JPH04502408A - ＩＬ―２レセプターのｐ５５ Ｔａｃタンパク質に特異的なキメラ免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ−２レセプターのｐ５５　Ｔａｃタンパク質に特異的なキメラ免疫グロブリ ン 発明の分野 本発明は一般に、新規治療薬を開発するための組換えＤＮＡ技術とモノクローナ ル抗体技術の組合せに関し、更に詳しくは、非免疫原性抗体の製造およびそれら の利用に関する。

発明の背景 哺乳類では、外来物質、即ち抗原、と特異的に相互作用する２つのタイプの細胞 によって免疫応答が媒介される。それらの細胞タイプの１つであるＢ細胞は、抗 体の生産を担う。

第二の細胞クラスであるＴ細胞は、Ｂ細胞とＴ細胞を含む広範な他の造血細胞の 両者の生体内機能を調節する様々な細胞サブセットを包含する。

Ｔ細胞がこの調節に力を及ぼす１つの方法は、最初はＴ細胞増殖因子と命名され たインターロイキン−２（ＩＬ−２＞として知られるリンホカインの生産を通し てである。ＩＬ−２の主な機能はＴ細胞の刺激と維持であると思われる。実際、 成る免疫学者はＩＬ−２が全免疫応答の中心にあるだろうと考えている［　Ｆａ ｒｒａｒ、Ｊ、ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、６３　：　１２９−１６６（１９ ８２）参照、これは参考として本明細書に組み込まれる〕。

その生物学的作用を及ぼすために、ＩＬ−２は特異的な高親和性膜レセプターと 相互作用する［Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｗ、　、ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ　ｌ（ｅｍ ａｔｏｌｏｇｙ　ＸＩＶ、　Ｂ、Ｂｒｏｗｎ編、Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔａｔ ｔｏｎ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９８６）、　２８３〜頁〕。ヒトＩＬ−２レセ プターは複雑な多重鋼の糖タンパク質であり、１本の鎖はＴａｃペプチドとして 知られ約５５に口のサイズである［Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ。

２６０　：　１８７２　（１９８５）参照、これは参考として本明細書中に組み 込まれる〕。このタンパク質をコードする遺伝子が単離されており、そして２１ アミノ酸のシグナルペプチドを含む２７２アミノ酸のペプチドを推定している［ Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３１１　：　６２６　（１９８４）参 照〕。ｐ５５　Ｔａｃタンパク質のＮ−末端の２１９アミノ酸は明らかに細胞外 領域を含んで成る［　Ｌｅｏｎａｒｄ。

胃、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　６３３−６３９　（１９８４）参照、こ れは参考として本明細書に組み込まれる〕。

ヒトＩＬ−２レセプターの構造と機能の解明のほとんどは、特異的反応性モノク ローナル抗体の開発のためである。特に、抗−Ｔａｃとして知られるマウスモノ クローナル抗体［Ｕｃｈｉ−ｙａｍａら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２６　：　 １３９３　（１９８１）　）は、ＩＬ−２レセプターがＴ細胞上だけでなく、単 球−マクロファージ群、肝臓のタッパ−細胞、皮膚のランゲルハンス細胞および もちろん活性化されたＴ細胞上でも検出され得ることを示した。重要なことには 、静止Ｔ細胞、Ｂ細胞または循環しているマクロファージは、典型的にはＩＬ− ２レセプターを提示しない［ｆｌｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６ ２：　１１１１　（１９８５）　］。

］抗−Ｔａｃモノクローナル抗は、ＩＬ−２相互作用を必要とするリンパ球機能 を明らかにするためにも用いられており、そして細胞培養における細胞毒性およ びサプレッサーＴリンパ球の発生を含む様々なＴ細胞機能を抑制することが示さ れている。また、抗−Ｔａｃおよび他の抗体を用いた研究に基づき、様々な障害 、特に成人Ｔ細胞白血病がＴ細胞による不適当なＩＬ−２レセプター発現に関係 づけられている。

より最近になって、ＩＬ−２レセプターはＴ細胞介在性疾患に対する新規治療ア プローチの理想的な標的であることが示された。ＩＬ−２レセプター特異的抗体 、例えば抗−Ｔａｃモノクローナル抗体を単独でまたは免疫複合体（例えばリシ ンＡ鎮、同位体等との免疫複合体）きして用いて、ＩＬ−２レセプターを有する 細胞を効果的に除去できることが提唱されている。例えばそれらの薬剤は、理論 上はＩＬ−２レセプターを発現している白血病細胞、成る種のＢ細胞、または病 気状態に関与する活性化されたＴ細胞を排除することができ、その上さらに必要 とされる時には成熟正常Ｔ細胞およびそれらの前駆体の保持によって正常Ｔ細胞 免疫応答を開始する能力を保証する。一般に、他のＴ細胞特異的薬剤の多くは本 質的に全ての周辺のＴ細胞を破壊し得、このことは薬剤の治療効能を制限する。

全体に、ＩＬ−２レセプターに特異的な適当なモノクローナル抗体の使用は、自 己免疫疾患、器官移植および活性化されたＴ細胞による任意の望ましくない応答 において療法的効用を有することができる。実際、例えば抗−Ｔａｃ抗体を使っ て臨床試験が開始されている〔一般に、Ｗａｌｄ−ｍａｎ、　Ｔ、ら、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、　４５　：　６２５　（１９８５）およびＷａｌｄｍａｎ、　Ｔ 、　。

考として本明細書中に組み込まれる〕。

不運にも、抗−Ｔａｃおよび他の非ヒトモノクローナル抗体の使用は、特に下記 に説明されるような繰り返し治療摂生において、幾つかの欠点を有する。例えば 、マウスモノクローナル抗体はヒト補体を十分に結合せず、そしてヒトにおいて 使用すると他の重要な免疫グロブリン機能特性を欠く。

おそらくより重要なのは、抗−Ｔａｃおよび他の非ヒトモノクローナル抗体が、 ヒト患者に注入すると免疫原性となるであろう実質的長さのアミノ酸配列を含む ことである。外来抗体の注入後、抗体に対して患者により惹起された免疫応答が 非常に強力であり、最初の処置後の抗体の治療効用を本質的に排除しうることを 多数の研究が示している。更に、様々な病気を処置するために増加する数の異な るマウスまたは他の抗原性（ヒトに対して）モノクローナル抗体が開発されるこ とが期待され得るので、任意の異なる非ヒトモノクローナル抗体での第一または 第二の処置後、無関係の治療のためでさえもその後の処置が無効または危険にな り得る。

いわゆる「キメラ抗体」　（例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス可変領域 ）は幾らか好結果であることが判明したが、重要な免疫原性の問題が残っている 。一般に、多数のヒト抗原と同じく、ヒトＩＬ−２レセプターと反応するヒト免 疫グロブリンの生産は、典型的なヒトモノクローナル抗体生産技術を使うことは 非常に困難である。同様に、いわゆる「ヒト化された」抗体（例えばＥＰＯ公報 Ｎα０２３９４００を参照は、一部は予想不可能な結合親和性のためである不確 かな結果を提供する。

従って、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療製剤および他の用 途に適当である形態において容易に且つ経済的に生産される改良形のヒト様免疫 グロブリン、例えばヒ）ＩＬ−２レセプターに特異的なもの、に対する要求が存 在する。本発明はそれらおよび他の要求を満たす。

発明の要約 本発明は、例えばＴ細胞により媒介されるヒト障害の処置において有用である新 規組成物を提供し、該組成物は、ＩＬ−２レセプターへのヒ）ＩＬ−２の結合を 特異的に阻止することができそして／またはヒトＩＬ−２レセプター上のｐ５５ Ｔａｃタンパク質に結合することができるヒト様免疫グロブリンを含有する。該 免疫グロブリンは、２対の軽鎖／重鎮複合体を有し、典型的には少なくとも１対 がヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結されたマウス相補性決定領 域を含んで成る鎖を有する。例えば、追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を有 するかまたは有しないマウス相補性決定領域を用いて、約１０”Ｍ−’よりも強 力な親和力レベルにおいてヒトＩＬ−２レセプターに結合することができるヒト 様抗体を生産することができる。

結合性断片または他の誘導体を包含する免疫グロブリンは、様々な組換えＤＮＡ 技術により、トランスフェクトされた細胞、好ましくは不死化された真核細胞、 例えばミエローマまたはハイブリドーマ細胞中での最大発現を使って生産するこ とができる。ヒト様免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第一の配列 と所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二の配列を含んで成るポ リヌクレオチドは、合成的にまたは適当なｃＤＮＡとゲノムＤＮＡセグメントを 結合することによって作製することができる。

ヒト様免疫グロブリンは、実質的に純粋な形態で単独に、または細胞毒性物質、 例えば放射性核種、リポソーム阻害タンパク質もしくは細胞表面において活性な 細胞毒性物質と複合体化して、使用することができる。それらの化合物は全て、 特にＴ細胞により媒介される障害を処置することにおいて有用であろう。ヒト様 免疫グロブリンまたはそれらの複合体は、投与の形式に依存するであろう医薬上 許容される剤形において調製することができる。

本発明は、供与体免疫グロブリンからの１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ ）およびヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域を有するヒト様免疫グロ ブリン鎖を設計するための新規方法も提供する。好ましい方法は、供与体免疫グ ロブリンのフレームワークまたは可変領域のアミノ酸配列をヒト免疫グロブリン 鎖のコレクション中の対応する配列と比較し、そして該コレクションからより相 同性の高い配列の１つをヒト免疫グロブリンとして選択することを含んで成る。

ヒト免疫グロブリンまたは受容体免疫グロブリン配列は、典型的には少なくとも １０〜２０の免疫グロブリン鎖配列のコレクションから選択され、そして通常は 該コレクション中のいずれかの配列の供与体免疫グロブリン配列に最も高い相同 性を有するだろう。ヒト免疫グロブリンフレームワーク配列は、供与体免疫グロ ブリンフレームワーク配列に対して典型的には約６５〜７０％またはそれ以上の 相同性を有するだろう。供与体免疫グロブリンは重鎮または軽鎖（または両方） のいずれであってもよく、そしてヒトコレクションは同じ種類の鎖を含有するだ ろう。ヒト化された軽鎖または重鎮を用いて、部分または全長のヒト定常領域お よび別のタンパク質を含むかまたは含まない、２対の軽鎖７型鎮を有する完全な ヒト化免疫グロブリンまたは抗体を形成せしめることができる。

本発明の別の態様によれば、上記の比較段階と共にまたは別々に、受容体免疫グ ロブリン中の追加のアミノ酸をＣＤＲ−供与体免疫グロブリン鎮からのアミノ酸 と置き換えることができる。更に特定的には、供与体免疫グロブリンからのフレ ームワークアミノ酸による受容体免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸 の更なる任意の置換は、次のような免疫グロブリン中の位置において行うことが できる：（ａ）受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の該アミン酸 がその位置に稀であり、そして供与体免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がヒ ト免疫グロブリン中のその位置に普通である； （ｂ）該アミノ酸がＣＤＨの１つのすぐ近くである；または （Ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３人以内に あり、そしてヒト化免疫グロブリンのＣＤＲまたは抗原と相互作用することがで きると予想される。

ヒト化免疫グロブリン鎮は、典型的には、ＣＤＲに加えて供与体免疫グロブリン からの少なくとも約３アミノ酸を含んで成り、通常は少なくともその１つが供与 体免疫グロブリン中のＣＤＨのすぐ近くであろう。３つの位置基準のうちのいず れか１つまたは全部を使うことにより重鎮および軽鎖を各々設計することができ る。

完全な抗体に結合される時、本発明のヒト化された軽鎖および重鎮はヒトにおい て実質的に非免疫原性であり１．そして供与体免疫グロブリンと実質的に同じ抗 原（例えばエビ）　−プを含むタンパク質または他の化合物）への親和力を保持 しているだろう。それらの親和力レベルは約１０”Ｍ−’以上から様々に異なる ことができ、そして抗原への供与体免疫グロブリンのもとの親和力の約４倍以内 であろう。

図面の簡単な説明 図１：抗−Ｔａｃ重鎮（上行）およびＥｕ重鎮（下行）の配列の比較。アミノ酸 の１文字記号が用いられている。各行の最初のアミノ酸に左側に番号を付けであ る。２つの配列中の同じアミノ酸は線でつながれている。３つのＣＤＲには下線 が付しである。ヒト化抗−Ｔａｃ重鎮においてＥｕアミノ酸よりもむしろ抗−Ｔ ａｃアミノ酸が使用された他のアミノ酸位置は★で示されている。

図２＝抗−Ｔａｃ軽鎖（上行）およびＥｕ軽鎖（下行）の配列の比較。アミノ酸 の１文字記号が用いられている。各行の最初のアミノ酸に左側に番号を付けであ る。２つの配列中の同じアミノ酸は線でつながれている。３つのＣＤＨには下線 が付しである。ヒト化抗−Ｔａｃ重鎮においてＥｕアミノ酸よりもむしろ抗−Ｔ ａｃアミノ酸が使用された他のアミノ酸位置は★で示されている。

図３＝ヒヒト抗−Ｔａｃ重鎮可変領域遺伝子のヌクレオチド配列。タンパク質を コードする遺伝子の部分についての翻訳アミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に 示されている。該遺伝子の始まりと終わりのヌクレオチドＴＣＴＡＧＡはＸｂａ 　Ｉ部位である。成熟重鎮配列はアミノ酸＃２０のＱで始まる。

図４：ヒト化抗−Ｔａｃ軽鎮可変領域遺伝子のヌクレオチド配列。タンパク質を コードする遺伝子の部分についての翻訳アミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に 示されている。該遺伝子の始まりと終わりのヌクレオチドＴＣＴＡＧＡはＸｂａ 　Ｉ部位である。成熟重鎮配列はアミノ酸＃２１のＤで始まる。

図５：Ａ、ヒト化ヒトＴａｃ重鎖遺伝子を合成するのに用いた、５′から３′方 向に記載した４つのオリゴヌクレオチドの配列。Ｂ、前記オリゴヌクレオチドの 相対位置。矢印は各オリゴヌクレオチドの３′方向を指している。

図６：（Ａ）ヒト化抗−Ｔａｃ軽鎖遺伝子を合成するのに用いた、５′から３′ 方向に記載した４つのオリゴヌクレオチドの配列。（Ｂ）前記オリゴヌクレオチ ドの相対位置。矢印は各オリゴヌクレオチドの３′方向を指している。ＪＦ口２ とＪＦＤ３とのオーバーラツプ中の旧ｎｄ１１１部位の位置が示されている。

図７：ヒヒト抗−Ｔａｃ重鎮を発現させるのに用いるプラスミドｐＨｕＧＴＡｃ １の略図。関係する制限部位が示されており、そして重鎮のコード領域が箱とし て表示されている。免疫グロブリン（Ｉｇ）プロモーターからの転写方向が矢印 により示されている。Ｅ□＝重鎮エンハンサ−１）ｌｙｇ＝ヒグロマイシン耐性 遺伝子。

図８：ヒト化抗−Ｔａｃ軽鎮を発現させるのに用いるプラスミドｐＦｌｕＬＴＡ ｃの略図。関係する制限部位が示されており、そして軽鎖のコード領域が箱とし て表示されている。Ｉｇプロモーターからの転写方向が矢印により示されている 。

図９：抗−Ｔａｃ抗体またはヒト化抗−Ｔａｃ抗体に次いで標識としてフルオレ セイン接合ヤギ抗マウスＩｇ抗体またはヤギ抗ヒ）Ｔｇ抗体でそれぞれ染色され たＨｕｔ−１０２およびＪｕｒｋａｔ細胞のフルオロサイトメトリー。各パネル において、点線曲線は第一抗体が削除された時の結果を示し、実線曲線は記載さ れた第一および第二（接合）抗体を含む時の結果を図１０＋　（Ａ）指摘される ような０〜４０ｎｇの抗−Ｔａｃ　、次いでビオチン化抗−ＴａＣ１次にフイコ エリトリン接合アビジンで染色されたＨｕｔ−１０２細胞のフルオロサイトメト リー。

（Ｂ）指摘の抗体、次いでビオチン化抗−Ｔａｃ　、次にフイコエＵ　）　ＩＪ ン接合アビジンで染色されたＨｕｔ−１０２細胞のフルオロサイトメトリー。

発明の詳細な記載 本発明の一態様によれば、所望のエピトープ、例えばヒトＴ細胞上のＩＬ−２レ セプター上のエピトープ、と特異的に反応するヒト様免疫グロブリンが提供され る。それらの免疫グロブリンは、少なくとも約１０＠Ｍ−１好ましくは１０’Ｍ −’〜１０１０Ｍ’″Ｉまたはそれ以上の結合親和力を有し、例えばヒトＩＬ− ２レセプターへのＩＬ−２の結合を阻止することができる。ヒト様免疫グロブリ ンは、ヒト様フレームワークを有し、そしてｐ５５　Ｔａｃタンパク質上のエピ トープと特異的に反応する免疫グロブリン、典型的にはマウス免疫グロブリンか らの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有することができる。本発明の免疫グロブリン は、経済的に大量に生産することができ、例えば、種々の技術によるヒト患者に おけるＴ細胞介在性障害の処置において、用途を見出す。

基本的な抗体構造単位は４量体を含むことが知られている。

各４量体は全く同じ２対のポリペプチド鎖から成り、多対は１本の「軽」　（約 ２５に口）鎖と１本の「重」　（約５０−７０ｋＤ）鎖を有する。重鎖のＮ１３ −末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可 変領域で始まる。重鎖のＣ００Ｈ−末端は、主にエフェクター機能を担う定常領 域を限定する。

軽鎖はにまたはλのいずれかとして分類される。重鎮はγ。

μ、α、δまたはεとして分類（および細分類）され、そしてそれぞれＩｇＧ、 ＩｇＭ、　ＪｇＡ、　ＩｇＤおよびＩｇＥとして抗体のイソタイプを限定する。

軽鎖および重鎖中の可変および定常領域は、約１２またはそれより多数のアミノ 酸の１Ｊ”領域により連結され、重鎮は約１２またはそれより多数のアミノ酸の “Ｄ″領域含む〔一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐ ａｕｌ、Ｗ、編、第７章、第１３１−１６６頁、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ 、Ｙ、　（１９８４）を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれ る〕。

各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗原結合部位を形成する。鎖は全て、３つの超可変 領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域という同じ一般構 造を示す〔“５ｅｑｕｅ−ｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、Ｋａｂａｔ、Ｂ。

ら、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　）ｌｕｍａ ｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　（１９８３）；並びにＣｈｏｌｔｈｉａおよびＬｅｓ ｋ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１９６：　９０１−９１７（１９８７）を参 照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。多対の二本鎖から のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープへの結合 を可能に本明細書中で使用する「免疫グロブリン」なる用語は、免疫グロブリン 遺伝子により実質的にコードされる１または複数のポリペプチドから成るタンパ ク質について呼称する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、に、λ、α 、γ。

δ、εおよびμ定常領域遺伝子、並びに秦数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が 挙げられる。免疫グロブリンは抗体の他に様々な形態で存在することができ、例 えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ　（ａｂ）　ａ並びに−重鎖を包含する〔例えば、 Ｈｕｓｔｏｎら、ｎμ二Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８５：　 ５８７９−５８８３　（１９８８）およびＢ’ｉｒｄら、細書中に組み込まれる 〕。〔一般に、Ｈｏｏｄら、“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”。

Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｎ、Ｙｏ、第２版（１９８４）　；並びにＨｕｎｋａｐ　 ｉ　１１ｅｒおよびＨｏｏｄ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２３　：　１５−１６　（ １９８６）を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる。〕キ メラ抗体は、典型的には遺伝子操作によって軽鎖および重鎮遺伝子が異なる種に 属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから作製されている抗体である。例えば 、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをヒト定常（ Ｃ）セグメント、例えばγ、およびＴ、に結合することができる。典型的な療法 用キメラ抗体はマウス抗体からのＶまたは抗原結合領域とヒト抗体からのＣまた はエフェクター領域とから成るハイブリッドタンパク質である（例えば、献Ｔ、 　Ｃ０Ｃ，登録番号ＣＲＬ　９６８８は抗−Ｔａｃキメラ抗体を分泌する）が、 他の哺乳動物種を使用することもできる。

本明細書中で使用する「フレームワーク領域」なる用語は、Ｋａｂａｔら、前掲 により定義されたように、単一種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存 される免疫グロブリン軽鎖および重鎮可変領域の部分について呼称する。本明細 書中で使用する「ヒト様フレームワーク領域」なる用語は、各々存在する鎖にお いてヒト免疫グロブリン中のものと等しい少なくとも約７０またはそれ以上のア ミノ酸残基、典型的には７５〜８５またはそれ以上のアミノ酸残基を含んで成る フレームワーク領域である。

本明細書中で使用する「ヒト様免疫グロブリン」なる用語は、ヒト様フレームワ ーク領域を含んで成る免疫グロブリンについて言及し、この場合、存在する任意 の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に相同であり、即ち少なくと も約８５〜９０％、好ましくは約９５％が同一である。よって、１または複数の 生来のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に相同である。例えば、ヒト 様免疫グロブリンはマウス可変領域／ヒト定常領域キメラ抗体を包含しないだろ う。

本発明の別の一般的観点によれば、ヒト化された免疫グロブリン鎖を含んで成る 抗体の親和力を増加させるために、ヒト様またはヒト化免疫グロブリン鎮のフレ ームワーク中の限定された数のアミノ酸が受容体Ｉｇよりもむしろ供与体Ｉｇ中 のそれらの位置のアミノ酸と同じであるように選択される基準も含まれる。

本発明のこの観点は、（例としてＣＤＲの入手源としてマウス抗体を使って）ヒ ト化抗体を生産する従来方法における親和力の低下の２つの原因が、下記のため であるというモデルに基づく： （１）マウスＣＤＲをヒトフレームワークと結合する時、ＣＤＨに密接したフレ ームワーク中のアミノ酸がマウスの代わりにヒトになる。理論に結び付けようと せずに、本発明者らは、それらの変更されたアミノ酸が供与体マウス抗体中とは 異なる静電的または疎水的力を生じるため、それらがわずかにＣＤＲを歪め、そ して歪められたＣＤＲは供与抗体中のＣＤＲが行うのと同じくらい効果的な抗原 との接触を行うこ（２）また、ＣＤＨに密接しているがその一部ではない（即ち まだフレームワークの一部である）元のマウス抗体中のアミノ酸は、親和力の原 因である抗原との接触を行うことができる。全てのフレームワークアミノ酸がヒ トにされるので、抗体がヒト化される時にそれらのアミノ酸は失われる。

それらの問題を回避するため、および所望の抗原に対し非常に強力な親和力を有 するヒト化抗体を生産するために、本発明はヒト化免疫グロブリンを設計するの に次の４つの基準を使用する。それらの基準を単独でまたは必要な時は組み合わ せて使用し、所望の親和力または他の特徴を獲得することができる。

基準ｌ：受容体として、ヒト化しようとする供与体免疫グロブリンに非常に相同 である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用するか、または多 数のヒト抗体からの共通のフレームワークを使用すること。例えば、データバン ク（例えばＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏ ｕｎｄａｔｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｏｕ ｒｃｅ）中のヒト重鎖（軽鎖）可変領域に対するマウス重鎮（軽鎖）可変領域の 配列の比較は、異なるヒト領域に対する相同性の程度が典型的には約４０％から 約６０−７０％まで大幅に異なることを示す。受容体免疫グロブリンとして、供 与体免疫グロブリンの重鎮（それぞれ軽鎖）に最も相同であるヒト重鎮（それぞ れ軽鎖）の１つを選択することにより、供与体免疫グロブリンから受容体免疫グ ロブリンに移る際にほとんどアミノ酸が変化しないであろう。よって、ヒト化免 疫グロブリン鎮を含んで成るヒト化抗体の正確な全形状が供与抗体の形状と非常 によく似ており、ＣＤＲを歪める見込みを減らすことができる。

典型的には、重鎮フレームワークを提供するために、少なくとも約１０〜２０の 別個のヒト重鎮の代表的コレクションの中の３〜５の最も相同な重鎮可変領域配 列のうちの１つが受容体として選択され、軽鎖についても同様にして選択される だろう。好ましくは、１〜３の最も相同な領域のうちの１つが使用されるだろう 。選択された受容体免疫グロブリン鎖は、供与体免疫グロブリンに対してフレー ムワーク領域内が最も好ましくは少なくとも約６５％の相同性を有するだろう。

いかにして受容体免疫グロブリンを選択するかにかかわらず、受容体よりもむし ろ供与体中のそれらの位置のアミノ酸と同じになるようにヒト化免疫グロブリン 鎮のフレームワーク中の少数のアミノ酸を選択することによって、より高い親和 力を獲得することができる。好ましくは、それらの基準の１つを満足するほとん どまたは全てのアミノ酸位置において、供与体アミノ酸が実際に選択されるだろ う。

基準■：ヒヒト容体免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が、普通でな い〔即ち［まれである」　；本明細書中で使用されるこの用語は、代表的なデー タバンク中のヒト重鎮（それぞれ軽鎖）■領域配列のたった約ｌＯ％しかその位 置に存在しないアミノ酸を示す］場合、またはその位置の供与体アミノ酸がヒト 配列に典型的である〔即ち「普通である」；本明細書中で使用されるこの用語は 、代表的なデータバンク中の少なくとも約２５％の配列に存在するアミノ酸を示 す〕場合、受容体よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう。

この基準は、ヒトフレームワーク中の普通でないアミノ酸が抗体構造を破壊しな いことを保証するのに役立つ。更に、普通でないアミノ酸をたまたまヒト抗体に 典型的である供与抗体からのアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体を低免 疫原性にすることができる。

基準■：ヒヒト免疫グロブリン鎮中の３つのＣＤＨのすぐ近くの位置において、 受容体アミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう。それらのアミ ノ酸は、おそらく特にＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用し、もし受容体から選択さ れれば供与体ＣＤ　Ｒ，を破壊しそして親和力を低下させるであろう。更に、近 隣のアミノ酸は抗原と直接相互作用し１：Ａｍ１ｔら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３ ３．　７４７−７５３　（１９８６）、これは参考として本明細書中に組み込ま れる〕、供与体からそれらのアミノ酸を選択することは元の抗体にあける親和力 を提供する全ての抗原接触を維持するのに望ましいかもしれない。

基準■：典型的には元の供与抗体の３次元モデルは、ＣＤＲの外側の幾つかのア ミノ酸がＣＤＨに密接しておりそして水素結合、ファンデルワールス力、疎水的 相互作用等によりＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する相当な確率を有することを 示す。それらのアミノ酸位置では、受容体免疫グロブリンアミノ酸よりもむしろ 供与体アミノ酸が選択され得る。この基準に従ったアミノ酸は、通常はＣＤＲ中 の成る部位の約３入車位内に側鎖原子を有し、そして確立された化学的力、例え ば上記に列挙した力に従ってＣＤＲ原子と相互作用することができるような原子 を含まなければならない。抗体などのタンパク質のモデルを作成するためのコン ピュータープログラムが一般に利用可能であり、そして当業者に周知であるＣＬ ｏｅｗら、Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｑｕａｎｔ、ＣｈｅＩｌｌ、　、　Ｑｕａｎｔ、Ｂｉ ｏｌ−Ｓｙｍｐ、　、１５　：　５５−６６　（１９８８）；　Ｂｒｕｃｃｏｌ ｅｒｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３３　：　７５５−７５８（１９８６）を参照 のこと。これら全てが参考として本明細書中に組み込まれる〕。それらは本発明 の部分を構成しない。実際、全ての抗体が類似の構造を有するので、Ｂｒｏｏｋ ｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＤａｔａＢａｎｋから入手可能である既知の抗体 を必要であれば別の抗体の荒モデルとして利用することができる。商業的に入手 可能であるコンピュータープログラムを用いてコンピューター画面にそれらのモ デルを表示し、原子間の距離を算出し、そして種々のアミノ酸相互作用の可能性 を評価することができる。

ヒト化またはヒト様抗体は、ヒト療法において使用されるマウス抗体または成る 場合にはキメラ抗体を上回る少なくとも３つの潜在的利点を有する： １）エフェクタ一部分がヒトであるため、ヒト免疫系のその他の部分と良好に反 応することができる〔例えば、補体依存性細胞障害作用（ＣＯＣ）または抗体依 存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）により、より効果的に標的細胞を破壊する〕。

２）ヒト免疫系は外来物としてヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を認 識しないであろう。従ってそのような注入抗体に対する抗体応答は全体的に外来 のマウス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するよりも小さいであろう。

３）注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりもずっと短いヒト循凰中 の半減期を有することが報告されている［　Ｄ、　Ｓｈａｗら、Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、１３８　：　４５３４−４５３８　（１９８７））　、注入されたヒ ト化抗体は、おそらく天然のヒト抗体により類似した半減期を有し、より少量ま たは少頻度の用量を与えることを可能にするだろう。

本発明は、ＥＰＡ公報Ｎα０２３９４００に記載されたものに関して改善された ヒト化免疫グロブリン（例えば、ヒ）ＩＬ−２レセプターに結合することができ る）に特に向けられる。その出願明細書（その開示は本発明の範囲から除去され る）は、成る種の免疫グロブリンについて、受容体抗体の軽鎖または重鎮可変領 域中のＣＤＲ領域を異なる特異性の抗体からのＣＤＲの類似部分（典型的には溶 媒の影響を受けやすい部分）で置換することを記載している。また、その出願明 細書は、成る種の免疫グロブリンについて、抗原結合部位から（溶媒に）影響さ れやすい残基を単に移動する可能性を記載しており、この残基は明らかに幾つか のフレームワーク領域を含むことができる〔特に、Ａｎ＋ｉｔら、５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２３３　：　７４７−７５３（１９８６）に記載されたような抗原結合に 関与することが既知である残基、またはおそらく鎮間相互作用に必須である残基 −ただしそれらの選択については該出願明細書において不十分な指針しか与えら れていない〕。例えば、本発明の好ましい態様は、全ＣＤＲアミノ酸およびＣＤ Ｒの１つ（または好ましくは各々）のすぐ近くのフレームワークアミノ酸を置換 することを伴う。一般に、例えばコンホメーション（および普通はそれらの抗原 結合特異性）を維持するためにＣＤＲと連絡をとる任意のフレームワーク残基が 、上記に詳細に記載された本発明の好ましい態様の範囲内に特に含まれる。

１つの観点において、本発明は、所望のエピトープ、例えばヒトＩＬ−２レセプ ター上のエピトープ、に結合することができる免疫グロブリン（例えば抗−Ｔａ ｃモノクローナル抗体）からの重鎮および／または軽鎖ＣＤＲ（典型的には上述 したような別のアミノ酸残基を有する）をコードする組換えＤＮＡセグメントに 向けられる。それらの領域をコードするＤＮＡセグメントは、典型的にはヒト様 フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントに結合されるだろう。例えば 、発現時に抗−Ｔａｃ重鎮および軽鎖超可変領域（ヒト様フレームワーク領域と 共に）を含んで成るポリペプチド鎖をコードする好ましいＤＮＡ配列がそれぞれ 図３と図４に示されている。コドン縮重および重要でないアミノ酸置換のため、 後述するようにそれらの配列の代わりに他の配列を容易に用いることができる。

前記ＤＮＡセグメントは、典型的には、ヒト様抗体のコード配列に作用可能に連 結した発現調節ＤＮＡ配列、例えば天然由来のまたは異種のプロモーター領域、 を更に含むだろう。

好ましくは発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェク ションせしめることができるベクター中の真核生物プロモーター系であろうが、 原核生物宿主用の調節配列を用いることができる。ベクターが適当な宿主中に組 み込まれれば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適当な条件下で維持さ れ、そして所望する時、軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎮二量体もしくは完全な抗体、結 合性断片または他の免疫グロブリン形態の収得および精製を行うことができる。

ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、周知の方法に従って、種々のヒト細胞から、好まし くは不死化されたＢ細胞から単離することができる（Ｋａｂａｔ、前掲＄よび畦 ８７１０２６７１を参照のこと）。例えば、ヒトに免疫グロブリン定常およびＪ 領域遺伝子および配列はＨｅ　ｉ　ｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ　２２　：　１９７−２ ０７　（１９８０）中に記載されており、そしてヒト免疫グロブリンＣ丁＋遺伝 子のヌクレオチド配列はＢｌｌ　１ｓｏｎら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、 １０　：　４０７１（１９８２）中に記載されている　（その両者は参考として 本明細書中に組み込まれる）。本発明の免疫グロブリンを作製するためのＣＤＲ は、所望の抗原（例えばヒ）ＩＬ−２レセプター）に結合することができるモノ クローナル抗体から同様にして誘導され、そしてマウス、ラット、ウサギまたは 抗体を生産することができる他のを推動物を含む任意の便利な畷乳動物起源にお いて生産されるだろう。ＤＮＡ配列の適当な起源細胞並びに免疫グロブリンの発 現および分泌のための宿主細胞は、多数の入手源、例えばアメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクションから入手することができる〔“Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　 ｏｆＣｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ″ｆ　第５版（１９ ８５）　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　１１．Ｓ、Ａ−；これは参考として本明細書中に組み込ま れる〕。

本明細書中に特定的に記載のヒト様免疫グロブリンに加えて、他の「実質的に相 同の」変更免疫グロブリンを容易に設計することができ、そして当業者に周知の 様々な組換えＤＮＡ技術を使って製造することができる。例えば、ＩＬ−２レセ プター免疫グロブリンについては、フレームワーク領域は幾つかのアミノ酸置換 、末端および中間の付加および削除等により一次構造レベルで図３および図４の 配列と異なることができる。更に、本発明のヒト様免疫グロブリンを基準として 、種々の異なるヒトフレームワーク領域を単独でまたは組合せて用いることがで きる。一般に、遺伝子の修飾は種々の周知の技術、例えば部位特異的突然変異誘 発［Ｇｉｌｌｍａｎおよ考として本明細書中に組み込まれる］により容易に達成 することができる。あるいは、−吹拭体構造の一部分のみを含んで成るポリペプ チド断片を製造することができ、この断片は１または複数の免疫グロブリン活性 （例えば補体結合活性）を有する。また多数の遺伝子と同様、免疫グロブリン関 連遺伝子は、各々が１または複数の別個の生物活性を有する別々の機能性領域を 含むため、該遺伝子を別の遺伝子からの機能性領域（例えば酵素；　１９８７年 １２月１５日提出の一般譲渡されたＵ、　Ｓ、Ｓ、　Ｎ、１３２．３８７を参照 のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる）と融合させ、新規性質を 有する融合タンパク質（例えば免疫毒素）を製造することができる。

最終的に所望のヒト様抗体を発現することができる本発明の核酸配列は、様々な 異なるポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ％ＲＮＡ　、合成オリゴ ヌクレオチド等）および成分（例えばＶ、Ｊ、ＤおよびＣ領域）から、そして様 々な異なる技術により、形成せしめることができる。適当なゲノム配列を連結す ることが現在量も一般的な製造方法であるが、ｃＤＮＡ配列を使用してもよい〔 ヨーロッパ特許公報Ｎα０２３９４００およびＲｅｉｃｈｍａｎ、　ｌ、ら、Ｎ ａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７　（１９８７）を参照のこと。この両者は 参考として本明細書中に組み込まれる〕。

前に述べたように、該ＤＮＡ配列を発現調節配列に作用可能に連結した（即ち、 機能を保証するように配置させた）後で該配列が宿主中で発現されるだろう。そ れらの発現ベクターは、典型的にはエビソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの 組込み部分として宿主中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤ ＮＡ配列により形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー、例 えばテトラサイクリンまたはネオマイシン耐性遺伝子を含むだろう（例えば、米 国特許第４．７０４．３６２号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組 み込まれる）。

大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）は本発明のＤＮＡ配列をクローニングするのに特に有用 な原核生物宿主である。使用に適当な他の微生物宿主としては、バシラス菌、例 えばバシラス・サブチリス（Ｂａｃ自１ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、並びに他 の腸内細菌、例えばサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　、セラチア菌（Ｓ ｅｒｒａｔ　ｉａ）および種々のシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 種が挙げられる。それらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合性であ る発現調節配列（例えば複製開始点）を含むであろう発現ベクターを作製するこ ともできる。加えて、任意の数の種々の周知のプロモーター、例えばラクトース プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼ プロモーター系、またはλファージからのプロモーター系が存在するだろう。プ ロモーターは、典型的には所望によりオペレーター配列と共に発現を調節し、そ して転写および翻訳を開。　始および終了させるためのリポソーム結合部位等を 有するだろう。

他の微生物、例えば酵母を発現に用いることもできる。サツカロミセス（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい宿主であり、適当なベクターは、発現調節配 列、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖酵素プロモーターを 包含するプロモーター、並びに所望により複製開始点、終結配列等を有する。

微生物に加えて、哺乳動物組繊細胞培養物を用いて本発明のポリペプチドを発現 および生産せしめることもできる［Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、　”Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎ ｅｓ　ｔｏ　Ｃ１ｏｎｅｓ”、　ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ。

Ｙ、、　Ｎ、Ｙ、（１９８７）を参照のこと：これは参考として本明細書中に組 み込まれる〕。完全な免疫グロブリンを分泌することができる多数の適当な宿主 細胞系が技術の現状において開発されているため実際は真核細胞が好ましい。そ のような真核細胞としては、ＣＨＯ細胞細胞種々のＣＯ８細胞系、ＨｅＬａ細胞 、ミエローマ細胞系等が挙げられるが、好ましくは形質転換されたＢ細胞または ハイブリドーマである。それらの細胞のための発現ベクターは、発現調節配列、 例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサ−［Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，ら、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、　８９：４９−６８　（１９８６）　；これは゛参考とし て本明細書中に組み込まれる〕、および必要なプロセシング情報部位、例えばリ ポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写タ ーミネータ−配列を含むことができる。好ましい発現調節配列は、エンハンサ− を有ｔルＳＶ４０　［Ｍｕｌｌｉ３ａｎおよびＢｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ０９：　１４２２−１４２７　（１９８０）を参照のこと〕、免疫グロブリン遺 伝子、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス等に由来するプロモーターである。

着目のＤＮＡセグメント（例えば、重鎮および軽鎖コード配列並びに発現調節配 列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して異なる周知の方法により、 宿主細胞中に移すことができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランス フェクション法が常用され、一方性の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理または エレクトロポレーションが使用され得る〔一般には、Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８２） を参照のこと：これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。

一度発現されれば、本発明の完全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎮 、または他の免疫グロブリン形態を当業界の標準法、例えば硫酸アンモニウム沈 澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従っ て精製することができる〔一般的には、５ｃｏｐｅｓ、　Ｒ，、Ｐｒｏ−ｔｅｉ ｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ 、　（１９８２）を参照のこと〕。少なくとも約９０〜９５％均質の実質的に純 粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質が医薬用途 に好ましい。部分的にまたは所望の時には均質まで精製されれば、療法的に（体 外的を含む）またはアッセイ方法、免疫蛍光染色法等を開発しそして実施する際 に該ポリペプチドを使用することができる〔一般的には、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ ｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、第１および■巻、Ｌｅｆ　ｋｏｖ　ｉｔｓおよびＰｅｒ ｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、（ １９７９および１９８１）を参照のこと〕。

本発明において例示されるＩＬ−２レセプター特異抗体は、典型的にはＴ細胞介 在性の病気状態を処置することにおいて個々に用いられるだろう。通常、病気に 関連する細胞がＩＬ−２レセプターを有すると同定された場合、ヒトＩＬ−２レ セプターへのＥＬ−２の結合を阻止することができるヒト様抗体が適当である（ ”Ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ　ａｎｄ　Ｄｉｓ −ａｒｄｅｒＳ”と題するυ、　Ｓ、　Ｓ、Ｎ、　０８５．７０７を参照のこと ：これは参考として本明細書中に組み込まれる）。例えば、処置に適する典型的 な病気状態として、器官移植、例えば心臓、肺、腎臓、肝臓等の移植を行う患者 における移植拒絶反応および対宿主性移植片病が挙げられる。他の病気としては 、自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑 性狼癒および重症筋無力症が挙げられる。

本発明のヒト様抗体は、別の抗体、特に病気の一因となる細胞上の別のマーカー と反応するヒトモノクローナル抗体と組合せて使用することもできる。例えば、 適当なＴ細胞マーカーとしては、第一回国際白血球分化ワークショップ（Ｆｉｒ ｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｔｉｏｎ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）。

（１９８４）　（これは参考として本明細書中に組み込まれる）により命名され たいわゆる「分化のクラスター（Ｃ１ｕｓｔｅｒｓ　ｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｔｉｏｎ）　」中に分類されるものを挙げることができる。

該抗体は、化学療法剤または免疫抑制剤と共に与えられる別々に投与される組成 物として使用することができる。典型的には、そのような薬剤としては、シクロ スポリンＡまたはプリン類似体（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリ ン等）が挙げられるだろうが、当業者に周知である多数の他の薬剤（例えばシク ロホスファミド、プレドニソン等）も使用することができる。

本発明の好ましい医薬組成物は、免疫毒素における当該抗体の使用を含んで成る 。免疫毒素は２つの成分により特徴づけられ、そして試験管内または生体内にお いて選択細胞を殺すのに特に有用である。第一成分は、付着または吸収すると細 胞に対して通常は致命的である細胞毒性物質である。「デリバリ−賦形剤」とし て知られる第二成分は、毒性物質を特定の細胞タイプ、例えばガンを含む細胞に 供給するための手ロブリンである時、結合は異種二価性架橋剤、例えば５ＰＤＰ 。

カルボジイミド、グルタルアルデヒド等によることができる。

種々の免疫毒素の製造が当業界で周知であり、例えば“Ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ 　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｊｎ　［１’ｏｎｊｕｇａｔｅｓ　：　Ａｉｍｉｎ ｇ　ｔｈｅ　Ｍａｇｉｃ　Ｂｕｌ−１ｅｔ’、　Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｔｉｃａｌ　Ｍｅｄｉ−ｃｉｎ ｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１６８−１９０　（１９８２）中に見つ けることができる。これは参考として本明細書中に組み込まれる。

様々な細胞毒性物質が免疫毒素における使用に適当である。

細胞毒性物質としては、放射性核種、例えばヨウ素−１３１１イツトリウム−９ ０、レニウム−１８８およびビスマス−２１２：多数の化学療法剤、例えばビン デシン、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびシスプラチン：並びに細胞 毒性タンパク質、例えば、リポソーム阻害タンパク質様アメリカヤマゴボウ抗つ ィルスタンパク質、シュードモナス外毒素Ａ１リシン、ジフテリア毒素、リシン Ａ鎖等；または細胞表面で活性な物質、例えばホスホリパーゼ酵素（例えばホス ホリパーゼＣ）を挙げることができる。［１９８８年１２月２８日に提出された 一般譲渡されたＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／　２９０．９６８；　＝Ｃｈｉ ｍｅｒｉｃ　Ｔｏｘｉｎｓ”。

０１ｓｎｅｓおよびＰｈ１ｌ、　Ｐｈａｒｍａｃ、Ｔｈｅｒ、、　２５：３５５ −３８１　（１９８２）　；並びに“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　ｌ１ｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＴｈｅｒａｐｙ” 、ＢａｉｄｗｉｎおよびＢｙｅｒｓ編、１５９−１７９．２２４−２６６頁、Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）を参照のこと。これら全てが参考と して本明細書中に組み込まれる。〕免疫毒素のデリバリ−成分は、本発明のヒト 様免疫グロブリンを含むだろう。好ましくは完全な免疫グロブリンまたはそれら の結合性断片、例えばＦａｂが使用される。典型的には、免疫毒素中の抗体はヒ ）　ＩｇＭまたはＩｇＧイソタイプのものであるだろう。しかし所望の時には他 の哺乳動物定常領域を用本発明のヒト様抗体およびそれの医薬組成物は、特に非 経口、即ち皮下、筋肉内または静脈内投与に有用である。非経口投与用組成物は 、通常、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された抗体の溶液または 混合物を含んで成るだろう。様々な水性担体、例えば水、緩衝化された水、０． ４％食塩水、０．３％グリシン等を使用することができる。それらの溶液は無菌 であり、通常は粒状物質を含まない。それらの組成物は、常用される周知の滅菌 技術により滅菌することができる。該組成物は、適切な生理的条件に必要である 時は医薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等 、例えば酢酸す）　ＩＪウム、塩化す）　ＩＪウム、塩化カリウム、塩化カルシ ウム、乳酸ナトリウム等を含有することができる。それらの組成物中の抗体の濃 度は広範囲に渡り異なることができ、即ち、少なくとも約０．５％未満から、通 常は少なくとも約１％から、１５〜２０重量％はどまでに及ぶことができ、そし て液体の体積、粘度等に主として基づいて、選択された特定の投与形式に従って 選択されるだろう。

筋肉内注射用の典型的医薬組成物は、１１１１１の無菌緩衝液と５０■の抗体を 含むように調製することができる。静脈点滴注入用の典型的医薬組成物は、２５ ０ｄの無菌リンガ−液と１５０■の抗体を含むように調製することができる。非 経口投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者に既知であるかまたは明白であ り、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｏ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌ　 ５ｃｉ一本明細書中に組み込まれる。

本発明の抗体は貯蔵のために凍結乾燥することができ、そして使用前に適当な担 体中で再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリンに関して効果 的であることが示されており、当業界で既知の凍結乾燥および再構成技術を用い ることができる。凍結乾燥と再構成は様々な程度の抗体活性の低下をもたらし得 ること（例えば従来の免疫グロブリンでは、−ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大 きな活性低下を有する傾向がある）、そして使用レベルを調整して埋め合わせな ければならないことがあることは、当業者により明白であろう。

本発明のヒト様抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、予防および／また は治療処置のために投与することができる。治療用途においては、組成物は、既 に病気にかかっている患者に、病気を治癒するかまたは少なくとも部分的に緩和 するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は「治療的有効量 」と定義される。この用途に有効な量は、感染の重度および患者自身の免疫系の 一般状態に依存するであろう。しかし通常は、用量あたり約１〜約２００■の抗 体、より好ましくは患者あたり５〜２５■の用量が使用されるだろう。本発明の 材料は通常は深刻な病気状態、即ち命にかかわるかまたはもしかすると命にかか わる状況において使用されるだろうことを念頭に置かなければならない。そのよ うな場合、本発明のヒト様抗体により達成される外来性物質の最小化および「外 来物質」拒絶の低確率の点からみて、実質的過剰量の抗体を投与することが可能 でありそして治療医により望ましいと感じられるかもしれない。

予防用途においては、本発明の抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、患 者の抵抗性を高めるためにまだ病気状態でない患者に投与される。そのような量 は「予防的有効量」として定義される。この用途の場合、正確な量は患者の健康 状態および免疫の一般レベルに依存するが、通常は用量あたり０．１〜２５■、 特に患者あたり０．５〜２．５■であろう。好ましい予防用途は、腎臓移植拒絶 の防止である。

本発明のヒト様抗体は、更に試験管内において広範な用途を見い出すことができ る。−例として、Ｔ細胞の型決定、特異的ＩＬ−２レセプターを有する細胞また は該レセプターの断片の単離、ワクチンの調製等に模範的な抗体を利用すること ができる。

診断目的に、抗体を標識してもよくまたは未標識であってもよい。未標識抗体は 、ヒト様抗体と反応性である別の標識抗体（二次抗体）、例えばヒト免疫グロブ リン定常領域に特異的な抗体と組合せて使用することができる。あるいは抗体を 直接標識してもよい。様々な標識、例えば放射性核種、蛍光団、酵素、酵素基質 、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハブテン）、等を使用することがで きる。多数の型式のイムノアッセイが利用可能であり、そして当業者に周知であ る。

細胞活性に対する保護もしくは検出または選択された抗原の存在の検出において 問題の抗体を使用するためにキットを供給することもできる。本発明の問題の抗 体組成物は、単独でまたは所望の細胞タイプに特異的な追加の抗体と共に、普通 は１つの容器に凍結乾燥形態で提供することができる。抗体は標識もしくは毒素 と接合されていても未接合であってもよく、緩衝液、例えばＴｒｉｓ、　リン酸 塩、炭酸塩等の緩衝液、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブ ミン等、および使用説明書のセットと共にキット中に含まれる。

一般にそれらの材料は活性抗体の量を基にして約５重量％未満、通常は抗体濃度 を基にして少なくとも約０．００１重量％の合計量において存在するだろう。し ばしは、活性成分を希釈するための不活性増量剤または賦形剤を含めることが望 ましく、この場合賦形剤は全組成の約１〜９９重量％で存在することができる。

キメラ抗体を結合することができる二次抗体をアッセイにおいて使用することが でき、これは通常は別の容器中に存在するだろう。二次抗体は典型的には標識と 接合され、上述の抗体製剤と同様にして製剤化される。

次の実施例は例示の目的で与えられ、限定のためではない。

実験 ヒト様軽鎖および重鎮遺伝子の設計 ヒト化抗体のフレームワークを提供するためにヒト抗体Ｅｕの配列（Ｓｅｑｕｅ ｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎ ｔｅ−ｒｅｓｔ、Ｋａｂａｔ、Ｅ、ら、Ｕ−Ｓ、Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ 　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ。

１９８３）を使用した。というのは、抗−Ｔａｃの重鎖のアミノ酸配列がＮａｔ ｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉ−ｃａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ中の他のいずれの重鎮配列 よりもこの抗体の重鎮に相同性が高かったためである。

ヒト化重鎮の配列を選択するために、抗−Ｔａｃ重鎖配列（一般譲渡されたＵ、 　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、の１８６．８６２と２２３．０３７を参照のこと。これらは 参考として本明細書中に組み込まれる）をＥｕ重鎖配列と整列した（図１）。各 位置において、その位置が次のカテゴリーのいずれか１つに入らない限り、Ｅｕ アミノ酸をヒト化配列のために選択した。次のカテゴリーのいずれか１つに入る 場合、抗−Ｔａｃアミノ酸を選択した。

（１）その位置が、Ｋａｂａｔら、前掲により定義されたような相補性決定領域 （ＣＤＲ）中にある（アミノ酸３１−３５．５０−６６゜９９−１０６）　； （２）その位置ではＥｕアミノ酸がヒト重鎮配列にまれであり、一方抗−Ｔａｃ アミノ酸がその位置でヒト重鎮配列に典型的であった（アミノ酸２７．９３．９ ５．９８．　１０７−１０９　、１１１）；（３）その位置が抗−Ｔａｃ重鎮の アミノ酸配列中のＣＤＨのすぐ近くであった（アミノ酸３０と６７）；（４）抗 −Ｔａｃ抗体の３次元モデルが、該アミノ酸が抗原結合部位に物理的に密接して いることを示唆した（アミノ酸４８と６８）。

幾つかのアミノ酸はそれらのカテゴリーのうちの複数に入るが、それらは１つの カテゴリーにのみ挙げである。

ヒト化軽鎖の配列を選択するために、抗−Ｔａｃ軽鎖配列をＥｕ軽鎖の配列と整 列させた（図２）。その位置が同じくカテゴリー（１）〜（４）のうちの１つに 入らない限り、Ｅｕアミノ酸を各位置において選択した（カテゴリ一定義中の重 鎖を軽鎖で置き換える）： （１）ＣＤＲ（アミノ酸２４−３４．５０−５６．８９−９７）。

（２）Ｅｕよりも抗−Ｔａｃアミノ酸がより典型的である（アミノ酸４８と６３ ）。

（３）ＣＤＨに近い（アミノ酸なし；Ｅｕと抗−Ｔａｃはそれらの位置全てにお いて既に同じであった）。

（４）結合領域に３次元的に近接している可能性（アミノ酸６０）。

重鎮（図３）と軽鎖（図４）の実際のヌクレオチド配列は次のようにして選択し た。

（１）該ヌクレオチド配列は上述のようにして選択したアミノ酸配列をコードす る。

（２）それらのコード配列の５′側のヌクレオチド配列はリーダー（シグナル） 配列、即ちＭＯＰＣ６３抗体の軽鎖のリーダーおよびＰＣＢ　１０８Ａ抗体の重 鎮のリーダー（Ｋａｂａｔら、前掲）をコードする。それらのリーダー配列を抗 体の典型として選択した。

（３）コード配列の３′側のヌクレオチド配列は、抗−Ｔａｃ配列の一部分であ るマウス軽鎖Ｊ５セグメントおよびマウス重鎖Ｊ５セグメントに従う配列である 。それらの配列はスプライス供与配列を含有するために含まれる。

（４）配列の各末端には、ｘｂａ　Ｉ部位での切断およびベクターのＸｂａ　Ｉ 部位へのクローニングを可能にするためのＸｂａ１部位が存在する。

ヒト化軽鎖および重鎮遺伝子の作製 重鎮を合成するために、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　Ｄ ＮＡ合成装置を使って４つのオリゴヌクレオチドＨＥＳ１２．　）ｌＥｓ１３゜ ＨＥＳ１４．１ＩＥｓ１５　（図５Ａ）を合成した。それらのオリゴヌクレオチ ドの２つは、重鎮の重鎮の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニーリ ングを可能にするために約２０ヌクレオチドが次のヌクレオチドとオーバーラツ プしている（図５Ｂ）。該オリゴヌクレオチドは一緒にすると、Ｘｂａ　１部位 での切断を可能にするために各末端に幾つかの余分なヌクレオチドを有する完全 なヒト化重鎮をカバーする。該オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルか ら精製した。

各′オリゴヌクレオチドを、標準手順（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲を参照のこと） によりＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化した。リン酸化 したオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを各々約３．７５− の濃度において４０１ｄのＴ　Ａ　（３３ｍＭ　Ｔｒｉｓ酢酸塩、ｐｆ４７．９ −６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム）中に一緒に懸濁し、４分 間９５℃に加熱し、そして４℃にゆっくり冷却した。各オリゴヌクレオチドの反 対鎖を合成することにより該オリゴヌクレオチドから完全な遺伝子を合成するた めに（図５Ｂ）、次の成分を１００パの最終容量において添加した： １０〆　アニールしたオリゴヌクレオチド各０．１６ｍＭ　デオキシリボヌクレ オチド０．５ｒｎＭ　ＡＴＰ Ｏ，５ｍＭ　ＤＴＴ １００ｊＩｓｒ　／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ ３．５層／ｍｌ　Ｔ４　ｇ４３タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）２５ｘ　／　 ｍｊｌ！　Ｔ４　ｇ４４／　６２タンパク質（ポリメラーゼ補助タンパク質） ２５ＪＷ／ｍ１４５タンパク質（ポリメラーゼ補助タンパク質）この混合物を３ ７℃で３０分間インキュベートした。次いで１゜ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼを添 加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。７０℃で１５分間反応液を インキュベートすることにより、ポリメラーゼとりガーゼを不活性化した。遺伝 子をＸｂａｌで消化するために、反応液に２０に／−のＢＳＡと１ｍＭのＤＴＴ を含む５０ｍの２ｘＴＡ、　４３ｍの水、および５ｄ中の５０ｕの）（ｂａＩを 添加した。反応液を３７℃で３時間インキュベートシ、そしてゲル上で泳動した 。ゲルから４３１ｂｐのＸｂａ　１断片を精製し、そして標準法によりプラスミ ドｐＵｃ１９のＸｂａ１部位中にクローニングした。４つのプラスミド単離物を 精製し、ジデオキシ法を使って配列決定した。そのうちの１つが正しい配列を有 した（図３）。

軽鎖を合成するために、４つのオリゴヌクレオチドＪＰＤＩ　。

ＪＦＯ２，ＪＦＤ３．　ＪＦＯ４（図６Ａ）を合成した。それらのオリゴヌクレ オチドの２つは、軽鎖の重鎮の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニ ーリングを可能にするために約２０ヌクレオチドが次のヌクレオチドとオーバー ラツプしている（図６Ｂ）。該オリゴヌクレオチドは一緒にすると、ＸｂａＩ部 位での切断を可能にするために各末端に幾つかの余分なヌクレオチドを有する完 全なヒト化軽鎖をカバーする。該オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル から精製した。

軽鎖遺伝子はそれらのオリゴヌクレオチドから２部分において合成した。ＪＰＤ ＩとＪＦＤ２各々０．５眉を２０４のシークエナーゼ緩衝液（４０＋ｎＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，２０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリ ウム）中に混合し、７０℃に３分間加熱し、そして該オリゴヌクレオチドをアニ ーリングさせるためにゆっくりと２３℃まで放冷した。ＪＦＤ３とＪＰＤ４も同 様にして処理した。

各反応液をＤＴＴ　１０ｍＭおよび各デオキシヌクレオチド０．５　ｍＭにし、 ６．５ｕのシークエナーゼ（ＩＩｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を最終容量２ ４ｉｔｌにおいて添加し、そして３７℃で１時間インキュベートして該ヌクレオ チドの反応方向鎮を合成した。各反応液にＸｂａＩと旧ｎｄｌｌＩを添加してＤ ＮＡを消化した（ＪＦＤ２とＪＦ［１３がオーバーラツプする領域の中、従って 合成されたＤＮＡの各々の中に１ｉｎｄＩＩ［部位が存在する；図６Ｂ）。反応 液をポリアクリルアミドゲル上で泳動し、Ｘｂａ　ｒ−ＨｉｎｄＩ［［断片を精 製し、そして標準法によりｐＨｃ１８中にクローニングした。各断片について数 個のプラスミド単離物をジデオキシ法により配列決定し、そして正しいものを選 択した。

ヒト化軽鎖および重鎮を発現させるためのプラスミドの作製重鎮Ｘｂａ　Ｉ断片 が挿入されているｐＨｃ１９プラスミドから該断片を単離し、そして標準法によ り正しい方向においてベクタ・−ｐＶｙＨ一般に譲渡されたＵ、　Ｓ、　Ｓ、　 Ｎ、　２２３．０３７を参照のこと）のＸｂａ　１部位に挿入し、プラスミドｐ ＨｕＧＴＡ［”ｌ　（図７）を作製した。このプラスミドは、適当な宿主細胞中 にトランスフェクトすると高レベルの完全重鎮を発現するだろう。

２つの軽鎖Ｘｂａ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［Ｉ断片が挿入されている各ｐ［Ｊｃ１８プ ラスミドからそれらの断片を単離した。ベクタープラスミ１’ＰＶＪｃ１（−酸 １：ｉｉ渡すれり１１．　Ｓ、　Ｓ、Ｎ、　２２３．０３７を参照ノコと）をＸ ｂａ　Ｉで切断し、標準法により脱リン酸しモして２断片を連結せしめた。所望 の反応生成物は次のような環状形を有する：ベクターーＸｂａＩ−断片１−旧ｎ ｄＩｎ−断片２−ＸｂａＩ−ベクター。数個のプラスミド単離物を制限マツピン グと配列決定により分析し、この形態を有する１つのプラスミドを選択した。こ のプラスミドｐＨｕＬＴＡＣ（図８）は完全なヒト化軽鎖（図４）を含有し、適 当な宿主細胞中にトランスフェクトすると高レベルの軽鎖を発現するだろう。

中にトランスフェクトし、そして該プラスミドを組み込んだ細胞を、プラスミド 上のｇｐｔおよびｈｙｇ遺伝子（図７，８）により付与されるミコフェノール酸 および／またはヒグロマイシンＢに対する耐性に基づいて標準法により選択した 。それらの細胞がＩＬ−２レセプターに結合する抗体を分泌したことを確かめる ために、細胞からの上清をＩＬ−２レセプターを発現することが知られているＨ ＵＴ−１０２細胞と共にインキュベートした。洗浄後、細胞をフルオレセイン接 合ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、そしてＦＡＣ３ＣＡＮサイ トフルオロメーター上で蛍光について分析した。結果（図９Ａ）は、ヒト化抗体 がそれらの細胞には結合するが、ＩＬ−２レセプターを発現しないＪｕｒｋａｔ 　Ｔ細胞には結合しない（図９Ｄ）ことを明らかに示す。対照として、もとのマ ウス抗−Ｔａｃ抗体を用いてそれらの細胞を染色すると同様な結果を与えた（図 ９Ｂ、Ｃ）。

更なる実験のために、ヒト化抗体を生産する細胞をマウスに注入し、そして生じ た腹水を回収した。標準法に従ってＡｆ　ｆ　ｉｇｅｌ−１０支持体（Ｂｉｏ− Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

ＣＡ）上に調製されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のアフィニティーカラムに 通過させることにより、腹水からヒト化抗体を実質上均質まで精製した。もとの 抗＝Ｔａｃ抗体に比較してヒト化抗体の親和力を測定するために、競合的結合実 験を行った。約５Ｘ１０’個の１（ｔｌＴ−１０２細胞を既知量（１０−４０％ ｇ）の抗−Ｔａｃ抗体とヒト化抗−Ｔａｃ抗体と共に４℃で１０分間インキュベ ートした。次いで細胞に１１００ｎのビオチン化抗−Ｔａｃを添加し、そして４ ℃で３０分間インキュベートした。この量の抗−Ｔａｃは細胞上の結合部位を飽 和するのに十分であり、大過剰であってはならないことが予め決定されている。

０．１％アジ化ナトリウムを含む２−のリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で細胞 を２回洗浄した。次いで２５０ｎＨのフィコエリトリン接合アビジ゛ンと共に細 胞を４℃で３０分間インキュベートし、この接合アビジンは既に細胞に結合して いるビオチン化抗−Ｔａｃに結合した。細胞を上記のように再び洗浄し、１％バ ラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、そしてＰＡＣＳＣＡＮサイトフル オロメーター上で蛍光分析した。

第一段階における競合体としての抗−Ｔａｃ抗体の使用量を増加していくと（１ ０−４０’ｎｇ）　、第二段階において細胞に結合することができたビオチン化 抗−Ｔａｃの量を減少させ、従って最終段階において結合したフィコエリトリン 接合アビジンの量を減少させ、こうして蛍光を減少させた（第１．ＯＡ）。当量 （２０％ｇ）の抗−Ｔａｃおよび競合体として使ったヒト化抗−Ｔａｃは、蛍光 をほぼ同じ程度に減少させた（図１０Ｂ）。このことは、それらの抗体がほぼ同 じ親和力（３〜４倍以内）を有することを示す。というのは、もし一方がずっと 大きな親和力を有するなら、より有効にビオチン化抗−Ｔａｃと競争し、従って 蛍光をもっと減少させたであろうからである。

ヒト化抗体の生物学的性質 ヒトの病気の処置における最適な使用のため、ヒト化抗体はＩＬ−２レセプター を発現している体内のＴ細胞を破壊することができるべきである。抗体が標的細 胞を破壊し得る１（１９８４）　、　６８１頁〕であり、この場合抗体は、標的 細胞と標的を溶解することができるマクロファージのようなエフェクタ１−細胞 との間に架橋を形成する。ヒト化抗体と元のマウス抗−Ｔａｃ抗体がＡＤＣＣを 媒介することができるかどうかを決定するために、標準法によりクロム放出アッ セイを行った。詳しくは、ＩＬ−２レセプターを発現するヒト白血病ＨＵＴ−１ ０２細胞を”Ｃｒと共にインキュベートし、それらにこの放射性核種を吸収させ た。次いでＨＵＴ−１０２細胞を過剰量の抗−Ｔａｃまたはヒト化抗−Ｔａｃ抗 体のいずれか一方と共にインキュベートシた。次にヒト組換えＩＬ−２との約２ ０時間のインキュベーションによって活性化された通常の精製ヒト末梢血単核細 胞である３０：１または１００：１の比のエフェクター細胞と共に４時間インキ ュベートした。標的ＨＵＴ−１０２細胞の溶解を示す”Ｃｒの放出を測定し、そ してバックグラウンドを差し引いた（表１）。その結果は、どちらの比のエフェ クター細胞においても、抗−Ｔａｃは有意な数の標的細胞を溶解しなかった（５ ％未満）が、一方ヒト化抗体は溶解した（２０％より多く）ことを示す。従って 、ヒト化抗体は、Ｔ細胞白血病または他のＴ細胞介在性の病気を治療することに おいて、＄そらく元のマウス抗体よりも効果的であろう。

表１ ＡＤＣＣ後の”Ｃｒ　＃放出率（％） エフェクター：標的比 抗−Ｔａｃ　４％　〈１％ ヒヒト抗−Ｔａｃ　２４％　２３％ 上記から、本発明のヒト様免疫グロブリンが他の抗体の多数の利点を提供するこ とは明らかであろう。例えば、抗−Ｔａｃマウスモノクローナル抗体と比較する と、本発明のヒト様ＩＬ−２レセプター免疫グロブリンは、より経済的に生産す ることができ、そして実質的に少ない外来アミノ酸配列を含むことができる。ヒ ト患者への注入後に抗原性となる可能性の減少は、上記の基準に従って設計され た免疫グロブリンにとって有意な療法的改善を意味する。

本発明を明確化および理解のために説明および実施例により幾分詳細に記載して きたが、添付の請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行い得ることは明らか であろう。

ＦＩＧ、Ｊ。

ＦＩＧ、Ｊ。

く　ロ ＥＨ ＦＩＧ、Ｊ。

ＦＩＧ、Ｊ。

ヒ）−、＋ｔ、ａ−ＴＡＣ１−ＴＡＣ 杭−ＴＡＣ，ヒト化坑−ＴＡＣ ＦＩＧ、Ｊ。

ＦＩＧ、ＪＯ。

国際調査報告 ｍ＾鋪−ｕｍｓ−・　ｒ／ＩＦＪＱ／（ｌｌ’１Ｑ５）ＰＬ”ｒ／ｕｓＨ’ｊ／ Ｕ３ｌｌ５７ Ｇ、Ｗｈｔ、ＬＶｕＬＪｈｈＷＩＬＩＪＡＬ１１１１丁ＹＯＦＩＮＶＶ丁１ＯＮ ＩｌｉＬＡＣＵＭＧ１頁の続き ＠Ｉｎｔ、　Ｃ１’　識別記号　庁内整理番号優先駐張　［相］１９８９年２月 １３日［相］米国（ＵＳ）［相］３１０，２５２発　明　者　セリク、ハロルド 　ニドウィン　アメリカ合衆国、カスローブ　アベニュ 特表千４−５０２４０８　（１６） ７リフオルニア　９４００２．ベルモント、サニーＬ　１６７３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｐ５５Ｔａｃタンパク質と特異的に反応する実質的に純粋なヒト様免疫グロ ブリンを含んで成る組成物。 ２．前記免疫グロブリンが２対の軽鎖／重鎖二量体を含んで成り、各領が可変領 域と定常領域を含んで成る、請求項１に記載の組成物。 ３．ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターへのヒトＩＬ−２の結合 を阻害することができる実質的に純粋なヒト様免疫グロブリンを含んで成る組成 物。 ４．前記免疫グロブリンが約１０８Ｍ−１またはそれより強いヒトインターロイ キン−２（ＩＬ−２）への結合親和力を示す、請求項１に記載の組成物。 ５．前記免疫グロブリンが１つの免疫グロブリンからの相補性決定領域および少 なくとも１つの異なる免疫グロブリンからのフレームワーク領域を含んで成る、 請求項１に記載の組成物。 ６．ヒト様フレームワーク領域および天然には該フレームワークと関連がない１ または複数の外来の相補性決定領域を含んで成る組換え免疫グロブリン組成物で あって、前記免疫グロブリンがヒトインターロイキン−２レセプターに結合する ことができる組成物。 ７．前記免疫グロブワンがＩｇＧ１免疫グロブリンインタイプである、請求項６ に記載の組成物。 ８．成熟軽鎖および重鎖可変領域タンパク質配列が図３および図４中の成熟タン パク質配列と実質的に相同である、請求項６に記載の組成物。 ９．２対の軽鎖／重鎖二量体を有し且つ少なくとも約１０８Ｍ−１の親和力でヒ トインターロイキン−２レセプター上のエピトープと特異的に反応することがで きるヒト様免疫グロブリンであって、前記軽鎖および重鎖が相補性決定領域（Ｃ ＤＲ）とヒト様フレームワーク領域を含んで成り、ここでＣＤＲが該フレームワ ーク領域とは異なる免疫グロブリンからのものである、ヒト様免疫グロブリン。 １０．ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターへのインターロイキン −２（ＩＬ−２）の結合を阻止することができる、請求項９に記載の免疫グロブ リン。 １１．ヒトインターロイキン−２レセプターに結合することができるヒト化免疫 グロブリンであって、前記免疫グロブリンはヒト様フレームワーク中に抗−Ｔａ ｃ抗体からの１または複数の相補性決定領域（ＣＯＲ）を含んで成り、ここで前 記ヒト様フレームワーク領域は抗−Ｔａｃ抗体から選択された少なくとも１つの アミノ酸を含んで成る、ヒト化免疫グロブリン。 １２．図３に示されるような成熟重鎖可変配列、および図４に示されるような成 熟軽鎖配列を有する、請求項１１に記載のヒト化免疫グロブリン。 １３，抗−ｔａｃ抗体からの追加のアミノ酸がＣＤＲのすぐ近くに存在する、請 求項１１に記載のヒト化免疫グロブリン。 １４．ヒト患者においてＴ細胞介在性障害を処置する方法であって、前記患者に 治療的有効量の請求項１に記載の免疫グロブリンを投与することを含んで成る方 法。 １５．ミエローマまたはハイプリドーマ細胞中で生産された請求項１に記載の免 疫グロブリン。 １６．ヒト様免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第一の配列および １または複数のマウス免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二の配列を 含んで成るポリヌクレオチド分子であって、発現時にｐ５５Ｔａｃタンパク質と 特異的に反応し且つヒトＴ細胞上のインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２ ）へのＩＬ−２の結合を阻止することができる免疫グロブリンをコードする前記 ポリヌクレオチド分子。 １７．請求項１６のポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた細胞系。 １８．供与体Ｉｇからの１または複数の相補性決定領域およびヒトＩｇからのフ レームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリン鎖の設計方法であって、供与体 Ｉｇ軽鎖または重鎖のフレームワークまたは可変領域のアミノ酸配列をヒトＩｇ 鎖のコレクション中の対応する配列と比較し；そしてヒトＩｇ軽鎖または重鎖の フレームワークを提供するためにコレクションからの約３つの最も相同性の配列 のうちの１つを選択することを含んで成る方法。 １９．ヒト受容体免疫グロブリンからのフレームワーク領域および抗原に結合す ることができる供与体免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する ヒト化免疫グロブリン鎖の設計方法であって、下記のような免疫グロブリン中の 位置において、受容体免疫グロブリンの少なくとも１つのヒトフレームワークア ミノ酸を供与体免疫グロブリンからの対応するアミノ酸で置換する段階を含んで 成る方法：（ａ）受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸 がその位置においてまれであり、そして供与体免疫グロブリンの対応するアミノ 酸がヒト免疫グロブリン配列中の前記位置において普通である；または（ｂ）該 アミノ酸がＣＤＲの１つのすぐ近くである；または （ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Ａ以内に 側鎖原子を有しそして抗原とまたはヒト化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用す ることができると予想される。 ２０．前記ヒト化免疫グロブリン鎖が、ＣＤＲに加えて、基準（ａ），（ｂ）ま たは（ｃ）により選択された供与体免疫グロブリンからの少なくとも３アミノ酸 を含んで成る、請求項１９に記載の方法。 ２１．供与体から置換されたアミノ酸のうちの少なくとも１つがＣＤＲのすぐ近 くである、請求項２０に記載の方法。 ２２．請求項１８，１９または２０に従って設計されたヒト化免疫グロブリン。