PT95809A - Processo para a preparacao de imunoglobulinas oligomericas, nomeadamente anticorpos monoclonais oligomericos - Google Patents

Description

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CAMPO DA INYEIIOÃO A presente invenção refere-se ao campo da imunodiagnóse e da imunoterapia e, mais particularmente, a novas formas oligoméri· cas de imunoglobulinas.

ESTADO ACTUAL DA TSCHICA A partir do advento da tecnologia dos anticorpos monoclonais, observou-se uma verdadeira explosão nas utilizações terapêuti-j cas e de diagnóstico dos anticorpos. O diagnóstico emprega agora técnicas sofisticadas, desde imunoensaios específicos e de elevada sensibilidade até imagens in vivo. Terapeuticamente, o3 anticorpos monoclonais têm sido formulados para o tratamento de uma vasta variedades de cancros e de doenças infecciosas, para regular a resposta imunitária de pacientes e para servirem mesmo como imunogénios, como com os anticorpos anti-idio-típicos. A medida que a tecnologia dos anticorpos e as maneiras de proceder de engenharia genética avançaram, os investigadores focaram a atenção sobre as maneiras para modificar a estrutura de anticorpos e, em alguns casos, a função dos anticorpos. Tor-nou-se agora possível, por exemplo, projeetar uma ligação de afinidade diferente para um anticorpo, para se obter uma classe de anticorpos, para alterar a espécie de um anticorpo ou para adicionar polipéptidos não-imimoglobulínicos heterólogos a uma cadeia de um anticorpo.

Estruturalmente, os anticorpos são compostos por uma ou mais unidades ou monómeros, apresentando oada um deles uma forma semelhante a Y. Um monómero contém quatro polipéptidos - duas cópias idênticas de um polipéptido formando uma cadeia designa-- ,7 l /y,3. & do cadeia pesada (H) e duas cópias idênticas de um polipépti-do formando a denominada cadeia leve (L). Os dois polipéptidos que formam a cadeia pesada têm um comprimento de aproximada-mente 440 aminoácidos e têm cerca de 55 000 daltons cada um.

As duas cadeias leves possuem aproximadamente um comprimento de 220 aminoácidos e cada uma delas cerca de 25 000 daltons. Uma cadeia leve associa-se com uma cadeia pesada e uma qualquer molécula de anticorpo apenas possui um tipo de cadeia leve e um tipo de cadeia pesada. A região variável amino-ter-minal de uma cadeia leve associa-se com a região variável ami-no-terminal de uma cadeia pesada para formar uma ligação de afinidade antigénica. As regiões carboxi-terminais das duas cadeias pesadas dobram-se conjuntamente para originarem um domínio E , As quatro cadeias polipeptídicas estão ligadas entre jsi por pontes de dissulfureto e ligações não covalentes.

Os anticorpos dividem-se em classes - IgG, IgM, IgA, IgE e IgDi com base nas cadeias polipetídicas do tipo pesado que eles com·· preendem > o^ © <f > respectivamente) . Existem apenas dois tipos de genes de cadeias leves, kapa (K) e lambda ()\). As classes variam também no número de monómeros que se ligam para formar um anticorpo completo. Por exemplo, os anticorpos IgM possuem cinco monómeros, cada um deles com dois sítios de liga·· ção de antigenes comportando 10 zonas de ligação de antigene idênticas por eada molécula. A IgM é assim referida como sendo deoavalente. As IgG-, IgE e IgD compreendem tipicamente uma única unidade monomérica e são pois bivalentes e a IgA pode consistir em um, dois ou três monómeros. A afinidade de anticorpos é uma medida da resistência da sua ligação a um epítopo. Em princípio, representa a ligação por uma região de ligação de antigene, isto é, metade das zonas de ligação total de um monómero. A avidez, por outro lado, é uma medida da estabilidade global do complexo entre anticorpo e

antigene. A avidez ê afectada pela afinidade intrínsica do anticorpo para o epítopo, pela valência do anticorpo e antigene e pelo arranjo geométrico dos componentes que interaetuam.

As interacções multivalentes podem permitir que anticorpos de baixa afinidade liguem fortemente antigenes e possam conferir uma maior estabilidade aos complexos imunes. Assim, os anticorpos de elevada avidez podem possuir uma maior valor diagnóstico ou terapêutico em comparação com anticorpos semelhantes de baixa afinidade e baixa avidez. Infelizmente, nem sempre é possível produzir anticorpos monoelonais com a avidez desejada. Por exemplo, apesar de ser possível produzir anticorpos para um epítopo específico, eles podem não ser IgM ou as IgM podem ser de baixa afinidade. Além disso, as IgM podem possuir peculiaridades que são indesejáveis para uma aplicação pretendida. Por exemplo, em comparação com as IgG, as IgM não atravessam a placenta e podem possuir uma menor estabilidade, um tempo de vida em armazém mais curto e um menor tempo de vida--média e podem também ser difícil de produzir em grandes quantidades.

Polloek et al., Proc. Hatil. Acad. Sei, USA 85;2298 (1988), descreveram anticorpos com uma capacidade de ligação aumentada de entre uma população de anticorpos com uma baixa capacidade de ligação. Os autores demonstraram que as alterações estruturais dos anticorpos responsáveis pela alteração de actividade correram na região constante da cadeia pesada e que a actividade de ligação aumentada não se devia à polimerização do anticorpo.

Por conseguinte, o que é necessário na técnica são anticorpos com elevada avidez e que, além disso, evitem muitas das dificuldades inerentes ao processamento das IgM. lais anticorpos originarão interaeções mais estáveis e de maior sucesso com o λ

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u /" ! i antigene alvo e consequentemente tornar-se-ão mais úteis no estabelecimento do diagnóstico ou da terapia. A presente invenção, notavelmente, preenche estas e outras necessidades relacionadas.

SUMARIO DA INVENgSO A presente invenção refere-se à descoberta de novos anticorpos monoclonais oligoméricos produzidos por uma célula e que compreendem dois ou mais monómeros imunoglobulinas. Num aspecto da invenção, os novos anticorpos possuem uma avidez aumentada para o antigene em comparação com a do anticorpo bivalen-te a partir do qual os novos anticorpos podem derivados. Num |outro aspecto, os anticorpos oligoméricos possuem uma cadeia pesada ^ e consequentemente são do isotipo IgG e podem compreender entre duas a cerca de seis unidades monoméricas. Em certas formas de realização de cadeias lives são kapa. As cadeis leves podem possuir uma inserção de sequêneias de amnoácidos, tal como uma duplicação de um domínio duma região variável ou constante no ou próximo do domínio da região constante e consequentemente podem possuir um peso molecular substancialmente mais elevado do que a molécula aparentada a partir da qual são obtidas. Assim, pelo menos um dos monómeros que são associados pela célula em multímeros pode possuir uma cadeia leve normal e uma aberrante ou daas cadeias lives aberrantes.

Numa forma de realização particular, a invenção compreende um anticorpo monoclonal oligomérico capaz de ligar antigene, sendo o anticorpo oligomérico produzido por uma célula e compreende dois ou mais monómeros de imunoglobulinas com a mesma especificidade de ligação do antigene e possuindo cada uma delas cadeias gama pesadas. Os multímeros são associados por liga-ções não covalentes e a cadeia pesada é de subclasse gama-1 e

A a cadeia leve ê da classe kapa. Os genes que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas são obtidas a partir de uma linha de células doadoras diferente da linha de células que serve como fonte de gene da região constante de cadeia pesada. Nesta forma de realização, as cadeias leves e pesadas primariamente humanas. A imunoglobulina oligomérica de uma forma de realização liga estreptococos do grupo B e é substancialmente mais protectora in vivo do que um anticorpo monomé-rico de IgG aparentado a partir do qual foi obtido.

Noutras formas de realização, a invenção refere-se ao processo para a produção de anticorpos monoclonais oligoméricos. Quando o multímero é de um isotipo de IgG, por exemplo, o processo compreende a transfectação para células hospedeiras imortalizadas dos genes ligados que codificam a cadeia leve, que pode ser ou kapa ou lambda. A célula hospedeira expressa também uma cadeia pesada, que pode ser endógena em relação à linha de célula ou a genes ligados que codificam a cadeia pesadas constante e regiões variáveis podem ser transfectadas para a célula, como para a cadeia leve. Os genes da região variável da cadeia pesada e leve são tipicamente derivadadas da mesma linh(a de células doadoras de forma a serem capazes de formar um anticorpo funcional para o antigene seleccionado. G gene que codifica a região constante da cadeia pesada, no entanto, pode ser obtido a partir da mesma linha de células doadorsa ou de uma outra linha diferente. As oélulas hospedeiras transfectadas são então cultivadas e os sobrenadantes das culturas são observados para pesquisar a presença, no caso de transfectan-tes de cadeias pesadas gama, de um anticorpo com uma avidez relativamente maior do que um anticorpo monomérico normal a partir do qual pode ser obtido e/ou com um peso molecular superior a 150 000 kd. 0 sobrenadante pode também ser inicialmente observado relativamente à presença de uma cadeia leve com um peso molecular aumentado, mas são também necessárias

observações subsequentes, por exemplo, de detecção de avidez aumentada. As cánlas transfeetadas que segregam o anticorpo oligomérico são identificadas e clonadas, se necessário, e o anticorpo é subsequentemente recuperado a partir dos sobrena-dantes da cultura.

Outra forma de realização da invenção compreende um processo para produzir anticorpos monoclonais oligoméricos que são par-ticularmente áteis no tratamento de doenças. Por exemplo, uma uma IgG oligomárica que liga o hidrato de carbono B dos estrep·· tococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) pode ser usada para prevenir ou tratar infecções originadas por este organismo. Numa aplicação, o anticorpo pode ser usado para prevenir infecções em fetos ou recém-nascidos, para o que a composição do anticorpo é administrado à mãe grávida antes ou durante o parto e o anticorpo oligomérico atravessa a placenta passando para dentro da corrente sanguínea do referido feto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Pig. la e lb mostram as estruturas de pNflA2.1 e pNkAl.l, respeetivamente. Ha Pig. la, a região constante jp. do gene é representada como uma inserção no sítio de BamH do pN.l, sendo a região variável do gene representada como uma inserção no sítio de Hind III da região constante do gene. As setas por cima dos genes das imuno-globulinas mostram o sentido da transcrição. Na Pig. lbr a imunoglobulina kapa do gene é representada como uma inserção do sítio de BamH do pN.l, em que a seta por cima da imunoglobulina dos genes mostra o sentido da transcrição. A Pig. 2A representa um cromatograma analítico do anticorpo ί (j

. Ί monoclonal 181 não fraccionado; as Pig. 2B e 2C são cro-matogramas de fracções de peso molecular elevado e baixo, respectivamente. A Fig. 3 representa uma análise do tipo PAGE não-SDS do tamanho dum anticorpo monoclonal 1B1 fraccionado em tampões que compreendem ureia; a pista 1 corresponde a um anticorpo monoclonal humano monomérico lgGl, a pista 2 é a de uma fracção de 1B1 de baixo peso molecular, a pista 3 é a de uma fracção de 1331 de elevado peso molecular, e a pista 4 refere-se a 1B1 não fraccionado, A Fig. 4A representa uma análise PAGE do anticorpo monoclonal 1B1 não fraccionado reduzido com /?-mercaptoetano 1, em que a pista 1 se refere a anticorpo 1B1, a pista 2 se refere a anticorpo monoclonal humano anti-GBS obtido a partir do transfeetoma de IgGl normal e a pista 3 refe-re-se a anticorpo monoclonal humano anti-GBS obtido a partir do transfeetoma IgG2 normal; a Pig. 4B representa uma análise PAGE das amostras das Pig. 4A, com a excep-ção de não se usar agente redutor: a Pig. 40 representa um gel bidimensional usando o anticorpo 1B1 não-reduzido na primeira dimensão e reduzido na segunda dimensão.

A Pig. 5 mostra o fraccionamento por tamanhos da proteína A do anticorpo moelonal 1B1 purificado sob condições redutoras, com fracções depois submetidas a electroforese em geles de SDS-poliacrilamidas e bandas de proteínas detectadas com uma mancha de prata. A Pig. 6 representa as sequências de ADN e de aminoácidos deduj-zidas das cadeias leves de 1B1, em que Lf,V(l) e L’V(2) se referem às primeira e segunda cópias das regiões LMT.

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A Fig. 7 representa a sequência obtida a partir do sequencia-mento do clone da região 4B9 V original. A Fig. 8 representa a sequência da cadeia pesada da região variável para o anticorpo monoclonal humano 4B9. A Fig. 9 representa os resultados das experiências de ligação usando IgG 1B1 monomérica e oligomériea e Igl (16/2B) com especificidade de ligação semelhante e usando como antigene estreptococos do grupo B.A ligação foi ensaiada com um anticorpo específico anti-humano de cadeia pesada.

As Fig. 10a e 10b mostram a ligação de um anticorpo anti-idio-típico para o anticorpo aparentado da IgM 4B9 (Fig. 10a) e para o multímero 1B1 comparativamente com o monómero 1B1 IgG (Fig. 10b). Na Fig. 10a, a curva assinalada com os quadrados abertos representa a curava de ligação de 4B9 suspenso em PBS/fween/soro humano diluído 1 : 40; a curva com losangos fechados representa 4B9 num diluente usado como espécimen (2,5 Í° p/v de leite magro seco, 0,01 fo de timerosal, 0,005 $ de agente anti-espuma A, em citrato de sódio 20 mM) e com soro diluído 1 : 40; a curva com círculos abertos representa 4B9 num diluente usado como espécimen; e a curva com quadrado fechados representa a IgM humana com uma especificidade de ligação diferente da do 4B9, diluída num dissolvente usado como espécimen, como um controlo para a especificidade do anticorpo anti-idiotípico. Na Figura 10b, a curva com quadrados abertos representa 1B1 oligomérico; a curva com losangos fechados representa 1B1 numa diluição de 1:100 em soro humano; a curva com quadrados fechados representa 1B1 oligomérico numa diluição de 1:500 em soro

humano; e a curva com losangos abertos representa a forma monomérica de 1B1.

A Pig. 11 representa uma análise funcional in vitro de IgG monomérica e oligomérica num ensaio opsonofagocítico, em que o anticorpo 1B1 monomérico é representado numa curva com círculos abertos, o anticorpo 1B1 oligo-mérico ê representado por uma curva com círculos fechados, e a curva com triângulos abertos refere-se a IgM t4B9.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS BE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS A capacidade de um anticorpo proteger contra o ataque dum agente patogénico depende frequentemente da capacidade um anti--corpo se ligar a antigene com uma avidez suficiente para que ele possa iniciar a cascata complementar. Um anticorpo da classe de IgG, por exemplo, devido às propriedades de ligação bi-valente das moléculas de IgG, pode não possuir a avidez suficiente para que um antigene supraprotector enquanto que uma IgM com a mesma especificidade antigénica, devido à natureza decavalente das moléculas de IgM, pode ser protectora, No entanto, o uso de certas classes de anticorpos para fins de diagnóstico ou de terapêutica podem ser limitados pelas propriedades intrínsecas destas classes de anticorpos. Por exemplo, os anticorpos de IgM normalmente não possuem a capacidade de atravessar a placenta, enquanto que os anticorpos de IgG podem atravessar a placenta e consequentemente conferir protecção ao feto. Esta característica é uma consideração especialmente importante para o desenvolvimento de produtos "baseados em anticorpos monoclonais para o tratamento de doenças, particularmente infecções, associadas com fetos e reeêm-naseidos. A pre-

sente invenção proporciona uma tentativa para a resolução destes problemas por formação de novas imunoglobulinas oligoméri-cas.

As imunoglobulinas oligoméricas podem possuir uma qualquer das classes pesadas e das suas subclasses associadas com a espécie do anticorpo que é utilizado, uma vez que as cadeias pesadas de uma qualquer molécula sejam da mesma classe. São particularmente preferidas as cadeias pesadas gama, a fim de formar moléculas de IgG oligoméricas, mas podem também ser usadas cadeias pesadas ou subclasses do tipo alfa, mu, épsilon ou delta ou subclasses conhecidas para cada espécie de animal. Por exemplo, as subclasses da IgG humana incluem os tipos 1, 2, 3 e 4, enquanto que as subclasses da IgG murina inclui os tipos |l, 2a, 2b e 3. Por oligomérico ou multimérico, entende-se um anticorpo que possui mais unidades monoméricas (isto é, H212) do que as conhecidas para o referido isotipo, unidades essas que são associadas covalente ou não covalentemente a fim de originarem sítios de ligação de antigenes funcionais. Tipicamente, as IgG, IgD e IgB são referidas como compreendendo mo-nómeros simples, enquanto que as Igl possuem cinco monómeros e as IgA possuem um mas podem possuir duas ou três unidades monoméricas associadas covalentemente por intermédio de cadeia; 3 J. As cadeias leves podem ser em kapa ou lambda. Numa forma de realização abaixo descrita, um multímero preferido possui cadeias pesadas da classe gama (humanas) e uma cadeia live kapa.

As imunoglobulinas oligoméricas podem ser de qualquer espécie ou de uma sua combinação a partir das quais os anticorpos podem ser preparados. Embora as imunoglobulinas humanas e murí-nicas são as mais geralmente usadas também podem ser utilizadas imunoglobulinas de outras espécies tais como do género Lagomorpha, bovina, ovina, equina, porcina, de aves ou semelhantes. Para administração terapêutica a seres humanos, as imunoglobulinas humanas são substancialmente preferidas para minimizar o seu reconhecimento como estranhas pelo sistema imunitário do paciente. Deve entender-se que as técnicas de anticorpos monoclonais e de engenharia genética tiveram um avanço suficiente de tal forma que as sequências de anticorpos de uma espécie podem ser permutadas com as de outras espécies. Assim, a expressão anticorpo "humano" tal como aqui é usada, por exemplo, refere-se a um anticorpo que primariamente é humano, soh o aspecto da origem, mas pode tamhém compreender sequências não humanas e/ou não imunoglobulinas. Similarmente, quando se refere a "imunoglobulinas” entender-se-à que podem estar presentes sequências não-imunoglobulinas na molécula, embora esta mantenha a capacidade de se ligar ao antigene.

As imunoglobulinas oligoméricas serão produzidas por biossín-tese, isto é, usando uma linha de células ou extracto celular, ao contrário da conjugação química de anticorpos usando técnicas de laboratório bem conhecidas, tais como usando reagentes de reticulação. Os multímeros podem ser convenientemente prepaf rados a partir de uma linha de células estabelecida que segrega anticorpos monoclonais que se ligam então a um antigene ou epitopo desejado. A linha de células paterna produtora de anticorpos pode ser isolada a partir das células B de várias espécies usando técnicas convencionais de fusão, de transformação virai ou outras técnicas de imortalização, bem conhecidas pelos peritos na técnioa. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados usando as técnicas de transformação por virus Epstein-Barr (EBY), técnicas de fusão de hi-bridomo, ou as suas combinaçães. Yer por exemplo, ICozbor et al Proc. ITatl, Acad. Sei. USA 79·6651 (1982), e as Patentes Americanas n^s. 4 464 465 e 4 624 921, que aqui são incorporadas como referência. 0 anticorpo monoclonal "antepassado” pode ser de qualquer das classes ou subclasses de imunoglobulinas. Por anticorpo monoclonal entende-se um anticorpo produzido por uma linha de células clonal contínuas, separadas de células que produzem anticorpos com uma especificidade de ligação ao anti-gene diferente. Assim, tais anticorpos monoclonais são produzidos e isolados a partir de outros anticorpos monoclonais e, por conseguinte, em formas substancialmente puras (relativamente a outros anticorpos) e a uma concentracção superior à que normalmente ocorre no soro das espécies de animais que ser vem como fonte de células B.

Os genes que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas podem ser clonados a partir de células "antepassadas” e transfectadas para uma células hospedeira capaz de expressar anticorpo. A célula hospedeira é uma célula eucarioti-ca, de preferência uma célula de um mamífero capaz de desenvolver modificações pós-translaccionais a proteínas de imuno-globulinas, incluindo a remoção de sequência líder, correção da cadeia dupla e de junção, glicolisação nos sítios correctos e secreção dum anticorpo funcional a partir da célula. As linhas de linfóçitos são as hospedeiras preferidas, especialmente aquelas da linhagem de células B. As células hospedeiras podem ser de uma linha de mieloma, tal como Ag8.653 como abaixo se descreve, A transfecção de células hospedeiras pode ser realizada median-t· te numerosos processos, tal como electroporação, coprecipita-ção de AM com fosfato de cálcio, precipitação por DEAE-dex-trano, fusão com protoplástos e microinjecção. Apés a transfecção as células são tipicamente incubadas durante um breve período de tempo num meio não selectivo e são depois transferidas para um meio selectivo e observadas quanto à proliferação. Apés um período de tempo suficiente para o crescimento celular, os sobrenadantes são pesquisados quanto às imunoglo-bulinas oligoméricas, como se descreve abaixo.

Para facilitar a identificação e seccção dos transfectantes que expressam os genes de imunoglobulinas transfeetadas, é geralmente introduzido um gene que confere um fenótipo seleccio-nável (um marcador seleccionável) dentro das células com o(s) gene(s) de imunoglobulinas de interesse. Os marcadores selec-cionáveis preferidos incluem genes que conferem resistência a fármacos tais como: neomicina, canamicina, metotrexato. 0 marcador seleccionável pode ser um marcador seleccionável de possível amplificação. Os marcadores seleccionáveis são apresentados por fhilly, Ivlammalian Gell Technology. Butterworth Pub., Stoneham, MA, e a escolha de tais marcadores êncontra-se tant-bém no âmbito dos peritos na técnica. Os marcadores seleccionáveis podem ser introduzidos na célula no mesmo plasmídeo que o gene ou genes de interesse ou num plasmídeo separado. Ver especificamente a patente americana n^. 4 634 665, aqui incorporada como referência. Se foi no mesmo plasmídeo, o marcador seleccionável e 0 gene de interesse podem estar sob controlo de diferentes promotrres ou de um mesmo promotor. 0 gene que codifica a região variável da cadeia live pode ser clonado com ou sem os genes que codificam 0 resto da cadeia leve, isto é, a região constante. Se apenas a região variável é clonada, esta é inserida dentro de uma "cassete” que compreende a região 0 da classe de cadeia live apropriada, de tal forma que os genes são operacionalmente ligados de forma a codificarem toda a cadeia leve quando esta é transfectada para dentro de uma célula hospedeira. 0 gene de região C pode ser obtido a partir da mesma linha de célula "antepassada” ou de diferentes linhas de células que 0 gene V. A "cassete” pode compreender elementos promotores de transcrição, promotores, etc., para induzir níveis de expressão superiores. A cassete pode também compreender um marcador seleccionável para conveniência de identificação e selecção bem sucedida dos transfectantes. IA estrutura dos genes de cadeia leve kapa humanos é descrita em Hieter et al., Cell 22:197-207 (1980), Hieter et al., J. Biol. Chem. 257:1516-1522 (1982), e em Klobeck et al*, Nucleic Acids Res. 12:6996-7006 (1984), aqui incorporadas como referência. Na configuração da linha gérmen existe uma ánica região constante kapa por genoma haploide. A mutante da região constante existe um grupo de 5 genes de região kapa J, e os genes da região variável localizam-se presumivelmente ainda mais a mutante. Para clonar um gene da região variável kapa rearranjada pode ser usada uma amostra que abrange a linha gérmen do gene kapa J. Gom certas enzimas de restrição que não possuem sequências de reconhedmento entre a região J e a região constante (por exemplo, BamH I), também pode ser usada uma amostra kapa C para detectar genes de região variável kapa rearranjada. A estrutura dos genes humanos de cadeia live lambda é descrita por Iiieter et al., fature 294:536-540 (1981), e por Udey e Blomberg, Immunogenet. 25:63-70 (1987), que aqui são incorporados como referência. Para clonação de genes lambda rearran-jados é usada uma amostra lambda-C para detectar os rearranjos que ocorrem em 5r no locus da lambda-J, tirando proveito da proximidade estreita entre os genes lambda-J e os genes lambda- C.

Nas células produtoras de cadeias kapa, um ou ambos os alelos kapa podem ser rearranjados, mas os locus lambda raramente ou nunca são rearranjados. Nas células produtoras de cadeia lambda, um dos alelos lambda ou ambos podem ser rearranjados e ambos os alelos kapa são normalmente rearranjados, apesar de estarem numa forma não produtiva de maneira que uma cadeia kapa completa não possa ser expressa. Gomo com as cadeias pesa-jdas, não se pode determinar ao nível do ADN (e não poderá ser capaz de determinar ao nível do ARN) qual das cadeias leves rearranjadas é expressa ao nível da proteína. Consequentemente tanto os genes kapa rearranjados como os genes lambda rearranjados dever ser olonados a partir de células produtoras de genes kapa ou lambda, respectivamente, sendo o gene funcional determinado por experiências de transfecção.

Para clonar um gene humano de cadeia leve, o AM genómico obtido a partir de células dadoras de interesse é restringido com uma endonuclease apropriada e os fragmentos de ADI do tamanho desejado (determinado por análises de transferência Southern usando uma amostra apropriada, tal como J-kapa, C-ka-pa, ou C-lambda) são enriquecidos pela centrifugação prepara-1tiva de gradiente de sacarose e usados para preparar uma biblioteca de bacteriófago. A biblioteca é então pesquizada com a amostra apropriada e as placas positivas são identificadas, purificadas e ampliadas. 0 ADI de bacteriófago é então isolado a partir das placas.

Se os genes da região variável e da região constante da cadeia leves são encontrados num pequeno fragmento da restrição suficientemente pequeno para ser clonado num único vector, eles podem ser clonados em..con junto e não necessitam de ser sub-clo-nados dentro de uma "cassete” de expressão antes de serem trans feridos para dentro das células hospedeiras. loutras circunstâncias, os genes das regiões constante e variável podem não ser adaptados a um vector e o gene da região variável requer subclonação dentro de uma cassete de expressão compreendida no gene de região constante. luma outra forma de realização, pode ser possível clonar os genes das regiões variável e constante num único vector, mas pode ser desejável transferir os genes para uma cassete que compreenda outros componentes que possam aumentar o nível de expressão.

Para facilitar o traçado do mapa de restrição e subclonação

# · / ί -

‘/V dentro de um vector ou cassete de expressão, os genes da região variável da cadeia leve rearranjada (elementos YJ) podem ser primeiramente subelonados. 0 AM de plasmídeo que compreende os genes rearranjados pode ser identificado por hibridi-zação com uma amostra apropriada da região C ou J. A inversão do gene da região variável é então transferida para o vector de expressão desejado pela restrição do vector e inserção com endonucleases que produzam extremidades compatíveis, e depois a ligação dos dois componentes. As bactérias podem ser transformadas com a mistura de ligação e os transformandos que comr· preendem os genes de cadeia leve completa (região variável e constante) numa orientação específica podem ser identificados usando digestão de restrição. Após os genes que codificam a cadeia leve terem sido ligados num vector de expressão (quer bacteriófago, quer plasmídio), o vector pode ser linearizado e transferido, quer simultânea quer sequencialmente, com genes que codificam as cadeias pesadas correspondentes, numa célula hospedeira eucariótica apropriada capaz de expressar os genes.

Deve entender-se que a cadeia leve resultante que está ligada nos monómeros de anticorpo pode ser anormal, pois pode compreender sequências de aminoáeidos adicionais que podem ser uma duplicação das sequências da cadeia live, particularmente as da região variável. Enquanto que o peso molecular da cadeia leve é normalmente de cerca de 25 000 daltons, uma cadeia leve anormal pode possuir um peso cerca de 50 fo superior ou mais, até cerca de 37 000 daltons. Tais moléculas anormais semelhantes à cadeia leve serão reconhecidas por reagentes típicos para cadeia leve, tal como imunoglobulinas anti-kapa. Uma ou duas de tais cadeias leves podem ser incorporadas em pelo menos um monómero que é usado pela célula (ou extrato) para formar mukímeros. Os multímeros podem compreender pelo menos um monómero que possui uma cadeia leve anormal.

0(s) mecanismo(s) pelo(s) qual(is) tanto a cadeia leve normal como a anormal aqui descritas podem ser sintetizadas pela mesma célula não são conhecidas. Uma hipótese oferecida como uma possível explicação e não como limitação, é agora descrita. As duas cadeias de polipejtídeos podem ser produzidas tanto a partir de cópias múltiplas do vector integrado no genoma da célula hospedeira, como em alternativa a partir da união de uma transcrição de ABI a partir de uma cópia única do vector. Se existirem cópias múltiplas do vector, uma ou mais destas cópias podem ter sido alteradas antes, durante ou depois do processo de integração. Estas alterações podem compreender, mas não se limitam, a duplicação do todo ou da parte de um ou ! de ambos os exões que codificam a cadeia leve, particularmente os das regiões variáveis. No caso de mecanismos de união alternativos, as sequências do vector podem ser integrados de tal forma que as zonas aceitadoras de união ocultas dentro do vector podem tornar-se activadas e serem ligadas às sequências dadoras de união tanto a partir do vector como a partir do genoma hospedeiro. Tanto podem ocorrer ligações normais como anormais na mesma célula, com eficiências diferentes. A região variável da cadeia pesada pode ser clonada e inserida numa cassete que compreende os genes da região constante, da mesma linha de células ou de uma linha diferente. A região constante pode ser mesmo isotipo ou subclasse ou de isotipo ou subclasse diferente que a região constante do anticorpo "antepassado”, e pode ser da mesma espécie ou de espécies diferentes. Os genes ligados manuseáveis podem então ser usados para transferir a linha de células hospedeiras que expressam a cadeia leve compatível. A estrutura geral dos genes da cadeia pesada é bem conhecida. Ter, por exemplo, lllison e Hood, Adv. Human, G-enet. 13:113--147 (1983), Joho et al., Curr. Topics Develop. Biol. 18:15-58 .4} /- (1983), e Calame, Am. Rev. Immunol. 3:159-195 (1985), que aqui são incorporadas como referência. Os genes que codificam uma cadeia pesada.funcional consistem num gene de régião variável rearranjado, separado por um intrão de um qualquer dos genes de região constante, gama, mu, alfa, epsilon, delta, ou as suas subclasses.

Pode ser desejável construir cassetes que compreendem genes de região constante da cadeia pesada em vectores de ABI tais que um gene de região variável possa ser inserida como 5' no gene de região constante para produzir um vector de expressão que compreende um gene de cadeia pesada, de possível expressão completa. Sal pode ser realizado introduzindo um gene de região constante de cadeia pesada num vector com uma curta poli-articulação ei 5' do gene de região constante. 0 gene de região variável pode então ser introduzido na região de poliar-ticulação. As poliartieulações que promovem sítios para endo-nucleases de restrição são bem conhecidas na técnica.

Um vector preferido para a construção de uma cassete de expres são, tal como é usado nos exemplos abaixo descritos, é o pSV2--neo, descrito por Southern e Berg em J, í.lol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982), aqui incorporado como referência. 0 sPV2-neo possui uma origem de replicação pBR322, um gene que codifica a beta-lactamase, uma origem de replicação SV40 para permitir a sua replicação nas câulas de mamíferos, e um gene de resistência a neomicina-Canamicina que proporciona um marcador se-leccionável em células bacterianas e em células de mamíferos. Outros vectores adequados para a transferência de forma estável de genes para uma diversidade de células são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, por Ooffin, RIA Tumor Viru-ses, volume 2, Weiss et al., Edições Cold Spring Harbor labo-ratory, New York (1985), páginas 36-63, e Kwok et al», Proo. Natl. Acad. Sei. USA 83:4552 (1986), que aqui são incorpora-

dos como referência.

Na construção de uma cassete para expressão dos genes de imu-noglobulina pode ser necessário modificar o vector de forma que este não compreende sítios de restrição que possam interferir com passos de clonação posteriores. Podem também ser previstas modificações para se obter níveis de expressão mais elevados do gene que codifica o marcador seleccionável, facilitando consequentemente a selecção de células que comportam o vector.

Em alguns casos, em função do vector no qual é introduzido o gene (CH) de região constante de cadeia peaada, pode ser conveniente realizar primeiro a subclonação do gene CH num vector transportador numa orientação de forma a que o extremo 5' fique adjacente a uma região de poliarticulação. 0 vector transportado pode então ser digerido com um enzima de restrição apropriado para libertar o gene CH com a poliarticulação no extremo 5’. 0 fragmento isolado pode então ser clonado num vector de expressão para formar uma cassete adequada para introduzir o gene da região Y desejado na região de poliarticulação .

Foram descritos clones dos genes CH de vários isotipos humanos. A clonação do gene gama-1 da linha gérmen humano é registada por Flanagan e Roberts, Natura 300:709-713 (1982), e El-lison et al., Nuol. Acids. Res. 10:4071-4079 (1982). 0 gene gama-2 é também descrito por Flanagan, id. e por lllison e Hood, Proc. lati. Acad. Sei. USA 79:1984-1989 (1982), e laka-hashi et al., Cell 29:671-679 (1982). Os genes gama-3 e gama-4 foram descritos por Flanagan, id., e o gene gama-4 é também descrito por EIJison et al., id., e Ellison et al., SNA 1:11-18 (1981). 0 gene mu é descrito por Ravetch et al., Cell 27:583--591 (1981), e os genes alfa-1, alfa-2 e epsilon são descritos anteriores é aqui in- por Flanagan, id, Cada um dos trabalhos ty- corporado como referência.

Um ou ambos os alelos da cadeia pesada podem submetera-se ao rearranjo VDJ, mas apenas uma das espécies de ARI (se ambas forem expressas como mARl) é transferida para um polipeptídeo de cadeia pesada completa (exclusão alélica). Assim, pode ser necessário elonar ambos os alelos rearranjados e depois determinar qual deles é expresso pela transfecção em células hospedeiras apropriadas. Para realizar esta operação, ο ADI genó-mico é restringido com uma endonuclease adequada, os fragmentos de ADI de tamanho desejado (determinado pela transferência Southern e hihridização com uma amostra da região JH) são enriquecidos por centrifugação preparativa de gradiente de sacarose e usados para preparar uma "biblioteca de hacteriófago, que é depois pesquizado com uma amostra da região JH e as placas positivas são identificadas, purificadas e amplificadas. Para facilitar a ohtenção de mapa de restrição e a subclona-ção numa cassete CH, os genes de região variável de cadeia pesada rearranjada (genes YDJ) podem ser subclonados. 0 ADI de plasmídeo que contém os genes da região V rearranjada é identificado pela Hind III-Bgl II hihridização com uma amostra JH de 0,8 kb como 3’ das regiães J. 0 gene da região V é então transferido para a cassete GH numa posição 5' do gene CH pela restrição de cada componente com endonucleases que produzem extremos compatíveis, e ligando então os dois componentes. As bactérias podem ser transformadas com a mistura de ligação e podem ser identificados os transformantes que compreendem o gene de cadeia pesada completa numa orientação própria, usando a digestão de restrição. Após ter sido ligado todo o gene de cadeia pesada, este pode ser linearizado e depois transfecta-do para um hospedeiro adequado, para coexpressão com um gane de cadeia leve.

Uma vasta variedade de técnicas de ADI recombinante estão dis· poníveis para os peritos na arte para isolar e transferir o

-/φ A

A

ADN que codifica os anticorpos oligomérieos ou suas regiões, incluindo regiões qae contribuem para a associação oligoméri-cas de monómeros, para vários hospedeiros para produção. As técnicas para produção de anticorpos quiméricos associados em classes ou humanizados (transferência de região hipervariável), hem como anticorpos com regiões constantes modificadas, em adição às técnicas aqui descritas, são descritas no Pedido de Patente copendente Horte Americano de I2. de Série 254 004, na Patente Americana 4 816 397 e nas Publicações EPO ΞΡ ...... 173 494 e ΞΡ 239 400 que aqui são incorporadas como referência. A detecção de multímeros de imunoglobulinas pode ser realizada por meio de variadas técnicas, incluindo cromatografia líquida, centrifugação em gradiente, e electroforese gel, entre outras, a actividade aumentada do multímero pode ser medida por ensaios quantitativos de ligação de antigene, experiências de competição de anticorpos e ensaios opsonofagocíticos. Estas técnicas são familiares aos peritos na técnica, e são descritas, por exemplo, por harlow e Lene em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1Ί.Υ., (1988), aqui incorporado como referência. 2al como acima se descreveu, a célula hospedeira pode segregar uma variedade de moléculas de imunoglobulinas. Se o hospedeiro é um mielona, este pode ou não produzir inerentemente um anticorpo de especificidade de ligação diferente da dos genes transfectados. As células podem segregar monómeros bivalentes em adição aos multímeros biva-lentes. Os multímeros podem possuir pelo menos um monómero em que pelo menos uma ou ambas as cadeias leves do monómero são anormais, tal como acima se descreveu. Logo, o anticorpo num sobrenadante da cultura pode compreender no mínimo 50 f ou mai do monómero normal, e no máximo 5 a 10 fo do multímero. Desejavelmente, o multímero perfaz pelo menos 10 % do anticorpo total, de preferência pelo menos 25 ¢, e preferencialmente pelo menos 50 $, recaindo a preferência sobre 90 $ ou mais do anti-

corpo total produzido pela cultura de células.

Os anticorpos de capacidade de ligação aumentada serão úteis no tratamento e diagnóstico de uma vasta variedade de condi-çães. Se um anticorpo oligomérico ê derisrado de uma linha de células "antepassadas" produtoras de anticorpos monoclonais, o multímero pode oferecer características de diagnóstico e terapêuticas melhoradas. Por exemplo, se o anticorpo original é uma célula de IgM e o multímero é composto por monómeros de IgG, o multímero pode possuir qualidades antifeociosas terapêuticas que são inerentes a certos anticorpos multivalente, tais como IgMs, e tamhém possuem qualidades inerentes aos monómeros IgG, tal como a sua capacidade única de atravessar a placenta e, por exemplo, proteger um feto de infecçães. Os multímeros de IgG podem tamhém possuir atributos tipicamente associados às IgGs, tais como fácil purificação, menor estabilidade, tempo de armazenazem e tempo de vida média in vivo aumentados.

Devido à avidez aumentada dos multímeros, é agora possível converter um anticorpo previamente não protector num anticorpo protector contra infecçães ou tumores, por exemplo, ou para aetuar com um imunomodulador potenciando ou regulando qualquer forma a resposta imunitária do hospedeiro a um antigene específico. Quando um anticorpo "antepassado" é uma IgG não pro-tectora, um multímero produzido usando para tal os métodos aqui descritos pode desenvolver avidez suficiente para conferir uma capacidade protectora significativa. É óbvio que se entende que a presente invenção não está limitada aos multímeros anticorpos que são protectores ou apresentam certos atributos funcionais in vivo, pois a maior avidez torna também praticável uma série de técnicas de diagnóstico que talvez não estejam de outra forma disponíveis para urna molécula anterior bivalen-te de baixa afinidade e/ou baixa avidez.

Kote-se também que a invenção não se limita à especificidade de ligação antigene dos multímeros específicos aqui exemplificados. 2em sido descrita uma vasta variedade de anticorpos monoclonais em literatura técnica e de patentes, muitas das quais estão publicadas e disponíveis pelos depositárbs de linhas de células. Os processos aqui descritos promovem a capacidade de produzir novas composições oligoméricas de genes de imunoglobulinas a partir de tais linhas de células. A capacidade dos anticorpos resultantes de inibirem um tumor, actuarem como imunomoduladores ou protegerem da agressão de um patogene, por exemplo, pode ser medida mediante uma vasta variedade de sistemas in vivo e in vitro, bem conhecidos pelos peritos na técnica. Um protocolo de exemplo para protecção contra streptococos do grupo B usando um anticorpo oligoméri-co que não era ou era fracamente protector, como uma IgG, quando administrado após o nascimento, aparece abaixo no Exemplo III.

Os novos anticorpos monoclonais oligoméricos e suas composições farmacêuticas são particularmente dteis para administração parentérica para tratamento profiláctico e/ou terapêutico. Preferivelmente, as composições farmacêuticas podem ser administradas por via parentérica, isto é, subcutânea, intramuscular, ou intravenosa. Assim, esta invenção revela composições para administração parentérica que compreendem uma solução do anticorpo monoclonal oligomlrico ou um "cocktail” de anticorpos oligoméricos e não oligoméricos dissolvidos numa substância veicular aceitável, de preferência numa substância veicular aquosa. Podem ser usadas várias substâncias veiculares, por exemplo, água, água tamponizada, solução de laCl a 0,4 f-, gli-cina 0,3 $ e semelhantes. Estas composições podem ser esterilizadas mediante técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem compreender substâncias auxi-

[liares farmaceuticamente aceitáveis, como é requerido, para jse assegurar as condições fisiológicas tais como; ajustamento de pH, agentes tampão, agentes de ajustamento da toxicidade e semelhantes, por exemplo acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, etc.. A concentração do anticorpo nestas formulações pode variar largamente, desde menos do que cerca de 0,5 ¢, normalmente pe-,1o menos a cerca de 1$, até 15 ou 20 % em peso, e será esco-jlhida primariamente por volume de fluído, viscosidade, etc., de acordo com o modo de administração específico escolhido. iAssim, uma composição farmacêutica típica para injecção intra-imuscular pode ser preparada de forma a compreender 1 ml de água esterilizada tamponizada, e 50 mg de anticorpo. Uma composição típica para infusão intravenosa pode ser preparada para compreender 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg do [anticorpo. Os processos reais para a preparação de compostos para administração parentérica são conhecidos pelos peritos na técnica e são descritos mais pormenorizadamente e, por exemplo, Reminaton*s Pharmaoeutioal Science. 16® Edição, Mack Puhlis-hing Company, Easton, PA (1982), que aqui é incorporada como referência.

As composições que compreendem os anticorpos poliméricos presentes, ou uma sua mistura, podem ser administradas para tratamentos terapêuticos e/ou profiláticos. Nas aplicações tera- ! pêuticas, as composições são administradas a uma paciente que já sofre de uma doença, numa quantidade suficiente para curar ou para pelo menos deter parcialmente a doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar tal função é definida como a Mdose efectiva terapeuticamente”. As quantidades efectivas para este uso dependerá da gravidade da infec-ção e do estado geral do sistema imunitário do próprio paciente, mas normalmente está compreendida no intervalo entre cerca

de 0,1 mg a cerea de 50 mg do anticorpo por kg de peso corporal por dose sendo as dosagens entre 5 mg e 25 mg do anticorpo por kg por paciente as mais commumente usadas. Deve ter-se em mente qae os materiais da presente invenção podem geralmente jser asados em estados graves de doenças, isto é, situações com perigo de vida ou potencialmente com perigo de vida. Em tais j! casos, com vista a minimizar as substâncias estranhas ou a baixar a probabilidade de rejeição de "substâncias estranhas" :que são alcançadas por anticorpos humanos oligoméricos proporcionadas por esta invenção, é possível e pode ser desejável ipelo médico, administrar excessos substanciais destes anticor-j pos ♦

Em aplicações profiláticas, as composições que compreendem os anticorpos presentes ou suas misturas são administradas a pacientes que ainda não se encontram em tadado de doença, no sentido de aumentar a resistência desses mesmos pacientes. Uma I tal quantidade é definida como sendo uma "dose profilaticamen-te efectival* Mesta aplicação, as quantidades precisas dependem também do estado de saáde do paciente e do nível geral de imunidade, mas normalmente está compreendida no intervalo entre C,1 mg a 25 mg por kg, especialmente entre 0,5 mg a 2,5 mg por quilograma. 0 uso profilático preferido é o do tratamento de fetos e recém-nascidos em risco de infecções através das suas mães. Quando o tratamento depende da passagem através da placenta a dosagem pode requerer ajustamento para reflectir a percentagem de anticorpo que é capaz de passar do sangue da |grávida para o sangue do feto. ;Podem realizar-se administrações únicas ou múltiplas das composições sendo seleccionados os padrões e níveis de dosagem pelo médico assistente. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem desenvolver uma quantidade de anticorpos oligoméricos desta invenção suficiente para tratar o paciente. ο A ·,filf !'// 28 ΑΛ .At jí ,·

VJ

Os anticorpos da presente invenção podem encontrar outros usos em ensaios de diagnóstico in vitro. Gomo exemplo, o anticorpo IgG oligomérico do Exemplo I abaixo pode ser usado para deteοι ar a presença de streptococos do grupo B, para a preparação de vacinas, ou semelhantes.

Para propósitos de diagnóstico, os anticorpos tanto podem ser imarcados como não marcados. Os anticorpos oligoméricos não mar-icados podem encontrar uso particular em ensaios de aglutina- i ição, ou podem ser usados em combinação com outros anticorpos marcados (anticorpos secundários) que reagem com o anticorpo oligomérico, tais como os anticorpos específicos para as re-igiões Fc. Como alternativa, o anticorpo pode ser marcado direc--'tamente. Pode ser usada uma vasta variedade de marcadores, tais como radionuclidos, partículas (por exemplo ouro, ferritina, partículas magnéticas, glóbulos vermelhos), flúores, enzimas, substratos de enzimas, cofactores enzimáticos, inibidores en-zimáticos, ligandos (particularmente haptenos), etc.. Estão disponíveis numerosos tipos de imuoensaios e são conhecidos pelos peritos nas técnicas, tais como ensaios competitivos e "compilados”, como descritos, por exemplo, na Patente Americana E2. 4 3γ5 no, aqui incorporada como referência, e Harlow e lane, supra.

Podem também ser fornecidos "kits" para uso com os anticorpos visados, na protecção contra, ou detecção da presença, de um antigene seleccionado. Assim, as composições dos anticorpos objecto da presente invenção podem ser proporcionadas, normal-,mente em formas liofilizadas num recipiente, tanto isoladas |como em associação com anticorpos adicionais. Os anticorpos, ique podem ser conjugados com um marcador ou toxina, ou não conjugados, estão incluídos nos "kits" com tampões, tais como 2ris, fosfatos, carbonatos, ect., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina de soro, ou semelhantes, e um manual de instruções para uso. ftTormalmente estes ma-

teriais estarão presentes numa parcentagem inferior a 5 1° em peso baseado na quantidade de anticorpo activo, e normalmente estão presentes numa quantidade total de pelo menos cerca de 0,0001 $ em peso, baseada na concentração do anticorpo. Frequentemente será desejável incluir um diluente ou excipiente inerte para diluir os ingredientes activos, podendo o excipiente estar presente no intervalo compreendido entre 1 /6 e 99$ da composição total. Quando é usado um segundo anticorpo capaz de se ligar ao anticorpo oligomérico num ensaio, este estará presente num recipiente separado. 0 segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um marcador e é formulado de forma análoga às formulações de anticorpos acima descritas.

Os exemplos seguintes são oferecidos como ilustração, não como limitação.

EXEMPLO I

Produção de um Anticorpo de Elevado Peso Molecular com avidez de Ligação Aumentada

Os anticorpos monoclonais específicos para o hidrato de carbo-!no do grupo B dos streptococos do grupo B (GBS) foram previa-mente isolados e caracterizados, como descrito no Pedido de Patente Morte Americano copendente n2. 189 359» aqui incorporado como referência. Estes anticorpos, originalmente do iso-;tipo IgM, foram convertidos em IgG usando técnicas de ADI re-1combinante, como é descrito no Pedido copendente USSM 254 004, aqui incorporado como referência.

Um anticprpo monoclonal, possuindo um peso molecular substancialmente superior ao de um anticorpo IgG típico, foi produzi-

! do usando genes de região V clonados a partir da linha de células linfoblastóides 3B9 (LC1) "antepassada" usando técnicas similares às usadas nas técnicas de mudança de classe acima referidas. Resumidamente, uma linha de células de mieloma de rato Ag8.653 foi primeiramente transfectada com um vector de plasmídeo que codifica a cadeia leve (kapa) do 4B9. Os clones que expressam a cadeia leve foram então transfectados com um vector que codifica a cadeia pesada. Os clones de transfectoma ique segregam imunoglobulinas de capacidade de ligação antigéni·-ca aumentada são os responsáveis pela produção de moléculas iIgG e cadeias lives de peso molecular aumentado. A. TEÓRICAS GERAIS 1. Preparação de AM ganémico 0 ADR total de peso molecular elevado foi purificado a partir de 1 - 2 x 10 célulos de 4B9 mediante um processo similar à técnica Perucho e al., 1981, Qell, 27:467-76. Resumidamente, as células foram lavadas por centrifugação em PBS (soro fisiológico tampamado com fosfato) ou IBS (soro fisiológico tampo-nado com Tris) e então lisadas num tampão de tris que compreende SDS, EDTA e proteinase IC. Após a digestão com proteinase, o ADR foi extraído com fenol e clorofórmio, foi precipitado com etanol e posto de novo em suspensão em TE. A amostra foi então digerida com AREase A, e novamente extraída com fenol e clorofórmio e posta de novo em suspensão com TE. A técnica é descrita mais abaixo em pormenor.

O São obtidas aproximadamente entre 1 a 2 x 10 células de 4B9 a partir das culturas e são centrifugadas a 1 000 g durante 10

jminutos. As células foram de novo postas em suspensão em 50 ml de TBS (8 g de NaCl, 0,38 g de HG1, 3,0 g de base Tris por litro, e HC1 IN até pH 7,4), ou PBS, eentrifugadas e de novo postas em suspensão e novamente eentrifugadas. Após a centrifugação final, as células foram postas em suspensão numa pequena quantidade de PBS ou TBS. Em alguns casos, são armazenadas a |j-20°C. Para cada 108 células, adicionaram-se 5 ml de tampão j;lise (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 50 ml, laCl 150 ml) compreenden-·; do 200 yUg/ml de Proteinase K (Boehringer Manheim). Este volume jé considerado como sendo um volume unidade. Foi adicionado |1/40 de volume de SDS a 20 #, o tubo de ensaio foi rapidamente !agitado e então incubado a 37°G. Um volume de 2 x tampão de :extraeção de fenol (Tris 10 mH, pH 8, EDTA 12 mM, NaCl 650 ml) foi então adicionado, seguido por dois volumes de fenol (equi-'librado com Tris até pH neutro) compreendendo 8-OH quinolina a 0,1 ¢. Os tubos foram cobertos, suavemente misturados duran-;te 5 a 10 minutos, e então centrifugados a 2500 rpm durante 20 minutos. A fase aquosa foi transferida para um tubo novo e foi repetida a extraeção de fenol 1 a 3 vezes até desaparecer a interface. A fase aquosa foi novamente transferida para um outro tubo novo e foram adicionados dois volumes de fenol: :clorofórmio:isoamil-álcool numa proporção de 25:24:1 (PCI). 0 tubo foi agitado, centrifugado, e a fase aquosa foi transferida para um outro tubo novo. A extraeção com PCI foi repeti- 1 da 1 a 3 vezes até desaparecer a interface. A fase aquosa foi novamente transferida para um outro tubo e extraída duas vezes com clorfórmio, álcool isoamílico (24:1). Pinalmente, a fase aquosa foi transferida para um outro tubo novo e suave-j mente abafado com quatro volumes de etaaol. 0 conteúdo do tubo ! foi suavemente misturado por inversão até o AM formar um. coágulo compacto. 0 AM foi removido com uma vareta de vidro e lavado sequencialmente com etanol a 70 % num tampão de diluição de etanol (Tris 10 mH, pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 150 mM), eta-nal a 85 56 e etanol a 100 ¢. 0 ADI foi seco por absorção do etanol numa toalha de papel e posto em suspensão em alguns mililitros de tampão ÍDE durante a noite, a 37°G. Este volume é considerado como sendo um volume.

Foi adicionado um volume do tampãp 2 x ARNse A (Tris 100 ml, pl-l 8, EDITA 20 nfflf, NaOl 20 m) seguido por ARNse A (Sigma, na. R-1525) até 100 yUg/ml (a ARNse A foi previamente fervida durante 30 minutos para remover os vestígios de actividade da jADNse). A mistura foi incubada durante 3 horas a 37°G. Foi adicionado um quinto do volume de acetato de sódio 3 Μ, o ADN foi extraído duas vezes com fenol/clorofórmio, precipitado com eta nol e posto em suspensão em ΪΕ tal como acima se descreveu. i ! : Foi preparado AM de elevado peso molecular a partir de células de placenta humana, como fonte de ADI de linha gérmen. Foram removidos tecidos con;jutivos a partir de cerca de 5 g do tecido da placenta; o tecido foi cortado em pequenos pedaços com um "bisturi e então lavado três vezes por centrifugação e posto em suspensão em TBS, de cada vez a 1000 X g a 4°C durante 10 minutos. 0 tecido (3,5 g) foi posto em suspensão em 20 ml de SBS, foi homogeneizado num homogeneizador de vidro-tef-lon accionado por motor, e foi novamente centrifugado durante 10 minutos a 1 000 x g e posto em suspensão em 3,5 ml de íPE, ohtendo-se assim uma suspensão muito compacta. Foi adicionado um tampão de lise (SD!EA 0,5 M, Sarkosil 0,5 ¢, e lOOyog de Proteinase K) e incubado a 50°C durante uma hora, posterior-mente durante a noite foi incubado a 37°0. As operaçães restantes foram as descritas por laniatis et alar, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, página 280, que aqui é incorpo-.rada como referência, excepto que a seguir à digestão por ARNse e antes da extracção com fenol, a amostra foi novamente digerida com Proteinase K (100 yUg/ml) durante a noite a 37°C. A concentração final do ADI da placenta foi de 0,15 mg/ml.

Preparação do Bacterófago λ 147.1

Nestas experiências, o bacteriófago /1147.1 foi usado como um vector. As raças de E. coli 1E 392 (ASCO na. 33572) e 803 supF (obtida através do Dr. N. Hozumi, It. Sinai Hospital, Toronto, iOntário) foram usadas como Hospedeiras para crescimento de

I jbacteriofagos 0 /)147.1 é descrito por Maniatis et al., Eolecu- llar Qloning. A Laboratory Manual, página 41 e por Loenen e I· j.Brammer, 1980, G-ene 10:249· Para usar 0 /1147.1 como um vector 0 fragmento "supérfluo” do meio foi removido, permitindo consequentemente a incorporação do AM estranho. Resumidamente, |tal foi realizado ligando os extremos coesos do vector, dige-|rindo 0 vector com uma endonuclease de restrição apropriada que removeu 0 fragmento supérfluo, e então separando os braços |do bacteriofago a partir da parte supérflua por centrifugação |através de gradientes de sacarose. A técnica experimental foi a que se segue. As extremidades coesas de 100 ul de AM do /)147.1 foram recozidas por incuba-bação num tampão que compreendia lgCl2 10 mM e Tris 150 mM, pH 8,0, durante 1 hora a 42°0. Os extremos recozidos foram então ligados e a ligase foi então inactivada pela acção de calor. Para a preparação de braços Hind III, 0 AM do vector foi en- tão digerido para completar quer com Hind III, quer com BamH I. :0 áltimo enzima serviu para digerir posteriormente a parte supérflua de forma qué as suas extremidades (BamH i) já não fos-isem compatíveis com as dos braços do vector (Hind III). 0 vec-! tor foi então tratado com fosfatase alcalina de bovino de fox-I ma que os braços do bacteriófago não se poderiam ligar um ao 1 : outro. 0 AM foi então extraído com fenol e clorofórmio, precipitado com etanol e posto em suspensão num tampão TE.

Foram então depositados 50 ug do AM de bacteriófago digerido em 40 ml de um gradiente linear de 10 a 40 $ de sacarose em ο

20 iiiM+Tris, ρΗ 8,0, NaGl Ι,ΟΜ, 2,5 mM BDTA. Os tubos foram centrifugados a 26 000 rpm durante 20 horas a 2020 num rotor S¥ 28 (Beckman). 0 gradiente foi removido a partir do fundo e as porções contendo os "braços do vector, mas não a parte supérflua, foram identificadas submetendo uma pequena amostra a electroforese através de um gel de agarose. 0 AM foi recuperado destas fracções por precipitação com etano1©suspensão de novo em tampão TE. Em alguns casos foi utilizada uma técnica de alternativa, mas menos eficiente. Resumidamente, os braços dos baeteriófagos foram preparados AM de 147.1 com Hind íIII9 recozendo os sítios, separando por centrifugação de gra-ίdiente de sacarose, e reunindo as fracções que compreendiam ibraços de fago mas não o fragmento supérfluo. Os braços do ! fago produzem um fungo forte, e assim o ADI! foi posteriormente digerido com BamH I para cortar qualquer fragmento supérfluo contaminante. Tal facto reduziu significativamente o fundo observado durante a ligação e armazenagem, sem a adição de qualquer AM introduzido. ca (formamida a 50 #, 5 x SSC, 5x solução de Denhardt, 50 jag/ /ml de ADM de esperma de salmão, Hepes 50 ml, pH 6,8, EDTA 5 mM, e 10 yUg/ml Poly(A)) suplementado eom glicina a 1 fe e SOS a 0,1 fo, durante pelo menos 2 horas em sacos de plástico fechados num "banho de água a 42°0. 0 tampão de hibridização variou de acordo com o tipo de hibridização; para transferências Southern genómicas, a mistura básica foi suplementada ,com sulfato de dextrano a 10 /, SDS a 0,2 f e 10^ cpm/ml de !amostra; para a transferência Southern de AM clonado, a mistura básica foi suplementada com SDS a 0,2 f e 10^ cpm/ml de amostra; para as primeiras pesquizas das bibliotecas do fago, a mistura básica foi suplementada com SDS a 0,2 % e 10^ cpm/ml de amostra, enquanto as pesquizas subsequentes tiveram fre-; quentemente menos quantidade de amostra. As hibridizações foram normalmente realizadas durante a noite a 422C. Após a hibridização, os filtros foram primeiro lavados em 2 x SSC, SDS ! a 10 ψ- à temperatura ambiente e depois em 0,1 x SSC, SDS a · 0,1 f a 65âC. Os filtros foram expostos a películas de raios X com filtros intensificadores a -702C durante intervalos de tempo variados. Quando o sinal se tornou obviamente muito forte foram omitidos os filtros intensificadores e a película foi exposta à temperatura ambiente. B. Construções do Gene de Oadeia leve

Dado que ambos os allelos da cadeia leve kapa da linha de células 4B9 poderiam ser expressos ao nível do A&N, ambos os ale-los da cadeia leve kapa rearranjados foram clonados e determinou-se então por transfecção qual deles foi transferido para uma proteína capaz de o combinar com a cadeia pesada apropriada para ligar o antigene. Boi usada a análise de transferência Southern com uma amostra de região J kapa (Jk) e uma amostra de região constante kaza (Ck) para determinar o tamanho

dos fragmentos BamH I do AM genómico a partir da linha de células 4B9 que poderia conter genes YJ da cadeia kapa rearran-jaso. Era importante determinar que os fragmentos BamH I possuíam o tamanho suficiente para conter o gene da região variável completo, bem como sequências a montante suficientes para promover níveis adequados de transcrição* 0 tamanho foi determinado mediante a medição da distância (em kb) a partir do sítio 3' do BamH I do Gk até ao extremo 5' do gene JK, e adicionando aproximadamente 2 kb para o gene L-Y e sequências promotoras. (Em vários genes Vk, existe uma zona BamH I dentro do complexo L-Yk; em tais casos, podem usar-se enzimas alterna-jtivos, tais como Hind III Ecor I.). Os genes Yk e Ok foram | encontrados nos mesmos fragmentos BamH I de menos de 19kb e ! poderiam consequentemente ser clonados dentro de um vector fago, (i 147.1. Os genes Yk e Gk foram portanto clonados em conjunto com um único fragmento de restrição.

Uma biblioteca bacteriófago foi produzida a partir de AM genómico digerida com BamH I e fraccionado por tamanhos a partir de 1C1 4B9. A biblioteca foi pesquizada com amostras Jk e Ck, o AM foi preparado a partir de placas positivas, e as digestões foram realizadas no ADN fago confirmar a identidade dos clones como genes kapa. 0 AM do fago foi então subclonado dentro de uma cassete de expressão. B. Clonação do Gene Kapa

Cento e vinte microgramas de AM da linha de células 4B9 e 10 μβ de AM da placenta humana foram digeridos com BamH I e então foram fraccionadas 7,5 yUg de cada por electroforese através de gel de agarose a 1,1 $ numa solução tampão TAE (Acetato de Tris 0,04 M, 1DTA 0,001 M). As transferências Southern foram realizadas no AM digerido com BamH I que foi então en- \ saiada com uma amostra de Jk que abrange a região Jk. A amostra Jk foi obtida a partir de um plasmídeo que compreende o fragmento Sac I de 1,8 kb do clone kapa de linha genen humano descrito por Hieter et al., 1980, Oell 22:197-207 e J. Biol. Qhem. 257:1516-1522 (1982). Esta amostra hibridiza a um fragmento de linha gérmen de llkb no AM da placenta e a um fragmento rearranjado de 16 kb do AM do 4B9. As experiências de transferências Southern usando a mesma amostra, mas com os digeridos tanto de EeoR I como de Hind III, revelaram que existiam dois genes kapa rearranjados em 4B9, sugerindo que a digestão com BamH I produziu dois fragmentos de peso molecular idêntico de tal forma que não eram distinguíveis um do outro. ;Cinquenta miorograms de ADR de 4B9 digerido por BamH I foram fraccionados num gradiente de sacarose entre 10 f.. a 40 $, e as fracções que compreendiam o AM de tamanho desejado (16 kb) foram pesquizadas por análise de transferência Southern com a amostra Jk. Foram usadas para a construção de bibliotacas as amostras que hibridizaram mais fortemente.

Foram ligados aproximadamente 5 $ do AM das fracções de pico com os braços do fago)\L47.1, (tendo sido digerido o .AM com BamH I) usando ligase T4 AM e um tampão de ligação (Tris 50 mM, pH 7,8, I:g012 10 mM, DII 1 mM, KOI 6 mM, ATP 1 mM, esper-midina- 1 mM) compreendendo PSG a 5 A reacção de ligação foi realizada in vitro, tal como se descreve abaixo para a clonação do gene de cadeia pesada. Foram determinados os títulos do bacteriófago usando para tal a raça 803 supF da 1.coli e estavam normalmente compreendidas no intervalo entre 0,5 a 1,5 x 10^ de unidades de formação de placa total (pfu) de cada reacção de ligação (correspondendo a 5 Í° de uma fracção de gra· diente de sacarose). Foram removidos aproximadamente 10 pfu. Foram removidos enxertos de duplicados de placas a partir de cada placa usando para tal papel de nitrocelulose (Schleicher

janà Schuell, BA85). Um conjunto de filtros foi hibridizado com a amostra Jk, e outro foi hibridizado com a amostra Ck (um fragmento Ecor I de 2.7 kb, obtido a partir da mesma linha gérmen do clone kapa humano previamente descrito). Apenas as placas hibridizadas com ambas as amostras foram removidas e posteriormente purificadas como é descrito para a clonação do gene de região variável de cadeia pesada.

Foram identificados dois clones kapa, designados Alk e A2k, possuindo ambos inserções de BamH I 16 kb. 0 AM de fago de ambos os clones foi cotransfectado com cassetes de cadeia pe-sada'V2 (compreendendo ambos regiões V da cadeia pesada) para j dentro de células Ag8.653. Foram ensaiadas os sobrenadantes da cultura para expressão de IgG-2. Apenas as células trans-fectadas com os alelos da cadeia peaada Alk e A2k segregaram IgG de especificidade correcta. Tal facto demonstrou que o alelo Alk é o que se encontra no anticorpo 4B9. 0 fragmento BamH I inteiro do AM de bacteriofago do Alk foi subclonado na região BamH I do vector pN, abaixo descrito, para formar pnkAl.l. A linha de mieloma Ag8.653 foi então transfectada com plkAl.l por electroporação, usando para tal 10yug de plkAl.l que tinha sido linearizado com Apa I e cerca de 2 x 10^/ml células de mieloma. As células foram incubadas num meio completo durante 48 horas e então transferidas para placas de microtítlo a uma concentração de 10^ células/plaea em RPMI compreendendo FCS a 20 Sb e 0,25 mg/ml de G418 (Gibco 860-1811IJ). As células foram alimentadas cada 4 a 5 dias. Buas ou três semanas depois, as células foram ensaiadas para a presença de cadeia kapa humana intracelular por manchamento por fluorescência. Três placas mestre apresentaram mancha positiva, sendo posteriormente clonadas em agarose suave. 0 clone 76-B4 em agarose

•Λ suave originou uma intensidade de fluorescência de 4+ e 100 $ das células eram positivas. As células foram colocadas em placas circulares de 24 cavidades e o anticorpo foi quantificado a 1,7 yUg/ml usando uma referência de anticorpo completo. 0 clone 7G-bx foi novamente clonado em agarose suave e o secundário 7G-B4-1 originou uma intensidade de fluorescência 4+. Esta linha foi designada por nB4-lM. B. Construção do Gíene de Região Constante de Cadeia Pesada

Foi construída uma cassete de cadeia pesada contendo um gene de região constante de cadeia pesada humano yi. Poi usado um clone de fago, Fago 3A (Bllison et al., 1982, Nucleic Acids Research, 10: 4071-4079) como fonte do gene da linha gérmen Cyi. Este clone tinha sido ohtido por pesquisa de uma biblio-ceta do AM genómico do fígado de feto humano com uma amostra de região constante ylcAM, como abaixo se descreve.

Resumidamente, a cassete γΐ, que compreende sequências não--codificantes, tanto em 3' como 5’ da região que codifica do gene de região constante yl, foi produzida primeiro a partir da subclonação das sequências apropriadas do gene C J 1 dentro da região de poliarticulação do vector pUG para produzir pyl.l A sequência 0 1 foi então removida do vector com as sequências de poliarticulação desejadas e inserida dentro do pH.l para produzir pN yi.l. As ténicas pormenorizadas usadas para a cons trução das cassetes são as que se seguem.

Bois microgramas do ATM 3A de fago foram digeridos até comple-tamento com BamH, extraídos com POI, precipitados com etanol e postos sm suspensão em 20 ^ul de tampão TE (Tris 10 mM, pH nj 7,8, ΕΒΊΑ 1 ml) (0,1 mg/ml). lO^ug àe pUCilS foram digeridos até completamento com BamH I, extraídos com PCI, precipitados com etanol e postos em suspensão em 44 ul de I^Q. 0 ADN foi então tratado com fosfatase alcalina intestinal de bovino (CIP); 28 unidades, da Boehringer-Mannheim), foi extraído com PCI, precipitado com etanol e posto em suspensão em ΪΕ até 50 ng/^ul. 200 ng de ADF de fago digerido por BamH I foi então „ligado a 200 ng do pUC18 digerido BamI e fosfatado, com 400 Sunidades de ligase T4 AON (New England Biolabs) durante 15 I· minutos à temperatura ambiente num tampão de ligação, num vo-lome final de 20 yul. A mistura reactiva foi então diluída até 80 yul com um tampão de ligação sem polietileno-glicol (PEG). 160 unidades de ligase 14 AM (New England Biolabs) foram adicionados e a mistura foi incubada durante a noite a 152C. 5 ^ul da mistura de ligação foram então usados para transformar 200 /ul de células JM83 competentes. As bactérias transformadas foram colocadas em placas num LB-agar que compreendia ampici-lina (100 ^ug/ml) e X-gal como indicador corado. Foram colhidas colónias brancas e cultivadas numa placa que compreende LB-agajr e ampicilina. Estas colónias desenvolveram-se e foram pesqui-zadas por hibridização de colónias, usando para tal uma amostra 3 transferida compacta, uma inserção Ecori I I-Hind III obtida a partir de p3.6RH4.2 descrito por Krawinkel, EMBO J. (1982) 1:403-407 e Flanagan e Rabbits, 1982, Fature, 300:709--713. 0 AM foi preparado a partir das colónias que hibridizarem com a amostra. 0 AM foi digerido com BamH I, submetido a electro-forese, fotografado e transferido para nitrocelulose e hibri-dizado com a mesma amostra 0 AM que compreendia a inserção de 10,5 kb foi detectado e o vector resultante foi designado p y1.1. 0 passo seguinte na construção da cassete de cadeia pesada

0 yl envolveu a remoção da sequência 0 yi do vector e intro-duzindo-o no vetor pl.l para formar a oassete de cadeia pesada pi Vl.l. 0 vector pl.l foi construído a partir do vector neo-pSV2, AICC Is 37149, descrito por Southern e Berg, J. Mol. Appl. Genet. (1982) 1:327-341. 0 vector neo-pSV2 foi modificado de forma a não compreender uma zona Hind III que interfiriria com os |últimos passos da clonação. Resumidamente, tal foi realizado pela digestão de neo-pSY2 com Hind III, toma.ndo as extremidades incoerentes terminadas com o fragmento de Elenovv de po-limerase ADI, ligando por ela própria o ABI e usando-o para í transformar a bactéria competente. 0 vector resultante foi de-.signado por pN.l.

Para introduzir a sequência 0 1 no vector pl.l, foram primeiramente digeridos 2,4^ug de pl.l com 99 unidades de BamH I, extraíui-se com fenol, precipitou-se com etanol, e pôs-se em suspensão em 50 jil de TB (originando 0,05 pg/jil). 0 p^L.l. foi também digerido com BamH I. Aproximadamente 1 jig do pfl.l digerido foi combinado com 100 ng do pl.l digerido na solução tampão de ligação, num volume de 98^ul, e aqueceu-se a 65°C durante 5 minutos. 2yul de ligase Q?4 ABI (lew England Biolabs) foram adicionados e a amostra foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguida por incubação uma noite a 14°C. 10 yUl a 50 yul da mistura reactiva de ligação foram usados para transformar 200 jâl de células BH5 competentes. As bactérias foram colocadas numa placa que compreendia IB-agar contendo

trans-

ampicilina ram pesquizados quanto à presença de ADI de plas-! rnídeo que compreendia a inserção de BamH I de 9 a 11 kb. Os transformandos que compreendiam uma inserção de 9,6 kb em pl.l foram seleeeionados. 0 ABI foi também digerido com Hind III e Bgl II para confirmar a presença da inserção )fl e para determinar a sua orientação. 0 Hind III linearizou o ADI. A digestão β

/ com Bgl II produziu fragmentos de 2,1 kb e aproximadamente 10 kb. Tal facto ê consistente com o facto de o gene yi estar na orientação oposta ao gene neo se existir uma eliminação que inclui a zona 5* do Bgl II da região que codifica γΐ. A digestão de Hind III mais Bgl II produziu bandas de 2,1 e um duple-to a cerca de 6kb. Tal facto é consistente com a orientação e a elimnação. 0 vector isolado a partir destes transformandos foi designado por pN 1.1. ! 1. Inserção do G-ene de Região Variável de Cadeia Pesada na ! Cassete de Região Constante da Gadeia Pesada ;Ambos alelos da cadeia pesada rearranjada da linha de células

I 4B9 foram clonados e inseridos numa cassete que compreendia a região constante da cassete pesada /2 na orientação adequada (ver pedido de Patente copendente USSM 254.004, aqui incorporado como referência). Determinou-se por transfecção que o alelo A2H foi traduzido numa cadeia polipeptídica que se combinou com a cadeia leve adequada para por fim se ligar ao anti·* gene. Cs pormenores são os seguintes.

Poram usadas análises de transferência Southern com uma amostra da região JVj- humano, pjg, para determinar o tamanho dos fragmentos Hind III do ADBT da linha de células 4B9 que compreendiam os genes VDJ de cadeia pesada rearranjada. Poi importante determinar que os fragmentos Hind III possuíam o tamanho .suficiente para compreender o gene de região variável comple- i to, bem como as sequências a montante suficientes para promo-iver níveis adequados de transcrição. Tal foi determinado mediante a medição da distância entre a zona Hind III no intrão Jbj-Cyu e o elemento Jg na extremidade de 5 ’, e adicionando apro·* ximadamente 2 kb para L-Y e sequência promotoras. ,ν ê

43

Foi preparada uma biblioteca de bacteriofago a partir de ADI jgenómico digerido com Hind III e fraccionado em tamanho a partir da linha de células 4B9. A biblioteca foi pesquisada com a amostra da região J, o ADI foi preparado a partir de placas positivas e o gene de região variável foi então sub-elonado em pUC18 para facilitar a localização das zonas de restrição e a identificação de clones duplicados. Os genes de região variável de 4B9 foram inseridas no pi ΥΊ.1 para formar um gene I ’ ide cadeia pesada de possível expressão.

I I2* Preparação da inserção de ADI Genómico da região variável I da Cadeia Pesada 4b9 ί

Foram digeridos separadamente com Hind II 120 ^ug de ADI do LGL 4b9, preparados como se descreveu acima, e 10 j&g de ADI da placenta humana, e foram fraccionados 7,5 yUg de cada por electro-forese através de gel de agarose a 1,1$ num tampão ΪΑΕ. 0 ADI foi transferido para papel de nitrocelulose usando técnicas convencionais, foi mantido durante a noite a 80°0 numa estufa não de vácuo e foi hibridizado com uma amostra da região J de cadeia pesada humana marcada com 32^ (inserção pjg). A inserção da amostra (em pBR322) extende-se desde um sítio artificial Ecor I perto do extremo 5' da região J, até ao sítio Hind III no intrão maior entre a região J e a região constante mu. A sequência ADI da região J e parte do intrão de um clone similar são descritos por Ravetch et al., 1981, Qell, 27:583-591 e por Rabbitts et al., 1983, lature, 306:806-809. Dado que os genes imunoglobulinas devem submeter-se a um rearranjo para |serem expressos, foram procurados os fragmentos ADI que estavam presentes no ADI do 4B9 e ausentes no ADI da linha gérmen (placenta). Esperava-se uma ou duas bandas rearranjadas, dependendo se um ou ambos os alelos se submeteram ao rearranjo, res-pectivamente. A amostra, pn^ hibridizou num fragmento da linha

gérmen de 9kb no AM da placenta, e nos fragmentos de 10,6 e 7,8 kb rearranjados do AM do 4B9.

Foram fraccionados 50 ug de AM do 4B9 digeridos por Hind III num gradiente de sacarose a 10 - 40 % como se descreveu acima para a preparação de braços de AM de vectores. As fracções que compreendiam o AM de tamanho desejado foram pesquizados por análises de transferência Southern com a amostra de inser- •30 ção pJjj marcada com J p. Dado que os fragmentos de 10,6 e 7,8 kb eram facilmente separáveis, essas fracções mais enriquecidas para cada banda foram usadas para a construção da biblioteca.

Aproximadamente 5 % a 10 fc do ADN das fracções do pico foram ligados com o braço do fago ^1/47.1, preparado como acima se descreveu, usando ligase Ϊ4 AM e o tampão de ligação. A mistura reactiva foi então colocada in vitro. Os extractos foram preparados de acordo com a técnica de Grosveld et al., 1981, Gene, 13:227-237, usando um lisado congelado-descongelado preparado a partir da raça de E. coli, BHB 2688 (ATCO ]P 35131) e um extracto de ultrassons preparado a partir da raça BHB 2690 (ΑΪΟΟ Ns 35132). Outras técnicas ou extractos embalados comercialmente podem ser usados. Os títulos dos bacteriofago foram determinados usando a raça supF da Ξ. coli e compreendiám nor-malmente entre 0,5 e 1,5 x 10 unidades de formaçao de placa total (pfu) de cada reacção de ligação (correspondendo a 5 a 10 ii de uma fracção de gradiente de sacarose).

Cada biblioteca correspondendo a uma banda específica observada na análise de transferência Southern compreendia pelo menos 105 placas (obtidas a partir de uma e 3 fracções de gradiente de sacarose). As bibliotecas foram pesquisadas usando a inser-ção pJH marcada com p. Removeram-se as placas positivas, di-luiram-se, colocaram-se em placas e foram pesquisadas com a mesma amostra. Este processo foi repetido (normalmente num to-

•tal de 3 a 5 vezes) até que todas as placas do contentor estarem positivas. 3· SubcLonação do gene de Região Variável de Cadeia Pesada na Cassete piyi !o gene de região variável da cadeia pesada de 4B9 foi inserido na cassete pN V1 acima descrita.

Especificamente, o vector pN^l.l foi digerido com Hind III e depois tratado com CIP. 0 fago A2H digerido por Hind III (como acima se descreve a) foi usado como fonte do gene de re-!gião variável de 4B9. 0 ADN do vector foi então misturado e ligado com o ADN do fago e a mistura de ligação foi usada para transformar células DIl5o( competentes. Os transformandos foram pesquizados quanto à presença do gene de região variável e a orientação do gene foi determinada por várias digestões com enzimas de restrição. Assim, uma construção compreendendo o gene de região variável 4B9 adjacente a um gene de região constante / 1 foi preparado e designado ρΝγΊΑ2.1. As técnicas para a produção da construção pN yiA2.1 são as seguintes.

Poram digeridos 7,5 ^ug de ADN do fago A2H com 80 unidades do Hind III, precipitou-se com etanol e põs-se em suspensão em 150 yul de TE. 50 yUg de pNJfl.l foram digeridos com 200 unidades de Hind III, foram tratados com CIP, precipitados com etanol e postos em suspensão em 100 yul de TE (0,5 yUg/^ul). Poram então ligados 500 ng de ADN de A2H com 25 ng de ADN de pN^l.l usando 1 unidade T4 ADN ligase (Boeirringer lanheim) num volume de reacção de 20 yul durante 30 minutos a 37°C. Poram diluídos 5 ^ul da mistura de ligação com 30 ^ul de TE e foram usados para transfornar 60 jolI de células DH5o( competentes. As células trans

I formadas foram colocadas em placas com LB-agar contendo ampi·

Foram colhidas doze colónias e o ADN foi preparado a partir destas. A digestão do ADI com Hind III revelou a presença de uma inserção de tamanho apropriado (cerca de 8,4 kh). A orientação foi então determinada pela digestão com BamH I e Bgl II. Gom base na ausência de sítio 5’ do Bgl II do gene y1, foram jseleccionados os transformandos que produziram bandas de 2,0; 3,7; 6,1; 4,8 e 7,8 kb. A construção resultante foi denominada pN/ 1A2.1. 4. gransfeoção com a Construção da Cadeia Pesada pi ^1A2.1 A construção da cadeia pesada foi então transfectada para as células B4-1 que expressaram a cadeia leve kapa. Dado que o vector da cadeia leve (ρΙ^ΙΑΙ. 1) compreendia um gene que conferiam resistência G-418 às células, foi necessário cotransfec-tar o vector de cadeia pesada com outro vector que contendo um marcador seleccionável diferente, o gene Eoogpt. 0 pG.3, um derivado de pSV2-gpt e descrito no nS de Série 254 004 foi usado para este propósito. Foram submetidas a electroforese aproximadamente 5 x 10 células de B4-1 em presença de 10 ^ug pN γΐΑ2.1 (restringida com BamH I) e 1yUg de pG.3. 48 h depois da eleótroporação, as células foram colocadas em placas de

pois, os sobrenadantes da cultura foram ensaiados quanto à produção de IgG, e as células de 10 das cavidades foram submetidas a clonação em agarose suave. A linha de células 1B1-D3--F3-D2-F3 foi submetida a duas fases de clonação por agarose suave. 0 clone resultante foi denominado nlBl". Antes de se

depositar este Pedido de Patente o transfectoma 1B1 foi depositado com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Pr., Rockvile, MD, 2085 e foi-lhe atribuído o ndmero de acesso ATCC CRI 10293. 0 transfectoma 1B1 produziu o anticorpo monoclonal IgGl que parece possuir avidez de ligação mais elevada (usando placas de microtítulo revestidas com GBS) do que outras linhas de células resultantes da mesma transfecção. As análises por HPLC do produto anticorpo demonstraram que a maioria do anticorpo monoclonal produzido possuía um peso molecular típico de 150 kd, enquanto 6 a 10 f do anticorpo produzido possuia um peso molecular de 300 a 450 kd. 0 transfectoma 1B1 produziu o anti-!corpo monoclonal IgGl em duas formas de peso molecular. 0 anticorpo monoclonal 1B1 purificado com proteína A foi usado para posteriores análises por cromatografia de filtração por gel. 0 sobrenadante esgotado em nutriente das células 1B1 foi passado por uma coluna de afinidade com proteína A (Langone, J. Immunol, Meth, 55:277 (1982)). 0 anticorpo foi eluído com um tampão de citrato 0,1 M, pH 3,5 (azida de sódio 0,02 f) e dealisado contra BBS, pH 7,2. A figura 2A é um cromatograma anilítico do anticorpo monoclonal 1B1 não fraccionado numa coluna de Superose'R' 6 PPIO (1 x 25 cm) ligada em série com uma coluna de Superose^ 12 (1 x 25 cm). 20^ug do anticorpo em 100yul foram carregados na coluna e passados a 0,30 ml/mi-nuto. A resolução do anticorpo monoclonal revelou dois picos: o material de baixo peso molecular foi eluído como esperado para IgG monomérico (160 a 180 kD), e as fracções de elevado peso molecular eluíram no intervalo esperado para multímero de IgG (> 300 kD). A resolução dos anticorpos monoclonas de IgG a partir de transfectomas não relacionados revelou picos mono-mérieos ánicos. 0 anticorpo purificado com proteína A adicional foi cromatogra·-

fado numa coluna preparativa de Sepharose ^ S-300 para aumentar a concentração do material de elevado peso molecular. Partindo de 146 mg do anticorpo monoclonal purificado com proteína A, foram removidas 5,2 mg de fracções de elevado peso molecular e 7Q mg de fracções de baixo peso molecular, foram ajustadas para A28q, e analisadas por FPLC como com a primeira amostra. As Piguras 2B e 20 são cromatogramas das fracções de elevado e baixo pesos moleculares, respectivamente. A fracção de elevado peso molecular compreendia cerca de 85 % de material de elevado peso molecular e 15 fo de material de baixo peso molecular, enquanto que a fracção de baixo peso molecular apresentou cerca de 99 $> de homogeneidade. Os anticorpos monoclonais das duas fracções foram ensaiados quanto à ligação de antigene e actividade biológica, tal como é discutido abaixo, e o material de elevado peso molecular revelou actividade grandemente aumentada.

EXEMPLO II

Análise Imunoquímica dos Anticorpos Monoclonais de Elevado Peso Molecular

Foram usados ensaios imunoquímicos para determinar a associação física das moléculas de IgG na fracção de elevado peso molecular. 0 anticorpo de cada colheita foi submetido a elec-troforese em geles de poliacrilamida sob condições standar de electroforese por gel de poliacrilamida (PAGE) não redutora, de Laemmli. Os anticorpos das colheitas não apresentaram resolução em bandas de pesos moleculares elevado e baixo, correspondendo a dados eromatográficos por exclusão de tamanhos.

Poi realizada a análise PAGE não-SDS usando ureia 0,5 M num sistema tampão descontínuo, de pH baixo, como se segue: tam-

pão de gel acamado (pH 6,8), 48 ml de KOH 1M e 2,9 ml de ácido acético glacial, e quanto baste de água para 100 ml; tampão de gel de resolução (pH 4,3), tal como acima mas visando 17,2 ml de ácido acético glacial; tampão de reserva (pH 4,5), 31,2 gm de/*-alanina e 8 ml de ácido acético glacial q.b. de H^O para 1 L (Hames et al., em Gel Electrophoresis of Proteins, Hames e Rickood, eds., IRI Press Ltd., Oxford, Engl. (1981), p. 1. 0 gel de resolução (2,7 a 5,0 % de gradiente linear com monómeros totais para uma taxa de reticulação de 19:1) e o gel acamado (2,5 f de acrilamida) foram vertidos num disposi-!tivo de preparação de gel que compreendia uma placa tratada

I J com papel-silano e em frente uma folha de película Gelbond Pag ;apoiada noutra placa de vidro. Nestas condições, tal como se mostra na Pigura 3, o anticorpo de elevado peso molecular re-I velou-se predominantemente como um dímero (duas vezes o peso molecular do monémero) e em menor quantidade revelou componentes monoméricos e trímeros, enquanto que a colheita de baixo peso molecular era toda ela essencialmente monomérica. Assim, conclui-se que os dímeros de IgG foram mantidos juntos por interacções não covalentes sensíveis à dissociação sob algumas condições desnaturantes (>2 % SDS) mas não todas (ureia 0,5 H). 0 anticorpo monoclonal 1B1 não fraccionado purificado foi analisado sob condições redutoras e não redutoras em geles de po-liacrilamida, na presença de SDS, e revelou duas configurações de bandas não usuais. Poi realizada a electroforese das amostras de anticorpo monoclonal purificado com proteína A, reduzidas com 1 % de p-mercaptoetanol, num gradiente linear de 5 a 15 f de SDS gel poliacrilamida, como descrito por Laemmli, seguido da detecção de proteínas usando para tal o manchamento com nitrato de prata (Bamerval et al., Slectisphoresis 8:158 (1987)). Com o agente redutor e SDS, os geles manchados com prata revelaram a presença de cadeias L e H típicas (bandas a »

25 e 50 kd, respectivamente) nos anticorpos monoclonais, quer de controlo, quer XB1. Io entanto, ο 1B1 continha uma banda adicional a 37 kD (Figura 4A). As imunomanchas revelaram que as bandas a 37 kD e 25 kD, reagiram com os reagentes específicos da cadeia 1 kapa, mas não com os reagentes específicos da cadeia Η. A banda a 37 kl) foi designada como sendo a cadeia L ‘'anormal", ou "L A linha de célula produzindo a cadeia original L (células B4-1) produziu ambas as cadeias 1, e outros transfectantes obtidos a partir desta linha de células continham também duas cadeias 1 e produziram quantidades variadas de dímeros.

Quando o anticorpo monoclonal 1B1 não fraccionado foi submetido a electroforese sem a acção do agente redutor (Figura 4B), foi resolvido em três bandas de espécies moleculares distintas. Ãs espécies inferiores correspondem a um peso molecular de 175 kD, e apresentaram praticamente a mesma mobilidade que a IgG-^ normal. As espécies intermédias corresponderam a um peso molecular de 190 IÍD. À espécie de peso molecular mais elevado correspondeu a uma imunoglobulina de peso molecular aproximadamente igual a 203 KD. Estes dados sugeriram que exi£ tem pelo menos três espécies de anticorpos monoméricos e oli-goméricos na população produzida pela linha de células 1B1, podendo todas as três possuir estequiometria IgG relativamente normal: duas cadeias pesadas normais associadas com as duas cadeias leves normais (¾¾¾^ Para a banda de 180 KD; duas cadeias pesadas normais associadas com uma cadeia leve normal e uma cadeia leve anormal grande para a banda de 190 KD; e duas cadeias pesadas normais associadas com duas cadeias leves anormais grandes (Hgl^Ijg) para a banda de 203 KD. 0 anticorpo em cada banda foi posteriormente submetido a elec-troferese através de um gel SDS de poliacrilamida bidimensio-nal, redutor, à primeira dimensão foi a amostra não reduzida

do anticorpo monoclonal 1B1, como acima se descreveu; após a electroferese a Banda da amostra foi raspada, fervida em β-mer-captoetanol a 1 f durante 10 minutos, e lavado duas vezes durante 5 minutos cada em tampão corrente. A faixa de gel foi colocada na área do gel acamado acima de um gel SDS-poliacri-lamida, de gradiente linear 5 a 15 % (1,5 mm), e foi mantido em posição por gel compacto não polimerizado. Após a polimeri-zação parcial o gel foi corrido e manchado com prata, como acima.

Os resultados da electroforese dos anticorpos de três pesos moleculares na PAG-E não redutora/redutora bidimensional são revelados na Fig. 40. iodas as três espécies demonstraram uma "banda de proteína similar correspondente ao peso molecular típico da cadeia pesada. Mo entanto, as três espécies compreendiam quantidades diferentes das duas bandas de cadeias leves uma de peso molecular normal (25 KD), e a outra de peso molecular mais elevada (37 KD). Ambas as danbas das cadeias leve e pesada foram verificadas como tal por reacção com anticorpos anti-cadeia e anti-cadeia pesada. C papel de 1 na formação de moléculas de anticorpos oligomé- d ricos foi posteriormente examinado. 0 anticorpo 1B1 purificado com a proteína A foi separado numa coluna de exclusão de tamanho PP1C, e as fracções que compreendiam proteínas, recolhidas entre os 29 e 40 minutos, foram analisados por PAGE redutora. Os geles manchados com prata revelaram que virtualmente todas as amostras possuíam três cadeias com pesos moleculares de 25, 37 e 50 KD (Figura 5). Mo entanto, o material de peso molecular elevado (fracções 29 e 34) possuía uma maior proporção de la (37KD) para a Ln (25 KD). Estes dados sugeriram que a La estava associada com a formação de oligoméros, apesar de todas as moléculas de imunoglobulinas que compreen-tem L& não formarem necessariamente oligómeros.

EXEMPLO III

Análises de Sequência da Cadeia Leve Aberrante

As sequências de aminoáeidos e de AM da cadeia leve aberrante foram determinadas, e foram construídas as linhas de células que expressam apenas La ou Ln.

As 1 e foram recuperadas a partir de SDS-PÁG-E por eleetro-a 11 ΦΓ' manchamento em ImmoMlon " (Millipore Oorpp. , Bedford, MA) usando Llini-transblot Electrophoretic Iransfer Cell (bío Rad Laboratories, Richmond, CA) como é descrito por Mattsudaira, J. Biol, Ghem. 261:10035-10038 (1987). A membrana foi manchada com Coomassie Brilliant Blue, bandas não manchadas e manchadas (pesos moleculares 37 KD e 25 KD) foram raspadas com uma lâmina da barba para a análise posterior da sequência amino terminal. A degradação Edman automática foi realizada num se-quenciador de protéína líquida por vibração (lodel 475A, Applied Biosystems, Inc. Póster City, CA). Poram analisados os derivados de feniltiohidantoina aminoáeidos por cromatografia líquida de elevada resolução de fase inversa, usando uma unidade de HPLC Modelo 120A em linha (Applied Biosystems, Inc.) com uma coluna ΡΪΗ C-18 (2,1 x 220 mm, ABI) e um gradiente de acetato de sódio/ tetrahidrofurano/acetonitrilo para eluição. Os resultados revelaram que os 25 aminoáeidos N-terminal de ambas as cadeias leves são idênticas:

Glu-1 le-V al-Le u- Thr-Gin-Ser-Pro-Ala- Ihr-Le u-Ser-Ie u-(Arg)-Pro-Gly-Glu-Arg-Ala-Ihr-le u A (Arg) na posição 14 teve baixo rendimento e também revelou alguma serina. A sequência de AM corresponde à serina.

Uma amostra da região 1, específica para o gene 4B9 foi então usada para pesquizar uma biblioteca de AM obtida a par-

L da linha de células 1B1. A amostra foi construída digerindo pUAlk (inserção Ecor I -Sac de 5 kb em pUC; ver Figura 1B) com Sac e Xba I, e a banda de 3kb foi purificada por gel sobre agarose de baixo ponto de fusão. 0 mARN foi purificado a rnuíj partir de células 1B1 usando o equipamento Fast Traek mARN Isolation Kit (Invitrogen Gorp., San Diego, GA). Foi preparada uma biblioteca de cADN no vector pCDK8 usando o primeiro oli-go (dt) e a Librarian ' I Kit (Invitrogen Corp.). A biblioteca foi pesquisada por hibridização de colónias usando a amostra da região 4B9 Y. Os clones positivos foram sequenciados pelo processo de terminação de cadeia dideoxi (Sanger). Algum de ADN foi sequenciado em apenas uma direcção porque os primeiros da região LfV recozeram em duas posições e consequente-i mente produziram uma cadeia dupla. A sequenciação revelou que o clone de cADN 4B9-Ykl5 compreendia uma repetição do exão da região L’V, resultando na estrutura ,,Líder-I,V-L,Y-C” em que L’Y representa o exão que codifica os dltimos três aminoácidos da sequência líder e o gene YJ rearranjado. 0 ADN e as sequências de aminoácidos deduzidas da cadeia leve são apresentados na Fig. 6. Note-se que 4B9--Vkl5 não é um clone de cADl complexo: começa com o G do ATG que codifica a metionina inieiadora. 0 L*Y(1) e o I’Y(2) refe-rem-se à primeira e à segunda cópias das regiões L’Y. A sequência corresponde à obtida a partir da sequenciação do clone de região Y origenal, como é apresentado na Figura 7.

Em experiências separadas foi determinada a região variável da cadeia pesada para o anticorpo monoclonal humano 4B9, como se mostra na Figura 8. 0 mARN desta sequência podia ser codificado pelo ADN genómieo contendo uma duplicação, quer do exão L'Y apenas quer dos doisi exões líder e I*Y No dltimo caso, a segundo cópia do exão líder não seria incluída no mARN porque lhe falta uma zona acei-

tadora. As manchas Southern genómicas de ADI da linha de células 1B1 foram realizadas e foram comparadas as intensidades de hibridização das amostras V, C e neo nas duas cópias. A amostra da região V hibridizou mais intensamente para uma das cópias, de acordo com a intrepertação que diz respeito à duplicação da região L’V.

EXEMPLO IY

Caracterização In Vitro da Avidez de Ligação Aumentada 0 anticorpo de maior peso molecular possuia afinidade ou avi-j dez de ligação mais elevada do que a forma com 150 kB, tal como se apresenta na Figura 9. lesta experiência, a raça de GBS 1334 foi ligada a placas de microtítulo uaando poli-L-li- sina. 0 anticorpo 1131 foi fraccionado por filtração por gel (v) numa coluna de Sephacryl ^ ’ S-300 para enriquecimento na forma de peso molecular mais elevado. As concentrações de proteínas equivalentes de um transfectoma obtido do anticorpo IgM com idêntica especificidade de ligação (t4B9), e as formas de peso molecular mais baixo e mais elevada do 1B1 reagiram com o GBS. A ligação foi testada com anticorpos específicos de cadeia gama e cadeia mu anti-humana, marcados com peroxidase de rábano silvestre. A propriedade multivalente do 1B1 foi determinada num ensaio de captura do anticorpo. Ias Figuras 10A e 10B as placas de microtítulo foram revestidas com um anticorpo anti-idiotípico que reagiu com IgM t4B9, com o monámero IgG e o múltimero IgG. Em testes paralelos, a IgM t4B9 (Figura 10A) e as fracções de baixo peso molecular versus fracções de elevado peso molecular de ΓΒ1 (Fig. 10B) reagiram a testes idênticos em placas. Após a lavagem, determinou-se a capacidade do anticorpo ligado para

posterior ligação ao mesmo anticorpo anti-idiotípico, marcado com iDiotina para fins de detecção. A fracção enriquecida no componente de peso molecular elevado possuía sítios de ligação adicionais disponíveis para posteriores ligações anti-idfo-tipo, similar à IgM, enquanto que a fracção de baixo peso molecular aparentemente não possía sítios adicionais disponíveis para ligação. Estes dados sugeriam posteriormente que o anticorpo IgG de elevado peso molecular existia como um olígomero.

Foram realizadas comparações funcionais posteriores in vitro da IgG monomérica e IgG oligomérica. Apesar da ligação ao an-j tigene ser normalmente obrigatória para os anticorpos media-j rem a actividade opsónica, a actividade de ligação isoladamen-i te não prediz quando é que um anticorpo aumentará eficazmente a fagocitose. Consequentemente, os anticorpos monoelonais foram comparados quanto às suas capacidades relativas para mediarem a opsonização e matarem um CBS de serotipo III clínico isolado. Os ensaios opsonofagocíticos foram realizados essencialmente como são descritos por Raff et al., supra, usando para tal a raça IIIR (Bohnsack et al., J. Immunol. 143:3338 (1989). Os estudos compararam a actividade do monómero 1B1 e do dímero 1B1, e a IgM t4B9. Os dados, apresentados na 3?ig. 11, são registados como: mortos = 100 x 1 -/CFU que restaram após incubação com neutrófilos, anticorpo complemento e de tes-te)/(CFU que restou após incubação com neutrófilos, anticorpo complemento e de controlo negativo7. Por quantificação de bactérias viáveis após cada anticorpo monoclonal ter sido incubado com neutrófilos humanos e soro humano (complemento), a fracção dímero revelou 100 vezes.mais actividade que 0 monómero. Quando 0 complemento foi omitido da mistura reactiva, não se observaram anticorpos monoelonais para demonstrar a actividade opsónica.

V

EXEMPLO

Preparação de Oligémeros IgG-2

Uma linha de células produtora de IgG-2 foi preparada por trans fecção de um vector)f2 com o mesmo gene de. região V da cadeia 3 (isto é 4B9) na linha de células B4-1 que expressou quer La quer In. A linha IgG-2 expressou um anticorpo monoclonal que compreendia 10 a 15 fo de dímero, similar à linha de células 1B1, confirmando que a La era necessária para a formação do olígomero de elevado peso molecular. A maior avidez dos olígo-meros IgG2 de peso molecular mais elevado, designados por 615, foi confirmada num ensaio de ligação de antigene. 0 ensaio foi realizado como é descrito genericamente ahaixo, excepto que o antigene GBS, em vez da Bactérias inteiras, foi adsorvido nas cavidades da placa de microtítulo.

EXEMPLO VI

Uso de IgG oligomérico no [Tratamento de Infecções Induzidas por Streptocooci do grupo B em Ratos Recém Nascidos

Ratos Sprague-Dawley recém nascidos com menos de 48 horas de idade (no ninho com as mães) foram infectados por via perito-neal com 80 a 500 streptococci (várias espécies), e 4 horas depois receberam 5 a 80 microgramas, quer do anticorpo 1B1 enriquecido com o polímero, de anticorpo 1B1 monòmérioo,. de anticorpo 4B9 IgM "antepassado”, quer de um anticorpo de controlo para flagelos de Pseudomonas aeruginosa. Em todas as experiências, as crias de rato foram examinadas duas vezes por dia quanto ao sintomas e foram registados em termos de sobrevivência. Os resultados das experiências, resumidos na Tabela I, demonstram que o anticorpo enriquecido no polímero protegei. â J**íi i' %<L· '«Λ· · i um nâmero significativo de animais da morte, tanto a baixas concentrações como a concentrações elevadas do anticorpo. Em contraste, o anticorpo IgG monomérieo desenvolveu protecção significativa contra uma raça e então apenas à concentração mais elevada do anticorpo. 5ABEL· X. Comparação das Formas Monoméricas e Poliméricas IgGl do anti-GBS Mb 4B9.

Pose Çug/rato)

Raça Anticorpo 80 40 20 5 1400 (lc) Polimérico 25/251° _c 12/161° 5/91° Monomérieo 19/49a - 1/8 IgM - - 24/2613 12/16^ Controlo Negativo 1/28 — — M94 Polimérico - 4/7a 1/7 Mondmero 1/6 - 0/7 IgM - - 7/8b 4/7a Controlo Negativo - 0/7 - a a p <*0,05 b = p< 0,01 c = Mo realizado

EXEMPLO VII

Atravessamento da Placenta por Anticorpos Oligoméricos para o Peto de Ratas grávidas A capacidade de anticorpos oligoméricos de elevado peso molecular atravessarem a placenta e passarem para o feto, e deste modo para as crias que irão nascer, foi comparada entre as formas de anticorpo monomérico e oligomérico. Poi usado um modelo de rato nascituro como um modelo animal. Modelos de ratos similares têm sido usados para predizer o atravessamento da placenta por parte de anticorpos e outras moléculas para fetos humanos. Brammbell, Prontlers Biol. 18í234276 (1970).

Hum conjunto de experiências, foram injectados por via intravenosa monómeros purificados, dímeros (85 $ oligómeros), e anticorpos monoclonais IgM em ratas grávidas Sprage -Dawley com tempo controlado, ao 182-192 dia de gestação. Ho dia do parto e todos 2 ou 3 dias durante 21 dias após o parto são feitas recolhas de sangue da mãe e cria. As mesmas fêmeas foram seguidas continuamente, enquanto que as crias apenas puderam ser submetidas à recolha de sangue uma vez antes de serem mortas. Consequentemente, os períodos de sémi-vida para as crias foi calculado usando diferentes coeficientes para cada tempo de amostragem. As concentrações do anticorpo monoclonal humano nos soros dos ratos foram quantificados usando um ensaio ELISA de imunoglobulina antihumana, como se descreveu acima no Exemplo V, excepto que a IgG anti-humana dos rosos polivalentes foi adsorvida para placas de microtítulo, e usou-se ELISA de antigene polissacarídeo anti- grupo B como descrito por Raff et al., supra. 0 ensaio anti-imunoglobulina detectou monómeros e oligómeros equivalentemente e não determinou se o oli-gdmero estava intacto, enquanto que o ensaio de ligação de antigene foi 100 vezes mais sensível para o oligómero do que pa-

ra o monómero. Comparando a relação das concentrações da imu-noglobulina entre os dois ensaios foi possível estabelecer que porção da imunoglobulina total era o oligómero. Os períodos de semi-vida do anticorpo foram calculados a partir dos dados do ensaio ELISA de ligação de antigene usando a análise por mínimos quadrados do log da concentração em relação ao tempo. Os resultados são apresentados na Tabela III. TABELA III. Períodos de semi-vida do anticorpo monoclonal oli- gomérico em fêmeas grávidas e que atravessaram a placenta para o feto

Ratos Anticorpo Semi-vida (dias) Pêmeas Monómero 3 Dímero 3 Igl 1 Crias Monómero 10 Dímero 7 Igl HD * * Hão detectável, 1,0 ng/ml

Nas fêmeas grávidas tanto os monómeros como os dímeros apresentaram uma semi-vida de 3 dias. Nos fetos as semi-vidas dos monómeros e dímeros extenderam-se a 10 e 7 dias, respectiva-mente, A semi-vida da IgM foi de 1,2 dias nas fêmeas e não atravessou a placenta para o feto (abaixo do limite inferior de detecção de ng/ml). As concentrações do dímero encontradas nas fêmeas grávidas e nas crias no dia do parto foi de 300 e 400 ng/ml de soro respectivamente.

Apesar da presente invenção ter sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e exemplo com o propósito de clarificar e compreender, tornar-se-à evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do espírito das reivindicações anexadas.

Claims (20)

1. ·- 61 <· f /}'' ,í

   REIVINDICAÇÕES: â 1 - Processo para a preparação de imunoglobulmas joligoméricas, nomeadamente anticorpos monoclonais contendo j IgG oligomérica, para um antigene escolhido, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em se transfectarem para células hospedeiras genes ligados que codificam as regiões constantes e variantes duma cadeia leve, em que a referida cadeialeve e uma cadeia pesada gama expressa pelas citadas células hospedeiras se reúnem formando multimeros que ligam o antigene seleccionado;se cultivarem as mencionadas células hospedeiras transfectadas;se seleccionar os sobrenadantes das culturas relativamente à presença dum anticorpo com uma afinidade de ligação do antigene aumentada quando'se compara com um monómero do referido anticorpo e com um peso molecular superior a cerca de 150 000 kD, e se identificar células transfectadas que segregam o referido anticorpo de IgG oligomérico; ese recuperar o citado anticorpo monoclonal de IgG oligomérico dum sobrenadante da cultura das células hospedeiras transfectadas que foi ' identificado e clonado. ci
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dé se transfectarem genes ligados que codificam a referida cadeia pesada gama para as citadas células hospedeiras. Q
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da citada cadeia pesada gama ser endógena para a linha de células hospedeiras. I â |4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do referido anticorpo monoclonal de IgG oligomérico ser um anticorpo humano. 3
4. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal oligomérico capaz de se ligar a antigene, sendo o referido anticorpo oligomérico produzido por uma'célula e compreendendo dois ou mais monómeros de imunoglobulina que têm a mesma especificidade de ligação do antigene e possuem cada um cadeias pesadas gama. 6a - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o citado anticorpo atravessar a placenta.
5. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal oligomérico |que contém dois monómeros de imunoglobulina.
6. 8 - Processo de acordo' com· a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal oligomérico que contém três monómeros de imunoglobulina.
7. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal oligomérico cujos monómeros estão associados duma maneira não covalente. ! 3
8. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado jpelo facto de a citada cadeia pesada pertencer à subclasse Igama 1.
9. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a mencionada cadeia leve dos referidos monómeros ser uma cadeia capa (K). i12 - Processo de acordo com a. reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal oligomérico cujos genes, codificam regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos citados monómeros, a partir duma linha de células doadoras, a qual é diferente da linha de células doadoras que serve como fonte do gene da região constante da cadeia pesada! Ia
10. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 13, 'caracterizado pelo facto de se obterem os referidos genes da !região variável dacadeia pesada e de cadeia leve a partir Iduma linha de células doadoras que expressam um anticorpo ;contendo IgM. 3
11. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se obterem os genes de cadeia leve a partir duma linha de células doadoras que expressa um anticorpo igM. a
12. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, i ! caracterizado pelo facto de o mencionado anticorpo de IgM ser ! humano. t I a
13. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, j caracterizado pelo facto das mencionadas regiões constantes i das cadeias leves e pesadas dos citados monómeros serem :humanas. a ! 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de as referidas regiões variáveis das cadeias leves e pesadas serem de seres humanos. a
14. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal ;oligomérico que se liga a estreptococos do grupo 19a - Processo de acordo com a reivindicação 18, I caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo que é um I agente de protecção in vivo contra as infecções provocadas pelos citados estreptococos. a j
15. 20 - Processo para a obtenção duma linha de células- de mamiferos que produz um anticorpo monoclonal oligomérico,

    caracterizado pelo facto de o referido anticorpo oligomérico compreender dois ou mais monómeros de imunoglobulina tendo a mesma especificidade de ligação de antigene e regiões constantes de cadeia pesada gama. cl
16. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, jcaracterizado pelo facto de a linha de células segregar ainda um anticorpo monomérico com a mesma especificidade de ligação ao antigene que o anticorpo oligomérico. ] Q
17. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o citado anticorpo monomérico constituir pelo menos cerca de 50% dos anticorpos produzidos pela citada linha de células. . i
18. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o mencionado anticorpo oligomérico compreender menos do que cerca de 10% dos anticorpos produzidos pela linha de células. i I I
19. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de os referidos anticorpos oligoméricos compreenderempelo menos um monómero que tem uma |cadeia leve normal e uma cadeia leve aberrante ou que possui !duas cadeias leves aberrantes.
20. 25 - Processo, caracterizado pelo facto de se obter a linha de células que tem o número de acesso da Colecção de Culturas *

    Tipicas Americanas ("Américan Type Culture Collection") ATCC CRL 10293 ou um seu subclone. 26a - Processo para a prepareção de um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de ser segregado pela linha de !células referidas na reivindicação 25. 27a - Processo para evitar doenças provocadas por estreptococos do grupo B num recém-nascido, caracterizado pelo facto de se administrar à mãe do referido recém-nascido, antes do seu nascimento, uma composição contendo anticorpos monoclonais delgG oligoméricos, que é capaz de atravessar a placenta e entrar na corrente sanguínea do feto, protegendo-o contra a mencionada infecção provocada pelos citados estreptococos, numa quantidad.ede preferência compreendida entre cerca de 5 e 25 mg de anticorpo por quilograma de peso corporal do paciente no caso do tratamentoterapeutico ou especialmente entre 0,5 e 2,5 mg por quilograma de peso corporal, no caso do tratamento profiláctico. Lisboa, 6 de Novembro de 1990 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

    feflCOMM Agente Oficial de Propriedade. industrial R.Gastiiho, 201-3. E.-1000 LISBOA Telefs. 65 13 39-654613