白。WO2008/132568涉及结合血管生成素和VEGF的融合蛋白。WO 2003/020906涉及具有受体的多个配体结合域的多价蛋白质缀合物。

WO 2009/136352涉及抗血管生成化合物。

发明概述

本发明涉及包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO:1作为重链可变域(VH)，

和SEQ ID NO:2作为轻链可变域(VL)；且

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO:3作为重链可变域(VH)，和SEQ ID NO:4作为轻链可变域(VL)。

在本发明的一个方面，依照本发明的双特异性抗体的特征在于包含：

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；和

b)特异性结合ANG-2的全长抗体的经修饰的重链和经修饰的轻链，其中恒定域CL和CH1彼此替换。

在一个实施方案中，此类双特异性二价抗体的特征在于包含：

a)氨基酸序列SEQ ID NO:7作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:5作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:8作为所述第二全长抗体的经修饰的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:6作为所述第二全长抗体的经修饰的轻链。

a)氨基酸序列SEQ ID NO:11作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:9作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:12作为所述第二全长抗体的经修饰的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:10作为所述第二全长抗体的经修饰的轻链。

a)氨基酸序列SEQ ID NO:15作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:13作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:16作为所述第二全长抗体的经修饰的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:14作为所述第二全长抗体的经修饰的轻链。

本发明的又一些方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物、用于治疗癌症的所述组合物、所述双特异性抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途、通过对需要此类治疗的患者施用所述双特异性抗体治疗患有癌症的患者的方法。

本发明的又一些方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物、用于治疗血管疾病的所述组合物、所述双特异性抗体用于制造用于治疗血管疾病的药物的用途、通过对需要此类治疗的患者施用所述双特异性抗体治疗患有血管疾病的患者的方法。

本发明的又一方面是编码依照本发明的双特异性抗体的链的核酸分子。

本发明进一步提供了含有依照本发明的所述核酸，能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体，和含有所述载体，用于重组生成依照本发明的双特异性抗体的宿主细胞。

本发明进一步包括包含依照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。

本发明进一步包括用于生成依照本发明的双特异性抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸，并从所述细胞或细胞培养上清液回收所述双特异性抗体。本发明进一步包括通过此类用于生成双特异性抗体的方法获得的抗体。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

依照本发明的双特异性二价抗体对需要VEGF和ANG-2靶向疗法的人患者显示益处。依照本发明的抗体具有对患有此类疾病，特别是患有癌症的患者产生益处的高度有价值的特性。依照本发明的双特异性抗体在肿瘤生长抑制和/或抑制肿瘤血管发生或血管疾病中是高度有效的。依照本发明的双特异性二价抗体，依照本发明的双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体显示有价值的药动学/药效学特性，如例如稳定性、良好的(即缓慢的)清除率(例如在低剂量)。

依照本发明的双特异性抗体在下列方面是高度有效的：

a)肿瘤生长抑制(例如，凭借依照本发明的双特异性抗体，与两种单特异性抗体的组合相比，已经可以在更低的浓度实现肿瘤停滞(stasis)(例如，在实施例9和10的Colo205和KPL-4肿瘤模型中，与10mg/kg的ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的组合相比，用10mg/kg的XMAb1已经实现肿瘤停滞)，和/或

b)抑制肿瘤血管发生或血管疾病(例如，与两种单特异性抗体的组合相比，用依照本发明的双特异性抗体已经可以在更低的浓度实现最大抗血管发生果(例如，在实施例8的小鼠角膜血管发生测定法中，与10mg/kg的ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的组合相比，用10mg/kg的XMAb1已经实现最大抗血管发生效果)。

附图简述

图1 Xmab例子的例示性二价双特异性抗体形式，其包含经突起-进入-空穴(Knobs-into-Holes)修饰的CH3域。

图2a OAscFab例子的例示性二价双特异性抗体形式，其包含经突起-进入-空穴修饰的CH3域。

图2b 例子OAscXFab1的例示性二价双特异性抗体形式，其包含经突起-进入-空穴修饰的CH3域。

图2c 例子OAscXFab2和OAscXFab3的例示性二价双特异性抗体形式，其包含经突起-进入-空穴修饰的CH3域。

图3<VEGF-Ang-2>XMab1对VEGF(第1步)，接着结合hAng-2(第二步)的同时结合。

图4用于量化结合活性单抗<Ang2/VEGF>抗体的ELISA原理。

图5用于量化结合活性<Ang2/VEGF>XMab1抗体的ELISA校准曲线。

图6小鼠角膜血管发生测定法：通过施用依照本发明的双特异性抗体抑制血管从缘(limbus)向VEGF梯度长出(outgrowth)。

图7小鼠角膜血管发生测定法：通过施用依照本发明的双特异性抗体抑制从缘(limbus)向VEGF梯度的血管发生/血管-比较双特异<Ang2/VEGF>抗体XMab1、<Ang2>单抗ANG2i-LC06(LC06)、<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合。

图8在人结肠直肠癌Colo205的小鼠异种移植物(小肿瘤)中通过依照本发明的双特异性抗体的体内肿瘤生长抑制：比较双特异<Ang2/VEGF>抗体XMab1、<Ang2>单抗ANG2i-LC06(LC06)、<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合。

图9在人结肠直肠癌Colo205的小鼠异种移植物(大肿瘤)中通过依照本发明的双特异性抗体的体内肿瘤生长抑制：比较双特异<Ang2/VEGF>抗体XMab1、<Ang2>Mab ANG2i-LC06(LC06)、<VEGF>Mab贝伐单抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>Mab贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合。

图10在人乳腺癌KPL-4的小鼠异种移植物(小肿瘤)中通过依照本发明的双特异性抗体的体内肿瘤生长抑制：比较双特异<Ang2/VEGF>抗体XMab 1、<Ang2>单抗ANG2i-LC06(LC06)、<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合。

图11在人乳腺癌KPL-4的小鼠异种移植物(大肿瘤)中通过依照本发明的双特异性抗体的体内肿瘤生长抑制：比较双特异<Ang2/VEGF>抗体XMab 1、<Ang2>单抗ANG2i-LC06(LC06)、<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合。

图12在胃癌N87的小鼠异种移植物中通过依照本发明的双特异性抗体的体内肿瘤生长抑制：比较双特异性<Ang2/VEGF>抗体XMab1、<Ang2>单抗ANG2i-LC06(LC06)、<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>单抗贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合。

发明详述

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO:1作为重链可变域(VH)，和SEQ ID NO:2作为轻链可变域(VL)；且

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的全长抗体的经修饰的重链和经修饰的轻链，其中恒定区CL和CH1彼此替换。

特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体的此双特异性二价抗体形式记载于WO 2009/080253(参见图1中包括经突起-进入-空穴修饰的CH3域的例示性方案)。将基于此双特异性二价抗体形式的抗体在本发明的例子中命名为Xmab。

a)氨基酸序列SEQ ID NO:19作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:17作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:20作为所述第二全长抗体的经修饰的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:18作为所述第二全长抗体的经修饰的轻链。

a)氨基酸序列SEQ ID NO:23作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:21作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:24作为所述第二全长抗体的经修饰的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:22作为所述第二全长抗体的经修饰的轻链。

在一个实施方案中，这类双特异性二价抗体的特征在于包含：

a)氨基酸序列SEQ ID NO:27作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:25作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:28作为所述第二全长抗体的经修饰的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:26作为所述第二全长抗体的经修饰的轻链。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的氨基酸序列。

在本发明的另一个方面，依照本发明的双特异性抗体的特征在于包含：

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N端经由肽接头与轻链的C端连接。

在图2a中显示了特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的此双特异性抗体的此双特异性二价抗体形式的例示性方案，其包含经突起-进入-空穴修饰的CH3域。将基于此双特异性二价抗体形式的抗体在本发明的例子中命名为OascFab。

a)氨基酸序列SEQ ID NO:30作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:31作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:29作为经由肽接头连接的所述第二全长抗体的重链和第二全长抗体的轻链。

a)氨基酸序列SEQ ID NO:33作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:34作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:32作为经由肽接头连接的所述第二全长抗体的重链和第二全长抗体的轻链。

在一个实施方案中，通过在下列位置之间引入二硫键将第二全长抗体的重和轻链的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)进行二硫化物稳定化：重链可变域第44位至轻链可变域第100位(总是依照Kabat的EU索引编号；Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。通过在第二全长抗体重链和轻链的可变区VH和VL之间引入二硫键来实现这类进一步的二硫化物稳定化。在例如WO 94/029350,Rajagopal,V.等,Prot.Engin.10(1997)1453-59;Kobayashi等,Nuclear Medicine&Biology,第25卷(1998)387-393;或Schmidt,M.等,Oncogene 18(1999)1711-1721中描述了引入非天然的二硫桥进行稳定化的技术。

如此，在一个实施方案中，此类双特异性二价抗体的特征在于包含第二全长抗体重链和轻链的可变域之间，即重链可变域第44位和轻链可变域第100位之间的二硫键，并包含

a)氨基酸序列SEQ ID NO:36作为所述第一全长抗体的重链，和氨基酸序列SEQ ID NO:37作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)氨基酸序列SEQ ID NO:35作为经由肽接头连接的所述第二全长抗体的重链和所述第二全长抗体的轻链的。

在本发明的另一个方面，依照本发明的双特异性抗体的特征在于包含

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，

其中重链的N端经由肽接头与轻链的C端连接；且其中可变域VL和VH彼此替换。

在图2b中显示了特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的此双特异性抗体的此双特异性二价抗体形式的例示性方案，其包括经突起-进入-空穴修饰的CH3域。将基于此双特异性二价抗体形式的抗体在本发明的例子中命名为OAscXFab1。

在一个实施方案中，此类双特异性抗体的特征在于包含

a)SEQ ID NO:39作为所述第一全长抗体的重链，和SEQ ID NO:40作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO:38作为经由肽接头连接的所述第二全长抗体的重链和所述第二全长抗体的轻链。

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，

其中重链的N端经由肽接头与轻链的C端连接；且

其中恒定域CL和CH1彼此替换。

在图2c中显示了特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的此双特异性抗体的此双特异性二价抗体形式的例示性方案，其包括经突起-进入-空穴修饰的CH3域。将基于此双特异性二价抗体形式的抗体在例子中命名为OAscXFab2和OAscXFab3。

在一个实施方案中，此类双特异性抗体的特征在于包含

a)SEQ ID NO:42作为所述第一全长抗体的重链，和SEQ ID NO:43作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO:41作为经由肽接头连接的所述第二全长抗体的重链和所述第二全长抗体的轻链。

在一个实施方案中，此类双特异性抗体的特征在于包含

a)SEQ ID NO:45作为所述第一全长抗体的重链，和SEQ ID NO:46作为所述第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO:44作为经由肽接头连接的所述第二全长抗体的重链和所述第二全长抗体的轻链。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

因而，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。

优选地，通过“突起-进入-空穴”技术改变依照本发明的双特异性二价抗体的CH3域，所述“突起-进入-空穴”技术以几个例子更为详细地记载于例如WO 96/027011,Ridgway J.B.等,Protein Eng 9(1996)617-621;和Merchant,A.M.等,Nat Biotechnol 16(1998)677-681。在此方法中，改变两个CH3域的相互作用表面以提高含有这两个CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)这两个CH3域每个都可以是“突起”，而另一个是“空穴”。二硫桥的引入使异二聚体稳定化(Merchant,A.M等,Nature Biotech 16(1998)677-681;Atwell,S.,等.J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产量。

在本发明的一个优选的方面，依照本发明的所有双特异性抗体的特征在于

一条重链的CH3域和另一条重链的CH3域各在包含抗体CH3域之间的初始界面的界面处相遇；

其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：

a)改变一条重链的CH3域，

从而在一条重链的CH3域中与双特异性抗体内另一条重链的CH3域的初始界面相遇的初始界面内，

氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3域的界面内产生突出，该突出可位于另一条重链的CH3域的界面内的穴内，且

b)改变另一条重链的CH3域，

从而在第二CH3域中与双特异性抗体内的第一CH3域的初始界面相遇的初始界面内，

氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内产生穴，第一CH3域的界面内的突出可位于该穴内。

如此，优选地，依照本发明的抗体特征在于

a)的全长抗体的重链CH3域和b)的全长抗体的重链CH3域各在包含抗体CH3域之间的初始界面中的改变的界面处相遇；

其中i)在一条重链的CH3域中，

氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3域的界面内产生突出，该突出可位于另一条重链的CH3域的界面内的穴中，

且其中

ii)在另一条重链的CH3域，

优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。

在本发明的一个方面，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3域的相应位置中的氨基酸，使得可以形成这两个CH3域间的二硫桥来进一步改变这两个CH3域。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含“突起链”的CH3域中的T366W突变和“空穴链”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变。也可以使用CH3域之间的别的链间二硫桥(Merchant,A.M等,Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如，通过将Y349C突变引入“突起链”的CH3域中并将E356C突变或S354C突变引入“空穴链”的CH3域中来进行。

在另一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗体包含在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一个中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在另一个优选的实施方案中，双特异性抗体包含在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(一个CH3域中的额外的Y349C突变和另一个CH3中的额外的E356C或S354C突变，其形成链间二硫桥)(总是依照Kabat的EU索引编号；Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,Public Health Service,N ational Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。而且或者/另外，也可以使用其它突起-进入-空穴技术，如EP 1870459A1描述的。如此，双特异性抗体的另一个例子是“突起链”的CH3域中的R409D;K370E突变和“空穴链”的CH3域中的D399K;E357K突变(总是依照Kabat的EU索引编号；Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含“突起链”的CH3域中的T366W突变和“空穴链”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变以及另外地，“突起链”的CH3域中的R409D、K370E突变和“空穴链”的CH3域中的D399K、E357K突变。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变以及另外地，“突起链”的CH3域中的R409D;K370E突变和“空穴链”的CH3域中的D399K;E357K突变。

在本发明的一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗体的特征在于具有下列一项或多项特性(在如实施例3至7中所描述的测定法中测定)：

-双特异性二价抗体以5nM或更小的结合亲和力的KD值结合VEGF；

-双特异性二价抗体以5nM或更小的结合亲和力的KD值结合ANG-2；

-双特异性二价抗体以15nM或更小的IC50(在一个实施方案中，以10nM或更小的IC50)抑制经Tie2转染的HEK293细胞中ANG-2诱导的Tie2磷酸化；

-双特异性二价抗体以20nM或更小的IC50(在一个实施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制ANG-2对Tie2的结合；

-双特异性二价抗体以20nM或更小的IC50(在一个实施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制VEGF对VEGF受体的结合；

-双特异性二价抗体以10nM或更小的IC50(在一个实施方案中，以5nM或更小的IC50)抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体的特征在于包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO:3作为重链可变域(VH)，和SEQ ID NO:4作为轻链可变域(VL)；

且具有下列一项或多项特性(在如实施例3至7中所描述的测定法中测定)：

-双特异性二价抗体以5nM或更小的结合亲和力的KD值结合VEGF；

在本发明的一个方面，依照本发明的此类双特异性抗体的特征在于包含

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的全长抗体的经修饰的重链和经修饰的轻链，其中恒定区CL和CH1彼此替换；

-双特异性二价抗体以5nM或更小的结合亲和力的KD值结合VEGF；

在一个实施方案中，双特异性二价抗体的特征在于包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO:1且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代作为重链可变域(VH)，和SEQ ID NO:2且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代作为轻链可变域(VL)；且

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO:3且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代作为重链可变域(VH)，和SEQ ID NO:4且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代作为轻链可变域(VL)。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体的特征在于包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于：

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO:3且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代作为重链可变域(VH)，和SEQ ID NO:4且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代作为轻链可变域(VL)；

且具有下列一项或多项特性(在测如实施例3至7中所描述的定法中测定)：

-双特异性二价抗体以5nM或更小的结合亲和力的KD值结合VEGF；

在本发明的一个方面，依照本发明的双特异性抗体的特征在于包含

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

且其中所述第一全长抗体的重链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代，且所述第一全长抗体的轻链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代，和

b)特异性结合ANG-2的全长抗体的经修饰的重链和经修饰的轻链，其中恒定域CL和CH1彼此替换，

且其中所述第二全长抗体的经修饰的重链包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代，且所述第二全长抗体的经修饰的轻链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代。

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，

且其中所述第二全长抗体的经修饰的重链包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且在CDR在具有不超过1处氨基酸残基替代，且所述第二全长抗体的经修饰的轻链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列且在CDR中具有不超过1处氨基酸残基替代；

-双特异性二价抗体以5nM或更小的结合亲和力的KD值结合VEGF；

如本文中使用的，“抗体”指包含抗原结合位点的结合蛋白。如本文中使用的，术语“结合位点”或“抗原结合位点”指抗体分子中配体实际结合的区域。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)(VH/VL对)。

抗体特异性指抗体对特定抗原表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。

依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体对两种不同抗原，即作为第一抗原的VEGF和作为第二抗原的ANG-2是特异性的。

如本文中所使用的，术语“单特异性”抗体指具有各自结合相同抗原的同一表位的一个或多个结合位点的抗体。

如本申请内使用的，术语“价”指抗体分子中存在规定数目的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别指抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。依照本发明的双特异性抗体是“二价的”。

如本文中所使用的，术语“VEGF”指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID NO:47)，其记载于例如Leung,D.W.等,Science 246(1989)1306-9;Keck,P.J.等,Science 246(1989)1309-12和Connolly，D.T.等,J.Biol.Chem.264(1989)20017-24。VEGF牵涉调节正常的和异常的血管发生和与肿瘤和眼内病症有关的新血管化(Ferrara,N.等,Endocr.Rev.18(1997)4-25;Berkman,R.A.等,J.Clin.Invest.91(1993)153-159;Brown,L.F.等,HumanPathol.26(1995)86-91;Brown,L.F.等,Cancer Res.53(1993)4727-4735;Mattern,J.等,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934;及Dvorak,H.F.等,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是已经自数个来源分离的同二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。

如本文中所使用的，术语“ANG-2”指血管生成素-2(ANG-2)(或缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ ID NO:48)，其记载于例如Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等,Genomics 48(1998)389-91。发现血管生成素-1和-2为Tie(即，一种在血管内皮内选择性表达的酪氨酸激酶家族)的配体。Yancopoulos,G.D.等,Nature 407(2000)242-48。目前血管生成素家族有四种确定的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可以代表小鼠和人中相同基因基因座的广泛趋异的对应物。Kim,I.等,FEBS Let,443(1999)353-56;Kim,I.等,J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初是在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂鉴定的(参见，对于ANG-1:Davis,S.等,Cell 87(1996)1161-69;和对于ANG-2:Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60)。所有已知的血管生成素主要结合Tie2，而Ang-1和-2两者都以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2。Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60。

本发明的双特异性抗体的抗原结合位点含有6个互补决定区(CDR)，其以不同程度促成结合位点对抗原的亲和力。存在着3个重链可变域CDR（CDRH1、CDRH2和CDRH3）和3个轻链可变域CDR（CDRL1、CDRL2和CDRL3）。通过与汇编的氨基酸序列数据库比较来确定CDR和框架区(FR)的范围，在所述数据库中已经依照序列间的可变性限定那些区域。本发明的范围内还包括由更少的CDR组成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由3、4或5个CDR决定)。例如，小于完整的一组6个CDR对于结合可以是足够的。在一些情况中，VH或VL域会是足够的。

本发明的抗体进一步包含一种或多种免疫球蛋白类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE同种型及在IgG和IgA的情况中包括其亚型。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子制备物。

术语“嵌合抗体”指包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的抗体，其通常通过重组DNA技术来制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中的恒定区已经自初始抗体的恒定区修饰或改变以生成依照本发明的特性（特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合）的。此类嵌合抗体又称为“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组DNA和基因转染技术，其是本领域中公知的。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238和US 5,204,244。

术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等,Nature 332(1988)323-327;及Neuberger,M.S.等,Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于那些代表识别上文关于嵌合抗体所记录的抗原的序列的。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性（特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合）的。

如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。还可以在转基因动物（例如小鼠）中生成人抗体，所述转基因动物在免疫后能够在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体的完整全集或选集。在此类种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列会导致抗原考验后人抗体的生成（参见例如Jakobovits,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等,Nature 362(1993)255-258;Brueggemann,M.等,YearImmunol.7(1993)33-40)。还可以在噬菌体展示文库中生成人抗体(Hoogenboom,H.R.,和Winter,G.J.,Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole,A.等及Boerner,P等的技术还可用于制备人单克隆抗体(Cole,A.等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Liss,A.L.,第77页(1985);及Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已经关于依照本发明的嵌合的和人源化的抗体所提及的，如本文中所使用的，术语“人抗体”还包含此类如下的抗体，其在恒定区中进行修饰以生成依照本发明的特性（特别地关于C1q结合/或FcR结合），例如通过“类转换”，即Fc部分的变化或突变（例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变）来实现。

如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或自人免疫球蛋白基因的转基因动物（例如小鼠）分离的抗体或使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞高突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下的序列，其尽管自人种系VH和VL序列衍生和与之相关，但是可以不在体内的人抗体种系全集内天然存在。

如本文中所使用的，“可变域”（轻链可变域(VL)、重链可变域(VH)）意指直接牵涉抗体对抗原结合的每对轻链和重链。人轻链和重链可变域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过3个“高变区”（或互补决定区，CDR）连接的4个序列广泛保守的框架(FR)区。框架区采用β-片层构象，而CDR可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供本发明的又一个目的。

术语“抗体的抗原结合部分”或“高变区”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是那些与如本文中定义的高变区残基不同的可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含N至C端的域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。每条链上的CDR被此类框架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。依照Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义来确定CDR和FR区(包括依照Kabat的EU索引的编号，在下文中缩写为依照Kabat的编号)。

如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在使用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定法(BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)（实施例3）中抗体对抗原（人VEGF或人ANG-2）表位的结合。通过术语ka（来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、k_D（解离常数）、和K_D(k_D/ka)来限定结合亲和力。在一个实施方案中，结合或特异性结合意味着10^-8mol/l或更小，优选10^-9M至10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。

术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。

在某些实施方案中，在抗体优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，其被说成特异性结合抗原。

术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体(参见图1)。“全长抗体重链”是以N端至C端方向由抗体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定域2(CH2)、和抗体重链恒定域3(CH3)(缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3)；和任选地，抗体重链恒定域4(CH4)(在亚类IgE的抗体的情况中)组成的多肽。优选地，“全长抗体重链”是以N端至C端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是以N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。两条全长抗体链经由CL域和CH1域之间的以及全长抗体重链铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的例子是天然抗体，如IgG(例如IgG 1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。依照本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合化的(chimerized)或人源化的抗体。依照本发明的全长抗体包含各由一对VH和VL形成的两个抗原结合位点，它们都特异性结合相同抗原。所述全长抗体的重链或轻链的C端指所述重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指所述重链或轻链的N端的最后一个氨基酸。

如本发明内所使用的，术语“肽接头”指具有氨基酸序列的肽，其优选是合成起源的。依照本发明的这些肽用于经由肽接头将轻链的C端与第二全长抗体(其特异性结合第二抗原)的重链N端连接。第二全长抗体重链和轻链内的肽接头是具有长度为至少30个氨基酸，优选地长度为32至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述接头是具有长度为32至40个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，(x=3，n=8、9或10且m=0、1、2或3)或(x=4且n=6、7或8且m=0、1、2或3)，优选地x=4，n=6或7且m=0、1、2或3，更优选地x=4、n=7且m=2。在一个实施方案中，所述接头是(G₄S)₆G₂。

如本申请内所使用的，术语“恒定区”意指抗体中与可变区不同的域的总和。恒定区不直接牵涉抗原的结合，但是展现出多种效应器功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体分成类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可以进一步分成亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的抗体对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ、和μ。可以在所有5种抗体类别中都找到的轻链恒定区称作κ（卡帕）和λ（拉姆达）。

如本申请中所使用的，术语“自人起源衍生的恒定区”意指亚类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的人抗体的重链恒定区和/或轻链κ或λ恒定区。此类恒定区是现有技术中公知的，并且例如由Kabat,E.A.（参见例如Johnson，G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218;Kabat,E.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788）描述。

优选地，依照本发明的双特异性二价抗体具有人IgG1亚类的恒定区。

虽然IgG4亚类的抗体显示降低的Fc受体(FcgRIIIa)结合，但是其它IgG亚类的抗体显示结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（丧失Fc碳水化合物）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、和His435是在改变时也提供降低的Fc受体结合的残基(Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund,J.等,FASEBJ.9(1995)115-119;Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324;EP 0307434)。

在一个实施方案中，依照本发明的抗体与IgG1抗体相比具有降低的FcR结合，而双特异性二价抗体就FcR结合而言是IgG4亚类的或具有S228、L234、L235和/或D265中的突变的IgG1亚类的，和/或含有PVA236突变。在一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，双特异性二价抗体中的突变在IgG4 S228P和L235E中及在IgG1L234A和L235A中。

在本发明的另一个方面，双特异性二价抗体的特征在于包含

a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，

其中所述重链的N端经由肽接头与所述轻链的C端连接；且

其中可变域VL和VH或恒定域CL和CH1彼此替换。

优选地，通过“突起-进入-空穴”技术改变此双特异性二价抗体形式的CH3域，所述“突起-进入-空穴”技术以几个例子更为详细地记载于例如WO 96/027011,Ridgway J.B.等,Protein Eng 9(1996)617-621;和Merchant,A.M.等,Nat Biotechnol 16(1998)677-681。在此方法中，改变两个CH3域的相互作用表面以提高含有这两个CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3域每个都可以是“突起”，而另一个是“空穴”。二硫桥的引入使异二聚体稳定化(Merchant,A.M等,Nature Biotech 16(1998)677-681;Atwell,S.,等.J.Mol.Biol.270(1997)26–35)并增加产量。关于更多详情和实施方案，见上文。

在本发明的另一个方面，双特异性二价抗体的特征在于包含

a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，

其中所述重链的N端经由肽接头与所述轻链的C端连接；且

其中可变域VL和VH彼此替换。

在图2b中显示了此双特异性二价抗体的例示性方案，其包括经突起-进入-空穴修饰的CH3域。基于此双特异性二价抗体形式的抗体在例子中命名为OAscXFab1。

在一个实施方案中，此类双特异性抗体的特征在于包含

a)SEQ ID NO:39作为所述第一全长抗体的重链，和SEQ ID NO:40作为所述第一全长抗体的轻链，且

在本发明的另一个方面，双特异性二价抗体的特征在于包含

a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，

其中所述重链的N端经由肽接头与所述轻链的C端连接；且其中恒定域CL和CH1彼此替换。

在图2c中显示了此双特异性二价抗体形式的抗体的例示性方案，其包括经突起-进入-空穴的修饰的CH3域。基于此双特异性二价抗体形式的抗体在例子中命名为OAscXFab2和OAscXFab3。

在一个实施方案中，此类双特异性抗体的特征在于包含

通过重组手段来生成依照本发明的抗体。如此，本发明的一方面是编码依照本发明的抗体的核酸，而又一方面是包含所述编码依照本发明的抗体的核酸的细胞。用于重组生成的方法是现有技术中普遍已知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体，并且通常纯化至药学可接受纯度。对于在宿主细胞中如前述那样表达抗体，通过标准的方法将编码各经修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞，如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母、或大肠杆菌细胞中实施表达，并且自细胞（上清液或裂解后的细胞）回收抗体。用于重组生成抗体的通用方法是现有技术中公知的，并且例如记载于综述文章Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.等,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。

因而，本发明的一个实施方案是用于制备依照本发明的双特异性抗体的方法，包含下列步骤：

a)用包含编码所述抗体的核酸分子的载体转化宿主细胞；

b)在允许所述抗体分子合成的条件下培养所述宿主细胞；并

c)从所述培养物中回收所述抗体分子。

通过常规的免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析来自培养液适当地分离双特异性抗体。容易使用常规规程将编码单克隆抗体的DNA和RNA分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入表达载体中，然后将所述表达载体转染入在其它情况中不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，以获得重组单克隆抗体在宿主细胞中的合成。

通过将合适的核苷酸变化引入抗体DNA中，或者通过核苷酸合成来制备双特异性抗体的氨基酸序列变体（或突变体）。然而，仅可以在非常有限的范围中实施此类修饰。例如，修饰不改变上文所提及的抗体特征诸如IgG同种型和抗原结合，但是可以改善重组生成的产量、蛋白质稳定性或者便于纯化。

如本申请中所使用的，术语“宿主细胞”意指可以工程化改造以生成依照本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞。如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传递的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。

例如，Barnes,L.M.等,Cytotechnology 32(2000)109-123;Barnes,L.M.等,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述了NS0细胞中的表达。例如，Durocher，Y.等,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述了瞬时表达。Orlandi,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837;Carter，P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289;及Norderhaug,L.等,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述了可变域的克隆。Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.,于Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger，E.-J.,于J.Immunol.Methods 194(1996)191-199描述了一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)。

适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵基因序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时，它是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

通过标准的技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域中公知的其它技术来实施抗体纯化以消除细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel,F.等编Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。不同方法是完善建立的，并且广泛用于蛋白质纯化，诸如用微生物蛋白质的亲和层析（例如，蛋白A或蛋白G亲和层析）、离子交换层析（例如，阳离子交换（羧甲基树脂）、阴离子交换（氨乙基树脂）和混合模式交换）、亲硫性吸附（例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体）、疏水性相互作用或芳香族吸附层析（例如，用苯基-Sepharose、亲氮杂芳烃性树脂(aza-arenophilicresin)、或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析（例如，用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料）、大小排阻层析、和电泳方法（诸如凝胶电泳、毛细管电泳）(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

现在已经发现依照本发明的针对人VEGF和人ANG-2的双特异性抗体具有有价值的特征，诸如高度稳定性和有价值的药动学/药效学特性，例如良好的(即缓慢的)清除率(例如在低剂量)。

依照本发明的双特异性二价抗体对需要VEGF和ANG-2靶向疗法的人患者显示益处。

此外，它们具有生物学或药理学活性，并且显示体内肿瘤生长抑制和/或对肿瘤血管发生的抑制。

依照本发明的双特异性抗体对下列方面是高度有效的

a)肿瘤生长抑制(例如，与两种单特异性抗体的组合相比，凭借依照本发明的双特异性抗体已经可以在更低的浓度实现肿瘤停滞(stasis)(例如，在实施例9和10的COLO205和KPL-4肿瘤模型中，与10mg/kg的ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的组合相比，用10mg/kg的XMAb1已经实现肿瘤停滞)，和/或

b)对肿瘤血管发生或血管疾病的抑制(例如，与两种单特异性抗体的组合相比，用依照本发明的双特异性抗体已经可以在更低的浓度实现最大抗血管生成效果(例如，在实施例8的小鼠角膜血管发生测定法中，与10mg/kg的ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的组合相比，用10mg/kg的XMAb1已经实现最大抗血管生成效果)。

最终，依照本发明的针对人VEGF和人ANG-2的二价双特异性可以具有有价值的效力/毒性谱，而且可以为需要抗VEGF和抗ANG-2疗法的患者提供益处。

本发明的一个方面是包含依照本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制造药物组合物的用途。本发明的又一个方面是制造包含依照本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面，本发明提供了含有与药用载体一起配制的依照本发明的抗体的组合物，例如药物组合物。

本发明的一个实施方案是依照本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症。

本发明的另一个方面是所述药物组合物，其用于治疗癌症。

本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途。

本发明的另一个方面是通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的抗体来治疗患有癌症的患者的方法。

本发明的另一个方面是所述药物组合物，其用于预防转移。

本发明包括依照本发明的双特异性抗体，其用于预防转移。

本发明的另一个方面是依照本发明的双特异性抗体用于制造用于预防转移的药物的用途。

本发明的另一个方面是在患有原发性癌症的患者中预防转移的方法，其通过对需要此类预防治疗的患者施用依照本发明的双特异性抗体来进行。

我们可以在正位(orthotopic)和皮下癌症模型中在体内显示对自发性转移/继发性肿瘤的高度有效预防(参见实施例9)(与i.v.注射肿瘤细胞的实验模型形成对比。这与细胞自原发性肿瘤散布并转移到继发性器官，如肺或肝(继发性肿瘤)的临床情况相似。

依照本发明的术语“转移”指癌性细胞从原发性肿瘤传送到患者中的别处，然后在那里形成一个或多个部位的继发性肿瘤。测定癌症是否已经转移的手段是本领域中已知的，并且包括骨扫描、胸部X射线(chest X-ray)、CAT扫描、MRI扫描和肿瘤标志物测试。

如本文中所使用的，术语“预防转移”或“预防继发性肿瘤”具有相同的含义，并且指以抑制或降低癌性细胞从原发性肿瘤进一步传送到患者中别处的一个或多个部位的此方式针对患有癌症的患者中的转移的防范剂。这意味着阻止、延迟或降低原发性肿瘤或癌症的转移，并且如此阻止、延迟或降低继发性肿瘤的形成。优选地，肺转移，即继发性肿瘤得到阻止或降低，这意味着癌性细胞从原发性肿瘤到肺的转移性传送得到阻止或降低。

如本文中所使用的，“药用载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂，等等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用（例如通过注射或输注）。

可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。如熟练技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发明的化合物，可能有必要用某种材料包被化合物，或者与某种材料共施用化合物以阻止其失活。例如，可以将化合物在合适的载体，例如脂质体或稀释剂中对受试者施用。药学可接受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。

如本文中所使用的，短语“胃肠外施用”意指通常通过注射进行的与肠和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

如本文中所使用的，术语癌症指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolarcell lung cancer)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌(cancer of the head or neck)、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌(cancer of the analregion)、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes)、子宫内膜癌(carcinoma of theendometrium)、宫颈癌(carcinoma of the cervix)、阴道癌(carcinoma of thevagina)、外阴癌(carcinoma of the vulva)、霍奇金氏病(Hodgkin’s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis)、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌(biliary cancer)、中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤(astrocytoma)、施万细胞瘤(schwanomas)、室管膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、脑脊膜瘤(meningioma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、垂体腺瘤(pituitary adenoma)和尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。

本发明的另一个方面是依照本发明的双特异性抗体或所述药物组合物作为抗血管生成剂。可以使用此类抗血管生成剂来治疗癌症，特别是实体瘤和其它血管疾病。

本发明的一个实施方案是依照本发明的双特异性抗体，其用于治疗血管疾病。

本发明的另一个方面是用于治疗血管疾病的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制造用于治疗血管疾病的药物的用途。

本发明的另一个方面是通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的抗体来治疗患有血管疾病的患者的方法。

术语“血管疾病”包括癌症、炎性疾病、动脉粥样硬化(Atherosclerosis)、缺血(Ischemia)、创伤、败血症、COPD、哮喘、糖尿病、AMD、视网膜病变、中风、肥胖、急性肺损伤、出血、血管渗漏(Vascular leak)，例如细胞因子诱导的，变态反应、格雷夫斯(Graves)病、桥本氏自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞动脉炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、克罗恩(Crohn)氏病、多发性硬化、溃疡性结肠炎，特别是实体瘤的，眼内新血管综合征，诸如增殖性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman,J.等,J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934;Klagsbrun,M.等,Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239;和Garner,A.,Vascular diseases,于：Pathobiology of ocular disease,A dynamicapproach,Garner,A.和Klintworth,G.K.,(编),第二版,Marcel Dekker,NewYork(1994),第1625页-第1710页)。

这些组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过无菌规程，见上文，及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等来确保阻止微生物的存在。还可能期望将等张剂，诸如糖、氯化钠等纳入组合物中。另外，可以通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式的吸收延迟。

不管选择的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物（其可以以合适的水合形式使用）和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。

可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平，从而获得对于实现特定患者的期望的治疗响应、组成、和施用模式有效的，而对患者无毒的活性成分量。选定的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前的医学史等医学领域公知的因素。

组合物必须是无菌的，而且是流体的，其程度使得组合物通过注射器可投递。在水外，载体优选地是等张缓冲盐水溶液。

可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包含等张剂（例如糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化钠）。

如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有与在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。在意图独特的名称的情况中，其从上下文看会是明显的。

如本文中所使用的，术语“转化”指将载体/核酸转移入宿主细胞中的过程。若使用没有难以应付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，则例如通过磷酸钙沉淀法来实施转染，如Graham,F.L.,van der Eb,A.J.,Virology 52(1973)546-467所描述的。然而，也可以使用其它用于将DNA导入细胞中的方法，诸如通过核注射或者通过原生质体融合来进行。若使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的细胞，则例如一种转染方法是使用氯化钙进行的钙处理，如Cohen,S.N.等,PNAS.69(1972)2110-2114所描述的。

如本文中所使用的，“表达”指将核酸转录成mRNA的过程和/或随后将转录的mRNA（又称为转录物）翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。若多核苷酸是自基因组DNA衍生的，则真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”指将插入的核酸分子转移入宿主细胞中和/或在宿主细胞间转移的核酸分子，特别是自我复制的。该术语包括主要在将DNA或RNA插入细胞（例如，染色体整合）方面发挥功能的载体、主要在DNA或RNA复制方面发挥功能的复制载体、和在DNA或RNA的转录和/或翻译方面发挥功能的表达载体。还包括提供超过一种功能的载体，如所描述的。

“表达载体”指在导入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常指包含能发挥功能以产生期望的表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。

提供以下实施例、序列表和图以帮助理解本发明，其实际范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规程做出修改。

序列表(氨基酸序列)的描述

SEQ ID NO:1 <VEGF>贝伐单抗的重链可变域VH

SEQ ID NO:2 <VEGF>贝伐单抗的轻链可变域VL

SEQ ID NO:3 <ANG-2>E6Q的重链可变域VH

SEQ ID NO:4 <ANG-2>E6Q的轻链可变域VL

SEQ ID NO:5 XMab1-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:6 XMab1-<ANG2>轻链

SEQ ID NO:7 XMab1-<VEGF>重链

SEQ ID NO:8 XMab1-<ANG2>重链

SEQ ID NO:9 XMab2-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:10 XMab2-<ANG2>轻链

SEQ ID NO:11 XMab2-<VEGF>重链

SEQ ID NO:12 XMab2-<ANG2>重链

SEQ ID NO:13 XMab3-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:14 XMab3-<ANG2>轻链

SEQ ID NO:15 XMab3-<VEGF>重链

SEQ ID NO:16 XMab3-<ANG2>重链

SEQ ID NO:17 XMab4-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:18 XMab4-<ANG2>轻链

SEQ ID NO:19 XMab4-<VEGF>重链

SEQ ID NO:20 XMab4-<ANG2>重链

SEQ ID NO:21 XMab5-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:22 XMab5-<ANG2>轻链

SEQ ID NO:23 XMab5-<VEGF>重链

SEQ ID NO:24 XMab5-<ANG2>重链

SEQ ID NO:25 XMab6-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:26 XMab6-<ANG2>轻链

SEQ ID NO:27 XMab6-<VEGF>重链

SEQ ID NO:28 XMab6-<ANG2>重链

SEQ ID NO:29 OAscFab1-肽连接的<ANG2>重链和轻链

SEQ ID NO:30 OAscFab1-<VEGF>重链

SEQ ID NO:31 OAscFab1-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:32 OAscFab2-肽连接的<ANG2>重链和轻链

SEQ ID NO:33 OAscFab2-<VEGF>重链

SEQ ID NO:34 OAscFab2-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:35 OAscFab3-肽连接的<ANG2>重链和轻链

SEQ ID NO:36 OAscFab3-<VEGF>重链

SEQ ID NO:37 OAscFab3-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:38 OAscXFab1-肽连接的<ANG2>重链和轻链

SEQ ID NO:39 OAscXFab1-<VEGF>重链

SEQ ID NO:40 OAscXFab1-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:41 OAscXFab2-肽连接的<ANG2>重链和轻链

SEQ ID NO:42 OAscXFab2-<VEGF>重链

SEQ ID NO:43 OAscXFab2-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:44 OAscXFab3-肽连接的<ANG2>重链和轻链

SEQ ID NO:45 OAscXFab3-<VEGF>重链

SEQ ID NO:46 OAscXFab3-<VEGF>轻链

SEQ ID NO:47 人血管内皮生长因子(VEGF)

SEQ ID NO:48 人血管生成素-2(ANG-2)

实施例

材料和通用方法

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸依照EU编号方式(Edelman,G.M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85;Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991))编号并提及。

重组DNA技术

使用标准的方法来操作DNA，如记载于Sambrook,J.等,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989的。依照制造商的指令使用分子生物学试剂。

基因合成

可以自通过化学合成生成的寡核苷酸制备期望的基因区段。通过寡核苷酸的退火和连接，包括PCR扩增，随后经由指定的限制性位点，例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆入基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中来装配基因区段，其侧翼有单一的限制性内切核酸酶切割位点。通过DNA测序来确认亚克隆的基因片段的DNA序列。

依照给定的规格在Geneart(Regensburg,Germany)定购基因合成片段。编码Ang-2/VEGF双特异性抗体的轻链和重链的所有基因区段都被合成为具有编码前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’端DNA序列，和合成的基因的5’和3’端的独特限制性位点，所述前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。携带二硫化物稳定化的经“突起-进入-空穴”修饰的重链的DNA序列设计为在“突起”重链中具有S354C和T366W及在“空穴”重链中具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变。

DNA序列测定

通过在MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten,Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。

DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理

使用GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)软件包第10.2版和Infomax的Vector NT1高级套件第8.0版来进行序列创建、定位、分析、注释和例示。

表达载体

对于所描述的抗体的表达，应用用于瞬时表达（例如在HEK293EBNA或HEK293-F细胞中）或用于稳定表达（例如在CHO细胞中）的表达质粒的变体，其基于具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造或基于具有CMV启动子的基因组构造（见图2B）。

在抗体表达盒外，载体含有：

-复制起点，其容许此质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。抗体基因的转录单元由下列元件构成：

-5’端的独特限制性位点

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，

-在cDNA构造的情况中接着有内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人抗体链（重链、经修饰的重链或轻链），其作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子构造的基因组构造

-具有多腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和

-3’端的独特限制性位点。

为了瞬时的和稳定的转染，通过来自经转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)。

细胞培养技术

使用标准的细胞培养技术，如记载于Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编),John Wiley & Sons,Inc的。

HEK293-F系统中的瞬时转染

依照制造商的用法说明书(Invitrogen,USA)使用FreeStyle^TM 293表达系统通过瞬时转染人胚肾293-F细胞表达重组免疫球蛋白变体。简言之，在37°C/8% CO₂在FreeStyle^TM 293表达培养基中培养悬浮FreeStyle^TM 293-F细胞，并将细胞在转染当天以1-2x10⁶个活细胞/ml的密度在新鲜的培养基中接种。对于用于单特异性亲本抗体的250ml转染终体积，以1:1摩尔比率使用325μl 293fectin^TM(Invitrogen,Germany)和250μg重链和轻链质粒DNA在

I培养基(Invitrogen,USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物。对于250ml转染终体积(OAscFab和OAscXFab)，一般以1∶1:1摩尔比率使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen,Germany)和250μg的“突起-进入-空穴”重链1和2以及轻链质粒DNA在

I培养基(Invitrogen,USA)中制备具有两种重链和一种轻链的“突起-进入-空穴”DNA-293fectin^TM复合物。为了表达产率优化，可以改变所述比率。对于250ml转染终体积，以1:1:1:1摩尔比率使用325μl 293fectin^TM(Invitrogen,Germany)和250μg“突起-进入-空穴”重链1和2以及轻链质粒DNA在

I培养基(Invitrogen,USA)中制备XMabDNA-293fectin复合物。为了表达产率优化，可以改变所述比率。在转染后7天通过以14000g离心30分钟收获含有抗体的细胞培养上清液，并将其过滤流过无菌滤器(0.22μm)。将上清液于-20°C贮存，直至纯化。

蛋白质测定

使用依照Pace,C.N.等,Protein Science,4(1995),2411-1423基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定280nm的光密度(OD)来测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。

上清液中的抗体浓度测定

通过用蛋白A琼脂糖珠(Roche)的免疫沉淀来评估细胞培养上清液中的抗体和衍生物的浓度。将60μL蛋白A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,1%Nonidet-P40)中清洗三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清液应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠。于室温温育1小时后，将珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon]上用0.5mL TBS-NP40清洗一次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2xPBS,Roche)清洗两次，并用0.5mL 100mM钠的柠檬酸盐pH5,0短暂清洗4次。通过添加35μl

LDS样品缓冲液(Invitrogen)来洗脱结合的抗体。分别将样品的一半与

样品还原剂组合或者保持未还原，并于70°C加热10分钟。因此，将20μl应用于4-12%

Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)（对于非还原性SDS-PAGE用MOPS缓冲液，而对于还原性SDS-PAGE用含抗氧化剂运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液），并用考马斯蓝染色。

通过蛋白A-HPLC层析测量细胞培养上清液中的抗体和衍生物的浓度。简言之，在Dionex HPLC系统上，将含有结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养上清液应用于50mM K2HPO4,300mM NaCl,pH7.3中的HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare)，并用550mM柠檬酸,pH2.5自基质洗脱。通过UV吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。纯化的标准IgG1抗体充当标准品。

或者，通过三明治式-IgG-ELISA来测量细胞培养物上清液中的抗体和衍生物的浓度。简言之，用100μL/孔0.1μg/mL的生物素化的抗人IgG捕捉分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)包被StreptaWell高结合链霉亲合素A-96孔微量滴定板(Roche)，于室温持续1小时或者备选地于4°C过夜，随后用200μL/孔PBS、0.05%Tween(PBST,Sigma)清洗三次。将100μL/孔各含有抗体的细胞培养物上清液在PBS(Sigma)中的稀释系列添加至孔，并在微量滴定板摇动器上于室温温育1-2小时。将孔用200μL/孔PBST清洗三次，并用100μl 0.1μg/mL的F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体在微量滴定板摇动器上于室温检测结合的抗体达1-2小时。用200μL/孔PBST将未结合的检测抗体洗掉三次，并通过添加100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗体。在Tecan Fluor光谱仪上以405nm的测量波长（参照波长492nm）实施吸光度测定。

双特异性抗体的纯化

通过使用蛋白A-Sepharose^TM(GE Healthcare,Sweden)的亲和层析和Superdex200大小排阻层析自细胞培养上清液纯化双特异性抗体。简言之，将无菌过滤的细胞培养上清液应用于用PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄,1mMKH₂PO₄,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH7.4)平衡的HiTrap蛋白A HP(5ml)柱上。用平衡缓冲液将未结合的蛋白质洗掉。用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH2.8将抗体和抗体变体洗脱，并用0.1ml 1M Tris,pH8.5将含有蛋白质的级分中和。然后，将洗脱的蛋白质级分合并，用Amicon Ultra离心滤器装置(MWCO:30K,Millipore)浓缩成3ml体积，并在用20mM组氨酸、140mM NaCl,pH6.0平衡的Superdex200HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare,Sweden)上加载。将含有具有小于5%高分子量聚集体的纯化的双特异性抗体的级分合并，并于-80°C以1.0mg/ml等分试样贮存。

SDS-PAGE

依照制造商的用法说明书使用

预制凝胶系统(Invitrogen)。具体地，使用4-20%

TRIS-甘氨酸预制凝胶和

TRIS-甘氨酸SDS运行缓冲液(参见，例如图3)。通过添加

样品还原剂实现样品的还原，之后运行凝胶。

分析用大小排阻层析

通过HPLC层析来实施用于测定抗体的聚集和寡聚状态的大小排阻层析。简言之，将蛋白A纯化的抗体应用于Agilent HPLC 1100系统上在300mMNaCl、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，pH7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或者应用于Dionex HPLC系统上在2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积级分来量化洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品（见例如图4）。

质谱术

经由电喷射离子化质谱术(ESI-MS)来测定并确认交换抗体的总脱糖基化质量。简言之，将100μg纯化的抗体用50mU在100mM KH₂PO₄/K₂HPO₄,pH7中的N-糖苷酶F(PNGaseF,ProZyme)于37°C以多至2mg/ml的蛋白质浓度脱糖基化12-24小时，随后经由Sephadex G25柱(GE Healthcare)上的HPLC脱盐。脱糖基化并还原后，通过ESI-MS来测定重链和轻链各自的质量。简言之，将115μl中的50μg抗体与60μl 1M TCEP和50μl 8M盐酸胍一起温育，随后脱盐。在装备有NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上经由ESI-MS来测定总质量和还原的重链和轻链的质量。

HEK293-Tie2细胞系的生成

为了测定血管生成素-2抗体对ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的干扰及ANGPT2对细胞上的Tie2的结合，生成重组HEK293-Tie细胞系。简言之，使用Fugene(Roche Applied Science)作为转染试剂将在CMV启动子和新霉素抗性标志物控制下编码全长人Tie2(SEQ ID 108)的基于pcDNA3的质粒(RB22-pcDNA3Topo hTie2)转染入HEK293细胞(ATCC)中，并在DMEM 10%FCS,500μg/ml G418中选择抗性细胞。经由克隆圆筒分离个别的克隆，随后通过FACS来分析Tie2表达。克隆22鉴定为即使在没有G418的情况中也具有高的且稳定的Tie2表达的克隆(HEK293-Tie2克隆22)。随后，使用HEK293-Tie2克隆22来进行细胞测定法：ANGPT2诱导的Tie2磷酸化和ANGPT2细胞配体结合测定法。

ANGPT2诱导的Tie2磷酸化测定法

依照以下测定法原理来测量ANGPT2抗体对ANGPT2诱导的Tie2磷酸化的抑制。在没有或存在ANGPT2抗体的情况中用ANGPT2刺激HEK293-Tie2克隆22达5分钟，并通过三明治式ELISA来量化P-Tie2。简言之，将每孔2x10⁵个HEK293-Tie2克隆22细胞在经聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上在100μl DMEM、10%FCS、500μg/ml遗传霉素中培养过夜。次日，在微量滴定板中制备ANGPT2抗体的滴定行（4倍浓缩的，75μl终体积/孔，一式两份），并将其与75μlANGPT2(R&D systems#623-AN]稀释（3.2μg/ml作为4倍浓缩溶液）混合。将抗体和ANGPT2于室温预温育15分钟。将100μl混合物添加至HEK293-Tie2克隆22细胞（与1mM NaV₃O₄，Sigma#S6508一起预温育5分钟)，并于37°C温育5分钟。随后，将细胞用每孔200μl冰冷的PBS+1mM NaV₃O₄来清洗，并通过添加冰上的每孔120μl裂解缓冲液(20mM Tris,pH8.0、137mMNaCl、1%NP-40、10%甘油、2mM EDTA、1mM NaV₃O₄、1mM PMSF和10μg/ml抑肽酶(Aprotinin))来裂解。将细胞于4°C在微量滴定板摇动器上裂解30分钟，并在没有先前离心的情况中及在没有总蛋白质测定的情况中将100μl溶胞物直接转移入p-Tie2ELISA微量滴定板(R&D Systems,R&D#DY990)中。依照制造商的指令来量化P-Tie2量，并使用Excel的XLfit4分析插件程序（剂量-响应一位点，205模型）来测定抑制的IC50值。IC50值可以在一个实验内比较，但是在实验间可能存在变化。

VEGF诱导的HUVEC增殖测定法

选择VEGF诱导的HUVEC（人脐静脉内皮细胞，Promocell#C-12200）增殖以测量VEGF抗体的细胞功能。简言之，将每96孔5000个HUVEC细胞（低传代数目，小于等于5次传代）在经胶原I包被的BD Biocoat胶原I 96孔微量滴定板(BD#354407/35640)中在100μl饥饿培养基（EBM-2内皮基础培养基2、Promocell#C-22211,0.5%FCS、青霉素/链霉素）中温育过夜。将变化浓度的抗体与rhVEGF(30ng1/ml终浓度，BD#354107)混合，并于室温预温育15分钟。随后，将混合物添加至HUVEC细胞，并将它们于37°C,5%CO₂温育72小时。在分析当天，将平板平衡至室温达30分钟，并使用CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定试剂盒依照手册(Promega,#G7571/2/3)来测定细胞存活力/增殖。在光谱仪中测定发光。

实施例1a

双特异性、二价的经域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子Xmab的表达和纯化

依照在上述材料和方法中所描述的规程，表达并纯化双特异性、二价的经域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子XMab1、XMab2和XMab3。<VEGF>部分的VH和VL(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)基于贝伐单抗。<ANG2>部分的VH(SEQ ID NO:3)通过ANG2i-LC06的VH序列(其记载于PCT申请No.PCT/EP2009/007182(WO2010/040508)，并且其是经由噬菌体展示获得的进一步成熟的序列片段)的E6Q突变(第6位初始氨基酸谷氨酸(E)用谷氨酰胺(Q)替换)衍生。<ANG2>部分的VL(SEQ ID NO:4)自ANG2i-LC06的VL序列(参见PCT申请No.PCT/EP2009/007182(WO2010/040508))衍生。表达并纯化双特异性、二价的经域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子XMab1、XMab2和XMab3。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO:5-8(XMab1)、SEQ ID NO:9-12(XMab2)和SEQ ID NO:13-16(XMab3)中给出。对于例示性结构，参见图1。

类似地，表达并纯化双特异性、二价<VEGF-ANG-2>抗体XMab4、XMab5和XMab6(相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO:17-20(XMab4)、SEQID NO:21-24(XMab5)和SEQ ID NO:25-28(XMab6)中给出)。

如描述的，测定结合亲和力和其它特性。

实施例1b

双特异性、二价<VEGF-ANG-2>抗体分子OAscFab的表达和纯化

依照在上述材料和方法中所描述的规程，表达并纯化双特异性、二价<VEGF-ANG-2>抗体分子OAscFab1、OAscFab2、OAscFab3。<VEGF>部分的VH和VL(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)基于贝伐单抗。<ANG2>E6Q部分的VH(SEQ ID NO:3)通过ANG2i-LC06的VH序列(其记载于PCT申请No.PCT/EP2009/007182(WO2010/040508)，并且其是经由噬菌体展示获得的进一步成熟的序列片段)的E6Q突变(第6位初始氨基酸谷氨酸(E)用谷氨酰胺(Q)替换)衍生。<ANG2>E6Q部分的VL(SEQ ID NO:4)自ANG2i-LC06的VL序列(参见PCT申请No.PCT/EP2009/007182(WO2010/040508))衍生。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO:29-31(OAscFab1)、SEQ ID NO:32-34(OAscFab2)和SEQ ID NO:35-37(OAscFab3)中给出。对于例示性结构，参见图2a。通过Western印迹确认OAscFab1、OAscFab2和OAscFab3的表达。OAscFab2和OAscFab3的纯化产生以下产量。

如描述的，测定结合亲和力和其它特性。

实施例1c

双特异性、二价的经域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子OAscXFab的表达和纯化

依照在上述材料和方法中所描述的规程，表达并纯化双特异性、二价的经域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子OAscXFab1、OAscXFab2、OAscXFab3。<VEGF>部分的VH和VL(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)基于贝伐单抗。<ANG2>E6Q部分的VH(SEQ ID NO:3)通过ANG2i-LC06的VH序列(其记载于PCT申请No.PCT/EP2009/007182(WO2010/040508)，并且其是经由噬菌体展示获得的进一步成熟的序列片段)的E6Q突变(第6位初始氨基酸谷氨酸(E)用谷氨酰胺(Q)替换)衍生。<ANG2>E6Q部分的VL(SEQ ID NO:4)自ANG2i-LC06的VL序列(参见PCT申请No.PCT/EP2009/007182(WO2010/040508))衍生。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO:38-40(OAscXFab1)、SEQ ID NO:41-43(OAscXFab2)和SEQID NO:44-46(OAscXFab3)中给出。对于例示性结构，参见图2b(OAscXFab1)和图2c(OAscXFab2,OAscXFab3)。通过Western印迹确认表达。

关键数据	OAscXFab1	OAscXFab2	OAscXFab3
				表达(产量)	23μg/mL	23μg/mL	26μg/mL

如描述的，测定结合亲和力和其它特性。

实施例2

双特异性抗体的稳定性

变性温度(SYPRO橙法)

为了测定发生蛋白质变性(即温度诱导的蛋白质结构丧失)的温度，使用一种依赖于在疏水性环境中展现出强荧光的疏水性荧光染料(SYPRO橙,Invitrogen)的方法。在蛋白质变性后，疏水性斑变得暴露于溶剂，导致升高的荧光。于高于变性温度的温度，荧光强度再次下降，因此将达到最大强度的温度定义为变性温度。该方法由Ericsson,U.B.等,Anal Biochem 357(2006)289-298和He,F.等,Journal of Pharmaceutical Sciences 99(2010)1707-1720描述。

将20mM His/HisCl，140mM NaCl，pH6.0中浓度为约1mg/mL的蛋白质样品与SYPRO橙(5000x储备溶液)混合以达到1:5000的最终稀释度。将20μL体积转移到384孔板中，并在

480实时PCR系统(Roche AppliedSciences)中以0.36°C/min的加热速率记录温度依赖性荧光。

通过动态光散射(DLS)得到的聚集温度

通过动态光散射(DLS)测定热诱导的蛋白聚集发生的温度。DLS产生关于大分子在溶液中大小分布的信息，其按微秒级自散射光强度波动衍生。当将样品逐渐加热时，于某一温度开始聚集，产生增长中的颗粒大小。将颗粒大小开始增加的温度定义为聚集温度。聚集和变性温度不需要必然是相同的，因为变性可以不必是聚集的前提。

对于聚集温度测量，使用DynaPro DLS读板仪(Wyatt technologies)。在测量前，将样品通过384孔过滤板(Millipore MultiScreen 384孔过滤系统，0.45μm)过滤到光学384孔板(Corning#3540)中。在配制缓冲液(20mM柠檬酸盐、180mM蔗糖、20mM精氨酸、0.02%聚山梨酯20)中以约1mg/mL的蛋白质浓度使用35μL的样品体积。将每孔用20μL的石蜡油(Sigma)覆盖以避免蒸发。将样品以0.05°C/分钟的速率从25°C加热至80°C，并对每次运行最大数目15份样品连续获得DLS数据。

按DLS的聚集速率

DLS是一种用于检测溶液中大分子的聚集体的灵敏方法，因为聚集体产生强烈的光散射信号。因此，可以通过重复采集DLS数据随时间追踪分子聚集的趋势。为了将潜在的聚集加速至实际速率，于50°C进行测量。

如上文所描述的，实施样品制备。记录DLS数据，直至100小时。以平均直径随时间的线性拟合的斜率计算聚集速率(nm/天)。

在配制缓冲液中的稳定性

为了就聚集/片段化而言对双特异性分子评估其稳定性，将样品在配制缓冲液(20mM柠檬酸盐、180mM蔗糖、20mM精氨酸、0.02%聚山梨酯20)中以约1mg/mL的蛋白质浓度于40°C温育3周。于-80°C将对照样品贮存3周。

通过HPLC实施用于量化聚集体和低分子量(LMW)种类的大小排阻层析。将25-100μg量的蛋白质应用于在Ultimate3000 HPLC系统(Dionex)上在300mM NaCl、50mM磷酸钾，pH7.5中的Tosoh TSKgel G3000SWXL柱。通过280nm的UV吸光度量化洗脱的蛋白质。

结果：

实施例3

双特异性抗体<VEGF-Ang-2>的结合特性

A)通过表面等离振子共振(SPR)分析表征的结合特性

使用BIAcore T100仪(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)通过应用表面等离振子共振(SPR)确认对两种抗原的同时结合。使用标准的胺偶联化学将VEGF固定化至CM5传感器芯片。在第一步中，将<VEGF-Ang-2>XMAb以HBS缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05%Tween 20,pH7.4)中10μg/ml的浓度于25°C注射。在抗体结合固定化的VEGF后，在第二步中将hAng-2以10μg/ml注射(图3)。

在进一步的实验中，测定<VEGF-Ang-2>Xmab的亲和力和结合动力学。简言之，将山羊<hIgG-Fcγ>多克隆抗体经由胺偶联在CM4芯片上固定化，以呈现针对Ang-2和VEGF的双特异性抗体。于25°C或37°C在HBS缓冲液中测量结合。以溶液中以0.37nM和30nM间或3.7nM和200nM间的多个浓度添加纯化的Ang-2-His(R&D Systems或自用纯化的)或VEGF(R&D Systems或自用纯化的)。通过3分钟注射测量结合；通过将芯片表面用HBS缓冲液清洗10分钟测量解离，并使用1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型估计KD值。由于Ang-2制备物的异质性，不能观察到1:1结合。因此，KD值是表观值。测定的<VEGF-Ang-2>Xmab对VEGF的亲和力极高，计算的解离速率即使于37°C也在Biacore规格外。在表1中，汇总了对两种抗原的结合常数。

表1：<VEGF-Ang-2>XMab1对Ang-2和VEGF的结合的动力学参数

分析物	表观ka(1/Ms)	表观kd(1/s)	表观KD(M)
				Ang-2	2.7E+06	6.3E-04	2.4E-10
VEGF	1.2E+05	<1E-06	<1E-10

B)用于量化结合活性双特异性<Ang2/VEGF>XMab1的测定法

作为SPR分析的备选，建立ELISA以量化结合活性双特异性单抗<Ang2/VEGF>抗体的量。在此测定法中，在第一步中将hAng2直接包被至Maxisorp微量滴定板(MTP)的孔。同时，将样品/参照标准品(单抗<Ang2/VEGF>)在另一MTP的孔中与洋地黄毒苷化(digoxigenylated)的VEGF一起预温育。在预温育和包被后，通过清洗经Ang2包被的MTP来将过量的未结合的Ang2除去。然后，将<Ang2/VEGF>和VEGF-Dig的预温育混合物转移至经hAng2包被的MTP，并温育。在温育后，通过清洗除去过量的预温育溶液，接着与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体一起温育。抗体-酶缀合物催化

底物的颜色反应。通过ELISA阅读器于405nm波长(参考波长：490nm([405/490]nm))测量信号。一式两份测定每份样品的吸光度值。(在图4中显示了例示此测试系统的方案，而在图5中显示了用于量化的ELISA校准曲线。)

实施例4

Tie2磷酸化

为了确认抗-ANGPT2相关活性在双特异性二价<VEGF-ANGPT2>抗体XMAb1中得到保留，实施Tie2磷酸化测定法。在如上文描述的ANGPT2刺激的Tie2磷酸化测定法中测定XMAb1的效力。

显示了XMAb1在如上文所描述的ANGPT2刺激的Tie2磷酸化测定法中干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化。XMAb1的IC50是7.4nM+/-2.3。

实施例5

对huANG-2结合Tie-2的抑制(ELISA)

在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE，产品目录编号464718)上于RT实施相互作用ELISA。在每个温育步骤后，将板用PBST清洗3次。将ELISA板用5μg/ml Tie-2蛋白包被1小时(h)。此后，将孔用补充有0.2% Tween-20和2%BSA(Roche Diagnostics GmbH,DE)的PBS封闭1小时。将纯化的双特异性Xmab抗体在PBS中的稀释液与0.2μg/ml人血管生成素-2(R&D Systems,UK,产品目录编号623-AN)于RT一起温育1小时。清洗后，添加0.5μg/ml生物素化的抗血管生成素-2克隆BAM0981(R&D Systems,UK)和1:3000稀释的链霉亲合素HRP(Roche Diagnostics GmbH,DE,产品目录编号11089153001)的混合物达1小时。此后，将板用PBST清洗3次。将板用新鲜制备的ABTS试剂(RocheDiagnostics GmbH,DE,缓冲液#204530001,片剂#11112422001)于RT显现30分钟。于405nm测量吸光度，并测定IC50。XMab1显示以IC50为12nM抑制ANG-2结合Tie-2。

实施例6

对hVEGF结合hVEGF受体的抑制(ELISA)

在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE,产品目录编号464718)上于RT实施测试。在每个温育步骤后，将板用PBST清洗3次。在开始时，将板用1μg/mlhVEGF-R蛋白(R&D Systems,UK,产品目录编号321-FL)包被1小时(h)。此后，将孔用补充有0.2%Tween-20和2%BSA(Roche Diagnostics GmbH,DE)的PBS封闭1小时。将纯化的双特异性Xmab抗体在PBS中的稀释液于RT与0.15μg/ml huVEGF121(R&D Systems,UK,产品目录编号298-VS)一起温育1小时。在清洗后，添加0.5μg/ml抗VEGF克隆单抗923(R&D Systems,UK)和1:2000辣根过氧化物酶(HRP)偶联的F(ab’)2抗小鼠IgG(GE Healthcare,UK,产品目录编号NA9310V)的混合物达1小时。此后，将板用PBST清洗6次。将板用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH,D E,缓冲液#204 530001,片剂#11 112 422 001)于RT显现30分钟。于405nm测量吸光度，并测定IC50。XMab1显示以IC50为10nM抑制VEGF结合VEGF受体。

实施例7

HUVEC增殖

为了确认抗-VEGF相关活性在双特异性二价<VEGF-ANG2>抗体XMAb1中得到保留，实施VEGF诱导的HUVEC增殖测定法。显示了XMAb1在如上文所描述的VEGF诱导的HUVEC增殖测试法中以与贝伐单抗相当的方式干扰VEGF诱导的HUVEC增殖。XMAb 1以浓度依赖性方式干扰VEGF诱导的HUVEC增殖，这与亲本抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀)相当。IC50是1.1nM(对于贝伐单抗)和2.3nM(对于XMAb)。

实施例8

小鼠角膜微袋血管发生测定法

8-10周龄雌性Balb/c小鼠购自Charles River,Sulzfeld,Germany。依据由Rogers,M.S.等,Nat Protoc 2(2007)2545-2550描述的方法修改方案。简言之，在麻醉小鼠中使用手术刀片和锋利的镊子在角膜缘至顶部的约1mm处在显微镜下制备宽度为约500μm的微袋。植入直径为0.6mm的盘(

PallCorporation,Michigan)，并使植入区的表面平滑。将盘在相应的生长因子或媒介物中温育至少30分钟。在3、5和7天后(或者仅3天后)，对眼照相，并测量血管应答。通过计算新血管面积占角膜总面积的百分比量化测定法。

将盘用300ng VEGF或用PBS作为对照加载，并植入7天。在第3天、第5天和第7天随时间监测血管从缘至盘的长出。在盘植入前1天，对于阿瓦斯汀和XMAb1，以10mg/kg的剂量静脉内施用抗体(<Ang-2/VEGF>XMAb1,<hVEGF>阿瓦斯汀(贝伐单抗))。对照组中的动物接受媒介物。应用体积是10ml/kg。

为了测试XMAb1在体内对VEGF诱导的血管发生的影响，我们实施小鼠角膜血管发生测定法。在此测定法中，将经VEGF浸泡的Nylaflo盘以与缘血管固定的距离植入无血管角膜的微袋中。血管立即向形成中的VEGF梯度长入角膜中。我们的结果证明，XMAb1(10mg/kg)的系统性施用自研究第3天至第5天几乎完全抑制血管从缘向VEGF梯度的长出(图6)。在进一步的实验中，施行直接的比较研究。将盘用300ng VEGF或用PBS作为对照加载，并植入3天。在第3天随时间监测血管从缘至盘的长出。在盘植入前1天，对于贝伐单抗(阿瓦斯汀)以10mg/g，对于XMAb1以10mg/g，对于贝伐单抗(阿瓦斯汀)以10mg/kg，及对于ANG2i-LC06以10mg/kg的剂量静脉内施用抗体(双特异性<Ang-2/VEGF>抗体XMAb1、亲本<VEGF>抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀)、亲本<Ang-2>抗体ANG2i-LC06，以及<VEGF>抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀)和<Ang-2>抗体ANG2i-LC06的组合)。在对于贝伐单抗(阿瓦斯汀)为10mg/kg和对于ANG2i-LC06为10mg/kg的情况中施用贝伐单抗(阿瓦斯汀)和ANG2i-LC06的组合。对照组中的动物接受媒介物。应用体积是10ml/kg。

我们的结果(参见图7和下表)证明了，与贝伐单抗和ANG2i-LC06的组合相当，XMAb1(10mg/kg)的系统性施用在研究第3天几乎完全抑制血管从缘向VEGF梯度的长出。比较而言，抗Ang-2单一疗法仅略微抑制VEGF诱导的血管发生(图7)。与10mg/kg ANG2i-LC06+10mg/kg贝伐单抗(阿瓦斯汀)的组合相比，较低浓度的10mg/kg XMAb1已经可以实现最大效果。

表：小鼠角膜微袋血管发生测定法中第3天对VEGF诱导的血管发生的百分比抑制

实施例9

双特异性抗体<VEGF-ANG-2>抗体在Scid米色小鼠的Colo205异种移植物模型中的体内效力

细胞系和培养条件：

Colo205人结肠直肠癌细胞(ATCC No.CCL-222)。在补充有10%胎牛血清(PAA Laboratories,Austria)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(PAA,Laboratories,Austria)中于37°C在水饱和的气氛中于5% CO₂常规培养肿瘤细胞。使用第2-5代进行移植。

动物：

将雌性SCID米色小鼠(到达时为4-5周龄)(购自Charles River Germany)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准。在到达后，将动物在动物房的检疫部分中维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。任意提供饮食食物(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH2.5-3)。研究开始时的小鼠为约10周龄。

肿瘤细胞注射：

在注射当天，自培养烧瓶(Greiner)收获(胰蛋白酶-EDTA)肿瘤细胞，并转移入50ml培养基中，清洗1次，并在PBS中重悬。在用PBS再清洗步骤和过滤(细胞滤网；

)后，将最终的细胞滴度调整为2.5x10⁷/ml。将肿瘤细胞悬浮液小心地用转移移液管混合以避免细胞聚集。此后，使用宽针(1.10x40mm)将细胞悬浮液充满入1.0ml的结核菌素(tuberculin)注射器(Braun Melsungen)；对于注射，改变针号(needle size)(0.45x25mm)，并且对于每次注射，使用新针。使用供小动物用的Stephens吸入单元实施麻醉，所述Stephens吸入单元具有预温育室（胶质玻璃）、单独的小鼠鼻罩（硅）和密闭循环系统中的非可燃性或爆炸性麻醉化合物异氟烷(cp-pharma)。在注射前两天，将动物的毛刮去，并且对于细胞注射，将麻醉动物的皮肤用解剖钳小心地提起，并将100μl细胞悬浮液(=2.5x10⁶个细胞)在动物的右体侧中皮下注射。

动物的处理

在随机化当天在均值肿瘤体积为约100mm3时分别开始动物处理。每周用不同化合物i.p处理小鼠一次，如下表指示的。

监测：

对动物每周2次控制其健康状态。在细胞注射后，将体重每周记录2x。在分期(staging)日开始并且随后在整个处理期期间每周2次通过测径器测量肿瘤尺寸。依照NCI方案计算肿瘤体积(肿瘤重量=1/2ab²，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长径和短径)。终止标准是动物的临界肿瘤质量(多至1.7g或

)、体重从基线损失超过20%、肿瘤溃疡或较差的一般状况。

结果(参见图8)显示了，与用单特异性抗体的处理相比，双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体XMAb1在Scid米色小鼠的异种移植物肿瘤模型Colo205中显示更高的肿瘤生长抑制。ANG2i-LC06和贝伐单抗组合的效力显示与XMAb1相当的结果。用10mg/kg已经达到XMAb1的最大效力。

在第二项实验中，分析XMAb1对更大的肿瘤的影响。

动物的处理

在随机化当天在均值肿瘤体积为约400mm3时分别开始动物处理。每周用不同化合物i.p处理小鼠一次，如下表指示的。

监测：

对动物每周2次控制其健康状态。在细胞注射后，将体重每周记录2x。在分期日开始并且随后在整个处理期期间每周2次通过测径器测量肿瘤尺寸。依照NCI方案计算肿瘤体积(肿瘤重量=1/2ab²，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长径和短径)。终止标准是动物的临界肿瘤质量(多至1.7g或

)、体重从基线损失超过20%、肿瘤溃疡或较差的一般状况。

结果(参见图9)显示了，与用单特异性抗体的处理相比，双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体XMAb1在Scid米色小鼠的异种移植物肿瘤模型Colo205中显示更高的肿瘤生长抑制，所述用单特异性抗体的处理与对照相比在大肿瘤中没有显示效力。ANG2i-LC06和贝伐单抗组合的效力显示与XMAb1相当的结果。用10mg/kg已经达到XMAb1的最大效力。

总之，结果证明，不依赖于肿瘤大小，XMAb1与用单特异性抗体的处理相比显示卓越的效力。

与10mg/kg ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的组合相比，在较低浓度10mg/kg XMAb1时已经可以在这些模型中实现肿瘤停滞。

实施例10

双特异性抗体<VEGF-ANG-2>抗体在Scid米色小鼠的正位KPL-4异种移植物模型中的体内效力

肿瘤细胞系

已经自具有炎性皮肤转移的乳腺癌患者的恶性胸腔积液建立了人乳腺癌细胞系KPL-4(Kurebayashi,J.等,Br.J.Cancer 79(1999)707-17)。在补充有10%胎牛血清(PAN Biotech,Germany)和2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech,Germany)的DMEM培养基(PAN Biotech,Germany)中于37°C在水饱和的气氛中于5%CO₂常规培养肿瘤细胞。用胰蛋白酶/EDTA 1x(PAN)实施培养物传代，分开三次/周。

小鼠

在到达后，将雌性SCID米色小鼠(10–12周龄；体重18-20g，CharlesRiver,Sulzfeld,Germany)在得到AALAAC批准的动物房的检疫部分中维持1周以使其适应新环境，并进行观察。实施连续健康监测。将小鼠在SPF条件下依照国际准则(GV-Solas;Felasa;TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的每日周期保持。任意提供饮食食物(Kliba Provimi 3347)和水(过滤的)。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(Regierung von Oberbayern;登记号211.2531.2-22/2003)。

肿瘤细胞注射

在注射当天，自培养烧瓶(Greiner TriFlask)收获(胰蛋白酶-EDTA)肿瘤细胞，并转移入50ml培养基中，清洗1次，并在PBS中重悬。在用PBS再清洗步骤和过滤(细胞滤网；

)后，将最终的细胞滴度调整为1.5x10⁸/ml。将肿瘤细胞悬浮液小心地用转移移液管混合以避免细胞聚集。使用供小动物用的Stephens吸入单元实施麻醉，所述Stephens吸入单元具有预温育室（胶质玻璃）、单独的小鼠鼻罩（硅）和密闭循环系统中的非可燃性或爆炸性麻醉化合物异氟烷(Pharmacia-Upjohn,Germany)。在注射前两天，将动物的毛刮去。对于i.m.f.p.注射，将细胞以20μl的体积正位注射到每只麻醉小鼠的右侧倒数第二个腹股沟乳房脂肪垫中。对于正位植入，使用Hamilton微升注射器和30Gx1/2”针将细胞悬浮液经由乳头下的皮肤注射。

动物的处理

在随机化当天在均值肿瘤体积为约80mm3时分别开始动物处理。每周用不同化合物i.p处理小鼠一次，如下表中指示的。

肿瘤生长的监测

对动物每周2x控制其健康状态。在细胞注射后，将体重每周记录2x。在分期日，在处理期开始时每周2次通过测径器测量肿瘤尺寸。依照NCI方案(B.Teicher;Anticancer drug development guide,Humana Press,1997,第5章，第92页)计算肿瘤体积(肿瘤重量=1/2ab2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长径和短径)。

终止标准是动物的临界肿瘤质量(多至1.7g或

)、体重从基线损失超过20%、肿瘤溃疡或较差的一般状况。

结果(参见图10)显示了，与用单特异性抗体的处理相比，双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体XMAb1在Scid米色小鼠的异种移植物肿瘤模型Colo205中显示更高的肿瘤生长抑制。ANG2i-LC06和贝伐单抗组合的效力显示与XMAb1相当的结果。用10mg/kg已经达到XMAb1的最大效力。

在第二项实验中，分析XMAb1对更大的肿瘤的影响。

动物的处理

在随机化当天在均值肿瘤体积为约160mm3时分别开始动物处理。每周用不同化合物i.p处理小鼠一次，如下表中指示的。

监测：

对动物每周2x控制其健康状态。在细胞注射后，将体重每周记录2x。在分期日，在处理期开始时每周2次通过测径器测量肿瘤尺寸。依照NCI方案(B.Teicher;Anticancer drug development guide,Humana Press,1997,第5章，第92页)计算肿瘤体积(肿瘤重量=1/2ab²，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长和短直径)。

终止标准是动物的临界肿瘤质量(多至1.7g或

)、体重从基线损失超过20%、肿瘤溃疡或较差的一般状况。

结果(参见图11)显示了，与用单特异性抗体的处理相比，双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体XMAb1在Scid米色小鼠的异种移植物肿瘤模型Colo205中显示更高的肿瘤生长抑制。ANG2i-LC06和贝伐单抗组合的效力显示与XMAb1相当的结果。用10mg/kg已经达到XMAb1的最大效力。

总之，结果证明了，不依赖于肿瘤大小，XMAb1与用单特异性抗体的处理相比显示卓越的效力。

与10mg/kg Ang2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的组合相比，较低浓度10mg/kg XMAb1已经可以在这些模型中实现肿瘤停滞。

实施例11

用XMAb1的处理对s.c.Colo205异种移植物中微血管密度的影响

通过对肿瘤载玻片的所有血管计数来评估血管密度。在经石蜡包埋的切片上用荧光抗小鼠CD34抗体(克隆MEC14.7)标记血管。对血管量化，并且微血管密度以每mm²的血管计算。所有结果都以均值±SEM表示。为了限定实验组的显著性差异，使用Dunnetts方法。认为p<0.05是统计学显著的。结果显示了，总的肿瘤内MVD在经处理的肿瘤中降低。用ANG2i-LC06的处理将MVD降低29%，用贝伐单抗降低</=0%，用贝伐单抗+ANG2i-LC06降低15%，而用XMAb1降低28%。

实施例12

双特异性抗体<VEGF-ANG-2>抗体在Scid米色小鼠的s.c.N87异种移植物模型中的体内效力

肿瘤细胞系

人胃癌细胞系N87癌细胞(NCI-N87(ATCC No.CRL 5822))。在补充有10%胎牛血清(PAN Biotech,Germany)和2mML-谷氨酰胺(PAN Biotech,Germany)的RPMI 1640中于37°C在水饱和的气氛中于5%CO₂常规培养肿瘤细胞。用胰蛋白酶/EDTA 1x(PAN)实施培养物传代，分开三次/周。

小鼠

在到达后，将雌性SCID米色小鼠(10–12周龄；体重18-20g，CharlesRiver,Sulzfeld,Germany)在得到AALAAC批准的动物房检疫部分中维持1周以使其适应新环境，并进行观察。实施连续的健康监测。将小鼠在SPF条件下依照国际准则(GV-Solas;Felasa;TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的每日周期保持。任意提供饮食食物(Kliba Provimi 3347)和水(过滤的)。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(Regierung von Oberbayern;登记号211.2531.2-22/2003)。

肿瘤细胞注射

在细胞注射当天，自培养烧瓶(Greiner T 75)收获细胞，转移到50ml的培养基中，清洗1次，并在PBS中重悬。在用PBS再清洗后，用Vi-Cell^TM(细胞存活力分析器，Beckman Coulter,Madison,Wisconsin,U.S.A.)测量细胞浓度。将肿瘤细胞悬浮液(PBS)小心地混合(以降低细胞聚集)，并在冰上保持。将细胞悬浮液充满入1.0ml注射器中。对于注射，使用0.45x25mm的针号。为了生成原发性肿瘤，将100μl体积PBS中的5x10⁶个N87肿瘤细胞皮下注射到每只小鼠的右体侧中。

动物的处理

在随机化当日在均值肿瘤体积为约130mm3时分别开始动物处理。每周用不同化合物i.p处理小鼠一次，如下表中指示的。

动物数	化合物	剂量(mg/kg)	施用路径/模式
				10	Xolair	10	每周一次i.p.
10	<VEGF>阿瓦斯汀	10	每周一次i.p.
				10	<ANG-2>Ang2i-LC06	10	每周一次i.p.
10	XMAb1	10	每周一次i.p.

肿瘤生长的监测

对动物每周1次控制其健康状态。在细胞注射后，将体重每周记录1x。在分期日，在处理期开始时每周1次通过测径器测量肿瘤尺寸。依照NCI方案(B.Teicher;Anticancer drug development guide,Humana Press,1997,第5章，第92页)计算肿瘤体积(肿瘤重量=1/2ab²，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长和短直径)。

终止标准是动物的临界肿瘤质量(多至1.7g或

)、体重从基线损失超过20%、肿瘤溃疡或较差的一般状况。

结果显示了，与用单特异性抗体的处理相比，双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体XMAb1在Scid米色小鼠的异种移植物肿瘤模型Colo205中显示更高的肿瘤生长抑制(图12)。