KR20130001291A - 이중특이적 2가 항-ｖｅｇｆ/항-ａｎｇ-2 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF/VEGF-A) 및 인간 안지오포이에틴(angiopoietin)-2(ANG-2)에 대한 이중특이적 2가 항체, 및 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF/VEGF-A) 및 인간 안지오포이에틴(angiopoietin)-2(ANG-2)에 대한 이중특이적 2가 항체, 및 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
혈관신생은 고형 종양, 안구내 신생혈관 증후군, 예컨대, 증식성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성(AMD), 류마티스 관절염 및 건선을 포함하는 다양한 장애의 발병기전에 연루되어 있다(문헌[Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934]; 문헌[Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239]; 및 문헌[Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710]). 고형 종양의 경우, 신생혈관형성은 정상 세포와 비교하여 종양 세포가 성장 이점 및 증식 자율성을 획득하게 한다. 따라서, 종양 절편에서의 미세혈관 밀도와 유방암 및 여러 다른 종양에서의 환자 생존 사이에 상관관계가 관찰되었다(문헌[Weidner, N., et al., N Engl J Med. 324 (1991) 1-8]; 문헌[Horak, E.R., et al., Lancet 340 (1992) 1120-1124]; 및 문헌[Macchiarini, P., et al., Lancet 340 (1992) 145-146]).
VEGF 및 항-VEGF 항체
인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF/VEGF-A)(서열번호 105)는 예를 들면, 문헌[Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9], 문헌[Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12] 및 문헌[Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24]에 기재되어 있다. VEGF는 종양 및 안구내 장애와 관련된 정상 및 비정상 혈관신생 및 신생혈관형성의 조절에 관여한다(문헌[Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25]; 문헌[Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159]; 문헌[Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91]; 문헌[Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735]; 문헌[Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934]; 및 문헌[Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039]). VEGF는 여러 공급원들로부터 단리된 동종이량체성 당단백질이다. VEGF는 내피 세포에 대한 매우 특이적인 유사분열촉진 활성을 나타낸다. VEGF는 배아 혈관발생 동안 새로운 혈관의 형성 및 성체 생존기간 동안 혈관신생에 있어서 중요한 조절 기능을 수행한다(문헌[Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439]; 문헌[Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442]; 문헌[Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25]에서 검토됨). VEGF에 의해 수행되는 역할의 의미는 단일 VEGF 대립유전자(allele)의 불활성화가 혈관구조의 실패된 발달로 인한 배아 치사를 야기한다는 것을 보여주는 연구에서 입증되었다(문헌[Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439]; 문헌[Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442]). VEGF는 단핵구에 대한 강한 화학주성인자 활성을 갖는다는 점 이외에, 내피 세포에서 플라스미노겐 활성화제 및 플라스미노겐 활성화제 억제제를 유도할 수 있고, 미세혈관 투과성도 유도할 수 있다. 후자의 활성으로 인해, VEGF는 종종 혈관 투과성 인자(VPF)로서 지칭된다. VEGF의 단리 및 성질은 문헌에 논의되어 있다(문헌[Ferrara, N., et al., J. Cellular Biochem., 47 (1991) 211-218] 및 문헌[Connolly, D.T., J. Cellular Biochem., 47 (1991) 219-223] 참조). 단일 VEGF 유전자의 선택적 mRNA 스플라이싱은 VEGF의 5종의 동형체를 발생시킨다.
항-VEGF 중화 항체는 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제한다(문헌[Kim, K.J., et al., Nature 362 (1993) 841-844]; 문헌[Warren, S.R., et al., J. Clin. Invest. 95 (1995) 1789-1797]; 문헌[Borgstrom, P., et al., Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039]; 및 문헌[Melnyk, O., et al., Cancer Res. 56 (1996) 921-924]). 국제 특허출원 공개 제94/10202호, 제98/45332호, 제2005/00900호 및 제00/35956호는 VEGF에 대한 항체를 언급한다. 인간화된 단일클론 항체 베바시주마브(bevacizumab)(상표명 아바스틴(Avastin: 등록상표) 하에 시판됨)는 종양 치료에서 사용되는 항-VEGF 항체이다(국제 특허출원 공개 제98/45331호).
라니비주마브(Ranibizumab)(상표명 루센티스(Lucentis: 등록상표))는 베바시주마브(아바스틴)와 동일한 모 뮤린(murine) 항체로부터 유도된 단일클론 항체 단편이다. 라니비주마브는 모 분자보다 훨씬 더 작고 VEGF-A와의 보다 강한 결합을 제공하도록 친화 성숙되어 있다(국제 특허출원 공개 제98/45331호). 라니비주마브는 연령 관련 시력 상실의 통상적인 형태인 "습성" 연령 관련 황반 변성(ARMD)을 치료하기 위해 승인받은 항-혈관신생제이다. 또 다른 항-VEGF 항체는 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2007/0141065호에 기재된 HuMab G6-31이다.
ANG-2 및 항-ANG-2 항체
인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)(대안적으로 ANGPT2 또는 ANG2로 약칭됨)(서열번호 106)는 문헌[Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60] 및 문헌[Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91]에 기재되어 있다. 안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2(ANG-1(서열번호 107) 및 ANG-2(서열번호 106))는 혈관 내피 내에서 선택적으로 발현되는 티로신 키나제(kinase)의 패밀리인 Ties에 대한 리간드로서 발견되었다(문헌[Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48]). 현재 안지오포이에틴 패밀리의 4종의 명확한 구성원들이 존재한다. 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4(ANG-3 및 ANG-4)는 마우스 및 인간에서 동일한 유전자 좌위의 넓게 분기된 대응물을 대표할 수 있다(문헌[Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56]; 문헌[Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28]). ANG-1 및 ANG-2는 조직 배양 실험에서 각각 작용제 및 길항제로서 처음으로 확인되었다(ANG-1에 대해 문헌[Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69]을 참조하고, ANG-2에 대해 문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]을 참조함). 공지된 모든 안지오포이에틴들이 주로 Tie-2에 결합하고, ANG-1 및 ANG-2 둘다 3 nM의 친화성(Kd)으로 Tie-2에 결합한다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]). ANG-1은 EC 생존을 지지하고 내피 완전성을 촉진하는 것으로 밝혀진 반면(문헌[Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69]; 문헌[Kwak, H.J., et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53]; 문헌[Suri, C., et al., Science 282 (1998) 468-71]; 문헌[Thurston, G., et al., Science 286 (1999) 2511-2514]; 문헌[Thurston, G., et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63]), ANG-2는 반대 효과를 나타내고 생존 인자 VEGF 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자의 부재 하에 혈관 불안정화 및 퇴행을 촉진하였다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]). 그러나, ANG-2 기능의 많은 연구들이 보다 복잡한 상황을 암시하였다. ANG-2는 혈관 발아(sprouting) 및 혈관 퇴행 둘다에서 일정한 역할을 수행하는 혈관 리모델링의 복합 조절제일 것이다. ANG-2의 이러한 역할을 지지하는 발현 분석은 ANG-2가 혈관신생 발아의 성체 셋팅에서 VEGF와 함께 급속히 유도되는 반면, ANG-2가 혈관 퇴행의 셋팅에서 VEGF의 부재 하에 유도된다는 것을 보여준다(문헌[Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98]; 문헌[Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62]). 환경 의존적 역할과 일치하여, ANG-2는 ANG-1에 의해 활성화되는 내피 특이적 수용체와 동일한 내피 특이적 수용체인 Tie-2에 특이적으로 결합하나, 그의 활성화에 대한 환경 의존적 효과를 나타낸다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]).
각막 혈관신생 분석은 ANG-1 및 ANG-2 둘다가 VEGF와 상승작용적으로 작용하여 새로운 혈관의 성장을 촉진하는 유사한 효과를 나타내었다는 것을 보여주었다(문헌[Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40]). 투여량 의존적 내피 반응이 존재할 가능성은 시험관 내에서 ANG-2가 고농도에서 전구혈관신생성도 나타낼 수 있다는 관찰에 의해 제기되었다(문헌[Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52]). 고농도에서, ANG-2는 PI-3 키나제 및 Akt 경로를 통한 Tie-2의 활성화를 통해 혈청 고갈 세포사멸 동안 내피 세포의 세포사멸 생존 인자로서 작용한다(문헌[Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52]).
다른 시험관내 실험은 지속된 노출 동안 ANG-2의 효과가 Tie-2의 길항제 효과로부터 Tie-2의 작용제 효과로 점진적으로 변동될 수 있고, 후기 시점에서 상기 효과가 혈관형성 및 신생혈관 안정화에 직접적으로 기여할 수 있다는 것을 암시하였다(문헌[Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70]). 더욱이, EC가 피브린 겔 상에서 배양된 경우, ANG-2에 의한 Tie-2의 활성화도 관찰되었는데, 이것은 아마도 ANG-2의 작용이 EC 분화 상태에 의존할 수 있다는 것을 암시한다(문헌[Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70]). ANG-2는 3차원적 콜라겐 겔에서 배양된 미세혈관 EC에서도 Tie-2 활성화를 유도할 수 있고 모세혈관 유사 구조의 형성을 촉진할 수 있다(문헌[Mochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83]). 혈관 성숙의 시험관내 모델로서 3차원적 타원체 공배양물(coculture)의 사용은 EC와 중간엽 세포 사이의 직접적인 접촉이 VEGF에 대한 반응성을 제거하는 반면, VEGF 및 ANG-2의 존재가 발아를 유도하였다는 것을 입증하였다(문헌[Korff, T., et al., Faseb J. 15 (2001) 447-57]). 에토와 그의 동료들(Etoh, T.H. et al.)은 Tie-2를 항시적으로 발현하는 EC에서 MMP-1, MMP-9 및 u-PA의 발현이 VEGF의 존재 하에 ANG-2에 의해 강하게 상향조절되었다는 것을 입증하였다(문헌[Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53]). 로보브와 그의 동료들(Lobov, I.B. et al.)은 생체내 동공막 모델을 사용하여, ANG-2가 내인성 VEGF의 존재 하에 모세혈관 직경의 급속한 증가, 기저층(basal lamina)의 리모델링, 및 내피 세포의 증식 및 이동을 촉진하고 새로운 혈관의 발아를 자극한다는 것을 보여주었다(문헌[Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10]). 대조적으로, ANG-2는 내인성 VEGF의 부재 하에 내피 세포 사멸 및 혈관 퇴행을 촉진한다(문헌[Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10]). 유사하게, 바이코츠키와 그의 동료들(Vajkoczy, P., et al.)은 생체내 종양 모델을 사용하여, 다세포 응집체가 숙주 및 종양 내피에 의한 VEGFR-2 및 ANG-2의 동시적 발현을 통한 혈관신생 발아로 혈관 성장을 시작한다는 것을 입증하였다(문헌[Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85]). 이 모델은 성장하는 종양의 확립된 미세혈관구조가 VEGF 및 ANG-2의 발현에 의해 매개되는 것으로 추정되는, 연속적 리모델링을 특징으로 한다는 것을 보여주었다(문헌[Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85]).
Tie-2 및 안지오포이에틴-1의 넉아웃(knock-out) 마우스 연구는 유사한 표현형을 보이고 안지오포이에틴-1 자극된 Tie-2 인산화가 발달하는 혈관의 리모델링 및 안정화, 혈관신생 동안 혈관 성숙의 촉진 및 내피 세포 지지 세포 부착의 유지를 매개한다는 것을 암시한다(문헌[Dumont, D.J., et al., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909]; 문헌[Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 70-74]; 문헌[Thurston, G., et al., Nature Medicine 6 (2000) 460-463]). 안지오포이에틴-1의 역할은 안지오포이에틴-1이 넓게 항시적으로 발현되는 성체에서 보존되는 것으로 생각된다(문헌[Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50]; 문헌[Zagzag, D., et al., Exp Neurology 159 (1999) 391-400]). 대조적으로, 안지오포이에틴-2 발현은 주로 혈관 리모델링의 부위로 한정되는데, 상기 부위에서 안지오포이에틴-2는 안지오포이에틴-1의 기능의 항시적 안정화 또는 성숙을 차단하여 혈관을 발아 신호에 더 잘 반응할 수 있는 플라스틱 상태로 복귀시키고 상기 상태를 유지하게 하는 것으로 생각된다(문헌[Hanahan, D., 1997]; 문헌[Holash, J., et al., Oncogene 18 (199) 5356-62]; 문헌[Maisonpierre, P.C., 1997]). 병리학적 혈관신생에서의 안지오포이에틴-2 발현의 연구는 많은 유형의 종양들이 안지오포이에틴-2 발현을 보인다는 것을 발견하였다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]). 기능 연구는 안지오포이에틴-2가 종양 혈관신생에 관여한다는 것을 암시하고 마우스 이종이식편 모델에서 안지오포이에틴-2 과발현을 증가된 종양 성장과 관련시킨다(문헌[Ahmad, S.A., et al., Cancer Res., 61 (2001) 1255-1259]). 다른 연구는 안지오포이에틴-2 과발현을 종양 혈관과다형성과 관련시켰다(문헌[Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53]; 문헌[Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129]).
최근에, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2 및/또는 Tie-2는 가능한 항암 치료 표적물로서 제안되었다. 예를 들면, 미국 특허 제6,166,185호, 제5,650,490호 및 제5,814,464호는 항-Tie-2 리간드 및 수용체 항체를 각각 개시한다. 가용성 Tie-2를 사용하는 연구는 설치류에서 종양의 수 및 크기를 감소시킨다고 보고되었다(문헌[Lin, 1997]; 문헌[Lin 1998]). 문헌[Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91]의 연구는 Tie-2의 세포외 도메인을 발현하는 인간 흑색종 세포주를 발생시켰고, 이들을 누드 마우스 내에 주입하였고 가용성 Tie-2가 종양 성장 및 종양 혈관신생을 유의하게 억제하였다고 보고하였다. 안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2 둘다가 Tie-2에 결합하는 한, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2 또는 Tie-2가 항암요법을 위한 흥미로운 표적일 것인지는 이들 연구들로부터 분명하지 않고, 안지오포이에틴-2 또는 Tie-2는 항암요법을 위한 흥미로운 표적일 것이다. 그러나, 효과적인 항-안지오포이에틴-2 요법은 질환의 진행이 비정상적인 혈관신생에 의존하는 질환(이때, 상기 과정의 차단이 질환 진행을 예방할 수 있음), 예컨대, 암의 치료에 있어서 유리할 것으로 생각된다(문헌[Folkman, J., Nature Medicine. 1 (1995) 27-31]).
추가로, 일부 연구진들은 안지오포이에틴-2에 결합하는 항체 및 펩티드의 용도를 보고하였다. 예를 들면, 미국 특허 제6,166,185호, 미국 특허출원 공개 제2003/10124129호, 국제 특허출원 공개 제03/030833호, 제2006/068953호 및 제03/057134호 또는 미국 특허출원 공개 제2006/0122370호를 참조한다.
안지오포이에틴-2의 국소 발현의 효과 연구는 안지오포이에틴-1/Tie-2 신호의 길항작용이 조밀한 혈관구조를 느슨하게 함으로써 EC를 혈관신생 유도제, 예를 들면, VEGF로부터의 활성화 신호에 노출시킨다는 것을 보여주었다(문헌[Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50]). 안지오포이에틴-1의 억제로부터 발생된 이 전구혈관신생 효과는 항-안지오포이에틴-1 요법이 효과적인 항암 치료가 아닐 것임을 시사한다.
ANG-2는 혈관 리모델링이 일어나는 부위에서 발생 과정 동안 발현된다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]). 성체 개체에서, ANG-2 발현은 혈관 리모델링 부위뿐만 아니라 아교종(문헌[Osada, H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09]; 문헌[Koga, K., et al., Cancer Res. 61 (2001) 6248-54]), 간세포암종(문헌[Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45]), 위암종(문헌[Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53]; 문헌[Lee, J.H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61]), 갑상선 종양(문헌[Bunone, G., et al., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76]), 비소세포폐암(문헌[Wong, M.P., et al., Lung Cancer 29 (2000) 11-22]), 결장암(문헌[Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43]), 및 전립선암(문헌[Wurmbach, J.H., et al., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20])을 포함하는 고도로 혈관형성된 종양에 한정되어 있다. 일부 종양 세포는 ANG-2를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45]의 연구진은 인간 간세포암종(HCC)의 12개 표본들 중 10개 표본들에서 ANG-2 mRNA를 검출하였다. 엘리스(Ellis) 연구진은 ANG-2가 종양 상피에서 편재적으로 발현된다고 보고하였다(문헌[Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43]). 다른 연구자들은 유사한 발견을 보고하였다(문헌[Chen, L., et al., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 228-35]). 문헌[Sfiligoi, C., et al., Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74]은 보관된 인간 유방암 표본들에서 ANG-2 mRNA 수준을 검출함으로써, ANG-2 mRNA가 보조 림프절 침윤, 짧은 질환 부재 시간 및 낮은 전체 생존과 유의하게 관련되어 있다고 보고하였다. 문헌[Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29]의 연구진은 각각 병리학적 단계 I 내지 IIIA를 갖는 총 236명의 비소세포폐암(NSCLC) 환자들을 조사하였다. 이 연구진은 면역조직화학적 기법을 이용하여, 상기 NSCLC 환자들의 16.9%가 ANG-2 양성을 나타낸다는 것을 발견하였다. ANG-2 양성 종양에 대한 미세혈관 밀도는 ANG-2 음성 종양의 미세혈관 밀도보다 유의하게 더 높다. ANG-2의 이러한 혈관신생 효과는 VEGF 발현이 높은 경우에만 관찰되었다. 더욱이, ANG-2의 양성 발현은 낮은 수술후 생존을 예측하는 중요한 요인이었다(문헌[Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129]). 그러나, 상기 연구진은 ANG-1 발현과 미세혈관 밀도 사이에 유의한 상관관계를 발견하지 못하였다(문헌[Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129]). 이들 결과들은 ANG-2가 여러 유형의 암을 갖는 환자들의 좋지 않은 예후의 표시자라는 것을 암시한다.
최근에, 얀코파울로스(Yancopoulos) 연구진은 ANG-2 넉아웃 마우스 모델을 사용하여, ANG-2가 생후 혈관신생을 위해 요구된다는 것을 보고하였다(문헌[Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23]). 이 연구진은 ANG-2 넉아웃 마우스의 눈에서 유리체 혈관구조의 발생학적으로 프로그래밍된 퇴행이 일어나지 않고 그들의 망막 혈관이 중심 망막 동맥으로부터 발아되지 못한다는 것을 보여주었다(문헌[Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23]). 또한, 상기 연구진은 ANG-2의 결실이 림프 혈관구조의 패턴화 및 기능에 있어서 심각한 결함을 야기한다는 것을 발견하였다(문헌[Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23]). ANG-1을 사용하는 유전적 레스큐(rescue)는 림프를 바로잡지만, 혈관신생 결함을 바로잡지는 못한다(문헌[Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23]).
피터스(Peters)와 그의 동료들은 가용성 Tie-2가 재조합 단백질로서 전달되거나 바이러스 발현 벡터 내에 포함되어 전달된 경우, 마우스 모델에서 뮤린 유선암종 및 흑색종의 생체내 성장을 억제하였다고 보고하였다(문헌[Lin, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34]; 문헌[Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78]). 이처럼 치료된 종양 조직에서 혈관 밀도는 크게 감소하였다. 또한, 가용성 Tie-2는 종양 세포 컨디셔닝된(conditioned) 배지에 의해 자극된 래트 각막에서의 혈관신생을 차단하였다(문헌[Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78]). 나아가, 이스너(Isner)와 그의 팀은 VEGF에 ANG-2의 첨가가 VEGF 단독보다 유의하게 더 길고 더 완곡한 신생혈관형성을 촉진하였다는 것을 입증하였다(문헌[Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40]). 과도한 가용성 Tie-2 수용체는 ANG-2에 의한 VEGF-유도된 신생혈관형성의 조절을 방해하였다(문헌[Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40]). 문헌[Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91]의 연구진은 누드 마우스 이종이식편을 사용하여, 상기 이종이식편 내에서의 Flt-1 또는 Tie-2의 세포외 리간드 결합 도메인의 과다발현이 나머지 하나에 의해 보충될 수 없는 경로의 유의한 억제를 야기한다는 것을 보여주었고, 이것은 VEGF 수용체 경로 및 Tie-2 경로가 생체내 혈관신생의 과정을 위해 필수적인 2개의 독립적인 매개자로서 간주되어야 한다는 것을 암시한다(문헌[Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91]). 이것은 보다 최근 문헌[White, R., R., et al., , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33]에 의해 입증된다. 그들의 연구에서, ANG-2에 특이적으로 결합하여 억제하는 뉴클레아제(nuclease) 내성 RNA 앱타머(aptamer)가 래트 각막 미세주머니 혈관신생 모델에서 bFGF에 의해 유도된 신생혈관형성을 유의하게 억제하였다는 것이 입증되었다.
이중특이적 항체
최근에 매우 다양한 재조합 항체 형태, 예를 들면, IgG 항체 형태와 단일쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발되었다(예를 들면, 문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163]; 국제 특허출원 공개 제2001/077342호; 및 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234] 참조).
또한, 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 보유되어 있지 않은 여러 다른 새로운 형태, 예컨대, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 미니바디 및 여러 단일쇄 형태(scFv, Bis-scFv)가 개발되었다(문헌[Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136]; 문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]; 문헌[Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74]; 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297]).
모든 이러한 형태들은 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가 결합 단백질(예를 들면, scFv)에 융합시키거나, 또는 예를 들면, 2개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합시키기 위해 연결기(linker)를 사용한다(문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]). 천연적으로 발생하는 항체와의 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 매개되는 이펙터(effector) 기능, 예컨대, 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 항체 의존적 세포매개 세포독성(ADCC)을 유지하기를 원할 수 있다는 것을 명심해야 한다.
국제 특허출원 공개 제2007/024715호에는 개조된 다가 다중특이적 결합 단백질로서의 이중 가변 도메인 면역글로불린이 보고되어 있다. 생물학적 활성 항체 이량체의 제조 방법은 미국 특허 제6,897,044호에 보고되어 있다. 펩티드 연결기를 통해 서로 연결되어 있는 4개 이상의 가변 도메인을 갖는 다가 FV 항체 구축물은 미국 특허 제7,129,330호에 보고되어 있다. 이량체 항원 결합 구조 및 다량체 항원 결합 구조는 미국 특허출원 공개 제2005/0079170호에 보고되어 있다. 연결 구조에 의해 서로 공유결합된 3개 또는 4개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이적 항원 결합 단백질(이 단백질은 천연 면역글로불린이 아님)은 미국 특허 제6,511,663호에 보고되어 있다. 국제 특허출원 공개 제2006/020258호에는 원핵세포 및 진핵세포에서 효율적으로 발현될 수 있고 치료 및 진단 방법에서 유용한 4가 이중특이적 항체가 보고되어 있다. 2종의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 하나 이상의 쇄간 이황화 연결을 통해 연결되지 않은 이량체로부터 하나 이상의 쇄간 이황화 연결을 통해 연결된 이량체를 분리하거나 우세하게 합성하는 방법은 미국 특허출원 공개 제2005/0163782호에 보고되어 있다. 이중특이적 4가 수용체는 미국 특허 제5,959,083호에 보고되어 있다. 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 개조된 항체는 국제 특허출원 공개 제2001/077342호에 보고되어 있다.
다중특이적 다가 항원 결합 폴리펩티드는 국제 특허출원 공개 제1997/001580호에 보고되어 있다. 국제 특허출원 공개 제1992/004053호는 전형적으로 동일한 항원성 결정인자(antigenic determinant)에 결합하는 IgG 클래스의 단일클론 항체들로부터 제조된 동종접합체가 합성 가교연결에 의해 공유연결되어 있다고 보고한다. 항원에 대한 높은 결합력을 갖는 올리고머 단일클론 항체는 국제 특허출원 공개 제1991/06305호에 보고되어 있는데, 전형적으로 IgG 클래스의 상기 올리고머는 서로 연결되어 4가 또는 6가 IgG 분자를 형성하는 2개 이상의 면역글로불린 단량체를 갖는 형태로 분비된다. 인터페론 감마 활성이 병원성을 나타내는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는, 양으로부터 유래된 항체 및 개조된 항체 구축물은 미국 특허 제6,350,860호에 보고되어 있다. 미국 특허출원 공개 제2005/0100543호에는 이중특이적 항체의 다가 담체인 표적화가능한 구축물(즉, 표적화가능한 구축물의 각각의 분자가 2개 이상의 이중특이적 항체의 담체로서 사용될 수 있음)이 보고되어 있다. 유전적으로 개조된 이중특이적 4가 항체는 국제 특허출원 공개 제1995/009917호에 보고되어 있다. 국제 특허출원 공개 제2007/109254호에는 안정화된 scFv로 구성되거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고되어 있다.
VEGF 억제제와 ANG-2 억제제의 조합
국제 특허출원 공개 제2007/068895호는 ANG-2 길항제 및 VEGF, KDR 및/또는 FLTL 길항제의 조합물을 언급한다. 국제 특허출원 공개 제2007/089445호는 ANG-2 억제제와 VEGF 억제제의 조합물을 언급한다.
국제 특허출원 공개 제2003/106501호는 안지오포이에틴에 결합하고 다량체화 도메인을 함유하는 융합 단백질을 언급한다. 국제 특허출원 공개 제2008/132568호는 안지오포이에틴 및 VEGF에 결합하는 융합 단백질을 언급한다. 국제 특허출원 공개 제2003/020906호는 수용체의 다수의 리간드 결합 도메인을 갖는 다가 단백질 접합체에 관한 것이다.
국제 특허출원 공개 제2009/136352호는 항-혈관신생 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 2를 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 4를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄로서, 이때 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 7의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 8의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 11의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 12의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 15의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 16의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물, 암의 치료를 위한 상기 조성물, 암 치료용 약제의 제조를 위한 상기 이중특이적 항체의 용도, 및 상기 이중특이적 항체를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 암을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명의 추가 양태는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물, 혈관 질환의 치료를 위한 상기 조성물, 혈관 질환 치료용 약제의 제조를 위한 상기 이중특이적 항체의 용도, 및 상기 이중특이적 항체를 혈관 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 혈관 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 쇄를 코딩하는 핵산 분자이다.
본 발명은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는, 본 발명에 따른 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터; 및 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 재조합 제조를 위한, 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 추가로 포함한다.
본 발명은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 본 발명에 따른 핵산을 발현하고 상기 세포 또는 세포 배양물 상청액으로부터 상기 이중특이적 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법을 추가로 포함한다. 본 발명은 이러한 이중특이적 항체의 제조 방법에 의해 수득된 항체를 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명에 따른 이중특이적 2가 항체는 VEGF 및 ANG-2 표적화 요법이 필요한 인간 환자에 대한 이점을 보인다. 본 발명에 따른 항체는 이러한 질환, 특히 암을 앓는 환자에 대한 이점을 야기하는 매우 귀중한 성질을 갖는다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 종양 혈관신생 또는 혈관 질환의 종양 성장 및/또는 억제에 있어서 매우 효과적이다. 본 발명에 따른 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체는 예를 들면, 안정성, (예를 들면, 낮은 투여량에서) 우수한(즉, 느린) 제거율과 같은 귀중한 약동학적/약력학적 성질을 보여준다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 하기 a) 및/또는 b)에 있어서 매우 효과적이다:
a) 종양 성장 억제(예를 들면, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 사용한 경우, 종양 정체가 2종의 단일특이적 항체의 조합물에 비해 더 낮은 농도에서 이미 달성될 수 있었음(예를 들면, 실시예 9 및 10의 Colo205 및 KPL-4 종양 모델에서, 10 mg/kg의 XMAb1을 사용한 경우 종양 정체가 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 아바스틴의 조합물에 비해 이미 달성되었음)), 및/또는
b) 종양 혈관신생 또는 혈관 질환의 억제(예를 들면, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 사용한 경우, 최대 항혈관신생 효과가 2종의 단일특이적 항체의 조합물에 비해 더 낮은 농도에서 이미 달성될 수 있었음(예를 들면, 실시예 8의 마우스 각막 혈관신생 분석에서, 10 mg/kg의 XMAb1을 사용한 경우 최대 항혈관신생 효과가 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 아바스틴의 조합물에 비해 이미 달성되었음)).
도 1: 크놉스-인투-홀스(Knobs-into-Holes) 변형된 CH3 도메인을 포함하는 XMab 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 2a: 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 OAscFab 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 2b: 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 OAscXFab1 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 2c: 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 OAscXFab2 및 OAscXFab3 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 3: VEGF에의 <VEGF-ANG-2> XMab1의 동시적인 결합(제1 단계) 후 hANG-2에의 결합(제2 단계).
도 4: 결합 활성 mAb<ANG-2/VEGF> 항체의 정량을 위한 ELISA 원리.
도 5: 결합 활성 <ANG-2/VEGF> XMab1 항체의 정량을 위한 ELISA의 보정 곡선.
도 6: 마우스 각막 혈관신생 분석 - 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 투여에 의한, 가장자리로부터 VEGF 구배로 향하는 혈관 과성장의 억제.
도 7: 마우스 각막 혈관신생 분석 - 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 투여에 의한, 가장자리로부터 VEGF 구배로 향하는 혈관신생/혈관 과성장의 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 8: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 대장암 Colo205(작은 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 9: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 대장암 Colo205(큰 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 10: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 유방암 KPL-4(작은 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 11: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 유방암 KPL-4(큰 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 12: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 위암 N87의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 2a: 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 OAscFab 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 2b: 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 OAscXFab1 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 2c: 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 OAscXFab2 및 OAscXFab3 예에 대한 예시적 2가 이중특이적 항체 형태.
도 3: VEGF에의 <VEGF-ANG-2> XMab1의 동시적인 결합(제1 단계) 후 hANG-2에의 결합(제2 단계).
도 4: 결합 활성 mAb<ANG-2/VEGF> 항체의 정량을 위한 ELISA 원리.
도 5: 결합 활성 <ANG-2/VEGF> XMab1 항체의 정량을 위한 ELISA의 보정 곡선.
도 6: 마우스 각막 혈관신생 분석 - 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 투여에 의한, 가장자리로부터 VEGF 구배로 향하는 혈관 과성장의 억제.
도 7: 마우스 각막 혈관신생 분석 - 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 투여에 의한, 가장자리로부터 VEGF 구배로 향하는 혈관신생/혈관 과성장의 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 8: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 대장암 Colo205(작은 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 9: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 대장암 Colo205(큰 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 10: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 유방암 KPL-4(작은 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 11: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 유방암 KPL-4(큰 종양)의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
도 12: 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 의한 인간 위암 N87의 마우스 이종이식편에서의 생체내 종양 성장 억제 - 이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMab1, <ANG-2> Mab ANG2i-LC06(LC06), <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴), 및 ANG2i-LC06과 <VEGF> Mab 베바시주마브(아바스틴)의 조합물의 비교.
본 발명은 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 2를 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 4를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄로서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체에 대한 이러한 이중특이적 2가 항체 형태는 국제 특허출원 공개 제2009/080253호에 기재되어 있다(도 1에서 크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함하는 예시적 도식 참조). 이러한 이중특이적 2가 항체 형태에 의거한 항체는 본 발명의 실시예에서 XMab로 명명된다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 7의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 8의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 11의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 12의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 15의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 16의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 19의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 20의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 23의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 24의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 27의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 28의 아미노산 서열, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 중쇄의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결되어 있는, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)에 특이적으로 결합하는 이러한 이중특이적 항체에 대한 이러한 이중특이적 2가 항체 형태의 예시적 도식(크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함함)은 도 2a에 제시되어 있다. 이러한 이중특이적 2가 항체 형태에 의거한 항체는 본 발명의 실시예에서 OAscFab로서 명명된다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 30의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 33의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 하기 위치들 사이에의 이황화 결합의 도입에 의해 이황화 안정화된다: 중쇄 가변 도메인 위치 44부터 경쇄 가변 도메인 위치 100까지(넘버링은 언제나 카바트(Kabat)의 EU 지수에 따름(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 이러한 추가 이황화 안정화는 제2 전장 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL 사이에의 이황화 결합의 도입에 의해 달성된다. 안정화를 위해 비천연 이황화 가교를 도입하는 기법은, 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제94/029350호, 문헌[Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59], 문헌[Kobayashi, et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25 (1998) 387-393] 또는 문헌[Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721]에 기재되어 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 2가 항체는 제2 전장 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들 사이에, 예컨대, 중쇄 가변 도메인 위치 44와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이에 이황화 결합을 포함하는 것을 특징으로 하고;
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 36의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고,
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 중쇄의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결되고, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)에 특이적으로 결합하는 이러한 이중특이적 항체에 대한 이러한 이중특이적 2가 항체 형태의 예시적 도식(크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함함)은 도 2b에 제시되어 있다. 이러한 이중특이적 2가 항체 형태에 의거한 항체는 실시예에서 OAscXFab1로 명명된다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 39의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 40의 아미노산 서열; 및
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 38의 아미노산 서열
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 중쇄의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결되고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)에 특이적으로 결합하는 이러한 이중특이적 항체에 대한 이러한 이중특이적 2가 항체 형태의 예시적 도식(크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함함)은 도 2c에 제시되어 있다. 이러한 이중특이적 2가 항체 형태에 의거한 항체는 실시예에서 OAscXFab2 및 OAscXFab3으로 명명된다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 42의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 43의 아미노산 서열; 및
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 41의 아미노산 서열
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 45의 아미노산 서열, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 46의 아미노산 서열; 및
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 44의 아미노산 서열
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 2가 항체의 CH3 도메인은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제96/027011호, 문헌[Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621] 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681]에서 여러 예를 통해 상세히 기재되어 있는 "크놉스-인투-홀스" 기술에 의해 변경된다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인을 함유하는 두 중쇄의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2개의 중쇄의) 상기 2개의 CH3 도메인 각각은 "크놉"일 수 있는 반면, 나머지는 "홀"이다. 이황화 가교의 도입은 상기 이종이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]; 문헌[Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]) 수율을 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 모든 이중특이적 항체는 한 중쇄의 CH3 도메인과 다른 중쇄의 CH3 도메인이 항체 CH3 도메인들 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 각각 만나고, 상기 계면이 상기 이중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되어 있는 것을 특징으로 하고, 이때 상기 변경은
a) 한 중쇄의 CH3 도메인이 원래의 계면 내에서 상기 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나고, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동(cavity)에 위치할 수 있는 돌출부(protuberance)가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록, 한 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고;
b) 제2 CH3 도메인이 원래의 계면 내에서 상기 이중특이적 항체 내의 제1 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나고, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록, 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는
a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인 및 b)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인이 각각 항체 CH3 도메인들 사이의 원래의 계면에서의 변경을 포함하는 계면에서 만나고;
i) 한 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동 내에 위치할 수 있는 돌출부가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되고;
ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 두 CH3 도메인들 사이의 이황화 가교가 형성될 수 있도록 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입함으로써 두 CH3 도메인들을 추가로 변경시킨다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, Y349C 돌연변이를 "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내로 도입하고 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내로 도입함으로써 CH3 도메인들 사이의 추가 쇄간 이황화 가교도 사용할 수 있다(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]).
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내에 Y349C 및 T366W 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내에 Y349C 및 T366W 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다(하나의 CH3 도메인 내의 추가 Y349C 돌연변이와 다른 CH3 도메인 내의 추가 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 이황화 가교를 형성함)(넘버링은 언제나 카바트의 EU 지수에 따름(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 그러나, 유럽 특허출원 제1 870 459 A1호에 기재된 다른 크놉스-인투-홀스 기술도 대안적으로 또는 추가로 이용될 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체에 대한 또 다른 예는 R409D; "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 K370E 돌연변이 및 D399K; 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 E357K 돌연변이이다(넘버링은 언제나 카바트의 EU 지수에 따름(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]).
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, R409D; "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 K370E 돌연변이 및 D399K; 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 E357K 돌연변이를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내의 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 상기 CH3 도메인들 중 다른 CH3 도메인 내의 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 상기 3가 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내의 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 상기 CH3 도메인들 중 다른 CH3 도메인 내의 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, R409D; "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 K370E 돌연변이 및 D399K; 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 E357K 돌연변이를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 (실시예 3 내지 7에 기재된 분석에서 측정된) 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 VEGF에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 ANG-2에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서 ANG-2 유도된 Tie-2 인산화를 15 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 10 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에의 ANG-2 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 VEGF 수용체에의 VEGF 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질; 및
- 이중특이적 2가 항체가 HUVEC 세포의 VEGF 유도된 증식을 10 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 5 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질.
한 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하고;
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 2를 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 4를 포함하고;
(실시예 3 내지 7에 기재된 분석에서 측정된) 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 VEGF에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 ANG-2에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서 ANG-2 유도된 Tie-2 인산화를 15 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 10 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에의 ANG-2 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 VEGF 수용체에의 VEGF 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질; 및
- 이중특이적 2가 항체가 HUVEC 세포의 VEGF 유도된 증식을 10 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 5 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이러한 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄로서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄
를 포함하고;
(실시예 3 내지 7에 기재된 분석에서 측정된) 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 VEGF에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 ANG-2에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서 ANG-2 유도된 Tie-2 인산화를 15 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 10 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에의 ANG-2 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 VEGF 수용체에의 VEGF 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질; 및
- 이중특이적 2가 항체가 HUVEC 세포의 VEGF 유도된 증식을 10 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 5 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질.
한 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하고;
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 4를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체는 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하고;
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 2를 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 4를 포함하고;
(실시예 3 내지 7에 기재된 분석에서 측정된) 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 VEGF에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 ANG-2에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서 ANG-2 유도된 Tie-2 인산화를 15 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 10 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에의 ANG-2 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 VEGF 수용체에의 VEGF 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질; 및
- 이중특이적 2가 항체가 HUVEC 세포의 VEGF 유도된 증식을 10 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 5 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이러한 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 제1 전장 항체의 중쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 전장 항체의 경쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄로서, 이때 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있고, 상기 제2 전장 항체의 변형된 중쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 전장 항체의 변형된 경쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 제1 전장 항체의 중쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 전장 항체의 경쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄로서, 이때 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있고, 상기 제2 전장 항체의 변형된 중쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 전장 항체의 변형된 경쇄가 CDR 내에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄
를 포함하고;
(실시예 3 내지 7에 기재된 분석에서 측정된) 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 VEGF에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 5 nM 이하의 결합 친화성 KD 값으로 ANG-2에 결합하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서 ANG-2 유도된 Tie-2 인산화를 15 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 10 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 Tie-2에의 ANG-2 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질;
- 이중특이적 2가 항체가 VEGF 수용체에의 VEGF 결합을 20 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 15 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질; 및
- 이중특이적 2가 항체가 HUVEC 세포의 VEGF 유도된 증식을 10 nM 이하의 IC50(한 실시양태에서 5 nM 이하의 IC50)으로 억제하는 성질.
본원에서 사용된 "항체"는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "결합 부위" 또는 "항원 결합 부위"는 리간드가 실제로 결합하는 항체 분자의 영역을 의미한다. 용어 "항원 결합 부위"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(VL)(VH/VL의 쌍)을 포함한다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들면, 천연 항체는 단일특이성을 나타낸다.
본 발명에 따른 "이중특이적 항체"는 2종의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 항체는 2종의 상이한 항원, 즉 제1 항원으로서 VEGF 및 제2 항원으로서 ANG-2에 대해 특이적이다.
본원에서 사용된 용어 "단일특이적" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 각각 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "가(valent)"는 항체 분자 내에 특정 수의 결합 부위가 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항체 분자 내에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 "2가" 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "VEGF"는 예를 들면, 문헌[Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9], 문헌[Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12] 및 문헌[Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24]에 기재된 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF/VEGF-A)(서열번호 47)를 지칭한다. VEGF는 종양 및 안구내 장애와 관련된 정상적 및 비정상적 혈관신생 및 신생혈관형성의 조절에 관여한다(문헌[Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25]; 문헌[Berkman, R.A.,et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159]; 문헌[Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91]; 문헌[Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735]; 문헌[Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934]; 및 문헌[Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039]). VEGF는 여러 공급원으로부터 단리된 동종이량체 당단백질이다. VEGF는 내피 세포에 대한 매우 특이적인 유사분열촉진 활성을 보인다.
본원에서 사용된 용어 "ANG-2"는 예를 들면, 문헌[Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60] 및 문헌[Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91]에 기재된 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)(대안적으로 ANGPT2 또는 ANG2로 약칭됨)(서열번호 48)를 지칭한다. 안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2는 혈관 내피 내에서 선택적으로 발현되는 티로신 키나제의 패밀리인 Ties에 대한 리간드로서 발견되었다(문헌[Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48]). 현재 안지오포이에틴 패밀리의 4종의 명확한 구성원들이 존재한다. 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4(ANG-3 및 ANG-4)는 마우스 및 인간에서 동일한 유전자 좌위의 넓게 분기된 대응물을 대표할 수 있다(문헌[Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56]; 문헌[Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28]). ANG-1 및 ANG-2는 조직 배양 실험에서 각각 작용제 및 길항제로서 처음으로 확인되었다(ANG-1에 대해 문헌[Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69]을 참조하고, ANG-2에 대해 문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]을 참조함). 공지된 모든 안지오포이에틴들이 주로 Tie-2에 결합하고, ANG-1 및 ANG-2 둘다 3 nM의 친화성(Kd)으로 Tie-2에 결합한다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60]).
본 발명의 이중특이적 항체의 항원 결합 부위는 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 다양한 정도로 기여하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. CDR 및 골격 영역(FR)의 규모는 상기 영역이 서열들 사이의 가변성에 따라 정의되어 있는 아미노산 서열의 축적된 데이터베이스와의 비교에 의해 측정된다. 보다 적은 CDR로 구성된 기능성 항원 결합 부위(즉, 결합 특이성이 3개, 4개 또는 5개의 CDR에 의해 결정됨)도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들면, 6개의 CDR로 구성된 완전한 세트보다 적은 수의 CDR이 결합에 충분할 수 있다. 일부 경우, VH 또는 VL 도메인이 충분할 것이다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 면역글로불린 클래스의 면역글로불린 불변 영역을 추가로 포함한다. 면역글로불린 클래스는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 동종형, 및 IgG 및 IgA의 경우 이들의 하위형들을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다.
용어 "키메라 항체"는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 하나의 공급원 또는 종으로부터 유래된 가변 영역, 즉 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 지칭한다. 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포괄되는 "키메라 항체"의 다른 바람직한 형태는 본 발명에 따른 성질, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련된 성질을 발생시키도록 불변 영역이 모 항체의 불변 영역으로부터 변형되어 있거나 변화되어 있는 키메라 항체이다. 이러한 키메라 항체는 "클래스 전환된 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 분절, 및 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 보편적인 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질감염 기법을 수반하는 키메라 항체의 제조 방법은 당업계에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855], 미국 특허 제5,202,238호 및 미국 특허 제5,204,244호에서 잘 공지되어 있다.
용어 "인간화된 항체"는 골격 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린의 특이성에 비해 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형되어 있는 항체를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 뮤린 CDR을 인간 항체의 골격 영역 내로 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들면, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327] 및 문헌[Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 특히 바람직한 CDR은 키메라 항체에 대해 전술된 항원을 인식하는 서열을 대표하는 CDR에 상응한다. 본 발명에 의해 포괄되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 본 발명에 따른 성질, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련된 성질을 발생시키도록 불변 영역이 모 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되어 있거나 변화되어 있는 인간화된 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 것이다. 인간 항체는 당업계의 기술 수준에서 잘 공지되어 있다(문헌[van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374]). 인간 항체는 면역화 시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 전체 레파토리 또는 선택된 항체를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예를 들면, 마우스) 내에서도 생성될 수 있다. 이러한 생식세포주 돌연변이체 마우스 내로의 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격 시 인간 항체를 생성할 것이다(예를 들면, 문헌[Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555], 문헌[Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258], 및 문헌[Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40] 참조). 또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 내에서도 생성될 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]; 문헌[Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597]). 콜과 그의 동료들((Cole, A. et al.) 및 보에르너와 그의 동료들(Boerner, P., et al.)의 기법들도 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용될 수 있다(문헌[Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985)]; 및 문헌[Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]). 본 발명에 따른 키메라 항체 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 예를 들면, "클래스 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들면, IgG1에서 IgG4로의 돌연변이 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 본 발명에 따른 성질, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련된 성질을 발생시키도록 불변 영역에서 변형되어 있는 이러한 항체도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체들, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, NS0 또는 CHO 세포로부터 단리되거나 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체를 포함하기 위한 것이다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과다돌연변이를 겪었다. 따라서, 재조합 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포주 VH 및 VL 서열로부터 유래되거나 상기 서열과 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식세포주 레파토리 내에서 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용된 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(VL) 및 중쇄의 가변 도메인(VH))은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하는 경쇄와 중쇄로 구성된 각각의 쌍을 의미한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인들은 동일한 일반 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 골격(FR) 영역들을 포함하고, 이 영역들의 서열들은 넓게 보존되어 있고 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결되어 있다. 상기 골격 영역들은 β-시트 입체구조를 채택하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄 내의 CDR들은 골격 영역들에 의해 그들의 3차원적 구조를 유지하고 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 특히 중요한 역할을 수행하므로 본 발명의 추가 양태를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원 결합 부분"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 쇄 상의 CDR은 이러한 골격 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 많이 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의에 따라 결정된다(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링(이하 본원에서 카바트에 따른 넘버링으로 약칭됨)을 포함함).
본원에서 사용된 용어 "결합" 또는 "특이적 결합"은 정제된 야생형 항원을 사용하는 시험관내 분석, 바람직하게는 플라스몬 공명 분석(비아코어(BIAcore), 지이 헬쓰케어, 스웨덴 업살라 소재)에서 항원(인간 VEGF 또는 인간 ANG-2)의 에피토프와 항체의 결합을 지칭한다. 결합의 친화성은 용어 ka(항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합을 위한 속도 상수), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다. 한 실시양태에서, 결합 또는 특이적 결합은 10-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 내지 10-13 mol/ℓ의 결합 친화성(KD)을 의미한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프 결정인자는 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐을 포함하고, 일부 실시양태에서 특이적 3차원적 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
일부 실시양태에서, 항체는 그가 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식하는 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 기재된다.
용어 "전장 항체"는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 구성된 항체를 의미한다(도 1 참조). "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)으로 구성된 폴리펩티드(VH-CH1-HR-CH2-CH3으로 약칭됨)이고; 선택적으로 하위클래스 IgE의 항체의 경우 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)를 포함한다. 바람직하게는, "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 구성된 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된 폴리펩티드(VL-CL로 약칭됨)이다. 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 2개의 전장 항체 쇄들은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역들 사이의 폴리펩티드간 이황화 결합을 통해 서로 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 천연 항체, 예컨대, IgG(예를 들면, IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE이다. 본 발명에 따른 전장 항체는 단일 종, 예를 들면, 인간으로부터 유래될 수 있거나, 키메라화된 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 각각 형성된 2개의 항원 결합 부위(이들 둘다 동일한 항원에 특이적으로 결합함)를 포함한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 존재하는 마지막 아미노산을 의미한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 존재하는 마지막 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드 연결기"는 바람직하게는 합성 유래의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미한다. 본 발명에 따른 이들 펩티드는 펩티드 연결기를 통해 경쇄의 C-말단을 (제2 항원에 특이적으로 결합하는) 제2 전장 항체의 중쇄의 N-말단에 연결하는 데에 사용된다. 제2 전장 항체 중쇄 및 경쇄 내의 펩티드 연결기는 30개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이, 바람직하게는 32개 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 실시양태에서, 펩티드 연결기는 32개 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 실시양태에서, 상기 연결기는 (GxS)nGm이고, 이때 G는 글리신이고, S는 세린이고, x는 3이고, n은 8, 9 또는 10이고, m은 0, 1, 2 또는 3이거나, x는 4이고, n은 6, 7 또는 8이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고, 바람직하게는 x는 4이고, n은 6 또는 7이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고, 보다 바람직하게는 x는 4이고, n은 7이고, m은 2이다. 한 실시양태에서, 상기 연결기는 (G4S)6G2이다.
본원에서 사용된 용어 "불변 도메인"은 가변 영역 이외의 항체의 도메인들 전부를 의미한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 여러 클래스가 하위클래스, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 모든 5종의 항체 클래스들에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역은 κ(카파) 및 λ(람다)로 지칭된다.
본원에서 사용된 용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역"은 하위클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역, 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 의미한다. 이러한 불변 영역은 당업계의 기술 수준에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 카바트에 의해 기재되어 있다(예를 들면, 문헌[Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 문헌[Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788] 참조).
바람직하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 2가 항체는 인간 IgG1 하위클래스의 불변 영역을 갖는다.
IgG4 하위클래스의 항체들이 감소된 Fc 수용체(FcγRIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 하위클래스의, 항체들은 결합을 보인다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 상실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435는 변경되는 경우, 감소된 Fc 수용체 결합도 제공하는 잔기이다(문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604], 문헌[Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119], 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324] 및 유럽 특허 제0 307 434호).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG1 항체에 비해 감소된 FcR 결합을 갖고, 이중특이적 2가 항체는 FcR 결합과 관련하여 S228, L234, L235 및/또는 D265에서 돌연변이를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 함유하는 IgG4 하위클래스 또는 IgG1 하위클래스의 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체 내의 돌연변이는 IgG4에서 S228P 및 L235E이고 IgG1에서 L234A 및 L235A이다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 중쇄의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 경쇄의 C-말단에 연결되어 있고, 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
바람직하게는, 이 이중특이적 2가 항체 형태의 CH3 도메인은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제96/027011호, 문헌[Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621] 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681]에서 여러 예를 통해 상세히 기재된 크놉-인투-홀스" 기술에 의해 변경된다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인들의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인들을 함유하는 두 중쇄의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (상기 2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인들 각각은 "크놉"일 수 있는 반면, 나머지는 "홀"이다. 이황화 가교의 도입은 상기 이종이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]; 문헌[Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]) 수율을 증가시킨다. 추가 세부사항 및 실시양태에 대해서는 상기 전술된 바를 참조한다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 중쇄의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결되고, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
이러한 이중특이적 2가 항체 형태의 예시적 도식(크놉스-인투 홀스 변형된 CH3 도메인을 포함함)은 도 2b에 제시되어 있다. 이러한 이중특이적 2가 항체 형태에 의거한 항체는 실시예에서 OAscXFab1로 명명된다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 39, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 40; 및
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 38
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄로서, 이때 상기 중쇄의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결되고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄
를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
이러한 이중특이적 2가 항체 형태의 예시적 도식(크놉스-인투-홀스 변형된 CH3 도메인을 포함함)은 도 2c에 제시되어 있다. 이러한 이중특이적 2가 항체 형태에 의거한 항체는 실시예에서 OAscXFab2 및 OAscXFab3으로 명명된다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 42, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 43; 및
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 41
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 45, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 46; 및
b) 펩티드 연결기를 통해 제2 전장 항체의 경쇄에 연결된 제2 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 44
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항체는 재조합 수단에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산이고, 추가 양태는 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 제조 방법은 당업계의 기술 수준에서 널리 공지되어 있고 원핵세포 또는 진핵세포 내에서 단백질을 발현시키는 단계, 후속적으로 항체를 단리하는 단계 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도까지 정제하는 단계를 포함한다. 숙주 세포 내에서 전술된 바와 같은 항체를 발현시키기 위해, 각각의 변형된 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 에스케리키아 콜라이 세포 내에서 수행되고, 항체는 세포(용해 후 상청액 또는 세포)로부터 회수된다. 항체의 일반적인 재조합 제조 방법은 당업계의 기술 수준에서 잘 공지되어 있고 예를 들면, 평론 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; 문헌[Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160]; 문헌[Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는
a) 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
b) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) 상기 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계
를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법이다.
이중특이적 항체는 보편적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리된다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA는 보편적인 절차의 이용에 의해 용이하게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA의 공급원으로서 사용될 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 발현 벡터를 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, HEK293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 상기 숙주 세포 내에서 재조합 단일클론 항체의 합성을 수득할 수 있다.
이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체(또는 돌연변이체)는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 DNA 내로 도입하여 제조하거나, 뉴클레오티드 합성을 통해 제조한다. 그러나, 이러한 변형은 매우 한정된 범위 내에서만 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 전술된 항체 특징, 예컨대, IgG 동종형 및 항원 결합을 변경시키지 않지만 재조합 제조의 수율 또는 단백질 안정성을 개선시킬 수 있거나 정제를 촉진할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 항체를 발생시키기 위해 개조될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 의미한다. 한 실시양태에서, HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로서 사용된다. 본원에서 사용된 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달의 횟수와 관계없이 일차 대상체 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손들은 의도적 돌연변이 또는 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량 면에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해된다. 형질전환된 모 세포에서 스크리닝된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
NS0 세포 내에서의 발현은 예를 들면, 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123] 및 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 기재되어 있다. 일시적 발현은 예를 들면, 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837], 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289] 및 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK293)은 문헌[Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 문헌[Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 기재되어 있다.
원핵세포에 적합한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓여 있을 때 "작동가능하게 연결"되어 있다. 예를 들면, 전구-서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구-단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되어 있고, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연결"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 존재하고 분비 리더의 경우 인접하여 판독 프레임으로 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 존재할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션(ligation)에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 연결기가 보편적인 관행에 따라 사용된다.
항체의 정제는 알칼리/SDS 처리, CsCl 결합, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에서 잘 공지된 기타 방법을 포함하는 표준 기법들을 이용하여, 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행된다. 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다. 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), (예를 들면, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용하는) 티오필릭(thiophilic) 흡착, (예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, (예를 들면, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용하는) 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 단백질 정제를 위해 널리 이용되고 있다(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102]).
본 발명에 따른 인간 VEGF 및 인간 ANG-2에 대한 이중특이적 항체는 귀중한 특징, 예컨대, 높은 안정성 및 귀중한 약동학적/약력학적 성질, 예컨대, (예를 들면, 낮은 투여량에서) 우수한(즉, 느린) 제거율을 갖는다.
본 발명에 따른 이중특이적 2가 항체는 VEGF 및 ANG-2 표적화 요법이 필요한 인간 환자에 대한 이점을 보인다.
나아가, 상기 이중특이적 2가 항체는 생물학적 또는 약리학적 활성을 갖고 생체내 종양 성장 억제 및/또는 종양 혈관신생의 억제를 보인다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 하기 a) 및/또는 b)에 있어서 매우 효과적이다:
a) 종양 성장 억제(예를 들면, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 사용한 경우 종양 정체가 2종의 단일특이적 항체의 조합물에 비해 더 낮은 농도에서 이미 달성될 수 있었음(예를 들면, 실시예 9 및 10의 Colo205 및 KPL-4 종양 모델에서, 10 mg/kg의 XMAb1을 사용한 경우 종양 정체가 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 아바스틴의 조합물에 비해 이미 달성되었음)), 및/또는
b) 종양 혈관신생 또는 혈관 질환의 억제(예를 들면, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 사용한 경우 최대 항혈관신생 효과가 2종의 단일특이적 항체의 조합물에 비해 더 낮은 농도에서 이미 달성될 수 있었음(예를 들면, 실시예 8의 마우스 각막 혈관신생 분석에서, 10 mg/kg의 XMAb1을 사용한 경우 최대 항혈관신생 효과가 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 아바스틴의 조합물에 비해 이미 달성되었음)).
마지막으로, 본 발명에 따른 인간 VEGF 및 인간 ANG-2에 대한 2가 이중특이적 항체는 귀중한 효능/독성 프로파일을 가질 수 있고 항-VEGF 및 항-ANG-2 요법이 필요한 환자에게 이점을 제공할 수 있다.
본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제제화된 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태는 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암의 치료를 위한 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 암 치료가 필요한 환자에게 투여하여 암을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 전이의 예방을 위한 약학 조성물이다.
본 발명은 전이의 예방을 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 전이 예방용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 전이 예방 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 일차 암을 앓는 환자에서 전이를 예방하는 방법이다.
본 발명자들은 정위(orthotopic) 및 피하 암 모델(실시예 9 참조)(종양 세포가 정맥내로 주사되는 실험 모델과 대조적으로, 이것은 세포가 일차 종양으로부터 떨어져 나와 이차 기관, 예컨대, 폐 또는 간(여기서, 이차 종양이 형성됨)으로 전이되는 임상적 상황과 유사함)에서 생체내 자연발생적 전이/이차 종양의 매우 효율적인 예방을 볼 수 있었다.
본 발명에 따른 용어 "전이"는 암세포가 일차 종양으로부터 환자 내의 어느 하나 이상의 부위로 전파되어 상기 부위에서 이차 종양이 발생하는 것을 지칭한다. 암이 전이되었는지를 확인하는 수단은 당업계에서 공지되어 있고, 골 스캔, 흉부 X-선, CAT 스캔, MRI 스캔 및 종양 마커 시험을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "전이의 예방" 또는 "이차 종양의 예방"은 동일한 의미를 갖고, 암세포가 일차 종양으로부터 환자 내의 어느 하나 이상의 부위로 더 전파되는 것을 억제하거나 감소시키는 방식으로 수행되는, 암을 앓는 환자에서의 전이에 대한 예방적 조치를 지칭한다. 이것은 일차 종양 또는 암의 전이가 예방되거나, 지연되거나, 감소되어 이차 종양의 발생이 예방되거나, 지연되거나, 감소된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 전이, 즉 폐의 이차 종양이 예방되거나 감소되는데, 이것은 암세포가 일차 종양으로부터 폐로 전이적으로 전파되는 것이 예방되거나 감소된다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "약학 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들면, 주사 또는 관주에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여에 적합하다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 공지된 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물을 일부 투여 경로로 투여하기 위해, 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질과 함께 공투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 적절한 담체, 예를 들면, 리포좀 또는 희석제 중의 상기 화합물을 대상체에게 투여할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 완충제 수용액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된"은 통상적으로 주사에 의한 (장 투여 및 국소 투여 이외의) 투여 방식을 의미하고, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 관주를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 증식성 질환, 예컨대, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포폐암(NSCL), 세기관지세포폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육아종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장세포암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 종양, 뇌간아교종, 다형성아교모세포종, 성상아교세포종, 슈반세포종(schwanoma), 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체선종 및 유윙(Ewings) 육종(상기 암들 중 임의의 암의 난치성 버젼, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 암의 조합을 포함함)을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 양태는 항혈관신생제로서 본 발명에 따른 이중특이적 항체 또는 상기 약학 조성물이다. 이러한 항혈관신생제는 암, 특히 고형 종양, 및 다른 혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 혈관 질환의 치료를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈관 질환의 치료를 위한 상기 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈관 질환 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 혈관 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 혈관 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
용어 "혈관 질환"은 암, 염증 질환, 죽상동맥경화증, 허혈, 외상, 패혈증, COPD, 천식, 당뇨병, AMD, 망막병증, 뇌졸중, 비만, 급성 폐 손상, 출혈, 혈관 누출, 예를 들면, 사이토카인에 의해 유도된 혈관 누출, 알레르기, 그레이브스병, 하시모토 자가면역 갑상선염, 특발성 혈소판감소성 자반증, 거대세포 동맥염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반루프스(SLE), 루프스 신염, 크론병, 다발성 경화증, 궤양성 결장염, 특히 고형 종양, 안구내 신생혈관 증후군, 예컨대, 증식성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성(AMD), 류마티스 관절염 및 건선을 포함한다(문헌[Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934]; 문헌[Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239]; 및 문헌[Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp 1625-1710]).
이들 조성물은 보조제, 예컨대, 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물의 존재 예방은 상기 멸균 절차, 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 상기 조성물 내에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 약학 제형의 연장된 흡수를 야기할 수 있다.
선택된 투여 경로와 관계없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 공지된 보편적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투약 제형으로 제제화된다.
본 발명의 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 구체적인 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 요구되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 구체적인 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 구체적인 조성물과 조합 사용되는 다른 약제, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지된 기타 요인들을 포함하는 다양한 약동학적 요인들에 의해 좌우될 것이다.
조성물은 멸균되어야 하고 조성물이 주사기에 의해 전달될 수 있을 정도의 유동성을 나타내어야 한다. 물 이외에, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수 용액이다.
적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
본원에서 사용된 표현 "세포," "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 횟수와 관계없이 일차 대상체 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손들은 의도적 돌연변이 또는 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량 면에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해된다. 형질전환된 모 세포에서 스크리닝된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 상이한 명칭이 의도되는 경우, 이것은 문맥으로부터 분명해질 것이다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환"은 벡터/핵산이 숙주 세포 내로 전달되는 과정을 지칭한다. 강력한 세포벽 장벽을 갖지 않은 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 형질감염은 예를 들면, 문헌[Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 546-467]에 기재된 바와 같은 인산칼슘 침전 방법에 의해 수행된다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법, 예를 들면, 핵 주입 또는 원형질체 융합도 이용될 수 있다. 원핵세포 또는 실질적인 세포벽 구축물을 함유하는 세포가 사용되는 경우, 예를 들면, 하나의 형질감염 방법은 문헌[Cohen, S.N., et al., PNAS. 69 (1972) 2110-2114]에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.
본원에서 사용된 "발현"은 핵산이 mRNA로 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA(전사체로도 지칭됨)가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 후속적으로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 유전자 생성물로서 총칭된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 진핵세포 내에서의 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전달하는 핵산 분자, 특히 자가 복제하는 핵산 분자이다. 상기 용어는 주로 세포 내로의 DNA 또는 RNA의 삽입(예를 들면, 염색체 삽입)을 위해 기능하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 기능하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 기재된 기능들 중 하나 초과의 기능을 제공하는 벡터도 포함된다.
"발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입되는 경우 폴리펩티드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 통상적으로 원하는 발현 생성물을 제공하도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 지칭한다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위 내에 기재되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 전술된 절차를 변형시킬 수 있다는 것이 이해될 것이다.
서열목록(아미노산 서열)의 설명
서열번호 1: <VEGF> 베바시주마브의 가변 중쇄 도메인 VH
서열번호 2: <VEGF> 베바시주마브의 가변 경쇄 도메인
서열번호 3: <ANG-2> E6Q의 가변 중쇄 도메인 VH
서열번호 4: <ANG-2> E6Q의 가변 경쇄 도메인 VL
서열번호 5: XMab1-<VEGF> 경쇄
서열번호 6: XMab1-<ANG-2> 경쇄
서열번호 7: XMab1-<VEGF> 중쇄
서열번호 8: XMab1-<ANG-2> 중쇄
서열번호 9: XMab2-<VEGF> 경쇄
서열번호 10: XMab2-<ANG-2> 경쇄
서열번호 11: XMab2-<VEGF> 중쇄
서열번호 12: XMab2-<ANG-2> 중쇄
서열번호 13: XMab3-<VEGF> 경쇄
서열번호 14: XMab3-<ANG-2> 경쇄
서열번호 15: XMab3-<VEGF> 중쇄
서열번호 16: XMab3-<ANG-2> 중쇄
서열번호 17: XMab4-<VEGF> 경쇄
서열번호 18: XMab4-<ANG-2> 경쇄
서열번호 19: XMab4-<VEGF> 중쇄
서열번호 20: XMab4-<ANG-2> 중쇄
서열번호 21: XMab5-<VEGF> 경쇄
서열번호 22: XMab5-<ANG-2> 경쇄
서열번호 23: XMab5-<VEGF> 중쇄
서열번호 24: XMab5-<ANG-2> 중쇄
서열번호 25: XMab6-<VEGF> 경쇄
서열번호 26: XMab6-<ANG-2> 경쇄
서열번호 27: XMab6-<VEGF> 중쇄
서열번호 28: XMab6-<ANG-2> 중쇄
서열번호 29: OAscFab1-<ANG-2> 펩티드에 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호 30: OAscFab1-<VEGF> 중쇄
서열번호 31: OAscFab1-<VEGF> 경쇄
서열번호 32: OAscFab2-<ANG-2> 펩티드에 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호 33: OAscFab2-<VEGF> 중쇄
서열번호 34: OAscFab2-<VEGF> 경쇄
서열번호 35: OAscFab3-<ANG-2> 펩티드에 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호 36: OAscFab3-<VEGF> 중쇄
서열번호 37: OAscFab3-<VEGF> 경쇄
서열번호 38: OAscXFab1-<ANG-2> 펩티드에 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호 39: OAscXFab1-<VEGF> 중쇄
서열번호 40: OAscXFab1-<VEGF> 경쇄
서열번호 41: OAscXFab2-<ANG-2> 펩티드에 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호 42: OAscXFab2-<VEGF> 중쇄
서열번호 43: OAscXFab2-<VEGF> 경쇄
서열번호 44: OAscXFab3-<ANG-2> 펩티드에 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호 45: OAscXFab3-<VEGF> 중쇄
서열번호 46: OAscXFab3-<VEGF> 경쇄
서열번호 47: 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF)
서열번호 48: 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)
실험 절차
실시예
재료 및 일반적인 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열들에 대한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공되어 있다. 항체 쇄들의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 넘버링되고 지칭된다(문헌[Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85]; 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)]).
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 제조자의 지시에 따라 분자생물학적 시약들을 사용하였다.
유전자 합성
화학적 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 원하는 유전자 분절을 제조할 수 있다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위에 의해 플랭킹된 상기 유전자 분절을, PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션으로 조립한 후 표시된 제한 부위, 예를 들면, KpnI/SacI 또는 AscI/PacI을 통해 pPCRScript(스트라타진) 계열의 pGA4 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
유전자 합성 단편들은 진아트(Geneart)(독일 레겐스부르그 소재)에서 주어진 요건에 따라 순서대로 정돈되었다. ANG-2/VEGF 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 모든 유전자 분절들은 진핵세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드(MGWSCIILFLVATATGVHS)를 코딩하는 5' 말단 DNA 서열을 갖고 합성된 유전자의 5' 말단 및 3' 말단에서 유일한 제한 부위를 갖도록 합성되었다. 이황화 안정화된 "크놉스-인투-홀" 변형된 중쇄를 보유하는 DNA 서열은 "크놉스" 중쇄 내에 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖고 "홀" 중쇄 내에 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖도록 디자인되었다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 메디게노믹스 게엠베하(MediGenomix GmbH)(독일 마르틴스리에드 소재) 또는 시퀴서브 게엠베하(Sequiserve GmbH)(독일 바터스테텐 소재)에서 수행된 이중 가닥 시퀀싱에 의해 결정되었다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스(Infomax) 벡터 NT1 어드밴스 스위트 버전 8.0을 서열 생성, 맵핑, 분석, 해석 및 예증에 사용하였다.
발현 벡터
전술된 항체의 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터를 갖는 cDNA 구성 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 구성에 의거한 (예를 들면, HEK293 EBNA 또는 HEK293-F 세포에서의) 일시적 발현 또는 (예를 들면, CHO 세포에서의) 안정한 발현을 위한 발현 플라스미드의 변이체들을 적용하였다(예를 들면, 도 2b).
항체 발현 카세트 이외에, 벡터는
- 에스케리키아 콜라이 내에서 이 플라스미드의 복제를 허용하는 복제기점, 및
- 에스케리키아 콜라이 내에서 앰피실린 내성을 부여하는 β-락타마제(lactamase) 유전자
를 함유하였다.
항체 유전자의 전사 유닛(unit)은 하기 요소들로 구성된다:
- 5' 말단에 존재하는 유일한 제한 부위(들),
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- cDNA 조직화의 경우 인트론 A 서열,
- 인간 항체 유전자의 5'-비번역 영역,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 면역글로불린 엑손-인트론 구성을 갖는 cDNA 또는 게놈 구성으로서의 인간 항체 쇄(중쇄, 변형된 중쇄 또는 경쇄),
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3'-비번역 영역, 및
- 3' 말단에 존재하는 유일한 제한 부위(들).
일시적 형질감염 및 안정한 형질감염을 위해, 형질전환된 에스케리키아 콜라이 배양물로부터의 플라스미드 제제(뉴클레오본드 에이엑스(Nucleobond AX), 마슈리-나겔(Macherey-Nagel))를 사용하여 보다 많은 양의 플라스미드를 제조하였다.
세포 배양 기법
문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 바와 같이 표준 세포 배양 기법을 이용하였다.
HEK293-F 시스템에서의 일시적 형질감염
제조자의 지시(인비트로겐, 미국 소재)에 따라 프리스타일(상표) 293 발현 시스템을 사용하여 인간 배아 신장 293-F 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 재조합 면역글로불린 변이체를 발현시켰다. 요약하건대, 현탁액 프리스타일(상표) 293-F 세포를 37℃/8% CO2에서 프리스타일(상표) 293 발현 배지 중에서 배양하고, 상기 세포를 형질감염 당일 1 x 106 내지 2 x 106개 생존 세포/㎖의 밀도로 새로운 배지 내에 시딩하였다. 단일특이적 모 항체에 대한 250 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 325 ㎕의 293펙틴(fectin)(상표)(인비트로겐, 독일 소재) 및 250 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 1:1 몰비로 사용하여 옵티(Opti)-MEM(등록상표) I 배지(인비트로겐, 미국 소재) 중에서 DNA-296펙틴(상표) 복합체를 제조하였다. 250 ㎖ 최종 형질감염 부피(OAscFab 및 OAscXFab)를 위해 325 ㎕의 293펙틴(상표)(인비트로겐, 독일 소재) 및 250 ㎍의 "크놉스-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA를 일반적으로 1:1:1 몰비로 사용하여 옵티-MEM(등록상표) I 배지(인비트로겐, 미국 소재) 중에서 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 갖는 "크놉스-인투-홀" DNA-293펙틴 복합체를 제조하였다. 발현 수율 최적화를 위해, 상기 비를 변경시킬 수 있다. 250 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 325 ㎕의 293펙틴(상표)(인비트로겐, 독일 소재) 및 250 ㎍의 "크놉스-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA를 1:1:1:1 몰비로 사용하여 옵티-MEM(등록상표) I 배지(인비트로겐, 미국 소재) 중에서 XMab DNA-293펙틴 복합체를 제조하였다. 발현 수율 최적화를 위해, 상기 비를 변경시킬 수 있다. 항체 함유 세포 배양물 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리하여 형질감염으로부터 7일 후 회수하고 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였다. 상청액을 정제할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
단백질 측정
문헌[Pace, C.N., et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423]에 따라 아미노산 서열에 의거하여 계산된 몰 흡광계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정하였다.
상청액 중의 항체 농도 측정
단백질 A 아가로스 비드(로슈(Roche))를 사용하는 면역침전을 이용하여 세포 배양물 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 평가하였다. 60 ㎕의 단백질 A 아가로스 비드를 TBS-NP40(50 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 노니데트(Nonidet)-P40)으로 3회 세척하였다. 그 후, 1 내지 15 ㎖의 세포 배양물 상청액을 TBS-NP40에 의해 미리 평형화된 단백질 A 아가로스 비드에 인가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 상기 비드를 울트라프리-MC-필터 컬럼(아미콘(Amicon)) 상에서 0.5 ㎖ TBS-NP40으로 1회 세척하고, 0.5 ㎖ 2x 포스페이트 완충 식염수(2xPBS, 로슈)로 2회 세척하고, 0.5 ㎖ 100 mM Na-시트레이트(pH 5.0)로 짧게 4회 세척하였다. 35 ㎕의 NuPAGE(등록상표) LDS 샘플 완충제(인비트로겐)를 첨가하여 결합된 항체를 용출하였다. 샘플의 절반을 NuPAGE(등록상표) 샘플 환원제와 조합하거나 미환원된 상태로 놓아두고, 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 후, 20 ㎕를 (비환원된 SDS-PAGE의 경우 MOPS 완충제를 사용하고, 환원된 SDS-PAGE의 경우 NuPAGE(등록상표) 항산화제 런닝 완충제 첨가제(인비트로겐)를 갖는 MES 완충제를 사용하는) 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 비스-트리스 SDS-PAGE(인비트로겐)에 인가하고, 코마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하였다.
세포 배양물 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 단백질 A-HPLC 크로마토그래피로 측정하였다. 요약하건대, 단백질 A에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양물 상청액을 완충제(50 mM K2HPO4 및 300 mM NaCl, pH 7.3) 중에서 하이트랩(HiTrap) 단백질 A 컬럼(지이 헬쓰케어)에 인가하고, 다이오넥스(Dionex) HPLC 시스템 상에서 550 mM 아세트산(pH 2.5)을 사용하여 매트릭스로부터 용출하였다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 대역의 적분으로 정량하였다. 정제된 표준 IgG1 항체를 표준물로서 사용하였다.
대안적으로, 세포 배양물 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA로 측정하였다. 요약하건대, 스트렙타웰 하이 바인드(StreptaWell High Bind) 스트렙타비딘 A-96 웰 마이크로타이터 플레이트(로슈)를 실온에서 1시간 동안, 또는 대안적으로 4℃에서 밤새 동안 0.1 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕/웰의 바이오티닐화된 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ>BI(다이아노바(Dianova))로 코팅한 후, 200 ㎕/웰의 0.05% 트윈 함유 PBS(PBST, 시그마)로 3회 세척하였다. 각각의 항체 함유 세포 배양물 상청액의 일련의 PBS(시그마) 희석물을 웰 당 100 ㎕씩 웰에 첨가하고, 실온에서 마이크로타이터플레이트 진탕기 상에서 1 내지 2시간 동안 항온처리하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 PBST로 3회 세척하고, 실온에서 마이크로타이터플레이트 진탕기 상에서 1 내지 2시간 동안 0.1 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕의 F(ab')2<hFcγ>POD(다이아노바)를 검출 항체로서 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. 비결합된 검출 항체를 200 ㎕/웰의 PBST로 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 ABTS를 첨가하여 결합된 검출 항체를 검출하였다. 405 nm(기준 파장 492 nm)의 측정 파장에서 테칸 플루오르(Tecan Fluor) 분광계 상에서 흡광도의 측정을 수행하였다.
이중특이적 항체의 정제
단백질 A-세파로스(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 수퍼덱스200 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양물 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제하였다. 요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 의해 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(5 ㎖)에 인가하였다. 비결합된 단백질을 평형화 완충제로 세척하였다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충제(pH 2.8)로 용출하고, 단백질 함유 분획을 0.1 ㎖의 1 M 트리스(pH 8.5)로 중화시켰다. 그 다음, 용출된 단백질 분획을 모으고 아미콘 울트라 원심분리 필터 장치(MWCO: 30 K, 밀리포어)로 3 ㎖의 부피까지 농축하고, 완충제(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0)에 의해 평형화된 수퍼덱스200 하이로드(HiLoad) 120 ㎖ 16/60 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 상에 적재하였다. 정제된 이중특이적 항체를 5% 고분자량 응집체 미만으로 함유하는 분획을 모으고 -80℃에서 1.0 mg/㎖ 분취액으로서 저장하였다.
SDS-PAGE
제조자의 지시에 따라 NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)을 이용하였다. 구체적으로, 4 내지 20% NuPAGE(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 트리스-글리신 프리-캐스트 겔 및 노벡스(등록상표) 트리스-글리신 SDS 런닝 완충제를 사용하였다(예를 들면, 도 3 참조). 상기 겔을 런닝하기 전에 NuPAGE(등록상표) 샘플 환원제를 첨가하여 샘플의 환원을 달성하였다.
분석적인 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태의 확인을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC 크로마토그래피로 수행하였다. 요약하건대, 단백질 A 정제된 항체를 아질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템 상에서 완충제(300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5) 중의 토소(Tosoh) TSK겔 G3000SW 컬럼에 인가하거나, 다이오넥스 HPLC 시스템 상에서 2X PBS 중의 수퍼덱스200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 인가하였다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 영역의 적분으로 정량하였다. 바이오라드 겔 여과 표준 151-1901을 표준물로서 사용하였다(예를 들면, 도 4 참조).
질량 분광법
교차 항체의 총 탈글리코실화된 질량을 전기분무 이온화 질량 분광법(ESI-MS)을 통해 측정하고 확인하였다. 요약하건대, 100 ㎍의 정제된 항체를 37℃에서 2 mg/㎖ 이하의 단백질 농도에서 100 mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7) 중의 50 mU의 N-글리코시다제 F(PNGaseF, 프로자임)로 12 내지 24시간 동안 탈글리코실화시킨 후 수퍼덱스 G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상의 HPLC를 통해 탈염시켰다. 각각의 중쇄 및 경쇄의 질량을 탈글리코실화 및 환원 후 ESI-MS로 측정하였다. 요약하건대, 115 ㎕ 중의 50 ㎍ 항체를 60 ㎕ 1 M TCEP 및 50 ㎕ 8 M 구아니딘-하이드로클로라이드와 함께 항온처리한 후 탈염시켰다. 환원된 중쇄 및 경쇄의 총 질량 및 질량을 나노메이트(NanoMate) 공급원이 장착된 Q-스타 엘리트(Star Elite) MS 시스템 상에서 ESI-MS를 통해 측정하였다.
HEK293
-
Tie-2
세포주의 발생
안지오포이에틴-2 항체가 ANGPT2 자극된 Tie-2 인산화, 및 ANGPT2와 세포 상의 Tie-2의 결합을 방해하는 정도를 측정하기 위해, 재조합 HEK293-Tie 세포주를 발생시켰다. 요약하건대, CMV 프로모터 및 네오마이신 내성 마커의 조절 하에 있는 전장 인간 Tie-2(서열번호 108)를 코딩하는 pcDNA3 계열의 플라스미드(RB22-pcDNA3 Topo hTie-2)를, 형질감염 시약으로서 퓨진(Fugene)(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))을 사용하여 HEK293 세포(ATCC) 내로 형질감염시키고, 내성 세포를 DMEM(10% FCS, 500 ㎍/㎖ G418) 중에서 선별하였다. 개개의 클론들을 클로닝 실린더를 통해 단리한 후 FACS로 Tie-2 발현에 대해 분석하였다. 클론 22는 G418의 부재 하에서조차도 높고 안정한 Tie-2 발현을 갖는 클론으로서 확인되었다(HEK293-Tie-2 클론 22). 그 후, HEK293-Tie-2 클론 22를 하기 세포 분석을 위해 사용하였다: ANGPT2 유도된 Tie-2 인산화 및 ANGPT2 세포 리간드 결합 분석.
ANGPT2
유도된
Tie
-2 인산화 분석
ANGPT2 항체에 의한 ANGPT2 유도된 Tie-2 인산화의 억제를 하기 분석 원리에 따라 측정하였다. HEK293-Tie-2 클론 22를 ANGPT2 항체의 부재 또는 존재 하에 ANGPT2로 5분 동안 자극하고, P-Tie-2를 샌드위치 ELISA로 정량하였다. 요약하건대, 웰 당 2 x 105개의 HEK293-Tie-2 클론 22 세포를 100 ㎕ DMEM(10% FCS, 500 ㎍/㎖ 제네티신) 중에서 폴리-D-라이신으로 코팅된 96 웰 마이크로타이터 플레이트 상에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, ANGPT2 항체의 적정 열(titration row)을 마이크로타이터 플레이트(4배 농축됨, 75 ㎕의 최종 부피/웰, 중복체) 내에서 제조하고, 75 ㎕의 ANGPT2(알 앤드 디 시스템스(R&D Systems) # 623-AN) 희석물(4배 농축된 용액으로서 3.2 ㎍/㎖)과 혼합하였다. 항체 및 ANGPT2를 실온에서 15분 동안 예비항온처리하였다. 100 ㎕의 혼합물을 HEK293-Tie-2 클론 22 세포에 첨가하고(1 mM NaV3O4와 함께 5분 동안 예비항온처리함, 시그마 #S6508) 37℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 그 후, 세포를 웰 당 200 ㎕의 빙냉 PBS + 1 mM NaV3O4로 세척하고, 얼음 상에서 웰 당 120 ㎕의 용해 완충제(20 mM 트리스, pH 8.0, 137 mM NaCl, 1% NP-40, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA, 1 mM NaV3O4, 1 mM PMSF 및 10 ㎍/㎖ 아프로티닌)를 첨가하여 용해시켰다. 세포를 4℃에서 마이크로타이터 플레이트 진탕기 상에서 30분 동안 용해시키고, 미리 원심분리하지 않고 총 단백질을 측정하지 않고 100 ㎕의 용해물을 p-Tie-2 ELISA 마이크로타이터 플레이트(알 앤드 디 시스템스, 알 앤드 디 #DY990) 내로 직접적으로 전달하였다. P-Tie-2 양을 제조자의 지시에 따라 정량하고, 억제에 대한 IC50 값을 엑셀에 대한 XLfit4 분석 플러그-인(plug-in)(투여량 반응 1개 부위, 모델 205)을 이용하여 측정하였다. IC50 값은 한 실험 내에서 비교될 수 있으나 실험마다 달라질 수 있다.
VEGF 유도된 HUVEC 증식 분석
VEGF 항체의 세포내 기능을 측정하기 위해 VEGF 유도된 HUVEC(인간 탯줄 정맥 내피 세포, 프로모셀(Promocell) #C-12200) 증식을 선택하였다. 요약하건대, 96 웰 당 5000개의 HUVEC 세포(낮은 계대배양 수, ≤5 계대배양)를 콜라겐 I 코팅된 BD 바이오코트(Biocoat) 콜라겐 I 96 웰 마이크로타이터 플레이트(BD #354407/35640) 내에서 100 ㎕ 기아(starvation) 배지(EBM-2 내피 기저 배지 2, 프로모셀 #C-22211, 0.5% FCS, 페니실린/스트렙토마이신) 중에서 밤새 항온처리하였다. 다양한 농도의 항체를 rhVEGF(30 ng/㎖ 최종 농도, BD # 354107)와 혼합하고 실온에서 15분 동안 예비항온처리하였다. 그 후, 혼합물을 HUVEC 세포에 첨가하고 37℃ 및 5 CO2에서 72시간 동안 항온처리하였다. 분석 당일, 상기 플레이트를 실온으로 30분 동안 평형화시키고, 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(상표) 발광 세포 생존율 분석 키트를 매뉴얼(프로메가, # G7571/2/3)에 따라 사용하여 세포 생존율/증식을 측정하였다. 발광을 분광계에서 측정하였다.
실시예 1a
이중특이적 2가 도메인 교환된 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 XMab의 발현 및 정제
상기 재료 및 방법에 기재된 절차에 따라, 이중특이적 2가 도메인 교환된 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 XMab1, XMab2 및 XMab3을 발현시키고 정제하였다. <VEGF> 부분의 VH 및 VL(서열번호 1 및 서열번호 2)은 베바시주마브에 의거한 것이다. <ANG-2> 부분의 VH(서열번호 3)는 ANG2i-LC06의 VH 서열(국제 특허출원 제PCT/EP2009/007182호(공개 제2010/040508호)에 기재되어 있고 파지 디스플레이를 통해 수득된 서열의 추가 성숙된 단편임)의 E6Q 돌연변이(위치 6에서 원래의 아미노산인 글루탐산(E)이 글루타민(Q)으로 교체됨)에 의해 유도되었다. <ANG-2> 부분의 VL(서열번호 4)은 ANG2i-LC06의 VL 서열(국제 특허출원 제PCT/EP2009/007182호(공개 제2010/040508호) 참조)로부터 유도되었다. 이중특이적 2가 도메인 교환된 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 XMab1, XMab2 및 XMab3을 발현시키고 정제하였다. 이들 이중특이적 2가 항체의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 5 내지 8(XMab1), 서열번호 9 내지 12(XMab2) 및 서열번호 13 내지 16(XMab3)에 제시되어 있다. 예시적 구조에 대해서는 도 1을 참조한다.
(서열번호 17 내지 20(XMab4), 서열번호 21 내지 24(XMab5) 및 서열번호 25 내지 28(XMab6)에 제시된 관련 경쇄 아미노산 서열 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는) 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMab4, XMab5 및 XMab6을 유사하게 발현시키고 정제하였다.
결합 친화성 및 다른 성질들은 전술된 바와 같이 측정되었거나 측정된다.
실시예 1b
이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 OAscFab의 발현 및 정제
상기 재료 및 방법에 기재된 절차에 따라 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 OAscFab1, OAscFab2 및 OAscFab3을 발현시키고 정제하였다. <VEGF> 부분의 VH 및 VL(서열번호 1 및 서열번호 2)은 베바시주마브에 의거한 것이다. <ANG-2>E6Q 부분의 VH(서열번호 3)는 ANG2i-LC06의 VH 서열(국제 특허출원 제PCT/EP2009/007182호(공개 제2010/040508호)에 기재되어 있고 파지 디스플레이를 통해 수득된 서열의 추가 성숙된 단편임)의 E6Q 돌연변이(위치 6에서 원래의 아미노산인 글루탐산(E)이 글루타민(Q)으로 교체됨)에 의해 유도되었다. <ANG-2>E6Q 부분의 VL(서열번호 4)은 ANG2i-LC06의 VL 서열(국제 특허출원 제PCT/EP2009/007182호(공개 제2010/040508호) 참조)로부터 유도되었다. 이들 이중특이적 2가 항체의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 29 내지 31(OAscFab1), 서열번호 32 내지 34(OAscFab2) 및 서열번호 35 내지 37(OAscFab3)에 제시되어 있다. 예시적 구조에 대해서는 도 2a를 참조한다. OAscFab1, OAscFab2 및 OAscFab3의 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. OAscFab2 및 OAscFab3의 정제는 하기 수율을 제공하였다.
결합 친화성 및 다른 성질은 기재된 바와 같이 측정된다.
실시예 1c
이중특이적 2가 도메인 교환된 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 OAscXFab의 발현 및 정제
상기 재료 및 방법에 기재된 절차에 따라 이중특이적 2가 도메인 교환된 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 OAscXFab1, OAscXFab2 및 OAscXFab3을 발현시키고 정제하였다. <VEGF> 부분의 VH 및 VL(서열번호 1 및 서열번호 2)은 베바시주마브에 의거한 것이다. <ANG-2>E6Q 부분의 VH(서열번호 3)는 ANG2i-LC06의 VH 서열(국제 특허출원 제PCT/EP2009/007182호(공개 제2010/040508호)에 기재되어 있고 파지 디스플레이를 통해 수득된 서열의 추가 성숙된 단편임)의 E6Q 돌연변이(위치 6에서 원래의 아미노산인 글루탐산(E)이 글루타민(Q)으로 교체됨)에 의해 유도되었다. <ANG-2>E6Q 부분의 VL(서열번호 4)은 ANG2i-LC06의 VL 서열(국제 특허출원 제PCT/EP2009/007182호(공개 제2010/040508호) 참조)로부터 유도되었다. 이들 이중특이적 2가 항체의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 38 내지 40(OAscXFab1), 서열번호 41 내지 43(OAscXFab2) 및 서열번호 44 내지 46(OAscXFab3)에 제시되어 있다. 예시적 구조에 대해서는 도 2b(OAscXFab1) 및 도 2c(OAscXFab2, OAscXFab3)를 참조한다. 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
결합 친화성 및 다른 성질은 기재된 바와 같이 측정된다.
실시예 2
이중특이적 항체의 안정성
변성 온도(
SYPRO
오렌지 방법)
단백질 변성(즉, 단백질 구조의 온도 유도된 상실)이 일어나는 온도를 측정하기 위해, 소수성 환경에서 강한 형광을 나타내는 소수성 형광 염료(SYPRO 오렌지, 인비트로겐)에 의존하는 방법을 이용하였다. 단백질 변성 시, 소수성 패치는 용매에 노출되어 증가된 형광을 야기한다. 변성 온도보다 높은 온도에서 형광 강도는 다시 감소하므로, 최대 형광이 도달된 온도가 변성 온도로서 정의된다. 상기 방법은 문헌[Ericsson, U.B., et al., Anal Biochem 357 (2006) 289-298] 및 문헌[He, F., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 99 (2010) 1707-1720]에 기재되어 있다.
완충제(20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl, pH 6.0) 중의 약 1 mg/㎖ 농도의 단백질 샘플을 SYPRO 오렌지(5000x 원액)와 혼합하여 1:5000의 최종 희석비에 도달하였다. 20 ㎕의 부피를 384 웰 플레이트 내로 옮기고, 온도 의존성 형광을 0.36℃/분의 가열 속도로 라이트사이클러(LightCycler)(등록상표) 480 실시간 PCR 시스템(로슈 어플라이드 사이언시스)에서 판독하였다.
동적 광 산란(DLS)에 의한 응집 온도
열적으로 유도된 단백질 응집이 일어나는 온도를 동적 광 산란(DLS)으로 측정하였다. DLS는 마이크로초 크기의 산란된 광 강도의 변동으로부터 유도된, 용액 중의 거대분자의 크기 분포에 대한 정보를 제공하였다. 샘플이 점진적으로 가열될 때, 응집이 일정 온도에서 일어나기 시작하여 입자 크기를 증가시킨다. 입자 크기가 증가하기 시작하는 온도는 응집 온도로서 정의된다. 응집 온도 및 변성 온도는 변성이 반드시 응집을 위한 전제조건이 아닐 수 있기 때문에 반드시 동일할 필요는 없다.
응집 온도 측정을 위해, 다이나프로(DynaPro) DLS 플레이트판독기(와이어트 테크놀로지스(Wyatt technologies))를 이용하였다. 측정 전에, 샘플을 384 웰 필터 플레이트(밀리포어 멀티스크린 384 웰 여과 시스템, 0.45 ㎛)를 통해 광학 384 웰 플레이트(코닝 #3540) 내로 여과시켰다. 35 ㎕의 샘플 부피를 제제화 완충제(20 mM 시트레이트, 180 mM 수크로스, 20 mM 아르기닌, 0.02% 폴리소르베이트 20) 중의 약 1 mg/㎖의 단백질 농도로 사용하였다. 각각의 웰을 20 ㎕ 파라핀 오일(시그마)로 덮어 증발을 방지하였다. 샘플을 0.05℃/분의 속도로 25℃부터 80℃까지 가열하고, DLS 데이터를 실시 당 최대 15개 샘플에 대해 연속적으로 획득하였다.
DLS
당 응집 속도
DLS는 응집체가 강한 광 산란 신호를 발생시키기 때문에 용액 중의 거대분자의 응집체를 검출하는 민감한 방법이다. 따라서, DLS 데이터를 반복적으로 획득함으로써 분자가 응집하는 경향을 시간에 따라 추적할 수 있다. 잠재적인 응집을 실제 속도까지 가속화시키기 위해, 측정을 50℃에서 수행하였다.
샘플 제조를 전술된 바와 같이 수행하였다. DLS 데이터를 100시간 이하의 시간 동안 기록하였다. 응집 속도(nm/일)를 시간에 따른 평균 직경의 선형 피트(fit)의 기울기로서 계산하였다.
제제화 완충제 중에서의 안정성
응집/단편화에 대한 이중특이적 분자들의 안정성을 평가하기 위해, 샘플을 약 1 mg/㎖의 단백질 농도로 40℃에서 제제화 완충제(20 mM 시트레이트, 180 mM 수크로스, 20 mM 아르기닌, 0.02% 폴리소르베이트 20) 중에서 3주 동안 항온처리하였다. 대조 샘플을 -80℃에서 3주 동안 저장하였다.
응집체 및 저분자량(LMW) 종의 정량을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC로 수행하였다. 25 내지 100 ㎍의 양의 단백질을 울티메이트(Ultimate) 3000 HPLC 시스템(다이오넥스) 상에서 완충제(300 mM NaCl, 50 mM 인산칼륨, pH 7.5) 중에서 토소 TSK겔 G3000SWXL 컬럼에 인가하였다. 용출된 단백질을 280 nm에서 UV 흡광도로 정량하였다.
결과
실시예
3
이중특이적 항체 <VEGF-ANG-2>의 결합 성질
A) 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 특징규명된 결합 성질
비아코어 T100 장치(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스 아베, 스웨덴 업살라 소재)를 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)을 인가하여 두 항원의 동시적인 결합을 확인하였다. 표준 아민 커플링 화학적 기법을 이용하여 VEGF를 CM5 센서칩에 고정시켰다. 제1 단계에서, <VEGF-ANG-2> XMAb를 25℃에서 HBS 완충제(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20, pH 7.4) 중의 10 ㎍/㎖의 농도로 주입하였다. 항체가 고정된 VEGF에 결합한 후, hANG-2를 제2 단계에서 10 ㎍/㎖의 농도로 주입하였다(도 3).
추가 실험에서, <VEGF-ANG-2> XMAb의 친화성 및 결합 동역학을 측정하였다. 요약하건대, ANG-2 및 VEGF에 대한 이중특이적 항체의 제공을 위해 염소<hIgG-Fcγ> 다중클론 항체를 아민 커플링을 통해 CM4 칩 상에 고정시켰다. 결합을 25℃ 또는 37℃에서 HBS 완충제 중에서 측정하였다. 정제된 ANG-2-His(알 앤드 디 시스템스 또는 사내 정제됨) 또는 VEGF(알 앤드 디 시스템스 또는 사내 정제됨)를 용액 중의 0.37 nM 내지 30 nM 또는 3.7 nM 내지 200 nM의 다양한 농도로 첨가하였다. 3분의 주입으로 결합을 측정하고, HBS 완충제로 10분 동안 칩 표면을 세척하여 해리를 측정하고, 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하여 KD 값을 평가하였다. ANG-2 제제의 이종성으로 인해 1:1 결합이 전혀 관찰될 수 없었다. 따라서, KD 값은 겉보기 값이다. VEGF에 대한 <VEGF-ANG-2> XMab의 측정된 친화성은 매우 높았고, 계산된 해리 속도는 37℃에서조차도 비아코어 요건을 벗어났다. 표 1에는 두 항원에 대한 결합 상수가 요약되어 있다.
B) 결합 활성
이중특이적
<
ANG
-2/
VEGF
>
XMab1
의 정량 분석
SPR 분석과 더불어, 결합 활성 이중특이적 mAb<ANG-2/VEGF> 항체의 양을 정량하기 위해 ELISA를 확립하였다. 이 분석에서, hANG-2를 제1 단계에서 맥시소르프 마이크로타이터 플레이트(MTP)의 웰에 직접적으로 코팅하였다. 한편, 샘플/기준 표준물(mAb<ANG-2/VEGF>)을 또 다른 MTP의 웰 내에서 디곡시제닐화된 VEGF와 함께 예비항온처리하였다. 예비항온처리 및 코팅 후, ANG-2 코팅된 MTP를 세척하여 여분의 비결합된 ANG-2를 제거하였다. 그 다음, <ANG-2/VEGF>와 VEGF-Dig의 예비항온처리된 혼합물을 hANG-2 코팅된 MTP로 옮기고 항온처리하였다. 항온처리한 후, 세척한 다음, 호스-라디쉬 퍼록시다제로 표지된 항-디록시제닌 항체와 함께 항온처리하여 여분의 예비항온처리 용액을 제거하였다. 항체-효소 접합체는 ABTS(등록상표) 기질의 색 반응을 촉진한다. 신호를 405 nm 파장(기준 파장: 490 nm([405/490] nm))에서 ELISA 판독기로 측정하였다. 각각의 샘플의 흡광도 값을 중복하여 측정하였다. (이 시험 시스템을 예시하는 도식은 도 4에 제시되어 있고, 정량을 위한 ELISA의 보정 곡선은 도 5에 제시되어 있음).
실시예 4
Tie
-2 인산화
항-ANGPT2 관련 활성이 이중특이적 2가 <VEGF-ANGPT2> 항체 XMAb1에서 보유되어 있는지를 확인하기 위해, Tie-2 인산화 분석을 수행하였다. XMAb1의 효능을 전술된 바와 같은 ANGPT2 자극된 Tie-2 인산화 분석에서 측정하였다.
XMAb1이 전술된 바와 같은 ANGPT2 자극된 Tie-2 인산화 분석에서 ANGPT2 자극된 Tie-2 인산화를 방해한다는 것이 밝혀졌다. XMAb1에 대한 IC50은 7.4 nM +/- 2.3이었다.
실시예 5
huANG
-2와
Tie-2
의 결합의 억제(
ELISA
)
상호작용 ELISA를 실온에서 384 웰 마이크로타이터 플레이트(마이크로코트, 독일 소재, 카달로그 번호 464718) 상에서 수행하였다. 각각의 항온처리 단계 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. ELISA 플레이트를 5 ㎍/㎖의 Tie-2 단백질로 1시간 동안 코팅하였다. 그 후, 상기 웰을 0.2% 트윈-20 및 2% BSA(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재)로 보충된 PBS로 1시간 동안 차단하였다. PBS 중의 정제된 이중특이적 XMab 항체의 희석물을 실온에서 0.2 ㎍/㎖의 인간 안지오포이에틴-2(알 앤드 디 시스템스, 영국 소재, 카달로그 번호 623-AN)와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 0.5 ㎍/㎖의 바이오티닐화된 항-안지오포이에틴-2 클론 BAM0981(알 앤드 디 시스템스, 영국 소재)과 1:3000 희석된 스트렙타비딘 HRP(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 카달로그 번호 11089153001)의 혼합물을 1시간 동안 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 새로 제조된 ABTS 시약(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 완충제 #204 530 001, 정제 #11 112 422 001)으로 30분 동안 현상하였다. 405 nm에서 흡광도를 측정하고, IC50을 결정하였다. XMab1은 12 nM의 IC50으로 ANG-2와 Tie-2의 결합의 억제를 보였다.
실시예 6
hVEGF와 hVEGF 수용체의 결합의 억제(ELISA)
시험을 실온에서 384 웰 마이크로타이터 플레이트(마이크로코트, 독일 소재, 카달로그 번호 464718) 상에서 수행하였다. 각각의 항온처리 단계 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 시작 시점에서, 플레이트를 1 ㎍/㎖의 hVEGF-R 단백질(알 앤드 디 시스템스, 영국 소재, 카달로그 번호 321-FL)로 1시간 동안 코팅하였다. 그 후, 상기 웰을 0.2% 트윈-20 및 2% BSA(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재)로 보충된 PBS로 1시간 동안 차단하였다. PBS 중의 정제된 이중특이적 XMab 항체의 희석물을 실온에서 0.15 ㎍/㎖의 huVEGF121(알 앤드 디 시스템스, 영국 소재, 카달로그 번호 298-VS)과 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 0.5 ㎍/㎖의 항-VEGF 클론 Mab923(알 앤드 디 시스템스, 영국 소재)과 1:2000 호스-라디쉬 퍼록시다제(HRP)-접합된 F(ab')2 항-마우스 IgG(지이 헬쓰케어, 영국 소재, 카달로그 번호 NA9310V)의 혼합물을 1시간 동안 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 6회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 새로 제조된 ABTS 시약(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 완충제 #204 530 001, 정제 #11 112 422 001)으로 30분 동안 현상하였다. 405 nm에서 흡광도를 측정하고, IC50을 결정하였다. XMab1은 10 nM의 IC50으로 VEGF와 VEGF 수용체의 결합의 억제를 보였다.
실시예 7
HUVEC 증식
항-VEGF 관련 항체가 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMAb1에서 보유되어 있는지를 확인하기 위해, VEGF-유도된 HUVEC 증식 분석을 수행하였다. XMAb1이 전술된 바와 같은 VEGF-유도된 HUVEC 증식 분석에서 베바시주마브와 유사한 방식으로 VEGF-유도된 HUVEC 증식을 방해한다는 것이 밝혀졌다. XMAb1은 모 항체 베바시주마브(아바스틴)에 필적할만한 수준으로 농도 의존적 방식으로 VEGF-유도된 HUVEC 증식을 방해한다. 베바시주마브에 대한 IC50은 1.1 nM이었고 XMAb에 대한 IC50은 2.3 nM이었다.
실시예 8
마우스 각막 미세주머니 혈관신생 분석
8 내지 10주령의 암컷 Balb/c 마우스를 찰스 리버(독일 술츠펠트 소재)로부터 구입하였다. 문헌(Rogers, M.S., et al., Nat Protoc 2 (2007) 2545-2550)에 기재된 방법에 따라 프로토콜을 변형하였다. 요약하건대, 마취된 마우스에서 수술용 칼 및 날카로운 핀셋을 이용하여 현미경 하에 각막의 가장자리부터 상부까지 약 1 mm의 두께로 약 500 ㎛ 폭의 미세주머니를 준비하였다. 직경이 0.6 mm인 원반(나일라플로(Nylaflo)(등록상표), 팔 코포레이션(Pall Corporation), 미국 미시간주 소재)을 이식하고, 이식 대역의 표면을 매끄럽게 하였다. 원반을 상응하는 성장 인자 또는 비히클의 존재 하에 30분 이상 동안 항온처리하였다. 3일, 5일 및 7일 후(또는 대안적으로 단지 3일 후), 눈의 사진을 촬영하고, 혈관 반응을 측정하였다. 각막의 총 면적 당 새로운 혈관의 면적의 백분율을 계산함으로써 상기 분석을 정량하였다.
상기 원반에 300 ng의 VEGF를 적재하거나 대조군로서 PBS를 적재하고, 7일 동안 이식하였다. 가장자리부터 원반까지 혈관의 과성장을 3일, 5일 및 7일째 날 시간의 경과에 따라 모니터링하였다. 원반 이식 1일 전, 항체(<ANG-2/VEGF> XMAb1, <hVEGF> 아바스틴(베바시주마브))를 아바스틴 및 XMAb에 대해 10 mg/kg의 투여량으로 정맥내로 투여하였다. 대조군 동물들은 비히클을 제공받았다. 적용 부피는 10 ㎖/kg이었다.
생체내 VEGF-유도된 혈관신생에 대한 XMAb1의 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 마우스 각막 혈관신생 분석을 수행하였다. 이 분석에서, VEGF 함침된 나일라플로 원반을 가장자리 혈관까지 고정된 거리에서 무혈관 각막의 주머니 내로 이식하였다. 혈관은 발달하는 VEGF 구배를 향하여 각막 내로 즉시 성장하였다. 본 발명자들의 결과는 XMAb1(10 mg/kg)의 전신 투여가 연구 3일 내지 5일째 날부터 가장자리로부터 VEGF 구배를 향하는 혈관의 과성장을 거의 완전히 억제하였다는 것을 입증한다(도 6). 추가 실험에서, 직접적인 비교 연구를 수행하였다. 원반에 300 ng의 VEGF를 적재하거나 대조군으로서 PBS를 적재하고 3일 동안 이식하였다. 가장자리로부터 원반까지의 혈관의 과성장을 3일째 날 시간의 경과에 따라 모니터링하였다. 원반 이식 1일 전, 항체(이중특이적 <ANG-2/VEGF> 항체 XMAb1, 모 <VEGF> 항체 베바시주마브(아바스틴), 모 <ANG-2> 항체 ANG2i-LC06, 및 <VEGF> 항체 베바시주마브(아바스틴)와 <ANG-2> 항체 ANG2i-LC06의 조합물)를 베바시주마브(아바스틴)에 대해 10 mg/kg의 투여량, XMAb1에 대해 10 mg/kg의 투여량, 베바시주마브(아바스틴)에 대해 10 mg/kg의 투여량 및 ANG2i-LC06에 대해 10 mg/kg의 투여량으로 정맥내로 투여하였다. 베바시주마브(아바스틴)와 ANG2i-LC06의 조합물을 베바시주마브(아바스틴)에 대해 10 mg/kg의 투여량 및 ANG2i-LC06에 대해 10 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 대조군 동물들은 비히클을 제공받았다. 적용 부피는 10 mg/kg이었다.
본 발명자들의 결과(도 7 및 하기 표 참조)는 XMAb1(10 mg/kg)의 전신 투여가 베바시주마브와 ANG2i-LC06의 조합물에 필적할만한 수준으로 연구 3일째 날 가장자리로부터 VEGF 구배를 향하는 혈관의 과증식을 거의 완전히 억제하였다는 것을 입증한다. 대조적으로, 항-ANG-2 단일요법은 VEGF-유도된 혈관신생을 단지 약간 억제하였다(도 7). 최대 효과는 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 베바시주마브(아바스틴)의 조합물에 비해 더 낮은 농도인 10 mg/kg의 XMAb1에서 이미 달성될 수 있었다.
실시예
9
중증복합면역결핍(SCID) 베이지 마우스의 Colo205 이종이식편 모델에서 이중특이적 항체 <VEGF-ANG-2> 항체의 생체내 효능
세포주 및 배양 조건
Colo205 인간 대장암 세포(ATCC 번호 CCL-222). 5% CO2를 함유하는 수-포화된 대기 하에 37℃에서 10% 태아소 혈청(피에이에이 레이보레이토리스(PAA Laboratories), 오스트리아 소재) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지(피에이에이 레이보레이토리스, 오스트리아 소재) 중에서 종양 세포주를 상용적으로 배양하였다. 2 내지 5회 계대배양을 이식에 이용하였다.
동물
(찰스 리버(독일 소재)로부터 구입된) 도착 시점에서 4 내지 5주령의 암컷 SCID 베이지 마우스를, 수용된 지침(지브이-솔라스(GV-Solas); 펠라사(Felasa); 티에르슈게(TierschG))에 따라 매일 12시간(명)/12시간(암)의 명암 주기를 이용하여 특정 병원체 부재(SPF) 조건 하에 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후, 동물들을 동물 시설의 격리 부분에서 1주일 동안 유지시켜 새로운 환경에 적응하게 하고 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 정규식(프로비미 클리바(Provimi Kliba) 3337) 및 물(pH 2.5 내지 3으로 산성화됨)을 무제한적으로 제공하였다. 연구의 시작 시점에서 마우스의 연령은 약 10주이었다.
종양 세포 주입
주입 당일, 종양 세포를 배양물 플라스크(그레이너)로부터 수거하고(트립신-EDTA) 50 ㎖ 배양 배지 내로 옮기고, PBS로 1회 세척하고 재현탁시켰다. PBS를 사용하는 추가 세척 단계 및 여과(세포 여과기(strainer); 팔콘 Φ 100 ㎛) 후, 최종 세포 역가를 2.5 x 107/㎖로 조절하였다. 종양 세포 현탁액을 전달 피펫으로 조심스럽게 혼합하여 세포 응집을 방지하였다. 이를 수행한 후, 세포 현탁액을 넓은 바늘(1.10 x 40 mm)을 이용하여 1.0 ㎖ 튜버큘린 주사기(브라운 멜순겐(Braun Melsungen)) 내로 충전시키고, 주입을 위해 바늘 크기를 변경시키고(0.45 x 25 mm), 주입할 때마다 새로운 바늘을 이용하였다. 폐쇄된 순환 시스템 내에서 예비항온처리 챔버(플렉시글라스), 개개의 마우스 코-마스크(실리콘) 및 비가연성 또는 비폭발성 마취제 화합물 이소플루란(시피-파마(cp-pharma))과 함께 작은 동물용 스티븐스 흡입 유닛을 사용하여 마취를 수행하였다. 주입 2일 전, 동물의 털을 면도하고, 세포 주입을 위해 마취된 동물의 피부를 해부학적 겸자를 이용하여 조심스럽게 들어 올리고, 100 ㎕의 세포 현탁액(= 2.5 x 106개 세포)을 동물의 우측 측면에 피하 주입하였다.
동물의 치료
동물의 치료를 약 100 ㎣의 평균 종양 부피에서 무작위화 날에 시작하였다. 마우스를 하기 표에 기재된 상이한 화합물들로 주 당 1회씩 복강내로 치료하였다.
모니터링
동물들을 그들의 건강 상태에 대해 주 당 2회씩 조절하였다. 세포 주입 후 체중을 주 당 2회씩 기록하였다. 종양 치수를 실행 당일부터 시작하여 그 후 전체 치료 기간 동안 주 당 2회씩 칼리퍼(caliper)로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2(이때, "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임)). 종결 기준은 임계 종양 질량(1.7 g 이하 또는 Φ > 1.5 cm), 기준으로부터 20% 초과의 체중 손실, 종양 궤양형성 또는 동물의 좋지 않은 일반적인 상태이었다.
결과(도 8 참조)는 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMAb1이 SCID 베이지 마우스의 이종이식편 종양 모델 Colo205에서 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 더 높은 종양 성장 억제를 보였다는 것을 보여준다. ANG2i-LC06과 베바시주마브의 조합물의 효능은 XMAb1에 필적할만한 결과를 보였다. XMAb1의 최대 효능은 10 mg/kg에서 이미 달성되었다.
제2 실험에서, 보다 큰 종양에 대한 XMAb1의 효과를 분석하였다.
동물의 치료
동물의 치료를 각각 약 400 ㎣의 평균 종양 부피에서 무작위화 날에 시작하였다. 마우스를 하기 표에 기재된 상이한 화합물들로 주 당 1회씩 복강내로 치료하였다.
모니터링
동물들을 그들의 건강 상태에 대해 주 당 2회씩 조절하였다. 세포 주입 후 체중을 주 당 2회씩 기록하였다. 종양 치수를 실행 당일부터 시작하여 그 후 전체 치료 기간 동안 주 당 2회씩 칼리퍼로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2(이때, "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임)). 종결 기준은 임계 종양 질량(1.7 g 이하 또는 Φ > 1.5 cm), 기준으로부터 20% 초과의 체중 손실, 종양 궤양형성 또는 동물의 좋지 않은 일반적인 상태이었다.
결과(도 9 참조)는 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMAb1이 SCID 베이지 마우스의 이종이식편 종양 모델 Colo205에서 (큰 종양에서 대조군에 비해 효능을 보이지 않는) 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 더 높은 종양 성장 억제를 보였다는 것을 보여준다. ANG2i-LC06과 베바시주마브의 조합물의 효능은 XMAb1에 필적할만한 결과를 보였다. XMAb1의 최대 효능은 10 mg/kg에서 이미 달성되었다.
이와 더불어, 상기 결과는 XMAb1이 종양 크기와 무관하게 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 우수한 효능을 보인다는 것을 입증한다.
이들 모델에서 종양 정체는 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 아바스틴의 조합물에 비해 보다 낮은 농도인 10 mg/kg의 XMAb1에서 이미 달성될 수 있었다.
실시예 10
SCID
베이지 마우스의
정위
KPL
-4
이종이식편
모델에서
이중특이적
항체 <VEGF-ANG-2> 항체의
생체내
효능
종양 세포주
인간 유방암 세포주 KPL-4(문헌[Kurebayashi, J., et al., Br. J. Cancer 79 (1999) 707-17])는 염증성 피부 전이를 갖는 유방암 환자의 악성 흉막삼출액으로부터 확립되었다. 5% CO2를 함유하는 수-포화된 대기 하에 37℃에서 10% 태아소 혈청(판 바이오텍(PAN Biotech), 독일 소재) 및 2 mM L-글루타민(판 바이오텍, 독일 소재)으로 보충된 DMEM 배지(판 바이오텍, 독일 소재) 중에서 종양 세포를 상용적으로 배양하였다. 트립신/EDTA 1x(판)를 사용하여 주 당 3회씩 분할하면서 계대배양을 수행하였다.
마우스
도착 후, 암컷 SCID 베이지 마우스(10 내지 12주령; 체중 18 내지 20 g, 찰스 리버, 독일 술츠펠트 소재)를 AALAAC에 의해 승인된 동물 시설의 격리 부분에서 1주일 동안 유지시켜 새로운 환경에 적응하게 하고 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 수행하였다. 상기 마우스를, 국제 지침(지브이-솔라스; 펠라사; 티에르슈게)에 따라 매일 12시간(명)/12시간(암)의 명암 주기를 이용하여 SPF 조건 하에 유지하였다. 정규식(클리바 프로비미 3347) 및 물(여과됨)을 무제한적으로 제공하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(Regierung von Oberbayern; 등록 번호 211.2531.2-22/2003)에 의해 검토되고 승인되었다.
종양 세포 주입
주입 당일, 종양 세포를 배양물 플라스크(그레이너 트라이플라스크)로부터 수거하고(트립신-EDTA), 50 ㎖ 배양 배지 내로 옮기고, PBS로 1회 세척하고, 재현탁시켰다. PBS를 사용하는 추가 세척 단계 및 여과(세포 여과기; 팔콘 Φ 100 ㎛) 후, 최종 세포 역가를 1.5 x 108/㎖로 조절하였다. 종양 세포 현탁액을 전달 피펫으로 조심스럽게 혼합하여 세포 응집을 방지하였다. 폐쇄된 순환 시스템 내에서 예비항온처리 챔버(플렉시글라스), 각각의 마우스 코-마스크(실리콘) 및 비가연성 또는 비폭발성 마취제 화합물 이소플루란(파마샤-업존(Pharmacia-Upjohn), 독일 소재)과 함께 작은 동물용 스티븐스 흡입 유닛을 사용하여 마취를 수행하였다. 주입 2일 전, 동물의 털을 면도하였다. 서혜 유선 지방 패드 주입을 위해, 20 ㎕ 부피의 세포를 각각의 마취된 마우스의 우측 끝에서 두 번째의 서혜 유선 지방 패드 내로 정위 주입하였다. 정위 이식을 위해, 해밀톤 마이크로리터 주사기 및 30Gx1/2" 바늘을 이용하여 세포 현탁액을 유두 하의 피부를 통해 주입하였다.
동물의 치료
동물의 치료를 각각 약 80 ㎣의 평균 종양 부피에서 무작위화 날에 시작하였다. 마우스를 하기 표에 기재된 상이한 화합물들로 주 당 1회씩 복강내로 치료하였다.
종양 성장의
모니터링
동물들을 그들의 건강 상태에 대해 주 당 2회씩 조절하였다. 세포 주입 후 체중을 주 당 2회씩 기록하였다. 종양 치수를 치료 기간의 시작 시점인 실행 당일부터 주 당 2회씩 칼리퍼로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜(문헌[B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, Chapter 5, page 92])에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2(이때, "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임)).
종결 기준은 임계 종양 질량(1.7 g 이하 또는 Φ > 1.5 cm), 기준으로부터 20% 초과의 체중 손실, 종양 궤양형성 또는 동물의 좋지 않은 일반적인 상태이었다.
결과(도 10 참조)는 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMAb1이 SCID 베이지 마우스의 이종이식편 종양 모델 Colo205에서 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 더 높은 종양 성장 억제를 보였다는 것을 보여준다. ANG2i-LC06과 베바시주마브의 조합물의 효능은 XMAb1에 필적할만한 결과를 보였다. XMAb1의 최대 효능은 10 mg/kg에서 이미 달성되었다.
제2 실험에서 보다 큰 종양에 대한 XMAb1의 효능을 분석하였다.
동물의 치료
동물의 치료를 각각 약 160 ㎣의 평균 종양 부피에서 무작위화 날에 시작하였다. 마우스를 하기 표에 기재된 상이한 화합물들로 주 당 1회씩 복강내로 치료하였다.
모니터링
동물들을 그들의 건강 상태에 대해 주 당 2회씩 조절하였다. 세포 주입 후 체중을 주 당 2회씩 기록하였다. 종양 치수를 치료 기간의 시작 시점인 실행 당일부터 주 당 2회씩 칼리퍼로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜(문헌[B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, Chapter 5, page 92])에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2(이때, "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임)).
종결 기준은 임계 종양 질량(1.7 g 이하 또는 Φ > 1.5 cm), 기준으로부터 20% 초과의 체중 손실, 종양 궤양형성 또는 동물의 좋지 않은 일반적인 상태이었다.
결과(도 11 참조)는 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMAb1이 SCID 베이지 마우스의 이종이식편 종양 모델 Colo205에서 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 더 높은 종양 성장 억제를 보였다는 것을 보여준다. ANG2i-LC06과 베바시주마브의 조합물의 효능은 XMAb1에 필적할만한 결과를 보였다. XMAb1의 최대 효능은 10 mg/kg에서 이미 달성되었다.
이와 더불어, 상기 결과는 XMAb1이 종양 크기와 무관하게 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 우수한 효능을 보인다는 것을 입증한다.
이들 모델에서 종양 정체는 10 mg/kg의 ANG2i-LC06 + 10 mg/kg의 아바스틴의 조합물에 비해 보다 낮은 농도인 10 mg/kg의 XMAb1에서 이미 달성될 수 있었다.
실시예 11
피하
Colo205
이종이식편에서
미세혈관 밀도에 대한
XMAb1
를 사용하는 치료의 효과
종양 슬라이드의 모든 혈관을 카운팅하여 혈관 밀도를 평가하였다. 혈관을 파라핀-포매된 절편 상에서 형광 항-마우스 CD34 항체(클론 MEC14.7)로 표지하였다. 혈관을 정량하고, 미세혈관 밀도를 ㎟ 당 혈관으로서 계산하였다. 모든 결과를 평균 ± SEM으로 표현하였다. 실험군의 유의한 차이를 정의하기 위해, 던넷(Dunnetts)-방법을 이용하였다. p<0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. 결과는 총 종양내 MVD가 치료된 종양에서 감소하였다는 것을 보여준다. ANG2i-LC06을 사용하는 치료는 MVD를 29%까지 감소시켰고, 베바시주마브는 MVD를 </=0%까지 감소시켰고, 베바시주마브 + ANG2i-LC06은 MVD를 15%까지 감소시켰고, XMAb1은 MVD를 28%까지 감소시켰다.
실시예 12
SCID 베이지 마우스의 피하 N87 이종이식편 모델에서 이중특이적 항체 <VEGF-ANG-2> 항체의 생체내 효능
종양 세포주
인간 위암 세포주 N87 암세포(NCI-N87(ATCC 번호 CRL 5822)). 5% CO2를 함유하는 수-포화된 대기 하에 37℃에서 10% 태아소 혈청(판 바이오텍, 독일 소재) 및 2 mM L-글루타민(판 바이오텍, 독일 소재)으로 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 종양 세포주를 상용적으로 배양하였다. 트립신/EDTA 1x(판)를 사용하여 주 당 3회씩 분할하면서 계대배양을 수행하였다.
마우스
도착 후, 암컷 SCID 베이지 마우스(10 내지 12주령; 체중 18 내지 20 g, 찰스 리버, 독일 술츠펠트 소재)를 AALAAC에 의해 승인된 동물 시설의 격리 부분에서 1주일 동안 유지시켜 새로운 환경에 적응하게 하고 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 수행하였다. 상기 마우스를, 국제 지침(지브이-솔라스); 펠라사; 티에르슈게)에 따라 매일 12시간(명)/12시간(암)의 명암 주기를 이용하여 SPF 조건 하에 유지하였다. 정규식(클리바 프로비미 3347) 및 물(여과됨)을 무제한적으로 제공하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(Regierung von Oberbayern; 등록 번호 211.2531.2-22/2003)에 의해 검토되고 승인되었다.
종양 세포 주입
세포 주입 당일, 세포를 배양물 플라스크(그레이너 T75)로부터 수거하고 50 ㎖ 배양 배지 내로 옮기고, PBS로 1회 세척하고 재현탁시켰다. PBS를 사용하는 추가 세척 후, 세포 농도를 바이-셀(Vi-Cell)(상표)(세포 생존율 분석기, 벡크만 코울터(Beckman Coulter), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 측정하였다. (세포 응집을 감소시키기 위해) 종양 세포 현탁액(PBS)을 조심스럽게 혼합하고 얼음 상에서 보관하였다. 세포 현탁액을 1.0 ㎖ 주사기 내로 충전시켰다. 주입을 위해, 0.45 x 25 mm의 바늘 크기를 이용하였다. 일차 종양을 발생시키기 위해, 100 ㎕ 부피의 PBS 중의 5 x 106개의 N87 종양 세포를 각각의 마우스의 우측 측면 내로 피하 주입하였다.
동물의 치료
동물의 치료를 각각 약 130 ㎣의 평균 종양 부피에서 무작위화 날에 시작하였다. 마우스를 하기 표에 기재된 상이한 화합물들로 주 당 1회씩 복강내로 치료하였다.
종양 성장의
모니터링
동물들을 그들의 건강 상태에 대해 주 당 1회씩 조절하였다. 세포 주입 후 체중을 주 당 1회씩 기록하였다. 종양 치수를 치료 기간의 시작 시점인 실행 당일부터 주 당 1회씩 칼리퍼로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜(B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, Chapter 5, page 92)에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2(이때, "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임)).
종결 기준은 임계 종양 질량(1.7 g 이하 또는 Φ > 1.5 cm), 기준으로부터 20% 초과의 체중 손실, 종양 궤양형성 또는 동물의 좋지 않은 일반적인 상태이었다.
결과는 이중특이적 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 XMAb1이 SCID 베이지 마우스의 이종이식편 종양 모델 Colo205에서 단일특이적 항체를 사용하는 치료에 비해 더 높은 종양 성장 억제를 보였다는 것을 보여준다(도 12).
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Bispecific, bivalent anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
<130> 26642 WO
<140> PCT/EP2011/054504
<141> 2011-03-24
<150> EP10003269.7
<151> 2010-03-26
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> variable heavy chain domain VH of <VEGF> bevacizumab
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> variable light chain domain VL of <VEGF> bevacizumab
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> variable heavy chain domain VH of <ANG-2> E6Q
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> variable light chain domain VL of < ANG-2> E6Q
<400> 4
Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 5
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly
130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr
145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180 185 190
<210> 6
<211> 504
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Human angiopoietin-2 (ANG-2) with leader and His-tag
<400> 6
Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu
65 70 75 80
Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
100 105 110
Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu
145 150 155 160
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
165 170 175
Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210 215 220
Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
245 250 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
260 265 270
Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
275 280 285
Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290 295 300
Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln
325 330 335
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg
355 360 365
Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
370 375 380
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile
405 410 415
Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
420 425 430
Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln
450 455 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
Ser Gly His His His His His His
500
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> XMab1 -<VEGF> light chain
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> XMab1 -<ANG2> light chain
<400> 8
Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 9
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> XMab1 -<VEGF> heavy chain
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 48
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> OAscXFab3 -<VEGF> light chain
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (20)
- 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 인간 안지오포이에틴(ANG)-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 2를 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인(VH)으로서 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL)으로서 서열번호 4를 포함하는
이중특이적 2가 항체. - 제1항에 있어서,
a) VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및
b) ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄로서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되어 있는, 제2 전장 항체의 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄
를 포함하는 이중특이적 2가 항체. - 제2항에 있어서,
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 7, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 5를 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 8, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 6을 포함하는
이중특이적 2가 항체. - 제2항에 있어서,
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 11, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 9를 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 12, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 10을 포함하는
이중특이적 2가 항체. - 제2항에 있어서,
a) 제1 전장 항체의 중쇄로서 서열번호 15, 및 제1 전장 항체의 경쇄로서 서열번호 13을 포함하고;
b) 제2 전장 항체의 변형된 중쇄로서 서열번호 16, 및 제2 전장 항체의 변형된 경쇄로서 서열번호 14를 포함하는
이중특이적 2가 항체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 2가 항체를 포함하는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료를 위한 이중특이적 2가 항체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
암 치료용 약제의 제조를 위한 이중특이적 2가 항체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 2가 항체를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 암을 앓는 환자를 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
혈관 질환의 치료를 위한 이중특이적 2가 항체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
혈관 질환 치료용 약제의 제조를 위한 이중특이적 2가 항체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 2가 항체를 혈관 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써, 혈관 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 2가 항체를 코딩하는 핵산.
- 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제13항에 따른 핵산을 발현할 수 있는, 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터.
- 제14항에 따른 발현 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
- a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 2가 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
b) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) 상기 항체 분자를 상기 배양물로부터 회수하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 2가 항체의 제조 방법. - 제16항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 이중특이적 2가 항체.
- 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 2가 항체.
- 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열들을 포함하는 이중특이적 2가 항체.
- 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열들을 포함하는 이중특이적 2가 항체.
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