MX2012010937A

MX2012010937A - Anticuerpos bivalentes biespecificos anti-vegf/anti-ang-2.

Info

Publication number: MX2012010937A
Application number: MX2012010937A
Authority: MX
Inventors: Monika Baehner; Sabine Imhof-Jung; Anita Kavlie; Hubert Kettenberger; Christian Klein; Joerg Thomas Regula; Wolfgang Schaefer; Juergen Michael Schanzer; Werner Scheuer; Kay-Gunnar Stubenrauch; Markus Thomas
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2012-10-15
Also published as: TW201138820A; CR20120464A; MA34172B1; RU2012143793A; AU2011231580A1; TWI426920B; ECSP12012177A; KR20130001291A; CN102906114A; UA110932C2; CN102906114B; BR112012024287A2; CA2793402C; WO2011117329A1; US20110236388A1; KR101484383B1; AU2011231580B2; CL2012002662A1; CO6630087A2; EP2552960B1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos bivalentes biespecíficos contra el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF-1) y contra la angiopoyetina-2 humana (ANG-2), a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de las mismas.

Description

ANTICUERPOS BIVALENTES BIESPECÍFICOS ANTI-VEGF/ANTI-ANG-2 La presente invención se refiere a anticuerpos bivalentes biespecífícos contra el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF- 1 ) y contra la angiopoyetina-2 humana (ANG-2), a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de las mismas.

Antecedentes de la invención La angiogénesis se encuentra implicada en la patogénesis de una diversidad de trastornos, entre los que se incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares, tales como retinopatías proliferativas o la degeneración macular relacionada con la edad (AMB), la artritis reumatoide y la soriasis (Folkman J. et al, J. Biol. Chem. 267:10931-10934, 1992; Klagsbrun M. et al, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239, 1991 ; y Garner A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., y Klintworth G.K. (editores), 2a edición, Marcel Dekker, New York, 1994, páginas 1625-1710). En el caso de los tumores sólidos, la neovasculanzación permite que las células tumorales obtengan una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. Por consiguiente, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones de tumor y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama, así como en algunos otros tumores (Weidner N. et al, N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991; Horak E.R. et al, Lancet 340:1120-1 124, 1992; y Macchiarini P. et al, Lancet 340: 145-146, 1992).

VEGF y anticuerpos anti-VEGF Se describe el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF/VEGF-A) (SEC ID n° 105) en, por ejemplo, Leung D.W. et al, Science 246: 1306-9, 1989; Keck P.J. et al, Science 246: 1309-12, 1989, y Connolly D.T. et al, J. Biol. Chem. 264:20017-24, 1989. VEGF se encuentra implicado en la regulación de la angiogénesis normal y anormal y la neovascularización asociada a tumores y a trastornos intraoculares (Ferrara N. et al, Endocr. Rev. 18:4-25, 1997; Berkman R.A. et al, J. Clin. Invest. 91 :153-159, 1993; Brown L.F. et al, Human Pathol. 26:86-91 , 1995; Brown L.F. et al, Cáncer Res. 53:4727-4735, 1993; Mattern J. et al, Brit. J. Cáncer 73:931-934, 1996, y Dvorak H.F. et al, Am. J. Pathol. 146:1029-1039, 1995). VEGF es una glucoproteína homodimérica que ha sido aislada a partir de varias fuentes. VEGF muestra una actividad mitogénica altamente específica para las células endoteliales. VEGF presenta importantes funciones reguladoras en la formación de nuevos vasos sanguíneos durante la vasculogénesis embrionaria y en la angiogénesis durante la vida adulta (Carmeliet P. et al, Nature 380:435-439, 1996; Ferrara N. et al, Nature 380:439-442, 1996; revisado por Ferrara N. et al, Endocr. Rev. 18:4-25, 1997. La importancia del papel desempeñado por el VEGF ha sido demostrada en estudios que muestran que la inactivación de un único alelo de VEGF resulta en letalidad embrionaria debido al fracaso del desarrollo de la vasculatura (Carmeliet P. et al, Nature 380:435-439, 1996; Ferrara N. et al, Nature 380:439-442, 1996). Además, VEGF presenta una fuerte actividad quimioatrayente hacia los monocitos, puede inducir el activador del plasminógeno y el inhibidor del activador del plasminógeno en células endoteliales, y también puede inducir la permeabilidad microvascular. Debido a esta última actividad, en ocasiones se denomina factor de permeabilidad vascular (VPF). El aislamiento y las propiedades del VEGF han sido revisadas; ver Ferrara N. et al, J. Cellular Biochem. 47:21 1-218, 1991 ; y Connolly D.T., J. Cellular Biochem. 47:219-223, 1991. El procesamiento alternativo del ARNm de un único gen de VEGF da lugar a cinco isoformas de VEGF.

Los anticuerpos neutralizadores anti-VEGF suprimen el crecimiento de una diversidad de líneas de células tumorales humanas en ratones (Kim K.J. et al, Nature 362:841-844, 1993; Warren S.R. et al, J. Clin. Invest. 95: 1789-1797, 1995; Borgstrom P. et al, Cáncer Res. 56:4032-4039, 1996; y Melnyk O. et al, Cáncer Res. 56:921-924, 1996). Las patentes WO n° 94/10202, n° 98/45332, n° 2005/00900 y n° 00/35956 se refieren a anticuerpos contra VEGF. El anticuerpo monoclonal humanizado bevacizumab (comercializado bajo la marca comercial Avastin®) es un anticuerpo anti-VEGF utilizado en la terapia tumoral (patente WO n° 98/45331)..

El ranibizumab (marca comercial: Lucentis®) es un fragmento de anticuerpo monoclonal derivado del mismo anticuerpo murino parental que bevacizumab (Avastin). Es de mucho menor tamaño que la molécula parental y presenta afinidad madurada para proporcionar una unión más fuerte a VEGF-A (patente WO n° 98/45331). Es un antiangiogénico autorizado para el tratamiento del tipo "húmedo" de degeneración macular relacionada con la edad (ARMD), una forma común de pérdida de visión relacionada con la edad. Otro anticuerpo anti-VEGF es, por ejemplo, HuMab G6-31, descrito en, por ejemplo, la patente US n° 2007/0141065.

ANG-2 y anticuerpos anti-ANG-2 La angiopoyetina-2 humana (ANG-2) (alternativamente abreviada ANGPT2 ó ANG2) (SEC ID n° 106) se describe en Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997, y Cheung A.H. et al, Genomics 48:389-91, 1998. Las angiopoyetinas 1 y 2 (ANG-1 (SEC ID n° 107) y ANG-2 (SEC ID n° 106)) se descubrieron como ligandos de los Ties, una familia de tirosina quinasasa que se expresa selectivamente dentro del endotelio vascular. Yancopoulos G.D. et al, Nature 407:242-48, 2000. En la actualidad se han descubierto cuatro miembros definitivos de la familia de las angiopoyetinas. Las angiopoyetinas 3 y 4 (Ang-3 y Ang-4) podrían representar contrapartidas ampliamente divergentes del mismo locus génico en el ratón y el ser humano. Kim I. et al, FEBS Lett. 443:353-56, 1999; im I. et al., J. Biol. Chem. 274:26523-28, 1999. ANG-1 y ANG-2 fueron identificados originalmente en experimentos de cultivo de tejidos como agonista y antagonista, respectivamente (ver, para ANG-1 : Davis S. et al, Cell 87: 1161-69, 1996; y para ANG-2: Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2, y tanto Ang-1 como Ang-2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM ( d) Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997. Se ha demostrado que Ang-1 contribuye a la supervivencia de EC y a potenciar la integridad del endotelio, Davis S. et ai, Cell 87:1161-69, 1996; Kwak H.J. et al, FEBS Lett. 448:249-53, 1999; Suri C. et al, Science 282:468-71, 1998; Thurston G. et al, Science 286:2511-2514, 1999; Thurston G. et al, Nat. Med. 6:460-63, 2000, mientras que ANG-2 presentaba el efecto contrario y estimulaba la desestabilización y regresión de los vasos sanguíneos en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o factor de crecimiento fibroblástico básico (Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997). Sin embargo, muchos estudios de la función de la ANG-2 sugieren una situación más compleja. ANG-2 podría ser un regulador complejo del remodelado vascular que desempeña un papel tanto en el crecimiento nuevo de vasos como en la regresión de los mismos. Corroborando dichas funciones de la ANG-2, los análisis de expresión revelan que ANG-2 resulta rápidamente inducida, conjuntamente con VEGF, en el contexto del crecimiento angiogénico en el adulto, mientras que la ANG-2 resulta inducida en ausencia de VEGF en el contexto de la regresión vascular (Holash J. et al, Science 284:1994-98, 1999; Holash J. et al, Oncogene 18:5356-62, 1999). Es consistente con un papel dependiente del contexto que la ANG-2 se une específicmanete al mismo receptor específico del endotelio, Tie-2, que resulta activado por Ang-1 , pero que presenta efectos dependientes del contexto sobre su activación (Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997).

Los ensayos de angiogénesis corneal han demostrado que tanto ANG-1 como ANG-2 presentan efectos similares, actúan sinérgicamente con VEGF estimulando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (Asahara T. et al, Circ. Res. 83:233-40, 1998). La posibilidad que se produzca una respuesta endotelial dependiente de la dosis se planteó a partir de la observación de que in vitro y a elevada concentración, ANG-2 también puede ser proangiogénico (Kim I. et al, Oncogene 19:4549-52, 2000). A concentración elevada, ANG-2 actúa como un factor de supervivencia a la apoptosis para las células endotelial es durante la apoptosis por privación de suero, a través de la activación de Tie2 mediante la ruta de la PI-3 quinasa y de Akt (Kim, I., et al, Oncogene 19:4549-52, 2000).

Otros experimentos in vitro han sugerido que, durante la exposición sostenida, los efectos de ANG-2 podría desplazarse progresivamente desde los de un antagonista a los de un agonista de Tie2, y en puntos temporales posteriores, podrían contribuir directamente a la formación de tubo vascular y a la estabilización de los neovasos (Teichert-Kuliszewska K. et al, Cardiovasc. Res. 49:659-70, 2001). Además, al cultivar ECs sobre gel de fibrina, también se observó la activación de Tie2 en el caso de ANG-2, sugiriendo tal vez que la acción de ANG-2 podría depender del estado de diferenciación de la EC (Teichert-Kuliszewska . et ai, Cardiovasc. Res. 49:659-70, 2001). En las EC microvasculares cultivadas en un gel de colágeno tridimensional, ANG-2 también podría inducir la activación de Tie2 y estimular la formación de estructuras de tipo capilar (Mochizuki Y. et al., J. Cell. Sci. 1 15:175-83, 2002). La utilización de un cocultivo esferoidal 3-D como modelo in vitro de maduración de vasos demostró que el contacto directo entre las ECs y las células mesenquimales elimina la sensibilidad a VEGF, mientras que la presencia de VEGF y ANG-2 induce el nuevo crecimiento (Korff T. et al., Faseb J. 15:447-57, 2001). Etoh T.H. et al. han demostrado que las ECs que expresan constitutivamente Tie2, la expresión de MMP-1, MMP-9 y u-Pa, se encontraban fuertemente reguladas positivamente por ANG-2 en presencia de VEGF (Etoh T. et al., Cáncer Res. 61 :2145-53, 2001). Utilizando un modelo de membrana pupilar in vivo, Lobov I.B. et al. han demostrado que ANG-2 en presencia de VEGF endógeno estimula un rápido incremento del diámetro capilar, el remodelado de la lámina basal, la proliferación y migración de las células endoteliales y estimula el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (Lobov I.B. et ai, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:11205-10, 2002). En contraste, ANG-2 estimula la muerte de las células endoteliales y la regresión de vasos sin VEGF endógeno (Lobov I.B. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:1 1205-10, 2002). De manera similar, con un modelo de tumor in vivo, Vajkoczy P. et al. han demostrado que los agregados multicelulares inician el crecimiento vascular mediante brote angiogénico mediante la expresión simultánea de VEGFR-2 y ANG-2 por parte de endotelio del huésped y tumoral (Vajkoczy P. et al., J. Clin. Invest. 109:777-85, 2002). Este modelo ilustra que la microvasculatura establecida de tumores en crecimiento se caracteriza por un remodelado continuo, mediado putativamente por la expresión de VEGF y ANG-2 (Vajkoczy P. et al, J. Clin. Invest. 109:777-85, 2002). Algunos estudios de inactivación génica en el ratón referidos a Tie-2 y a angiopoyetina-1 muestran fenotipos similares y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 media en el remodelado y estabilización de los vasos en desarrollo, estimula la maduración de los vasos sanguíneos durante la angiogénesis y el mantenimiento de la adhesión celular basada en células endoteliales (Dumon D.J. et al, Genes & Development 8:1897-1909, 1994; Sato T.N., Nature 376:70-74, 1995; Thurston G. et al, Nature Medicine 6:460-463, 2000). Se cree que el papel de la angiopoyetina-1 se encuentra conservado en el adulto, en el que se expresa amplia y constitutivamente (Hanahan D., Science 277:48-50, Zagzag D. et al, Exp. Neurology 159:391-400, 1999). En contraste, la expresión de la angiopoyetina-2 se limita principalmente a sitios de remodelado vascular, en donde se cree que bloquea la función estabilizadora o maduradora constitutiva de la angiopoyetina-1, permitiendo que los vasos reviertan a un estado plástico, o se conserven en él, que puede ser más sensible a señales de brote (Hanahan D., 1997; Holash J. et al, Oncogene 18:5356-62, 1999; Maisonpierre P.C., 1997). Algunos estudios sobre la expresión de la angiopoyetina-2 en la angiogénesis patológica han encontrado que muchos tipos tumorales muestran expresión vascular de angiopoyetina-2 (Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997). Los estudios funcionales sugieren que la angiopoyetina-2 se encuentra implicada en la angiogénesis tumoral y asocian la sobreexpresión de la angiopoyetina-2 al crecimiento tumoral incrementado en un modelo de xenoinjerto en el ratón (Ahmad S.A. et al, Cáncer Res. 61 : 1255-1259, 2001). Otros estudios han asociado la sobreexpresión de la angiopoyetina-2 a la hipervascularidad tumoral (Etoh T. et al, Cáncer Res. 61 :2145-53, 2001 ; Tanaka, F. et al, Cáncer Res. 62:7124-7129, 2002).

En los últimos años, se ha propuesto la angiopoyetina-1, la angiopoyetina-2 y/o Tie-2 como posibles dianas terapéuticas anticáncer. Por ejemplo, las patentes US n° 6.166.185, n° 5.650.490 y n° 5.814.464 dan a conocer, cada una de ellas, anticuerpos anti-ligando de Tie- 2 y anti-receptor de Tie-2. En algunos estudios con Tie-2 solubles se informa de la reducción del número y tamaño de los tumores en roedores (Lin, 1997; Lin, 1998). Siemeister G. et al, Cáncer Res. 59:3, 3185-91, 1999, generaron líneas celulares de melanoma humano que expresaban el dominio extracelular de Tie-2, inyectaron éstas en ratones desnudos e informaron de que el Tie-2 soluble resultaba en la inhibición significativa del crecimiento tumoral y la angiogénesis tumoral. Dado que tanto la angiopoyetina-1 como la angiopoyetina-2 se unen a Tie-2, no se determina claramente en estos estudios si la angiopoyetina-1 , la angiopoyetina-2 o Tie-2 sería una diana atractiva para la terapia anticáncer. Sin embargo, se cree que una terapia anti-angiopoyetina-2 efectiva resulta beneficiosa en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer, en la que el avance depende de la angiogénesis aberrante, en la que el bloqueo del proceso puede conducir a prevenir el avance de la enfermedad (Folkman J., Nature Medicine 1 :27-31, 1995).

Además, algunos grupos han informado de la utilización de anticuerpos y péptidos que se unen a angiopoyetina-2. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 6.166.185 y US n° 2003/10124129, WO n° 03/030833, WO n° 2006/068953, WO n° 03/057134 ó US n° 2006/0122370.

El estudio del efecto de la expresión focal de la angiopoyetina-2 ha demostrado que el antagonismo de la señal angiopoyetina-l/Tie-2 debilita la estructura vascular, exponiendo las ECs de esta manera a señales activadoras de inductores de la angiogénesis, por ejemplo VEGF (Hanahan D., Science 277:48-50, 1997). Este efecto proangiogénico resultante de la inhibición de la angiopoyetina-1 indica que la terapia anti-angiopoyetina-1 no resultaría un tratamiento anticáncer efectivo.

ANG-2 se expresa durante el desarrollo en sitios en los que se produce el remodelado de los vasos sanguíneos (Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997). En individuos adultos, la expresión de ANG-2 se encuentra restringida a sitios de remodelado vascular, así como a tumores altamente vascularizados, incluyendo el glioma (Osada H. et al, Int. J.

Oncol. 18:305-09, 2001 ; Koga K. et al, Cáncer Res. 61 :6248-54, 2001), el carcinoma hepatocelular (Tanaka S. et ai, J. Clin. Invest. 103:341-45, 1999), el carcinoma gástrico (Etoh T. et al, Cáncer Res. 61 :2145-53, 2001 ; Lee J.H. et al, Int. J. Oncol. 18:355-61 , 2001), el tumor del tiroides (Bunone G. et al, Am. J. Pathol. 155:1967-76, 1999), el cáncer pulmonar de células no pequeñas (Wong M.P. et al, Lung Cáncer 29:1 1-22, 2000) y el cáncer de colon (Ahmad S.A. et al, Cáncer 92: 1138-43, 2001) y de próstata (Wurmbach J.H. et al, Anticancer Res. 20:5217-20, 2000). Se observa que algunas células tumorales expresan ANG-2. Por ejemplo, Tanaka S. et al, J. Clin. Invest. 103:341-45, 1999, detectaron ARNm de ANG-2 en 10 de 12 especímenes de carcinoma hepatocelular humano (HCC). El grupo de Ellis informó de que ANG-2 se expresa ubicuamente en epitelio tumoral (Ahmad S.A. et al, Cáncer 92:1138-43, 2001). Otros investigadores han informado de resultados similares (Chen L. et al, J. Tongji Med. Univ. 21 :228-35, 2001). Mediante la detección de los niveles de ARNm de ANG-2 en especímenes de cáncer de mama humano en archivo, Sfiligoi C. et al., Int. J. Cáncer 103:466-74, 2003, informaron de que el ARNm de ANG-2 se asociaba significativamente a la invasión de nodulos linfáticos auxiliares, a un tiempo reducido libre de enfermedad y a una pobre supervivencia final. Tanaka F. et al., Cáncer Res. 62:7124-29, 2002, revisaron un total de 236 pacientes de cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) con estadio I a IIIA patológico, respectivamente. Utilizando la inmunohistoquímica, encontraron que 16,9% de los pacientes de NSCLC eran positivos para ANG-2. La densidad de microvasos en el tumor positivo para ANG-2 era significativamente superior que en el negativo para ANG-2. Dicho efecto angiogénico de ANG-2 se observo únicamente en el caso de que la expresión de VEGF fuese alta. Además, la expresión positiva de ANG-2 era un factor significativo en la predicción de una supervivencia postoperatoria pobre (Tanaka F. et al., Cáncer Res. 62:7124-7129, 2002). Sin embargo, no encontraron ninguna correlación significativa entre la expresión de Ang-1 y la densidad de microvasos (Tanaka F. et al., Cáncer Res. 62:7124-7129, 2002). Estos resultados sugieren que ANG-2 es un indicador de pacientes de mal prognóstico en varios tipos de cáncer.

Recientemente, utilizando un modelo de inactivación génica de ANG-2 en el ratón, el grupo de Yancopoulos ha informado de que resulta necesaria la ANG-2 para la angiogénesis postnatal Gale N.W. et al., Dev. Cell 3:411-23, 2002). Demostraron que la regresión programada en el desarrollo de la vasculatura hialoide del ojo no se producía en ratones con inactivación génica de ANG-2 y que los vasos sanguíneos retiñíanos de los mismos no conseguían brotar de la arteria retiniana central (Gale N.W. et al., Dev. Cell 3:41 1-23, 2002). También encontraron que la deleción de ANG-2 resultaba en defectos profundos de la formación de patrón y de función de la vasculatura linfática. (Gale N.W. et al., Dev. Cell 3:41 1-23, 2002). El rescate génico con Ang-1 corrige los defectos linfáticos, aunque no de angiogénesis (Gale N.W. et ai, Dev. Cell 3:411-23, 2002).

Peters y sus colaboradores informaron de que Tie2 soluble, administrada en forma de proteína recombinante o en un vector vírico de expresión, inhibía el crecimiento in vivo del carcinoma mamario y melanoma murinos en modelos de ratón (Lin P. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:8829-34, 1998; Lin P. et al., J. Clin. Invest. 100:2072-78, 1997). Las densidades vasculares en los tejidos tumorales tratados de esta manera se redujeron en gran medida. Además, el Tie2 soluble bloqueaba la angiogénesis en córneas de rata estimuladas con medio condicionado de células tumorales (Lin P. et al., J. Clin. Invest. 100:2072-78, 1997). Además, Isner y su equipo demostraron que la adición de ANG-2 a VEGF estimulaba una neovascularidad significativamente más prolongada y más circunferencial que VEGF por sí solo (Asahara T. et al., Circ. Res. 83:233-40, 1998). El exceso de receptor de Tie2 soluble bloqueaba la modulación de la neovascularización inducida por VEGF por parte de ANG-2 (Asahara T. et ai, Circ. Res. 83:233-40, 1998). Siemeister G. et ai, Cáncer Res. 59:3, 1999, 3185-91, demostraron con xenoinjertos en ratones desnudos que la sobreexpresión de los dominios de unión a ligandos extracelulares de Flt-1 ó de Tie2 en los xenoinjertos resultaba en una inhibición significativa de la ruta que no podía ser compensada por otra, sugiriendo que la ruta del receptor de VEGF y la ruta de Tie2 deben considerarse dos mediadores independientes que resultan esenciales para el proceso de angiogénesis in vivo (Siemeister G. et ai, Cáncer Res. 59:3, 3185-91, 1999). Lo anterior ha sido demostrado en una publicación más reciente, de White R.R. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:5028-33, 2003. En su estudio, se demostró que un aptámero de ARN resistente a nucleasa que se une específicamente e inhibe la ANG-2 inhibe significativamente la neovascularización inducida por bFGF en el modelo de angiogénesis de la microbolsa corneal de rata.

Anticuerpos biespecíficos Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo recombinante, por ejemplo anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante la fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de una sola cadena (ver, por ejemplo, Coloma M.J. et al, Nature Biotech. 15:159-163, 1997, patente WO n° 2001/077342, y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25: 1233-1234, 2007).

Además, se han desarrollado algunos otros formatos nuevos en los que ya no se retiene la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de una sola cadena (scFv, Bis-scFv), que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger, P. et al., Nature Biotech. 23: 1 126-1136, 2005; Fischer, N. y Léger, O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen, J. et al, Journal of Immunological Methods 318:65-74, 2007; Wu, C. et ai, Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007).

La totalidad de dichos formatos utiliza moléculas conectoras para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una pro teína ligante adicional (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007). Puede desearse la conservación de las funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), las cuales se encuentran mediadas por la unión de un receptor Fe, mediante el mantenimiento de un grado elevado de similitud con los anticuerpos naturales.

En la patente WO n° 2007/024715 se informa de inmunoglobulinas duales de dominio variable en forma de proteínas construidas ligantes multivalentes y multiespecíficas. Se informa de un procedimiento para la preparación de anticuerpos diméricos biológicamente activos en la patente US n° 6.897.044. Se informa de un constructo de anticuerpo Fv multivalente que presenta por lo menos cuatro dominios variables que se encuentran unidos entre sí mediante péptidos conectores en la patente US n° 7.129.330. Se informa de estructuras de unión de antígeno diméricas y multiméricas en el documento US n° 2005/0079170. En el documento WO n° 2006/020258 se informa de anticuerpos biespecíficos tetravalentes que pueden expresarse eficientemente en células procarióticas y eucarióticas, y que resultan útiles en métodos terapéuticos y diagnósticos. Se informa en el documento US n° 2005/0163782 de un método para la separación o la síntesis preferente de dimeros unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro entre cadenas, a partir de dimeros que no se encuentran unidos por, como mínimo, un enlace disulfuro entre cadenas, en el que se parte de una mezcla que comprende los dos tipos de polipéptidos diméricos. Se informa de receptores tetravalentes biespecíficos en la patente US n° 5.959.083. Se informa de anticuerpos construidos con tres o más sitios de unión de antígeno funcionales en el documento WO n° 2001/077342.

Se informa de polipéptidos de unión a antígeno multiespecíficos y multivalentes en el documento WO n° 1997/001580. El documento WO n° 1992/004053 informa de homoconjugados, típicamente preparados a partir de anticuerpos monoclonales de la clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico, unidos covalentemente mediante entrecruzamiento sintético. Se informa de anticuerpos monoclonales oligoméricos con elevada avidez para antí genos en el documento WO n° 1991/06305, en el que se secretan oligómeros, típicamente de la clase IgG, que presentan dos o más monómeros inmunoglobulina asociados entre sí formando moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes. Se informa de anticuerpos derivados de ovejas y constructos de anticuerpo manipulados en la patente US n° 6.350.860, que pueden utilizarse para tratar enfermedades en las que la actividad del interferón gamma resulta patogénica. En el documento US n° 2005/0100543 se informa de constructos dianizables que son portadores multival entes de anticuerpos biespecíficos, es decir, cada molécula de un constructo dianizable puede servir como portador de dos o más anticuerpos biespecíficos. Se informa de anticuerpos tetravalentes biespecíficos genéticamente manipulados en el documento WO n° 1995/009917. En el documento WO n° 2007/109254 se informa de moléculas de unión estabilizadas que consisten o que comprenden un scFv estabilizado.

Combinación de inhibidores de VEGF y de ANG-2 La patente WO n° 2007/068895 se refiere a una combinación de un antagonista de ANG-2 y un antagonista de VEGF, de KDR y/o de FLTL. La patente WO n° 2007/089445 se refiere a combinaciones de inhibidores de ANG-2 y de VEGF.

La patente WO n° 2003/106501 se refiere a proteínas de fusión que se unen a angiopoyetina y que contienen un dominio de multimerización. La patente WO n° 2008/132568 se refiere a proteínas de fusión que se unen a angiopoyetina y a VEGF.

La patente WO n° 2009/136352 se refiere a compuestos antiangiogénicos.

Descripción resumida de la invención La invención se refiere a un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque: i) dicho primer sitio de , unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 1, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 2, y ii) dicho segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 3, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 4.

En un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en las que los dominios constante CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 7, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 5, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 8, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 6.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífíco se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 11, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 9, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 12, y como cadena- ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 10.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífíco se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 15, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 13, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 16, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 14.

Son aspectos todavía adicionales de la invención, una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo biespecífico, dicha composición para el tratamiento del cáncer, la utilización de dicho anticuerpo biespecífico para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer, un método de tratamiento de un paciente que sufre cáncer mediante la administración de dicho anticuerpo biespecífico en un paciente que necesita dicho tratamiento.

Son aspectos todavía adicionales de la invención, una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo biespecífico, dicha composición para el tratamiento de enfermedades vasculares, la utilización de dicho anticuerpo biespecífico para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades vasculares, un método de tratamiento de un paciente que sufre enfermedades vasculares mediante la administración de dicho anticuerpo biespecífico en un paciente que necesita dicho tratamiento.

Un aspecto adicional de la invención es una molécula de ácidos nucleicos codificante de una cadena de un anticuerpo biespecífico según la invención.

La invención proporciona además vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos según la invención capaces de expresar dichos ácidos nucleicos en una célula huésped procanótica o eucariotica, y células huésped que contienen dichos vectores para la producción recombinante de un anticuerpo biespecífico según la invención.

La invención comprende además una célula huésped procanótica o eucariotica que comprende un vector según la invención.

La invención comprende además un método para la producción de un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado porque se expresa un ácido nucleico según la invención en una célula huésped procariótica o eucariótica y recuperar dicho anticuerpo biespecífico a partir de dicha célula o del sobrenadante de cultivo celular. La invención comprende además el anticuerpo obtenido mediante dicho método para la producción de un anticuerpo biespecífico.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, y de la secuencia SEC ID n° 8.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 9, SEC ID n° 10, SEC ID n° 11, y de la secuencia SEC ID n° 12.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n0 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, y de la secuencia SEC ID n° 16.

Los anticuerpos bivalentes biespecíficos según la invención muestran beneficios para pacientes humanos que necesitan de una terapia con diana en VEGF y en ANG-2. Los anticuerpos según la ivnención presentan propiedades altamente valiosas que causan un beneficio para un paciente que sufre dicha enfermedad, especialmente que sufre cáncer. Los anticuerpos biespecíficos según la invención resultan altamente eficaces en en el crecimiento tumoral y/o en la inhibición de la angiogénesis tumoral o de enfermedades vasculares. Los anticuerpos bivalentes biespecíficos <VEGF-ANG-2> según la invención muestran propiedades farmacocinéticas/dinámicas valiosas como, por ejemplo, estabilidad y una buena (es decir lenta) eliminación (por ejemplo a dosis bajas).

Los anticuerpos biespecíficos según la invención resultan altamente eficaces en a) la inhibición del crecimiento tumoral (por ejemplo con los anticuerpos biespecíficos según la invención pudo conseguirse la estasis tumoral ya a concentraciones inferiores en comparación con la combinación de los dos anticuerpos monoespecíficos parentales (por ejemplo en los modelos tumorales COLO205 y KPL4 de los Ejemplos 9 y 10, la estasis tumoral ya se consiguió con 10 mg/kg de XMAbl, en comparación con la combinación de 10 mg/kg de Ang2i-LC06 + 10 mg/kg de avastatina), y/o b) la inhibición de la angiogénesis tumoral o de enfermedades vasculares (por ejemplo ya pudieron conseguirse efectos antiangiogénicos máximos con los anticuerpos biespecíficos según la invención a concentraciones inferiores en comparación con la combinación de los dos anticuerpos monoespecíficos parentales (por ejemplo en el ensayo de angiogénesis corneal en el ratón del Ejemplo 8, el efecto antiangiogénico máximo ya se consiguió con 10 mg/kg de XMAbl, en comparación con la combinación de 10 mg/kg de Ang2i-LC06 + 10 mg/kg de avastatina).

Descripción de las figuras Figura 1 Formato ejemplar de anticuerpo biespecífico bivalente para ejemplos de XMab que incluyen dominios CH3 modificados de botón-en-ojal Figura 2a Formato ejemplar de anticuerpo biespecífico bivalente para ejemplos de OAscFab que incluyen dominios CH3 modificados de botón-en-ojal Figura 2b Formato ejemplar de anticuerpo biespecífico bivalente para ejemplos de OAscXFabl que incluyen dominios CH3 modificados de botón-en-ojal Figura 2c Formato ejemplar de anticuerpo biespecífico bivalente para ejemplos de OAscXFab2 que incluyen dominios CH3 modificados de botón-en-ojal Figura 3 Unión simultánea de XMabl <VEGF-Ang-2> contra VEGF (primera etapa) seguido de la unión a hAng-2 (segunda etapa) Figura 4 Principio de ELISA para la cuantificación de la unión de anticuerpos mAb<Ang2 VEGF> activos Figura 5 Curva de calibración de ELISA para la cuantificación de la unión de anticuerpos XMabl <Ang2 VEGF> activos Figura 6 Ensayo de angiogénesis corneal del ratón - inhibición del crecimiento de vasos del limbo hacia el gradiente de VEGF mediante la administración de un anticuerpo biespecífico según la invención.

Figura 7 Ensayo de angiogénesis corneal del ratón - inhibición de la angiogénesis/crecimiento de vasos del limbo hacia el gradiente de VEGF mediante la administración de un anticuerpo biespecífico según la invención. Comparación entre el anticuerpo XMabl biespecífico <Ang2/VEGF>, el Mab <Ang2> ANG2Í-LC06 (LC06), el Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y la combinación de ANG2Í-LC06 y Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina).

Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral in vivo en el cáncer colorrectal humano Colo205 (tumores pequeños) por un anticuerpo biespecífíco según la invención - Comparación entre el anticuerpo XMabl biespecífíco <Ang2/VEGF>, el Mab <Ang2> ANG2Í-LC06 (LC06), el Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y la combinación de ANG2Í-LC06 y Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina).

Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral in vivo en xenoinjerto en el ratón de cáncer colorrectal humano Colo205 (tumores grandes) por un anticuerpo biespecífíco según la invención - Comparación entre el anticuerpo XMabl biespecífíco <Ang2/VEGF>, el Mab <Ang2> ANG2i-LC06 (LC06), el Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y la combinación de ANG2Í-LC06 y Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina).

Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral in vivo en xenoinjerto de ratón de cáncer de mama humano KPL-4 (tumores pequeños) por un anticuerpo biespecífíco según la invención - Comparación entre el anticuerpo XMabl biespecífíco <Ang2/VEGF>, el Mab <Ang2> ANG2i-LC06 (LC06), el Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y la combinación de ANG2Í-LC06 y Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina).

Figura 11 Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral in vivo en xenoinjerto de ratón de cáncer de mama humano KPL-4 (tumores grandes) por un anticuerpo biespecífico según la invención - Comparación entre el anticuerpo XMabl biespecífico <Ang2 VEGF>, el Mab <Ang2> ANG2i- LC06 (LC06), el Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y la combinación de ANG2Í-LC06 y Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina).

Figura 12 Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral in vivo del cáncer gástrico N87 por un anticuerpo biespecífico según la invención - Comparación entre el anticuerpo XMabl biespecífico <Ang2/VEGF>, el Mab <Ang2> ANG2Í-LC06 (LC06), el Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y la combinación de ANG2Í-LC06 y Mab <VEGF> bevacizumab (Avastatina).

Descripción detallada de la invención La invención se refiere a un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque: i) dicho primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 1, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 2, y ii) dicho segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 3, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 4.

En un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en las que los dominios constante CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

Este formato de anticuerpo bivalente biespecífico para el anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano y la angiopoyetina-2 (ANG-2) humana se describe en la patente WO n° 2009/080253 (ver esquema ejemplar que incluye los dominios CH3 modificados de botón-en-ojal en la figura 1). Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo bivalente biespecífico se denominan XMab en los ejemplos de la presente invención.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 11, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 9, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 12, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 10.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 15, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 13, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 16, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 14.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 19, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 17, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 20, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 18.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 23, y como cadena ligera del primer anticuerpo.de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 21, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 24, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 22.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 27, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 25, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 28, y como, cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 26.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n0 17, SEC ID n0 18, SEC ID n0 19, y de la secuencia SEC ID n° 20.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 21 , SEC ID n° 22, SEC ID n° 23, y de la secuencia SEC ID n° 24.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 25, SEC ID n° 26, SEC ID n° 27, y de la secuencia SEC ID n° 28.

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en el que el extremo N-terminal de la cadena pesada se encuentra conectado al extremo C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido conector.

Un esquema ejemplar de dicho formato de anticuerpo bivalente biespecífico para este anticuerpo biespecífico que se une específicamente a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano y a angiopoyetina-2 (ANG-2) humana se muestra en la figura 2a, que incluye dominios CH3 modificados de botón-en-ojal. Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo bivalente biespecífico se denominan OAscFab en los ejemplos de la presente invención.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 30, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 31 , y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 29.

En una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 33, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 34, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 32.

En una realización, el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa se encuentran estabilizados por puente disulfuro mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera (la numeración en todo caso según el índice EU de Kabat (Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Dicha estabilización adicional mediante disulfuros se consigue mediante la introducción de un enlace disulfuro entre los dominios variables VH y VL de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa. Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización se describen en, por ejemplo, la patente WO n° 94/029350, Rajagopal V. et al, Prot. Engin. 10:1453-59, 1997; obayashi et al, Nuclear Medicine & Biology 25:387-393, 1998, o Schmidt M. et a/., Oncogene 18: 1711-1721, 1999.

De esta manera, en una realización, dicho anticuerpo bivalente biespecífíco se caracteriza porque el enlace disulfuro comprendido entre los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa se encuentra entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, y porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 36, y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 37, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conectar, la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 35.

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífíco según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en los que el extremo N-terminal de la cadena pesada se encuentra conectado al extremo C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido conector, yen los que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente.

Un esquema ejemplar de dicho formato de anticuerpo bivalente biespecifico para este anticuerpo biespecifico que se une específicamente a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano y a angiopoyetina-2 (ANG-2) humana se muestra en la figura 2b, que incluye dominios CH3 modificados de botón-en-ojal. Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo bivalente biespecifico se denominan en los ejemplos OAscXFab 1. En una realización, dicho anticuerpo biespecifico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 39, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 40, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptidq conector, la secuencia SEC ID n° 38.

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo biespecifico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en los que el extremo N-terminal de la cadena pesada se encuentra conectado al extremo C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido conector, y en los que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

Un esquema ejemplar de dicho formato de anticuerpo bivalente biespecífico para este anticuerpo biespecífico que se une específicamente a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano y a angiopoyetina-2 (ANG-2) humana se muestra en la figura 2c, que incluye dominios CH3 modificados de botón-en-ojal. Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo bivalente biespecífico se denominan en los ejemplos OAscXFab2 y OAscXFab3.

En una realización, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 42, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa^ la secuencia SEC ID n° 43, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector, la secuencia SEC ID n° 41.

En una realización, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 45, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 46, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector, la secuencia SEC ID n° 44.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífíco que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 29, SEC ID n° 30, y de la secuencia SEC ID n° 31.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífíco que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 32, SEC ID n° 33, y de la secuencia SEC ID n° 34.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífíco que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 35, SEC ID n° 36, y de la secuencia SEC ID n° 37.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífíco que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 38, SEC ID n° 39, y de la secuencia SEC ID n° 40.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 41 , SEC ID n° 42, y de la secuencia SEC ID n° 43.

Por consiguiente, una realización de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizada porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 44, SEC ID n° 45, y de la secuencia SEC ID n° 46.

Preferentemente, los dominios CH3 de dicho anticuerpo bivalente biespecífico según la invención se altera mediante la tecnología de "botón en ojal", que se describe en detalle mediante varios ejemplos en, por ejemplo, la patente WO n° 96/027011, Ridgway J.B. et al, Protein Eng. 9:617-621, 1996, y en Merchant A.M. et al, Nat. Biotechnol. 16:677-681 , 1998. En este método, se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen dichos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant A.M. et al, Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell S. et al, J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) e incrementa el rendimiento.

En un aspecto preferente de la invención, todos los anticuerpos biespecífícos según la invención se caracterizan porque: el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúnen en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo, en donde se altera dicha interfaz con el fin de estimular la formación del anticuerpo biespecífico, en la que la alteración se caracteriza porque: a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada en el anticuerpo biespecífico, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.

De esta manera, el anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque: el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de b) se reúnen, cada uno, en una interfaz que comprende una alteración de la interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en donde i) en el dominio CH3 de una cadena pesada, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada , y en donde ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.

Preferentemente, dicho residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

Preferentemente, dicho residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

En un aspecto de la invención, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como el aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que pueda formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En una realización, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botón", y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojal". También puede utilizarse un puente disulfuro entre cadenas adicional entre los dominios CH3 (Merchant A.M. et al, Nature Biotech. 16:677-681, 1998), por ejemplo mediante la introducción de una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena de ojal".

En otra realización, el anticuerpo biespecífico según la invención comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones E356C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En otra realización preferente, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación E356C o S354C adicional en el otro dominio CH3 que forma un puente disulfuro entre cadenas) (la numeración en todos los casos según el índice EU de Kabat (Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Aunque también pueden utilizarse alternativa o adicionalmente otras tecnologías de botón-en-ojal, tal como se describe en el documento EP n° 1 870 459 Al . De esta manera, otro ejemplo del anticuerpo biespecífico es R409D; las mutaciones K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal" (numeración en todos los casos según el índice EU de Kabat; Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

En otra realización preferente, el anticuerpo biespecífíco comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena del botón" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojal", y además las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón", y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal".

En otra realización, el anticuerpo biespecífíco comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o dicho anticuerpo biespecífíco trivalente comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, y además las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y las mutaciones D399 y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal".

En una realización de la invención, el anticuerpo biespecífíco según la invención se caracteriza porque presenta una o más de las propiedades siguientes (determinadas en ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 3 a 7): - el anticuerpo bivalente biespecífíco se une a VEGF con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, el anticuerpo bivalente biespecífíco se une a ANG-2 con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por ANG-2 en células HEK293 transfectadas con Tie2 con una IC50 de 15 nM o inferior (en una realización con una IC50 de 10 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de ANG-2 a Tie2 con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de VEGF al receptor de VEGF con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC con una IC50 de 10 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 5 nM o inferior), En una realización, el anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizados porque: i) dicho primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 1, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 2, y ii) dicho segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 3, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 4; y que presenta una o más de las propiedades siguientes (determinadas en ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 3 a 7): el anticuerpo bivalente biespecífico se une a VEGF con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, el anticuerpo bivalente biespecífico se une a ANG-2 con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por ANG-2 en células HEK293 transfectadas con Tie2 con una IC50 de 15 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 10 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de ANG-2 a Tie2 con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de VEGF al receptor de VEGF con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC con una IC50 de 10 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 5 nM o inferior), En un aspecto de la invención, dicho anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en las que los dominios constante CL y CH1 se sustituyen mutuamente. y que presenta una o más de las propiedades siguientes (determinadas en ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 3 a 7): - el anticuerpo bivalente biespecífico se une a VEGF con un valor de D de afinidad de unión de 5 nM o inferior, - el anticuerpo bivalente biespecífico se une a ANG-2 con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por ANG-2 en células HEK293 transfectadas con Tie2 con una IC50 de 15 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 10 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de ANG-2 a Tie2 con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de VEGF al receptor de VEGF con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC con una IC50 de 10 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 5 nM o inferior), En una realización, el anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizados porque: i) dicho primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 1 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 2 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y ii) dicho segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 3 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 4 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs.

En una realización, el anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza porque comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizados porque: i) dicho primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 1 con sustituciones de, como máximo, l residuo aminoácido en las CDRs, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 2 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y ii) dicho segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 3 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 4 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y que presenta una o más de las propiedades siguientes (determinadas en ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 3 a 7): el anticuerpo bivalente biespecífico se une a VEGF con un valor de D de afinidad de unión de 5 nM o inferior, el anticuerpo bivalente biespecífico se une a ANG-2 con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por ANG-2 en células HEK293 transfectadas con Tie2 con una IC50 de 15 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 10 nM o inferior), el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de ANG-2 a Tie2 con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de VEGF al receptor de VEGF con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC con una IC50 de 10 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 5 nM o inferior), En un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y en el que la cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa comprende la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 7 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y la cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en las que los dominios constante CL y CH1 se sustituyen mutuamente. y en las que la cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs y la cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs.

En un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y en el que la cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa comprende la secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID n° 7 con. sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y la cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en las que los dominios constante CL y CH1 se sustituyen mutuamente. y en las que la cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs y la cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6 con sustituciones de, como máximo, 1 residuo aminoácido en las CDRs, y que presenta una o más de las propiedades siguientes (determinadas en ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 3 a 7): - el anticuerpo bivalente biespecífico se une a VEGF con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, - el anticuerpo bivalente biespecífico se une a ANG-2 con un valor de KD de afinidad de unión de 5 nM o inferior, el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por ANG-2 en células HEK293 transfectadas con Tie2 con una IC50 de 15 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 10 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de ANG-2 a Tie2 con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la unión de VEGF al receptor de VEGF con una IC50 de 20 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 15 nM o inferior), - el anticuerpo bivalente biespecífico inhibe la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC con una IC50 de 10 nM o inferior (en una realización, con una IC50 de 5 nM o inferior), Tal como se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo" se refiere a una proteína de unión que comprende sitios de unión a antígeno. Las expresiones "sitio de unión" o "sitio de unión a antígeno" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a una o más regiones de una molécula de anticuerpo a las que se une realmente un ligando. La expresión "sitio de unión a antígeno" comprende dominios variables de cadena pesada (VH) de anticuerpo y dominios variables de cadena ligera (VL) de anticuerpo (pareja VH VL). La especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento específico del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos.

La expresión "anticuerpos biespecíficos" según la invención se refiere a anticuerpos que presentan dos especificidades de unión de antígeno diferentes. Los anticuerpos de la presente invención son específicos de dos antígenos diferentes, VEGF como primer antígeno, y ANG-2 como segundo antígeno.

El término "monoespecífico" referido a un anticuerpo tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que presenta uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno.

El término "valente" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" se refieren a la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos según la invención son "bivalentes".

El término "VEGF" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF VEGF-A) humano (SEC ID n° 47), descrito en, por ejemplo, Leung D.W. et al, Science 246:1306-9, 1989; Keck PJ. et al, Science 246:1309-12, 1989, y Connolly D.T. et al, J. Biol. Chem. 264:20017-24, 1989. VEGF se encuentra implicado en la regulación de la angiogénesis normal y anormal y en la neovascularización asociada a tumores y a trastornos intraoculares (Ferrara N. et al, Endocr. Rev. 18:4-25, 1997; Berkman R.A. et al, J. Clin. Invest. 91 :153-159, 1993; Brown L.F. et al, Human Pathol. 26:86-91, 1995; Brown L.F. et al, Cáncer Res. 53:4727-4735, 1993; Mattern J. et al, Brit. J. Cáncer 73:931-934, 1996, y Dvorak H.F. et al, Am. J. Pathol. 146:1029-1039, 1995). VEGF es una glucoproteína homodimérica que ha sido aislada de varias fuentes. VEGF muestra una actividad mitogénica altamente específica para las células endoteliales. El término "ANG-2" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) (alternativamente abreviada ANGPT2 ó ANG2) (SEC ID n° 48), que se describe en, por ejemplo, Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997, y Cheung A.H. et al, Genomics 40:389-91, 1998. Las angiopoyetinas 1 y 2 fueron descubiertas como ligandos de las Ties, una familia de tirosina quinasas que se expresa selectivamente dentro del endotelio vascular. Yancopoulos G.D. et al, Nature 407:242-48, 2000. En la actualidad se han descubierto cuatro miembros definitivos de la familia de las angiopoyetinas. Las angiopoyetinas 3 y 4 (Ang-3 y Ang-4) podrían representar contrapartidas ampliamente divergentes del mismo locus génico .en el ratón y el ser humano. Kim I. et al, FEBS Lett. 443:353-56, 1999; Kim I. et al, J. Biol. Chem. 274:26523-28, 1999. ANG-1 y ANG-2 fueron identificados originalmente en experimentos de cultivo de tejidos como agonista y antagonista, respectivamente (ver, para ANG-1 : Davis S. et al, Cell 87: 1 161-69, 1996; y para ANG-2: Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2, y tanto Ang-1 como Ang-2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd). (Maisonpierre P.C. et al, Science 277:55-60, 1997).

Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico de la invención puede contener seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que contribuyen en diversos grados a la afinidad del sitio de unión para el antígeno. Existen tres CDRs de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDRs de dominio variable de cadena ligera (CDRLl , CDRL2 y CDRL3). La extensión de las regiones CDR y de marco (FRs) se determina mediante comparación con una base de datos compilada a partir de secuencias de aminoácidos en las que dichas regiones se han definido según la variabilidad entre secuencias. También se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención los sitios de unión a antígeno funcionales que comprenden menos CDRs (es decir, en lso que la especificidad de unión está determinada por tres, cuatro o cinco CDRs). Por ejemplo, menos de un juego completo de 6 CDRs puede resultar suficiente para la unión. En algunos casos, resultará suficiente un dominio VH o un dominio VL.

Los anticuerpos de la invención comprenden además regiones constantes de inmunoglobulina de una o más clases de inmunoglobulina. Entre las clases de inmunoglobulina se incluyen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y, en el caso de IgA e IgA, los subtipos de las mismas.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir la región de unión, procedénte de una fuente o especie, y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de "anticuerpos quiméricos" comprendidas en la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la unión de receptor Fe (FcR). Este tipo de anticuerpos quiméricos también se denomina "anticuerpos de clase intercambiada". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Morrison, S.L. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1985, y las patentes US n° 5.202.238 y n° 5.204.244).

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que el marco o las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) han sido modificadas para que comprendan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferente, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar un "anticuerpo humanizado". Ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al, Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger, M.S. et al, Nature 314:268-270, 1985. Las CDRs particularmente preferentes corresponden a aquéllas que representan secuencias que reconocen los anteriormente indicados antígenos de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la del receptor de Fe (FcR).

La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el reto de antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits A. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits A. et al, Nature 362:255-258, 1993; Brueggemann M. et al, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Las técnicas de Colé, A. et al y de Boerner P. et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé A. et al, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, A.R. Liss, página 77, 1985; y Boerner P. et al, J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal como ya se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión "anticuerpo humano" tal como se utiliza en la presente memoria también comprende los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o la unión de FcR, por ejemplo mediante "intercambio de clase", es decir, el cambio o mutación de partes Fe (por ejemplo de IgGl a IgG4 y/o la mutación IgGl/IgG4).

La expresión "anticuerpo recombinante humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NSO o CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutación somática in vivo. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana. La expresión "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL), dominio variable de una cadena pesada (VH)) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada cadena de la pareja de cadenas ligera y pesada implicada directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas variables ligeras y pesadas humanas presentan la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas y conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDRs). Las regiones de marco adoptan una conformación de hoja ß y las CDRs pueden formar bucles conectando la estructura de hoja ß. Las CDRs en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de marco y forman conjuntamente con las CDRs de la otra cadena el sitio de unión de antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención y, por lo tanto, proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o "parte de unión de antígeno de un anticuerpo", tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs". Las regiones "de marco" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDRs en cada cadena se encuentran separadas por dichos aminoácidos de marco. En particular, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de antígeno. Las regiones de CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat E.A. eí al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (incluye la numeración según el índice EU de Kabat (abreviada como numeración según Kabat posteriormente en la presente memoria)).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "unión" o "unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno (VEGF humano o ANG-2 humana) en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia) (Ejemplo 3) con antígeno de tipo salvaje purificado. La afinidad de unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno), ko (constante de disociación) y D (ko/ka). En una realización, unión o unión específica se refiere a una afinidad de unión (KD) de 10"8 moles/1 o inferior, preferentemente de entre 10"9 M y 10" 13 moles/1.

El término epítopo incluye cualquier determinante polipéptido capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el determinante epítopo incluye grupos superficiales químicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, fosforilo o sulfonilo y, en determinadas realizaciones, puede presentar características estructurales tridimensionales específicas, o presentar características de carga específica. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo.

En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno en el caso de que reconozca preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

La expresión "anticuerpo de longitud completa" se refiere a un anticuerpo que consiste de dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa" (ver la fig. 1). Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CHl), una región bisagra de anticuerpo (HR), un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3), en forma abreviada: VH-CH1-HR-CH2-CH3, y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada de anticuerpo (CH4) en el caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Preferentemente la "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de VH, CHl, HR, CH2 y CH3. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL), en forma abreviada: VL-CL. El dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) puede ser ? (kappa) o ? (lambda). Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa se encuentran unidas entre sí mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos, entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Son ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos anticuerpos naturales tales como IgG (por ejemplo IgGl e lgG2), IgM, IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos de longitud completa según la invención pueden ser de una única especie, por ejemplo el ser humano, o puede ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa según la invención comprende dos sitios de unión de antígeno formado cada uno de una pareja de VH y VL, uniéndose ambos específicamente al mismo antígeno. El extremo C-terminal de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido en el extremo C-terminal de dicha cadena pesada o ligera. El extremo N-terminal de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido en el extremo N-terminal de dicha cadena pesada o ligera.

La expresión "péptido conector" tal como se utiliza en la invención se refiere a un péptido con secuencias de aminoácidos que preferentemente es de origen sintético. Estos péptidos según la invención se utilizan para conectar el extremo C-terminal de la cadena ligera al extremo N-terminal de la cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa (que se une específicamente a un segundo antígeno) mediante un péptido conector. El péptido conector dentro de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de por lo menos 30 aminoácidos, preferentemente con una longitud de entre 32 y 50 aminoácidos. En una realización, el péptido conector es un péptido con una secuencia de aminoácidos que presenta una longitud de entre 32 y 40 aminoácidos. En una realización, dicho conector es (GxS)n, con G=glicina, S=serina, (x=3, n=8, 9 ó 10, y m=0, 1, 2 ó 3), o (x=4 y n=6, 7 ó 8, y m=0, 1 , 2 ? 3), preferentemente con x=4, n-6 ó 7, y m=0, 1 , 2 ó 3, más preferentemente con x=4, n=7 y m=2. En una realización, dicho conector es (G4S)6G2.

La expresión "región constante" tal como se utiliza en las presentes solicitudes se refiere a la suma de los dominios de un anticuerpo que no son la región variable. La región constante no se encuentra directamente implicada en la unión de un antígeno, aunque muestra diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases siguientes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases, tales como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera que pueden encontrarse en la totalidad de las cinco clases de anticuerpo se denominan ? (kappa) y ? (lambda).

La expresión "región constante derivada de un origen humano" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Dichas regiones constantes son bien conocidas del estado de la técnica y son descritas por, por ejemplo, Kabat, E.A. (ver, por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28:214-218, 2000; Kabat, E.A. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72:2785-2788, 1975.

Preferentemente, los anticuerpos bivalentes biespecíficos según la invención presentan una región constante de la subclase IgGl humana.

Aunque los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran un nivel reducido de unión de Fe (FcyRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran unión. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que, en caso de alterarse, también proporcionan un nivel reducido de unión de Fe (Shields, R.L. et ai, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001 ; Lund, J. et al, FASEB J. 9:1 15-119, 1995; Morgan, A. et ai, Immunology 86:319-324, 1995; patente EP n° 0 307 434).

En una realización, un anticuerpo según la invención presenta un nivel reducido de unión de FcR en comparación con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo bivalente biespecífico presenta, con respecto a la unión de FcR de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl, una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una realización, las mutaciones en el anticuerpo bivalente biespecífico son en IgG4, S228P y L235E, y en IgGl, L234A y L235A.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico caracterizado porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno,en las que el extremo N-terminal de la cadena pesada se encuentra conectado al extremo C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido conector, yen las que los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

Preferentemente, los dominios CH3 de dicho formato de anticuerpo bivalente biespecífico se alteran mediante la tecnología de "botón en ojal", que se describe en detalle mediante varios ejemplos en, por ejemplo, la patente WO n° 96/02701 1, Ridgway J.B. et ai, Protein Eng. 9:617-621, 1996, y en Merchant A.M. et al, Nat. Biotechnol. 16:677-681 , 1998. En este método, se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen dichos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant A.M. et al, Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell S. et al, J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) e incrementa el rendimiento. Para más detalles y realizaciones ver anteriormente.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico caracterizado porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en las que el extremo N-terminal de la cadena pesada se encuentra conectado al extremo C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido conector, yen las que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente.

Un esquema ejemplar de dicho formato de anticuerpo bivalente biespecífico se muestra en la figura 2b, que incluye dominios CH3 modificados de botón-en-ojal. Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo bivalente biespecífico se denominan en los ejemplos OAscXFabl.

En una realización, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 39, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 40, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conectar, la secuencia SEC ID n° 38.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo bivalente biespecífico caracterizado porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en los que el extremo N-terminal de la cadena pesada se encuentra conectado al extremo C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido conector, y en los que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

Un esquema ejemplar de dicho formato de anticuerpo bivalente biespecífico se muestra en la figura 2c, que incluye dominios CH3 modificados de botón-en-ojal. Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo bivalente biespecífico se denominan en los ejemplos OAscXFab2 y OAscXFab3.

En una realización, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 42, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 43, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector, la secuencia SEC ID n° 41.

En una realización, dicho anticuerpo biespecifico se caracteriza porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 45, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 46, y b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectado a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector, la secuencia SEC ID n° 44.

El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico codificante del anticuerpo según la invención, y un aspecto adicional es una célula que comprende dicho ácido nucleico codificante de un anticuerpo según la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos del estado de la técnica y comprende la expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con el aislamiento posterior del anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos tal como se ha indicado anteriormente en una célula huésped, se insertan ácidos nucleicos codificantes de las cadenas ligeras y pesadas modificadas respectivas en los vectores de expresión mediante métodos estándares.

La expresión se lleva a cabo en células huésped procarióticas o eucarióticas apropiadas, tales como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HE 293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o de la parte celular tras la lisis). Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos del estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17: 183-202, 1999; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16:151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Por consiguiente, una realización de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespecífico según la invención, que comprende las etapas de: a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dicho anticuerpo, b) b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Se separan convenientemente anticuerpos biespecíficos a partir del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN codificante de los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células HEK 293, células CHO o células de miel orna que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Las variantes (o mutantes) de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo biespecífico trivalente se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo, sin embargo, únicamente en un rango muy limitado. Por ejemplo, las modificaciones que no alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo, tal como el isotipo y la unión de antígeno del IgG pero que podrían mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

La expresión "célula huésped" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una realización, se utilizan células HEK293 y CHO como células huésped. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas dichas denominaciones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada.

La expresión en células NSO se describe en, por ejemplo, Barnes, L.M. et al, Cytotechnology 32: 109-123, 2000; Barnes, L.M. et al, Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y. et al, Nucí. Acids Res. 30:E9, 2002. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Cárter, P. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al, J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, ., Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194: 191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, intensifícadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" en el caso de que se encuentre situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN de un polipéptido en el caso de que se exprese en forma de una preproteina que participe en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre situado de manera que facilite la traducción. Generalmente, la expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensifícadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o una molécula conectora según la práctica convencional.

La purificación de los anticuerpos se lleva a cabo con el fin de eliminar los componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, incluyendo el tratamiento alcalino/de SDS, la formación de bandas en CsCl, la cromatografía de columna, la electroforesis en gel de agarosa, y otras técnicas bien conocidas de la técnica (ver Ausubel, F. et al, editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Una serie de diferentes métodos se encuentran bien establecidos y son ampliamente utilizados para la purificación de proteínas, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo la cromatografía de afinidad de proteína A o de proteína G), la cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas carboximetilo), de intercambio aniónico (resinas minoetilo) y de intercambio de modo mixto), la adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y con otros ligandos de SH), la cromatografía de interacción hidrofóbica o de adsorción aromática (por ejepmlo con fenil-sefarosa, resians aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico), la cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo con material de afinidad por el Ni(II) y por el Cu(II)), la cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como la electroforesis en gel y la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75:93-102, 1998).

Ahora se ha encontrado que los anticuerpos biespecíficos contra el VEGF humano y la ANG-2 humana según la presente invención presentan características valiosas, tales como una elevada estabilidad y propiedades farmacocinéticas/farmacodinámicas valiosas tales como, por ejemplo, buena (es decir lenta) eliminación (por ejemplo a dosis bajas).

Los anticuerpos bivalentes biespecíficos según la invención muestran beneficios para pacientes humanos que necesitan de una terapia con diana en VEGF y en ANG-2.

Además, presentan actividad biológica o farmacológica y muestran una inhibición del crecimiento tumoral in vivo y/o inhibición de la angiogénesis tumoral.

Los anticuerpos biespecíficos según la invención resultan altamente eficaces en a) la inhibición del crecimiento tumoral (por ejemplo con los anticuerpos biespecíficos según la invención pudo conseguirse la estasis tumoral ya a concentraciones inferiores en comparación con la combinación de los dos anticuerpos monoespecí fieos parentales (por ejemplo en los modelos tumoral es COLO205 y KPL4 de los Ejemplos 9 y 10, la estasis tumoral ya se consiguió con 10 mg/kg de XMAbl, en comparación con la combinación de 10 mg/kg de Ang2i-LC06 + 10 mg/kg de avastatina), y/o b) la inhibición de la angiogénesis tumoral o de enfermedades vasculares (por ejemplo ya pudieron conseguirse efectos antiangiogénicos máximos con los anticuerpos biespecíficos según la invención a concentraciones inferiores en comparación con la combinación de los dos anticuerpos monoespecíficos parentales (por ejemplo en el ensayo de angiogénesis corneal en el ratón del Ejemplo 8, el efecto antiangiogénico máximo ya se consiguió con 10 mg/kg de XMAbl, en comparación con la combinación de 10 mg/kg de Ang2i-LC06 + 10 mg/kg de avastatina).

Finalmente, el anticuerpo bivalente biespecífico contra el VEGF humano y la ANG-2 humana según la presente invención puede presentar un perfil de eficacia/toxicidad valioso y puede proporcionar beneficios para un paciente que necesita una terapia anti-VEGF y anti-ANG-2.

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención. Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de una composición farmacéutica. Un aspecto adicional de la invención es un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención. En ótro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo según la presente invención, formulado conjuntamente con un portador farmacéutico.

Una realización de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer mediante la administración de un anticuerpo según la invención en un paciente que necesita dicho tratamiento.

Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica para el tratamiento de la metástasis.

La invención comprende el anticuerpo biespecífico según la invención para la prevención de la metástasis.

Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo biespecífico según la invención para la preparación de un medicamento destinado a la prevención de la metástasis.

Otro aspecto de la invención es un método para la prevención de la metástasis en un paciente que sufre cáncer primario, mediante la administración de un anticuerpo biespecífico según la invención en un paciente que necesita dicho tratamiento preventivo. Los presentes inventores pudieron demostrar una prevención altamente eficiente de metástasis espontánea/tumores secundarios in vivo en un modelo de cáncer ortotópico y en uno subcutáneo (ver el Ejemplo 9) (en contraste con el modelo experimental en el que las células tumorales se inyectan i.v. Esto es similar a la situación clínica en la que las células se diseminan desde un tumor primario y metastatizan a un órgano secundario como el pulmón o el hígado (en donde son tumores secundarios)).

El término "metástasis" según la invención se refiere a la transmisión de células cancerosas desde el tumor primario a uno o más sitios distantes en un paciente en el que en este caso se desarrollan tumores secundarios. Los medios para determinar si un cáncer se ha metastatizado son conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen el escaneo óseo, rayos X torácico, escaneo CAT, escaneo MRI y ensayos de marcadores tumorales.

La expresión "prevención de la metástasis" o "prevención de tumores secundarios" tal como se utiliza en la presente memoria presenta el mismo significado y se refiere a un agente profiláctico contra la metástasis en un paciente que sufre cáncer, inhibiendo o reduciendo de esta manera una transmisión posterior de células cancerosas desde el tumor primario a uno o más sitios distantes en un paciente. Lo anterior implica que la metástasis del tumor o cáncer primario se impide, se retrasa o se reduce y, de esta maenra, se impide, se retrasa o se reduce el desarrollo de tumores secundarios. Preferentemente la metástasis, es decir los tumores secundarios, de pulmón se impiden o se reduce, lo que implica que se impide o se reduce la transmisión metastásica de células cancerosas del tumor primario hasta el pulmón.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "portador farmacéutico" incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, medios dé dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, ?? portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión).

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención mediante determinadas vías de administración, puede resultar necesario recubrir el compuesto con un material, o coadministrar el compuesto con un material, para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse en un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas o un diluyente. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina y soluciones tamponadoras acuosas. Entre los portadores farmacéuticos se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida de la técnica.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitarse a las mismas, las inyecciones e infusiones intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal El término "cáncer" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de células pulmonares no pequeñas (NSCL), cáncer pulmonar de células bronquioloalveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de tiñón o uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasma del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependinomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriormente indicados, o de una combinación de uno o más de los cánceres anteriormente indicados.

Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención o dicha composición farmacéutica como agente antiangiogénico. Dicho agente antiangiogénico puede utilizarse para el tratamiento del cáncer, especialmente de tumores sólidos y de otras enfermedades vasculares.

Una realización de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que sufre cáncer, mediante la administración de un anticuerpo según la invención en un paciente que necesita dicho tratamiento.

La expresión "enfermedades vasculares" incluye cáncer, enfermedades inflamatorias, ateroesclerosis, isquemia, traumatismo, sepsis, COPD, asma, diabetes, AMD, retinopatía, ictus, adipositas, lesión pulmonar aguda, hemorragia, fuga vascular, por ejemplo inducida por citoquinas, alergia, enfermedad de Graves, tiroiditis autoinmunológica de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, arteritis de células gigantes, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis lupus, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, colitis ulcerosa, especialmente a tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares, tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular relacionada con la edad (AMD), artritis reumatoide y soriasis (Folkman J. et al, J. Biol. Chem. 267:10931-10934, 1992; Klagsbrun M. et al, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239, 1991, y Garner A., Vascular Diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner A. y Klintworth G.K. (editores), 2a edición, Marcel Dekker, New York, 1994, páginas 1625 a 1710 Dichas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibactérianos y antifúngicos, por ejemplo parabén, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, puede conseguirse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Con independencia de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.

Los niveles reales de las dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que resulte efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada en un paciente, composición y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se utiliza, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, sexo, peso, condición, estado de salud general e historia médica del paciente bajo tratamiento, y factores similares bien conocidos de la técnica médica.

La composición debe ser estéril y líquida en grado suficiente para que la composición resulte administrable mediante jeringa. Además de agua, el portador preferentemente es una solución salina tamponada isotónica.

Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo mediante la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante la utilización de surfactantes. En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas dichas expresiones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. En donde se pretendan utilizar denominaciones diferentes, éstas resultarán evidentes a partir del contexto.

El término "transformación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico al interior de una célula huésped. En el caso de que se utilicen células sin grandes barreras de pared celular a modo de células huésped, la transfección se lleva a cabo mediante, por ejemplo, el método de precipitación con fosfato de calcio, tal como se describe en Graham F.L. y van der Eb A.J., Virology 52:546-467, 1973. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en las células, tales como la inyección nuclear o la fusión de protoplasto. En el caso de que se utilicen células procarióticas o células que contengan construcciones de pared celular sustanciales, un método de transfección es, por ejemplo, el tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio, tal como describen Cohén S.N. et al. , PNAS 69:21 10-21 14, 1972.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "expresión" se refiere al procedimiento por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o al procedimiento por el que el ARNm transcrito (también denominado "transcrito") se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente "producto génico". En el caso de que se derive el polinucleótido de ADN genómico, la expresión en una célula eucariótica puede incluir el procesamiento del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácidos nucleicos, en particular autorreplicativa, que transfiere una molécula de ácidos nucleicos insertada al interior de células huésped o entre las mismas. El término incluye vectores que funcionan principalmente insertando ADN o ARN en una célula (por ejemplo la integración cromosómica), la replicación de vectores que funcionan principalmente replicando ADN o ARN, y los vectores de expresión que funcionan transcribiendo y/o traduciendo ADN o ARN. También se encuentran incluidos los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriormente descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, al introducirlo en una célula huésped apropiada, puede transribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" habitualmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar rindiendo un producto de expresión deseado.

Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espíritu de la invención.

Descripción del listado de secuencias (secuencias de aminoácidos") SEC ID n° 1 dominio variable de cadena pesada VH de bevacizumab <VEGF> SEC ID n° 2 dominio variable de cadena ligera VL de bevacizumab <VEGF> SEC ID n° 3 dominio variable de cadena pesada VH de E6Q <ANG-2> SEC ID n° 4 dominio variable de cadena ligera VL de E6Q <ANG-2> SEC ID n° 5 cadena ligera de XMabl-<VEGF> SEC ID n° 6 cadena ligera de XMabl-<ANG-2> SEC ID n° 7 cadena pesada de XMabl-<VEGF> SEC ID n° 8 cadena pesada de XMabl-<ANG2> SEC ID n° 9 cadena ligera de XMab2-<VEGF> SEC ID n° 10 cadena ligera de XMab2-<ANG-2> SEC ID n° 11 cadena pesada de XMab2-<VEGF> SEC ID n° 12 cadena pesada de XMab2-<ANG2> SEC ID n° 13 cadena ligera de XMab3-<VEGF> SEC ID n° 14 eadena ligera de XMab3-<ANG-2> SEC ID n° 15 cadena pesada de XMab3-<VEGF> SEC ID n° 16 cadena pesada de XMab3-<ANG2> SEC ID n° 17 cadena ligera de XMab4-<VEGF> SEC ID n° 18 cadena ligera de XMab4-<ANG-2> SEC ID n° 19 cadena pesada de XMab4-<VEGF> SEC ID n° 20 cadena pesada de XMab4-<ANG2> SEC ID n° 21 cadena ligera de XMab5-<VEGF> SEC ID n° 22 cadena ligera de XMab5-<ANG-2> SEC ID n° 23 cadena pesada de XMab5-<VEGF> SEC ID n° 24 cadena pesada de XMab5-<ANG2> SEC ID n° 25 cadena ligera de XMab6-<VEGF> SEC ID n° 26 cadena ligera de XMab6-<ANG-2> SEC ID n° 27 cadena pesada de XMab6-<VEGF> SEC ID n° 28 cadena pesada de XMab6-<ANG2> SECIDn029 cadena pesada y cadena ligera de 0AscFabl-<ANG2> conectadas mediante péptido SECIDn030 cadena pesada de OAscFabl-<VEGF> SECIDn031 cadena ligera de O AscFabl-<VEGF> SECIDn032 cadena pesada y cadena ligera de OAscFab2-<ANG2> conectadas mediante péptido SECIDn033 cadena pesada de OAscFab2-<VEGF> SECIDn034 cadena ligera de OAscFab2-<VEGF> SEC ID n° 35 cadena pesada y cadena ligera de OAscFab3-<ANG2> conectadas mediante péptido SECIDn036 cadena pesada de OAscFab3-<VEGF> SECIDn037 cadena ligera de OAscFab3-<VEGF> SEC ID n° 38 cadena pesada y cadena ligera de OAscXFabl-<ANG2> conectadas mediante péptido SECIDn039 cadena pesada de O AscXFabl-<VEGF> SEC ID n° 40 cadena ligera de OAscXFab 1 -<VEGF> SECIDn041 cadena pesada y cadena ligera de OAscXFab2-<ANG2> conectadas mediante péptido SECIDn042 cadena pesada de OAscXFab2-<VEGF> SEC ID n° 43 cadena ligera de OAscXFab2-<VEGF> cadena pesada y cadena ligera de OAscXFab3-<ANG2> conectadas mediante péptido cadena pesada de OAscXFab3-<VEGF> cadena ligera de OAscXFab3-<VEGF> Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano Angiopoyetina-2 (ANG-2) humana Procedimientos experimentales Ejemplos Materiales y métodos generales Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo se numeran y se hace referencia a las mismas según la numeración EU (Edelman G.M. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63:78-85, 1969; Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

Técnicas de ADN recombinante Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Síntesis génica Los segmentos génicos deseados pueden prepararse a partir de oligonucleótidos construidos mediante síntesis química. Los segmentos génicos, que se encuentran flanqueados por sitios de restricción de corte por endonucleasa únicos, se ensamblaron mediante hibridación y ligación de oligonucleótidos, incluyendo la amplificación por PCR, y posteriormente se clonaron utilizando los sitios de restricción indicados, por ejemplo Kpnl/SacI o AscI/PacI en un vector de clonación pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Las secuencias de ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmaron mediante secuenciación del ADN.

Los fragmentos de síntesis génica se ordenaron según las especificaciones proporcionadas por Geneart (Regensburg, Alemania). Todos los segmentos génicos codificantes de las cadenas ligera y pesada de los anticiuerpos biespecíficos Ang-2/VEGF se sintetizaron con una secuencia de ADN 5'-terminal de un péptido líder (MGWSCIILFLVATATGVHS), que dirige proteínas para su secreción en células eucarióticas, y sitios de restricción únicos en los extremos 5' y 3' del gen sintetizado. Las secuencias de ADN que portaban cadenas pesadas modificadas "de botón en ojal" estabilizadas con disulfuro se diseñaron con las mutaciones S354C y T366W en la cadena pesada "de botón" y las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V en la cadena pesada "de ojal".

Determinación de la secuencia de ADN Se determinaron las secuencias de ADN mediante secuenciación de doble cadena realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o en Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania).

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de secuencias El paquete informático del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), versión 10.2, y el programa informático Vector NT1 Advance suite versión 8.0 de Infomax, fueron utilizados para la creación de secuencias, mapeado, análisis, anotación e ilustración.

Vectores de expresión Para la expresión de los anticuerpos indicados se utilizaron variantes de plásmidos de expresión para células de expresión transitoria (por ejemplo HEK293 EBNA o HEK293-F) o para la expresión estable (por ejemplo en células CHO) basada en una organización de ADNc con un promotor del CMV con intrón A o en una organización genómica con un promotor de CMV (por ejemplo la figura 2B).

Aparte del cásete de expresión de anticuerpo, los vectores contenían: un origen de replicación que permite la replicación de dicho plásmido en E. coli, y un gen ß-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina a E. coli.

La unidad de transcripción del gen de anticuerpo está compuesta de los elementos siguientes: uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 5' el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano, seguido de la secuencia del intrón A en el caso de la organización de ADNc, - una región 5' no traducida de un gen de anticuerpo humano, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina, la cadena de anticuerpo humana (cadena pesada, cadena pesada o cadena ligera modificada) en forma de ADNc o de organización genómica con una organización de exón-intrón de inmunoglobulina - una región 3' no traducida con una secuencia de señal de poliadenilación, y uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 3'.

Para transfecciones transitorias y estables, se prepararon cantidades mayores de los plásmidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de cultivo celular Se utilizaron técnicas estándares de cultivo celular tales como las descritas en Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. y Yamada .M. (editores), John Wiley & Sons, Inc.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F Se expresaron variantes recombinantes de inmunoglobulina mediante transfección transitoria de células 293-F renales embrionarias humanas utilizando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 Expression System siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA). Brevemente, se cultivó una suspensión de células 293-F FreeStyle™ en medio de expresión FreeStyle™ 293 Expression médium, a 37°C/8% de C02, y las células se sembraron en medio fresco a una densidad de entre lxl O6 y 2x106 células viables/ml el día de la transfección. Se prepararon complejos de ADN-293fectin™ en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de plásmido de ADN de cadena pesada y de cadena ligera en una proporción molar 1 :1 para un volumen final de transfección de 250 mi en el caso de anticuerpos parentales monoespecíficos. Se prepararon complejos de ADN-293fectin de "botón en ojal" con cadenas pesadas y una cadena ligera en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de plásmido de ADN "botón en ojal" de cadenas pesadas 1 y 2 y de cadena ligera generalmente en una proporción molar 1:1 :1 para un volumen final de transfección de 250 mi (OAscFab y OAscXFab). Para la optimización del rendimiento de expresión puede modificarse la proporción. Se prepararon complejos de ADN-293fectin XMab en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de plásmido de ADN "botón en ojal" de cadenas pesadas 1 y 2 y de cadena ligera en proporciones molares 1 : 1 :1 : 1 para un volumen final de transfección de 250 mi. Para la optimización del rendimiento de expresión puede modificarse la proporción. Se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos 7 días después de la transfección mediante centrifugación a H.OOOxg durante 30 minutos, y se filtraron a través de un filtro estéril (0,22 µp?). Los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta la purificación.

Determinación de proteínas Se determinó la concentración de proteínas de anticuerpos purificados y derivados, mediante la determinación de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos según Pace C.N. et al, Protein Science 4:2411-2423, 1995.

Determinación de la concentración de anticuerpos en sobrenadantes Se estimó la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular mediante inmunoprecipitación con perlas de agarosa-proteína A (Roche). Se lavaron 60 µ? de perlas de agarosa-proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1%). Posteriormente, se aplicaron 1 a 15 mi de sobrenadante de cultivo celular a las perlas de agarosa-proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Tras la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las perlas se lavaron en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 mi de TBS-NP40, dos veces con 0,5 mi de 2x de solución salina tamponada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 mi de citrato sódi 100 mM, pH 5,0. El anticuerpo ligado se eluyó mediante la adición de 35 µ? de tampón para muestras NuPAGE® LDS (Invitrogen). Se combinó la mitad de la muestra con agente reductor de muestras NuPAGE® o se dejó sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 minutos a 70°C. Después, se aplicaron 20 µ? a un SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE® al 4-12% (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo antioxidante de tampón de corrido NuPAGE® (Invitrogen) para un SDS-PAGE reducido) y se tiñeron con azul de Coomassie. La concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular se midió mediante cromatografía HPLC-proteína A. Brevemente, se aplicaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos y derivados que se unen a proteína A a una columna HiTrap de proteína A (GE Healthcare) en K2HP04 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,3, y se eluyeron de la matriz con ácido acético 550 mM, pH 2,5, en un sistema de HPLC Dionex. Las proteínas eluídas se cuantificaron a partir de la absorbancia de UV e integración de las áreas de los picos. Un anticuerpo IgGl estándar purificado sirvió como estándar.

Alternativamente, se mide la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular mediante ELISA tipo sándwich de IgG. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina StreptaWell High Bind (Roche) con 100 µ?/pocillo de molécula de captura biotinilada anti-IgG humana F(ab')2<h-Fcy> BI (Dianova) a una concentración de 0,1 pg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente, o alternativamente durante la noche a 4°C y posteriormente se lavaron tres veces con 200 µ?/pocillo de PBS, Tween al 0,05% (PBST, Sigma). Se añadieron 100 µ?/pocillo de una serie de dilución en PBS (Sigma) de sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo respectivo, a los pocilios y se incubaron durante 1 a 2 horas en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Los pocilios se lavaron tres veces con 200 µ?/pocillo de PBST y el anticuerpo ligado se detectó con 100 µ? de F(ab')2<hFcy>POD (Dianova) a una concentración de 0,1 µg/ml como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador para placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavó el anticuerpo de detección no ligado tres veces con 200 µ?/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección ligado se detectó mediante adición de 100 µ? de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llevó a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Purificación de anticuerpos biespecíficos Se purificaron anticuerpos biespecíficos a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex200. Brevemente, se pasaron sobrenadantes de cultivo celular filtrados a esterilidad por una columna HiTrap HP de proteína A (5 mi) equilibrada con tampón PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no unidas se lavaron con tampón de equilibración. Los anticuerpos y variantes de anticuerpo se eluyeron con tampón citrato 0,1 M, pH 2,8, y las fracciones que contenían proteínas se neutralizaron con 0,1 mi de Tris 1 M, pH 8,5. A continuación, las fracciones de proteínas eluidas se agruparon, se concentraron con un dispositivo de filtración centrífuga de Amicon Ultra (valor de corte de PM: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 mi y se cargaron en una columna de filtración en gel 16/60 Superdex200 HiLoad de 120 mi (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. Las fracciones que contenían anticuerpos biespecíficos purificados con menos de 5% de agregados de elevado peso molecular se agruparon y se almacenaron en forma de alícuotas 1 ,0 mg ml a -80°C.

SDS-PAGE Se utilizó el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En particular, se utilizaron geles premoldeados TRIS-Glicina NuPAGE® Novex® y un tampón de corrido TRIS-Glicina SDS Novex® (ver, por ejemplo, la figura 3).

Se consiguió reducir las muestras mediante la adición de agente reductor de muestras NuPAGE® previamente al corrido del gel.

Cromatografía analítica de exclusión por tamaño La cromatografía de exclusión por tamaño para la determinación de la agregación y estado oligomérico de los anticuerpos se llevó a cabo mediante cromatografía de HPLC.

Brevemente, se aplicaron anticuerpos purificados con proteína A en una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2P04/K2HP04 50 mM, pH 7,5 en un sistema HPLC 1100 de Agilent o en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2xPBS en un sistema de HPLC de Dionex. Las proteínas eluidas se cuantificaron a partir de la absorbancia de UV e integración de las áreas de los picos. El estándar de filtración en gel 151-1901 de BioRad sirvió de estándar, (ver, por ejemplo, la figura 4).

Espectrometría de masas Se determió la masa desglucosilada total de los anticuerpos entrecruzados y se confirmó medainte espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS). Brevemente, se desglucosilaron 100 µg de anticuerpos purificados con 50 mU de N-glucosidasa F (PNGasaF, ProZyme) en KH2P04/K2HP04 100 mM, pH 7, a 37°C durante 12 a 24 horas a una concentración de proteínas de hasta 2 mg/ml y posteriormente se desalaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa de las cadenas pesada y ligera respectivas se determinó mediante ESI-MS tras la desglucosilación y reducción. Brevemente, se incubaron 50 µg de anticuerpo en 1 15 µ? con 60 µ? de TCEP 1 M y 50 µ? de hidrocloruro de guanidina 8 M posteriormente desalado. Se determinó la masa total y la masa de las cadenas pesada y ligera reducidas mediante ESI-MS en un sistema de MS Q-Star Elite dotado de una fuente NanoMate.

Generación de la línea celular HEK293-Tie2 Con el fin de determinar la interferencia de los anticuerpos de angiopoyetina-2 con la fosforilación de Tie2 estimulada por ANGPT2 y con la unión de ANGPT2 a Tie2 en las células, se generó una línea celular recombinante HE 293-Tie. Brevemente, se transfectó un plásmido basado en pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2) codificante de Tie2 humano de longitud completa (SEC ID n° 108) bajo el control de un promotor de CMV y un marcador de resistencia a la neomicina, utilizando Fugene (Roche Applied Science) como reactivo de transfección en células HEK293 (ATCC) y las células resistentes se seleccionaron en DMEM+FCS al 10%, G418 500 µg/ml. Se aislaron clones individuales mediante un aro de clonación, y se analizaron posteriormente para la expresión de Tie2 mediante FACS. Se identificó el clon 22 como clon con elevada expresión estable de Tie2, incluso en ausencia de G418 (HEK293-Tie2 clon 22). Seguidamente se utilizó HEK293-Tie2 clon 22 para los ensayos celulares siguientes: ensayo de fosforilación de Tie inducida por ANGPT2 y de unión de ligando celular de ANGPT2.

Ensayo de fosforilación de Tie2 inducida por ANGPT2 La inhibición de la fosforilación de Tie2 inducida por ANGPT2 por anticuerpos de ANGPT2 se midió según el principio de ensayo siguiente. Se estimuló HEK293-Tie2 clon 22 con ANGPT2 durante 5 minutos en ausencia o en presencia de anticuerpo de anticuerpo de ANGPT2 y se cuantificó P-Tie2 mediante un ELISA sándwich. Brevemente, se cultivaron 2x105 células de HEK293-Tie2 clon 22 por pocilio durante la noche en una placa de microtitulación de 96 pocilios recubiertos con poli-D-lisina en 100 µ? de DMEM, FCS al 10% y geneticina 500 µ /??1. Al día siguiente, se preparó una fila de titulación de anticuerpos biespecíficos de ANGPT2 en una placa de microtitulación (concentrada 4 veces, volumen final de 75 µ?/pocillo, por duplicado) y se mezcló con 75 µ? de una dilución de ANGPT2 (R&D Systems, n° 623-AN) (3,2 µg/ml en forma de solución concentrada 4 veces). Se preincubaron los anticuerpos y ANGTP2 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 100 µ? de la mezcla a las células HEK293-Tie2 clon 22 (preincubadas durante 5 minutos con NaV304 1 mM, Sigma n° S6508) y se incubaron durante 5 minutos a 37°C. A continuación, las células se lavaron con 200 µ? de PBS helado + NaV304 1 mM por pocilio y se Usaron mediante la adición de 120 µ? de tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, NP-40 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, NaV304 1 mM, PMSF 1 mM y aprotinina 10 g/ml) por pocilio sobre hielo. Se Usaron las células durante 30 minutos a 4°C en un agitador de placas de microtitulación y se transfirieron directamente 100 µ? de Usado a una placa de microtitulación ELISA de p-Tie2 (R&D Systems, R&D n° DY990) sin centrifugación previa y sin determinación de las proteínas totales. Se cuantificaron las cantidades de P-Tie2 siguiendo las instrucciones del fabricante y se determinaron los valores de IC50 para la inhibición utilizando el plug-in de análisis XLfit4 para Excel (respuesta de dosis de un sitio, modelo 205). Los valores de IC50 pueden compararse dentro de un experimento dado, pero pueden variar entre experimentos.

Ensayo de proliferación de HUVEC inducida por VEGF La proliferación de HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana, Promocell n° C- 12200) inducida por VEGF se seleccionó para medir la función celular de los anticuerpos de VEGF. Brevemente, se incubaron 5.000 células HUVEC (número de pases reducido, <5 pases) por cada pocilio de placa de 96 pocilios, en 100 µ? de medio de ayuno (EMB-2, medio endotelial basal 2, Promocell n° C-2221 1, FCS al 0,5%, penicilina/estreptomicina) en una placa de microtitulación de 96 pocilios recubierta con colágeno I (BD Biocoat Collagen I) (BD n° 354407/35640) durante la noche. Se mezclaron diversas concentraciones de anticuerpo con VEGFrh (concentración final: 30 ng/ml, BD n° 354107) y se preincubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la mezcla a las células HUVEC y se incubaron durante 72 horas a 37°C, 5% de C02. El día del análisis, la placa se equilibró a la temperatura ambiente durante 30 minutos y se determinó la viabilidad/proliferación celular utilizando el kit de ensayo luminiscente de viabilidad celular CellTiter-Glo™ según el manual (Promega, n° G7571/2/3). Se determinó la luminiscencia con un espectrofotómetro.

Ejemplo la Expresión y purificación de moléculas bivalentes biespecíficas de anticuerpo XMab <VEGF-ANG-2> de dominios intercambiados Según los procedimientos descritos en la sección anterior de materiales y métodos, se expresaron y se purificaron las moléculas biespecíficas bivalentes de anticuerpo <VEGF-ANG-2> de dominios intercambiados XMabl, XMab2 y Xmab3. Las VH y VL de la parte <VEGF> (SEC ID n° 1 y SEC ID n° 2) se basan en bevacizumab. La VH de la parte <ANG2> (SEC ID n° 3) se derivó de una mutación E6Q (el aminoácido ácido glutámico (E) original en la posición 6 se sustituyó por glutamina (Q)) de la secuencia VH de ANG2i-LC06 (que se describe en la solicitud de patente PCT n° PCT/EP2009/007182 (patente WO n° 2010/040508) y que es un fragmento adicionalmente madurado de una secuencia obtenida mediante expresión fágica). La VL de la parte <ANG2> (SEC ID n° 4) se derivó de las secuencias de VL ANG2Í-LC06 (ver la solicitud de patente PCT n° PCT/EP2009/007182 (patente WO n° 2010/040508)). Se expresaron y se purificaron las moléculas biespecíficas bivalentes de anticuierpo <VEGF-ANG-2> de dominios intercambiados XMabl, XMab2 y XMab3. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada relevantes de dichos anticuerpos biespecíficos bivalentes se proporcionan en las secuencias SEC ID n° 5 a 8 (XMabl), en las secuencias SEC ID n° 9 a 12 (XMab2), en las secuencias SEC ID n° 13 a 16 (XMab3). Para una estructura ejemplar ver la figura 1.

Análogamente, se expresaron y se purificaron los anticuerpos biespecíficos bivalentes <VEGF-ANG2> XMab4, XMab5 y XMabó (con las secuencias de aminoácidos de cadenas ligera y pesada relevantes que se proporcionan en las secuencias SEC ID n° 17 a 20 (XMab4), en las secuencias SEC ID n° 21 a 24 (XMab5), en las secuencias SEC ID n° 25 a 28 (XMabó).

Se determinaron las afinidades de unión y otras propiedades tal como se ha descrito.

Ejemplo Ib Expresión y purificación de moléculas bivalentes biespecíficas de anticuerpo OAscFab <VEGF-ANG-2> Según los procedimientos descritos en la sección anterior de materiales y métodos, se expresaron y se purificaron las moléculas biespecíficas bivalentes de anticuerpo <VEGF-ANG-2> OAscFab 1 , OAscFab2 y OAscFab3. Las VH y VL de la parte <VEGF> (SEC ID n° 1 y SEC ID n° 2) se basan en bevacizumab. La VH de la parte <ANG2> de E6Q (SEC ID n° 3) se derivó de una mutación E6Q (el aminoácido ácido glutámico (E) original en la posición 6 se sustituyó por glutamina (QJ) de la secuencia VH de ANG2Í-LC06 (que se describe en la solicitud de patente PCT n° PCT/EP2009/007182 (patente WO n° 2010/040508) y que es un fragmento adicionalmente madurado de una secuencia obtenida mediante expresión fágica). La VL de la parte <ANG2> de E6Q (SEC ID n° 4) se derivó de las secuencias de VL de ANG2Í-LC06 (ver la solicitud de patente PCT n° PCT7EP2009/007182 (patente WO n° 2010/040508)). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada relevantes de dichos anticuerpos biespecíficos bivalentes se proporcionan en las secuencias SEC ID n° 29 a 31 (OAscFabl), en las secuencias SEC ID n° 32 a 34 (OAscFab2), y en las secuencias SEC ID n° 35 a 37 (OAscFab3). Para una estructura ejemplar ver la figura 2a. Se confirmó la expresión de OAscFabl, OAscFabl, OAscFab2 y OAscFab3 mediante transferencia western. La purificación de OAscFab2 y OAscFab3 proporcionó los rendimientos siguientes.

Ejemplo le Expresión y purificación de moléculas bivalentes biespecíficas de anticuerpo OAscXFab <VEGF-ANG-2> de dominios intercambiados Según los procedimientos descritos en la sección anterior de materiales y métodos, se expresaron y se purificaron las moléculas biespecíficas bivalentes de anticuerpo <VEGF-ANG-2> de dominios intercambiados OAscXFabl, OAscXFab2, y OAscXFab3. Las VH y VL de la parte <VEGF> (SEC ID n° 1 y SEC ID n° 2) se basan en bevacizumab. La VH de la parte <ANG2> de E6Q (SEC ID n° 3) se derivó de una mutación E6Q (el aminoácido ácido glutámico (E) original en la posición 6 se sustituyó por glutamina (Q)) de la secuencia VH de ANG2Í-LC06 (que se describe en la solicitud de patente PCT n° PCT/EP2009/007182 (patente WO n° 2010/040508) y que es un fragmento adicionalmente madurado de una secuencia obtenida mediante expresión fágica). La VL de la parte <ANG2> de E6Q (SEC ID n° 4) se derivó de la secuencia de VL de ANG2Í-LC06 (ver la solicitud de patente PCT n° PCT/EP2009/007182 (patente WO n° 2010/040508)). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada relevantes de dichos anticuerpos biespecíficos bivalentes se proporcionan en las secuencias SEC ID n° 38 a 40 (OAscXFabl), en las secuencias SEC ID n° 41 a 43 (OAscXFab2), y en las secuencias SEC ID n° 44 a 46 (OAscXFab3). Para una estructura ejemplar ver la figura 2b (OAscXFabl) y la figura 2c (OAscXFab2, OAscXFab3). Se confirmó la expresión mediante transferencia western.

Ejemplo 2 Estabilidad de los anticuerpos biespecíficos Temperatura de desnaturalización (método de SYPRO-orange) Para determinar la temperatura a la que se producía la desnaturalización de las proteínas (es decir, la pérdida inducida por la temperatura de la estructura proteica), se utilizó un método basado en un pigmento fluorescente hidrofóbico (SYPRO-orange, Invitrogen) que muestra una fluorescencia fuerte en ambientes hidrofóbicos. Al desnaturalizarse las proteínas, las áreas hidrofóbicas quedan expuestas al solvente, conduciendo a un incremento de la fluorescencia. A temperaturas superiores a la temperatura de desnaturalización, se reducen nuevamente las intensidades de fluorescencia, por lo tanto, la temperatura a la que se alcanza el máximo de intensidad se define como la temperatura de desnaturalización. El método se describe en Ericsson U.B. et al, Anal. Biochem. 357:289-298, 2006, y He F. et al, Journal of Pharmaceutical Sciences 99:1707-1720, 2010.

Se mezclaron muestras de proteínas a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, con SYPRO-orange (solución madre 5.000x) para alcanzar una dilución final de 1 :5.000. Se transfirió un volumen de 20 µ? a una placa de 384 pocilios y se registró la fluorescencia dependiente de la temperatura en un sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 480 (Roche Applied Sciences) a una tasa de calentamiento de 0,36°C/minuto.

Temperatura de agregación mediante dispersión lumínica dinámica (DLS) La temperatura a la que se produce la agregación de proteínas inducida térmicamente se determinó mediante dispersión lumínica dinámica (DLS). La DLS proporciona información sobre la distribución de tamaños de las macromoléculas en solución, derivada a partir de las fluctuaciones de las intensidades de la luz dispersada en una escala de microsegundos. Al calentar las muestras gradualmente, se inicia la agregación a una temperatura determinada, dando lugar a tamaños de partícula crecientes. La temperatura a la que empiezan a incrementarse los tamaños de partícula se define como la temperatura de agregación. Las temperaturas de agregación y de desnaturalización no es necesario que sean idénticas, debido a que la desnaturalización no es un requisito previo para la agregación.

Para las mediciones de la temperatura de agregación se utilizó un lector de placas DynaPro DLS (Wyatt Technologies). Antes de la medición, las muestras se filtraron con placas de filtro de 384 pocilios (sistema de filtración de 384 pocilios MultiScreen de Millipore, 0,45 µ??) en placas ópticas de 384 pocilios (Corning n° 3540). Se utilizó un volumen de muestra de 35 µ? a una concentración de proteína de aproximadamente 1 mg/ml en tampón de formulación (citrato 20 mM, sacarosa 180 mM, arginina 20 mM, polisorbato-20 al 0,02%). Se cubrió cada pocilio con 20 µ? de aceite de parafina (Sigma) para evitar la evaporación. Las muestras se calentaron de 25°C a 80°C a una tasa de 0,05°C/minuto y se captaron los datos de DLS continuamente durante un número máximo de 15 muestras en cada serie. Tasa de agregación según la DLS La DLS es un método sensible para detectar agregados de macromoléculas en solución, debido a que los agregados dan lugar a señales fuertes de dispersión lumínica. Por lo tanto, la tendencia de una molécula a agregarse puede seguirse en el tiempo mediante la captura repetida de datos de DLS. Para acelerar la agregación potencial hasta tasas prácticas, se realizaron mediciones a 50°C.

Se llevó a cabo la preparación de muestras tal como se ha indicado anteriormente. Se registraron los datos de DLS durante como máximo 100 horas. Se calcularon las tasas de agregación (nm/día) como la pendiente de un ajuste lineal de los diámetros medios a lo largo del tiempo.

Estabilidad en tanipón de formulación Para evaluar la estabilidad de las moléculas biespecíficas con respecto a la agregación/fragmentación, se incubaron las muestras durante 3 semanas a 40°C en tampón de formulación (citrato 20 mM, sacarosa 180 mM, arginina 20 mM, polisorbato-20 al 0,02%) a una concentración de proteínas de aproximadamente 1 mg ml. Se almacenó una muestra de control durante 3 semanas a -80°C.

Se llevó a cabo la cromatografía de exclusión por tamaño para la cuantificación de agregados y de especies de bajo peso molecular (LMW) mediante HPLC. Se aplicó una cantidad de entre 25 y 100 µg de proteína a una columna Tosoh TSKgel G3000SWXL en NaCl 300 mM, fosfato potásico 50 mM, pH 7,5, en un sistema de HPLC Ultimate3000 (Dionex). Se cuantificaron las proteínas eluidas a partir de la absorbancia de UV a 280 nm.

Ejemplo 3: Propiedades ligantes del anticuerpo biespecífico <VEGF-Ang-2> A) Propiedades de unión caracterizadas mediante análisis de resonancia del plasmón superficial (SPR) Se confirmó la unión simultánea de ambos antígenos mediante resonancia del plasmón superficial (SPR) utilizando un instrumento BI Acore TI 00 (GE Healthcare Biosci enees AB, Uppsala, Suecia). Se inmovilizó VEGF en un chip detector CM5 utilizando reacciones estándares de acoplamiento de aminas. En una primera etapa, se inyectó XMab <VEGF-Ang-2> a una concentración de 10 µg/ml en tampón HBS (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05%, pH 7,4) a 25°C. Tras la unión del anticuerpo al VEGF inmovilizado, se inyectó hAng-2 a una concentración de 10 µg/ml en una segunda etapa (figura 3).

En un experimento adicional, se determinó la cinética de afinidad y de unión del XMab <VEGF-Ang-2>. Brevemente, se inmovilizaron anticuerpos policlonales <hIgG-Fcgamma> de cabra en un chip CM4 mediante acoplamiento de aminas para la presentación del anticuerpo biespecífico contra Ang-2 y VEGF. Se midió la unión en tampón HBS a 25°C o a 37°C. Se añadió Ang-2-His (R&D Systems o purificado en el propio laboratorio) o VEGF (R&D Systems o purificado en el propio laboratorio) purificados a diversas concentraciones; de entre 0,37 n y 30 nM, o de entre 3,7 nM y 200 nM en solución. Se midió la asociación mediante una inyección de 3 minutos; se midió la disociación mediante lavado de la superficie del chip con tampón HBS durante 10 minutos y se estimó un valor de D utilizando un modelo de unión de Lagmuir 1 :1. Debido a la heterogeneidad de la preparación de Ang-2, no pudo observarse unión 1: 1. Por lo tanto, los valores de KD son valores aparentes. La afinidad determinada de XMab <VEGF-Ang-2> para VEGF es extremadamente elevada, la tasa de disociación calculada se encuentra fuera de las especificaciones del Biacore incluso a 37°C. En la Tabla 1 se resumen las constantes de unión para ambos antígenos.

Tabla 1: Parámetros cinéticos de la unión de XMabl <VEGF-Ang-2> a Ang-2 y a VEGF B) Ensayo para la cuantifícación de XMab biespecífico <Ang2 VEGF> activo ligante Además del análisis de SPR, se estableció un ELISA para cuantificar la cantidad de anticuerpos biespecíficos mAb<Ang2/VEGF> activos ligantes En dicho ensayo, en la primera etapa se recubren los pocilios de una placa de microtitulación maxisorp (MTP) directamente con hAng2. Simultáneamente, se preincubaron las muestras/estándares de referencia (mAb<Ang2/VEGF>) en los pocilios de otra MTP con VGF digoxigenilada. Tras la preincubación y el recubrimiento, se eliminó el exceso de Ang2 no unido mediante lavado de la MTP recubierta con Ang2. A continuación, la mezcla preincubada de <Ang2 VEGF> y VEGF-Dig se transfirió a la MPT recubierta con hAng2 y se incubó. Tras la incubación, se eliminó el exceso de solución de preincubación mediante lavado, seguido de la incubación con un anticuerpo anti-digoxigenina marcada con peroxidasa de rábano picante. El conjugado de anticuerpo-enzima cataliza la reacción de formación de color del sustrato ABTS®. Se midió la señal mediante un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm ([405/490] nm)). Se determinaron los valores de absorbancia de cada muestra por duplicado, (se muestra un esquema que ejemplifica dicho sistema de ensayo en la figura 4 y la curva de calibración de ELISA para la cuantificación se muestra en la figura 5).

Ejemplo 4 Fosforilación de Tie2 Con el fin de confirmar que se conservan las actividades relacionadas anti-ANGPT2 en el anticuerpo XMAbl <VEGF-ANGTP2> biespecífico bivalente, se llevó a cabo un ensayo de fosforilación. Se determinó la eficacia de XMAbl en el ensayo de fosforilación de Tie2 estimulada por ANGPT2, tal como se ha descrito anteriormente.

Se demostró que XMAbl interfiere con la fosforilación de Tie2 estimulada por ANGPT2 en el ensayo de fosforilación de Tie2 estimulada por ANGPT2, tal como se ha descrito anteriormente. La IC50 para XMAbl era 7,4 nM +/- 2,3.

Ejcmplo 5 Inhibición de la unión de huANG-2 a Tie-2 (ELISA) Se llevó a cabo el ELISA de interacción en placas de microtitulación de 384 pocilios (MicroCoat, DE, n° de cat. 464718) a temperatura ambiente. Tras cada etapa de incubación, las placas se lavaron 3 veces con PBST. Las placas ELISA se recubrieron con 5 µ^p?? de proteína Tie-2 durante 1 hora (h). A continuación, se bloquearon los pocilios con PBS suplementado con Tween-20 al 0,2% y BSA al 2% (Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 hora. Las diluciones de anticuerpos XMab biespecíficos purificados en PBS se incubaron conjuntamente con 0,2 µ§/p?1 de huAngiopoyetina-2 (R&D Systems, Reino Unido, n° de cat. 623-AN) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se añadió durante 1 hora una mezcla de 0,5 µ§/?? de anti-angiopoyetina-2 biotinilada clon BAM0981 (R&D Systems, Reino Unido) y estreptavidina-HRP diluida 1 :3.000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, n° de cat. 1 1089153001). A continuación se lavaron las placas 3 veces con PBST. Las placas se revelaron con reactivo ABTS recién preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, tampón n° 204 530 001 , tabletas n° 1 1 1 12 422 001) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 405 nm y se determinó la IC50. XMabl mostró una inhibición de la unión de ANG-2 a Tie-2 con una IC50 de 12 nM.

Ejemplo 6 Inhibición de la unión de hVEGF al receptor de hVEGF (ELISA) Se llevó a cabo el ensayo en placas de microtitulación de 384 pocilios (MicroCoat, DE, n° de cat. 464718) a temperatura ambiente. Tras cada etapa de incubación, las placas se lavaron 3 veces con PBST. Al inicio, las placas se recubrieron con proteína hVEGF-R 1 g/ml (R&D Systems, Reino Unido, n° de cat. 321-FL) durante 1 hora (h). A continuación, se bloquearon los pocilios con PBS suplementado con Tween-20 al 0,2% y BSA al 2% (Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 hora. Las diluciones de anticuerpos XMab biespecíficos purificados en PBS se incubaron conjuntamente con 0,15 µ /p?1 de huVEGF121 (R&D Systems, Reino Unido, n° de cat. 298- VS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se añadió durante 1 hora una mezcla de 0,5 µ /p?1 de anti-VEGF clon Mab923 (R&D Systems, Reino Unido) y F(ab')2 anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) 1 :2.000 (GE Healthcare, Reino Unido, n° de cat. NA9310V). A continuación se lavaron las placas 6 veces con PBST. Las placas se revelaron con reactivo ABTS recién preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, tampón n° 204 530 001 , tabletas n° 1 1 112 422 001) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 405 nm y se determinó la IC50. XMabl mostró una inhibición de la unión de VEGF al receptor de VEGF con una IC50 de 10 nM.

Ejemplo 7 Proliferación de HUVEC Con el fin de confirmar que se conservaban las actividades relacionadas anti-VEGF en el anticuerpo XMAbl <VEGF-ANG2> biespecífico bivalente, se llevó a cabo un ensayo de proliferación de HUVEC inducida por VEGF. Se demostró que XMAbl interfería con la proliferación de HUVEC inducida por VEGF de un modo comparable a bevacizumab en el ensayo de proliferación de HUVEC inducida por VEGF, tal como se ha descrito anteriormente. XMAbl interfería de modo dependiente de la concentración con la proliferación de HUVEC inducida por VEGF en grado comparable al anticuerpo parental bevacizumab (Avastatina). La IC50 era 1,1 nM para bevacizumab y de 2,3 nM para XMAb.

Eiemplo 8 Ensayo de angiogénesis en microbolsas corneales de ratón Se obtuvieron ratones Balb/c hembra de 8 a 10 semanas de edad de Charles River, Sulzfeld, Alemania. Se modificó el protocolo según el método descrito por Rogers M.S. et al, Nat. Protoc. 2:2545-2550, 2007. Brevemente, se prepararon microbolsas con una amplitud de aproximadamente 500 µp? bajo un microscopio desde aproximadamente 1 mm del limbo hasta la parte superior de la córnea utilizando una cuchilla quirúrgica y pinzas afiladas en el ratón anestesiado. Se implantó el disco (Nylaflo®, Pall Corporation, Michigan), con un diámetro de 0,6 mm, y se alisó la superficie del área de implantación. Se incubaron los discos en factor de crecimiento correspondiente o en vehículo durante por lo menos 30 minutos. Tras 3, 5 y 7 días (o alternativamente tras sólo 3 días), se fotografiaron los ojos y se midió la respuesta vascular. Se cuantificó el ensayo mediante el cálculo del porcentaje del área de vasos nuevos respecto al área total de la córnea.

Se cargaron los discos con 300 ng de VEGF o con PBS como control y se implantaron durante 7 días. Se realizó un seguimiento del crecimiento de los vasos desde el limbo hasta el disco durante el tiempo los días 3, 5 y 7. Un día antes de la implantación del disco, se administraron intravenosamente los anticuerpos (XMAbl <Ang-2/VEGF>, Avastatina <hVEGF> (bevacizumab)) a una dosis de 10 mg/kg para la Avastatina y XMAbl . Los animales en el grupo de control recibieron vehículo. El volumen de aplicación fue de 10 ml/kg.

Para someter a ensayo el efecto de XMAbl sobre la angiogénesis in vivo inducida por VEGF, los presentes inventores llevaron a cabo un ensayo de angiogénesis corneal en el ratón. En dicho ensayo, se implanta un disco Nylaflo sumergido en VEGF en una bolsa de la córnea avascular a una distancia fijada de los vasos del limbo. Los vasos crecen inmediatamente en la córnea hacia el gradiente de VEGF en desarrollo. Los resultados de los presentes inventores demuestran que la administración sistémica de XMAbl (10 mg/kg) inhibe prácticamente por completo el crecimiento de los vasos desde el limbo hacia el gradiente de VEGF entre los días de estudio 3 y 5 (fig. 6). En un experimento adicional, se llevaron a cabo estudios de comparación directa. Se cargaron los discos con 300 ng de VEGF o con PBS como control y se implantaron durante 3 días. Se realizó un seguimiento del crecimiento de vasos entre el limbo y el disco durante el tiempo el día 3. Un día antes de la implantación del disco, se administraron intravenosamente los anticuerpos (anticuerpo biespecífico XMAbl <Ang-2/VEGF>, anticuerpo parental <VEGF> bevacizumab (Avastatina), anticuerpo parental <Ang-2> ANG2Í-LC06, y la combinación de anticuerpos <VEGF> bevacizumab (Avastatina) y <Ang-2> ANG2Í-LC06, a una dosis de 10 mg/kg para bevacizumab (Avastatina), 10 mg/kg para XMAbl, 10 mg/kg para bevacizumab (Avastatina) y 10 mg/kg para ANG2Í-LC06. Se administró la combinación de bevacizumab (Avastatina) y ANG2Í-LC06 a una concentración de 10 mg/kg en el caso de bevacizumab (Avastatina) y de 10 mg/kg en el caso de ANG2Í-LC06. Los animales en el grupo de control recibieron vehículo. El volumen de aplicación fue de 10 ml/kg.

Los resultados de los presentes inventores (ver la fig. 7 y la Tabla, posteriormente) demuestran que la administración sistémica de XMAbl (10 mg/kg) inhibió prácticamente por completo el crecimiento de los vasos desde el limbo hacia el gradiente de VEGF en el día de estudio 3 en grado comparable a la combinación de bevacizumab y Ang2i-LC06. La monoterapia anti-Ang-2, en contraste, únicamente inhibió ligeramente la angiogénesis inducida por VEGF (fig. 7). El efecto máximo ya podía alcanzarse a concentraciones más bajas de XMabl 10 mg/kg en comparación con la combinación de Ang2i-LC06 10 mg/kg + bevacizumab (Avastatina) 10 mg/kg.

Tabla: Porcentaje de inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF el día 3 en un ensayo de angiogénesis en microbolsas corneales de ratón Ejemplo 9 Eficacia in vivo del anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> en el modelo de xenoinjerto Colo205 en ratones Scid beige.

Líneas celulares y condiciones de cultivo Células de cáncer colorrectal humano Colo205 (ATCC n° CCL-222). La línea de células tumorales se cultivó rutinariamente en medio RPMI 1640 (PAA Laboratories, Austria) suplementado con suero de feto bovino al 10% (PAA Laboratories, Austria) y L-glutamina 2 mM a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de C02. Se utilizó el pase 2-5 para el trasplante.

Animales: Los ratones SCID beige hembra; de 4 a 5 semanas de edad a la llegada (adquiridos de Charles River, Sulzfeld, Alemania) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local. Tras la llegada, los animales se mantuvieron en la parte de cuarentena de las instalaciones para los animales durante una semana para que se aclimatasen al nuevo ambiente y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular. Se proporcionó alimentación dietética (Provimi Kliba 3337) y agua (acidificada a pH 2,5 a 3) ad libitum. La edad de los ratones al inicio del estudio era de aproximadamente 10 semanas.

Inyección de células tumorales: El día de la inyección se recolectaron células tumorales (tripsina-EDTA) de matraces de cultivo (Greiner) y se transfirieron a 50 mi de medio de cultivo, se lavaron una vez y se resuspendieron en PBS. Tras una etapa de lavado adicional con PBS y la filtración (filtro celular; Falcon 0 100 µ??), se ajustó el título celular final a 2,5 x 107/ml. La suspensión de células tumorales se mezcló cuidadosamente con una pipeta de transferencia para evitar la agregación celular. A continuación, se rellenó una jeringa de tuberculina de 1,0 mi (Braun Melsungen) con la suspensión celular utilizando una aguja ancha (1,10 x 40 mm); para la inyección, se modificó el tamaño de la aguja (0,45 x 25 mm) y para cada inyección se utilizó una aguja nueva. Se llevó a cabo la anestesia utilizando una unidad de inhalación Stephens para animales pequeños con cámara de preincubación (de plexiglass), una mascarilla nasal individual para ratones (de silicona) y el compuesto anestésico no inflamable ni explosivo isoflurano (cp-pharma) en un sistema de circulación cerrado. Dos días antes de la inyección se afeitó el pelaje de los animales y para la inyección celular se levantó cuidadosamente la piel de los animales anestesiados con unas pinzas de disección y se inyectaron subcutáneamente 100 µ? de suspensión celular (=2,5 x 106 células) en el flanco derecho de los animales.

Tratamiento de los animales El tratamiento de los animales se inició el día de la aleatorización a un volumen medio de tumor de ~100 mm3, respectivamente. Los ratones fueron tratados una vez a la semana i.p. con los diferentes compuestos, tal como se indica en la tabla a continuación.

Seguimiento: Los animales fueron controlados 2x a la semana para su estado de salud. Se documentaron 2x a la semana los pesos corporales tras la inyección celular. Se midieron las dimensiones tumorales con un calibrador desde el día de la estadificación y posteriormente 2 veces a la semana durante todo el periodo de tratamiento. Se calculó el volumen tumoral según el protocolo de la NCI (peso del tumor=l/2ab2, en donde "a" y "b" son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente). Los criterios de terminación fueron una masa tumoral crítica (hasta 1 ,7 gramos o 0 > 1 ,5 cm), una pérdida de peso corporal superior a 20% respecto a la línea base, ulceración tumoral o un estado general pobre de los animales.

Los resultados (ver la fig. 8) demuestran que el anticuerpo biespecífico bivalente XMAbl <VEGF-ANG-2> mostraba una inhibición más elevada del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto tumoral Colo205 en ratones Scid beige en comparación con el tratamiento con anticuerpos monoespecíficos. La eficacia de la combinación de LC06 y bevacizumab mostró resultados comparables a los de XMAbl . La eficacia máxima de XMAbl ya se alcanzaba con 10 mg/kg.

En un segundo experimento se analizó el efecto de XMAbl sobre tumores de mayor tamaño.

Tratamiento de los animales El tratamiento de los animales se inició el día de la aleatorización a un volumen medio de tumor de ~400 mm , respectivamente. Los ratones fueron tratados una vez a la semana i.p. con los diferentes compuestos, tal como se indica en la tabla a continuación.

Seguimiento: Los animales fueron controlados 2x a la semana para su estado de salud. Se documentaron 2x a la semana los pesos corporales tras la inyección celular. Se midieron las dimensiones tumorales con un calibrador desde el día de la estadificación y posteriormente 2 veces a la semana durante todo el periodo de tratamiento. Se calculó el volumen tumoral según el protocolo de la NCI (peso del tumor=l/2ab , en donde "a" y "b" son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente). Los criterios de terminación fueron una masa tumoral crítica (hasta 1,7 gramos o 0 > 1,5 cm), una pérdida de peso corporal superior a 20% respecto a la línea base, ulceración tumoral o un estado general pobre de los animales.

Los resultados (ver la fig. 9) demuestran que el anticuerpo biespecífico bivalente XMAbl <VEGF-ANG-2> mostraba una inhibición más elevada del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto tumoral Colo205 en ratones Scid beige en comparación con el tratamiento con anticuerpos monoespecíficos, que no mostró eficacia en tumores grandes en comparación con el control. La eficacia de la combinación de LC06 y bevacizumab mostró resultados comparables a los de XMAbl. La eficacia máxima de XMAbl ya se alcanzaba con 10 mg kg.

Conjuntamente, los resultados demuestran que, con independencia del tamaño tumoral, XMAbl muestra una eficacia superior a la del tratamiento con anticuerpos monoespecíficos.

La estasis tumoral en estos modelos ya podía alcanzarse a concentraciones inferiores de XMabl 10 mg/kg en comparación con la combinación de Ang2i-LC06 10 mg/kg + Avastatina 10 mg/kg.

Eiemplo 10 Eficacia in vivo del anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> en el modelo ortotópico de xenoinjerto KPL-4 en ratones Scid beíge.

Línea de células tumorales Se estableció la línea celular de cáncer de mama humano KPL-4 (Kurebayashi J. et ai, Br. J. Cáncer 79:707-17, 1999) a partir de efusión pleural maligna de un paciente de cáncer de mama con una metástasis inflamatoria de la piel. Las células tumorales se cultivaron rutinariamente en medio DMEM (PAN Biotech, Alemania) suplementado con suero de feto bovino al 10% (PAN Biotech, Alemania) y L-glutamina 2 mM (PAN Biotech, Alemania) a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de C02. Se llevó a cabo un pase de cultivo con tripsina EDTA 1 x (PAN) subcultivando tres veces/semana.

Ratones Tras su llegada, se mantuvieron los ratones SCID-beige hembra (edad de 10 a 12 semanas; peso corporal: 18 a 20 gramos; Charles River, Sulzfeld, Alemania) en la sección de cuarentena de las instalaciones animales autorizadas por la AALAAC, durante una semana para aclimatarlos al nuevo ambiente y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud. Los ratones se mantuvieron bajo condiciones SPF según las directrices internacionales (GV-Solas, Felasa, TierschG) con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se proporcionó ad libitum alimento dietético (Kliba Provimi 3347) y agua (filtrada). El protocolo de estudio experimental fue revisado y aprobado por el gobierno local (Regierung von Oberbayem, registro n° 211.2531.2-22/2003).

Inyección de células tumorales El día de la inyección se recolectaron células tumorales (tripsina-EDTA) de matraces de cultivo (Greiner TriFlask) y se transfirieron a 50 mi de medio de cultivo, se lavaron una vez y se resuspendieron en PBS. Tras una etapa de lavado adicional con PBS y la filtración (filtro celular; Falcon 0 100 µ??), se ajustó el título celular final a 1,5 x 108/ml. La suspensión de células tumorales se mezcló cuidadosamente con una pipeta de transferencia para evitar la agregación celular. Se llevó a cabo la anestesia utilizando una unidad de inhalación Stephens para animales pequeños con cámara de preincubación (de plexiglass), una mascarilla nasal individual para ratones (de silicona) y el compuesto anestésico no inflamable ni explosivo isoflurano (Pharmacia-Upjohn, Alemania) en un sistema de circulación cerrado. Dos días antes de la inyección, se afeitó el pelaje de los animales. Para la inyección i.m.f.p., las células se inyectaron ortotópicamente a un volumen de 20 µ? en la almohadilla adiposa mamaria inguinal penúltima derecha de cada ratón anestesiado. Para la implantación ortotópica, se inyectó la suspensión celular a través de la piel bajo el pezón utilizando una jeringa Hamilton de microlitros y una aguja 30Gxl/2".

Tratamiento de los animales El tratamiento de los animales se inició el día de la aleatorización a un volumen medio de tumor de -80 mm3, respectivamente. Los ratones fueron tratados una vez a la semana i.p. con los diferentes compuestos, tal como se indica en la tabla a continuación.

Seguimiento del crecimiento tumoral Los animales fueron controlados 2x a la semana para su estado de salud. Se documentaron 2x a la semana los pesos corporales tras la inyección celular. Se midieron las dimensiones tumorales con un calibrador el día de la estadifícación, desde el inicio del periodo de tratamiento 2 veces a la semana. Se calculó el volumen tumoral según el protocolo de la NCI (B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, capítulo 5, página 92) (peso del tumor=l/2ab2, en donde "a" y "b" son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente).

Los criterios de terminación fueron una masa tumoral crítica (hasta 1,7 gramos o 0 > 1 ,5 cm), una pérdida de peso corporal superior a 20% respecto a la línea base, ulceración tumoral o un estado general pobre de los animales.

Los resultados (ver la fíg. 10) demuestran que el anticuerpo biespecífico bivalente XMAbl <VEGF-ANG-2> mostraba una inhibición más elevada del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto tumoral Colo205 en ratones Scid beige en comparación con el tratamiento con anticuerpos monoespecíficos. La eficacia de la combinación de LC06 y bevacizumab mostró resultados comparables a los de XMAbl. La eficacia máxima de XMAbl ya se alcanzaba con 10 mg kg.

Tratamiento de los animales El tratamiento de los animales se inició el día de la aleatorización a un volumen medio de tumor de -160 mm3, respectivamente. Los ratones fueron tratados una vez a la semana i.p. con los diferentes compuestos, tal como se indica en la tabla a continuación.

Seguimiento: Los animales fueron controlados 2x a la semana para su estado de salud. Se documentaron 2x a la semana los pesos corporales tras la inyección celular. Se midieron las dimensiones tumorales con un calibrador el día de la estadificación, desde el inicio del periodo de tratamiento 2 veces a la semana. Se calculó el volumen tumoral según el protocolo de la NCI (B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, capítulo 5, página 92) (peso del tumor=l/2ab2, en donde "a" y "b" son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente).

Los criterios de terminación fueron una masa tumoral crítica (hasta 1 ,7 gramos o 0 > 1,5 cm), una pérdida de peso corporal superior a 20% respecto a la línea base, ulceración tumoral o un estado general pobre de los animales.

Los resultados (ver la fig. 1 1) demuestran que el anticuerpo biespecífíco bivalente X Abl <VEGF-ANG-2> mostraba una inhibición más elevada del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto tumoral Colo205 en ratones Scid beige en comparación con el tratamiento con anticuerpos monoespecífícos. La eficacia de la combinación de LC06 y bevacizumab mostró resultados comparables a los de XMAbl. La eficacia máxima de XMAbl ya se alcanzaba con 10 mg/kg.

Conjuntamente, los resultados demuestran que, con independencia del tamaño tumoral, XMAbl muestra una eficacia superior a la del tratamiento con anticuerpos monoespecífícos.

La estasis tumoral en estos modelos ya podía alcanzarse a concentraciones inferiores de XMAbl 10 mg kg en comparación con la combinación de Ang2i-LC06 10 mg/kg + Avastatina 10 mg/kg.

Ejemplo 11 Efecto del tratamiento de XMAbl sobre la densidad de microvasos en xenoinjerto s.c. Colo205 Se evaluó la densidad vascular mediante el recuento de todos los vasos de un portaobjetos con tumor. Se marcaron los vasos con anticuerpo anti-CD34 de ratón fluorescente (clon MECI 4.7) en secciones incluidas en parafina. Se cuantificaron los vasos y se calculó la densidad de microvasos como vasos por mm2. Todos los resultados se expresan como medias ± SEM. Para definir las diferencias significativas entre grupos experimentales, se utilizó el método de Dunnetts. Se consideró que p<0,05 era el nivel de significancia estadística. Los resultados demuestran que la MVD intratumoral se encontraba reducida en los tumores tratados. El tratamiento con ANG2Í-LC06 redujo la MVD en 29%, el bevacizumab en </=0%, el bevacizumab + ANG2Í-LC06 en 15% y el XMAbl en 28%.

Ejemplo 12 Eficacia in vivo del anticuerpo biespecífíco <VEGF-ANG-2> en el modelo de xenoinjerto s.c. N87 en ratones Scid beige.

Línea de células tumorales Línea celular de cáncer gástrico humano N87 (NCI-N87 (ATCC n° CRL 5822)). Las células tumorales se cultivaron rutinariamente en medio RPMI1640 suplementado con suero de feto bovino al 10% (PAN Biotech, Alemania) y L-glutamina 2 mM (PAN Biotech, Alemania) a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de C02. Se llevó a cabo un pase de cultivo con tripsina/EDTA l (PAN) subcultivando tres veces/semana.

Ratones Tras su llegada, se mantuvieron los ratones SCID-beige hembra (edad de 10 a 12 semanas; peso corporal: 18 a 20 gramos; Charles River, Sulzfeld, Alemania) en la sección de cuarentena de las instalaciones animales autorizadas por la AALAAC, durante una semana para aclimatarlos al nuevo ambiente y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud. Los ratones se mantuvieron bajo condiciones SPF según las directrices internacionales (GV-Solas, Felasa, TierschG) con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se proporcionó ad libitum alimento dietético (Kliba Provimi 3347) y agua (filtrada). El protocolo de estudio experimental fue revisado y aprobado por el gobierno local (Regierung von Oberbayern, registro n° 211.2531.2-22/2003).

Inyección de células tumorales El día de la inyección de células, se recolectaron las células de los matraces de cultivo (Greiner T 75) y se transfirieron a 50 mi de medio de cultivo, se lavaron una vez y se resuspendieron en PBS. Tras un lavado adicional con PBS, se midió la densidad celular con un Vi-Cell™ (Cell Viability Analyzer, Beckman Coulter, Madison, Wisconsin, U.S.A.). La suspensión de células tumorales (PBS) se mezcló cuidadosamente (para reducir la agregación celular) y se mantuvo sobre hielo. Se rellenó una jeringa de 1,0 mi con la suspensión celular. Para la inyección, se utilizó un tamaño de agua de 0,45 x 25 ram. Para generar tumores primarios, se inyectaron subcutáneamente 5 x 106 células tumorales N87 en un volumen de 100 µ? de PBS en el flanco derecho de cada ratón.

Tratamiento de los animales El tratamiento de los animales se inició el día de la aleatorización a un volumen medio de tumor de -130 mm3, respectivamente. Los ratones fueron tratados una vez a la semana i.p. con los diferentes compuestos, tal como se indica en la tabla a continuación.

Seguimiento del crecimiento tumoral Los animales fueron controlados lx a la semana para su estado de salud. Se documentaron lx a la semana los pesos corporales tras la inyección celular. Se midieron las dimensiones tumorales con un calibrador el día de la estadificación, desde el inicio del periodo de tratamiento una vez a la semana. Se calculó el volumen tumoral según el protocolo de la NCI (B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, capítulo 5, página 92) (peso del tumor=l/2ab , en donde "a" y "b" son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente).

Los criterios de terminación fueron una masa tumoral crítica (hasta 1,7 gramos o 0 > 1,5 cm), una pérdida de peso corporal superior a 20% respecto a la línea base, ulceración tumoral o un estado general pobre de los animales.

Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico bivalente XMAbl <VEGF-ANG-2> mostraba una inhibición más elevada del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto tumoral Colo205 en ratones Scid beige en comparación con el tratamiento con anticuerpos monoespecíficos (fig. 12).

Claims

Reivindicaciones Anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado porque: i) dicho primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 1, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 2, y ii) dicho segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la secuencia SEC ID n° 3, y como dominio variable de cadena ligera (VL), la secuencia SEC ID n° 4. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en las que los dominios constante CL y CH1 se sustituyen mutuamente. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 7, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 5, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 8, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 6. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 11, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 9, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 12, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 10. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende: a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 15, y como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 13, y b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 16, y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa, la secuencia SEC ID n° 14. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 5. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para el tratamiento del cáncer. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. Método de tratamiento de un paciente que sufre cáncer, mediante la administración de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un paciente que necesita didio tratamiento. 10. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de enfermedades vasculares. 1 1. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades vasculares. 12. Método de tratamiento de un paciente que sufre enfermedades vasculares, mediante la administración de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un paciente que necesita dicho tratamiento. 13. Ácido nucleico codificante de un anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 14. Vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico según la reivindicación 13, capaz de expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped procariótica o eucariótica. 15. Célula huésped procariótica o eucariótica que comprende un vector según la reivindicación 14. 16. Método para la preparación de un anticuerpo biespecífico según las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas siguientes: a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dicho anticuerpo, b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo. 17. Anticuerpo biespecífico obtenido mediante el método según la reivindicación 16. 18. Anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, y de la secuencia SEC ID n° 8. 1 . Anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 9, SEC ID n° 10, SEC ID n° 1 1, y de la secuencia SEC ID n° 12. 20. Anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias SEC ID n° 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, y de la secuencia SEC ID n° 16.