RS58742B1 - Konjugat antitelo na igf-1r-lek i njegova upotreba u lečenju kancera - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na konjugat antitelo-lek koji je sposoban da se veže za IGF-1R. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat antitelo-lek koji sadrži antitelo sposobno da se veže za IGF-1R, gde je navedeno antitelo konjugovano sa bar jednim lekom odabranim od derivata dolastatina 10 i auristatina. Pronalazak obuhvata i navedeni konjugat antitelo-lek za upotrebu u lečenju kancera i opisuje metod lečenja.

Pozadina pronalaska

[0002] Receptor faktora rasta 1 sličan insulinu pod nazivom IGF-1R (ili ponekad IGF1R ili IGF-IR) je receptor sa aktivnošću tirozin kinaze koji ima 70% homologije sa insulinskim receptorom IR. IGF-1R je glikoprotein molekulske težine približno 350,000. To je heterotetramerni receptor čija je svaka polovina -vezana disulfidnim mostovima- sastavljena od vanćelijske α-podjedinice i transmembranske β-podjedinice. IGF-1R vezuje IGF1 i IGF2 vrlo visokim afinitetom (Kd #1 nM), ali je jednako sposoban da veže insulin sa afinitetom 100 do 1000 puta manjim. Obrnuto, IR vezuje insulin vrlo visokim afinitetom, mada se IGF-ovi vezuju samo za insulinski receptor 100 puta nižim afinitetom. Domen tirozin kinaze IGF-1R i IR imaju vrlo visoku sekvencnu homologiju, mada se zone slabije homologije respektivno odnose na region bogat cisteinom, situiran na α-podjedinici i C-terminalnom delu βpodjedinice. Razlike sekvenci koje se vide u α-podjedinici su smeštene u zoni vezivanja liganada i time su u korenu relativnih afiniteta IGF-1R i IR za IGF-ove i insulin, respektivno. Razlike u C-terminalnom delu β-podjedinice dovode do divergencije signalnih puteva dva receptora; IGF-1R posreduje u efektima mitogeneze, diferencijacije i antiapoptoze, dok aktivacija IR u principu uključuje efekte na nivou metaboličkih puteva.

[0003] Citoplazmatski tirozin kinazni proteini se aktiviraju vezivanjem liganda za vanćelijski domen receptora. Aktivacija kinaza sa svoje strane uključuje stimulaciju različiitih unutarćelijskih supstrata, uključujući IRS-1, IRS-2, Shc i Grb 10. Dva glavna supstrata IGF-1R su IRS i Shc koji, aktivacijom brojnih nizvodnih efektora, posreduju u većini efekata rasta i diferencijacije, povezanih sa kačenjem IGF za ovaj receptor. Dostupnost supstrata može posledično da diktira konačan biološki efekat vezan za aktivaciju IGF-1R. Kad dominira IRS-1, ćelije imaju tendenciju da proliferuju i da se transformišu. Kad dominira Shc, ćelije imaju tendenciju da diferenciraju. Izgleda da je put koji je u principu uključen u efekte zaštite od apoptoze fosfatidil-inozitol 3-kinazni (PI 3-kinazni) put.

[0004] Uloga IGF sistema u karcinogenezi je postala predmet intenzivnog istraživanja u poslednjih deset godina. Ovaj interes je počeo posle otkrića činjenice da je, pored svojih mitogenih i antiapoptoznih osobina, IGF-1R, izgleda, potreban za ustanovljavanje i održavanje transformisanog fenotipa. U stvari, već je dobro poznato da preterana ekspresija ili konstitutivna aktivacija IGF-1R, u širokom spektru ćelija, dovodi do rasta ćelija nezavisno od hrane u medijumima bez fetalnog telećeg seruma i do formiranja tumora u golim miševima. Ovo samo po sebi nije jedinstvena osobina, jer široki spektar proizvoda preterano eksprimiranih gena može da transformiše ćelije, uključujući dobar broj receptora faktora rasta. Međutim, glavno otkriće koje je jasno pokazalo da glavnu ulogu u transformaciji igra IGF-1R je demonstracija da su IGR-1R<->ćelije, u kojima je inaktiviran gen koji kodira IGF-1R, potpuno refraktorne na transformaciju različitim agensima koji su obično u stanju da transformišu ćelije, kao što je E5 protein goveđeg papiloma virusa, preterana ekspresija EGFR ili PDGFR, T antigen SV40, aktiviran ras ili kombinacija ova dva poslednja faktora.

[0005] IGF-1R se eksprimira u širokom spektru tumora i tumorskih linija i WO 2010/146059 opisuje biomarkere za odabir pacijenata za terapiju inhibitorom IGF-1R, naročito za kancer dojke i kolorektalni kancer. IGF amplifikuju rast tumora putem vezivanja za IGF-1R. Ostali argumenti za ulogu IGF-1R u karcinogenezi dolaze iz studija koje koriste mišja monoklonska antitela usmerena na receptor ili koje koriste negativne dominante IGF-1R. U stvari, mišja monoklonska antitela usmerena na IGF-1R inhibiraju proliferaciju brojnih ćelijskih linija u kulturi i rast tumorskih ćelija in vivo. Takođe je pokazano da je negativna dominanta IGF-1R u stanju da inhibira proliferaciju tumora.

[0006] Započet je veliki broj projekata da bi se razvila gola IGF-1R antitela za lečenje kancera (npr. WO 2012/142164 ). Ipak, do danas, nijedan od ovih projekata nije bio uspešan i na tržištu nema antitela na IGF-lR.

[0007] Štaviše, niz kliničkih ispitivanja koja uključuju anti-IGF-lR antitela kombinovana sa anti-EGFR antitelima da bi se ciljali i EGFR i IGF-1R, nije uspeo, jer nijedno od ovih antitela nije bilo u stanju da tretira pacijente sa KRAS mutacijom.

[0008] Kao posledica, IGF-1R više nije glavna meta i, u istraživanju za potencijalna terapijska antitela, IGF-1R više nije od naročitog interesa.

[0009] Ipak, mora se primetiti da su napori za generisanje IGF-1R antitela bili fokusirani na gola antitela, tj. antitela koja su korisna zbog svojih intrinsičnih osobina. U tom smislu, IGF-1R se ne smatra pogodnom metom za generisanje ADC kao što je konjugat antitelo-lek (pominjan kao "ADC"), kao što je IGF-1R opisan kao meta, koji takođe naširoko eksprimiraju normalne ćelije, uključujući krvne sudove. U tom smislu, može se primetiti da je najnovije antitelo na IGF-1R, tj. AVE1642, razvijeno kao golo antitelo, "nenaoružano" lekom. Isto je i sa drugim IGF-1R antitelima koja su trenutno u razvoju i sa svima onima koja nisu uspela u kliničkim ispitivanjima.

[0010] U tom kontekstu, pronalazak se odnosi na ADC ili konjugat i njegovu upotrebu za lečenje kancera, a konkretnije, IGF-1R koje eksprimiraju kanceri.

[0011] ADC kombinuju specifičnost vezivanja koju ima antitelo sa potentnošću lekova kao što su, na primer, citotoksični agensi. Tehnologija vezana za razvoj monoklonskih antitela, upotreba efektivnijih lekova i dizajn hemijskih linkera da kovalentno vežu ove komponente, je brzo napredovala poslednjih godina.

[0012] Upotreba ADC omogućava lokalno isporučivanje lekova koji, ako se daju kao nekonjugovani lekovi, mogu da dovedu do neprihvatljivih nivoa toksičnosti za normalne ćelije.

[0013] Drugim rečima, time se traži maksimalna efikasnost uz minimalnu toksičnost. Napori da se dizajniraju i rafiniraju ADC su fokusirani na selektivnost antitela kao i mehanizam delovanja leka, vezivanje leka, odnos lek/antitelo (punjenje ili DAR) i osobine oslobađanja leka. Delovi lekova mogu da ispolje svoje citotoksične i citostatičke efekte preko mehanizama koji uključuju vezivanje tubulina, vezivanje DNK, proteazoma, oštećivanje ribozomske funkcije, sintezu proteina i/ili inhibiciju topoizomeraze. Neki citotoksični lekovi imaju tendenciju da budu neaktivni ili manje aktivni kad se konjuguju sa velikim antitelom.

[0014] Svako antitelo mora da bude okarakterisano zasebno, da se dizajnira odgovarajući linker i da se identifikuje pogodan citotoksični agens koji zadržava svoju potentnost kad dospe do tumorskih ćelija. Mora da se uzme u obzir gustina antigena na kancerskoj meti i da li normalna tkiva eksprimiraju ciljni antigen. Ostala razmatranja uključuju da li se celokupan ADC internalizuje po vezivanju za metu; da li je citostatički ili citotoksični lek poželjan kad se uzme u obzir moguće izlaganje normalnog tkiva i/ili tip i stadijum kancera koji se tretira; i, da li se linker koji spaja antitelo za citotoksičnu aktivnost leka može raspasti ili ne. Štaviše, konjugacioni odnos antitela prema leku mora da bude dovoljan a da ne kompromituje aktivnost vezivanja antitela i/ili potentnost leka i da ne modifikuje fizičko hemijske osobine ADC što bi dovelo do agregiranja ili opasnih osobina u vezi sa budućim razvojnim procesom jedinjenja.

[0015] ADC je složen biološki molekul i izazov da se razvije efektivan ADC ostaje značajan problem.

Kratak prikaz pronalaska

[0016] Predmetni pronalazak je namenjen da se bavi ovim problemom i odnosi se na ADC sledeće formule (I):

Ab-(L-D)n(I)

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

gde je

Ab antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sposobno da veže humani IGF-1R,

gde navedeno antitelo sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 1, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.4, 5 i 6;

L je linker;

D je deo leka sledeće formule (II):

gde je:

R2COOH, COOCH3ili tiazolil;

R3H ili (C1-C6)alkil;

R9H ili (C1-C6)alkil;

m je ceo broj između 1 i 8;

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L; a

n je 1 do 12.

[0017] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je Ab odabrano od:

a) antitelo koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitelo koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10, 5 i 11;

c) antitelo koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12 i

d) antitelo koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 8, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11.

[0018] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je Ab odabrano od:

a) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 13 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 14 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10, 5 i 11;

c) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 15 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12;

d) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 16 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

e) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 17 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12.

[0019] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je Ab odabrano od:

a) antitelo koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 18 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

b) antitelo koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 19 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

c) antitelo koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 20 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

d) antitelo koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 21 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.8, 2 i 3 i

e) antitelo koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 22 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

[0020] U jednom rešenju pronalazak se odnosi na ADC gde je Ab odabrano od antitela 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 i 213B10.

[0021] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je Ab humanizovano antitelo.

[0022] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je Ab odabrano od antitela koja sadrže:

a) težak lanac koji ima CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID br. 7, 2 i 3, respektivno, i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGHV1-46*01 (SEQ ID br.46), i FR4 izvedene iz humane embrionske linije IGHJ4*01 (SEQ ID br.

48) i

b) lak lanac koji ima CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sekvence SEQ ID br. 9, 5 i 11, respektivno, i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGKV1-39*01 (SEQ ID br.47), i FR4 izvedene iz humane embrionske linije IGKJ4*01 (SEQ ID br.

49).

[0023] U jednom rešenju pronalaska, Ab je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 33 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 33 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 34 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 34 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11.

[0024] U jednom rešenju pronalaska, Ab je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 35 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 35 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 36 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 36 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

[0025] U jednom rešenju pronalaska, Ab je odabrano od:

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 37 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 37 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 39 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.39 i

b) antitelo koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 38 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 38 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 40 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.40.

[0026] U jednom rešenju pronalaska, Ab je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.

57 i 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 ili 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60.

[0027] U jednom rešenju pronalaska, Ab je odabrano od:

a) teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 i 81 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 ili 81 i

b) lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 59 i 61 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59 ili 61.

[0028] U jednom rešenju, pronalazak se odnosi na ADC gde je L linker sledeće formule (III):

gde je

L2(C4-C10)cikloalkil-karbonil, (C2-C6)alkil ili (C2-C6)alkil-karbonil;

W je aminokiselinska jedinica; w je ceo broj između 0 i 5;

Y je PAB-karbonil gde je PAB

y je 0 ili 1;

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa D; a

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa Ab.

[0029] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je L2sledeće formule:

gde

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa (W)w, a

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa atomom azota maleimidne grupe formule:

[0030] U jednom rešenju pronalaska, w = 0 ili w = 2, a zatim je (W)wodabrano od:

gde

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa (Y)y, a

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L2.

[0031] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je L odabrano od:

gde zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa D, a talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa Ab.

[0032] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je (L-D) odabrano od:

�

Ċ

i

gde talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa Ab.

[0033] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC koji ima formulu odabranu od:

1

�

�

i njegove farmaceutski prihvatljive soli,

gde je Ab izabrano iz grupe koja se sastoji od:

i) antitela 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 i 213B10;

ii) antitela koja su u kompeticiji za vezivanje IGF-1R sa antitelima i

iii) antitela koja se vezuju za isti epitop IGF-1R kao antitela i).

[0034] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je n 2.

[0035] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je n 4.

[0036] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC za upotrebu kao lek.

[0037] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na sastav koji sadrži ADC kao što je gore opisan.

[0038] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na sastav koji dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0039] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na sastav za upotrebu u tretiranju kancera koji eksprimira IGF-1R, ili kancere koji su vezani za IGF-1R.

[0040] Kancer koji eksprimira IGF-1R ili kanceri vezani za IGF-1R uključuju tumorske ćelije koje eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju ceo ili deo IGF-1R na svojoj površini.

[0041] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na sastav, gde je navedeni kancer koji eksprimira IGF-1R kancer odabran od kancera dojke, kolona, ezofagusnog karcinoma, hepatoćelijskog kancera, gastričnog kancera, glioma, kancera pluća, melanoma, osteosarkoma, kancera jajnika, prostate, rabdomiosarkoma, renalnog kancera, tiroidnog kancera, kancera endometrijuma, mezotelioma, oralnog skvamoznog karcinoma i bilo kog kancera rezistentnog na lekove.

[0042] Predmetni opis otkriva i metod za lečenje kancera koji eksprimira IGF-1R u subjektu kome je to potrebno, koji sadrži davanje subjektu efektivne količine bar jednog konjugata antitelo-lek ili sastava prema pronalasku.

[0043] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na komplet koji sadrži bar i) konjugat antitelo-lek i/ili sastav kao što je gore opisan i ii) špric ili fiolu ili ampulu u kojoj se nalazi navedeni konjugat antitelo-lek i/ili sastav.

Detaljan opis pronalaska

I - Antitelo (Ab)

[0044] Termini "antitelo", "antitela" "ab", "Ab", "MAb" ili "imunoglobulin" se koriste u istom značenju u najširem smislu i uključuju monoklonska antitela, izolovana, inženjerisana ili rekombinantna antitela (npr., pune dužine ili intaktna monoklonska antitela), poliklonska antitela, multivalentna antitela ili multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), a takođe i fragmente antitela, dok god oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost.

1

[0045] U jednom rešenju, antitelo ADC iz pronalaska se sastoji od rekombinantnog antitela. Termin "rekombinantno antitelo" se odnosi na antitelo koje je rezultat ekspresije rekombinantne DNK unutar žive ćelije. Rekombinantno antitelo ADC iz pronalaska se dobija korišćenjem laboratorijskih metoda genetičke rekombinacije, dobro poznatih stručnjaku, kreiranjem sekvenci DNK koje se ne bi našle u biološkim organizmima.

[0046] U jednom drugom rešenju, antitelo ADC iz pronalaska je hemijski sintetisano antitelo.

[0047] Konkretnije, takav molekul je glikoprotein koji sadrži bar dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac obuhvata varijabilni region (ili domen) teškog lanca (ovde skraćeno sa HCVR ili VH) i konstantan region teškog lanca. Konstantan region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki lak lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno sa LCVR ili VL) i konstantan region lakog lanca. Konstantan region lakog lanca obuhvata jedan domen, CL. VH i VL regioni se dalje mogu podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), prožete regionima koji su više očuvani, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, poređanih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0048] Pod "fragment koji vezuje antigen" ili "fragment koji vezuje IGF-IR" antitela ADC prema pronalasku, podrazumeva se bilo koji peptid, polipeptid ili protein koji zadržava sposobnost da se veže za metu (koja se generalno zove i antigen) antitela.

[0049] U jednom rešenju, takvi "fragmenti koji vezuju antigene" su odabrani iz grupe koja se sastoji od Fv, scFv (sc od single chain, što znači jedan lanac), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc fragmenti ili dijatela, ili bilo koji fragment čije bi poluvreme života bilo povećano hemijskom modifikacijom, kao što je dodavanje poli(alkilen) glikola, kakav je poli(etilen) glikol ("PEGilacija") (pegilovani fragmenti, koji se zovu Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ili Fab'-PEG) ("PEG" za Poli (Etilen) Glikol), ili ugrađivanjem u lipozom, gde navedeni fragment imaju bar jednu od osobina CDR-ova antitela prema pronalasku. Poželjno, navedeni "fragment koji vezuje antigene" će biti konstituisan ili će sadržati delimičnu sekvencu teškog ili lakog varijabilnog lanca antitela iz kog su izvedeni, gde je navedena parcijalna sekvenca dovoljna da zadrži istu specifičnost vezivanja kao antitelo iz kog je potekao i dovoljan afinitet, poželjno bar jednak 1/100, na poželjniji način, do bar 1/10, afiniteta antitela iz kog je potekao, u odnosu na metu. Još poželjnije, navedeni "fragment koji vezuje antigene" će biti konstituisan ili će sadržati bar tri CDR-a CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 teškog varijabilnog lanca i tri CDR CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 lakog varijabilnog lanca antitela iz kog su izvedeni.

[0050] Pod "vezivanje", "vezuje" ili slično, podrazumeva se da antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje se može okarakterisati ravnotežnom konstantom disocijacije od bar oko 1x10<-6>M. Metodi za određivanje da li se dva molekula vezuju su dobro poznati u struci i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu, radioaktivno obeležene probe i slično. Da bi se izbegla sumnja, to ne znači da

1

navedeno antitelo ne bi moglo da se veže ili da interferira, na niskom nivou, za neki drugi antigen. Ipak, kao rešenje, navedeno antitelo se vezuje samo za navedeni antigen.

[0051] Kao što se koristi u predmetnoj specifikaciji, izraz "antitelo na IGF-1R" bi trebalo da se interpretira slično kao "anti-IGF-lR antitelo" i označava antitelo sposobno da se vezuje za IGF-1R.

[0052] U jednom rešenju predmetne prijave, epitop antitela je poželjno smešten u vanćelijski domen humanog IGF-1R (zvanog i ECD IGF-1R).

[0053] U jednom konkretnom rešenju, antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, je sposobno da se vezuje za IGF-1R sa EC50između 10x10<-10>i 1x10<-10>, a još poželjnije, između 8x10<-10>i 2x10<-10>.

[0054] Termin polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) odgovara koncentraciji leka, antitela ili toksikanta koji indukuje odgovor do polovine između osnovne linije i maksimuma posle nekog specifikovanog vremena izlaganja. ona se obično koristi kao mera potentnosti leka. EC50krive doza-odgovor, prema tome, predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj se vidi 50% njegovog maksimalnog efekta. EC50kvantne krive doza-odgovor predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj 50% populacije pokazuje odgovor, posle nekog specifikovanog trajanja izlaganja. Mere koncentracije tipično prate sigmoidnu krivu, rastući brzo tokom relativno male promene koncentracije. Ovo se može odrediti matematički pravljenjem izvoda linije sa najboljim fitom.

[0055] Kao poželjno rešenje, EC50, određeno u predmetnom pronalasku, karakteriše potentnost antitela da se veže za ECD IGF-1R izložen na humanim tumorskim ćelijama. Parametar EC50se određuje pomoću FACS analize. Parametar EC50odražava koncentraciju antitela za koju se dobija 50% maksimalnog vezivanja za humani IGF-1R eksprimiran na humanim tumorskim ćelijama. Svaka vrednost EC50je izračunata kao središnja tačka krive doza-odgovor korišćenjem curve fitting programa za fitovanje regresione krive sa četiri parametra (Prism Software). Ovaj parametar je odabran da predstavlja fiziološke/patološke uslove.

[0056] Termin "epitop" je region antigena koji je vezan za antitelo. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu biti i konformacioni, odnosno, sastavljeni od nelinearnih aminokiselina. U određenim rešenjima, epitopi mogu da uključuju determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe ili sulfonil grupe i, u određenim rešenjima, mogu da imaju specifične trodimenzione strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.

[0057] Kompeticija za vezivanje za IGF-1R se može odrediti bilo kojim metodima ili tehnikama poznatim stručnjaku, kao što su, bez ograničenja, radioaktivnost, Biacore, ELISA, protočna citometrija, itd. Pod "koji je u kompeticiji za vezivanje za IGF-1R" podrazumeva se kompeticija od bar 20%, poželjno bar 50% i još poželjnije, bar 70%.

[0058] Određivanje vezivanja za isti epitop se može odrediti bilo kojim metodima ili tehnikama poznatim stručnjaku, kao što su, bez ograničenja, radioaktivnost, Biacore, ELISA,

1

protočna citometrija, itd. Pod "koji se vezuje za isti epitop IGF-1R" podrazumeva se kompeticija od bar 20%, poželjno bar 50% i još poželjnije, bar 70%.

[0059] Kao što je gore pomenuto, i suprotno opštem znanju, predmetni pronalazak se fokusira na specifična IGF-1R antitela koja imaju visoku sposobnost da budu internalizovana posle vezivanja za IGF-1R. Kao što se ovde koristi, antitelo koje "je internalizovano" ili koje se "internalizovalo" (ova dva izraza su slična) je ono koje je uzela ćelija (u značenju ono "ulazi") posle vezivanja za IGF-1R na sisarskoj ćeliji. Takvo antitelo je interesantno kao deo ADC, tako da se ono obraća ili usmerava vezan citotoksični agens u ciljane kancerske ćelije. Jednom kad je internalizovan, citotoksični agens uključuje smrt kancerske ćelije.

[0060] Iznenađujuće, sva antitela prema pronalasku imaju iste sekvence za CDR-H2, CDR-H3 i CDR-L2, a ostala 3 CDR su različita. Ova opservacija deluje koherentno kao deo opšteg znanja, u vezi sa specifičnošću vezivanja antitela, da je CDR-H3 opisan kao najvažniji i najviše uključen u prepoznavanje epitopa.

[0061] Smatra se da je važan ključ za uspeh ADC terapije specifičnost ciljanog antigena i internalizacija kompleksa antigen-antitelo u kancerske ćelije. Očigledno su antigeni koji se ne internalizuju manje efektivni u dostavljanju citotoksičnih agenasa nego oni koji se internalizuju. Procesi internalizacije su različiti za različite antigene i zavise od mnogo parametara na koja mogu da utiču antitela.

[0062] U ADC, citotoksični agens prenosi citotoksičnu aktivnost i upotrebljeno antitelo je odgovorno za specifičnost u odnosu na kancerske ćelije, kao i vektor za ulazak u ćelije da korektno aktivira citotoksični agens. Dakle, da bi se popravio ADC, antitelo može da ispolji visoku sposobnost da se internalizuje u ciljane kancerske ćelije. Efikasnost internalizacije posredovana antitelom se značajno razlikuje u zavisnosti od ciljanog epitopa. Izbor antitela na IGF-1R potentnih u internalizaciji zahteva razne eksperimentalne podatke ne samo o nishodnoj regulaciji IGF-1R, nego i o internalizaciji antitela na IGF-1R u ćelijama.

[0063] U jednom rešenju, internalizacija antitela iz ADC prema pronalasku se može proceniti imunofluorescencijom ili pomoću FACS (protočna citometrija) (kao što je dato u primeru dalje u predmetnoj prijavi) ili bilo kojim metodom ili postupkom poznatim stručnjaku specifičnom za mehanizam internalizacije. U jednom poželjnom rešenju, antitelo iz ADC prema pronalasku može da indukuje internalizaciju posle vezivanja za IGF-1R od bar 30%, poželjno 50% i još poželjnije 80%.

[0064] Kompleks IGF-1R/antitelo se internalizuje posle vezivanja antitela za ECD navedenog IGF-1R i indukuje se smanjenje količine IGF-1R na površini ćelije. Ovo smanjenje se može kvantifikovati bilo kojim metodom poznatim stručnjaku, kao što su neograničavajući primeri western blota, FACS i imunofluorescencije.

[0065] U jednom rešenju, ovo smanjenje, koje odražava internalizaciju, se može poželjno meriti FACS-om i izraziti kao razlika ili delta između srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI, od Mean Fluorescence Intenzitet) merenog na 4°C sa MFI merenim na 37°C posle 4 sata inkubacije sa antitelom.

[0066] Kao neograničavajući primer, ova delta se određuje na osnovu MFI dobijenih sa netretiranim ćelijama i ćelijama tretiranim antitelom, korišćenjem i) ćelija kancera dojke MCF7 posle perioda inkubacije sa ovde opisanim antitelom od 4 sata i ii) sekundarnog

2

antitela, obeleženog pomoću Alexa488. Ovaj parametar se definiše kao što je izračunat po sledećoj formuli: ∆(MFI4 C-MFI37 C).

[0067] Ova razlika između MFI-ova odražava nishodnu regulaciju IGF-1R, jer su MFI proporcionalni IGF-1R eksprimiranim na površini ćelije.

[0068] U jednom preimućstvenom aspektu, antitela su antitela koja trigeruju ∆(MFI4 C-MFI37 C) na MCF-7 od bar 280, poželjno od bar 400.

[0069] U više detalja, gore pomenuta delta se može meriti prema sledećem postupku, koji se mora smatrati ilustrativnim i neograničavajućim primerom:

a) Tretiranje i inkubiranje tumorskih ćelija od interesa antitelom iz pronalaska, bilo u hladnom (4°C), bilo u toplom (37°C) kompletnom medijumu za kulturu;

b) tretiranje tretiranih ćelija iz koraka a) i, paralelno, netretiranih ćelija sekundarnim antitelom;

c) merenje MFI (reprezentativnog za količinu IGF-1R prisutnog na površini) za tretirane i netretirane ćelije sekundarnim obeleženim antitelom, sposobnim da se veže za antitelo iz pronalaska i

d) izračunavanje delte oduzimanjem MFI dobijenog na tretiranim ćelijama od MFI dobijenog na netretiranim ćelijama.

[0070] Iz ove delte MFI, procenat internalizacije se može odrediti kao: 100x(MFI4 C-MFI37 C) / MFI4 C.

[0071] Antitela iz ADC prema pronalasku, predstavljaju, poželjno, na MCF7 procenat internalizacije koji je između 50% i 99%, 70% i 90%, poželjno između 75% i 87%.

[0072] Naročita prednost ovde opisanih antitela leži u njihovom stepenu internalizacije.

[0073] Opšte je poznato da je, za ADC, poželjno da antitela koja se koriste ispoljavaju brzu internalizaciju, poželjno u okviru 24 sata od administracije antitela, poželjnije u okviru 12 sati, a još poželjnije u okviru 6 sati.

[0074] U predmetnom pronalasku, stepen internalizacije, o kom se govori i kao o smanjenju antitela na površini ćelije ili raspadu antitela na površini ćelije, se izražava kao t1/2 (poluživot) i odgovara vremenu neophodnom da se dobije smanjenje ∆MFI od 50% (ovaj aspekt će biti potpuno jasan kroz sledeće primere).

[0075] Naročita prednost je da antitela iz ADC pronalaska imaju t1/2 između 5 i 25 minuta, a poželjno između 10 i 20 minuta.

[0076] Posebno rešenje pronalaska se odnosi na ADC u kom antitelo Ab obuhvata tri CDR teškog lanca sa CDR-H2 sekvencom SEQ ID br. 2 i CDR-H3 sekvencom SEQ ID br. 3, i tri CDR lakog lanca sa CDR-L2 sekvencom SEQ ID br.5.

[0077] Posebno rešenje pronalaska se odnosi na ADC u kom antitelo Ab obuhvata tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.1, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.4, 5 i 6.

[0078] Jedno rešenje ADC obuhvata antitelo koje sadrži tri CDR teškog lanca koji sadrže ili se sastoje od sekvenci SEQ ID br. 1, 2 i 3, ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 1, 2 ili 3; i tri CDR lakog lanca koji sadrže ili se sastoje od sekvenci SEQ ID br. 4, 5 i 6, ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.4, 5 ili 6.

[0079] U jednom drugom rešenju, antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, obuhvata tri CDR teškog lanca koji sadrže sekvence SEQ ID br.1, 2 i 3; i tri CDR lakog lanca koji sadrže sekvence SEQ ID br.4, 5 i 6.

[0080] Jedinstvena numeracija IMGT je definisana za poređenje varijabilnih domena na kom god antigenskom receptoru, tipu lanca, ili vrsti [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. U jedinstvenoj numeraciji IMGT, konzervisane aminokiseline uvek imaju istu poziciju, na primer, cistein 23 (1. -CYS), triptofan 41 (CONSERVED-TRP), hidrofobna aminokiselina 89, cistein 104 (2.-CYS), fenilalanin ili triptofan 118 (J-PHE ili J-TRP). Jedinstvena numeracija IMGT obezbeđuje standardizovano razgraničenje okvirnih regiona (FR1-IMGT: pozicije 1 do 26, FR2-IMGT: 39 do 55, FR3-IMGT: 66 do 104 i FR4-IMGT: 118 do 128) i regiona koji određuju komplementarnost: CDR1-IMGT: 27 do 38, CDR2-IMGT: 56 do 65 i CDR3-IMGT: 105 do 117. Pošto jazovi (gaps) predstavljaju pozicije koje nisu zauzete, dužine CDR-IMGT (prikazane u zagradama i razdvojene tačkama, npr. [8.8.13]) postaju krucijalna informacija. Jedinstvena numeracija IMGT se koristi u 2D grafičkim prezentacijama, označenim kao IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] i u 3D strukturama u IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

[0081] Mora se razumeti da, bez kontradiktorne specifikacije u predmetnoj specifikaciji, regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi, označavaju hipervarijabilne regione teškog i lakog lanca imunoglobulina, kao što je definisano prema sistemu numeracije IMGT.

[0082] Ipak, CDR se mogu definisati i prema Kabatovom sistemu numeracije (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, i kasnija izdanja). Postoje tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca. Ovde, termini "CDR" i "CDR-ovi" se koriste da označe, u zavisnosti od slučaja, jedan ili više, ili čak sve, regione koji sadrže većinu aminokiselinskih ostataka odgovornih za afinitet vezivanja antitela za antigen ili epitop koji ono prepoznaje. Da bi se uprostilo čitanje predmetne prijave, CDR-ovi prema Kabatu nisu definisani. Ipak, za stručnjaka bi bilo očigledno, primenom definicije CDR prema IMGT, da definiše CDR prema Kabatu.

[0083] U smislu predmetnog pronalaska, "identičnosti" ili "procenat identičnosti" dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina znači procenat identičnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u dve sekvence koje se porede, dobijen posle optimalnog poravnanja, gde je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su nasumično distribuirane duž njihovih dužina. Poređenje dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se tradicionalno vrši poređenjem sekvenci pošto su one optimalno poravnate, gde navedeno poređenje može da se vrši po segmentima ili korišćenjem "prozora poravnanja". Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može vršiti, pored poređenja rukom, putem algoritma lokalne homologije Smith-a i Waterman-a (1981) [Ad. App. Math. 2:482], putem algoritma lokalne homologije Neddleman-a i Wunsch-a (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], metodom traženja sličnosti Pearson-a i Lipman-a (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ili pomoću kompjuterskog softvera koji koristi ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ili pomoću softvera za poređenje BLAST NR ili BLAST P).

[0084] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja pozicije na kojoj je aminokiselina, nukleotid ili ostatak identičan u dve sekvence, poželjno u dve kompletne sekvence, deljenjem broja identične pozicije ukupnim brojem pozicija u prozoru poravnanja i množenjem rezultata sa 100, da bi se dobio procenat identičnosti dve sekvence.

[0085] Na primer, program BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett.174:247-250), dostupan na sajtu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, može da se koristi sa datim (default) parametrima (naročito za parametre "open gap penalty": 5 i "extension gap penalty": 2; gde je izabrana matrica, na primer, "BLOSUM 62" matrica predložena u programu); program direktno računa procenat identičnosti dve sekvence koje se porede.

[0086] Za aminokiselinsku sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa referennom aminokiselinskom sekvencom, poželjni primeri uključuju one koji sadrže referentnu sekvencu, određene modifikacije, naročito deleciju, adiciju ili supstituciju bar jedne aminokiseline, odsecanje ili produžavanje. U slučaju supstitucije jedne ili više uzastopnih ili neuzastopnih aminokiselina, poželjne su supstitucije u kojima su supstituisane aminokiseline zamenjene "ekvivalentnim" aminokiselinama. Ovde je izraz "ekvivalentne aminokiseline" namenjen da označava bilo koje aminokiseline koje će verovatno biti supstituisane jednom od strukturnih aminokiselina, ali ne modifikujući biološke aktivnosti odgovarajućih antitela i onih iz specifičnih primera definisanih niže.

[0087] Ekvivalentne aminokiseline se mogu odrediti bilo po njihovoj strukturnoj homologiji sa aminokiselinama kojima su supstituisane, bilo na osnovu rezultata komparativnih testova biološke aktivnosti različitih antitela koja će verovatno biti generisana.

[0088] Kao neograničavajući primer, tabela 1 ispod sumira moguće supstitucije koje će se verovatno izvršiti, a da ne dovedu do značajnih modifikacija biološke aktivnosti odgovarajućeg modifikovanog antitela; inverzne supstitucije su prirodno moguće u istim uslovima.

Tabela 1

2

[0089] Poseban aspekt pronalaska je da se antitelo iz ADC, ne vezuje za insulinski receptor (IR). Ovaj aspekt je od interesa jer antitelo opisano ovde neće imati nikakav negativan impakt na IR, što znači ni na metabolizam insulina.

[0090] U jednom drugom rešenju, još jedan preimućstven aspekt antitela iz ADC iz pronalaska je da je ono sposobno da veže ne samo humani IGF-1R, nego i majmunski IGF-1R, a konkretnije, cinomolgusov IGF-1R. Ovaj aspekt je takođe od interesa jer će olakšati procenu toksičnosti potrebnu u kliničkim ispitivanjima.

[0091] A u još jednom rešenju, antitelo iz ADC iz pronalaska je monoklonsko antitelo.

[0092] Termin "monoklonsko antitelo" ili "Mab", kao što se ovde koristi, se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela u populaciji su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena na jedan jedini epitop. Takvo monoklonsko antitelo može da proizvede jedan jedini klon B ćelija ili hibridoma. Monoklonska antitela mogu biti i rekombinantna, tj. proizvedena proteinskim inženjeringom ili hemijskom sintezom. Monoklonska antitela se mogu i izolovati iz fagnih biblioteka antitela. Pored toga, za razliku od pripremanja poliklonskih antitela koja tipično uključuju različita antitela usmerena na različite determinante, ili epitope, svako monoklonsko antitelo je usmereno na jedan jedini epitop antigena.

[0093] Monoklonska antitela ovde uključuju mišja, himerna i humanizovana antitela, kao što su kasnije opisana.

[0094] Antitelo je poželjno izvedeno iz hibridoma mišjeg porekla, zavedenih u okviru francuske kolekcije kultura mikroorganizama (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), gde su navedeni hibridomi dobijeni fuzijom splenocita/limfocita Balb/C imunizovanih miševa i ćelija mijeloma Sp 2/O-Ag 14 ćelijske linije.

[0095] U jednom rešenju, antitelo na IGF-1R iz ADC pronalaska je mišje antitelo, tada označeno kao m[naziv antitela].

[0096] U jednom rešenju, antitelo na IGF-1R je himerno antitelo, tada označeno kao c[naziv antitela].

[0097] U jednom rešenju, antitelo na IGF-1R je humanizovano antitelo, tada označeno kao hz[naziv antitela].

[0098] Da bi se izbegla sumnja, u sledećoj specifikaciji, izrazi "antitelo na IGF-1R" i "[naziv antitela]" su slični i uključuju (ukoliko nije naznačeno drukčije) mišju, himernu i humanizovanu verziju navedenog antitela na IGF-1R ili navedenog "[naziv antitela]". Kad je neophodno, koristi se prefiks m- (mišje), c- (himerno) ili hz- (humanizovano).

[0099] Radi jasnoće, sledeća tabela 2 ilustruje CDR sekvence, definisane prema IMGT, za poželjna antitela.

Tabela 2

2

[0100] Stručnjaku će biti očigledno da bilo koja kombinacija 6 CDR-ova, kao što su gore opisani, može da se smatra delom predmetnog pronalaska.

[0101] Kao što se može videti iz ove tabele 2, sva antitela opisana ovde imaju iste sekvence za CDR-H2, CDR-H3 i CDR-L2 i ova osobina je od posebnog značaja, kao što je gore opisano.

[0102] Jedan specifičan aspekt se odnosi na ADC u kom je antitelo mišje antitelo, koje se odlikuje time što navedeno antitelo obuhvata konstantne regione i lakog lanca i teškog lanca izvedene iz antitela vrste heterologne sa mišem, naročito čoveka.

[0103] Još jedan specifičan aspekt se odnosi na ADC u kom je antitelo himerno (c) antitelo, koje se odlikuje time što navedeno antitelo obuhvata konstantne regione i lakog lanca i teškog lanca, izvedene iz antitela vrste heterologne sa mišem, naročito čoveka.

[0104] Himerno antitelo is ono koje sadrži prirodan varijabilan region (lakog lanca i teškog lanca) izveden iz antitela date vrste u kombinaciji sa konstantnim regionima lakog lanca i teškog lanca antitela vrste heterologne sa navedenom datom vrstom.

[0105] Himerna antitela se mogu dobijati upotrebom tehnika rekombinantne genetike. Na primer, himerno antitelo bi se moglo praviti kloniranjem rekombinantne DNK koja sadrži promoter i sekvencu koja kodira varijabilni region ne-humanog monoklonskog antitela, naročito mišjeg i sekvencu koja kodira konstantni region antitela heterologne vrste, poželjno čoveka. Himerno antitelo iz ADC prema pronalasku koje kodira jedan takav rekombinantni gen bi moglo da bude, na primer, himera miš-čovek, gde bi specifičnost ovog antitela bila određena varijabilnim regionom izvedenim iz mišje DNK, a njegov izotip bi bio određen konstantnim regionom izvedenim iz humane DNK.

[0106] U jednom poželjnom, ali ograničavajućem, rešenju, antitelo iz ADC iz pronalaska je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 13 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 13 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 14 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 14 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10, 5 i 11;

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 15 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 15 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12;

d) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 16 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 16 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

e) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 17 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 17 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12.

[0107] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 13 do 17", podrazumevaju se sekvence koje ispoljavaju tri CDR

2

teškog lanca SEQ ID br.1, 2 i 3 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 13 do 17 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.1, 2 i 3).

[0108] U jednom drugom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, antitelo iz ADC pronalaska je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 18 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 18 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 19 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 19 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

c) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 20 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 20 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

d) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 21 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 21 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.8, 2 i 3 i

e) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 22 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 22 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

[0109] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 18 do 22", podrazumevaju se sekvence koje respektivno ispoljavaju tri CDR lakog lanca SEQ ID br. 4, 5 i 6 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 18 do 22 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.4, 5 i 6).

[0110] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC u kom je Ab antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 13 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 13 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 18 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.18;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 14 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 14 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 19 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID NO.19;

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 15 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 15 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 20 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.20;

d) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 16 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 16 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 21 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.21 i

e) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 17 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 17 i varijabilni

2

domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 22 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.22.

[0111] Himerna antitela opisana ovde se mogu odlikovati i konstantnim domenom i, konkretnije, navedena himerna antitela mogu biti odabrana ili dizajnirana kao što su, bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD ili IgE. Poželjnije, u kontekstu predmetnog pronalaska, navedena himerna antitela su IgG1 ili IgG4.

[0112] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC u kom je Ab himerno antitelo koje sadrži varijabilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG1. Poželjnije, navedeno himerno antitelo obuhvata konstantan domen za VH sekvence SEQ ID br.43 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0113] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC u kom je Ab himerno antitelo koje sadrži varijabilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG4. Poželjnije, navedeno himerno antitelo obuhvata konstantan domen za VH sekvence SEQ ID br.44 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0114] U jednom drugom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, antitelo iz ADC pronalaska je odabrano od:

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 23 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 23 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 28 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.28;

b) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 24 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 24 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 29 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.29;

c) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 25 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 25 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 30 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.30;

d) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 26 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 26 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 31 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.31 i

e) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 27 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 27 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 32 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.32.

[0115] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 3 ilustruje sekvence VH i VL, respektivno, za poželjna himerna antitela.

Tabela 3

2

[0116] Još jedan specifičan aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na ADC u kom je "Ab" humanizovano antitelo koje se odlikuje time što su konstantni regioni lakog lanca i teškog lanca izvedeni iz humanog antitela, respektivno, lambda ili kapa region i gama-1, gama-2 ili gama-4 region.

[0117] "Humanizovana antitela" označava antitelo koje sadrži CDR regione izvedene iz antitela koje nije humanog porekla, a ostali delovi molekula antitela su izvedeni iz jednog (ili nekoliko) humanih antitela. Pored toga, neki od ostataka segmenta skeleta (zvani FR) se mogu modifikovati da sačuvaju afinitet vezivanja.

[0118] Humanizovana antitela ili fragmenti istih se mogu dobijati tehnikama poznatim stručnjaku. Takva humanizovana antitela su poželjna zbog upotrebe u metodima koji uključuju in vitro dijagnoze ili preventivan i/ili terapijski tretman in vivo. Ostale tehnike humanizacije, takođe poznate stručnjaku, kao što je, na primer, tehnika "transplantacije CDR" opisana pomoću PDL u patentima EP 0451 216, EP 0682 040, EP 0 939 127, EP 0566 647 ili US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 i US 5,693,761. US patenti 5,639,641 ili 6,054,297, 5,886,152 i 5,877,293 se takođe mogu citirati.

[0119] Kao posebno rešenje pronalaska i, kao što će biti objašnjeno sa više detalja u primerima posle, ovde je opisano antitelo koje se sastoji od hz208F2. Takva humanizacija se može primeniti i na druge delove antitela predmetnog pronalaska.

[0120] U jednom poželjnom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima:

i) CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID br.7, 2 i 3, respektivno i

ii) FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGHV1-46*01 (SEQ ID br.

46) i

2

iii) FR4 izvedene iz humane embrionske linije IGHJ4*01 (SEQ ID br.48).

[0121] U jednom poželjnom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima:

i) CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sekvence SEQ ID br.9, 5 i 11, respektivno i ii) FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGKV1-39*01 (SEQ ID br.

47) i

iii) FR4 izvedene iz humane embrionske linije IGKJ4*01 (SEQ ID br.49).

[0122] U jednom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju pronalaska, antitelo obuhvata:

a) težak lanac koji ima CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID br. 7, 2 i 3, respektivno, i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGHV1-46*01 (SEQ ID br. 46), i FR4 izveden iz humane embrionske linije IGHJ4*01 (SEQ ID br.

48) i

b) lak lanac koji ima CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sekvence SEQ ID br. 9, 5 i 11, respektivno, i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGKV1-39*01 (SEQ ID br. 47), i FR4 izveden iz humane embrionske linije IGKJ4*01 (SEQ ID br.

49).

[0123] U jednom rešenju, antitelo iz ADC prema pronalasku obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 i varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35. Navedeno humanizovano antitelo će se ubuduće nazivati hz208F2 ("varijanta 1" ili "Var.1").

[0124] U jednom drugom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br.33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95.

[0125] Pod izrazom "povratna mutacija" misli se na mutaciju ili zamenu humanog ostatka prisutnog u embrionskoj liniji odgovarajućim ostatkom koji je inicijalno bio prisutan u mišjoj sekvenci.

[0126] U jednom drugom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br.33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata povratne mutacije 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ili 17 odabrane od ostataka 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95.

[0127] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 4 ilustruje poželjne povratne mutacije.

T l 4

[0128] U jednom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br.35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 i 87.

[0129] U jednom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br.35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 povratnih mutacija odabranih od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 ili 87.

[0130] U jednom drugom rešenju, antitelo iz ADC prema predmetnom pronalasku obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95 i

b) varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 i 87.

[0131] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 5 ilustruje poželjne povratne mutacije.

Tabela 5

[0132] U takvom rešenju, antitelo iz ADC prema pronalasku obuhvata sve gore pomenute povratne mutacije i odgovara antitelu koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 34 i varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 36. Navedeno humanizovano antitelo će se ubuduće nazivati hz208F2 ("Varijanta 3" ili "Var.3").

[0133] U jednom drugom rešenju, sve humanizovane forme između Varijanta 1 i Varijanta 3 su takođe obuhvaćene predmetnim pronalaskom. Drugim rečima, antitelo prema pronalasku odgovara antitelu koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) "konsenzus" sekvence SEQ ID br. 41 i varijabilni domen lakog lanca (VL) "konsenzus" sekvence SEQ ID br. 42. Navedeno humanizovano antitelo, kao celina, će se ubuduće nazivati hz208F2 ("Varijanta 2" ili "Var.2").

[0134] U jednom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, antitelo iz ADC pronalaska je odabrano od:

a) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 33 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.33 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

b) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.34 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.34 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11.

1

[0135] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 33 ili 34", podrazumevaju se sekvence koje ispoljavaju tri CDR teškog lanca SEQ ID br.1, 2 i 3 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 33 ili 34 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.1,2 i 3).

[0136] Ako nije naznačeno u relevantnim paragrafima, u predmetnom opisu, pod bilo kojom sekvencom ili pod sekvencom koja ispoljava bar 80% identičnosti sa određenom sekvencom, se mora podrazumevati da navedena sekvenca ispoljava bar 80%, a poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa referentnom sekvencom. Ako sekvence sadrže CDR sekvence, podrazumeva se da sekvence koje ispoljavaju bar ove CDR-ove identično sa CDR-ovima referentne sekvence, 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom treba da se izračuna za preostalu sekvencu lociranu van sekvenci koje odgovaraju ovim CDR-ovima.

[0137] U jednom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, antitelo pronalaska je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 35 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.35 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 36 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.36 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

[0138] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 35 ili 36", podrazumevaju se sekvence koje ispoljavaju tri CDR lakog lanca SEQ ID br.4, 5 i 6 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 35 ili 36 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.4, 5 i 6).

[0139] Humanizovana antitela opisana ovde se mogu odlikovati i konstantnim domenom, a konkretnije, navedena humanizovana antitela mogu biti izanrana ili dizajnirana, kao što su, bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD ili IgE. Poželjnije, u kontekstu predmetnog pronalaska, navedena humanizovana antitela su IgG1 ili IgG4.

[0140] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je "Ab" humanizovano antitelo koje sadrži varijablilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG1. Poželjnije, navedeno humanizovano antitelo obuhvata konstantni domen za VH sekvence SEQ ID br.43 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0141] Jedno rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je "Ab" humanizovano antitelo koje sadrži varijablilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG4. Poželjnije, navedeno humanizovano antitelo obuhvata konstantni domen za VH sekvence SEQ ID br.44 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0142] Još jedno drugo rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je "Ab" antitelo odabrano od:

2

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 37 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 37 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 39 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.39 i

b) antitelo koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 38 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 38 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 40 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.40.

[0143] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 6a ilustruje neograničavajuće primere sekvenci VH i VL za varijantu 1 (Var. 1) i varijantu 3 (Var. 3) humanizovanog antitela hz208F2. Obuhvaćena je i konsenzus sekvenca za varijantu 2 (Var.2).

Tabela 6a

[0144] U jednom drugom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, antitelo iz ADC pronalaska je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80; i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 1;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.

57 ili 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60; i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

c) antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80; i varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 ili 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60.

[0145] Još jedno drugo rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je "Ab" antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 57 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.57 i

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.56, 64, 68 i 78 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.56, 64, 68 ili 78 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 60, ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.60.

[0146] A još jedno drugo rešenje pronalaska se odnosi na ADC gde je Ab antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 58 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 58 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59;

b) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 58 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 58 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.61;

c) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 63 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 63 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59;

d) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 65 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 65 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59;

e) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 65 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 65 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.61;

f) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br.67 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.67 i lakog lanca sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.

59;

g) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 69 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 69 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59;

h) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 69 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 69 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.61;

i) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br.71 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.71 i lakog lanca sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.

59;

4

j) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br.73 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.73 i lakog lanca sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.

59;

k) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 75 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 75 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59;

l) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br.77 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.77 i lakog lanca sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.

59;

m) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 79 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 79 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59;

n) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 79 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 79 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.61 i

o) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 81 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 81 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59.

[0147] Drugim rečima, pronalazak se odnosi na ADC gde je Ab is antitelo koje sadrži:

a) težak lanac sekvence odabrane od SEQ ID br.58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 i 81 ili bilo koju sekvencu sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 i 81 i

b) lak lanac sekvence odabrane od SEQ ID br. 59 i 61 ili bilo koju sekvencu sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59 i 61.

[0148] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 6b ilustruje neograničavajuće primere sekvenci VH i VL (varijablilni domen i puna dužina) za različite varijante humanizovanog antitela hz208F2.

T l

[0149] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je ADC gde je Ab antitelo koje je proizveo hibridom 1-4757, 1-4773, 1-4775, 1-4736 ili 1-4774, deponovan u CNCM, Institut Pasteur France, 30. maja, 2013., 26. juna, 2013., 26. juna, 2013., 24. aprila, 2013. i 26. juna, 2013., respektivno.

[0150] Zaista, ovde je opisan mišji hibridom odabran od hibridoma 1-4757, 1-4773, 1-4775, 1-4736 i 1-4774, deponovan u CNCM, Institut Pasteur France, 30. maja, 2013., 26. juna, 2013., 26. juna, 2013., 24. aprila, 2013. i 26. juna, 2013., respektivno.

[0151] Takođe je opisana izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema pronalasku.

[0152] Termini "nukleinska kiselina", "nukleinska sekvenca", "sekvenca nukleinske kiseline", "polinukleotid", "oligonukleotid", "polinukleotidna sekvenca" i "nukleotidna sekvenca", koje se u predmetnom opisu ravnopravno koriste, označavaju preciznu sekvencu nukleotida, modifikovanu ili ne, koja definiše fragment ili region nukleinske kiseline, koji sadrži ili ne sadrži neprirodne nukleotide i koja je ili dvolančana DNK, jednolančana DNK ili proizvod transkripcije navedenih DNK.

[0153] Ove sekvence su izolovane i/ili prečišćene, tj., uzorkovane su direktno ili indirektno, na primer, kopiranjem, gde je njihovo okruženje bar delimično modifikovano. Izolovane nukleinske kiseline dobijene rekombinantnom genetikom, putem, na primer, ćelija domaćina, ili dobijene hemijskom sintezom, bi takođe ovde trebalo pomenuti.

[0154] Takođe je opisan vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz ADC prema pronalasku, naročito kloniranjem i/ili ekspresionim vektorima koji sadrže takvu nukleotidnu sekvencu.

[0155] Poželjno je da vektori sadrže elemente koji dozvoljavaju ekspresiju i/ili sekreciju nukleotidnih sekvenci u datoj ćelija domaćinu. Vektor, dakle, može da sadrži promoter, signale za početak i kraj translacije, kao i pogodne regione za regulaciju transkripcije. On mora da bude u stanju da se održi na stabilan način u ćeliji domaćinu i može opciono da ima specifične signale koji specifikuju sekreciju transliranog proteina. Ovi različiti elementi su izabrani i optimizovani od strane stručnjaka u skladu sa upotrebljenom ćelijom domaćinom. U ovu svrhu, nukleotidne sekvence se mogu insertovati u samoreplicirajuće vektore unutar izabranog domaćina ili da budu integrativni vektori izabranog domaćina.

[0156] Vektori su, na primer, vektori plazmidnog ili viralnog porekla. Koriste se za transformaciju ćelija domaćina da bi se klonirale ili eksprimirale nukleotidne sekvence iz pronalaska.

[0157] Takvi vektori se dobijaju metodima koje stručnjak tipično koristi i dobijeni klonovi mogu da se uvedu u pogodnog domaćina standardnim metodima kao što je lipofekcija, elektroporacija, konjugacija, toplotni šok ili hemijski metodi.

[0158] Ove izolovane ćelije domaćini su transformisane ili sadrže vektor kao što je gore opisano.

[0159] Ćelija domaćin se može odabrati od prokariotskih ili eukariotskih sistema, kao što su bakterijske ćelije, na primer, ali i ćelije kvasca ili životinjske ćelije, naročito sisarske ćelije (sa izuzetkom čoveka). Insekt ili biljka se takođe može koristiti.

[0160] Takođe je opisan metod za proizvodnju antitela za ADC prema pronalasku, ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde navedeni metod obuhvata sledeće korake:

a) kultura u medijumu sa pogodnim uslovima za kulturu za ćeliju domaćina kao što je gore opisano i

b) sakupljanje ovako proizvedenih antitela iz medijuma za kulturu ili iz navedenih gajenih ćelija.

[0161] Transformisane ćelije su od upotrebe u metodima za dobijanje rekombinantnih antitela za ADC prema pronalasku. Metodi za dobijanje antitela u rekombinantnoj formi pomoću vektora i/ili ćelije transformisane vektorom kao što je gore opisano, su takođe sadržani u predmetnoj specifikaciji. Poželjno je da se ćelija transformisana vektorom, kao što je gore opisano, gaji u uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju gorenavedenog antitela i sakupljanje navedenog antitela.

[0162] Kao što je već pomenuto, ćelija domaćin se može izabrati od prokariotskih ili eukariotskih sistema. Konkretno, moguće je identifikovati nukleotidne sekvence koje olakšavaju sekreciju u takvom prokariotskom ili eukariotskom sistemu. Vektor, kao što je gore opisan, koji nosi takvu sekvencu se, dakle, može preimućstveno koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina koje treba sekretovati. Zaista, prečišćavanje ovih rekombinantnih proteina od interesa će biti olakšano činjenicom da su oni prisutni u supernatantu ćelijske kulture više nego u ćelijama domaćinima.

[0163] Antitelo za ADC iz predmetnog pronalaska se može dobijati i hemijskom sintezom. Stručnjak poznaje metode hemijske sinteze, kao što su tehnike čvrste faze ili tehnike parcijalne čvrste faze, kondenzacijom fragmenata ili konvencionalnom sintezom u rastvoru. Polipeptidi dobijeni hemijskom sintezom i sposobni da sadrže odgovarajuće neprirodne aminokiseline se takođe mogu citirati.

[0164] Antitelo koje će se verovatno dobiti gore opisanim metodom je takođe sadržano u ADC iz predmetnog pronalaska.

[0165] Prema jednom posebnom aspektu, pronalazak se odnosi na ADC gde je Ab antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano za upotrebu kao prenosoca za dostavljanje citotoksičnog agensa na ciljno mesto u domaćinu, gde se navedeno ciljno mesto u domaćinu sastoji od epitopa lokalizovanog u IGF-1R, poželjno u vanćelijskom domenu IGF-1R, poželjnije humanom IGF-1R (SEQ ID br. 50), a još poželjnije, humanom vanćelijskom domenu IGF-1R (SEQ ID br. 51), a još poželjnije u N-terminusu humanog vanćelijskog domena IGF-1R (SEQ ID br.52), ili bilo kojoj prirodnoj varijanti njegove sekvence.

[0166] U jednom poželjnom rešenju, navedeno ciljno mesto u domaćinu je ciljno mesto sisarske ćelije, poželjnije humane ćelije, poželjnije, ćelije koja prirodno ili putem genetičke rekombinacije, eksprimira IGF-1R.

[0167] U jednom još poželjnijem rešenju, navedeno ciljno mesto je ciljno mesto ćelije pacijenta, poželjno čoveka, koji ima kancer, poželjno kancer koji eksprimira IGF-1R, ili kancer vezan za IGF-1R.

[0168] Kanceri koji eksprimiraju IGF-1R ili kanceri vezani za IGF-1R naročito uključuju kancere u kojima tumorske ćelije eksprimiraju ili preterano eksprimiraju ceo ili deo IGF-1R na svojoj površini.

II - Lek (D)

[0169] Funkcionalna grupa leka prema pronalasku ima sledeću formulu (II)

gde je:

- R2COOH, COOCH3ili tiazolil (kao što je tiazol-2-il),

- R3je H ili (C1-C6)alkil (kao što je metil), naročito (C1-C6)alkil grupa,

- R9je H ili (C1-C6)alkil (kao što je metil),

- m je ceo broj između 1 i 8, a

- talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L.

[0170] Pod "alkil" u predmetnom pronalasku se misli na linearan ili razgranat, zasićen lanac ugljovodonika. Na primer, može se pomenuti metil, etil, propil, isopropil, butil, izobutil, sekbutil, terc-butil, pentil ili heksil grupa.

[0171] Pod "(Cx-Cy)alkil" u predmetnom pronalasku se misli na alkilni lanac kao što je definisan gore koji sadrži x do y ugljenikovih atoma. Prema tome, (C1-C6)alkil grupa je alkilni lanac koji ima 1 do 6 ugljenikovih atoma.

[0172] (C1-C6)alkil je prvenstveno (C1-C4)alkil, poželjno (C1-C2)alkil.

[0173] Među jedinjenjima iz pronalaska, jedna naročito cenjena klasa funkcionalnih grupa leka odgovara formuli (II) funkcionalne grupe leka u kojoj R2predstavlja COOH grupu.

[0174] Još jedna naročito cenjena klasa funkcionalnih grupa odgovara formuli (II) funkcionalnih grupa u kojoj je R2tiazol (naročito tiazol-2-il grupa).

[0175] Još jedna naročito cenjena klasa funkcionalnih grupa odgovara formuli (II) funkcionalnih grupa u kojoj je R2COOMe.

[0176] Prema jednom konkretnom rešenju predmetnog pronalaska, R2je konkretnije COOH, COOMe ili tiazol-2-il grupa.

[0177] Prema prvom poželjnom rešenju, R2je COOH.

[0178] Prema drugom poželjnom rešenju, R2je COOMe.

[0179] R3naročito predstavlja (C1-C6)alkil, prvenstveno metil grupu.

[0180] m je ceo broj između 1 i 8, naročito između 1 i 6, prvenstveno između 1 i 4, poželjno je 1 ili 2.

[0181] U jednom poželjnom rešenju, R2je COOH, R3je metil grupa, a m je 1 ili 2.

[0182] Među funkcionalnim grupama leka iz pronalaska, jedna naročito cenjena klasa funkcionalnih grupa leka odgovara formuli (II) funkcionalne grupe leka u kojoj je R9metil grupa ili vodonik.

[0183] U jednom poželjnom rešenju:

- R2je COOH, R3je metil grupa, R9je metil grupa, a m je 1 ili 2, ili

- R2je COOH, R3je metil grupa, R9je vodonik, a m je 1 ili 2.

[0184] Prema jednom poželjnom rešenju, NR9grupa je smeštena na fenilnom prstenu u para poziciji u odnosu na (CH2)mgrupu.

[0185] Prvenstveno, funkcionalna grupa leka je odabrana od sledećih grupa:

4

Dobijanje leka (formule DH):

[0186] Lek se može dobijati primenom opštih metoda opisanih u sledećim šemama sinteze, po potrebi, opciono obogaćenim bilo kojom standardnom operacijom koja je opisana u literaturi ili je dobro poznata stručnjacima, ili je opisana u primerima u njihovom eksperimentalnom delu.

[0187] Šema 1 ilustruje prvi opšti metod koji se može koristiti za dobijanje leka. U gornjim opštim formulama, R1= H, R2i R3su kao što su prethodno definisani za formulu II, R4predstavlja

R4apredstavlja R4grupu kao što je prethodno definisana, opciono u zaštićenom vidu, a G je zaštitna grupa.

[0188] Prvi korak se sastoji od kondenzovanja jedinjenja (II), zaštićenog na svojoj amin grupi zaštitnom grupom G, sa jedinjenjem (III). X može da predstavlja odlazeću grupu kao što je hlor. U tom slučaju, prvi korak je reakcija između kiselog hlorida i amina. Ova reakcija se može voditi primenom metoda i tehnika dobro poznatih stručnjacima. U jednom naročito cenjenom metodu, dva entiteta su izazvana da reaguju u prisustvu organske ili neorganske baze, npr. Et3N, iPr2NEt, piridina, NaH, Cs2CO3, K2CO3u rastvaraču kakav je THF, dihlorometan, DMF, DMSO, na temperaturi naročito između -20°C i 100°C. X može biti i hidroksil (OH). U tom slučaju, prvi korak je reakcija kondenzacije između karboksilne kiseline (II) i amina (III). Ova reakcija se može vršiti sledećim metodima i tehnikama dobro poznatim stručnjacima. U jednom naročito cenjenom metodu, ova dva entiteta su izazvana da reaguju u prisustvu agensa za kuplovanje kakav je 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid (EDC), 3-hidroksi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on, tercijerni amin kakav je diizopropiletilamin, u polarnom aprotičnom rastvaraču kakav je dihlorometan ili DMF, na temperaturi poželjno između -15°C i 40°C. U jednom drugom naročito cenjenom metodu, ova dva entiteta su izazvana da reaguju u prisustvu dietil fosforocijanidata (DEPC), tercijernog amina kakav je trietilamin, u polarnom aprotičnom rastvaraču kakav je dihlorometan ili DMF, na temperaturi između -15°C i 40°C. Jedan drugi naročito cenjen metod se sastoji od

4

izazivanja ova dva entiteta da reaguju u prisustvu O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronijumheksafluorofosfata (HATU), tercijernog amina kakav je diizopropiletilamin, u polarnom aprotičnom rastvaraču kakav je dihlorometan ili DMF, na temperaturi između-15°C i 100°C.

[0189] Posle skidanja zaštite sa intermedijera pomoću tehnika dobro poznatih stručnjacima (« Protective Groups in Organic Synthesis », T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 i «Protecting Groups », P.J. Kocienski, Thieme Verlag, 1994), jedinjenje (IV) se može kondenzovati sa jedinjenjem (V), sledeći metode i tehnike opisane gore da bi se dobilo jedinjenje (VI) posle koraka skidanja zaštite. Ovo jedinjenje može zatim, posle kondenzacije sa intermedijerom (VII) i opcionog skidanja zaštite, da dovede do formiranja leka. Jedinjenje (VI) se takođe može kuplovati sa jedinjenjem (VII') u kom je R'3prekursor R3, naročito R3grupa je zaštićena zaštitnom grupom. Kuplovanje i sledeće skidanje zaštite sa grupe R'3da bi se dobio R3se može vršiti sledeći iste procedure kao što je prethodno opisano.

[0190] Šema 2 ilustruje drugi opšti metod koji se može koristiti za dobijanje leka. U gornjim opštim formulama, G je zaštitna grupa, R1= H, R2, R3i R4asu kao što su prethodno definisani, a R4bpredstavlja

[0191] U prvom koraku, jedinjenje (IX) zaštićeno na svojoj amin grupi zaštitnom grupom G, je kondenzovano sa jedinjenjem (VI). X može da predstavlja odlazeću grupu, npr. hlor. U tom slučaju, prvi korak je reakcija između kiselog hlorida i amina. Ova reakcija se može voditi primenom metoda i tehnika dobro poznatih stručnjacima. U jednom naročito cenjenom metodu, dva entiteta su izazvana da reaguju u prisustvu organske ili neorganske baze, kakve su Et3N, iPr2NEt, piridin, NaH, Cs2CO3, K2CO3u rastvaraču kakav je THF, dihlorometan, DMF, DMSO, na temperaturi naročito između -20°C i 100°C. X može predstavljati i hidroksil. U tom slučaju, prvi korak je reakcija kondenzacije između karboksilne kiseline (IX) i amina (VI). Ova reakcija se može vršiti sledećim metodima i tehnikama dobro poznatim stručnjacima. U jednom naročito cenjenom metodu, ova dva entiteta su izazvana da reaguju u prisustvu 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimida (EDC), 3-hidroksi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on-a, tercijernog amina kakav je diizopropiletilamin, u polarnom aprotičnom rastvaraču kakav je dihlorometan ili DMF, na temperaturi poželjno između -15°C i 40°C. U jednom drugom naročito cenjenom metodu, ova dva entiteta su izazvana da reaguju u prisustvu dietil fosforocijanidata (DEPC), tercijernog amina kakav je trietilamin, u polarnom aprotičnom rastvaraču kakav je dihlorometan ili DMF, na temperaturi poželjno između -15°C i 40°C.

[0192] Posle skidanja zaštite sa intermedijera, primenom tehnika dobro poznatih stručnjacima, dobijeno jedinjenje (VIII) može da dovede do leka posle reakcije sa R4Y. U tom slučaju, Y je odlazeća grupa kao što je Cl, Br, I, OSO2CH3, OSO2CF3ili O-Tosyl. Reakcija se vodi u prisustvu organske ili neorganske baze kao što je Et3N, iPr2NEt, NaH, Cs2CO3, K2CO3, u polarnom anhidrovanom rastvaraču kakav je dihlorometan, THF, DMF, DMSO na temperaturi poželjno između -20° i 100°C U jednom drugom naročito cenjenom metodu, jedinjenje (VIII) je izazvano da reaguje sa aldehidom formule R4b-CHO, gde R4bodgovara prekursoru R4. U tom slučaju, reakcija je reduktivna aminacija u prisustvu redukcionog sredstva kakav je NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3, u polarnom rastvaraču kakav je 1,2-dihloroetan, dihlorometan, THF, DMF, MeOH, opciono u prisustvu titanijum izopropoksida (IV), na pH koji se može kontrolisati dodavanjem kiseline kakava je sirćetna kiselina, na temperaturi poželjno između -20°C i 100°C.

[0193] U gornjim šemama sinteze, lek može da dovede do jednog drugog leka posle dodatnog reakcionog koraka, kao što je saponifikacija, na primer, primenom metoda dobro poznatih stručnjacima, gde se R2grupa, koja predstavlja estar (COOMe), zameni R2grupom koja predstavlja karboksilnu kiselinu (COOH).

[0194] Ako se želi izolovati lek koji sadrži bar jednu osnovnu funkcionalnu grupu u vidu kisele adicione soli, ovo je moguće tretiranjem slobodne baze leka (koji sadrži bar jednu osnovnu funkcionalnu grupu) pogodnom kiselinom, poželjno u ekvivalentnoj količini. Pogodna kiselina može konkretno biti trifluorosirćetna kiselina.

III - Linker (L)

[0195] "Linker", "Linkerska jedinica", "L" ili "link" označava, u predmetnom pronalasku, hemijsku grupu koja sadrži kovalentnu vezu ili lanac atoma koji kovalentno spaja antitelo sa bar jednim lekom.

[0196] Linkeri mogu da se prave upotrebom niza bifunkcionalnih agenasa za kuplovanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom 14 je primer sredstva za heliranje za konjugaciju citotoksičnih agenasa sa prenosnim sistemom. Ostali reagensi za

4

unakrsno vezivanje (kros-linkeri) mogu da budu BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr., od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A).

[0197] Linker može da bude takav da "ne može da se cepa" ili da "može da se cepa" (cleavable).

[0198] U jednom poželjnom rešenju, linker "može da se cepa" oslobađajući otpuštanje leka u ćeliju. Na primer, mogu se koristiti kiselo-labilan linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilan linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid. U jednom poželjnom rešenju, linker može da se cepa u uslovima unutar ćelije, tako da cepanje linkera oslobađa lek sa antitela u unutarćelijskoj sredini.

[0199] Na primer, u nekim rešenjima, linker može da se cepa pomoću agensa za cepanje koji je prisutan u unutarćelijskoj sredini (npr., unutar lizozoma ili endozoma ili kaveole). Linker može biti, na primer, peptidil linker koji cepa unutarćelijska peptidaza ili proteazni enzim, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomsku ili endozomsku proteazu. Tipično, peptidil linker obuhvata bar dve uzastopne aminokiseline ili bar tri uzastopne aminokiseline ili je bar dve aminokiseline dug ili bar tri aminokiseline dug. Agensi za cepanje mogu da uključuju katepsine B i D i plazmin, koji su svi poznati da hidrolizuju dipeptidne derivate leka što dovodi do oslobađanja aktivnog leka unutar ciljne ćelije. Na primer, može da se koristi peptidil linker koji može da se cepa pomoću katepsina-B, tiol-zavisne proteaze, koji se jako eksprimira u kancerskom tkivu (npr., linker koji sadrži ili je Phe-Leu ili Gly-Phe-Leu-Gly). U specifičnim rešenjima, peptidil linker koji može da se cepa pomoću unutarćelijske proteaze obuhvata ili je Val-Cit ili Phe-Lys. Jedna prednost upotrebe unutarćelijskog proteolitičkog oslobađanja leka je da je lek tipočno oslabljen kad je konjugovan i stabilnosti konjugata u serumu su tipično visoke.

[0200] U drugim rešenjima, linker koji može da se cepa je osetljiv na pH, tj., osetljiv na hidrolizu pri određenim vrednostima pH. Tipično, linker osetljiv na pH je hidrolizabilan u kiselim uslovima. Na primer, može da se koristi kiselo-labilan linker koji je hidrolizabilan u lizozomu (npr., hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitinski amid, ortoestar, acetal, ketal ili slično). Takvi linkeri su relativno stabilni u uslovima neutralnog pH, kao što su oni u krvi, ali su nestabilni ispod pH 5,5 ili 5,0, približan pH lizozoma. U određenim rešenjima, hidrolizabilan linker je tioetarski linker (kao što je, npr., tioetar spojen sa lekom preko acilhidrazonske veze).

[0201] A u nekim drugim rešenjima, linker može da se cepa u reduktivnim uslovima (npr., disulfidni linker). Niz disulfidnih linkera je poznat u struci, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati pomoću SATA (N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen).

[0202] U određenim poželjnim rešenjima, linkerska jedinica može imati sledeću opštu formulu:

-(T)a-(W)w-(Y)y-

4

gde je:

T produžna (stretcher) jedinica;

a je 0 ili 1;

W je aminokiselinska jedinica;

w je ceo broj u opsegu od 0 do 12;

Y je spejser jedinica;

y je 0, 1 ili 2.

[0203] Produžna jedinica (T), kad je prisutna, vezuje antitelo sa aminokiselinskom jedinicom (W) kad je prisutna, ili sa spejser jedinicom kad je prisutna, ili direktno sa lekom. Korisne funkcionalne grupe koje mogu biti prisutne na antitelu, bilo prirodno, bilo hemijskom manipulacijom, uključuju sulfhidril, amino, hidroksil, anomernu hidroksilnu grupu ugljovodonika i karboksil. Pogodne funkcionalne grupe su sulfhidril i amino. Sulfhidril grupe se mogu generisati redukcijom intramolekulskih disulfidnih veza antitela, ako su prisutne. Alternativno, sulfhidril grupe se mogu generisati reakcijom amino grupe iz lizinske grupe antitela sa 2-iminotiolanom ili nekim drugim reagensima koji generišu sulfhidril. U specifičnim rešenjima, antitelo se inženjeriše tako da nosi jedan ili više lizina. Poželjnije, antitelo se može inženjerisati tako da nosi jedan ili više cisteina (cf. ThioMabs).

[0204] U određenim specifičnim rešenjima, produžna jedinica formira vezu sa atomom sumpora iz antitela. Atom sumpora može biti izveden iz sulfhidril (-SH) grupe redukovanog antitela.

[0205] U nekim drugim određenim specifičnim rešenjima, produžna jedinica je spojena sa antitelom preko disulfidne veze između atoma sumpora iz antitela i atoma sumpora iz produžne jedinice.

[0206] U nekim drugim specifičnim rešenjima, reaktivna grupa produžnice sadrži reaktivno mesto koje može da bude reaktivno na amino grupu antitela. Amino grupa može da bude ona iz arginina ili lizina. Pogodna reaktivna mesta na amin uključuju, ali bez ograničenja, aktivirane estre (kao što su sukcinimid estri, 4-nitrofenil estri, pentafluorofenil estri), anhidridi, kiseli hloridi, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocijanati.

[0207] U jednom drugom aspektu, reaktivna grupa produžnice sadrži reaktivno mesto koje je reaktivno na modifikovanu ugljovodoničnu grupu koja može da bude prisutna na antitelu. U jednom specifičnom rešenju, antitelo je glikozilovano enzimski da bi obezbedilo ugljovodoničnu grupu ili je prirodno glikozilovano. Ugljovodonik može da bude blago oksidovan reagensom kao što je natrijum perjodat i dobijena karbonilna jedinica oksidovanog ugljovodonika može biti kondenzovana sa produžnicom koji sadrži funkcionalnu grupu kao što je hidrazid, oksim, reaktivni amin, hidrazin, tiosemikarbazid, hidrazin karboksilat, ili arilhidrazid.

[0208] Prema jednom posebnom rešenju, produžna jedinica ima sledeću formulu:

4

gde je

L2(C4-C10)cikloalkil-karbonil, (C2-C6)alkil ili (C2-C6)alkil-karbonil (cikloalkil ili alkil grupe su spojene sa atomom azota iz maleimidne grupe), zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa aminokiselinskom jedinicom, ako je prisutna, sa spejser jedinicom, ako je prisutna, ili sa lekom D i

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa antitelom Ab.

[0209] Pod "(C4-C10)cikloalkil" u predmetnom pronalasku se misli na ugljovodonični prsten koji ima 4 do 10 ugljenikovih atoma uključujući, ali bez ograničenja, ciklopentil, cikloheksil i slično.

[0210] L2može prvenstveno biti (C2-C6)alkil-karbonil kao što je pentil-karbonil sledeće formule:

gde

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa aminokiselinskom jedinicom, ako je prisutna, sa spejser jedinicom, ako je prisutna, ili sa lekom D i

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa sa atomom azota iz maleimidne grupe.

[0211] Aminokiselina jedinica (W), kad je prisutna, spaja produžnu jedinicu (T) ako je prisutna, ili na drugi način antitelo sa spejser jedinicom (Y) ako je spejser jedinica prisutna, ili sa lekom ako je spejser jedinica odsutna.

[0212] Kao što je gore pomenuto, (W)wje odsutna (w = 0) ili može biti dipeptidna, tripeptidna, tetrapeptidna, pentapeptidna, heksapeptidna, heptapeptidna, oktapeptidna, nonapeptidna, dekapeptidna, undekapeptidna ili dodekapeptidna jedinica, gde se aminokiseline koje formiraju peptide mogu razlikovati među sobom.

[0213] Prema tome, (W)wmože biti predstavljen sledećom formulom: (W1)w1(W2)w2(W3)w3(W4)w4(W5)w5, gde svaki od W1 do W5 predstavlja, nezavisno od ostalih, aminokiselinu jedinicu i svaki od w1 do w5 je 0 ili 1.

[0214] U nekim rešenjima, aminokiselinska jedinica (W)wmože da sadrži aminokiselinske ostatke kao što su oni koji se javljaju prirodno, kao i manje aminokiseline i aminokiselinske analoge koji se ne javljaju prirodno, kao što je citrulin.

4

[0215] Aminokiselinski ostaci iz aminokiselinske jedinice (W)wuključuju, bez ograničenja, alanin, valin, leucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofan, prolin, lizin zaštićen ili ne acetilom ili formilom, arginin, arginin zaštićen ili ne tozilom ili nitro grupama, histidin, ornitin, ornitin zaštićen acetilom ili formilom i citrulin. Primeri komponenata aminokiselinskih linkera poželjno uključuju dipeptid, tripeptid, tetrapeptid ili pentapeptid, pogotovo dipeptid ili tripeptid.

[0216] Primeri dipeptida uključuju: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N<9>-tosyl-Arg, Phe-N<9>-Nitro-Arg.

[0217] Primeri tripeptida uključuju: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

[0218] Primeri tetrapeptida uključuju: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO.54).

[0219] Primeri pentapeptida uključuju: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO.55).

[0220] Prema jednom posebnom rešenju, (W)wmože biti dipeptid (tj. w = 2) kao što je Val-Cit, ili linkeru nedostaje aminokiselinska jedinica (w=0). Kad linkeru nedostaje aminokiselinska jedinica, poželjno je da mu nedostaje i spejser jedinica.

[0221] Prema jednom poželjnom rešenju, w = 0 (tj. (W)wje jednoguba veza) ili w = 2 (tj. (W)wje dipeptid) i (W)wdakle može biti odabrana od:

4

a naročito je Val-Cit,

gde

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa spejser jedinicom ako je prisutna, ili sa lekom D i

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L2.

[0222] Komponente aminokiselinskog linkera mogu biti dizajnirane i optimizovane u svojoj selektivnosti za enzimsko cepanje konkretnim enzimom, na primer, proteazom vezanom za tumor, katepsinom B, C i D, ili plazmin proteazom.

[0223] Aminokiselinska jedinica linkera se može enzimski cepati enzimom uključujući, ali bez ograničenja, proteazu vezanu za tumor, da bi oslobodila lek.

[0224] Aminokiselinska jedinica može biti dizajnirana i optimizovana u svojoj selektivnosti za enzimsko cepanje konkretnom proteazom vezanom za tumor. Pogodne jedinice su one čije cepanje je katalizovano proteazama, katepsinom B, C i D i plazminom.

[0225] Spejser jedinica (Y), kad je prisutna, spaja aminokiselinsku jedinicu, ako je prisutna, ili produžnu jedinicu, ako je prisutna, ili na drugi način antitelo sa lekom. Spejser jedinice su dva opšta tipa: samožrtvujuća i nesamožrtvujuća. Nesamožrtvujuća spejser jedinica je ona čiji deo ili cela spejser jedinica ostaje vezana za lek posle enzimskog cepanja aminokiselinske jedinice od konjugata antitelo-lek. Primeri nesamožrtvujuće spejser jedinice uključuju, ali nisu ograničeni na (glicin-glicin) spejser jedinicu i glicinsku spejser jedinicu. Da bi se oslobodio lek, nezavisna reakcija hidrolize bi trebalo da se desi unutar ciljne ćelije da bi se pocepala veza glicin-lek jedinice.

[0226] U jednom posebnom rešenju, nesamožrtvujuća spejser jedinica (Y) je Gly.

[0227] Alternativno, konjugat antitelo-lek koji sadrži samožrtvujuću spejser jedinicu može da oslobodi lek bez potrebe za odvojenim korakom hidrolize. In takvim rešenjima, (Y) je ostatak p-aminobenzil alkoholne (PAB) jedinice koja je spojena sa (W)wputem azotovog atoma iz PAB grupe i spojena direktno sa lekom preko estarske, karbonatne, karbamatne ili etarske grupe.

[0228] Ostali primeri samožrtvujućih spejsera uključuju, ali bez ograničenja, aromatična jedinjenja koja su elektronski ekvivalentna sa PAB grupom, kao što su ostaci 2-aminoimidazol-5-metanol derivata i orto ili para-aminobenzilacetali. Mogu se koristiti spejseri koji se podvrgavaju lakoj ciklizaciji posle hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobuterne kiseline, odgovarajuće supstituisani sistemi biciklo[2.2.1] i biciklo[2.2.2] prstena i amidi 2-aminofenilpropionske kiseline.

[0229] U jednom alternativnom rešenju, spejser jedinica je razgranata bis(hidroksimetil)stirenska (BHMS) jedinica, koja se može koristiti za ugrađivanje dodatnih lekova.

[0230] U jednom posebnom rešenju, spejser jedinica (Y) je PAB-karbonil sa PAB koja je

(kiseonik iz PAB jedinice je vezan za karbonil), a y = 1 ili linkeru nedostaje spejser jedinica (y=0).

[0231] U jednom posebnom rešenju, linker ima sledeću formulu (III):

gde je

L2(C4-C10)cikloalkil-karbonil, (C2-C6)alkil ili (C2-C6)alkil-karbonil (karbonil iz ovih grupa je, kad je prisutan, vezan za (W)w),

W predstavlja aminokiselinsku jedinicu, sa w koji predstavlja ceo broj između 0 i 5, Y je PAB-karbonil, sa PAB koja je

(kiseonik iz PAB jedinice je vezan za karbonil), a y je 0 ili 1 (poželjno je da y bude 0 kad je w 0 i y 0 ili 1 kad je w između 1 i 5),

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa lekom D i

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa antitelom Ab.

[0232] Prvenstveno, L2je (C2-C6)alkil-karbonil, kao što je pentil-karbonil, sledeće formule:

gde

zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa (W)wi

talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa azotovim atomom iz maleimidne grupe.

[0233] Prema jednom poželjnom rešenju, linker L je odabran od:

1

gde zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa lekom D, a talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa antitelom Ab.

IV - Konjugat antitelo-lek (ADC)

[0234] U jednom poželjnom rešenju, konjugat antitelo-lek iz pronalaska se može dobijati bilo kojim metodom poznatim stručnjaku kao što je, bez ograničenja, i) reakcija nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim linker reagensom, a zatim reakcija sa nukleofilnom grupom leka ili ii) reakcija nukleofilne grupe leka sa bivalentnim linker reagensom, a zatim reakcija sa nukleofilnom grupom antitela.

2

[0235] Nukleofilne grupe na antitelu uključuju, bez ograničenja, N-terminalne amino grupe, amino grupe bočnog lanca (npr. lizin), tiol grupe bočnog lanca i hidroksil ili amino grupe šećera kad je antitelo glikozilovano.

[0236] Nukleofilne grupe na leku uključuju, bez ograničenja, amino, tiol i hidroksilne grupe i poželjno amino grupe.

[0237] Amino, tiol i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na funkcionalnim grupama linkera i linker reagensima uključujući, bez ograničenja, aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i kiseli halidi; alkil i benzil halidi kao što su haloacetamidi; aldehidi; ketoni; karboksil i maleimidna grupa. Antitelo može da ima reducibilne disulfide između lanaca, tj. cisteinske mostove. Antitelo može da se napravi reaktivnim za konjugaciju sa linker reagensima tretmanom sa reduktivnim sredstvima kao što je DTT (ditiothreitol). Svaki cisteinski most će, dakle, da formira, teorijski, dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe se mogu uvesti u antitelo kroz bilo koju reakciju poznatu stručnjaku. Kao neograničavajući primer, reaktivne tiol grupe mogu da se uvedu u antitelo uvođenjem jednog ili više cisteinskih ostataka.

[0238] Konjugati antitelo-lek se mogu dobijati i modifikacijom antitela da uvede elektrofilne grupe, koje mogu da reaguju sa nukleofilnim supstituentima na linker reagensu. Šećeri glikozilovanog antitela mogu da se oksiduju da formiraju aldehidne ili ketonske grupe koje mogu da reaguju sa amino grupom linker reagensa ili leka. Dobijene iminske grupe Schiffove baze mogu da formiraju stabilne veze, ili mogu da se redukuju da formiraju stabilne aminske veze. U jednom rešenju, reakcija ugljovodoničnog dela glikozilovanog antitela sa bilo galaktoznom oksidazom ili natrijum meta-perjodatom može da da karbonilne (aldehidne i ketonske) grupe u proteinu koji može da reaguje sa odgovarajućim grupama na leku. U jednom drugom rešenju, proteini koji sadrže N-terminalni serin ili treonin mogu da reaguju sa natrijum meta-perjodatom, dovodeći do proizvodnje aldehida na mestu prve aminokiseline.

[0239] U jednom poželjnom rešenju, konjugat antitelo-lek iz pronalaska se dobija dobijanjem lek-linker grupe, a zatim kuplovanjem nukleofilne grupe antitela (npr. SH grupa iz cisteinske grupe) i elektrofilne iz lek-linker grupe (npr. maleimid).

1. Lek-linker

[0240] Lek-linker grupa se može dobiti kuplovanjem:

- linkera sa lekom,

- dela linkera sa lekom pre završetka sinteze linkera,

- linkera sa delom ili prekursorom leka pre završetka sinteze leka, ili

- dela linkera sa delom ili prekursorom leka pre završetka sinteze linkera i leka.

[0241] Reakcije kuplovanja su dobro poznate reakcije za stručnjaka između nukleofilne grupe i elektrofilne grupe.

[0242] Nukleofilna grupa konkretno može biti amino, tiol ili hidroksilna grupa. U jednom poželjnom rešenju, to je primarna ili sekundarna amino grupa.

[0243] Elektrofilna grupa može biti karboksilna grupa (COOH) opciono u aktiviranom vidu ili aktivirana estarska grupa karbonata.

[0244] Pod "aktivirani vid" karboksilne kiseline se misli na karboksilnu kiselinu u kojoj je OH grupa iz COOH zamenjena aktiviranom odlazećom grupom (LG), omogućavajući kuplovanje aktivirane karboksilne grupe sa amino grupom da bi se formirala amidna veza i oslobodilo jedinjenje LG-H. Aktivirane forme mogu biti aktivirani estri, aktivirani amidi, anhidridi ili acil halidi kao što su acil hloridi. Aktivirani estri uključuju derivate formirane reakcijom karboksilne grupe sa N-hidroksibenzotriazolom ili N-hidroksisukcinimidom.

[0245] Pod "aktivirani karbonatni estar" se misli na karbonatni estar koji sadrži -OC(O)OR grupu u kojoj OR predstavlja dobru odlazeću grupu koja omogućava kuplovanje aktiviranog karbonatnog estra sa amino grupom da bi se formirala karbamatna grupa i oslobodilo jedinjenje ROH. R grupa iz aktiviranog karbonatnog estra uključuje, bez ograničenja, p-nitrofenil, pentafluorofenil, 2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il i benzil grupe, poželjno p-nitrofenil i pentafluorofenil grupe.

[0246] Kad linker ima sledeću formulu (III):

lek-linker grupa ima sledeću formulu (IV):

a poslednji korak u sintezi lek-linker grupe je generalno kuplovanje između jedinjenja sledeće formule (V):

4

gde je L2kao što je prethodno definisan, a LG predstavlja odlazeću grupu, poželjno halid kao što je hlorid ili grupa izvedena iz N-hidroksisukcinimida,

i jedinjenja sledeće formule (VI):

H-(W)w-(Y)y-D (VI)

[0247] Kad je y = 1 i Y = PAB-karbonil, jedinjenje formule (VI) se može dobiti kuplovanjem leka (DH) i jedinjenja sledeće formule (VII), poželjno njegove zaštićene forme:

G-(W)w-PAB-CO-OR (VII)

gde su W i w kao što su prethodno definisani, a R je definisan u definiciji "aktiviranog karbonatnog estra", a G je H ili zaštitna grupa.

[0248] Kad je jedinjenje formule (VII) u zaštićenoj formi, konačni korak skidanja zaštite je neophodan.

[0249] Kad je y = 0, jedinjenje (VI) ima formulu H-(W)w-D, gde su (W)wi poželjno D sastavljeni od aminokiselinskih jedinica. Kao posledica, jedinjenje (VI) se može dobiti u tom slučaju konvencionalnim metodom peptidne sinteze dobro poznatim stručnjaku.

2. Ab-linker-lek

[0250] Poželjno rešenje prema pronalasku se sastoji od kuplovanja cisteina prisutnog na antitelu i elektrofilne grupe iz lek-linker grupe, poželjno sa maleimidnom grupom prisutnom na lek-linker grupi.

[0251] Kuplovanje maleimid-cistein se može vršiti metodima dobro poznatim stručnjaku.

[0252] Uopšteno, antitela ne sadrže mnogo, ako uopšte, slobodnih i reaktivnih tiol grupa cisteina koje se mogu vezati sa funkcionalnom grupom leka. Većina tiol ostataka cisteina u antitelima postoje kao disulfidni mostovi i moraju se redukovati reduktivnim sredstvom kao što je ditiothreitol (DTT) ili TCEP, u parcijalnim ili totalnim redukcionim uslovima. Punjenje (odnos lek/antitelo) ADC se može kontrolisati na nekoliko različitih načina, uključujući: (i) ograničavanje molarnog viška lek-linker intermedijera (D-L) ili linker reagensa u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanje vremena ili temperature za reakciju konjugacije i (iii) parcijalne ili ograničene redukcione uslove za modifikaciju tiola cisteina.

[0253] Struktura disulfidne veze humanog IgG je sada dobro utvrđena (pregled u Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23). U stvari, postoji mnogo sličnosti i neke razlike u pogledu struktura disulfidne veze 4 humane podklase IgG, naime, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Sve podklase IgG sadrže nepromenljivo 12 disulfidnih mostova među lancima i razlike leže u njihovim disulfidnim vezama formiranim između teških i lakih lanaca. Svaka međulančana disulfidna veza je povezana sa pojedinačnim IgG domenom, tj. varijablilnim (VL i VH) i konstantnim (CL, CH1, CH2 i CH3) domenima. Dva teška lanca su vezana u svojim zglobnim regionima različitim brojem disulfidnih mostova: 2 za IgGI i IgG4, 4 za IgG2 i 11 za IgG3. Težak i lak lanac IgG1 su spojeni disulfidnom vezom između poslednjeg cisteinskog ostatka lakog lanca i petog ostatka teškog lanca, dok je za ostale podklase, IgG2, IgG3 i IgG4, lak lanac vezan za težak lanac disulfidnom vezom između poslednjeg cisteinskog ostatka lakog lanca i trećeg ostatka teškog lanca, koji je smešten na dodirnoj površini VH i CH1 domena. Strukture disulfidne veze drukčije od ovih klasičnih struktura su opisane za IgG2 i IgG4 (pregled u Liu and May,, mAbs 4 (2012): 17-23). Međulančane disulfidne veze su jako eksponirane rastvaraču i prema tome mnogo reaktivnije nego međulančane disulfidne veze koje su zakopane u strukturama anti-paralelnih beta ravni unutar svakog domena i nisu eksponirane rastvaraču. Iz ovih razloga, koji god da je izotip antitela, kuplovanje će se desiti na međulančanim eksponiranim cisteinskim ostacima posle blage redukcije. Svaki međulančani disulfidni most, prema tome, može da formira, teorijski, dva mesta konjugacije.

[0254] Dodatne nukleofilne grupe se mogu uvesti u antitela preko reakcije lizina sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens) što dovodi do konverzije amina u tiol. Reaktivne tiol grupe se takođe mogu uvesti u into antitelo (ili njegov fragment) inženjerisanjem jednog, dva, tri, četiri, ili više cisteinskih ostataka (npr., dobijanjem mutantnih antitela koja sadrži jedan ili više nenativnih cisteinskih ostataka). US 7521541 govori o inženjerisanju antitela uvođenjem reaktivnih cisteinskih aminokiselina.

[0255] Cisteinske aminokiseline se mogu inženjerisati na reaktivnim mestima u antitelu i koje ne formiraju međulančane ili međumolekulske disulfidne spojeve (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Inženjerisani cisteinski tioli mogu da reaguju sa linker reagensima ili lek-linker reagensima iz predmetnog pronalaska koji imaju elektrofilne grupe reaktivne sa tiolom, kao što je maleimid ili alfa-halo amidi, da formiraju ADC sa cisteinski inženjerisanim antitelima i funkcionalnim grupama leka. Lokacija funkcionalne grupe leka sa, dakle, može dizajnirati, kontrolisati i znati. Punjenje leka se može kontrolisati, jer inženjerisane tiol grupe cisteina tipično reaguju sa linker reagensima koji su reaktivni sa tiolom ili lek-linker reagensima sa visokim prinosom. Inženjerisanje IgG antitela da uvedu cisteinsku aminokiselinu supstitucijom na jednom mestu na teškom ili lakom lancu daje dva nova cisteina na simetričnom antitelu. Punjenje leka od skoro 2 se može postići uz približnu homogenost proizvoda konjugacije ADC.

[0256] Kad više od jedne nukleofilne ili elektrofilne grupe antitela reaguje sa lek-linker intermedijerom, ili linker reagensom, a zatim funkcionalnom grupom leka kao reagensom, onda je dobijeni proizvod smesa ADC jedinjenja sa distribucijom funkcionalne grupe leka prikačene za antitelo, npr. 1, 2, 3, itd. Metodi tečne hromatografije kao što je polimerna reverzne faze (PLRP) i hidrofobne interakcije (HIC) mogu da razdvoje jedinjenja u smesi punjenja leka. Preparati ADC sa jednom vrednošću punjenja leka (p) mogu da se izoluju, međutim, ovi ADC-ovi sa jednom vrednošću punjenja još uvek mogu da budu heterogene smese zato što funkcionalne grupe leka mogu da budu spojene, preko linkera, na različitim mestima na antitelu.

[0257] Za neke konjugate antitelo-lek, odnos leka može da bude ograničen brojem mesta vezivanja na antitelu. Velika punjenja leka, npr. odnos leka >5, mogu da izazovu agregiranja, nerastvorljivost, toksičnost, ili gubitak ćelijske permeabilnosti određenih konjugata antitelolek. Tipično, manje funkcionalnih grupa leka nego što je teorijski maksimum je konjugovano za antitelo tokom reakcije konjugacije.

[0258] Punjenje leka, koje se još naziva odnos lek-antitelo (DAR) je prosečan broj lekova po agensu koji vezuje za ćeliju.

[0259] U slučaju izotipova antitela IgG1 i IgG4, gde su lekovi vezani za cisteine posle parcijalne redukcije antitela, punjenje leka može da se kreće od 1 do 8 lekova (D) po antitelu, tj. gde je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 funkcionalnih grupe leka kovalentno vezano sa antitelom.

[0260] U slučaju izotip antitela IgG2, gde su lekovi vezani za cisteine posle parcijalne redukcije antitela, punjenje leka može da se kreće od 1 do 12 lekova (D) po antitelu, tj. gde je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12 funkcionalnih grupe leka kovalentno vezano sa antitelom.

[0261] Sastavi ADC uključuju skupove agenasa koji vezuje za ćeliju, npr. antitela, konjugovana sa nizom lekova, od 1 do 8 ili 1 do 12.

[0262] Prosečan broj lekova po antitelu u preparatima ADC iz reakcija konjugacije se mogu okarakterisati konvencionalnim sredstvima kao što su UV, HPLC reverzne faze, HIC, masena spektrometrija, ELISA test i elektroforeza.

[0263] Kao jedno neograničavajuće rešenje, ovde je predstavljena konjugacija sa antitelom c208F2. U tom slučaju, lek je kuplovan sa bar jednim cisteinom odabranim od i) za sekvencu lakog lanca SEQ ID br.28, ostatak Cys. na poziciji 214 i ii) za sekvencu teškog lanca SEQ ID br. 23, ostaci Cys. na pozicijama 223, 229 i 232.

[0264] Kao jedno neograničavajuće rešenje, ovde je predstavljena konjugacija sa antitelom c208F2. U tom slučaju, lek je kuplovan sa dva, tri ili četiri cisteina odabranih od i) za sekvencu lakog lanca SEQ ID br. 28, ostatak Cys. na poziciji 214 i ii) za sekvencu teškog lanca SEQ ID br.23, ostaci Cys. na pozicijama 223, 229 i 232.

[0265] Kao jedno neograničavajuće rešenje, ovde je predstavljena konjugacija sa antitelom hz208F2 (ar. 1). U tom slučaju, lek je kuplovan sa bar jednim cisteinom odabranim od i) za sekvencu lakog lanca SEQ ID br. 39, ostatak Cys. na poziciji 214 i ii) za sekvencu teškog lanca SEQ ID br.37, ostaci Cys. na pozicijama 223, 229 i 232.

[0266] Kao jedno neograničavajuće rešenje, ovde je predstavljena konjugacija sa antitelom hz208F2 (var. 3). U tom slučaju, lek je kuplovan sa dva, tri ili četiri cisteina odabranih od i) za sekvencu lakog lanca SEQ ID br. 40, ostatak Cys. na poziciji 214 i ii) za sekvencu teškog lanca SEQ ID br.38, ostaci Cys. na pozicijama 223, 229 i 232

[0267] Alternativa je kuplovanje lizina. Antitelo može da sadrži, na primer, mnogo lizinskih ostataka koji ne reaguju sa lek-linker intermedijerom (D-L) ili linker reagensom. Samo najreaktivne lizinske grupe mogu da reaguju sa linker reagensom reaktivnim na amin. Takođe, samo najreaktivne tiol grupe cisteina mogu da reaguju sa linker reagensom reaktivnim na tiol.

[0268] Kad su jedinjenja iz pronalaska vezana za lizine, punjenje leka može da se kreće od 1 do 80 lekova (D) po antitelu ćelije, mada gornja granica od 40, 20, 10 ili 8 može biti poželjna.

Sastavi ADC uključuju skupove agenasa koji vezuju za ćeliju, npr. antitela, konjugovana sa nizom lekova od 1 do 80, 1 do 40, 1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 8.

[0269] ADC formule (I) prema pronalasku može biti u vidu farmaceutski prihvatljive soli.

[0270] U predmetnom pronalasku, pod "farmaceutski prihvatljiv" se misli na onaj koji se može koristiti u pripremanju farmaceutskog sastava koji je generalno bezbedan, netoksičan i ni biološki ni na neki drugi način nepoželjan i koji je prihvatljiv za veterinarsku upotrebu, kao i za humanu farmaceutsku upotrebu.

[0271] Pod "farmaceutski prihvatljiva so" jedinjenja se misli na so koja je farmaceutski prihvatljiva kao što je ovde definisano i koja ima željenu farmakološku aktivnost roditeljskog jedinjenja.

[0272] Farmaceutski prihvatljive soli su poželjno:

(1) adicione soli farmaceutski prihvatljivih kiselina formirane sa farmaceutski prihvatljivim neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična, bromovodonična, fosforna, sumporna i slične kiseline; ili formirane sa farmaceutski prihvatljivim organskim kiselinama kao što su sirćetna, trifluorsirćetna, propionska, jantarna, fumarna, jabučna, mravlja, limunska, askorbinska, maleinska, glutaminska, benzojeva, salicilna, toluensulfonska, metanesulfonska, stearinska, mlečna i slične kiseline i (2) adicione soli farmaceutski prihvatljivih baza formirane kad se proton iz kiseline, prisutan u roditeljskom jedinjenju, ili zameni metalnim jonom, npr. jonom alkalnog metala, jonom zemnoalkalnog metala ili aluminijumovim jonom; ili koordiniše sa farmaceutski prihvatljivom organskom bazom kao što je lizin, arginin i slično; ili sa farmaceutski prihvatljivom neorganskom bazom kao što je natrijum hidroksid, potaša, kalcijum hidroksid i slično.

[0273] Ove soli se mogu dobiti iz jedinjenja iz pronalaska koja sadrže baznu ili kiselu funkcionalnu grupu i odgovarajućih kiselina ili baza pomoću konvencionalnih hemijskih metoda.

V - Tretman

[0274] Konačno, pronalazak se odnosi na ADC, kao što je gore opisan, za upotrebu kao lek, naročito u lečenju kancera.

[0275] Dalji predmet predmetnog pronalaska je jedinjenje formule (I), kao što je definisano gore, za upotrebu kao medicinski proizvod, naročito za lečenje kancera.

[0276] Predmetni pronalazak se odnosi i na upotrebu jedinjenja formule (I), kao što je definisano gore, za pravljenje medicinskog proizvoda, naročito namenjenog za lečenje kancera.

[0277] Predmetni opis otkriva i metod za lečenje kancera koji obuhvata davanje osobi kojoj je to potrebno efektivne količine jedinjenja formule (I), kao što je definisano gore.

[0278] Kanceri se poželjno mogu izabrati preko kancera zavisnih od IGF-1R, uključujući tumorske ćelije koje eksprimiraju ili preterano eksprimiraju ceo ili deo proteina IGF-1R na svojoj površini.

[0279] Konkretnije, navedeni kanceri su kancer dojke, kolona, ezofagusni karcinom, hepatoćelijski kancer, gastrični kancer, gliom, kancer pluća, melanom, osteosarkom, kancer jajnika, prostate, rabdomiosarkom, renalni kancer, tiroidni kancer, kancer endometrijuma, švanom, neuroblastom, oralni skvamozni karcinom, mezoteliom, sarkom glatkih mišića i bilo koji fenomen rezistencije na lekove ili kanceri.

[0280] Da bi se izbegla sumnja, pod kancer rezistentan na lekove koji eksprimira IGF-1R, moraju se podrazumevati ne samo rezistentni kanceri koji inicijalno eksprimiraju IGF-1R, nego i kanceri koji inicijalno ne eksprimiraju ili preterano eksprimiraju IGF-1R, ali koji eksprimiraju IGF-1R kad postanu rezistentni na prethodni tretman.

[0281] Još jedan predmet pronalaska je farmaceutski sastav koji sadrži ADC kao što je opisan u specifikaciji.

[0282] Konkretnije, pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži ADC iz pronalaska sa bar ekscipijentom i/ili farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0283] U predmetnom opisu, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "ekscipijent" treba da označava jedinjenje ili kombinaciju jedinjenja koja ulaze u farmaceutski sastav koja ne izazivaju sekundarne reakcije i koja dozvoljavaju, na primer, olakšavanje administracije aktivnih jedinjenja, povećanje njegovog trajanja i/ili efikasnosti u telu, povećanje njegove rastvorljivosti u rastvoru ili poboljšanje njegove očuvanosti. Ovi farmaceutski prihvatljivi nosači i ekscipijenti su dobro poznati i stručnjak će ih prilagoditi kao funkciju prirode i načina administracije izabranog aktivnog jedinjenja.

[0284] Aktivan sastojak se može davati u jediničnim formama administracije, u smesi sa konvencionalnim farmaceutskim nosačima, životinjama ili ljudskim bićima. Pogodne jedinične forme administracije su forme za oralni put i forme za administraciju parenteralnim putem (subkutano, intradermalno, intramuskularno ili intravenozno).

[0285] Kao čvrsti sastavi, za oralnu administraciju, mogu se koristiti tablete, pilule, prahovi (tvrde ili meke želatinske kapsule) ili granule. U ovim sastavima, aktivan sastojak iz pronalaska se meša sa jednim ili više inertnih razblaživača kao što je skrob, celuloza, saharoza, laktoza ili silika, u struji argona. Ovi sastavi mogu da sadrže i druge supstance osim razblaživača, na primer, jedan ili više lubrikanata, kao što je magnezijum stearat ili talk, boju, oblogu (obložene tablete) ili lak.

[0286] Sterilni sastavi za parenteralnu administraciju mogu poželjno biti vodeni ili nevodeni rastvori, suspenzije ili emulzije. Kao rastvarač ili nosač, može se koristiti voda, propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, naročito maslinovo ulje, injektabilni organski estri, npr. etil oleat ili drugi pogodni organski rastvarači. Ovi sastavi mogu da sadrže i adjuvante, naročito sredstva za kvašenje, izotonike, emulzifikatore, sredstva za dispergovanje i stabilizatore. Sterilizacija se može vršiti na nekoliko načina, na primer, sanitetskom filtracijom, ugrađivanjem sredstava za sterilizaciju u sastav, zračenjem ili grejanjem. Oni se mogu pravitiu vidu čvrstih sterilnih sastava koji se u vreme upotrebe mogu rastvoriti u sterilnoj vodi ili bilo kom drugom injektabilnom sterilnom medijumu.

[0287] Poželjno je da se ovi ADC administriraju sistemskim putem, naročito intravenskim putem, intramuskularnim, intradermalnim, intraperitonealnim ili subkutanim putem, ili oralnim putem. Na jedan poželjniji način, sastav koji sadrži ADC prema pronalasku će biti administriran nekoliko puta, sekvencijalno.

[0288] Pronalazak se odnosi i na komplet koji sadrži bar i) konjugat antitelo-lek prema pronalasku i/ili farmaceutski sastav prema pronalasku i ii) špric ili fiolu ili ampulu u koju je navedeni konjugat antitelo-lek i/ili farmaceutski sastav smešten.

[0289] Njihovi načini administracije, doze i optimalni farmaceutski oblici se mogu odrediti prema kriterijumima koji se uopšteno uzimaju u obzir prilikom utvrđivanja tretmana prilagođenim pacijentu kao što su, na primer, starost ili telesna težina pacijenta, ozbiljnost njegovog opšteg stanja, tolerancija tretmana i primećeni sekundarni efekti.

[0290] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska se javljaju u nastavku opisa sa primerima i slikama čije legende su predstavljene niže.

LEGENDE SLIKA

[0291]

Slike 1A-1C: Vezivanje antitela za humani nativni IGF-1R pomoću FACS analiza. Slika 1A predstavlja titracionu krivu, na MCF-7 ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. Slika 1B predstavlja EC50i mišjeg i himernog anti-IGF-1R antitela na MCF-7 ćelijskoj liniji. Slika 1C predstavlja Bmaxhimernog anti-IGF-1R antitela na MCF-7 ćelijskoj liniji.

Slike 2A-2B: Procena prepoznavanja hIGF-1R primenom transfektovanih u odnosu na netransfektovane ćelije. Slika 2A) predstavlja titracione krive jednog himernog anti-IGF-1R Ab na IGF-1R<+>ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. Slika 2B predstavlja vezivanje himernih anti-IGF-1R Ab na ćelijskoj liniji humanog IGF-1R.

Slike 3A-3B: Procena specifičnosti Ab na IGF-1R u odnosu na hIR pomoću transfektovanih ćelija. Slika 3A predstavlja vezivanje mišjeg anti-IGF-1R Ab na hIR<+>transfektovanoj ćelijskoj liniji. Slika 3B predstavlja vezivanje himernog anti-IGF-1R Ab na IR+ ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. GRO5 anti-hIR Mab (Calbiochem) je uveden kao pozitivna kontrola.

Slika 4: Vezivanje mišjeg anti-IGF-1R Ab na IM-9 ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. GRO5 anti-hIR Mab je uveden kao pozitivna kontrola.

Slike 5A-5C: Procena prepoznavanja majmunskog IGF-1R. Slika 5A predstavlja titracione krive himernog anti-IGF-1R Ab na COS-7 ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. Slika 5B predstavlja EC50i mišjeg i himernog anti-IGF-1R antitela na COS-7 ćelijskoj liniji. Slika 5C predstavlja EC50himernog anti-IGF-1R antitela i na NIH 3T3 transfektovanim ćelijama hIGF-1R+ i COS-7 ćelijskoj liniji.

Slika 6: Senzogrami dobijeni na osnovu SPR tehnologije pomoću Biacore X100 korišćenjem CM5 senzorskog čipa aktiviranog sa više 11000 RU mišjeg anti-Tag His antitela, hemijski nakalemljenog na karboksimetil dekstransku matricu. Eksperiment se odvijao sa brzinom protoka od 30 µl/min na 25°C uz HBS-EP+ kao elucionim puferom i puferom za razblaživanje uzoraka. Slika pokazuje superpoziciju 4 nezavisna senzograma poređana na x-osi na početku prve injekcije analita i na y-osi uz osnovnu liniju definisanu pred ovu prvu injekciju. Senzogrami dobijeni hvatanjem sekvence zasnovane na čoveku rekombinantnog rastvorljivog IGF1R su označeni romboidima. Senzogrami dobijeni hvatanjem sekvence zasnovane na Cynomolgusu sekvence rekombinantnog rastvorljivog IGF-1R su označeni trouglovima. Beli simboli odgovaraju praznim kružićima (5 injekcija elucionog pufera), a crni simboli odgovaraju injekcijama rastućih koncentracija c208F2 (5, 10, 20, 40 i 80 nM).

Slika 7: Procena intrinsičnog efekta anti-hIGF-1R antitela na fosforilaciju receptora u poređenju sa IGF1.

Slika 8: Inhibicija fosforilacije IGF-1R kao odgovor na IGF-1 od strane mišjeg antihIGF-1R.

Slika 9: Intenzitet signala anti-IGF-1R antitela sa površine ćelije je regulisan naniže posle inkubacije ćelija na 37°C. MCF-7 ćelije su inkubirane 4 h na 4°C ili 37°C sa 10 µg/ml Ab. Slika predstavlja ∆MFI.

Slike 10A-10B: Raspad antitela na površini. Antitelo vezano za površinu ćelije je procenjeno posle 10, 20, 30, 60 i 120 min na 37°C. Slika 10A predstavlja % preostalog IGF-1R u poređenju sa intenzitetom signala merenim na 4°C. Slika 10B predstavlja izračunavanje poluživota primenom softvera Prims Software i fitovanjem na eksponencijalni raspad.

Slika 11: Anti-hIGF-1R Ab su internalizovani. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml mišjih Ab 0, 30 ili 60 min na 37°C. Ćelije su permeabilizovane ili ne i inkubirane sa sekundarnim anti-mišjim IgG-Alexa 488. Membrana odgovara intenzitetu signala bez permeabilizacije. "Ukupan" odgovara intenzitetu signala posle permeabilizacije ćelija, a "citoplazmatski" odgovara internalizovanim Ab. Naziv svakog procenjenog antitela je označen na vrhu svakog grafika.

Slike 12A-12B: Snimci internalizacije Ab. Slika 12A: MCF-7 ćelije inkubirane 20 min sa m208F2 na 4°C i oprane pre inkubacije (W) na 37°C 15 (X), 30 (Y) i 60 (Z) min. Ćelije su fiksirane i permeabilizovane. m208F2 Ab je otkriven pomoću anti-mišjeg IgG Alexa488 i Lamp-1 pomoću zečjeg anti-Lamp-1 antitela i sa sekundarnim antizečjim IgG Alexa 555. Slika 12B: MCF-7 ćelije su inkubirane 30 minuta na 37°C sa anti-hIGF-1R mišjim antitelima i obojene kao što je gore opisano. Kolokalizacija je identifikovana pomoću priključka za obeležavanje kolokalizacije softvera ImageJ. Slika 13: Uključenost lizozomskog puta u raspad antitela.

Slika 14: Kiseli pH smanjuje kapacitet vezivanja pet mišjih anti-IGF-1R antitela.

Slike 15A-15D: Vezivanje karakteristično za prvu humanizovanu formu c208F2 Mab. Osobine vezivanja hz208F2 VH3/VL3 mAb su procenjene na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 (A), na majmunskoj ćelijskoj liniji COS-7 (B) i na transfektovanoj mišjoj ćelijskoj liniji koja eksprimira humani insulinski receptor (C). Vezivanje mišjih i himernih 208F2 mAb je procenjeno paralelno. Klon GRO5 anti-hIR antitela je korišćen za potvrđivanje ekspresije hIR na transfektovanoj ćelijskoj liniji (D).

Slika 16: Raspad antitela hz208F2 VH3/VL3 na površini.

1

Slika 17: Superpozicija senzograma dobijena uređajem Biacore X100 na bazi SPR na temperaturi od 25°C sa CM5 senzorskim čipom aktiviranim na obe protočne ćelije sa oko 12000 RU mišjeg anti-TagHis monoklonskog antitela hemijski nakalemljenog na karboksimetil dekstransku matricu uz upotrebu HBS-EP+ kao elucionog pufera pri brzini protoka od 30 µl/min. Svaki senzogram (prvi je označen trouglovima, a drugi je označen romboidima) odgovara kompletnom ciklusu:

1- injekcija tokom jednog minuta rastvora rekombinantnog h-IGF-1R (10 µg/ml) u drugoj protočnoj ćeliji.

2- za prvi senzogram: 5 injekcija elucionog pufera, svaka tokom 90 s za drugi senzogram: pet injekcija pri rastućim koncentracijama rastvora anti-IGF-1R c208F2 antitela, svaka tokom 90 s

3- kašnjenje od 300 s za određivanje kinetičkih brzina disocijacije

4- regeneracija površine injekcijom od 10 mM glicina, HCl pufera pH 1,5 tokom 45 s

Slika 18: senzogram koji odgovara oduzimanju praznog senzograma (5 injekcija HBS-EP+) od senzograma dobijenog pri rastućim koncentracijama rastvora anti-IGF-1R c208F2 je predstavljen sivim. Teorijski senzogram koji odgovara 1:1 modelu sa sledećim parametrima: kon = (1,206 ± 0,036) x 10<6>M<-1>.s<-1>, koff= (7,81 ± 0,18) x 10-5 s<-1>, Rmax = 307,6 ± 0,3 RU je predstavljen tankom crnom linijom. Izračunate koncentracije c208F2 su date na grafiku: samo najviša koncentracija (24 nM) se računa kao konstantna).

Slika 19: Konstante disocijacije odgovaraju srednjim vrednostima iz četiri eksperimenta rađenim za svako antitelo i odgovaraju odnosu: koff/konx 10<12>, koji treba izraziti u pM jedinicama. Stubići greške odgovaraju standardnim greškama (n=4). Slika 20: Poluživoti odgovaraju srednjim vrednostima iz četiri eksperimenta rađenim za svako antitelo i odgovaraju odnosu: Ln(2)/koff/3600 koji treba izraziti u h jedinicama. Stubići greške odgovaraju standardnim greškama (n=4).

Slika 21: Ćelijska citotoksičnost anti-IGF-1R kuplovanih sa tri različita jedinjenja. Pet himernih antitela na IGF-1R je kuplovano sa E-13, G-13 ili F-63. Irelevantno antitelo c9G4 je takođe kuplovano sa istim jedinjenjima.

Slike 22A-22C: in vivo procena c208F2-E-13 (Slika 22A), c208F2-G-13 (Slika 22B) i c208F2-F-63 (Slika 22C) u modelu ksenografta MCF-7.

Slike 23A-23B: in vivo procena i c208F2-E-13 (Slika 23A) i c208F2-G-13 (Slika 23B) u poređenju sa ADC kontrolom (c9G4-E13 i c9G4-G-13) u modelu ksenografta MCF-7.

Slike 24A i B: Kiseli pH smanjuje kapacitet vezivanja humanizovanog IGF-1R antitela hz208F2 H076/L024 (A) i hz208F2 (H077/L018 (B).Slika 25: Procena citotoksičnosti c208F2-G-13 na normalne ćelije.

Slika 26: Ćelijska citotoksičnost humanizovane varijante hz208F2 kuplovane sa G-13. Irelevantno antitelo c9G4 je takođe kuplovano sa istim jedinjenjem.

Slika 27: in vivo procena humanizovanih formi 208F2-G-13 u odnosu na c208F2-G-13 u modelu ksenografta MCF-7.

Slike 28A i 28B: in vivo procena ili c208F2-G-13 (28A) ili hz208F2-4-G-13 (28B) injektiranih 4 puta u poređenju sa jednom injekcijom u modelu ksenografta MCF-7.

2

Slike 29A i 29B: in vivo procena c208F2-E-13 (29A) i c208F2-G-13 (29B) u modelu ksenografta CaOV-3.

PRIMERI

Primer 1: Generisanje mišjih antitela podignutih na ECD IGF-1R

[0292] Da bi se generisala mišja monoklonska antitela (Mab) na humani vanćelijski domen (ECD) humanog IGF-1 receptora (hIGF-1R), 5 BALB/c miševi su imunizovani 3 puta s.c. pomoću 10 µg rhIGF-1R proteina (R&D Systems, Cat N°391-GR). Kao alternativa, tri dodatne imunizacije pomoću 10 µg mišjeg vanćelijskog domena (ECD) IGF-1R (R&D Systems, Cat N° 6630-GR /Fc) su urađene na nekim životinjama. Prva imunizacija je urađena u prisustvu kompletnog Freund-ovog adjuvanta (Sigma, St Louis, MD, USA). Nekompletan Freund-ovog adjuvant (Sigma) je dodat za sledeću imunizaciju. Tri dana pre fuzije, imunizovanim miševima su busterovani pomoću 10 µg rhIGF-1R proteina. Zatim su splenociti i limfociti pripremljeni perfuzijom slezine i sitnjenjem susednih limfnih čvorova, respektivno, sakupljeni iz 1 od 5 imunizovanih miševa (izabranog posle titracije seruma svih miševa) i fuzionisani sa SP2/0-Ag14 ćelijama mijeloma (ATCC, Rockville, MD, USA). Protokol fuzije su opisali Kohler i Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Fuzionisane ćelije su zatim podvrgnute HAT selekciji. U opštem slučaju, za pravljenje monoklonskih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, pogotovo mišjeg porekla, moguće je koristiti tehnike koje su opisane naročito u priručniku "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988). Približno 10 dana posle fuzije, pretražene su kolonije hibridnih ćelija. Za primarni pregled, 5 BALB/c miševi su imunizovani 3 puta s.c. pomoću 10 µg proteina rhIGF-1R bubrega zelenog majmuna transformisanog sa SV40 koji eksprimiraju majmunski IGF-1R na površini ćelija. Preciznije, za odabir pomoću protočne citometrije, 10<5>ćelija (bilo MCF7, bilo COS7) je zasejano u svako udubljenje ploča sa 96 udubljenja u PBS koji sadrži 1% BSA i 0,01% natrijum azid (FACS pufer) na 4°C. Posle 2 min centrifugiranja na 2000 rpm, pufer je uklonjen i dodati su supernatanti hibridoma za testiranje. Posle 20 min inkubacije na 4°C, ćelije su oprane dvaput i dodat je Alexa 488-konjugovano kozje anti-mišje antitelo 1/500° razblaženo u FACS puferu (#A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) i inkubirane 20 min na 4°C. Posle konačnog pranja FACS puferom, ćelije su analizirane pomoću FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) posle dodavanja propidijum jodida u svaku epruvetu u konačnoj koncentraciji od 40 µg/ml. Udubljenja koja sadrže same ćelije i ćelije inkubirane sa sekundarnim Alexa 488-konjugovanim antitelom su uključujena kao negativne kontrole. Izotipske kontrole su korišćene u svakom eksperimentu (Sigma, ref M90351MG). Bar 5000 ćelija je procenjeno da bi se izračunala srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI).

[0293] Dodatno je urađen test internalizacije da bi se izabrala samo internalizujuća antitela. Za ovaj test, MCF7 tumorska ćelijska linija je gajena u RMPI 1640 bez fenolnog crvenog sa 1% L-glutaminom i 10% FACS 3 dana pre eksperimenta. Ćelije su zatim odlepljene pomoću tripsina i 100 µl ćelijske suspenzije sa 4·10<5>ćelija/ml je stavljeno na ploče sa 96 višestrukih udubljenja u RPMI1640 bez sa 1% L-glutamin i 5% FBS. Posle 2 min centrifugiranja na 2000 rpm, ćelije su ponovo supendovane u 50 µl ili supernatanta hibridoma ili rastvora kontrolnog antitela (pozitivna i izotipska kontrola pri 1 µg/ml). Posle 20 min inkubacije na 4°C, ćelije su centrifugirane 2 min na 2000 rpm i ponovo supendovane bilo u hladnom (4°C), bilo u toplom (37°C) kompletnom medijumu za kulture. Ćelije su zatim inkubirane 2 sata ili na 37°C, ili na 4°C. Zatim su ćelije oprane tri puta FACS puferom. Alexa 488-obeleženo kozje anti-mišje IgG antitelo je inkubirano 20 minuta i ćelije su oprane tri puta pre FACS analize bez propidijum jodida ćelijskoj populaciji.

[0294] Posle FACS analize, dva parametra su određena: (i) razlika fluorescentnog signala detektovanog na površini ćelija inkubiranih na 4°C sa onima dobijenim sa ćelija inkubiranih na 37°C sa jednim supernatantom hibridoma i (ii) procenat preostalog IGF-1R na površini ćelija. preostalog hIGF 1R je izračunat na sledeći način: % preostalog IGF-1R = (MFIAb 37 C/MFIAb 4 C) x 100.

[0295] Procenat preostalog hIGF 1R je izračunat na sledeći način: % preostalog IGF-1R = (MFIAb 37 C/MFIAb 4 C) x 100.

[0296] Dodatno su urađene tri ELISA-e (ili pre ili posle kloniranja) da bi se ispitalo vezivanje antitela na rekombinantni humani (hIGF-1R) i mišji (mIGF-1R) protein i na rekombinantni humani insulinski receptorski (hIR) protein. Hibridomi koji sekretuju antitelo koje pokazuje vezivanje na rh- i/ili rm-IGF-1R i nema vezivanje na rhIR su zadržani. Ukratko, ELISA ploče sa 96 udubljenja (Costar 3690, Corning, NY, USA) su obložene sa po 100 µl/udubljenje ili rhIGF-1R proteina (R&D Systems, kat. br. 391-GR) pri 0,6 µg/ml ili rmIGF-1R proteina (R&D Systems, cat N°6630-GR/Fc) pri 1 µg/ml ili rhIR proteina (R&D Systems, kat. br.

1544-IR/CF) pri 1 µg/ml u PBS preko noći na 4°C. ploče su blokirane pomoću PBS koji sadrži 0,5% želatin (#22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) 2 h na 37°C. Kad je saturacioni pufer odbačen pomoću uređaja na ploči, 100 µl svakog razblaženja supernatanta je dodato u svako udubljenje (ili nerazblažen supernatant hibridoma ili serijska razblaženja supernatanta) i inkubiran 1 h na 37°C. Posle tri pranja, 100 µl poliklonski kozji anti-mišji IgG (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) konjugovan sa peroksidazom rena je dodat u 1/5000 razblaženju u PBS koji sadrži 0,1% želatin i 0,05 tež.% Tween 201 h na 37°C. ELISA ploče su oprane 3 puta i dodat je TMB (#UP664782, Uptima, Interchim, France) supstrat. Posle 10 min inkubacije na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena 1 M sumpornom kiselinom i merena je optička gustina na 450 nm.

[0297] Hibridomi koji sekretuju antitelo od interesa su umnoženi i klonirani iz graničnog razblaženja. Kad su izotipirani, jedan klon od svakog koda je umnožen i zamrznut. Svako antitelo od interesa je napravljeno u sistemima za in vitro proizvodnja pod nazivom CellLine (Integra Biosciences) za dalju karakterizaciju.

[0298] Dodatni testovi za ispitivanje specifičnosti vezivanja FACS analizama su urađeni na IM9 ćelijama (humani B limfoblasti koji eksprimiraju IR), kao i na ćelijama transfektovanim pomoću hIGF-1R prema netransfektovanim ćelijama.

[0299] Svi podaci koji odgovaraju izabranim antitelima su sumirani u Tabeli 7 i demonstrirali su da pet izabranih antitela dobro prepoznaju nativni humani IGF-1R eksprimiran ili na MCF-7 ćelijama kancera dojke ili na transfektovanim ćelijama Ona prepoznaju i majmunski IGF-1R na COS-7 ćelijama. Ova antitela ne reaguju unakrsno sa humanim insulinskim receptorom, visoko eksprimiranim na IM9 ćelijama. Treba primetiti da ova antitela slabo prepoznaju ECD rhIGF-1R protein kad se direktno oblože ELISA ploče.

4

Primer 2: Vezivanje antitela za humani nativni IGF-1R pomoću FACS analize

[0300] Pet mišjih IGF-1R antitela je himerizovano. Osobine vezivanja i mišjeg i himernog antitela na IGF-1R su procenjene FACS analizama na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 adenokarcinoma dojke (ATCC#HTB-22) korišćenjem rastućih koncentracija antitela. U tu svrhu, ćelije (1x10<6>ćelije/ml) su inkubirane sa IGF-1R antitelima 20 min. na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). One su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 još 20 minuta na 4°C u mraku, pre nego što su oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). Maksimum intenziteta signala dobijen sa svakim antitelom je označen sa Bmaxi izražen kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0301] Titraciona kriva za svako mišje ili himerno Ab je demonstrirala da su sva generisana antitela sposobna da prepoznaju nativnu formu IGF-1R sa tipičnim saturacionim profilom (Slika 1A). Da bi se antitela rangirala i da bi se uporedile osobine vezivanja mišjih i himernim Ab, EC50vezivanje svakog jedinjenja je određeno primenom nelinearne regresione analize. Poređenje EC50svakog mišjeg Ab sa njegovom odgovarajućom himernom formom je pokazalo da 2 forme ispoljavaju iste osobine vezivanja, što demonstrira da himerizacija Ab nije uticala na prepoznavanje IGF-1R (Slike 1B-C). Vrednosti EC50i Bmaxhimernog antitela su sumirane u Tabeli 8.

T l

Primer 3: Potvrđivanje specifičnosti antitela korišćenjem ili IGF-1R ili IR transfektovanih ćelija ili IM9 ćelija koje eksprimiraju značajne nivoe IR

[0302] Da bi se potvrdila specifičnost generisanih antitela za IGF-1R prema IR, stabilni transfektanti koji eksprimiraju ili hIGF-1R ili hIR su procenjeni FACS analizama. Ukratko, rastuće koncentracije himernih mAb su inkubirane sa ćelijama 20 min na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1%BSA, 0,01% NaN3). Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 pre inkubiranja još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0303] Titracione krive dobijene na ćelijskoj liniji transfektovanoj hIGF-1R-om (Slika 2A) prema netransfektovanim ćelijama (Slika 2B) su potvrdile specifičnost vezivanja himernih Ab za humani IGF-1R. Vrednosti EC50i Bmaxsu sumirane u Tabeli 9.

T l

[0304] Da bi se proverilo odsustvo vezivanja i mišjeg i himernog antitela za hIR, korišćena je stabilna ćelijska linija koja eksprimira humani IR (hIR). Prepoznavanje hIR sa površine humanih ćelija od strane i mišjeg i himernog Ab je izvedeno FACS analizama. Rastuće koncentracije bilo mišjih bilo himernih mAb su inkubirane na ćelijskoj liniji transfektovanoj hIR<+>-om 20 minuta na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 pre inkubiranja još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0). Klon GRO5 anti-hIR antitela je korišćen kao pozitivna kontrola. Mišje i himerno 9G4 antitelo su uvedena kao irelevantna antitela.

[0305] Visok nivo ekspresije hIR na ćelijskoj površini transfektovanih ćelija je potvrđen korišćenjem komercijalnog anti-hIR antitela GRO5 (Slike 3A i 3B). Čak i kad se koriste visoke koncentracije bilo mišjih (Slika 3A) bilo himernih (Slika 3B) hIGF-1R Ab, ne vidi se vezivanje na ćelijskoj površini hIR<+>transfektovanih ćelija. Ovi rezultati su demonstrirali da ni mišja ni himerna anti-hIGF-1R Ab ne prepoznaju hIR.

[0306] Ova specifičnost prepoznavanja hIGF-1R u odnosu na IR je takođe demonstrirana, FACS analizom, upotrebom IM9 ćelija, B-limfomske ćelijske linije koja eksprimira hIR (Slika 4). Za ovu FACS analizu, protokol je bio isti kao onaj opisan gore i mišja antitela su korišćena da bi se sprečila unakrsna reaktivnost sekundarnog anti-humanog Ab (IM9 ćelije eksprimiraju humani Ig na svojoj površini). Rezultati koji su predstavljeni na Slici 4 demonstrirali su još jednom da je očekivani signal viđen uz korišćenje GRO5 anti-hIR antitela, dok nijedno od procenjenih mišjih antitela nije ispoljilo nikakav značajan signal vezivanja na ovoj ćelijskoj liniji.

Primer 4: Vezivanje antitela za majmunski nativan IGF-1R FACS i Biacore analizama

[0307] Jedan od prvih preduslova za ispitivanja u regulatornoj toksikologiji je da se nađe relevantna životinjska vrsta da bi se procenilo izabrano jedinjenje. Pošto niz antitela opisanih ovde nije u stanju da prepozna mišji IGF-1R, najpogodnija vrsta za toksikološku procenu je ne-humani primat (NHP).

[0308] Da bi se procenilo vezivanje anti-IGF-1R antitela za majmunski IGF-1R, vezivanje i mišjih i himernih anti-hIGF-1R antitela je prvo procenjeno FACS analizom na COS-7 ćelijskoj liniji primenom rastućih koncentracija antitela. Ćelije (1x10<6>ćelije/ml) su inkubirane sa anti-IGF-1R antitelima 20 minuta na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Zatim su ćelije oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 pre inkubacije još 20 minuta na 4°C u mraku i konačno oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0309] Titracione krive dobijene na COS-7 majmunskoj ćelijskoj liniji su pokazale da su sva anti-hIGF-1R Ab specifično prepoznala IGF-1R eksprimiran na površini majmunske ćelijske linije (Slika 5A). Određivanje EC50za svako mišje i himerno Ab je pokazalo da su 2 oblika uporediva po svojim osobinama vezivanja za majmunski IGF-1R (Slika 5B). Ti rezultati su pokazali da su sva generisana anti-hIGF-1R Ab prepoznala majmunski IGF-1R.

[0310] Poređenje EC50vezivanja na COS-7 ćelijama u odnosu na ćelije transfektovane IGF-1R-om je urađeno da bi se potvrdila veličina prepoznavanja humanog u odnosu na majmunski IGF-1R od strane himernog antitela. Rezultati prikazani na Slici 5C su demonstrirali slično prepoznavanje humanog i majmunskog IGF-IR od strane svih antitela.

[0311] Da bi se potvrdilo prepoznavanje na drugom tipu majmuna, ćelije su transfektovane pomoću IGF-1R iz majmuna Cynomolgusa da bi se proizveo rastvorljiv majmunski ECD IGF-1R i Biacore eksperimenti su izvedeni sa jednim od himernih antitela (c208F2) da bi se uporedile njegove osobine vezivanja bilo sa hIGF-1R bilo sa Cynomolgusovim IGF-1R.

[0312] Eksperimenti prepoznavanja su vođeni na uređaju Biacore X100 uz upotrebu CM5 senzorskog čipa aktiviranog anti-Tag His antitelom (komplet za hvatanje His GE Healthcare kataloški broj 28-9950-56). Više od 11000 RU antitela je hemijski nakalemljeno na karboksimetil dekstransku matricu primenom kompleta za hemiju amina. Eksperimenti su vršeni na 25°C sa brzinom protoka od 30 µl/min korišćenjem HBS-EP pufera (GE Healthcare) kao elucioni i pufer za razblaživanje uzoraka. Kinetička šema jednog ciklusa je primenjena za definisanje kinetičkih parametara vezivanja himerne forme 208F2 antitela (c208F2) za hIGF-1R u poređenju sa IGF-1R makakija.

[0313] Rastvor rastvorljive rekombinantne verzije hetero-tetramera IGF-1R sastavljenih od 2α lanca i vanćelijskih domena 2β lanaca eksprimirane sa dodatnom C-terminalnom 10-His markerom, na osnovu ili sekvence humanog (R&D Systems kataloški broj 305-GR-50) ili onog Cynomolgusa (u domaćoj proizvodnji) je ubrizgavan 1 minut u drugu protočnu ćeliju u razblaženju definisanom da uhvati oko 160 RU antigena. Posle faze hvatanja, ubrizgavan je ili elucioni pufer 5 puta (90 s svaka injekcija) ili 5 rastućih koncentracija c208F2 (90s svaka injekcija) u obe protočne ćelije. Na kraju pete injekcije, elucioni pufer je propušten da bi se definisala brzina disocijacije.

[0314] Površina je zatim regenerisana injekcijom 10 mM glicina, HCl pH 1,5 pufera tokom 30 s.

[0315] Izračunati signal odgovara razlici između odgovora protočne ćelije 2 (sa uhvaćenim IGF-1R) i odgovora protočne ćelije 1 (bez ikakvih IGF-1R molekula) (Slika 6).

[0316] Za svaki IGF-1R molekul (human iili Cynomolgusa), signal zbog injekcije rastućih of koncentracija c208F2 je korigovan oduzimanjem signala dobijenog sa 5 injekcija pufera (dupla referenca). Dobijeni senzogrami su were analizirani pomoću softvera Biaevaluation sa modelom 1:1. Kinetičke brzine su određene ili nezavisno (2 kinetičke brzine vezivanja c208F2 za svaki IGF-1R) ili zajedno (iste kinetičke brzine vezivanja c208F2 za humani i Cynomolgusov IGF-1R). Kvalitet fitovanja je procenjen odnosom Chi2/Rmax nižim od 0,05 RU.

[0317] Kinetičke brzine vezivanja (videti Tabelu 10) definisane odvojeno za svaki IGF-1R su blizu jedna drugoj i fitovanje oba senzograma sa istim kinetičkim brzinama je dobrog kvaliteta.

[0318] c208F2 antitelo prepoznaje isto tako dobro rekombinantni humani i kao i Cynomolgus ov IGF-1R sa konstantom disocijacije (KD) od oko 0,2 nM. Afiniteti definisani u ovoj studiji odgovaraju funkcionalnim afinitetima (aviditetima) antitela za nivo uhvaćenog humanog i Cynomolgusovog IGF-1R od oko 160 RU.

T l 1

Primer 5: Intrinsični efekti generisanig antitela na fosforilaciju IGF-1R

[0319] Dobro je poznato da antitela mogu da indukuju agonistički efekat kad se vežu za receptore tirozin kinaze. Pošto ne bismo želeli da izaberemo takva agonistička antitela, određivanje fosforilacije hIGF-1R je ispitano uz korišćenje himernih antitela.

[0320] U tu svrhu, MCF-7 ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma preko noći. Zatim je dodavan ili IGF-1 (100 nM) ili antitela koja se testiraju (10 µg/ml) 10 minuta na 37°C. Medijum je odbačen i ćelije su sastrugane u puferu za lizu (pH 7,5) koji sadrži 10 mM Tris HCl pufer (pH 7,5), 15% NaCl (1 M), 10% mešavinu deterdženta (10 mM Tris-HCl, 10% Igepal pufer za lizu) (Sigma Chemical Co.), 5% natrijum dezoksiholat (Sigma Chemical Co.), 1 TM tabletu (Roche) kompletnog koktela inhibitora proteaze, koktel 1% inhibitora fosfataze Set II (Calbiochem), 90 min na 4°C. Lizati su izbistreni centrifugiranjem na 4°C, zagrevani 5 min na 100°C i čuvani na -20°C ili direktno stavljani na 4-12% SDS-PAGE gelove. Inkubacija primarnog antitela je vršena 2 hr na sobnoj temperaturi, a zatim inkubacija sa sekundarnim antitelom sa vezanim HRP je rađena 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su oprane u TBST pre vizuelizacije proteina sa ECL. Blotovi su kvantifikovani pomoću softvera J software. Fosfo-proteinske vrednosti su normalizovane sa GAPDH. Fosforilacija hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 je smatrana 100 %-nom stimulacijom. Efekat anti-hIGF-1R Ab na fosforilaciju hIGF-1R je određen kao % fosforilacije indukovane pomoću IGF-1.

[0321] Rezultati opisani na Slici 7 predstavljaju srednju vrednost % pIGF-1R kao odgovor na himerna anti-IGF-1R Ab iz 3 nezavisna eksperimenta /- S.D. u poređenju sa IGF-1. Kao što je ilustrovano, nije detektovana značajna ni manja (<10%) fosforilacija hIGF-1R kad su MCF-7 ćelije inkubirane sa 10 µg anti-IGF-1R Ab.

Primer 6: Inhibicija fosforilacije IGF-1R kao odgovor na IGF-1 mišjeg antitela na IGF-1R

[0322] Da bi se okarakterisala izabrana antitela, proučavana je njihova sposobnost da inhibiraju fosforilaciju indukovanu IGF1-om. U tu svrhu, MCF-7 ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma preko noći. Zatim su ćelije inkubirane 5 minuta sa mišjim anti-hIGF-1R Ab pre dodavanja IGF-12 minuta na 37°C. Medijum je odbačen i ćelije su sastrugane u puferu za lizu (pH 7,5), koji sadrži 10 mM Tris HCl pufer (pH 7,5), 15% NaCl (1 M), 10% mešavinu deterdženta (10 mM Tris-HCl, 10% Igepal pufer za lizu) (Sigma Chemical Co.), 5% natrijum dezoksiholat (Sigma Chemical Co.), 1 TM tabletu (Roche) kompletnog koktela inhibitora proteaze, koktel 1% inhibitora fosfataze Set II (Calbiochem), 90 min na 4°C. Lizati su izbistreni centrifugiranjem na 4°C, zagrevani 5 min na 100°C i čuvani na -20°C ili direktno stavljani na 4-12% SDS-PAGE gelove. Inkubacija primarnog antitela je vršena 2 hr na sobnoj temperaturi, a zatim inkubacija sa sekundarnim antitelom sa vezanim HRP je rađena 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su oprane u TBST pre vizuelizacije proteina sa ECL. Blotovi su kvantifikovani pomoću softvera J software. Fosfo-proteinske vrednosti su normalizovane sa GAPDH. Fosforilacija hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 je smatrana 100 %-nom stimulacijom. Efekat anti-hIGF-1R Ab na fosforilaciju hIGF-1R je određen kao % fosforilacije indukovane pomoću IGF-1.

[0323] Sva anti-IGF-1R Ab su jako inhibirala fosforilaciju hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 (smanjenje > 80%) (Slika 8). Najbolji inhibitori fosforilacije hIGF-1R indukovane IGF1-om su m208F2, m212A11 i m214F8 Mab.

Primer 7: Studija internalizacije IGF-1R posle vezivanja generisanih antitela na IGF-1R FACS analizom

[0324] MCF-7 ćelije su inkubirane sa himernim antitelom od 10µg/ml na 4°C 20 min. Zatim su ćelije oprane i inkubirane na 4°C ili 37°C 4 h. Količina antitela vezanih za površinu ćelija je određena pomoću sekundarnog antitela. ∆MFI, definisan kao razlika između MFI merenog na 4°C i MFI merenog na 37°C posle 4 sata inkubacije, odgovara količini internalizovanih Ab. ∆MFI je predstavljen na Slici 9 i Tabeli 11. Procenat internalizacije pri 10 µg/ml Ab je izračunat na sledeći način: 100*(MFI na 4°C - MFI na 37°C)/MFI na 4°C i predstavljen u Tabeli 11.

T l 11

[0325] Da bi se odredilo da li su antitela koja prepoznaju i majmunski IGF-1R sposbna da internalizuju ovaj receptor, izveden je isti eksperiment sa internalizacijom. Rezultati sumirani u Tabeli 12 su demonstrirali da su sva testirana antitela bila u stanju da posreduju u internalizaciji majmunskog IGF-1R.

T l 12

[0326] Smanjenje kinetike antitela vezanog za površinu ćelije je dalje procenjivano. U tu svrhu, MCF-7 ćelije su zasejane na ploče sa 96 udubljenja i inkubirane sa 10 µg/ml mišjeg 20 min na 4°C. Ćelije su zatim oprane da bi se uklonilo nevezano antitelo i u medijumu na 37°C 10, 20, 30, 60 ili 120 min. U svakoj vremenskoj tačci, ćelije su centrifugirane, a zatim im je površina obeležena na ledu sa sekundarnim anti-mišjim IgG-Alexa488 da bi se odredila količina antitela koja je ostala na ćelijskoj površini. Intenzitet fluorescencije za svaki mišji Ab i za svaku vremensku tačku je normalizovan signalom na 4°C (% preostalog IGF-1R) i fitovan na exponencijalni raspad da bi se odredio poluživot (t1/2). t1/2 je smatran kao vreme potrebno da se dobije smanjenje signala od 50%. Kao što je ilustrovano na Slici 10, nivo na površini svih mišjih Ab je naglo padao tokom prvih 30 min i smanjenje je skoro maksimalno posle 60 min inkubacije (Slika 10A). Izračunati poluživot se nalazio između 10 i 18 min prema mišjem Ab (Sl.10B).

[0327] Da bi se validiralo da je smanjenje signala sa ćelijske površine usled internalizacije Ab, a ne usled rasipanja receptora, ćelije su inkubirane sa mišjim Ab 0, 30 i 60 min na 37°C (Slika 11). Ćelije su zatim pričvršćene i permeabilizovane ili ne da bi se odredilo antitelo vezano za površinu ćelija (bez permeabilizacije) i ukupan signal antitela koji odgovara Ab vezanom za površinu ćelija internalizovano Ab (sa permeabilizacijom). Količina internalizovanog Ab (citoplazmatskog) je određena na sledeći način: MFI posle permeabilizacije - MFI bez permeabilizacije. Ovaj eksperiment je pokazao da je smanjenje Ab vezanog za površinu ćelija zbog povećanja citoplazmatskih Ab, što demonstrira da su Ab internalizovana (Slika 11). Pored toga, degradacija Ab je počela posle 1 sat od inkubacije, kao što je indikovano smanjenjem signala posle permeabilizacije (ukupno).

Primer 8: Studija internalizacije IGF-1R posle vezivanja generisanih anti-IGF-1R antitela konfokalnom analizom

[0328] Da bi se dalje potvrdila internalizacija antitela, urađena je konfokalna mikroskopija da bi se procenila unutarćelijska distribucija antitela posle kretanja u ćeliji. Ćelije su inkubirane sa anti-hIGF-1R Ab na 37°C, fiksirane i permeabilizovane. Prema tome, ćelije su bojene korišćenjem sekundarnog antitela Alexa-488 i sa zečjim anti-lamp-1 antitelom koje je otkriveno korišćenjem sekundarnog anti-zečjeg IgG Alexa 555. Pre inkubacije na 37°C, mišji 208F2 Ab je lokalizovan na membrani MCF-7 ćelija (Slika 12A). Nije primećena nikakva kolokalizacija sa lizozomskim markerom, lamp-1 korišćenjem priključka za obeležavanje kolokalizacije softvera Image J. Antitelo vezano za površinu ćelije se dramatično smanjilo posle 15 min inkubacije na 37°C. Istovremeno sa smanjenjem antitela vezanog za površinu ćelije, unutarćelijsko antitelo je detektovano u vezikulama. Retko se mogla videti kolokalizacija sa lamp-1. Posle 30 min inkubacije, antitelo vezano za površinu ćelije je jedva detektovano. Međutim, kolokalizacija Ab u lizozomu je porasla. Posle 1 h inkubacije, bojenje unutarćelijskog Ab se smanjilo, kao i broj kolokalizacija sa lamp-1. Ova kinetika antitela vezanog za površinu ćelije i njegova unutarćelijska akumulacija su korelisale sa kinetikom raspada antitela na površini, merenom pomoću FACS. Pored toga, kao što je već opisano u studijama FACS-om, degradacija mišjih Ab je počela posle 1sata inkubacije pomoću konfokalne mikroskopije.

1

[0329] Internalizacija svih drugih anti-hIGF-1R mišjih antitela i njihova kolokalizacija sa Lamp-1 je takođe procenjena (Slika 12B). Posle 30 min inkubacije na 37°C, unutarćelijsko antitelo je detektovano i kolokalizacija sa lamp-1 je mogla da se vidi, što ukazuje na to da su sva anti-IGF-1R antitela efektivno internalizovana u lizozome.

Primer 9: Inhibicija degradacije Ab pomoću inhibitora lizozoma, bafilomicina A1

[0330] Da bi se potvrdilo da su antitela stigla do lizozoma gde bivaju razgrađena, ćelije su tretirane ili ne bafilomicinom A1, potentnim inhibitorom lizozomskih funkcija. Ćelije su zatim inkubirane na 4°C sa 10 µg/ml Ab koja se testiraju, oprane i inkubirane još 2 h na 37°C. Internalizovani Ab je detektovan posle permeabilizacije ćelija upotrebom sekundarnog antimišjeg IgG-Alexa 488 Ab. Dodatak bafilomicina A1 je sprečio degradaciju unutarćelijskog Ab (Slika 13) ukazujući na to da su Ab efektivno internalizovani i degradirani u lizozomima.

Primer 10: Efekat pH na vezivanje anti-IGF-1R antitela

[0331] Dok su antitela birana na osnovu njihovog potencijala internalizacije i pokazano je gore da kolokalizuju sa ranim endozomima pre ulaska u lizozomski odeljak, interesantan pristup je bio biranje antitela za koja je stabilnost vezivanja Ab/hIGF-1R modulsana s obzirom na pH okoline i poželjna su antitela koja poželjno disosuju od IGF-1R kad pH okoline postane kiselo. Zaista, primarna razlika između ranih endozoma i lizozoma je njihov luminalni pH: u endozomskom odeljku, pH je približno 6, dok je u lizozomskom odeljku the pH oko 4,5.

[0332] Dobro je poznato da jednom kad se internalizuje posle vezivanja liganda (IGF1), hIGF-1R se vraća na površinu ćelije putem recikliranja.

[0333] Bez vezivanja za teoriju, hipoteza opisana ovde je da antitela sklonija da budu oslobođena od svoje mete rano, pri kiselom pH, će verovatno favorizovati recikliranje mete do membrane i sledstveno tome, mogla bi se smatrati boljim kandidatima za pristupe ADC.

[0334] Da bi se ispitalo da li neka od naših antitela ispoljavaju takvu osobinu i da bi se ta osobina korelisala sa citotoksičnom aktivnošću, vezivanje mišjih anti-hIGF-1R Mab za MCF-7 ćelijskoj liniji je rađeno sa puferima pri različitim pH. Rastuće koncentracije mišjih mAb su inkubirane sa MCF-7 ćelijskom linijom 20 min na 4°C na različitim pH u opsegu od 5 do 8. Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 u FACS puferu. Ćelije su inkubirane još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-hIGF-1R antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida koji boji mrtve ćelije. EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0). Sva izabrana mišja anti-IGF-1R antitela su pokazala niži kapacitet vezivanja pri kiselim pH, kao što je ilustrovano na Slici 14.

[0335] Vezivanje humanizovanih anti-IGF-1R Mab za MCF-7 ćelijsku liniju je rađeno u puferima na različitim pH. Rastuće koncentracije humanizovanih mAb su inkubirane sa MCF-7 ćelijskom linijom 20 min na 4°C na različitim pH u opsegu od 5 do 8. Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 u FACS puferu. Ćelije su inkubirane još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R humanizovanog antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida koji boji mrtve ćelije.

2

EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0). Humanizovana anti-IGFR-antitela su pokazala niži kapacitet vezivanja pri kiselim pH, kao što je ilustrovano na Slici 24.

Primer 12: Procena humanizovane forme 208F2 Mab

12.1 Procena vezivanja i internalizacije prve humanizovane forme hz208F2 VH3/VL3 (zvane i hz208F2 H026/L024)

[0336] Vezivanje prve humanizovane forme c208F2 mAb je procenjeno na MCF-7, COS-7 i NIH 3T3 IR<+>ćelijskim linijama. Rastuće koncentracije m208F2, c208F2 ili hz208F2 VH3VL3 su dodavane svakoj ćelijskoj liniji po 20 min. na 4°C. Ćelije su zatim oprane i vezivanje testiranih mAb je otkriveno korišćenjem odgovarajućeg sekundarnog antitela. Da bi se validirala ekspresija humanog IR na transfektovanoj ćelijskoj liniji, korišćen je komercijalni klon GRO5 anti-hIR antitela i njegov profil prepoznavanja je dat kao primer (Slika 15D).

[0337] Pređenje humanizovane forme bilo sa mišjim, bilo sa himernim na MCF-7 (Slika 15A) ili majmunskim COS-7 (Slika 15B) ćelijama je pokazalo bliske profile za ove 3 testirane forme. Postupak humanizacije nije modifikovao specifičnost prepoznavanja antitela koji je savršeno uporedljiv sa mišjom i himernom formom u vezi sa odsustvom unakrsne reaktivnosti na humanom insulinskom receptoru (Slika 15C).

[0338] Izračunati EC50prve humanizovane forme 208F2 na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 i majmunskoj ćelijskoj liniji COS-7 su slični sa onim određenim sa bilo mišjim bilo himernom formom mAb 208F2.

[0339] Kapacitet mAb hz208F2 VH3/VL3 da bude internalizovan je procenjen protočnom citometrijom. MCF-7 ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela na 4°C 20 min. Zatim su ćelije oprane i inkubirane 4 h na 4°C ili 37°C. Količina antitela vezanih za površinu ćelije je određena uz upotrebu sekundarnog antitela. ∆MFI, definisan kao razlika između MFI merenog na 4°C i MFI merenog na 37°C posle 4 sata inkubacije, odgovara količini internalizovanih Ab. ∆MFI je predstavljen na Slici 16 i Tabeli 13. Procenat internalizacije pri 10 µg/ml Ab je izračunat na sledeći način: 100*(MFI na 4°C - MFI na 37°C)/MFI na 4°C i predstavljen u Tabeli 13. Prema tome, humanizovani hz208F2 VH3/VL3 ima slične osobine vezivanja i internalizacije kao one merene kod odgovarajućeg mišjeg i himernog 208F2 antitela.

T l 1

12.2 Procena vezivanja sledećih humanizovanih formi hz208F2

[0340] MAb 208F2 je humanizovan i procenjene su osobine vezivanja šesnaest humanizovanih varijanti (uključujući prvu formu opisanu u 12.1). Osobine vezivanja humanizovanih varijanti su procenjene pomoću FACS analize na humanoj MCF-7 ćelijskoj liniji adenokarcinoma dojke i majmunskoj ćelijskoj liniji Cos-7, uz upotrebu rastućih koncentracija antitela. U tu svrhu, ćelije (1x10<6>ćelije/ml) su inkubirane sa anti-IGF-1R antitelima 20 min. na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Zatim su oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom, kuplovanim sa Alexa 488 još 20 minuta na 4°C u mraku pre pranja 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R antitela je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0341] Izračunati EC50humanizovanih varijanti su pokazali da sve humanizovane varijante ispoljavaju ekvalentne osobine vezivanja i na humanoj i na majmunskoj ćelijskoj liniji.

[0342] EC50humanizovanih antitela je sumiran u Tabeli 13b.

T l 1

12.3 Procena internalizacije jedne druge humanizovane forme hz208F2

[0343] MCF-7 ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml humanizovanog antitela na 4°C 20 min. Zatim su ćelije oprane i inkubirane na 4°C ili 37°C 4 h. Količina antitela vezanih za površinu ćelije je određena uz upotrebu sekundarnog antitela na protočnom citometru FacsCalibur (Becton Dickinson). ∆MFI, definisan kao razlika između MFI merenog na 4°C i MFI merenog na 37°C posle 4 sata inkubacije, odgovara količini internalizovanih Ab. ∆MFI je predstavljen u Tabeli 13c. Procenat internalizacije pri 10 µg/ml Ab je izračunat na sledeći način: 100*(MFI na 4°C - MFI na 37°C)/MFI na 4°C Humanizovano antitelo hz208F2 H077/L018 je sposobno da indukuje značajnu internalizaciju IGF-1R.

4

T l 1

Primer 13: Definisanje konstanti disocijacije (KD) vezivanja pet himernih anti-IGF-1R antitela (c208F2, c213B10, c212A11, c214F8 i c219D6) i humanizovane verzije (VH3/VL3) antitela 208F2 za rastvorljiv rekombinantni humani IGF-1R

[0344] Konstante disocijacije (KD) vezivanja antitela za rekombinantni rastvorljiv human-IGF-1R su definisane odnosom između brzine disocijacije (kd) i brzine asocijacije (ka). Kinetički eksperimenti su vođeni na uređaju Biacore X100 uz upotrebu CM5 senzorskog čipa aktiviranog anti-Tag His monoklonskim antitelom. Oko 12000 RU antitela je hemijski nakalemljeno na karboksimetil dekstransku matricu korišćenjem kompleta za hemiju amina.

[0345] Eksperimenti su vršeni na 25°C sa brzinom protoka od 30 µl/min uz upotrebu HBS-EP+ pufera (GE Healthcare) kao elucionog i pufera za razblaživanje uzoraka.

[0346] Kinetička šema jednog ciklusa je korišćena za definisanje kinetičkih parametara vezivanja anti-IGF-1R antitela za rastvorljiv rekombinantni humani IGF-1R, uhvaćen preko svoja dva C-terminalna 10 histidinska markera.

1- Rastvor rastvorljive rekombinantne verzije humanog IGF-1R hetero-tetramera: 2α lanca i vanćelijski domeni 2β lanaca eksprimirani sa dodatnim C-terminalnim 10-His markerom (R&D Systems kataloški broj 305-GR-50) je ubrizgavan 1 minut u drugu protočnu ćeliju u koncentraciji od 10µg/ml. Srednja vrednost od 587 RU (sa standardnom devijacijom od 24 RU) rastvorljivog receptora je uhvaćena u svakom od 24 ciklusa realizovanih za ovu studiju.

2- Posle faze hvatanja, ubrizgavan je ili elucioni pufer 5 puta (90 s svaka injekcija) ili 5 rastućih koncentracija jednog od šest antitela (90s svaka injekcija) u obe protočne ćelije. Na kraju pete injekcije, elucioni pufer je propušten tokom 5 minuta da bi se definisala brzina disocijacije.

3- Zatim je generisana površina injekcijom 10mM glicina, HCl pH 1,5 pufera 45 s.

[0347] Izračunati signal odgovara razlici između odgovora protočne ćelije 2 (sa uhvaćenim IGF-1R) i odgovora protočne ćelije 1 (bez ikakvih molekula IGF-1R).

[0348] Za svaki IGF-1R, signal zbog injekcija rastućeg opsega koncentracija jednog antitela je korigovan oduzimanjem signala dobijenog sa 5 injekcija pufera (dupla referenca), videti Sliku 17.

[0349] Dobijeni senzogrami su were analizirani pomoću softvera Biaevaluation sa modelom 1:1.

[0350] Četiri eksperimenta je vršeno za svako antitelo primenom dva različita opsega koncentracija: 40, 20, 10, 5 i 2,5 nM za dva prva eksperimenta i: 24, 12, 6, 3 i 1,5 nM za dva poslednja eksperimenta izvedena za svako antitelo.

[0351] Za 6 antitela testiranih u ovom eksperimentu, eksperimentalni podaci su lepo fitovali u model 1:1 sa značajnim vrednostima kdkad je viša koncentracija bila definisana kao konstantna, a ostale četiri koncentracije su izračunate (videti Sliku 18).

[0352] Konstante disocijacije (KD) izračunate kao odnos: kd/kai poluživot komplekasa izračunat kao odnos Ln(2)/kdsu predstavljeni na Slikama 19 i 20. Oni odgovaraju srednjim vrednostima iz četiri nezavisna eksperimenta urađena za svako antitelo. Stubići greške odgovaraju standardnim greškama (n=4) vrednosti.

[0353] Konstante disocijacije su u opsegu od 10 do 100 pM. c208F2 antitelo ima slabiji afinitet (višu vrednost konstante disocijacije) za h-IGF-1R (sa KDoko 75 pM) i njegova humanizovana verzija je bar isto toliko dobra kao himerna verzija (sa KDoko 60 pM). Ostala četiri anti-IGF-1R himerna antitela imaju prilično sličan afinitet za hIGF1-R (sa KDoko 30 pM). Razlika afiniteta je u principu vezana za brzinu disocijacije ili rezultujući poluživot komplekasa. Sa 208F2 poluživot kompleks je između 2 i 3 sata sa himernom i humanizovanom (VH3/VL3) verzijom. Za ostala četiri himerna antitela, srednje vrednosti poluživota su između 7,0 i 9,4 h.

[0354] Ove vrlo spore kinetike disocijacije su očito vezane za bivalentnu strukturu antitela, koje je u stanju da se veže simultano sa oba svoja Fab kraka za dva susedna h-IGF-1R molekula. U tom slučaju, nivo uhvaćenih IGF-1R molekula može da ima uticaj na brzinu disocijacije. Afiniteti definisani u ovoj studiji odgovaraju funkcionalnim afinitetima (ili aviditetima) antitela za nivo uhvaćenog h-IGF-1R oko 600 RU. Nađena razlika KDod 3 puta između podataka pokazanih gore (Tabela 10) i vrednosti predstavljenih u Primeru 13 je povezana sa promenom nivoa hvatanja hIGF-1R (600RU prema 160 RU u Primeru 4).

Primer 14: Sinteza lekova iz pronalaska

[0355] Sledeće skraćenice su korišćene u sledećim primerima:

aq. vodeni

ee enantiomerni višak

ekv ekvivalent

ESI jonizacija elektrosprejem

LC/MS tečna hromatografija kuplovana sa masenom spektrometrijom

HPLC tečna hromatografija visokih performansi

NMR nuklearna magnetna rezonanca

sat. zasićen

UV ultraviolet

Referentno jedinjenje 1

(S)-2-((S)-2-((3-aminopropil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid, bis trifluorosirćetna kiselina

[0356]

Jedinjenje 1A : (4R, 5S)-4-metil-5-fenil-3-propanoil-1,3-oksazolidin-2-on

[0357]

[0358] (4R, 5S)-4-metil-5-fenil-1,3-oksazolidin-2-on (5,8 g, 32,7 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u tetrahidrofuranu (THF, 120 mL) u inertnoj atmosferi. Smesa je ohlađena do -78°C i n-butillitijum (14,4 mL) je dodat kap po kap. Posle 30 minuta mućkanja na -78°C, dodat je propanoil hlorid (5,7 mL). Mućkanje je nastavljeno 30 minuta na -78°C, a zatim preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa je koncentrovana, a zatim ponovo rastvorena u 200 mL vode. pH rastvora je podešen na 7 zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Ova vodena faza je ekstrahovana 3 puta pomoću 100 mL etil acetata (EtOAc). Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 6,8 g (89 %) jedinjenja 1A u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1B: terc-butil (2S)-2-[(1R,2R)-1-hidroksi-2-metil-3-[(4R,5S)-4-metil-2-okso-5-fenil-1,3-oksazolidin-3-il]-3-oksopropil]pirolidin-1-karboksilat

[0359]

[0360] Jedinjenje 1A (17,6 g, 75,45 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u dihlorometanu (DCM, 286 mL) u inertnoj atmosferi. Ovaj rastvor je ohlađen na ledenom kupatilu. Trietilamin (TEA, 12,1 mL, 1,15 ekv) i Bu2BOTf (78,3 mL, 1,04 ekv) su dodati kap po kap uz držanje temperature reakcione smese ispod 2°C. Mućkanje je nastavljeno 45 minuta na 0°C, posle čega je reakcija ohlađena do -78°C. Rastvor terc-butil (2S)-2-formilpirolidin-1-karboksilata (8,5 g, 42,66 mmol, 0,57 ekv) u DCM (42 mL) je dodat kap po kap. Mućkanje je nastavljeno još 2 sata na -78°C, a zatim 1 sat na 0°C i konačno 1 sat na sobnoj temperaturi. Reakcija je neutralisana pomoću 72 mL fosfatnog pufera (pH = 7,2 – 7,4) i 214 mL metanola i ohlađena do 0°C. Rastvor 30 % vodonik peroksida u metanolu (257 mL) je dodat kap po kap dok je temperatura održavana ispod 10°C. Mućkanje je nastavljeno 1 sat na 0°C. Reakcija je neutralisana pomoću 142 mL vode, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dobijen vodeni rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 200 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i petrolej etra (EtOAc:PE = 1:8) da bi dale 13,16 g (40 %) jedinjenja 1B u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1C: (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(terc-butoksi)karbonil]pirolidin-2-il]-3-hidroksi-2-metilpropanonska kiselina

[0361]

[0362] Jedinjenje 1B (13,16 g, 30,43 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u THF (460 mL) u prisustvu vodonik peroksida (30 % u vodi, 15,7 mL), a zatim ohlađeno na ledenom kupatilu. Vodeni rastvor litijum hidroksida (0,4 mol/L, 152.1 mL) je dodat kap po kap dok je reakciona temperatura održavana ispod 4°C. Reakciona smesa je mućkana 2,5 sati na 0°C. Vodeni rastvor Na2SO3(1 mol/L, 167,3 mL) je dodat kap po kap dok je temperatura održavana na 0°C. Reakciona smesa je mućkana 14 sata na sobnoj temperaturi, a zatim neutralisana pomoću 150 mL hladnog zasićenog rastvora natrijum bikarbonata i oprana 3 puta pomoću 50 mL DCM. pH vodenog rastvora je podešen na 2-3 1M vodenim rastvorom KHSO4. Ovaj vodeni rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 100 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane jednom zasićenim rastvorom NaCl, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 7,31 g (88 %) jedinjenja 1C u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1D: (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(terc-butoksi)karbonil]pirolidin-2-il]-3-metoksi-2-metilpropanonska kiselina

[0363]

[0364] Jedinjenje 1C (7,31 g, 26,74 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u THF (135 mL) u prisustvu jodometan (25,3 mL). Reakcioni medijum je ohlađen na ledenom kupatilu posle čega je NaH (60 % u ulju, 4,28 g) dodat u porcijama. Reakcija je ostavljena uz mućkanje 3 dana na 0°C, a zatim neutralisana pomoću 100 mL zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata i oprana 3 puta pomoću 50 mL etra pH vodenog rastvora je podešen na 3 1M vodenim rastvorom KHSO4. Ovaj vodeni rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 100 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 100 mL Na2S2O3(5 % u vodi), jednom zasićenim rastvorom NaCl, a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 5,5 g (72 %) jedinjenja 1D u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1E: N-metoksi-N-metil-2-fenilacetamid

[0365]

[0366] 2-fenilsirćetna kiselina (16,2 g, 118,99 mmol, 1,00 ekv) je rastvorena u dimetilformamidu (DMF, 130 mL) zatim ohlađena do -10°C. Dodati su dietil fosforocijanidat (DEPC, 19,2 mL), metoksi(metil)amin hidrohlorid (12,92 g, 133,20 mmol, 1,12 ekv) i trietilamin (33,6 mL). Reakciona smesa je mućkana 30 minuta na -10°C, a zatim 2,5 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je ekstrahovana dvaput pomoću 1 litra EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput pomoću 500 mL NaHCO3(sat.), jednom pomoću 400 mL vode, a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela pomoću EtOAc i PE smese (1:100 do 1:3) da bi dao 20,2 g (95 %) jedinjenja 1E u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1F: 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etan-1-on

[0367]

[0368] Tetrametiletilendiamin (TMEDA, 27,2 mL) je rastvoren u THF 300 mL) u inertnoj atmosferi, zatim ohlađen do -78°C pre dodavanja kap po kap n-BuLi (67,6 mL, 2,5 M). 2-bromo-1,3-tiazol (15,2 mL) je dodat kap po kap i mućkanje je nastavljeno 30 minuta na -78°C. Jedinjenje 1E (25 g, 139,50 mmol, 1,00 ekv), rastvoreno u THF (100 mL), je dodato kap po kap. Mućkanje je nastavljeno 30 minuta na -78°C, a zatim 2 sata na -10°C. Reakcija je neutralisana pomoću 500 mL KHSO4(sat.), a zatim ekstrahovana 3 puta pomoću 1 litra EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput pomoću 400 mL vode i dvaput pomoću 700 mL NaCl (sat.), a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:100 do 1:10) da bi dao 25 g (88 %) jedinjenja 1F u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1G: (1R)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etan-1-ol

[0369]

[0370] U inertnoj atmosferi, rastvor jedinjenja 1F (15 g, 73,8 mmol, 1,00 ekv.) u etru (300 mL) je dodat kap po kap u (+)-B-hlorodiizopinokamfilboran ((+)-Ipc2BCl, 110,8 mL). Reakciona smesa je mućkana 24 sata na 0°C, a zatim neutralisana pomoću 300 mL (1:1) smese NaOH (10 % u vodi) i H2O2(30 % u vodi) i konačno ekstrahovana tri puta pomoću 500 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput pomoću 300 mL K2CO3(sat.) i jednom pomoću 500 mL NaCl (sat.), a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:20 do 1:2) da bi dao 6,3 g (42 %) jedinjenja 1G u vidu belog taloga.

Jedinjenje 1H: 2-[(1S)-1-azido-2-feniletil]-1,3-tiazol

[0371]

[0372] Jedinjenje 1G (6 g, 29,23 mmol, 1,00 ekv.) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u THF (150 mL) u prisustvu trifenilfosfina (13 g, 49,56 mmol, 1,70 ekv.), zatim ohlađeno do 0°C. Dietilazodikarboksilat (DEAD, 7,6 mL) je dodat kap po kap, a zatim difenilfosforilazid (DPPA, 11 mL), hladno kupatilo je onda sklonjeno i rastvor je ostavljen uz mućkanje 48 sati na sobnoj temperaturi. Medijum je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:100 do 1:30) da bi dao 8 g delinično prečišćenog jedinjenja 1H u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1H je korišćeno kao takvo u sledećem koraku.

Jedinjenje 1I: terc-butil N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil] karbamat.

[0373]

[0374] Jedinjenje 1H (6,5 g, 28,2 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u THF (100 mL) u prisustvu trifenilfosfina (6,5 g, 33,9 mmol, 1,20 ekv.) i grejano do 50°C 2 sata. Amonijak (70 mL) je onda dodat i grejanje je nastavljeno još 3 sata. Reakcija je ohlađena, neutralisana pomoću 500 mL vode, a zatim ekstrahovana 3 puta pomoću 500 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane i ekstrahovane dvaput pomoću 500 mL 1N HCl. Vodene faze su kombinovane, dovedene na pH 8-9 dodavanjem rastvora natrijum hidroksida (10% u vodi), a zatim ekstrahovane 3 puta pomoću 500 mL DCM. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 4,8 g (83 %) (1S)-2-fenil-1(1,3-tiazol-2-il)etan-1-amina u vidu žutog ulja. Ovo jedinjenje je onda zaštićeno Boc ((tercbutoksi)karbonil) grupom tako da bi moglo da bude prečišćeno. Rastvoreno je u inertnoj atmosferi u 1,4-dioksanu (40 mL), zatim ohlađeno do 0°C. (Boc)2O (10,26 g, 47,01 mmol, 2,00 ekv), razblažen u 20 mL 1,4-dioksana, je dodat kap po kap. Hladno kupatilo je uklonjeno i rastvor je ostavljen uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi pre nego što je neutralisan pomoću 300 mL vode i ekstrahovan dvaput pomoću 500 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:100 do 1:20, ee = 93 %). Zatim je rekristalisan u smesi heksan/aceton (∼ 5-10 / 1, 1g / 10 mL) da bi dao 6 g (84 %) jedinjenja 1I u vidu belog taloga (ee > 99 %).

Jedinjenje 1J : terc-butil (2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]karbamoil]etil]pirolidin-1-karboksilat

[0375]

[0376] Jedinjenje 1I (3 g, 9,86 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u 10 mL DCM. Trifluorosirćetna kiselina (TFA, 10 mL) je dodata i rastvor je ostavljen uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 2,0 g (64 %) (1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etan-1-amin trifluorosirćetne kiseline u vidu žutog ulja. Ovaj intermedijer je ponovo rastvoren u 20 mL DCM, posle čega su dodati jedinjenje 1D (1,8 g, 6,26 mmol, 1,05 ekv), DEPC (1,1 g, 6,75 mmol, 1,13 ekv) i diizopropiletilamin (DIEA, 1,64 g, 12,71 mmol, 2,13 ekv). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:100 do 1:3) da bi dao 2,3 g (81 %) jedinjenja 1J u vidu bledožutog taloga.

Jedinjenje 1K: (2R,3R)-3-metoksi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirolidin-2-il]propanamid trifluorosirćetna kiselina

[0377]

[0378] Jedinjenje 1J (2,25 g, 4,75 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u inertnoj atmosferi u 10 mL DCM. TFA (10 mL) je dodat i rastvor je ostavljen uz mućkanje preko noći na sobnoj

1

temperaturi, a zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 2,18 g (94 %) jedinjenja 1K u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1L: (2S,3S)-2-(benzilamino)-3-metilpentanonska kiselina

[0379]

[0380] (2S,3S)-2-amino-3-metilpentanonska kiselina (98,4 g, 750 mmol, 1,00 ekv) je dodata na sobnoj temperaturi i u porcijama u 2N rastvor natrijum hidroksida (375 mL). Benzaldehid (79,7 g, 751,02 mmol, 1,00 ekv) je brzo dodat i dobijeni rastvor je mućkan 30 minuta. Natrijum borohidrid (10,9 g, 288,17 mmol, 0,38 ekv) je dodat u malim porcijama, dok je temperatura održavana između 5 i 15°C. Mućkanje je nastavljeno još 4 sata na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa je razblažena pomoću 200 mL vode, a zatim oprana dvaput pomoću 200 mL EtOAc. pH vodenog rastvora je podešen na 72N rastvorom hlorovodonične kiseline. Obrazovani precipitat je sakupljen filtriranjem i dao je 149,2 g (90 %) jedinjenja 1L u vidu belog taloga.

Jedinjenje 1M: (2S,3S)-2-[benzil(metil)amino]-3-metilpentanonska kiselina

[0381]

[0382] Jedinjenje 1L (25 g, 112,97 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u mravljoj kiselini (31,2 g) u prisustvu formaldehida (36,5 % u vodi, 22,3 g). Rastvor je mućkan 3 sata na 90°C, a zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je triturisan u 250 mL acetona, a zatim koncentrovan. Ova operacija triturisanja/uparavanja je ponovljena dvaput pomoću 500 mL acetona da bi dala 21,6 g (81 %) jedinjenja 1M u vidu belog taloga.

Jedinjenje 1N : (2S,3S)-2-[benzil(metil)amino]-3-metilpentan-1-ol

[0383]

2

[0384] LiAlH4(0,36 g) je suspendovan u 10 mL THF u inertnoj atmosferi na 0°C. Jedinjenje 1M (1,5 g, 6,37 mmol, 1,00 ekv) je dodato u malim porcijama dok je temperatura održavana između 0 i 10°C. Reakciona smesa je mućkana 2 sata na 65°C, a zatim opet ohlađena do 0°C pre neutralisanja sukcesivnim dodavanjima 360 µL vode, 1 mL 15 % natrijum hidroksida i 360 µL vode. Aluminijumove soli koje su precipitirale su odstranjene filtriranjem. Filtrat je osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:50) da bi dao 820 mg (58 %) jedinjenja 1N u vidu bledožutog ulja.

Jedinjenje 1O: (2S,3S)-2-[benzil(metil)amino]-3-metilpentanal

[0385]

[0386] Oksalil hlorid (0,4 mL) je rastvoren u DCM (15 mL) u inertnoj atmosferi. Rastvor je ohlađen do -70°C i rastvor dimetilsulfoksida (DMSO (0,5 mL) u DCM (10 mL) je dodavan kap po kap tokom 15 minuta. Reakciona smesa je mućkana 30 minuta, posle čega je rastvor jedinjenja 1N (820 mg, 3,70 mmol, 1,00 ekv) u DCM (10 mL) dodavan kap po kap tokom 15 minuta. Reakciona smesa je mućkana još 30 minuta na niskoj temperaturi, a zatim je polako dodat trietilamin (2,5 mL). Reakciona smesa je mućkana 1 sat na -50°C, hladno kupatilo je zatim sklonjeno i reakcija je neutralisana pomoću 25 mL vode, dok je temperatura ostavljena da se vrati do normalne. Rastvor je opran jednom pomoću 30 mL zasićenog vodenog rastvora NaCl, a zatim osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:200) da bi dao 0,42 g (52 %) jedinjenja 1O u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1P: (2S,3S)-N-benzil-1,1-dimetoksi-N,3-dimetilpentan-2-amin

[0387]

[0388] Jedinjenje 1O (4,7 g, 21,43 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 20 mL metanola na 0°C. Koncentrovana sumporna kiselina (4,3 mL) je dodata kap po kap i mućkanje je nastavljeno 30 minuta na 0°C. Trimetil ortoformijat (21,4 mL) je dodat, hladno kupatilo je sklonjeno i reakcioni medijum ostavljen uz mućkanje for 3 sata na sobnoj temperaturi. Reakcioni medijum je razblažen pomoću 200 mL EtOAc, sukcesivno opran pomoću 100 mL 10 % Na2CO3i 200 mL zasićenog NaCl, a zatim osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 3,4 g (60 %) jedinjenja 1P u vidu bledožutog ulja.

Jedinjenje 1Q: [[1-(terc-butoksi)etenil]oksi](terc-butil)dimetilsilan

[0389]

[0390] Diizopropilamin (20 g, 186,71 m mol, 1,08 ekv) je rastvoren u 170 mL THF u inertnoj atmosferi i ohlađen do -78°C. nBuLi (2,4 M, 78,8 mL) je dodat kap po kap i rastvor je mućkan 30 minuta na niskoj temperaturi (da bi dao LDA-litijum diizopropilamid) pre dodavanja terc-butil acetata (20 g, 172,18 mmol, 1,00 ekv). Reakciona smesa je mućkana 20 minuta na -78°C pre dodavanja heksametilfosforamida (HMPA, 25,8 mL) i rastvora tercbutildimetilhlorosilana (TBDMSCl, 28 g, 185,80 mmol, 1,08 ekv) u 35 mL THF. Mućkanje je nastavljeno još 20 minuta na niskoj temperaturi i hladno kupatilo je onda sklonjeno. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u 100 mL vode i ekstrahovan 3 puta pomoću 100 mL PE. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 500 mL zasićenog vodenog rastvora NaCl, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen destilacijom da bi dao 16,6 g (83 %) jedinjenja 1Q u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1R: terc-butil (3R,4S,5S)-4-[benzil(metil)amino]-3-metoksi-5-metil heptanoat

[0391]

[0392] Jedinjenje 1P (2,0 g, 7,54 mmol, 1,00 ekv) i jedinjenje 1Q (2,6 g, 11,28 mmol, 1,50 ekv) su rastvoreni u 33 mL DCM u inertnoj atmosferi. Rastvor je ohlađen do 0°C. DMF (1,2 g) je dodat kap po kap zajedno sa rastvorom BF3·Et2O (2,1 g) u 7,5 mL DCM. Mućkanje je nastavljeno još 24 sata na 0°C. Reakcioni medijum je opran jednom pomoću 30 mL natrijum karbonata (10 %) i dvaput pomoću 50 mL zasićenog vodenog rastvora NaCl, a zatim osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:100) da bi dao 1,82 g (91 %) jedinjenja 1R u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1S: (3R,4S,5S)-3-metoksi-5-metil-4-(metilamino)heptanoat hidrohlorid

[0393]

4

[0394] Jedinjenje 1R (2,4 g, 6,87 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u 35 mL etanola u prisustvu Pd/C (0,12 g) i koncentrovane hlorovodonične kiseline (0,63 mL). Atmosfera azota zamenjena atmosferom vodonika i reakcioni medijum je ostavljen uz mućkanje 18 sati na sobnoj temperaturi. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je triturisan u 50 mL heksana i uklonjen je supernatant koji je, posle sušenja pod sniženim pritiskom, dao 1,66 g (82 %) jedinjenja 1S u vidu belog taloga.

Jedinjenje 1T: terc-butil (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(benziloksi)karbonil]amino]-N,3-dimetilbutanamido]-3-mthoksi-5-metilheptanoat

[0395]

[0396] (2S)-2-[[(benziloksi)karbonil]amino]-3-metilbutanonska kiselina (15 g, 0,40 mmol, 1,00 ekv) je rastvorena u 300 mL DCM u prisustvu DIEA (38,3 mL) i bromotripirolidinofosfonijum heksafluorofosfata (PyBrOP, 32,3g). Rastvor je mućkan 30 minuta na sobnoj temperaturi pre dodavanja jedinjenja 1S (15,99g, 0,42 mmol, 1,07 ekv). Reakcioni medijum je mućkan 2 sata, a zatim koncentrovan. Ostatak je prečišćen u reverznoj fazi (C18) smesom acetonitrila (ACN) i vode (30:70 do 100:0 za 40 minuta) da bi dao 17 g (58 %) jedinjenja 1T u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1U: terc-butil (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-amino-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoksi-5 -metilheptanoat

[0397]

[0398] Jedinjenje 1T (76 mg, 0,15 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u 10 mL etanola u prisustvu Pd/C (0,05 g). Atmosfera azota zamenjena atmosferom vodonika i reakcija je mučkana 2 sata na sobnoj temperaturi. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 64 mg jedinjenja 1U u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1V: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil] amino]-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoksi-5-metilheptanoat

[0399]

[0400] Jedinjenje 1U (18,19 g, 50,74 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 400 mL smese 1,4-dioksan/voda (1:1) u prisustvu natrijum bikarbonata (12,78 g, 152 mmol, 3,00 ekv) i 9H-fluoren-9-ilmetil hloroformijata (Fmoc-Cl, 19,69 g, 76 mmol, 1,50 ekv), a zatim mućkano 2 sata na sobnoj temperaturi. Reakcioni medijum je onda razblažen pomoću 500 mL vode i ekstrahovan 3 puta pomoću 200 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 200 mL zasićenog vodenog rastvora NaCl, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 40 g delimično prečišćenog jedinjenja 1V u vidu bledožutog ulja.

Jedinjenje 1W: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil] amino]-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoksi-5-metilheptanonska kiselina

[0402] Jedinjenje 1V (40 g, 68,88 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u neutralnoj atmosferi u 600 mL DCM. TFA (300 mL) je dodat. Rastvor je mućkan 2 sata na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom f metanola i DCM (1:10) da bi dao 23,6 g (65 %) jedinjenja 1W u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 1X: 9H-fluoren-9-ilmetil N-[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil] karbamoil] etil]pirolidin-1-il]-5-metil-1-oksoheptan-4-il](metil) karbamoil]-2-metilpropil]karbamat

[0404] Jedinjenje 1W (2,53 g, 4,82 mmol, 1,08 ekv) je rastvoreno u 20 mL DCM u prisustvu jedinjenje 1K (2,18 g, 4,47 mmol, 1,00 ekv), DEPC (875 mg, 5,37 mmol, 1,20 ekv) i DIEA (1,25 g, 9,67 mmol, 2,16 ekv). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim sukcesivno oprana pomoću 50 mL zasićenog KHSO4i 100 mL vode, osušena preko natrijum sulfata, profiltrirana i koncentrovana. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom metanola i DCM (1:200 to 1:40) da bi dao 2,8 g (71 %) jedinjenja 1X u vidu bledožutog taloga.

Jedinjenje 1Y: (2S)-2-amino-N-[(3R,5S)-3-metoksi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]karbamoil]etil] pirolidin-1-il]-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N,3-dimetilbutanamid

[0405]

[0406] Jedinjenje 1X (2,8 g, 3,18 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u acetonitrilu (ACN, 12 mL) u prisustvu piperidina (3 mL) i ostavljeno uz mućkanje 18 sati na sobnoj temperaturi. Reakcija je neutralisana pomoću 50 mL vode, a zatim ekstrahovana dvaput pomoću 100 mL DCM. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom metanola i DCM (1:100 to 1:40) da bi dao 1,2 g (57 %) jedinjenja 1Y u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 1ZA: (2S)-2-[[(terc-butoksi)karbonil](metil)amino]-3-metil butanonska kiselina

[0407]

[0408] (2S)-2-[[(terc-butoksi)karbonil]amino]-3-metilbutanonska kiselina (63 g, 289,97 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u inertnoj atmosferi u THF (1000 mL) u prisustvu jodometana (181 mL). Rastvor je ohlađen do 0°C pre dodavanja natrijum hidrida (116 g, 4,83 mol, 16,67 ekv) u malim porcijama. Reakciona smesa je mućkana 1,5 sat na 0°C, hladno kupatilo je onda sklonjeno i mućkanje je nastavljeno još 18 sati. Reakcija je neutralisana pomoću 200 mL vode, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Preostala vodena faza je razblažena pomoću 4 litra vode, oprana jednom pomoću 200 mL EtOAc i njen pH podešen na između 3 i 4 1N rastvorom hlorovodonične kiseline. Dobijena smesa je ekstrahovana 3 puta pomoću 1,2 L EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 60 g (89 %) jedinjenja 1ZA u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1ZB: benzil (2S)-2-[[(terc-butoksi)karbonil](metil)amino]-3-metilbutanoat

[0409]

[0410] Jedinjenje 1ZA (47 g, 203,21 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u DMF (600 mL) u prisustvu Li2CO3(15,8 g, 213,83 mmol, 1,05 ekv). Rastvor je ohlađen dto 0°C, a zatim je benzil bromid (BnBr 57,9 g, 338,53 mmol, 1,67 ekv) dodat kap po kap. Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći pre nego što je neutralisana pomoću 400 mL vode i profiltrirana. Dobijeni rastvor je ekstrahovan dvaput pomoću 500 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:100 do 1:20) da bi dao 22,5 g (34 %) jedinjenja 1ZB u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 1ZC: benzil (2S)-3-metil-2-(metilamino)butanoat hidrohlorid

[0411]

[0412] Jedinjenje 1ZB (22,5 g, 70,00 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 150 mL DCM. Gasovita hlorovodonična kiselina je barbotirana. Reakcija je mućkana 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi dala 17 g (94 %) jedinjenja 1ZC u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 1ZD: terc-butil N-(3,3-dietoksipropil)karbamat

[0413]

[0414] 3,3-dietoksipropan-1-amin (6 g, 40,76 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u 1,4-dioksanu (30 mL) u prisustvu TEA (4,45 g, 43,98 mmol, 1,08 ekv), zatim ohlađen do 0°C. (Boc)2O (9,6 g, 43,99 mmol, 1,08 ekv), razblažen u 20 mL 1,4-dioksana, je dodat kap po kap. Rastvor je mućkan 2 sata na 0°C, pre nego što je neutralisan preko noći na sobnoj temperaturi pomoću 10 mL vode. pH je podešen na 5 pomoću HCl (1 %). Rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 50 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 8,21 g (81 %) jedinjenja 1ZD u vidu bledožutog ulja.

Jedinjenje 1ZE: terc-butil N-(3-oksopropil) karbamat

[0415]

[0416] Jedinjenje 1ZD (8,20 g, 33,15 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 18,75 mL sirćetne kiseline i ostavljeno uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcioni medijum je zatim ekstrahovan 3 puta pomoću 30 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane 3 puta pomoću 30 mL zasićenog rastvora NaCl, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 5 g (87 %) jedinjenja 1ZE u vidu tamnocrvenog ulja.

Jedinjenje 1ZF : (2S)-2-[(3-[[(terc-butoksi)karbonil]amino]propil)(metil) amino]-3-metilbutanonska kiselina

[0417]

[0418] Jedinjenje 1ZE (2,4 g, 13,86 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 50 mL THF u prisustvu jedinjenja 1ZC (3,56 g, 13,81 mmol, 1,00 ekv) i DIEA (9,16 mL, 4,00 ekv). Reakciona smesa je mućkana 30 minuta na sobnoj temperaturi pre dodavanja natrijum triacetoksiborohidrida (5,87 g, 27,70 mmol, 2,00 ekv). Mućkanje je nastavljeno preko noći, a zatim je reakcija neutralisana pomoću 100 mL vode i ekstrahovana 3 puta pomoću 50 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je delimično prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:4). Dobijeni sirovi proizvod je ponovo rastvoren u 20 mL metanola u prisustvu Pd/C (1,2 g) i hidrogenizovan 20 minuta na normalnoj temperaturi i pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 200 mg (5 %) jedinjenja 1ZF u vidu belog taloga.

Jedinjenje 1ZG: terc-butil N-(3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]karbamoil]til]pirolidin-1-il]-5-metil-1-oksoheptan-4il] (metil) karbamoil]-2-metilpropil]karbamoil]-2-metilpropil](metil)amino]propil) karbamat

[0419]

[0420] Jedinjenje 1Y (50 mg, 0,08 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 2 mL DMF u prisustvu jedinjenja 1ZF (26,2 mg, 0,09 mmol, 1,20 ekv), DIEA (37,7 mL) i O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfata (HATU, 43,3 mg, 0,11 mmol, 1,50 ekv). Reakcija je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim razblažena pomoću 10 mL vode i ekstrahovana 3 puta pomoću 5 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 100 mg jedinjenja 1ZG u vidu delimično prečišćenog bezbojnog ulja.

[0421] Jedinjenje 1ZG (90 mg, 0,10 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u neutralnoj atmosferi u 2 mL DCM i rastvor je ohlađen na ledenom kupatilu. TFA (1 mL) je dodat i reakcija mućkana 2 sata na sobnoj temperaturi, zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 18 % do 31 % ACN 7 minuta, a zatim 31 % do 100 % ACN 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 1 je dobijeno sa prinosom od 25 % (23 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Atlantis T3 kolona, 3 µm, 4,6 x 100 mm; 35°C; 1 mL / min, 30 % do 60 % ACN u vodi (20 mM amonijum acetat 6 minuta); ESI (C44H73N7O6S, tačna masa 827,53) m/z: 829 (MH<+>), 5,84 min (93,7 %, 254 nm).

<1>H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,85 - 7,80 (m, 1H); 7,69 - 7,66 (m, 1H), 7,40 - 7,10 (m, 5H), 5,80 - 5,63 (m, 1H), 4,80 - 4,65 (m, 2H), 4,22 -4,00 (m, 1H), 3,89 - 0,74 (m, 58H).

Referentno jedinjenje 2

(S)-2-((S)-2-(((2-aminopiridin-4-il)metil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid trifluorosirćetna kiselina

[0422]

Jedinjenje 2A: terc-butil (S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-karboksilat

[0423]

[0424] Jedinjenje 1D (2,5 g, 8,70 mmol, 1,00 ekv) i (1S,2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol (1,315 g, 8,70 mmol, 1,00 ekv) su rastvoreni u inertnoj atmosferi u DMF (35 mL). Rastvor je ohlađen do 0 °C, a zatim su DEPC (1,39 mL) i TEA (1,82 mL) dodati kap po kap. Reakciona smesa je mućkana 2 sata na 0 °C, a zatim 4 sata na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa je razblažena pomoću 200 mL vode i ekstrahovana tri puta pomoću 50 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 50 mL KHSO4(1 mol/L), jednom pomoću 50 mL NaHCO3(sat.), jednom pomoću 50 mL NaCl (sat.), zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi dale 3,6 g (98 %) jedinjenja 2A u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 2B : (2R,3R)-N-((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)-3-metoksi-2-metil-3-((S)-pirolidin-2-il)propanamid 2,2,2-trifluoroacetat

[0425]

[0426] Jedinjenje 2A (2,7 g, 6,42 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u DCM (40 mL), a zatim ohlađeno do 0 °C. TFA (25 mL) je dodat i rastvor je mućkan 2 sata na 0 °C. Reakciona smesa je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi dala 4,4 g jedinjenja 2B u vidu žutog ulja.

1

Jedinjenje 2C: (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il) (metil)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat

[0427]

[0428] Jedinjenja 2B (4,4 g, 10,13 mmol, 1,00 ekv) i 1W (5,31 g, 10,12 mmol, 1,00 ekv) su rastvorena u inertnoj atmosferi u DCM (45 mL). Rastvor je ohlađen do 0°C, a zatim su DEPC (1,62 mL) i DIEA (8,4 mL) dodati kap po kap. Reakciona smesa je mućkana 2 sata na 0 °C, a zatim na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa je razblažena pomoću 100 mL vode i ekstrahovana tri puta pomoću 50 mL DCM. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 50 mL KHSO4(1 mol/L), jednom pomoću 50 mL NaHCO3(sat.), jednom pomoću 50 mL NaCl (sat.), a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod pritiskom da bi dale 3,3 g (39 %) jedinjenja 2C u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 2D: (S)-2-amino-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid

[0429]

[0430] Jedinjenje 2C (300 mg, 0,36 mmol, 1,00 ekv.) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u ACN (2 mL) i piperidinu (0,5 mL). Rastvor je ostavljen uz mućkanje na sobnoj temperaturi preko noći, a zatim uparen do suva pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom DCM i MeOH (1:100) da bi dao 150 mg (68 %) jedinjenja 2D u vidu belog taloga.

Jedinjenje 2E: metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)izonikotinat

[0431]

2

[0432] Metil 2-aminopiridin-4-karboksilat (2 g, 13,14 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u tercbutanolu (20 mL), posle čega je dodat di-terc-butil dikarbonat (4,02 g, 18,42 mmol, 1,40 ekv). Reakciona smesa je mućkana na 60°C preko noći, a zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem 1M vodenog rastvora NaHCO3(50 mL). Talog je sakupljen filtracijom, opran pomoću 50 mL EtOH, a zatim osušen na vakuumu da bi dao 2,5 g (75 %) jedinjenja 2E u vidu belog taloga.

Jedinjenje 2F: terc-butil (4-(hidroksimetil)piridin-2-il)karbamat

[0433]

[0434] Jedinjenje 2E (2,5 g, 9,91 mmol, 1,00 ekv) i CaCl2(1,65 g) je rastvoreno u EtOH (30 mL). Rastvor je ohlađen do 0°C, a zatim NaBH4(1,13 g, 29,87 mmol, 3,01 ekv) je dodavano postepeno. Rastvor je ostavljen uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim je reakcija zaustavljena pomoću dodavanja vode (50 mL). Smesa je ekstrahovana tri puta pomoću 20 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput pomoću 20 mL NaCl (sat.) zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi dale 2,0 g (90 %) jedinjenja 2F u vidu bezbojnog taloga.

Jedinjenje 2G: terc-butil (4-formilpiridin-2-il)karbamat

[0435]

Dodato je 19,4 g (223,14 mmol, 20,02 ekv) MnO2. Smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na 70 °C, a zatim su čvrste supstance ukljonjene filtriranjem. Filtrat je uparen do suva da bi dao 1,4 g (57 %) jedinjenja 2G u vidu belog taloga.

Jedinjenje 2H: benzil (S)-2-(((2-((terc-butoksikarbonil)amino)piridin-4-il)metil) (metil)amino)-3-metilbutanoat

[0437]

[0438] Jedinjenje 2G (2,3 g, 10,35 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 25 mL THF u prisustvu jedinjenja 1ZC (2,93 g, 11,37 mmol, 1,10 ekv), DIEA (5,39 g, 41,71 mmol, 4,03 ekv) i NaBH(OAc)3(4,39 g, 20,71 mmol, 2,00 ekv). Reakciona smesa je mućkana 6 sati na sobnoj temperaturi, a zatim neutralisana pomoću 60 mL NaHCO3(sat.) i ekstrahovana 3 puta pomoću 20 mL AcOEt. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput pomoću 20 mL NaCl (sat.), osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:15) da bi dao 2,7 g (61 %) jedinjenja 2H u vidu belog taloga.

Jedinjenje 2I: (S)-2-(((2-((terc-butoksikarbonil)amino)piridin-4-il)metil) (metil)amino)-3-metilbutanonska kiselina

[0439]

[0440] Jedinjenje 2H (500 mg, 1,17 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 10 mL AcOEt i 2 mL metanola u prisustvu Pd/C (250 mg), i hidrogenizovano 3 sata na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 254 mg (64 %) jedinjenja 2I u vidu bezbojnog taloga

Jedinjenje 2J: terc-butil (4-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-sec-butil)-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-3,6-diizopropil-2,8-dimetil-4,7-diokso-11-oksa-2,5,8-triazadodecil)piridin-2-il) karbamat

[0441]

[0442] Jedinjenje 2J je dobijeno na sličan način kao jedinjenje 1ZG, iz amina 2D (85,2 mg, 0,14 mmol, 1,50 ekv), kiseline 2I (31,7 mg, 0,09 mmol, 1,00 ekv), HATU (42,9 mg, 0,11 mmol, 1,20 ekv) i DIEA (36,7 mg, 0,28 mmol, 3,02 ekv) u DMF (3 mL). Posle uparavanja do suva, dobijeno je 100 mg sirovog proizvoda u vidu belog taloga.

[0443] Jedinjenje 2J (100 mg, 0,11 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 2 mL DCM i 1 mL TFA. Reakcija je mućkana 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak (80 mg) je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN 10 minuta, a zatim 40 % do 100 %

4

ACN 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 2 je dobijeno sa prinosom od 6 % (6,3 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 kolona, 2,7 µm, 4,6 x 100 mm; 40°C; 1,8 mL/min, od 10 % do 95 % ACN u vodi (0,05 % TFA) tokom 6 minuta); ESI (C45H73N7O7, tačna masa 823,56) m/z: 824,5 (MH<+>) i 412,9 (M,2H<+>/2, 100 %), 3,21 min (99,2 %, 210 nm)

<1>H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,81 - 7,79 (m, 1H); 7,39 - 7,29 (m, 5H); 6,61 - 6,59 (m, 2H); 4,84 - 4,52 (m, 1H); 4,32 - 4,02 (m, 1H); 3,90 - 2,98 (m, 10H); 2,90 - 2,78 (m, 1H); 2,55 - 0,81 (m, 39H).

Referentno jedinjenje 3

Metil ((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoat trifluorosirćetna kiselina

[0444]

Jedinjenje 3A: terc-butil (S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-3-(((S)-1-metoksi-1-okso-3-fenilpropan-2-il)amino)-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-karboksilat

[0445]

[0446] Jedinjenje 1D (3 g, 10,44 mmol, 1,00 ekv) i metil (S)-2-amino-3-fenilpropanoat (2,25 g, 12,55 mmol, 1,20 ekv) su rastvoreni u inertnoj atmosferi u DMF (40 mL). Rastvor je ohlađen do 0 °C, a zatim su DEPC (1,67 mL, 1,05 ekv) i TEA (3,64 mL, 2,50 ekv) dodati kap po kap. Reakciona smesa je mućkana 2 sata na 0 °C, a zatim na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa je razblažena pomoću 100 mL vode i ekstrahovana tri puta pomoću 50 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 100 mL KHSO4(1 mol/L), jednom pomoću 100 mL NaHCO3(sat.), jednom pomoću 100 mL NaCl (sat.), a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod pritiskom da bi dale 4 g (85 %) jedinjenja 3A u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 3B: 2,2,2-trifluoroacetat metil (S)-2-((2R,3R)-3-metoksi-2-metil-3-((S)-pirolidin-2-il)propanamido)-3-fenilpropanoata

[0447]

[0448] Jedinjenje 3A (5 g, 11,15 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u DCM (40 mL). TFA (25 mL) je dodat i rastvor je mućkan 2 sata. Reakciona smesa je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi dala 8 g jedinjenja 3B u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 3C: metil (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoat

[0449]

[0450] Jedinjenja 3B (8,03 g, 17,36 mmol, 1,00 ekv) i 1W (9,1 g, 17,34 mmol, 1,00 ekv) su rastvorena u inertnoj atmosferi u DCM (80 mL). Rastvor je ohlađen do 0 °C, a zatim su dodati DEPC (2,8 mL) i DIEA (12 mL) kap po kap. Reakciona smesa je mućkana 2 sata na 0 °C, a zatim na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa je razblažena pomoću 200 mL vode i ekstrahovana tri puta pomoću 50 mL DCM. Organske faze su kombinovane, oprane jednom pomoću 50 mL KHSO4(1 mol/L), jednom pomoću 50 mL NaHCO3(sat.), jednom pomoću 50 mL NaCl (sat.), a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi dale 5 g (34 %) jedinjenja 3C u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 3D: metil (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-amino-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3 - fenilpropanoat

[0451]

[0452] Jedinjenje 3C (5,5 g, 6,43 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u rastvoru tetrabutilamonijum fluorida (TBAF, 2,61 g, 9,98 mmol, 1,55 quiv) u DMF (100 mL). Rastvor je mućkan na sobnoj temperaturi 2 sata, a zatim razblažen pomoću 100 mL vode i ekstrahovan tri puta pomoću 50 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, a zatim osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi dale 3,3 g (81 %) jedinjenja 3D u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 3E: benzil (S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino) butanoat

[0453]

[0454] Piridin-4-karbaldehid (1 g, 9,34 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u 10 mL 1,2-dihloroetana (DCE) u prisustvu jedinjenja 1ZC (2,9 g, 11,25 mmol, 1,21 ekv) i titanijum izopropoksida (IV) (4,19 mL, 1,40 ekv). Smesa je mućkana na sobnoj temperaturi 30 minuta, a zatim je dodato 2,77 g NaBH(OAc)3(13,07 mmol, 1,40 ekv). Reakcioni medijum je ostavljen uz mućkanje preko noći, a zatim neutralisan pomoću 100 mL vode i smesa je ekstrahovana 3 puta pomoću 50 mL AcOEt. Organske faze su kombinovane i uparene do suva. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:20) da bi dao 1,3 g (45 %) jedinjenja 3E u vidu bezbojnog ulja.

Jedinjenje 3F: (S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino)butanonska kiselina

[0455]

[0456] Jedinjenje 3E (800 mg, 2,56 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 30 mL AcOEt u prisustvu Pd/C (300 mg) i hidrogenizovano 3 sata na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom DCM i MeOH (100:1 to 5:1) da bi dao 100 mg (18 %) jedinjenja 3F u vidu belog taloga.

[0457] Jedinjenja 3D (50 mg, 0,08 mmol, 1,00 ekv) i 3F (26,34 mg, 0,12 mmol, 1,50 ekv) su rastvorena u 3 mL DCM. Rastvor je ohlađen do 0 °C, a zatim je dodato 0,018 mL DEPC i 0,0392 mL DIEA. Reakcija je mućkana na 0°C 2 sata, a zatim na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcioni medijum je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatak (70 mg) je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN 2 minuta; Waters 2545 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 3 je dobijeno sa prinosom od 27 % (20 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 kolona, 2,7 µm, 4,6 x 100 mm; 40°C; 1,5 mL/min, 10 % do 95 % ACN u vodi (0,05 % TFA) tokom 8 minuta); ESI (C46H72N6O8, tačna masa 836,5) m/z: 837,5 (MH<+>) i 419,4 (M,2H<+>/2 (100 %)), 7,04 min (90,0 %, 210 nm)

<1>H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 8,76 - 8,74 (m, 2H); 8,53 - 8,48 (m, 0,4H, NHCO nepotpuna izmena); 8,29 - 8,15 (m, 0,8H, NHCO nepotpuna izmena); 8,01 (s, 2H), 7,31 - 7,22 (m, 5H), 4,88 - 4,68 (m, 3H); 4,31 - 4,07 (m, 2H); 3,94 - 2,90 (m, 18H); 2,55 - 0,86 (m, 38H).

Referentno jedinjenje 4

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanonska kiselina, trifluorosirćetna kiselina

[0458]

[0459] Jedinjenje 3 (100 mg, 0,11 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u smesi vode (5 mL), ACN (5 mL) i piperidina (2,5 mL). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN 2 minuta; Waters 2545 UV detektor na 254 nm i 220 nm), da bi dao 20 mg (20 %) jedinjenja 4 u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 kolona, 2,7 µm, 4,6 x 100 mm; 40°C; 1,5 mL/min, 10 % do 95 % ACN u vodi (0,05 % TFA) tokom 8 minuta); ESI (C45H70N6O8, tačna masa 822,5) m/z: 823,5 (MH<+>) i 412,4 (M,2H<+>/2, 100 %), 6,84 min (89,1 %,210 nm).

<1>H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 8,79 - 8,78 (m, 2H); 8,09 (m, 2H); 7,30 - 7,21 (m, 5H); 4,80 - 4,80 (m, 1H), 4,36 - 0,87 (m, 58H).

Referentno jedinjenje 6

Metil (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminopropil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoat bis trifluorosirćetna kiselina

[0460]

Jedinjenje 6A: metil (2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(tercbutoksi)karbonil]amino]propil)(metil)amino]-3-metil butanamido]-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoksi-5-metilheptanoil]pirolidin-2-il](metoksi)metil]propanamido]-3-fenilpropanoat

[0461]

[0462] Jedinjenje 3D (157,5 mg, 0,25 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno na 0°C u inertnoj atmosferi u 3 mL DCM u prisustvu karboksilne kiseline 1ZF (78,7 mg, 0,27 mmol, 1,10 ekv), DEPC (46 µl) i DIEA (124 µl). Reakciona smesa je mućkana 2 sata na niskoj temperaturi i hladno kupatilo je zatim sklonjeno i mućkanje je nastavljeno još 4 sata. Zatim je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi dala 200 mg jedinjenja 6A u vidu sirovog žutog ulja. Ono je korišćeno kao takvo u sledećem koraku.

[0463] Jedinjenje 6A (200 mg, 0,22 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi na 0°C u 2 mL DCM. TFA (1 mL) je dodat kap po kap i hladno kupatilo je sklonjeno. Reakciona smesa je mućkana 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisan pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm), da bi dala 60 mg (26 %, prinos u 2 koraka) jedinjenja 6 u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Zorbax Eclipse Plus C8, 3,5 µm, 4,6 x 150 mm; 1 mL/min, 40°C, 30 do 80 % metanola u vodi (0,1 % H3PO4) tokom 18 minuta); ESI (C43H74N6O8, tačna masa 802,56) m/z: 804 (MH<+>); 11,50 min (91,5 %, 210 nm).

<1>H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 8,52 (d, 0,3H, NHCO nepotpuna izmena); 8,25 (d, 0,5H, NHCO nepotpuna izmena); 7,30-7,22 (m, 5H); 4,9-4,6 (m, 3H); 4,2-4,0 (m, 1H); 4,0-0,86 (m, 61H).

Referentno jedinjenje 7

(S)-2-((2R,3R)+3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminopropil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil) pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanonska kiselina, bis trifluorosirćetna kiselina

[0464]

[0465] Jedinjenje 6 (70 mg, 0,08 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u smesi vode (5 mL), ACN (2,5 mL) i piperidina (5 mL). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisan pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN 2 minuta; UV Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm), da bi dao 14,6 mg (21 %) jedinjenja 7 u vidu belog taloga. LC/MS/UV (Ascentis Express C18, 2,7 µm, 4,6 x 100 mm; 1,5 mL/min, 40°C, 0 do 80 % metanola u vodi (0,05 % TFA) tokom 8 minuta); ESI (C42H72N6O8, tačna masa 788,54) m/z: 790 (MH<+>), 5,71 min (96,83 %, 210 nm).

<1>H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 8,42 (d, 0,3H, NHCO nepotpuna izmena); 8,15 (d, 0,2H, NHCO nepotpuna izmena); 7,31-7,21 (m, 5H); 4,9-4,6 (m, 3H); 4,25-4,0 (m, 1H); 4,0-0,86 (m, 59H).

Jedinjenje 11

(S)-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino) butanamido)butanamid trifluorosirćetna kiselina

[0466]

1

Jedinjenje 11A: terc-butil N-[4-(2-hidroksietil)fenil]karbamat

[0467]

[0468] Di-terc-butil dikarbonat (16,7 g, 77 mmol, 1,05 ekv.) je dodat u rastvor 2-(4-aminofenil)etanola (10 g, 72,9 mmol, 1 ekv.) u THF (200 mL), i reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Smesa je razblažena pomoću EtOAc (200 mL), oprana vodom (200 mL), a zatim 1M-nom HCl (100 mL), zatim zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(100 mL), zatim slanim rastvorom (100 mL). Organske faza su osušene preko MgSO4, a zatim uparene do suva pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je triturisan dvaput heptanom (150 mL) i osušen na vakuumu da bi dao jedinjenje 11A kao belu čvrstu supstancu (14,7 g, 84 %).

Jedinjenje 11B: terc-butil N-[4-(2-oksoetil)fenil]karbamat

[0469]

[0470] Jedinjenje 11A (2,5 g, 10,5 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 25 mL DCM, a zatim ohlađeno do -78°C. Rastvor Des-Martinovog perjodinana (DMP, 6,71 g, 15,8 mmol, 1,5 ekv) u DCM (10 mL) je dodat kap po kap. Hladno kupatilo je uklonjeno i mućkanje je nastavljeno još 1 sat na sobnoj temperaturi. Reakcija je neutralisana pomoću 60 mL 50/50 smese zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata i zasićenog vodenog rastvora Na2S2O3. Dobijeni rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 30 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput zasićenim vodenim rastvorom NaCl, osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na silika gelu (EtOAc/PE 1/15) da bi dao 1,0 g (40 %) jedinjenja 11B u vidu bledožutog taloga.

Jedinjenje 11C : benzil (2S)-2-[[2-(4-[[(terc-butoksi)karbonil]amino]fenil) etil](metil)amino]-3-metilbutanoat

1 1

[0472] Jedinjenje 1ZC (3,5 g, 13,6 mmol, 1,1 ekv) je rastvoreno u THF (30 mL) u prisustvu DIEA (6,4 g, 49,7 mmol, 4,0 ekv), aldehida 11B (2,9 g, 12,3 mmol, 1,0 ekv) i natrijum triacetoksiborohidrida (5,23 g, 49,7 mmol, 2,0 ekv). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim neutralisana pomoću 60 mL zasićenog rastvora natrijum bikarbonata. Dobijeni rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 30 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, oprane dvaput zasićenim vodenim rastvorom NaCl, osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na silika gelu (EtOAc/PE 1:20) da bi dao 3,7 g (68 %) jedinjenja 11C u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 11D: (2S)-2-[[2-(4-[[(terc-butoksi)karbonil]amino]fenil)etil] (metil)amino]-3-metilbutanonska kiselina

[0473]

[0474] Jedinjenje 11C (2 g, 4,5 mmol, 1 ekv) je rastvoreno u 10 mL metanol u prisustvu Pd/C (2 g) i hidrogenizovano 2 sata na normalnoj temperaturi i pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 1,2 g (75 %) jedinjenja 11D u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 11E: (2S)-2-[[2-(4-[[(terc-butoksi)karbonil](metil)amino]fenil) etil](metil) amino]-3-metilbutanonska kiselina

[0475]

[0476] Jedinjenje 11D (1,2 g, 3,4 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u inertnoj atmosferi u THF (20 mL). Reakcioni medijum je ohlađen na ledenom kupatilu, posle čega je NaH (60 % u ulju, 549 mg, 13,7 mmol, 4,0 ekv) dodat u porcijama, a zatim i jodometan (4,9 g, 34 mmol, 10 ekv). Reakcija je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj teperaturi, a zatim neutralisana

1 2

vodom i oprana pomoću 100 mL EtOAc. pH vodenog rastvora je podešen na 6-7 1N-nom HCl. Ovaj vodeni rastvor je ekstrahovan 3 puta pomoću 100 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane da bi dale 800 mg (64 %) jedinjenja 11E u vidu žutog taloga.

Jedinjenje 11F: terc-butil N-[4-(2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]karbamoil]etil]pirolidin-1-il]-5-metil-1-oksoheptan-4yl] (metil)karbamoil]-2-metilpropil]karbamoil]-2-metilpropil](metil)amino] etil)fenil]-N-metilkarbamat

[0477]

[0478] Jedinjenje 11F je dobijeno na sličan način kao jedinjenje 6A, iz amina 1Y (150 mg, 0,22 mmol, 1,2 ekv) i kiseline 11E (70 mg, 0,19 mmol, 1,0 ekv). Posle prečišćavanja na silika gelu (EtOAc/PE 1:1), dobijeno je 100 mg (52 %) željenog proizvoda u vidu bledožutog taloga.

[0479] Jedinjenje 11 je dobijeno na isti način kao jedinjenje 1, iz intermedijera 11F (100 mg, 0,1 mmol). Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 11 je dobijeno sa prinosom od 39 % (39,7 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Eclipse Plus C8, 3,5 µm, 4,6 x 150 mm; 1 mL/min, 40°C, 50 do 95 % metanola u vodi (0,05 % TFA) in 18 minuta); ESI (C50H77N7O6S, tačna masa 903,57) m/z: 904,5 (MH<+>), 7,53 min (93,68 %, 254 nm).

<1>H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 8,84 (d, 0,5H, NHCO nepotpuna izmena); 8,7-8,5 (m, 0,9H, NHCO nepotpuna izmena); 7,76-7,73 (m, 1H); 7,55 - 7,4 (m, 1H); 7,28-7,22 (m, 7H); 7,08-7,05 (m, 2H); 5,51-5,72 (m, 1H); 4,9-4,80 (m, 2H); 4,3-0,7 (m, 60H).

Jedinjenje 12

Metil (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoat trifluorosirćetna kiselina

[0480]

1

[0481] Na isti način kao za završnu fazu sinteze jedinjenja 1, jedinjenje 12 je dobijeno u dva koraka iz amina 3D (118 mg, 0,19 mmol) i kiseline 11E (82 mg, 0,22 mmol). Konačni ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 12 je dobijeno sa prinosom od 7 % (13,7 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Eclipse Plus C8, 3,5 µm, 4,6 x 150 mm; 1 mL/min, 40°C, 40 do 95 % metanola u vodi (0,05 % TFA) in 18 minuta); ESI (C49H78N6O8, tačna masa 878,59) m/z: 879,7 (MH<+>), 10,07 min (90,6 %, 254 nm).

<1>H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,40 (se, 2H); 7,38-7,22 (m, 7H); 4,95-4,7 (m, 3H); 4,2-4,0 (m, 1H); 3,9-0,86 (m, 62H).

Jedinjenje 13

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoksi-5-metil heptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanonska kiselina, trifluorosirćetna kiselina

[0482]

[0483] Jedinjenje 13 je dobijeno na isti način kao jedinjenje 7, iz jedinjenja 12 (100 mg, 0,10 mmol). Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 13 je dobijeno sa prinosom od 20 % (20 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18, 2,7 µm, 4,6 x 100 mm; 1,5 mL/min, 40°C, 10 do 95 % metanola u vodi (0,05 % TFA) tokom 8 minuta); ESI (C48H76N6O8, tačna masa 864,57) m/z: 865,6 (MH<+>), 6,05 min (90,9 %, 210 nm).

1 4

<1>H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,32-7,19 (m, 9H); 4,9-4,65 (m, 3H); 4,2-4,0 (m, 1H); 3,9-0,86 (m, 59H).

Jedinjenje 14

(S)-2-((S)-2-((3-aminobenzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid, trifluorosirćetna kiselina

[0484]

Jedinjenje 14A: terc-butil (3-(hidroksimetil)fenil) karbamat

[0485]

[0486] (3-aminofenil)metanol (3 g, 24,36 mmol, 1,00 ekv) je rastvoren u THF (60 mL) posle čega je dodat di-terc-butil dikarbonat (6,38 g, 29,23 mmol, 1,20 ekv). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi i reakcija je zatim razblažena dodavanjem 200 mL vode. Proizvod je ekstrahovan 3 puta pomoću 100 mL AcOEt i organske faze su zatim rekombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi dale sirovi proizvod (13,85 g jedinjenja 14A) u vidu žutog ulja.

Jedinjenje 14B: terc-butil (3-formilfenil)karbamat

[0487]

[0488] Jedinjenje 14A (13,8 g, 61,81 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u DCE (400 mL), a zatim je dodat MnO2(54 g, 621,14 mmol, 10,05 ekv). Smesa je ostavljena uz mućkanje na sobnoj temperaturi 3 dana, posle čega su čvrste supstance odstranjene filtriranjem. Filtrat je uparen

1

do suva i ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:30) da bi dao 3 g (22 %) jedinjenja 14B u vidu čvrste supstance.

Jedinjenje 14C : benzil (S)-2-((3-((terc-butoksikarbonil)amino)benzil) (metil)amino)-3-metilbutanoat

[0489]

[0490] Jedinjenje 14B (1 g, 4,52 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 20 mL THF, u prisustvu jedinjenja 1ZC (1,16 g, 4,50 mmol, 1,00 ekv), DIEA (3 mL) i NaBH(OAc)3(1,92 g, 9,06 mmol, 2,01 ekv). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim neutralisana pomoću 100 mL vode i ekstrahovana 3 puta pomoću 50 mL AcOEt. Organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane. Ostatak je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:50) da bi dao 1,9 g (99 %) jedinjenja 14C u vidu belog taloga.

Jedinjenje 14D: (S)-2-((3-((terc-butoksikarbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanonska kiselina

[0491]

[0492] Jedinjenje 14C (1 g, 2,34 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u 30 mL AcOEt i 4 mL metanola, u prisustvu Pd/C (400 mg) i hidrogenizovano 1 sat na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 680 mg (86 %) jedinjenja 14D u vidu belog taloga.

Jedinjenje 14E : terc-butil (3-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-sek-butil)-3,6-diizopropil-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-2,8-dimetil-4,7-diokso-11-oksa-2,5,8-triazadodecil)fenil) karbamat

[0493]

1

[0494] Jedinjenje 14E je sintetisano na isti način kao jedinjenje 3, iz amina 1Y (100 mg, 0,15 mmol, 1,00 ekv), kiseline 14D (102,27 mg, 0,30 mmol, 2,00 ekv), DEPC (0,053 mL) i DIEA (0,046 mL) u DCM (3 mL). Sirovi proizvod (80 mg) je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:1) da bi dao 100 mg (67 %) jedinjenja 14E u vidu bledožutog taloga.

[0495] Jedinjenje 14 je sintetisano na isti način kao jedinjenje 2, iz intermedijera 14E (100 mg, 0,10 mmol, 1,00 ekv). Sirovi proizvod (80 mg) je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisan pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters 2545 UV detektor na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 14 je dobijeno sa prinosom od 10 % (10 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Eclipse plus C8 kolona, 3,5 µm, 4,6 x 150 mm; 40°C; 1,0 mL / min, 40 % do 95 % MeOH u vodi (0,05 % TFA) tokom 18 minuta); ESI (C48H73N7O6S, tačna masa 875,5) m/z: 876,5 (MH<+>) i 438,9 (M,2H<+>/2, 100 %), 11,35 min (95,6 %, 210 nm).

<1>H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 8,92 - 8,86 (m, 0,4H, NH nepotpuna izmena); 8,70 - 8,54 (m, 0,6H, NH nepotpuna izmena); 7,88 - 7,78 (m, 1H); 7,60 -7,50 (m, 1H); 7,45 - 6,97 (m, 9H); 5,80 - 5,65 (m, 1H); 4,85 - 4,70 (m, 1H); 4,40 - 0,80 (m, 56H).

Jedinjenje 15

metil (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminobenzil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoat, trifluorosirćetna kiselina

[0496]

Jedinjenje 15A: metil (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((tercbutoksikarbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoat

1

[0498] Jedinjenje 15A je sintetisano na isti način kao jedinjenje 3, iz amina 3D (200 mg, 0,32 mmol, 1,00 ekv), kiseline 14D (212,6 mg, 0,63 mmol, 2,00 ekv), DEPC (0,1103 mL) i DIEA (0,157 mL, 3,00 ekv) u DCM (5 mL). Sirovi proizvod je prečišćen na koloni od silika gela smesom EtOAc i PE (1:1) da bi dao 200 mg (67 %) jedinjenja 15A u vidu žutog taloga.

[0499] Jedinjenje 15: Jedinjenje 15 je sintetisano na isti način kao jedinjenje 2, iz intermedijera 15A (200 mg, 0,21 mmol, 1,00 ekv). Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters UV detektor 2545 na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 15 je dobijeno sa prinosom od 19 % (38,6 mg) u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 kolona, 2,7 µm, 4,6 x 100 mm; 40°C; 1,5 mL/min, 10 % do 95 % MeOH u vodi (0,05 % TFA) tokom 8 minuta); ESI (C47H74N6O8, tačna masa 850,5) m/z: 851,5 (MH<+>) i 426,4 (M,2H<+>/2, 100 %), 6,61 min (91,1 %, 210 nm).

<1>H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,53 - 7,42 (m, 1H); 7,35 - 7,18 (m, 8H); 4,88 - 4,79 (m, 2H); 4,42 - 4,00 (m, 3H); 3,93 - 2,71 (m, 22H); 2,61 - 0,81 (m, 33H).

Jedinjenje 20

(S)-2-((S)-2-((4-aminobenzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid trifluorosirćetna kiselina

[0500]

1

[0501] Jedinjenje 20 je dobijeno na isti način kao jedinjenje 1, iz amina 1ZC i odgovarajućeg aldehida.

[0502] 4-nitrobenzaldehid, uključen u dobijanje jedinjenja 20, je komercijalan.

[0503] Sinteza jedinjenja 20 je urađena redukovanjem nitro grupe. Ovo je izvedeno na sledeći način: (2S)-N-[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-[[(1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il]karbamoil]-1-metoksi-2-metiletil] pirolidin-1-il]-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N,3-dimetil-2-[(2S)-3-metil-2-[metil[(4-nitrofenil)metil]amino]butanamido]butanamid (40 mg, 0,05 mmol, 1,0 ekv) je rastvoren u 15 mL etanola. Dehidratisan kalaj hlorid (II) (317 mg, 1,4 mmol, 30 ekv) je dodat i rastvor je ostavljen uz mućkanje 3 dana na sobnoj temperaturi. Reakcija je neutralisana pomoću 50 mL vode, a zatim ekstrahovana tri puta sa 50 mL EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata, profiltrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi dale jedinjenje 20 u sirovom stanju (čistoća: 93,2%; količina: 21,6 mg).

[0504] Jedinjenje je prečišćeno preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters 2489 UV detektor na 254 nm i 220 nm), da bi dalo odgovarajuće TFA soli u vidu belih taloga.

<1>H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,85-7,80 (m, 1H); 7,6-7,5 (m, 1H); 7,4-7,15 (m, 5H); 7,1-7,05 (m, 2H); 6,73-6,70 (m, 2H); 5,8-5,55 (m, 1H); 5,0-4,7 (m, 2H); 4,25-4,05 (m, 1H); 4,0-0,8 (m, 54H). LC/MS/UV ESI: (C48H73N7O7S, tačna masa 875,53) m/z 876 (MH<+>), 439 [75 %, (M,2H<+>)/2]; UV: RT = 4,83 min (96,8 %, 254 nm).<1>H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,85-7,80 (m, 1H); 7,6-7,5 (m, 1H); 7,4-7,1 (m, 7H); 6,76-6,72 (m, 2H); 5,8-5,55 (m, 1H); 4,9-4,65 (m, 2H); 4,25-4,05 (m, 1H); 4,0-0,8 (m, 54H).

Jedinjenje 29

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminobenzil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanonska kiselina, trifluorosirćetna kiselina

[0505]

[0506] Jedinjenje 15 (100 mg, 0,10 mmol, 1,00 ekv) je rastvoreno u smesi vode (5 mL), ACN (5 mL) i piperidina (2,5 mL). Reakciona smesa je ostavljena uz mućkanje preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen

1

preparativnom HPLC (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 150 mm; eluirajuća faza: voda / ACN puferisana pomoću 0,05 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % ACN tokom 10 minuta, a zatim 40 % do 100 % ACN tokom 2 minuta; Waters 2545 UV detektor na 254 nm i 220 nm), da bi dao 20 mg (20 %) jedinjenja 29 u vidu belog taloga.

LC/MS/UV (Eclipse Plus C8 kolona, 3,5 µm, 4,6 x 150 mm; 40°C; 1,0 mL/min, 40 % do 95 % MeOH u vodi (0,05 % TFA) tokom 18 minuta); ESI (C46H72N6O8, tačna masa 836,54) m/z: 837,5 (MH<+>) i 419,4 (M,2H<+>/2, 100 %), 10,61 min (92,5 %, 210 nm).

<1>H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (prisustvo rotamera) 7,38 - 7,15 (m, 6H); 7,00 - 6,99 (m, 3H); 4,85 - 4,68 (m, 2H); 4,37 - 3,38 (m, 11H); 3,31 - 2,70 (m, 8H); 2,60 - 0,82 (m, 35H).

Jedinjenje 61

(S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid

[0507]

Jedinjenje 61A: N-(4-aminofenetil)-N-metil-L-valin dihidrohlorid

[0508]

[0509] Jedinjenje 11D (962 mg, 2,75 mmol) je rastvoreno u 10 ml komercijalno dostupnog rastvora HCl u propan-2-olu (5 - 6 M) i mešano na sobnoj temperaturi 2 sata. TLC analiza je ukazala na potpunu potrošenost početnog materijala. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i dobijena žuta čvrsta supstanca talog je triturisan pomoću Et2O (2 x 10 ml). Proizvod je osušen na vakuumu da bi dao jedinjenje 61A kao žutu čvrstu supstancu

[0510] Jedinjenje 61: Karboksilna kiselina 61A (73 mg, 0,23 mmol, 1 ekv.) i amin 1Y (150 mg, 0,23 mmol, 1 ekv.) su rastvoreni u suvom DMF (2 ml). Dodati su DIEA (158 µl, 0,90 mmol, 4 ekv.) i DECP (drugi naziv DEPC) (51 µl, 0,34 mmol, 1,5 ekv.) i reakcija je mešana 4 sata na sobnoj temperaturi. Analiza pomoću LC-MS je pokazala potpunu potrošenost

11

početnog materijala. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao jedinjenje 61 kao bledožutu čvrstu supstancu (83 mg, 40 %).

<1>H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ (prisustvo rotamera), 8,86 (d, 0,5H, NHCO); 8,65 (d, 0,5H, NHCO), 8,11-8,05 (m, 1H, NHCO), 7,80 (d, 0,5H, tiazol), 7,78 (d, 0,5H, tiazol), 7,65 (d, 0,5H, tiazol), 7,63 (d, 0,5H, tiazol), 7,32 - 7,12 (m, 5H), 6,83 (d, J=8,3 Hz, 2H), 6,45 (d, J=8,3 Hz, 2H), 5,56 - 5,49 (m, 0,5 H), 5,42 - 5,35 (m, 0,5H), 4,78 (s, 2H, NH2), 4,74 - 4,46 (m, 2H), 4,01 - 0,66 (m, 57H).

HPLC (Xmost Shield C18, 3,5 µm, 4,6 x 50 mm; 3,5 ml/min, 40°C, 0 to 95 % MeCN u vodi (0,1 % TFA) tokom 2,25 minuta, a zatim 95 % MeCN tokom 0,5 minuta, Tr = 1,31 min (96,5 %, 220 nm).

m/z (Q-TOF ESI<+>) 890,5558 (2%, MH<+>, C49H76N7O6S zahteva 890,5572), 445,7834 (100 %, (MH2)<2+>, C49H77N7O6S zahteva 445,7823).

Jedinjenje 62

Metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat

[0511]

[0512] Jedinjenje 62 je dobijeno na isti način kao jedinjenje 61, korišćenjem karboksilne kiseline 61A (69 mg, 0,21 mmol, 1 ekv.), amina 3D (135 mg, 0,21 mmol, 1 ekv.), DIEA (75 µl, 0,43 mmol, 2 ekv.) i DECP (49 µl, 0,32 mmol, 1,5 ekv.). Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao jedinjenje 62 kao žućkastu čvrstu supstancu (82 mg, 45 %).

<1>H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ (prisustvo rotamera), 8,50 (d, J=8,3, 0,5H, NHCO); 8,27 (d, J=8,0, 0,5H, NHCO), 8,15-8,04 (m, 1H, NHCO), 7,27 - 7,13 (m, 5H), 6,86 - 6,79 (m, 2H), 6,48 - 6,42 (m, 2H), 4,78 (s, 2H, NH2), 4,74 - 4,44 (m, 3H), 4,01 - 3,72 (m, 1,5H), 3,66 (s, 1,5H, CO2Me), 3,63 (s, 1,5H, CO2Me), 3,57 - 0,65 (m, 55,5H).

HPLC (Xmost Shield C18, 3,5 µm, 4,6 x 50 mm; 3,5 ml/min, 40°C, 0 to 95 % MeCN u vodi (0,1 % TFA) tokom 2,25 minuta zatim 95 % MeCN tokom 0,5 minuta, Tr = 1,29 min (95,3 %, 220 nm).

m/z (Q-TOF ESI<+>) 865,5800 (2%, MH<+>, C48H77N6O8zahteva 865,5797), 433,2937 (100 %, (MH2)<2+>, C48H78N6O8zahteva 433,2935).

Jedinjenje 63

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin 2,2,2-trifluoroacetat

[0513]

[0514] Jedinjenje 62 (23 mg, 0,03 mmol) je rastvoreno u smesi vode (1 ml) i acetonitrila (1 ml). Piperidin (0,75 ml) je dodat i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 5 sati. TLC analiza je ukazala na potpunu potrošenost početnog materijala. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (SunFire Prep kolona C18 OBD, 5 µm, 19 x 150 mm; Mobilna faza: voda/MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 20 % do 40 % MeCN tokom 10 minuta, a zatim od 40 % do 100 % MeCN tokom 2 minuta; detektor UV Waters 2545 na 254 nm i 220 nm). Jedinjenje 63 je dobijeno kao beli talog (14 mg, 66 %).

<1>H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ (prisustvo rotamera), 12,7 (s(br), 1H, CO2H), 9,58 (m(br), 1H); 9,04 - 8,89 (m, 1H), 8,41 (d, 0,6H, NHCO), 8,15 (d, 0,4H, NHCO), 7,27 - 7,13 (m, 5H), 7,13 - 6,99 (m(br), 2H), 6,90 - 6,64 (s(br), 2H), 4,77 - 3,40 (m, 10H), 3,34 - 2,75 (m, 20H), 2,34 - 1,94 (m, 4H), 1,90 - 0,7 (m, 25H).

HPLC (Xmost Shield C18, 3,5 µm, 4,6 x 50 mm; 3,5 ml/min, 40°C, 0 do 95 % MeCN u vodi (0,1 % TFA) tokom 2,25 minuta zatim 95 % MeCN tokom 0,5 minuta, Tr = 1,24 min (100 %, 220 nm).

m/z (Q-TOF ESI<+>) 851,5641 (6%, MH<+>, C47H75N6O8zahteva 851,5641), 426,2854 (100 %, (MH2)<2+>, C47H76N6O8zahteva 426,2857).

Primer 15: Antiproliferativna aktivnost lekova

Metod:

[0515] Kultura ćelija. A549 (kancer pluća nemalih ćelija - ATCC CCL-185) i MDA-MB-231 (adenokarcinom dojke - ATCC HTB-26) ćelije su gajene u minimalnom esencijalnom medijumu Eagle (MEM) sa 5% fetalnim telećim serumom (FCS) i Dulbecco-ovom modifikovanom medijumu Eagle (DMEM) sa 10% FCS, respektivno. MCF7 (duktalni karcinom dojke - ATCC HTB-22) i SN-12C (karcinom bubrega - ATCC) ćelije su održavane u RPMI1640 medijumu (bez fenol crvenog za MCF7 ćelije) koji sadrži 10% FCS. Svi medijumi su obogaćeni fungizonom (1,25 µg/mL) i penicilin-streptomicinom (100 U / 100 µg/mL). Ćelije su gajene u standardnim uslovima u inkubatoru na 37°C, sa 5% CO2i 95% atmosferne vlažnosti.

[0516] Antiproliferativna aktivnost na 4 tumorske ćelijske linije. Antiproliferativna aktivnost izabranih lekova je ispitana primenom ATPlite testa proliferacije (Perkin Elmer, Villebon sur Yvette, France) na obuhvatnom panelu od 4 ćelijske linije. Ćelije su zasejane u ploče sa 96 udubljenja (10<3>ćelija/udubljenje za A549, 2·10<3>za MCF7, MDA-MB-231 i SN12C) 0. dana, u koncentraciji koja osigurava da ćelije ostanu u fazi logaritamskog rasta kroz ceo period tretmana lekom od 72 h. Posle perioda inkubacije od 24h, sve ćelije su tretirane serijskim razblaženjima testiranih jedinjenja (11 µL 10X rastvora u 1% DMSO - 6 udubljenja / razblaženje). Da bi se izbeglo adherovanje jedinjenja na nastavcima, nastavci su menjani između dva uzastopna razblaženja. Ćelije su zatim stavljene na 37°C, u inkubator sa 5% CO2. Dana 4, vijabilnost ćelija je procenjena određivanjem ATP oslobođenog iz vijabilnih ćelija. Broj vijabilnih ćelija je analiziran u poređenju sa brojem ćelija tretiranih rastvaračem. Vrednosti EC50su određene analizom fitovanja krive (nelinearan regresioni model sa sigmoidnim odgovorom na dozu, varijablilni koeficijent nagiba), izvedenom pomoću algoritma obezbeđenog u softveru GraphPad (GraphPad Software Inc., CA, USA).

Rezultati:

Različiti lekovi:

[0517] Razni lekovi su testirani da bi se odredila njihova antiproliferativna aktivnost na MDA-MB-231 ćelijskoj liniji, sledeći gore opisani metod. Merene aktivnosti su dale vrednosti EC50< 0,1µM.

[0518] Nekoliko sledećih primera, izabranih među gore prikazanim lekovima, ilustruju njihove potpuno izvanredne antiproliferativne osobine:

Primer 12: EC50= 5,80x10<-10>M; Primer 13: EC50= 7,95x10<-8>M; Primer 15: EC0= 1,70x10-5

<10>M; Primer 27: EC50= 1,20x10<-10>M.

Različite ćelijske linije:

[0519] Jedinjenje 15 je testirano na različitim ćelijskim linijama (A549, MDA-MB-231, MCF-7, SN12C) sledeći gore opisani metod. Merene aktivnosti su dale vrednosti EC50< 0,1µM na svim testiranim ćelijskim linijama.

Komparativni primeri:

[0520] Supstitucija na fenilnom prstenu (amino v. karboksil) je proučavana u komparativnim primerima niže, pokazavši poboljšanu antiproliferativnu aktivnost lekova prema pronalasku koji sadrže amino supstituent.

11

Primer 16: Sinteza grupe lek-linker

Jedinjenje E-11

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil (4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-diizopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-5,11-dimetil-6,9-diokso-2-oxa-5,8,11-triazatridekan-13-il)fenil)(metil)karbamat 2,2,2-trifluoroacetat

[0521]

Jedinjenje E-11-1: metil (S)-2-amino-5-ureidopentanoat hidrohlorid

[0522]

[0523] Acetil hlorid (10 mL) je dodat kap po kap u MeOH (120 mL) na 0°C uz mešanje. Posle 20 minuta, L-citrulin (10 g, 57 mmol, 1,00 ekv.) je dodat i smesa je grejana uz refluks preko noći. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom da bi dao 15 g (116 %) jedinjenja E-11-1 kao beli talog. Proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg sušenja.

Jedinjenje E-11-2: metil (S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanoat

[0524]

[0525] Jedinjenje E-11-1 (13 g, 57,6 mmol, 1,1 ekv.) je rastvoreno u DMF (140 mL) na 0°C u inertnoj atmosferi. Dodati su DIEA (30 mL, 173 mmol, 3,0 ekv.), hidroksibenzotriazol (HOBt - 10,59 g, 69,1 mmol, 1,2 ekv.) i Boc-L-valin hidroksisukcinimid estar (Boc-Val-OSu - 18,1 g, 57,6 mmol, 1,0 ekv.). Reakciona smesa je mućkana preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim je rastvarač uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (100 mL) i ekstrahovan dvaput DCM-om (150 mL). Organske faze su kombinovane, osušene preko

11

Na2SO4i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao 18,8 g (84 %) jedinjenja E-11-2 kao beli talog.

Jedinjenje E-11-3: (S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metil butanamido)-5-ureidopentanonska kiselina

[0526]

[0527] Jedinjenje E-11-2 (18,8 g, 48,4 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u MeOH (200 mL) na 0°C.

1M rastvor NaOH (72 mL, 72 mmol, 1,5 ekv.) je dodat i smesa je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi. MeOH je uklonjen pod sniženim pritiskom i preostali vodeni rastvor je zakišeljen 1M-nom HCl. Vodena faza je uparena do suva i ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao 18 g (99 %) jedinjenja E-11-3 kao beli talog.

Jedinjenje E-11-4: terc-butil ((S)-1-(((S)-1-((4-(hidroksimetil)fenil) amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat

[0528]

[0529] Jedinjenje E-11-3 (5g, 13,4 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u smesi suvog DCM (65 ml) i suvog MeOH (35 ml). Dodati su (4-aminofenil)metanol (1,81 g, 14,7 mmol, 1,1 ekv.) i N-etoksikarbonil-2-etoksi-1,2-dihidrokinolin (EEDQ - 6,60 g, 26,7 mmol, 2 ekv.) i smesa je mešana u mraku preko noći. Rastvarači su upareni pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao 5,2 g (73 %) jedinjenja E-11-4 kao zagasitobeli talog.

Jedinjenje E-11-5: terc-butil ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrophenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oksobutan-2-il)karbamat

[0530]

11

[0531] Jedinjenje E-11-4 (1,1 g, 2,29 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u suvom DMF (5 ml) na sobnoj temperaturi u inertnoj atmosferi. Bis(4-nitrofenil) karbonat (1,40 g, 4,59 mmol, 2 ekv.) je dodat, a zatim DIEA (600 µl, 3,44 mmol, 1,5 ekv.) i dobijeni žuti rastvor je mešan preko noći. DMF je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao 1,27 g (84 %) jedinjenja E-11-5 kao zagasitobeli talog.

Jedinjenje E-11-6: 4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil (4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sek-butil)-7,10-diizopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-5,11-dimetil-6,9-diokso-2-oksa-5,8,11-triazatridekan-13-il)fenil)(metil)karbamat 2,2,2-trifluoroacetat

[0532]

[0533] Karbonat E-11-5 (114 mg, 0,177 mmol, 1,2 ekv.) i anilin 11F (150 mg, 0,147 mmol, 1 ekv.) su rastvoreni u suvom DMF (4 mL). HOBt (38 mg, 0,295 mmol, 2 ekv.) i DIEA (54 µL, 0,295 mmol, 2 ekv.) su dodati i smesa je mešana tokom vikenda na sobnoj temperaturi. DMF je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu, eluiran DCM-om. Proizvod je ponovo prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje E-11-6 kao beli talog (89 mg, 39 %).

11

Jedinjenje E-11:

[0535] Jedinjenje E-11-6 (21 mg, 0,014 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u DCM (0,25 mL) i dodat je TFA (40 µL). Rastvor je mešan 2 sata na sobnoj temperaturi, posle čega je LC-MS analiza ukazala da je početni materijal potpuno potrošen. Smesa je kratko hlađena (kupatilo sa tečnim azotom) uz simultano dodavanje DMF (0,5 mL), a zatim DIEA (100 µL) da bi se neutralisao TFA. Hladno kupatilu je zatim sklonjeno i 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (4 mg, 0,012 mmol, 1 ekv.) je dodat. Smesa je mešana na sobnoj temperaturi 48 sati i proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje E-11 kao beli talog (11 mg, 54 %). m/z (Q-TOF MS ESI+) 1524,8282 (2 %, MNa<+>, C79H115N13NaO14S zahteva 1524,8299), 751,9283 (100 %, (MH2)<2+>, C79H117N13O14S zahteva 751,9276).

Jedinjenje E-12

Metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil) amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0536]

11

Jedinjenje E-12-1: terc-butil ((S)-3-metil-1-okso-1-(((S)-1-okso-1-((4-((((perfluorophenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)amino)-5-ureidopentan-2-il)amino)butan-2-il)karbamat

[0537]

[0538] Jedinjenje E-11-4 (670 mg, 1,26 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u suvom DMF (6 ml) na 0°C u inertnoj atmosferi. Bis(perfluorofenil) karbonat (991 mg, 2,51 mmol, 2 ekv.) je dodat, a zatim i DIEA (329 µl, 1,89 mmol, 1,5 ekv.), i dobijeni bezbojni rastvor je mešan 30 minuta na sobnoj temperaturi. DMF je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao 836 mg (96 %) jedinjenja E-12-1 kao zagasitobeli talog.

Jedinjenje E-12-2: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0539]

11

[0540] Anilin 12 (165 mg, 0,189 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoren u DMF (5 mL) na 0°C u inertnoj atmosferi. Karbonat E-12-1 (194 mg, 0,282 mmol, 1,5 ekv.), HOBt (51 mg, 0,375 mmol, 2 ekv.) i DIEA (66 µL, 0,375 mmol, 2 ekv.) su dodati i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 8 sati. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje E12-7 kao beli talog (247 mg, 77 %).

Jedinjenje E-12-3: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi) karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat bis(2,2,2-trifluoroacetat)

[0541]

12

[0542] Jedinjenje E-12-2 (5,6 mg, 4,04 µmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u TFA (100 µL). Posle 5 minuta, 2 ml vode je dodato i smesa je liofilizovana preko noći da bi dala jedinjenje E-12-3 kao zagasitobeli talog (5,6 mg, 98 %).

Jedinjenje E-12:

[0544] Jedinjenje E-12-3 (5,6 mg, 4 µmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u acetonitrilu (0,5 mL) i DIEA (5 µL, 7 ekv.) je dodat, a zatim i 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (2,5 mg, 8 µmol, 2 ekv.). Smesa je mešana 6 sati na sobnoj temperaturi. Posle kontrolisanja reakcije pomoću LC-MS, 200 µL vode je dodato i dobijeni rastvor je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje E-12 kao beli talog (4,6 mg, 70 %). m/z (Q-TOF MS ESI+) 739,4389 (100 %, (MH2)<2+>, C78H118N12O16zahteva 739,4389).

Jedinjenje E-13 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino )-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin 2,2,2-trifluoroacetat

Jedinjenje E-13-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin

[0546]

[0547] Jedinjenje E-12-2 (185 mg, 0,123 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u smesi vode (5 mL) i acetonitrila (5 mL) na sobnoj temperaturi. Piperidin (3,67 mL, 300 ekv.) je dodat i smesa je mešana 6 sati na sobnoj temperaturi. Rastvarači su upareni do suva pod sniženim pritiskom i ostatak je triturisan sa Et2O (60 mL). Talog je ispran dvaput pomoću Et2O (20 ml) i osušen na vakuumu da bi dao jedinjenje E-13-1 kao zagasitobeli talog (175 mg, 95 %).

12

Jedinjenje E-13-2: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin bis (2,2,2-trifluoroacetat)

[0548]

[0549] Jedinjenje E-13-1 (175 mg, 0,128 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u TFA (200 µL). Posle 5 minuta, dodati su voda (1 mL) i acetonitril (1 mL) i rastvor je liofilizovan preko noći da bi dao jedinjenje E-13-2 kao zagasitobeli talog (180 mg, 87 %).

Jedinjenje E-13: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil) pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin, 2,2,2-trifluoroacetat

[0550]

[0551] Jedinjenje E-13-2 (80 mg, 0,058 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u smesa acetonitrila (1,5 mL) i DMF (0,4 mL). DIEA (50 µL, 0,289 mmol, 5 ekv.) je dodat, a zatim i 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (36 mg, 0,116 mmol, 2 ekv.). Smesa je mešana 3 sata na sobnoj temperaturi. Posle kontrolisanja reakcije pomoću LC-MS, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje E-13 kao beli talog (32 mg, 35 %).

m/z (Q-TOF MS ESI-) 1461,8336 (100 %, (M-H)-, C77H113N12O16zahteva 1461,8403). m/z (Q-TOF MS ESI+) 1463,8565 (2 %, MH<+>, C77H115N12O16zahteva 1463,8549), 732,4317 (100 %, (MH2)<2+>, C77H116N12O16zahteva 732,4311).

Jedinjenje E-15

Metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0552]

12

Jedinjenje E-15-1: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi)karbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0553]

[0554] Jedinjenje E-15-1 je dobijeno po istom metodu kao jedinjenje E-11-6, korišćenjem karbonata E-11-5 (28 mg, 0,044 mmol, 1 ekv.), anilina 15 (42 mg, 0,044 mmol, 1 ekv.), HOBt (3 mg, 0,022 mmol, 0,5 ekv.) i DIEA (15 µL, 0,087 mmol, 2 ekv.) u DMF (2 mL). Jedinjenje E-15-1 je izolovano kao beli talog (8,2 mg, 13 %).

Jedinjenje E-15-2: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oksi) karbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat bis(2,2,2-trifluoroacetat)

12

[0556] Jedinjenje E-15-1 (8,2 mg, 5,58 µmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u TFA (200 µL). Posle 5 minuta, voda (1 mL) je dodata i rastvor je liofilizovan preko noći da bi dao jedinjenje E-15-8 kao beli talog (7,6 mg, 99 %).

Jedinjenje E-15:

[0557]

12

[0558] Jedinjenje E-15 je dobijeno po istom metodu kao jedinjenje E-12, korišćenjem amina E-15-2 (7,6 mg, 5,55 µmol, 1 ekv.), 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (2 mg, 6,65 µmol, 1,2 ekv.) i DIEA (5 µL, 0,028 mmol, 5 ekv.) u acetonitrilu (0,5 mL). Jedinjenje E-15 je izolovano kao beli talog (4,2 mg, 48 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1471,8169 (2 %, MNa<+>, C76H112N12NaO16zahteva 1471,8211), 725,4223 (100 %, (MH2)<2+>, C76H114N12O16zahteva 725,4232), 483,9482 (10 %, (MH3)<3+>, C76H115N12O16zahteva 483,9513).

Jedinjenje F-13

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin 2,2,2-trifluoroacetat

[0559]

Jedinjenje F-13-1: benzil N-(4-((terc-butoksikarbonil)(metil)amino)fenetil)-N-metil-L-valinat

[0560]

[0561] Jedinjenje 11C (250 mg, 0,567 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u THF (10 ml), a zatim je dodat NaH (60 % suspenzija u mineralnom ulju, 68 mg, 1,702 mmol, 3 ekv.). Smesa je mešana 5 minuta pre dodavanja jodometana (106 µL, 1,702 mmol, 3 ekv.). Reakcija je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi pre gašenja vodom i razdvajanja EtOAc (100 mL) i vode (50 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4i uparena do suva da bi dala jedinjenje F-13-1 kao žuto ulje (250 mg, 97 %), koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.

Jedinjenje F-13-2: benzil N-metil-N-(4-(metilamino)fenetil)-L-valinat

12

[0563] Boc-zaštićen anilin F-13-1 (250 mg, 0,550 mmol, 1 eq) je rastvoren u MeOH (5 mL), a zatim je dodat 1 mL komercijalno dostupnog rastvora HCl u<i>PrOH (5 - 6 M). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 2 sata pre uparavanja do suva pod sniženim pritiskom. Dobijeno žuto ulje je triturisano pomoću Et2O da bi dalo jedinjenje F-13-2 kao žuti talog (202 mg, 94 %).

Jedinjenje F-13-3: benzil N-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)-N-metil-L-valinat

[0564]

[0565] Kiselina E-11-3 (190 mg, 0,508 mmol, 1,5 ekv.) je rastvorena u suvom DMF (1 ml), a zatim su dodati DIEA (118 µL, 0,677 mmol, 2 ekv.), benzotriazol-1-iloksitripirolidinofosfonium heksafluorofosfat (PyBOP - 264 mg, 0,508 mmol, 1,5 ekv.) i anilin F-13-2 (120 mg, 0,339 mmol, 1 ekv.). Smesa je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i rastvarači su upareni pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje F-13-3 kao beli talog (140 mg, 45 %).

Jedinjenje F-13-4: N-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)-N-metil-L-valin

[0566]

12

[0567] Jedinjenje F-13-3 (116 mg, 0,163 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u MeOH (5 ml) u prisustvu Pd/C 10% (30 mg) i hidrogenizovano 2 sata na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi dao 110 mg (99 %) jedinjenja F-13-4 kao bež talog.

Jedinjenje F-13-5: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0568]

[0569] Amin 3D (89 mg, 0,140 mmol, 1 ekv.) i kiselina F-13-4 (145 mg, 0,210 mmol, 1,5 ekv.) su rastvoreni u suvom DMF (4 mL), i dodati su PyBOP (109 mg, 0,210 mmol, 1,5 ekv.) i DIEA (73 µL, 0,420 mmol, 3 ekv.). Smesa je mešana 1 sat na sobnoj temperaturi i rastvarač je uparen. Ostatak je razdvojen između EtOAc i vode i organska faza je osušena preko MgSO4, profiltrirana i uparena pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm;

1

eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje F-13-5 kao beli talog (140 mg, 73 %).

Jedinjenje F-13-6: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin 2,2,2-trifluoroacetat

[0570]

[0571] Jedinjenje F-13-5 (140 mg, 0,104 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u smesi vode (4 mL), acetonitrila (4 mL) i piperidina (2 mL) i mešano na sobnoj temperaturi 4 sata. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovani da bi dale jedinjenje F-13-6 kao beli talog (115 mg, 83 %).

Jedinjenje F-13:

[0572]

1 1

[0573] Jedinjenje F-13 je dobijeno istim metodom kao jedinjenje E-11, korišćenjem Boczaštićenog amina F-13-6 (55 mg, 0,041 mmol, 1,0 ekv.) u DCM (0,5 mL) i TFA (100 µL, 30 ekv.), iza čega je sledilo razblaženje DMF-om (1 mL), gašenje (DIEA (320 µL, 45 eq), a zatim reakcija sa 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoatom (15 mg, 0,049 mmol, 1,2 ekv.). Posle prečišćavanja preparativnom HPLC i liofilizacije, jedinjenje F-13 je dobijeno kao beli talog (14 mg, 24 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1314,8067 (2 %, MH<+>, C69H108N11O14zahteva 1314,8072), 657,9067 (100 %, (MH2)<2+>, C69H109N11O14zahteva 657,9072).

Jedinjenje F-61

N-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-diizopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-5,11-dimetil-6,9-diokso-2-oxa-5,8,11-triazatridekan-13-il)fenil)amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamid 2,2,2-trifluoroacetat

[0574]

1 2

Jedinjenje F-61-1: benzil N-(4-aminofenetil)-N-metil-L-valinat dihidrohlorid

[0575]

[0576] Jedinjenje 11C (1,0 g, 2,27 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u 8 mL komercijalno dostupnog rastvora HCl u<i>PrOH (5 - 6 M). Smesa je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi pre uparavanja do suva pod sniženim pritiskom. Ostatak je triturisan dvaput pomoću Et2O (30 mL) i osušen na vakuumu da bi dao jedinjenje F-61-1 kao beli talog (916 mg, 98 %).

Jedinjenje F-61-2: benzil N-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)-N-metil-L-valinat

[0577]

[0578] Kiselina E-11-3 (769 mg, 2,05 mmol, 1,5 ekv.) je rastvorena u suvom DMF (2,5 ml), a zatim su dodati DIEA (957 µL, 5,48 mmol, 4 ekv.) i PyBOP (1,07 g, 2,05 mmol, 1,5 ekv.). Anilin F-61-1 (566 mg, 1,369 mmol, 1 ekv.) je dodat i smesa je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarači su upareni pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH) da bi dao 969 mg (102 %) jedinjenja F-61-2 kao beli talog.

Jedinjenje F-61-3: N-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)-N-metil-L-valin

1

[0580] Jedinjenje F-61-2 (969 mg, 1,28 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u MeOH (20 ml) u prisustvu Pd/C 10% (270 mg) i hidrogenizovano 3 sata na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku. Reakcioni medijum je profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen na silika gelu (DCM/MeOH/AcOH) da bi dao 520 mg (67 %) jedinjenja F-61-3 kao beli talog.

Jedinjenje F-61-4: terc-butil ((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-diizopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-5,11-dimetil-6,9-diokso-2-oxa-5,8,11-triazatridekan-13-il)fenil)amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat 2,2,2-trifluoroacetat

[0581]

1 4

[0582] Kiselina F-61-3 (67,5 mg, 0,111 mmol, 1,5 ekv.) je rastvorena u suvom DMF (2 mL) i dodati su DECP (17 µL, 0,111 mmol, 1,5 ekv.) i DIEA (39 µL, 0,223 mmol, 3 ekv.). Posle mešanja 15 minuta na sobnoj temperaturi, amin 1Y (50 mg, 0,074 mmol, 1 ekv.) je dodat i rastvor je mešan preko noći. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje F61-4 kao beli talog (28 mg, 28 %).

Jedinjenje F-61-5: (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sekbutil)-7,10-diizopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-5,11-dimetil-6,9-diokso-2-oksa-5,8,11-triazatridekan-13-il)fenil)-5-ureidopentanamid bis(2,2,2-trifluoroacetat)

[0583]

[0584] Jedinjenje F-61-4 (28 mg, 0,021 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u TFA (200 µL). Posle 5 minuta, dodati su voda (2 mL) i acetonitril (0,5 mL) i rastvor je liofilizovan preko noći da bi dao jedinjenje F-61-5 kao bezbojno ulje (38 mg, 134 %).

Jedinjenje F-61:

[0585]

1

[0586] Jedinjenje F-61-5 (28,3 mg, 0,020 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u acetonitrilu (0,5 mL), iza čega su sledili 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (9 mg, 0,029 µmοl, 1,4 ekv.) i DIEA (25 µL, 0,143 mmol, 7 ekv.). Smesa je mešana 4,5 sata, posle kog vremena je HPLC analiza pokazala prisustvo početnog materijala, ali potpunu potrošenost sukcinimida. Zato je dodat je dodatan 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (3 mg, 0,01 µmol, 0,5 ekv.) i reakcija je mešana 1,5 sat. HPLC analiza je pokazala potpunu potrošenost početnog materijala. Rastvarač je uparen do suva i ostatak je triturisan dvaput smesom EtOAc/Et2O (80/20) da bi dao jedinjenje F-61 kao zagasitobeli talog (19,4 mg, 70 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1361,7725 (2 %, MNa<+>, C70H106N12NaO12S zahteva 1361,7666), 670,3961 (100 %, (MH2)<2+>, C70H108N12O12S zahteva 670,3960).

Jedinjenje F-62:

Metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0587]

1

Jedinjenje F-62-1: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0588]

[0589] Jedinjenje F-62-1 je dobijeno na sličan način kao jedinjenje F-61-4, iz amina 3D (100 mg, 0,158 mmol, 0,9 ekv.), kiseline F-61-3 (108 mg, 0,178 mmol, 1 ekv.), DECP (41 µL, 0,267 mmol, 1,5 ekv.) i DIEA (93 µL, 0,534 mmol, 3 ekv.) u DMF (2 mL). Posle prečišćavanja preparativnom HPLC, jedinjenje F-62-1 je dobijeno kao beli talog (93 mg, 39 %).

Jedinjenje F-62-2: metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil) amino)-3-metilbutanamido)-

1

N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil) pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat bis(2,2,2-trifluoroacetat)

[0590]

[0591] Jedinjenje F-62-1 (35 mg, 0,026 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u TFA (200 µL). Posle 10 minuta, dodati su voda (2 mL) i acetonitril (0,5 mL) i rastvor je liofilizovan preko noći da bi dao jedinjenje F-62-2 kao beli talog (34 mg, 105 %).

Jedinjenje F-62:

[0592]

1

[0593] Amin F-62-2 (34 mg, 5,55 µmol, 1 ekv.) je rastvoren u acetonitrilu (3 mL). Dodati su DIEA (5 µL, 0,028 mmol, 5 ekv.) i 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (2 mg, 6,65 µmol, 1,2 ekv.). HPLC analiza je pokazala potpunu potrošenost početnog materijala. Rastvarač je uparen do suva i ostatak je triturisan smesom EtOAc/Et2O (80/20). Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje F-62 kao beli talog (5,5 mg, 13 %)

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1336,7859 (2 %, MNa<+>, C69H107N11NaO14zahteva 1336,7891), 657,9073 (100 %, (MH2)<2+>, C69H109N11O14zahteva 657,9072).

Jedinjenje F-63:

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin 2,2,2-trifluoroacetat

[0594]

1

Jedinjenje F-63-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin

[0595]

[0596] Jedinjenje F-62-1 (157 mg, 0,118 mmol, 1 ekv.) je rastvoreno u smesi vode (4,5 mL), acetonitrila (4,5 mL) i piperidina (3,5 mL) i mešano na sobnoj temperaturi 5 sati. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i ostatak je triturisan Et2O (60 mL). Talog je pokupljen filtracijom i ispran dvaput pomoću Et2O (10 mL) da bi dao jedinjenje F-63-1 kao zagasitobeli talog (153 mg, 100 %).

14

Jedinjenje F-63-2: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil) pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin bis 2,2,2-trifluoroacetat

[0597]

[0598] Jedinjenje F-63-1 (153 mg, 0,127 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoreno u TFA (200 µL). Posle 10 minuta, dodati su voda (2 mL) i acetonitril (0,5 mL) i rastvor je liofilizovan preko noći da bi dao jedinjenje F-63-2 kao beli talog (34 mg, 105 %).

Jedinjenje F-63:

[0599]

[0600] Amin F-63-2 (100 mg, 0,082 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u smesi acetonitrila (2 mL) i DMF (0,5 mL) i dodati su 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (45 mg, 0,147 mmol, 1,8 ekv.) i DIEA (71 µL, 0,409 mmol, 5 ekv.). Posle mešanja na sobnoj temperaturi 4,5 sata, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje F-63 kao beli talog (42 mg, 36 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1300,7901 (2 %, MH<+>, C68H106N11O14zahteva 1300,7915), 650,8990 (100 %, (MH2)<2+>, C68H107N11O14zahteva 650,8994).

Jedinjenje G-12

Metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-metilheksanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0601]

Jedinjenje G-12-1: benzil N-(4-aminofenetil)-N-metil-L-valinat dihidrohlorid

[0602]

[0603] 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanonska kiselina (200 mg, 0,947 mmol, 1 ekv.) je rastvorena u oksalil hloridu (3 mL). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 5 sati pre uparavanja do suva pod sniženim pritiskom. Jedinjenje G-12-1 je dobijeno kao bež talog (217 mg, 100 %) i korišćen u sledećem koraku bez prečišćavanja.

Jedinjenje G-12:

[0604]

14

[0605] Anilin 12 (40 mg, 0,045 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u suvom DCM (1 mL) na 0°C i DIEA (8 µL, 0,045 mmol, 1 ekv.) je dodat. Posle mešanja 30 minuta, rastvor jedinjenja G-12-1 (10 mg, 0,45 mmol, 1 ekv.) u suvom DCM (1 mL) je uveden i reakcija je mešana 1 sat na 0°C. Smesa je razblažena DCM-om (25 ml) i oprana dvaput vodom (20 mL), jednom slanim rastvorom (10 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4, profiltrirana i uparena pod sniženim pritiskom da bi dala sirovi proizvod kao svetlobraon talog (54 mg). Ovaj je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (DCM/MeOH), a zatim preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izolovani proizvod je liofilizovan da bi dao beli talog (23 mg), koji je ponovo prečišćen preparativnom HPLC i izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje G-12 kao beli talog (9 mg, 16 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1094,6543 (20 %, MNa<+>, C59H89N7NaO11zahteva 1094,6512), 1072,6722 (16 %, MH<+>, C59H90N7O11zahteva 1072,6693), 536,8358 (100 %, (MH2)<2+>, C59H91N7O11zahteva 536,8383).

Jedinjenje G-13

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-metilheksanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanin 2,2,2-trifluoroacetat

[0606]

Jedinjenje G-13:

[0607]

[0608] Anilin 13 (15 mg, 0,015 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u suvom DCM (1,5 mL) na 0°C i dodat je DIEA (8 µL, 0,046 mmol, 3 ekv.). Rastvor jedinjenja G-12-1 (3,5 mg, 0,046 mmol, 1 ekv.) u suvom DCM (0,5 mL) je uveden i reakcija je mešana 1,5 sat na 0°C. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje G-13 kao beli talog (11,4 mg, 62 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1058,6510 (30 %, MH<+>, C58H88N7O11zahteva 1058,6536), 529,8285 (100 %, (MH2)<2+>, C58H89N7O11zahteva 529,8305).

Jedinjenje G-15

metil ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninat 2,2,2-trifluoroacetat

[0609]

14

Jedinjenje G-15:

[0610]

[0611] Anilin 15 (40 mg, 0,047 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u suvom DCM (2 mL) na 0°C i dodat je DIEA (10 µL, 0,056 mmol, 1,2 ekv.). Rastvor jedinjenja G-12-1 (108 mg, 0,47 mmol, 10 ekv.) u suvom DCM (1 mL) je uveden i reakcija je mešana 1,5 sat na 0°C. Smesa je razblažena DCM-om (10 ml) i oprana dvaput vodom (5 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, profiltrirana i uparena pod sniženim pritiskom da bi dala sirovi proizvod kao bež talog. Ovaj je prečišćen preparativnom HPLC (Waters 600E, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 µm, 19 x 100 mm; eluirajuća faza: voda / MeCN puferisana pomoću 0,1 % TFA; gradijent od 5 % do 100 % MeCN tokom 15 minuta; Waters 2487 UV detektor na 220 nm). Izabrane frakcije su kombinovane i liofilizovane da bi dale jedinjenje G15 kao beli talog (27 mg, 50 %).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1066,6517 (2 %, MNa<+>, C57H85N7NaO11zahteva 1066,6199), 522,8224 (100 %, (MH2)<2+>, C57H87N7O11zahteva 522,8226).

Primer 17: sinteza ADC, prečišćavanje i karakterizacija

[0612] Procedura opisana niže važi za himernu i humanizovanu formu IgG1. Mora se razumeti da za bilo koje druge forme, kao što je IgG2, IgG4, itd., stručnjak bi bio u stanju da adapatira ovu proceduru koristeći opšte znanje.

[0613] Antitela (1-5 mg/ml) su delimično redukovana Tris(2-karboksietil)fosfin hidrohloridom (TCEP) u 10 mM boratnom puferu pH 8,4 koji sadrži 150 mM NaCl i 2 mM EDTA 2 h na 37°C. Tipično, 2,5-3 molarna ekvalenta TCEP se koriste za ciljanje odnosa leka prema antitelu (DAR) od oko 4, respektivno. Delimično redukovanje antitela je potvrđeno SDS-PAGE analizom u nereduktivnim uslovima. Pre kuplovanja linker-lek sa oslobođenim međulančanim cisteinskim ostacima, redukciona smesa je ostavljena da se ohladi do sobne temperature. Koncentracija antitela je zatim podešena na 1 mg/ml 10 mM boratnim puferom

14

pH 8,4 koji sadrži 150 mM NaCl i 2 mM EDTA i 5-o molarni višak leka u odnosu na antitelo je dodat iz 10 mM rastvora u dimetil sulfoksidu (DMSO). Konačna koncentracija DMSO je podešena na 10% da bi se održala rastvorljivost leka u vodenom medijumu tokom kuplovanja. Reakcija je vršena 1 h na sobnoj temperaturi. Višak leka je neutralisan dodavanjem 1,5 mola N-acetilcisteina po molu leka i inkubacijom 1 h na sobnoj temperaturi. Posle dijalze prema 25 mM His puferu, pH 6,5, koji sadrži 150 mM NaCl, preko noći na 4°C, konjugati antitelo-lek su prečišćeni primenom metoda poznatih stručnjacima na osnovu komercijalnih hromatografskih kolona i ultrafiltracionih jedinica. Prvo, agregati nekuplovanog leka i ADC su eliminisani ekskluzionom hromatografijom (SEC) na S200 (GE Life Sciences) ili TSK G3000 SW (Tosoh) koloni. Prečišćeni monomeri ADC su zatim koncentrovani do 2-3 mg/ml ultrafiltracijom na filtracionim jedinicama od 30 ili 50 kDa MWCO ili afinitetnom hromatografijom na Proteinu A. Prečišćeni ADC su čuvani na 4°C posle sterilne filtracije na filtru od 0,2 µm. Dalje su analizirani pomoću SDS-PAGE u reduktivnim i nereduktivnim uslovima da bi se potvrdila konjugacija leka i pomoću SEC na analitičkim S200 ili TSK G3000 SWXL kolonama da bi se odredio sadržaj monomera i agregiranih formi. Koncentracije proteina su određene testom sa bicinhoninskom kiselinom (BCA) sa IgG kao standardom. DAR je procenjen za svaki prečišćen ADC pomoću HIC i LC-MS. Tipično, sadržaj agregiranih formi je niži od 5% i DAR je između 3,5 i 5.

Primer 18: Procena citotoksičnosti IGF-1R antitela kuplovanih sa različitim lekovima

18.1 Procena himernih antitela na MCF-7 ćelijama

[0614] Pokazano je da se pet anti-IGF-1R antitela brzo internalizuju u lizozomima i da imaju niži kapacitet vezivanja u kiselim sredinama. U tom smislu, ta Ab imaju sve osobine da se koriste za ADC. Prema tome pet himernih anti-IGF-1R antitela je kuplovano sa tri različita jedinjenja (G-13; E-13 i F-63). Odnos lek - antitelo tih ADC je oko 4. Da bi se procenila nespecifična citotoksičnost, irelevantno himerno antitelo c9G4 je takođe kuplovano sa tim jedinjenjima u istom DAR. MCF-7 ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama svakog od ADC na 37°C 6 dana u kompletnom medijumu za kulture. Vijabilnost ćelija je procenjena primenom luminescentnog testa ćelijske vijabilnosti (CellTiter-Glo, Promega). Luminescentan signal je očitavan pomoću Mithras čitača ploča (Berthold Technologies). Irelevantno himerno antitelo c9G4 kuplovano sa E-13, G-13 ili F-63 je ispoljilo nikakvo ili skromno citotoksično dejstvo na MCF-7 ćelije (Slika 21). Nasuprot tome, dodavanje svih drugih ADC dobijenih posle kuplovanja anti-IGF-1R antitela sa E-13, G-13 ili F-63 je dramatično smanjilo vijabilnost MCF-7 ćelija.

18.2 Procena himernog antitela na normalnim ćelijama

[0615] Nivoi ekspresije IGF-1R su procenjeni na primarnim normalnim ćelijama (PromoCell GmbH) korišćenjem c208F2 mAb. U tu svrhu, ćelije (0,5x10<6>ćelije/ml) su inkubirane 20 min. sa 10 µg/ml c208F2 antitela na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Zatim su oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 još 20 minuta na 4°C u mraku pre nego što su oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje antitela na IGF-1R je odmah izvedeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). Nivo ekspresije (Bmax) je nizak u normalnim ćelijama (Tabela 14) u poređenju sa ekspresijom IGF-1R u MCF-7 ćelijama (videti Primer 2, Tabela 8).

14

T l 14

[0616] Citotoksičnost ADC c208F2-G-13 je procenjena na normalnim ćelijama. Ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama c208F2-G-13 na 37°C 6 dana u kompletnom medijumu za kulture. Vijabilnost ćelija je procenjena primenom luminescentnog testa ćelijske vijabilnosti (CellTiter-Glo, Promega). Luminescentan signal je očitavan pomoću Mithras čitača ploča (Berthold Technologies). Nije nađena nikakva ozbiljna citotoksičnost za HBSMC, HPMEC, HAoEC i HREpC (Slika 25). Manja ćelijska toksičnost je izmerena za HUC samo pri visokim koncentracijama c208F2-G-13.

18.3 Procena humanizovane varijante hz208F2

[0617] Šesnaest humanizovanih varijanti 208F2 je kuplovano sa jedinjenjem G-13. Odnos lek - antitelo tih ADCs je oko 4. Da bi se procenila nespecifična citotoksičnost, irelevantno himerno antitelo c9G4 je takođe kuplovano sa tim jedinjenjima u istom DAR. Himerno antitelo c208F2 je takođe kuplovano sa G-13. MCF-7 ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama svakog ADC na 37°C 6 dana u kompletnom medijumu za kulture. Vijabilnost ćelija je procenjena primenom luminescentnog testa ćelijske vijabilnosti (CellTiter-Glo, Promega). Luminescentan signal je očitavan pomoću Mithras čitača ploča (Berthold Technologies). Irelevantno himerno antitelo c9G4 je kuplovano sa G-13 je ispoljilo nikakvo ili skromno citotoksično dejstvo na MCF-7 ćelije (Slika 26). Nasuprot tome, dodavanje svih drugih ADC dobijenih posle kuplovanja anti-IGF-1R antitela sa G-13 je dramatično smanjilo vijabilnost MCF-7 ćelija. Sposobnost šesnaest humanizovanih varijanti da indukuju citotoksičnost je bar ekvalentna ili čak veća od one izmerene kod himerne forme c208F2-G-13, kao što je prikazano u Tabeli 15 i ilustrovano sa jednom humanizovanom varijantom na Slici 26.

Tabela 15

14

Primer 19: In vivo aktivnost c208F2 antitela konjugovanog sa E-13, G-13 ili F-63 jedinjenjem u modelu ksenografta MCF-7

[0618] Da bi se potvrdilo da se in vitro efikasnost c208F2 kuplovanih sa G-13, E-13 ili F-63 jedinjenjem može da se prevede in vivo, ona su testirana u modelu ksenografta MCF-7.

[0619] Sve procedure sa životinjama su izvedene prema smernicama 2010/63/UE direktive o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe. Protokol je odobren od strane Etičkog kommiteta za životinja instituta Pierre Fabre. Pet miliona MCF-7 ćelija je subkutano injektirano u 7 nedelja stare Swiss/nude miševe. Pre ubrizgavanja ćelija, estrogenske kuglice (Innovative Research of America) su implantirane u levi bok miševa da bi oslobađale estrogene neophodne za in vivo rast MCF-7 tumora.

[0620] Dvadeset dana posle implantacije MCF-7 ćelija, kad su tumori dostigli prosečnu veličinu od 120-150 mm<3>, životinje su podeljene u grupe od po 5 miševa prema veličini i aspektu tumora. Različiti tretmani su inokulisani intraperitonealnim injekcijama. Zdravstveno stanje životinja je praćeno svakodnevno. Zapremina tumora je merena dvaput nedeljno elektronskim kaliperom do kraja studije. Zapremina tumora je izračunata po sledećoj formuli: π/6 x dužina x širina x visina. Toksičnost je procenjivana praćenjem težine životinja tri puta nedeljno. Statističke analize su rađene za svaku meru pomoću Mann-Whitney testa. Sva jedinjenja su ubrizgana intraperitonealno (i.p.). U ovom primeru, anti-tumorska aktivnost c208F2 mAb kuplovanih sa E-13, F-13 ili F-63 u DAR oko 4 je procenjena posle 2 injekcije u dozi od 7 mg/kg dana D20 i D27 (Slika 22A, 22B i 22C). Paralelno, "pokrivene" (capped) funkcionalne grupe leka E-13, F-13 i F-63 su ubrizgane u ekvalentnoj dozi onoj koja odgovara 7 mg/kg c208F2-E-13, c208F2-F-13 i c208F2-F-63 DAR oko 4.

[0621] Injekcija c208-E-13 (Slika 22A), c208F2-G-13 (Slika 22B) ili c208F2-F-63 (Slika 22C) je značajno inhibirala, pa čak i indukovala potpunu regresiju rasta tumora (p <0,05 prema odgovarajućem pokrivenom leku). Nije bila primećena statistička razlika u aktivnostima c208-E-13, c208F2-G-13 i c208F2-F-63. Pokriveni lekovi nisu imali nikakav efekat na rast tumora MCF-7 (p >0,05 prema kontrolnoj grupi).

[0622] Drugi skup eksperimenata je izveden sa c208F2 kuplovanim sa bilo E-13, bilo G-13 i sa irelevantnim antitelom c9G4 kuplovanim sa bilo E-13, bilo G-13 u modelima ksenografta MCF-7 opisanim prethodno. Miševima su ubrizgane i.p. sa 7 mg/kg svakog od ADC dana D20 i D27 (Slike 23A i 23B).

[0623] Injekcija i c9G4-E-13 i c9G4-F-13 je umereno i prolazno uticala na rast ksenograftskih MCF-7 tumora. Međutim, ovaj drugi eksperiment je potvrdio da injekcije bilo c208-E-13, bilo c208F2-G-13 indukuju potpuno povlačenje tumora, jer D43 pokazuje visoku anti-tumorsku aktivnost tih ADC.

14

Primer 20: In vivo aktivnost hz208F2 antitela konjugovanih sa jedinjenjem G-13 u 3<+>modelu ksenografta MCF-7

[0624] Humanizovane forme 208F2 kuplovane sa jedinjenjem G-13 su procenjene in vivo, u modelu ksenografta MCF-7.

[0625] Sve procedure sa životinjama su izvedene prema smernicama 2010/63/UE direktive o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe. Protokol je odobren od strane Etičkog kommiteta za životinja instituta Pierre Fabre. Pet miliona MCF-7 ćelija je subkutano injektirano u 7 nedelja stare Swiss/nude miševe. Pre ubrizgavanja ćelija, estrogenske kuglice (Innovative Research of America) su implantirane u levi bok miševa da bi oslobađale estrogene neophodne za in vivo rast MCF-7 tumora.

[0626] Dvadeset dana posle implantacije MCF-7 ćelija, kad su tumori dostigli prosečnu veličinu od 120-150 mm<3>, životinje su podeljene u grupe od po 6 miševa prema veličini i aspektu tumora. Različiti tretmani su inokulisani intraperitonealnim injekcijama prema protokolu 4 injekcije; jedna injekcija na svaka četiri dana (Q4d4). Zdravstveno stanje životinja je praćeno svakodnevno. Zapremina tumora je merena dvaput nedeljno elektronskim kaliperom do kraja studije. Zapremina tumora je izračunata po sledećoj formuli: π/6 x dužina x širina x visina. Toksičnost je procenjivana praćenjem težine životinja tri puta nedeljno. Statističke analize su rađene za svaku meru pomoću Mann-Whitney testa. Sva jedinjenja su ubrizgana intraperitonealno (i.p.). U ovom primeru, anti-tumorska aktivnost c208F2 mAb kuplovanih sa jedinjenjem G-13 je poređena sa različitim humanizovanim formama takođe kuplovanim sa G-13 (Slika 27). Testirane humanizovane forme su opisane u Tabeli 16 niže:

Tabela 16

[0627] Injekcija bilo c208-G-13, bilo 208F2 humanizovane forme je značajno inhibirala i pa čak i indukovala potpunu regresiju rasta tumora on (p <0,05 prema odgovarajućoj kontroli). Nisu bile primećene statističke razlike u aktivnostima c208F2-G-13 i testiranih humanizovanih formi.

[0628] Drugi skup eksperimenata je izveden bilo sa c208F2, bilo sa hz208F2-4, kuplovanim sa G-13 u modelima ksenografta MCF-7 opisanim prethodno (Slike 28A i 28B respektivno).. Miševima su ubrizgane i.p. sa 3 mg/kg na svaka četiri dana za 4 injekcije (Q4d4) ili samo jednom.

[0629] Ista velika anti-tumorska aktivnost je viđena kad je ADC injektiran četiri puta kao i samo jednom u modelu ksenografta MCF.

Primer 21: In vivo aktivnost 208F2 antitela konjugovanog sa jedinjenjima G-13 ili E-13 u 2<+>CaOV-3 modelu ksenografta

1

[0630] Antitumorska aktivnost je proučavana i na tumoru koji eksprimira 2<+>, model ksenografta CaOV-3 koji je ćelijska linija karcinoma jajnika. Za taj predlog, miševima je subkutano injektirano dana D0 po 7x10<6>ćelija. Kad su tumouri dostigli približno 120 mm<3>(19 dana posle injekcije tumorskih ćelija), životinje su podeljene u 5 grupa od po 5 miševa sa uporedljivim veličinama tumora i tretirane intraperitonealno pomoću c208F2 kuplovanog sa bilo E-13, bilo G-13 i pomoću irelevantnog antitelom c9G4 kuplovanog sa bilo E-13, bilo G-13. Miševima su ubrizgane i.p. sa po 3 mg/kg za ciklus od 6 injekcija; na svaka četiri dana po jedna. Praćena je brzina rasta ksenografta kod miševa. Zapremina tumora je izračunata po sledećoj formuli: π/6 x dužina x širina x visina.

[0631] U poređenju sa c9G4-E-13, koji su umereno i prolazno indukovali usporavanje rasta, injekcija c9G4-G-13 nije uticala na rast CaOV-3 ksenograftskih tumora. U međuvremenu, injekcije bilo c208F2-E-13, bilo c208F2-G-13, su indukovale 95% i 77%, respektivno, inhibicije rasta tumora 50. dana (Slike 29A i 29B).

1 1

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

�

1

�

�

1

�

11

12

�

��

1

�

�

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

�

1

11

12

1

14

1

1

1

1

�

2

21

22

2

24

�

�

�

�

�

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

�

21

22

�

��

2

2

�

�

2

��

��

24

24

��

��

24

�

21

22

�

��

2

2

�

�

Claims (25)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Konjugat antitelo-lek sledeće formule (I): Ab-(L-D)n(I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde je Ab antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sposobno za vezivanje humanog IGF-1R, gde navedeno antitelo sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.1, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.4, 5 i 6; L je linker; D je funkcionalna grupa leka sledeće formule (II):

   gde: je R2COOH, COOCH3ili tiazolil; R3je H ili (C1-C6)alkil; R9je H ili (C1-C6)alkil; m je ceo broj između 1 i 8; talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L i n je 1 do 12.
2. 2. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde je Ab odabrano od: a) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11; b) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10, 5 i 11; c) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7,2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12 i d) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 8, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11. 2
3. 3. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1 ili 2, gde je Ab odabrano od: a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 13 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11; b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 14 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10,5 i 11; c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 15 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12; d) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 16 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i e) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 17 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12.
4. 4. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1 ili 2, gde je Ab odabrano od: a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.18 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3; b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.19 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3; c) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.20 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3; d) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.21 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.8, 2 i 3 i e) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.22 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.
5. 5. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde je Ab odabrano od antitela 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 i 213B10.
6. 6. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde Ab obuhvata: a) varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95 i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 ili 87.
7. 7. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde je Ab odabrano od: a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br,56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11; b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 ili 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 57 ili 60 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br,56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 ili 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60.
8. 8. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde Ab obuhvata: a) težak lanac sekvence odabrane od SEQ ID br.58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 i 81 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 ili 81 i b) lak lanac sekvence odabrane od SEQ ID br. 59 i 61 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.59 ili 61.
9. 9. Konjugat antitelo-lek iz bilo kog od prethodnih zahteva, gde je L linker sledeće formule (III):

   gde je L2(C4-C10)cikloalkil-karbonil, (C2-C6)alkil, (C2-C6)alkil-karbonil, W je aminokiselinSKa jedinica; w je ceo broj između 0 i 5; Y je PAB-karbonil, gde je PAB

   y je 0 ili 1; zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa D, a talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa Ab.
10. 10. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 9, gde je L2sledeće formule:

    gde zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa (W)w, a talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa azotovim atomom iz maleimidne grupe. 2 1
11. 11. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 9, gde je (W)wodabrano od: jednogube veze,

    gde zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa (Y)y, a talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L2.
12. 12. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 9, gde je w = 0; ili w = 2 i (W)wje odabrano od:

    gde 2 2 zvezdica ukazuje na tačku spajanja sa (Y)y, a talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa L2.
13. 13. Konjugat antitelo-lek iz bilo kog od prethodnih zahteva, gde je (L-D) odabrano od:

    2

    ��

    �

    gde talasasta linija ukazuje na tačku spajanja sa Ab.
14. 14. Konjugat antitelo-lek prema zahtevu 1 koji ima formulu odabranu od:

    2

    �

    �

    �

    i njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde je Ab izabrano iz grupe koja se sastoji od antitela 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 i 213B10.
15. 15. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 14, gde je Ab izabrano iz grupe koja se sastoji od: - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.56 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.56 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.60; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.62 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.64 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.64 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.60; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.66 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.68 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.68 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.60; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.70 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.72 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.74 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.76 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.78 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.78 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.60 i 2 - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57.
16. 16. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 15, gde je Ab izabrano iz grupe koja se sastoji od: - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 58 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 58 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 61; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 63 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 65 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 65 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 61; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 67 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 69 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 69 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 61; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 71 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 73 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 75 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 77 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 79 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 79 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 61 i - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 81 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59.
17. 17. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 14 koji ima sledeću formulu: 2 1

    gde je Ab izabrano iz grupe koja se sastoji od: - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.70 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.74 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57; - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.57 i - antitela koje ima varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.34 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.36.
18. 18. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 17, gde je Ab izabrano iz grupe koja se sastoji od: - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 71 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 75 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59; - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 81 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 59 i - antitela koje ima težak lanac sekvence SEQ ID br. 38 i lak lanac sekvence SEQ ID br. 40.
19. 19. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde je n 2.
20. 20. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 1, gde je n 4.
21. 21. Konjugat antitelo-lek iz bilo kog od prethodnih zahteva za upotrebu kao lek.
22. 22. Sastav koji sadrži bar jedan konjugat antitelo-lek iz bilo kog od prethodnih zahteva.
23. 23. Sastav iz zahteva 22 koji još sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
24. 24. Sastav iz zahteva 22 ili 23 za upotrebu u tretmanu kancera koji eksprimira IGF-1R.
25. 25. Sastav iz zahteva 24, gde je navedeni kancer koji eksprimira IGF-1R kancer odabran od kancera dojke, kolona, ezofagusnog karcinoma, hepatoćelijskog kancera, 2 2 gastričnog kancera, glioma, kancera pluća, melanoma, osteosarkoma, kancera jajnika, prostate, rabdomiosarkoma, renalnog kancera, tiroidnog kancera, kancera endometrijuma, mezotelioma, oralnog skvamoznog karcinoma i bilo kog kancera rezistentnog na lekove. 2