JPH06506120A

JPH06506120A - ヒト腫瘍壊死因子に特異的なモノクローナルなキメラ抗体

Info

Publication number: JPH06506120A
Application number: JP4509686A
Authority: JP
Inventors: リー，ユンミン; ヴィルチェック，ヤン; ダッドーナ，ピーター・イー．; グレイエッブ，ジョン; ナイト，デイビット・エム．; シーゲル，スコット・エイ．
Original assignee: ニューヨーク・ユニバーシティ; セントコア，インク
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1992-03-18
Publication date: 1994-07-14
Also published as: EP1097945B1; EP1097945A3; DE07006112T1; DE06001779T1; EP0610201B1; DE69231828D1; ES2156859T5; DE69233701D1; ATE366316T1; GR3036375T3; JP2004180686A; CA2736076A1; ES2289997T3; LU90854I2; DK0610201T3; EP1097945A2; DK1097945T3; EP0610201A4; JP2008156371A; EP1681305A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腫瘍壊死因子的なモノクローナルなキメラ抗体発明の背景本願は１９９１年３月１８日に出願された米国特許出願０７／６７０．８２７号の継続出願であり、同出願の内容は参照によってすべて本願に取り込まれている。

兄男府分野免疫学と医学の分野に属する本発明はヒトの腫瘍壊死因子−アルファ（ｈ　ＴＮＦα）；そのフラグメント、領域部分（原文：ｒｅｇｉｏｎｓ）および誘導体；その薬用組成物および計重用組成物、ならびにその産生、それによる診断および治療法に関する６本発明は、またそのような抗体、フラグメント、領域部分をコードするヌクレオチド配列、ならびにそのような配列を含むベクターおよび宿主と、さらにその製法とに関する。

茸量技衝の記載腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα；カケクチンとも称せられる）として知られるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）は、主として単球およびマクロファージによって内毒素ないし他の刺激に反応して分泌される、１７ｋＤの蛋白質サブユニットの可溶性ホモトリマーとしての、蛋白質である（Ｓｍｉｔｈ、Ｒ，Ａ、旦ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：６９５１−６９５４　（１９８７））、ＴＮＦ由来の、膜に結合した２６ｋＤの前駆体形もまた、記載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｅｌ　１　５３４５−５３　（１９８８））、ＴＮＦについての総説は、Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５８４　（１９８６）：０１ｄ、Ｌ、Ｊ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：６３０　（１９８６）：およびＬｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ、５６：２３３４　（１９８７）を参照されたい、ＴＮＦは、もともと細菌ワクチン（ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、ＢＣＧ）または内毒素（Ｃａｒｉｗｅｌ　ｌ、Ｅ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ　ヱ２　：３６６６　（１９７５））の連続注射を受けた動物の血清中に見出された。

ＴＮＦαをコードする遺伝子の発現は、単球／マクロファージ族の細胞に限定されるものではない、数種のヒトの非単球腫瘍細胞系列がＴＮＦαを産生ずることが、Ｉ％！告されている（Ｒｕｂｂｉｎ、Ｂ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、　ｄユＪ］ｕと二Ｙｅｄ、１６４：１３５０　（１９８６）；Ｓｐｒｉｇｇｓ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４　：　６５６３　（１９８７））、ＴＮＦはまた、ＣＤ４’およびＣＤ８”末梢血管血液Ｔリンパ球、または種々の培養されたＴおよびＢ細胞系列によって産生される（Ｃｕｔｕｒｉ、Ｍ、Ｃ。

ｅし　ａｌ、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、上旦旦：　１５８１　（１９８７）；Ｓｕｎｇ。

Ｓ、−Ｓ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１旦旦：１５３９　（１９８８））　。

蓄積されつつある証拠は、ＴＮＦが多面発現性生物学的活性を有する調節サイトカインであることを示す、これらの活性は、リボ蛋白質リパーゼ合成の阻害（カケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）活性）（Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ。

、Ｎａｔｕｒｅ　３１６：５５２　（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ、Ｓ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：４２２０　（１９８６）；Ｐｅｒｕｓｓｉａ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８ニア６５　（１９８７））、細胞成育の阻害もしくは刺激（Ｖｉｌｃｅｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、旦ｘ　、Ｍｅｄ、１６３：６３２　（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ、Ｂ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：９４３　（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ、Ｌ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１旦旦：２９１３　（１９８７））、ある種の形質転換細胞タイプに対する細胞毒活性（Ｌａｃｈｍａｎ、Ｌ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、上掲文献；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ、Ｚ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｅ、Ｒｅｓ、４４：８３　（１９８４））、抗ウィルス活性（Ｋｏｈａｓｅ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　旦：６５９　（１９８、Ｎａｔｕｒｅ　３１９：５１６　（１９８６）；５ａｋｌａｔｏｖａｌａ、Ｊ。

、Ｎａｔｕｒｅ　旦２２　：　５４７　（１９８６））、コラゲナーゼとプロスタグランジＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ、Ｊ、−ＩＶｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、立入旦工琶旦亘、土旦２：２１６３　（１９８５））；そしてＴ細胞の活性化を含む免疫調節作用（Ｙｏｋｏｔａ、　ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０＝５３１　（１９８Ｂ））、Ｂａ１ｌの活性化（Ｋｅｈｒｌ、Ｊ、Ｈ，ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、ＥｘＰユＭ旦す、上旦旦ニア８６　（１９８７））、単球の活性化（Ｐｈｉ　ｌ　ｉｐ、　Ｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２旦：８６　（１９８６））、胸腺リンパ球の活性化（Ｒａｎｇｅｓ、Ｇ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１旦ヱ：１４７２　（１９８ｇ））、主要組織適合性遺伝子複合体（Ｍｌ−ＩＣ）クラスＩおよびＩＩの細胞表面への出現の刺激（Ｃｏｌ　１　ｉｎｓ、Ｔ、ｅｔ　Ｅｌｆ、、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦３：４６６　（１９８６）ｉＰｕｊｏｆ−Ｂｏｒｒｅｌｌ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２旦＝３０４（１９８７））も報告されている。

ＴＮＦは、脈管内皮細胞に対する凝集誘導作用のような組織破壊に到る炎症支援作用（Ｐｏｂｅｒ、Ｊ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３旦＝１６８０　（１９８６））、好中球およびリンパ球付着増進作用（Ｐｏｂｅｒ、Ｊ。

Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８：３３１９　（１９８７）　）、マクロファージ、好中球および脈管内皮細胞から血小板活性化因子を解放する刺激（Ｃａｍｍｕｓｓｉ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６６：１３９０　（１９８７））によっても知られている。

最近の証拠によると、ＴＮＦが、多くの感染において（Ｃｅｒａｎｉ、Ａ、旦ｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏｌ、工ｍ　旦：２８　（１９８８））　、免疫不全、悪性形質変換性疾患、例えばある種の悪性腫瘍に伴う悪液質において（Ｏｌｉｆｆ、Ａ−ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ　ｌ　旦０：５５５　（１９８７））、自己免疫性疾患および移植片体宿主疾患（原文：ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）において（Ｐｉｇｕｅｔ、Ｐ、−Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、立入２工Ｍ旦亘、１旦旦：１２８０　（１９８７））、発病図に関係するようである、ＴＮＦと癌および感染疾患の病理の関連性は、しばしば宿主の異化作用（物質分解代謝）に関係がある。癌患者における主要問題は１通常食欲不振に由来する体重減少である。全体的消耗が、通常［悪液質」として知られる結果を惹起する（Ｋｅｒｎ、Ｋ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｐａｒｅｎｔ　Ｅｎｔｅｒ、Ｎｕｔ二、上ス：　２８６−２９８　（１９８８））、悪液質は、進行性体重減少１、食欲不振、ｌ１１ｒｓの成長に伴う執ような身体のびらんを含む、基本的な生理上の障害は。

エネルギー消費に対する食物摂取の減退である。悪液質状態はかくして重要な疾病状態に関係し、癌死亡率の重要な要因である。多数の研究が、ＴＮＦが癌と感染性疾患の病理と他の異化作用による悪液質の仲介者となっていることを、示唆する。

ＴＮＦはグラム陰性閑による敗血症と内毒素シフツクとの病理生理学的帰趨において中心的役割を演すると考えられており（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｈ，Ｒ，ｅｔ　ａ土、、Ｂｒ、Ｊ、Ｓｕｒ　、７６：６７０−６７１　（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ、Ｊ、Ｍ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、５ｅｃｏｎｄ　ＶｉｅｎｎａＣｈｏｃｋ　Ｆｏｒｕｎ、ｐ、４６３−４６６　（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｓ、Ｑ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｒｉ　ｔ、Ｃａｒｅ　Ｃ１ｉｎ、５：２７−４７　（１９８９））、その範囲は発熱、倦怠感、食欲不振、悪液質を含む。内毒素は、ＴＮＦとその他のサイトカインの産生と分泌とを刺激する潜在的単球／マクロファージ活性化剤である（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ、Ｓ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：２５８５−２５９１　（１９８６）およびその他）、ＴＮＦは、内毒素の生理的効果を模倣するから、内毒素に関連する疾患の臨床的所見に対して責任ある中心的仲介者であると結論付けられる。ＴＮＦおよび他の単球から誘導されるサイトカインは、内毒素に対する代謝的ならびに神経ホルモン的反応を仲介する（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｉｆ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎ、Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、３１８：１４８１−１４８６　（１９８８））、ヒトの有志被検者に対する投与は、発熱、頻脈、代謝の増大、ストレスによるホルモン分泌を含むインフルエンザ様症状を伴う急性疾患を惹起する（Ｒｅｖｈａｕｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Δｒｃｈ、Ｓｕｒ　、１２３：１Ｇ２−１７０　（１９８８））、グラム陰性菌による敗血症の患者では、高し冒５ｅｃｏｎｄ　Ｖｉｅｎｎａ　５ｈｏｃｋ　Ｆｏｒｕｍ　ｐ、　７１５−７１８　（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ、Ｊ、Ｍ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｃｒ１ｔ、Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ、１７：４８９−４９７　（１９８９）；Ｃａ１ａｎｄｒａ、Ｔ、ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、１６１　：９８２−９８７　（１９９０））−その殺腫瘍活性の故になされるＴＮＦによる癌患者の治療は、５４５μｇ／ｍ”／２４ｈｒより多い投与で、健康人に対する内毒素４ｎｇ／ｋｇの注射によって惹起されるのに似た変化を惹き起こすことがわかり（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｈ，Ｒ。

ｅｔ、ａｌ、、Ｓｕｒ　ｅｒ　１０４：２８０−２８６（１９８８））、敗血症と内毒素に対する反応の主たる宿主の仲介者としてのＴＮＦの役割を支持している。ヒトまたはラットへの長期間にわたる静脈内注入は食欲不振、体液うつ滞、急性反応、負の窒素バランス（すなわち、古典的異化効果）に関係し、重篤な疾患において見られる多くの変化に対する原因であるという結論に導かれる（（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｈ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Δｎｎ、Ｓｕｒ　、２０９：１９−２４（１９８９））。

上に論じたように、中和作用を有するＴＮＦに向けられた受動的免疫療法はこの様な病理状態で、増大したＴＮＦ産生と高められたＴＮＦレベルに基づいて、グラム陰性菌敗血症と内毒素症に有利な効果を有するであろう。

後にＴＮＦと同一物であることが見出されたカケクチンとして特徴付けられる変調因子物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、にょって開示されている（ヨーロッパ特許公報Ｎｏ、０２１２４８９，１９８７年３月４日）、そのような抗体は１診断用免疫学的検定と細菌感染におけるショックの治療とに有用であると言われていた。Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、は、ヒトのＴＮＦに対する単クローン抗体、そのような抗体を分泌するハイブリドーマ、そのような抗体を産生する方法、ＴＮＦの免疫学的検定におけるそのような抗体の使用を開示した（ヨーロッパ特許公報Ｎｏ、０２１８８６８）、Ｙｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、は、ｍＡｂを含む抗ＴＮＦ抗体類と、それの、諸疾患、特に川崎病と細菌感染の免疫学的診断における有用性とを開示した（ヨーロッパ特許公報Ｎｏ、０２８８０８８）。

川崎病（小児急性有熱性粘膜皮膚すンパ結節症侯群、Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｔ。

、Δ上上！　１旦：１７８　（１９６７）；　Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｔ、、５ｈｏｎｉｋａ　（Ｐｅｄｉａｔｉｒｉｃｓ）２旦：９３５　（１９８５））の患者の体液は高レベルのＴＮＦを含み、病変の進展に関係があると言われていた（（Ｙｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、上記文献）。

他の研究者等は、試験管内で中和作用を有する組換えヒトＴＮＦに特異的であるｍＡｂを記載した（Ｌｉａｎｇ、Ｃ−Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１３７：８４７−８５４　（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ、Ａ、ｅし　ａｌ、、Ｈｂｒｉｄｏｍａ　６：３０５−３１１　（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、旦ｍ土ｄｏｍａ　６：３５９−３６９；Ｂｒｉｎｇｍａｎ、Ｔ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｈｂｒｉｄｏｍａ　６：４８９−５０７　（１９８７）；Ｈｉｒａｉ　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、９６：５７−６２　（１９８７）；Ｍｏ１ｌｅｒ、Ａ、ｅｔ　ａｌ。

、（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　２：　１６２−１６９　（１９９０））、これらのｍＡｂのあるものは、ヒトのＴＮＦのマツピングと酵素の免疫学的検定の開発に使用され（Ｆｅｎｄｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、１掲文献；Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ、、１掲文献；Ｍｏ１ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１掲文献）、また組換えＴＮＦの生成の助剤とされた（Ｂｒｉｎｇｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１掲文献）、シかしながら、これらの研究は、ヒトにおける生体内診断または治療に使用できるＴＮＦ中和抗体産土産生礎を提供するものではない。

抗ＴＮＦ免疫療法の採用に対する最も直接的な支持が、ヒト以外の動物の生体内保護の研究から得られる。ＴＮＦに対する中和作用を有する抗血清またはｍＡｂが、ヒト以外の哺乳類について、実験的に惹起された内毒素血症と画面症における致死的挑戦の後に不利な生理的変化を停止し死を阻止することが示された。

この効果は、例えば、げっ肉類致死率検定と霊長類病理モデル系において実証された（Ｍａｔ、ｈｉｓｏｎ、Ｊ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃ１ｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、８１　：　１９２５−１９３７　（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２旦：８６９−８７１　（１９６５）；Ｔｒａｃｅｙ、に、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：６６２−６６４　（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ、Ｙ、ｅｔ　ａｍ　、Ｉｍｍｕｏｌ、Ｌｅｔｔ、１７：３１１−３１８　（１９８８）；Ｓｉ　ｌｖａ、Ａ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６２：４２１−４２７　（１９９０）、０ｐａｌ、Ｓ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６１　：１１４８−１１５２　（１９９０）；１１ｉｎｓｈａｗ、Ｌ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１ｒｃ、５ｈｏｃｋ　３０：２７９−２９２　（１９９０））、例えば、抗ＴＮＦｍＡｂを中和するＦ　（ａｂ’　）フラグメントは、ヒトにおけるＥ−ｃｏｌｉ生菌によって惹起された敗血症によるショックを阻止することができた（Ｔｒａｃｅｙ、に、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、１掲文献）。

ｈＴＮＦαの推定されるレセプター結合位置がＥｃｋとＳｐｒａｎｇとによって示された（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　（２９）、１７５９５−１７６０５　（１９８９））。彼等は、ＴＮＦαのリセブター結合位置をアミノ酸１１− １３．３７−４２．４９−５７および１５５−１５７と同定した０国際特許出願Ｗ０９１１０２０７８　（優先権主張日、１９８９年８月７日）は１次の様なエピトープ、すなわち１−２０．５６−７７および１０８−１２７の少なくとも一つ、１−２０．５６−７７．１０８−１２７および１３８−１４９の少なくとも二つ、１−１８．５８−６５，１１５−１２５および１３８−１４９のすべて、１−１８、および１０８−１２８のすべて、５６−７９．１１０−１２７および１３５−または１３６−１５５のすべて、１−３０，１１７−１２８および１４１−１５３のすべて、！−２６，１１７−１２８および１４１−１５３のすべて、２２−４０．４９−９６または−９７，１１０−１２７および１３６−１５３のすべて、１２−２２．３６−４５．９６−１０５および１３２−１５７のすべて、■−２０と７６−９０の両者のすべて、２２−４０．６９−９７，１０５− １２８および１３５−１５５のすべて、２２−３１および１４６−１５７のすべて、２２−４０および４９−９８のすべて、２２−４０．４９−９８および６９ −９７の少なくとも一つ、そして２２−４０と７０−８７の両者を有するモノクローナル抗体に結合することのできるＴＮＦリガンドを、開示している。

今日までのところ、ヒトにおける抗ＴＮＦｍＡｂ療法についての実験は限られている。一つのフェイズ■研究では、１４人の重篤な敗血症ショックの患者が、中和作用を有するマウスの抗ＴＮＦｍＡｂを０．４−１０ｍｇ／ｋｇの投与を１回受けた（Ｅｘｌｅｙ、Ａ、Ｒ，、Ｌａｎｃｅｔ　３３５：１２７５−１２７７（１９９０））。しかしながら、１４人中７人の患者がこの治療に対してヒトの抗マウス抗体反応を起こし、マウス抗体の重鎮（原文；ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）および軽鎖（原文；ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）部分に↓る免疫発現による既知の諸問題をこうむった。そのような免疫発現は、続（投与の有効性を減じ、マウス抗ＴＮＦ抗体の診断的または治療的投与を受けた患者に、免疫拒絶反応の故に、治療効果を無効にすることがある。

重篤な移植片体宿主疾患（原文；ｇｒａｆｔ　ｖｓ　ｈｏｓｔ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を患う患者に対するマウスＴＮＦｍＡｂの投与についてもまた報告されている（Ｈｅｒｖｅ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌ　ｍ　ｈｏｍａ　Ｒｅ５一旦：５９１（１９９０））。

したがって、マウス抗体免疫発現に関する諸問題を克服し、免疫発現の低い、そして中和活性の高い新規なＴＮＦ抗体の提供が必要とされている。

元唄の概要本発明の目的は、従来技術の欠陥を克服することである。

本発明の他の目的は、マウス抗組織壊死因子（ＴＮＦ）抗体とキメラ抗体とそれらのフラグメントおよび領域部分であって、生体内でＴＮＦの生物学的活性を阻害ないし中和し、ヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ｈＴＮＦａ）に特異的であるものを提供することである。一つの好適実施態様において、本発明の抗ＴＮＦ抗体はＡ２抗体のＴＮＦへの結合を完全に阻害する。

他の好適実施態様においては、本発明の抗ＴＮＦ抗体は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ｈＴＮＦａの残基３７−１０８または残基５９−８０および８７ −１０８の両者の少なくとも５個のアミノ酸のエピトープと結合するが、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）アミノ酸配列１−２０．１１−１３．３７−４２．４９−５７または１５５−１５７のよりなＴＮＦの既知あるいは推定されている結合部位には結合しない。

本発明のそのような抗ＴＮＦ抗体、そのフラグメント、領域部分は、マウス／マウスハイブリドマのようなハイブリドーマと、マウス／ヒトキメラ抗体のような少なくとも可変領域をコードする異種（非対応）核酸を発現する組損え細胞の両方から産生されるものを含む。すなわち、ＴＮＦ特異性抗体およびそのフラグメントと領域部分である。

ハイブリドーマと遺伝子工学技術を用いて抗ＴＮＦ抗体、そのフラグメントおよび領域部分を提供する本発明の他の目的は、上述の様なＴＮＦに関連するヒトの疾病の生体内診断および治療に有用な製品を提供することである。

本発明の他の目的は、ＴＮＦａの部分に相当するｈＴＮＦａの抗体ポリペプチドを提供することであり、これらのポリペプチドのエピトープがＴＮＦ特異性抗体に結合するとき、生体内においてＴＮＦａの生物学的活性を中和または阻害する。本発明のさらに他の目的は、図１５に示されるよりなｈＴＮＦａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１における）残基８７−１０８または５９−８０および８７−１０８から選ばれる少なくとも５個のアミノ酸に相当するポリペプチドの特定エピトープに結合するハイブリドーマまたは組換え宿主から産生される抗体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、生体内においてＴＮＦａを阻害および／または中和する活性を有し、悪液質を含むＴＮＦａに関連する疾患、細菌性疾患、ウィル炎症性および免疫性疾患の診断および治療のための、薬用および診断用の組成物として提供され得る抗ＴＮＦαおよび／またはそのフラグメント、領域部分を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、生体内において、ＴＮＦα阻害ないし中和作用を有し、悪液質を含むＴＮＦａに関連する疾患、細菌性疾患、ウィルス性疾患、および真菌性疾患のような急性および慢性の感染性および寄生虫性疾患、自己免疫疾患、アルコール誘発性肝炎、悪性形質転換疾患等を含む急性および慢性の炎症性および免疫性疾患の診断および治療のための、薬用および診断用の組成物として提供することのできる抗ＴＮＦαおよび／またはそのフラグメント、領域部分を提供することである。治療用に好適なのは、高親和性抗ＴＮＦα抗体で、モノクローナルキメラ抗体であって、組換えによりまたはハイブリドーマによって産生されるものを含み、それは少なくとも約１ｕｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約１１００ｎ／ｍｌ、もつとも好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌの阻害投与量５０　（ＩＤ５０）で生体内でヒトのＴＮＦａを阻害ないし中和する。

本発明の他の様相によれば、抗ＴＮＦαｍＡｂまたはキメラｍＡｂまたはそのＴＮＦα結合性フラグメントは、ＴＮＦａの産生に関連する症状を病むと疑われる患者の体内でヒトＴＮＦαを検出するための診断法において特に有用であり。

本発明の高親和性マウス抗ＴＮＦα抗体またはキメラ抗ＴＮＦα抗体が、患者または、検出された抗原抗体反応から得られる生物学的物質と接触させられる方法を含む０本発明はまた１本発明の高親和性マウス抗ＴＮＦα抗体および／またはキメラ抗ＴＮＦα抗体を、好ましくは、検出できるようにラベルされた形で含む、生物学的流体（体液）中のＴＮＦａを検出するためのキットをも含む。

本発明のキメラ抗体はｍＡｂの有利な特徴の組合せを具体化するものである。

本発明のキメラ抗体は、マウスｍＡｂと同様に、ヒトのＴＮＦを認識し、これと結合する。しかし、マウスｍＡｂとは異なり、このキメラ抗体の「ヒトに特異的な」性質が、抗体に対する免疫応答の可能性を低下させ、そして浄化値（原文；ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の低下により血液循環中で長く維持される。さらに、本発明によって開示された方法を採用することにより、どのような所望のヒト免疫グロブリンのイソタイプでもその一定領域において所望の抗原結合部位と結合できる。

本発明の一つの実施態様は、ヒトＴＮＦαに特異的であるＡ２と名付けられる高親和性のマウスｍＡｂに関する。この抗体は、検出可能にラベルされた形で使用される。別の実施態様では、ｈＴＮＦａのポリペプチド部分であって、そのペプチド部分に含まれるエピトープに特異的な抗体またはそのフラグメントによって無傷のＴＮＦα分子の一部として結合するときに、生体内においてＴＮＦα活性を阻害または中和するものが提供される。

本発明のさらに別の目的は、１１またはＬのキメラ免疫グロブリン鎖であって、可変または不変（恒常）領域を有し、ＴＮＦの一以上のエピトープに対する特異性を有する、好ましくは、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦａの、残基５９−８０および８７−１０８の両者の組合せまたは残基８７−１０７の少なくとも５個のアミノ酸のエピトープ、に対する特異性を有するものを提供することである。好適実施態様において、エピトープアミノ酸は、（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：ｌにおける）ｈＴＮＦａの１１−１３．３７−４２．４９−５７または１５５−１５７の少なくとも一つの残基からのアミノ酸を含まない、ヒト／マウス− キメラ免疫グロブリン鎖は、天然のヒト免疫グロブリン中に存在するものに実質的に類似の不変（Ｃ）領域と、好ましくはＴＮＦエピトープに対する高親和性と所望の特異性を有する可変（ｖ）領域を含む０本発明はまた、分子全体が所望の抗原認識作用および結合作用を示すように会合させられたキメラＨおよびＬ鎖を有する抗原、そのフラグメント、領域部分を提供する。

具体的には、本発明は二つの軽鎖と二つの重鎮を有し、そのおのおのがヒトの不変領域の少なくとも一部と非ヒト起源のｈＴＮＦｃｚに対する特異性を有する（ ■）可変領域の少なくとも一部とを有し、ｈＴＮＦａの阻害性および／または中和性エピトープに対して高親和結合性を有するキメラ抗体に関する０本発明はまたそのような抗体のフラグメントまたは誘導体を含む、好ましくは、■領域は。

非ヒト起源のものであり、もっとも好ましくはマウス起源のものである。好適実施態様において、■領域は、Ａ２　ｍＡｂのエピトープから誘導されるか、それに結合する。別の好適実施態様においては、キメラＡ２　（ｃＡ２）と名付けられるキメラ抗体か、ｃＡ２とＴＮＦａの結合を競合的に阻害するヒト／マウス− キメラ抗ＴＮＦｍＡｂのエピトープと結合する抗体を提供する。

好ましくは、このキメラ抗体は、生体内で、少なくとも約ｌｕｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１１００ｎ／ｍ１．最も好ましくは、少なくとも約１５．３０．５０もしくは８０ｎｇ／ｍｌのＩＤ５０の投与で、ｈＴＮＦａを阻害または中和する。

図面の簡単な説明図１は、ヒトＴＮＦαに対する、マウスｍＡｂ　Ａ２の結合に依存する用量（原文；ｄｏｓｅ）を示すグラフである。

図２は、ｍＡｂＡ２による。熱で不活性化されたヒトＴＮＦαの認識の欠如を示すグラフである。

図３は、ネズミのＡ２による生体内でのＴＮＦ細胞毒作用の中和を示すグラフである。対照：天然のヒトＴＮＦを有する、ネズミのＩｇＧ１抗脂質Ａ　ｍＡｂ（８Ａｌ）。対照に対する平均吸光度値は次のとおりである：ＴＮＦなし＝１．０８．天然ＴＮＦ、抗体なし＝０．２９０；組み替えＴＮＦ、抗体なし＝（Ｌ　５００゜図４は、ｍＡｂ　Ａ２およびキメラＡ２がヒドリンホトキシン（ＴＮＦβ）を阻害または中和しないことを示すグラフである。

図５は、ｍＡｂネズミＡ２およびキメラＣＡ２がネズミＴＮＦαを阻害または中和しないことを示すグラフである。

図６および図７は、ｍＡｂ　Ａ２が、チンパンジー単球およびｒｈＴＮＦαによって産生されたＴＮＦを阻害または中和することを示すグラフである。

図８は、キメラＡ２抗体のキメラＨ鎖（ｐＡ２ＨＧｌａｐｇｐｔ）およびキメラし鎖（ｐＡ２ＨｕＫａｐｇｐｔ）の発現のために使用されたプラスミドを示す模式図である。

図９は、ネズミのＡ２　（ｍＡ２）およびキメラ抗体（ｃＡ２）で競合的にエピトープ　ＥＬＩＳＡを交差ブロック（原文；ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）　した結果を示すグラフである。

図１０は、マイクロタイタープレート（原文；ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ）上に固定された組み換えヒトＴＮＦαに結合する、　＋ｔｓｌでラベルされたｍＡｂ　Ａ２（ｍＡ２）およびキメラＡ２　（ｃＡ２）に関するスキャチャード分析のグラフである。各Ｋａ値は、二つの独立した測定値の平均から計算された。

図１１は、キメラＡ２によるＴＮＦ細胞毒作用の中和を示すグラフである。対照は、天然のヒトＴＮＦと反応するキメラマウス／ヒトＩｇＧ１抗血小板ｍＡｂ（７Ｅ３）である、対照に対する平均吸光度値は、ＴＮＦなし＝１．０８；天然ＴＮＦ、Ａｂなし＝０．２９０；組み換えＴＮＦ、Ａｂなし＝０．５００である。

図１２は、キメラＡ２による、ＴＮＦ導入ＥＬＡＭ−１発現の生体外（原文；ｉｎ　ｖｉしｒｏ）での中和を示すグラフである。対照は、キメラマウス／ヒトＩｇＧ抗ＣＤ４抗体である。

図１３は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１としての、ヒトＴＮＦのアミノ酸の配列を示す。

図１４Ａは、ヒトＴＮＦペプチドピンへのｃＡ２の相対的な結合を示すキメラｍＡｂ　ｃＡ２のエピトープ地図を示すグラフ表示である。

図１４Ｂは、ヒトＴＮＦの存在下におけるヒトＴＮＦペプチドビンへのｃＡ２の相対的な結合を示すキメラｍＡｂ　ｃＡ２のエピトープ地図を示すグラフ表示である。

図１５は、ｃＡ２により認識されたエピトープの部分を有する配列を示している、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列を表す。

図１６Ａは、ヒトＴＮＦモノマーのモデルを示す三次元画像である。

図１６Ｂは、ｃＡ２により認識されたヒトＴＮＦの非隣接ペプチド配列のモデルを示す三次元画像である。

ましい態　の品　な！本発明は、マウス抗組ｍ壊死因子（ＴＮＦ）抗体とネズミ／ヒトキメラ抗体とそれらのフラグメントおよび領域部分であって、生体内（原文；ｉｎ　ｖｉｖ。

）でＴＮＦ生物学的活性を阻害ないし中和し、そして、ヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ｈＴＮＦａ）に対して特異的であるもの、かつ、計重上および治療上の目的のために、通常の健康な被検体に存在するよりも過剰の量で存在する抗ＴＮＦ抗体特にｇＴＮＦαと反応活性である物質の存在に付随した状態または病理学的状態にある被検体に、使用されるものを、提供する０本発明の、抗体、ならびにそれらのフラグメント、領域部分および誘導体は、生体内で（原文；ｉｎ　ｖｉｖｃ））生物学的活性を阻害ないし中和するＴＮＦのエピトープを認識するところの、■領域部分を少なくとも好ましく含有する。

予想外のこととして、本発明のｍＡｂｓは、ＥｃｋおよびＳｐｒａｎｇ　（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２旦４　（２９）、１７５９５−１７６０５　（１９８９）によって、　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ｈＴＮＦａの１１−１３．３７−４２．４９−５７および１５５−１５７である複数のアミノ酸であるとして示されたように、推定されたレセプター結合位置に結合することなく、ＴＮＦ−αの活動を遮断することができる。

本発明の好ましい抗体は、ネズミ抗体または高親和性ヒト／ネズミキメラ抗ＴＮＦα抗体、ならびにそれらのフラグメントもしくは領域部分であり、それらは生体内で（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）ヒトＴＮＦαに対して効力のある阻害活性および／または中和活性を有する。そのような抗体およびキメラ抗体は１Ｍ製された組み換えｈＴＮＦａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）またはそれらのペプチドフラグメントを使用する免疫感作によって生じたものを含む、そのようなフラグメントは、　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌの複数のアミノ酸に相当する）ｈＴＮＦａの残基５９−８０および残基８７−１０７の両方の組み合わせまたは残基８７−１０７の内の少なくとも５分子のアミノ酸のエピトープを含む。さらに、本発明の好ましい抗体、抗ＴＮＦ抗体のフラグメントおよび抗ＴＮＦ抗体の領域部分は、（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１（７））ｈＴＮＦａにｊ５４ｔ６複数（７）７ミ／ｆｉｔ　１−１３．３７−４２．４９−５７または１５５−１５７の少なくともひとつから由来する複数のアミノ酸（原文；　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）を認識しない。

ＴＮＦの循環濃度は非敗血症個体中で約１０ｐｇ／ｍｌの程度で非常ド低く、一方、敗血症患者では約５０ｐｇ／ｍｌに達しくＨａｍｍｅｒｌｅ、Ａ、Ｆ。

ｅｔ　ａｌ、、１９８９．上掲書）、あるいは、病理学的にＴＮＦでメデイエートされたサイトで検出され得るだけであるから、病理学的にＴＮＦでメデイエートされた免疫検定および療法の両方のために、生体内で（原文；ｉｎ　ｖｉｖ。

）ＴＮＦ阻害および／または中和する高親和性および／または効力のある抗体、そのフラグメント、またはその領域部分を使用するのが好ましい、そのような抗体、フラグメントおよび領域部分は、Ｋａとして発現された、たとえば５×１０ ”　Ｍ−’、８Ｘ１０’　Ｍ−’、２Ｘ１０”Ｍ−’、４Ｘ１０”　Ｍ−’、６ｘｌＯ＠Ｍ−’、８Ｘ１０”　Ｍ−’のような少なくとも１０”　Ｍ−’、より好ましくは少なくともｌＯ’　Ｍ−’のｈＴＮＦａに対する親和性を好適に有している。

ヒトに対する治療学的使用に対して好適であるのは、ＴＮＦ誘導ＩＬ−６分泌を遮断するところの、生体内で（原文；　ｉｎ　ｖｉｖｏ）ＴＮＦα阻害活性および／またはＴＮＦα中和活性を有する、本発明の高アフイニテイを有するネズミとのキメラ抗体ならびにそれらのフラグメント、領域部分および誘導体である。

ヒトに対する治療学的使用に対してまた好適であるのは、生体内外およびその位置において（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ、　ｉｎ　５ｉｔｕ、ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）　、ＥＬＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のような細胞接着分子のＴＮＦ誘導発現を遮断すること、および、ＴＮＦマイトジェン活性を遮断することを含めて、ＴＮＦ誘導プロ凝固活性（原文；ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を遮断するところの、高親和性を有するネズミとのキメラ抗ＴＮＦα抗体、ならびにそれらのフラグメント、領域部分および誘導体である。

好ましい抗ＴＮＦ　ｍＡｂｓは、ネズミの抗ＴＮＦａ　ｍＡｂ　Ａ２、キメラｍＡｂ　ｃＡ２　または、前記フラグメントおよび領域部分と同様に特別の結合特性を実質的に備えた抗体のヒトＴＮＦαへの結合を競合的に生体内で（原文；ｉ　ｎ　ｖ　ｉ　ｖｏ）阻害することのできるものである０本発明の好ましし）抗体６よＡ２およびｃＡ２により認識されたエピトープを結合したものであり、そのエピトープは、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の相当するアミノ酸として）ｈＴＮＦａにおける５９−８０および／または８７−１０８の複数のアミノ酸中に含まれ、ヒトｈＴＮＦαの上記部分から由来する少なくとも１分子のアミノ酸を有する少なくとも５分子のアミノ酸からなる。競合的阻害によるｍＡｂの特異性および親和性を決定する好適な方法は、Ｍｕｌ　ｌｅｒ、Ｍｅｔｈ、旦旦ＡＬｍ旦１．９２　：　５８９−６０１　（１９８３）により見出されることができ、その内容は参照によってこの明細書の内容として完全に組み込まれる。

本発明における抗体の例として、本発明のネズミｍＡｂ　Ａ２が、ｃ１３４Ａとして指定される細胞系により産生される。キメラ抗体ｃＡ２が、０１６８Δとして指定される細胞系により産生される。細胞系ｃ１３４Ａは、セントコア　セル　バイオロジー　サービス　デボジトリ（原文；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）にあるリサーチセルバンク（原文；ｒｅｓｅｒｃｈ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）に預託され、また、細胞系ｃ１６８Ａ　（ＲＣＢ）は、セントコア　コーホレート　セル　カルチャーリサーチ　アンド　デベロップメント　デボジトリ（原文：ＣｅｎｔｏｃｏｒＣｏｒｐｏｒａｔｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）に預託されている。なお、両者とも、セントコ乙　２００グレート　バレイ　バークウェイ、マルバーン。

ペンシルベニア州、１９３５５に位置している。そのｃ１６８Ａ細胞系は、また、オランダ国ライデンのセントコアＢＶに預託されている。

さらに、ｃ１６８Ａは１本願の出願日に、培地安全預託（原文；Ｃｕ１ｔｕｒｅ　５ａｆｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔ）として、メリーランド州のロックビルにあるアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（原文；Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ：ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に、預託された。

用語の「エピトープ」は、抗体により認識されることができ、かつ抗体に結合されることのできるその部位を指すものとして、意味される。エピトープは、通常、複数のアミノ酸または複数の糖側鎖のような、化学的に活性な複数の分子の集合表面からなり、特異的な電荷特性のみならず特異的な三次元構造特性を有している。［阻害し、および／または中和するエピトープ」とは、ＴＮＦリセブターへのＴＮＦの結合を含めて、生体内外およびその位置において（原文；１ｎｖｉｖｏ、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　５ｉｔｕ）、より好ましくは生体内で（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）、抗体が結合するとエピトープを含有する分子または組織の生物学的活性を喪失するエピトープを意図する０本発明の好ましい抗体、抗ＴＮＦ抗体のフラグメントおよびその領域部分は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦａの残基８７−１０８のアミノ酸からの、または残基５９ −８０および８７−１０８の両方のアミノ酸からの少なくとも１分子のアミノ酸を有する５分子のアミノ酸を含むエピトープを認識する０本発明の好ましい抗体、抗ＴＮＦ抗体のフラグメントおよびその領域部分は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１における）ｈＴＮＦａの１１−１３．３７−４２．４９−５７または１５５− １５７のアミノ酸の少なくともひとつから由来するエピトープを認識しない、好ましい態様においては、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ｈＴＮＦａの残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方からの少なくとも２分子のアミノ酸を含有する。他の好ましい態様においては、エピトープは、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦａの残基５９−８０および残基８７ −１０８からの少なくとも３分子のアミノ酸を含有する。その他の好ましい態様においては、エピトープは、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦａの残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方からの少な（とも４分子のアミノ酸を含有する。その他の好ましい態様においては、エピトープは、　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ｈＴＮＦａの残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方からの少なくとも５分子のアミノ酸を含有する。その他の好ましい態様においては、エピトープは、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１における）ｈＴＮＦａの残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方からの少な（とも６分子のアミノ酸を含有する。その他の好ましい態様においては、エピトープは、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ｈＴＮＦａの残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方からの少なくとも７分子のアミノ酸を含有する。

「抗原」は、その抗原のエピトープに結合することのできる抗体を産生するために動物を誘導することのできる抗体によって結合されることのできる分子であるか、または分子の一部である。一つの抗原は、−以上のエピトープを含有していても良い。上記の特異的な反応は、抗原が高度に選択的な挙動で、その対応する抗体と反応することができるが、他の抗原により引き起こされる多数の他の抗体とは反応することがないということを示すものとして、意味される。抗体、本発明の抗ＴＮＦａのフラグメントおよび領域部分を結合する好ましい抗原は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦａ（７）残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方からのアミノ酸の少なくとも一つを含有する少なくとも５分子のアミノ酸を含む、抗体、本発明の抗ＴＮＦｃｚのフラグメントおよび領域部分を結合する好ましい抗原は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦａのアミノ酸１１−１３．３７−４２．４９−５７または１５５ −１５７からのアミノ酸を含まない。

用語の「抗体」は、ＴＮＦによるＴＮＦリセブターへの結合を阻害するＴＮＦの部分を結合することのできる、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、ならびにそのフラグメントおよび領域部分を、それらの誘導体と同様に、含んで意味される。フラグメントは、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）ｓ、およびＦｖを含む、これらのフラグメントは、抗体そのもののＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に清適になり（原文；ｃｌｅａｒ　ｍｏｒｅ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、そして抗体そのものよりも非特異的でない組織結合を有している（原文；ｍａｙ　ｈａｖｅ　１ｅｓｓ　ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ　ｂｉｎ：ｄｉｎｇ　ｔｈａｎａｎ　１ｎｔａｃｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｗａｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、２４：３１６−３２５　（１９８３））、これらのフラグメントは、この技術分野に良く知られた方法、たとえば（Ｆａｂフラグメントを得るには）パパインのような酵素、あるいは（Ｆ　（ａｂ’　）　ｚを得るには）ペプシンのような酵素を使用するタンパク質分解により、抗体そのものから得られる０本発明の抗ＴＮＦ抗体の領域は、重鎮定常領域（１−１ｃ）　、重鎮可変領域（Ｈ，）、軽鎖可変領域（Ｌ、）および軽鎖定常領域（Ｌｃ）の少なくとも一つを含み、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらのフラグメントおよび領域部分が、ＴＮＦの一部を結合し、かつＴＮＦ生物学的活性を阻害するところの、少なくとも一つの重鎮可変領域（Ｈｌ）または軽鎖可変１域（Ｌ、）を含む。

好適な態様においては、抗体は、バイプリドーマまたは組み換え宿主により産生されるところの、その抗体がＡ２、ｒＡ２、またはｃＡ２と指定されるＴＮＦのエピトープのアミノ酸を結合する、モノクローナル抗体である。他の好適な態様では、抗体は、Ａ２により認識されたエピトープを認識するところの、キメラ抗体である。更に好適な態様においては、抗体は、キメラＡ２　（ｃＡ２）と指定されるキメラ抗体である。本発明におけるマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域部分は、個々の重（Ｈ）鎖免疫グロブリン鎖および軽（Ｌ）鎖免疫グロブリン鎖からなる。キメラμ鎖は、ヒト８ｍＣ領域の少なくとも一部に結合された。ＴＮＦに対して特異的な非ヒト抗体の１１鎖から誘導された抗原結合領域を有する。

本発明のキメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）の少なくとも一部に結合された、ＴＮＦに対して特異的な非ヒト抗体のし鎖から誘導された抗原結合領域からなる。

ここで使用されているように、用語の［抗原結合領域」は、抗原と相互作用をし、抗原に対するその特異性および親和性を抗体に付与するところのアミノ酸残基を含有する抗体分子のその部位を示すものとされる。抗体領域は、抗原結合残基の適当な構造を維持するために必要な「読み取り枠」アミノ酸残基を含む。

この明細書で使用されるものとして、用語の「キメラ抗体」は、−価、二価または多価の免疫グロブリンを含む、−価のキメラ抗体は、キメラし鎖とジスルフィド架橋で結合されたキメラμ鎖により形成された二量体（ＨＬ）である、二価のキメラ抗体は、少なくとも一つのジスルフィド架橋で結合された二つのＨＬ二量体から形成された四量体（Ｈ，Ｌ、）である、多価キメラ抗体は、たとえば、凝集するＣＩ４領域（たとえばＩｇＭのμ鎖またはμ鎖から）を用いることによって得ることができる。

本発明はまた、ネズミのまたはキメラ抗体、そのフラグメント、その領域部分、またはそれらの誘導体について「誘導体」を規定し、その用語は、免疫グロブリンと機能的に類似する分子種を生成する。切り縮められ、または修飾された遺伝子によりコードされたそれらのタンパクを含む、その修飾は、植物毒および細菌毒のような細胞毒タンパクをコードする遺伝子配列の付加を含むが、それらに限定はされない、そのフラグメントおよび誘導体は、この発明のいかなる宿主からも産生されることができる。また、抗ＴＮＦ抗体、フラグメントおよび領域部分は、細胞毒タンパクまたは化合物に生体外で（原文；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）結合されて、ＴＮＦリセブターを有する細胞を選択的に殺す細胞毒の抗ＴＮＦ抗体を産生ずる。

同一または相違するＶ領域を特異的に結合するキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖を有する抗体、フラグメント、または誘導体は、たとえば５ｅａｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　Ｉ２　：３５３−３５７　（１９７５）により教示されたように１個々のポリペプチド鎖の適当な会合により得られることができる。そのやり方の場合、キメラＨ鎖（またはそれらの誘導体）を発現する宿主がキメラＬ鎖（またはそれらの誘導体）を発現する宿主とは別々にして培養され、そして免疫グロブリンが別々に回収されて会合される。

また別に、複数の宿主が同時培養されることができ、？Ｉ数の鎖が培地中で自発的に会合させられ、会合した免疫グロブリン、フラグメンまたは誘導体が回収される。

本発明のキメラ抗体の抗原結合領域は、ヒトＴＮＦに対して特異的な非ヒト抗体から好適に得られる。そのような非ヒト抗体をコードする好ましいＤＮＡ源は、抗体を産生ずる細胞系、好ましくはハイブリドーマとして普通に知られている雑種細胞系を含む。好ましいバイポリドーマはＡ２ハイブリドーマ細胞系である。

雑種細胞は、非ヒト抗ｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆα抗体産生細胞、典型的には天然のもしくは組み換えヒトＴＮＦまたはヒトＴＮＦαタンパク配列のペプチドフラグメントに対して免疫された動物の胛臓細胞の融合によって形成される。また、非ヒト抗ＴＮＦ抗体産生細胞は、血液、膵臓、リンパ節またはＴＮＦで免疫された動物の他の組織から得られたＢリンパ球であっても良い。

本発明におけるキメラ抗体の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列に寄与する抗体産生細胞は、霊長類のような非ヒト細胞またはヒト細胞の形質転換により産生される６たとえば、抗ＴＮＦ抗体を産生するＢリンパ球は、エプスタイン −パールウィルス（原文；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）のようなウィルスで感染され、形質転換されて、不滅の抗ＴＮＦ抗体産生細胞を生成する（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｔ、、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａ　４ニア２−７９（１９８３））。また、そのＢリンパ球は、この技術分野で良く知られているように、形質転換遺伝子または形質転換遺伝子産生物を与えることにより、形質転換されても良い。

好ましくは、抗原結合領域部分は、ネズミ起源である。他の態様においては、抗原結合領域部分は、他の動物種、特にウサギ、ラットまたはハムスターのような唱歯類から得られる。

永続的機能を与える第２の融合相手は、リンパ球様細胞またはそれ自身抗体産生細胞ではないが悪性である形質細胞腫もしくはミエローマの細胞であっても良い。好ましい融合相手細胞は、５Ｐ２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と略されルハイブリドーｖＳＰ２１０−Ａｇ１４．およびミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８８））を含む。

ヒトＴＮＦαに特異的なｍＡｂを産生ずるネズミハイブリドーマは、マウス融合相手細胞たとえばＳ　Ｐ　２１０と、精製されたｈＴＮＦα、組み換えｈＴＮＦ α、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ＴＮＦの残基５９−８０および８７− １０８から選択される５以上のアミノ酸を含む、天然もしくは人工のＴＮＦペプチドで免疫されたマウスの膵臓細胞との融合によって形成される。マウスを免疫するために、従来の種々の異なる実験記録が参照される。

（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ＴＮＦにおけるＴＮＦ残基８７−１０８もしくは残基５９−８０および８７−１０８の両方、フラグメントまたはそれらの中に含まれるペプチドの組み合わせが２本来のＴＮＦ分子の脈絡（原文；Ｃｏｎｔｅｘｔ）中に存在するペプチド配列を認識する抗体を形成するために、免疫源として有効である。

本発明における、抗体によって認識されるエピトープ、ならびにそのフラグメントおよび領域部分は、高ＴＮＦ活性を有し、本発明の抗体、フラグメント、それらの可変領域部分によって認識されるＴＮＦの局所的エピトープを提供する、以下に示されるＴＮＦのアミノ酸配列の各々もしくは両方の少なくとも一つのアミノ酸を含有する５分子以上のアミノ酸を含む。

５９−８０　：　Ｔｙ　ｒ−Ｓｅ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ｇ１　ｙ−Ｇ１１−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ− Ｈｉ　５−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉ　５−Ｔｈｒ　−１１ｅ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌのＡＡ　５９−８０）および８７−１０８：Ｔｙｒ −Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Δ１ａ −１１ｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−１’ｒｏ　−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌのＡＡ　８７ −１０８）本発明の抗体を発生させるのに使用されることのできる特別のペプチドが、残基８７−１０８または残基５９−８０および８７−１０８の両方の少なくともいずれかから選択されるところの、抗ＴＮＦ抗体、フラグメントおよびそれらの領域部分により結合されたＴＮＦエピトープを形成するために結合された、そして、その結合が抗ＴＮ生物学的活性を発生させるアミノ酸の組み合わせを含む。そのようなエピトープは、ＴＮＦの他のアミノ酸との結合により長さとして少なくとも５分子のアミノ酸のエピトープを生成するところの、残基８７−１０８または残基５９−８０８よび８７−１０８の各々から選択される少なくとも１〜５分子のアミノ酸および２２未満のアミノ酸を含む。

本発明の抗体を、遊離のもしくは接合した形でまたは大きなペプチドの脈絡における本来の配列として存在する時にそれらの配列を認識し、かつ結合する小さなペプチド配列にする技術は、この技術分野において良く知られている。それらの抗体は、この技術分野で知られたハイブリドーマまたは組み換え技術によって産生されたところの、Ｅネズミ抗体、ネズミ／ヒト抗体およびヒト／ヒト抗体を含む。

本発明のｍＡｂｓによって認識されたこれらのペプチド配列の同定は、結合特性を有する付加的なモノクローナル抗体を発生させるに必要な情報およびこの好適な適用に匹敵する治療掌上の有用性を提供する。

好適な態様において、エピトープのアミノ酸は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ｈＴＮＦαのアミノ酸１１−１３．３７−４２．４９−５７および１５５ −１５７に関連しない。

細胞融合は、免疫学の分野における当業者に良（知られた標準的な手法によって達成される（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２旦旦：４９５−４９７　（１９７５）　およびＵ、　Ｓ、特許第４，３７６．１１０号；Ｈａｒｔｌｏｗ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、上掲書；Ｃａｍｐｂｅｌ　ｌ、Ａ、、”　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ、１ｏｄｉｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、” Ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｖｏｌｕｍｅ　１３（Ｂｕｒｄｏｎ、ｒ、、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍ５ｔｅｒｄ。

ｍ（１９８４）；Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（Ｋｅｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、ｐｐ、３６５−３６７、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８０）；ｄｅ　Ｓｔ、Ｇｒｏｔｈ。

Ｓ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、１旦：　１−２１　（１９８０）；Ｇａｌ　ｆｒｅ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　旦旦ＡＬ匹旦１゜旦旦：３−４６　（１９８１）　；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ、Ｗ、１９８７．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２ｎｄ　ｅｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；融合相手細胞系と、ハイブリドーマを選択しかつ融合し、およびｍＡｂｓをスクリーニングするための方法とは、この技術分野において良（知られている（Ｈａｒｔｌｏｗ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、上掲書；Ｋａｗａｍｏｔｏ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　ｍｏｌ　上λ１　：　２６６−２７７　（１９８６）；Ｋｅａｒｎｅｙ、Ｊ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２３：１５４８ −１５５０　（１９７９）；Ｋｉ　１ｍａｒｔｉｎ、Ｊ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｏ１．９旦：５７６−５８２　（１９８２）’；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、旦：２９２−２９５（１９７６）；Ｌａｎｅ、Ｄ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｕｅｌｌｅｒ、ｔＪ、Ｗ、ｅＬ　ａｔ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、旦ヱ：１９３−１９６　（１９８６）；Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏ、Ｄ、、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ。

１　：３９７−４００　（１９７５）；５ｈａｒｏ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ヱ６：　１４２０−１４２４　（１９７９）；Ｓｈｕｌｍａｎ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９−２７０　（１９７８）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｔ、Ａ、（ｅｄ）、ＨｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、＋９８５；　ａｎｄ　Ｔａｇｇａｒｔ、Ｒ，Ｔ、ｅｔ　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２上旦：１２２８−１２３０　（１９８２））。

本発明の、ｈＴＮＦαに特異的なネズミｍＡｂまたはヒトｍＡｂは、抗体を分泌するハイブリドーマまたはトランスフエフトーマ細胞をネズミの腹腔内に注射するか、適当な時間の経過後に高力価のｍＡｂに達している腹水症液を収集し、それからｍＡｂを単離するかによって、大量に生産されることができる。そのような、非ネズミハイブリドーマ（たとえばラットまたはヒト）によるｍＡＢの生体内で（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）の産生のために、ハイブリドーマ細胞が、照射されたマウスまたは胸腺欠損マウス中で好適に成長される。

また、抗体は、ハイブリドーマまたはトランスフエフトーマ細胞を生体外で（原文；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）培養し、そして選択されたｍＡｂをその細胞培地から単離することによって産生されることもできる。

本発明のモノクローナル抗体は、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１における）ＴＮＦの残基８７−ｔｏｇまたは残基５９−８０と８７−１０８との両方の非隣接配列内に位置された非隣接残基を含むエピトープを認識する。好適な抗ＴＮＦｍＡｂは、これらの−以上のペプチド配列に結合する能力によってヒトＴＮＦαのそのリセブターへの結合を阻害するものである。これらの抗体は、（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：１における）ＴＮＦの８７−１０８および／または１１０−１２８を含む配列のエピトープに結合することによって、ＴＮＦの活性を遮断する。そのような結合は、ここに述べられたように、ＴＮＦ活性を阻害するために例証される。

本発明の抗体をスクリーニングするために使用されることのできる特別なペプチドは、少なくとも残基８７−１０８または残基５９−８０と８７−１０８との両方のいずれかから選択されたところのアミノ酸の組み合わせを含み、それらのアミノ酸は、本発明の抗ＴＮＦ抗体、そのフラグメントおよびその領域部分により結合されたＴＮＦのエピトープを提供するために結合され、その結合は抗ＴＮＦ生物学的活性を提供する。そのようなエピトープは、少なくとも１〜５分子のアミノ酸および２２未満のアミノ酸を含むか、または残基５９−８０および８７− ｔｏｇの各々のアミノ酸を含み、それらは少な（とも５分子長のアミノ酸のエピトープを形成する。

几ＴＮＦ？　几　の組み　え　のアミノ酸配列中に（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにおける）ｈＴＮＦαの残基８７− ｔＯＳまたは残基５９−８０と８７−１０８との両方のいずれかが含まれたエピトープを結合しかつＴＮＦを阻害するところの、組み換え体であるネズミ抗体、またはネズミ／ヒトキメラ抗体もしくはヒト／ヒトキメラ抗体は、ここに提供された教示に基づく既知の手法を使用する本発明に従って提供される。

本発明の抗ＴＮＦ抗体をコードするＤＮＡは、重鎮定常領域（Ｈｃ）、重鎮可変領域（Ｈ，）　、軽鎖定常領域（Ｌｃ）　！３よび軽鎖可変領域（Ｌ、）の内の少なくとも一種をコードするところの、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであっても良い。ネズミのＶ領域における抗原結合セグメントをコードするＤＮＡ源としての染色体遺伝子フラグメントを使用することの外に取り得ることは、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構成のためのｃＤＮＡを使用することであり、このことはＬｉｕｅｔ　ａｌ、、ｊ旦り立旦ユＮ旦１上工Δ立旦亘、互旦１工、１旦Δ　旦：３４３９　（１９８７）およびＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　上旦旦：３５２１　（１９８７）により報告されており、その内容は参照することによってここに完全に組み込まれる。ｃＤＮＡを使用するには、所望のタンパクを合成するために宿主細胞に好適な遺伝子発現要素が遺伝子と結合されることを、要する。ｃＤＮＡ配列の使用には、適当なＲＮＡスプライシング系を欠いている細菌または他の宿主中でｃＤＮＡ配列が発現されることができるという点で、　（イントロンを含む）ゲノム配列を使用する以上に利点がある。

本発明におけるネズミのキメラ抗体、フラグメントおよびそれらの領域部分の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、ヒト胎生肝の遺伝子ライブラリーから、既知の方法により得られることができる。Ｃ領域をコードするヒト遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現し産生ずるものを初めとするヒト細胞から得られることができる。ヒトＣ□領域は、既知のクラス、またはガンマ、μ、α、δまたはＣを初めとするヒト［Ｉ鎖のイソタイプおよびＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のようなヒトＨ鎖のサブタイプのいずれからも得られることができる。Ｈ鎖のイソタイプは抗体の種々のエフェクター機能に対して応答するので、Ｃｎ領域の選択が、所望のエフェクター機能、たとえば補体結合または抗体依存性細胞障害（ΔＤＣＣ）における活性によって案内される。好ましくは、０．４領域は、ガンマｌ　（１ｇＧ４）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、ガンマ４（１ｇＧ４）またはｕ（ＩｇＭ）から得られる。

ヒトＣＬ領域はヒトＬ鎖イソタイプ、カッパまたはガンマから得られる。

ヒト免疫グロブリンのＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なりローニング技術によってヒト細胞から得られることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、旦１ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８９）ａｎｄ　Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７−１９９１））。ヒトＣ領域遺伝子は、Ｌ鎖の二つのクラス、Ｈ鎖の五つのクラスおよびそれらのサブクラスを表す既知のクローンから入手される。キメラ抗体フラグメントたとえばＦ　（ａｂ’　）−およびＦａｂは、適当に切り縮められたキメラＨ鎖遺伝子を設計することにより得られることができる。たとえば、Ｆ　（ａｂ’　）フラグメントのＨ鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ，ドメインおよびＨ鎖のヒンジ部分をコードし、切り縮められた分子を生成するための翻訳停止コドンを有するＤＮＡ配列を含む。

一般的には、本発明の、ネズミのまたはヒト／ネズミのキメラ抗体、フラグメントおよびその領域部分は、ネズミのまたはヒト／ネズミのキメラ免疫グロブリンをコードする遺伝子を産生ずるために、ＴＮＦに特異的な抗体のＨ鎖およびＬ鎖における抗原結合領域をコードするＤＮＡをクローニングすること、およびこれらのＤＮＡセグメントを０Ｍ領域およびＣＬ領領域それぞれコードするＤＮＡに結合することによって産生される。

このように、好適な態様においては、結合（Ｊ）セグメントを備えた機能的に再編成されたＶ領域のような非ヒト起源の抗原結合領域を少なくともコードし、かつ、ヒトＣ領域の少なくとも一部をコードする第２ＤＮＡに結合された第１のＤＮＡセグメントからなる融合キメラ遺伝子が創生される。

それ故に、抗体における■領域およびＣ領域をコードするｃＤＮＡならびに本発明におけるキメラ抗体を産生ずる方法は、以下の段階を含み、その概要が以下に説明される。

１、　抗ＴＮＦ抗体を産生ずる細胞系から、および重鎮定常領域と軽鎖定常領域とを与える任意選択の付加的な抗体から、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を単離し、クローニングし、ｃＤＮＡを産生ずること。

２、　Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子における適当なＶ領域遺伝子および／またはＣ領域遺伝子が、（ｉ）適当なプローブで同定され、（ｉｉ）順序良く配列され（原文：５ｅｑｕｅｎｃｅｄ）　、および（ｉｉｉｌキメラ抗体のためにその他の抗体からＣ遺伝子セグメントまたはＶ遺伝子セグメントと一致させられる。そのような精製したｍＲＮＡから全長のｃＤＮＡライブラリーを合成すること。

３、　上述されたように、クローニングされた特定のＶ領域遺伝子セグメントを、クローニングされたＣ領域遺伝子を結合することによって、完全なＨ鎖またはＣ鎖をコードする遺伝子が形成されること。

４、　ネズミ／ネズミ、ヒト／ネズミ、ヒト／ヒトまたはヒト／ネズミ抗体を産生するための原核細胞および真核細胞を含む、選択された宿主中でＬ鎖およびＨ鎖の発現と産生とが行われること。

全ての免疫グロブリンにおけるＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子、およびそれらがコードするｍＲＮＡにおける共通の特徴は、Ｊ領域である。Ｈ鎖およびＬ鎖におけるＪ領域は異なる配列を有するが、高度の配列相同性が（８０％以上の割合で）各グループの間に、特にＣ領域の近傍に、存在する。この相同性はこの方法で開発され、そして、Ｈ鎖およびＬ鎖におけるＪ領域の一致した配列が、■領域セグメントをヒトＣ領域セグメントにその後に結合するためのＪ領域に有益な制限サイトを導入するためのプライマーとして使用するための、オリゴヌクレヲチドを設計するのに使用される。

ヒト細胞から調製されたＣ領域のｃＤＮＡベクターが、サイトの指定された突然変異誘発によって修飾されて、ヒト配列中の類似の位置に制限サイトを配置することができる。たとえば、完全なヒトカッパｍｃ　（Ｃ，）領域および完全なヒトガンマ−ＩＣ６Ｉ域（ＣｇＭ＃ｍ＠−１）がクローニングされることができる。この場合、Ｃ領域ベクター源としてのゲノムＣ領域クローンを基礎にした別の方法では、介在配列を除去するのに必要な酵素が存在しないような細菌系でこれらの遺伝子が発現されられない、クローン化された■領域セグメントが切り出され、そして、ＬまたはＨ鎖Ｃ領域ベクターに連結される。また別に、ヒトｃ１１．．．．−Ｉ領域が、Ｆａｂ分子）（鎖部分をコードする遺伝子配列をそれによって発生する停止コドンを導入することにより修飾される。結合されたＶ領域およびＣ領域を有するコード配列が、原核または真核の適当な宿主中での発現のために、適当な発現ビークル中に転移される。

もしもトリブレット読み枠の改変または中断なしに結合が翻訳可能な配列となっているならば、二種のコードＤＮＡ配列が「操作的に結合された］　（原文：０ｐｅｒａｂｌｙ　目ｎｋｅｄ）と称される。もしも結合が、コード配列が発現するようにその遺伝子発現要素の適当な機能を有するならば、ＤＮＡコード配列が、遺伝子発現要素に、操作的に結合される。

発現ビークルは、プラスミドまたは他のベクターを含む、これらの中でも好ましいのは、適当な付着末端を有するいかなるｖＨまたは■、鎖配列もその中に挿入されることができるように設計された適当な制限サイトを有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ鎖配列を運ぶビークルである。ヒトＣ０またはｃＬ鎖配列含有ビークルは、どのような適当な宿主中でどのような所望の完全なＨまたはＬ鎖の発現のための中間としても、働く。

キメラ抗体、たとえばネズミ／ヒトまたはヒト／ヒトキメラ抗体が、典型的には、形成のために使用されたネズミのＨおよびＬ鎖Ｖ領域に備わっている染色体遺伝子プロモータにより駆動される遺伝子から合成されることができ、その場合通常、スプライシングが、ネズミのＪＭ城中のスプライス供与サイトとヒトＣ領域に先立つスプライス受容サイトとの間であり、ヒトＣ工領域内で発生するスプライス領域で、発生し、ポリアデニル化および転写停止がヒトコード領域の下流側にある生来の染色体サイトで起こる。

ｃＤＮＡ遺伝子の発現のために有益である遺伝子発現要素は、（１１）ウィルス性転写プロモータおよびそれらのエンハンサ−要素、たとえばＳＶ４０初期プロモータ（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、旦：　２８０　（１９８３））、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、、ＵＳＡ　ヱ旦：６７７７　（１９８２）、およびモロニーネズミ白血病ウィルスＬＴＲ（原文：Ｍｏ１ｏｎｅｙ　ｍｕｒｉ、ｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ＬＴＲ）（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４工：８８５　（１９８５））、　（ｂ）スプライス領域およびポリアデニル化サイト、たとえばＳＶ４０後期領域から得られたもの（Ｏｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、上掲書）および（ｃ）ポリアデニル化サイト、たとえばＳＶ４０中のそれ（Ｏｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、上掲書）を含む。

免疫グロブリンｃＤＮＡ遺伝子は、Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、上掲書およびＷｅｉｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　旦１　：　２１　（１９８７）に記載されたように１発現要素として、ＳＶ４０初期プロモーターおよびそのエンハンサ−、ネズミ免疫グロブリンＨ鎖プロモータエンハンサ−１ＳＶ４０後期領域ｍＲＮＡスプライシング（原文：ＳＶ４０　１ａｔｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｍＲＮＡ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、ウサギβグロブリン介在配列、免疫グロブリンおよびウサギβグロブリンポリアデニル化サイト、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化要素を使用して。

発現されることができる。部分ｃＤＮＡ、部分ゲノムｃＤＮＡ　（Ｗｈｉｔｔｌｅｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　ｌ　：４９９　（１９８７））を有する免疫グロブリン遺伝子のために、転写プロモータはヒトサイトメガロウィルスであり、プロモータエンハンサ−はサイトメガロウィルスおよびネズミ／ヒト免疫グロブリンであり、また、ｍＲＮＡスプライシングおよびポリアデニル化サイトは将来の染色体免疫グロブリン配列由来である。

一つの態様において、”Ｉ肉類細胞中のｃＤＮＡ遺伝子の発現のために、転写プロモータはウィルス性ＬＴＲ配列であり、転写プロモータエンハンサ−はマウス免疫グロブリン重鎮エンハンサ−およびウィルス性ＬＴＲエンハンサ−のいずれかまたは両方であり、スプライス領域は３１ｂｐ以上のイントロンを含有し、ならびに、ポリアデニル化領域および転写終結領域は、合成される免疫グロブリン鎖に相当する生来の染色体配列に由来される。他の態様においては、伯のタンパクをコードするｃＤＮＡ配列は、咄乳類細胞中でタンパクの発現を達成するために、上に引用された発現要素に結合される。

各融合遺伝子が発現ベクター中で組み立てられ、あるいはそれに挿入される。

キメラ免疫グロブリン鎖遺伝子産生物を発現することのできる宿主細胞が、キメラ１１または■４鎖コード遺伝子で形質移入（トランスフェクション）され、あるいは、キメラ１１鎖遺伝子およびキメラＬ鎖遺伝子で同時形質移入される。トランスフェクトされた宿主細胞が、組み込まれた遺伝子が発現するような条件下に培養され、発現した免疫グロブリン鎖または無傷の抗体またはフラグメントが培地から回収される。

一つの態様において、キメラ［１鎖またはキメラＬ鎖をコードする、またはそれらのタンパクをコードする融合遺伝子が、宿主細胞を同時形質移入するために使用される分離した発現ベクター中で組み立てられる。

各ベクターは二種の選択可能な遺伝子を含有していても良く、第１の選択可能な遺伝子は細菌系内での選択のために設計され、第２の選択可能な遺伝子は真核生物系内での選択のために設計され、いずれのベクターも相違する一対の遺伝子を有する。この方法は、細菌系内で融合遺伝子を産生し、それを増殖させるベタ時トランスフェクトされた細胞の選択をするために引き続き使用される。

細菌系内での使用のための選択可能な遺伝子の例として、アンピシリンに対する耐久性を付与する遺伝子、およびクロラムフェニコールに対する耐久性を付与する遺伝子がある。真核生物系形質移入体（原文：ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）中での使用のための好適な選択可能な遺伝子は、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（省略名は且２１）およびＴｎ５由来のトランスフェラーゼ遺伝子（省略名は旦旦旦）を含む。ｍを発現する細胞の選択は、この遺伝子によってコードされた酵素はプリンヌクレオチド合成のための基質としてキサンチンを使用するが類似の内生の酵素はそうではないという事実に基づく。（１）イノシン＃（原文：１ｎｏｓｉｎｅ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をキサンチン酸（原文：ｘａｎｔｈｉｎｅ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変換するのを遮断するマイコフェノールａ（原文：ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌ　ｉｃ　ａｃｉｄ）、および（２）キサンチンを含有する培地中で、且２１遺伝子を発現する細胞のみが生き残る。旦旦旦の産生物は、構成物質Ｇ４１８およびネオマイシンクラスの他の構成物質により、タンパク合成の阻害を遮断する。

二種の選択手法が、二種の相違するＤＮＡベクターで真核生物細胞中に導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択するために、同時にまたは連続的に使用されることができる。真核生物細胞のために、相違する選択可能なマーカーを含むことは必要ではなく、それぞれが選択可能なベクターを含有しているＨ鎖ベクターおよびＬ鎖ベクターが、同時トランスフェクトされる。適正な耐久性を有する細胞を選択した後に、大多数のクローンが、Ｈ鎖ベクターおよびＬ鎖ベクターの両方が一体となった複製を含んでいる。

また、キメラＨおよびＬ鎖をコードする融合遺伝子は、同じ発現ベクターで組み立てられることができる。

発現ベクターおよびキメラ抗体の産生のために、好適な宿主細胞系はミエローマ細胞である。ミエローマ細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によりコードされた免疫グロブリンを合成し、組み立て、そして分泌することができ、免疫グロブリンのグリコジル化のための機作を有する。特に好適な宿主細胞は、１ｇ非産産生エローマ細胞５Ｐ２１０　（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ８２８７）である、５Ｐ２１０細胞は、トランスフェクトされた遺伝子によりコードされた免疫グロブリンのみを産生ずる。ミエローマ細胞は、培地中またはマウスの腹腔中で成長することができ、そのような培地または腹腔中で、分泌された免疫グロブリンが腹水液から得られることができる。他の適当な宿主細胞は、リンパ球細胞たとえばヒトまたは非ヒト起源のＢリンパ球、ヒトまたは非ヒト起源のハイブリドーマ細胞、または種間へテロハイブリドーマ細胞を含む。

本発明のキメラ抗体の構造を運ぶ発現ベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱法、およびジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンの投与のような生物化学的手段、ならびにエレクトロポレーション、ダイレクトマイクロインジェクションおよびマイクロプロジェクティルボンバードメント（原文；ｍ１ｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１５３８　（１９８８））のようなＩｌ減的手段等の種々の好適な方法によって、適当なホスト細胞に導入される。

リンパ系細胞にはエレクトロポレーションによってＤＮＡを導入するのが好ましい（Ｐｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ旦Δ　呈上ニア１６１　（１９８４）；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、に、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ　ｎ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、ヱヱ：１１２２−１１３３）、この方法においては１組み込むＤＮＡの存在下に受容体細胞を電気パルスにさらす、一般的には、トランスフェクションの後に、細胞を完全培地中で約２４時間回復させる、次いで、選択培地の存在下に９６穴カルチヤープレートに植え付ける。Ｇ４１８セレクシヨンは、約０．４から０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて行われる、ミコフェノール酸セレクション（原文；ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は６ｕｇ／ｍｌのミコフェノール酸と約０．２５ｍｇ／ｍｌのキサンチンとを使用する。エレクトロポレーション技術は、５ｐ２１０細胞に対して約１０−’から約１Ｏ−４の割合でトランスフェクション頻度をもたらすと期待される。プロトプラスト融合法では、リゾチームは、キメラ抗体遺伝子を有する組み換えプラスミドを包含しているカタルから、細胞壁を除去する。結果として得られるスフェロプラストは、ポリエチレングリコールでミエローマ細胞と融合される。

本発明の免疫グロブリン遺伝子は、哺乳動物の非リンパ系細胞中、酵母のような他の真核細胞中、原核細胞中または特定のバクテリア中で、発現し得る。

免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖を製造するという点で、酵母はバクテリアよりかなり有用である。酵母は、糖鎖形成を含む翻訳後のペプチド修飾を行う、今日では、強力なプロモーター配列と、酵母中で所望の蛋白を生産するために用いることのできる高複製数のプラスミドとを使用するＤＮＡ組換え方法が多数存在している。酵母は哺乳動物のクローン遺伝子生産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を生じさせるペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する（Ｈｉｔｚｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１３−１７．１９８２）。

酵母の遺伝子発現システムを用いると、キメラＨ鎖およびＬ鎖蛋白、ならびに組み込まれたマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域の製造、分泌および安定性の程度を評価することができる。酵母がグルコースに富んだ培地で培養されたときに大量に生産される解糖酵素をコードする活性発現遺伝子から、プロモーターと終結要素とを組み込むという遺伝子発現システムの酵母であれば、いかなるシリーズのものも使用することができる。公知の解糖遺伝子も非常に効率的な転写調節信号を与えることができる０例えば、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネータ−信号を利用することができる。酵母中でクローン免疫グロブリンｃＤＮＡを発現するのに最適な発現プラスミドを評価するにあたっては数多（の取り組みがなされている（Ｇｌｏｖｅｒ、Ｄ、Ｍ、、ｅｄ、、ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｖｏｌ、　ＩＩ、　ｐｐ４５−６６、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５を見よ）。

細菌株も、本発明で記述する抗体分子または抗体フラグメントの製造のホストとして使用することができる。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）のようなＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株、サルモネラ　ティフィムリウム（原文；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）もしくはセラティア　マルセシエンス（原文；５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような他のエンテロバクテリ乙および様々なシュードモナス（原文；　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を用いることができる。

宿主細胞と適合性のある種から得られるレプリコンおよびコントロール配列を有するプラスミドベクターは、これらの細菌性宿主と関連して使用することができる。該ベクターは、トランスフオームされた細胞中で表現型の選択を提供することのできる特定の遺伝子は勿論のこと、複製部位も運ぶことができる。マウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域の産生、または細菌中でクローンされた免疫グロブリンｃＤＮＡによってコードされた抗体鎖の産主に関して１発現プラスミドを評価する数多くの試みがなされている（Ｇｌｏｖｅｒ、Ｄ、Ｍ、。

ｅｄ、、　ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｖｏｌ、　１．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５を見よ）。

好ましい宿主は、生体内で（原文；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）もしくは生体外で（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）で成長した哺乳動物の細胞である。＋＊乳動物の細胞は、免疫グロブリン蛋白分子に対して、翻訳後に、リーダーペプチドの除去、Ｈ鎖およびＬ鎖の折り畳みと組立、抗体分子の糖鎖形成および機能性抗体蛋白の分泌等の修飾を行う。

上記のリンパ球系起源の細胞に加えて、抗体蛋白を製造するための宿主として有用な哺乳動物の細胞は、へ口（原文；Ｖｅｒｏ）（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１）またはＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　６１）（７）ような繊維芽細胞起源の細胞を含む。

哺乳動物の細胞では、クローンされたＨおよびＬ鎖の発現に多くのベクター系を使用することができる（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、、　ｅｄ、、ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｖｏｌ、　ＩＩ、　ｐｐ＋４３−２３８．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５を見よ）、引き続いて異なる方法を行うことにより、完全なＨａＬ、抗体を得ることができる。上で議論したように、同じ細胞内で、Ｈ鎖とＬ鎖とを共発現させて、Ｈ鎖とＬ鎖との細胞内会合および結合から完全な四量体のＨ２Ｌ２抗体を達成することができる。該共発現は、同じ宿主内で、同じもしくは異なるプラスミドを使用することによって起こすことができる。Ｈ鎖とＬ鎖との両方の遺伝子は同じプラスミドに入れることができ、次いで該プラスミドを細胞にトランスフェクトし、それによって、両鏡を発現する細胞を直接的に選択する。他の方法としては、片方の鎖１例えばＬ鎖をコードしたプラスミドで細胞を最初にトランスフェクトし、次いで、得られた細胞系を第２の選択可能なマーカーを有するＨ鎖プラスミドでトランスフェクトする。いずれかの方法によってＨ２Ｌ、分子を製造する細胞系は、さらに他の選択マーカーと接続したＨ鎖、Ｌ鎖および■プラスＬ鎖の複製をコードするプラスミドでトランスフェクトされて、組み立てられたＨａＬ、＊抗体分子の生産が高度化する。もしくはトランスフェクトされた細胞系の安定性が増すなどの、優れた特性を有する細胞系を産生ずる。

モノクローナルまたはキメラ抗ＴＮＦ抗体に加えて、本発明は、本願の抗ＴＮＦ抗体に特異的な抗イデイオタイプ（以下、「抗ＩｄＪと略すことがある）抗体にも関するものである。一般に、抗Ｉｄ抗体は、他の抗体の抗原結合領域に関連する特有の決定基を認識する抗体である。ＴＮＦに特有の抗体が、イディオタイプあるいはＩｄ抗体と名付けられる。抗Ｉｄは、同種および遺伝子型が同じである（例えば、マウス菌株）動物をＩｄ抗体源とし、該動物をＩｄ抗体もしくはその抗原結合領域で免疫感作することによって調製することができる。免疫感作された動物は、その動物を免疫感作した抗体のイディオタイプ決定基を認識して反応し、抗１ｄ抗体を製造する。該抗Ｉｄ抗体はさらに他の動物に免疫反応を起こさせ、抗−抗１ｄ抗体を製造させる「免疫原」としても用いることができる。抗− 抗１ｄは、その抗原決定基が前記抗１ｄを誘起した元々の抗体と全（同じである可能性がある。このようにｍＡｂのイディオタイプ決定基への抗体を用いることによって、特異性が全く同じである抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。

したがって、本発明のＴＮＦに抗して生成したｍＡｂＳは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのような適切な動物内において、抗Ｉｄ抗体を誘起するのに用いることができる。免疫感作されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ等のマウスから取り出した神職細胞は、抗１ｄｍＡｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを製造するのに使用することができる。

さらに、得られた抗１ｄｍＡｂをキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアと結び付けることもできるし、さらに他のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作するのに用いることもできる。これらのマウスから取り出した血清は、あるＴＮＦエビ１−−ブに特異的な元のｍＡ、ｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含んでいるであろう。

本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、抗ＴＮＦ抗体、特にＴＮＦと反応する物質が正常で８１ＦＭな人に存するレベルを越える量で存在することに関連する疾患あるいは状態を有する患者の治療に有益である。上記の疾患としては、悪液質、循環虚脱および急性あるいは慢性の細菌感染に起因するショックを含む敗血症候群：細菌性、ヴイールス性および菌性の急性および慢性の寄生虫もしくは感染性の経過（原文；　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）；全身系の紅斑性根そうおよびリウマチ様関節炎のような急性および慢性の免疫および自己免疫疾患；アルコール誘導杆？ｊ！：サイコイドーシスおよびクローン病のような慢性炎症性疾患；播種性血管向凝固症のよな血管炎症性疾患；移植片対宿主病：川崎病：およびＴＮＦ−分泌性ｌｔＩＩｍに関わる悪性病等を挙げることができるが、これらには限定されない。

前記治療は、抗体、フラグメントおよび誘導体の一回分または複数回分を非経口的に投与することからなる。人体用の薬剤に使用するものとして好適であるものは、本発明の、高度の親和性があるｈＴＮＦα−阻害型および／または中和型のマウスとのキメラの抗体、フラグメントおよび領域である。

モノクローナル抗体は、哺乳動物の体内の薬剤が作用すべき位置に効力のある薬剤が届（ような方法であれば、いかなる方法で投与されてもよい０本発明の抗体の場合は、モノサイトとマクロファージとから放出されるＴＮＦに到達して該ＴＮＦと結合することができるということが重要である。蛋白は、経口で投与されると消化されやすいので、静脈注射、皮下注射および筋肉注射などの非経口投与が、通常、吸収を最大限にするために用いられる。

モノクローナル抗体は個別の治療薬剤として投与されてもよいし、他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。モノクローナル抗体は単独で投与することもできるが、通常は、投与のルートと標準的な準則投与のプラクティスとに基づいて選択された薬学的キャリアと共に投与される。

言うまでもなく、投与量は、この薬剤の薬力学的性質、投与の型およびルート：患者の年齢、健康状態および体重；ならびに、症状の性質と程度、同時に行う処置の種類、処置の頻度および望まれる効果などの公知の因子に応じて変化することになる。一般的には、有効成分の一日の投与量は、体重１キログラム当たり約０．１から１００ミリグラムである。−日に体重１キログラムに対して、通常、０．５から５０ミリグラム、好ましくは１から１０ミリグラムを、１回から６回に分け、あるいは持続的放出の形態で投与すると、望ましい結果を得るのに効果的である。

体内投与に適した投薬剤（投与組成物）は、一般的に、ｍ位置たり約１ミリグラムから約５００ミリグラムの有効成分を含有するものである。これら薬剤組成物においては、有効成分は、通常、組成物の全重量に対して０．５〜９５重量％の量で存在することになる。

非経口投与用に、前記抗体は、薬剤として適用し得る非経口ビヒクルと共に、溶液、懸濁液、エマルジョンあるいは凍結乾燥粉末として製剤することができる、前記ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストローゼ溶液および５％のヒトの血清アルブミンを挙げることができる。リポソームや固定オイルのような非水性ビヒクルも使用することができる。ビヒクルあるいは凍結乾燥粉末は等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、緩衝液および防腐剤）を維持するための添加剤を含んでもよい、得られた製剤を通常使用されている方法によって滅菌する。

好適な薬剤キャリアは、この分野において標準的な参照文献であるＡ、０ｓ０１著の［レミントンズ　ファーマス−ティカル　サイエンス（原文；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ａ。

０ｓｏｌ）Ｊの最新版に記載されている。

例えば、注射による投与に好適なある非経口組成物は、０．９％の塩化ナトリウム溶液に１．５重量％の有効成分を溶解して調製する。

本発明の抗体は、表面にＴＮＦが結合した細胞に対する抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を媒介する（ｍｅｄｉａｔｅ）作用を有するので、効力ある治療薬として好適である。上記作用には、エフェクター細胞の内性源（原文；ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　５ｏｕｒｃｅ）または外性源（原文；ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　５ｏｕｒｃｅ）のいずれか（ＡＤＣＣに対する）、あるいは、補体成分（ＣＤＣに対して）を利用することができる。本発明のマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域、それらのフラグメントおよび誘導体は、免疫接合体として治療に用いることができる（Ｄｉｌｍａｎ、Ｒ，Ｏ，、Ａｎｎ、　Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、　１１１：５９２−６０３　（１９８９）を参即）。本発明のマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域、それらのフラグメントおよび誘導体は、リチン−Ａ、シュードモナストキシン、ジフテリアトキシンおよびＴＮＦ等の（限定はされない）細胞毒蛋白と結び付けることができる。抗体または他の配位子に接合した毒は、この分野では公知である（例えば、０１ｓｎｅｓ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌエーエ立亘旦Ｌ　皿：２９１−２９５　（１９８９）を参照）。植物および細菌の毒は、一般に、蛋白合成ＷＡ横を破壊するものである。

本発明の抗体は、放射性核種、細胞毒性剤および薬剤を含む（限定はされない）その他の型の治療薬と接合させることができる。抗体と結合することができ、生体外での抗原の位置に送ることのできるｌｉ！ｌ射性核種の例としては、””Ｂｉ、＋３１Ｔ、１１１１１Ｒｅおよび”Ｙを挙げることができるが、これらは完全に研究されたものではない。放射線治療の技術分野で知られていることであるが、放射性核種は細胞に局部的に細胞毒の照射を行い様々な細胞内外傷をもたらすことによって、細胞毒性効果を作用させる。

抗体と接合して、次いで生体外でで治療に用いることのできる薬剤としては、ダウノルビシン（原文；ｄａｕｎｏｒｕｂｔｃｉｎ）、ドクソルビシン（原文；ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキセート（原文；ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびマイトマイシンＣ（原文；Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。細胞毒性薬剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白の合成を含む細胞の重要なプロセスを阻害する。この分野で知られているこのクラスの薬剤のより完全な説明と作用のメカニズムとに関しては、Ｇ。

ｏｄｍａｎ、Ａ、Ｇ、、ｅｊ　ａｌ、、Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉ１ｍａｎ ’　ｓ　ＴＨＥ　ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＮＡＬ　ＢＡＳＩＳ　ＯＦ　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ３，７ｔｈ　Ｅｄ、、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　１９８５を参照。

本発明の抗体は、他のモノクローナルまたはマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域、または、リンフ才力インまたは造血成長因子などと結び付けると、効果的に使用することができる。このように結び付けることにより、抗体と相互作用するエフェクター細胞の活性または数を増加させることができる。

本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体は、ＴＮＦの好ましくない副作用を妨げるために、ＴＮＦによる治療と組み合わせて使用してもよい。癌治療の最近のアプローチは、癌患者へのＴＮＦの直接投与、または癌患者へのリンフ才力イン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｗ」恒Ｌ−Ｌ−均担、現ユニ１４８５−１４９２　（１９８５）　）も０　（１９８６）；　Ｋｒａｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２４ニア６−８５　（１９８７）；　Ｋｒａｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、工ｒａｎｓ　１ａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、２０：３３６−３３８　（１９８８））による免疫治療等である。現在、修飾されたＬＡＫ細胞もしくはＴＮＦ遺伝子でトランスフェクトされて多量のＴＮＦを産するようになったＴＩＬを使用した実験が進行中である。このような治療法は、ＴＮＦの上記の多面的な作用によって引き起こされる数多くの望ましくない副作用を伴いがちである。本発明によると、ＴＮＦを受容するものあるいは多量のＴＩＬを製造する細胞を、本発明の抗体、フラグメントもしくは誘導体で同時に処理することにより、このような副作用を低下させることができる。効果的な投与量は上で述べた通りである。ＴＮＦの主要な抗腫瘍効果を損ねることなく副作用をブロックするためには、投与されるＴＮＦやＴＮＦを産する細胞の投与量に応じて投与量レベルを調整する必要がある。当業者であれば不要な実験をすることなく、そのような投与量を決定する方法を知っている。

固体の担体に付着した本発明のマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域、またはそれらのフラグメントまたは誘導体は、液体または組織抽出物もしくは細胞抽出物からＴＮＦを取り除くのに用いることができる。好ましい態様では、上記のものは血液あるいは血漿生成物からＴＮＦを除去するのに用いられる。

他の好ましい態様では、マウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、体外の免疫吸着装置で有効に利用される。このことは当該技術分野では知られていることである（例えば、Ｓｅｍユｎａｒｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏ　、Ｖｏｌ、２６　（２５ｕｐｐ１．　ｔ）　（１９８９）を参照）、患者の血液あるいは他の被験者の液体を抗体の付着した担体に曝すと、循環するＴＮＦ（遊離であるかもしくは免疫複合体中にある）は部分的あるいは完全に除去され、次いで、ＴＮＦを除去された液体は体内に戻される。この免疫吸収は２細胞の遠心分離ステップを伴っであるいは伴わないで、持続漬方式で実施することができる、例えば、Ｔｅｒｍａｎ、Ｄ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　上エヱ：１９７１−１９７５　（１９７６）を参照。

本発明は、以下に述べるように、検出用に標識された上記抗体、フラグメントおよび誘導体をも提供する。これらはＴＮＦαが介在する病気であることがわかっている、あるいは、疑われている患者のＴＮＦαを検出する診断方法に使用することができる。

本発明の抗体は、試料中のＴＮＦもしくは抗ＴＮＦ抗体を検出あるいは定量する免疫検定に有効である。ＴＮＦの免疫検定は、一般に、選択的にＴＮＦに結合することのできる横出用に標識された本発明の高親和性抗体の存在下で生物試料を保温し、試料に結びついた標識された抗体を検出することからなる。様々な臨床的免疫検定の−ｆ４ａ４１上匹匹旦ユ旦旦旦旦旦り旦−王立ｒｔ互旦一旦旦二旦。

Ａ、Ｖｏｌｌｅｒ　ｅｔ、ａｌ、、ｅｄｓ、、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰａｒｋ、　１９８１に記載されている。

したがって、本発明のこの面においては、細胞、細胞粒子または可溶蛋白を固定しくｌるニトロセルロースまたは他の固体担体に、抗体もしくは生物試料を添加する。該担体は適当な緩衝液で洗浄され、次いで、検出用に標識されたＴＮＦに特異的な抗体で処理される。結合していない抗体を除去するために、固相担体は緩衝液で二度目の洗浄を受ける。前記固体担体に結合した標識の量は従来の手段で検出される。

「固相担体」あるいは「キャリア」という言葉は、抗原あるいは抗体を結合し得るあらゆる担体を示すものである。よ（知られている担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。本発明の目的を考慮すると、キャリアの性質はある程度可溶か不溶性のものである。結合した分子がＴＮＦあるいは抗ＴＮＦ抗体に結合し得る限り、担体材料は実質的にあらゆる実在する構造的形状を有するものであってよい、したがって、担体の形状は、ビーズのような球形、試験管の内面あるいは棒の外面のような円筒状のものであってもよい。あるいは、その表面がシートやテストストリップ等のような平面状でもよい、好ましい担体はポリスチレンビーズを含む、当業者であれば、抗体もしくは抗原を結合させるのに適当な他の多くのキャリアを知っているか、または、ルーチン試験によって抗体もしくは抗原を結合させるのに適当な他の多くのキャリアを確認することができる。

抗ＴＮＦ抗体の任意のロフトの結合活性は、公知の方法に従って決定することができる。当業者はルーチン試験によって有効で最適な分析条件を各分析について決定することができる。

ＴＮＦ特異性抗体を検出用に標識することのできる方法の１つは、該抗体を酵素に結合させることによるものであり、酵素免疫分析（Ｅ　Ｉ　Ａ）もしくは酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）で用いられているものである。引き続いて該酵素をその基質に曝すと、該酵素は基質と反応して、例えば、分光光度分析的手段、蛍光光度分析的手段もしくは視覚的手段によって検出することのできる化学的部分を発生する。本発明のＴＮＦに特異的な抗体を検出用に標識するのに使用することのできる酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５ −ステロイド異性化酵素、アルコール酵母脱水素酵素、α−グリセリンリン酸脱水素酵素、リン酸トリオース異性化酵素、ホースラディツシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β −ガラクトシダーゼ、ＲＮＡ分解酵素、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６ −ホスフアーゼ脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ等であるが、これらに限定されない。

ＴＮＦ特異性抗体を放射能を用いて標識することにより、放射性同位元素標識免疫測定（ＲＩ　Ａ）の使用を通じてＴＮＦを検出することができる（例えば、Ｗｏｒｋ、Ｔ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｔｅｃｈｎｉｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ１旦土旦且り、Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ、Ｙ、　（１９７８）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターもしくはシンチレーション計数計を使用する手段によって、またはオートラジオグラフ法によって検出することができる。本願の目的に特に有用なアイソトープは”Ｈｌ　１２″Ｎ、　１３１１．３ｓＳおよび１４Ｃであり、ｆ＋Ｐｔ、Ｌ＜は”’Ｉである。

蛍光化合物でＴＮＦ特異性抗体に標識を付けることも可能である。蛍光性の標識が付いた抗体が適当な波長の光に曝されると、その存在を蛍光によって検出することができる。最も一般的に使用される蛍光性ラベリング化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、藻紅素、藻青紫、アロフィコシアニン（原文；ａｌ　１ｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ｏ−フタルデヒド（原文；ｏ− ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレスカミン（原文；　ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ３がある。

ｉ？１記ＴＮＦ特異性抗体は、　””Ｅｕや他のランタニド元素のような蛍光発光金属を用いて検出可能に標識を付けることもできる。これらの金属はジエチレントリアミンペンタ酸ｆｉｌ　（ＤＰＴＡ）もしくはエチレンジアミン−テトラ酢ｍ　（ＥＤＴＡ）などの金属をキレート化する化合物を用いてＴＮＦ特異性抗体に付着させることができる。

ＴＮＦ特異性抗体は、化学発光をする化合物に結合させることによって、検出可能に標識することもできる。化学発光によって標識された抗体の存在は、化学反応の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光ラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチイックアクリディニウムエステル（原文；ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ　ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒ）　、イミダゾール、アクリディニウム塩およびオキサレートエステルである。

同様に、生物発光化合物も本発明のＴＮＦ特異性抗体、フラグメントおよび誘導体に標識を付けるのに使用することができる。生物発光は、触媒蛋白が化学発光反応の効率を増加させる生物系で発見された化学発光の一種である。生物発光蛋白の存在は発光の存在を検出することによって決定される。標識を付けるという目的に対して重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

ＴＮＦ特異性抗体、フラグメントまたは誘導体の検出は、例えば検出可能な標識がγ線放射体である場合はシンチレーション計数計が、例えば標識が蛍光性のものである場合は蛍光光度計が必要である。酵素標識の場合は、検出には、該酵素用の基質を使用する比色法が必要である。比色法による検出では、同様に調製された基準と比較して基質の酵素反応の程度を視覚的に比較ことも必要である。

本発明の目的に対しては、上記分析で検出されたＴＮＦが生物試料中に存在しても良い。試料とし工は、ＴＮＦを含有するあらゆるものを使用することができる。好ましくは、試料は、例えば血液、血清、リンパ、尿、炎症性滲出液、髄液、羊水、組織の抽出物もしくはホモジェネートなどの生物液体である。しカルながら、本発明はこれらの試料のみを使用した分析に限定されない。当業者には他の試料を使用するのに適した条件を定めることができる。

生体内原位置の検査は、患者から組ｌｌケ本を切除し、その標本に本発明の標識の付いた抗体を結合させることによってなされる０本発明においては、標識の付いた抗体（もしくはフラグメント）を生物試料に塗布またはかぶせるのが好ましい。そのようにすることで、ＴＮＦの存在だけではなく、被検組織中のＴＮＦの分布も決定することができる。本発明を利用して、多岐に渡る組織学的方法（染色法などの）のいかなるものも上記生体内原位置の検査を行うのに適宜変更し得ることを、当業者は理解するであろう。

本発明の抗体、フラグメントもしくは誘導体は、「ツーサイト（原文；　ｔｗ。

−５ｉｔｅ）Ｊまたは「サンドウィッチ（原文；ｓａｎｄｗｉｃｈ）Ｊ分析としても知られている免疫測定分析において利用することができる。典型的な免疫測定分析においては、多量の標識されていない抗体（あるいは抗体のフラグメント）は被検液体に不溶の固体担体に結合しており、検出用に標識されている一定量の可溶抗体が固相の抗体、抗原および標識された抗体で形成された三元複合体の検出および／または定量なすべく添加される。

一般的で好ましい免疫測定分析の１つとして、同相と抗体ＴＮＦとの二元複合体の形成による試料からＴＮＦを抽出するために、前記固相に結合している抗体を最初に被検試料に接触させる［フォワード（原文；　ｆｏｒｗａｒｄ）Ｊ分析を挙げることができる。該分析においては、適当な時間保温した後に、固体担体は、もし存在すれば未反応ＴＮＦを含有する液体試料の残さを除去するために洗浄され１次いで、公知の量の！識された抗体（「レポーター分子」として機能する）を含有する溶液と接触させられる。標識されていない抗体を通して固体担体に結合しているＴＮＦと標識された抗体との複合体を形成するための２度目の保温を経て、未反応の標識された抗体を除去するために、固体担体は２度目の洗浄を受ける。このタイプの［フォワードサンドウィッチ（原文；ｆｏｒｗａｒｄ　ｓａｎｄｗｉｃｈ）Ｊは、ＴＮＦが存在するがどうかを決定する単純な［イエス／ノーＪ分析か、予めわかっている量のＴＮＦを含有している標準試料について得られた測定値と？！ｊ識された抗体の測定値とを比較することによって定量的になされるものである。このような「ツーサイト（原文；　ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）Ｊまたは［サンドウィッチ（原文；ｓａｎｄｗｉｃｈ）Ｊ分析については、Ｗｉｄｅが論文を書いている（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａ　Ｍｅｔｈｏｄ、Ｋｉｒｋｈａｍ、ｅｄ、、Ｅ、＆　Ｓ、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、　１９７０．　ｐｐ、　１９９−２０６）。

他のタイプの［サンドウィッチ（原文；　ｓａｎｄｗｉｃｈ）Ｊ分析であって、やはりＴＮＦに関して有用であるものは、いわゆる「同時（原文；ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）Ｊ分析と［リバース（原文；　ｒｅｖｅｒｓｅ）Ｊ分析である。

同時分析は保温ステップが１段であり、そのステップでは、固体担体に結合した抗体と標識が付いた抗体との両方を同時に被検試料に添加する。保温が終了すると、固体担体は液体試料の残渣と複合体を形成していない標識の付いた抗体とを除去するために洗浄される。固体担体と結合した標識の付いた抗体の存在は、従来の「フォワード」サンドウィッチ（原文；”ｆｏｒｗａｒｄ″　ｓａｎｄｗｉｃｈ）分析と同様にして決定される。

［リバース（原文；ｒｅｖｅｒｓｅ）Ｊ分析においては、最初に標識の付いた抗体の溶液を流体試料に段階的に添加し、次いで、適当な保温時間を経た後に、固体担体に結合した標識の付いていない抗体を添加する、という方法が使用される。２度目の保温の後に、被検試料の残渣と未反応の標識が付いた溶液とを除去するために従来法で同相を洗浄する。固体担体に結合した標識の付いた抗体の測定は「同時（原文；ｓｉｍｕｌ　ｔａｎｅｏｕｓ）Ｊ分析および「フォワード（原文；　ｆｏｒｗａｒｄ）Ｊ分析と同様に行う、−態様として、個々のエピトープに特異的な本発明の抗体を組み合わせによって、感度の良い３サイト（原文：ｔｈｒｅｅ−ｓｉｔｅ）免疫放射測定分析を構成することができる。

今まで一般的に発明を記述してきたが、説明の為のみに本願に含まれ、そうでない旨の記載がない限り本発明を限定することのない具体的な実施例を参照することによって、本発明はさらに理解されるであろう。

実施医１マウス抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗　のＴＮＦモノクローナル抗体の臨床研究を容易にするために、Ａ２と呼ばれる、阻害および／または中和能のある高親和性のマウス抗ヒトＴＮＦ免疫グロブリンＧｌモノクローナル抗体が生産された。

１０週齢のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌マウスは、ジャクソン・ラボラトリ−社（バー・ハーバ−）から得られた。　０．４ｒｒ＋Ｊ２中に完全フロイント・アジュバント（ディフコ・ラボラトリーズ社から得られた）の４０μｇと共に乳剤化される、精製されたＥ、ｃｏｌｉ由来組換えヒトＴＮＦの４０μｇが、マウスの皮下および腹腔（以下、ｉ、ｐ、と称することがある。）に注射された。−週間後、アジュバントを含まないＴＮＦの１０ｕｇが連続４回腹腔に注射された後、不完全フロイント・アジュバント中に含まれるｒｈＴＮＦの５ｕｇが腹腔に注射された。最後の注射から８週間後、マウスは、ＴＮＦのＩＯμｇで腹腔に追加免疫された。

４日後、マウスは犠牲にされ、その肺臓が得られ、牌細胞の懸濁液が調製された。牌細胞は、３０％ポリエチレングリコール、ＰＥＧ１４５０の０．３ｍｇ中で、非分泌性ハイブリドーマの細胞である５ｐ２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と、牌細胞と５ｐ２１０との比が４：１で融合された。３７℃で６時間の培養後、融合細胞は、２Ｘ１０’個の５ｐ２１０細胞／ウエルの濃度で、９６穴プレート中に０．２ｍεのアリクオツドに配分された。５Ｘ１０’個の正常ＢＡＬＢ　／　ｃ牌細胞が、各ウェルに添加された。

使用される増殖培地は、熱不活性化された１０％の子ウシ血清（ヒフローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社）、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのし一グルタミン、１００Ｕ／ｒｒ＋１２のペニシリン、１１００ｕ／ｍＱのストレプトマイシン（ギブコ・ラボラトリーズ社）、および選択のためのヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン（以下、ＨＡＴと称することがある。）（ベーリンガー・マンハイム社）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地からなる。

同相ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと称することがある。）は、ｒｈＴＮＦαに特異的なモノクローナル抗体の存在する上清をスクリーニングするのに用いられた。このアッセイについては、以下の実験２において詳述される。このアッセイにおける結合のバックグラウンドは、約５００ｃｐｍであった。上清は、２０００ｃｐｍ以上の結合を生じたならば陽性とみなされた。

スクリーンされた３２２の上清の内の２５が、ＲＩＡにより陽性を示した。これら２５の内、結合の値が最高（４８００ｃｐｍ）であった１つは、Ａ２と名付けられた。陽性を示すウェルは、添加されたマウス細胞に限界希釈された状態でサブクローンされた。中和アッセイにおける前記上清の更なる分析に関して、Ａ２は、阻害および／または中和活性を示す唯一の陽性クローンとして発見された。

このように、ハイブリドーマ系Ａ２が選択された。この系は、１０％の子ウシ血清（ギブコ・ラボラトリーズ社）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、ｔｏｏｌ／ｍεのペニシリン、および１１００ｕ／ｍＩ２のストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中に保存された。

ＴＮＦの生物活性を阻害する抗ＴＮＦ抗体は、上述したように、ｒＴＮＦタンパクの代わりに用いられる、ＴＮＦ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、ｌの）の８７〜１０８のアミノ酸残基あるいは５９〜８０および８７〜１０８の両アミノ酸残基、あるいはその中に含まれるペプチド結合の組合せにおける、少なくとも５つのアミノ酸を含むペプチドへの結合によって１選択的にスクリーニングされ得る。

実施層重１この発　における几ＴＮＦ　の εの濃度に希釈され、この溶液の０．１ｍεが各アッセイウェルに添加された。

４℃で一昼夜培養した後、各ウェルは、ＢＣＢで簡単に洗浄され、それから３７ ℃で１時間、ＢＣＢ中の１％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと称することがある。）でシールされた。各ウェルは、それから０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳ　（以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと称することがある。）で３回洗浄され、希釈されたＡ２腹水の７０μｅが、各ウェルに添加された。各ウェルは、３７℃で２時間培養され、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄された。その後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎの５０μβ中に含まれる、　１５Ｉで標識された、ヒツジ抗マウスＩｇ抗体のＦ　（ａｂ’　）　２フラグメントのおよそ５０．０００ｃｐｍが、各ウェルに添加され、各ウェルは、更に３７℃で２時間培養された、各ウェルは、各々ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄され、切り離され、計数された。２つの測定の結果が図１に示されている。

ＰＢＳに含まれる５μｇ／ｍβのｒｈＴＮＦは、６０’Ｃで加熱された６種々の時点における加熱処理されたＴＮＦ試料のアリクオツドが、迅速に４℃に冷却され、ＢＣＢ中で５倍に希釈され、ＲＩＡマイクロプレートウェルをコートするのに使用された。ＲＩＡは、上述した通りに行われた。２つの測定の結果が図２に示されている。６０℃での培養は、ｈＴＮＦαの生物活性を実質上低下させたので、この実験は、Ａ２モノクローナル抗体は熱不活性化ヒトＴＮＦαには結合できないことを示している。

Ｂ−史肋第信ゴＡ２およびｃＡ２の試料は、プロティンＡ・アフィニティー・クロマトグラフィーにより、Ｃ１３４Ａ、Ｃ１６８Δ（上述）とそれぞれ呼ばれる細胞系のハイブリドーマ組織培養上清から精製され、ｐＨ７，２のリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称することがある。）でダイアフィルトレージョンされた。

一定の腫瘍細胞系におけるＴＮＦの細胞障害作用は、実験試料および生体液中における１旦　ｖｉｔｒｏでのＴＮＦレベルと適合する。ＴＮＦ感受性標的細胞Ａ６３７　（ヒト横絞筋腫細胞系）を用いる、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３：３５１７−３５２３　（１９８９）に記載のＡｄｅｒｋａ　ｅｔ　ａｌ、により改良された、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、土旦旦：　６３５−６４０　（１９８７）に記載のＦｅｉｎｍａｎ　ｅｔ、ａｌ、のアッセイ法は、ＴＮＦの細胞障害作用を阻害あるいは中和するＡ２の能力を研究するのに用いられた。

培養されたヒトＡ　６７３／６細胞は、３９℃で一昼夜、２０ｔｉｇ／ｍβのシクロへキシミドの存在下、種々の濃度のモノクローナル抗体Ａ２と、ナチュラル（原文；ｎａｔｕｒａｌ）のヒトＴＮＦα（ジエンザイム社、ボストン、ＭＡ）あるいは組換えヒトＴＮＦα（サントリー（株）、大阪、日本）の４０ｐｇ／ｍ βと共に培養された。対照には、各ウェルにおいて、培地のみ、あるいは培地とＴＮＦとを含有するものを用いた。細胞の死は、ナフトール・ブルー・ブラックで染色することにより測定され、その結果が、６３０ｎｍの波長で光学的に測定された。この波長での吸光度は、現存する生細胞数と相関する。

線量依存法において、Ａ２は、天然および組換えヒトＴＮＦの両方の細胞障害作用を阻害あるいは中和したことがわかった（図３）。

他の実験において、この阻害および／または中和活性の特異性が試験された。

Ａ６７３／６細胞は、ＴＮＦのバイオアッセイの前に、３Ｘ１０’細胞／ウエルの割合で２０時間種培養された。ｒｈＴＮＦ、旦、ｃｏｌｉ由来組換えヒドリンホトキシン（ＴＮＦβ）、および旦、ｃｏｌｉ由来組換えネズミＴＮＦの２倍系列希釈液が、調製された。Ａ２ハイブリドーマ上漬は、希釈されたＴＮＦ試料液に等鳳添加され、その混合物は室温で３０分間インキュベートされた。０．１ｍ２のアリクオツドは、Ａ６７３／６細胞を含むウェルに移され、シクロへキシミドの２０μｇ／ｍ℃が添加され、細胞は３９℃で一昼夜培養された。細胞は、それから固定され、細胞障害作用の評価のために染色された。結果は、Ａ２モノクローナル抗体は、ヒドリンホトキシン（ＴＮＦβ）（図４）あるいはネズミＴＮＦ（図５）に作用しないが、ｒｈＴＮＦの細胞障害作用を特異的に阻害あるいは中和したことを示している。

次に、Ａ２モノクローナル抗体の非ヒト霊長類由来のＴＮＦとの交叉反応性を分析するため、実験が行われた。Ｂ５１４　（ヒヒ）、Ｉ９１（カニクイザル）。

およびＲＨ３８３（アカゲザル）の血液からフィコール比重差遠心により分離された単球は、ＴＮＦ生産を誘導するため、３７℃で３時間あるいは１６時間、５％ＦＢＳおよび２Ｊｉｇ／ｍＱの旦、ｃｏｌ　１ＬＰＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地中で、ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞／ウェルの割合で培養された。同じウェルからの各上清は、上述のＡ６７３／６細胞を用いるＴＮＦのバイオアッセイが行われるまで、４℃で２０時間未満、貯蔵された。培養上清の２倍希釈液は、１μｇ　／　ｍ　Ｉ２の最終濃度で、培地あるいは精製されたＡ２モノクローナル抗体のいずれかと共に混合され、室温で３０分間インキュベートされ、そして、アリクオツドは、指示細胞に移された。結果としては、Ａ２モノクローナル抗体は、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルの単球により生産されるＴＮＦの細胞障害作用を阻害あるいは中和していなかった。

更なる実験は、チンパンジーＴＮＦを用いて行われた。ＣＨ３６３（チンパンジー）の血液から分離された単球は、上述のように、ＴＮＦを含有する上清を生成するために培養された。これらの上演の生物活性を阻害あるいは中和するＡ２モノクローナル抗体の１０μｇ／ｍβの能力は、上記のようにアッセイされた。

ヒトＴＮＦは、ポジティブ・コントロールとして使用された０図６に示されるように、結果としては、Ａ２モノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦに対する活性能（図７）に類似した、チンパンジーＴＮＦに対する阻害および／または中和活性能を有していた。

Ａ２モノクローナル抗体の阻害および／または中和活性は、ＴＮＦ−１，７ＮＦ −２およびＴＮＦ−３と名付けられたヒトＴＮＦに特異的な他の３つのネズミモノクローナル抗体、およびコントロール用モノクローナル抗体と比較された。

精製されたモノクローナル抗体の２倍系列希釈液は、ｒｈＴＮＦ　（４０ｐｇ／ｍｉ）と共に混合され、室温で３０分間インキュベートされ、そして、アリクオツドは、上述のように゛ｒＮＦ生物活性について試験された。ＴＮＦ−１、ＴＮＦ−２、およびＴＮＦ−３の各モノクローナル抗体は、類似した適度の阻害および／または中和活性を有していたことがわかった。対照的に、Ａ２モノクローナル抗体は、より高い阻害および／または中和活性能を有していた。

実廊伊巳」」− 冗　のＶおよびＣ遺伝　をクローニングするための−　・な　法上述の抗ＴＮＦ抗体を分泌するＡ２ハイブリドーマからのＨ鎖およびし鎖遺伝子についての■領域をクローニングするための方法は、機能的に再編成される（および発現される）１ｇ遺伝子についての、■領域および対応するＪ領域間のゲノムにおける連結に基づいて行われた。Ｊ（結合）領域のＤＮＡプローブは、Ｊ領域にリンクされるＤＮＡを分離するため、ゲノム・ライブラリーをスクリーンするのに用いられた。生殖細胞系の配列における（すなわち、未再編成された）ＤＮＡは、Ｊプローブにハイブリッド化するにもかかわらず、このＤＮＡは、ＩｇのＶ領域のシーフェンスにリンクせず、分離されたクローンの制限酵素分析により同定され得る。

ここで用いられるクローニング法は、Ｊ□およびＪにプローブを用いて、再編成されたＨ鎖およびＬ鎖遺伝子由来の■領域を分離する方法である。これらのクローンは、ノーザンブロッテインクによりＡ２ハイブリドーマ中にこれらのシーフェンスが発現されるかどうかを観察するために試験された。発現されたシーフェンスを含むこれらのクローンは、ヒトＣ領域を含む発現ベクター中にクローンされ、抗体が生産されるかどうかを測定するため、マウス骨髄腫細胞にトランスフェクトされた。細胞が生産した抗体は、その後、結合の特異性について試験され、ネズミＡ２抗体と機能的に比較された。

実施例１ＭＬ　ゲノム・ライブラリーのＡ２ハイブリドーマからのし鎖の■領域遺伝子を分離するため、大きさの選択されたゲノム・ライブラリーは、λフアージベクターシャロン（原文；Ｃｈａｒｏｎ）２７を用いて構築された。高分子量ＤＮＡが、Ａ２ハイブリドーマ細胞から分離され、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ［＋で完全に切断された。ＤＮＡは、それから０．８％アガロースゲル上で分画され、およそ３ｋｂ、４ｋｂおよび６ｋｂという３つの異なる大きさのＤＮＡフラグメントが、電気溶出によりゲルから分離された。ライブラリー構築についての大きさの範囲は、サザーンブロッテインクにおいてＪＫプローブとハイブリッド化したＨ　ｉ　ｎｄ［ＩＩフラグメントの大きさに基づいて選択された。フェノール／クロロホルム溶出およびエタノール沈澱の後、同じ大きさのクラスからのＤＮＡフラグメントは、λシャロン（原文；Ｃｈａｒｏｎ）２７のアームと結合され、ストラタジーン社からの得たギガバック・ゴールドを用いてｉｙｌ　ｖｉｔｒｏでファージ粒子中にパッケージされこれらのライブラリーは、　”ｐｍ″７ａされたＪにプローブを用いて、およそ２０．０００プラ一ク／１５０ｍｍペトリ皿の密度で直接的にスクリーンされた。マウスのし鎖のＪにプローブは、全５つのＪにセグメントを含む２．７ｋｂのＨｉｎｄ［ＩＩフラグメントであった。そのプローブは、ペーリンガー・マンハイム社から得られたキットを用いて、ランダム・ブライミング（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｆｎｇ）により１Ｐで標識された。フリーなヌクレオチドは、セファロースＧ−５０カラムを通じて遠心分離により除去された。そのプローブの特異的な活性は、およそＩＯ’ｃｐｍ／μｇであった。

プラーク・ハイブリダイゼーションは、５倍濃度の５ＳＣ１５０％ホルムアミド、２倍濃度のデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、および４２℃で１８〜２０時間変性された２００μｇ／ｍｌｌのサケ精子ＤＮＡの系において行われた。最終の洗浄は、６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣおよび００１％のＳＤＳを用いて行われた。ポジティブクローンは、オートラジオグラフィーの後に同定された。

実施凱ｙＨゲノム・ライブラリーのＡ２の■１鎖についてのｖｆＩｉ域遺伝子を分離するため、ゲノム・ライブラリーが、えｇｔｌＯベクター系において構築された。高分子量のＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に切断され、およそ７．５ｋｂのフラグメントが、アガロースゲル電気泳動後に分離された。これらのフラグメントは、えｇｔｌＯアームと共に結合され、ギガバック・ゴールドを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏでファージ粒子中にパッケージされた。

このライブラリーは、Ｊ、プローブを用いて、２０，０００プラ一ク／１５０ｍｍプレートの密度でスクリーンされたＩＩＪＨプローブは、Ｊ３およびＪ４セグメントを含む、２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントであった。そのプローブは、実験３のように標識され、同様の比放射活性を有していた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、実験３において用いた条件と同様とした。

実施例ｙ１ＴＮＦに、　・なＶ“　−９のクローニング類つかのポジティブ・クローンが、Ｊ□およびＪにプローブをそれぞれ用いて、各ライブラリーからおよそ１０＠個のプラークをスクリーニングした後に、ＨおよびＬ鎖うイブラリーから分離された。プラーク精製に続いて、バタテリオファージＤＮＡが、各ポジティブ・クローンのために分離され、ＥｃｏＲＩ　（Ｈ鎖りローン）あるいはＨｉｎｄｕｌ（Ｌ鎖りローン）で切断され、１％アガロースゲルにおいて分画された。ＤＮＡは、ニトロセルロースに移され、プロットはＪｎあるいはＪにプローブでハイブリッド化された。

Ｊ、プローブにハイブリッド化した７、５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＤＮＡフラグメントを含んだ幾つかのＨ鎖りローンが得られた。Ｌ鎖うイブラリーについては、Ｊにプローブにハイブリッド化するＨｉｎｄ０１フラグメントを含む、大きさの選択された３つの各ライブラリーから幾つかのクローンが、分離された。Ｌ鎖については、２ｋｂライブラリーから独自に得られた、幾つかの２．９ｋｂのＨ３ｎｄｒＵフラグメントは、ＳＰ２１０ｍＲＮＡでなく、Ａ２からのＬ２５０ｂｉ）のｍＲＮＡと共にハイブリッド化した（実施例ｖｔｔｌ照）、加えて、４ｋｂのライブラリー由来の幾つかのＨｉｎｄ［ＩＩフラグメントは、Ａ２ｍＲＮＡおよび融合相手のｍＲＮＡにハイブリッド化した。６ｋｂのライブラリー由来の５．７ｋｂのＨｉｎｄ［＋フラグメントは、両方のＲＮＡのいずれにもハイブリッド化しなかった。

ハイブリッド化するＡ２ｍＲＮＡの観察された長さは、Ｈ鎖およびＬ鎖ｍＲＮＡの正確な大きさに相当した。ＲＮＡ発現は、Ａ２ハイブリドーマに制限されたので、７．５ｋｂのＨ鎖フラグメントおよび２．９ｋｂのＬ鎖フラグメントは、Ａ２由来の正しいＶ領域シーフェンスを含むと仮定された。各型についてのある実験が、更なる研究のために選択された０重要な機能の試験は、これらの■領域シーフェンスが、適当なＣ領域シーフェンスと結合したとき、ネズミＡ２抗体と同様の特異性および親和性を有する抗体の合成を指示し得ることの証明であ７．５ｋｂのＨ鎖フラグメントおよび２．９ｋｂのＬＪｉフラグメントは、ネズミ骨髄腫細胞中のマウス／ヒト・キメラタンパクの発現を許容するプラスミド・ベクターにサブクローンされた（実施例ＶＩＩＩおよび実施例ＩＸ参照）。完全な抗体分子が分泌されるかどうか、もしそうであるならば、これらの抗体分子が適当な特異性および親和性を有するものであるかどうかを確かめるため、これらのプラスミドは、Ｓ　Ｐ　２１０細胞中にトランスフェクトされた。対照のトランスフェクションは、推測上の抗ＴＮＦＨ鎖と、無関係な、しかし発現されるし鎖とを組合せることにより、また、推測子の抗Ｔ　Ｎ　Ｆ　１．、鎖と、無関係な、しかし発現される１１鎖とを組合せることにより行われた。結果は、７．５ｋｂのＨ鎖フラグスントは発現され得るが、２．９ｋｂのＬ鎖フラグメントは発現され得ないことを示した。このことは、他の公知のＬ鎖アミノ酸シークエンスと比較したときに、コード領域の部分が、適当なアミノ酸読み枠（リーディング・フレーム）中に存在しないことを示した、ＤＮＡシークエンス分析によって確認された。

２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩ＋フラグメントは、機能できるＶ遺伝子を含んでいないようであったので、Ｌ鎖うイブラリーから分離された４、０ｋｂおよび５．７ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントが、発現ベクター中にクローンされ、７．５ｋｂのＩＩ鎖とのトランスフェクションの後、キメラ抗体の発現について試験された。５７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは抗体発現を支持し得るが、４．０ｋｂＨｉｎｄｍフラグメントは抗体発現を強く支持した。７．５ｋｂの推測上のＨ鎖■領域および４．０ｋｂのＬ鎖Ｖ領域のトランスフェクションから生じた抗体は、精製され、同相ＴＮＦ結合アッセイにおいて試験され、そして不活性であることがわかった。４、ＯｋｂのＨｉｎｄ［ＩＩフラグメントに含まれるＶ領域は、正しい抗ＴＮＦのＶ領域ではなく、融合相手によってバイブリドーマに付与されたものであったと結論された。このことは、Ａ２ハイブリドーマおよび融合相手に由来するｃＤＮＡのシーフェンス分析によって、その後確認された。

Ａ２ｍＲＮＡとハイブリッド化した２、９ｋｂのＨｉｎｄ［［Ｉフラグメントを含む、独自に得られた伯のＬ鎖りローンが、より詳細に特徴づけられた。制限地図は類似していたにもかかわらず、クローンは、ＡｃｃＩ酵素部位の存在あるいは欠損に関し、二つのクラスに分かれた。オリジナル（機能のない）の２．９ｋｂフラグメント（クローン８．３と呼ばれる）には、幾つかの他のクローン（クローン４，３に代表される）中におけるＡｃｃＩ部位が欠損していた。クローン４．３のＤＮＡシークエンスは、クローン８．３に極めて類似していたが、クローン８．３と異なる。公知のし鎖に近い相同性を有する一つのアミノ酸リーディング・フレームを含んでいた。クローン４．３からの２．９ｋｂのＨｉ　ｎｄ［ＩＩフラグメントは、Ｌ鎖発現ベクター中にサブクローンされ、Ｓ　Ｐ　２１０細胞中に推測上の抗ＴＮＦＨ鎖と共にトランスフェクトされた。抗体は合成され、精製され、同相ＴＮＦ結合アッセイにより試験された。この抗体は、ＴＮＦに結合した。したがって、クローン４．３のＬ鎖■領域が、正しい抗ＴＮＦの■領域であると仮定された。

Ａ２ネズミハイブリドーマは、再編成された少なくとも４つのＬ鎖Ｖ領域遺伝子を含むことが示された。これらの内の少なくとも２つ、即ちクローン４，３（正しい抗ＴＮＦのＬ鎖遺伝子）、および４．０ｋｂのＨｉ　ｎｄＩＩＩフラグメント（融合相手によって与えられた）中に含まれる遺伝子は、タンパクとして発現される。２つのし鎖の発現は、ネズミ・ハイブリドーマから分泌された抗体は、実際には、正しいし鎖を用いた抗体、正しくないＬ鎖を用いた抗体、およびこれらを各一つずつ用いた抗体の混合物であることを意味する。ネズミＡ２抗体における２つの異なるし鎖の存在は、ＳＤＳゲルおよび精製された抗体のＮ末端タンパクシーフェンス分析によって確認された。Ａ２キメラ抗体の構築は、個々のＨおよびＬ鎖遺伝子のクローニン久および非生産性細胞系でのそれらの発現を含んでいるので、生じた抗体は、正しいし鎖のみを有し、したがって、より能力の高い抗体である（実施例Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩ参照）。

実施例ＶｌｌクローンされたＤＮＡのノーザン　析Ａ２ハイブリドーマからの標準のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域に相当する。クローンされたＤＮＡは、Ａ２ｍＲＮＡにハイブリッド化することが予想される。Ｈ鎖あるいはし鎖の遺伝的な位置での機能をもたないＤＮＡの再編成は、当然発現されない。

全細胞質ＲＮＡのｌＯμｇは、１％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）において電気泳動され、ニトロセルロースに移された。プロットは、５０％ホルムアミド、２箔製度のデンハルト（原文；Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、５箔製度の５ＳＣ１および４２℃で１０時間変性された２００μｇ／ｍＱのサケ精子ＤＮＡの系において、ランダム・プライム（原文；ｒｏｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｄ）されたＤＮＡプローブと共にハイブリッド化された、ｎ終の洗浄条件は、６５℃で０．５箔製度のＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを用いる条件であった。

サブクローンされたＤＮＡフラグメントは、ランダム・プライムによってｓａｐで標識され、Ａ２細胞、あるいはＡ２の融合相手である５Ｐ２１０細胞に由来の全ＲＮＡを含むノーザン・プロットにハイブリッド化された。７．５ｋｂのＥｃｏＲ１Ｈ鎖フラグメントは、ＳＰ２１０ｍＲＮＡとではなく、Ａ２からの２ｋｂのｍＲＮＡとハイブリッド化した。同様に２．９ｋｂ（７）Ｌ鎖Ｈｉ　ｎｄｌＩＩフラグメント（クローン４．３）は、ＳＰ２１０ｍＲＮＡとではな（、Ａ２からの１２５０ｂｐのｍＲＮＡとハイブリッド化した。ハイブリッド化するＡ　２　ｍ　ＲＮ　Ａの観察された長さは、Ｈ鎖およびＬ鎖ｍＲＮＡそれぞれについての正しいサイズであった。このことは、これらのＤＮＡフラグメントにおけるＶ領域配列が、Ａ２ハイブリドーマ細胞中で発現されることを確証している。

実施桝ｙ上１１穴現さ２タニの憔笛上述の推測上のＬ鎖（クローン４．３）およびＨ鎖Ｖ遺伝子は、発現ベクター中においてヒトに（原文；　ｈｕｍａｎ　ｋａｐｐａ）およびγｌ定常領域遺伝子（原文；ｇａｍｍａｌ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）に連結された。Ａ２からの推測上のＶＨ領域遺伝子に相当する７、５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントは、ｐＡ２１１Ｇｌａｐｇｐｔと呼ばれるプラスミドを生ずる、ヒトＣγ１遺伝子（原文；ｈｕｍａｎ　Ｃｇａａｍｓ＋　ｇｅｎｅ）およびＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含む発現ベクター中にクローンされた（図８参照）。

クローン４．３からの２．９に１ｂの推測上のｖＬフラグメントは、動物細胞における分泌を許容する、ヒトにＣに遺伝子（原文；ｈｕｍａｎ　ｋａｐｐａＣ，）およびＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含むベクター中にクローンされた。生じたプラスミドは、ｐＡ２ＨｕＫａｐｇｐｔと指定された。（図８参照）。

１実施例ＩＸキメラ　′　云−・の− キメラＨ鎖およびＬ鎖遺伝子を発現させるため、発現プラスミドは、非生産性マウスミエローマ（骨髄腫）細胞系である５Ｐ２１０中にトランスフェクトされた。トランスフェクトされるプラスミドＤＮＡは、エチジウムブロマイド／セシウムクロライド・グラシュエンド中での２回の平衡遠心によって精製された。プラスミドＤＮＡ　（１０〜５０　ｕ　ｇ）が、へンク塩（原文；Ｈａｎｋ’　ｓ　５ａｌＵＳ）を含有する培地中の１０７個のＳ　Ｐ　２１０細胞に添加され、この混合物は、バイオラット社製のエレクトロポレーション装置中に配置された。

９６六マイクロプレート中に細胞がプレートされた後、エレクトロポレーションが２０Ｖで行われた。

２４時間後にマイコフェノール酸（原文；Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉＳ）選択が行われ、薬剤耐性細胞のコロニーは、１〜２週間後に同定された。耐性細胞のコロニーは、安定した細胞系に発展させられ、これらの細胞系からの組織培養上清か、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体およびアルカリホスファターゼで結合されたヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ　（ジャクソン・ラボラトリーズ社から得られた）を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより、抗体について試験された。

キメラＡ２抗体は、プロティンＡ−セファロース・クロマトグラフィーにより組織培養上清から精製された。上清は、Ｏ，１Ｍトリス、０．００２ＭのＥＤＴＡを用いてｐＨｓ、０に調整され、同じバッファー中で平衡されたプロティンへ− セファロース・カラムに充填された。ＩｇＧは、ｐＨ３，５のＯ，１Ｍクエン酸塩で溶出され、ＩＭＩ−リスで阻害あるいは中和され、そして、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称することがある。）中に透析された。

精製されたキメラ抗体は、その結合、ならびに阻害および／または中和活性について評価された。

実施例Ｘｒ′ＴＮＦキメラ　のＣΔ２のドメインと結合する抗体はネズミＡ２に由来するので、これらのモノクローナル抗体は、ＴＮＦにおける同じ結合部位に拮抗（競合）することが予想される。ｒｈＴＮＦ　（大日本、大阪１日本）で被覆された９６六マイクロプレート中で、固定された濃度のキメラＡ２およびネズミｍＡｂ　Ａ２が、増加する濃度のネズミキメラＡ２の拮抗（競合）体で、それぞれインキュベートされた。抗ヒト免疫グロブリンと結合したアルカリ・ホスホツーゼおよび抗マウス免疫グロブリン第二抗体が、それぞれ、ネズミキメラＡ２の結合のレベルを検出するのに用いられた。ＴＮＦ抗原に対する交叉競合が、この固層ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて観察された（図９）、この発見は、ｃＡ２およびネズミＡ２の予想される同一のエピトープ特異性と矛盾していない。

マウスＡ２およびｃＡ２モノクローナル抗体のｒｈＴＮＦαへの結合についての親和定数は、スカッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ｇ、、Ａｎｎ、Ｎ。

Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、５１　：６６０　（１９４９））により決定された。この結果が、図１０に示されている。この分析は、９６穴プレート中に固定されたｒｈＴＮＦαへの、　１２５１標識されたｃＡ２の直接の結合を測定することを意味する。抗体は、ヨードゲン（原文；　ｉｏｄｏｇｅｎ）法により約９．７ｕＣｉ／ｕｇの比活性（原文；５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）に各々標識された。マウスＡ２モノクローナル抗体については、０．５ＸｌＯ”　Ｉ２１モルの親和定数（１０”Ｒ１モルという高い親和性を有していた。このように、この発明のキメラ抗ＴＮＦα抗体は、親株のネズミＡ２モノクローナル抗体のヒトＴＮＦαへの結合の親和性よりも、高（重要なヒトＴＮＦαへの結合の親和性を示すことが、証・明された。ネズミとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、親株のモノクローナル抗体の親和性と等しいかあるいは低い親和性を有することが予想されるので、この発見は驚くべきことであった。

ＴＮＦαへの結合の親和性が、Ｋａで表すと少なくともＩ　Ｘ　１０’　Ｍ−’ 、好ましくはＩ　Ｘ　１０’　Ｍ−’である。このような高親和性抗ＴＮＦ抗体は、生体液中の極微量レベルのＴＮＦを検出するイムノアッセイに好適である。

加えて、このような高親和性を有する抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦαに介在される健康状態あるいは病状の診断に好適である。

ＴＮＦに対するｃＡ２の特異性は、ヒト・リンホトキシン（ＴＮＦ−β）の交叉中和反応について試験することにより確認された。リンホトキシンは、幾つかの配列の相同性、および、例えばＴＮＦによる腫瘍細胞の細胞障害作用などの一定の生物活性を共有している（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ旦　１１ヱ：　７２４−７２９　（１９８４））、培養されたヒト八６７３細胞は、３９℃で一昼夜、２０μｇ／ｍｌｌのシクロへキシミドの存在下で、４ｇｇ／ｍＩ２のキメラＡ２を含むあるいは含まない、増加する（異なる）濃度のヒドリンホトキシン（ジェネンテック社）と共にインキュベートされた。細胞の死は、上述のナフトール・ブルー・ブラックでの致命的な染色を行うことにより測定された。

結果は、ｃＡ２はヒト・リンホトキシンの阻害および／または中和性に影響しなかったことを示した。これは、キメラ抗体のＴＮＦα特異性を確証している。

異なる動物種由来のＴＮＦと反応する。Ａ２あるいはｃＡ２の能力がまた評価された。最初に言及したように、阻害および／または中和性のモノクローナル抗体が結合するヒトＴＮＦに多重エピトープが存在する（Ｍｏｌｌｅｒ、Ａ、ｅｔａｌ、）、ヒトＴＮＦは、ホスト動物種の広い範囲において生物活性を有する。しかしながら、ヒトＴＮＦにおける一定の阻害および／または中和性のエピトープは、異なる動物種間で維持されるにもかかわらず、その外は、ヒトおよびチンパンジーに限定された。

中和反応実施例は、ＴＮＦ源として新たに分離したヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、ヒト、ブタ、イヌ、ウサギ、あるいはラットの単球からの、細胞障害活性化された細胞上演を用いた。上述したように、ネズミＡ２モノクローナル抗体は、ヒトあるいはチンパンジーＴＮＦのみの活性を阻害あるいは中和し、その他の冨長類あるいは低級動物に由来するＴＮＦに対する効能を有していなかった。Ａ２は、また、組換えマウスＴＮＦの細胞障害作用を阻害あるいは中和しなかった。

このように、Ａ２により認識されるエピトープは、ヒトおよびチンパンジーＴＮＦαにより共有されるエピトープである。また、キメラＡ２は、この方法でラット、ウサギ、イヌおよびブタからの単球由来のＴＮＦとの交叉反応性についても、精製された組換えマウスＴＮＦαおよび天然あるいは組換えヒトＴＮＦαとの交叉反応性についても試験された。キメラＡ２は、天然あるいは組換えＴＮＦα のみを阻害あるいは中和した。したがって、ＣＡ２は、ネズミＡ２との種特異性を共有するようである。

実施例Ｘ１キメラ　ＴＮＦ　の生　（７、・ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　活　と　２カネズミキメラ抗ＴＮＦ−α抗体すなわちＡ２およびＣＡ２の両抗体が、有効なＴＮＦ阻害および／または中和活性を有することが示された。前述の細胞障害性分析において、ネズミ　Ａ２は、約１２５ｎｇ／ｍｊ２の濃度で、４０ｐｇ／＋ｎＪ２濃度のｒｈＴＮＦαの生物学的活性を完全に阻害または中和した。二つの独立した系で阻害および／または中和能を調べた結果、５０％阻害投与量（ＩＤ５０）は、１５．９±１．０１および１７．９±１．６量ｇ／ｍｊｌ！　（平均信士標準誤差）と測定された。よって、ｍＡｂ　Ａ２は約１７ｎｇ／ｍ［のｌ０５０値を有する。

同一の実験系による、ＴＮＦに対して同程度の結合親和性を有する他の３つのネズミ抗ＴＮＦ−〇抗体（ＴＮＦ−１，７ＮＦ−２、ＴＮＦ−３と定義する。）の試験の結果、これらは１〜２オーダー大きいＩＤ値を有すること、っまりＡ２と比較すると明らかに小さい中和活性しか有さないことが判明した。

ＣＡ２の生体外での（原文；ｉｎ　ｙｉｔｒｏ）ヒトＴＮＦ−αの生物学的活性に対する阻害および／または中和活性能の評価は、上述したバイオアッセイ系を用いて行われた。培養へ６７３細胞が、４０ｐｇ／ｍｆｆのノーマルＴＮＦ　（ゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社製、ボストン、ＭＡ）または組換えヒトＴＮＦ　（サントリー社製、大阪、日本）と共に、抗体の存在下または抗体非存在下に上述の方法で培養された。そして、生体染色によって細胞の生死が測定された。

Ａ２ネズミｍＡｂの前記結果に基づいた予想通り、細胞障害性アッセイにおいて、ＣＡ２も同様にノーマルヒトＴＮＦおよび組換えヒトＴＮＦの活性の投与量に応じて阻害または中和した（図１１）、この実験系において、ＣＡ２は１２５ｎｇ／ｍＱ程度の濃度で完全にＴＮＦの細胞障害作用を消失させた。実験を繰り返した結果、前記ｃＡ２は元のネズミＡ２ｍＡｂよりも強いＴＮＦ阻害および／または中和活性を示すことが判明した。このような抗体濃度ｌｕｇ／ｍβ以下での阻害および／または中和活性は、抗体を投与した患者の血液中において容易に達成することができる。従って、このような強力な阻害および／または中和活性（特にキメラ抗体の活性）は、ＴＮＦにより介される病気や健康状態の治療上好ましい。

前述の通り、ＴＮＦは細胞のＩＬ−６の分泌を誘起させる。更に、その症候群における詳細な役割は不明であるが、ＩＬ−６は敗血症の病理学的状態に関与していることが明らかにされている（Ｆｏｎｇ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ一旦ＵＭｅｄ　１ヱ０：１６２７〜１６３３　（１９８９）；５ｔａｒｎｅｓ　Ｊｒ、。

Ｉｌ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４５：４１８５〜４１９１　（１９９０））。ＴＮＦにより誘起されるＩＬ−６の分泌に対する、ＣＡ２の阻害または中和活性が、培養ヒト二倍体ＦＳ−４繊維芽細胞を用いて調べられた。

表１に示す結果は、ＣＡ２がＴＮＦ添加で一晩培養された細胞のＩＬ−６の分泌を阻害するのに有効であることを示している。ＴＮＦに誘導されるＩＬ−６の分泌は、ｍａｂの非存在下または他の抗原に特異的なコントロールｍＡｂの存在下においては、阻害を受けなかった。

値は、二つの系の平均ＩＬ−６濃度（ｎｇ／ｍβ）である。培養ＦＳ−４繊維芽細胞にｒｈＴＮＦ（サントリー、大阪府、日本）を、単独で若しくは４量ｇ／ｍ βの抗体と共に添加し、１８時間後にその上清中のＩＬ−６量をクオンテイ力イン（原文；ｑｕＢｎｔｉｋｉｎｅ）ヒトＩＬ−６イムノアツセイ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス　ＭＮより入手）により測定した。コントロールｍＡｂ＝キメラ　ネズミ／ヒト　ＩｇＧ１抗血小板（原文；ａｎｎし１−ｐｌａｔ。

ｅｌｅｔ）ｍＡｂ　（７Ｅ３）。

ＴＮＦの有する内皮細胞（ＥＣ）のプロ凝固活性上昇や接着分子作用を誘導する機能は、病理学の病理生理学において重要な内容である。特に、血管の損傷、播種性血管向凝固、および敗血症の症状と関連する重厚な高血圧とも関連する。

そのため、ＣＡ２が、ＴＮＦに誘導される、培養ヒトさい帯の、動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の活性を阻害するか否かが評価された。未変性（原文；１ｎｔａｃｔ）のＨＵＶＥＣ細胞を、抗体の存在下および非存在下においてＴＮＦに４時間接触させた後、細胞溶解産物（原文；　１ｙｓａｔｅ）をヒト結漿（原文；ｐｌａｓｍａ）凝固分析（原文；ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ａｓｓａｙ）することにより、ＴＮＦのプロ凝固活性への刺激性が調べられた０表２に示された結果は、予想されたＴＮＦのＨＬＩＶＥＣのプロ凝固活性に対する正の制ｒＢ（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を示している（凝固時間の減少に反映される。）、キメラ抗体ｃＡ２は、ＴＮＦの活性を投与量に応じて、効果的に阻害または中和した。

°値は、枯葉の凝固時間（秒）を示す（±Ｓ、　Ｄ、　）。凝固時間は、抗体の存在下若しくは非存在下にｒｈＴＮＦ　（大日本、大阪府、日本）処理したＨＵＶＥＣ細胞の溶解産物（原文；　１ｙｓａｔｅ）をカルシウム存在下、３７℃において、正常なヒトの枯葉と混合して測定した。Ｎ、Ｄ、＝不実施、　コントロールＡｂ＝キメラ　ネズミ／ヒト　ＩｇＧ１抗ＣＤ４抗体プロ凝固活性を上昇させる作用に加えて、ＴＮＦは内皮細胞にＥＬＡＭ−１やＩＣＡＭの等の接着分子（原文；ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の産生を誘導する機能を有する。このＴＮＦの活性を阻害または中和活性をＥＬＡＭ−１を検出する放射免疫定量法によって調べた。培養したＨＵＶＥＣに、抗体添加、または無添加で２５０ｎｇ／ｍβ　ｒｈＴＮＦ　（大日本製薬製、大阪府、日本）による！ＩＩｍが与えられ、３７℃において一晩９６穴プレート上に培養された、ネズミ抗ヒトＥＬＡＭ−１ｍＡＢおよびＩＩ！ＩＩでＷしたウサギ抗ネズミ免疫グロブリンを４ ℃において、この順に直接培養プレートに添加することによりＥＬＡＭ−１の細胞表面への発現が、評価された。

図１２に示すように、ＴＮＦは培養ＨＵＶＥＣの表面へのＥＬＡＭ−１の発現を誘導した。また、ＣＡ２の添加量に相関し、このＴＮＦの活性が効果的に阻害される。

最後に、ＴＮＦは培養繊維芽細胞に対して分裂促進（マイトジェン）活性を有することが知られている。キメラＡ２本発明はＴＮＦに誘導されるヒト二倍体ＦＳ −４培養繊維牙細胞の有糸分裂（原文；ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を阻害および／または中和する作用を有する、これによりＡ２がｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、更にＴＮＦの幅広い生物学的活性に渡って阻害および／または中和活性を有することが確信される。

実施例ｘ１ＩＣＡ２ｔ″　の生　原　・ｉｎ　ｖｉｖｏ　活　と機能ｃＡ２の種交叉反応性が高度に制限的であるので、人間やチンパンジー以外の動物の生体内での（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）この抗体の機能を調べるための試験は厳しい制約を受ける。それでもなお、ｃＡ２の生体外での（原文；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）強い阻害および／または中和作用が生体内（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても発現されるという証明が望まれていた。過去の動物実験は、実験動物へのＴＮＦの投与は、グラム陰性細菌の感染またはエンドトキシンの直接的投与にＵ　ａｌ、、１９８６．前出；Ｔｒａｃｅｙ、に、Ｊ、ｅｔ、ａｌ、、１９８７、前出；Ｌｅｈｍａｎｎ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、、前出）。

ガラクトサミン感作のネズミにヒトＴＮＦの致死量を投与する生体内での（原’ ｉｌ；ｉｎ　ｖｉｖｏ）実験系（Ｌｅｈｍａｎｎ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、、前出）を、ｃＡ２の生体内での（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）のＴＮＦ阻害または中和作用の評価をする実験に採用した。ｒｈＴＮＦを５ｕｇ　（０，２５ｍｇ／ｋｇ）腹腔投与した結果、ｃＡ２未処理のコントロール用動物および投与後１５〜３０分後に生理食塩水または２　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇのコントロール用抗体（キメラＩｇＧ１；ネズミ７Ｅ３抗血小板（原文；　ｐｌａｔｅｌｅｔ）ｍＡＢ由来）を静脈注射（ｉ、　ｖ、　）により投与した場合には８０〜９０％の致死率であった。

これに対し、ｃＡ２による処理は、致死率を０．４ｍｇ／ｋｇの抗体を投与した場合には０〜３０％に、２０ｍｇ／ｋｇｓの場合には０−１０％に低下させた、これらの結果を表３にまとめて記載したが、この結果は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏと同様に生体内での（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても、ｃＡ２がＴＮＦの生物学的活性を阻害および／または中和する作用を有することが示された。

メスのＣ３Ｈ／ＨｅＮネズミに５ｕｇのｒｈＴＮＦ　（大日本、大阪１日本）＋１８ｍｇガラクトサミンが腹腔投与された。投与後４８時間後の生存数を記録した。コントロールｍＡｂは、ネズミ／ヒトのキメラＩｇＧ１抗血小板（原文；ａｎｔｉ−ｐｌａｔｅｌｅｔ）ＭＡＢ　（７Ｅ３）であり、Ｎ、Ｄ、は試験しなかったことを示す、Ｐ値はコントロール　Ａｂとの比較である。

実施例λ１上１ｃＡ２により認識されるヒトＴＮＦ−ａのアミノ　テ２、決　−の゛試−墓　下記の市販の試薬は容易に入手可能である。ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｃｙｓ　（Ｔｒｔ）７０Ｐｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−０Ｐｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ）−０Ｐｆｐ、ＦＭＱＣ−Ｌ −Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ−ｏｐｔ’ｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｈｉｓ　（Ｂｏｃ）−０Ｐｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−１１ｅ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）−０Ｐｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ− Ａｓｎ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｇｉｎ− ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）−０Ｐｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−３ｅｒ　（ｔＢｕ）−０Ｄｈｂｔ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｔｈｒ　（ｔＢｕ）−０Ｄｈｂｔ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｔｒｙ　（ｔＢｕ）−０Ｐｆｐ、およびｌ−ヒドロキシベットリアゾール（ＨＯＢＴ）をケンブリッジ　リサーチ　バイオケミカルズより人手した。ピペリジン（原文；ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）はアプライド　バイオシステム社より入手した。ｌ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）をＥＭ　サイエンスより入手した、以下、メタノールをＪＴ　ベーカーより、無水酢酸をアプライド　バイオシステムズ社より、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をアプライド　バイオシステムズ社より、ジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ）、）リエチルアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびアニソールをアルドリッチ社より、塩酸（Ｈ（１）をＪＴベーカー社よりそれぞれ人手した。

略−号　ＦＭＯＣは９−フルオレニルメトキシカルボニルを、ｔＢｕはｔ−ブチルエーテルを、ＯｔＢはｔ−ブチルエステルを、Ｂｏｃはし一ブチルオキシカルボニルを、Ｍし「は４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニルを、Ｔｒｔはトリデルを、０Ｐｆｐはペンタフルオロフ二ニルエステルを、０Ｄｈｂｔはオキソ−ベンゾトリアゾンエステルを示す。

本発明のキメラ抗体（ｃＡ２と表示される抗体）が、ＴＮＦアミノ酸配列配列のどの部分が抗体による阻害的結合に関与しているかをエピトープマツピンクにより調べるために、用いられた。これによって、ｃＡ２によって認識されるＴＮＦ −〇のアミノ酸配列が決定された。

ヒトＴＮＦａの完全な一次構造（ｒ’ｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ３１２　：　７２４−７２９　（１９８４）による）を図１３に示した。

ヒトＴＮＦαの全アミノ酸配列に渡る、二つ毎のアミノ酸より開始し、オーバーラツプする、デカペプチドがポリエチレン　ビン上にＧｙＳｅｎの方法を用いて合成された（Ｇｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、アメリカン　ペプチド　シンポジウム文書、ｐ、５１９−５２３．Ｅｄ、Ｇ、Ｒ，Ｍａｒｓｈａｌ　１．Ｅｓｃｏｍ。

Ｌｅｉｄｎ、＋　９８８）、アセチル化Ｎ−末端を有するペプチドのビン群と、遊離のＮ−末端を有するペプチドのビン群がそれぞれ調製された。以下に示すように、ヒトＴＮＦ−〇のエピトープを構成するアミノ酸配列を決定するため、これらペプチドビンの両群が、抗ＴＮＦ　ｍＡＢ　ｃＡ２含有溶液中にインキュベートされた。

図１４Ａに、それら全部でヒトＴＮＦ−〇の全配列を網羅する、オーバーラツプしているデカペプチドのそれぞれについて、結合試験の結果を示した。０．Ｄ、は直接ｃＡ２の結合の増加と相関する。図１４Ｂは、ＴＮＦ−αの存在下における同一のペプチドビン群に対するｃＡ２の結合を調べた結果である。この競合的結合試験により、ｃＡ２に対し非特異的に結合するペプチドが示された。

ｃＡ２に認識される互いに隣接しないＴＮＦ−αペプチド配列は、少なくても二以上ある。Ｎ末端アミノ酸を１とする通常の蛋白質の順番付与方法を用いると、ｃＡ２ｍＡＢは、少なくともＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにより示されるＴＮＦの８７−１０８番の残基中、または５９−８０番の残基および８７−１０８番の残基の両残基中に存在するアミノ酸部分に形成されるエピトープを認識する。

図１５は、ＴＮＦ中に存在するこれらの非隣接の配列を示したものである。これらの配列の空間配置図を図１６Ｂに示し、同時にＴＮＦ単量体の空間配置図を１６Ａに示した。

予想に反し、ｍＡＢ　ｃＡ２は、ＴＮＦ−αのりセブターの結合位置と推定される位置（例えばＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌのｈＴＮＦαにおける１１−１３．３７４２．４９−５７，１５５−１５７）ｋ：結合すルコとなく、’ｒＮＦ−ａ（７）活性を阻害する。好ましい抗ＴＮＦｍΔＢとしては、これらのペプチド配列の一つ若しくはいくつかに結合することによって、ヒトＴＮＦ−αの対応するレセプターへの結合を阻害するものである。この様な抗体はｃＡ２エピトープに結合することによってＴＮＦの活性を阻害することができる。この結合がＴＮＦの活性を阻害することは証明されている。

ｃＡ２によって認識されるこれらのペプチド配列を同定によって、本発明の態様に類似する結合特性および治療上の利用性を有する他のモノクローナル抗体の調製に必要な情報が得られた。

さブ±上１？７（７）”Ｍ　ケンブリッジ　リサーチ　バイオケミカルズ社（ＣＲＢ）より購入したエピトープ　マツピング　キットを用いて、ヒトＴＮＦ−α の全配列に対応するドデカペプチドをポリエチレンセイ製のビン上に合成した。

合成スケジュールが、ＣＲＢエピトープ　マツピンク　ソフトウェアを用いて作成された。最初のアミノ酸をカップリングする前に、予め２０％ピペリジンのＮＭＰ溶液中での、室温下、３０分処理することにより、脱保護された。脱保護されたビンは室温下においてＮＭＰで５回洗浄され、さらにメタノールで３回洗浄された。洗浄後、最低１０分間以上空気中で乾燥した。

各カップリングサイクル毎に以下の操作が行なわれた。

ｌ）前記アミノ酸誘導体および前記ＨＯＢＴの前記合成スケジュールにおける必要量が秤量された。

２）前記ＨＯＢＴの前記合成スケジュールによる適当量がＮＭＰに溶解された。

３）前記アミノ酸誘導体が適量のＨＯＢ　Ｔ溶液に溶解され、次いでピペットによりその１６０ａｌｌが合成スケジュールのウェル位置表（原文；５ｈｅｅｔ）の示す適切なウェルに注入された。

４）ビンを有するブロックが前記ウェル中に入れられ、この「サンドイッチ」ユニットはプラスチック製容器中で、１８時間３０℃の温浴中に保持された。

５）ビンがウェルより取り出され、ＮＭＰにより１回（５分間）、メタノールにより３回（２分間）洗浄された後、１０分間空気中で乾燥された。

６）ビンが前記と同様に脱保護され、さらに、この操作が繰り返された。

一つのブロックのビン上のペプチドをアセチル化するためには、前記ペプチドビンは洗浄され、脱保護され、ＮＭＰ、無水酢酸ニトリエチルアミン（５：　２　：ｌ）を含有する溶液の１５０ｕｇで３０℃において９０分間処理され、次いで前に概説した洗浄方法により洗浄された。他のペプチドビンの群は、２末端フリーアミノ酸残基を得るために、アセチル化されず、脱保護された。

側鎖保護基を除去するための最後の脱保護は、ＴＦＡ：アニソール：ジチオスレイトールの混合溶液、９５：２．５：２．５　（Ｖ：Ｖ：Ｗ）を用いて、４時間、周囲の温度で処理することにより行われた。脱保護の後、１０分間空気乾燥され、次いで１％塩酸のメタノール−蒸留水のｌ＝１混合溶液中で超音波処理（原文；５ｏｎｉｃａｔｉｏｎ）が行われた。−晩乾燥され、試験に供するビンが得られた。

ｃＡ２のＴＮＦ−ａペプチドへの　Ａを＝べるためのＥＬＩＳＡ　＃″ＬＪ：ＬＪ：デイスラブシヨンァーニリン酸二水素ナトリウム（３１，２ｇ、シグマ社（原文；Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ＃Ｓ−０７５１または同等物）およびドデシル硫酸ナトリウム（２０，０ｇ、シグマ社　ｃａｔ＃Ｌ−３７７１または同等物）を２．ＯＬのミリＱ（原文；ｍｉ　１１　ｉＱ）水に溶解した０次いで、５０％　ｗ／ｗ　水酸化ナトリウム（ＶＷＲ社　ｃａｔ　＃　ＶＷ６７３０−３または同等物）によりｐｉを７．２±０．１に調整した。

ブロッキング　バッファーニリン酸二水素ナトリウム（０，３９ｇ、シグマ社ｃａｔ＃Ｓ−０７５１または同等物）、リン酸水素二ナトリウム（１，０７ｇ、ベーカー社（原文；Ｂａｋｅｒ）　ｃａｔ＃３８２８−１または同等物）および塩化ナトリウム（８，５０ｇ、ベーカー社　ｃａｔ＃３６２４−５または同等物）をミリＱ水１０Ｌに溶解した。５０％　ｗ／ｗ　水酸化ナトリウム（原文、ＶＷＲ社　ｃａｔ　＃　ＶＷ６７３０−３または同等物）によりｐＨを７．２±０．１に調整した。

鶏卵アルブミン（１０，０ｇ、シグマ社　ｃａｔ＃Ａ−５５０３または同等物）および牛血清アルブミン（１０，０ｇ、シグマ社　ｃａｔ＃Ｌ−３２９４または同等物）を室温下で緩やかに撹拌しながら溶解した。この溶液を濾過し、瀘過液に、ツウィーン（原文；Ｔｗｅｅｎ）２０　（２，０ｍｆｆ　シグマ社　ｃａｔ＃１３．７９または同等物）を添加した。さらに４０分間室温にて緩やかに撹拌し、濾過した後、４０℃に保存した。

ＰＢＳ／ツウィーン（原文；Ｔｗｅｅｎ）２０ニリン酸二水素ナトリウム（３，９０ｇ、シグマ社　ｃａｔ＃Ｓ−０７５１または同等物）、リン酸水素二ナトリウム（１０，７０ｇ、ベーカー社　ｃａｔ＃３８２８−１または同等物）および塩化ナトリウム（８５，０ｇ、ベーカー社　ｃ　ａ　ｔ　＃　３６２４−５または同等物）をミリＱ水１．ＯＬに溶解することによって、濃度１０溶液を調製した０次いで、５０％　ｗ／ｗ　水酸化ナトリウム（ＶＷＲ社　ｃａｔ　＃　ＶＷ６７３０−３または同等物）によりｐｎを７．２±Ｏ，ｌに調整した。この溶液に対しツウィーン（原文；Ｔｗｅｅｎ）２０　（５，０ｍ！２　シグマ社　ｃａｔ＃Ｐ−１３７９または同等物）を添加し、この混合液を緩やかに撹拌した。使用する直前に、この溶液１００ｒｒｌをミリＱ水で１．ＯＬに希釈した。

基質溶液：クエンａ（４，２０ｇ、Ｍａｌ　１ｎｃｋｒｏｄｔ　ｃａｔ＃Ｓ−０６２７または同等物）およびリン酸二ナトリウム（７，Ｌｏｇ、ベーカー社　Ｃａｔ＃３８２８−１または同等物）をミリＱ水１．ＯＬに溶解し基質用バッファーを調製した０次いで、５０％　ｗ／ｗ　水酸化ナトリウム（ＶＷＲ社　ｃａｔ＃　ＶＷ６７３０−３または同等物）によりｐＨを５．００に調整した。使用直前にＯＰＤ基質錠（３０ｍｇ、シグマ社　ｃａｔ＃Ｐ−８４１２または同等物）および３０％　ｖ／ｖ　過酸化水素（４０ｕ１２．シグマ社　ｃａｔ＃Ｐ−１３７９または同等物）を基質バッファーに添加した。この溶液はアルミホイルで包んで充分に撹拌した。

４ＮＩ酸：！＃（５３ｒｒ＋１２．イーエム　サイエンス社（ＥＭ　５ｃｉｅｎｃｅ）ｃａｔ＃５Ｘ１２４４−５または同等物）をミリＱ水（４４７ｍＬ）に徐々に添加し、使用前に室温迄に冷却した。

ＬＪ：モレキュラーデバイシス　モデルｎｕ−ｍａｘプレートリーダーまたは同等物、サイエンティフィックプロダクツ　モデルＲ４１４０卓上振盪機または同等物、プランソン　モデル５２００超音波バスまたは同等物、フィンピペット　モデル４１７２３１７マルチチヤンネル　ピペッタ−または同等物、コーニング（原文；ｃｏｒｎｉｎｇ）　モデル２５８０１　９６ウエル　ディスポーザブル　ポリスチレン　Ｅｌｉｓａ　プレート使用前にまたは下記に示す使用の後に、ペプチドビンは以下に示す手順で洗浄された。ディブラブチョン　バッファーは６０℃に加熱され、ヒユーム（原文；ｆｕｍｅ）フード中の超音波バスに注入された。このディスラプション　バッファーにジチオスレイトール（２，５ｇ、　シグマ社　ｃａｔ＃Ｄ−０６３２または同等物）が添加された。ペプチドビンが溶液中で３０分間超音波処理され、処理後ミリＱ水で完全に洗浄された０次いで沸騰エタノール中に２分浸漬され、その後空気乾燥された。

ディスポーザブル　ポリスチレン　Ｅｌｉｓａ　プレートの９６のウェル中に、ブロッキング　バッファー（２００ｕｆｆ）が、分注され、これらのウェル中にペプチドビンが保持された。このペプチドビンおよびプレートは室温下、卓上振１＃Ｉｌ上で２時間インキュベートされた０次いで、このプレートおよびペプチドビンはＰＢＳ／ツウィーン（原文；Ｔｗｅｅｎ）２０で洗浄された（４回）０個々のウェルにそれぞれ２０ｇｇ／ｍｆｆ濃度のｃＡ２抗体を注入された（ブロッキング　バッファーにより希釈した。１７５μＬ／ウエル）、ＴＮＦ競合の方は、ＴＮＦ−ａ　（４０ｇｇ／ｍｆｆ）およびｃＡ２　（２０ｇｇ／ｍｌ２）を含有するＢＳＡ／卵アルブミン／ＢＢＳ中に室温下、３時間インキュベートすることによって行われた。ペプチドビンはプレート中に保持され、４℃で一晩インキユベートされた。−晩インキュベート後に、このペプチドビンおよびプレートはＰＢＳ／ツウィーン（原文；Ｔｗｅｅｎ）２０で洗浄された（４回）、各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗ヒトの山羊の抗体（ブロッキング　バッファーで２０００倍に希釈、１７５μＬ／ウエル、ジャクソン　イムノ　リサーチ　ラボラトリーズ（原文；Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ））が添加された。このプレート中にペプチドビンが保持され、室温下で卓上振盪機上で１時間インキュベートされた。インキュベート後、プレートおよびペプチドビンはＰＢＳ／ツウィーン（原文；Ｔｗｅｅｎ）２０で洗浄された（４回）。各ウェル中に調製直後の基質溶液が分注され（１５０μβ／ウエル）、室温下において１時間、卓上ｔＳｔ機上のこのプレート中でペプチドビンがインキュベートされた。インキュベート後、ペプチドビンは取り外され、各ウェル中に４Ｎ硫酸（５０μＬ）が添加された。このプレートをモレキュラー　デバイシス　プレートリーダーにより読み取らせ（４９０ｎｍの値、ブランク値として６５０ｎｍの値を減する）、この結果が、前記の通り１図１４Ａおよび図１４Ｂに示した。

実施例λ１ＭＴＮＦペプチドフラグメントを　したネズミの　ヒトＴＮＦモノクローナル抗体９作製ＴＮＦ（ＳＥＱ、ＩＤ　ＮＯ：ｌにより示される）における上述の非隣接の配列５９−８０．８７−１０８中、または向配列５９−８０．８７−１０８中に存在する少なくとも５アミノ酸残基である抗ＴＮＦエピトープを含有する旦、旦旦± １由来組換えヒトＴＮＦ　（ｒｈ’ｒＮＦ）フラグメントの精製品４０ｕｇを、等量の完全フロイント・アジュバント（ディフコ・ラボラトリーズ社から人手）により乳化し、０．４ｍεとしたものが、実施例Ｉにおけるのと同様に、ＢＡＬＢ／Ｃ雌ネズミの皮ネズよび腹腔に注射された。−週間後、不完全フロイント・アジュバント中の前記ｒｈＴＮＦフラグメント５μｇが腹腔に追加免疫として注射され、次いで、ＴＮＦ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌにより示される）における配列５９−８０．８７−１０８中、または向配列５９−８０．８７−１０８中にのアミノ酸残基を有する抗ＴＮＦエピトープを含有するＴＮＦフラグメントが、アジュバントなしで、４回連続して腹腔注射された。最後の注射から８週間後に、ネズミはＴＮＦｌＯｕｇにより追加免疫された。

４日後、ネズミは犠牲にされた。その神職を得、肺臓細胞の懸濁液が調製された。肺臓細胞は、３０％ポリエチレングリコール、ＰＥＧ１４５０の０．３ｍβ中で、非分泌性ハイブリドーマ細胞である５ｐ２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と、４：ｌの比で融合された。３７℃で６時間インキュベートした後、融合細胞は、５ｐ２１０細胞濃度がｌウェル当たり２ＸＩＯ’個になるように、９６穴プレート中に０．２ｍεづつ配分された＠５ＸｌＯ’個の正常ＢＡＬＩ３／Ｃ牌臓細胞が、各ウェルに添加された。

使用された増殖培地は、ＲＰＭＩ−１６４０培地、熱で不活性化された１０％の子ウシ血清（ＨＢＳ）（ヒフローン（原文；Ｈｙｃｌｏｎｅ）社製）、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのし一グルタミン、１００Ｕ／ｍ、ｇのペニシリン、１１００ｕ／ｍｊ２のストレプトマイシン（ギブコ・ラボラトリーズ社製）、および選択のためのヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ベーリンガー・マンハイム社製）よりなる。

同相放射性免疫アッセイ（ＲＩ　Ａ）が、配列５９−８０．８７−１０８、または向配列５９−８０．８７−１０８中に存在するアミノ酸残基を含有するｒｈＴＮＦαフラグメントに特異的なモノクローナル抗体が存在する上清を選択するために、採用された。このアッセイについては、前記実験２において詳述した。このアッセイにおける結合のバックグランドは、約５００ｃｐｍである。上演は、２０００ｃｐｍまたはそれ以上結合しているならば陽性とみなした。

選択された上清の内の一つまたはいくつかの上清が通常のＲＩＡにより同定された。これら陽性の上演の内で、最も高い結合性を有する（よりｃｐｍ値を示すことで判定される。）ものが、ネズミのフィーダー細胞添加の限定希釈法によりサブクローニングされた。中和アッセイにおける前記上演の更なる分析において、一つまたはいくつかの抗体が、阻害および／または中和作用を有することを確認した。そして、これらの陽性であり、阻害および／または中和作用を有するハイブリドーマ系列が選択され、ｌＯ％ＦＢＳ　（ギブコ社製）、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのし一グルタミン。

１００Ｕ／ｍＩ２のペニシリン、および１００μｇ／ｍＩ２のストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に保存（ｍａｉｎｔａｉｎ）された。

実施例凶ＶＴＮＦペプチドを用いたネズミとのキメラｒ゛、そのフラグメントおよび９域９作製ネズミとのキメラ抗体、そのフラグメントおよび領域が、実施例ＸＩＶで得られたネズミ抗体の可変領域とヒト定常領域とのキメラ発現媒体を構築することによって、前記実施例４〜９に示した方法によって作製された。キメラＡ２抗体は、タンパク　Ａセファロース　りロマトグラフィーによって組織培養上演より精製され得られた。上清は０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ加０．１Ｍ　トリスによってｐＨ８，０に調整され、同バッファーにより平衡化されたタンパク　Ａセファロースカラムにアプライされた。ｐＨ３，５のクエン酸バッファーによりＩｇＧが溶出され、ＩＭＩ−リスで中和された後に、リン酸バッファーによる緩衝能を有する生理食塩水中で透析された。

こうして得られたネズミとのキメラ抗体、そのフラグメントおよび領域について、その結合能、阻害および／または中和活性が評価された。

実施例ＸＶエキメラ抗’ｒＮＦ抗　のｉｎ　ｖｉｔｒｏの活性と中和活例えば、阻害作用が５０％阻害投与量として表わされるＴＮＦ細胞障害作用のアッセイにおいて、実施例ＸＩＶと実施例ｘ■において得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体のいづれも、阻害および／または中和活性を有することが確認された。

同一の実験系による評価試験により、同程度の結合親和性を有する他の３つのネズミ抗ＴＮＦ−〇抗体（ＴＮＦ−１，７ＮＦ−２、ＴＮＦ−３と定義する。）を評価したところ、ＩＤ（ａが１〜２オーダー大きいこと、つまり本発明のネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体と比較すると、明らかに小さい中和活性しか有さないことが判明した。

実施例ＸＩＶと実施例ＸＶにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体の両抗体の生体外での（原文；ｉｎ　ｖｉｔ、ｒｏ）ヒトＴＮＦ−αに対する阻害および／または中和活性能の評価は、上述したバイオアッセイ系を用いて行われた。実施例ＸＩＶと実施例ｘ■において得られたネズミ抗体またはキメラ抗ＴＮＦ抗体を産生ずる培養細胞が、４０ｐｇ／ｍｇのノーマルＴＮＦ　（ゲンザイム（原文；Ｇｅｎｚｙｍｅ）社製、ボストン、ＭＡ）または組換えヒトＴＮＦ　（サントリー社製、大阪、日本）と、抗体の存在下または抗体非存在下に上述の方法で培養された。そして、生体染色によって細胞の生死が測定された。

ＴＮＦの細胞障害アッセイにおいて、予想通り、実施例ｘＩ■と実施例ｘｖにおいて得られた本発明のネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体は、共に投与量に応じた、ノーマルおよびｒｈＴＮＦの活性の阻害または中和活性を示した。このような、抗体濃度１ｔｉｇ／ｍβ以下での阻害および／または中和能は抗体を投与された患者の血液中でも容易に達成することができる。従って、このような抗ＴＮＦ抗体、特にキメラ抗体は、その高い阻害および／または中和能によって、ＴＮＦによってもたらされる病気や病理学的状態の治療に好適である。

培養ヒト二倍体ＦＳ−４繊維牙細胞を用いて、ｃＡ２のＴＮＦによるＩＬ−６の分泌の阻害または中和能を評価した。望ましい結果は、実施例ＸＩＶと実施例ｘＶにおいて（すられたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体が共に、ＴＮＦの存在下に一晩培養した細胞においてＩＬ−６の産生の阻害活性を示すという結果である。ＴＮＦによって誘導されるＩＬ−６の産生は、ｍＡＢの非存在下または他の抗原に対するコントロールｍＡＢの存在下においては阻害されなかった。

ＴＮＦの有する内皮細胞（ＥＣ）のプロ凝固活性上昇や接着分子作用を誘導する機能は、病理学の病理生理学において重要な内容である。特に、血管の損傷、播種住血管内凝固、および敗血症の症状と関連する重厚な高血圧とも関連する。

そのため、実施例ＸＩＶと実施例ｘＶにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体について、ＴＮＦに誘導される、培養ヒトさい帯の、動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の活性を阻害するか否かが評価された。未処理のＨＵＶＥＣ細胞を、抗体の存在下および非存在下においてＴＮＦに４時間接触させた後、細胞溶解産物（原文；　１ｙｓａｔｅ）をヒト枯葉（原文；ｐｌａｓｍａ）凝固分析（原文；ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ａｓｓｅｙ）することにより、ＴＮＦのプロ凝固活性への刺激性が調べられた。予想される結果は、ＴＮＦカ用ＵＶＥＣのプロ凝固活性に対しの正の制御を示すことである。本発明の実施例ＸＩＶと実施例ｘｖにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦの活性を投与量に応じて阻害または中和することが予想される。

プロ凝固活性を上昇させる作用に加えて、ＴＮＦは内皮細胞にＥＬＡＭ−１やＩＣＡＭの等の接着分子（原文；ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の産生を誘導する機能を有する。本発明の実施例ＸＩＶと実施例ｘ■において得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体の両抗体は、このＴＮＦの活性を阻害または中和することが予想されるが、これについてＥＬＡＭ−１を検出する放射免疫定量法によって調べた。培養したＨＵＶＥＣに抗体添加、または無添加で２５０ｎｇ／ｒｒ＋ｊ２　ｒｈＴＮＦ（大日本、大阪、日本）による刺激が与えられ、３７℃において一晩９６穴プレート上に培養された。ネズミ抗ヒトＥＬＡＭ−１ｍＡＢおよび１１ｓ■で標識したウサギ抗ネズミ免疫グロブリンを４℃において、この順に直接培養プレートに添加することによりＥＬＡＭ−１の細胞表面への発現が、評価された。

ＴＮＦは、ＥＬＡＭ−１の培養ＨＵＶＥＣ細胞表面の発現を誘導することが予想され、さらに本発明の実施例ＸＩＶと実施例ｘＶにおいて１１られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体のいづれによっても添加撤に応じて、このＴＮＦの活性が阻害されることが予想される。

最後に、ＴＮＦは培養繊維芽細胞において分裂促進（マイトジェン）活性を有することが知られている０本発明の実施例ＸＩＶと実施例ｘＶにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体の両抗体とも、ＴＮＦに誘導されるヒト二倍体ＦＳ−４培養繊維牙細胞の有糸分裂（原文；ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を阻害および／または中和することが期待され、本発明の実施例ＸＩＶと実施例ｘ■において得られたネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体の両抗体が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＴＮＦの生物学的活性を幅広く阻害および／または中和することが確信される。

実施例ＸＶＩＩでの（、・ｉｎ　ｖｉｖｏ　にお番るｃＡ２　の゛　およびｔ実施例×！■と実施例ｘ■において得た本発明のネズミ抗体またはキメラ抗ＴＮＦ抗体が生体内での（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）においてＴＮＦの阻害または中和作用を有するか否かを調べるために、ガラクトサミンで感作したネズミに致死量のヒトＴＮＦを投与する生体内での（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）実験系が採用された。

５ｕｇ　（０，２５ｍｇ／ｋｇ）のｒｈＴＮＦを腹腔投与された結果、未処理のコントロール用動物および投与後１５〜３０分後に生理食塩水または２ｍｇ／ｋｇのコントロール用抗体（キメラＩｇＧ１；ネズミ７Ｅ３抗血小板（原文；ｐｌａｔｅｌｅｔ）ｍＡＢ由来）が静脈注射（ｔ、　Ｖ、　）により投与された場合には８０〜９０％の致死率であった。

これに対し、実施例ＸＩＶと実施例ｘＶにおいて得た本発明のネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦ抗体で処理されたものは、致死率が、０．４ｍｇ／ｋｇの抗体を投与した群は０〜３０％に、２０ｍｇ／ｋｇｓの群は０〜１０％に低下することが予想される。この予想の結果によって、実施例ＸＩＶと実施例ｘ■において得られた本発明のネズミ抗体およびキメラ抗ＴＮＦα抗体が生体外（原文；１ｎｖｉｔｒｏ）のみならず生体内（原文；ｉｎ　ｖｉｖｏ）においてもＴＮＦの生物学的活性を阻害および／または中和する効力を有することを示されることになる。

実施医ＸＶ土１１ｃＡ２　の臨　パ　およびｔ抗ヒトＴＮＦのキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体ｃＡ２が健康な男性ボランティアに投与された。ＮＩＨ標準エンドトキシン４ｎｇ／ｋｇの投与の一時間後に、ボランティアに、コントロールとしての生理食塩水またはｏ、ｏｔ、ｏ、ｔｏまたはｌｏｍｇ／ｋｇのｃＡ２が製剤の形態で投与された。血清中のＴＮＦ値が経時的に追跡された結果、ＴＮＦ値の最高値はｃＡ２の投与に応じた減少することが示され、ｃＡ２をｌｏｍｇ／ｋｇ投与したボランティアについてはＴＮＦは検出されなかった。したがって、本発明の抗ＴＮＦ抗体による処置は、人体中のＴＮＦによってもたらされる作用を阻害することが予想される。

エンドトキシンを受けた（原文；ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）患者は、白血球の辺縁趨向が原因と考られる白血球減少を示す、白血球が活性化されるにことによって、内皮に結合可能となりその結果として内皮の損傷を生じる。１．０〜１０．０ｍｇ／ｋｇの投与により、この白血球減少は認められなくなる、これに対し、０、Ｏ１〜ｏ、ｔｍｇ／ｋｇの投与では白血球数の減少が観察された。この減少は特に多形核の細胞系列において顕著であった。その後、全ての患者において白血球は増加した。この過程はｃＡ２によって何ら影響を受けなかった。この白血球の辺縁趨向の防＋ｈ効果はＴＮＦによる内皮細胞の損傷を防止できることを意味すると考えられる。この分野において、このＴＮＦによる内皮の損傷は敗血症による症状や死において重要な役割を果たしていると考えられている。従って、本発明の抗ＴＮＦ抗体は、ここに示されたように、このような損傷効果に対する予防効果を有することが予想される。

前記各引用文献の内容は、特に組込むことの明記がなくても、ここに言及することにより全て本発明の内容に含めるものとする。

以上、本発明について充分に開示したのであるから、この分野における通常の知識を有するものが、本発明の精神と目的の範囲内において、また不適当な（原文；ｕｎｄｕｅ）実験でない限りにおいて、幅広い範囲について数値、濃度、条件を適当に変更して本発明を実施することができる。

本願は本発明の特定の一態様について記載したのであるが、他にも様々な態様が可能である０本出願は、本発明の原理に一般的に従い、この発明が属する技術の分野における公知のあるいは慣習的なプラクティスの範囲内に入るような変更であって、かつ、以下に示されたクレームの範囲内から外れることなく、本発明の本質的特長に適合するような変更を含む、本発明の全ての態様、使用、または応用をも包含することを意図している。

これらに制限されるものではない。

シーフェンス・リスト（１）一般的情報：（ｉ）出願人：リー、ユンミン（原文；Ｌｅ、Ｊｕｎｍｉｎｇ）ヴイルチェック、ヤン（原文；Ｖｉ　１ｃｅｋ、Ｊａｎ）ダッドーナ、ビータ−・イー。

（原文；Ｄａｄｄｏｎａ、Ｐｅｔｅｒ　Ｅ、）グレイニップ、ジョン（原文；Ｇｈｒａｙｅｂ、Ｊｏｈｎ）ナイト、ディピッド・エム。

（原文；Ｋｎｉｇｈｔ、Ｄａｖｉｄ　Ｍ、）シーゲル、スコツト・エイ。

（原文；Ｓｉｅｇｅｌ、５ｃｏｔｔ　Ａ、）（ｉ　ｉ）発明の名称：ヒト腫瘍壊死因子に特異的なモノクローナルなキメラ抗体（ｉｉｉ）配列の数：１（ｉｖ）通信宛先（Ａ）宛先ニブロウディ　アンド　ナイマーク（原文；Ｂｒｏｗｄｙ　ａｎｄ　Ｎｅｉｍａｒｋ）（Ｂ）ストリート：４１９　セブンス　ストリート、エヌダブリュ（Ｃ）シティニワシントン（Ｄ）ステイト：ＤＣ（Ｅ）郵便番号：　２０００４（Ｖ）コンピューターの読み込み形式：（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンビニ−ター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ）本願に関するデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願口：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先の出願のデータ（八）出ｌｌ′ｉ番号：ｌＪＳ　０７／６７０，８２７（Ｂ）出願口：ｌ９９１年３月１８日（ｉｘ）通信先（Ａｌ電話番号：　２１２−６２８−５１９７（Ｂ）ファクシミリ番号二２１２ −７３７−３５２８（２）ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：ｌに関する情報：（ｉｌ配列の特徴：（Ａ）長さ＝１５７個のアミノ酸（Ｂｌｌコ二アミノ酸Ｃ）１−ポロジーニー次配列（ｉｉ）分子種：ペプチド（ｘｉ）配列の描写：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：第１図（Ａ２）腹水の希釈第２図ｒ　Ｈｕ　ＴＮＦの６０℃でのインキュベーション第３図＋　１　１０　１００１０００　＋００００ＭＡｂ　ｎｇ／ｍｌ −書＝ナチェラル　ヒト　ＴＮＦ −〇−組換え　ヒト　ＴＮＦ −＾−コントロールｕｌｕｏｉ９　’Ｏ’０ｕｌｕｏｉ　’Ｏ’０ｕｕｕ　ｏｖｃ＋　’ａ’。

０００　ｏｏｏ□ｏｏｏ　ＯＯ■　の　Ｎ　■　０　寸　ｎ　〜　−ｕｌＵＱθ９　’Ｇ’０第８ａ図ｐへ２ＨＧ１ｏｐｇｐ＋第８ｂ図ａｍＨＩｐへ２ＨｕＫａｐｇｐ＋第９ａ図第９ｂ図マウス八２ｎｑ／ｍｌ第１ｏａ図結合１　ｎｇ第１０　ｂ図結合阪　ｎｇ第１１図１　１　ＩＱ　＋００　１０００　１００１００Ｏ０ｎｑ／ｍｌ第１２図ｃｐｍト１２５第１４８図ＴＮＦ　配列第１４　ｂ図ＴＮＦ　配列国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　７／１０１３１００　ＺＮＡ１５／２８　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０Ｃｌ３Ｆ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ（Ｃ１２Ｐ　２１１０８（７２）発明者　リー、ユンミンアメリカ合衆国　ニューヨーク州１１３７２ジャックソン・ヘイツ、ナインティ・セカンド・ストリート、　３３−２６．エイピーティー、３　エックス（７２）発明者　ヴイルチェック、ヤンアメリカ合衆国　ニューヨーク州１００２１ニューヨーク、セブンティ・ナインス・ストリート、１８０　イー。

Ｉ（７２）発明者　ダッドーナ、ピータ−・イー。

アメリカ合衆国　ペンシルバニア州１９３８０ウェスト・チェスター、メアリーデル・ドライブ　６４２（７２）発明者　グレイニップ、ジョンアメリカ合衆国　ペンシルバニア州１９３７２スローンディール、レイ・ロード　３２０２フロントページの続き（７２）発明者　ナイト、ディビット・エム。

アメリカ合衆国　ペンシルバニア州１９３０１パオリ、フェザント・ラン・ドライブ（７２）発明者　シーゲル、スコツト・エイ。

アメリカ合衆国　ペンシルバニア州１９３８０ウェスト・チェスター、ハンター・レーン１４１５

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対する高親和性マウスモノクローナル抗体であって、（ａ）抗体Ａ２のＴＮＦとの結合を競合的に阻害し、（ｂ）ヒトＴＮＦαの中和性エピトープに結合する抗体。
２．請求項１に記載のマウスモノクローナル抗体であって、検出可能にラベルされているもの。
３．ヒトの免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部と、ヒトのＴＮＦαに特異性を有するヒト以外の免疫グロブリンの可変部分の少なくとも一部を含むキメラ免疫グロブリン鎖。
４．請求項３に記載のキメラ免疫グロブリン鎖であって、Ｈ鎖とＬ鎖を有するもの。
５．請求項３に記載のキメラ免疫グロブリン鎖であって、不変領域がヒト起源のものであるもの。
６．２個のＬ鎖と２個のＨ鎖を有し、そのおのおのが不変領域の少なくとも一部と可変領域の少なくとも一部からなり、可変領域がヒトＴＮＦαに対して特異性を有し、生体内で、ヒトＴＮＦαの中和作用を有するエピトープに高い親和性をもって結合するキメラ抗体分子。
７．請求項６に記載のキメラ抗体であって、ＴＮＦβに結合しないもの。
８．請求項６に記載のキメラ抗体であって、可変領域および不変領域がマウス起源であるもの。
９．請求項６に記載のキメラ抗体であって、その可変領域がヒトＴＮＦαの中和作用を有するエピトープに結合する高親和性マウスモノクローナル抗体から誘導されるもの。
１０．請求項９に記載のキメラ抗体であって、該マウスモノクローナル抗体がＡ２またはｃＡ２のＴＮＦαに対する結合を競合的に阻害するするもの。
１１．請求項９に記載のキメラ抗体であって、該マウスモノクローナル抗体がＡ２であるもの。
１２．請求項６に記載のキメラ抗体であって、会合定数（Ｋａ）で示される親和性が少なくとも１×１０８ｌ／ｍｏｌであるもの。
１３．請求項６に記載のキメラ抗体であって、会合定数（Ｋａ）で示される親和性が少なくともｌ×１０９ｌ／ｍｏｌであるもの。
１４．請求項６に記載のキメラ抗体であって、少なくとも１μｇ／ｍｌで、ＩＤ５０でヒトＴＮＦαを中和するもの。
１５．請求項６に記載のキメラ抗体であって、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌでＩＤ５０でヒトＴＮＦαを中和するもの。
１６．請求項６に記載のキメラ抗体であって、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌで、ＩＤ５０でヒトＴＮＦαを中和するもの。
１７．請求項６に記載のキメラ抗体であって、検出可能にラベルされているもの。
１８．請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、ハイプリドーマによりまたは組換えにより産生される検出可能にラベルされたもの。
１９．請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、ｈＴＮＦαの残基８７− １０８、または５９−８０および８７−１０８の両者と結合する抗原結合領域を有するもの。
２０．請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、それ自身、そのフラグメント、または領域がＳＥＱＩＤＮＯ：１のｈＴＮＦαのアミノ酸１１−１３、３７−４２、４９−５７または１５５−１５７に含まれる１個以上のエピトープに結合しないもの。
２１．（ａ）モノクローナル抗体Ａ２のマウスモノクローナル抗体、または（ｂ）モノクローナル抗体ｃＡ２のマウス／ヒトーキメラモノクローナル抗体に相当する抗ＴＮＦ結合領域またはそのフラグメントを有する抗ＴＮＦ抗体。
２２．ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸残基８７−１０８または５９−８０および８７−１０８の両者からなる群から選ばれる少なくとも５個のアミノ酸からなるＴＮＦペプチドであって、ＴＮＦのＴＮＦレセプターへの結合を実質的に阻害するように、レセプター結合配列と結合することによる抗ＴＮＦ生物学的活性を有する抗ＴＮＦ抗体のエピトープを有するＴＮＦポリペプチド。
２３．請求項２２に記載のＴＮＦポリペプチドであって、実質的に、ＳＥＤＩＤＮＯ：１のアミノ酸５９−８０としての【配列があります】およびＳＥＤ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸８７−１０８として【配列があります】の少なくとも一つの配列の３ないし２２個のアミノ酸からなるＴＮＦポリペプチド。
２４．請求項１に記載の抗体もしくはそのフラグメント、領域部分、またはその薬学的に許容されエステル、エーテル、硫酸塩，炭酸塩、グルクロン化物もしくはその塩、および薬学的に許容される担体からなる薬学的組成物。
２５．単離ＴＮＦポリヌクレオチドであって、請求項６に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列からなり、該ヌクレオチド配列が、少なくとも一つの不変領域との作動連関（連鎖）において少なくとも一つの不変領域をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
２６．請求項２５に記載のポリヌクレオチドであって、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するもの。
２７．請求項２５に記載のポリヌクレオチドであって、それ自身が発現担体であるもの。
２８．請求項２５に記載のポリヌクレオチドで転換され、またはトランスフェクトされた宿主。
２９．請求項２８に記載の宿主であって、真核細胞または細菌細胞であるもの。
３０．請求項２９に記載の宿主であって、哺乳類の細胞であるもの。
３１．請求項６に記載の抗体またはそのフラグメント、領域部分の製法であって、（ａ）請求項２８に記載の宿主を抗体が回収可能の量で発現するように培養し、（ｂ）該抗体、またはそのフラグメント、領域部分を宿主または培養物から回収することからなる製法。
３２．ＴＮＦαによって仲介される疾患を有する患者の治療法であって、患者に請求項２４に記載の薬学的組成物の治療量を投与することからなる治療法。
３３．ＴＮＦαによって仲介される疾患を有する患者の治療法であって、患者に請求項４２に記載の薬学的組成物の治療量を投与することからなる治療法。
３４．試料からＴＮＦαもしくはそのフラグメントまたは該ＴＮＦαを含む免疫複合体から該ＴＮＦαを除去するための、（ａ）該試料を、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント、領域部分であって、該ＴＮＦα、その部分または免疫複合体が固定された抗体、フラグメント、または領域部分が可逆的に結合して、結合したＴＮＦα、その部分または免疫複合体を生成するように支持体に結合されたもの、を含む手段と接触させ、（ｂ）該結合抗体、フラグメント、または領域部分から、結合したＴＮＦα、その部分、または免疫複合体を回収することからなる方法。
３５．試料からＴＮＦαもしくはそのフラグメントまたは該ＴＮＦαを含む免疫複合体から該ＴＮＦαを除去するための、（ａ）該試料を、請求項６に記載の抗体またはそのフラグメント、領域部分であって、該ＴＮＦα、その部分または免疫複合体が固定された抗体、フラグメント、または領域部分に可逆的に結合して、結合したＴＮＦα、その部分または免疫複合体を生成するように支持体に結合されたもの、を含む装置と接触させ、（ｂ）該結合抗体、フラグメント、または領域部分から、結合したＴＮＦα、その部分、または免疫複合体を回収することからなる方法。
３６．体液中の高レベルのＴＮＦαに関係する疾患または症状を有することを疑われている患者を治療するための、（ａ）請求項３４に記載の方法によって、該体液から該ＴＮＦαを除去し、（ｂ）該体液を患者に戻すことからなる方法。
３７．体液中の高レベルのＴＮＦαに関係する疾患または症状を有することを疑われている患者を治療するための、（ａ）請求項３５に配置の方法によって、該体液から該ＴＮＦαを除去し、（ｂ）該体液を患者に戻すことからなる方法。
３８．試料中のヒトのＴＮＦα検出する免疫検定方法であって、（ａ）該試料を請求項１に記載の抗体、またはそのフラグメント、領域部分と接触させ、（ｂ）抗体と該ＴＮＦαの結合を検出することからなる方法。
３９．試料中のヒトのＴＮＦα検出する免疫検定方法であって、（ａ）該試料を請求項６に記載の抗体、またはそのフラグメント、領域部分と接触させ、（ｂ）抗体と該ＴＮＦαの結合を検出することからなる方法。
４０．請求項３２に記載の患者の治療方法であって、該疾患が敗血症症候群、悪液質、循環虚脱、急性および慢性の細菌感染、ウィルス感染、真菌感染によるショック、紅斑性狼蒼、リウマチ性関節炎、アルコール誘発性肝炎、慢性炎症性疾患、脈管炎症性疾患，ＧＶＨ疾患、カイサキ病、および悪性疾患の一つである方法。
４１．請求項３３に記載の患者の治療方法であって、該疾患が敗血症症候群、悪液質、循環虚脱、急性および慢性の細菌感染、ウィルス感染，真菌感染によるショック、紅斑性狼蒼、リウマチ性関節炎、アルコール誘発性肝炎、慢性炎症性疾患、脈管炎症性疾患、ＧＶＨ疾患、カイサキ病、および悪性疾患の一つである方法。
４２．請求項６に記載の抗体、もしくはそのフラグメント、領域部分、またはその薬学的に許容されるエステル、エーテル、硫酸塩、炭酸塩、グルコン化物もしくはその塩と、薬学的に許容できる担体からなる薬学的組成物。