UA120364C2 - Кон'югат антитіла до igf-1r з лікарським засобом - Google Patents

Кон'югат антитіла до igf-1r з лікарським засобом Download PDF

Info

Publication number
UA120364C2
UA120364C2 UAA201611833A UAA201611833A UA120364C2 UA 120364 C2 UA120364 C2 UA 120364C2 UA A201611833 A UAA201611833 A UA A201611833A UA A201611833 A UAA201611833 A UA A201611833A UA 120364 C2 UA120364 C2 UA 120364C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
antibody
zeo
light chain
heavy chain
Prior art date
Application number
UAA201611833A
Other languages
English (en)
Inventor
Айан Рілатт
Айан РИЛАТТ
Мішель Перес
Мишель ПЕРЕС
Ліліан Гьотш
Лилиан ГЁТШ
Маттьйо Брусса
Шарлотт БО-ЛАРВОР
Жан-Франсуа Хьов
Тьєррі Шампьйон
Тьерри Шампьйон
Ален РОБЕР
Original Assignee
Пьєр Фабр Медікамент
Пьер Фабр Медикамент
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пьєр Фабр Медікамент, Пьер Фабр Медикамент filed Critical Пьєр Фабр Медікамент
Publication of UA120364C2 publication Critical patent/UA120364C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується кон'югата антитіла з лікарським засобом, де антитіло здатне до зв'язування з IGF-1R. Також винахід стосується композиції, що містить даний кон’югат, та способу лікування IGF-1R-експресуючого раку у суб’єкта, що потребує цього.

Description

Даний винахід відноситься до кон'югата антитіла з лікарським засобом, здатного до зв'язування з ІЗЕ-1К. В одному аспекті винахід відноситься до кон'югата антитіла з лікарським засобом, що містить антитіло, здатне до зв'язування з ІЗЕ-1К, де антитіло кон'юговане з щонайменше одним лікарським засобом, вибраним з похідних доластатину 10 і ауристатинів.
Винахід також включає в себе спосіб лікування і застосування зазначеного кон'югата антитіла з лікарським засобом для лікування раку.
Попередній рівень техніки
Рецептор інсуліноподібного фактора росту 1, званий ІСЕР-1К (або іноді ІСЕ1Е або ІСБР-ІВ) являє собою рецептор, що володіє активністю тирозинкінази, який має 7095 гомології з рецептором інсуліну ІК. ІЗЕ-12 являє собою глікопротеїн з молекулярною масою приблизно 350 000. Він являє собою гетеродимерний рецептор, кожна половина якого, пов'язана з іншою дисульфідними містками, складається з позаклітинної «-субодиниці і трансмембранної рД- субодиниці. ІЗЕ-1Е пов'язує ІСЕ1 і ІСЕ2 з дуже високою спорідненістю (Кажі нМ), але в рівній мірі здатний до зв'язування з інсуліном зі спорідненістю в 100-1000 разів нижче. Навпаки, ІК пов'язує інсулін з дуже високою спорідненістю, хоча ІСЕ зв'язуються з рецептором інсуліну зі спорідненістю в 100 разів нижче. Тирозинкіназний домен ІЗЕ-1К і ІК мають дуже високу гомологію послідовності, хоча зони більш слабої гомології відповідно стосуються багатої цистеїном ділянки, розташованої на а-субодиниці і С-кінцевій частині В-субодиниці. Відмінності послідовності, які спостерігаються в а-субодиниці, розташовані в зоні зв'язування лігандів і, отже є джерелом відносних значень спорідненості ІЗЕ-1К і ІК до факторів ІСЕ та інсуліну відповідно. Результатом відмінностей в С-кінцевій ділянці В-субодиниці є розбіжність біохімічних шляхів передачі сигналу двох рецепторів; ІЗЕ-1ЖК опосередковує мітогенні ефекти, диференціювання і антиапоптичні ефекти, тоді як в активацію ІК, головним чином, залучені ефекти на рівні метаболічних біохімічних шляхів.
Цитоплазматичні тирозинкіназні білки активуються зв'язуванням ліганда з позаклітинним доменом рецептора. У активацію кіназ, в свою чергу, залучена стимуляція різних внутрішньоклітинних субстратів, що включають ІВ5-1, І85-2, Зпс і Сг 10. Два основних субстрати ІСЕ-12 являють собою ІЗ і ЗПС, які опосередковують за рахунок активації численних подальших ефекторів більшість дій на ріст і диференціювання, пов'язаних з приєднанням ІСЕ до цього рецептора. Доступність субстратів може, отже, визначати кінцеву біологічну дію, пов'язану з активацією ІСЕ-1К. У разі переважання ІК5-1 клітини схильні до проліферації і до трансформації. У разі домінування Зпс клітини схильні до диференціювання. Мабуть, в дії відносно захисту проти апоптозу, головним чином, залучений шлях, який являє собою шлях фосфадилінозит-3-кіназ (РІ З-кіназ).
За останні десять років роль системи ІСЕ в канцерогенезі стала предметом інтенсивного дослідження. За цим інтересом послідувало відкриття того факту, що на додаток до його мітогенних і антиапоптичних властивостей ІСЕ-1К, мабуть, потрібно для встановлення і підтримання трансформованого фенотипу. Насправді чітко встановлено, що гіперекспресія або конститутивна активація ІЗЕ-1К в широкому ряді клітин веде до зростання клітин незалежно від підживлення середовищем без фетальної сироватки теляти і до утворення пухлин у безтимусних мишей. Ця властивість сама по собі не є унікальною властивістю, оскільки до трансформації клітин може вести широке розмаїття продуктів гіперекспресованих генів, що включають значне число рецепторів факторів росту. Однак критичним відкриттям, що чітко продемонструвало провідну роль, яку відіграє ІЗЕ-1К в трансформації, стала демонстрація того, що клітини ІЇЗК-18-, в яких інактивований ген, кодуючий ІСЕ-1К, повністю стійкі до трансформації різними агентами, які зазвичай здатні трансформувати клітини, такими як білок
Е5 вірусу бичачої папіломи, гіперекспресія ЕСЕК або РОСЕРЕ, антиген Т 5М40, активований газ або комбінація цих двох останніх факторів.
ІБЯЕ-1К експресується в широкому ряді пухлин і пухлинних ліній, і ЗЕ ампліфікують пухлинний ріст за допомогою їх приєднання до ІСЕ-1К. Інші аргументи на користь ролі ІБЕ-1К в канцерогенезі отримані з досліджень з використанням мишиних моноклональних антитіл, спрямованих проти рецептора, або з використанням негативних домінантів ІЗЕ-1К. Дійсно, мишині моноклональні антитіла, спрямовані проти ІСБ-1К, інгібують проліферацію різних ліній клітин в культурі і ріст пухлинних клітин іп мімо. Було показано, що негативний домінант ІСЕ-18, ймовірно, здатний інгібувати проліферацію пухлини.
Розпочато велику кількість проектів по розробці ізольованих антитіл до ІЗЕ-1К для лікування форм раку. Проте, до цієї дати жоден з цих проектів не мав успіху, і жодного антитіла до ІСЕ-1К немає в продажу.
Крім того, серія клінічних досліджень, в яких були задіяні антитіла до ІЗЕ-1Е в комбінації з (610) антитілами до рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕК) для націлювання на обидві мішені ЕСЕК і ІСБ-1К, не мала успіху, оскільки жодне з цих антитіл при силікозі не було здатне до лікування пацієнтів з мутацією гомолога вірусного онкогена щурячої саркоми Кірстена (КВА5Б).
Внаслідок цього ІЗЕ-ЇК в даний час не вважають значною мішенню, і при дослідженні потенційних терапевтичних антитіл ЗЕ-1К більше не вважають такими, що представляють інтерес.
Крім того, також необхідно зазначити, що прагнення до створення антитіл до ІЗЕ-1К були зосереджені на ізольованих антитілах, тобто антитілах, корисних за рахунок своїх власних властивостей. У цьому сенсі ІЗЕ-1К вважають невідповідним як мішень для створення АОС, тобто кон'югата антитіла з лікарським засобом (званим «АЮсС»), оскільки ІЗЕ-1К описаний як мішень, також широко експресовану нормальними клітинами, включаючи кровоносні судини. У цьому сенсі можна відзначити, що найбільш нещодавно одержане антитіло до ІСБЕ-1К, тобто
АМЕ1642, розробляється у вигляді ізольованого антитіла, не навантаженого лікарським засобом. Те ж саме вірно для інших антитіл ІСОЕ-18, які в даний час знаходяться в розробці, і для всіх антитіл, які не мали успіху в клінічних дослідженнях.
В даному контексті винахід відноситься до АС або до кон'югата і до його застосування для лікування раку, і більш конкретно для лікування форм раку, що експресують ІСБЕ-1Н8.
Кон'югати АОС поєднують зв'язуючу специфічність з активністю лікарських засобів, таких як, наприклад, цитотоксичні агенти. В технології, що пов'язана з розробкою моноклональних антитіл, в застосуванні більш ефективних лікарських засобів і конструюванням хімічних лінкерів для ковалентного зв'язування цих компонентів, в останні роки відбувся швидкий прогрес.
Застосування АОС дає можливість для локального доставлення лікарських засобів, введення яких у вигляді некон'югованих лікарських засобів може призводити в результаті до неприйнятних рівнів токсичності для нормальних клітин.
Іншими словами, їх застосування, таким чином, має на увазі максимальну ефективність при мінімальній токсичності. Спроби конструювання та очищення АОС зосереджені як на селективності антитіла, так і на механізмі дії лікарського засобу, властивості зв'язування лікарського засобу, співвідношення лікарський засіб/антитіло (навантаження лікарським засобом або агид/апіїроду гайо, ВАК) і вивільнення лікарського засобу. Угруповання лікарського засобу можуть передавати свої цитотоксичні і цитостатичні впливи за допомогою механізмів, що включають зв'язування тубуліну, зв'язування ДНК, протеасом, порушення функції рибосом, синтезу білка та/або інгібування топоіїзомераз. Деякі цитотоксичні лікарські засоби схильні до інактивації або до меншої активності при кон'югації з антитілом великого розміру.
Необхідно окремо охарактеризувати кожне антитіло, сконструювати відповідний лінкер і ідентифікувати відповідний цитотоксичний агент, який зберігає свою активність при доставленні в пухлинні клітини. Необхідно враховувати антигенну щільність на ракової мішені, а також враховувати, чи експресують нормальні тканини цільовий антиген. Інші міркування включають: чи відбувається інтерналізація АОС при зв'язуванні мішені; чи переважний цитостатичний або цитотоксичний лікарський засіб при розгляді можливого впливу на нормальну тканину та/або типу та стадії раку, що підлягає лікуванню; і чи являє собою лінкер, з'єднуючий антитіло з корисним навантаженням лікарським засобом, розщеплюваним або нерозщеплюваним зв'язком. Крім того, відносно процесу майбутньої розробки сполуки відношення кон'югації антитіла з угрупованням лікарського засобу має бути достатнім, і при цьому повинен бути відсутнім ризик для зв'язуючої активності антитіла та/або активності лікарського засобу, а фізико-хімічні властивості АОС не повинні зазнавати модифікацій, що призводять внаслідок до агрегації.
Ар являє собою комплексну біологічну молекулу, і труднощі, пов'язані з розробкою ефективного А0С, залишаються суттєвим питанням.
Суть винаходу
Даний винахід направлено на вирішення даного питання і відноситься до АЮС наступної формули (1):
АРр-(-О) п (І) або її фармацевтично прийнятної солі, де
Ар являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, здатні до зв'язування ІСЕ- 1К людини, вибрані з наступних: ї) антитіло, що містить три ділянки, які визначають комплементарність (СОК, від англ. сотріетепіатпіу-дегептіпіпуд гедіоп), важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО І МО 1,2 і 10) З, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 4, 5 і 6;
і) антитіло, конкуруюче за зв'язування з ІСБ-1К з антитілом і); і ії) антитіло, що зв'язується з тим же епітопом, що і антитіло ї) до ІЗЕ-1В8;
Ї являє собою лінкер; р являє собою угруповання лікарського засобу наступної формули (І): (Ф) / р; (СН»о)т М Ж М
А Ко зм : М чи
На Кз 0 и о. о о б МН (1), де:
В2 являє собою СООН, СООСН:» або тіазоліл;
Взявляє собою Н або (С.:-Св)алкіл;
Ве являє собою Н або (С.:-Св)алкіл; т являє собою ціле число, що становить від 1 до 8; хвилястою лінією показана точка приєднання до |. і п дорівнює від 1 до 12.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІО МО 7,2 і
З, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ МО 9, 5 і 11; р) антитіла, що містить три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО 10 МО 7,2 і
З, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 10, 5 і 11; с) антитіла, що містить три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності ХЕО ІО МО 7,2 і
З, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 5 і 12; і а) антитіла, що містить три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ МО 8,2 і
З, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮО МО 9, 5 і 11.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ХЕО
ІО МО 13, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮО МО 9, 5 і 11; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ХЕО
ІО МО 14, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5БЕО ІЮ МО 10, 5 і 11; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність зХЕО
ІО МО 15, і три СОЕ легкого ланцюга, що мають послідовності БЕО ІЮ МО 9, 5 і 12; а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ФЕО
ІО МО 16, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ МО 9, 5111; ї е) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність «ФЕО
ІО МО 17, і три СОЕ легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ МО 9, 5 і 12.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність 5ЕО ІЮ
МО 18, ії три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5БЕО ІЮ МО 7, 2 і 3; р) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ХЕО ІЮ
МО 19, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5БЕО ІЮ МО 7, 2 і 3; с) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 20, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5БЕО ІЮ МО 7, 2 і 3; а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 21, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕОІЮО МО 8,213; е) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 22, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5БЕО ІЮ МО 7, 2 і 3.
У втіленні винахід відноситься до АОС, де АБ вибрано з: і) антитіл 2082, 212А11, 2148, 21906 і 213810; ії) антитіл, що конкурують за зв'язування з ІСЕ-18 з антитілами і); і ії) антитіл, що зв'язуються з тим же епітопом ІСЕ-1Н, що і антитіла Ї).
Втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ являє собою гуманізоване антитіло.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ вибрано з: антитіла, що містить: а) важкий ланцюг, що має СОК-НІ, СОВ-Н2 ї СОВ-НЗ послідовностей ЗЕОІЮО МО 7,213 відповідно, і ЕК, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з ІЗНМ1-46701 (5ЕО ІЮ МО 46) зародкової лінії людини, і
ЕКА, виділений з І5Н.4701 зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО 48); і р) легкий ланцюг, що має СОК-І1, СОВ-І2 і СОК-ЇЗ послідовностей 5ЕО ІЮО МО 9, 5 і 11 відповідно, і ЕК, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з ЗНМ1-39701 (5ЕО ІЮ МО 47) зародкової лінії людини, і
ЕКА, виділений з ІСК.)4701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО 49).
У втіленні винаходу АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ХЕО
ІО МО 33 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095 ідентичність зХЕО ІЮ МО 33, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 51 11; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО
ІО МО 34 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 34, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 5 і 11.
У втіленні винаходу АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 35 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095 ідентичність зЕО ІЮО МО 35, їі три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕОІЮ МО 7,213; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО
ІО МО 36 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095 ідентичність зХЕО ІЮ МО 36, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 7, 2 і 3.
У втіленні винаходу АБ вибрано з: а) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 37 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 37, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 39 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 39, або такого, що складається з цих ланцюгів; і
Б) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО І МО 38 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 38, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 40 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 40, або такого, що складається з цих ланцюгів.
У втіленні винаходу АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної БЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80; і три
СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮО МО 9, 5 і 11;
Б) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮО МО 57 і 60 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної 5ЕО
ІО МО 57 і 60; і три СОЕ важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО І МО 7,213; ї с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної БЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80; і три
СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ МО 57 або 60 або будь-яку послідовність, щонайменше на 8095 ідентичну 5ЕО ІЮ МО 57 або 60;
У втіленні винаходу АБ вибрано з: а) важкого ланцюга, що має послідовність, вибрану з БЕО ІЮО МО 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 і 81 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної 5ЕО ІЮ МО 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 або 81; і р) легкого ланцюга, що має послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО 59 ії 61 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної ЗЕО ІО МО 59 або 61.
У втіленні винахід відноситься до АОС, де І являє собою лінкер наступної формули (ПІ): (6) дО 5 М (Ф)
де
Ї2» являє собою (Са4-Сто)циклоалкіл-карбоніл, (С2-Св)алкіл або (С2-Св)алкіл-карбоніл;
М/ являє собою амінокислотну ланку; м/ являє собою ціле число, що становить від 0 до 5;
У являє собою РАВ-карбоніл, де РАВ являє собою
Н и М '- М
СХ о. 7 7 у дорівнює 0 або 1; зірочкою вказана точка приєднання до О; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до АБ.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де І» має наступну формулу (110): к.з о де зірочкою вказана точка приєднання до (М/м; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до атому азоту малеїмідного угруповання формули: (в) у Щ з, (в)
У втіленні винаходу м дорівнює 0, або м дорівнює 2, і тоді (МУ) вибрана з:
ГФ) ІФ) ще ще "
М оо т М шана: і: Е НН не (в) , рай о ,
Ше й
МН
(в)
АХ й най
Е Н ра о і з де зірочкою вказана точка приєднання до (у; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до І».
Втілення винаходу відноситься до АОС, де І вибраний з:
Ше й
МН
Ге) (в)
Н Н ще М ноту , і с.
Е Н
(Ф) д (9) 0) й 9) з
Ше й
МН
Ге! (в)
МАХ " 2 тре - М
Е Н
Оу о (в) ;і (в)
Ж
ІФ) (в) де зірочкою вказана точка приєднання до 0, а хвилястою лінією вказана точка приєднання до АБ.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де (І -О) вибрано з: о МН;
Я ни
М М нас ги в) (є)
ГО
По А! о,
М уйтнн
Ма кв (Е-11)
окунь
НМ колки еру со. о ОК () Ше й о
ІГАТАТ, ! б МН о ре (Е-12) о
М
-ту С. но о о м М М
Ї о А! о.о я
М ойткн о /о (а-12)
НМ. ро т
Мн о но га веритрр веб нн ооо о М м
Ї о А о. о о,
Х о МН о он (Е-13)
НМ. ро т
Мн о но га м. Ж м мосту Н М о
Ї о А! о.о0 б
М ойттн о он (Е-13)
у і митр С но -- Ї вв
Її о А! о о я
М й ттн о он (а-13) нь (Фо)
Ва
ІТ! о но га м. Ж М о хоча
ОК
М дйттн (9) ло 5 (Е-15)
М м. Ж М -ту о о ра І о. о о, (о! 7 (в)
М уйттмн о л (а-15)
НМ. ро
Ще
МН о но га м. Ж М
М М о певно
Ї о ри | о. о
М ойттн
Мая кв (Р-61)
НМ. 2о
Ле (в) (о)
Н Н кір но о (Ф) р (Ф) М до М о р | о. о б
М ой ттн
Ге) /о (Е-62) і
НМ 2»о
Ле
Ге) (е)
Н Н вилок сг о о 0, (в) М до М
Ї о ри | о. о б
М уйтн (в) он (Р-63) де хвилястою лінією вказана точка приєднання до АБ.
Втілення винаходу відноситься до АОС, що має формулу, вибрану з: о МН; и. о Н зе
М М раль о (в) іевзевоо
І БАТАб,
М уйтн
Маха в п (АБ-Е-11)
охуна ни о но Н дь вить о о 0, (о) Шк й о о оз
УТ,
М дн о. ;/В п (АБ-Е-12) у й
АТ Тр те Х о Ге М М а М о реч | о. о
І в МН о ло п (Ар-С-12) наго чн (в) (в) ді САЛА о оо Шк й о є) івзозо5
Ї о А ЇЇ в.о я
М ойтнн о. он п (АБ-Е-13) нам. 2О
Ва
МН о но дь СИЛА но о ох (о) М М.А М
Ї о А! о.о я
М осн о он п
(АБ-Р-13) і;
М о М т М
Ї о А! о9.о б
І в МН о он п (Ар-С-13) нач и
МН о но Н м С о
АЬ сттух ні о. почат о (С Ї о А 1 оо 4 о МН ;/о п (АБ-Е-15)
М м. Ж М
Ар Ма Іо; Ї Н т ї Ї о,
МН
(в) () 55 п (АЬ-С-15) ни
МН о но Н
АБ АЛАМКИ ц о о о А.Л о АКА м
Ї о А! о.о б
М ойтн
Моя кв п (АБ-Е-61)
нам. ио
МН
Ге) |в) н Н п; дЬ митр - М о о А "Ло М Ж м о ще Її ГЕ о А о. о р - 9 о Мн (о) /о п (АБ-Е-62) нам. ио
МН
(в) (о)
Н н
ПЧ; лама о о А." о че м о ще БЕ о А о. о раль - 9 ої Мн (о) он п (АБ-Е-63) та їх фармацевтично прийнятних солей, де АБ вибрано з групи, що складається з: і) антитіл 2082, 212А11, 2148, 21906 і 213810; ії) антитіл, що конкурують за зв'язування з ІСЕ-18 з антитілами і); і ії) антитіл, що зв'язуються з тим же епітопом ІСЕ-1Н, що і антитіла Ї).
Втілення винаходу відноситься до АОС, де п дорівнює 2.
Втілення винаходу відноситься до АОС, де п дорівнює 4.
Втілення винаходу відноситься до АОС для застосування як лікарського засобу.
Втілення винаходу відноситься до композиції, що містить АОС, як описано вище.
Втілення винаходу відноситься до композиції, що додатково містить фармацевтично прийнятний носій.
Втілення винаходу відноситься до композиції для застосування при лікуванні ІСЕ-1В8- експресуючого раку або форм раку, обумовлених ІСБ-1Н8.
ІЯЕ-1В-експресуючий рак або форми раку, обумовлені ІЗЕ-1К, включають пухлинні клітини, які експресують або володіють гіперекспресією повнорозмірного ІСЕ-1К або його ділянки на їх поверхні.
Втілення винаходу відноситься до композиції, де ЇЗЕ-1 В-експресуючий рак являє собою рак, вибраний з карциноми молочної залози, ободової кишки, стравоходу, печінково-клітинного раку, раку шлунка, гліоми, раку легені, меланоми, остеосаркоми, раку яєчника, передміхурової залози, рабдоміосаркоми, раку нирки, щитовидної залози, ендометрія матки, мезотеліоми, плоскоклітинної карциноми порожнини рота і будь-якого лікарсько-стійкого раку.
Втілення винаходу відноситься до способу лікування ІСЕ-1 В-експресуючого раку у суб'єкта, що потребує цього, що включає введення суб'єкту ефективної кількості щонайменше одного кон'югата антитіла з лікарським засобом або композиції відповідно до винаходу.
Втілення винаходу відноситься до набору, який містить щонайменше ії) кон'югат антитіла з
З0 лікарським засобом та/або композицію, як описано вище, та її) шприц, флакон або ампулу, в які поміщають кон'югат антитіла з лікарським засобом та/або композицію.
Докладний опис винаходу
І- Антитіло (АБ)
Терміни «антитіло», «антитіла», «ар», «Аб», «МАБ» або «імуноглобулін» використовуються як взаємозамінні в найширшому сенсі і включають моноклональні антитіла, ізольовані, сконструйовані методами генної інженерії або рекомбінантні антитіла (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, полівалентні антитіла або мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), а також їх фрагмент антитіла за умови проявлення ними бажаної біологічної активності.
В одному втіленні винаходу антитілл АОС за винаходом складається з рекомбінантного антитіла. Термін «рекомбінантне антитіло» відноситься до антитіла, одержаного в результаті експресії рекомбінантної ДНК всередині живих клітин. Рекомбінантне антитіло АОС за винаходом одержують шляхом використання лабораторних методик генетичної рекомбінації, добре відомих фахівцям в даній області техніки, що дозволяють створити послідовності ДНК, які не виявляються в живих організмах.
В іншому втіленні винаходу антитіло АОС за винаходом складається з хімічно синтезованого антитіла.
Більш конкретно така молекула складається з глікопротеїну, що містить щонайменше два важких (Н) ланцюги і два легких (І) ланцюги, з'єднані один з одним дисульфідними зв'язками.
Кожний важкий ланцюг містить варіабельну область (або домен) (в даному документі скорочену як НСМЕК або УН) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домени, СНІ, СН2 ії СНЗ. Кожний легкий ланцюг містить варіабельну область (в даному документі скорочену як І СУ або МІ) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга містить один домен, Сі. Області МН і МІ можуть бути додатково підрозділені на області гіперваріабельності, звані ділянками, що визначають компліментарність (сотріетепіагту аейгегтіпіпуд гедіоп5, СОК), розташовані між більш консервативними областями, звані каркасними областями (Ігатеуогк гедіоп5, ЕК). Кожна МН і МІ. складається з трьох СОК і чотирьох ЕЕ, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в такому порядку: ЕК!, СОКІ,
ЕК2, СОМ2, ЕКЗ, СОКУ, ЕКА4. Варіабельні області важкого і легкого ланцюгів містять зв'язуючий домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Сід) класичної системи комплементу.
Під «антигензв'язуючим фрагментом» або «ІСБ-ІВ-зв'язуючим фрагментом» антитіла АОС відповідно до винаходу мають на увазі вказівку на будь-який пептид, поліпептид або білок, який зберігає здатність до зв'язування з мішенню (також в цілому званої антигеном) антитіла.
У втіленні винаходу такі «антигензв'язуючі фрагменти» вибрані з групи, що складається з фрагментів або діатіл Ем, 5сЕм (562 для одного ланцюга), Бар, Е(ар)», Бар", 5сЕм-Ес або будь- якого фрагмента, період напіввиведення якого збільшений в результаті хімічної модифікації, такий як приєднання полі(алкілен)гліколю, такого як полі(етилен)гліколь («ПЕГілування») (пегіловані фрагменти, звані Ем-РЕСї, зсЕм-РЕСІ, Рар-РЕС, Е(аб)2-РЕСІ або Рар--РЕС) («РЕС» означає полі(етилен)гліколь), або в результаті включення в ліпосому, при цьому дані фрагменти мають щонайменше одну з ділянок СОК, характерних для антитіла відповідно до винаходу.
Переважні «антигензв'язуючі фрагменти» складаються з часткової послідовності важкого або легкого варіабельного ланцюга антитіла, з якого вони виділені, або містять цю послідовність, де дана часткова послідовність достатня для збереження такої ж специфічності зв'язування, як у антитіла, з якого вона походить, і достатньої спорідненості по відношенню до мішені, переважно щонайменше рівного 1/100, більш переважно щонайменше 1/10, від спорідненості антитіла, від якого вона походить. Більш переважно «антигензв'язуючі фрагменти» складаються щонайменше з трьох СОК СОК-НІ, СОВ-Н2 і СОК-НЗ важкого варіабельного ланцюга і трьох
Сов 'СОВ-11, СОВ-1І2 і СОК-ЇЗ легкого варіабельного ланцюга антитіла, від якого вони виділені, або містять ці ділянки.
Терміни «зв'язуючий», «зв'язує» і тому подібне мають на увазі, що антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент утворює комплекс з антигеном, який є відносно стабільним в фізіологічних умовах. Специфічне зв'язування може характеризуватися рівноважною константою дисоціації щонайменше приблизно 1х105 М. Способи визначення, чи зв'язуються дві молекули, добре відомі в даній області техніки і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс, кількісні аналізи з радіоактивною міткою і таке інше. Щоб уникнути сумнівів, це не означає, що антитіло не може зв'язуватися або взаємодіяти на низькому рівні з іншим антигеном. Проте, як втілення, дане антитіло зв'язується тільки з даним антигеном.
Як використовують в даному описі, вираз «антитіло до ІЗЕ-1К» слід інтерпретувати як 10) аналогічний вислів «антитіло проти ІСЕ-1К» і означає антитіло, здатне до зв'язування з ІСЕ-18.
В одному втіленні даного винаходу епітоп антитіла переважно локалізований в позаклітинному домені ІЗЕ-1Е людини (також званому ІЗЕ-18 ЕСО).
У конкретному втіленні даного винаходу антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент здатний до зв'язування з ІСЗЕ-1Е з ЕСзо, що становить від 10х1079 до 1х10-9, і більш переважно, від 8х1079 до 2х1070,
Термін «половинна максимальна ефективна концентрація» (ЕСбхо) відповідає концентрації лікарського засобу, антитіла або токсичного агента, яка індукує відповідь, що знаходиться між вихідним рівнем і максимумом, після деякого заданого часу впливу. Її часто використовують як міру активності лікарського засобу. ЕСво зростаючої кривої доза-відповідь, таким чином, являє собою концентрацію сполуки, де спостерігається 5095 її максимального ефекту. ЕСво квантової кривої доза-відповідь являє собою концентрацію сполуки, де 5095 популяції проявляє відповідь після заданої тривалості впливу. Міри концентрації в характерному випадку слідують сигмоїдальній кривої з швидким зростанням протягом щодо незначної зміни концентрації. Це може бути визначено математично шляхом побудови кращої емпіричної кривої.
В якості переважного втілення ЕСбхо, визначена в даному винаході, характеризує активність зв'язування антитіла з ІЗЕ-1К ЕСО, виявленим на поверхні пухлинних клітин людини. Параметр
ЕСво визначають з використанням аналізу сортування флуоресцентно-активованих клітин (ГАС5). Параметр ЕСьо відображає концентрацію антитіла, для якої одержують 5095 максимального зв'язування на ІЗЕ-1К людини, експресованого на пухлинних клітинах людини.
Кожне значення ЕСзхо було обчислено як середня точка кривої доза-відповідь з використанням програми відповідності чотирьохпараметричної кривої регресії (програмне забезпечення Ргівзт).
Цей параметр вибраний як репрезентативний параметр фізіологічних/патологічних умов.
Термін «епітоп» являє собою ділянку антигену, що зв'язується антитілом. Епітопи можуть бути визначені як структурні чи функціональні. Функціональні епітопи в цілому являють собою підгрупу структурних епітопів і мають залишки, які вносять безпосередній внесок в спорідненість взаємодії. Епітопи можуть бути також конформаційними, тобто складаються з нелінійних амінокислот. У деяких втіленнях винаходу епітопи можуть включати детермінанти, що представляють собою хімічно активні поверхневі угруповання молекул, таких як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і в деяких втіленнях можуть володіти специфічними тривимірними структурними характеристиками та/або специфічними характеристиками заряду.
Конкуренція за зв'язування з ІЗЕ-1К може бути визначена будь-якими способами або методами, відомими фахівцям ов даній області техніки, такими як, без обмежень, радіоактивність, Віасоге, твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА), проточна цитометрія і т.д. Під «конкуруючим за зв'язування з ІЗЕ-1К" мають на увазі конкуренцію щонайменше 20965, переважно щонайменше 509; і більш переважно щонайменше 7095.
Визначення зв'язування з тим же епітопом можна здійснювати будь-якими способами або методами, відомими фахівцям ов даній області техніки, такими як, без обмежень, радіоактивність, Віасоге, ІФА, проточна цитометрія і т.д. Під «такими, що зв'язуються з тим же епітопом ІСБ-1К" мають на увазі конкуренцію щонайменше 2095, переважно щонайменше 5095 і більш переважно щонайменше 7095.
Як згадано вище, і на противагу загальним відомостями, даний винахід зосереджено на специфічних антитілах до ІЗЕ-1К, що представляють високу здатність до інтерналізації після зв'язування ІСЕ-1К. При використанні в цьому документі антитіло, яке «інтерналізується» або «інтерналізовано» (ці два вирази аналогічні), являє собою антитіло, яке поглинається клітиною (що означає «входить в клітину») після зв'язування з ІСБ-1К на клітині ссавця. Таке антитіло становить інтерес в складі АЮС, оскільки воно адресує або направляє пов'язаний 3 ним цитотоксичний агент в ракові клітини-мішені. Відразу після інтерналізації цитотоксичний агент ініціює загибель ракової клітини.
Несподівано виявлено, що всі антитіла відповідно до винаходу презентують одні й ті ж послідовності СОК-Н2, СОВ-НЗ і СОК-І2, а інші 3 СОК розрізняються. Це спостереження, мабуть, є органічним, оскільки становить частину загальнодоступних відомостей про те, що стосовно зв'язуючої специфічності антитіла СОК-НЗ описаний як найважливіша ділянка, в максимальному ступені задіяний в розпізнаванні епітопу.
Важливими аспектами успіху терапії АОС вважають специфічність до антигену-мішені і інтерналізацію комплексів антиген-антитіло в ракові клітини. Очевидно, що не інтерналізуючі антигени менш ефективні для доставлення цитотоксичних агентів, ніж інтерналізуючі антигени.
Процеси інтерналізації розрізняються серед антигенів і залежать від безлічі параметрів, на які можуть впливати антитіла. (610) В АОС цитотоксичний агент надає цитотоксичну активність, а використовуване антитіло відповідально за специфічність до ракових клітин, а також використовується в якості вектора всередині клітин для вірного направлення цитотоксичності. Таким чином, для вдосконалення
АОС антитіло може проявляти високу здатність до інтерналізації в ракові клітини-мішені.
Ефективність опосередкованої антитілом інтерналізації істотно відрізняється в залежності від епітопа-мішені. Для вибору антитіл, що активно інтерналізуються ІСЕ-1К, необхідні різні експериментальні дані досліджень не тільки понижувальної регуляції ІЗЕ-1К, але також подальшої інтерналізації антитіла до ІСЕ-1К в клітини.
В одному втіленні винаходу інтерналізацію антитіла АОС відповідно до винаходу можна оцінювати за допомогою імунофлуоресценції або РАС5 (проточної цитометрії) (приклади якої наведено далі в даному документі), або будь-якого способу або процесу, відомого фахівцям в даній області техніки, специфічного для механізму інтерналізації. У переважному втіленні винаходу антитілло АОС відповідно до винаходу може індукувати інтерналізацію після зв'язування з ІСЕ-1К щонайменше на 3095, переважно 5095 і більш переважно 8095.
Комплекс ІСЕ-1К/антитіло інтерналізуєтся після зв'язування антитіла з ЕСО ІСБ-1В та індукує зменшення кількості МЗЕ-1К на поверхні клітин. Це зменшення можна визначити кількісно будь-яким способом, відомим фахівцям в даній області технікию, що не обмежуються прикладами в яких є вестерн-блотинг, ЕАС5 та імунофлуоресценція.
В одному втіленні винаходу це зменшення, відображуюче, таким чином, інтерналізацію, можна переважно вимірювати за допомогою ЕАСЗ5 і висловлювати у вигляді різниці або дельта між середньою інтенсивністю флуоресценції (Меап Рісогезсепсе Іпіепзйу, МЕ), яка вимірюється при 4 "С, і МЕЇ, виміряної при 37 "С, після 4 годин інкубації з антитілом.
В якості небмежувального прикладу цю різницю дельта визначають на основі МРІ, отриманих на необроблених клітинах і на клітинах, оброблених антитілом, використовуючи і) клітини МСЕ7 раку молочної залози після 4-годинного періоду інкубації з антитілом, описаним в цьому документі, та ії) друге антитіло, мічене барвником АІеха488. Даний параметр визначають шляхом обчислення за такою формулою: Д(МЕЇ4 «с- МЕР Ї1з7 с).
Ця різниця між МЕЇ відображає знижувальну регуляцію ІЗЕ-1К, оскільки МЕЇ пропорційні
ІСЕ-1К, експресованим на клітинній поверхні.
У переважному аспекті антитіла складаються з антитіл, що ініціюють А (МЕїл»с- МЕЇз7 с) на
МСЕ-7 щонайменше 280, переважно щонайменше 400.
Більш детально, вищезгадану різницю дельта можна вимірювати в такий спосіб, який повинен розглядатися як ілюстративний і необмежувальний приклад: а) Обробка та інкубація пухлинних клітин, що представляють інтерес, з антитілом за винаходом або в холодному (4 "С), або в теплому (37 "С) повному культуральному середовищі;
Б) Обробка оброблених клітин стадії а) і паралельно - необроблених клітин другим антитілом; с) Вимірювання МЕРЇ (репрезентативної для кількості (ЗЕ-1К, присутнього на поверхні) для оброблених та необроблених клітин за допомогою другого міченого антитіла, здатного до зв'язування з антитілом даного винаходу; і 4) Обчислення різниці дельта шляхом вирахування МЕїЇ, отриманої з обробленими клітинами, з МЕЇ, отриманої з необробленими клітинами.
На підставі даного значення дельта МЕЇ можна визначити відсоток інтерналізації як: 10Ох(МРЇ 4 го-МЕЇз7 «с) / МЕЇ 4 сс,
Відсоток інтерналізації антитіл АЮС відповідно до винаходу, присутніх переважно на клітинах МСЕ7, становив від 5095 до 9995, від 7095 до 9095, переважно від 7595 до 8790.
Особлива перевага антитіл, описаних в даному документі, заснована на швидкості їх інтерналізації.
Загальновідомо, що для АОС бажано, щоб використовувані антитіла виявляли високу швидкість інтерналізації, переважно в межах 24 годин від введення антитіла і більш переважно в межах 12 годин, і навіть більш переважно в межах 6 годин.
В даному винаході швидкість інтерналізації, також званої зменшенням кількості антитіл, пов'язаних з клітинної поверхнею, або розпадом антитіл клітинної поверхні, виражена у вигляді 1/2 (час напівжиття) і відповідає часу, необхідному для отримання зменшення МЕЇ на 5095
Д(даний аспект буде чітко зрозумілий при розгляді наведених нижче прикладів).
Особлива перевага полягає в тому, що антитіла АЮС за винаходом мають И/2, що становить від 5 до 25 хвилин і переважно від 10 і 20 хвилин.
Конкретне втілення винаходу відноситься до АОС, де антитіло АБ містить три ділянки СОК важкого ланцюга, з яких СОК-Н2 має послідовність хЕО ІЮ МО 2 ії СОК-НЗ - послідовність БЕО
ІО МО 3, і три ділянки СОК легкого ланцюга, з яких СОК-12 має послідовність хЕО 10 МО 5. 10) Конкретне втілення винаходу відноситься до АОС, де антитіло АБ містить три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮО МО 1, 2 ї 3, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕОІЮ МО 4, 516.
Одне втілення АОС включає антитіло, що містить три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності ЗЕО ІЮ МО 1, 2 і З або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 1, 2 або 3, або таких, складаються з цих послідовностей; і три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності ЗЕО ІЮ МО 4, 5 і 6 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 4, 5 або 6, або таких, що складаються з цих послідовностей.
В іншому втіленні винаходу антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент містить три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності «»ЕО ІЮО МО 1,2 ї 3, ії три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності ЗЕО ІЮ МО 4, 5 і 6.
Для порівняння варіабельних доменів незалежно від рецептора антигену, типу ланцюга або виду визначена унікальна нумерація ІМОТ |Геїтапс М.-Р., Іттипоїіоду Тодау 18, 509 (1997) /
Ї епапс М.-Р., Тне Іттипоіодіві, 7, 132-136 (1999) / | епапс, М.-Р., Роттіє, С., ці, М., Сіцаїсеії,
М., Еоцдціег, Е., Тгиопод, Г., Тпоимепіп-Сопівї, М. апа І еїтапс, Оєм. Сотр. Іттипої., 27, 55-77 (2003)). У цій унікальній нумерації ІМОТ консервативні амінокислоти завжди мають одне і те ж положення, наприклад цистеїн 23 (151-СУ5), триптофан 41 (СОМ5ЕКМЕО-ТЕР), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2п4-СУ5), фенілаланін або триптофан 118 (9-РНЕ або 2-ТРР).
Унікальна нумерація ІМОТ забезпечує стандартизоване розмежування каркасних областей (ЕВ1-ІМСОТ: положення з 1 по 26, ЕК2-ІМСИТ: з 39 по 55, ЕКЗ-ІМСИТ: з 66 по 104 і ЕВ4-ІМСТ: з 118 по 128) і ділянок, що визначають комплементарність: СОК1-ІМИСТ: з 27 по 38, СОК2-ІМОТ: з 56 по 65 і СОВЗ-ІМИТ: з 105 по 117. Оскільки гепи являють собою незайняті положення, довжини
СОВ-ІМОТ (показані між дужками і розділені крапками, наприклад, І8.8.131) стають критичною інформацією. Унікальну нумерацію ІМОТ використовують в графічних зображеннях 20, позначених як ІМОТ СоШег5 де Регпез |Киї7, М. апа Геїтапс, М.-Р., Іттиподепеїїйсв5, 53, 857-883 (2002) / Каав, О. апа І еїтапс, М.-Р., Сцтепі Віоіпіоптаїйсв, 2, 21-30 (2007)), і в структурах ЗО в
ІМат/ЗзОвігисіиге-ОВ ІКаав, О., Виї7, М. апа І емапс, М.-Р., Т сеїЇ гесерюг апа МНС 5ігисімчгаї дата.
Мисі. Асіав5. Невз., 32, 0208-0210 (2004)|.
Повинно бути зрозуміло, що за відсутності суперечливих вказівок в даному описі ділянки, що визначають комплементарність, або СОК, означають гіперваріабельні ділянки важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, як визначено відповідно до системи нумерації ІМОТ.
Проте, СОВ також можна визначити відповідно до системи нумерації Кебота (Кабаї ї аї.,
Зедиеєпсев ої ргоївїп5 ої іттипоіодіса! іпієгеві, Бій Еа., 0.5. Юерапйтепі ої Неацй апа Нитап
Зегмісев, МІН, 1991, і більш пізні видання). Існує три ділянки СОВ важкого ланцюга і три ділянки
СОВА легкого ланцюга. У цьому документі терміни «ділянка СОН» і «ділянки СОН» використовують для зазначення залежно від випадку одної, декількох або навіть всіх ділянок, що містять більшість амінокислотних залишків, відповідальних за зв'язувальну спорідненість антитіла до антигену, що розпізнається, або епітопів. З метою спрощення читання даного документа СОК за Кеботом не визначені. Проте, фахівцю в даній галузі техніки повинно бути очевидно використання визначення СОР відповідно до ІЇМСОСТ для визначення СОК за Кеботом.
У сенсі, що відноситься до даного винаходу, «ідентичність» або «відсоток ідентичності» між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислот означає відсоток ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків між двома порівнюваними послідовностями, отриманий після оптимального вирівнювання, при цьому даний відсоток є виключно статистичним, і відмінності між двома послідовностями розподілені випадковим чином по всій їх довжині. Порівняння двох нуклеїново-кислотних або амінокислотних послідовностей традиційно проводять шляхом порівняння послідовностей після того, як вони оптимально вирівняні, при цьому порівняння можна проводити посегментно або з використанням «вікна вирівнювання».
Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння можна проводити, крім порівняння вручну, за допомогою алгоритму локальної гомології Зтйп апа Умаїегтап (1981) (Аа. Арр. Май. 2:4821|, за допомогою алгоритму локальної гомології МедаІетап апа Умипзсп (1970) (У. Мої. Віої. 48:443|, методом пошуку подібності Реагзоп апа Гіртап (1988) (Ргос. Май). Асай. 5сі. О5А 85:2444| або за допомогою комп'ютерних програм, що використовують ці алгоритми (САР,
ВЕБТРЇІТ, ЕГА5ТА і ТЕА5ТА в пакеті програм М/ізсопвіп Сіепеїїс5 боймаге РасКаде, Сепеїіс5
Сотршег Стоир, 575 5Зсієпсе Ог., Мадізоп, М/І, або за допомогою програм порівняння ВІ АЗТ МА або ВІ А5Т Р).
Відсоток ідентичності обчислюють шляхом визначення числа положень, в яких амінокислота, нуклеотид або залишок ідентичні між двома послідовностями, переважно між двома повнорозмірними послідовностями, ділення числа ідентичних положень на загальне (610) число положень у вікні вирівнювання і множення результату на 100 з отриманням відсотка ідентичності між двома послідовностями.
Наприклад, можна використовувати програму ВІ А5Т "ВІ А5Т 2 зедиеєепсевз" (Тайзома вї аї., "Віаві 2 зедиепсез - а пему/ ї00! г сотрагіпу ргоївіп апа писіеоїіде зедиепсев", РЕЕМ5 Місгобіо!., 1999, Тен. 174: 247-250), доступну на сайті РЕр:/Лимлиу.пеобрі.піт.піп.дом/доп/рі2.пІті, з параметрами за замовчуванням (конкретно для параметрів: «штраф на відкриття гепа»: 5 і «штраф на подовження гепа»: 2; вибрана матриця являє собою, наприклад, матрицю «В О5ОМ 62», запропоновану програмою); відсоток ідентичності між двома порівнюваними послідовностями обчислюється безпосередньо програмою.
Для амінокислотної послідовності, яка проявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 90905, 9595 і 9895 ідентичність еталонної амінокислотної послідовності, кращі приклади включають еталонну послідовність, що містять, деякі модифікації, зокрема, делецію, додавання або заміну щонайменше однієї амінокислоти, вкорочення або подовження. У разі заміни одної або більше послідовних або непослідовних амінокислот кращі заміни, в яких замінні амінокислоти заміщуються «еквівалентними» амінокислотами. В даному випадку під виразом «еквівалентні амінокислоти» мають на увазі вказівку на будь-які амінокислоти, з більшою ймовірністю здатні до заміни однієї з структурних амінокислот, при цьому, тим не менш, не модифікуючи біологічні активності відповідних антитіл, і конкретні приклади таких амінокислот наведені нижче.
Еквівалентні амінокислоти можна визначити або за їх структурною гомологією з амінокислотами, які вони замінюють, або за результатами порівняльних тестів на біологічну активність між різними антитілами, які, ймовірно, будуть створені.
В якості необмежувального прикладу, в таблиці 1 нижче наведена зведена інформація про можливі заміни, які, ймовірно, будуть зроблені, не приводячи в результаті до значної модифікації біологічної активності відповідного модифікованого антитіла; зворотні заміни можливі природним шляхом в тих же умовах.
Таблиця 1
Шеф 77777111 бе
Конкретний аспект винаходу полягає в тому, що антитіло АОС не зв'язується з рецептором інсуліну (ІК). Даний аспект представляє інтерес, оскільки антитіло, описане в даному документі, не зробить ніякого негативного впливу на ІЕ, тобто на метаболізм інсуліну.
В іншому втіленні винаходу ще один інший переважний аспект антитіла АОС за винаходом полягає в тому, що воно здатне зв'язуватися не тільки з ІЗЕ-1К людини, але також з ІСБЕ-1В мавпи і більш конкретно з ІСЕ-1К яванського макака. Даний аспект також представляє інтерес, оскільки сприяє оцінці токсичності, що вимагається для клінічних досліджень.
Ще в одному іншому втіленні винаходу антитілли АЮС за винаходом складається з моноклонального антитіла.
Термін «моноклональне антитіло» або «Мар», як використовують в цьому документі,
відноситься до антитіла, одержаного з популяції по суті однорідних антитіл, тобто окремі антитіла популяції ідентичні за винятком можливих мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути присутніми в незначних кількостях. Моноклональні антитіла мають високу специфічність, оскільки спрямовані на єдиний епітоп. Таке моноклональне антитіло може продукуватися єдиним клоном В клітин або гібридоми. Моноклональні антитіла можуть бути також рекомбінантними, тобто можуть бути одержані методами білкової інженерії або хімічного синтезу. Моноклональні антитіла можуть бути також виділені з фагових бібліотек антитіл. Крім того, на противагу препаратам поліклональних антитіл, які в характерному випадку включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант або епітопів, кожне моноклональне антитіло спрямовано проти єдиного епітопу антигену.
Моноклональне антитіло в даному документі включає мишине, химерне і гуманізоване антитіло, таке як описано нижче.
Антитіло переважно виділяють з гібридоми мишиного походження, зареєстрованої у французькій колекції культур мікроорганізмів (СМСМ, Інститут Пастера, 25 рю дю Доктор Руа, 75724 Париж, Седекс 15, Франція), де гібриди одержують шляхом злиття спленоцитів/лімфоцитів імунізованих мишей Ваїр/сС і клітин лінії клітин мієломи 5р 2/0-Ад 14.
В одному втіленні винаходу антитіло до І(ЗЕ-18 АОС за винаходом складається з мишиного антитіла, далі позначеного як тіІназва антитіла).
В одному втіленні винаходу антитіло до ІЗЕ-1К складається з химерного антитіла, далі позначеного як сІназва антитіла).
В одному втіленні винаходу антитіло до ІСЕ-1К. складається з гуманізованого антитіла, далі позначеного як піІназва антитіла)|.
Щоб уникнути сумнівів в подальшому описі вирази «антитіло до ІСЕ-1Е» і «Іназва антитіла|» аналогічні і включають (за відсутності протилежного опису) мишиний, химерний і гуманізований варіанти антитіла до ІОБ-1Е або «Іназва антитіла|». При необхідності використовують префікс т- (мишине), с- (химерне) або п2- (гуманізоване).
Для більшої ясності в наступній таблиці 2 проілюстровані послідовності СОР, визначені відповідно до ІМОТ, для бажаних антитіл.
Таблиця 2 11111111, Важкийланцюг | Лежийланцюг | 5ЕОЮМО совно С1СЇ111111111 совне С Ї111111111111111111111112 консенсус 00 СОН 22200113 1 їсов 7 / Ї7111111114 11111 їсров 777 |Ї777711111715 пн Сет; 1 Я ПО спо совно СГ! совне С Ї111111111111111111111112 совнІ СС 11111113 ява пп пліви 11017701198 11111 їсов 777 Ї77711111715 нн Го: У Я ПОЛО ПО совні11СГ111111111117 бовнеге С Ї111111111111111111111111112
Коївіх як ВИН ПОН КО: ЗО пал ОО вия 01011710 11111 їсов 777 Ї77711111715 нн Го: У Я ПОЛО ПО совні11СГ111111111117 бовнеге С Ї111111111111111111111111112 й тсовні 00300003 11 їсов 7777 Ї771111111719 1. пе ОО 2 Лсотя З 303030303030412734343131313135 1111111 їсовяз/// ЇЇ зо
Таблиця 2 (продовження) 11111111 | 0 ВБажкийланцюг | Лежийланцюг | 5ЕОЮМО соні Св бовнае С/Г 21906 сбовнІ СГ сова 77777719 1 їсброви 77/15 1 їсоваз7//77777771ї171111т1
Фахівцю в даній області техніки очевидно, що будь-яку комбінацію 6 СОК, як описано вище, слід розглядати в складі даного винаходу.
Як можна спостерігати з даної таблиці 2, всі антитіла, описані в даному документі, мають однакові послідовності СОК-Н2, СОВ-НЗ і СОК-12, і ця властивість представляє особливий інтерес, як описано вище.
Конкретний аспект відноситься до АЮС, де антитіло являє собою мишине антитіло, яке відрізняється тим, що антитіло також містить константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, виділені з антитіла виду, гетерологічного для миші, зокрема, людини.
Інший конкретний аспект відноситься до АОС, де антитіло являє собою химерне (с) антитіло, яке відрізняється тим, що антитіло також містить константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, виділені з антитіла виду, гетерологічного для миші, зокрема, людини.
Химерне антитіло являє собою антитіло, що містить природну варіабельну область (легкого ланцюга і важкого ланцюга), виділену з антитіла даного виду в комбінації з константними областями легкого ланцюга і важкого ланцюга антитіла виду, гетерологічного для даного виду.
Химерні антитіла можуть бути одержані шляхом використання методів рекомбінантної генетики. Наприклад, химерне антитіло може бути одержано шляхом клонування рекомбінантної ДНК, що містить промотор і послідовність, що кодує варіабельну ділянку моноклонального антитіла, що відрізняється від людського, зокрема, мишиного, і послідовність, що кодує константну область антитіла гетерологічного виду, переважно людини. Химерне антитіло АОС відповідно до винаходу, які кодуються одним таким рекомбінантним геном, може являти собою, наприклад, химерне антитіло миші-людини, при цьому специфічність цього антитіла визначається варіабельною областю, виділеної з мишиної ДНК, а його ізотип визначається константною областю, виділеної з ДНК людини.
У переважному, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло АОС за винаходом вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ХЕО
ІО МО 13 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 13, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 5 і 11; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО
ІО МО 14 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 14, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 10, 5 і 11; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність зХЕО
ІО МО 15 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІО МО 15, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 5 і 12; а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ФЕО
ІО МО 16 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 16, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 51 11; е) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ХЕО
ІО МО 17 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 17, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 5 і 12.
Під «будь-якою послідовністю, яка проявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 95965 і 9895 ідентичність зЕО ІЮО МО з 13 по 17» мають на увазі позначення послідовностей, що містять три СОК важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО 1, 2 і З, і, крім того, такі, що виявляють щонайменше 8095, переважно 8595, 90905, 9595 і 9895 ідентичність з повнорозмірною послідовністю 5ЕО ІЮ МО з 13 по 17 поза послідовностей, що відповідають СОК (тобто 5ЕО ІЮО МО 1, 2 і 3).
В іншому переважному, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло АМС за винаходом вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 18 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 18, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 7, 2 і 3; р) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ХЕО ІЮ
МО 19 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 19, їі три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 7, 2 і 3; с) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 20 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 20, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 7, 2 і 3; а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 21 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 21, їі три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності ЖЕО ІЮ МО 8,213; ї е) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 22 або будь-яку послідовність, що виявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ХЕО ІЮО МО 22, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 7, 2 і 3.
Під «будь-якою послідовністю, яка проявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 95965 і 9895 ідентичність зЕО ІЮО МО з 18 по 22» мають на увазі позначення послідовностей, що містять три СОК важкого ланцюга ЗЕОІЮО МО 4, 511 6, і, крім того, такі, що виявляють щонайменше 8095, переважно 8595, 90905, 9595 і 9895 ідентичність з повнорозмірною послідовністю 5ЕО ІЮ МО з 18 по 22 поза послідовностей, відповідних СОК (тобто 5ЕО ІЮО МО 4, 5 і 6).
Втілення винаходу відноситься до АОС, де Ар являє собою антитіло, вибране з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО 13 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 13,ї варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО 18 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 80595 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 18; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО 14 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 14, |і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО 19 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 80595 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 19; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО 15 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 15,ї варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО 20 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 80595 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 20; а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО 16 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 16, |і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО 21 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 21; і е) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО 17 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 17, Її варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО 22 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 80595 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 22.
Химерні антитіла, описані в даному документі, можуть також відрізнятися константним доменом, і більш конкретно химерні антитіла можуть бути вибрані або позначені як, наприклад, без обмеження Ідс1, Ідс2, ІдСеЗ3, ІМ, ІдА, дО або ЧЕ. Більш переважно в контексті даного винаходу химерні антитіла є ЇдС1 або Ідсаі.
Одне втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ являє собою химерне антитіло, що містить варіабельні домени МН і МІ, як описано вище, в форматі Їд1. Більш переважно це химерне антитіло містить константний домен для МН послідовності БЗЕО ІЮО МО 43 і домен каппа для МІ послідовності ЗЕО ІЮО МО 45.
Одне втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ являє собою химерне антитіло, що містить варіабельні домени МН і Мі, як описано вище, в форматі Ідс4. Більш переважно це химерне антитіло містить константний домен для МН послідовності БЕО ІЮО МО 44 і домен каппа для МІ послідовності ЗЕО ІЮО МО 45.
В іншому переважному, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло АМС за винаходом вибрано з: а) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 23 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 23, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 28 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІО МО 28, або такого, що складається з цих ланцюгів;
Б) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 24 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 24, ії легкий ланцюг 10) послідовності 5ЕО ІЮО МО 29 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 29, або такого, що складається з цих ланцюгів; с) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 25 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 25, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 30 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 30, або такого, що складається з цих ланцюгів;
Я) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО І МО 26 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 26, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 31 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 31, або такого, що складається з цих ланцюгів; і е) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 27 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 27, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 32 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІО МО 32, або такого, що складається з цих ланцюгів.
Для більшої ясності в наступній таблиці З проілюстровані послідовності МН і МІ. відповідно для бажаних химерних антитіл.
Таблиця З 77711111 | Бажкийланцюг | Легкийланцют./ | 5ЕОЮМО
Варіабельнийдомен (МН | (77777171 с?ОВЕо
Повнорозмрний.ї//-/-/:/ ОЇ 77777772 11111110 |Повнорозмрниї/:/ З | 77/28
Варіабельнийдомен (МН | /7777771171711711111ИИИ111117а4 сто
Повнорозмрний.ї///-/:/ ОЇ 77777777777771111111111111111Ї111111111241 11111110 |Повнорозмрниї/:/ З | 77/29...
Варіабельнийдомен (МН | (77777171 с?14ЕВ
Повнорозмрний.ї///-/:/ ОЇ 77777777777771111111111111111Ї1111111112571 11111111 |Повнорозмрниї/:/ /- | (30 г Д ХК
Варіабельнийдомен (МН | /(/777771111711111111ИИИ111111т16в11 с21906
Повнорозмрний.ї//-/-/:/ ОЇ 77777777777777111111111111111Ї111111111261 11111110 |Повнорозмрниї/:/ /- | 79/31
Варіабельнийдомен (МН | (77777171 с?13810
Повнорозмрний.їд///:/ ОЇ 77777772 11111111 |Повнорозмрнийї/:/ //- | 7 /-:/ 32 9 -Н
Ще один інший конкретний аспект даного винаходу стосується АОС, де «Ар» являє собою гуманізоване антитіло, яке відрізняється тим, що константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, виділені з антитіла людини, являють собою відповідно лямбда- або каппа-область і область гамма-1, гамма-2 або гамма-4. «Гуманізовані антитіла» означають антитіло, яке містить ділянки СОК, виділені з антитіла походження, що відрізняється від людського, де інші частини молекули антитіла виділено з одного (або кількох) антитіл людини. Крім того, деякі з залишків каркасного сегмента (званого
ЕК) можуть бути модифіковані для збереження зв'язуючої спорідненості.
Гуманізувані антитіла або їх фрагменти можуть бути одержані методами, відомими фахівцям в даній області техніки. Такі гуманізовані антитіла переважні для застосування в способах, що включають діагностику іп міго або превентивне та/або терапевтичне лікування іп мімо. Інші методи гуманізації, також відомі фахівцям в даній області техніки, такі як, наприклад, метод «прищеплення СОК», описаний РОЇ в патентах ЕР 0 451 216, ЕР 0 682 040, ЕР 0 939 127, ЕР 0 566 647 або 05 5,530,101, 005 6,180,370, 05 5,585,089 ії О5 5,693,761. Можна також процитувати патенти ОБ 5,639,641 або 6,054,297, 5,886,152 і 5,877,293.
В якості конкретного втілення винаходу, і як буде більш детально пояснено нижче в прикладах, в даному документі описано антитіло, що складається з п2208Е2. Таку гуманізацію можна також застосовувати до інших антитіл, що є частиною даного винаходу.
У переважному втіленні винаходу антитіло АОС відповідно до даного винаходу містить варіабельний домен важкого ланцюга (УН), що має: її СОВ-НІ, СОВ-Н2 і СОК-НЗ послідовностей ЗЕО ІО МО 7, 2 і З відповідно і ії) ЕК1, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з ІЗНМ1-46701 (З5ЕО ІЮО МО 46) зародкової лінії людини, і ії) ЕК4, виділений з ІЗН.4701 (5ЕО ІЮ МО 48) зародкової лінії людини.
У кращому втіленні винаходу антитілло АМС відповідно до даного винаходу містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), що має: її СОВ-І 1, СОВ-І2 ї СОК-ЇЗ послідовностей ЗЕО ІЮ МО 9, 5 і 11 відповідно і ії) ЕК1, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з ІЗНМ1-39701 (ЗЕО ІЮО МО 47) зародкової лінії людини, і ії) ЕК4, виділений з ІЗН.4701 (5ЕО ІЮ МО 49) зародкової лінії людини.
У кращому, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло містить: а) важкий ланцюг, що має СОК-НІ, СОВ-Н2 ї СОВ-НЗ послідовностей ЗЕОІЮО МО 7,213 відповідно, і ЕК, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з ЗНМ1-46701 (5ЕО ІЮ МО 46) зародкової лінії людини, і
ЕН4, виділений з ІЗН.4701 зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО 48); і р) легкий ланцюг, що має СОК-І1, СОВ-І2 і СОК-ЇЗ послідовностей 5ЕО ІЮО МО 9, 5 і 11 відповідно, і ЕК, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з (ЗНМ1-39701 (5ЕО ІЮ МО 47) зародкової лінії людини, і
ЕКА, виділений з ІСК.)4701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО 49).
В одному втіленні винаходу антитіло АОС відповідно до винаходу містить варіабельний домен важкого ланцюга (УН) послідовності ЗЕО ІЮ МО 33 і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності ЗЕСО ІО МО 35. Дане гуманізоване антитіло далі в даному документі називають п2208ГЕ2 («варіант 1» або «вар. 15).
В іншому втіленні винаходу антитілло АОС відповідно до даного винаходу містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності ЗЕО ІЮ МО 33, де дана послідовність
ЗЕО ІОЮ МО 33 містить щонайменше одну зворотну мутацію, обрану із залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 і 95.
Під виразом «зворотна мутація» мають на увазі мутацію або заміну залишку, присутнього в зародковій лінії людини, відповідним залишком, початково присутніх в мишиній послідовності.
В іншому втіленні винаходу антитілло АОС відповідно до даного винаходу містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності ЗЕО ІЮ МО 33, де дана послідовність
ЗЕО ІЮО МО 33 містить 2, 3,4,5,6, 7,8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 зворотних мутацій, обраних із залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79,82 і 95.
Для більшої ясності в наступній таблиці 4 проілюстровані переважні зворотні мутації.
Таблиця 4
Миша ІМ ПМ |їкїсбм іїк (мб (
Людина |М |м Ін (| Їм п |5 (А |/
Таблиця 4 (продовження)
Людина (ОО |мМ | | | 5 | (ГЕ М /
В одному втіленні винаходу антитілло АОС відповідно до даного винаходу містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності зХЕО ІЮО МО 35, де дана послідовність
ЗЕО ІЮ МО 35 містить щонайменше одну зворотну мутацію, вибрану із залишків 22, 53, 55, 65, 71,72, 77 1 87.
В одному втіленні винаходу антитілло АЮС відповідно до даного винаходу містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності зХЕО ІЮО МО 35, де дана послідовність
ЗЕО ІЮО МО 35 містить 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 зворотних мутацій, вибраних із залишків 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 або 87.
В іншому втіленні винаходу антитіло АОС відповідно до даного винаходу містить: а) варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності ЗЕО ІО МО 33, де дана послідовність ЗЕО ІЮ МО 33 містить щонайменше одну зворотну мутацію, вибрану із залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79,821 95; 1
Б) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності 5ЕО ІЮО МО 35, де дана послідовність ЗЕО ІЮ МО 35 містить щонайменше одну зворотну мутацію, вибрану із залишків
22,53, 55,65, 71,72, 77 і 87.
Для більшої ясності в наступній таблиці 5 проілюстровані переважні зворотні мутації.
Таблиця 5
Миша // |І5 (8 нм 7 5ЙЩ |мМ (в
Людина | |5 0 |5 |(є іт |5 | /
У такому втіленні винаходу антитіло АОС відповідно до винаходу містить всі згадані вище зворотні мутації і відповідає антитілу, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності «ЕО ІЮ МО 34 і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності БЕО ІЮ
МО 36. Дане гуманізоване антитіло далі в даному документі називають п27208Е2 («варіант 3» або «вар. 3»).
В іншому втіленні винаходу всі гуманізовані форми, що містяться між варіантом 1 і варіантом 3, також охоплені даним винаходом. Іншими словами, антитіло згідно винаходу відповідає антитілу, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) «консенсус» послідовності ЗЕО 10 МО 41 і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) «консенсус» послідовності ЗЕО ІЮО МО 42. Дане гуманізоване антитіло в цілому далі в даному документі буде називатися п2208Е2 («варіант 2» або «вар. 25»).
У переважному, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло АОС за винаходом вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ХЕО
ІО МО 33 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9590 і 9895 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 33, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ
МО 9,5111; і р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО
ІО МО 34 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9590 і 9895 ідентичність ЗЕО ІЮО МО 34, і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ
МО 9, 5 і 11.
Під «будь-якою послідовністю, яка проявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 33 або 34» мають на увазі позначення послідовностей, що містять три СОК важкого ланцюга 5ЕО ІО МО 1, 2 і 3, і, крім того, такі, що виявляють щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 95905 і 9895 ідентичність з повнорозмірною послідовністю ЗЕО ІЮ МО 33 або 34 поза послідовностей, відповідних СОК (тобто ЗЕО ІО МО 1,2 і 3).
Якщо це не вказано у відповідних абзацах, в даному описі під будь-якою послідовністю або під послідовністю, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність конкретної послідовності, має бути зрозуміло, що ця послідовність проявляє щонайменше 8095 і переважно 8595, 9095, 95 95 і 9895 ідентичність еталонній послідовності. Якщо ці послідовності містять послідовності СОК, це має на увазі, що послідовності, що проявляють ідентичність щонайменше цих ділянок СОК ділянок СОК еталонної послідовності 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895, ідентичність повнорозмірної послідовності, яку слід обчислити для решти послідовності, розташована поза послідовностей, які відповідають цим ділянкам СОК.
У переважному, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло даного винаходу вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ
МО 35 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичність 560 ІЮО МО 35, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ
МО 7,213; р) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ХЕО ІЮ
МО 36 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичність 560 ІЮ МО 36, і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ
МО 7,213.
Під «будь-якою послідовністю, яка проявляє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 95965 і 9895 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 35 або 36» мають на увазі позначення послідовностей, що містять три СОК легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО 4, 5 і 6, і, крім того, такі, що виявляють щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичність з повнорозмірною послідовністю ЗЕО І МО 35 або 36 поза послідовностей, відповідних СОК (тобто ЗЕО ІО МО 4, 5 і 6).
Гуманізовані антитіла, описані в даному документі, можуть також відрізнятися константним доменом, і більш конкретно гуманізовані антитіла можуть бути вибрані або позначені як,
наприклад, без обмеження Ідс1, Ідс2, дез, І9М, ІдА, дО або ІЗ4Е. Більш переважно в контексті даного винаходу гуманізовані антитіла є Їдс1 або Ідсаі.
Одне втілення винаходу відноситься до АОС, де «Аб» являє собою гуманізоване антитіло, що містить варіабельні домени МН і Мі, як описано вище, в форматі Ідс1. Більш переважно це гуманізоване антитіло містить константний домен для МН послідовності ЗЕО ІЮО МО 43 ї домен каппа для МІ. послідовності ЗЕО ІЮ МО 45.
Одне втілення винаходу відноситься до АОС, де «Аб» являє собою гуманізоване антитіло, що містить варіабельні домени МН і Мі, як описано вище, в форматі Ідс4. Більш переважно це гуманізоване антитіло містить константний домен для МН послідовності ЗЕО ІЮО МО 44 і домен каппа для МІ. послідовності ЗЕО ІЮ МО 45.
Ще одне інше втілення винаходу відноситься до АЮС, де «Аб» являє собою антитіло, вибране з: а) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 37 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 37, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 39 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 39, або такого, що складається з цих ланцюгів; і
Б) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 38 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІО МО 38, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 40 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 40, або такого, що складається з цих ланцюгів.
Для більшої ясності в наступній таблиці ба проілюстровані необмежувальні приклади послідовностей МН і Мі для варіанта 1 (вар. 1) і варіанта З (вар. 3) гуманізовані антитіла п2208БЕ2. Вона також містить консенсус-послідовність для варіанта 2 (вар. 2).
Таблиця ба 11111111 | 0 Важкийланцюг | Легкийланцюгд/ | 5ЕОЮМО
Варіабельнийдомен (МН) | (77777777 93 424 пг208Б2 11111111 |ВаріабельнийдоменіМ3уї | //-/-/оз35 47 (вар. 1) Повнорозмрний.//-/-/:О|Ї 77777771 11111111 |Повнорозмірний/:/ З | 7 /-:/ 39 З
Варіабельнийдомен (МН) | ((//7777777777Г177717171171734 пг208Б2 11111111 |ВаріабельнийдоменіМмОуї | -::/ 36 З (вар. 3) Повнорозмрний.//-/-/:|Ї7777777777777771111111111111111Г1111111881 11111111 |Повнорозмірний./:/ (| 4 4щ 40 г
ВО сс естттстикі нн ни НН НН (вар. 2) 11111111 |ВаріабельнийдоменіМмуї | -/-: 42
В іншому переважному, але не обмежувальному втіленні винаходу антитіло АМС за винаходом вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095, переважно на 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичної 5ЕО ІО МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80; і три СОК легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮ МО 9, 5 і 1;
Б) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з БЕО ІЮО МО 57 або 60 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095, переважно на 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичної 5ЕО ІЮ МО 57 або 60; і три СОК важкого ланцюга, що мають послідовності З»ЗЕОІЮО МО 7,213; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095, переважно на 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичної 5ЕО ІО МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80; і варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО 57 або 60, або будь-яку послідовність, щонайменше на 8095, переважно на 8595, 9095, 9595 і 9895 ідентичну ЗЕО ІЮ МО 57 або 60.
Ще одне інше втілення винаходу відноситься до АЮС, де «Аб» являє собою антитіло, вибране з: а) антитіла, що містить важкий ланцюг, що має послідовність зЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної ЗЕО ІЮ МО 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80; і легкий ланцюг, що має послідовність зЕО ІЮ МО 57 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 80595 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 57; і р) антитіла, що містить важкий ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО 56, 64, 68 і 78 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність з БЕО ІЮ МО 56, 64, 68 або 78; і легкий ланцюг, що має послідовність БЕО ІЮ МО 60 або будь-яку послідовність, яка виявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 60.
Ще одне інше втілення винаходу відноситься до АОС, де АБ являє собою антитіло, вибране 3: а) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 58 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІО МО 58, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів;
Б) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 58 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЕС ІЮ МО 58, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 61 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 61, або такого, що складається з цих ланцюгів; с) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 63 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 63, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮ МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів;
Я) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО І МО 65 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕСО ІЮ МО 65, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів; е) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО 65 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЕС ІО МО 65, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 61 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 61, або такого, що складається з цих ланцюгів;
ТУ) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО 67 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 67, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів; 9) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО І МО 69 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 69, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів;
Р) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 69 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 69, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 61 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 61, або такого, що складається з цих ланцюгів; ї антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО 71 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 71, ї легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів;
Ї) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО 73 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕСО ІЮ МО 73, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів;
К) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 75 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 75, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів;
ЇЇ антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО 77 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕ ІЮ МО 77, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів; т) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО 79 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 79, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів; п) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 79 або будь-якої 10) послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 79, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 61 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 61, або такого, що складається з цих ланцюгів; і о) антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності 5ЕО І МО 81 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність ЗЕО ІЮ МО 81, і легкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮО МО 59 або будь-якої послідовності, яка проявляє щонайменше 8095 ідентичність 5ЕО ІЮО МО 59, або такого, що складається з цих ланцюгів.
Іншими словами, винахід відноситься до АОС, де АБ являє собою антитіло, що містить: а) важкий ланцюг, що має послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮО МО 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 і 81 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної ЗХЕО ІО МО 58, 63, 65, 67,69, 71, 73, 75, 77, 79 або 81; і
Б) легкий ланцюг, що має послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮО МО 59 і 61 або будь-якої послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної ЗЕО ІО МО 59 або 61.
Для більшої ясності в наступній таблиці 65 проілюстровані необмежувальні приклади послідовностей МН і МІ (варіабельного домену і повнорозмірного) для різних варіантів гуманізованого антитіла п2208БЕ2.
Таблиця 6р 71111111 | Важкийланцюг | Легсийланцюг | 5ЕОЮМО 56 п2208Б2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нОЗ7/ 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 58 59 56
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) (610) нОЗ7/ 021 Повнорозмірний Повнорозмірний 58 61 62
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 но47/ 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 63 59 64
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 но49/Г 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 65 59 64
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) (610) ноОо49/ 021 Повнорозмірний Повнорозмірний 65 61 66
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57
НоОБб1/ 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 67 59 68
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 ноОБ2/Г 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 69 59 68
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) (610) нОБ2/ 021 Повнорозмірний Повнорозмірний 69 61
НггоВЕг - - 70
НОБ7Л 018 Варіабельний домен (УН) Варіабельний домен (Му 57
Повнорозмірний Повнорозмірний 71 59 72
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нобв8/ 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 73 59
Таблиця 6р 71111111 | Важкийланцюг | Легсийланцюг | 5ЕОЮМО 74
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО70/Г 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 75 59 76
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57
НО71/ 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 77 59 78
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО76/Г 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 79 59 78
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) (610) нО76/ 021 Повнорозмірний Повнорозмірний 79 61 80
НнНг2овБ2 Варіабельний домен (УН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО77/ 018 Повнорозмірний Повнорозмірний 81 59
Інший аспект даного винаходу являє собою АОС, в якому АБ являє собою антитіло, вибране з ї) антитіла, що продукується гібридомою 1-4757, І-4773, І-4775, І-4736 або І-4774, депонованою в СМСМ, Інститут Пастера, Франція, 30 травня 2013 року, 26 червня 2013 року, 26 червня 2013 року, 24 квітня 2013 року і 26 червня 2013 року відповідно, або ії) антитіла, яке конкурує за зв'язування з ІСБЕ-1К з антитілом і); або ії) антитіла, яке зв'язується з тим же епітопом ІСБ-18, що і антитіло і).
Дійсно, в даному документі описана мишина гібридома, вибрана з гібридоми 1-4757, І-4773, І- 4775, І1-4736 і І-4774, які депоновані в СМСМ, Інститут Пастера, Франція, 30 травня 2013 року, 26 червня 2013 року, 26 червня 2013 року, 24 квітня 2013 року і 26 червня 2013 року відповідно.
Також описана ізольована нуклеїнова кислота, що кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент згідно винаходу.
Терміни «нуклеїнова кислота», «послідовність нуклеїнової кислоти», «нуклеїново-кислотна послідовність», «полінуклеотид», «олігонуклеотид», «полінуклеотидна послідовність» (І «нуклеотидна послідовність», що використовуються в даному документі як взаємозамінні, означають точну послідовність нуклеотидів, модифіковану або немодифіковану, що визначає фрагмент або ділянку нуклеїнової кислоти, яка містить або що не містить неприродні нуклеотиди і являє собою або двониткову ДНК, або однониткову ДНК, або продукти транскрипції цих ДНК.
Ці послідовності ізольовані та/або очищені, тобто відібрані прямим або непрямим шляхом, наприклад шляхом копіювання, з їх оточення, щонайменше частково модифікованого. У даному документі слід також згадати ізольовані нуклеїнові кислоти, одержані методами рекомбінантної генетики, наприклад, за допомогою клітин-хазяївів, або одержані шляхом хімічного синтезу.
Також описаний вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент АОС відповідно до винаходу, зокрема, клонуючі та/або експресійні вектори, які містять таку нуклеотидну послідовність.
Вектори переважно містять елементи, які дають можливість для експресії та/або секреції нуклеотидних послідовностей в даній клітині-хазяїні. Таким чином, вектор може містити промотор, сигнали ініціації і термінації трансляції, а також відповідні регуляторні ділянки транскрипції. Він повинен мати здатність до стабільного збереження в клітині-хазяїні і може необов'язково містити специфічні сигнали, які задають секрецію трансльованого білка. Ці різні елементи вибирає і оптимізує фахівець в даній області техніки відповідно до використовуваної клітини-хазіїна. Для цієї мети нуклеотидні послідовності можуть бути вбудовані в вектори, автономно репліковані всередині обраної клітини-хазяїна, або в інтеграційні вектори обраної клітини-хазяїна.
Вектори є, наприклад, векторами плазмідного або вірусного походження. Їх використовують для трансформації клітин-хазяївів 3 метою клонування або експресії нуклеотидних послідовностей за винаходом.
Такі вектори одержують способами, зазвичай використовуваними фахівцями в даній області техніки, і одержані в результаті клони можна вводити в відповідну клітину-хазяїна стандартними способами, такими як ліпофекція, електропорація, кон'югація, тепловий шок або хімічні способи.
Ці ізольовані клітини-хазяїва трансформовані описаним вище вектором або містять цей вектор.
Клітина-хазяїн може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем, таких як, наприклад, бактеріальні клітини, а також дріжджові клітини або клітини тварин, зокрема, клітини ссавців (за винятком людини). Можна також використовувати клітини комах або рослин.
Також розкрито спосіб одержання антитіла АОС відповідно до винаходу або його антигензв'язуючого фрагмента, що включає наступні стадії: а) культивування в середовищі в умовах культивування, придатних для описаної вище клітини-хазяїна; і
Б) виділення одержаного таким шляхом антитіла з культурального середовища або з культивованих клітин.
Трансформовані клітини використовують в способах одержання рекомбінантних антитіл
АОС відповідно до винаходу. В даний опис також включені способи одержання антитіл в рекомбінантній формі з використанням вектора та/або клітини, трансформованої вектором, як розкрито вище. Переважно клітину, трансформовану вектором, як описано вище, культивують в умовах, що дають можливість експресії описаного вище антитіла і виділення цього антитіла.
Як уже згадувалося, клітина-хазяїн може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можливо ідентифікувати нуклеотидні послідовності, що сприяють секреції в такій прокаріотичній або еукаріотичній системі. Вектор, як розкрито вище, несе таку послідовність можна, отже, переважно використовувати для одержання секретованих рекомбінантних білків. Дійсно, очищення цих рекомбінантних білків, що представляють інтерес, полегшується за рахунок факту їх більш ймовірної присутності в супернатанті, ніж усередині клітин-хазяївів.
Антитіло АОС за даним винаходом може бути також одержано шляхом хімічного синтезу.
Один такий спосіб одержання також становить об'єкт винаходу. Фахівцю в даній області техніки відомі способи хімічного синтезу, такі як твердофазні методи або часткові твердофазні методи, шляхом конденсації фрагментів або шляхом традиційного синтезу в розчині. Можна також вказати поліпептиди, одержані шляхом хімічного синтезу і здатні до вмісту відповідних неприродних амінокислот.
В даний винахід також включено антитіло, яке може бути одержано описаним вище способом.
Згідно конкретного аспекту винахід відноситься до АОС, в якому АВ являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, як описано вище, для застосування в якості направляючого носія для доставлення цитотоксичного агента в сайт-мішень хазяїна, де сайт- мішень хазяїна складається з епітопа, локалізованого в ІЗЕ-1К, переважно у позаклітинному домені ІСЗЕ-1К, більш переважно ІЗЕ-1К людини (ЗЕО ІЮ МО 50) і ще більш переважно у позаклітинному домені ІЗЕ-1Ж людини (ЗЕО ІЮ МО 51) і ще більш переважно в М-кінцевій ділянці позаклітинного домену ІЗЕ-11Ж4 людини (5ЕО І МО 52) в будь-якому природному варіанті цієї послідовності.
У переважному втіленні винаходу сайт-мішень хазяїна являє собою сайт-мішень клітини ссавця, більш переважно клітини людини, більш переважно клітини, які природно або шляхом генетичної рекомбінації експресують ІСБ-1Н8.
У більш переважному втіленні винаходу сайт-мішень хазяїна являє собою сайт-мішень клітини пацієнта, переважно людини, яка страждає на рак, переважно ІСЕ-1Н-експресуючим раком або раком, обумовленим ІСЕ-18.
ІБЕ-1В-експресуючі форми раку або форми раку, обумовлені ІСЕ-1К, включають, зокрема, форми раку, де пухлинні клітини експресують або характеризуються гіперекспресією повнорозмірного ІСБЕ-1К або його ділянки на їх поверхні.
ІЇ- Лікарський засіб (0)
Угруповання лікарського засобу відповідно до винаходу має наступну формулу (І):
(,; / М -- М н М
Ї | че б МН
Ко де: - В» являє собою СООН, СООСН: або тіазоліл (такий як тіазол-2-іл), - Вз являє собою Н або (С1-Св)алкіл (такий як метил), зокрема, (С1-Св)алкільну групу, - Веявляє собою Н або (С:-Св)алкіл (такий як метил), - т являє собою ціле число, що складає від 1 до 8, їі - хвилястою лінією вказана точка приєднання до І.
Під «алкілом» в даному винаході мають на увазі прямоланцюговий або розгалужений насичений вуглеводневий ланцюг. Наприклад, можна згадати метильні, етильні, пропільні, ізопропільні, бутильні, ізобутильні, втор-бутильні, трет-бутильні, пентильні або гексильні групи.
Під «(Си х - С у)алкілом» в даному винаході мають на увазі алкільний ланцюг, такий як визначено вище, що містить від х до у атомів вуглецю. Таким чином, (Сі-Св)алкільна група являє собою алкільний ланцюг, що має від 1 до 6 атомів вуглецю. (С1-Св)алкіл здебільшого являє собою (С1-Са4)алкіл, переважно (С:і-Сг)алкіл.
Серед сполук даного винаходу одному з особливо прийнятних класів угруповань лікарського засобу відповідають угруповання лікарського засобу формули (ІІ), в яких Ко являє собою групу
СсоОнН.
Другому особливо прийнятному класу угруповань відповідають угруповання формули (Ії), в яких Кгявляє собою тіазол (зокрема, групу тіазол-2-іл).
Другому класу особливо прийнятних угруповань відповідають угруповання формули (Ії), в яких КЕ? являє собою СООМЕе.
Відповідно до одного конкретного втілення винаходу Кг більш переважно являє собою групу
СООН, СООМе або тіазол-2-іл.
Відповідно до першого переважного втілення Ко являє собою СООН.
Відповідно до другого переважного втілення Ко являє собою СООМЕе.
Вз, зокрема, являє собою (С1-Св) алкіл, переважно метильну групу. т являє собою ціле число, яке складає від 1 до 8, зокрема, від 1 до 6, переважно від 1 до 4, переважно дорівнює 1 або 2.
У кращому втіленні винаходу К2 являє собою СООН, Ез являє собою метильну групу, і т дорівнює 1 або 2.
Серед угруповань лікарських засобів за винаходом одному з особливо прийнятних класів угруповань лікарського засобу відповідають угруповання лікарського засобу формули (Ії), в яких
В» являє собою метильну групу або атом водню.
У кращому втіленні винаходу: - В» являє собою СООН, Кз являє собою метильну групу, Ко являє собою метильну групу, і т дорівнює 1 або 2, або - В? являє собою СООН, РВз являє собою метильну групу, Но являє собою атом водню, і т дорівнює 1 або 2.
Згідно з переважним втілення винаходу група МКе розташована на фенільному кільці в пара-положенні по відношенню до групи (СНг) т.
Переважно угруповання лікарського засобу вибрано з наступних угруповань:
х й (в; в) А | о |в) о б МН
М ув
І ,
Яся о
Її о А! о9.о о
М он о о...
М х те М її
МАДАМ
Її о А! о.о я
М оутин о) он о)
Н Н щ: вв о реч | о. Од
М он
Мі фу в о щ; МА
Пошив
М он о о-. зо
Н (в) она чаві ко в) ра од Ге) : он
Мі фу (в)
Н Н
М М
Іо. А! оо, б МН но (в) н з х пе М Ї
М М шк о А оо р - 9 б ин
М в
М х те М її
М М
М м
І о А! о0.о о б МН (в) ол ;і
М
- пе но
М М
М а
І о А! о0.о о б МН (Ф) он
Одержання лікарського засобу (формули ОН):
Лікарський засіб може бути одержано загальними способами, описаними на наступних нижче схемах синтезу, необов'язково доповнених при необхідності будь-якою стандартною операцією, описаної в літературі або добре відомої фахівцям в даній області техніки, або описаної в прикладах в експериментальному розділі цього документа. н її т
Фу К С ре М Ж с еватличи І | и :
Є | ; нм, А 1 «сволучення ие І до В З «сподучення -ї Ж нина їх и шо птн е і ї бе ту б-видапення 8. б отой 2 видалЮння
Бо Мей захисту захисту
НН НО ІУ ге як, ух, я а щи, На, в ма ли шен шк а. миши ее, дич ко є й «З чі ї ї ї і ЩІ А ЩЕ
Ї тн ппннкнкинанннинньна скіфк, В ве Я 5 ій ха ве Потім . Гайне в, я й необов'язкове ; тай
Б що видалення захисту є з
СУ
Схема З
На схемі 1 проілюстровано перший загальний спосіб, який можна використовувати для одержання лікарського засобу. У наведених вище загальних формулах ЕК: - Н, В» і Ез є такими,
СУ сн ня -- як визначено вище для формули ІІ, К. являє собою Ко ; Вла являє собою групу Ка, як визначено вище, необов'язково в захищеній формі, і З являє собою захисну групу.
Перша стадія полягає в конденсації сполуки (ІІ), захищеної на її амінній функціональній групі захисної групою с, із сполукою (ІІ). Х може являти собою группу, що заміщується, таку як атом хлору. У цьому випадку перша стадія полягає у взаємодії між хлорангідридом і аміном. Цю взаємодію можна проводити, використовуючи способи і методи, добре відомі фахівцям в даній області техніки. При одному особливо прийнятному способі викликають взаємодію двох хімічних сполук в присутності органічної або неорганічної основи, наприклад ЕБМ, і Рг2МЕЇ, піридину,
Ман, С52СОз, Кг2СОз в розчиннику, такому як ТГФ, дихлорметан, ДМФ, ДМСО, при температурі, зокрема, від -20 "С до 100 "С. Х може також являти собою гідроксил (ОН). У цьому випадку перша стадія являє собою реакцію конденсації між карбоновою кислотою (І) і аміном (ІІ). Цю взаємодію можна проводити, дотримуючись способів і методів, добре відомих фахівцям в даній області техніки. При одному особливо прийнятному способі викликають взаємодію цих двох хімічних сполук в присутності агента сполучення, такого як 1-(З-диметиламінопропіл)-3-етил- карбодімід (ЕС), З-гідрокси-1,2,3-бензотриазин-4(ЗН)-он, третинного аміну, такого як діізопропілетиламін, в полярному апротонному розчиннику, такому як дихлорметан або ДМФ, при температурі, зокрема, від -157С до 40 "С. При іншому особливо прийнятному способі викликають взаємодію цих двох хімічних сполук в присутності діетилфосфороціанідату (ОЕРС), третинного аміну, такого як триетиламін, в полярному апротонному розчиннику, такому як дихлорметан або ДМФ, при температурі, зокрема, від -157С до 40"б. Інший особливо прийнятний спосіб полягає в тому, що викликають взаємодію двох хімічних сполук в присутності
О-(7-азабензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію гексафторфосфату (НАТИУ), а третинного аміну, такого як діїзопропілетиламін, в полярному апротонному розчиннику, такому як дихлорметан або ДМФ, при температурі від -15 "С до 100 "С.
Після видалення захисту проміжної сполуки з використанням методів, добре відомих фахівцям в даній області техніки («Ргоїесіїме Сгоире5 іп Огдапіс Зупіпевіб», Т.М. сгеепе, Удопп
УМіеу в 5опв, 2006 і «Ргоїесііпд Сгоир5», Р.). КосієпеКкі, Тпіете Мепад, 1994), сполуку (ІМ) можна конденсувати із сполукою (М), слідуючи способам і методам, описаним вище, що приводять до сполуки (МІ) після стадії видалення захисту. Потім ця сполука після конденсації з проміжною сполукою (МІ) і необов'язкового видалення захисту веде до утворення лікарського засобу.
Сполуку (МІ) можна також піддавати сполученню із сполукою (МІ), в якої Кз являє собою попередник Кз, зокрема, групу Кз, захищену захисною групою. Сполучення, наступне за видаленням захисту групи Кз з одержанням Нз можна здійснювати, дотримуючись таких же самих методик, як описано вище. вй
З рих я бар Є х не КК ре Ки у , хдей но зе вия
Ст пон НН м В В; жк ва а я І «сполучення : шк ше: ши ша
Ї он в нн НИ М Є «я - в ра: а -видалення |! обтнн п.
У Ка захисту чи в я ев Я Ки їй ра ке ще
Кан у ов я, збо НеСНО те чити ти
У: ши Че де
Потім . ї ан в, необов'язкова і в видапаенна захисту й У -
Схема є
На схемі 2 проілюстровано другий загальний спосіб, який можна використовувати для одержання лікарського засобу. У наведених вище загальних формулах с являє собою захисну групу, Кі - НН, В», Аз і АВла є такими, як визначено вище, і Вль являє собою
НІ --
Ка
На першій стадії сполуку (ІХ), захищену на її амінній функціональнії групі захисної групою 0, конденсують з сполукою (МІ). Х може являти собою группу, що заміщується, наприклад, атом хлору. У цьому випадку перша стадія полягає у взаємодії між хлорангідридом і аміном. Цю взаємодію можна проводити, використовуючи способи і методи, добре відомі фахівцям в даній області техніки. При одному особливо прийнятному способі викликають взаємодію двох хімічних сполук в присутності органічної або неорганічної основи, наприклад ЕМ, іРг2МЕЇ, піридину,
Ман, С52СОз, Кг2СОз в розчиннику, такому як ТГФ, дихлорметан, ДМФ, ДМСО, при температурі, зокрема, від -20 "С до 100 "С. Х може також являти собою гідроксил. В цьому випадку перша стадія являє собою реакцію конденсації між карбоновою кислотою (ІХ) та аміном (МІ). Цю взаємодія можна проводити, дотримуючись способів і методів, добре відомих фахівцям в даній області техніки. При одному особливо прийнятному способі викликають взаємодію двох хімічних сполук в присутності 1-(З-диметиламінопропіл)-3-етил-карбодіїмід (ЕОС), З-гідрокси-1,2,3- бензотриазин-4(ЗН)-он, третинного аміну, такого як діїзопропілетиламін, в полярному апротонному розчиннику, такому як дихлорметан або ДМФ, при температурі, зокрема, від - 157С до 40 "С. При іншому особливо прийнятному способі викликають взаємодію цих двох хімічних сполук в присутності діетилфосфороціанідату (ОЕРС), третинного аміну, такого як триетиламін, в полярному апротонному розчиннику, такому як дихлорметан або ДМФ, при температурі, зокрема, від -15 "С до 40 70.
Після видалення захисту проміжної сполуки, використовуючи методи, добре відомі фахівцям в даній області технікию, одержана сполука (МІ) може призводити до одержання лікарського засобу після взаємодії з Вау. В цьому випадку У являє собою групу, що заміщується, таку як СІ,
Ве І, Оо5О»2СНаз, О502СЕз або О-тозил. Реакцію проводять в присутності органічної або неорганічної основи, такої як ЕМ, іРг2МЕЇ, Ман, Св52СбОз, К»СбОз, в полярному безводному розчиннику, такому як дихлорметан, ТГФ, ДМФ, ДМСО, при температурі, зокрема, від -20" до 100 "С. При іншому особливо прийнятному способі викликають взаємодію сполуки (МІ) з альдегідом формули Каь-СНО, де Каь є відповідним попереднику На. В цьому випадку реакція являє собою відновне амінування в присутності відновного агента, такого як МавнНа, мавнНзсм,
Мавн(ОАс)з, в полярному розчиннику, такому як 1,2-дихлоретан, дихлорметан, ТГФ, ДМФ,
Меон, необов'язково в присутності ізопропоксиду титану (ІМ), при рН, який можна регулювати додаванням кислоти, такої як оцтова кислота, при температурі від-20 "С до 100 "76.
На наведених вище схемах синтезу лікарський засіб може привести до одержання іншого лікарського засобу після додаткової стадії взаємодії, такого як омилення, наприклад, використовуючи способи, добре відомі фахівцям в даній області техніки, за допомогою яких група Кг, що являє собою складний ефір (СООМе), змінюється на групу К2, що являє собою карбонову кислоту (СООН).
Якщо бажано виділити лікарський засіб, що містить щонайменше одну функціональну групу основи в стані кислотно-адитивної солі, це можливо шляхом обробки лікарського засобу у формі вільної основи (що містить щонайменше одну функціональну групу основи) відповідною кислотою, переважно в еквівалентній кількості. Відповідна кислота може, зокрема, являти собою трифтороцтову кислоту.
ШІ - Лінкер (3) «Лінкер», «лінкерних ланка», «І» або «зв'язок» означають в даному винаході хімічне угруповання, що містить ковалентний зв'язок або ланцюг атомів, який ковалентно приєднує антитіло щонайменше до одного лікарського засобу.
Лінкери можуть бути одержані з використанням різноманітних біфункціональних агентів сполучення білків, таких як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)упропіонат (ЗРОР), сукцинімідил-4- (М-малеімідометил)циклогексан-і-карбоксилат (ЗМСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональних похідних складних імідоефірів (таких як диметиладипімідат НС), активних складних ефірів (таких як дисукцинімідилсуберат), альдегідів (таких як глутаральдегід), біс-азидосполук (таких як біс(пара-азидобензоїл)гександіамін), біс-діазонієвих похідних (таких як о біс-(пара- діазонійбензоїл)-етилендіамін), діїзоцианатів (таких як толуол-2,б-діїззоціанат) і біс-активних сполук фтору (таких як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Вуглець-14-мічена 1- ізотіоціанатобензил-З-метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) є ілюстративним хелатуючим агентом для кон'югації цитотоксичних агентів з направляючою системою. Інші перехресно-зшиваючі агенти можуть являти собою ВМР5, ЕМСОС5, ЗМВ5, НВМ5, І С-5МОС,
МВ5, МРВН, ЗВАР, ІА, ЗБІАВ, ЗМОСС, 5МРВ, 5МРН, сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-
КМИ5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-ЗМОС і сульфо-5МРВ і 5М5В (сукцинімідил-(4- вінілсульфон)бензоат), які маються в продажу (наприклад, від Рієгсе Віоїесппоіоду, Іпс.,
Рокфорд, ІП., США).
Лінкер може бути «нерозщеплюваним» або «розщеплюваним».
У переважному втіленні винаходу лінкер являє собою «розщеплюваний лінкер», що сприяє вивільненню лікарського засобу в клітині. Наприклад, можна використовувати кислотолабільний лінкер, пептидазочутливий лінкер, фотолабільний лінкер, диметильний лінкер або дисульфід- містячий лінкер. У переважному втіленні винаходу лінкер є розщеплювальним у внутрішньоклітинних умовах, так що в результаті розщеплення лінкера лікарський засіб вивільняється від антитіла у внутрішньоклітинне середовище.
Наприклад, в деяких втіленнях винаходу лінксер є розщеплюючим розщеплювальним агентом, присутнім у внутрішньоклітинному середовищі (наприклад, всередині лізосоми, або ендосоми, або кавеоли). Лінкер може являти собою, наприклад, пептидильний лінкер, який розщеплюється внутрішньоклітинними ферментами пептидазою або протеазою, включаючи без обмежень лізосомальну або ендосомальну протеазу. Як правило, пептидильний лінкер містить щонайменше дві послідовні амінокислоти або щонайменше три послідовні амінокислоти, або має довжину щонайменше дві амінокислоти або довжину щонайменше три амінокислоти.
Розщеплюючі агенти можуть включати катепсини В і О і плазмін, при цьому відомо, що всі ці агенти гідролізують дипептидні похідні лікарських засобів, приводячи в результаті до вивільнення активного лікарського засобу всередині клітин-мішеней. Наприклад, можна використовувати пептидильний лінкер, розщеплюваний тіолзалежною протеазою катепсином-В, володіє високим рівнем експресії в раковій тканині (наприклад, лінкер, що містить або являє собою РІе-Геи або СіІу-РНе-І еи-СІу). У конкретних втіленнях винаходу пептидильний лінкер, розщеплюваний внутрішньоклітинною протеазою, містить або являє собою Ма!-Сії або Рпе-ї ув.
Одна з переваг використання внутрішньоклітинного протеолітичного вивільнення лікарського засобу полягає в тому, що при кон'югації лікарський засіб, як правило, аттенуїровано, і стабільності кон'югатів в сироватці, як правило, високі.
В інших втіленнях винаходу розщеплюваний лінкер є рН-чутливим, тобто чутливим до (610) гідролізу при деяких значеннях рН. У характерному разі рН-чутливий лінкер є гідролізованим в кислих умовах. Наприклад, можна використовувати кислотолабільний лінкер, який піддається гідролізу в лізосомах (наприклад, гідразон, семікарбазон, тіосемікарбазон, цис-аконітовий амід, складний ортоефір, ацеталь, кеталь або тощо). Такі лінкери відносно стабільні в нейтральних умовах рН, наприклад, в крові, але нестабільні при рН менше 5,5 або 5,0, приблизному рН лізосоми. У деяких втіленнях винаходу гідролізований лінкер являє собою простий тіоефірний лінкер (такий як, наприклад, простий тіоефір, приєднаний до лікарського засобу за допомогою ацилгідразонового зв'язку).
Ще в інших втіленнях лінкер є розщеплюєваним в відновних умовах (наприклад, дисульфідний лінкер). У даній області техніки відомий ряд дисульфідних лінкерів, що включають, наприклад, лінкери, які можуть бути утворені з використанням ЗАТА (М- сукцинімідил-5-ацетилтіоацетат), ЗРОР (М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат), ЗРОВ (М- сукцинімідил-3-(2-піридилтіо)бутират) ії ЗМРТ (М-сукцинімідил-оксикарбоніл-альфа-метил- альфа-(2-піридил-дитіо)толуол).
У деяких бажаних втіленнях винаходу лінкерна ланка може мати таку загальну формулу: «Пам ж-(Юу- де:
Т являє собою подовжуючу ланку; а дорівнює 0 або 1;
М/ являє собою амінокислотну ланку; м являє собою ціле число в діапазоні від 0 до 12;
У являє собою спейсерну ланку; у дорівнює 0, 1 або 2.
Подовжуюча ланка (Т) при її наявності пов'язує антитіло з амінокислотною ланкою (М/) при її наявності, або зі спейсерною ланкою при її наявності, або безпосередньо з лікарським засобом.
Корисні функціональні групи, які можуть бути присутніми на антитілі, або природним шляхом, або за допомогою хімічної маніпуляції, включають сульфгідрил, аміно, гідроксил, аномірну гідроксільну групу вуглеводу і карбоксил. Відповідними функціональними групами є сульфгідрил і аміно. Сульфгідрильні групи можуть бути утворені шляхом відновлення внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків антитіла при їх наявності. Альтернативно сульфгідрильні групи можуть бути утворені шляхом взаємодії аміногрупи лізінового угруповання антитіла з 2-імінотіоланом або з іншими реагентами, що утворюють сульфгідрил. У конкретних втіленнях винаходу антитіло сконструйовано таким чином, що воно несе один або більше лізинів. Більш переважно антитіло може бути сконструйовано таким чином, що воно несе один або більше цистеїнів (див. ТпіоМаб).
У деяких конкретних втіленнях винаходу подовжуюча ланка утворює зв'язок з атомом сірки антитіла. Атом сірки може мати походження від сульфгідрильної (-5Н) групи відновленого антитіла.
У деяких інших конкретних втіленнях винаходу подовжуюча ланка пов'язана з антитілом за допомогою дисульфідного зв'язку між атомом сірки антитіла і атомом сірки подовжуючої ланки.
В інших конкретних втіленнях винаходу активна група подовжуючої ланки містить активний центр, який може взаємодіяти з аміногрупою антитіла. Аміногрупа може являти собою аміногрупу аргініну або лізину. Відповідні активні центри, які взаємодіють з амінами, включають без обмежень активовані складні ефіри (такі як сукцинімідні складні ефіри, 4-нітрофенільні складні ефіри, пентафторфенільні складні ефіри), ангідриди, хлорангідриди, сульфонілхлориди, ізоціанати та ізотіоціанати.
Ще в одному іншому аспекті винаходу реакційна функціональна група подовжуючої ланки містить активний центр, який взаємодіє з модифікованою вуглеводною групою, яка може бути присутньою на оантитілі. У конкретному втіленні винаходу антитіло глікозильованого ферментативним шляхом з одержанням вуглеводного угруповання або глікозильованого природним шляхом. Вуглевод можна піддавати м'якому окисленню реагентом, таким як періодат натрію, і одержана в результаті карбонільна ланка окисленого вуглеводу може бути конденсована з подовжуючою ланкою, яка містить функціональну групу, таку як гідразид, оксим, активний амін, гідразин, тіосемікарбазид, гідразинкарбоксилат або арилгідразид.
Згідно конкретного втілення винаходу подовжуча ланка має наступну формулу:
0)
І» нд
Ге, де
Їг2 являє собою (С4-Сіо)циклоалкіл-карбоніл, (Со-Св)алкіл або (С2-Св)алкіл-карбоніл (циклоалкільні або алкільні угруповання пов'язані з атомом азоту малеїмідного угруповання), зірочкою вказана точка приєднання до амінокислотної ланки при її наявності, до спейсерної ланки при її наявності або до лікарського засобу О, і хвилястою лінією вказана точка приєднання до антитіла АБ.
Під «(С«-Сіо)уциклоалкілом» в даному винаході мають на увазі вуглеводневий цикл, що має від 4 до 10 атомів вуглецю, що включає без обмежень циклопентил, циклогексил тощо.
Ї» може переважно являти собою (С2-Св)алкіл-карбоніл, такий як пентил-карбоніл, наступної формули: ситет (в) де зірочкою вказана точка приєднання до амінокислотної ланки при її наявності, до спейсерної ланки при її наявності або до лікарського засобу Ю; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до атому азоту малеїмідного угруповання.
Амінокислотну ланку (М/) при її наявності пов'язує подовжуюча ланка (Т) при її наявності або в іншому випадку антитіло з спейсерною ланкою (У) при наявності спейсерної ланки або з лікарським засобом під час відсутності спейсерної ланки.
Як зазначено вище, (ММ)ж відсутня (м/ дорівнює 0) або може являти собою дипептидну, трипептидну, тетрапептидну, пентапептидну, гексапептидну, гептапептидну, октапептидну, нонапептидну, декапептидну, ундекапептидну або додекапептидну ланку, де амінокислоти, що утворюють пептиди, можуть відрізнятися один від одного.
Так, (М/)ж може бути представлена наступною формулою: (М/1)м (М/2)м2 (МУЗ) м (М 4) ма (МБ) мн, де кожний з М/1-МУ5 являє собою незалежно один від одного амінокислотну ланку, і кожна м/1-- м/5 дорівнює 0 або 1.
У деяких втіленнях винаходу амінокислотна ланка (МУ); може містити амінокислотні залишки, такі як зустрічаються в природі, а також мінорні амінокислоти і такі, що не зустрічаються в природі аналоги амінокислот, такі як цитрулін.
Амінокислотні залишки амінокислотної ланки (М/)ж включають без обмеження аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, триптофан, пролін, лізин, незахищений або захищений ацетилом або формілом, аргінін, аргінін, незахищений або захищений тозильними групами або нітрогрупами, гістидин, орнітин, орнітин, захищений ацетилом або формілом, і цитрулін. Ілюстративні компоненти амінокислотного лінксера включають переважно дипептид, трипептид, тетрапептид або пентапептид, зокрема, дипептид або трипептид.
Ілюстративні дипептиди включають: Ма1-Сії, АІа-Маї!, Аіа-АІа, Ма!-Айа, І увз-І ув, СИП-Сії, Ма!-Г ув,
Аіа-Рпе, Рпе-Гув, Аїа-Гуз, Рие-Сії, Геци-Сії, Пе-Сії, Тутр-Сії, Ріпе-АІа, Рпе-М-тозил-Агу, РІе-Ме- нітро-Ага.
Ілюстративні трипептиди включають: Ма!-Аіа-Маї, АІа-Авп-Маї, Ма!-І еиш-І уз, Аіа-АІа-Авп, РНе-
Рпе-Гуз, Спу-сСту-Сспу, О-Рпе-РНе-Гув, Сіу-РНе-Г ув.
Ілюстративні тетрапептиди включають: Спіу-Рпе-І еш-Сту (ЗЕО ІО МО 53), Аїа-їЇ еи-Аїа-І еи (ЗЕО ІО МО 54).
Ілюстративний пентапептид включає: Рго-МаІ-Сіу-МаІ-Ма! (ЗЕО ІО МО 55).
Згідно конкретного втілення винаходу (МуУ)х» може являти собою дипептид (тобто м дорівнює 2), такий як Ма!-Сії, або в лінкері відсутня амінокислотна ланка (м дорівнює 0). При відсутності в лінкері амінокислотної ланки переважно в ньому також відсутня спейсерна ланка.
Згідно з переважним втілення винаходу м/ дорівнює 0 (тобто (М/)ж являє собою простий зв'язок) або м/ дорівнює 2 (тобто (М/)ж являє собою дипептид) і (МУ)ж може бути, таким чином, вибрана з:
Зб і)
ІК .
КО
Е Н т о (Аіа-Аїа), () ан:
Е Н р (в) ! (мМа!-Ага) і
Ше й
МН
()
Ж :
ОТО
Е н ра (в) (Ма!-СіЮ і, зокрема, являє собою Маї!-Сії, де зірочкою вказана точка приєднання до спейсерної ланки при її наявності або до лікарському засобу О; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до І».
Компоненти амінокислотного лінкера можуть бути сконструйовані і оптимізовані за їх селективністю до ферментативного розщеплення конкретним ферментом, наприклад, пухлиноасоційованою протеазою, катепсином В, С і О або плазміновою протеазою.
Амінокислотна ланка лінкера може ферментативно розщеплюватися ферментом, що включає без обмеження пухлиноасоційовану протеазу, з вивільненням лікарського засобу.
Амінокислотна ланка може бути сконструйована і оптимізована за її селективністю до ферментативного розщеплення конкретною пухлиноасоційованою протеазою. Відповідні ланки є ланками, розщеплення яких каталізується протеазами, катепсином В, С і О та плазміном.
Спейсерна ланка (ХУ) при її наявності пов'язує амінокислотну ланку при її наявності або подовжуючу ланка при її наявності або в іншому випадку антитіло з лікарським засобом.
Спейсерні ланки належать до двох різних типів: саморозщеплювальні і дне саморозщеплювальні. Не саморозщеплювальна спейсерна ланка являє собою ланку, в якій вся спейсерна ланка або її частина залишається пов'язаною з лікарським засобом після ферментативного відщеплення амінокислотної ланки від кон'югата антитіла з лікарським засобом. Приклади не саморозщеплювальної спейсерної ланки включають без обмежень спейсерну ланку (гліцин-гліцин) і гліцинову спейсерну ланку. Для вивільнення лікарського засобу всередині клітини-мішені повинна відбуватися незалежна реакція гідролізу для розщеплення зв'язку гліцин-лікарська ланка.
У конкретному втіленні винаходу не саморозщеплювальна спейсерна ланка (У) являє собою су.
Альтернативно кон'югат антитіла з лікарським засобом, що містить саморозщеплювальну спейсерну ланка, може вивільняти лікарський засіб без необхідності в окремій стадії гідролізу. У цих втіленнях винаходу (У) являє собою залишок ланки пара-амінобензилового спирту (РАВ), який пов'язаний з (М/)ж за допомогою атома азоту групи РАВ і з'єднаний безпосередньо з лікарським засобом складноефірною, карбонатною, карбаматною або простою ефірною групою.
Інші приклади саморозщеплювальних спейсерів включають без обмежень ароматичні сполуки, електронно еквівалентні групі РАВ, такі як залишки похідних 2-аміноімідазол-5- метанолу та орто або пара-амінобензилацеталей. Можна використовувати спейсери, що легко зазнають циклізації після гідролізу амідного зв'язку, такі як заміщені і незаміщені аміди 4- аміномасляної кислоти, заміщені відповідним чином біцикло|2.2.1| і біцикло|2.2.2| кільцеві системи та аміди 2-амінофенілпропіонової кислоти.
В альтернативному втіленні винаходу спейсерна ланка являє собою розгалужену біс
(гідроксиметил)стирольну (ВНМ5) ланку, яку можна використовувати для включення додаткових лікарських засобів.
У конкретному втіленні винаходу спейсерна ланка (У) являє собою РАВ-карбоніл, де РАВ
Н
ХМ их
С в. являє собою и (де атом кисню ланки РАВ зв'язаний з карбонілом), і у дорівнює 1, або в лінкері відсутня спейсерна ланка (у дорівнює 0).
В конкретному втіленні винаходу лінкер має наступну формулу (ІП): (о; дя 5 М о; (І) де
Їг2 являє собою (Са4-Сіо)циклоалкіл-карбоніл, (С2-Св)алкіл або (С2-Св)алкіл-карбоніл (де карбоніл цих угруповань при його наявності зв'язаний з (М/)м),
М/ являє собою амінокислотну ланку, де м/ являє собою ціле число, що складає від 0 до 5,
Н хАМ я
С ви
У являє собою РАВ-карбоніл, де РАВ являє собою и (атом кисню ланки РАВ зв'язаний з карбонілом), і у дорівнює 0 або 1 (переважно у дорівнює 0, коли м дорівнює 0, і у дорівнює 0 або 1, коли м складає від 1 до 5), зірочкою вказана точка приєднання до лікарського засобу ОЮ, і хвилястою лінією вказана точка приєднання до антитіла АБ.
Переважно !2 являє собою (С2-Св)алкіл-карбоніл, такий як пентил-карбоніл наступної формули:
Ж о де зірочкою вказана точка приєднання до (М/м; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до атому азоту малеїмідного угруповання.
Згідно з переважним втілення винаходу лінкер І. вибраний з:
Ше
МН
Ге) (6)
Н Н
М М
В М х М
Е Н в) р (в) о . в) ва о ;
Ше й
МН
Ге) (в) ще й
Е тр : М
Е Н аа в) (о; ;і о,
Ж в) (о; з де зірочкою вказана точка приєднання до лікарського засобу 0, а хвилястою лінією вказана точка приєднання до антитіла АБ.
ЇМ - Кон'югат антитіла з лікарським засобом (АБС)
У переважному втіленні винаходу кон'югат антитіла з лікарським засобом за винаходом може бути одержаний будь-яким способом, відомим фахівцям в даній області техніки, таким як, без обмежень, ї) взаємодія нуклеофільної групи антитіла з двовалентним лінкерним реагентом з наступною взаємодією з нуклеофільною групою лікарського засобу або ії) взаємодія нуклеофільної групи лікарського засобу з двовалентним лінкерним реагентом з наступною взаємодією з нуклеофільною групою антитіла.
Нуклеофільні групи на антитілі включають без обмежень М-кінцеві амінні групи, амінні групи бічного ланцюга (наприклад, лізину), тіольні групи бічного ланцюга і гідроксільні або аміногрупи цукру в разі глікозильованого антитіла.
Нуклеофільні групи на лікарському засобі включають без обмежень амінні, тіольні і гідроксильні групи, і переважно амінні групи.
Амінні, тіольні і гідроксільні групи є нуклеофільними та здатні взаємодіяти з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами на лінкерних угрупованнях і лінкерних реагентах, що включають без обмежень активні складні ефіри, такі як складні ефіри М- гідроксисукциніміди (МН5), складні ефіри М-гідроксибензотриазоли (НОВІ), галогенформіати і галогенангідриди; алкіл- і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; альдегіди; кетони; карбоксил і малеїімідні групи. Антитіло може мати відновлювані міжланцюгові дисульфідні зв'язки, тобто цистеїнові місточки. Антитіло можна зробити активним для кон'югації з лінксерними реагентами шляхом обробки відновлювальним агентом, таким як ДТТ (дитіотрейтол). Кожен цістеїновий місток, таким чином, теоретично утворює дві активні тіольні нуклеофільні групи.
Додаткові нуклеофільні групи можна вводити в антитіло за допомогою будь-якої реакції, відомої фахівцям в даній області техніки. В якості необмежувального прикладу активні тіольні групи можна вводити в антитіло шляхом введення одного або більше залишків цистеїну.
Кон'югати антитіла з лікарським засобом можуть бути також одержані шляхом модифікації антитіла з введенням електрофільних угруповань, які можуть взаємодіяти з нуклеофільними замісниками на лінкерному реагенті. Цукри глікозильованого антитіла можуть бути окислені з утворенням альдегідних або кетонних груп, які можуть взаємодіяти з амінною групою лінкерних реагентів або лікарського засобу. Одержані в результаті іміногрупи, що являють собою
Шиффові основи, можуть утворити стабільний зв'язок або можуть бути відновлені з утворенням стабільних амінних зв'язків. В одному втіленні винаходу в результаті взаємодії вуглеводної частини глікозильованого антитіла або з галактозооксидазою, або з мета-періодатом натрію можна одержати карбонільні (альдегідні або кетонні) групи в білку, які можуть взаємодіяти з відповідними групами на лікарський засіб. В іншому втіленні винаходу білки, що містять М- кінцеві залишки серину або треоніну, можуть взаємодіяти з мета-періодатом натрію з одержанням в результаті альдегіду замість першої амінокислоти.
У переважному втіленні винаходу кон'югат антитіла з лікарським засобом за винаходом одержують шляхом підготовки угруповання лікарський засіб-лінксер з подальшим сполученням між нуклеофільною групою антитіла (наприклад, групою 5Н цістеїнового угруповання) і електрофільною групою угруповання лікарський засіб-лінкер (наприклад, малеїіміду). 1. Лікарський засіб-лінкер
Угруповання лікарський засіб-лінкер може бути одержано шляхом сполучення: - лінкера з лікарським засобом, - частини лінкера з лікарським засобом до завершення синтезу лінкера, - лінкера з частиною або попередником лікарського засобу до завершення синтезу лікарського засобу, або - частини лінкера з частиною або попередником лікарського засобу до завершення синтезу лікарського засобу.
Реакції сполучення є добре відомими реакціями для фахівця в даній області техніки між нуклеофільною групою і електрофільною групою.
Нуклеофільна група може являти собою, зокрема, амінну, тіольну або гідроксільну групу. У переважному втіленні винаходу вона являє собою первинну або вторинну амінну групу.
Електрофільна група може являти собою карбоново-кислотну групу (СООН), необов'язково в активованій формі, або активоване карбонатне складноефірне угруповання.
Під «активованою формою» карбонової кислоти мають на увазі карбонову кислоту, в якій угруповання ОН функціональної групи СООН заміщене активованою групою, що заміщується (І с), що забезпечує сполучення активованої карбоново-кислотної групи з аміногрупою з метою утворення амідного зв'язку і вивільнення сполуки І С-Н. Активовані форми можуть являти собою активовані складні ефіри, активовані аміди, ангідриди або галогенангідриди, такі як хлорангідриди. Активовані складні ефіри включають похідні, утворені шляхом взаємодії карбоново-кислотної групи з М-гідроксибензотриазолом або М-гідроксисукцинімідом.
Під «активованим карбонатним складним ефіром» мають на увазі карбонатний складний ефір, що містить угруповання -«ОС(ООЕК, в якому ОВ являє собою гарну групу, яка заміщується, що забезпечує сполучення активованого карбонатного складного ефіру з аміногрупою з метою утворення карбаматного угруповання і вивільнення сполуки КОН. Група К активованого карбонатного складного ефіру включає без обмежень пара-нітрофенільну, пентафторфенільну, 2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-ільну і бензильну групи, переважно пара-нітрофенільну і пентафторфенільну групи.
Коли лінкер має наступну формулу (ІП): о;
Яд 5 М (в) (І) угруповання лікарський засіб-лінкер має наступну формулу (ПП): о) ан
М
) (М) і остання стадія синтезу угруповання лікарський засіб-лінкер в цілому являє собою сполучення сполуки наступної формули (М): о)
М о (М)
де 2 є таким, як визначено вище, і б являє собою групу, що заміщується, зокрема, галогенід, такий як хлорид або групу, одержану з М-гідроксисукциніміду, і сполуки наступної формули (МІ):
НА - Ух Хх (му-о (МІ).
Коли у дорівнює 1 і М - РАВ-карбоніл, сполука формули (МІ) може бути одержна шляхом сполучення між лікарським засобом (ОН) і сполукою наступної формули (МІ), переважно її захищеної форми:
О-(МХ-АРАВ-ЯСО-0ИОЯОВ (МІ) де МУ і м/ є такими, як визначено вище, і А є таким, як вказано у визначенні «активованого карбонатного складного ефіру», і С являє собою Н або захисну групу.
Коли сполука формули (МІЇ) знаходиться в захищеній формі, необхідна кінцева стадія видалення захисту.
Коли у дорівнює 0, сполука (МІ) має формулу Н-(УМ)м-О, де (УМ)ж і переважно О складаються з амінокислотних ланок. Отже, сполука (МІ) може бути одержана в даному випадку способом традиційного пептидного синтезу, добре відомим фахівцям в даній області техніки. 2. Ар-лінкер-лікарський засіб
Бажане втілення відповідно до винаходу полягає в сполученні між цистеїном, присутнім на антитілі, і електрофільної групою угруповання лікарський засіб-лінкер, переважно з малеімідним угрупованням, присутнім на угрупованні лікарський засіб-лінкер.
Сполучення малеїімід-цдистеїн можна виконувати способами, добре відомими фахівцям в даній області техніки.
В цілому антитіла не містять велику кількість або зовсім не містять вільних і активних тіольних груп цистеїну, які можна зшивати з угрупованням лікарського засобу. Більшість тіольних груп цистеїнових залишків в антитілах існує у вигляді дисульфідних місточків і повинні бути відновлені відновлюючим агентом, таким як дитіотрейтол (ДТТ) або трис-2- карбоксіегилфосфін (ТСЕР), в умовах часткового або повного відновлення. Навантаження (відношення лікарський засіб/антитіло) АОС можна регулювати кількома різними шляхами, що включають: (ї) обмеження молярного надлишку проміжної сполуки лікарський засіб-лінкер (013 або лінкерного реагенту відносно антитіла, (ї) обмеження часу або температури реакції кон'югації, і (ії) умови часткового або обмеженого відновлення для модифікації тіолу цистеїну.
Структура дисульфідного зв'язку (ІД людини в даний час добре встановлена (огляд в І ій апа Мау, тАб5 4 (2012): 17-23). Насправді є безліч подібностей і деякі відмінності, що стосуються структур дисульфідного зв'язку 4 підкласів | людини, а саме Ідс1, Ідс2, ДОЗ і
ІЧ9е4. Всі підкласи дО містять 12 інваріантних внутрішньоланцюгових дисульфідних місточків, і відмінності полягають в їх міжланцюгових дисульфідних зв'язках, утворених між важким і легким ланцюгами. Кожний внутрішньоланцюговий дисульфідний зв'язок асоційований з окремим доменом Ідс, тобто варіабельними (МІ. і МН) і константними (СІ, СНІ, СН52 і СНЗ) доменами. 2 важкі ланцюги зшиті в їх шарнірній області варіабельності числом дисульфідних місточків: 2 для
ІЧФО1 і Ід24, 4 для Ідса2 і 11 для Ід3. Важкі і легкі ланцюги ІдДс1 з'єднані дисульфідним зв'язком між останнім залишком цистеїну легкого ланцюга і п'ятим залишком важкого ланцюга, тоді як для інших підкласів, Ідс2, дез і Ід04, легкий ланцюг зшитий з важким ланцюгом дисульфідним зв'язком між останнім залишком цистеїну легкого ланцюга і третім залишком цистеїну важкого ланцюга, який розташований на межі доменів УН і СНІ. Структури дисульфідних зв'язків, що відрізняються від цих класичних структур, описані для Ідвеса2 і Ідс4 (огляд в іш апа Мау, тАбрз 4 (2012): 17-23). Міжланцюгові дисульфідні зв'язки в високому ступені піддаються впливу розчинника і, отже, значно активніші, ніж внутрішньоланцюгові дисульфідні зв'язки, які поглиблені в антипаралельних структурах бета-шару всередині кожного домена і не піддаються впливу розчинника. З цих причин незалежно від ізотипу антитіла сполучення буде відбуватися на міжланцюгових відкритих залишках цистеїну після відновлення в м'яких умовах. Таким чином, кожен міжланцюговий дисульфідний місточок може теоретично утворити два центри кон'югації.
Додаткові нуклеофільні групи можна вводити в антитіла за допомогою взаємодії лізинів з 2- імінотіолпаном (реагентом Трота), що приводить в результаті до перетворення аміну в тіол.
Активні тіольні групи також можна вводити в антитіло (або його фрагмент) шляхом конструювання одного, двох, трьох, чотирьох або більше залишків цистеїну (наприклад, одержання мутантних антитіл, що містять один або більше ненативних амінокислотних залишків цистеїну). У патенті О5 7521541 заявлено конструювання антитіл шляхом введення активних цістеїнових амінокислот.
Цистеїнові амінокислоти можуть бути сконструйовані в активних центрах в антитілі, і які не утворюють внутрішньоланцюгові або міжмолекулярні дисульфідні зшивання (дипиїціа, еї аї., 200806 Майте Віоїтесн., 26 (8): 925-932; Богпап єї а! (2009) Віоса 114 (13): 2721-2729; 05 7521541; 5 7723485; МО2009/052249). Сконструйовані тіоли цистеїну можуть взаємодіяти з лінксерними реагентами або з реагентами лікарський засіб-лінксер за даним винаходом, які мають взаємодіючі з тіолом, електрофільні групи, такі як малеїмід, або альфа-галогенаміди з утворенням АОС з антитілами з сконструйованими цистеїнами і угрупованнями лікарського засобу. Таким чином, положення угруповання лікарського засобу може бути сконструйовано, відрегульовано і відомо. Навантаження лікарським засобом можна регулювати, оскільки сконструйовані тіольні групи цистеїну в характерному випадку взаємодіють з лінкерними реагентами, взаємодіючими з тіолами, або реагентами лікарський засіб-лінкер з високим виходом. В результаті конструювання до антитіла з введенням амінокислоти цистеїну шляхом заміни в одному сайті на важкому або легкому ланцюзі одержують два нових цистеїни на симетричному антитілі. Навантаження лікарським засобом близько 2 може бути досягнуто майже з однорідністю продукту кон'югації АОС.
Де більше ніж одна нуклеофільна або електрофільна група антитіла взаємодіє з проміжною сполукою лікарський засіб-лінкер або лінкерним реагентом з наступною взаємодією з реагентом угруповання лікарського засобу, одержаний в результаті продукт являє собою суміш сполук
АС з розподілом угруповань лікарського засобу, приєднаних до антитіла, наприклад, 1, 2, З і т.д. Способами рідинної хроматографії такими як полімерна звернена фаза (ПЛЗФ) і гідрофобна інтерактивна хроматографія (ГІХ), можна розділяти сполуки в суміші за величиною навантаження лікарським засобом. Можна виділити препарати АОС з одною величиною навантаження лікарським засобом (р), проте, ці АОС з одною величиною навантаження лікарським засобом можуть все ж являти собою гетерогенні суміші, оскільки угруповання лікарського засобу можуть бути приєднані за допомогою лінкера в різних сайтах на антитілі.
Для деяких кон'югатів антитіло-лікарський засіб частку лікарського засобу можна обмежити числом сайтів приєднання на антитілі. Високе навантаження лікарським засобом, наприклад, частка лікарського засобу понад 5, може викликати агрегацію, нерозчинність, токсичність або втрату клітинної проникності деяких кон'югатів антитіло-лікарський засіб. Як правило, в ході реакції кон'югації з антитілом кон'6Юптують менше число угруповань лікарського засобу, ніж теоретичний максимум.
Навантаження лікарським засобом, також звана відношенням лікарського засобу до антитіла (ОАВ), являє собою середнє число угруповань лікарського засобу на клітинно-
З5 зв'язуючий агент.
У разі ізотипів антитіла ІдсС1 і Ідс4, де лікарські засоби пов'язують з цистеїнами після часткового відновлення антитіла, навантаження лікарським засобом може перебувати в діапазоні від 1 до 8 угруповань лікарського засобу (0) на антитіло, тобто де 1,2,3,4,5,6,718 угруповань лікарського засобу ковалентно приєднані до антитіла.
У разі ізотипу антитіла Ід02, де лікарські засоби пов'язують з цистеїнами після часткового відновлення антитіла, навантаження лікарським засобом може перебувати в діапазоні від 1 до 12 угруповань лікарського засобу (0) на антитіло, тобто де 1,2, 3,4,5,6, 7,8, 9, 10,11 ї 12 угруповань лікарського засобу ковалентно приєднані до антитіла.
Композиції АОС включають колекції клітинно-зв'язуючих агентів, наприклад, антитіл, кон'югованих з лікарськими засобами в кількості, що знаходиться в діапазоні від 1 до 8 або від 1 до 12.
Середнє число угруповань лікарського засобу на антитіло в препаратах АОС з реакцій кон'югації можна охарактеризувати традиційними методами, такими як УфФф-спектрометрія, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) з оберненою фазою, ГІХ, мас-спектрометрія, кількісний аналіз ІФА і електрофорез.
В якості необмежувального втілення винаходу в даному документі представлена кон'югація з антитілом с208Е2. В цьому випадку лікарський засіб піддають сполученню щонайменше з одним цистеїном, обраним з ї) залишку Су в положенні 214 легкого ланцюга послідовності ЗЕО
ІО МО 28 і ії) залишків Суз5 в положенні 223, 229 і 232 важкого ланцюга послідовності БЗЕО ІЮ МО 555: ЦД 23.
В якості необмежувального втілення винаходу в даному документі представлена кон'югація з антитілом с208Е2. В цьому випадку лікарський засіб піддають сполученню з двома, трьома або чотирма цистеїнами, вибраними з ї) залишку Суб в положенні 214 легкого ланцюга послідовності БЕО ІЮ МО 28 і її) залишків Суз5 в положенні 223, 229 і 232 важкого ланцюга 10) послідовності зЕО ІЮ МО 23.
В якості необмежувального втілення винаходу в даному документі представлена кон'югація з антитілом п2208Е2. (вар. 1). В цьому випадку лікарський засіб піддають сполученню щонайменше з одним цистеїном, вибраним з ї) залишку Суб в положенні 214 легкого ланцюга послідовності ЕС ІЮ МО 39 і її) залишків Суз5 в положенні 223, 229 і 232 важкого ланцюга послідовності зЕО ІЮ МО 37.
В якості необмежувального втілення винаходу в даному документі представлена кон'югація з антитілом п27208БГЕ2 (вар. 3). В цьому випадку лікарський засіб піддають сполученню з двома, трьома або чотирма цистеїнами, вибраними з ї) залишку Су5 в положенні 214 легкого ланцюга послідовності БЕО ІЮ МО 40 і її) залишків Суз5 в положенні 223, 229 і 232 важкого ланцюга послідовності зЕО ІЮ МО 38.
Альтернатива полягає в сполученні лізину. Антитіло може містити, наприклад, багато залишків лізину, які не взаємодіють з проміжною сполукою лікарський засіб-лінкер (0-І) або з лінкерним реагентом. Тільки найбільш активні групи лізину можуть взаємодіяти з лінкерним реагентом, що реагує з аміном. Також тільки найбільш активні тіольні групи цистеїну можуть взаємодіяти з лінкерним реагентом, що реагує з тіолом.
У разі зв'язування сполук за винаходом з лізинами навантаження лікарським засобом може перебувати в діапазоні від 1 до 80 угруповань лікарського засобу (І) на клітинне антитіло, хоча може бути переважна верхня межа 40, 20, 10 або 8. Композиції АОС включають колекції клітинно-зв'язуючих агентів, наприклад, антитіл, кон'югованих з лікарськими засобами в кількості, що знаходиться в діапазоні від 1 до 10 або від 1 до 8.
АОС формули (І) відповідно до винаходу може перебувати в формі фармацевтично прийнятної солі.
В даному винаході під «фармацевтично прийнятним» мають на увазі те, що можна застосовувати при одержанні фармацевтичної композиції, в цілому безпечної, нетоксичної та ні біологічно, ні інакше небажаної, і прийнятної як для ветеринарного застосування, так і для фармацевтичного застосування для людини.
Під «фармацевтично прийнятною сіллю» сполуки мають на увазі сіль, яка є фармацевтично прийнятною, як визначено в даному документі, і яка має бажану фармакологічну активність вихідної сполуки.
Фармацевтично прийнятні солі, зокрема, включають: (1) фармацевтично прийнятні кислотно-адитивні солі, утворені з фармацевтично прийнятними неорганічними кислотами, такими як хлористоводнева, бромистоводнева, фосфорна, сірчана і подібні кислоти; або утворені з фармацевтично прийнятними органічними кислотами, такими як оцтова, трифтороцтова, пропіонова, бурштинова, фумарова, яблучна, винна, лимонна, аскорбінова, малеїнова, глутамінова, бензойна, саліцилова, толуолсульфонова, метансульфонова, стеаринова, молочна і подібні кислоти; і (2) фармацевтично прийнятні основно-адитивні солі, утворені в разі, коли протон кислоти, присутній у вихідній сполуці, або заміщений іоном металу, наприклад, іоном лужного металу, іоном лужноземельного металу або іоном алюмінію; або координований з фармацевтично прийнятною органічною основою, такою як лізин, аргінін тощо; або з фармацевтично прийнятною неорганічною основою, такою як гідроксид натрію, поташ, гідроксид кальцію тощо.
Ці солі можуть бути одержані із сполук за винаходом, що містять основну або кислотну функціональну групу, і відповідних кислот або основ з використанням традиційних хімічних методів.
М - Лікування
Нарешті, винахід відноситься до АОС, як описано вище, для застосування як лікарського засобу, зокрема, при лікуванні раку.
Наступним об'єктом даного винаходу є сполука формули (І), така як визначено вище, для застосування як лікарського препарату, зокрема, для лікування раку.
Даний винахід також відноситься до застосування сполуки формули (І), такої як визначено вище, для одержання лікарського препарату, зокрема, призначеного для лікування раку.
Даний винахід також відноситься до способу лікування раку, який включає введення людині, що потребує цього, ефективної кількості сполуки формули (І), такої як визначено вище.
Форми раку можуть бути переважно вибрані з ІСЕ-1Щ8-обумовлених форм раку, що включають пухлинні клітини, які експресують або володіють гіперекспресією повнорозмірного
ІСЕ-1К або його ділянки на їх поверхні.
Більш конкретно ці форми раку являють собою рак молочної залози, рак ободової кишки, карциному стравоходу, печінково-клітинний рак, рак шлунка, гліому, рак легені, меланому, остеосаркому, рак яєчника, рак передміхурової залози, рабдоміосаркому, рак нирки, рак (610) щитовидної залози, рак ендометрію матки, шванному, нейробластому, плоскоклітинний рак порожнини рота, мезотеліому, лейоміосаркому і будь-які лікарсько-стійкі явища або форми раку.
Щоб уникнути сумнівів під лікарсько-стійкими ІСЕ-1РН-експресуючими формами раку необхідно розуміти не тільки стійкі раки, які початково експресують ІСЕ-1Е, але також форми раку, які початково не виявляють експресії або гіперекспресії ІЩ4Е-1ІК, але починають експресувати ІСБ-1К,, як тільки стають стійкими до попередньої терапії.
Іншим об'єктом винаходу є фармацевтична композиція, що містить АОС, як розкрито в описі.
Більш конкретно винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить АОС за винаходом, щонайменше з ексципієнтом та/або фармацевтично прийнятним носієм.
В даному описі вираз «фармацевтично прийнятний носій» або «ексципієнт» призначений для позначення сполуки або комбінації сполук, що входять в фармацевтичну композицію, що не викликають вторинних реакцій, і які дають можливість, наприклад, полегшити введення активної (сих) сполук (и), збільшити тривалість її (їх) перебування та/або ефективності в організмі, збільшити її (їх) розчинність в розчині або, крім того, поліпшити її (їх) збереження. Ці фармацевтично прийнятні носії та наповнювачі добре відомі і пристосовані фахівцем в даній області техніки в залежності від їх природи і вибраного способу введення активної (-их) сполук (-и).
Активний інгредієнт можна вводити в одиничних формах введення, в суміші з традиційними фармацевтичними носіями, тваринам або людям. Відповідні одиничні форми введення включають форми за допомогою перорального шляху і форми для введення за допомогою парентерального шляху (підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного).
В якості твердих композицій для перорального введення можна застосовувати таблетки, пігулки, порошки (тверді або м'які желатинові капсули) або гранули. У цих композиціях активний інгредієнт за винаходом змішують з одним або більше інертних розріджувачів, таких як крохмаль, целюлоза, сахароза, лактоза або діоксид кремнію, в потоці аргону. Ці композиції можуть також містити речовини, що відрізняються від розріджувачів, наприклад одна або більше змащувальних речовин, таких як стеарат магнію або тальк, барвник, покриття (таблетки з покриттям) або глазур.
Стерильні композиції для парентерального введення можуть переважно являти собою водні або неводні розчини, суспензії або емульсії. В якості розчинника або носія можна застосовувати воду, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, зокрема, оливкову олію, ін'єкційні органічні складні ефіри, наприклад, етилолеат, або інші відповідні органічні розчинники. Ці композиції можуть також містити ад'юванти, зокрема, зволожуючі, ізотонічні, емульгуючі, диспергуючі і стабілізуючі засоби. Стерилізацію можна виконувати декількома шляхами, наприклад, шляхом стерилізаційного фільтрування, шляхом включення стерилізуючих агентів в композицію, шляхом опромінювання або шляхом нагрівання. Їх можна також готувати у формі твердих стерильних композицій, які можна розчиняти під час застосування в стерильній воді або будь-якому іншому ін'єкційному стерильному середовищі.
Переважно ці АОС будуть вводити системним шляхом, зокрема, внутрішньовенним шляхом, внутрішньом'язовим, внутрішньошкірним, інтраперитонеальним або підшкірним шляхом, або пероральним шляхом. Більш переважно композицію, яка містить АОС відповідно до винаходу, будуть вводити кілька разів послідовно.
Винахід, таким чином, також відноситься до набору, який містить щонайменше Її) кон'югат антитіла з лікарським засобом та/або фармацевтичну композицію відповідно до винаходу і ії) шприц, або флакон, або ампулу, в які поміщають кон'югат антитіла з лікарським засобом та/або фармацевтичну композицію.
Способи її введення, дозування і оптимальні фармацевтичні форми можуть бути визначені відповідно до критеріїв, що зазвичай приймаються до уваги при встановленні терапії, адаптованої для пацієнта, такими як, наприклад, вік або маса тіла пацієнта, серйозність його/її загального стану, переносимість терапії і зазначених вторинних ефектів.
Інші характеристики і переваги винаходу очевидні при продовженні описування прикладами і графічними матеріалами, підписи до яких наведене нижче
Підписи до графічних матеріалів
Фігури 1А-1С: Зв'язування антитіла з нативним ІСЕ-1К людини на підставі аналізів ЕАС5. На
Фіг. 1А представлена крива титрування на лінії клітин МСЕ-7. МЕЇ являє собою середню інтенсивність флуоресценції. На Фіг. 18 представлена ЕСзо обох антитіл до ІЗЕ-1К, мишиного та химерного, на лінії клітин МСЕ-7. На Фіг. 1С представлена Втлах химерних антитіл до ІЗБЕ-18 на лінії клітин МСЕ-7.
Фігури 2А-28В: Оцінка розпізнавання ПІСЕ-1К з використанням трансфікованих клітин в (610) порівнянні з нетрансфікованими. На фіг. 2А) представлені криві титрування одного химерного
АБ до ІСБЕ-1К на лінії клітин ІСЕ-18:. МЕЇ являє собою середню інтенсивність флуоресценції. На фіг. 28 представлено зв'язування химерних АБ до ІСБЕ-18 на лінії клітин їЕ-1В- людини.
Фігури ЗА-3В: Оцінка специфічності Аб до ІЗЕ-1К в порівнянні з ПІК з використанням трансфікованих клітин. На фіг. ЗА представлено зв'язування мишиного АБ до ІСЕ-1К на лінії трансфікованих клітин ПІК". На фіг. ЗВ представлено зв'язування химерного АБ до ІСБЕ-1К на лінії клітин ІК". МЕЇ являє собою середню інтенсивність флуоресценції. Мар ЗКО5 до ПІВ (СаіІріоспет) було введено в якості позитивного контролю.
Фігура 4: Зв'язування мишиного АБ до ІСЕ-1К на лінії клітин ІМ-9. МЕЇ являє собою середню інтенсивність флуоресценції. Маю СКОБ до ПІК було введено в якості позитивного контролю.
Фігури 5А-5С: Оцінка розпізнавання ІСЕ-1К мавпи. На фіг. 5А представлені криві титрування химерного Ар до ІСЕ-1Б на лінії клітин СО5-7. МЕЇ являє собою середню інтенсивність флуоресценції. На Фіг. 58 представлена ЕСво обох антитіл до ІЗЕ-1К, мишиного та химерного, на лінії клітин СО5-7. На фіг. 5С представлена ЕСзо химерних антитіл до ІСБЕ-1К на обох лініях клітин - трансфікованих клітинах МІН ЗТЗ3 ПІСБЕ-1К «я і клітинах СО5-7.
Фігура 6: Сенсограми, отримані за допомогою Віасоге Х100 на основі технології поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ), використовуючи сенсорний чіп СМ5, активований більше 11 000 резонансних одиниць (РЕ) мишиного антитіла до гістидинової міткиії, щепленого хімічним шляхом на карбоксиметилдекстрановому матриксі. Експеримент проводили при швидкості струму 30 мкл/хв при 25 "С, використовуючи НВО-ЕР- в якості буфера для хроматографії та для розведення проб. На фігурі показано поєднання 4 незалежних сенсограм, вирівняних по х-осі на початку першого введення проб аналітів і по у-осі по вихідному рівню, визначеного безпосередньо перед цим першим введенням проби. Сенсограми, отримані із захопленням послідовності на основі послідовності рекомбінантного розчинного ІЗЕ1Е. людини, відзначені ромбиками. Сенсограми, отримані із захопленням послідовності на основі послідовності рекомбінантного розчинного ІСЕТЕ. яванського макака, відзначені трикутниками.
Білі символи відповідають циклам холостої проби (5 вводів проби буфера для хроматографії, а чорні символи відповідають вводам ряду зростаючих концентрацій с208БЕ2 (5, 10, 20, 40 ї 80
НМ).
Фігура 7: Оцінка власної дії антитіл до ПІСЕ-1К фосфорилювання рецептора в порівнянні з зо Іа.
Фігура 8: Інгібування фосфорилювання ІСБЕ-1Е у відповідь на ІЗЕ-1 мишиним антитілом до панв-18.
Фігура 9: Інтенсивність сигналу клітинної поверхні антитіл до ІЗЕ-1К зазнає знижувальну регуляцію після інкубації клітин при 37 "С. Клітини МСЕ-7 інкубували при 4 С або 37" протягом 4 г з 10 мкг/мл АБ. На фігурі представлена АМРЇ1.
Фігури 10А-10В: Розпад антитіл клітинної поверхні. Зв'язане з клітинною поверхнею антитіло оцінювали після 10, 20, 30, 60 і 120 хв при 37 "С. На Фіг. 10А представлений 95 залишкового
ІЯЕ-1К в порівнянні з інтенсивністю сигналу, яка вимірюється при 4 "С. На Фіг. 108 представлено обчислення періоду напіввиведення з використанням програмного забезпечення
Ргітв і з використанням збігу з експоненційною кривою розпаду.
Фігура 11: АБ до ПІСБР-1К інтерналізуются. Клітини інкубували з 10 мкг/мл мишиних АБ протягом 0, 30 або 60 хв при 37 "С. Клітини піддавали або не піддавали пермеабілізації та інкубували з другим антимишиним Ідс-АїйЇеха 488. Мембрана відповідає пермеабілізації мас./об. інтенсивності сигналу. Загальний сигнал відповідає інтенсивності сигналу після пермеабілізації клітин, а цитоплазматичний відповідає інтерналізованому АБ. Назва кожного оцінюваного антитіла зображено зверху кожного графіка.
Фігури 12А-12В: Візуалізація інтерналізації АБ. Фігура 12А: Клітини МСЕ-7 інкубували з т208Б2 протягом 20 хв при 4 "С і промивали, після чого інкубували (ММ) при 37 "С протягом 15 (Х), 30 (ХУ) і 60 (2) хв. Клітини фіксували і піддавали пермеабілізації. АБ т208Бг2 виявляли з використанням антимишиного Ідс АїІеха488 і І атр-1, використовуючи кроляче антитіло до
І атр-1 і другий антикролячий Ід АїЇеха 555. Фігура 128: Клітини МСЕ-7 інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С з мишиними антитілами до ПІСЕ-1Ж і фарбували, як описано вище.
Колокалізацію ідентифікували, використовуючи маркерний плагін колокалізації програми
Ітаде».
Фігура 13: Залучення лізосомального біохімічного шляху в розкладання антитіла.
Фігура 14: Кислий рН зменшує зв'язувальну здатність п'яти мишиних антитіл до ІБ-18.
Фігури 15А-150: Зв'язування, характеристичне для першої гуманізованої форми Мар с208БЕ2. Зв'язуюючі властивості п27208Е2 УНЗ/ЛЛ/ З тАБ оцінювали на лінії клітин людини МСЕ-7 (А), на лінії клітин мавпи СО5-7 (В) і на трансфікованій лінії клітин миші, експресуючий рецептор (610) інсуліну людини (С). Зв'язування обох тАб, мишиного та химерного 208Е2, оцінювали паралельно. Антитіло до ПІК, клон ЗКО5, використовували для підтвердження експресії ПІК на трансфікованій лінії клітин (0).
Фігура 16: Розпад поверхневого антитіла п2208Е2 УНЗ/ЛЛ/ З
Фігура 17: Поєднання сенсограм, отриманих за допомогою пристрою Віасоге Х100 на основі
ЗРК при температурі 25 "С з сенсорним чіпом СМ5, активованим на обох проточних кюветах приблизно 12 000 РЕ мишиних моноклональних антитіл до гістидинової мітки, щеплених хімічним шляхом на карбоксиметилдекстрановому матриксі, використовуючи НВ5-ЕР в в якості буфера для хроматографії при швидкості струму 30 мкл/хв. Кожна сенсограма (перша відзначена трикутниками, а друга відзначена ромбиками) відповідає повному циклу: 1- Введення протягом однієї хвилини проби розчину рекомбінантного п-ІСБЕ-1К (10 мкг/мл) у другу проточну кювету. 2- Для першої сенсограми 5 вводів проби буфера для хроматографії протягом 90 с кожний.
Для другої сенсограми: п'ять вводів проби в ряді зростаючих концентрацій розчинів антитіла с2о8Е2 до ІСЕ-1К протягом 90 с кожний.
З3- Відстрочка 300 с для визначення кінетики швидкості дисоціації. 4- Регенерація поверхні шляхом введення протягом 45 с 10 мМ буфера гліцин, НСІ рн 1,5.
Фігура 18: Сенсограма, відповідна відніманню холостої сенсограми (5 вводів НВЗ-ЕР к) з сенсограми, отриманої для ряду зростаючих концентрацій розчинів антитіл с208Е2 до ІСБЕ-18, представлена сірим кольором. Теоретична сенсограма, відповідна моделі 1:11 з наступними параметрами: Коп-(1,206:20,036)х105 М'.с", Кон-(7,81-0,18)х105 с", Ктах-3076 0,3 РЕ представлена тонкою чорною лінією. Обчислені концентрації с208г2 наведені на графіку: тільки найвищу концентрацію (24 нМ) розглядають як константи).
Фігура 19: Константи дисоціації, відповідні середньому з чотирьох експериментів, проведених для кожного антитіла, і відповідні відношенню: Кой/Коп х 1012, вираженому в одиницях пМ. Вуса діаграми відповідають стандартній помилці (п дорівнює 4).
Фігура 20: Періоди напівжиття відповідають середньому з чотирьох експериментів, проведених для кожного антитіла, і відповідають відношенню: Іп(2)/Коб/3600 вираженому в одиницях г. Вуса діаграми відповідають стандартній помилці (п дорівнює 4).
Фігура 21: Клітинна цитотоксичність антитіла до ІЗЕ-1К при поєднанні з трьома різними сполуками. П'ять химерних антитіл до ІЗЕ-1Ж2 піддавали сполученню з Е-13, 2-13 або Е-63.
Нерелевантне антитіло с904 також піддавали сполученню з тими ж сполуками.
Фігури 22А-22С: Оцінка іп мімо с208Е2-Е-13 (Фіг. 22А), с208Е2-(2-13 (Фіг. 22В) і с208Е2-Е-63 (Фіг. 22С) в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7.
Фігури 23А-23В: Оцінка іп мімо обох антитіл с208Е2-Е-13 (Фіг. 23А) і с208Е2-0-13 (Фіг. 238) в порівнянні з контролем АОС (с904-Е13 і с954-04-13) в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7.
Фігури 24А і В: Кислий рН зменшує специфічність зв'язування гуманізованих антитіл до ІБ- 1К п220862 НО7б/ 024 (А) і п2208БЕ2 (НО77/. 018 (В). Фігура 25: Оцінка цитотоксичності с2говЕ2- 0-13 на нормальних клітинах.
Фігура 26: Клітинна цитотоксичність гуманізованих варіантів п2208Е2 в сполученні з 0-13.
Нерелевантне антитіло с964 також піддавали сполученню з тою же сполукою.
Фігура 27: Оцінка іп мімо гуманізованих форм 2082-20-13 в порівнянні з с208Е2-0-13 в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7.
Фігури 284А і 288: Оцінка іп мімо або с208Е2-4-13 (28А), або п22081Е2-4-45-13 (288), введених 4 рази, в порівнянні з одним вводом в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7.
Фігури 29А і 298: Оцінка іп мімо с208Е2-Е-13 (29А) і с208Е2-23-13 (298) в моделі ксенотрансплантата Саом-3.
Приклади
Приклад 1: Одержання мишиних антитіл, індукованих проти ІСЕ-1А8 ЕСО
Для одержання мишиних моноклональних антитіл (Мар) проти людського позаклітинного домену (ЕСО) рецептора ІСЕ-1 людини (пПІСБЕ-1К) 5 мишей ВАГ В/с імунізували З рази підшкірно (5.с.) 10 мкг білка гпІСБ-1К (КК 8 О Бузіетв5, Мо за каталогом 391-СК). В якості альтернативи у деяких тварин було проведено три додаткових імунізації 10 мкг мишиного позаклітинного домену (ЕСО) ІСБ-1К (КО 8 ОО бувієт5, Мо за каталогом 6630-ОК/Ес). Перша імунізація була виконана в присутності повного ад'юванта Фрейнда (Зідта, Сент-Луіс, штат Меріленд, США).
Для подальших імунізацій додавали неповний ад'ювант Фрейнда (Зідта). Через три дні після злиття імунізованим мишам проводили бустер-ін'єкцію 10 мкг білка гпІСБ-1К. Спленоцити і лімфоцити одержували шляхом перфузії селезінки і шляхом подрібнення проксимальних лімфатичних вузлів відповідно, зібраних від однієї з 5 імунізованих мишей (відібраної після титрування сироватки всіх мишей) і проводили злиття з клітинами мієломи ЗР2/0-Аа14 (АТО, 10) Роквілл, штат Меріленд, США ). Протокол злиття описаний в статті Копіег апа Міївієїп (Маїиге,
256: 495-497, 1975). Потім злиті клітини піддавали відбору на середовищі з гіпоксантином, аміноптерином і тимідином (НАТ). Як правило, для одержання моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів, особливо мишиного походження, можна зробити посилання на методи, які описані, зокрема, в керівництві "Апіїроадіє5" (Нагіоуг апа І апе, Апііродіє5: А І арогагу
Мапаиаї, Соїд бргіпд Нагрог І арогаїогу, Соїд Зргіпд Нагбог МУ, рр. 726, 1988). Приблизно через днів після злиття гібридні клітини піддавали скринінгу. Для первинного скринінгу супернатанти гідридом оцінювали на секрецію Маб, індукованих проти білка ІСЕ-1К ЕСО, за допомогою аналізу ГАС5 з використанням пухлинних клітин МСЕ7 раку молочної залози людини (АТСС) та/або клітин мавпи СО57 (трансформованих 5М40 клітин нирок африканської 10 зеленої мавпи), експресуючих ІСЗЕ-1К на їх клітинній поверхні. Точніше, для відбору за допомогою проточної цитометрії 105 клітин (або МСЕ7, або СО57) висівали в кожну лунку 96- лункового планшета в фосфатно-сольовому буфері (ФСБ), що містить 195 бичачий сироватковий альбумін (БСА) та 0,0195 азид натрію (буфер РБАС5) при 4 "С. Після 2 хв центрифугування при 2000 об/хв буфер видаляли і додавали тестовані супернатанти гібридоми.
Після 20 хв інкубації при 4 "С клітини двічі промивали і додавали Аїеха 488-кон'юговане козяче антимишине антитіло 1/5007, розведене в буфері БАС (Ж А11017, МоїІесшіаг Ргобез Іпс.,
Юджин, США) та інкубували протягом 20 хв при 4 "С. Після остаточного відмивання буфером
ЕАСЗ клітини аналізували за допомогою ЕАСЗ5 (Расзсаїїриг, Весіоп-ОісКіпзоп) після додавання в кожну пробірку пропідію йодиду при кінцевій концентрації 40 мкг/мл. Як негативний контроль включали лунки, що містять тільки клітини і клітини, що проінкубували з другим АїЇеха 488- кон'югованим антитілом. У кожному експерименті використовували контроль ізотипу (Зідта, геї
М90351М0). Для обчислення середнього значення інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) оцінювали 5000 клітин.
З метою відбору тільки інтерналізуючих антитіл додатково проводили аналіз інтерналізації.
Для цього аналізу лінію пухлинних клітин МСЕ7 культивували в середовищі ЕМРІ 1640 без фенолового червоного з 195 І -глутаміном і 1095 ЕАС5 протягом З днів до експерименту. Потім клітини відокремлювали, використовуючи трипсин, і 100 мкл клітинної суспензії висівали при 4.105 клітин/мл в 96-лункові планшети в середовищі ЕРМІ1640 без фенолового червоного з 195
І -глутаміном і 595 фетальною бичачою сироваткою (ФБС). Після 2 хв центрифугування при 2000 об/хв клітини ресуспендували в 50 мкл або супернатантів гібридоми, або розчинів контрольного антитіла (позитивний контроль і контроль ізотипу 1 мкг/мл). Після 20 хв періоду інкубації при 4 "С клітини центрифугували протягом 2 хв при 2000 об/хв і ресуспендували або в холодному (4"С), або в теплому (37 "С) повному культуральному середовищі. Потім клітини інкубували протягом 2 годин або при 37 "С, або при 4 "С. Потім клітини промивали три рази буфером
ЕАС5. АІеха 488-мічене антитіло козячий антимишиний Ідс інкубували протягом 20 хвилин, і клітини промивали три рази, після чого проводили аналіз ЕАС5 на популяції клітин, що не забарвлюються пропідію йодидом.
Після аналізу ГЕАС5 визначали два параметри: (І) різниця сигналу флуоресценції, що визначається на поверхні клітин, проінкубованих при 4 С, і одержаного з клітинами, проінкубованими при 37 "С з одним супернатантом гібридоми, і (її) відсоток залишкового ІЗЕ-18 на клітинній поверхні.
Відсоток залишкового ПІСЕ-1К обчислюють таким чином: 95 залишкового ЗЕ-1А - (МЕїЇдь 37"с/ МЕїдь а гс) х 100.
Крім того, було проведено три твердофазні імуноферментні аналізи (ІФА) (або до, або після клонування) для дослідження зв'язування антитіл на рекомбінантних білках людини (ПІСЕ-1К) і миші (тісСв-1К) ії на рекомбінантному білку рецептора інсуліну людини (ПІК) . Зберігали гіоридому, секретоване антитіло, що проявляє зв'язування на Ійп- та/або пт-ІС-1К і відсутність зв'язування на гпІК. Коротко, в 96-лункові планшети ЕГІБЗА (Совіаг 3690, Корнінг, штат Нью-
Йорк, США) наносили 100 мкл/лунка або білка гпІСБЕ-18 (Б 5 О Бузіет»5, Ме за каталогом 391-
СК) концентрації 0,6 мкг/мл, або білка ппісЕе-1Е (Б 8 О Зуєіетв5, Мо за каталогом 6630-21 / Ес) при 1 мкг/мл, або білка ПІК (Б 45 О БЗувєіетв5, Мо за каталогом 1544-ІР/СЕ) концентрації 1 мкг/мл в
ФСБ протягом ночі при 4 "С. Потім планшети блокували ФСБ, що містить 0,595 желатин (Мо22151, Зегма ЕІесігорпогезі5 СТЬН, Хайдельберг, Німеччина) і міцно зв'язували протягом 2 г при 37 "С. Після видалення буфера насичення шляхом постукування перевернутих планшетів в кожну лунку додавали 100 мкл кожного розведення супернатанта (або нерозведеного супернатанта гібридоми, або серійних розведень супернатанта) та інкубували протягом 1 г при 37"С. Після трьох промивок додавали 100 мкл кон'югованого з пероксидазою хрону поліклонального козячого антимишиного Ідс (Ме115-035-164, дасКбвоп Іттипо-Незеагсп
І арогайогієв, Іпс., Уест-Гров, штат Пенсільванія, США) додавали при розведенні 1/5000 в ФСБ, (610) що містить 0,590 желатин і 0,059 Твін 20 (мас./мас.) протягом 1 г при 37 "С. Потім планшети для
ІФА промивали З рази і додавали тетраметилбензідиновий субстрат (ТМБ) (МеОРбб4782,
Орійта, Іпіегспіт, Франція). Після 10 хв періоду інкубації при кімнатній температурі реакцію зупиняли, використовуючи 1 М сірчану кислоту, і вимірювали оптичну щільність при 450 нм.
Гібридому, декретовану, що представляє інтерес антитіло, розмножували і клонували шляхом граничного розведення. Після ізотипування по одному клону під кожним кодом розмножували і заморожували. Кожне антитіло, що представляє інтерес, одержували в системах продукування іп мійго, званих СеШіпе |(Іпієдга Віоб5сіепсе5), для подальшої характеризації.
Додаткові кількісні визначення для аналізів спрямованої зв'язуючій специфічності ЕАС5 проводили на клітинах ІМОУ (В-лімфобластів людини, що експресують ІК), а також на клітинах, трансфікованих ПІСЕ-1Е, в порівнянні з нетрансфікованими клітинами.
Всі дані, відповідні відібраним антитілам, підсумовані в таблиці 7, і показано, що п'ять відібраних антитіл характеризуються сильним розпізнаванням нативного людського ІСБ-18В, експресованого або на клітинах МСЕ-7 раку молочної залози, або на трансфікованих клітинах.
Вони також розпізнають ІСЕ-1К мавпи на клітинах СО5-7. Ці антитіла перехресно не реагують з рецептором інсуліну людини, експресованого на клітинах ІМУО у високому ступені. Слід зазначити, що ці антитіла слабо розпізнають білок ПіІСЕ-1Ж5 ЕСО при безпосередньому нанесенні на планшети ІФА.
Таблиця 7
ПРИ 5 МКГ/МЛ пмлровосвмма 17 007710000177М 0030
НАзвА 5 пБРрИДОМИ ТИП СМОМІ| вн | ям | вн щ А (МА! ІМ9| Со8-7 НЕ ТЕ о о/«ОСТАТОЧ-4 С - ТЕ |клІТИН
Іа- | ІДЕ- ІНнсСУЛІНА "СІВ? "С (н анг: й ів | В В ного вн| МЕЇ ІВ") МАВПИ) ІаеТАЖІСЕА
ІСЕТА 137 с)
Приклад 2: Зв'язування антитіла з нативним ІСБЕ-1К людини на основі аналізів РАС 5
П'ять мишиних антитіл до ІСЕ-1Е були химеризовані. Зв'язуючі властивості обох антитіл до
ІСЕ-1К, мишиного та химерного, оцінювали за допомогою аналізів ЕАСЗ5 на лінії клітин МС Е-7 аденокарциноми молочної залози людини (АТСС Ж НТВ-22), використовуючи зростаючі концентрації антитіла. З цією метою клітини (1 х105 клітин/мл) інкубували з антитілами до ІЗЕ-1А протягом 20 хв при 4 "С в буфері ЕАСЗ (ФСБ, 0,195 БСА, 0,0195 МаМ»з). Потім їх промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з АЇеха 488, протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С в темряві, після чого промивали З рази в буфері ЕАС5. Зв'язування антитіл до ІЗЕ-1ЖК відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид (який забарвлює мертві клітини). Максимальна інтенсивність сигналу, отримана з кожним антитілом, була позначена як Втлах і виражена як середня інтенсивність флуоресценції (МЕ). ЕСвзо зв'язування, виражену в молярності (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (сгарпРадй Р'гіїтзв 4.0).
Крива титрування кожного мишиного або химерного АБ продемонструвала, що всі одержані антитіла здатні розпізнавати нативну форму ІСБЕ-1К з типовим профілем насичення (Фіг. 1А). З метою ранжирування антитіл і порівняння зв'язують властивості обох АБ, мишиного та химерного, ЕСво зв'язування кожної сполуки визначали з використанням аналізу нелінійної регресії. Порівняння ЕСво кожного мишиного АБ з його відповідної химерної формою показало, що 2 форми проявляли однакові зв'язуючі властивості, демонструючи, що химеризація АБ не впливає на розпізнавання ІСБ-1К (Фіг. 18-С)3. Значення ЕсСбо і Втах химерних антитіл підсумовані в таблиці 8.
Таблиця 8
Приклад 3: Підтвердження специфічності антитіла шляхом використання клітин, трансфікованих або ІСЕ-1К, або І, або клітин ІМУ9, експресуючих значні рівні ІК
Щоб підтвердити специфічність одержаних антитіл до ІЗБЕ-1Е в порівнянні з І, стабільні трансформанти, які експресують або ПІСЕ-1К, або ПІК, оцінювали за допомогою аналізів ЕАС5.
Коротко, химерні тАб в зростаючих концентраціях інкубували з клітинами протягом 20 хв при 4"С в буфері БАСЗ (ФСБ, 0,195 БСА, 0,0195 МаМ»). Потім клітини промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з АІеха 488 перед інкубацією протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С в темряві, а потім промивали З рази в буфері ЕАС5. Зв'язування антитіл до ІЗЕ-1ЖК відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид (який забарвлює мертві клітини). ЕСзо зв'язування, виражену в молярности (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (сгарпРаа Ргітз 4.0).
Криві титрування, отримані на лінії клітин, трансфікованих ПІСЕ-1К (Фіг. 2А), в порівнянні з нетрансфікованими клітинами (Фіг. 28) підтвердили специфічність зв'язування химерних АБ з
ІДЕ-1К людини. Значення ЕсСбо і Втах химерних антитіл підсумовані в таблиці 9.
Таблиця 9
З метою перевірки відсутності зв'язування обох антитіл, мишиного та химерного, на ПІК, використовували стабільну лінію клітин, що експресує ІК людини (ПІК). Розпізнавання ПІК людини на клітинній поверхні обома АБ, мишиним і химерним, досліджували за допомогою аналізів РЕАС5. Або мишині, або химерні тАбр в зростаючих концентраціях інкубували на лінії трансфікованих клітин ПІК: протягом 20 хвилин при 4 "С в буфері ЕАСЗ (ФСБ, 0,195 БСА, 0,019
Мам»). Потім клітини промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з АІеха 488 перед інкубацією протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С в темряві, а потім промивали З рази в буфері ГАС5. Зв'язування антитіл до ІСЕ-1К відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид (який забарвлює мертві клітини). ЕСво зв'язування, виражену в молярності (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (сгарпРай Ргіт5 4.0). Як позитивний контроль використовували антитіло до ПІК, клон ОКО5. Мишине і химерне антитіла до 904 вводили в якості нерелевантних антитіл.
Високий рівень експресії ПІК на клітинній поверхні трансфікованих клітин підтверджували з використанням комерційного антитіла до ПІК ОКО5Б (Фіг. ЗА і 3В). Навіть при використанні високих концентрацій або мишиного (Фіг. ЗА), або химерного (Фім. ЗВ) АБ до пПІСБ-1В зв'язування на клітинній поверхні клітин, трансфікованих ПІК", не спостерігали. Ці результати продемонстрували, що ні мишині, ні химерні АБ до ПІСЕ-1К не розпізнавали ПІВ.
Ця специфічність розпізнавання ПІСЕ-1К в порівнянні з ІК також продемонстрована за допомогою аналізів ЕАС5 з використанням клітин ІМО лінії клітин В-лімфоми, що експресують
НЕ (Фіг. 4). Для цих аналізів ЕАС5 протокол був таким же, як описано вище, і мишині антитіла використовували з метою запобігання перехресній реактивності другого АБ проти людини (клітини ІМУ експресують Ід людини на їх клітинній поверхні). Результати, представлені на Фіг. 4, ще раз продемонстрували, що очікуваний сигнал спостерігали при використанні антитіла
СКОБ до ПІК, при цьому жодне з оцінюваних мишиних антитіл не проявляло будь-якого значного сигналу зв'язування на даній лінії клітин.
Приклад 4: Зв'язування антитіла з нативним ІСБЕ-1К мавпи на основі аналізів ЕАСЗ і Віасоге
Однією з перших передумов для нормативних токсикологічних досліджень є знаходження релевантного виду тварини для оцінки вибраної сполуки. Оскільки серія антитіл, описаних в даному документі, не спроможна розпізнавати мишиний ІСБЕ-1К, найбільш вірогідним видом для токсикологічної оцінки є нелюдиноподібний примат (МНР).
З метою оцінки зв'язування антитіл до ІЗЕ-1ЖК на ІЗБ-1К мавпи спочатку оцінювали зв'язування обох антитіл до ПІСЕ-1К, мишиного та химерного, за допомогою аналізів ЕАС5 на лінії клітин СО5-7, використовуючи зростаючі концентрації антитіла. Клітини (1х105 клітин/мл) інкубували з антитілами до ІЗЕ-1К протягом 20 хв при 4 "С в буфері ЕАС5З (ФСБ, 0,195 БСА, 0,0195 Мам»). Потім клітини промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з АЇеха 488 перед інкубацією протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С в темряві і, нарешті, промивали З рази в буфері ЕАС5. Зв'язування антитіл до ІСЕ-1К відразу оцінювали на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид (який забарвлює мертві клітини). ЕСво зв'язування, виражену в молярності (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (СстарпРаай Ргітз 4.0).
Криві титрування, отримані на лінії клітин СО5-7 мавпи, показали, що АБ до ПІСБ-1В специфічно розпізнавали ІЗЕ-1К, експресований на поверхні в лінії клітин мавп (Фіг. 5А).
Визначення ЕСво для кожного мишиного і химерного АБ показало, що 2 форми у високому ступені можна порівняти з їх зв'язуючими властивостями з ІСР-1К мавпи (Фіг. 58). Ці результати показали, що всі одержані антитіла до ПІСЕ-1К розпізнавали ІСЕ-1К мавпи.
Порівняння ЕСвзо зв'язування на клітинах СО5-7 зі зв'язуванням на трансфікованих клітинах
ІЯЕ-1їК проводили з метою перевірки величини розпізнавання химерним антитілом ІСБ-1А людини в порівнянні з ІЇЗЕ-1ЇК мавпи. Результати, показані на Фіг. 5С, продемонстрували подібне розпізнавання ІСЕ-1К людини і мавпи усіма антитілами.
З метою підтвердження розпізнавання на іншому типі мавп клітини трансфіковані ІБЕ-1А яванського макака для продукування розчинного ІЗЕ-1К ЕСО мавпи і проводили експерименти за допомогою пристрою Віасоге з одним з химерних антитіл (с208Е2) з метою порівняння їх властивостей зв'язування або ПІСЕ-1К, або ІСЕ -1К яванського макака.
Експерименти по розпізнаванню проводили на пристрої Віасоге х 100, використовуючи сенсорний чіп СМ5, активований антитілом до гістидинової мітки (набір для антитіла захоплення
Ніз (сарішге КІ) СЕ Неайсаге, номер за каталогом 28-9950-56). Більш 11000 РЕ антитіл прищеплюють хімічним шляхом на карбоксиметилдекстрановому матриксі, використовуючи набір для амінної хімії. Експерименти проводили при 25 "С при швидкості струму 30 мкл/хв, використовуючи буфер НВЗ-ЕР (СЕ Неайсаге) як буфер для хроматографії та розведення зразка. Для визначення кінетичних параметрів зв'язування химерної форми антитіла 208Е2 (с208Е2) на пПІСЕ-1К в порівнянні з ІЗЕ-1ЇМ макаки використовували кінетичну схему одного циклу.
Розчин розчинного рекомбінантного варіанту гетеротетрамеру ІСЕ-1К, що складається з 2а ланцюгів і позаклітинних доменів з 28 ланцюгів, експресованого з додатковою С-кінцевою міткою 10-Нів, на основі послідовності або людини (Р. 85. ОО Зузіет»5 номер за каталогом 305-С8- 50), або послідовності яванського макака (виділяється в лабораторії), вводили протягом 1 хвилини до другої проточної кювети при розведенні, визначеному для захоплення близько 160
РЕ антигену. Після фази захоплення або вводили буфер для хроматографії 5 разів (кожне введення проби 90 с), або вводили ряд зростаючих 5 концентрацій с208Е2 (кожен введення проби 90 с) в обидві проточні осередки. В кінці п'ятого введення проби буфер для хроматографії пропускали з метою визначення швидкості дисоціації.
Потім поверхню регенерували введенням буфера 10 мМ гліцин, НОСІ рн 1,5 протягом 30 с.
Обчислений за допомогою комп'ютерної програми сигнал відповідає різниці між відповіддю проточного осередка 2 (з іммобілізованим ІЗЕ-1К) і відповіддю проточного осередка 1 (без будь-яких молекул ІСБ-1К) (Фіг. б).
Для кожної молекули ІСЕ-1К (людини або яванського макака) сигнал за рахунок введення ряду зростаючих концентрацій с208Е2 коректували шляхом віднімання сигналу, отриманого в результаті 5 вводів буфера (подвійний контроль). Отримані в результаті сенсограми аналізували з використанням програмного забезпечення ВіаемаІчайоп в моделі 1:1. Кінетичні коефіцієнти оцінювали або незалежно (2 кінетичних коефіцієнти с208Е2 на кожному ІСЕ-1НВ), або спільно (однакові кінетичні коефіцієнти зв'язування с208Е2 на ІСБЕ-1К людини і яванського макака). Якість відповідності оцінювали на підставі відношення Спіг/КІтах нижче 0,05 РЕ.
Кінетичні коефіцієнти зв'язування (див. Таблицю 10), визначені окремо для кожного ІСБ-1Н8, 10) близькі, і якість відповідності обох сенсограм з однаковими кінетичними коефіцієнтами є 5О0 високою.
Антитіло с208Е2 розпізнає як рекомбінантний людський ІЗЕ-1К, так і ІОБ-12 яванського макака з константою дисоціації (КО) приблизно 0,2 нМ. Значення спорідненості, визначені в цьому дослідженні, відповідають значенням функціональної спорідненості (авидності) антитіл для рівня захоплення ІСЕ-1К людини і яванського макака близько 160 РЕ.
Таблиця 10
Приклад 5: Агоністична дія одержаних антитіл на фосфорилювання ІСБЕ-1А
Добре відомо, що антитіла можуть індукувати агоністичну дію при їх зв'язуванні з тирозинкіназними рецепторами. Оскільки автори винаходу не хотіли б вибрати такі агоністичні антитіла, була проведена оцінка фосфорилювання ПІСЕ-1Е з використанням химерних антитіл.
Для цієї мети клітини МСЕ-7 інкубували в середовищі без сироватки протягом ночі. Потім додавали або ІСЕ-1 (100 нМ), або тестовані АБ (10 мкг/мл) протягом 10 хвилин при 37 "с.
Середовище видаляли, і клітини зішкрябували в буфер для лізису (рН 7,5), що містить 10 мМ буфер Трис НСЇІ (рН 7,5), 1595 Масі (1 М), 1095 суміш детергентів (10 мМ Ттгі5-НСІ, 10 95 буфер для лізису Ідераї) (Зідта Спетіса! Со.), 595 дезоксихолат натрію (Зідта Спетіса! Со.), 1 таблетку ТМ повної суміші інгібіторів протеаз (Коспе), 195 суміш інгібіторів фосфатаз СосКаїЇ
Зеї ПП (Саіріоспет) та інкубували протягом 90 хв при 4"С. Лізати освітлювали центрифугуванням при 4 "С, нагрівали протягом 5 хв при 100 "С і витримували при -20 "С або безпосередньо наносили на 4-1295 поліакриламідні гелі з додецилсульфатом натрію для електрофорезу (ДСН-ПААГ). Інкубацію з першим антитілом проводили протягом 2 годин при кімнатній температурі, а потім інкубували з НКР-пов'язаними другими антитілами протягом 1 г при кімнатній температурі. Мембрани промивали в буфері ТВ5Т, після чого білки візуалізували методом електрохемілюмінесцентного визначення (ЕХЛ). Кількісне визначення блоттинга проводять за допомогою програмного забезпечення Ітаде У. Значення фосфорилювання білків нормалізували по гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназі (ЗАРОН). Фосфорилювання ПІСЕ-1К. у відповідь на ІСЕ-1 вважали за 10095 стимуляцію. Дія АБ до ПІСЕ-1К на фосфорилювання НІСЕ- 1К визначали як 96 фосфорилювання, індукованого ІСЕ-1.
Результати, описані на Фіг. 7, являють собою середнє значення 95 рісЕ-1А у відповідь на химерні Ар до ІОБ-ІК З незалежних експериментів ж/- 5.0. в порівнянні з ІСЕ-1. Як проілюстровано, ні значного, ні незначного (менше 1095) фосфорилювання пПІСЕ-1К не було виявлено при інкубації клітин МСЕ-7 з 10 мкг АБ до ІСБ-18.
Приклад 6: Інгібування фосфорилювання ІСБЕ-1К. у відповідь на ІОЕ-1 мишиними антитілами до ПІСБ-1В
Щоб охарактеризувати відібрані антитіла, досліджували їх здатність до інгібування ІСЕ1- індукованого фосфорилювання. Для цієї мети клітини МСЕ-7 інкубували в середовищі без сироватки протягом ночі. Потім клітини інкубували протягом 5 хвилин з мишиними АБ до ПІОБЕ, після чого додавали ІЗЕ-1 протягом 2 хвилин при 37 "С. Середовище видаляли, і клітини зішкрябували в буфер для лізису (рН 7,5), що містить 10 мМ буфер Трис НСЇІ (рН 7,5), 1595 Масі (1 М), 1095 суміш детергентів (10 мМ трис-НСЇ, 10 95 буфер для лізису Ідераї) (Бідта Спетісаї!
Со.), 595 дезоксихолат натрію (бідта Спетіса! Со.), 1 таблетку ТМ повної суміші інгібіторів протеаз (Коспе), 195 суміш інгібіторів фосфатаз СосКіаїй 5еї І! (СаІріоснет) та інкубували протягом 90 хв при 4 "С. Лізати освітлювали центрифугуванням при 4 "С, нагрівали протягом 5 хв при 100 "С і витримували при -20 "С або безпосередньо наносили на 4-1295 поліакриламідні гелі з додецилсульфатом натрію для електрофорезу (ДСН-ПААГ). Інкубацію з першим антитілом проводили протягом 2 годин при кімнатній температурі, а потім інкубували з НЕР- пов'язаними другими антитілами протягом 1 г при кімнатній температурі. Мембрани промивали в буфері ТВ5Т, після чого білки візуалізували методом електрохемілюмінесцентного визначення (ЕХЛ). Кількісне визначення блоттинга проводять за допомогою програмного забезпечення Ітаде .). Значення фосфорилювання білків нормалізували по гліцеральдегід-3- фосфатдегідрогеназі (ЗАРОН). Фосфорилювання ПІСЕ-1К у відповідь на ІЗЕ-1 вважали за 10095 стимуляцію. Дія АБ до ПІСЕ-1К на фосфорилювання ПІСЕ-1К визначали як 95 фосфорилювання, індукованого ІСБ-1.
Всі АБ до ІСБ-1К сильно інгібували фосфорилювання ПІСЕ-1К у відповідь на ІСБ-1
(зменшення » 8095) (Фіг. 8). Кращими інгібіторами ІСЕ1-індукованого фосфорилювання пПІСБ-1А є Маб т208БЕ2, т212А11 і т214Е8.
Приклад 7: Дослідження інтерналізації ІЗЕ-1К після зв'язування одержаних антитіл до ІСБ- 14 за допомогою аналізів ЕАС5
Клітини МСЕ-7 інкубували з 10 мкг/мл химерних антитіл при 4 "С протягом 20 хв. Потім клітини промивали та інкубували при 4 С або 37 С протягом 4 г. Кількість зв'язаного з клітинною поверхнею антитіла визначали з використанням другого антитіла. ДМРЇ визначали як різницю між МЕЇ, виміряну при 4 "С, ії МЕЇ, виміряну при 37 "С, після 4-годинного періоду інкубації, відповідно до кількості інтерналізованого АБ. АМРЇ була представлена на Фіг. 9 і в таблиці 11. Відсоток інтерналізації при 10 мкг/мл АБ вираховували, слідуючи формулі 100(МРЕЇ при 4 "С - МЕЇ при 37 "С) / МНРЇ при 4 "С, і результати представлені в таблиці 11.
Таблиця 11 се12АТ 1 Ї777117171717178011111711111111322 11111127 сг1906.777777777711Ї7111171717178011111171Ї111111119353.. |... 44е6Ю
Щоб визначити, чи здатні антитіла, які також розпізнають ІСБЕ-1К мавпи, до інтерналізації даного рецептора, був проведений такий же самий експеримент по інтерналізації. Результати, підсумовані в таблиці 12, продемонстрували, що всі протестовані антитіла здатні до опосередкування інтерналізації ЗЕ-1 8.
Таблиця 12 11001111 МишиніАб////////// | о Химернідб7/////ШЗО о а1еАТІ17777711783. 11171173 Ї711111798 11111175 2 щЩ 24817176. Її Ї711111719811111111720 11721906. 17777771780 11111171 Ї1111110о2 |7777111740
Далі оцінювали кінетику зменшення кількості антитіла, зв'язаного з клітинної поверхнею. З цією метою клітини МСЕ-7 висівали в 96-лункові планшети та інкубували з 10 мкг/мл мишиного антитіла протягом 20 хв при 4 "С. Потім клітини промивали для видалення незв'язаного антитіла і поміщали в середовище при 37 "С на 10, 20, 30, 60 або 120 хв. У кожен момент часу клітини центрифугували, а потім мітили клітинну поверхню на льоду другим антимишиним антитілом Ідс-АІеха4-88, щоб визначити кількість антитіла, що залишилося на клітинній поверхні. Інтенсивність флуоресценції для кожного мишиного АБ і для кожного моменту часу нормалізували по сигналу при 4 "С (95 решти ІСЕ-1К) і приводили у відповідність з експоненціальним розпадом, щоб визначити час напівжиття (И/2). 1/2 вважали часом, протягом якого отримували 5095 зниження сигналу. Як проілюстровано на Фіг. 10, рівень всіх мишиних АБ на поверхні швидко падав протягом перших 30 хв, і зниження було майже максимальним після 60 хв інкубації (Фіг. 10А). Розрахований час напівжиття становив від 10 до 18 хв відповідно до мишиних АБ (Фіг. 108).
З метою валідації, що зменшення сигналу клітинної поверхні є наслідком інтерналізації АБ і не пов'язана з шеддінгом рецептора клітини інкубували з мишиними АБ протягом 0, 30 і 60 хв при 37 "С (Фіг. 11). Потім клітини фіксували і або пермеабілізували, або не пермеабілізували, щоб визначити антитіло, пов'язане з клітинної поверхнею (за відсутності пермеабілізації),, і сумарний сигнал антитіла, відповідний пов'язаному з клітинної поверхнею «т інтерналізованому
Ар (з пермеабілізацією). Кількість інтерналізованого АБ (цитоплазматичного) визначали наступним чином: МРЇ після пермеабілізації - МЕРІ без пермеабілізації. Цей експеримент показав, що зниження кількості зв'язаного з клітинною поверхнею АБ відбувалося внаслідок зростання кількості цитоплазматичних АБ, що демонструє, що АБ були інтерналізованими (Фіг. 11). Крім того, розщеплення АБ починалося після 1 г інкубації, що показано на підставі зниження сигналу після пермеабілізації (сумарного).
Приклад 8: Дослідження інтерналізації ІЗЕ-1К після зв'язування одержаних антитіл до ІСБ- 14 за допомогою аналізів ЕАС5
Для додаткового підтвердження інтерналізації антитіл проводили конфокальну мікроскопію, щоб оцінити субклітинний розподіл антитіл після внутрішньоклітинного транспортування.
Клітини інкубували з АБ до ПІСЕ-1В8 37 "С, фіксували і пермеабілізували. Таким чином, клітини фарбували з використанням другого антитіла АІеха-488 і кролячого антитіла до Іатр-1, яке було виявлено з використанням другого антикролячого Ідс, міченого АЇеха 555. Перед інкубацією при 37 "С мишине АБ 208ГЕ2 було локалізовано на мембрані клітин МСЕ-7 (Фіг. 12А).
Відсутність колокалізації з лізосомним маркером Іатр-1 було зазначено з використанням маркерного плагіну колокалізації програми Ітаде 9. Кількість зв'язаного з клітинною поверхнею антитіла різко зменшувалася після 15 хв інкубації при 37 "С. Одночасно зі зменшенням зв'язаного з клітинної поверхнею антитіла внутрішньоклітинне антитіло виявлялося в везикулах.
Можна було спостерігати рідкісну колокалізацію з Іатр-1. Після 30 хв інкубації зв'язане з клітинною поверхнею антитіло насилу виявлялося. Проте колокалізація АБ в лізосомах зростала. Після 1 г інкубації зменшувалося як фарбування внутрішньоклітинного АБ, так і число колокалізацій з Іатр-1. Кінетика зв'язаного 3 клітинної поверхнею антитіла і його внутрішньоклітинної акумуляції корелювала з кінетикою розпаду поверхневого антитіла, виміряною за допомогою БАС5. Крім того, як вже описано для досліджень ЕАС5, на підставі конфокальної мікроскопії розщеплення мишиних АБ починалося після 1 г інкубації.
Також оцінювали інтерналізацію всіх інших мишиних антитіл до ПІСЕ-1ВА та їх колокалізацію з Гатр-1 (Фіг. 128). Після 30 хв інкубації при 37 "С виявлялося внутрішньоклітинне антитіло, і можна було спостерігати колокалізацію з Іатр-1, що вказує на те, що всі відібрані антитіла до
ІСЕ-1К ефективно інтерналізувалися в лізосоми.
Приклад 9: Інгібування розщеплення АБ з використанням інгібітора лізосом бафіломіцину А
Щоб підтвердити, що антитіла, які досягли лізосоми, розщеплюються, клітини обробляли бафіломіцином Ат, що представляє собою активний інгібітор функції лізосом, або залишають без обробки. Потім клітини інкубували з 10 мкг/мл тестованого АБ при 4 "С, промивали і інкубували протягом 2 г при 37 "С. Інтерналізоване Ар визначали після пермеабілізації клітин, використовуючи друге антимишине АБ ІдО-АЇеха 488. Додавання бафіломіцину АТ запобігало розщепленню внутрішньоклітинного АБ (Фіг. 13), що вказує на те, що АБ були ефективно інтерналізовані і розщеплювалися в лізосомах.
Приклад 10: Дія рН на зв'язування антитіло-ІБЕ-1А
Оскільки антитіла були відібрані на основі їх потенціалу до інтерналізації, і, як показано вище, колокалізуются з ранніми ендосомами перед входженням в лізосомальний компартмент, цікавий підхід полягав у відборі антитіл, для яких відбувається модулювання стабільності зв'язування АБ/пПІСБЕ-1К в залежності від рН навколишнього середовища, і переважно антитіл, дисоціюючих від ІЗЕ-1К, коли рН навколишнього середовища стає кислим. Дійсно, основна відмінність між ранніми ендосомами і лизосомами складається в рН їх просвіту: в ендосомальному компартменті рН становить приблизно б, тоді як в лізосомальному компартменті рН становить близько 4,5.
Добре відомо, що відразу після інтерналізації після зв'язування ліганда (ІСЕ1) пІСБ-1В повертається до клітинної поверхні за допомогою біохімічного шляху рециклінгу.
Без зв'язку з будь-якої теорією гіпотеза, описана в цьому документі, полягає в тому, що антитіла, більш схильні до раннього вивільнення від їх мішені при кислому рН, ймовірно, сприятимуть рециклінгу мішені на мембрані і, отже, можуть вважатися кращими кандидатами для підходів АОС.
Щоб вивчити, чи виявляють деякі з антитіл таку властивість, і досліджувати кореляцію цієї властивості з цитотоксичною активністю, зв'язування мишиних Мар до ПІСЕ-1К на лінії клітин
МСОЕ-7 проводили в буферах при різних значеннях рН. Зростаючі концентрації мишиних тАб інкубували на лінії клітин МСЕ-7 протягом 20 хв при 4 "С при різних значеннях рН в діапазоні від 5 до 8. Потім клітини промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з Айеха 488, в буфері ЕАС5 . Клітини інкубували додатково протягом 20 хвилин при 4 "С в темряві, а потім промивали З рази в буфері ЕАС5. Зв'язування антитіл до ІСЕ-1К відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид, який забарвлює мертві клітини. ЕС5о зв'язування, виражену в молярности (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (сгарпРавй Ргітз 4.0). Всі відібрані мишині антитіла до
ІСЕ-1К проявляли знижену зв'язуючу здатність при кислому рН, як проілюстровано на Фіг. 14.
Зв'язування гуманізованих Мар до ІСБЕ-1К на лінії клітин МСЕ-7 проводили в буферах при різних рН. Зростаючі концентрації мишиних тА інкубували на лінії клітин МСЕ-7 протягом 20 хв (610) при 4 "С при різних значеннях рН в діапазоні від 5 до 8. Потім клітини промивали З рази і інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з АЇеха 488, в буфері ЕАС5З . Клітини інкубували додатково протягом 20 хвилин при 4 "С в темряві, а потім промивали З рази в буфері РАС5. Зв'язування гуманізованих антитіл до ІОБЕ-1Е відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид, який забарвлює мертві клітини.
ЕСово зв'язування, виражену в молярності (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (сгарпРайд Ргіт5 4.0). Гуманізовані антитіла до ІСЕК проявляли знижену зв'язуючу здатність при кислому рН, як проілюстровано на Фіг. 24.
Приклад 12: Оцінка гуманізованої форми 208Е2 Мар 12.1 Оцінка зв'язування та інтерналізації першої гуманізованої форми п2208Е2 МНЗ/Л/ З (також званої п7208Е2 НО26/І 024)
Зв'язування першої гуманізованої форми с208Е2 тАбр оцінювали на лініях клітин МСЕ-7,
СоО5-7 і МІН З3Т3З ІВ:. До кожної клітинної лінії додавали зростаючі концентрації т2го8Е2, сговЕ2 або п2208Е2 МНЗМІ З на 20 хв при 4 "С. Потім клітини промивали, і зв'язування тестованих тАб виявляли з використанням відповідного другого антитіла. З метою валідації експресії ІК людини на трансфіковані лінії клітин використовували клон ОКО5 комерційного антитіла до ПІК і використовували в якості прикладу профілю розпізнавання, навеєденого на Фіг. 150.
Порівняння гуманізованої форми з мишиними або химерними формами на клітинах МСЕ-7 (Фіг. 15А) або СО5-7 мавпи (Фіг. 158) показало близькі профілі для З тестованих форм. Процес гуманізації не модифікував специфічність розпізнавання антитіла, яка є точно порівняною з мишиною і химерною формами з відсутності перехресної реактивності на рецепторі інсуліну людини (Фіг. 15С).
Обчислені значення ЕСзхо першої гуманізованої форми 208Е2 на лінії клітин МСЕ-7 людини і лінії клітин СО5-7 мавпи були подібними зі значенням, визначеним або для мишиної, або для химерної форми тАбБ 208Б2.
Здатність тАр п2208Е2 МНЗЛ/ІЗ до інтерналізації оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Клітини МСЕ-7 інкубували з 10 мкг/мл антитіл при 4 "С протягом 20 хв. Потім клітини промивали та інкубували при 4 "С або 37 "С протягом 4 г. Кількість пов'язаного з клітинною поверхнею антитіла визначали з використанням другого антитіла. АМЕЇ, що визначається як різниця між МР, виміряною при 4 "С, і МЕЇ, виміряною при 37 "С, після 4-годинного періоду інкубації відповідає кількості інтерналізованого АБ. АМРЇ представлена на фіг. 16 і в таблиці 13.
Відсоток інтерналізації при 10 мкг/мл АБ вираховували, слідуючи формулі 100(МРЕЇ при 4 7 -
МРЇ при 37 "С)У/МРЇ при 4 "С, і результати представлені в таблиці 13. Таким чином, гуманізоване антитіло п2208Е2 МНЗЛ//І3 мало властивості зв'язування та інтерналізації, подібні властивостям, виміряним для відповідного мишиного і химерного антитіл 208Е2.
Таблиця 13а 11111111 А | Обінтерналізацї 12.2 Оцінка зв'язування додаткових гуманізованих форм п2208Е2 тАр 2082 піддавали гуманізації і оцінювали зв'язуючі властивості шістнадцяти гуманізованих варіантів (включаючи першу форму, описану в 12.1). Зв'язуючі властивості гуманізованих варіантів оцінювали за допомогою аналізів БАС5 на лінії клітин МСОЕ-7 аденокарциноми молочної залози людини і лінії клітин Со5-7 мавпи з використанням зростаючих концентрацій антитіла. З цією метою клітини (1х106 клітин/мл) інкубували з антитілами до ІСЕ-1К протягом 20 хв при 4 "С в буфері ГАС5 (ФСБ, 0,195 БСА, 0,0195 МамМз).
Потім їх промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, зв'язаним з Аеха 488, протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С в темряві, після чого промивали З рази в буфері ЕАС5.
Зв'язування антитіл до ІСЕ-1К відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид (який забарвлює мертві клітини). ЕСзо зв'язування, виражену в молярності (М), обчислювали, використовуючи аналіз нелінійної регресії (сгарпРавй Ргітв5 4.0).
Значення ЕСзхо гуманізованих варіантів показали, що все гуманізовані варіанти проявляють еквівалентні зв'язуючі властивості на обох лініях клітин людини і мавпи.
Значення ЕСбво гуманізованих антитіл були підсумовані в таблиці 136.
Таблиця 13р 11111 вс 11111111 1мсе 7 |со57
Гуманізовані варіанти 12.3 Оцінка інтерналізації іншої гуманізованої форми п2208Е2
Клітини МСЕ-7 інкубували з 10 мкг/мл гуманізованих антитіл при 4 "С протягом 20 хв. Потім клітини промивали та інкубували при 4 С або 37 "С протягом 4 г. Кількість зв'язаного з клітинною поверхнею антитіла визначали з використанням другого антитіла на проточному цитометрі РасзСаїїриг Ріом/ (Весіоп ОісКіп5оп). АМЕЇ, що визначається як різниця між МРЇ, виміряною при 4 "С, і МЕЇ, виміряною при 37 "С, після 4-годинного періоду інкубації відповідає кількості інтерналізованого АБ. АМРЇ представлена в таблиці 13с. Відсоток інтерналізації при 10 мкг/мл АБ вираховували за такою формулою: 100(МРЇ при 4 "С - МЕЇ при 37 "СУМНІ при 4 76.
Гуманізоване антитіло п2208Е2 НО77/ 018 здатне індукувати значиму інтерналізацію ІСЕ-1Н8.
Таблиця 13с 11111071 А | бінтерналізацї
Приклад 13: Визначення константи дисоціації (Ко) зв'язування п'яти химерних антитіл до
ІСЕ-1ІК (с208Е2, с213810, с212А11, с214Е8 і с21906) і гуманізованого варіанта (МНЗ/МІ 3) антитіла 2082 на розчинному рекомбінантному ІСЕ-1К людини
Константи дисоціації (Ко) зв'язування антитіл на рекомбінантному розчинному ІСнЕ-1А людини визначали по відношенню між швидкістю дисоціації (Кокю) і швидкістю асоціації (Коп).
Експерименти з кінетики проводили на пристрої Віасоге х100, використовуючи сенсорний чіп
СМ5, активований мишиним моноклональним антитілом до гистидинової мітки. Близько 12 000
РЕ антитіл прищеплюють хімічним шляхом на карбоксиметилдекстрановому матриксі, використовуючи набір для амінної хімії.
Експерименти проводили при 25 "С при швидкості струму 30 мкл/хв, використовуючи буфер
НВ5-ЕР (СЕ Неайсаге) як буфер для хроматографії та розведення зразка.
Для визначення кінетичних параметрів зв'язування антитіл до ІЗЕБ-1К на розчинному рекомбінантному ІЗБЕ-1Ж людини, захопленому його двома С-кінцевими 10-гістидиновими мітками, використовували кінетичну схему одного циклу. 1- Розчинення розчинного рекомбінантного варіанта гетеротетрамеру І2Е-1К людини: 2а ланцюга і позаклітинні домени 238 ланцюгів, експресовані з додатковою С-кінцевою міткою 10-
Ні5х (К80О Бузіет5 номер за каталогом 305-48-50), вводили протягом одної хвилини в другий проточний осередок при концентрації 10 мкг/мл. В середньому в кожному з 24 циклів, виконаних для даного дослідження, було захоплено 587 РЕ (зі стандартним відхиленням 24 РЕ) розчинного рецептора. 2- Після фази захоплення або вводили буфер для хроматографії 5 разів (кожне введення проби 90 с), або вводили ряд зростаючих 5 концентрацій одного з шести антитіл (кожне введення проби 90 с) в обидва проточні осередки. В кінці п'ятого введення проби буфер для хроматографії пропускали протягом 5 хвилин з метою визначення швидкості дисоціації. 3- Потім поверхню регенерували введенням буфера 10 мМ гліцин, НОСІ рН 1,5 протягом 45 с.
Обчислений за допомогою комп'ютерної програми сигнал відповідає різниці між відповіддю проточного осередка 2 (з іммобілізованим ІЗЕ-1К) і відповіддю проточного осередка 1 (без будь-яких молекул ІСЕ-1 8).
Для кожного ІЗЕ-1ЇК сигнал за рахунок введення ряду зростаючих концентрацій одного антитіла коректували шляхом віднімання сигналу, отриманого в результаті 5 вводів буфера (подвійний контроль), див. Фіг. 17.
Отримані в результаті сенсограми аналізували з використанням програмного забезпечення
ВіаемаІчаціоп в моделі 1:1.
Для кожного антитіла проводили чотири експерименти, використовуючи два різних ряди концентрацій: 40, 20, 10, 5 і 2,5 нМ для перших двох експериментів і 24, 12,6, З і 1,5 НМ для двох останніх експериментів, проведених з кожним антитілом.
Для 6 антитіл, тестованих в даному експерименті, експериментальні дані відповідали моделі 1:11 зі значними значеннями Кої, де більш високу концентрацію визначали як константи, і обчислювали чотири інші концентрації (див. Фіг. 18).
Константи дисоціації (Ко), обчислені як відношення: Кон/Коп, а час напівжиття комплексів, обчислене як відношення: І п(2)/Кої, представлені на фіг. 19 і 20. Вони відповідають середнім значенням чотирьох незалежних експериментів, проведених для кожного антитіла. Вуса діаграми відповідають стандартній помилці (п дорівнює 4) значень.
Константи дисоціації знаходяться в діапазоні від 10 до 100 пМ. Антитіло с208Е2 володіє більш слабкою спорідненістю (більш високим значенням константи дисоціації) до п-ІСЕ-1К (при
Ко близько 75 пМ), а його гуманізований варіант володіє щонайменше такою же гарною спорідненістю, як химерний варіант (при Ко близько 60 рМ) . Чотири інших химерних антитіла до
ІСЕ-1К володіють в достатній мірі подібною спорідненістю до ПІСЕ1-К (при Ко близько 30 пМ).
Різниця значень спорідненості, в основному, пов'язана зі швидкістю дисоціації отриманого в результаті часу напівжиття комплексів. З антитілом 208Е2 час напівжиття комплексу становить від 2 до З годин для химерного і гуманізованого (МНЗЛ/І 3) варіантів. Для чотирьох інших химерних антитіл середні значення часу напівжиття становлять від 7,0 до 9,4 г.
Ці дуже повільні значення кінетики дисоціації явно пов'язані з двухвалентною структурою антитіл, які здатні до одночасного зв'язування обома плечима Бар з двома сусідніми молекулами й-ІСЕ-1К. У цьому випадку рівень захоплених молекул ІЗЕ-1К може впливати на швидкість дисоціації. Значення спорідненості, визначені в цьому дослідженні, відповідають значенням функціональної спорідненості (або авидності) антитіл для рівня захоплення П-ІСЕ-1А близько 600 РЕ. 3-кратна відмінність Ко, що спостерігається між представленими вище даними (таблиця 10), і значення, наведені в Прикладі 13, пов'язані зі зміною рівня захоплення ПІСБ-1А8 (600 РЕ в порівнянні з 160 РЕ в Прикладі 4).
Приклад 14: Синтез лікарських засобів за винаходом
У наведених нижче прикладах використані такі скорочення: ад. водний розчин ен енантіомерний надлишок екв еквівалент
ІЕР Іонізація електророзпилюванням
РХ/МС Рідинна хроматографія, сполучена з мас-спектрометрією
ВЕРХ Високоефективна рідинна хроматографія
ЯМР Ядерний магнітний резонанс нас. насичений
УФ ультрафіолетове випромінювання
Еталонна сполука 1 (5)-2-(5)-2-((3-амінопропіл)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М-((3А,45,55)-3- метокси-1-4((5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((5)-2-феніл-1-(тіазол-2- іл)етил)аміно)пропіл)піролідин--1-іл)-5--метил-1-оксогептан-4-іл)-М,З-диметилбутанамід, біс- трифтороцтова кислота
Во | З тр -х и Н Н тн М ку М х М пд Чия «8. и М ОХ М тр їй : ї | і Х о а Й ж со. а А су Й ей ї жи
Кк: «кт і у ше
Сполука 1А: (48, 55)-4-метил-5--феніл-3-пропаноїл-1,3-оксазолідин-2-он шик ой : й ко Ос МК бо ж ї г У
Ми у й пон НН СК и х вий, ТгФ ра
Б ж (48, 55)-4-метил-5-феніл-1,3-оксазолідин-2-он (5,8 г, 32,7 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в тетрагідрофурані (ТГФ, 120 мл) в інертній атмосфері. Суміш охолоджували до -787сС і додавали по краплях н-бутиллітій (14,4 мл). Після перемішування протягом 30 хвилин при - 787С додавали пропаноїлхлорид (5,7 мл). Перемішування продовжували протягом 30 хвилин при -78 "С, потім протягом ночі при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш концентрували, потім повторно розчиняли в 200 мл води. рН розчину доводили до 7 насиченим водним розчином бікарбонату натрію. Водну фазу екстрагували З рази 100 мл етилацетату (ЕТОАс). Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 6,8 г (8995) сполуки ТА в формі жовтого масла.
Сполука 18: трет-Бутил-(25)-2-Ц18,28)-1-гідрокси-2-метил-3-|(4Н,55)-4-метил-2-оксо-
Б-феніл-1,3-оксазолідин-3-іл|-3З-оксопропіл|піролідин-1-карбоксилат в с Ге) о ос о
Би с М у.о / ге) М - - - ---2 Вос М ї ВшовОТ, ЕвМ но
Сполуку ТА (17,6 г, 75,45 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в дихлорметані (ДХМ, 286 мл) в інертній атмосфері. Цей розчин охолоджували в крижаній бані. Додавали по краплях триетиламін (ТЕА, 12,1 мл, 1,15 екв) і Ви2ВОТІ (78,3 мл, 1,04 екв), при цьому підтримуючи температуру реакційної суміші нижче 2 "С. Перемішування продовжували при 0 "С протягом 45 хвилин, після чого реакційну суміш охолоджувалі до -78 "С. Додавали по краплях розчин трет-- бутил (25)-2-формілпіролідин-1-карбоксилат (8,5 г, 42,66 ммоль, 0,57 екв) в ДХМ (42 мл).
Перемішування продовжували протягом 2 годин при -78 "С, потім протягом 1 години при 0 Сі, нарешті, 1 години за нормальної температури довкілля. Реакційну суміш нейтралізували 72 мл фосфатного буфера (рН становить від 7,2 до 7,4) та 214 мл метанолу і охолоджували до 0 "с.
Додавали по краплях розчин 3095 пероксиду водню в метанолі (257 мл), підтримуючи при цьому температуру нижче 10 "С. Перемішування продовжували протягом 1 години при 0 "С. Реакційну суміш нейтралізували 142 мл води, потім концентрували при зниженому тиску. Одержаний в результаті водний розчин екстрагували З рази 200 мл ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Ес і петролейного ефіру (ЕЮАс: РЕ становить 1:68) з одержанням 13,16 г (4095) сполуки 1В в формі безбарвного масла.
Сполука 16: (28,38)-3-(25)-1-МК(трет-бутокси)карбоніл|піролідин--2-іл|-3-гідрокси-2-- метилпропанова кислота г хх М і ле
Ох -О. Б бос ВК: іє ! Н У З я че й а І 3 о. Я хх я с ж до: су -М ах
М шт сеовичте є нат і Вис, М ' ге. | Є що
Сполуку 1В (13,16 г, 30,43 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в ТГФ (460 мл) в присутності пероксиду водню (3095 у воді, 15,7 мл), потім охолоджували в крижаній бані. Додавали по краплях водний розчин гідроксиду літію (0,4 моль/л, 152,1 мл), підтримуючи при цьому температуру реакційної суміші нижче 4 "С. Реакційну суміш перемішували протягом 2,5 годин при 0 "С. Додавали по краплях водний розчин Ма»5Оз (1 моль/л, 167,3 мл), підтримуючи при цьому температуру реакційної суміші при 0 "С. Реакційну суміш перемішували протягом 14 годин при температурі навколишнього середовища, потім нейтралізували 150 мл холодного насиченого розчину бікарбонату натрію і промивали З рази 50 мл ДХМ. рН водного розчину доводили до 2-3 1М водним розчином КНЗО». Водний розчин екстрагували З рази 100 мл
ЕЮОАс. Органічні фази об'єднували, промивали один раз насиченим розчином Масі, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 7,31 г (8895) сполуки 1С в формі жовтого масла.
Сполука 10: (2838)-3-(25)-1-К(трет-бутокси)карбоніл|піролідин--2-іл|-3-метокси-2-- метилпропанова кислота г ек . ке т Г ман, снаутгФ м не ше шен а СИ усон но а ч 0
Сполуку 1С (7,31 г, 26,74 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ТГФ (135 мл) в присутності йодметану (25,3 мл). Реакційнну суміш охолоджували в крижаній бані, після чого додавали порціями Ман (6095 в маслі, 4,28 г). Реакційну суміш залишали при перемішуванні на
З дні при 0 "С, а потім нейтралізували 100 мл насиченого водного розчину бікарбонату натрію і промивали З рази 50 мл ефіру. рН водного розчину доводили до З 1М водним розчином КНЗО».
Водний розчин екстрагували З рази 100 мл ЕІОАс. Органічні фази об'єднували, промивали один раз Маго2Оз (595 в воді), один раз насиченим розчином Масі, потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 5,5 г (7295) сполуки 10 в формі безбарвного масла.
Сполука 1Е: М--метокси-М-метил-2-фенілацетамід зо
НО
,. их Ла Один що карих о БИ;
ЦИ І Пн НН ШИ ЩО о: ШЕ щока І Й | У ау й
ПЕРС, ЕБМЛМО 2-Фенілоцтову кислоту (16,2 г, 118,99 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в диметилформаміді (ДМФ, 130 мл), потім охолоджували до -10 "С. Додавали діетилфосфороціанідат (ОЕРС, 19,2 мл), гідрохлорид метокси(метил)аміну (12,92 г, 133,20 ммоль, 1,12 екв) і триетиламін (33,6 мл).
Реакційну суміш перемішували протягом 30 хвилин при -10 "С, потім 2,5 години при температурі навколишнього середовища. Потім її двічі екстрагували 1 літром ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, двічі промивали 500 мл Мансоз (нас.), Один раз 400 мл води, потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Ес і РЕ (від 1:100 до 1:3) з одержанням 20,2 г (9595) сполуки ТЕ у формі жовтого масла.
Сполука ТЕ: 2-Феніл-1-(1,3-тіазол-2-іл)етан-1-он
А
М 5 о жк Хлх ел: меш я й ; жа й о по, тМЕрАЛТФ М З
Тетраметилетилендіамін (ТМЕВА, 27,2 мл) розчиняли в ТГФ (300 мл) в інертній атмосфері, потім охолоджували до -78"0С, після чого додавали по краплях п-Виї і (67,6 мл, 2,5 М).
Додавали по краплях 2-бром-1,3-тіазол (15,2 мл), і перемішування продовжували протягом 30 хвилин при -78 "С. Додавали по краплях сполуку 1Е (25 г, 139,50 ммоль, 1,00 екв), розчинену в
ТГФ (100 мл) Перемішування продовжували протягом 30 хвилин при -78 "С, потім 2 годин при - "б. Реакційну суміш нейтралізували 500 мл КНБО» (нас.), Потім екстрагували З рази 1 літром
ЕОАс. Органічні фази об'єднували, двічі промивали 400 мл води і двічі 700 мл Масі (нас.), 10 Потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Ес і РЕ (від 1:100 до 1:10) з одержанням 25 г (8895) сполуки 1Е в формі жовтого масла.
Сполука 12: (18)-2-феніл-1-(1,3-тіазол-2-іл)етан-1-ол (о); но (13-ІрсоВСІ 7 -- -- 45... з -
МВ ЕЬО МВ х-у/ х-/
В інертній атмосфері розчин сполуки ТЕ (15 г, 73,8 ммоль, 1,00 екв.) в ефірі (300 мл) додавали по краплях до (-)-В-хлордіїзопінокамфеїлборану ((-)-ІрсгВСІ, 110,8 мл). Реакційну суміш перемішували протягом 24 годин при 0 "С, потім нейтралізували 300 мл суміші (1:1)
Маон (1055 в воді) і НгОг» (3095 в воді і, нарешті, екстрагували три рази 500 мл ЕІОАс. Органічні фази об'єднували, двічі промивали 300 мл К»СОз (нас.) і один раз 500 мл Масі (нас.), потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Ес і РЕ (від 1:20 до 1:2) з одержанням 6,3 г (4295) сполуки 15 в формі білої твердої речовини.
Сполука 1Н: 2--(15)-1-азидо-2-фенілетил)-1,3-тіазол они ща х 5 черА ! ! пс шк С мив ние ак Шк ч-і тгФф У
Сполуку Та (6 г, 29,23 ммоль, 1,00 екв.) розчиняли в інертній атмосфері в ТГФ (150 мл) в присутності трифенілфосфіну (13 г, 49,56 ммоль, 1,70 екв.), потім охолоджували до 0760.
Додавали по краплях діетилазодикарбоксилат (ОБАО, 7, мл) з наступним додаванням дифенілфосфорилазиду (ОРРА, 11 мл), потім охолоджуючу баню видаляли, і розчин залишали при перемішуванні на 48 годин при температурі навколишнього середовища. Суміш концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Е(ОАсС і
РЕ (від 1:100 до 1:30) з одержанням 8 г частково очищеної сполуки 1Н в формі жовтого масла.
Сполуку 1Н використовували в такому вигляді в наступній стадії.
Сполука 11: трет-Бутил-М-А((15)-2-феніл-1-(1,3-тіазол-2-іл)/етилІкарбамат
Ма. ще : Н р Ії з а РРЛІФ МНН ОМ. ям
М п ї осо, дюжозн вите ее
Хі
Сполуку 1Н (6,5 г, 28,2 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ТГФ (100 мл) в присутності трифенілфосфіну (6,5 г, 33,9 ммоль, 1,20 екв.) і нагрівали до 50 "С протягоме 2 годин. Потім додавали аміак (70 мл), і нагрівання продовжували протягом З годин. Реакційну суміш охолоджували, нейтралізували 500 мл води, потім екстрагували З рази 500 мл ЕЮАСс.
Органічні фази об'єднували і двічі екстрагували 500 мл 1 н. НС. Водні фази об'єднували, доводили до рН 8-9 додаванням розчину гідроксіду натрію (1095 у воді), потім екстрагували З рази 500 мл ДХМ. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 4,8 г (83 90) (15)---феніл-1-4(1,3-тіазол-2-іл)уетан-1-аміну в формі жовтого масла. Потім ці сполуки захищали групою Вос ((трет-бутокси)карбоніл), щоб її можна було очистити. Її розчиняли в інертній атмосфері в 1,4-діоксані (40 мл), потім охолоджували до 0 "С. Додавали по краплях (Вос)2О (10,26 г, 47,01 ммоль, 2,00 екв), розведений в 20 мл 1,4-діоксану. Охолоджуючу баню видаляли, і розчин залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, після чого нейтралізували 300 мл води і двічі екстрагували 500 мл ЕОАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕЮАс і РЕ (від 1:100 до 1:20, ен дорівнює 9395). Потім суміш перекристалізованої в суміші гексан/ацетон (- 5-10/1,1 г/10 мл) з одержанням б г (8495) сполуки 1! в формі білої твердої речовини (ен » 9995).
Сполука 19: трет-Бутил (25)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-2-|(15)-2-феніл-1-(1,3- тіазол--2-іл/уетилікарбамоїліетил|піролідин--1-карбоксилат 2 (0) /
ША, од, 29 : їм Те мк претттттттеетеетттете тестове Ж Я |; ії г «Ка Мей веж овес дхм ш-й Є Вл дів Свопука 1 ув б ре
Сполуку ТІ (3 г, 9,86 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в 10 мл ДХМ.
Додавали трифтороцтоову кислоту (ТФО, 10 мл), і розчин залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску з одержанням 2,0 г (64905) (15)-2--феніл--1-(1,3-тіазол-2-іл)етан-1-аміну; трифтороцтова кислота в формі жовтого масла. Цю проміжну сполуку повторно розчинили в 20 мл ДХМ, після чого додавали сполуку 10 (1,8 г, 6,26 ммоль, 1,05 екв), ОЕРС (1,1 г, 6,75 ммоль, 1,13 екв) і дііззопропілетиламін (ОІЕА, 1,64 г, 12,71 ммоль, 2,13 екв). Реакційну суміш залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Е(Ас і РЕ (від 1:100 до 1:3) з одержанням 2,3г (8195) сполуки 1.) в формі блідо-жовтої твердої речовини.
Сполука ІК: (28,38)-3-метокси-2-метил-М-(Ц15)-2-феніл-1-(1,3-тіазол-2-іл)етилІ|-3-
К25)-піролідин-2-іл|Іпропанамід; трифтороцтова кислота їй Є ТЕВ
БОС -Ї у чад оз» а А у ще Я їз дхм о В; щи щи
Сполуку 1) (2,25 г, 4,75 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в 10 мл ДХМ.
Додавали ТФО (10 мл), і розчин залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску з одержанням 2,18 г (9495) сполуки 1К в формі жовтого масла.
Сполука 11: (25,35)-2--(бензиламіно)-3-метилпентанова кислота 5 он о Ммавн,, маон(г2 М) бо
(25,35)-2-аміно-3-метилпентанову кислоту (98,4 г, 750 ммоль, 1,00 екв) додавали при температурі навколишнього середовища і порціями до 2 н. розчину гідроксиду натрію (375 мл).
Швидко додавали бензальдегід (79,7 г, 751,02 ммоль, 1,00 екв), і одержаний в результаті розчин перемішували протягом 30 хвилин. Додавали невеликими порціями боргідрид натрію (10,9 г, 288,17 ммоль, 0,38 екв), підтримуючи при цьому температуру від 5 до 15 "С. Перемішування продовжували протягом 4 годин при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш розбавляли 200 мл води, потім двічі промивали 200 мл ЕІОАс. рН водного розчину доводили до 7 2 зв. розчином соляної кислоти. Осад збирали фільтруванням і одержали 149,2 г (9095) сполуки 1! в формі білої твердої речовини.
Сполука 1М: (25,35)-2--бензил(метил)аміно|-3-метилпентанова кислота ст АХ он Формапьденід ду дві Он и нн НИ Я НН Я м НН: неон. вою я
Сполуку 1 (25 г, 112,97 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в мурашиній кислоті (31,2 г) в присутності формальдегіду (36,595 в воді, 22,3 г). Розчин перемішували протягом З годин при 90 "С, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок розтирали в 250 мл ацетону, потім концентрували. Операцію розтирання/випарювання повторювали двічі з 500 мл ацетону з одержанням 21,6 г (8195) сполуки 1М в формі білої твердої речовини.
Сполука 1М: (25,35)-2--бензил(метил)аміно|-3-метилпентан-1-ол дю т ву те Ще пт ше я і Не ще: !
ШПАЇНа. (0,36 г) суспендували в 10 мл ТГФ в інертній атмосфері при 0 "б. Додавали невеликими порціями сполуку 1М (1,5 г, 6,37 ммоль, 1,00 екв), підтримуючи при цьому температуру від 0 до 10 "б. Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при 65 "С і знову охолоджували до 0 "С, після чого нейтралізували послідовними доповненнями 360 мкл води, 1 мл 1595 гідроксиду натрію і 360 мкл води. Осаджені солі алюмінію відокремлювали фільтруванням. Фільтрат висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували.
Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕюЮАс і РЕ (1:50) з одержанням 820 мг (5895) сполуки 1М в формі блідо-жовтого масла.
Сполука 10: (25,35)-2--бензил(метил)аміно|-3-метилпентаналь це жк Оки т тр з і Її ОДМсо, вом Її о тоди Н а ши С я
Я дхм ше
Оксалілхлорид (04 мл) розчиняли в ДХМ (15 мл) в інертній атмосфері. Розчин охолоджували до -70 "С і додавали по краплях розчин диметилсульфоксиду (ДМСО (0,5 мл) у
ДХМ (10 мл)) протягом 15 хвилин. Реакційну суміш перемішували 30 хвилин, після чого додавали по краплях розчин сполуки 1М (820 мг, 3,70 ммоль, 1,00 екв) в ДХМ (10 мл) протягом 15 хвилин. Реакційну суміш перемішували додатково протягом 30 хвилин при низькій температурі, потім повільно додавали триетиламін (2,5 мл). Реакційну суміш перемішували 1 годину при -50 "С, потім охолоджуючу баню видаляли, і реакційну суміш нейтралізували 25 мл води, при цьому даючі температурі суміші повернутися до звичайної. Розчин двічі промивали 30 мл насиченого розчину МасСі, потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕТОАс і РЕ (1:200) з одержанням 0,42 г (52905) сполуки 10 в формі жовтого масла.
Сполука 1Р: (25,35)-М-бензил-1,1-диметокси-М,3-диметилпентан-2--амін
М до о. М о.
С | | о
НьБО,, меон т
Сполуку 10 (4,7 г, 21,43 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 20 мл метанолу при 0 "С. Додавали по краплях концентровану сірчану кислоту (4,3 мл), і перемішування продовжували протягом 30 хвилин при 0 "С. Додавали триметилортоформіат (21,4 мл), охолоджуючу баню видаляли, і 5 реакційну суміш залишали при перемішуванні на З години при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш розбавляли 200 мл ЕЇОАс, послідовно промивали 100 мл 1095
Маг2бОз і 200 мл насиченого розчину МасСі, потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 3,4 г (6095) сполуки 1Р в формі блідо-жовтого масла.
Сполука 10: (П1-««трет-бутокси)етеніл|окси|«трет-бутил)удиметилсилан виме о ! | - твором. о ше тома: Її т Ва ке пн дю о7 А,
МА ТРФ, НМРА
Діїзопропіламін (20 г, 186,71 ммоль, 1,08 екв) розчиняли в 170 мл ТГФ в інертній атмосфері і охолоджували до -78 "С. Додавали по краплях пВиї і (2,4 М, 78,8 мл), і розчин перемішували протягом 30 хвилин при низькій температурі (з одержанням І ВА - діізопропіламіду літію), після чого додавали трет-бутилацетат (20 г, 172,18 ммоль, 1,00 екв). Реакційну суміш перемішували хвилин при -78 "С, після чого додавали гексаметилфосфорамід (НМРА, 25,8 мл) і розчин трет-бутилдиметилхлорсилану (ТВОМ5СІ, 28 г, 185,80 ммоль, 1,08 екв) в 35 мл ТІФ. 20 Перемішування продовжували додатково протягом 20 хвилин при низькій температурі, а потім охолоджуючу баню видаляли. Розчин концентрували при зниженому тиску. Залишок повторно розчиняли в 100 мл води, потім екстрагували З рази 100 мл РЕ. Органічні фази об'єднували, промивали один раз 500 мл насиченого розчину масі, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали перегонкою з одержанням 16,6 г (8395) сполуки 10 в формі безбарвного масла.
Сполука 1К: трет-Бутил (ЗК,45,55)-4-(бензил(метил)аміно|-3-метокси-5-метилгептаноат рення ТВО ую нак ша з
НН І і тив ЦО в 5 і води ОО схдкоюе ; Моя -
М х ВЕУ; ББОДЛМе, го
Сполуку 1Р (2,0 г, 7,54 ммоль, 1,00 екв) і сполуку 10 (2,6 г, 11,28 ммоль, 1,50 екв) розчиняли в 33 мл ДХМ в інертній атмосфері. Розчин охолоджували до 0 "С. Додавали по краплях ДМФ (1,2 г) разом з розчином ВЕз'ЕБО (2,1 г) в 7,5 мл ДХМ. Перемішування продовжували протягом 24 годин при 0 "С. Реакційну суміш промивали один раз 30 мл карбонату натрію (1095) і двічі 50 мл насиченого водного розчину Масі, потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕТОАс і РЕ (1:100) з одержанням 1,82 г (9195) сполуки 1К в формі жовтого масла.
Сполука 15: Гідрохлорид (З3К,45,55)-3-метокси-5-метил-4-(метиламіно)гептаноату
Ра/С, НС, Но», ЕЮН /ОНСЇ се - « - йЯж у о. о о. о
Сполуку 1К (2,4 г, 6,87 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в 35 мл етанолу в присутності Ра/с (0,12 г) і концентрованої соляної кислоти (0,63 мл). Атмосферу азоту витісняли атмосферою водню, і реакційну суміш залишали при перемішуванні на 18 годин при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Залишок розтирали в 50 мл гексану, і супернатант видаляли, в результаті після висушування при зниженому тиску одержали 1,66 г (8295) сполуки 15 в формі білої твердої речовини.
Сполука 1: трет-Бутил (3Е,45,55)-4-І(25)-2-ІКбензилокси)карбоніл|аміно|-М,3- диметилбутанамідо|-3-метокси-5- метилгептаноат о
М а . ЯМ Ж ту : сет суб ТОН Оу щи я шк и ре В Ї ДІ кт ННЯ й щі й окр у по с ун Со їй БУВР, ОІБАЛТФ --0 о (25)-2-І(бензилокси)карбоніл|аміно|-3-метилбутанову кислоту (15 г, 0,40 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 300 мл ДХМ в присутності СІЕА (38,3 мл) і бромтрипіролідинфосфонію гексафторфосфату (РУВГОР, 32,3 г). Розчин перемішували 30 хвилин при температурі навколишнього середовища, після чого додавали сполуку 15 (15,99 г, 0,42 ммоль, 1,07 екв).
Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин, а потім концентрували. Залишок очищали на колонці з оберненою фазою (С18) сумішшю ацетонітрилу (АСМ) та води (від 30:70 до 100:0 за 40 хвилин) з одержанням 17 г (5895) сполуки 17 в формі безбарвного масла.
Сполука 1Ш: трет-Бутил-(38,45,55)-4-(25)-2-аміно-М,3-диметилбутанамідо| 3З-метокси- 5- метилгептаноат (6)
Н (в)
М що ЗО РЯ/С, ЕЮН а у
Х о. о р - реч о. о
Сполуку 1 (76 мг, 0,15 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в 10 мл етанолу в присутності Ра/С (0,05 г). Атмосферу азоту витісняли атмосферою водню, і реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 64 мг сполуки ТО в формі безбарвного масла.
Сполука 1М: (38,45,55)-4-(25)-2-І(9Н-флуорен-9-ілметокси)карбоніл|аміно|-М,3- диметилбутанамідо|-3-метокси-5-метилгептаноат ж нев мч о І , глин но ,
НЯМ. сш Ве лк 0 ка Пора ко кошт В вень ря
КО мансоїї ра о ЕН дійкоав ЛЬ рен 0 о з
Сполуку 1Ш (18,19 г, 50,74 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 400 мл суміші 1,4--діоксан/вода (1:1) в присутності бікарбонату натрію (12,78 г, 152 ммоль, 3,00 екв) і 9Н-флуорен-9- ілметилхлорформіат (Етос-СІ, 19,69 г, 76 ммоль, 1,50 екв), потім перемішували протягом 2 годин при температурі навколишнього середовища. Потім реакційну суміш розбавляли 500 мл води і екстрагували З рази 200 мл ЕОАс. Органічні фази об'єднували, промивали один раз 200 мл насиченого водного розчину МасСі, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 40 г частково очищеної сполуки 1М в формі блідо-жовтого масла.
Сполука 1Му: (38,45,55)-4-(25)-2-І4(9Н-флуорен-9-ілметокси)карбоніл|аміно|-М,3-- диметилбутанамідо|-3-метокси-5-метилгептанова кислота
В Ї Ві й ефВанкивх х Ї ВІ . он
Ето с во 7 йо Й тр те щи пиття кутя ТО Е пк й В м Ш-
А ва я в
Сполуку 1М (40 г, 68,88 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в нейтральній атмосфері в 600 мл ДХМ.
Додавали ТФО (300 мл). Розчин перемішували 2 години при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю метанолу та ДХМ (1:10) з одержанням 23,6 г (6595) сполуки ТУМ в формі безбарвного масла.
Сполука 1Х: 9Н-флуорен-9-ілметил М-(15)-1-І((ЗА,45,55)-3-метокси-1-((25)-2-(18,28)- 1-метокси-2-метил-2-їЇ(15)-2-феніл-1-4(1,3-тіазол--2-іл)етилікарбамоїлі|етилі| піролідин--1-іл|-
Б-метил-1-оксогептан-4-іл)"(метил)карбамоїл|-2--метилпропіл|карбамат а ра мех но ше ! Сполука ЗК сени ЛИХ А
Ер ї і ї Її І. пЕАОЕРЕ, ДМ а ме сй г є кн
Мей зов т
Сполуку ТУУ (2,53 г, 4,82 ммоль, 1,08 екв) розчиняли в 20 мл ДХМ в присутності сполуки їК (2,18 г, 4,47 ммоль, 1,00 екв), ОЕРС (875 мг, 5,37 ммоль, 1,20 екв) і ОІЕА (1,25 г, 9,67 ммоль, 2,16 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, потім послідовно промивали 50 мл насиченого розчину КНЗО» і 100 мл води, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю метанолу та ДХМ (від 1: 200 до 1:40) з одержанням 2,8 г (71965) сполуки 1Х в формі блідо-жовтої твердої речовини.
Сполука 1У: (25)-2-аміно-М-((ЗА,55)-3-метокси-1-(25)-2-(Щ18,28)-1-метокси-2-метил- 2-І(К15)-2-феніл--1-4(1,3-тіазол-2-іл/етилікарбамоїл|етил|піролідин--1-іл|-5--метил--1- оксогептан--4-іл|-М,З-диметилбутанамід о шк вх І о р 7
ЕнвкаМ. щйх ен 24 ПлеридиносвУК ет й ши ше и од ин ши ше ше ше р чи і и я ОМ ж у сни ї дин
Мей у ей Що ме Бех
Сполуку 1Х (2,8 г, 3,18 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в ацетонітрилі (АСМ, 12 мл) в присутності піперидину (З мл) і залишали при перемішуванні на 18 годин при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш нейтралізували 50 мл води, потім двічі екстрагували 100 мл ДХМ.
Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували.
Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю метанолу та ДХМ (від 1:100 до 1:40) з одержанням 1,2 г (57965) сполуки 1У в формі жовтої твердої речовини.
Сполука 172 А: (25)-2--ІКтрет-бутокси)карбоніл|(метил)аміно|-3-метилбутанова кислота й а о к-т
Восние й тгФ босМ г о о зо (25)-2-І(трет-бутокси)карбоніл|аміно|-3-метилбутанову кислоту (63 г, 289,97 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ТГФ (1000 мл) в присутності йодметану (181 мл). Розчин охолоджували до 0 "С, після чого додавали гідрид натрію (116 г, 4,83 моль, 16,67 екв) невеликими порціями. Реакційну суміш перемішували протягом 1,5 годин при 0 "С, потім охолоджуючу баню видаляли, і перемішування продовжували протягом 18 годин. Реакційну суміш нейтралізували 200 мл води, а потім концентрували при зниженому тиску. Залишкову водну фазу розбавляли 4 літрами води, промивали один раз 200 мл ЕОАс і доводили рН до значення між З і 4 1 зв. розчином соляної кислоти. Одержану суміш екстрагували З рази 1,2 л
ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 60 г (8995) сполуки 12А в формі жовтого масла.
Сполука 128: бензил-(25)-2-І(трет-бутокси)карбоніл|(метил)аміно|-3-метилбутаноат ї Ко; Ні ели а Ш ВІ ОВ
Восм р "тлмФ жо ВеМ тю
Сполуку 12А (47 г, 203,21 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в ДМФ (600 мл) в присутності І і2СОз (15,8 г, 213,83 ммоль, 1,05 екв). Розчин охолоджували до 0 "С, потім додавали по краплях бензилбромід (ВопВг 57,9 г, 338,53 ммоль, 1,67 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні, після чого нейтралізували 400 мл води і фільтрували. Одержаний розчин двічі екстрагували 500 мл ЕОАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕОАс і РЕ (від 1:100 до 1:20) з одержанням 22,5 г (34965) сполуки 12В в формі жовтого масла.
Сполука 12С: гідрохлорид бензил-(25)-3-метил-2-(метиламіно)бутаноату чо ще ай вч шк де щ Х ов Не тА ОВ досМ ї М - НМ І
ЇЇ о дхМ Її о
Сполуку 128 (22,5 г, 70,00 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 150 мл ДХМ. Барботували газоподібну соляну кислоту. Реакційну суміш перемішували 1 годину при температурі навколишнього середовища, а потім концентрували при зниженому тиску з одержанням 17 г (9495) сполуки 12С в формі жовтої твердої речовини.
Сполука 120: трет-Бутил-М-4(3,3-діетоксипропіл)карбамат "а осо, МЕ с) нате тет» діюксан ВДоснм ета»
З3,3-Діеєтоксипропан--1-амін (6 г, 40,76 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 1,4--діоксані (30 мл) в присутності ТЕА (4,45 г, 43,98 ммоль, 1,08 екв), потім охолоджували до 0 "С. Додавали по краплях (Вос)2О (9,6 г, 43,99 ммоль, 1,08 екв), розведений в 20 мл 1,4-діоксану. Розчин перемішували 2 години при 0 "С, потім протягом ночі при температурі навколишнього середовища, після чого нейтралізували 10 мл води. рН доводили до 5 НОСІЇ (195). Розчин екстрагували З рази 50 мл ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 8,21 г (8195) сполуки 120 в формі блідо- жовтого масла.
Сполука 12Е: трет-Бутил-М-(3-оксопропіл/укарбамат о АСОН, НьО н о -- н «- - яшьк й - воснМ о. Вос7 Я Х
Сполуку 120 (8,20 г, 33,15 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 18,75 мл оцтової кислоти і залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища. Потім реакційну суміш екстрагували З рази 30 мл ЕІАс. Органічні фази об'єднували, промивали З рази 30 мл насиченого розчину Масі, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 5 г (8795) сполуки 12Е в формі темно-червоного масла.
Сполука 1: (25)-2-І(3-Ітрет-бутокси)карбоніл|аміно|пропіл)у(метил)аміно|-3- метилбутанова кислота нм Х дою й
Й -ко й о ше РЕНО, Вос. пана -- АН
Вот 7-70 МАВ, Мерн й щ
ГТБАДТФ й
Сполуку 12Е (2,4 г, 13,86 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 50 мл ТГФ у присутності сполуки 17С (3,56 г, 13,81 ммоль, 1,00 екв) і ОІЕА (9,16 мл, 4,00 екв). Реакційну суміш перемішували 30 хвилин при температурі навколишнього середовища, після чого додавали триацетоксиборгідрид натрію (5,87 г, 27,70 ммоль, 2,00 екв). Перемішування продовжували протягом ночі, потім реакційну суміш нейтралізували 100 мл води і екстрагували З рази 50 мл
ЕТАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок частково очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕАс і РЕ (1:4).
Одержаний неочищений продукт повторно розчиняли в 20 мл метанолу в присутності Ра/с (1,2 г) і гідрогенізували протягом 20 хвилин при звичайній температурі і тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 200 мг (595) сполуки 127Е в формі білої твердої речовини.
Сполука 125: трет-бутил-М-(3-(К1 5)-1--(15)-1-І((Х38,45,55)-3-метокси-1-((25)-2-
І 1А,28)-1-метокси-2-метил-2-Ї(15)-2-феніл-1-(1,3-тіазол--2-іл)етилікарбамоїлі|гіїл піролідин--1-іл|-5--метил--1-оксогептан-4-іл|"метил)карбамоїл|-2-метилпропілікарбамоїл|-2-- метилпропіл)|)(метил)аміно|Іпропіл)/укарбамат ин шви І В в шо мн най Що шщ у жов Кз т з я їх ак
К в МАТИ ОКАДМФ і 5 як вв дей 3 щеяв ри З
Сполуку 1 (50 мг, 0,08 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 2 мл ДМФ в присутності сполуки 17Е (26,2 мг, 0,09 ммоль, 1,20 екв), БІЕА (37,7 мл) ії О-(7-азабензотриазол--1-іл)-М,М,М'М'- тетраметилуронію гексафторфосфату (НАТИ, 43,3 мг, 0,11 ммоль, 1,50 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, потім розбавляли 10 мл води і екстрагували З рази 5 мл ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 100 мг сполуки 172 в формі частково очищеного безбарвного масла.
Сполуку 172 (90 мг, 0,10 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в нейтральній атмосфері в 2 мл ДХМ, і розчин охолоджували в крижаній бані. ТФО (1 мл) додавали, і реакційну суміш перемішували 2 години при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску.
Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 ЗНІМАБ2И, колонка З!йпРїіге Ргер С18
ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 1895 до 3195 АСМ протягом 7 хвилин, потім від 3195 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; УМаїегв 2489, УФ детектор при 254 нм і 220 нм). Сполуку 1 було одержано при виході 2595 (23 мг) у формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Айапіїв ТЗ, З мкм, 4,6 х 100 мм; 35 "С; 1 мл/хв, від 3095 до 6095 АСМ в воді (20 мМ ацетат амонію протягом 6 хвилин); ІЕР (С44Н73М7065, точна маса 827,53) т/: 829 (МНУ), 5,84 хв (93,795, 254 нм).
І"Н ЯМР (300 МГц, СОзО0б, ррт): б (присутність ротамерів) 7.85 - 7.80 (т, 1Н); 7.69 - 7.66 (т, 1Н), 7.40 - 7.10 (т, 5Н), 5.80 - 5.63 (т, 1Н), 4.80 - 4.65 (т, 2Н), 4.22 -4.00 (т, 1Н), 3.89 - 0.74 (т, 58Н).
Еталонна сполука 2 (5)-2-(5)-2-((2-амінопіридин-4-іл)метил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М- (38,45,55)-1-((5)-2-(18,28)-3-((15,28)-1-гідрокси-1-фенілпропан-2-іл)аміно)-1-метокси- 2-метил-3-оксопропіл)піролідин-1-іл)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан--4-іл)-М,3- диметилбутанамід, трифтороцтова кислота тк ва уже - ; во шо; на а Кит В р: вч Ся -ч рах «М
Ї Е Й т ї і і В і
М а: ШИ мо о ж щи - з С ї то і оч он
Гак
Сполука 2А: трет-бутил-(5)-2-(18,28)-3-((15,28)-1-гідрокси-1-фенілпропан-2-іл)аміно)- 1-метокси-2-метил-3-оксопропіл)піролідин-1-карбоксилат
ОМ об ті г Он
НМ. Ка ше о о. о іє пе ни М. Х Кос
Ї Ї зоре ІВ ве о вань й с нер у, воє 5 а і | щі 00 БОМ, ОБР, ДАМ чо я
Сполуку 10 (2,5 г, 8,70 ммоль, 1,00 екв) і (15,28)-2-аміно-1-фенілпропан-1-ол (1,315 г, 8,70 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ДМФ (35 мл). Розчин охолоджували до 0 "С, потім додавали по краплях ОЕРС (1,39 мл) і ТЕА (1,82 мл). Реакційну суміш перемішували 2 години при 0 "С, потім 4 години при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш розбавляли 200 мл води і екстрагували З рази 50 мл ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, промивали один раз 50 мл КНБЗО» (1 моль/л), один раз 50 мл Мансо»з (нас.), один раз 50 мл масі (нас.), потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 3,6 г (9895) сполуки 2А в формі жовтої твердої речовини.
Сполука 2В: (28,38)-М-(15,28)-1-гідрокси-1-фенілпропан-2-іл)-3-метокси-2-метил-3- ((5)-піролідин-2-іл)упропанамід 2,2,2-трифторацетат жк но он - ОН «111 Я. тео / ї н
С ви АХ пт ни п ла дхМ Ав о і І й та й я
Сполуку 2А (2,7 г, 6,42 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ДХМ (40 мл), потім охолоджували до 0 "С. Додавали ТФО (25 мл), і розчин перемішували протягом 2 годин при 0 С. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску з одержанням 4,4 г сполуки 2В в формі жовтого масла.
Сполука 20: (9Н--флуорен-9-іл)метил ((5)-1-((38,45,55)-1-4((5)-2-(18,28)-3-((15,28)-1- гідрокси-1-фенілпропан-2-іл)аміно)-4-метокси-2-метил-3-оксопропіл)піролідин--1-іл)-3-- метокси-5-метил--1-оксогептан-4-ілуметил)аміно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)укарбамат
З с
А що я си вав СтСтИ "ще Ше
Гн ій ки е БИВВНМ Я ит оса я т У: Ве ее
Кт т ї КО дев яку АТ КВ А як Як З и нта ДХМ ши ше: дек і їй ря
З зо
Сполуки 2В (4,4 г, 10,13 ммоль, 1,00 екв) і 1УМ (5,31 г, 10,12 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ДХМ (45 мл). Розчин охолоджували до 0 "С, потім додавали по краплях
ОЕРС (1,62 мл) і ОІЕА (8,4 мл). Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при 0 "С, потім при температурі навколишнього середовища протягом ночі. Реакційну суміш розбавляли 200 мл води і екстрагували З рази 50 мл ЕІОАс. Органічні фази об'єднували, промивали один раз 50 мл
КНБЗО» (1 моль/л), один раз 50 мл Мансоз (нас.), Один раз 50 мл Масі (нас.), Потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 3,Зг (3995) сполуки 2С в формі жовтої твердої речовини.
Сполука 20: (5)-2-аміно-М-((38,45,55)-1-((5)-2-(1828)-3-((15,28)-1-гідрокси-1- фенілпропан-2-іл)аміно)-1-метокси-2-метил-3-оксопропіл)піролідин-1-іл)-3-метокси-о5- метил-1-оксогептан-4-іл)-М,3-диметилбутанамід «3 пень вх, гу й їх ем Я. ве; пічеридин в я борту в ; 5 пеМидин 5 Я ї х . в м о нон мо їй я є т
Ух тя ій р і-й
ЗКУ и
Сполуку 20 (300 мг, 0,36 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в АСМ (2 мл) і піперидині (0,5 мл). Розчин залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, потім випарювали до сухого стану при зниженому тиску. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ДХМ та Меон (1:100) з одержанням 150 мг (6895) сполуки 20 в формі білої твердої речовини.
Сполука 2Е: метил 2-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)ізонікотинат
Н
НьЬМ с СсОоОМе Восо Вос7 7 с СООМе - 32
М. 2 Іі-ВиОН М. 2
Метил-2-амінопіридин-4--карбоксилат (2 г, 13,14 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в трет-бутанолі (20 мл), після чого додавали ди-трет-бутилдикаронат (4,02 г, 18,42 ммоль, 1,40 екв). Реакційну суміш перемішували при 60 "С протягом ночі, потім реакцію зупиняли за допомогою додавання водного розчину 1М Мансо»з (50 мл). Тверду речовину виділяли фільтруванням, промивали 50 мл ЕЮН, потім висушували у вакуумі з одержанням 2,5 г (7595) сполуки 2Е в формі білої твердої речовини.
Сполука 2Е: трет-бутил (4-(гідроксиметил)піридин-2-ілукарбамат
Н Н
М СсОоОМе М
Вос7 ху Ммавн, Сасі Вос7 хх ОН
Сполуку 2Е (2,5 г, 9,91 ммоль, 1,00 екв) і СасСі» (1,65 г) розчиняли в ЕЮН (30 мл). Розчин охолоджували до 0 "С, потім поступово додавали Мавна» (1,13 г, 29,87 ммоль, 3,01 екв). Розчин залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, потім реакцію зупиняли додаванням води (50 мл). Суміш екстрагували три рази 20 мл ЕІЮАс. Органічні фази об'єднували, промивали двічі 20 мл Масі (нас.), Потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 2,0 г (9095) сполуки 2Е в формі безбарвної твердої речовини.
Сполука 20: трет-бутил (4-формілпіридин-2-іл)укарбамат . Ех ву нжі я А і ; ож
Вос р зон МО у во ро
Сполуку 2Е (2,5 г, 11,15 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в ДХЕ (25 мл), потім додавали 19,4 г (223,14 ммоль, 20,02 екв) МпО2». Суміш залишали при перемішуванні на ніч при 70 "С, потім тверді речовини видаляли фільтруванням. Фільтрат випарювали до сухого стану з одержанням 1,4 г (5795) сполуки 20 в формі білої твердої речовини.
Сполука 2н: бензил-(5)-2-((2-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)піридин--4-іл)метил) (метил)аміно)-3-метилбутаноат що Х ок А
Я роя і їй Й о - ! З й !
Ва ХУ буу в СМ В а а а с зн ШО й ї В:
Я ТИФ тнЕ ЧК АМаВНОКОВ ще: ИН Є
Сполуку 22 (2,3 г, 10,35 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 25 мл ТГФ в присутності сполуки 170 (2,93 г, 11,37 ммоль, 1,10 екв), ОІЕА (5,39 г, 41,71 ммоль, 4,03 екв) і Мавн(ОАс)з (4,39 г, 20,71 ммоль, 2,00 екв). Реакційну суміш перемішували протягом б годин при температурі навколишнього середовища, потім нейтралізували 60 мл Мансоз (нас.) і екстрагували З рази 20 мл АсСОЕЇ. Органічні фази об'єднували, промивали двічі 20 мл Масі (нас.), висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю Ес і РЕ (1:15) з одержанням 2,7 г (6195) сполуки 2Н в формі білої твердої речовини.
Сполука 21: (5)-2-((2-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)піридин-4-іл)метил) (метил)аміно)--3-- метилбутанова кислота : 98 : воє7 М | зх «Со ра/с,нь Вос7 У с «Сон
М. | о ЕЮАсС/Меон М. | о
Сполуку 2Н (500 мг, 1,17 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 10 мл АСОБЕЇ і 2 метанолу в присутності Ра/С (250 мг) і гідрогенізували протягом З годин при температурі навколишнього середовища і атмосферному тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 254 мг (6495) сполуки 2І в формі безбарвної твердої речовини.
Сполука 2: трет-бутил (4-((35,65,95,108)-9-((5)-втор-бутил)-10-(2-((5)-2-(18,28)-3- ((15528)-1--гідрокси-1-фенілпропан-2-іл)аміно)-1-метокси-2-метил-3-оксопропіл)піролідин-- 1-іл)-2-оксоетил)-3,6-діізопропіл-2,8-диметил-4,7-діоксо-11-окса-2,5,8- триазидодецил)піридин-2-іл) карбамат тео; й шо: й ро Ї Ей Її Ве о, о;
КОВО и в ше: меш В Її М ШО х ще нв ще п Мі нь я я я р шшШе МАМІ ДЕК І З ше » р дмФ 5 й з
Сполуку 2) було одержано аналогічно сполуці 17 з аміну 20 (85,2 мг, 0,14 ммоль, 1,50 екв), кислоти 21 (31,7 мг, 0,09 ммоль, 1,00 екв), НАТИ (42,9 мг, 0,11 ммоль, 1,20 екв) і ОІЕА (36,7 мг, 0,28 ммоль, 3,02 екв) в ДМФ (3 мл). Після випарювання до сухого стану було одержано 100 мг неочищеного продукту в формі білої твердої речовини.
Сполуку 27 (100 мг, 0,11 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 2 мл ДХМ та 1 мл ТФО. Реакційну суміш перемішували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001
ЗНІМАЮ2И, колонка ЗипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода/АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Умаїег5 2489, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сполуку 2 було одержано при виході 695 (6,3 мг) у формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Азсепіїз Ехрге55 С18, 2,7 мкм, 4,6 х 100 мм; 40 "С; 1,8 мл / хв, від 10 95 до 95 95 АСМ в воді (0,0595 ТФО) протягом 6 хвилин; ІЕР (Са5Н7зіМ707, точна маса 823,56) т/л: 824,5 (МНУ) ї 412,9 (М.2НУ/2, 100 Фо), 3,21 хв (99,296, 210 нм)
І"Н ЯМР (400 МГц, СОзОб, ррт): б (присутність ротамерів) 7.81 - 7.79 (т, 1Н); 7.39 - 7.29 (т, 5Н); 6.61 - 6.59 (т, 2Н); 4.84 - 4.52 (т, 1Н); 4.32 - 4.02 (т, 1Н); 3.90 - 2.98 (т, 10Н); 2.90 - 2.78 (т, 1Н); 2.55 - 0.81 (т, ЗОН).
Еталонна сполука З метил (5)-2-(28,38)-3-((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-М,3-диметил-2-4((5)-3-метил-2- (метил(піридин-4-ілметил)аміно)бутанамідо)бутанамідо)-3-метокси-о-
метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3--метокси-2-метилпропанамідо)-3-фенілпропаноат, трифтороцтова кислота в я я і ши тв янь ж ра сук ам в «М. ;
М -ши й ЕФ. шт, ск Ге я - -х сн я о р ше "МА тео шщя би іх очну мл й іч й
Сполука ЗА: трет-бутил (5)-2-(18,28)-1--метокси-3-4(((5)-1-метокси-1-оксо-3- фенілпропан-2-іл)аміно)-2-метил-3-оксопропіл)піролідин--1-карбоксилат
С і і вам 1 1 КІ Ж щ Те Ї я о ще да : го га тек - с КаОе я Й у айс з; їх «АГ
НІМ. т Пт 7 зи Бе
БЬМООБРСДМФ в 5 о Ї , р ши шк осей пла и о е
Сполуку 10 (З г, 10,44 ммоль, 1,00 екв) і метил-(5)-2-аміно-3-фенілпропаноат (2,25 г, 12,55 ммоль, 1,20 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ДМФ (40 мл). Розчин охолоджували до 0 с, потім додавали по краплях ОЕРС (1,67 мл, 1,05 екв) і ТЕА (3,64 мл, 2,50 екв). Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при 0 "С, потім при температурі навколишнього середовища протягом ночі. Реакційну суміш розбавляли 100 мл води і екстрагували три рази 50 мл Е(АСс.
Органічні фази об'єднували, промивали один раз 100 мл КНЗО» (1 моль/л), один раз 100 мл
МансСоОз (нас.), один раз 100 мл Масі (нас.), потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 4 г (8595) сполуки ЗА в формі безбарвного масла.
Сполука ЗВ: 2,2,2-трифторацетат метил (5)-2-((28,38)-3-метокси-2-метил-3-((5)- піролідин-2-іл)упропанамідо)-3-фенілпропаноат
С Ще ження - - Ел ; Я ех і | Її в 7 тео г 1 Її н ! в чи ще: Я ше М ее
ЕК дит о є з ї тр во й дхм Я 6 бля
Бе й Е же ся Ь п й и дядя то ото
Сполуку ЗА (5 г, 11,15 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ДХМ (40 мл).
Додавали ТФО (25 мл), і розчин перемішували протягом 2 годин. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску з одержанням 8 г сполуки ЗВ в формі жовтого масла.
Сполука ЗС: метил о (5)-2-(2Н8,38)-3-((5)-1-((38,45,55)-4-(5)-2-(((9Н-флуорен-9- ілуметокси)карбоніл)аміно)-М,3-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-- 2-іл)-3-метокси-2-метилпропанамідо)-3-фенілпропаноат бок о пр Го рих му, ра ся пише я ме о ре я , щи -к в АК ин
М ОоЕ ї докладно ох т зх й т
С ЧИХ : У МН А к Я був гвкА, ПЕРСДАМ Ге; р; днк
У гот т о.
Сполуку ЗВ (8,03 г, 17,36 ммоль, 1,00 екв) і ТУМ (9,1 г, 17,34 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ДХМ (80 мл). Розчин охолоджували до 0 "С, потім додавали по краплях
ОЕРС (2,8 мл) і ОІЕА (12 мл). Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при 0 "С, потім при температурі навколишнього середовища протягом ночі. Реакційну суміш розбавляли 200 мл води і екстрагували три рази 50 мл ДХМ. Органічні фази об'єднували, промивали один раз 50 мл КНБЗО» (1 моль/л), один раз 50 мл МансоОз (нас.), один раз 50 мл Масі (нас.), потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 5 г (3495) сполуки ЗС в формі жовтої твердої речовини.
Сполука 30: метил (5)-2-(28,38)-3-4((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2--аміно-М,3- диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-- метилпропанамідо)-3- фенілпропаноат ши и м ек нн фа веде В МФ се а о ня ЕК, м ще Я ше де твАє рі ря і їх У цій Пити. А З Є З; з сов у с у. ; г ре Бе: й та
Тайн хайтнної В
Бе й ще де ьУ раса о ви чн Ой й
Сполуку ЗС (5,5 г, 6,43 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в розчині фториду тетрабутиламонію (ТВАБЕ, 2,61 г, 9,98 ммоль, 1,55 екв) в ДМФ (100 мл). Розчин перемішували при температурі навколишнього середовища протягом 2 годин, потім розбавляли 100 мл води і екстрагували три рази 50 мл ЕЮАс. Органічні фази об'єднували, потім висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 3,3 г (8195) сполуки ЗО в формі жовтої твердої речовини.
Сполука ЗЕ: бензил-(5)-3-метил-2-(метил(піридин-4-ілметил)аміно)бутаноат й є й ее Ї Н ї ( у в й НИ Її а г т ке щ7 з о
М - ІЗ ни" х дих т Ж й пуд оумюин й т ше. мав Моб 0000
ДХЕ
Піридин-4-карбальдегід (1 г, 9,34 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 10 мл 1,2-дихлоретану (ДХЕ) в присутності сполуки 176 (2,9 г, 11,25 ммоль, 1,21 екв) та ізопропоксиду титану (ІМ) (4,19 мл, 1,40 екв). Суміш перемішували при температурі навколишнього середовища протягом 30 хвилин, потім додавали 2,77 г Мавн(ОАс)з (13,07 ммоль, 1,40 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні, потім нейтралізували 100 мл води, і суміш екстрагували З рази 50 мл
АСОКЇ. Органічні фази об'єднували і випарювали до сухого стану. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕТОАс і РЕ (1:20) з одержанням 1,3 г (4595) сполуки ЗЕ в формі безбарвного масла.
Сполука ЗЕ: (5)-3-метил-2-(метил(піридин-4-ілметил)аміно)бутанова кислота
Ра/с,нь Он ху 58 - : -ш- хх с
М. я Ї о ЕОАС М. | о
Сполуку ЗЕ (800 мг, 2,56 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 30 мл АсСОЕ Її в присутності Ра/С (300 мг) і гідрогенізували протягом З годин при температурі навколишнього середовища і атмосферному тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску.
Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ДХМ та Меон (від 100:1 до 5:1) з одержанням 100 мг (1895) сполуки ЗЕ в формі білої твердої речовини.
Сполуку ЗО (50 мг, 0,08 ммоль, 1,00 екв) і ЗЕ (26,34 мг, 0,12 ммоль, 1,50 екв) розчиняли в З мл ДХМ. Розчин охолоджували до 0 "С, потім додавали по краплях 0,018 мл ОЕРС і 0,0392 мл
ОІЕА. Реакційну суміш перемішували при 0 "С протягом 2 годин, потім при температурі навколишнього середовища протягом ночі. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску, і залишок (70 мг) очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 ЗНІМАО2И, колонка
З,ипРїіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода/"АСМ, забуферена 0,05 до ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Умаїег5 2545, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сполуку З було одержано при виході 2795 (20 мг) у формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Азсепіїз Ехрге55 С18, 2,7 мкм, 4,6 х 100 мм; 40 "С; 1,5 мл / хв, від 10 95 до 95 95 АСМ в воді (0,0595 ТФО) протягом 8 хв; ІЕР (СалвН72МеОзв, точна маса 836,5) т/7: 837,5 (МНУ) ї 419,4 (М.2НУ2 (10095)), 7,04 хв (90,090, 210 нм)
ІН ЯМР (400 МГц, СОзОб, ррт): б (присутність ротамерів) 8.76 - 8.74 (т, 2Н); 8.53 - 8.48 (т, 0.4Н, МНСО неповний обмін); 8.29 - 8.15 (т, 0.8Н, МНСО неповний обмін); 8.01 (5, 2Н), 7.31 - 7.22 (т, 5Н), 4.88 - 4.68 (т, ЗН); 4.31 - 4.07 (т, 2Н); 3.94 - 2.90 (т, 18Н); 2.55 - 0.86 (т, З8Н).
Еталонна сполука 4 (5)---(28,38)-3-4((5)-1-((38,45,55)-4-4((5)-М,3-диметил-2-((5)-3-метил-2- (метил(піридин-4-ілметил)аміно)бутанамідо)бутанамідо)-3-метокси-о- метилгептаноїл)піролідин--2-іл)-3--метокси-2-метилпропанамідо)-3-фенілпропанова кислота, трифтороцтова кислота
ОО; : пи д. М що в з шо ви ча мя А Ко й- ве ой ра шт о 4 хи мн дхм у
Ох у е-Я
Сполуку З (100 мг, 0,11 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в суміші води (5 мл), АСМ (5 мл) і піперидину (2,5 мл). Реакційну суміш залишали при перемішуванні на ніч, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІС-001 ЗНІМА02И, колонка ЗипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода/АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ в протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 100965 АСМ протягом 2 хвилин; Умаїег5 2545, детектор УФ при 254 нм і 220 нм).
РХ/МС/УФ (колонка Азсепії5 Ехрге55 С18, 2,7 мкм, 4,6 х 100 мм; 40 "С; 1,5 мл / хв, від 1095 до 9595 АСМ в воді (0,0595 ТФО) протягом 8 хвилин; ІЕР (Са5НооМеОв, точна маса 822,5) ту/: 823,5 (МНУ) ії 412,4 (М.2НУ/2, 10095), 6,84 хв (89,1905, 210 нм).
І"Н ЯМР (400 МГц, СОзО0, рріт): б (присутність ротамерів) 8.79 - 8.78 (т, 2Н); 8.09 (т, 2Н); 7.30 - 7.21 (т, 5Н); 4.80 - 4.80 (т, 1Н), 4.36 - 0.87 (т, 58Н).
Еталонна сполука 6 метил (5)-2-(28,38)-3-4((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2-(5)---((3-амінопропіл) (метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,3-диметилбутанамідо)-3-метокси-о- метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3--метокси-2-метилпропанамідо)-3- фенілпропаноат, біс- трифтороцтова кислота вач меш ка днях и що; п хи З ї х и т я м щі й де ! З жк ! 0 г. нн
ІФ А то й ге І
МАМ о і Бе ес и
ОЗ.
Сполука бА: метил (25)-2-((28)-2-І((8)-(25)-1-((38,45,55)-4-(25)-2-(25)-2-і(3-І(трет- бутокси)карбоніл|іаміно|Іпропіл)ууметил)аміно|-3-метилбутанамідо|-М,3-диметилбутанамідо|-3- метокси-5-метилгептаноїл|піролідин-2-ілІ(метокси)метилі пропанамідо|-3-фенілпропаноат 5 вк 7 че й зх ке З них п вною Ве Еш зр ве ши и ша ди сн дет Я и ин и ше. ї ще вн ї- ККРАКЦИЯ ДАМ х сен й з
ЕСжо ж Ви
Сполуку 30 (157,5 мг, 0,25 ммоль, 1,00 екв) розчиняли при 0 "С в інертній атмосфері в З мл
ДХМ в присутності карбонової кислоти 17 Е (78,7 мг, 0,27 ммоль, 1,10 екв), ОЕРС (46 мкл) і ОІЕА (124 мкл). Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при низькій температурі, а потім охолоджуючу баню видаляли, і перемішування продовжували протягом 4 годин. Потім її концентрували при зниженому тиску з одержанням 200 мг сполуки бА в формі неочищеного жовтого масла. Суміш використовували в такому вигляді в наступній стадії.
Сполуку бА (200 мг, 0,22 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері при 0 "С вв 2 мл
ДХМ. Додавали по краплях ТФО (1 мл), і охолоджуючу баню видаляли. Реакційну суміш перемішували 1 годину при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 5БНІМА02, колонка
З,пРїге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода/"АСМ, забуферена 0,05925
ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ в протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; УмМаїег5 2489, детектор УФ при 254 нм і 220 нм) з одержанням 60 мг (265965, вихід за 2 стадії) сполуки 6 в формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка 2ограх Есіїрзе Ріиз С8, 3,5 мкм, 4,6 х 150 мм; 1 мл / хв, 40 "С; від ЗО до 8095 метанолу в воді (0,1 95 НзРОз) протягом 18 хвилин; ІЕР (СазН7«МеОзв, точна маса 802,56) т/2: 804 (МНУ); 11,50 хв (91,595, 210 нм). "Н ЯМР (ЗО00МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 8.52 (0, 0.ЗН, МНСО неповний обмін); 8.25 (й, 0.5Н, МНСО неповний обмін); 7.30-7.22 (т, 5Н); 4.9-4.6 (т, ЗН); 4.2-4.0 (т, 1Н); 4.0-0.86 (т, 61Н).
Еталонна сполука 7 (5)-2-(28,38)-3-((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2-(5)-2-((3-амінопропіл) (метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,3-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл) піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропанамідо)-3-фенілпропанова кислота, біс-трифтороцтова кислота т н о ту - Що; г. пад ум по а Я и ше м и М Ве Я:
БА ВО я б он
Сполуку 6 (70 мг, 0,08 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в суміші води (5 мл), АСМ (2,5 мл) і піперидин (5 мл). Реакційну суміш залишали при перемішуванні на ніч при температурі навколишнього середовища, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 ЗНІМАЮБ2И, колонка З!йпРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095
АСМ в протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Умаїег5 2489, детектор УФ при 254 нм і 220 нм) з одержанням 14,6 мг (2195) сполуки 7 в формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Азсепіїз Ехрге55 С18, 2,7 мкм, 4,6 х 100 мм; 1,5 мл / хв, 40 "С; від 0 до 8095 метанолу в воді (0,0595 ТФО) протягом 8 хвилин; ІЕР (Са2Но2МеОв, точна маса 788,54) ті/з: 790 (МНУ),, 5,71 хв (96,8395, 210 нм).
І"Н ЯМР (300 МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 8.42 (а, 0.ЗН, МНСО неповний обмін); 8.15 (й, 0.2Н, МНСО неповний обмін); 7.31-7.21 (т, 5Н); 4.9--4.6 (т, ЗН); 4.25-4.0 (т, 1Н); 4.0-0.86 (т, 59Н).
Сполука 11 (5)-М-((38,45,55)-3-метокси-1-((5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((5)-2- феніл-1-(тіазол-2-іл)етил)аміно)пропіл)піролідин--1-іл)-5-метил-1-оксогептан-4-іл)-М,3- диметил-2-((5)-3-метил-2-(метил(4-(метиламіно)фенетил)аміно) бутанамідо)бутанамід, трифтороцтова кислота
В ек ям те дет З шт, сн шаичишщшцшо;
КИ Зм м ща з тр Я Що
АВ вини тео у ши ще щен
Б ї
Вей
КО Ху бе й В зн
Шк
Сполука 114А: трет-бутил-М-І4-(2-гідроксіетилуфенілікарбамат
НУ осо ше Є, в щі в митр Те шви
Ди-трет-бутилдикарбонат (16,7 г, 77 ммоль, 1,05 екв) додавали до розчину 2-(4- амінофеніл)етанолу (10 г, 72,9 ммоль, 1 екв) в ТГФ (200 мл), і реакційну суміш перемішували протягом ночі при температурі навколишнього середовища. Суміш розбавляли ЕЮАс (200 мл), промивали водою (200 мл), потім НСІ 1М (100 мл), потім насиченим водним розчином МанСОз (100 мл), потім соляним розчином (100 мл). Органічну фазу висушували над Мод5О5», потім випарювали до сухого стану при зниженому тиску. Неочищений продукт двічі розтирали з гептаном (150 мл) і висушували у вакуумі з одержанням сполуки 11А у вигляді білої твердої речовини (14,7 г, 84905).
Сполука 118: трет-бутил-М-І4-(2-оксоетил)феніл|карбамат н й ще М і Гм юне і
І оре и "зон Дом в т
Сполуку 11А (2,5 г, 10,5 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 25 мл ДХМ, потім охолоджували до - 7870. Додавали по краплях розчин періодинану Десса-Мартіна (ОМР, 6,71 г, 15,8 ммоль, 1,5 екв) в ДХМ (10 мл) Охолоджуючу баню видаляли, і перемішування продовжували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш нейтралізували 60 мл суміші 50/50 насиченого водного розчину бікарбонату натрію і насиченого водного розчину
Маг52Оз3. Одержаний в результаті розчин екстрагували З рази 30 мл ЕАс. Органічні фази об'єднували, двічі промивали насиченим водним розчином Масі, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали на силікагелі (ЕАС/РЕ 1/15) з ожержанням 1,0 г (4095) сполуки 11В в формі блідо-жовтої твердої речовини.
Сполука 11с: бензил-(25)-2-(Ц(2-(А-І|(Ктрет-бутокси)карбоніл|аміно|феніл) етил|(метил)аміно|-3-метилбутаноат во щи
Н т |! х3 їх / й ж докт ник ше Ши и ит и т
З ЕР тхЕА МаВНОАС ЕЕ 5
Сполуку 176 (3,5 г, 13,6 ммоль, 1,1 екв) розчиняли в ТГФф (30 мл) в присутності ОІЕА (6,4 г, 49,7 ммоль, 4,0 екв), альдегіду 118 (2,9 г, 12,3 ммоль, 1,0 екв) і триацетоксиборгідриду натрію (5,23 г, 49,7 ммоль, 2,0 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, потім нейтралізували 60 мл насиченого розчину бікарбонату натрію. Одержаний в результаті розчин екстрагували З рази 30 мл Е(ОАс. Органічні фази об'єднували, двічі промивали насиченим водним розчином МасСі, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали на силікагелі (ЕФАС/РЕ 1:20) з одержанням 3,7 г (6895) сполуки 11С в формі жовтого масла.
Сполука 110: (25)-2-((2-(4-(Ктрет-бутокси)карбоніліаміно|феніл)етил| (метил)аміно|-3- метилбутанова кислота
М М
Вос па в ді Но ра/с бос С Ів о -- он он
Її меон Її ів; о
Сполуку 11С (2 г, 4,5 ммоль, 1 екв) розчиняли в 10 мл метанолу в присутності Ра/сС (2 г) і гідрогенізували протягом 2 годин при звичайній температурі і тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 1,2 г (75965) сполуки 110 в формі жовтого масла.
Сполука 11Е: (25)-2--І(2-(А-ІКтрет-бутокси)карбоніл|(метил)аміно|феніл)етилІ|(метил)аміно|-
З-метилбутанова кислота
ЕК м век ШК й ях
Во г ї ї Мей Де ее" ва т р а НО КО: Пани А не ах и ти тм й М вн х Як се М зл СО о ше
Сполуку 110 (1,2 г, 3,4 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в інертній атмосфері в ТГФ (20 мл).
Реакційну суміш охолоджувалі в крижаній бані, після чого додавали порціями Ман (60595 в маслі, 549 мг, 13,7 ммоль, 4,0 екв) з подальшим додаванням йодметану (4,9 г, 34 ммоль, 10 екв).
Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, потім нейтралізували водою і промивали 100 мл ЕАс. рН водного розчину доводили до 6-7 1 н. розчином НСІ. Водний розчин екстрагували З рази 100 мл Е(ОАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з одержанням 800 мг (6495) сполуки 11Е в формі жовтої твердої речовини.
Сполука 11Е: // трет-бутил-М-4І4-(2-(К15)-1-4((15)-1-((38,45,55)-3-метокси-1-(25)-2- (1А,28)-1-метокси-2-метил-2-Ї(15)-2-феніл-1-(1,3-тіазол--2-іл)уетилікарбамоїл|етил |Іпіролідин-1-іл|-2-метил-1-оксогептан-4-іл)"метил)карбамоїл|-2--метилпропілікарбамоїл|-2- метилпропіл|(метил)аміної| етил/феніл|-М-метилкарбамат г де ях ; ; ц й пев; ! Бест Ср 00 Вот й с Ма я В ще жк вет поети ях пеРСТВЕАЧТК ше сей (0 РолЕАДХМ ну
Сполуку 11Е було одержано аналогічно сполуці бА з аміну 1МУ (150 мг, 0,22 ммоль, 1,2 екв) і кислоти 11Е (70 мг, 0,19 ммоль, 1,0 екв). Після очищення на силікагелі (Е(ФАС/РЕ 11) одержали 100 мг (5295) бажаного продукту в формі блідо-жовтої твердої речовини.
Сполуку 11 було одержано так само, як і сполуку 1, з проміжної сполуки 11Е (100 мг, 0,1 ммоль). Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 5БНІМА0Б2И, колонка ЗипРїге
Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ в протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Уаїег5 2489, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сподуку 11 було одержано при виході 3995 (39,7 мг) у формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Есіїрзхе Ріи5 С8, 3,5 мкм, 4,6 х 150 мм; 1 мл / хв, 40 "С; від 50 до 9595 метанолу в воді (0,0595 ТФО) протягом 18 хвилин); ІЕР (С5оН/7М7Ов65, точна маса 903,57) т/л: 904,5 (МНУ), 7,53 хв (93,6895, 254 нм).
І"Н ЯМР (300 МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 8.84 (а, 0.5Н, МНСО неповний обмін); 8.7-8.5 (т, 0.9Н, МНСО неповний обмін); 7.76-7.73 (т, 1Н); 7.55 - 7.4 (т, 1Н); 7.28-7.22 (т, 7Н); 7.08-7.05 (т, 2Н); 5.51-5.72 (т, 1Н); 4.9--4.80 (т, 2Н); 4.3-0.7 (т, 6ОН).
Сполука 12 метил-(5)-2-(28,3Н8)-3-4((5)-1-((38,45,55)-4-4((5)-М,3-диметил-2-((5)-3-метил-2- (метил(4-«(метиламіно)фенетил)аміно)бутанамідо)бутанамідо)-3-метокси-5-- метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3--метокси-2-метилпропанамідо)-3- фенілпропаноат, трифтороцтова кислота «он, во "у виш
І : о «Х, вх т ре м беру - 7 ше ши НН єї р на й о, ой ми о-.
Так само, як і для кінцевих фаз синтезу сполуки 1, сполуку 12 було одержано за дві стадії з аміну 30 (118 мг, 0,19 ммоль) і кислоти 11Е (82 мг, 0,22 ммоль). Кінцевий залишок очищали препаративною ВЕРХ (Ргє-НРІ С-001 5НІМАЮБ2И, колонка 5!йпРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095
АСМ протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; У/аїег5 2489, детектор
Уф при 254 нм і 220 нм). Сполуку 12 було одержано при виході 795 (13,7 мг) у формі білогої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Есіїрзхе Ріи5 С8, 3,5 мкм, 4,6 х 150 мм; 1 мл / хв, 40 "С; від 40 до 9595 метанолу в воді (0,0595 ТФО) протягом 18 хвилин); ІЕР (СлеН7вМєОв, точна маса 878,59) ті/л: 879,7 (МНУ), 10,07 хв (90,6965, 254 нм).
І"Н ЯМР (300 МГц, СОзО0, рріт): б (присутність ротамерів) 7.40 (зе, 2Н); 7.38-7.22 (т, 7Н); 4.95-4.7 (т, ЗН); 4.2-4.0 (т, 1Н); 3.9-0.86 (т, 62Н).
Сполука 13 (5)---(28,38)-3-4((5)-1-((38,45,55)-4-4((5)-М,3-диметил-2-((5)-3-метил-2-(метил(4- (метиламіно)фенетил)аміно)бутанамідо)бутанамідо)-3-метокси-о-метил гептаноїл)піролідин-- 2-іл)-3-метокси-2-метилпропанамідо)-3-фенілпропанова кислота, трифтороцтова кислота ї сала "а й н о те Ме Га щ о пет ГТ М. АЖ шодо, «М. а пн и и и в
А во иЙчИи
Фо т и дея хееюн Є В їй й Жещ
Ощеб он
Сполуку 13 було одержано так само, як і сполуку 7, із сполуки 12 (100 мг, 0,10 ммоль).
Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 ЗНІМАБ2И, колонка З!йпРїіге Ргер С18
ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 20956 до 4095 АСМ в протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин;
Умаїег5 2489, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сполуку 13 було одержано при виході 2095 (20 мг) у формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Азсепії5 Ехрге55 С18, 2,7 мкм, 4,6 х 100 мм; 1,5 мл / хв, 40 "С; від 10 до 95 95 метанолу в воді (0,0595 ТФО) протягом 8 хвилин; ІЕР (СавіН7єМеОзв, точна маса 864,57) т/л: 865,6 (МНУ), 6,05 хв (90,9 90, 210 нм).
ІН ЯМР: (300 МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 7.32-7.19 (т, 9Н); 4.9--4.65 (т,
ЗН); 4.2-4.0 (т, 1Н); 3.9-0.86 (т, 59Н).
Сполука 14 (5)-2-(5)-2-((3-амінобензил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М-((3А,45,55)-3- метокси-1-((5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-4((5)-2-феніл-1-(тіазол-2- іл)уетил)аміно)пропіл)піролідин--1-іл)-5--метил-1-оксогептан-4-іл)-М,3-диметилбутанамід, трифтороцтова кислота т у о тр щу нм им шу М -- я щу вки М т ще нини ще Ши НЕ а щит - е о о М. ди тео ше
Мей З
КА ся хх иЗ де Ще й и
Сполука 144А: трет-бутил (3-«гідроксиметил)феніл)карбамат
Ве в шт ! З ав ве кв | Не Е т й х но ті ше ши ре к --й "вн Як з зи -Й с: і З Є ож і б З а зи : . и 5 т -й іже (3-Амінофеніл)метанол (З г, 24,36 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в ТГФ (60 мл), після чого додавали ди-трет-бутилдикарбонат (6,38 г, 29,23 ммоль, 1,20 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, а потім реакційну суміш розбавляли додаванням 200 мл води. Продукт екстрагували З рази 100 мл АсСОБЕЇїЇ, а потім органічні фази повторно об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням неочищеного продукту (13,85 г сполуки 14А) в формі жовтого масла.
Сполука 148: трет-бутил(3-формілфеніл)карбамат г Мо; С
Во. т р о: ИН Вос. ше я -в
Н ХЕ н
Сполуку 14А (13,8 г, 61,81 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в ДХЕ (400 мл), а потім додавали
Мпо» (54 г, 621,14 ммоль, 10,05 екв). Суміш залишали при перемішуванні при температурі навколишнього середовища на З дні, після чого тверді речовини видаляли фільтруванням.
Фільтрат випарювали до сухого стану, і залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю
ЕОАс і РЕ (1:30) з одержанням З г (2295) сполуки 14В в формі білої твердої речовини.
Сполука 14С: бензил (5)-2-((3-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)бензил) (метил)аміно)--3- метилбутаноат йо ж ке о С
В М шк ши З о шк
Воє нн ше пана В 7 й п т те ой а
В ТИФ ООІБА Мав сі о
Сполуку 148 (1 г, 4,52 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 20 мл ТГФ в присутності сполуки 176 (1,16 г, 4,50 ммоль, 1,00 екв), ОІЕА (З мл) і Мавн(ОАдс): (1,92 г, 9,06 ммоль, 2,01 екв). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, а потім нейтралізували 100 мл води і екстрагували З рази 50 мл АсОкї. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували. Залишок очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕАс і РЕ (1:50) з одержанням 1,9г (9995) сполуки 14С в формі білої твердої речовини.
Сполука 140: (5)---(3-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)бензил)(метил)аміно)--3-- метилбутанова кислота
Н
Вос" м спдотдаюо Вос М
ЕЮАсС/МеОНнН
Ге) (в)
Сполуку 14С (1 г, 2,34 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в 30 мл АсСОБКЕЇї і 4 мл метанолу в присутності Ра/С (400 мг) і гідрогенізували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища і атмосферному тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 680 мг (8695) сполуки 140 в формі білої твердої речовини.
Сполука 14ЄЕ: трет-бутил (3-((35,65,95,108)-9-((5)-втор-бутил)-3,6-діїзопропіл-10-(2- зо (5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2-іл)етил) аміно)пропіл)піролідин--1-іл)-2-оксоетил)-2,8-диметил--4,7-діоксо-11-окса-2,5,8- триазадодецил)феніл)карбамат о во;
КТ хи
КУТ, : є Фев | «а І що у со це вчи ц з з ше она
Ме в с У ща «Ккотщииятя в: не в
З її с з я УК УК У УК УК ня оо хлеб Ж - у се ПЕРСОБАДХМ ї дня ов я
Сполуку 14Е синтезували таким же чином, як для сполуки 3, з аміну 1М (100 мг, 0,15 моль, 1,00 екв), кислоти 140 (102,27 мг, 0,30 ммоль, 2,00 екв), ОЕРС (0,053 мл) і ОІЕА (0,046 мл) в
ДХМ (3 мл). Неочищений продукт (80 г) очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕАс і РЕ (17) з одержанням 100 мг (6795) сполуки 14Е в формі блідо-жовтого масла.
Сполуку 14 синтезували таким же чином, як сполуку 2, з проміжної сполуки 14Е (100 мг, 0,10 ммоль, 1,00 екв). Неочищений продукт (80 мг) очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С--001
ЗНІМАО2), колонка З!ипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода /
АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Умаїег5 2545, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сполуку 14 було одержано при виході 1095 (10 мг) в формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Есіїрзе ріи5 С8, 3,5 мкм, 4,6 х 150 мм; 40 "С; 1,0 мл / хв, від 4095 до 9590
Меон в воді (0,0595 ТФО) протягом 18 хвилин); ІЕР. (СавН7зМ?7О65, точна маса 875,5) т/7: 876,5 (МНУ) і 438,9 (М.2Н-/2, 10095), 11,35 хв (95,695, 210 нм).
І"Н ЯМР (400МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 8.92 - 8.86 (т, 0.4Н, МН неповний обмін); 8.70 - 8.54 (т, 0.6Н, МН неповний обмін); 7.88 - 7.78 (т, 1Н); 7.60 - 7.50 (т, 1Н); 7.45 - 6.97 (т, 9Н); 5.80 - 5.65 (т, 1Н); 4.85 - 4.70 (т, 1Н); 4.40 - 0.80 (т, 56Н).
Сполука 15 метил (5)-2-(28,38)-3-((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2-(5)-2-((3-амінобензил) (метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,3-диметилбутанамідо)-3-метокси-о- метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3--метокси-2-метилпропанамідо)-3- фенілпропаноат, трифтороцтова кислота кри З . ав ше, ! ні ту і но ша ма: ї М в ц М шк т М -
За В. ! й шт ! о о є и
Ян Ох ї мед: ня
М лечни Є тео Я щи и дн Й о
Сполука 15А: метил-(5)-2-(28,38)-3-4((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2-(5)--2-(3-(трет- бутоксикарбоніл)аміно)бензил) (метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,3-диметилбутанамідо)-3- метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3--метокси-2-метилпропанамідо)-3- фенілпропаносат
МЕ сне ре диких х Фо р. в зі й е ; ех я
М М шо ж о печити АЛ кВ МВ одну тт ше и АВ ще ук й НИ шЕРС, ЩЕАЛХМ бно зо ! ! маш
Сполуку 15А синтезували таким же чином, як для сполуки 3, з аміну ЗО (200 мг, 0,32 ммоль, 1,00 екв), кислоти 140 (212,6 мг, 0,63 ммоль, 2,00 екв), ФЕРС (0,1103 мл) і ОІЕА (0,157 мл, 3,00 екв) в ДХМ (5 мл). Неочищений продукт очищали на колонці силікагелю сумішшю ЕЮАс і РЕ (171) з одержанням 200 мг (6790) сполуки 15А у формі жовтої твердої речовини.
Сполука 15: Сполуку 15 синтезували так само, як сполуку 2, з проміжної сполуки 15А (200 мг, 0,21 ммоль, 1,00 екв). Неочищений продукт очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001
ЗНІМАОЮ2, колонка ЗипРїіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода /
АСМ, забуференай 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ протягом 10 хвилин, потім від 4090 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; УМаїег5 2545, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сполуку 15 було одержано при виході 1995 (38,6 мг) у формі білої твердої речовини.
РХ/МС/УФ (колонка Азсепіїв Ехргез55 С18, 2,7 мкм, 4,6 х 100 мм; 40 "С; 1,5 мл / хв, від 10 95 до 95 95 МеОН в воді (0,0595 ТФО) протягом 8 хвилин; ІЕР (С47Н7«МеОзв, точна маса 850,5) т/: 851,5 (МНУ) і 426,4 (М.2Н-/2, 100965), 6,61 хв (91,195, 210 нм).
І"Н ЯМР (400 МГц, СОзО0б, ррт): б (присутність ротамерів) 7.53 - 7.42 (т, 1Н); 7.35 - 7.18 (т, 8Н); 4.88 - 4.79 (т, 2Н); 4.42 - 4.00 (т, ЗН); 3.93 - 2.71 (т, 22Н); 2.61 - 0.81 (т, ЗЗН).
Сполука 20 (5)-2-(5)-2-((4-амінобензил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М-((3А,45,55)-3- метокси-1-4((5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((5)-2-феніл-1-(тіазол-2- іл)уетил)аміно)пропіл)піролідин--1-іл)-5--метил-1-оксогептан-4-іл)-М,3-диметилбутанамід, трифтороцтова кислота
Моя она: ве шк у ошо сут ни з Зм зт а
А й Е д Бе І З З М. й І
Й ой Миша ша с ї тео айв ді в ож х г
Сполуку 20 було одержано так само, як і сполуку 1, з аміну 17 і відповідного альдегіду. 4-Нітробензальдегід, залучений в одержання сполуки 20, придбаний комерційним шляхом.
Синтез сполуки 20 виконували шляхом відновлення нітрогрупи. Синтез проводили в такий спосіб: (25)-М-((38,45,55)-1-(25)-2-(18,28)-2---(15,28)-1-гідрокси-1-фенілпропан-2- іл|карбамоїл|-1-метокси-2-метилетиліпіролідин--1-іл|-3-метокси-о-метил-1-оксогептан--4-іл|-
М,З-диметил-2-((25)-3-метил-2-Іметилі(4-нітрофеніл)метилІаміно|бутанамідо|бутанамід (40 мг, 0,05 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в 15 мл етанолу. Додавали дигідрат хлориду олова (Ії) (317 мг, 14 ммоль, 30 екв), і розчин залишали при перемішуванні на З дні при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш нейтралізували 50 мл води, потім екстрагували З рази 50 мл ЕІОАс. Органічні фази об'єднували, висушували над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням сполуки 20 в неочищеному стані (чистота: 93,290; кількість: 21,6 мг).
Сполуку очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ б-001 ЗНІМАЮ2И, колонка З!йпРїіге Ргер
С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095 АСМ в протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Умасег5 2489 детектор УФ при 254 нм і 220 нм).
ІН ЯМР: (400 МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 7.85--7.80 (т, 1Н); 7.6-7.5 (т, 1Н); 7.4-7.15 (т, 5Н); 7.1-7.05 (т, 2Н); 6.73-6.70 (т, 2Н); 5.8-5.55 (т, 1Н); 5.0-4.7 (т, 2Н); 4.25- 4.05 (т, 1Н); 4.0-0.8 (т, 54Н). РХ/МС/УФ ІЕР: (СавНозіМ7075, точна маса 875,53) т/72 876 (МН), 439 (7595, (М.2НУ/2І; УФ: час утримання (ВТ) дорівнює 4,83 хв (96,895, 254 нм). "Н ЯМР (400
МГц, СОзО0, ррт): б (присутність ротамерів) 7.85-7.80 (т, 1Н); 7.6-7.5 (т, 1Н); 7.4-7.1 (т, 7Н); 6.76-6.72 (т, 2Н); 5.8-5.55 (т, 1Н); 4.9-4.65 (т, 2Н); 4.25-4.05 (т, 1Н); 4.0-0.8 (т, 54Н).
Сполука 29 (5)-2-(28,38)-3-((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2-(5)-2-((3-амінобензил)(метил)аміно)--3-- метилбутанамідо)-М,3-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин--2-іл)-3- метокси-2-метилпропанамідо)-3-фенілпропанова кислота, трифтороцтова кислота дит З , м вх
В Ї їх мМ оз нь Х "М. А. ВІ не «М заерерижт
Я БА ВВ и тво | об ян ння ге мч: нний
Сполуку 15 (100 мг, 0,10 ммоль, 1,00 екв) розчиняли в суміші води (5 мл), АСМ (5 мл) і піперидину (2,5 мл). Реакційну суміш залишали на ніч при перемішуванні при температурі навколишнього середовища, а потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Рге-НРІ С-001 ЗНІМАЮБ2И, колонка З!йпРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; елюююча фаза: суміш вода / АСМ, забуферена 0,0595 ТФО; градієнт від 2095 до 4095
АСМ протягом 10 хвилин, потім від 4095 до 10095 АСМ протягом 2 хвилин; Умаїег5 2545 детектор
УФ при 254 нм і 220 нм).
РХ/МС/УФ (колонка Есіїрзе ріих5 С8, 3,5 мкм, 4,6 х 150 мм; 40 "С; 1,0 мл / хв, від 4095 до 9590
Меон в воді (0,0595 ТФО) протягом 18 хвилин); ІЕР (СалвНо2МеОзв, точна маса 836,54) іт/7: 837,5 (МНУ) їі 419,4 (М.2НУ/2, 10095), 10,61 хв (92,595, 210 нм).
ІН ЯМР: (400 МГц, СОзОб, рріт): б (присутність ротамерів) 7.38 - 7.15 (т, 6Н); 7.00 - 6.99 (т,
ЗН); 4.85 - 4.68 (т, 2Н); 4.37 - 3.38 (т, 11Н); 3.91 - 2.70 (т, 8Н); 2.60 - 0.82 (т, ЗБН).
Сполука 61 (5)-2-((5)-2-(4-амінофенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М-(38,45,55)-3-метокси-1- (5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2- іл)етил)аміно)пропіл)піролідин- 1-іл)-о-метил-1-оксогептан-4-іл)-М,З-диметилбутанамід
М М гро б А о. о ра - 9 б МН
Ме ув
Сполука 61А: Дигідрохлорид М-(4-амінофенетил)-М-метил-і -валіну
ВоснМ НМ пе он --к 2Ної по он
М М
Сполуку 110 (962 мг, 2,75 ммоль) розчиняли в 10 мл наявного в продажу розчину НОСІ в пропан-2-олі (5 - 6 М) і перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин. Аналіз ТШХ показав повне витрачання вихідної речовини. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і одержану в результаті жовту тверду речовину розтирали з Е2БО (2 х 10 мл). Продукт висушували у вакуумі з одержанням сполуки 61А у вигляді жовтої твердої речовини (322 мг, 47).
Сполука 61: Карбонову кислоту 61А (73 мг, 0,23 ммоль, 1 екв) і амін 1У (150 мг, 0,23 ммоль, 1 екв) розчінялі в сухому ДМФ (2 мл). Додавали ОІЕА (158 мкл, 0,90 ммоль, 4 екв) і ОЕСР (також званий ОЕРС) (51 мкл, 0,34 ммоль, 1,5 екв), і реакційну суміш перемішували протягом 4 годин при кімнатній температурі. Аналіз за допомогою РХ-МС показав повне витрачання вихідної речовини. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали флеш- хроматографією на силікагелі (ДХМ/МеоН) з одержанням сполуки 61 у вигляді світло-жовтої твердої речовини (83 мг, 40960). "Н ЯМР: (500 МГц, ДМСО-сав, ррт): б (присутність ротамерів), 8.86 (а, 0.5Н, МНСО); 8.65 (й, 0.5Н, МНСО), 8.11-8.05 (т, 1Н, МНСО), 7.80 (а, 0.5Н, тіазол), 7.78 (а, 0.5Н, тіазол), 7.65 (й, 0.5Н, тіазол), 7.63 (а, 0.5Н, тіазол), 7.32 - 7.12 (т, 5Н), 6.83 (й, У дорівнює 8.3 Гц, 2Н), 6.45 (а, 9 дорівнює 8.3 Гц, 2Н), 5.56 - 5.49 (т, 0.5 Н), 5.42 - 5.35 (т, 0.5Н), 4.78 (5, 2Н, МН»), 4.74 - 4.46 (т, 2Н), 4.01 - 0.66 (т, 57Н).
ВЕРХ (Хбгідде ЗпієЇа С18, 3,5 мкм, 4,6 х 50 мм; 3,5 мл/хв, 40 "С, від 0 до 9595 Месм в воді (0,195 ТФО) в 2,25 хвилин, потім 9595 МесМ протягом 0,5 хвилин, Тг складає 1,31 хв (96,5965, 220
НМ). т/2 (0О-ТОЕ ІЕР») 890,5558 (295, МН", СлеНувМ7Ово потрібно 890,5572), 445,7834 (10095, (МНег)2х, СлеН7М7О65 потрібно 445,7823).
Сполука 62
Метил-(28,3А)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-(5)-2-(4-амінофенетил)(метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінат шеф Н (в) м а М
Ї о А ! о.о0о о
М оїтмн () о-
Сполуку 62 було одержано так само, як і сполуку 61, з використанням карбонової кислоти 61А (69 мг, 0,21 ммоль, 1 екв), аміну ЗО (135 мг, 0,21 ммоль, 1 екв), ОІЕА (75 мкл, 0,43 ммоль, 2 екв) і ОЕСР (49 мкл, 0,32 ммоль, 1,5 екв). Неочищений продукт очищали флеш-хроматографією на силікагелі (ДХМ/МеОнН) з одержанням сполуки 62 у вигляді жовтуватої твердої речовини (82 мг, 4590).
ІН ЯМР: (500 МГц, ДМСО-ав, рріт): б (присутність ротамерів), 8.50 (й, У дорівнює 8.3, 0.5Н,
МНОО); 8.27 (д, У дорівнює 8.0, 0.5Н, МНСО), 8.15-8.04 (т, 1Н, МНСО), 7.27 - 7.13 (т, 5Н), 6.86 - 6.79 (т, 2Н), 6.48 - 6.42 (т, 2Н), 4.78 (5, 2Н, МН»), 4.74 - 4.44 (т, ЗН), 4.01 - 3.72 (т, 1.5Н), 3.66 (5, 1.5Н, СО2Ме), 3.63 (5, 1.5Н, СО2гМе), 3.57 - 0.65 (т, 55.5Н).
ВЕРХ (Хбгідде ЗпієЇа С18, 3,5 мкм, 4,6 х 50 мм; 3,5 мл/хв, 40 "С, від 0 до 9595 Месм в воді (0,195 ТФО) протягом 2,25 хвилин, потім 9595 МесСМ протягом 0,5 хвилин, Тг дорівнює 1,29 хв (95,395, 220 нм). т/2 (0-ТОБ ІЕР") 865,5800 (295, МН", СазвН77МеОв потрібно 865,5797), 433,2937 (10095, 15. (МНег)2», СавНувМеОзв потрібно 433,2935).
Сполука 63 (2гв,3А)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-(4-амінофенетил)(метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланіну 2,2,2-трифторацетат
Б Зк й фр К, же х ти ї ї в З ту і х кн в ан лиш ше нин п ш ши: Ши НН с по й о 1 й ше ЩО ба й
Ок
Сполуку 62 (23 мг, 0,03 ммоль) розчиняли в суміші води (1 мл) і ацетонітрилу (1 мл).
Додавали піперидин (0,75 мл), і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 5 годин. Аналіз ТШХ показав повне витрачання вихідної речовини. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали препаративною ВЕРХ (колонка З!йипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 150 мм; рухома фаза: вода/Месм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 2095 до 40905
МесмМ протягом 10 хвилин, потім від 40956 до 10095 МесСмМ протягом 2 хвилин; УМаїег5 2545, детектор УФ при 254 нм і 220 нм). Сполуку 63 було одержано у вигляді білої твердої речовини (14 мг, 6690).
ІН ЯМР: (500 МГц, ДМСО-ав, ррт): б (присутність ротамерів), 12.7 (5(Бг), ТН, СОН), 9.58 (т(бг), 1Н); 9.04 - 8.89 (т, 1Н), 8.41 (а, 0.6Н, МНСО), 8.15 (а, 0.4Н, МНСО), 7.27 - 7.13 (т, 5Н), 7.13 - 6.99 (т(рі), 2Н), 6.90 - 6.64 (5(рі), 2Н), 4.77 - 3.40 (т, 10Н), 3.34 - 2.75 (т, 2ОН), 2.34 - 1.94 (т, 4Н), 1.90 - 0.7 (т, 25Н).
ВЕРХ (Хбгідде ЗпієЇа С18, 3,5 мкм, 4,6 х 50 мм; 3,5 мл/хв, 40 "С, від 0 до 9595 Месм в воді (0,195 ТФО) протягом 2,25 хвилин, потім 9595 МесМм протягом 0,5 хвилин, Тг дорівнює 1,24 хв (10095, 220 нм). т/2 (0О-ТОЕ ІЕР") 851,5641 (боб, МН", С47Н75МеОв потрібно 851,5641), 426,2854 (10095, (МНг)2», Са7НоєМеОзв потрібно 426,2857).
Приклад 15: Антипроліферативна активність лікарських засобів
Методика:
Культура клітин Клітини А549 (недрібноклітинний рак легені - АТОС СС -185) і МОА-МВ-231 (аденокарцинома молочної залози - АТОС НТВ-26) культивували в мінімальному живильному середовищі Ігла (МЕМ) з 595 фетальною телячою сироваткою (ФСТ) та модифікованому
Дульбекко середовищі Ігла (ОМЕМ) з 1095 ФСТ відповідно. Клітини МСЕ? (дуктальна карцинома молочної залози - АТОС НТВ-22) і клітини 5М-12С (карцинома нирки - АТСС) підтримували в середовищі ЕРМІ1640 (без фенолового червоного для клітин МСЕ7), що містить 1095 ФСТ. У всі середовища додавали фунгізон (1,25 мкг/мл) і пеніцилін-стрептоміцин (100 од./100 мкг/мл).
Клітини культивували в стандартних умовах в інкубаторі при 37 "С, 595 СО» і 9595 атмосферної вологості.
Антипроліферативна активність на 4 лініях пухлинних клітин
Вибрані лікарські засоби досліджували на їх антипроліферативну активність з використанням кількісного визначення проліферації АТРІйе (РегїКіп ЕІтег, МіІПероп зи Умейне,
Франція) на об'ємній панелі з 4 ліній клітин. Клітини висівали в 9б-лункові планшети (103 клітин/лунка для АБ549, 2.103 для МСЕ7, МОА-МВ-231 ії 5М12С) в день 0 при концентрації, що забезпечує збереження клітин в логарифмічній фазі росту протягом 72 годин періоду обробки лікарським засобом. Після 24 год періоду інкубації все клітини інкубували з серійними розведеннями тестованих сполук (11 мкл 1Охрозчину в 195 ДМСО - 6 клітин/умова). Щоб уникнути прилипання сполук до наконечників піпеток наконечники міняли між двома послідовними розведеннями. Потім клітини поміщали в інкубатор при 37 "С, 595 СО». На день 4 життєздатність клітин оцінювали шляхом визначення дози АТФ, що вивільняється життєздатними клітинами. Проводили аналіз числа життєздатних клітин в порівнянні 3 числом клітин, інкубуємих з розчинником. Значення ЕСвхо визначали за допомогою аналізу апроксимації кривої (моделі нелінійної регресії з сігмоїдної кривої доза-відповідь, змінний коефіцієнт нахилу
Хілла), проведеного за допомогою алгоритму, що забезпечується програмою СгарпРай (СгтарпРаад Зоїмаге Іпс., штат Каліфорнія, США).
Результати:
Різні лікарські засоби:
Різні лікарські засоби досліджували з визначенням їх антипроліферативної активності на лінії клітин МОА-МВ-231, слідуючи описаній вище методиці. При вимірюванні активностей отримали значення ЕСзо менше 0,1 мкМ.
У кількох наведених нижче прикладах, вибраних з наведених вище ілюстративних лікарських засобів, показані їх повністю значущі антипроліферативні властивості:
Приклад 12: ЕСво - 5,80х1079 М; Приклад 13: ЕСвхо - 7,95х108 М; Приклад 15: ЕСво - 1,70х10- 10 М; Приклад 27: ЕСво - 1,20х10-79 М.
Різні лінії клітин:
Сполуку 15 досліджували на різних лініях клітин (А549, МОА-МВ-231, МОСЕ-7, ЗМ12С), слідуючи описаній вище методиці. При вимірюванні активностей на всіх досліджених лініях клітин отримали значення ЕСзо менше 0,1 мкМ.
Порівняльні приклади:
Заміщення на фенільному кільці (аміно в порівнянні з карбоксилом) було досліджено в наведених нижче порівняльних прикладах і показало поліпшену антипроліферативну активність лікарських засобів відповідно до винаходу, що містять аміно-замісник. 231
З
12 у Ше м--000/0о- | 1,48х1070| 5,80х1070
НМ УТ О же Сл
З
15 ном ки ль м--800/7Со-000|145х1070|1,70х1070
АЙ о С/
М Структура БАЗ МОА-МВ-
З
Порі Й сл ху паній і кан а м-9../о- | 3,76х109 | 2,29х109 риклад но АЛ о. Су (в)
З
13 куму м-- 000) Сон |2,71х108 7,95х108
АВ о. Су ня і
З
Порі Й й 2 гу орівняльний од М до - й "он 4,03х107 9,75х107 приклад 2 ЕН Ії / но реч О (в)
Приклад 16: Синтез угруповання лікарський засіб-лінкер
Сполука Е-11 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)гексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил(4-(38,45,75,105)-4-((5)-втор-бутил)-7,10-діїзопропіл-3-(2-((5)-2- (18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2-іл/уетил)аміно)пропіл)піролідин- 1- іл)-2-оксоетил)-5,11-диметил-б,9-діоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13- іл)феніл)(метил)карбамату 2,2,2-трифторацетат
Оз ня -ч
З АНА лм ши ши ши ! р й ям, й Іа. в Б «0 ой и ее Че о ше ни ше Б г7 г»
Є За тери 7 ке м ше я
БАК ОВ они квант - м «ї Й ж тФо й
Я с
Сполука Е-11-1: гідрохлорид метил-(5)-2-аміно-5-уреїдопентаноату
Охуимн» бер»
НМ н"/меон Нм - --ь-
ОМ
НьМ он НОМ е о нс 9
Ацетилхлорид (10 мл) додавали по краплях до Мен (120 мл) при 0 "С при перемішуванні.
Через 20 хвилин додавали І -цитрулін (10 г, 57 ммоль, 1,00 екв), і суміш нагрівали зі зворотним холодильником протягом ночі. Розчинник випарювали при зниженому тиску з одержанням 15 г (11695) сполуки Е-11-1 у вигляді білої твердої речовини. Продукт використовували в наступній стадії без додаткового сушіння.
Сполука Е-11-2: метил-(5)-2-((5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5-
уреїдопентаноат о дод МН ко ШІ, Фен; й М воснм. «Ки» є Я
М В З ММ. т й 1 ня х ЗЕ нові, рів, дме ос «КА ув і. ит, Ко;
Сполуку Е-11-1 (13 г, 57,6 ммоль, 1,1 екв) розчиняли в ДМФ (140 мл) при 0 "С в інертній атмосфері. Додавали ОІЕА (30 мл, 173 ммоль, 3,0 екв), гідроксибензотриазол (НОВІ - 10,59 г, 69,1 ммоль, 1,2 екв) і складний ефір гідроксисукцинімід Вос-І -валіну (Вос-МаІ-О5и - 18,1 г, 57,6 ммоль, 1,0 екв). Реакційну суміш перемішували протягом ночі при температурі навколишнього середовища, потім розчинник випарювали при зниженому тиску. Залишок розчінялі в воді (100 мл) і двічі екстрагували ДХМ (150 мл). Органічні фази об'єднували, висушували над Маг5Ох і концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеонН) з одержанням 18,8 г (8495) сполуки Е-11-2 у вигляді білої твердої речовини.
Сполука Б-11-3: (5)-2-(5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанова кислота бра Ох мн» ню НМ
Ммаон (в) -Щ8ШИНИ о вон ск ОоМе меон восНнМ АК он д в Н й о ра о
Сполуку Е-11-2 (18,8 г, 48,4 ммоль, 1 екв) розчиняли в Меон (200 мл) при 0 "С. Додавали розчин Маон 1 М (72 мл, 72 ммоль, 1,5 екв), і суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі. МеОН видаляли при зниженому тиску, і залишковий водний розчин підкислювали НСІ 1 М. Водну фазу випарювали до сухого стану, і залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеОН) з одержанням 18 г (9995) сполуки Е-11-3 у вигляді білої твердої речовини.
Сполука Е-11-4: трет-бутил-((5)-1-(((5)-1-(4-«гідроксиметил)феніл)аміно)-1-оксо-5- уреїдопентан-2-іл)аміно)-3-метил-1-оксобутан-2-ілукарбамат ско МН МОМ дк, Осо ни З С он ко вен М оон ЕЕБО, ваенк. Х р ще еея о МОМ дк, и оди хи
Сполуку Е-11-3 (5 г, 13,4 ммоль, 1 екв) розчиняли в суміші безводного ДХМ (65 мл) і безводного МеонН (35 мл). Додавали (4-амінофеніл)метанол (1,81 г, 14,7 ммоль, 1,1 екв) і М- етоксикарбоніл-2-етокси-1,2-дигідрохінолін (ЕЕЮОО - 6,60 г, 26,7 ммоль, 2 екв), і суміш перемішували в темряві протягом ночі. Розчинники випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеОнН) з одержанням 5,2 г (73965) сполуки Е-11-4 у вигляді білуватої твердої речовини.
Сполука Б-11-5: трет-бутил-((5)-3-метил-1-(((5)-1-((4-(((4- нітрофенокси)карбоніл)окси)метил)феніл)аміно)-1-оксо-5-уреїдопентан-2-іл)аміно)-1-оксобутан- 2-іл)укарбамат ок Оки МНУ
Фея МНЕ ж у З В. 1 Я -й і ЕІ со Нв се рес: НИЙ ОО і щ щ пкт тт тт уя ях ук ха кутя кт ке й як Ї В н
Со 5 НА Кк яКЖЯ я ай кож, во ая вен. 30 Й. я, 0 Ба, ДМ ше
М: Не М Я: в и в ефе я м ші Й Її 5 - сн а хе за я
Сполуку Е-11-4 (1,1 г, 2,29 ммоль, 1 екв) розчиняли в безводному ДМФ (5 мл) при температурі навколишнього середовища в інертній атмосфері. Додавали біс(4- нітрофеніл)карбонат (1,40 г, 4,59 ммоль, 2 екв) з подальшим додаванням ОІЕА (600 мкл, 3,44 ммоль, 1,5 екв.), і одержаний в результаті жовтий розчин перемішували протягом ночі. ДМФ випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеонН) з одержанням 1,27 г (8495) сполуки Е-11-5 у вигляді білуватої твердої речовини.
Сполука Е-11-6: 4-((5)-2-((5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил (4-(38,45,75,105)-4-((5)-втор-бутил)-7,10-діїзопропіл-3-(2-((5)-2- (18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2-іл/уетил)аміно)пропіл)піролідин- 1- іл)-2-оксоетил)-5,11-диметил-б,9-діоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13- іл)феніл)(метил)карбамату 2,2,2-трифторацетат
Хе М
Вк щч ЩІ ії х Я шк пкт в ша 2-х ан км, вим ши т й ци чу ка Я.
Еш о ще Од я ние ни в и ши ку у че ше ще пн НЕ ї З Н Ед - - пе г ї рік
Фа Мооюну, хан ФІ, ї М Ху
Н ! з пе з К | нові ва ДМФ лов
ОК ї 5, х шк х
Моє шу зу
А Ко ий В и М улех хи що буин що сини ново ввоге г шх дет, М зе у зу" х Ек с а я 5 с і ще й йо з м їз і -к тФо ан Є й ий хх о
Карбонат Е-11-5 (114 мг, 0,177 ммоль, 1,2 екв) і анілін 11Е (150 мг, 0,147 ммоль, 1 екв) розчиняли в безводному ДМФ (4 мл). Додавали НОВІ (38 мг, 0,295 ммоль, 2 екв) і ОІЕА (54 мкл, 0,295 ммоль, 2 екв), і суміш перемішували протягом вихідних днів при кімнатній температурі.
ДМФ випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали флеш-хроматографією на силікагелі, елююючи ДХМ. Продукт піддавали переочищенню препаративною ВЕРХ (М/аїетгв бО0ОЕ, колонка З!ипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / мМесм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 Месм в 15 хвилин; Умаїег5 2487, детектор УФ 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-11-6 у вигляді білої твердої речовини (89 мг, 3995).
Сполука БЕ-11:
Ки МН,
КУ мі. я
Їй восНУ | З в
Ж, щ ун и Ми я ах це ще дк ще є Її Ів Іі нї | щу; х шу вну ваше Кк ее ще ї Я ш ї Н і в Ав о Кей я о І У ан ій І і тФО, ДхМ дитя скит 2) 0ІБА, ДМФ ги ни. ї. маша чия і ! ії Ж З ж З к І а ще фе оон лк щ па хи би х ши Ха на З І ке з
А ре ИН вне й не тк т
Бе Зв май в й шк і маш Кі ша и и р тео ши ШИ ви
С.
Сполуку Е-11-6 (21 мг, 0,014 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в ДХМ (0,25 мл) і додавали ТФО (40 мкл). Розчин перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі, після чого аналіз РХ-
МС показав повне витрачання вихідної речовини. Суміш швидко охолоджували (баня з рідким азотом), при цьому одночасно додавали ДМФ (0,5 мл), потім ОІЕА (100 мкл), щоб нейтралізувати ТФО. Потім охолоджуючу баню видаляли і додавали 2,5-діоксопіролідин-1-іл-б- (2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексаноат (4 мг, 0,012 ммоль, 1 екв). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 48 годин, і продукт очищали препаративною ВЕРХ (У/агег5 бО0ОЕ, колонка З!ипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / мМесм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 5 96 до 10095 МесмМ протягом 15 хвилин; УМаїег5 2487 детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е- 11 у вигляді білої твердої речовини (11 мг, 54965). т/2 (О-ТОЕ МС ЕР") 15248282 (295, ММа», СтеНії5МізМаОча5 потрібно 1524,8299), 751,9283 15. (10095, (МН2г)25, СтоНі17М130145 потрібно 751,9276).
Сполука Е-12 метил-(28,3А)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5- дигідро-1Н-пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдо- пентанамідо)бензил)окси)карбоніл)(метил)іаміно)фенетил)(метил) аміно)-3-метилбутанамідо)-
М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2- метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2-трифторацетат
Оуен»
Ще а я 0 оди» Учоих ве кА М 1. Й ее . вед ги р я а - а кбй я пись бе -к рень с 7 Її - ій зе ї К іще а Но; нн ваш ши
М джу ке: й ї я
ТЕА ше нч : себе що вжи дз
Сполука Е-12-1: трет-бутил-((5)-3-метил-1-оксо-1-(((5)-1-оксо-1-((4- ((«(перфторфенокси)карбоніл)окси)метил)феніл)аміно)-5-уреїдопентан-2-іл)аміно)бутан-2- іл)укарбамат в ; з че б, я їх МН
Я ЕТ а че в в й "Ек нн
НА Е Є ї і о и В о х во ; ван І денм. ЯК. її Ж р -
Ванмо ЯК, Х Ж як МЕАДМФ ра І ше пиши шк : й Кй т | б, 33 Дриим ск м ит о І о Кеди М | і і я у де те і
Сполуку Е-11-4 (670 мг, 1,26 ммоль, 1 екв) розчиняли в безводному ДМФ (6 мл) при 0 "С в інертній атмосфері. Додавали біс(перфторфеніл)карбонат (991 мг, 2,51 ммоль, 2 екв) з подальшим додаванням ОІБА (329 мкл, 1,89 ммоль, 1,5 екв), і одержаний в результаті безбарвний розчин перемішували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі ДМФф випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеонН) з одержанням 836 мг (9695) сполуки Е-12-1 у вигляді білуватої твердої речовини.
Сполука Е-12-2: метил-(28,3Н8)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-(((4-((5)-2-(5)-2- (трет-бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл) (метил)аміно)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5- метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату-2,2,2- трифторацетат
ОМ
Нк і рес 7 в итях, ях
Шк ЩА щи НЕ й веН.. ЯК, І: Ж ж АК МА зей а стій я ва 7 КЕ і Х ш і ХЕ і - (І ї ій ЕН Н Ч а лиж, з; о є «у рес ша чн рик Я у. нак
ШЕ тео с абтнно їй ге х шк й р З щих й в
Оки ВН ня. НОВІ, ріБА. ДМФ ! ' 7
Воснм. 55. АХ Ж ж, ще ши ши ! ях й го І а о мий со рень у кий т че Ї ій в Іі че тк, тк (о ри роя гм ; и К щи зи сш щі Є
Н ці п Н в 3 ше ще Че: Ка й ; тФо хна ви й ж
Анілін 12 (165 мг, 0,189 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в ДМФ (5 мл) при 0 "С в інертній атмосфері. Додавали карбонат Е-12-1 (194 мг, 0,282 ммоль, 1,5 екв), НОВІ (51 мг, 0,375 ммоль, 2 екв) і ОІЕА (66 мкл, 0,375 ммоль, 2 екв), і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 8 годин. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали препаративною ВЕРХ (Умаїег5 6О0Е, колонка Зи!ипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / МесМ, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесмМ протягом 15 хвилин; Умаїег5 2487 детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-12-7 у вигляді білої твердої речовини (247 мг, 7790).
Сполука Е-12-3: метил-(28,3Н)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-(((4-((5)-2-(5)-2- аміно-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил)окси) карбоніл)у/метил)аміно)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3- метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату біс(2,2,2-трифторацетат) бо МН,
Ж ж г: за и ! тео її Бе. Х : р Сай . й шк ще Жди ко дин ви тоб я
Са Кк дим. вч Я по та маси 2 ши ше шин ши : , етно їх бо МН, і що ее до
Ше то ке вк. 1 В '
М -е НИ ж т ї чу Й го дних ден кдн КУ й о и ; я рив ння ваша г, 5 ОЗ Хх М як, щи б ак я й З -Е
Ши М ак
І Х дез юВ у і. 27ФО щи
Ос Шо о
Сполуку Е-12-2 (5,6 мг, 4,04 мкмоль, 1,0 екв) розчиняли ТФО (100 мкл). Через 5 хвилин додавали 2 мл води, і суміш ліофілізували протягом ночі з одержанням сполуки Е-12-3 у вигляді білуватої твердої речовини (5,6 мг, 98965).
Сполука Е-12:
ее МНх
В: ел ни жи Вих и аа дет я ек на М КК ше ше Я і є М с -ї
З кн її ооо оцю те щ МОМ вон сх т М. . Ш
Я "ЖК в дм х м пай дяк ше чК й зе М о дя : й м нн ни о п А ком
Мая Мою мл а с й ГУ Фе р
З Заибитери зи ши
А ВВ ж І ши я ів з
ТЕХ ши. ді й й
Сполуку Е-12-3 (5,6 мг, 4 мкмоль, 1,0 екв) розчиняли в ацетонітрилі (0,5 мл) і додавали ОІЕА (5 мкл, 7 екв) з подальшим додаванням 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н- пірол-1-іл)угексаноату (2,5 мг, 8 мкмоль, 2 екв). Суміш перемішували протягом б годин при кімнатній температурі. Після перевірки реакції по РХ-МС додавали 200 мкл води, і одержаний в результаті розчин очищали препаративною ВЕРХ (Умаїег5 60О0Е, колонка ЗйипРїіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / МесМ, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 Месм протягом 15 хвилин; УмМаїег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-12 у вигляді білої твердої речовини (4,6 мг, 709). т/2 (О-ТОЕ МС ЕР") 739,4389 (10095, (МН2г)2», СтвНітв8Мі2Оч6 потрібно 739,4389).
Сполука Б-13 (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н- пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл)(метил)аміно)фенетил)(метил)аміно) -3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланіну 2,2,2-трифторацетат
НУ -й а нн? й и
Ху и КК і ек ще ЧИН: м зи щоки, ше й КО АЖ иКки хи дк от, я хо тк Я зи ще - г з ах Я ! о я ! Б 8 я со Кх
Я ! ії Хей
За Ше ся
Сполука Б-138-1: (28,3)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-(4-((((4-((5)-2-(5)-2-(трет- бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл) (метил)аміно)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-
метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланін
НЯ ше т ій н дос Ше Ж ; тм ет ; дк Кф Мн нн хх і ц а ве ву,
ЕК Саду 7 чи, у зи й р : з в ден й 4 І й й о | ак
НК й ії цен ї іа І І ; Ки о | Вода, Мас, ба й; і . піперидин їе т ! Й оси шк щ хх ий в ;
СУ: ЖЕ: о, киш й сонне о имя ше вечея Й го их, ре,
М ди ей бод й "В т, ет а ше ши ши ши ши,
Хо кох Я т де х КУЩ а ї х щтян ї |: що ри зн
Сполуку Е-12-2 (185 мг, 0,123 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в суміші води (5 мл) і ацетонітрилу (5 мл) при кімнатній температурі. Додавали піперидин (3,67 мл, 300 екв), і суміш перемішували протягом 6 годин при кімнатній температурі. Розчинники випарювали до сухого стану при зниженому тиску, і залишок розтирали з ЕФО (60 мл). Тверду речовину двічі промивали ЕСО (20 мл) і висушували в вакуумі з одержанням сполуки Е-13-1 у вигляді білуватої твердої речовини (175 мг, 95965).
Сполука Е-13-2: ((28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-(4-(((4-((5)-2-((5)-2-аміно-3- метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл)(метил)аміно) фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5- метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланіну біс-(2,2,2- трифторацетат)
І чо й ки ше
М ей я ї коди В ж са й жк о Ше ши о К й а Зник ших, ї НЕ її. ї
ЕЯ ет ври з нн ди синя М. й шини ши ше
НУМО ша З пен чи ач ще дім й Я ї ї яку Зм вЗЙ Х тео сажі се ка і У щен ши : он
МО пек м дк шо т зр ;
Ж в ге шо Ко ЯК, З и Хо й ау ее а ет М чут М. й ни и ИН джний
Й Й Й М х ях
М у й Мк
Ок ми
Сполуку Е-13-1 (175 мг, 0,128 ммоль, 1,0 екв) розчиняли ТФО (200 мкл). Через 5 хвилин додавали воду (1 мл) і ацетонітрил (1 мл), і розчин ліофілізували протягом ночі з одержанням сполуки Е-12-2 у вигляді білуватої твердої речовини (180 мг, 87965).
Сполука Е-13: (28,3Н8)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-(((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо- 2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл)(метил)аміно)фенетил)(метил)аміно) -3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланіну 2,2,2-трифторацетат
Ме
МН іч н м чех М Я М ех ;
КО Му щем о ; ех
Ку с дн жи зе вс | КІ ц 9 рі хх - х ен й т у КЕ: ї т й Ж ее НУ б, 1 бу ЕІ Сак ча ї пом З х : иа ОН ЩЕ
Е а еще а о сх
НМ. - х п я нт. Як ще ве ! сш наве Щі я МН щесМ чи й щи - Н Ше: а і Б; як їх ви Я
З м її Є в
З КУ х ОНИ; шу,
Вк 5 р Й ре Бади ки Мо вчи А я ех о у КО ї || х Я і у
Ка с и и НН в 2 ни и: НН С дн -- тво денні її ї у. обох дай Шк дв
Сполуку Е-13-2 (80 мг, 0,058 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в суміші ацетонітрилу (1,5 мл) і ДМФ (0,4 мл). Додавали ОІБА (50 мкл, 0,289 ммоль, 5 екв) з подальшим додаванням 2,5- діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-ілугексаноату (36 мг, 0,116 ммоль, 2 екв). Суміш перемішували протягом З годин при кімнатній температурі. Після перевірки реакції по РХ-МС розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали препаративною
ВЕРХ (УМаїєтз 6О0Е, колонка б!ипРіге Ргтер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода/Месм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесМ протягом 15 хвилин; У/аїегв5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-13 у вигляді білої твердої речовини (32 мг, 35965). т/2 (0О-ТОЕ МС ІЕР-) 1461,8336 (10095, (М-Н)У, С77Ні13М120ч6 потрібно 1461,8403). т/2 (О-ТОГ
МС ЕР жк) 1463,8565 (295, МНУ, С77Ні15Мі2Оч16 потрібно 1463,8549), 732,4317 (10095, (МНг)2,
С НізвМ2О16 потрібно 7324311).
Сполука Е-15 метил-(28,3А)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((3-((((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5- дигідро-1Н-пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл)аміно)бензил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,3- диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-
І-фенілаланінату 2,2,2-трифторацетат
НА га ше є ;
Я І: Н ! е Я
Хо о | жд 2 їх Ше ях ше и ни шк НН ех лк у ; ї бен їх тео Оу и
Сполука Е-15-1: метил-(28,3Н)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((3-(((4-((5)-2-(5)-2- (трет-бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл) аміно)бензил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5- метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2- трифторацетат нано : в'я - о пе ТУ
ВОМ. сх нь В. я ї і Ї 3 ж і Її Х х ж ї х ІН те І я ЕФ кн М їх ода: А го ех бай з я
Но
Ян щи я ре сен, С де 5 че дае ее Бу Жкд ваша те че М з 7 й з з тк у аа ВА ВВ сні о
Сполуку Е-15-1 було одержано відповідно до такої ж методики, як для сполуки Е-11-6, з використанням карбонату Е-11-5 (28 мг, 0,044 ммоль, 1 екв), аніліну 15 (42 мг, 0,044 ммоль, 1 екв), НОВІ (З мг, 0,022 ммоль, 0,5 екв) і ОІЕА (15 мкл, 0,087 ммоль, 2 екв) в ДМФ (2 мл). Сполуку
Е-15-1 виділили у вигляді твердої речовини (8,2 мг, 13905).
Сполука Е-15-2: метил-(28,3Н)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((3-(((4-((5)-2-(5)-2- аміно-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил)окси)карбоніл)аміно)бензил) (метил) аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2- іл)-З3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату біс(2,2,2-трифторацетат)
В. ни
МН
ВоСНК. и ше І вся Щ а ве в, ше ше щи що Т ПО и щу, - в й Хр тки Ше й З з в и че я ж т ак х ебчжн й І:
СА ! Єву б в А ок, І мк я їх й нь ит ше ши ше шк пт ще Ге у дик дея У по ав ЗИ не «М ка ет о ень де рань с ж і ІЗ р В Її У М ж Її ТЕ х ши ши ш ше ши не
І Кк У С Щ й то У Що в
Те й Вас
Сполуку Е-15-1 (8,2 мг, 5,58 мкмоль, 1,0 екв) розчиняли в ТФО (200 мкл). Через 5 хвилин додавали воду (1 мл), і розчин ліофілізували протягом ночі з одержанням сполуки Е-15-8 у вигляді білої твердої речовини (7,6 мг, 9995).
Сполука Е-15:
ов ще
У о я «ше вч кит, плете ни я в ей сли я р ще ві я ! в я ! КК в Я з й ї он г і
Ї су й т х шо нано Я кожний й їн ОБА оз т в с З їй | і і у її З оби т : месм ще Ко 9-й р о а вся й з ре вх
З щі л - п З Ь Х ТЯ Й се шк 1 х ї Кк; Я я »
Зо, со ших сі а і я о ІН и я
З с ї 5 а : Я ГЗУ і й о ге лк и -В
Сполуку Е-15 було одержано відповідно до такої ж методики, як для сполуки Е-12, з використанням аміну Е-15-2 (7,6 мг, 5,55 мкмоль, 1 екв), 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо- 2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)гексаноату (2 мг, 6,65 мкмоль, 1.2 екв) і ОІЕА (5 мкл, 0,028 ммоль, 5 екв) в ацетонітрилі (0,5 мл). Сполуку Е-15 виділили у вигляді білої твердої речовини (4,2 мг,
АВ). т/2 (9О-ТОЕ МС ЕР") 1471,8169 (295, ММа», СтвНі12М12МабОчвє потрібно 1471,8211), 7254223 (10095, (МН2г)2:, СтвНізаМі12Оч6 потрібно 725,4232), 483,9482 (1095, (МНз)з», СтвНі15М120ч6 потрібно 483,9513).
Сполука Б-13 (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н- пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-М-метил-5- уреїдопентанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3- метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І-фенілаланіну --2,2,2- трифторацетат о сві повне завевмне затнненк зовн почсвнни
Не ший
МВ і Я берил чи ЩО тонн вк чн | а в ше шк щ ам, й і І і. ОА, ше й ле па.
М х
Сполука Б-13-1: бензил-М-(4-«(трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)фенетил)-М-метилз-і - валінат
І ше ман, Ме! восіу
М ОВ 5: (о) Ї о
Сполуку 11С (250 мг, 0,567 ммоль, 1 екв) розчиняли в ТГФ (10 мл) з подальшим додаванням ман (6095 суспензія в мінеральному маслі, 68 мг, 1,702 ммоль, З екв). Суміш перемішували протягом 5 хвилин, потім додавали йодметан (106 мкл, 1,702 ммоль, З екв). Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі, після чого гасили водою і розділяли між ЕЮАс (100 мл) і водою (50 мл). Органічну фазу висушували над Мд5Ох і випарювали до сухого стану з одержанням сполуки Е-13-1 у вигляді жовтого масла (250 мг, 9790), яке використовували без додаткового очищення.
Сполука Е-13-2: бензил-М-метил-М-(4-(метиламіно)фенетил)-І -валінат ше НСИРОН і,
М ОВ Фо5з: (в) Ї о 2 НОЇ
Вос-захищений анілін Е-13-1 (250 мг, 0,550 ммоль, 1 екв) розчиняли в Меон (5 мл) з подальшим додаванням 1 мл наявного в продажу розчину НСІ в "РІОН (5-6 М). Розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин, після чого випарювали до сухого стану при зниженому тиску. Одержане в результаті жовте масло розтирали з ЕСО з одержанням сполуки Е-13-2 у вигляді жовтої твердої речовини (202 мг, 9496).
Сполука Е-13-3: бензил-М-(4-((5)-2-((5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-З-метилбутанамідо)-
М-метил-5-уреїдопентанамідо)фенетил)-М-метил-їі -валінат
ІЗ Б - у мам. 5 С и нн ся НМ. ше їй . о в Ї їй сш ува 9 дв воснн. чук он щі вен чн овоя Ки в. удо; ОБА ДМ АТО ВО шк печу ов
Кислоту Е-11-3 (190 мг, 0,508 ммоль, 1,5 екв) розчиняли в безводному ДМФ (1 мл) з подальшим додаванням ОСІБА (118 мкл, 0,677 ммоль, 2 екв), бензотриазол-і1-іл- окситрипіролідинофосфонію гексафторфосфату (РУВОР - 264 мг, 0,508 ммоль, 1,5 екв) і аніліну
Е-13-2 (120 мг, 0,339 ммоль, 1 екв). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі, ії розчинники випарювали при зниженому тиску. Залишок очищали препаративною ВЕРХ (Умаїег5 600Е, колонка З!ипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода/месм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 Месм в 15 хвилин; Умаїег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-13-3 у вигляді білої твердої речовини (140 мг, 45965).
Сполука | Б-13-4: М-(4-((5)-2-(5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-М- метил-5-уреїдопентанамідо)фенетил)-М-метил-ї -валін нами
НМ. ро
МН лен 1 | НУРИС 2 весну М Х ра (в; ОВп Воснм м ве
М ЕН о ран ІФ) М он
Ї о
Сполуку Е-13-3 (116 мг, 0,163 ммоль, 1 екв) розчиняли в Мен (5 мл) в присутності Ра/С 10965 (30 мг) і гідрогенізували протягом 2 годин при температурі навколишнього середовища і атмосферному тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску з одержанням 110 мг (9995) сполуки Е-13-4 у вигляді бежевої твердої речовини.
Сполука БЕ-13-5: метил-(2А8,3НА)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-(4-((5)-2-(5)-2-(трет- бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-М-метил-5-уреїдопентанамідо)фенетил) (метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-З-метокси-5-метилгептаноїл) піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2-трифторацетат ня. ш ій з де : а в ще ТХ
ВН ЖЖ х ходім я нави б» ща ге) й очи лан шк ї З їз « не ж о і 5 х ОНИ кн . й
ВУВОВ, СК, лМиФ
Нам й вен, т шк з у но зу ку --к кни шо чи вк в. ши ше НН че лк --
Я Шо
Амін ЗО (89 мг, 0,140 ммоль, 1 екв) і кислоту Е-13-4 (145 мг, 0,210 ммоль, 1,5 екв) розчиняли в безводному ДМФ (4 мл) і додавали РУВОР (109 мг, 0,210 ммоль, 1,5 екв) і ОІЕА (73 мкл, 0,420 ммоль, З екв). Суміш перемішували протягом 1 години при кімнатній температурі, і розчинник випарюали. Залишок розділяли між ЕОАс і водою, і органічну фазу висушували над Мд5О5, фільтрували і випарювали при зниженому тиску. Неочищений продукт очищали препаративною
ВЕРХ (УМаїєтє 6О0ОЕ, колонка б!ипРігє Ргтер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода/Месм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесмМ в 15 хвилин; У/аїег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е- 13-5 у вигляді білої твердої речовини (140 мг, 7395).
Сполука Б-13-6: (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-(5)-2-(трет- бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-М-метил-5-уреїдопентанамідо)фенетил)(метил) аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2- іл)у-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланіну 2,2,2-трифторацетат
НМ З а в і г
ВОБНН ебчкря меш Задюй во т ше ше ши ШЕ Її в ту дк, а Зайти зи хоч в йо м
Й о шк Й о о дн овен то ше ен
У » шу Ми х ІЗ
Б ї ау ща і (В. зі й
Е И о Піперидин, вода Месм
Ну М. ше і й 7 «МН ше шЕ
ВОК. не М Д. Може оди гр нн, ро 3 и т зо ча иберу тк пт ши ше ше ше Ши
З ЕВ ве 0 Кк е К й шо -о ба
Х каш:
Де ша
Сполуку Е-13-5 (140 мг, 0,104 ммоль, 1 екв) розчиняли в суміші води (4 мл), ацетонітрилу (4 мл) і піперидину (2 мл) і перемішували при кімнатній температурі протягом 4 годин. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали препаративною ВЕРХ (УМаїєг5 бООЕ, колонка ЗипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода/месМ, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесМ протягом 15 хвилин; У/аїег5 2487 детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-13-6 у вигляді білої твердої речовини (115 мг, 83965).
Сполука Е-13:
НМ. й
МН
- КІ
БМ ютер мети ж я З вв А, хна ЩО що Ї в Па м. рми и й й Ше в т тр й ! о як, | мед о ден що тео Ши гей чн Дн ск о чутФОо, дДхМ вн 21 0БЕА, ДМФ і
З долу
ВО но є м Й ї Е І; кН о щі 4 9; лк ЖЕ
М дети ВА» й й о ри сте, ше о са 15 Ж, Ж. м шки Моди зу й і о жк | 0 а я не - т «х. у та січки кр С х тво и ке дн он
Сполуку Е-13 було одержано відповідно до такої ж методики, як для сполуки Е-11, з використанням Вос-захищеного аміну Е-13-6 (55 мг, 0,041 ммоль, 1,0 екв) в ДХМ (0,5 мл) і ТФО (100 мкл, 30 екв) з подальшим розведенням ДМФ (1 мл), гасінням ОІЕА (320 мкл, 45 екв), потім взаємодією з 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексаноатом (15 мг, 0,049 ммоль, 1,2 екв). Після очищення препаративною ВЕРХ і ліофілізації сполуку Е-13 було одержано у вигляді білої твердої речовини (14 мг, 24965). т/2 (0-ТОЕ МС ЕР; жк) 1314,8067 (295, МН», СвеНіовМі1:Оч14 потрібно 1314,8072), 657,9067 10. (10095, (МН2)2х, СвеНтоеМі1Оч4 потрібно 657,9072).
Сполука Е-61
М-((5)-1-(((5)-1-(4-(38,45,75,105)-4-((5)-втор-бутил)-7,10-Діїзопропіл-3-(2-((5)-2-(18,28)-1- метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2-іл)летил)аміно)пропіл)піролідин-1-іл)-2- оксоетил)-5,11-диметил-б,9-діоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-1 3-ілуфеніл)аміно)-1-оксо-5- уреїдопентан-2-іл)аміно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1- іл)угексанаміду 2,2,2-трифторацетат
НМ щей ге ни ст й і о ше
Я. шен ши ше ж: ше ше ШИЯ мч З ит м щщ ово; 6 о, о ен тФо ан З
Б « ї. х щи ай ч:
Сполука Е-61-1: дигідрохлорид бензил-М-(4-амінофенетил)-М-метил-їі -валінат ше НСИРГОН нм
М ОВ 95: (в) | о 2 НС
Сполуку 11С (1,0 г, 2,27 ммоль, 1 екв) розчиняли в 8 мл наявного в продажу розчину НСІ в
ІРОН (5-6 М). Суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі, після чого випарювали до сухого стану при зниженому тиску. Залишок двічі розтирали з ЕСО (30 мл) і висушували у вакуумі з одержанням сполуки Е-61-1 у вигляді білої твердої речовини (916 мг, 9896).
Сполука Е-61-2: бензил-М-(4-((5)-2-((5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-З-метилбутанамідо)- 5-уреїдопентанамідо)фенетил)-М-метил-їі -валінат
НМ те б ве Кк й й нем че ем з не в МВ ванн нов ШИ ШИ І йони АК Б. ей, Шо У РУБОВ, ЮА. ДМ ей, В а о шк ти, ї «о КАВА їх х -х ТуЄ пк й !
Кислоту Е-11-3 (769 мг, 2,05 ммоль, 1,5 екв) розчиняли в безводному ДМФ (2,5 мл) з подальшим додаванням ОІЕА (957 мкл, 5,48 ммоль, 4 екв) і РУВОР (1,07 г, 2,05 ммоль, 1,5 екв).
Додавали анілін Е-61-1 (566 мг, 1,369 ммоль, 1 екв), і суміш перемішувалі при кімнатній температурі протягом ночі. Розчинники випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеоН) з одержанням 969 мг (10295) сполуки Е-61-2 у вигляді білої твердої речовини.
Сполука Е-61-3: М-(4-((5)-2-((5)-2-(трет-бутоксикарбоніл)аміно)-З-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)фенетил)-М-метил-ї -валін нем нм (Фе)
МН 2 в ці /РО/С воснм. М Нг/Ра о Н р: м ОвВп весну ве
І 6 реч (в) М он
Ї о
Сполуку Е-61-2 (969 мг, 1,28 ммоль, 1 екв) розчиняли в МеонН (20 мл) в присутності Ра/С 1095 (270 мг) і гідрогенізували протягом З годин при температурі навколишнього середовища і атмосферному тиску. Реакційну суміш фільтрували і концентрували при зниженому тиску, і залишок очищали на силікагелі (ДХМ/МеОН/АсонН) з одержанням 520 мг (6795) сполуки Е-61-3 у вигляді білої твердої речовини.
Сполука Е-61-4: трет-бутил-((5)-1-((5)-1-(4-(38,45,75,105)-4-((5)-втор-бутил)-7,10-
Діїзопропіл-3-(2-((5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2- іл)етил)аміно)пропіл)піролідин-1-іл)-2-оксоетил)-5,11-диметил-б,9-діоксо-2-окса-5,8,11- триазатридекан-13-іл)/феніл)аміно)-1-оксо-5-уреїдопентан-2-іл)аміно)-3-метил-1-оксобутан-2- іл)укарбамату 2,2,2-трифторацетат
Наш чи 4 во пи о | ВІ й зенно КИЙ. ше у х Немо. м и мч Н У 9 тут р 0 дк я
В х Ус м У Кай І:
МН й в:
ОЕСР, ЇЇБА ДМФ
Нам й ! й о й й Ї ГБ.
Во ї с Ж ! «Я зд, - дих : пошне я осн Шк М з ВШ ї н З с --х
Її 65 186 й о ОК о З я і - її У та ж ше в НИ то Я баня
Май
Кислоту Е-61-3 (67,5 мг, 0,111 ммоль, 1,5 екв) розчиняли в безводному ДМФ (2 мл) і додавали ОЕСР (17 мкл, 0,111 ммоль, 1,5 екв) і СІЕА (39 мкл, 0,223 ммоль, З екв). Після 5 перемішування протягом 15 хвилин при кімнатній температурі додавали амін 1 (50 мг, 0,074 ммоль, 1 екв), і розчин перемішували протягом ночі. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок очищали препаративною ВЕРХ (У/аїег5 600Е, колонка 5йпРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / МесМ, забуференийа 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесмМ протягом 15 хвилин; У/аїєт5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-61-4 у вигляді білої твердої речовини (28 мг, 2890).
Сполука Б-61-5: (5)-2-((5)-2-аміно-3-метилбутанамідо)-М-(4-(38,45,75,105)-4-((5)-втор- бутил)-7,10-Діїзопропіл-3-(2-((5)-2-(18,28)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((5)-2-феніл-1-(тіазол-2- іл)етил)аміно)пропіл)піролідин-1-іл)-2-оксоетил)-5,11-диметил-б,9-діоксо-2-окса-5,8,11- триазатридекан-13-іл)/феніл)-5-уреїдопентанаміду біс(2,2,2-трифторацетат)
Нам шо «МН
З 4 й
Воснм пі ще ч ост зт т сет б са Шк й ше ше ше | ї є Х п. а о би ше Ши мой в й ге ще - ши ше ин ня
ФО Ц тер Гой Х а М Дай по Шк то зрив
НН. ао І ї ї
Шо я
А
Її ій ї но я ше СИ о пе й н о в п тн З За итчци ес що те дя учи
Ї їх ши ще у и: шию ОО я їх у о Х Мн а Ше х ї. ! от ій | З 2 тФО бо йн
Ме ем ко й м - В
Сполуку Е-61-4 (28 мг, 0,021 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в ТФО (200 мкл). Через 5 хвилин додавали воду (2 мл) і ацетонітрил (0,5 мл), і розчин ліофілізували протягом ночі з одержанням сполуки Е-61-5 у вигляді безбарвного масла (38 мг, 134965).
Сполука Е-61:
нами
МН о н ра (о) М М.А М
Ї о А! о.о я
М ой ттн (в) ів о / в мит тр "М
ПІЕА, Месм ХМ У р (в) (в) нак и
МН
(о) (о) н н іс 5 о ОА. (е) М а М
Ї о А! о0.о б
М дин
Ме ков
Сполуку Е-61-5 (28,3 мг, 0,020 ммоль, 1 екв) розчиняли в ацетонітрилі (0,5 мл) з подальшим додаванням 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексаноату (9 мг, 0,029 мкмоль, 1,4 екв) і ОІЕА (25 мкл, 0,143 ммоль, 7 екв). Суміш перемішували протягом 4,5 годин, після чого аналіз ВЕРХ показав присутність вихідної речовини, але повне витрачання сукциніміду. Тому додавали додаткову кількість 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5- дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексаноату (З мг, 0,01 мкмоль, 0,5 екв), і реакційну суміш перемішувалі протягом 1,5 годин. Аналіз ВЕРХ показав повне витрачання вихідної речовини. Розчинник випарювали до сухого стану, і залишок двічі розтирали з сумішшю ЕАс/ЕБО (80/20) з утворенням сполуки Е-61 у вигляді білуватої твердої речовини (19,4 мг, 70905). т/2 (О-ТОЕ МС ІЕР к) 1361,7725 (295, ММа"», СтоНтовМ1і2МаОч25 потрібно 1361,7666), 670,3961 (10095, (МН2г)2х, СтоНіовМ120325 потрібно 670,3960).
Сполука Е-62: метил-(28,3А)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро- 1Н-пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2-трифторацетат
Шк й
Ми
Го. о й - ї си ж от, Ж ме Ко за ки шо Ка ак ше й ту що вм и т Щ в о ту ех ту ре й ІЗ. дн І с нки рату ння АК, их риби «З. З о ще сер, ши и я тФо отв г и
Сполука Б-62-1: метил-(2А8,3НА)-3-((5)-1-((38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-(4-((5)-2-(5)-2-(трет- бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)фенетил) (метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл) піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2-трифторацетат
Я сна
ВОНО, же 1 й вика вою НИ ето ти о во ше ше ше у ше ши о шо М в і Х вн ях 0. ей же ні За ит я те Щі шо | в. | у й І х шавей
Осі й
ВЕСР, ОКА, ДМФ
Но. ей Я
ВН
ЕК і М се ЕЗ о і щих ча «7 й Боня зн ИЙ им, й й З й ку вх сом: МИ ЧИН НН, Я: я й шу Її Жди ди яю де я х . пдв В бу зд го -
Ї х а і у і) ї ши ще НН че ан щ а
ВЕ МНН ія
ТЯ ли я їто вия
Сполуку Е-62-1 було одержано аналогічно сполуці Е-61-4 з аміну ЗО (100 мг, 0,158 ммоль, 0,9 екв), кислоти Е-61-3 (108 мг, 0,178 ммоль, 1 екв), ОЕСР (41 мкл, 0,267 ммоль, 1,5 екв) і ОІЕА (93 мкл, 0,534 ммоль, З екв) в ДМФ (2 мл). Після очищення препаративною ВЕРХ сполуку Е-62-1 було одержано у вигляді білої твердої речовини (93 мг, 39905).
Сполука БЕ-62-2: метил-(28,3Н)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-((5)-2-аміно-3- метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,3- диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-
І -фенілаланінату біс(2,2,2-трифторацетат)
НМ.
ММ
"ж венно МОХ я кн о с-ще ши з щ7 в'я Ше 4 ва А! во А то ї я ща ія х тФо
ЕК ча і ! ! чи : пай їе ! , "и як Є В. ще че прє в ш- У ой ки | по а вх, и ши ши ще Її в ЩІ; о Се ве в зи Ше щ ве -й ше ше и ни А
І ем о. о а вк
КІ ї й Ще: : я АСТМИ їх 2 то о о.
Ох и нний і
Сполуку Е-62-1 (35 мг, 0,026 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в ТФО (200 мкл). Через 10 хвилин додавали воду (2 мл) і ацетонітрил (0,5 мл), і розчин ліофілізували протягом ночі з одержанням сполуки Е-62-2 у вигляді білої твердої речовини (34 мг, 10595).
Сполука Е-62:
ВАМ -щЩей
ВН
З ща ц
НВ. А Її й веди ба ; ре . ж Еок. бук тв зрив ше зу
Н З х і їй Я ке ж 2. то ож бо нд т дб
ХМ дян рах й Б я че й вес о й М щі Х й т
ПЕА МОМ 5 оз
Н Хата Що данний ! ре У
Но ' ск ен ей вк й нн о т Тх
ЗА В. лк Що а риби п а у жо ле - ше ши ше ше еще Клей Щ тФо танні й ту ТВ ія 5 : іч щ йо Я о
Пе
Амін Е-62-2 (34 мг, 5,55 мкмоль, 1 екв) розчиняли в ацетонітрилі (З мл). Додавали ОІЕА (5 мкл, 0,028 ммоль, 5 екв) і 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1- іл)угексаноат (2 мг, 6,65 мкмоль, 1,2 екв). Аналіз ВЕРХ показав повне витрачання вихідної речовини. Розчинник випарювали до сухого стану, і залишок розтирали з сумішшю ЕЮАсС/ЕСО (80/20). Неочищений продукт очищали препаративною ВЕРХ (М/аїег5 60О0Е, колонка ЗийпеРїге
Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / МесМ, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесМм в 15 хвилин; Умаїег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-62 у вигляді білої твердої речовини (5,5 мг, 13965). т/2 (О-ТОЕ МС ІЕР'к) 1336,7859 (295, ММа", СвеНіо7М11МаОча потрібно 1336,7891), 657,9073 (10095, (МН2г)2», СвеНтоеМі1Оч14 потрібно 657,9072).
Сполука Е-63: (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н- пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланіну 2,2,2-трифторацетат ном о м ге ій в х М г ; й . . й
Аооди дии кни рр Ме ей не ву рн
Же о о ве іо о а М о врик лич А о ще же ше и ме де Шк
І. чу і Бо З дн . то Х де нн З о ко
Ой он
Сполука Е-63-1: (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-(5)-2-(трет- бутоксикарбоніл)аміно)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3- метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3- метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланін
НК. «МН а Я
ВасНК щи ее й н в ж вх ій Ку ЕВ Шо ши не ан в а
Її ва 5 , рив ші Й Той в очна тео Її аевюн її а | Я ска -й жд і о т щ | Піперидив, кода, щесмМ О.
НН. о Е що і щ й і Ос ий Щ я ше о, ж Щ гу . ж ут реа С БО дк М «7 Шк ке ій ви о ;
І у З ; х 1 Кз р ДТ ЖЕ М - ді он
Сполуку Е-62-1 (157 мг, 0,118 ммоль, 1 екв) розчиняли в суміші води (4,5 мл), ацетонітрилу (4,5 мл) і піперидину (3,5 мл) і перемішували при кімнатній температурі протягом 5 годин.
Розчинник випарювали при зниженому тиску, і залишок розтирали з ЕСБО (60 мл). Тверду речовину збирали фільтруванням і двічі промивали ЕСО (10 мл) з утворенням сполуки Е-63-1 у вигляді білуватої твердої речовини (153 мг, 100965).
Сполука Е-63-2: (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-((5)-2-((5)-2-аміно-3- метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,3-
диметилбутанамідо)-3-метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-
І-фенілаланіну біс-2,2,2-трифторацетат с ві вій !
Ше
Васнм Її ! й
УК, ники М де У в й є З ж тк
ЗШ: НИХ Я ШЕ і
Яку о ба да зв сих щи вен ! о шт і о о ей ща і. щу 3 мана то аб її ; і о
М шо дн
Кй ї
МН '
З т і В
НМ. мч г о Не ее ; а нки ші шк ШИ Є ле пи а
Еш ше ше | «І ще. : раз г З се ко, хв, ХУ Кк де М Ж єї усе М «А - я де лк ЕуУ ЖК ва З ті Ба х
І Де і й ї а А Вон х й я ЕФ 3 ря хячнн й з тФо м ме. с й вс о я он
Сполуку Е-63-1 (153 мг, 0,127 ммоль, 1,0 екв) розчиняли в ТФО (200 мкл). Через 10 хвилин додавали воду (2 мл) і ацетонітрил (0,5 мл), і розчин ліофілізували протягом ночі з одержанням сполуки Е-63-2 у вигляді білої твердої речовини (34 мг, 10595).
Сполука Е-63:
НЯ. -
Мн гЗ йо 7 в з х що о ле шк ре ; 0 щі обу ях Ма, а 2твО ше НН ще лк - ; й й х
У Н чай і есе ДВ
Е М ве сля пит - он піша месмо | К 7»
А Фони ; в У
ВК. сш '
Її. ся ни ее мае щей БУ й их у модем Се : у ке шик
Ак й диттж є: вона ит ж ше жд реж М 9 ще пн и и ши ше чн ши Й тео Я ше З
Ї х 6 ви і 5 ди и зн
Амін Е-63-2 (100 мг, 0,082 ммоль, 1 екв) розчиняли в суміші ацетонітрилу (2 мл) і ДМФ (0,5 мл) і додавали 2,5-діоксопіролідин-1-іл-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексаноат (45 мг, 0,147 ммоль, 1,8 екв) і ОІЕА (71 мкл, 0,409 ммоль, 5 екв). Після перемішування при кімнатній температурі протягом 4,5 годин розчинник випарювали при зниженому тиску. Неочищений продукт очищали препаративною ВЕРХ (Умаїег5 60О0Е, колонка З,ипРїіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / МесмМм, забуференийа 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095
МесмМ в 15 хвилин; Умаїег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки Е-63 у вигляді білої твердої речовини (42 мг, 3695). т/2 (О-ТОГ МО ЕР") 1300,7901 (295, МН", СввНіовМіїОї4 потрібно 1300,7915), 650,8990 (10095, (МН2г)2:, СввНіо7М11О:4 потрібно 650,8994).
Сполука (1-12 метил-(28,3НА)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол- 1- іл)-М-метилгексанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3- метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2- трифторацетат а
Ду жи ух я
КА в ові ЇЇ р и сля я у о пт, в А Во ин їй ку т о У де тФо ак. ди в
Сполука С1-12-1: дигідрохлорид бензил-М-(4-амінофенетил)-М-метил-і -валінату і) ау о о (Ф) он сі мот - Дж митр с о «с о о о
В оксалілхлориді (З мл) розчиняли 6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексанову кислоту (200 мг, 0,947 ммоль, 1 екв). Розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 5 годин, після чого випарювали до сухого стану при зниженому тиску. Сполуку (3-12-1 було одержано у вигляді бежевої твердої речовини (217 мг, 10095) і використано в наступній стадії без очищення.
Сполука (1-12: нк , й оби ск М. М" Куди Шк: й і й ди Бе : Й їй б ІЙ ту і аєтнно її я й
Шк тя о У ря дит реа ее . я Й ще 1 прівА, ДФ ев а з
Га у; же о й я 2. дк че дж ван Що стук ше Зо хд, тру й зе и ту ше й й
І га я в | 0 Її і ще .
Я х Я З тФо Я и
Ой ке
Анілін 12 (40 мг, 0,045 ммоль, 1 екв) розчиняли в безводному ДХМ (1 мл) при 0" і додавали ОІЕА (8 мкл, 0,045 ммоль, 1 екв). Після перемішування протягом 30 хвилин вводили розчин сполуки 0-12-1 (10 мг, 0,45 ммоль, 1 екв) в безводному ДХМ (1 мл), і реакційну суміш перемішувалі протягом 1 години при 0 "С. Суміш розбавляли ДХМ (25 мл) і двічі промивали водою (20 мл), один раз соляним розчином (10 мл). Органічну фазу висушували над Маг5Ох», фільтрували і випарювали при зниженому тиску з одержанням неочищеного продукту у вигляді світло-коричневої твердої речовини (54 мг). Цей продукт очищали флеш-хроматографією на силікагелі (ДХМ/МеоОнН), а потім препаративною ВЕРХ (М/агег5 60О0Е, колонка Зи!ипРїіге Ргер С18
ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / МесМм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесмМ в 15 хвилин; МУа(ег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Виділений продукт ліофілізували з одержанням білої твердої речовини (23 мг), яку піддавали переочищенню препаративною ВЕРХ, і відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки о- 12 у вигляді білої твердої речовини (9 мг, 16 95). т/2 (О-ТОЕ МС ЕР») 1094,6543 (2095, ММа", СвеНвоМ7Масй!: потрібно 10946512), 1072,6722 (1695, МН», СвеНеоМ7Оч11 потрібно 1072,6693), 536,8358 (10095, (МНг)», СвеНеїМ7Оч11 потрібно 536,8383).
Сполука (1-13 (28,38)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((4-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-М- метилгексанамідо)фенетил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3- метокси-5-метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І-фенілаланіну --2,2,2-
трифторацетат о сту де вай а ре ун хі С Її Кі Ще. : ; щи. ІІ : : «и М. зе ди ие І. и М" чу М б и -я ке енн ее) о :
Он
Сполука 2-13: ії
НМ. ка Мод и о Ше ан -е
І її ши
Жов дб у Кельн г дих М -е рань г З зр М я
Н Б д пен чі ку с кл де, те й Бе ще Ксеня 3 тФо о у вес ай
ЕК ' жк Ж те он ї с ях о а в щ о
Що Ї ГЕАДМФ ла Ео т о ія а ня Не м яса юр Е ще й тя иа ня ях : й дення сл С
Мити за с: ше ох шх й й й т в ж Ї ту жк й і ї Ме ще ХАН Її тФо ей
СХ -
Он
Анілін 13 (15 мг, 0,015 ммоль, 1 екв) розчиняли в безводному ДХМ (1,5 мл) при 0 С і додавали ОІЕА (8 мкл, 0,046 ммоль, З екв). Вводили розчин сполуки (3-12-1 (3,5 мг, 0,046 ммоль, 1 екв) в безводному ДХМ (0,5 мл), і реакційну суміш перемішували протягом 1,5 годин при 0 "С. Розчинник випарювали при зниженому тиску, і сирий продукт очищали препаративною
ВЕРХ (УМагег5 600Е, колонка З!ипРїіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода /
МесМм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 100 95 МесмМ протягом 15 хвилин; Умаїег5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки 0-13 у вигляді білої твердої речовини (11,4 мг, 6295). т/2 (0-ТОБ МС ЕР; ж) 1058,6510 (3095, МН», СввНввМ7О:1ї потрібно 1058,6536), 529,8285 (10095, (МН2г)2», СввНвоМ7О 1 потрібно 529,8305).
Сполука (1-15 метил-(28,3А)-3-((5)-1-(38,45,55)-4-((5)-2-((5)-2-((3-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол- 1- ілугексанамідо)бензил)(метил)аміно)-3-метилбутанамідо)-М,З-диметилбутанамідо)-3-метокси-5-
метилгептаноїл)піролідин-2-іл)-3-метокси-2-метилпропаноїл)-І -фенілаланінату 2,2,2- трифторацетат ня я що т Я З гі: "ж бе ет
З АЖ ем а ву ; ря тек г х зи щ" н ниття, Як
Я ЕУ х і й. ж. о не ще і ж і що. фе т і абтнно її б | щи
Сполука (3-15:
Я ж зу вен ом «ще ше ше й ї Бе ше Не ге ей те М зх м зу дих М те : нин и НН , я ї ве ше шк НИНІ ей в
Ох и «7 : ГІЕА, ДМ в Во ї ї о ай я, вет ц тку » т м Сет ! ше м шк ше е М ої га а і
А ши шиши ше чиш ден Й я. ех ж С то Осій й
Анілін 15 (40 мг, 0,047 ммоль, 1 екв) розчиняли в сухому ДХМ (2 мл) при 0 "0 і додавали
РІЕА (10 мкл, 0,056 ммоль, 1,2 екв). Вводили розчин сполуки С-12-1 (108 мг, 0,47 ммоль, 10 екв) в сухому ДХМ (1 мл), і реакційну суміш перемішувалі протягом 1,5 годин при 0 "б. Суміш розбавляли ДХМ (10 мл) і двічі промивали водою (5 мл). Органічну фазу висушували над
Маз5о», фільтрували і випарювали при зниженому тиску з одержанням неочищеного продукту у вигляді бежевої твердої речовини (54 мг). Цей продукт очищали препаративною ВЕРХ (У/аїегтв бООЕ, колонка Б!ипРіге Ргер С18 ОВО, 5 мкм, 19 х 100 мм; елюююча фаза: вода / Месм, забуферена 0,195 ТФО; градієнт від 595 до 10095 МесмМ в 15 хвилин; УУаїєг5 2487, детектор УФ при 220 нм). Відібрані фракції об'єднували і ліофілізували з одержанням сполуки (3-15 у вигляді білої твердої речовини (27 мг, 50965). т/2 (О-ТОГ МС ІЕР кю) 1066,6517 (295, ММа", С57На5М7Мабчї потрібно 1066,6199), 522,8224 (10095, (МН»2)2», С57На?7М70ч1 потрібно 522,8226).
Приклад 17: Синтез, очищення і характеризація АОС
Описана нижче методика застосовна до химерних і гуманізованих форм ІдсС1. Необхідно розуміти, що для інших форм, таких як Ідс2, Ідс4 і т.д., фахівець в даній області техніки здатний адаптувати цю методику з використанням загальних знань.
Антитіла (1-5 мг/мл) частково відновлювали гідрохлоридом трис(2-карбоксіетилуфосфіну (ТСЕР) в 10 мм боратному буфері рН 8,4, що містить 150 мМ Масі і 2 мМ ЕДТА, протягом 2 г при 37 "С. Як правило, для одержання цільових відносин лікарського засобу до антитіла (ВАВ) близько 4 відповідно використовували 2,5-3 молярних еквіваленти ТСЕР. Часткове відновлення антитіла підтверджували аналізом в ДСН-ПААГ електрофорезі в невідновлювальних умовах.
Перед сполученням угруповання лінкер-лікарський засіб з вивільненими міжланцговими залишками цистеїну відновлену суміш залишали охолоджуватися до кімнатної температури.
Потім концентрацію антитіла доводили до 1 мг/мл 10 мМ боратним буфером рн 8,4, що містить 150 мМ Масі і 2 мм ЕДТА, ї додавали 5-кратний молярний надлишок лікарського засобу до антитіла з 10 мМ розчину в диметилсульфоксиді (ДМСО). Кінцеву концентрацію ДМСО доводили до 1095 для підтримки розчинності лікарського засобу у водному середовищі в процесі сполучення. Реакцію проводили протягом 1 г при кімнатній температурі. Надлишок лікарського засобу гасили додаванням 1,5 моль М-ацетилцистеїну на моль лікарського засобу та інкубації протягом 1 г при кімнатній температурі. Після діалізу проти 25 мМ Ніх буфера рн 6,5, що містить 150 мМ масі, протягом ночі при 4 "С кон'югат антитіла з лікарськими препаратами очищали шляхом використання способів, відомих фахівцям в даній області техніки, заснованих на комерційних хроматографічних колонках і ультрафільтраційних пристроях. Спочатку незв'язаний лікарський засіб і агрегати АОС видаляли за допомогою ексклюзійної хроматографії (ЕХ) на колонці 5200 (СЕ І їе Зсіепсе5) або Т5К (33000 5МУ (То50П). Потім очищені мономери
АОС концентрували до 2-3 мг/мл за допомогою ультрафільтрації на фільтраційних пристроях з номінальним відсіканням по молекулярній масі (НОММ) 30 або 50 кДа або афінної хроматографії на білку А. Очищені АОС зберігали при 4 "С після стерилізації фільтруванням на фільтрах 0,2 мкм. Далі їх аналізували шляхом електрофорезу в ДСН-ПААГ в відновлювальних і в невідновлювальних умовах для підтвердження кон'югації лікарського засобу та шляхом хроматографії на ЕХ або аналітичних колонках 5200 або Т5К 3000 5МУХІ для визначення вмісту мономерів і агрегованих форм. Концентрації білка визначали шляхом кількісного аналізу з використання біцинхонінової кислоти (БЦК) з дО в якості стандарту. ОАК оцінювали для кожного очищеного АЮС за допомогою ГІХ і РХ-МС. Як правило, вміст агрегованих форм був нижче 5960, і БАК становило від 3,5 до 5.
Приклад 18: Аналіз цитотоксичності антитіл ІЗЕ-1К, кон'югованих з різними лікарськими засобами 18.1 Оцінка химерних антитіл на клітинах МСЕ-7
Було показано, що п'ять антитіл до ІЗЕ-1К зазнають швидку інтерналізацію в лізосомах і мають низьку зв'язуючу здатність в кислих середовищах. У зв'язку з цим дані Ар володіли всіма властивостями для використання в складі АОС. Таким чином, п'ять химерних антитіл до ІЗБЕ-18 піддавали сполученню з трьома різними сполуками (0-13; Е-13 і Е-63). Відношення лікарського засобу до антитіла цих АОС становило близько 4. З метою оцінки неспецифічної токсичності нерелевантне химерне антитіло с9604 також піддавали сполученню з цими сполуками при таких же РАК. Клітини МСЕ-7 інкубували зі зростаючими концентраціями кожного АЮС при 37 "С протягом б днів в повному культуральному середовищі. Життєздатність клітин оцінювали, використовуючи кількісне визначення життєздатності клітин за допомогою люмінесцентного аналізу (СеПТйег-СіІо, Рготеда). Люмінесцентний сигнал зчитували з використання планшет- рідера Міга (Вепйпоїй ТесппоІодіеє5). Нерелевантне химерне антитіло с904, кон'юговане з будь-яким з Е-13, (3-13 або Е-63, не проявляло або проявляло помірну цитотоксичну активність на клітинах МСЕ-7 (Фіг. 21). Навпаки, при додаванні всіх інших АОС, одержаних в результаті сполучення антитіл до ІЗЕ-1Е з будь-яким з Е-13, (2-13 або Е-63, життєздатність клітин МСЕ-7 різко знижувалася. 18.2 Оцінка химерних антитіл на нормальних клітинах
Рівні експресії ЗЕ-1К оцінювали на первинній культурі нормальних клітин (РготосСеї! стрнН) з використання с208Е2 тАБ. З цією метою клітини (0,5 х 105 клітин/мл) інкубували з 10 мкг/мл антитіла с208Е2 протягом 20 хв при 4 "С в буфері ЕАС5 (ФСБ, 0,195 БСА, 0,0195 МаМз). Потім їх промивали З рази та інкубували з відповідним другим антитілом, пов'язаним з АїЇеха 488, протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С в темряві, після чого промивали З рази в буфері ЕАС5.
Зв'язування антитіл до ІСЕ-1К відразу проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували, використовуючи пропідію йодид (який забарвлює мертві клітини). Рівень експресії (Втах) на нормальних клітинах (таблиця 14) був низьким у порівнянні з експресією ІЗЕ-1К на клітинах
МСЕ-7 (див. Приклад 2, таблиця 8). бо
Таблиця 14
Цитотоксичність АОС с208Е2-4-13 оцінювали на нормальних клітинах. Клітини інкубували зі зростаючими концентраціями с208Е2-4-13 при 37 "С протягом 6 днів в повному культуральному середовищі. Життєздатність клітин оцінювали, використовуючи кількісне визначення життєздатності клітин за допомогою люмінесцентного аналізу (СейПТйег-Сіо, Рготеда).
Люмінесцентний сигнал зчитували з використанням планшет-рідера Міїйга5 (Вегппоїа
Тесппоїодіех)о. На НВЗМС, НРМЕС, НАОЕС і НКЕрс значної цитотоксичності не спостерігали (Фіг. 25). Незначна цитотоксичність була виміряна тільки на клітинах НОС при високих концентраціях с208Е2-а4-13. 18.3 Оцінка гуманізованих варіантів 22082
Шістнадцять гуманізованих варіантів 2082 піддавали сполученню із сполукою (1-13.
Відношення лікарського засобу до антитіла цих АОС становило близько 4. З метою оцінки неспецифічної токсичності нерелевантне химерне антитіло с904 також піддавали сполученню з цими сполуками при таких же БАК. Химерне антитіло с208БЕ2 також піддавали сполученню з О- 13. Клітини МСЕ-7 інкубували зі зростаючими концентраціями кожного АОС при 37 "С протягом б днів в повному культуральному середовищі. Життєздатність клітин оцінювали, використовуючи кількісне визначення життєздатності клітин за допомогою люмінесцентного аналізу (СеїПТйег-СіІо, Рготеда). Люмінесцентний сигнал зчитували з використанням планшет- рідера Міїнгаз (Вепійоїй Тесппоіодіеєх). Нерелевантне химерне антитіло с904, кон'юговане з О- 13, не проявлялао або проявляло помірну цитотоксичну активність на клітинах МСЕ-7 (Фіг. 26).
Навпаки, при додаванні всіх інших АОС, одержаних в результаті сполучення антитіл до ІСБ-1К з (2-13, життєздатність клітин МСЕ-7 різко знижувалася. Здатність шістнадцяти гуманізованих варіантів до індукції клітинної цитотоксичності була щонайменше еквівалентною або навіть кращою в порівнянні з певною для химерної форми с208Е2-0-13, як показано в таблиці 15 і проілюстровано для одного гуманізованого варіанту на Фіг. 26.
Таблиця 15 н""'нкжОООООЛВОВВЛВВВЛВВЛВЛВЛВЛВОЛВОЛВОТЛВОТВОТВОТВОТОНУНИИИ о: 11111111 пнгеовРг(ногвлогяу я 1лЛЕЛО
Гуманізовані варіанти
Приклад 19: Активність іп мімо антитіла с208Е2, кон'югованого з будь-якою з сполук Е-13, С- 13 або Р-63 в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7
З метою підтвердження, що ефективність с208Е2 в поєднанні з сполуками 5-13, Е-13 або Б- 63 іп міго може бути трансльована іп мімо, їх тестували в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7.
Методики роботи з тваринами виконували у відповідності з керівними принципами
Директиви 2010/63/ЕС щодо захисту тварин, що використовуються в наукових цілях. Протокол був схвалений Комітетом з контролю етичних норм поводження з тваринами інституту Рієїте
Еабге. П'ять мільйонів клітин МСЕ-7 ін'єктували підшкірно 7-тижневим мишам лінії Зм/із5/Миае.
Перед ін'єкцією клітин в лівий бік мишей імплантували пелети естрогену (Іппомаїйме Кезеагсі ої
Атетгіса), необхідного для росту іп мімо пухлин МСЕ-7.
Через двадцять днів після імплантації МСЕ-7, коли пухлини досягали середнього розміру 120-150 мму, тварин ділили на групи по 5 мишей відповідно до розміру і аспектом пухлини. Різні препарати вводили шляхом інтраперитонеальних ін'єкцій. Стан здоров'я тварин контролювали щодня. Обсяг пухлини вимірювали два рази на тиждень за допомогою електронного циркуля до кінця дослідження. Обсяг пухлини обчислюють за такою формулою: п/б х довжина х ширина х висота. Токсичність оцінювали шляхом спостереження за масою тіла тварин три рази на тиждень. Статистичні аналізи проводили для кожного показника за допомогою критерію
Уілкоксона-Манна-Уїтні. Всі сполуки ін'єктували інтраперитонеально (і.р.). В даному Прикладі протипухлинна активність с208Е2 тАБ в сполученні з будь-яким з Е-13, Е-13 або Е-63 при ОАК близько 4 оцінювали після 2 ін'єкцій дози 7 мг/кг при 020 і 027 (Фіг. 22А, 228 і 223). Паралельно блоковані угруповання лікарського засобу Е-13, Е-13 і Е-63 ін'єктували в еквівалентній дозі, що відповідає дозі 7 мг/кг сС208Е2-Е-13, сговЕ2-Е-13 і с208Е2-Е-63 САКЕ близько 4.
Ін'єкція будь-якого з с208-Е-13 (Фіг. 22А), с208Е2-0-13 (Фіг. 228) або с208Е2-Е-63 (Фіг. 225) приводила до значного інгібування і навіть індукції повної регресії зростання пухлини (р менше 0,05 в порівнянні з відповідним блокованим лікарським засобом). Статистично значна відмінність активності с208-Е-13, с2говЕБ2-0-13 і с208Е2-Е-63 не була відзначена. Блоковані лікарські засоби не чинили впливу на ріст пухлини МСЕ-7 (р » 0,05 у порівнянні з контрольною групою).
Друга серія експериментів була проведена з с2081Е2, кон'югованим або з Е-13, або з С-1313 нерелевантним антитілом с9054, кон'югованим або з Е-13, або з 0-13, в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7, як описано вище. Мишам ін'єктували і.р. 7 мг/кг кожного АОС при рг20 і 027 (Фіг. 23А і 238).
Ін'єкція обох с9(04-Е-13 і с954-Е-13 надавала помірний і транзиторний вплив на ріст пухлин ксенотрансплантата МСЕ-7. Проте, цей другий експеримент підтвердив, що ін'єкції або с208-Е- 13, або с208Е2-04-13 призводять до індукції повної регресії 043, що показує високу протипухлинну активність АОС.
Приклад 20: Активність іп мімо антитіла п2208Е2, кон'югованого із сполукою (3-13, в моделі ксенотрансплантата 33 МСЕ-7
Гуманізовані форми 2082 в сполученні із сполукою (3-13 оцінили іп мімо в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7.
Методики роботи з тваринами виконували у відповідності з керівними принципами
Директиви 2010/63/ЕС щодо захисту тварин, що використовуються в наукових цілях. Протокол був схвалений Комітетом з контролю етичних норм поводження з тваринами інституту Ріеїте
Еабге. П'ять мільйонів клітин МСЕ-7 ін'єктували підшкірно 7-тижневим мишам лінії Зм/із5/Миде.
Перед ін'єкцією клітин в лівий бік мишей імплантували пелети естрогену (Іппомайме Кезеагспй ої
Атегіса), необхідного для росту іп мімо пухлин МСЕ-7.
Через двадцять днів після імплантації МСЕ-7, коли пухлини досягали середнього розміру 120-150 мм3, тварин ділили на групи по 6 мишей відповідно до розміру і аспектом пухлини. Різні препарати вводили шляхом інтраперітонеальних ін'єкцій по протоколу 4 ін'єкцій: одна ін'єкція один раз в чотири дні (0444). Стан здоров'я тварин контролювали щодня. Обсяг пухлини вимірювали два рази на тиждень за допомогою електронного циркуля до кінця дослідження.
Обсяг пухлини обчислюють за такою формулою: п/б х довжина х ширина х висота. Токсичність оцінювали шляхом спостереження за масою тіла тварин три рази на тиждень. Статистичні аналізи проводили для кожного показника за допомогою критерію Уілкоксона-Манна-Уіїтні. Всі сполуки ін'єктували інтраперитонеально (і.р.-). В даному Прикладі протипухлинну активність с208Е2 тА, кон'югованого з сполукою С-13, порівнювали з різними гуманізованими формами, також кон'югованими з 0-13 (фіг. 27). Протестовані гуманізовані форми описані в таблиці 16 нижче:
Таблиця 16
Ін'єкція будь-якої з гуманізованих форм с208-023-13 або 2082 приводила до значного інгібування і навіть індукції повної регресії зростання пухлини (р менше 0,05 в порівнянні з відповідним контролем). Статистично значимої різниці активності між с208Е2-0-13 і протестованими гуманізованими формами не спостерігали.
Другу серію експериментів проводили або з с2081Е2, або з п2208Е2-4 в сполученні з 5-13 в моделі ксенотрансплантата МСЕ-7, як описано вище (Фіг. 28А і 288 відповідно)» Мишам ін'єктували і.р. З мг/кг кожного АОС у вигляді 4 ін'єкцій раз на чотири дні (0444) або тільки один раз.
У моделі ксенотрансплантата МСЕ-7 спостерігали таку ж сильну протипухлинну активність при чотириразовому або тільки одноразовому введенні АОС.
Приклад 21: Активність іп ммо антитіла 208Е2, кон'югованого з сполукою (2-13 або Е-13 в моделі ксенотрансплантата 27 Сабм-3
Протипухлинну активність також досліджували в 2" експресуючій пухлині в моделі ксенотрансплантата СаОм-3, що представляє собою лінію клітин карциноми яєчника. З цією метою мишам ін'єктували підшкірно на день СО 7х105 клітин. Коли пухлини досягали приблизно 120 мм (19 днів після ін'єкції пухлинних клітин) тварин ділили на 5 груп по 5 мишей з порівнянним розміром пухлини і вводили інтраперитонеально с2081Е2, кон'юговане або з Е-13, або з 0-13, і нерелевантне антитіло с9(034, кон'юЮговане або з Е-13, або з 0-13. Мишам ін'єктували і.р. З мг/кг кожного АОС по 6 ін'єкцій на цикл; одна ін'єкція раз на чотири дні. У мишей спостерігали зростання ксенотрансплантата. Обсяг пухлини обчислювали за формулою: п/б х довжина х ширина х висота.
У порівнянні з с904-Е-13, яке помірно або транзиторно індукувало уповільнення зростання, с904-4-13 не впливало на зростання ксенотрансплантатів пухлини Саоу-3. Ін'єкції або с208БЕ2-
Е-13, або с208Е2-20-13 приводили до індукції в середньому 95595 і 7795 інгібування росту пухлини відповідно на день 50 (Фіг. 29А і 298).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 РІБВНЕ БАВКЕ. МЕОТСАМЕМТ «1205 КОН'юЮГгАтТ АНТИТІЛА ПРОТИ їоК-18Б 3 ЛІКАРСЬКИМ ЗАСОБОМ ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
ДЛЯ ЛІКУВАННЯ РАКУ
«3305 033593 «1405 РСТЕР2О15/ 159045 «1415 2015-04-27 хі502 ЕР143056520.8 «1512» 2014-04-25 «1605 81 «1705 Раїептїїп уегаіоп 3.5 «10 1 «8 8 «912» РЕВТ хйїЗ3» актйбіста! «ох «йе3ж Сопвзепзив СОК -НІ «ех «Ве» МІЗС. ЕЕАТНВЕ «седйж (33.03 «ф23» Тг тау Бе геріасей бу ет «г ій МІС КЕАТОКЕ «Вйв» (8)..( «РеЗ» туг шау Бе гтеріасей бу РВа «АХ чу тук твг Рве Те 5ек тує туг «ій» 2 кеїї5 8 «ій РЕТ кгіЗ» агііттіста! «20» «йа3юж Сопвепвия СОК-нНО «4005 2 тів тер о Рго С1у Ар сіЖ Бек ТНг 1 5 «210х З «її» 33 «212» РВТ «иа» актітісіа! «гр «223» бСопзепвив сСоВ-НІ «А00» 3 діа Заг вго Мет пе ТИгОоРГО АВпоОтТує ще мет АБО туг . З 3 к2102 4 ке1ї» 6 «РІ1й2 РЕТ 23» аскіттста «СаО» ха» Сопзейбия СОБК-Т 3 ки гОдж «йдіх МІ5С ЕЕАТОВЕ «вййм (43..(4) «йд3» 5ег там Бе геріасеві Бу Ап «00» 4
Оій Ар ше бег гу Туг 1 5 «М» 5 «11» 3 «Вій» ВЕТО «213» агтітісів! «290х «23» Сопзепзне СОБ-12 «ОО» 5 тук таг щег і «240» 5 хе» З «105 РТ. «2135 агжійтїсіа! «0» «ВЗ» Сопбвепзив СОК-1 3 «220» «3 МІБС БЕАТІЖЕ «йййж 053..(5) «23» тТрготау бе геріасесі Бу А1а «Нюх 5 біп біп біу бек ТЬгогбем обго тує тве 1 5 «20 7 «11» 8 «рійх РТ «13» агтітіста! «220 «ваз» срВ-НІ «ОД» 7 сіу туго тиг Ре тк о5еготує туг 1 З «10» 8 кеїї» 5 каї0з РЕТ «13» ветітіста «ай» «23» щов-ні1 «005 8 сіу тук бег Ре ТВг Баг о Туг РЕ. 1 5 «10» З кіїх 56 «Е1й» РЕТ «із» агтітіста! «во» «дез СрК-
«щю- а сій Азротіє Бег бух туг 1 5 «М» 10 «11» б «Вб РТ «213» астітіста! «2205 «23» сов-Б1 «4002 30 сіп Ар тіесА5п о гує Туг 1 5 хгійх 11 «11 З «125 РВТ «йА3» агтітістіа! «ох «йе3Зм ср-3 «Нюх 1 біп біп біу дек тпг осей Рго туго тТвВг 1 5 «Ох 1 «ії 9 «Взйх РТ. «813» вгкітісіа! «Ве» хреа» СОВ-З «ДО» 12 сів бів б1у бер ща Гевз вго Ту таг і кіз 43 «її» 1920 «9125 РЕТ «13» амітіста! «йо0х «23» сеОВЕ2, пПеачу спатн, УНН «300» 13 біп о уаї біп бец «18 сіп Зег обім Рго бін Гем маї Бу Рго оТу Аїа 1 5 10 15
Зак уаї їуб Ме бек Суч« Гуз Аїа чег б1у Тут Тиг о РИЄ Тр обек тує туг її туго тгроуаї гу5 ої Аго РКО Зіу отТй сім ей бї тероцецй 5 сіу тгр Хі ТгроРго сіу д5роо1у бег То Гу5 Туг А5п сти Муз РВе 25 50 у дру таготВт ге) тк одіа АЗроцує 5егобег Ач Тпг дів тус 7О 75 80
Мет Рай івец Зер о бег (се) ТВгобеє біц Ар об5ег Аа маї тук РНе суз 85 90 95
Аїа бег рго Ммеї її ТК оРгОо Ап о тук АТа Мет дев тує тер о бім їй 100 105 Мо бі Аїа 5егоуа! Ті Уві) Заг обер 115 1950 «в» 4 «її» 320 «зх РТ «13» вежі Рїсіаї «Ох «223» се1?2АЛІ1, Неаму сваїп, УН кд0О0» 14 сіп мат сів оїен бій сій бек сім Рсе бій їер уві був рго с1у А1а 1 5 10 15 зег Маї їу5 Мебї бек Суб Гу5 Аїа зеб о сіу Тук тТнгоРНе тиг бек о туг 20 25 30 тує жів нів ТгроМаї Су іп Агу вго 61у сбіа сіу Кей бі теротіє 35 о 45 сіу тгр ІТ тер о Рко біу Ар бім чек тйгоїуб тТук Азп біз вух вве 50 55 50 су« а1у їуз Тит тТНгогГем ТНгойіа АБзрогуз Зег о ЗегозЗегс ТНК Аіа туг 55 70 75 во
Мет ре еп бет 5аг Ге ТАг обего сій Ар 5ег о АТа Уві Тук рле Суб 55 90 95 діа бБег овго Ме ї1е Тиг РКО Ази тує Аза мех дер туг тер обіу о1п 100 105 а сіу Аїа чек уд! Тит Уаї бегохег 115 120 «2105 15 ка1ї» 120 «212» РЕТ «213» асхітіста! кховОз кгйЗ» сгі14к8, певму сваїй, УНН «НЮ» 15 сіп маї біп їви бій сій бЗег о біу бБвробін іви маї буз рго біу Аїд 1 5 юю 15 5ег уаї їуз Бей бег о Сух їу5 АТа чего О1у Туг о Твк РБе Твг обег Туг 20 25 БІ тТук їїТе ні тгр о уаї гує є1п Агу Бго с1у сій ТУ ем сі Тероїт1е 35 40 45 сбіу ткр їїе тгроРго біу Ар о сіу Зег тк мує Туг АБ сТу дго вве 50 55 50
Гуз еіїу уз твгР Тк Гей ТйгОАза Азріув5 б5ег бек баг те АТа тус 55 70 75 50
Мет Ре їеци Зег бегоіїеци тАйгозек бін Ар о5ег о АТа Уа! тує Ре су 85 90 95
Аїа бег о рго Мет ї1е ТпгоОРГО Аза Тугб АЇВа Меї Азр Туг тгроаіу б1п 160 105 110 сіу Аїд бБегомаї Тпг уві бек об5ег 120
«2510» 16 «2115 20 свій РКТ «213» агітісіа! «од «23» се1906, Нваму спаїзп, МН «АО0О» 36 сіп о маї сій їгц сій сів бек сіу Рго сій існ ма! уз рРго сіу АБ ії 5 10 15 чек Ма! їуз Мебє бвгосСуз у Аїа бек сТіу туго дес РП ТИг бек отуг випа тіЄ ні тер ома?) Гуз іп алго Рго Ф1у св сту гей обід тер те сіу тгрої1Те тгроврго сіу Ахр сіу 5ег Те ух Туг АВ Бій вуз ле й
Гуз Фі1у ув ТВЕ тт осей Твг о тВгбоАврогуз бек обзегобег тТВг о АТа туг 55 70 75 во
Мет Ре зей Ап 5ег гей ТНг бек осі дер оявг діа Уаї ТУк РАйе Су 855 90 95
Аіа бегорго Меї тІе тТийгоРГго Аза туго А)їа Меж Ар Туг тер біу аїй 100 105 0
Зі АТа зег уаі те Уаі Зег о 5ег 115 120 «210» 17 «211» 190 «в12» РК кеїа» вежітіста! «дай жеа»3» с213810, пезачу спаїп, УН «4005 17 сіп ма! біпїеп біай сій 5ег йпіу 5ег бій бен о Ущі у5 вго пі дів 1 5 3 15 бег маї їу5 Меї бек Суз цу о Аїа бак біу Туг тТвг РНе тВк бек тує 20 25 за туг жіє ні ТгромМаї су чів Ага го біу сій діу бец с тгроїгів 35 40 45 бі Ткроїіє Тгр о Рго сім дер обім чек Таг о гух Туг о Азп 10 Ага вве 50 55 50 сут аїу їувз ТВтТ о тТНг ог еи ТВг Аїа Ар губ зер Зек б5ег ТК АТа Туг 55 79 75 80 мес РВЕ ей бЗег его оїей Таб обек бій А5ро5ег Аа Уа! Тує врле Су 85 що 95
А1їа Заг вго Мек їТе ТАК ОРКО АЗпоТуг АТа мех Ар отуг тер у сів 100 105 ло сіу Аїа чего ма! тк муаї бЗег хег 115 120 «2105 18 «11» 307 «9125 РЕТ хФг1З3» агтітісла!
ки гОдж й , «беж СЛОВЕО, ТД снаїй, М «800» 18 а5р х1е біп Меї тик о бія Таге отВбобев бек оїви бек Ах Зег гей Ту 1 5 10 15 лвроАгоа ма! твг оЇї1Іе 5ег о Суз Аго А1їа бек спій АЗИ ї1е бек суб Туг 20 25 30 без Ап о тТгротук б1в та біп во АЗросіу тТВг ї1е6 губ геи їеу ї1Те 35 40 45 тук тТуг тйгобек Аг зе ніз Зак обіу уаї Ро баг одгд Ре 5акоб1у 50 535 60
Ага біу 5ег о бБіу тт о А5р о туг бегоїен тб те 5ег о Аеп уві сФіш бій 55 70 75 850 сі А5рот1е с Аїа твт оТук о рйе Су біп сій бу его тик Бей Рго тує 85 90 95
Тк оРйе сі бі б1у тк огу« бец бі тів у 100 105 «2105 19 «ії» 107 «12» РКТ 213» агтітістіа! ках І й «Вгї» сеї?2АЛ3, 11ОпЖ спаїйп, мМ «005 19
Ан ті біп меж тик о біп таб о тйгб чає баг орей бе Афа зар огбец ТУ 1 5 10 15
Ар оАга маї тт тіє 5Зег оСу5 Ага АТа 5ек ста Ар оІ1а Ап кує Туг 20 25 за ев ап о тгротут Я1п бій дій Рго АзрозТу тнгомаї бу єю геу те 35 о 45 туг Туг тйгозег Адго сеи Ні зег біу Маї Рго 5ег Аг Ріе бек бу 55 50 ага сіу зег о біу Тк Ар Туг 5ег Гей тТйг о їТе 5ег Ап їец сін ой 55 70 75 50 «іп АБр оте Аіа тБк туго РНе Суб біп сій біу 5ег о ппгобеп вго Туг 85 90 93
ТигоРвВе сіу б1у су ТНК оцуз ен бій їТе 1у5 що 105 «2102 70 х21ї» 07 «2122 РЕТ «2Ії3» агжітістаї «его» «223» сгі4к8, Зідйс свати, М «МО» 20
Ар тів сбіп Меб тпгосій Твг оТвг обЗег обет сен 5ег Аїа 5ек о геч о1у 1 5 10 15 дер Ага Уді тйпг о Рпе бег Суз Аг Аіа Бег сій АзроІ1е 5ек о руз тук за
Гей дей Теротує 10 бій єїй бга Азробіу ТВг лів вух без гей Те 35 40 45 туго Тутє Тиг обег Аго Сем Ніз бек сіу Маї Рго 5ег ага Рне 5ег ау що 55 50 дго сіу 5ег сіу ті Азр Тук его іеу Тйг о Т1іе Тиг о Азп бе) бій бій 55 79 75 ва сій А5рЇ1е АТа тк тує Ре сСсуз й бій Ту его Аїа Бей оРго тус 85 чо 95 тТНгоРНе С1у Біу б1Уу тик о сух сви бі тів зу т00 105 «210» 21 «41» 307 «ті?» РЕТ «2132 астітісіві «ИЙ» «гй3» сг1906, іде свати, мі «4005 21
Ар оїіе біп мес тТвгосіп тс о ТВгобек бЗег оте 5ег Аа его бец о1у 1 5 10 15
Азр Аг Ууаї тс ої16 Бек Сух Агу Аа бек сів А5роїгів 5ек о гбу5 тук
Зо їви АБИ Тгротує б1іпосіп бій Рго АБробіу Твг ма! губ ве без Пе до 45
Туг тує таг озего Ага гей ні бег сіу мМаї рко 5ег Аг Рпе бек пу 50
Агу сіу 5ег бу тТиг о Азо Тук бегогеи ТК оті бек о Адзп о вез бій дій 55 79 75 80 бій Аб5р тів АТа тб тує ре Су Сб1іп бів сту бек Тигогез РКО тТуг 85 50 95 тб овве сіу сіу Я1у Тйг уз ген сій т1є 1у5 700 105 «2» 22 «2115 307 «10 РТ -в135 агтівісїіа! «220. «ВЗ» ст13810, Тїопх спдаіїп, У «Ах? дер тів біп мебє тт бій тс отве беб чего гер бег АТїа баб їв о1у 1 5 10 15
Ар Ага уаї так о їІе 5ек Су Аго Аа бег бів Ар о тТе бегогув о тук 20 25 зо еп дп о тТгротуєв оійб бів Бій рко д5робіу Таб ожтТе уз ге бец Те 35 40 45
Тук туг ТНг бек Агу Сей Ні ес овіу Уа)! рРго Бег о АкЯ Ра бек сіу 50 58 60
Ага сіу бег біу тТпг Або туго зяб ге тв їі Тйго аа бец Є сіл 65 70 75 80 біц Ар їв АТа тик тує РНе Суз сій б1п сту сзек Аїа ій рго туг
85 90 95 тТае вне сту сіу с1у тТиг гуз бец сій 116 1у5 00 105 «0» 23 «зх 449 «вій ВТО -й13» агжхійіста! «ай» «23» сова, Веау садіп, 11 Тепоесп «005 23 сій маї сій їец ой сій бег о сіу Рго сій бен ма! був рго сі Аа ї 5 10 15.
Чег Уа! їуз Мебє зе Суз гу АЇв бек біу туго тт РНе ти бекотує 270 25 30
Тук тіє Тусг тТгроуві Суз біп Аг РгГо сіу іп біУу гео сіц ткроген спіу тер ї11е тгао вро с1іу д5росТу 5егб оте ув Тут АВ бід Суб вле со уз А5рогбуз тк Отйг Се) тр оАТа ар огув его бег Аа тИг о АЇВ туг 5х 70 75 о
Мет вне їієцй Зв о 5егоїеу тТвгобек осі А5р о зег Аїа уві тує РНе. Суб 85 50 95
Аіїа его Рго Меї 116 ТпгоРго А5потТук Аа Меї Азо Туг тер о біу с1й 105 105 То сіу Аїа бек уаії ті Уві Бег бек дів б5ег ТВгоГсу5 сіу Рго бег уд 115 1570 125
Ре вго їей АЇа Рго бег о бег рух Чек так Яви су біу Тк АТа Аїд 130 115 146 іїен сіу сув ій Ммаї їу5 Ар тує ВБе Рго бій Рго Уа! ТвгомМа1 5ег 145 150 155 160
Тер оАБи 5егобіу Аза сей тпг бек сіу маї ні тТнг о рйе Рго АТа уаї 1655 170 175 їез біп Зак бек с1у сей тує Зек цен баг о5ег уа| маї тк омаї рго 150 155 199
Зекг обег обЗег о їец біу ТВгобій тк тує ї1е Сує дя ма! АбЗп НІ Гуз 195 290 205 вго Бег Авп таг Гуз уаї Азр їуб5 Ага маї біб Рго Був бег Суб АЗр 210 215 220 іїу5 Так онНіз тТАКоСух РКО Рго Суб Рго А1Я РО Ти рев гей сіу б1у 225 230 235 240
Рго баг уаї Бе гей вне рРгГО Бко ту Рго Бу5 Авр тк бен Маї тів 245 250 255 5ег Агу ТВе Рго сім маї Тк оСуз ма! Уа! маї Ахромаї бек ні сін 250 255 270
Ар овго сій маї Ку5 РАВ А5потТгтротуг мафії Ар сту Уаї бій Уаї нів 275 2850 285
Авп. АЗа їу5 ТВг ог ує Рго Аго піц сі) біп Туг А5а беготйг тує Аго 230 295 300
Уа! уаї б5ег Уа! Ген тиб ома1ї ге ні5 ей дер тро гей А5п Є1у суб 305 310 315 320 бій Туг їу5 Суб ух МаЗ его Абпогує діа ем о рео Аїа Рго ї16 1 325 330 335 муж ТВготІіЄ ет ув АТа уз біу сіп Рго Аго 61 Рго біп Ма1ї Туг 340 345 З50
Тиг сечо го Рго б5егоАРу біц зі меж тйгоїу5 АВ бій маї бек ген 355 360 365 тТиК Суб бе Уа) ух сіу Ре тур Рго бек Азр ї1е Аїа аі би тро 370 375 зво сі) зег АБ бі б1й вго бі Ай Аби ту обу Те тиг овго Рго маї 385 З90 395 до іец Ар бе АЗросіу ек Ра Ве їец Ту 5ег бує се) ТНК ма! Ар 415
Гуз бек Ага Тгробіп сів біу Ап Ма! ве 5ег Су баг Уа! Мех нів 420 425 430 сій Аїа ївеи ні АзпонНіз Туг ТВеобіп Гуз 5егоїеу Бер о рец 5ег о Рго 435 440 445 чіу «2105 24 «її» 449 «12» РКТ 213» агтітістіа! кавою «23» се1гА11, певуу спаіп, ТІ Тепутв «00 4 біп ма! бій їеш б16 сій бек обі во біб фей о маї бух рго б1у Аїд 1 5 10 15 5ег оуаії ув Ме бак о су 1у5 Аїа чек о біу тує тТвг оРйе тнкобекотує тук жтіе ніх тер о хаї Гуз ій вго Рго сіу бій сту ген бів тер т11е о 45 бі тер тів тувровко сіу А5р о біу бЗеє тйгоїу5 Туг Аза бі) бує РБе 50
Суб Ту уз ТВеотНг грец Тс о АЗа Азросув бег бак бег Те Аа тує 55 70 75 50
Меї Ре бец 5ег бек ге ТНгозег бін А5р о5ег АТа ма! тує вне сСух 85 50 95
Аза бек вго мер ї18 тик о рРгО депоТує АТа Мет Абр Тук Тер Фу їй що 105 мо «іу Аїд бег о маї тт омаї бек бек Аїд чего тТвгогух Ф1у Рго бек маї 115 120 125
РНе рго іеци Аїа Рго бег бек о буз бЗег ТВго5ег о біу Фіу тк АВ Аа 130 135 140 цец сбіу Суз їен Уві Гуз АЗр отут Рпе Рго бід Вго маї ТИиб Уаї бек 145 150 155 1650
Тгроаяп о бегобіу іа Сей Твгобеє о біу Уа! Ні тс Ре Рго дія ма 165 170 175 їен біп 5ег бек біу Гей туго бБяебо ге бек зак Маї Уві тб оУуаї вро 1595 185 195 бег зек бег їву б1у Тиг осів ТВготуг 116 Суб Аа Уа! Абп Ні Су
195 200 205
Рга баб А5п о ТВг огу5 Маі дер рук Аго маї бій РРО рух бег Су БД 210 2715 220 цу тТвгонів тВе Сув рго Рго бСуя Рго Аїз рго бів бец без б1у 1у 225 230 235 240
Рго бег ма! РВе гей ве орго Рго бух го у АБО Тпг без меж 116 245 250 255 5ек Ага тиг оРго о1й маї ТАК оСуб5 ма! маї МаЗі Ар ома! 5ек нів 1 250 265 27
Ар о РгО бі маї гу вва АБ отгротут маії Або сту маї сій маї ні 275 280 285
Ап Аїд іу5 тТАйг оту Ро дго 10 бі сій Туг Ази Зег ТАЄ туго Аго 290 295 300 уа! Ма! бепс Уущі їец Те ма! Сей нія сій Ар о ткрогбез А5п о б1іу зує 305 Зо З15 зга
Фі туго вуз Суз уз мМаї 5егоАб5й їуз АТа ен о РГо Аїа Рго ї1в ой 325 330 335 цу так жте 5ег 15 АТа гу піу бій РРО Аго бій Рго бій муаії тус 340 345 50
Те оцей рго Рго 5ег о АгЯ 5Ри бій Ммеб тт о їу5 деп бій ма! бек цей 355 Ї 360 365
Тае Суз мед маї Цу5 сСіу ме Туг го бБег АБр о їТе Аїа маї бі Тгр 370 375 зво бій зег дви б1у Бій Рго біз деп. Ай туго бух тТВготвг Рго РгО Ма зва 390 355 400 гей Ар 5ег оАаероб1іу Зег бе вп. Сей туго сег їу5 Бец тТНг Ма| Абр 455 310 415
Гу Зег Аго теробів бій сфу А5зп ма! Ре его суз бег Уа! меж нів 420 425 430 бій дів тей Ні дев Ні Туг таб бій бух звг оре бег ів 5ес рго 435 440 445
Фіу -2105 Д 25 -2115 449 «212» РЕТ -ВІ13» асжхітісів! ке» жага» сй14в8, пейму сваїт, ТІ! Тепоїй «Ах 25 сій ма! сій ен ста сів баб о сіу б5ег бій сен ма! Гуз рго б1у Аа 1 5 16 15 5ег ма! уз бе бег Сув туї Аїа 5ек б1уУ Тук тв о РНе Тйб бек тує 275 зо
Тут тіе ні тТгр Уа?! Гуз біп дга Рго бі сів бту еп би ткротів сіу тгр о їіє Тер о Рго сіу Ад5робіу 5еготвВг їух туго Ап зіц Арго Ре бо
Гуз Фіу фу тТИг таб гей тТаг АтТа Ар Гу5 бек обек бек тпг АТа тук 55 70 75 о мет вве зви бег 5вгоїем Тйкоб5егб бі) Ахрояег АТа Узі Туг рРйе су 85 90 95
Аіа бегорго Меж ї1е Тс орго АзпоТує Аїа Меї Ар оТуг тер оТу ап 100 105 119 бі Аїа 5ег Уа! Тіг- Ма) бек его А1а бег ТВг 1 у5 Біу Рго бек Уа! 115 120 125 ве РКО їеу Аїа Рко 5ек бег Муз бек Тнгобег о с1уУ біу ТВ АТа АТта 130 1575 150 ївю біу Су5 ей уаї Іу5 Азр о тук РВе РгО біб Ро Уді твк о уаї 5ег 145 150 55 60
ТгроАви чего біу АЇа іен тТйг бек бі маї Ні Тиг о РМа Рго Ав ма 165 170 175
Се біп чего 5ег б1у Ген туг Бек овец чек 5ег маії маї тис маї Рго 180 185 198
Зек Зег Зег їен бі Тк обіп тбг о туг їТїе Суб Азп Уа! А5п нів гу 195 200 205 вВго 5ет Акп ТИгогух уаї а5р уз Аг ма! бій Рго уз бег Су5 д5р гій 215 220 уз тк оНнії тТвг Суб рго вго Суз Рго АЇа РгО бТб без рей б1у су 225 230 235 240
Рго бЗег ма! Рпе 180 РАВ РГО РГО Гуз РКО уз АЮ таб орви меж пе 245 250 255 бек Ага тВговго 510 маі Тр обуз ма! Уа) уаі Адзроуді бек Ні Су 255 265 й а5р ого біз Уаї уз РП Ахи Теротук о Маї Азросіу уві сів Уді Ні 275 280 285
Аза дів їуз ТВт ог ув Ро Аго бій сій 51 Туг Ав бес Так тує Ага 290 295 300
Уа! Уа! 5ег ма! йеп тйг омаї ев нів біп Ар о ТгроГец Абп о біу Гу 305 310 315 320 бій Тут бузх Суз ув ма) заг А5поїу5 Аїа зви РгОо АЇа Рго тів сти 325 330 335 ув ТАготІЇе его гуз АТа їуз б1у сій Рго АкО оц Рко біп ма! туг 340 345 350 тик о сСец Рго Рго бегоАдка біш біз Мет так уз дБА бі0 Уа! бек о іеч 155 360 365
ТЕг Суб гей Уа! Суз су Ре тТуг РГО чего Азр т1Те АТа ма! 1 тер 370 375 380
Фі его дп бі сій Рго бій АБп Аа тує оїуб ТВ Тр орго го Уаї 385 з90 395 400 іе) АЗр бек дер о сїу бег рйе РНе ген туго 5ег Гу без тйб маї Абв 05 4410 415
Гуз 5ек Ага МВ ой сів біу дяй ма! вБе бек Сух бЗег ма! мех ніх 42 425 430 осі Аа їгц Ні А5Зпо нія тує тв осбіп бух бек ївецй его іви бек рРго 435 440 445 сіу «2105 26 к2іїз 449
«217» АТ «13» агтітісіа! «го» , «223» сиЩїЗ05, Неачу спатп, Тм1і Тепатб «00» 26 сій Ууаії біп їм б1п сій бесосіу Рго сій їец маї Суб РгОо б1у АБр 1 5 10 15 ек а! бу5 Мет баг Суб Гуз АЗіа бБег сіу туг бег Рйе Так Заг тус вне тіє Нія Тер оУаї Гуз біп о Аго Рго біу бій сту без бій терої16 сФіу Тер І1е тгроРго чіу й5р о сіу 5ек о тбу їує туго Аза би губ рРАе
Бо уз біу фуз так отТйг рез тТВготвге Абробув бег явго Баг ТВ АЇВОТуг 65 70 75 59
Меї Рлйе іїецй Ап обег ге) Тс обегосбіц Азр 5ег АТа ма! Туг Ре суб 85 90 95
Аіа бек рго Мебї 516 ТК о Рго Ай Туб АЗа Мет Азротуг тер ш1у ба 160 105 110 су Аїд обБег омаії ТТН Уаі бЗег зег Азія Бек Твгоїує 01у го Бек ма! 115 120 125
Ре рРго Мед Аа РО бек 5ег Гуз Заг ТВг обег сту С1у Тнг Аа АТ 130 135 140 цец сі1у Суз Гей ма! Гу дер туго вне Рго бій Рго Ув! тик Ма! заг 145 150 155 160 тгроАБи 5ег біу Аїа сем Ттаг обегосіу мМаї Ні тТве Ре го лій ма! 165 170 175 цей сій б5ег о бег б01іу сем Тує обег обей 5Забк б5еве уаї Уа1 тк омМаї вго їБо 155 1990 зек Зег 5ег беци су тигоаій тб тує те Суб дей Ууді Ап нія Суб 195 200 295 вго 5ег А5пП ТВг ої уз Уд)і Ар Гуз Ага Маї Бім Ро і у5 бег Сує Ар 210 215 220
Суб Тве Ні ТвВгоСуз Рго Рго Суб Рго АТа Рго ой гец їв о1у Біу 225 235. 235 240
Бкто его ома! Ре цей Ре рго РтТо бух Рго 1у5 АБр тТЬг о бей меє пе 245 250 235 «ек Ага ТВгоРрОо бій ма3і ТВгбосСуз уві хаф о уаЗі Аброуаї бек нів І 250 255 278 дер Рго сіи Уаї Гу« РМе А5потгротук муаї Ар сту маї сій ма! нія 275 280 285
Ави Аіа їу5 ТВгогуб Рго Ага сі бій біл отуг Ап бек ТК Тут Аго 290 295 00
Уа! маї бегохаї сем тпгомМа! Сецш нія сій А5р о тТгрогез Азп о 1у гу
З05 310 315 320 сіш тус їу5 Суз їуб5 маії бер АБ іубБ Аійа гей РгОо Аїд РГоО 118 01 325 330 335 цу тиг о жів заг гу АТа 1у5 біу сіп ВБго АБЗ біб Рго б5іп уді туг 349 345 850
Те сей рРго Рго бек ака сів біш Ме таб рух Ап обіп чаї бек Гей
3553 3650 3655
ТАиеосСуз гей уві губ біу Ре туго вро 5ек Ар тів АТа муаї 60 тр 379 375 380 сі бБег Азп о с1у Зіп рго сій А5поАБпП Тук руб ТАс Тигобго рго Уа 355 390 395 400 сей дір бег Авзр О1у 5егорпе рРпе сви Тук о бег був Гей ТНК Ма! АБрЮ 405 414 «15
Гуз 5ег Ага тгроб1іп біп оту д5й Уа! Рпе 5ег Суз 5ег Уа! мет ні 420 А?5 АЗО сів Аїд іви Ні аб нів тус отвгобЇп їуз б5ег іецй б5ег гей бак Рго а35 до 445 «у «105 22 «2115 449 «2123 РК. «23» агтітіста! «паО» Й «ге3» с213810, Незуу снаїп, Ти1ї1 Тепукй «4005 27 сіп ма! сій бе бій сій его біу зек бій сен Уа! Був рого 61у Аїд 1 З юЮ 15 зЗег маї уз меї 5ег Суз 1у5 Аа бек о1іу Туг Тс РП ТР бек Тук тус ІЗе ніб тгромаї Гуз сів Аг Рго біу біп Ту ви сів тер опе біу тгр їі тТгроРго сіу дзр біж баб твгорух туго Аза ів Ага вве
ЕВ бо їут Фу туз тВт ТАК гем ТагоАза Абзросуз бег бер бег тик АТа туг 70 75 ва
Мет Ре їеп чего бег Гей Таг о бег бій Ар ово діа Уві Тук Рйе Су 85 0 25 діа бег о вго Меж ї18 ТИгОоРКО АБИ туго А)а Меї др туг Тгр о біу сп 100 105 130 сіу Аа зак Уді Тк Уві! бег бер Аїа 5ен ТВг о їуз сіу Рго Зег Уві 115 120 125 вне рго бец АЗа Рго 5егобег осу5 бес ТК о5ег сту ц1у Тс А1а Аа 1350 135 130
Ге сіу Суз їви Маї (уз АзротТуг Ре вго 010 Рго маї їй маї 5ег 155 150 155 т180
Тгтр Ази Яег обіу АТа ге) твгозЗеєб о біу маї ні тигб Ре Рго Аа ма 165 170 175 їезш бій чего бек біу цез тує бег'івби бег озег уаі! ма! тис о Ууаії бго 180 185 190
Бек бег 5ег зїен біу Тк обій тег отук те Суб АБпоуді АБ ні Гу 195 200 205
Рго зег дей тТпгогГув маії д5ро уз Аго Уа! бій рго Гуз 5ег бСуз дер 210 215 220
Гуз Тйгонів ТвгоСубє рго Рго Суз го Аїа рго біб ви зву б1у о1у 228 250 235 гай
Бго бЗег та! вве їец Ре Рго Рго Бу5 Рго уз Ар тйг ге мет ї11е 245 250 255
Бек дра так овго сту ма? ТйгосСуях Уа! Маї Уа) Ар уві бек НІ Ти 250 265 270 дп оРКО бій Уа! Суз вп АБ Тгротук маії АБросіу ма) бін ма! нів 25 280 285
АП АТа ух ТВ Гуз Рго Ага зіц сім осіп Туг АВ бБего те туг Ага 290 295 300 ма! Уаї 5ег Ма! Гей тпгоУаї їеу Ні сіп Або тТкРробец А5п о Біу гу 305 Б) 515 320 сі туго їуз сСу5 Гуз Маї бег Ап Гуз Аїд іїен РГО АТа Рго тів січ 325 330 335
Суб тис ті 5ег ух АТа Гу Ф1у біп о вко АкЯ сі вго сіп о маї тує зо 345 350
ТК сей вго го бет Ага бій сі) Мет Тс був АБпобівВ Ма! 5ек веи 355 зво 305
ТНкЕ оСув сей ма! Су п1іу Рйе Тук вго чего Ар те Аїа Уа! Її тор 370 375 35О0 сій бек Азп о біу бій Ро біз дяп Ап Тут уз Тс ТК о бго вко ма! 385 390 395 400 іви дер бек Ар цзіу бек Ре Рне ге тує ек Гу Бей тик ма! Ар 405 0 415 ух зег Аго тТгробіп о сіп біу АБйй ма! Ре баг сСув Зег уаї Мет ні 320 425 30 би дія фен Ні5 Ап Ні туг тиб шій гу бег ген о бег ве) бек Рго «435 ай 445 віу «210» 28 «1 214 «лій» РТ «13» агтітіста! «220х що | шо «23» сеОвк2, 1Т9БЕ спаїп, ТШ11 Тепокв «00» 8
Ар отіє біп Мер о тБк осзій тТАг отТйг обеб зак греч обег АТа бек їгц у 1 5 10 15
АвроАко ма! тпг ї1е б5ег Суб Агу Аза чего бій АБр о т1е бек Су5 тує іїеу Ази тиротук сій с1п бій вго АЗИ осіу тве оїТе руб Гей без Те тук тук тег 5Зекг Акдф осей ія Зегобіу маї Рго 5ег Аг Рйе 5ек о1у
БО
Ага біу его сбіу Тит дер туго бег огец тТВтг їі баб Ав Узі сів бій 55 70 75 ко
СТ АБр оте сАїа твготТук Рйе Суб сіп біп сіу 5ег Тгобей Рго тує 85 90 95
Те бе сіу сЄ1у о1у ТВгогуб5 гей сі) їіе уз Ага ТВгома! Аів Аа 100 105 150
Рго зег Уа! Рйпе т11іе Рпе РРО Рго Зак Ар с1и 51 Бей іуб бе о1у 115 1285 125
ТАК дія Баг оуа! маї Си ву їец Аби Ап оРВе тує рго АгЯ бід Аї1В 130 135 140 уує уаі біп гр уз Уві дер Азп А1а Бен бій бег біу АБп бек спіл 155 150 155 що бій Зег о ма1! УР обін сій Ар бЗег іу5 дер бЗег ТИг Туг Зег іец 5ег 1і1655 Тл 175 5ек твВг беу твВг спец 5ег о цу5 АЇа Азр тує Бі уз Ні уз маї тус 180 185 190 діа сує бі смаї тйг Ніз бій біу цей зеко5ег рго ма! Таб о буз 5ег 195 200 205 вне Аби Агоа с1у см Су 210 «21025 29 «2115 214 «2123 РК. «23» агтітіста! «паО» о Й «ге3» с212511, 1З1Овж снаїп, Ти1ї1 Тепутй «4005 29
Азр Тіе біп меї тТВгосій тВг отв бек обеє їец о зег Аїа 5ек бе су 1 5 10 15
АВ Ага Уа! те ої1е бве Суз Ага діа 5ег сій Ар о їТ16 Авп оБуб Туг цен дп тТгротукє сій біп сій Рго А5робіу тс омаї у« ве вбей Те 0 45
Туг Туг Таг о бет Аед ем нів бегосіу маї рРго бек Ага вне бек (1у
ЕЕ бо і
Ага Фі1у бег біу тс Ар оТуг бег о бен тТАг о ті 5ег А5лп ге їй си 65 70 75 80 біб А5р оті Аїа тик Туг РНе сСує бій віп оіу 5ег ТИг бе) рРго Туг 85 0 25
Ти оРВе сіУу сіу біу ТНгогуз без бій її см5 дго тис ма! Аїа АВ 100 105 10 вго Бег мат! РБе ї1е РМе Рго Ро Бей Ар зіч 01й грец був Зек 01у 115 120 125 тНк Аа его ома1! Уаї Суб сей без АЗп АБИ Ре Туг РО АгЯ ТЦ Аа 1350 135 150
Гуз маї сій тер ос уз уаЗі АзродУв Аза івеу о1п Зегб біу А5п озеро б1п 145 15 155 та0 сі заг оуа!ї такт бі сій Ар о беб о гбу« АбБр о5ек ТВг о Туг баб о гви 5ег 165 170 175 черг Тйгоїєец твгогецй бек гу А1А АЗроТує зів іїу5 нів гу уаії тус 180 185 190
Аїа суз ій ма! тйг ні5 бїп сіу бе б5ет баг о рго уаї тТиг уз 5ег 195 200 205
Рпе д5п Агу біу б1М Сух 210 «2105 30 кгіїз 214
«212» РТ «13» агтітісіа! «го» | й , «вда» сиїЯКЕВ, 1Я9вЕ сваїя, Тм1і1 Тепотв «А» 30
Азр її біп Мем тиг сій Тс тб обевг бЗег їец 5ек Аа бек се соту 1 5 10 15
Азродйга ма! твг оРНе 5егосСу5 Агу Аа бек бій Ар о т1е бек обу тус
Сез Ази тгротук бЇй біб біп вбго А5роб1іу твготТє груз бецч ви ї11є 0 45
Тук Тук тТвВг оЗег о Агд їв нія Зекобіу Маї Ро бег Аг РВе 5егоб1у
Бо
Ага біу чего сі тТиг о дхр туб бек оїеу те сіє тс оАяй бец сім бій 65 7а 75 80 сій Азр о тТе Аїа ТНг оТук вла сСуз сіп бій 51іу бег Аїа ге Рго туг 85 90 95
ТВеовйе бі б1у б1іу тТйгогув Се біц ї1іе уз Ак так оМЗ1 АТАа Аа 160 105 110
Рго Зег о маії Рпе 311е РНе Рго Рго Зак АБЗр ої бій ред обу бек су 115 120 125
Тс АЇа Зег маї маї Суб гсец Гей А5п АБИ Ре Туг Рго АгЯ 51ім Аа 130 135 340 їм Ма! біп тер огув уаі Ар д5п А1в ген бій бек б1у А5п бек сія 145 150 155 160 бій чего ма! тве бів біп дер бег уз А5Зр чес Твг о Туг бай о веуи Чет 165 170 175
Бег о тВг оїен тВт Бе) бег оїу5 Аза дер тує сім гук ніш гу Ма! туг їБо 155 1990
АЇа сув сій уа| тпг нія ій біу фей бек овзег о рРгГО Уві тТвеоїуя 5ег 195 200 295 впе деп Ага с1у 61 сСм5 210 -2105 31 ейІїї1 214 «212» РЕТ -ВІ13» асжхітісів! ке» Й жхейазм сй1905, Зідйж сбаїт, ТІ Тепосй «АВ 31
АБр оІїе сіп Мебє тйг осів тйготвК бек очвг бен бек АТа беб ву о1у 1 5 16 15
АБроАго уаї тТвкК ї12 бек о сСу« Агу Аза его бів Аврої1е бек ру туг 20 275 30
Мен Ап отгротук ст бій біп РКО Ахробіу тк оУуд! буз їей без Те 35 40 45 тТук Туг тТВг бек Аго Ге ніб бег ошіу Уа)! Рго 5егоаАгу Ріпа бек о с1у 50 55 50
Ага чіу бек бі тк о Абр тук бЗег сей твт Ї18 5ег А5п їеу ЄТц с1л 55 70 75 що бій д5р оті АТа ти туго РНе су« іп біп сту 5ег ТВговез Рго Туг 85 90 95
Те ве біу біу 01у Тиг о уз без бі ї1в ух го тТагомаї Аа АТ 100 та5 1310
Бго бег ма! Ре 118 Рйє РгОо Рго бек Ар бій бів Гео вуз бек 01у 115 120 125
ТИК АТа бер Ма)| Уаї суб сей це Ай Ап РВе Туг о рРго АгЯ ЄіЦ АВ 130 155 150
Гуз ма! сій тер оСує Уа! Азр Ап Аїа їви бій его оБіу Абп 5егк бій 145 150 155 150 бі бегоуа! тТвгос1й сів д5розеє їу5 А5ро5ег Трготук бек їв) 5ег 1655 170 175
Чек Так оїец тТаг осей озер огух АЇз Абротук ів Туз Ніз гм маї туг 1850 185 199
Аіа су» сій ма! трг о ніз біп біу їец бек 5ег Рго уаї Тпг Гу 5ег 195 200 205
РНе азп Ага о1у 01и Суб гій «105 32 «211» 214 х212х РЕТ «2ї3» агіійбісіа! «г2гох «23» с?13В10, 1іойж спаїв, тТи11 Тепукй «400 32
Ази жів бій мек тТьгобіпй Те отТве чеб бек оїву бек АТа бек ге ФУ 1 5 10 15
Ар Ага Уа! тВт 11е бег Су Ат А1а Бек бій Ар І1е его гу туг зо сен Аби Тгротує о1в бій с1в вРго А5росіу тВг от16 Су еп вец 12 тук туго тиг Бег Ага Бей ні заг обіу маії Рго Зак дго РВе бек Ту 50 да оіу зег о сіу ТНг одхо Туг бек о їец тп їТе тТпг Аза Бей 10 ой 65 70 їх 5о0
Фі Азрот1е Аїа тпгоТує Рйе Суб бБіпосіп шіу бег АТа Бей Рвго Туг 85 90 95
Те вп сіу біу с1у ТНК о Су« без бій ї16 1уб Аго ТК ма! А1в АВ 100 105 що
Рго баг уа!ї Бе ї18 вне рго рРго 5ег ар обі ст Без бує чего обу 115 120 125
Твг Аза беє маї Уа)! Суб грец без А5п АБИ Рйе тує Рго Аго бїї Аза 130 135 140 уз Уаї сій тгробуб5 маії А5р Ази Аа тей сів его о1у дп бак 518 145 150 155 1650 сім бегоуаі тТпгобін сіп А5р бяг їух Ар о Зег ТВгоТуг 5екогецч баг 165 170 175 бес тиг о їеч тик оте) бек їу5 Аза Ар тує сі губ ніз груз Уаї тук 1850 155 1990
Аїа суз біц Уа! ті ні сій віх їеи бегозег рго Узі тТвгогуя 85ег 195 20 205
Ре АзпоАго б1у 010. Сук 210 «20» 33 -й1ї1» 120 «вій» РК «13» агтіісіа! «вад» І «223» БЕ20О8Б2 (маг.1) пеаму сваїп, МИ -3х 33 сіп маї біп гей ма? бій беб сі1у Аїа сій Маї їує був Рго Фіу Аа
Ей 5 10 15 чек ма! уз маї бег Сув ух Аїа бек піу Тук ТБг РМе ТЕ Бек о туг
Тук мес ні Тгроуві АкЯ біп Аїа овго Сі б1іп Ту ев бій Ткр Ммеє сіу їіе ї1їе ТгроБго сіу А5р пі бек тТВт Зег туго А1їа біп Гуз рве 50 сій сіу Ага ошмаї тб оМмеї твгодга Ар оте его твг о Зеботйг омаї тує 55 70 75 о
Мет сі зей бер 5ег гей Аго бег о сіц Ар Тит о АТа ма! туго тує Суб 85 90 95
Аїа заг рга Мет ї1е Тит орго Ап отук А1їа Меї до тує теробїу 1 100 105 135 еіу тиви уві! ТіК Уді бек 5ег 115 120 «210» 34 «й1ї1» 120 «вір» РТ. «213ж агжібісіа! «ре» «фе3У Вж2ОБР? Стак. 3), УН -3005 34 сіпома1ї сіп теп уаї сій его сіу Аза си ма1і буз Куб Рго сту Аїа 1 З 10 ї5 зег ма! їу5 Мет бег сСу5 ух АТа 5ег о сіу Туг ТНг РНе Тс 5ег туг 20 25 30 тТук ті тТуг тТероуа? Гуз біб А1їа Ро сту дів 61у без біц тер Ген 35 40 45 сФіу тТероїіє тер овго 1у А5р о спіу зер ТБгоіуз Туг Ав бій губ опе 5О 55 | 50 сіп оіу ду ма! тТйгосез тТпг о АЇа Ар огух5 бек Зевг АВ ТАК АТа тук 55 70 75 о
Мет впе іїієй 5ег 5ег Гец Аго бег бі АЗр о тпг о АТа маї туг вбе о сує 55 90 95 діа б5ег рго мМмеб ї1а ТНг ого д5потук Аза мет Аза тує тер б1у сій 105 105 115 сіу таб оієц Уа! ТК Уві 5егоб5ег 115 129 «М» 35 «й1ї» 307 «вій» РЕТ «РіЗ3» агжітісіа! «го «23» ВЕ208Б2 Суаг. 1), УЮ «002 35
Ар оті біп Мет отв зіп обЗег Рго бег баг тен баг АТа бек маї бу 1 5 10 15
АзроАка маї тТвгої1Те Те оСух Аг Аза его об1ів Азротіе бек гує туг 20 25 30 дей ап отгротук бій біп Сух рго віу уз АТа Рго туз ви ви Тіє 35 40 45
Тук Туг тТВг о5Зег бег гСез біп о бегосіу уаї Ро бег Аг вйе бек ооіу 50 35 50 век біу Бесг бі ТВг о Абробйе ТВг рей твг о ї1е зег бек бец сій Рго 55 70 75 80 сш дер РБе діа тн Тук о тук Суз сіп біп с1у Зег ТВгобеу Рко туг 85 90 95
Тс вне оту С1у б1у Те обу Уа! сім 516 губ 100 105 «105 36 «-511. 107 «12» РЕТ «13 актійістіа! «20х «ф23ж Вп ОВЕа Смає.33, М. «300» 36
АзроїІ18е бій мек тн Осій забо вро бек бак сви его Аїа Бек ма? пу 1 5 10 15 дер Ага маї твг о г1е 5ег Су АгУ А1а бек бій Абр отіе 5ек губ туг 20 25 30
Мер дзи Тгротує сп сій уз го с1іу су АТа Рго руб бе бец їЛе чо а5
Тут Туг о Твбгобег Аг Ге Ні зег біу маї Рко 5ег АгЯд Ре 5ег 01у
Бо
Ага біу чек зі тб дер тує Зег гей Тнг о 11е бег Ай іп сіп вго 55 7о Їх 80 сій а5р вне Аза трг тує Ре Суз бій бій оту бек тк Бен Рго тук 85 90 95
ТВгорвпе сі1у Б1іУ біу твгогрує уаї бій 3Те Гуз 160 105 «210» 37 х2їії» 445 «Е1й» РЕТ «213» аттіста! «бо» й | Я хвдЗ» пхгОВБЕа (мак. 1), Недму спаїп, ТТ Лепдїв
«ЩЮх 37 бій уаї бій зем маї біпозек о біу АТа бін Уа? суб бує Рго бі1у АТа 1 5 10 15
Зег уд! їу5 ма! 5вг Суб Муз Аза бек с1у Туг Тиг РБе те о 5ек тис 20 25 30
Тук меж нії тТгроуаії Акод біп ліа Рко 531у бій сіу бец бій Тер Мет 35 40 43 сім т11е т1іе Тгрорго зіУу А5р о зіу бег тк о5ег туг Аїа сіп Гу РВе 50 55 50 сіп о біу Ага маї ТНК о Ммеї ТВг Ага Ар отвг о 5ег тйс бек отв маї Туг 55 7О 75 80 меї біс ієемн бек бег Гей Ага бегобін Авр таг о АТа ма! тує тукосув 85 90 95 діз 5ег вго Ммеє Т1Є ТНК РРО Ап Тук АТа Мет Азротук стр ту б1я 100 105 о сіу тйгоїєц ма! тт омаї 5ег бек Аїа Зег ТНгОоїу5 сім рго бек ма! 115 120 125
Рпе рго іец Афа Рго бек обег Гуз 5Зег Тпгобек о біу біу Лис Аа Аа 130 135 346 цей б3у Суз їви ма)! су5 деротук пе вро Зі вго уві так ма! Зак 145 150 155 160
ТРр Ази Зег б1іу АТа сей тк обегосіу маЗї ні ТВгоРНе Бго АТа ма! 165 170 175 цен бій бек бак 01у ей Тук бе ве) бек бег Мма1ї Уві ТНК омаї во 180 185 190 зег чег 5ег їец 51у тТийг осів Таеотує 116 Суз дв о Уді Адчп нія Суз 195 200 205
РГО бег А5п ТВ Гуз Уаії Ар уз Акд Ммаї б1й РгО бух Бек Су АБр 210 215 220
Гу те ні ТВ оСуз вго ргО Су ВгОо АЇа рРго сів гей ге) бі с1У 230 235 240
Бгто зег чаї ре іей вРйе Рго Рго Гуз РгОо ЦУ5 Ар о ТИйгс бе ме їТе 245 250 2535
Зег Ага Тег о рРго бій Уві Тг Суб Уа! маї Уа? Ар ма! бек ні 1 260 25 270
АБр РКО сій маї уз Рпе Ази ттротує маї Ар сту ма! бі хмаї нів 2/5 280 285
Ази Аїа уз ТВг ос уз Рго Ага біз біб бій Туг Аза об5ег їй туго Ага 290 295 300 уа! Маї Яекоуаї цем Тк Ма! Сецз нів сіп яр тТгр без Аза с1у зу 305 з1й 315 з2а сіш тТук губ Суб ух маї бе АЙ іу« АЇВ Ген Рго Аза Рго її б14 325 330 335 цу тйг оте бер гу АТа цу сіу іп РКО Ага бій Ро бій маї тує 340 345 350 тТВкЕогецш о рго Рго 5ег Аг біз бій мес пт бух дай бів ма! бег їв 355 зБо Зб те Суб їеч ма! цуб5 біу ва туго Рго 5ег дер 118 АТа ма! бі1ц тер 370 375 зво бій бегодяп б1іу б1іп Рго сі АБпП АБИ Ту Буз ТВг о Тйг о Рго РКО Уа! 385 390 395 400 цей др 5ег Азр У 5вгоРНе РБеоівуи Зук о бвг о Буб5 Сец ТНК ма! Або 30 А10 415 мує Бек агу тгробіп бій сіу дзпоУв! Рпе 5ег сСуз бЗег ма! мет нів 420 425 439 сі АТа фе Ні5 Ап Ні Туг тр об1й ух Зег це) Бег бец 5ег. рРго 335 440 445 оіу «2105 38 «21ї1х 448 «212» РЕТ «213» вежітісіа! «Ей» «223» На2О8Е?2 (Уувг.3), Неаму спаїп Ти Тепосй «00» 38 сій маї біпоіїєн о узі бів б5еб Ту АТа біц маї Гуз уз Бго сіу Аа і 5 10 15 зеє ма! уз Меї зеб о суз кує Аа бер сіу ту тТигоРНЕ тив бек тус за
Тут жів туг тгрома!ї мух іп Аіа го 6Є1їу сій сту Сен Бій тер бен сіу ттр тів ТетроРго с1у Азр о біу 5ег о твг Гуз Туг Ап бів уз Ре
Ж 50 біп сФіу Ага маї тег Гей таг Аза Ар осу5 баг бек Ази Тк о Аїа тує та 75 о меж вне їси сег бар іви Аг Зек сій Азр о ТВгОАТа Уа! Тук Рле су 85 чо 95
Аїа бБег рго Ме 11е Тис оРКО дзпотТуг А1іа Мет А5р тує тер обіу бій 100 105 135 біу твгоіеи Уа)! ТНК ома) заг бек А1а бак тб гу бі рРго 5егоуаї 115 120 125 вне рго геи Аа Рго 5его5ег губ бе тик Зег о1у сім ТАК Аа АТа 130 155 140 іез сіу Сузх їв уві губ А5р о тук Ре Рго Бій Рго ма! ТВкохмаї 5ег 145 ЩО 155 1650
Тер Ази его оіу АТа ге Тйг бек біу маї ні тийг РБе Рго Аївоуаі 165 170 125
Се бій бек бек СТУ без тує бек оіец чего бегоуаї маї тає маї Рго 180 185 190 зек баг бЗег цен су Тнгобіп тВкотує тів суб АБ ма! Авпонів губ 195 200 205
Рг бек АБИ ТИг оту маї ав Гуз Аг уаї 5) Рго гу бек Су» А5р 210 21 270
Суз тйгонія тк Суб Ро РГО Суз РГОо АЇа РРО СТИ Бец їв сту бу 25 230 235 240
Рго Заг уа! Рів іен Ре Рго Рго ух Рго ух АБроТНгогец Мех Тіє 245 250 255 бек Аг твгоРГО вій мМаі ТВб оСуз ма! Ма? маї Азроуаї 5ек Ні Ти 260 265 279
АБИ оРгО бі Уа! Суворе Ап оТгротТує Маї АБросіу Уві «іш Ма! Ні 275 280 255
Азп Аза вуз ТВтоГсув о рго Аг біз бі біп Туг дв Зег Тег отук Аго 290 295 300
Ма! Уа! 5ег ма! цен Тиг Ома! Сец ні іп Азр Тероїви Абп біу Гуз 305 310 315 320
Їй Тут уз Суб уз ма! бег Азп Су АВ ївец РГО Аїа РКО ще пт 325 330 335 їує тТаг о їТе 5ек гу Ата цу СТУ бій Рго дка іш РО біп уаї тує 340 345 350
Тк осей о бго Рго бег до біц сів Меє ТВгогбуб Аза бів Уа! зер оцев 355 350 365
Тік Суб ем ма! уз сіу рйе Туг орга чек Азр тів АЇа Ма! «1 тер 370 375 380 сій 5ег А5п о піу біп о Рго біц дб5п Ап тує гу Тс о тТпг оРгоО Рго Узі 385 390 395 400 іей др 5ег Ар б1у бек рве ве ген Туг бег губ Без Твг ма! Аб5ра 45 10 415 цу5 5ег дго тгробіпй сіп офу дяп Уа! Ре заг Сує бек ма! мет ні 425 425 430 сін Аїа їєй Ні о Аза нів тус тибосій бу5 5егоїецй Зеб реву бек вго 435 440 445 су «210» 385 «її 214 «їй» РАТ «її» актітіста! «20 «223» Вх2ОВЕй Смак. 13, Тож спаїп, 11 Тепоєв «300» 39
Аьр оте сіп Межк тпг сій Бек вго Зес бер оіен 5ег АТа бек ма! Су 1 5 10 15 дер. Ага Маї ТвгоїТЛе те Суб Аг Аїа его бій Ар ї112е бек у Тує бе Аби Тгротук сій біпогуз вто біу у АТа Рго вуб5 Бей їв пе
Туг тує тнг обер ви гей біпо бек біу маф Рго Зег о дка Ре его о1у 50 чек біу чес осФіу ТВг одер Рйе ТК огеу Те ї1е Зег о 5егобеу сіп Рго 65 7 75 50 сі А5роввВе Аза твгоТує тук о Суз віп біл об)у бес Те Бей рго тує 85 90 95
ТВе овйе сім шбіу о1їу Тиг обу уаї сбіц 311 уз Аго тпгоУаї АТа Аа 100 105 о рго 5Зег уді Рпе їі РПе Рго Рго 5ек о Азр бій бій є) Ту бек б1у 115 120 125
Тиг АТа 5ег ма! Ма! Суб5 тез гей А5п ОА Ре туго Рго Аг еїш А18 130 135 340 їу« уаї бій тгрогбув мі дер Аз А1а іен 01й бек 01уУ Ап бек Ф1й
145 150 155 160 бій баб Уа! ТВ осів бій А5робегоіфуз Ар озег Ти Туг бек грец 5ег 165 лі 175 зак ТЕ реп тТвЕ єп обег Суз Аа АБротук сім туз ні бу5 ма! туг 1850 185 199
Аіа сСуз бі Уа! Тпе нія сій віу Сей бегобег рРго Ууді Тако бує 5ег 195 200 205 вне азп Аго Є1у Ти Суб 210 «210» 40 «21ї1х 214 «212» РЕТ «213» вежітісіа! «Ей» І «223» На2О8Е?2 (узвг.3), Тов спаїп, Ти1ї Зепокн «00» 40
Авр їі біп меє Твг осів бег РгоОо 5ег бе їєн 5егАїа бег уаї У 1 5 ик; 15
АБО дго Уа! тк ожхіе Бек Сує Ага АЇа бБег сій А5р їі бек уз туг
За цей деп отгротує їй сів ту оРгО біу бу5 Аїа Рго Су5 Гей бен їїе тує Туг тВг бек Ак ем ні 5ег о сіу Уа) Рго 5ег Аг РМйа 5еє С1у 5 50 ага сі1у бЗег сіу ті АБЗротуг бек оіви Тйг оТів 5егоабп бе) б1іп рко та 75 ва біЧ о АБроРлйе АТа ТіК тус вне сух сій 5іп СТ1у бег ТИг о іеу Ргостуг 85 КІ 95 тис вне біу с1у б1у Тс о су5 Ма! Сі їіє Су5 деку тис Уа! АТа АТа 109 105 135 вго бег ма! РБе чІ16 РйЄ Рго Рго 5ег Ар аїм с1в о гСец уз 5ег у 115 120 125
Тиг о АЇТв 5егоуді хаї Суб їец о їей Ап о Аа РНЄ тТуг РгО Ага и Аа 130 135 140 му5 маі біп тгроцуз Уді А5р дп Аа гей бій бегозіу деп бек обівй 145 50 155 1650 сій бБег оуа! зтпг сОТц зіп АбБр зер зуб Ар 5ег ТИйг о Туг Бек Гецу 5ег 163 ді 175 чек тТйг івеи твпгоїей бек огуя Аза АЗИ тує С уз ні ух маї Тук 180 185 90
Атїа Суб сіш маї тт нів біп о сіу ген бвгобек рго Уа! тТйг обу бек 195 200 205
Ре Ап Ага с1у сом Суб 210 х210» 41 хг1іїх 150 «Е1й» РЕТ «213» аттіста! «бо» й хз» па208Б2 (уаг.2) пейму снаїй, УН
«ее «22їх МІС ЕЕАТЦВЕ «ой» (203,20) й «223» Ме там бе геріасей Бу ма! «вд «йдї» МІС КЕАТОВЕ «дей К3А).,(34) І «свеЗ» ї11е мау ре геріасей бу мех «и «291» МІ5С ЕБАТуВЕ «вий» К35)..135) І «223» Туг тау Бе геріасвй Бу нів «220» «гі» МІ5С ЕЕАТЬВЕ «гра» (383,.538) «223» їуз тау Бе гарідсей Бу Ага «220» «гві» МІЗС РЕАТИКЕ хейд (483..С48) «23» 16; тау бе геріаєві Бу меє «еаО» «і» МІБ5С РЕАТОВЕ «фа?» С50У..0503 «223» Тгир отау Бе геріасей Бу ї1е «220» «ав МІБС БЕАТУКЕ «ж С59У..С55) «23» уз тау бе геріасесі Бу б5ег «280х «їх МІС БЕАТУВЕ «йдйж 613..4513 «23» Ал тау Бе геріасей Бу Аа «20 «БЕ» МІ5ЗС БЕАТЦВЕ «дах 623.62). «23» бів та бе геріасей Бу біп «220 «21» МІ5С ЕЕАТНВЕ «ййй» СУ0). СВ «23» зей тау Бе геріасей Бу Меє «дей «221» МІ5С КЕАТуВЕ «ВИЙ Стйу.
Си «23» Аа ау бе геріасей Ву Ага кад» «221» МІЗС КЕАТИКЕ «вад СТАЛО «йиЗ» 1у5 тву ре геріасей Бу тк «ог «21» МІБ5С КЕАТИВЕ ей (703,76) «223» Бер тау ре геріасей ру ти «й» «Рі» МІ5С РЕАТИКЕ хай (77, СУТ «3» АБ тду Ме геріасей Бу зег «ТЕЙ «21» МІЗС БЕАТИКЕ хвййв СИЗу, 0793
«223» АТа тау бе геріасей Бу ма «ее «21» МІЗЄ КЕАТУКЕ «ой» (823.82) й «223» Ре тау Бе геріасей Бу си «вд «йдї» МІС ЕЕАТОВЕ «дей К353..095) «23» вне шау ре геріасей бу туг -002 41 сій Уа! біпоїсу Уа? іп обег біу АЗіа бі) маі їу5 груз Рго су Аїд 1 5 10 15
Яегомаї Гуз Мет бек суб ух АЇа бек с1у Туг ТВг о РНе тйг об5вг о Туг тук тТіє туп тгроУуві уз біп Аїа Рга сі біп сту без біч тер зей
Фіу тер ІТе тгрорго біу Азр о сбіу 5еготВгоБу5 туго Азп бій Бу РНе 35 50 сій біу ага маї Тс оре) ТВсоАТа АБрогув 5еговег дей ТК Аїд Тук 70 75 80
Меї Рйе ївц хек о5ег оре Аг зе осі) А5р отпг о Аїа уаї тТуг Ре Су 85 90 95
Аїа бЗег Рго Меї ї1Їе Тйг овго дзй Туг діа Меї Азр Туг Тер Є1у сп 100 1605 15 соіу тиб фей ма! Тпг Уа? бек обес 115 120 «ЕМ А «її 302 «їй» РАТ «2І3» агтітісіа! «й20х «й23» БЕдОВЕР Смак. 23, 14ДВЕ спаїп, МЕ «вай» «ЕЕ» МІЗС ЕЕАТОВЕ «ВайУ Си). 223 -2235 Бег тау Бе геріясей бу тТвг «Ох «2215 МІС ПТЕАТЦВЕ «дйй» (533..(53) хгй3» Ага тау Ве геріасвй ру 5ег «ех «25їУ МІ5С КЕАТИВЕ «йод» (5535..0553 «23» нНіз мау Бе гвріасед Бу 1 «80» кейї» МІ5С БЕАТЬВЕ «гг» СБУ, с653 «223» Ага ау ре геріасва Бу 5ег «ейх ха2іїх МІ5ЗС ОКЕАТИКЕ кеййм К713..171) «23» Туг шау Бе геріасей бу Рве «бао» хобі МІЗСОЕЕАТУНЕ
«орви СУ у: 23 «йеЗ» его тау ре геріасей Бу тНг «20» «2дї» МІЗС БЕАТЦВЕ «ай» (77у: и й «23» АБИ шпау Ве геріасей Бу бе «20 ейеїж МІЗС ТЕАТОВЕ «вдйт КВТ). «223» Ре мау бе геріасей Ву туг «ЩЮ» 42
АБроїіє біп Мет тНг сій бегорго бег чегоісн 56г о АТа бек маї су 1 5 10 15
Азр о Агя уаї тьг о їТе бек оСучз Аго Азіа Бех сій Ар отіе бек цу туг 20 25 30 дез ап тир отук біп сій Сук вго біу уз Аїа Рго уз Бей еу тіє 35 40 45
Тук о Туг ТВго5егоАгЯ Гео Нія 5егобіу маї Рко бег Аго РНе 58 бу 50 55 Бо
Ага віу бБег йбіу ТИПг одер о Туг о бег їеу ТВйт Ії бегодявп Бец п1й Рго 65 70 75 во сій дер о РБе Аа тВготук ве Суз сіп бій З1у зек Тир о бей РКО тук за 95
ТВ вне соіу біУу 1у Те чув Уа! Ту 1 ув 100 105 -910ю 43 «211 329 «їй» РАТ «її» актітіста! «20 «?2З» Сойзжавтї ботаїй СН) 1961 «МО» 43
АЗіа его ті о їуз О1у Рго бек Уа| РВе Рго ей Аїд рго Баг бе ув 1 5 19 15
Бек Твг заго біу о1у Твг АТа АТа іец с1у Суз сей маї Су5 А5ротує вве рго бій Рго ма? тігома! Зекотгродяпо5ег соту Аіа Бей тпроБег сФі1у ма! ні5 таговве рго Ада уаї ей сій 5ег зЗег о біу цем Туг 5ег 50 іїецп бег обег Уа! Уві Тк Ма! Рго бек зег о 5ег Гей Б1у Таб об таг 65 7а 75 50
Тук їіє Суз А5п Узі дев Ні Гуз рРго бетг Абп ТВгс був Ма! Авр кує 85 90 95
Акад ма! сій Рго ух Баг Су д5роїує ТБт ні Тис Суз Рго Рго су 100 105 о рго Аза рго бі іен оцей су біу го 5Зег Ууаї Ре грец Ріпа Рго вро 115 120 125
Вуз го фу АБрОтТИг Гей Ме їі6 5ег Ага тик оРго бій уаї ТВ Су 130 135 340 ма! маї Уді Ар о маї бек нів біц Ар РРО 01 Ма! ух Ре Авпотгр
145 150 155 160 тус Ууаї А5р о сіу маї сім Уаї ніс Аби Аа 1у5 тий о рує рРГО Або ати 165 170 175 ід оїй Туг А5п бек отйб Тує Ага Уа! маї бегома! бец ТНг Уа! цей 1850 185 199 ні софй Ар отгр сен А5п с1іу вує бій Тує бує Суб Суб ма! 5егодей 195 200 205
Гуз Аїа гей РгГО Аїа РО Ті бі) вуз тТпк о ІТе Баг Гуз Аза уз 1у 210 215 2270 сіп РгО Аго бід Рко бій ма! туго твг ге РКО Рго 5ег Ага см б1н 225 230 235 240
Меї тату Ап спо уаї бегоїеу ТВк Суб іенома1 губ б1у пе тує 245 250 255
Рго 5ег Ар зів АЇа ма! біц Тер обіц бегод5п су бій Рго 41 Ав 250 255 27
Ази туго уз Тр ОТГ оРгОо Рго уд! гей дзр 5ег Ар сіу зег РНе Рле 275 280 255 їв) Тук Бе? губ ем тк Ух Ахроіув 5ег Ага Тгр осів біп сіу Аа 290 295 БІ)
Уві РБе 5ег Суб 5егоуаї меж ніз сій АТа гей нія АБИ МІ тує таг 305 310 315 320 сій су Зег іє 5ег осей 5ег Рго пу 325 «105 44 -911- 325 «12» РЕТ «213» агтійісіа! «20х «?23ж СопвтТавт ботаїп СУН) то64 (5228) «300» 44
Аіа ет тк оїуз о1іу ра зеає омаї РВЕ вго ви діа Рго Суз 5еБ Ага 1 5 10 15 чес тйг зако бій бек Тиб АТа Аїа бен сі1у Су5 Гей Уа! уз А5ротуг 20 25 30 вне Рго бі Рго уві тйгоуа! ек оїгроАбп о 5ег б1У Аза бе г 5ес чо а5 сіу Уаї нНі5 тТВт Ре Рго Та ма! се сій 5ег 5ег сіу Бей Тугк 5ег
Бо іє) 5ег бек ма! Маії ТНг ма! го Бек бвгоб5еє сво б1у Тс огрув так 55 7 5 80 тук о тиг Суб деп Уві дер Нія уз Рго че Аби ТВгоСув маї АБр суб 85 90 95
Ага ма! сій бек тує Тук бу Рго Рго Суб реа Рго Суб Рго Аїд вгО 100 105 110 сін вне зей біу б1у Рко бек Уа! Рле бе РПе Рго РгО їу5 РКО Бу5 115 120 125
Авротйг оїецч Ммеї ї1|е бек Аго твВг ого піц маї тваг оСуз маї уаї У! 130 135 140
Ав о уа! 5ег біп бін Абр вго біз ма! бій РБе Аби Тгротук Уа А5р 145 150 155 160 біу ма! бій Уа! ніз А5подіз Бу« ТВговує Рго Ага бій сів о1п вве
Ї 165 17 175
Азпобег Тис о ухг Аго Уві ма! бегоуа! цен ТВг оМаї Сем Ніз біп Ар 150 185 190
Тер сечо Аби сіу гуз сій Тук Гуз Суз був Уаі бег Азп уз б1у Геи 195 200 205 вго бБег ер 312 010 мує Те Тіе бек пуб АТа уз Бім сій Рго Аго 210 215 д2гй бі РО сій ма! туго таг оСец вго РКО заг бій сій бів Ме тр ої у 225 230 235 240
Ап о оій маї 5ег Гей тнг оСуз без ма! Гуз б1іу Рре тук рго 5ек Аве 245 250 255
Тіе Аїа ума! бін о трроаіц Бек Ап біу бій рго сф Аяв Абпотук вух 260 255 27
Те отйг ого бго Уві Ге) Аб5роЗеб Азр о сіу 5ег РБе Ре гБец тук 5ег 275 280 285
АгЯй тей тВгомаї А5р о губ бег Ак тер бій бі біу Аа Ма) РБе бег 290 295 зо сСуз бБег уаї Меї ні бій АТа сей ні АБп ні туго Тк сій уз 5ег 305 310 315 329 їез бег їєи бак іви сі1у 325 «2105 45 «11» 307 «517 РЕТ «213» агтійіста! «КеОх «Ра3» Потаїай Карра МІ) «800» 45 дга тагомаї Аа Аза Рга Зег ма! Ре т1Їе рРНе РГО Рго Бек Ар оби 1 5 10 15 біпогеч о їух его б1у тпг о Аїа зегоуа! Маї Суб їец гбец Абп А5п РНе тТук рго зго сій АТа ту ма с Тгро був Ма! АБИ ий Аїа семи 01 3 5 «ак боту ап 5ек сій сти бегомаї тВг оби ото АБр о 5ег вуз дер б5ег 50
ТНг отук чего їец бр бек ТВг обєц ТВ о сец 5ег г у5 АТа АЗротук 1 55 7о 75 89 іув ні іу5 маї тут Аїа бух Фій Ма! твг ні ота с1у Бей бек баг 85 90 95 го ма! ТНгоїує бегоРНе А5поАго біу бій Су 100 105 «2105 45 «211» 98 «12 РЕТ хгі5» агтіттісла! «220 «виз» Нитав бдегтіїпе гонм1-48701 «005 46 біп Уа! біп без маї сій бек бі А1а ОН Уві суб рух РгОо біу А1В 1 5 10 15 5ег Уа! уз Уа! бек Суя уз Афіа бек сіу Тупг Те Ре Те беготТуг
Туг Мех ні5 Тер маї Акд бів Аза рРго 5іу оій с1у Гео бі) Тер мех соіу ї1те Т16 А5п о Рко 5егостіу Бім бес тйг бек тТуг Аїа сіп куб вНе 35 50 сій біу Аго Маїс тТвВе Меї тТВгоАга А5ротне 5еготвг обег Тв маї туг 70 75 50
Меї біц іїен 5Зег бек оїео дго Хек обіц Абр о твг АТа маї тує тТукосув 85 90 95
Аіз Ага кга0»м 47 «2115 95 «105 РТ «13» свгвітіста! «ай х «ф23» Нитав дегтіїпе їбкх1-39701 «4005 47
Ар о т1іе бій меж тпг сій Баг Рго баг Бек ге 5ег АТа зек ма! ЛУ 1 5 10 15
Ар Ага ма! тт т1іе Тит Суз Ага Аів бег біп 5ег те Заг бек о туг 20 25 30 іей о АБп тер тує іп сіп о у5 рго сіу гує АТа РО рух ее тео їїе 35 40 45 тук Аза Аїа бег баг оіеи бів об5еб С1іу маї Рго 5ег аг вне бек (1у 50 55 50 зек сіу бек сіу тне Азш о РпЕе тВг бер тик жТе аг оЗевгобеу сій РКО 05 70 75 бо
Зій Ар овпе Аа тик тує тув суб іп сб1іп о Зег тує бег те рго 85 Ко 95 «10» 48 «Ії» 35 «вій» РТ хаї3» вежіРіста «Дей «2235 Нимат дегтіЗзпе тІсн3а»Ої «4005 48
Тук Рйе дер о тук тїгтрошіу бів с1у ТИгоіви уаї тТВгбомаї бег бер 3 5 | 10 15 х210х 49 «11» 12 хеї25 РЕТ й «3» агтійісіа! «гг «23» Нитай дегтіїпе тчохлаАчОї
«А» 49 їец те вве сіу с1у біу Тйгорук Уа! Ти те ув 1 5 10 «й» 50 «1 1367 «вій ВТО -й13» агжхійіста! «й «ййЗ» ТОоБ-18 СВитап) «00» 50 меї цу заг обіу бег с1іу біу спіу бек Бко тТйгобзегогїез Тер с1у ї ей ї 5 10 15.
Сем Рйе іец бек А1іа Аїда ген бегобец Терорго Твг о5ег о біу сі тіє 270 25 30 сСуз бБіу Рго ціу ї1іе Ар ІчІЇе Агу АЗп о АБротук бій сів Бей гу Аго їв) бій АЙ Суб ТВгомуаії Ті бій біу Туг їев віх Ї11е без о беи 116 5о
Звг СУБ АТа бій Ар тує Аг Зесотук Ака ве Рго буз бец ТВ ма! 65 70 75 що
Іїв тиг оїц тує сен гей ген РБе Аго Уаї Аїа о1у Кей бБіц бек ви 85 90 95 с1у Адвр о беп Ре Рго Ап оієв твсома! ї1е АКд сіу Теробуз гей вве 105 105 110 тус АБИ тує Аа сен оуаі Тіе Рйе сіц меж ТВг оди рем вуз Ав те 115 120 125 бу Се Туг Ап Се Аг деп о тіє тТвВгоАго сі1у АТа Те Ако 116 Ти 150 135 140
Гу« Аяп діа дер Ген Суя Туг рец Бек тик о Уді Азр Тер озег їец те 145 150 155 1650 цей Ар Аа Ма! бек Аза дяйп тує її маї СТУ ля Гує ргОо вго Гу 155 171 175 сій су біу Авр гей Суб Рго сзіу тн меж іч біб» Був Рго мет су 180 155 190 сі му5 тТВготвг о їТе дза Аза біз тує А5п тТуг Агу суз Тгротпг тТАе 195 200 205
АЗП оАго Суз іп уз меї Сух го 5ек ТйгосСуб ОТУу уз Аго Аїв су 210 215 220
Тк бій АБ Аби Сім Суз Су Нів Рга бій Суб тей біу бесг Сув бат 225 230 235 240
Аїд Рга Азр о Ази Ар оТвг о Аїа Суз ма! АТа Суз лго нів тує Тук тує 245 250 255
Аїа сіу уа!ї Сув Уа! РО АТа сСуз Рго РКО дей ТВ ОтТук Агу РНе 1 2650 265 279 сіу тер о дгу Суб Ма! Ар Аго Адхв Ре Су діа Аз тів бе) сег дів 275 280 285 сій бег бег А5роБег бій сіу РБе ма! 318 нів А5рос1у бі бСуз мех 290 295 з00 біп іш сув вго бек обіу Ре Ії Агу Абп біу 5ег бІп 5ег меє ТУЄ 305 310 315 329 суч ї1е рРго Суб ст біу Ро Су« вго уз уаі сСу5 бій сів бі Су 325 з30 335 муз тТвг обу тТвгоЇ1е Ар о 5ег ма! тТВе 5ег АТа соїв меж бен сп оту 340 345 350 сСу5 ТВг фіе РВе Гуз б1у деп сец іем ї1)е АБ І1е Аго Агу біу АБИ 355 3650 355 деп ої1е діа бек обої їеу бій А5п РВе Меб сту гей тів Єїи маї ма 370 375 350 тик обіу туг ма! цуз ї11іе дк ні бек із АТа (ви Уа! бек іви 58 85 Ба, 395 оо вне сец їу5 дп Гей Аг гей тіе ген сі Біб біб сів еп осі оту 405 10 15 дей тТуг вег ре туг уаї Гей Ар. сій Ап сей бів біпо веб тро 420 425 430
Ар тер А5р оніб5 АгЯ Ап огец те ї1є Су АТа біу Гуз Мет тук Рів 435 440 4345
Аїа вне Ап го Гу5 Ге) Су Уа! бек бім т1е Туг Ага Мет 21 ої 450 455 466
Уа! тбгтооіу те обу5 Сіу Аго бій 5ек Гуз сіу Азр ї1е Ап о тТНе АгО 065 АТО 475 480
Ав АБИ біу 019 АгО Аа бег Су бій 5ег АбЗромаї Сей Ні Рйвотаг 485 490 495 беготаг таб тигоб5екогух Ав Ага т1е ї1е ТТе таб отгроніб Ага туг 500 505 510
Ага вВго РгОо АвроТуг Ага Ар оїбец тів 5ек о РБо ТВ Уві Тук тує уз 515 520 525 бій Аїв Рго Ре суб Ап Уа! таб ос1 туго АБросіу біп дер АТа Су 530 535 540 біу зег дв5п бек Тер Аза Мет ма! Ар мМаї Азр їе) ргОо РгОо АП оГув 545 550 555 550 деп оча! сій Вго біу ї1Тее ев сцец ні с1уУ це фу ро Тгротлк ой 855 570 575 туг Аїа маї туго ма? Гуз АТа ма! ТНт (ей ТВагоМеї ма! бій дп Ар 580 585 590
Ні ІТе Аг9 51у АТа уз бег сі жі сен туго хТе Аг тв А5п АТа 595 6500 605 чек ма! вго 5Зег їТе РгОо цец др о уді іву 5ег Аа 5ег Ап зер 5ег 510 51 5О чек бій їец з1іе ув) Гу5 тер Ап Рго ро 5ег гемо го Азп об1у Аа 525 530 535 64й
Сем бек тує тук їІє маї дга ткр біб Ак зів Рго спів Ази Фіу тує 645 50 655
Меп туг до нів А5поТук Сує бБег цу Ар цу5 Ті рго т16 Аго Гує 550 665 670 туг дів др сб1у тб Іі д5р тів бін бій маї тег бід АБИ РКО Сух 675 бо 6855
Тве бі Уа! Суз я1у С1у бій уз б1У Рго Суз Суб АТа Суб Рг. су 595 700 тб е1ш АТа сш уз стп АТа біц вуз бін оТи АТа бТи Туг Ага губ 705 ла 735 720 маї вре біц Аза Ре ему Ні АзпобЗек ї11е рве уаї РКО дгЯ реа сти 725 за 735 гг бух Аго В Авр уві мех біп уві Аїа АБО Тс о тйгомеє бак обег 74 745 750
Аг Бег Ага АБп оТвг о тТАг А? Аіа Авротйг тує Аа ї1е Тк о АБровго 75у 750 755 сбіц оіц ей бін тТвг ОЗ тус вго ВВе Рлпе 01 Заг Ага Ууаї А5р Ап 770 7 З 750
Суб бій Ага тек оуа! Ті бЗег АВ їси АгРо РО РБе Тиг ов тук АкКа 785 о 795 500 те Ар т1е Ні бег Суб5 Ап оні5 бін Аїда бін сує бен обіу Суб 5ег до о 815 діа 5ег АБ о рРпе Уві РМе Аіа дго ти Межк о?рго АТа сів біУ АВ. АБ 825 530
АЮ отТіе рго бім рко маї тйг отТгтробіц вко Аго Рго бів АБпобек Те 8535 840 545
Ре цец о їу5 Тгробго 10 Рго сі) Ап о Рго Аза біу грец 112 еп мес 850 855 860 тук сій їіе уз туго с1іу 5ег бій ма! с А5р осіб Ако сій уз ма! 805 870 875 880
ЗР Ага бій б1у Тук аку уз туго біу 6іу Аїа Суб грец Азп АКЯ сец 885 890 895
Ап овго біу деп отук ТИг ОАТа Аг т1іе біп АТа тігобег о вво бак у ч00 905 910
Ап о біу бек ТрротТвг Аза го мВ) ВБбе рпе Туг о маї бій АЇа рух ТВг 915 920 325 біу туп бій Ап РН Іїє Ні гей ї1іе ї1іе АТа Сеп Рго Уаї Аїда Уа! 230 935 940
Ген спец тіє Уаї Я1у бі Ге ма! хіе меє іви туго Уві Не ніє Ага 945 950 а55 збо цу АгЯ АБ о АБп бег Аг ев бі АБИ сСіУу Уа)! сей тус Аїд зек о уд 9655 ча 975 деп РКО бій Тугб Ре 5ег АТа Аза Азр маї Туг маі РгОо Ар озіш То зво 985 990 сій ма1ї Аа Ага б Гуз ї1е тро Меї бег дгу бій Бей біу а сту 395 1000 1005 чек Ре біу Ммек уд! тує зії 0іу Уа! АїВ8 уз б1у ма! Уаї Гуз 1010 1015 1020
Ар обіц РгГО сію тб ака Маї Аа ті уз Тис омМаї АБИ бід Аїа 3025 1030 1035
Аїй б5его Мек Ак сій лгоа їі бі) вве ге Аза сі» о Аїа Бек Уві
Т040 1045 1050 меї цу біц Ре деп Су ні5 оніз Уа! маї Адго це цеч о1у Уа! 1055 1060 1065
Уа! 5ег бів сіу віп о рРгОостйе баеу ма) ІТ мес-біц ен мес Тве 1070 1075 1080
Ага сіу дер ец фу 5ег тує еп Аго бек без дга РКО б) Мек 1055 1090 1095
Ой А5п АЗИ РКО Ма! і8гц АТа го РгОо его ге) б5его Гуз Меї 116 їлов 1105 117Лло бій Мет АТ оіу сім тів АТа А5роєіу Мет АТа тує цей АБИ Дів 1115 1120 1125 дп обу» РНе ма! ніз Ага А5р о бен діа АТа Аго АЗпо Суз Меї маї 1130 1135 1140
Аі1а іш АБровйе твВгомаї бує тХіє Сіу А5р РВе сіу Меї ТНг АКо 1145 1150 1155 дероїіе туго бі твг одер тує туго ага фу 61 бі уз бі Те) 1160 1165 1170 дез рРго ма! Ак тгроМеж его Рго бій бек обей бує Ар о біу ма? 1175 150 11855
Бе тйг о стик Тук о бек Ар ма! теробег Ре боту Уа! маї сек тку 115 МІ95 1200 сі тів Аза тик веб АТа 510 біб оРго Тук біб сі Сей бек АБ 1205 12ю 1215 сій бій ма! Сей дго Ре омаї меб бій с01у с б1у Сей бен д5о Су 1920 1225 1230
Ргб о А5ро Ап о Суз Рго д5ромет Бен Ре іш бей Меї дру Меб Су» 1235 1240 1245 тр осій туго Ай го їу5 Мет Аго РГО бе вне це 61 тів ІїТа 1250 1255 1260 бекв о зек діе шуб сі бій Меї біш Ро б1у пе Ага бів маї 5ег 1265 1270 1275
Ре тТуг туг бек сій Сіц Ав Був гей о РгГО ші) Рго бін бу ев ї280 1285 1290
Ази цец сів РРО бій Ай мех бі Зак оУаї Бго гей Азр о вко 5ег 1295 1їзоо 1305 аіа бег бег 5ег бег іеу ргОо Бей Рго А5р о Аго нія бет пу нів 1510 315 1320 цуч« Аїа іш Аза сСіу Рго біу РРО сіу ума) іви ма! сей Ага Аза 1325 1330 1335 чег Рпе дАб5рооЇШ Ага бій Рго стуб діа нія Меї дев о о1у О1у го 1340 1345 1350
Муз Ази біш Аго Аїа сей оРсо вед оРго зіпй Бек бек о Твг Су 1355 1350 1365 кед» 51 ке1ї15 932 «212 рЕТ «2135 ветітіста! «го» «??З» ХОЕ-1В СВ С(пПитат «4005 51
Меї цу5 б5ег сіу зег сіу ЄТу с1у 5ег Рго Тпг о 5ег Кеу тор біу гей 1 5 10 15 цей вне їєй ек Аа Аа зву бек бен ткровго те бек бі 6їш ле 20. 25 БІ
Суз сбіу рго с1іу ж1е Ар тів до оАЗп Ар отук сій сій гей уз Аг цецч аій А5п Суб ТнгоМмаЗ ті біз сіу туго іви нів ї16 рез гео ї1е 50 55 50 бек Су5 АЗа бій Ар туго Аг бек тує Аго Ре Рго Бу їеи г Уві 55 70 75 ва
Ііїє твг бій туго сен огву се Ре Агд маї АТа сіУ Гени бій бек гей 85 чо 95 і А5В беу Ре Рко Азп о бец тигоУуа! Зу16 Аг сіу теробуз ей ре
Т00 105 110 туг Аби туго Аїа ви Уа! Ії6 Рпе бій Мат тТВг о Аб5й Пец вух дер тів 115 120 125 сіу сей туго А5а Геш дод Ап ті тТвг оАго б5іу Аїа ті Аго Те бів 130 155 150
Гуз Ап ої Ар огви Су5 Туг бен бек те уа1 Азроткробеє ву ті1є 145 150 155 160
Пе Азр АЇїа ма! бевг Ап о АБп о тує іє Уві су А5лоєух Рго РгГОо Гук 165 170 175 сій Суб 6Т1У А5В сви Суб Рво Ту Таб меж бів бін уз рго Меї сСув 180 185 190 сій сСув твготпк о ї1е Ап Аза бів туго АЗй Туг Ага Суз тер те так 195 200 205
Азп Ага Суз іп о Су5 Меї сСуз Рго Зег ТВг о Су5з сіу Гуз Аго АТа су 210 215 220 тТие бій АЗИ АБп сі Су Суз Ні вго б1н Суб ев біу Зак Сух заг 2955 230 235 240
АТа вго Аз о АБА дер тис Аїа Суч уаї Аза Суб дра нія Ту тує тус 245 250 255
Аіїа Ффіу маї Су5 маї Рго А1а Сує РгОо РГО АБ Таг отуг АКдД пе и 258 255 279 бі ткроАго Суз чаї Ар о АКа в5р Ре су АТа дей ті без 5ег Аїд 280 285 сій зего5аг Ар обагобій с1іу Рпе Уа! З1есні др о біу Сі Сує Ме 290 295 300 сіп о оіц Суб Рго бегооіу Рпе 112 Агд дп о б1іу бег бів бек Меї тус 305 310; 315 320 суз5 хі его Суз біц 5іу Рго Суб5 Рго вух маі Суз бів бій сі Гуз 325 330 335
Суб тТвг о рув тар оЇїТе дер бегоуаї ТВ чег АТа бій Меб ей сФіп сту 340 345 354
Сув такт те Рпе ух біу а5поїрец бе Т12 дей тів АК АК с1у дБА 355 з6о0 365
Ап хів Аїа зекобім Ге біц Адяп ре Меї сіу їви тів бій мУаї ма! 370 375 зво
ТВе обіу туго маї 1у5. 119 Агу Ніз бек Ніз АЇЗз 1їем маї бек гГец 5ек 385 390 395 400
Рпе Гей фу деп іен Ако і еци її івц бі біб сії бів їеу Єїи с1у 405 10 415
Ап отуг 5ег Ре туго Уді Гец дер А5п біп Абл Ге) бій б5іп їецй тер 420 425 230
Ав Тгр Ар Ні Ага Ай без ТТГ Ожї1е їуз АТа с1у ух Меї тує вне
435 440 ч45
Афїа вве А5п о рРГО Гу Гей су Уа! Бек 10 їТе туг аку Мет бїц а1їи 450 455 450 маї твеобіу тк Був СТУ дгу біп обек гу ОТУу АБроїТе дп ТР ОАгО 465 470 475 480
АБ АБЗ о б1іУ бім Ага Аїа его суз сій 5ег Аб5р маї Гей ні Рпе ТВ 485 49й 495 5ек тТВготИг тТНг Заг губ Ап Аг 318 116 ІТ тТвг тер нів АКЯ тус 500 505 510
Ага Рго Бго АЗВотТує Аго Ар оїец їі бак РБа тТЬгома1ї Тук туго Гу 515 520 525.
ФіШ Аза вБго Рйе ух Ап Ма! ТК оЄїу Тує Ар сту бів А5р А1а су 530 535 340 сіу 5ег Азп о 5Зег тгр ап Мет уа! А5роУуаї Ар ви РКО РКО АП ух 545 550 552 560
Азр ма! сій Рго біу 112 Гец о іец ніз сіу ей Гуз РКО тро оте зів 585 | І 570 І 575 тут Аза уа! ту уві Гу5 Аїа ма! тигоїец тнгомеж маї січ А5п А5а 550 585 590 ні жів дгоа сіу Аїа бух Бег обі 51іе Бей тук о хТ6 Ако тиг деп АТа 595 500 605
Зег ма! Рго Зв ЗТ рРго Тез дзр уа! бен 5ег дія 5Зег А5п бек заг 510 515 620 бЗев сій їеи ї1е Уа! Гуз Тер Ап о Рго РКО Зег о мец Рго А5побіу Ав 525 530 535 п)
Мей дат тук тує т11е ві дк тгросіп да бій Рео сій дер біу туг 55 650 655 іеи Тут Ага Ні Ап туго Су5 бегоіуз Азро1у5 тТіє Рго ті Ага ув 5о0 665 670 тук Аза др сіу тік ІТе Авр Іі Сі бін ма1 Таб обім А5п о Рго гу 675 658О 685 тик сін маї Суз с1їу біу її бує 1у го Суз Су Аїд Су Рго Гу5 595 796 тТие Оїч Аїа сін сбуз Біп Аїа б1й вух бій Бі АТАа вів тує Ага губ 705 710 715 720 ма! Ре бі Аби РІВ Гей Ні Авпобеє ї1е Ре маї Рго Ага РСО ОМ 773 730 735
Аго су Аго Ага Азроуаї Меж сій маї Аїа Аза тиг отТг о Меї ек 5еє 740 745 750
Ага Бег Ага Аза о ТВг ТНК АТа АТа АЗИ ОтТвг о тує АБ тів ТВ Ар РКО 755 760 755 сі бій їен бін твг осів тує Рго РНе ве соти бек оАга Маї АБр дви 77 775 780 уз іш Ага твКоУаії їв бег дл о гец Аго РгОо вйе тк о вец Туг АгО 785 790 795 ОО
І18 дер о ІТе Ні5 бек о Су5 Ап оНіз бій АТа бі бує без сту Суз 5ег 505 510 815
Аїа 5ег АБ Рпе ма! РНе діа Аго тйг о Мек Рго Аїа біц бім Аїа дер 829 525 30
Азротіе Рго Бім РКО Уві тає отгросій РКО Ага Рго біц А5п бек Пе 535 540 845
РПе цей оїуз тгробго сій вро бій Аби Рго Аза сТу Бей тів Ген Мех 850 855 Бо тук аїй їі 3у5 Тук біу Бек о біп уа! бін АБО Ів Ако і сСух чаї 565 870 875 ко
Зег Ако бій бій Туг Аг вуз тут сту су АТа Гуз ем А5п 88 цем 885 890 89
АвпоРгОо б1іу АБп оТуг ТТГ ОА? Аго ї1е сіп АТа Тв Бегобез 5ег пу що З05 910 деп о Оіу его тгротйг АБробго Уа! вве Ре Туг Уаі бій АТа губ ТАС 315 920 925 сіу тук бій Ази з3о «2102 57 «11» 512 «21022 РЕТ «2135 аг тіста! «ех | й «223» ЇОЕ-18 ЕСО Мбегтіва! Спутал) «00» 52
Мет суз бЗег біу 5ег сіу бїу біу бЗек рко тТігоЗег бец тер бу гей 1 5 то 15
Сем РнНе їец бег Аза Аа гец бег ої Ткр о рго ТК обегозім б1ч Пе 20 25 30 сух Б1Уу Рго біу те А5р о І1е Ага Ап дхр туго отв бій без губ Ага 35 БІ 45
Гей сім Аза буз Так оУві тіє бій сіу тук зви ні ї18 рей Кей те 50 55 бо 5ег Гуз Аза ТИ Аяр тТуг до зеботук Ап вве бго рух зе) так Уа! 55 70 75 8а тіє тВгобЇц тут без гей їез Ре Аго уаї АТа сіу тен сів 5Зеб сей 85 ж 95 біу дер іец РБе Рго А5п о Сец тпгбоУуа! 316 Аго с1у ттроу5 беу Ве 100 105 110 тут Авп о Туг АТа їец Уві ЇТє Ре сій Меїб ТВгоАб5а ен у5 Ар їе 120 125
Фіу їеи Туг Ап Сем дед дп І1е тТВг о Агоу о1у АТа тів Аго тів бін 130 155 140 іу5 АЗИ АТ АЗроіви суз Туг бен бей тв Ууаі АБр Тгр овес сви ї16 145 150 5 360
Гей АЗв Аа Маї бег о дчи Ап отук Т16 ма? 51У АБИ губ рго РГО Бу 155 170 175 сій Суз бі1у Аз їви Суз рго сіу таб Мої сб)ів біб Був Рго Меї суб 180 185 190 сій зуб Твготвг о ї1іе Ав АЗпобів туго Аби Тук Аго Суз ТрРр отв так 195 200 205
АхпоАго Суз іп гує Меї сСух Рго 5ек те Сув біу Гу5 гу А1а суб 210 215 270
ТАгРОбТШ АЗп Ап Бін Су Суб Ні го біз Сує ген сіу 5ек буз 5ег 225 230 235 250
Аїа вго Ар Ап АхротТиг Аа Су маї Аза Су дго Ні Туг тує Туг
285 РІВ! 255
Аїа аїу маї сСуз Маї Рго дів Су РвгОо РГО Ап о тиг о тТуг Ага вйе са1и 260 255 270 сі тгр о Аго Суз маї Аз о Аго а5р о РБе сСуз АТа дев ІТе бер бегО Аа 275 250 285 сій бБег зег Азр бБег сій сім Рйе уаї ї1е нія АЮ біу сію Сує Мех 290 295 300 сбіп о оїш Суб Рго Заг обіу РАпЄ І1е Аг доп оту Заг вій 5ег мех тус 305 ЗІ 315 320 сСуз її вго сувз сій с1у Рко Суз Рго бух маі Суз бів бій сів ї1у5 325 330 335
Суб тйг фу тТнг о ї1е Азробег ма! тТаг о бет АТа бій Меє грец сій б1у зо 345 350
Суб тйг тів Рпе ух спіу Ап рез бец 112 Ап хів Аго Ак «1у дБА 355 БІ 365
Ап тів АТа 5ек бій Геп біц Ап Ре Меж сб1у ев тіе січ хаї ма 370 375 35О0
Тк оБіу Туг о маї Гу5 їі Аго Ні5 бек Ні Аїа іем Маї бек бе 5ег 385 390 395 400
Рпе цей їуз Ап ем Ага Гей її6 ївеу Є1У бі біб бій зву бін біу 405 410 415
Ав Туг Зег РВе Тук маії їец Ар деп бій Ап Ге сів Бій ей тео 320 425 430
Ар отгр др Ні5 Ага АБп Гез тиЄ тів їуб5 АТа сту гу Меї тує РпВ 435 0 445
Аіїа вне Ахп о РГО Гуз без сСуз УВ1 чек бін їТе тТуг Аге меї бій «Ти 450 455 460 І
Ма! тве бу Тв губ бі дк9 біп его бує сіу Ар їТе дп так у 465 47) 475 4850 деп о АБ5п о сіу бій Або Аїа бег су бі) 5ек АБромаії Гей Ні Рйе ТВг 485 490 495 век тВг Отак ТВг бек гм Аяп о АгО ї1е ї1в жі тйготер ні АгОо Стус 500 505 519 «2105 53 «211» 4. «125 РЕТ «233» аежтітіста! кг2О» «223хм Хетгарерііїйе «(Тіпкек) «400» 53 сіу Ре їви сім 1 «210» 54 «її» 4 хеід» РТ. «13» аРтітіста! ке» й «223» хХатгарертсіде (1іпкег) «МЩЮ» за
Аїа бец АТа ви «2» 55 «Її» 5 «212» РАТ «13» агкіжісіа! «20 й Що І -й2а» хекгарерсііде (С іпКкег) «400» 55 вго маї Сі1у ма! Уаї 1 5 «210х 58. «115 120 кої» РТ «213» агтітісід! «2205 «223» ВетОВЕ?2 певму спати НОЗІ. МН «й00х 55 сій ма! бій івп суді сій бек йіу Аіа бій счаї гу уз рго біу Аа і 5 10 15
Зве ма! бух ма! 5ег сСу5 цуб5 Аїда зег б1іу Тук тйг о РБе Тиг бек стук
М) 25 за тує меж нів Тгр.омаї Аго зіп діа вго б1у біп о1у Сец о зіц Тгр мех 35 40 45 сіу тгр її тер Рго біу д5р бі зве твгогуз тує АТа віп гу Ре 50 55 50 біп сіу дга Уа! тик меж Тнг Агу Аврогує Явг обег обег Те Ома! тує 55 та 75 Во мес бій бе бзетг баг мен Акд бек бій Ар о ТВг о АТа ува! тую Рпе су 85 чо 95
АЇа его рРго меж т1е тТиИгоРКО в5потуР Азіа мМеї дер) туг тер о біу б1й 100 105 110 бі тВгоїєц ма! тТпгоуа! 5ек баг 115 1265 -2105 57 -2115 307 «212» РЕТ -ВІ13» асжхітісів! ке» І й «223» БигО8Е? ЗідВт свати 1018, мі. «ДО0х 57
АБр оІїе сіп Мебє тйг сій баг орко бек очвг бен бек АТа беб о уаії о1у 1 5 10 15
АБроАго уаї тТвкК ї12 те о Сує агу Аза его бів Аврої1е бек ру туг 275 зо
Мен Ап отгротук ст бій гує го бі вфУу5 АЇа Рго буз їей Без Те тТук Туг тТВг бек Аго Ге сіп бег ошіу Уа)! Рго 5егоаАгу Ріпа бек о с1у бо
Ага чіу бек бі тпг о Абр тТук бЗег бей твт Ії бек бегогец біп Рго 55 70 75 що
Ой АБр оре АТа тнготуєс РНе Су сій бій 0Т1у Бек ТВг Ге рго Ту 85 90 95
Те ве біу біу 1у тТНг ої уз ма! бін 116 ух 100 та5 «М» 58 -211» 449 «вій» РК «13» агтіісіа! «240 й й «223» БЕи208Б2 Вваму спаїп нОЗ) Ти1ї Тепотй «хх 58 сій ма! сбіп ген ма? сп бек сФіу Авіа сій Маї гує бує Рго шіу Аа
Ей 5 10 15 чек чаї уз маї ет Су5 сук Аа бек біу тук ТВгоРНе ТВ 5ек о тук
Тук мес ні Тгроуві АкЯ біп Аїа о вго Сі б1іп Ту ев обій Ткр Ммеє сіу Тер о їТе ТгроБго сіу А5р пі бек тТВт туз туго А1їа біп су рве 50 сіп е1у дго ма! тТВгоМех ТагоАгу Ар огСуз Зег зегк бБег Тк мУаї тук 55 70 75 80
Мет бі їей бек 5аг їви дго Зесо бі Абр отв АТа маї туго вле су 855 90 95
АТа заг Рга Меї т1іе Тийг о Бко А5потук Аїв Мех др отуг тер обїу сти 100 105 о біу жЖбг зей уаї Тнгомв! 5ег обег Аїда 5ег ТВгогуз біж го бек о маї 115 120 125
Ре Рго їеу АТа ко бег оЗек руч бек тТАйг о бег сіу б1іу тик Аїа АїВ 150 135 140
Ген аїу Суб їеи Жаї Гу Ар тує вВбе Рго піц Рго Уві Тк УЗ) 5ег 145 150 55 160 тТгроАзп Заг біу Аїд ве тйгобеб о шіу маї ні ТВгоРйе РКО Аа уді 155 171 175 без біп бак обег с1у гей Туг о Зегоїеч Заг обег маї Ма! Те маї рко 180 155 190 авг его 5ег бен сту тігобіп твготує ї1е суб Ал ма! дбзпоніб вуз 195 200 205 вго ек АБИ ТВг ої уз уаі Азробуз ага ма? 010 РгГО уз бег Суз АВ 210 215 220 іїуз тТаг Ні твг обу Рко Рго Су5 о Рго А1а Рго сТм Ген ви б1у б1у 225 230 235 г4й
Бро бегоуаї ?йе їси РН рго Ко іує« Рро уз Азр ТНК оїей Мат 116 245 250 255
Зек Аг твг о РГгО бій Уаї тб осСуз ма! Уа? маї АБО Маї Бек нів ой 2650 255 270 дкровго бій маї губ Ре д5потго отуг Уаї дер біу маї вій маї нів 275 280 285 деп о АЇа фув ТК цу рго Аго сій Єїй бій Тук Аза бег о їйк тує АгОо 290 295 300
Уа1ї Уаї 5ег Уа! їеп тиг Уаї Гей нів обіп Абр Тер гей Ап бу губ 305 310 315 320 бій тує фу Суз ув Уаї Бек о Авпоїу5 Аіа бви Рго Ата Рго 516 Ти 325 з30 335 мує тт от) Бек су АТЯ Муз Б1у Сіп Ргоа Аго єї Рго біп ма! тус 340 345 350 тик Сем орго Рго зег Акод 41) біз Меж таб о гує Ап бів ма! Зег сем 355 350 355 тик осСу5 ей маї Гуз ЗТу Ре Туг Рго Зак Азр 16 Аїаз Уаї 510 тро 379 375 350 сів Зег Ап бі СІ Ро Сі Аа Аа туго їу5 Те ТК о Рго Рго уд 85 Б, 395 00 ей Ар озег Ар оо1їу Бек оре Ре їен тує 5ег о їує ен тиг о маї Або 405 410 15 іїу5 5ег Ага Тр обіп сів біу дяп ма! Ре б5ег Сує бег Маі Меї ні 420 425 430 сій Аїа їец ніб5 Азпонів туго ТВгеобіп бух 5ег іє бег о гву 5вк орга 435 440 4345 іу «210» 59 к211х 214 «їі РТ «Фі3» акжітісіа! «920» «вав» пидОнк? Товт спаїа 0185 тв1 Тепосй «МюЮх 59
Ази ЇІїе 5іп меж тТаг бій бег Рго Чек оЗегоіви 5Бег Аза Зек о маї ФУ 1 5 10 15 а5р Ага Уаї тве о І11е твг оСуз вго АЇа бек бій Ар їі бек гу Тук 20 25 30 сен Аби Тгротує о1в бій Гуз рго 1у суб АТа Рго Су бе їец ї1їе 35 40 45 тук туго тиг Бег Ага Бей сій Зеб о біу маї Рго 5ег дгЯа РНе бек сту 50 55 50 дк оіу Зег е1у ТК Ар о туго зег вен о тбу їТе заго бег бе сіп РКО 65 7О 7 50 сіш Азр ве Аїа їй тує РНе суз біп ой оту Зет ТК грец РКО Тут 85 9 95
ТВ овйе С1у сім 6Є1у тик о гуя маї бід 12 зуб дго Типг Ма? Аа А1а 100 105 яма рго бек уа! Ре їІе РНо рРго Рго б5ег о Азробій бій без рух баг біу 120 125
ТВг Аїа бБег уаї Уві Су5 Гец Бецп А5п Ап Рпе Туг РгОо Ага 1 Аа 130 135 140
Гуз ма! бїп тгрогуб маії дер Ай Аа сен бів бег біу Ап бе сій 145 150 155 160 сій бег о уді тТпгобіц бій д5розяг губ Ар заг Тйг тує 5ек о бец 5ег 165 170 175 ес Тйг їв) те ген бек їм Аїа Ар тує сти су ніх фу маї туг
150 185 190
Аїа сСуз бій Уа! ТК ні Яій біу гей 5ек о зег Рго уд! ТНК рух бег 195 200 295
Ре деп Аго С1у сп су 2 «20» 60 «ві» 0? «212» РЕТ «213» агтібісіа! «Ва» «йЗ» ВБ208Е? Зївйж спдій 1091, МЕ «4005 60
АБроїіе біп мес твЄ чіп бек Рго бек чек о їен бег Аїа бек ма! бі1у 1 5 19 15
Азро Ага уа! твг оті тик Су Агу АЇа бе іп Азрот1е его ух тує
Сей дп отгтротук б1п осів гу вро б1у уз с АТа Бго Гуз тей ви Т1Є 435 тує ту тег бер Ага Сез нія бег сіу уді Ро 5Бег Ага Ре бек су 50
Ага сіу Бег Сіу тйг оаАб5вВ о РВе его їец г тів бЗег зе ви б1п вго 55 70 75 що сій Ар оРйе А1їа тваг тує РНа сСуз сіп бій бт1у 5Бег ТЕГ оБец рРго Туг 85 90 95
Тис вве біу бі щу Тк цу уд! сі) зів ув 100 105 «230» ві «21їх 214 «Р1йж РТ «йіЗ» агтібісіа! «роб» | ши «й23ж В?ОВЕ ТтавЕ спаїп ЦІ Ти11 Телосй -300» б1 дер їїе біп меж Тк осіп бег Рго бе 5ег геч бег АТа бек узі с1у 1 5 10 15 дБр дга маї тЬг о їТе твгоСуз Агуд о А1Та зегобТй Ар оте бек овуб туг 20 25 30 іГез ап отгротук сл сій вух вго біу 1у5 АТа Рго уз Бец іву Те 35 40 45
Тук Тут Твг Берг Ак Ге) Нія бек о біу уаї Рко бег Ага Ре Зак о о1у 50 55 БО
Агу зіу зег біу Те дер рРйе бегоіви ТВг о ї1е его 5ек грец св бго 55 70 5 во сій А5роРБе Аїа о тийгоТук Рйе сСуз віп бій біу 5еб тк овБец Рго стук 83 90 95
Тк овне біу біу бу тб огує Уа! біу їТе зу Аг Тпгома! Аза діа 160 105 110
Рго б5ег Уа! Рве ї1е рив Рго Рго 5ег Ар сію біб ви бує Бек о1У 115 120 125 тпг Аза 5ег о уа! Маї Суз це Гей Ай Азп Ре тТуг Рго Аго бін Аза 130 135 140 пує уаї бій угр о бух Маї дер Ап Аа Бен ой Бек біу дей бек сій 145 150 155 160 бій Бег ма! тв осі бібф о д5розеб бух Абробег ТВг туго ев гео 5ег 165 171 175
Бек тТВг о беу Тит гГецз бегосуз Афа Авр о туг бу гу Ні уз Ма! тус 150 185 190 діа суз сій Ма! ТНг нів іп біу бе Зак о5ек Рго ма! ТАК о їух5 5аг 195 200 205 вне Ази Ага біу си Суб 210 «2102 62 «11» 120 «21022 РЕТ «213» акті тістай «Ох І «23» пж2ОВЕо йеаму сваїп НОЯ, МН «005 52 сіп маї біп сей ма! бій бек бі Аза Єїи маї гує уз РГо БІ1У АВ 1 5 10 15
Зег Уаї гу ув! зег суб Гуз дів зе сім Туг твг. Ре М Зег туг тує хЗе нія Тгромаї Агуд сіп Аза го е1у бій сту ви ЄВ Тер мах
НІ 45 біу тгр тів ТтгроРко Сіу дер о біу чак о тТйгоїух тує АТа бій Гу Ре 60 бій аіїу Ага Уа! таб Мет Тйг о Аго АБр отак бек бек ав Тк омаї тТуг 55 70 75 80 мес сій без бег бек оіем Аго 5ег бі) Ар ТВг ОАТа Узі Тук туго суб 85 КІВІ 95
Аїа его рго меї І16 тТйгоРКО А5потук Аза меж дво туго теросіу сій 100 105 їю сіу тйгогвеи уді тик Уа! 5ег бек о 120 «10» 653 «Ії» 449 «вій» РТ хаї3» вежіРіста «Дей «223 Вха08к2 Мпевму спаїп нОдУ ТТ Тепотв «4005 53 сій ма! сбіп овен уві сій б5еє сФіу АЗіа сій маї їу5 ув рРго ім Аї18 ії 5 10 15
Бег маї 15 Уа! 5ег Су Гу Аїа зее с1уУ тук о твг вне М Зек тук тТук жів ні Тгроуа) дгуу віп Аїа го 61їу зіпй біу бен біб Ткр мет 35 40 45 сіу тер оїТе терорРго бу Ад5р о сіу б5ег о тйг бух туг АТа сіп Гуз вве 50 55 5О біп Ту АРО Уа! тпге мет Тйг о Аго АБротайг его бег Аз Те омаї туг 55 70 75 88
Мет а1ій Бей бБеє бак сви дко бек сії дер Тиг АТа уві Тук тук осув 85 90 95 аій Бек Рго Меї ї11е ТгоРКО А5потук А1а Меїх дяр тує тер об1у сТй 100 195 1 сіу тпгоїеу Уа) ТНг Уа! бег бер Аїа бек ТВг Гуз біу Ро 5егоча? 115 120 125 вне Рко ієц Аіа Рго 5ег о б5ег губ бег ТК об5ег с1у біу тик Аа Аа 1590 135 150 іїез біу Сузв їви маї їу5 дер о Туг РНе Рго Бін Рго Уа! ТВкомаї 58 145 150 155 160 тгроАвп 5еговіу АТа гей тб о Зег обіу маї ні Тит Рйе Рго дів ма 165 170 175 їде біп яего5ек біу без туго зе їец бек бег ува! ма! те хаї рго 180 185 190 дек бег Бег ієц біу тк обіп твгеотук хів Суб Ап омаї Ап ОНІВ губ 195 200 205
Рго бег о АхИ ТигОоГу5 маії А5р обу Аго маії 510 Рго Гуз бЗег Сув Або 210 215 220
Су тт оніз Те оСув Рко вго Суз Рго Аа Рго біб Бей гей бі о1у 225 230 235 240
Рго Бег УАТ РВе Беу РИ ро РгО у Рго ух А5О тб обе) ме пе 245 250 255 бек одго таКоРго сі Ма? тТвгоСух Уа! Ма1ї маі дер уві бек нії Ти 250 255 270
Ар овго біч УаЇ губ Ре Ап оТтротує маї Азросіу Уві Фіз маї нів та 280 285
Ап дів Ту ТВЖ Гу Рг 859 бій бін бів тТуг Ап бег о тик о тук АКа 290 29 300 ча! чаї 5ек о Уді ен тйг о маї гей Ні сій Авр тТгр ген дз біу губ 305 Ба) ЗЕ5 3209 сій туго був Су груз Ууді 5аг АБИ уз Аіа сей вго АТа Рго тів їй 325 330 335
Су5 ТВг Тіе 5ег гук Аїя Буз сіу бій Рго Аг сід Рко бій маї тус 340 345 350
ТНК оцей го Рго Звг дра бій сі меб тн огу5 АБ зів Уа! 5ег о вец 155 360 365
Те бух їви ма1ї (ух сіу Рйе туго Рго чего дзр о їТе АТа Мв1 1 тк 370 375 ЕК сіц баг дп біу бій РКО бій Аєп АБи Ту їу5 ТИг Так оБго Рго ма 385 390 395 400
Сем Ар очег ар біу ек ре РНе іви Туг 5ег їу5 рев тиг омаії А5о 410 515 цуз б5ег Аг тгробіпй сій сту деп ма1 РНе Заг Сує бек Уа! Меє ніє 4320 425 430 сій діа їєй ні5 дзпонНів тує те біп ух Зег ген бег бец бас вго а35 440 445 іу
«2305 54 «11 20 «й1йж РЕТ «із» ачітісіа! «220» «23» ВЕ2ОВЕ2 Бевату спаїп НОЯА9, МН «4005 654 сіпоуУуа!ї сів бе уаї сія б5ег о зіу Аза бі Уа! уз буз Рго біу АТа і БІ 10 І І 15
Заг ома! уз ма! бек Суб цу АЗа бег б1у туго тТвВг Ра так зекотує 20 25 30
Тук Меж ні ТгроУа! до сіп Аза Рг сіу бій сту без бТи тер меє 35 40 45 сеіу терот1е тгр вро чіу а5ропіу бек тб їув тТуг АТа біп руб рде 50 55 50 сіп біу дга ма! трг о Меї ТВгодгу Азрогу5 Заг бек бег ТАг оУуаї Ту 65 7й 75 8О0
Межї віч їец бек бек огеу го бек обіц АБр тт АТа маї тує Тук сСуя 90 95
Аза зег рРго Меї 11 ТАК орРго д5п Туг АТа мет Ар о туг тгроБіу сій 100 105 119 сіу тик оїєи Уа1ї тНгомаї бек обег 115 120 «9530» 85 «и1ї1Зх 445 «212 РЕТ «213» акжіттсіа! «род «223» Вх208Е2 Неаму сплата НОїО та Тепотй «400» 65 біп уаї біп іє жаї біп бег біу Хід бін Уа! ух ув РГО біу Аїд 1 5 10 15 зек Уді уз Ма! бек су уз Афїа ек о б1У Тут тТпгорРйЄ ТВгозег тує тук меж ні Тгроуаї Акд с1й Аза рРго сіу ій 01уУ рен бі) тер меж нів аа сіу тгр піе тгр о Рго 51їу Ар сіу бес тт губ тТуг АТа біп вбу5 рРАе 25 50 сіп біу дго маї Тйг Меї Тйг ого д5рііуз бег зер бер їй ма! туг 85 70 7 80
Мет бій іеци 5Зег бег Ге) айго Зебобіц АБ5р так о АТа маї тує тукосуя 85 90 95
Аїд бек Рго меє ї1є ТНгоргОо Ай тТук АТа мет азр тує тер Ф1у 1 100 105 110 сіу тйгоїєн маї ТНгомаї 5егоб5ес А1а Бек ТвгоСу5 сіу рго бек ма 115 120 125
Рпе Рго зей діа Рро Зегозег губ зЗек оте баг біу біу тиг Аза діа 130 135 150
Геж сіу Суз їец ма! губ А5ротуг ре Рго сій Рго маї тйгомаї 5ег 145 150 155 І60 тер оА5Зпо5ег с1у АТа гей Тс обер бЄїу ма! Ні тВгоРйе Рго АТа Уа! 165 170 175 се аіїп бек бег с1у сем Туг бек оіїеу 5екобег о маї Уа! тВк ма! вко 180 155 190
Заг Бег бек їеи с1іу таг осів таботук ї1е Суз дяв ма)! АБ нтів Су 195 290 205 вго 5ег А5пП ОТВг Гуз Уаі Ар суб Аг мМаї сім РгО Гуз бек Суб АБр 210 215 220
Гуз їВгонії Тк оСуз Ро Рго Суб Вго діа Рго зі Ге їви 51у бу 225 230 235 240 вто Зегоуаї Рпе ій РБе Рго рго уз Вго 1у5 АбБр тик ви меї 112 245 250 235 ек Ага тигоРго бТи Уаії Твб оСу5 Уа! маї Уаї Авромуа! бег Ні 619 250 2658 270 дзровго сім Ма! ух Ре азпоткротує уа! Ар біу ма! бій маї ні би 280 285
Ап о Аїа ув Тк обух РгО Бо Чіч бій сій туго дп обего тк Туг Ага 290 29 306 ча Ма! бБег маї їеми Тк Уа! Сец нів біп Або Тгрогбецосазп о п1у Гу 305 310 315 320 сій туго обу Суб їу5 Маї бег дз Гуз АЇа сей рго Аїа Рго їїє сій 325 330 335 уз Тиг т1є бек бує Аа уз б1у бій Рго АК зіб Рго біп Ууаї тує 340 345 359
Тигобецй о рго Рго 5ег о агу біз січ Меї тАгобує дев бів маї бек (ви 355 360 365
ТВг осСуз їецомуа! зуб бі РНе туго вго 5ег Азр тів Аїа маї оч ткр 375 375 380 бій бег Азп бу біп Рго с Ап Аби Тук обу ТВг Тис РКО РКО Уа? 385 399 395 400
Ге дер бек дер Чіу 5ег РНе Ре іє туго бевг о руз Гей ТВгомаї АБО 425 434 415 уує зег ага тгробів стій Ту АБИ Уа! Рйе бБег Суб бЗег Уа! меж нів 420 425 439 сій АТа їв ві АБ оНі Тугс тТвР обі Суб бег огец бер вец о зЗек ргоа 435 440 445 «у к210» 66 «11» 120 «212у РЕТ «213» акжійчїста! «220» «293» па208Е2 педму сваїп НОВІ, мн «4005 56 сіп ма! біп ієн Уві сів бек біУу Аа сіц о маї бує буз Рго о1у дів 1 5 10 15 ве уаї уз ма! 5ег Су5 1и5 Аїа зер обіу туго Трек РИйЄ ТНК бек туг тує мет нія тгромаї ака сіп Аза вго б5Ііу біп фу гей бі Тгромеї
35 0 45 б5іу тер тів угр РКО біу дер біу бек так ух туг АтТа «іп рух рве 50 5 50 іп сіу ага Уа! Тк Мет ТАг Аг АБр ТНК 5егобег Аа ТНгоУаї тує 55 70 75 ва мес сій ге Бег бег Пец Ага 5ег сій дер тТвг о Аїа ма) Тук вве су 85 зо 95
АіЗа бБег рРго Мет 116 Тиг о РКО А5потуг АТа Мег Ар тує тру оп 100 105 о сіу тайгоіви чаї тве Ууаї бег о5ег 115 120 кб» 67 «тії» 445 «122 РЕТ «213» ветіттста кгйО» і хгй3» ПРОВЕ? пезму спаїл НОВІ ти Тепкв «4005 67 аеій ма! сій бен ма! сій бек Бім Аа сій маї суб вуз вго сту Ав ї 5 10 15
Звг ма! їу5 чаї Зег о сСсуз губ АТа заг о біу туго тЕг о РПе тТигозекстуг зо тує мех ніз Тгро Ма! Ага сіп Аза Рго Б1іу біп о сіу Бей біз Ткр мех
НІ 45 біу тгр тів тгрорко бі А5робіу чак о Тйг огГує туг АТа сіп бух вне 650 бій аіїу Ага Уа! таб Мет Тйг о Аго АБр отак бек бек ав Тк омаї тТуг 55 70 75 80 мес сій без бег бек оіем Аго 5ег бі) Ар ТВг ОАТа Уді Тук рпе суб 85 КІВІ 25
Аїа его рго меї ї16 тТйгоРКО А5потук АЗа меж до туго теросіу Ти 100 105 їю сіу тйгоїви уді тб Уа) 5ег об5еб АТа бек ТВг Гуз віу Рго Зекоуді о 120 185 вне Рго без АТа РгОо бегобег груз бек Тк об5ег С1у сіу Тк Аї8 Аа 130 135 140
Сер біу Суз їей Уа? Гуз АЗротТук Рйе вго 610 Рго уаї тб маї 5ег 145 159 155 150 ттр Ази зег біу А1а це) тве о5ек обіу маї ніб тТВг о РВйе Рго дів ха 1655 170 175
Гец віп Зег обер обі Ге) тує бек гей бог о 5его уві Маї твкоуаї бго 180 185 190 чего бег бег іен о піу ТАг Бій те отук ї1ї2 Суб Азпомаї АЗпПОНіЗ їує 195 200 205 рго 5ег дж тТпгогуб маї а4зр уз Аго Уа! бій РгО губ 5ег уз АБ 210 215 270 буз Тиг о нів тТпг Суб рго Рго Суз Рго Аїа рго ой гей гео бу с1у 225 230 235 250
Рго зекг Уа! РБе гей ре Рго Рго бу Рко ух дер тТИг о їву мех Пе
245 РТВ. 255 5агдгад так о рРо сі маї Тагосує ма! Маї УаЗі Ар уд! 5ег нія а1и 260 255 27 дей РКО біц Ма! ув Ба дп теротук маї Ад5росіу ма! сн маї ніз 75 250 285
АБ АТ ву5 ТИгГ огув РгОо Аго віз бій б1іп тує дей Зег о тТвк тує Ага 290 295 300 ма! Уаї 5егома! сей тик Уа! без ні сіп А5зр о тиробен аАбп с1у Гу 305 ЗІ 315 320 сів туг бух був гу Уаї бЗег Ап фу Аїд тен РгГО АТа Рго ше бін 325 330 335
Гуз тТйготІ1е 5Зек гу АТа Гу С1у б61п РгОо Аа оТи РГО біп маї Туг з40 345 350
ТВЕ тен рго РгОо 5ег АгЯ біз сій Ме Твгоїуз Ай сів Ма! бек оте 355 з60 365
ТНК Суз гей та! їуз біу вйе туго Рго его Ар ІТе Аїа У Ти тер 370 375 зво сій бек АБ б1Уу біп рРго бі Ай АЗИ Туб зу ТВг ОТВгорРКО РКО Уа! 385 390 395 400 зей Ар 5ег А5роб1іу Бек Ре РБе бе туго Зекогуя бец жйг о Ууаї А5р щь 410 15
Су Бег Аго Тр обі Сіп фу дзп ма! РВє бЗег Су Зег ма! Мет Ні 25 425 430 іш Аїа зей Ні Ап Ні тук таб Осій бує Зег Ген бег оїеу бек вго 435 440 д45 сіу «2305 658 «-й11х 120 «ф1й ВАТ «йіЗ» агтібісіа! «вай «23 ВІ?ОВЕ Неауу спаїп НПЗ, МН «00» БВ сій Уа! бій бец о хуаії 5іп бекгсзіу А1а бі) Уа) Гу5 ув Рго сі А 1 З 10 15 ет маї їуз Ммаї 5вг суб Гуз А1а бес о сіу Туг ТВгоРНе ТвЕ Заг туг
Тук Мет Ні5 Тер Уві дго бій Ав Рго с1у Та сту бен обіу теромет зо 45
Фі1у тер ї1е Тгроркго біу А5р с1іу бек тйгоїуз тТуг Аїа біп суб Рле 50 сій біу алго ма! ТВе мет Таб о АгУ АВ ТвВг о б5ег ТИб бек тис ува! Ту 55 70 75 о мет сі іей бек 5ег сен Агу 5ег бі А5р о тйг АТа уа1ї тує РЯе сСує 83 90 95
Аіа зег рРго Ммеї ЗІ Тк о Рго дхй туг Аїа Ммеї Ар оТуг тер Ту віп 100 1605 110 сіу тигоїєц маї тТвгоуді 5егозяг 115 120
«10» Ба «11 449 «раю ВТО. «213» агтзтісіа! «20 «Р23» Вх2О8К2 Неаму спдія НОВ? то11 Тепдей -300х «3 сбіпома! сіп о зєнсуаі віп бек о сіу Аза сій ма! уз Гуз Рго су Аа 1 5 10 15 ек Уа! їу«х Уа! баг Суз у Аа бег біу туго ТЬг о РНа Те бак туг
Тук Меж Ні Тгроуаї Ако бів Аїа Рго с1іу 510 сту Ген бій теромеє сіу тгроїтіе тгроРко б1у Азр сіу бег о твгоїуз туго АТа бій бу вве 50 сій біу ага та! ТвВг о Меб Таб о Агу А5ротве 5еготвВгобек Тит удаї туг 55 70 75 50
Мет ві) іїец бер бБег оІіец Аг бег обі Ар ТК о АТа Маї Туг вБе сСує 85 90 55
АТа 5ег о рго Маї 31іе ТР оРго Ази туг АТа мех Ар Туг тер Б1у сп 100 105 115 сіу тиг ієй маї ТР маії бег его діа 5ег ТР Гуз Ту го 5екомаї 115 120 127
Ре Рго мен А1Та Ро бег бек бує бек тйг бес сту су тик АТа АТВ 130 135 140 гец сіу суб їец омаї бує дроту вро РКО сТЇм РРО Уа) Те мМаЗ бег 145 150 155 1650
ТгроА5п о бег б1у Аїа сей Так обег б1у мМаї Ві ТВгоРБе Рго Аїд Уа! 1655 170 175
Гец аїп бек бек я1іу гей туго бегоіїец) 5екозвг ма! Уві! твВгомаї рго 150 185 190 чек бег дак іви б1іу тТвгосій тб тує їі Суб дя У) деп нія фу 195 200 205 вго бег ди ТНг ої ув уві Ар губ Ага Маі сім РгОо Був бег Суз АБО 210 21 220
Суз тйгонії твг о Суб рго Рго Суб5 Рго Аїв ро сти гез о вей Ф1у о1у 225 230 235 240 вБго 5Зег уаї! РБе іти РНе Рго Рго ту Рго і м5 АЗзротТйРгР Беу меї Іїе 245 250 255 чек Ага твВгоРго бін маї так оСу5 ма! ма? маї ар маї бе НІВ 1 250 765 278
АБр о Рго піц маї суб РНе Ап отгротмг Уа? дер о сіу ма! бій маї нів 275 280 285
Ави Аїз уз тТпроцує РКО Аг сіц бій бій тук Аа бек тис туго Аго 2930 295 300 уа! мМаї бег маї бец тий" ма! гей о ніб бій дев о тгробец дип б1у гух 305 310 315 320 сій тТуг уз Суз цуб5 уаі 5ег дп Гуз Аа во рРго А1їа рго тів о1у 325 330 335 імя тиб тТе чет Гуз АТа їу5 біу сій Рго АР сію Рго сій маї туг 340 345 ЗО тик Сей рРгОо Бго баг Ага аїр біц Меї тк рух дп бій Уаї бек гви 355 350 365
Тиг оСув фей Уа! суб біу вне тук Рго 5ек АБротів АТа ма! с1ц тр. 370 375 380 бі о бБег А5п о сіу бів Ро й? Азп Ап Туг їу5 ТК ТвгоРго рго чаї 385 390 395 А
Сез Ар его Азр о б1у бег Ре впе їеи Тук Бек ух Гей Так Уа! А5р 405 що 15
Суб Зег Ага тер сій бій сіу Ап Ма! ББе бег Суз бек ма! мех нів 420 25 30 сій Аїа бен нів А5п нів тук тйгобіп бує 5ег сец бБег обец 5ек Рго 435 440 445 «у «210х 70 «11» 0120 «то РТ «13» свгвітіста! «ай х «ф23» Бх?ОВк2 пеаму спати мнО57, УН «4005 70 сіп ма! їй їецомаї сій 5екобіу дів бін маі суб уз Рго біу АВ 1 5 10 15 зек ма! зу Ууаї 5ег Су Гуз Аїа чек обіу Тут Те Ре тик бек туг тук їТе нів трроМаї Аг сів Аіа Бго 51у сій су рем бі Тгр Мет 5іу тир жів тер Рго еїу Ар біу б5ег тйг бує Туг АТа біп сує РВЕ 50 біп сіу дга Уа! тнромехс тТпг о Агу АЗр був Зег отв Аза тк ма! тує 05 70 75 ба мес ій іїєц щег бек цен дго бек бій дер ТВг АТа уві тує тук су 85 чо 95
Аза бег о рго мех те тТігоРго д5потує Аїд Мет АБО туг їго су ої 106 105 110 сіу тпг о їец ма! типгоуаї бег 5ег 115 1205 «2105 71 «11» 449 «2125 РЕТ «?13» астітісів! ке йО» й «23» паро пеаму спаїп НО5У ТИ Тепдтв «00 1 сій ма! бій Бей Уа! бів 5зеб біу діа бій уаї су5 гу5 вго біу Аа і 5 10 15 б5екоуа! ув ма! 5егоСух Му5 Аїа бек бТу Тук тТВг о РНе тпг беготук 20 25 30 туг тіе ніз тгроМмаї аАгу «іп Аза Рго б1іу сій є1у гей бі) тгромеї 35 о 45 біу ткр їі тер о Рго біу дер біу бек тик рує туг Аїа сій бух рРпе 50 55 50 іп сім дго ма! Тпг омеє Тс о Аго АБробує Зег тТйгоА5п тн ома! Туг 655 70 75 8а мес іш фе бег бек сечу дгоа 5ег сім Абр ТАг АТа Ма! тує Тук су» 85 99 5 діа бБег ого Меї 116 Тпг о рРго Азп Туг діа Мет АзроТуг тср Біу віп 100 5 119 сіу тАигоїєи ма! тНгоУаї бего5аг Аза беб тТвг о Гуз С1у Рко баг ма! 115 120 125
ЕМпе РгОо бец Афа Рго 5ег бек о цу5 5ег тргоб5ег сту Сіу тТпг Аїв. Аа 130 135 140 їез біу Суз цен уза)? Гуз Авротує РИйє Рго бів Рго уаї тВгоУаї 5еб 145 150 155 150 трап бБег сім АТа гео тйгоб5егб обі ма? ні ТВгоРпе вго А13 Уві 165 170 175
Мем біп бег бер бІу Ге) Туг бек їец бег обБег Уа! Маї Таг Уа ро 180 185 190 зЗег 5ег об5ег о ївуи піу ТНгозіп те отук їїе Суз АБИ Уві Азпоніз гу 1955 250 205
Рго зег АЗИ тТпговБує уаії Ар о буз Ага Уаі сій рРго уз зер сСух др 210 215 220 мя тТигонНів тре Суб Рго Бго Су Рго Аів рко ів гей вво бїУу у п2й 230 235 240
Рга чего ма! ве це) рРНе бро Рго вуз РГО у дер Тс рез Мет ї1е 245 250 25
Бек Ага ТагоБго біз Уа? ТагоСуз Уа! Маї УаЗі Ар уві бек нія Ти 250 255 270 дер оРКО бій УаЇ уз Ре Ап Теротує маї Ар о сіу Уді сів ма! нів 280 285 дей АТа ух ТВР Гуз вгО АКУ біз 10 бій Туг дя бег ТНК отук АгО 299 295 300
Уа! Уа! Зак Уа Гей тйгомаї без Ні біп АБО Тгроген Ай бі Гуз 305 10 315 370 іш туго бух суб буз маї бег А5поОбуб Аїд їец Рго Аа Рго т1е 61 325 330 335
Суз ТйкК те 5ег іс уз Аїа бух бі біп вго Аго сі) Рго біп маї тує 340 345 350
Твк ген овВго го бег Ак бій біз Меє те оїу5 Ап бів Ма1ї бек ген 355 360 355
Твг Сук іви маї су щ1у рРйе Тук Рго бег Абр Те АТа У3з1 сТь тор
З 375 З80 сій 5егодб5п біу бій РРО бій дей Ап отуг губ ТВ ТНК о вго РГО ма 385 390 395 400
Сен А5р бег др о бІу зег РНа Ре гїеи ТугобЗаг руб сей тиг маї дер 05 10 15 іуз бег дга Тгровіп бій сіу д5п ма! Ре Зак Суб бага! Мет ні 4325 525 430 оій Аза івец Ні5 Азп Ні Туг те сТй Гує 5ег ер бег оївеи бек Рго 435 440 445 су «210» 072 «вії 20 «вій ВТО -й13» агжхійіста! «й «ВЗ» Бж?208Е2 Веаму спдіп НОбБ, МН «00 072 біп ма! сій їец Уа) сів бек сіу Аза сій Маі суб суз Рго сіу Аїд ї 5 10 15.
Чег Уа! їуз маї зеє сСуз гсух АЇв бек біу туго тт РНе ти бекотує 270 25 30 тук мех Ні Тгроуві Аг біп дів Рго сіу зіп біу гео су ткромех 35 40 45 спіу тер ї1е тгао вро с1іу д5росТу 5егб оте тує тут АТа іп суб вле 50 55 50 сій сіу алго ма! тйгб о Ммеї тйг ого дер оте аб тТвг о АбАа тигоуаї тус 655 70 75 50 мет сій їєй вт о5егогеу дгоа 5екосіц А5р тйг Аа уві тує Ре суб 85 50 95
Аіїа его Рго Меї 116 ТпгоРго А5потТук Аа Меї Азо Туг тер о біу с1й 105 105 То сіу тт гей Ууаї ті Уві Бек бег 115 1570 «210» 73 «21їх 449 «Рій РТ «йіЗ» агтібісіа! «роб» шо «й23ж ВІ?ОВЕ Неачу спаїп НОБЕ Ти Теплосй «300 73 сіп ма! бій їеу о хуаї іп бЗес зіу Аїх бій Ма? їу5 Був вго б5іу Аа 1 З 10 15 ет ма! їуз Ммаї 5евг суб Гуз Аза бес о сіу Туг тТйг о РНа тв хаготує
Тук Мет Ні5 Тер оУаії Ага бій Аїва Рго сім о1іп с1у без біз тер мех зо 45 сіу тер т1іе Тер о Рго піу А5рошіу бек Трг огу5 Тує АТа біп уз Ре 50 сій біу Аг маї ТВе мес ТИР Аг А5роТвВго5ег ТВгодявВ тик Ууаї тує 55 70 5 во мес сі) їей зер бЗег цен Аг Зег б1й А5р оТИК о АтТа маї тук рНе суб 83 90 25 діа зег рго меї УТе ТПг оРго дай туг дів Меї АзроТук тер С1у іп 160 105 115 сіу тт оїєц ма! Пе маві 5еб о бег АЇв 5ег ТК огує 01у рого б5еє ма! 115 120 125
Рпе Рго еп АТа Рго бек бег Гуя чек ТВг овес сту б1у Тк АТас Аа 130 135 140 сер аїу суб зем маї цу« Азротук ве вго сім Рго Уаї тТВк ма! бес 145 150 155 160 тероА5п о бЗегобіу А1а сей Тс обзаеєб сіу ма! нія ТВг о Рйе Рго А1а ма 165 170 175
Пец сій бек бег сС1іу се Туг Заг оіемн 5ег обег маї Уа! Тк оУаї вго 150 185 190 ек бБег обегоїен 51у п оо1івп Таб оТує т1іе Суб Ай ма! Ап нів гу 195 200 205 то Зег АБИ Тек огСуз уаії дер Гуз Ага Ууаї бін РгГОо ув бек Суб Ав 210 25 220
Суб тис ні тТвгоСух РКО Рго Су5 РГОо Аїда Рго сш ген бен шіу б1у 225 230 735 240
Рго бек уаї пе цей Ре Рго Рго Бут го уз АБр отйг бе меї Тіє 245 250 5
Зек аг твгоРГОо бій о маї тТагоСуз Ма! ма?! маї др о маї 5ег ні 1 250 255 270
Ар орга бід маї Суб Ре Ап оТгротує уві Ар обіу маї біз Уа! хе 275 280 255
А5п Аіа їуз ТК оГу5 РКО де сій сі) бій Туг Ази бер ТК тує АгО 290 255 зп
Уа! маї б5ег маї ец Те ма! гей ні бій Аб5р тер Гей Ап о бТу суз 305 310 315 320 б туг ку Суб у Маї Бег депо буз Аїа Бей рго Аїа го її6 Фи 325 з 335 гуя ТВг їі бегогув Аїа цуз бі сіп РгО Аг сіб Рго сій Уві Туг 340 345 Зо
ТВг Се Рго Рго 5ег Ага аїз бід Меї тлг обу Ав біп маї бек Гви 355 350 355 тик Суз тей Уа іу5 бі Рае тує вго 5ек Авр тів Аа маії бі тгРр 379 375 зво сіц бег А5п о с1у бій РгОо с15 А5П АБО Туєк бує ТйгОотТигс РгГО Рго Уді 3855 390 395 за сец Азр зек Абр б1у бег о рРПе Ре сец Тук бБег їу5 Ген Те Уа! Ар 405 410 415 цуз его Ага теробТй сій біу Ад5пома! Ре 5ег Сух Бек ма! мет нів 420 425 30 сів Аіїа іїец ніз Аз Ні тус ті бій іу5 Бег ей бер вец зер Рго 435 440 445 «1у «210» 74 «її 120 «від» РТ «23» агтігістаї «вх хг п20БЕ2 пезауу сваїп нО/0О, Ун «400» 74 сіп уаї біп бе Маї біп бек біу Аза бін маії 15 Грубо го Є1уУ Аа 1 5 10 15
5ек уа! їув Уа! 5 сСу« Гу Аіа чек біу туг Тпг о рБє ТНг бек Туг 20 25 30 тує Межх нів гр о маї Агу біп Аіа вро бі бій сФ1іу Сей бів тгр о Меї 35 40 45 біу тТгр тів тгр о Ргоосіу Адвробіу бек Тйгоїуя Туг АКа сій Бу РВЕ. 55 50 сіп Ту Аго Уа)! Тпк Мет ТНг о АгОо Абзротиг бег ТнгозЗегс Твг омаї тус 55 70 75 50 мес бтц ївуи 5ег бек гей Ага 5Зег о бій А5р тВг о АТа Уа! тує тук сСух 85 вн, 95
Аза бег вго мес ї1е Тиг о Рго Абп о тТук АТ Меї Ар тує тер с1у 1 100 105 110 сіу так оїецп маї Тв уаї 5Зег 5ег 5 120 «210» 75 хеі» 449 «105 РТ. «2135 агжійтїсіа! «290» «фйЗ3» пхрОВЕ? пеауу спатп нОО жи1ї Тепдїй к400» 75 сій маї бій їєу ма! сіп бег біу діа бій мі Гуз уз вго бІУ А18 1 5 10 15 5ег Уа! вуз Уа! 5ег о Сух уз Аза бек бу тує тпг о Рйе тік бат туг зо тус меж ні Ткромаї Ага сіп Аза го біу сбТй ТУ Бей сів Тер мех що 45 біу тгр тів тгроРго сту дер біу бек тАгоїуз Туг Аїа іп гГу5 вве 650 біп бїу дга уа! Тк мет тНг Ага Ар отвг озес Тнгробеє Тео ма! тує 55 75 75 80 мект паї рей зег бек оіей Ак зер о біч Ар о тТвг АТа ма! Тук отуг Су 85 КО 95 діа бег рго Меж ї1е ТйгоРгОо Ап Тут А1а Мет Ар о тТуг Тгровіу їй що 105 цоО сіу тйгобец маї тв Ууаії бег заг Аза заг твг оцух щіу Рго заг омаї 115 120 125 вне Рго ей А1а РКО 5ег обег Гуз 5Зег ТНго5ег Ту Бу Тит лів Аа 130 135 340 іец біу Су5 бе ув) Гу5 Ар отуг Рйве ро 910 Рго Ма! тис маї Бе 145 150 155 160
Тер би чего сіу АЇа без Те зе біу маї нів Те о РНе Рго дів Ма! 165 170 175
Сеш сів Зес 5ер біу СГез туго 5ег ге 5ет бек Уді маї тик Ууаї Рго 180 185 190 зЗек зег бЗег еп бу Тйгобіп тТвг тує 112 Су5 дей маі Ап онів гу 195 200 205 рго бег дзи ТвВг о цу5 уаі А5ровбуз Аго Уді с13 Рго уз 5ек сСу5 Авр 2810 215 22 імя тТиб оніз ТВ Сув рро Рго Суя Рго Аїа Рго сів гей іви бу с1у 2255 230 235 240
Бгто беє чаї вве бе) ве РКО РгГОо Гуз РО Су АБротиг ве мет тів 245 5 255 ек Ако таб овго сін Уа! ТвеоСуя Уа! Маї Уві дяр ма! Зеконіб Ти 255 255 279
АвроРго бі Уа! Гуз вла депотер тує чаї Ар об1у мді бів Ма! Ні 275 285 285 деп ОАТа фу ТВг ог уз Ро Ага Зі іш сій Туг дей 5ег Тк тує Ага 290 295 300
Уа! Уаї чего Маї йец Тк ма! Сен вів сій А5ор Тгрогев Аби сі гу 305 310 315 328 сій туго іуб Суб Гух Ууаі бег Азп о їуз Аїд івн РгГО Аїа Рго тів б 325 330 335 ух таг о тіє Заг бує діа Сук щіу віп вго Асо сім РКО біпомаї тує 340 345 350
ТНк осей рго Рго бе Ага бій бі мес тт оїу5 Ап бів Ма! бек ген 355 360 3655
ТНгоСух їец муаї Гу5 с1у Бе Туг о Рго бЗет Або їТе Аїа Узі 21 тер зо 375 380 сій 5егод5п біу вій РКО сій дей А5потує уз Тс отВрРорго РКО Ма! 385 390 395 490 ем А5ро5ег Ар о1у Зевс вйе Риб се) Тут о б5ег губ рей Твгожаї Або 405 410 415 цу Баг йго тгросїй сіп сіу Абп' уаї РВе баг Суб бег ма! Меї ні 425 425 30 бій діа зец ні Ап нія Туг Тпгосій вує чего бен бек без бек вго 435 я40 445 сіу «210» 76 «в1ї» 120 «й12х рат «13» агтітісіа! «ох -2235 Ба20О8Е2 Неаму сбатп НОЙТ, МН «Ой» 76 сФіпомаї сіп без Уаї зіп бег с1у Аїа сіц Ма1ї уз уз Рго віу 214 1 т 10 15 кег Ма! їуз ма! бег Сув с у« Аза Бек сіу тує тТг вне тве 5еротує тук має ні тТгромаї АК обіп АТа Рго с1у б1іп сту бен бін тер Меє сіу тер жїТе Тгрорго Є1у Азросіу бек твбг обу туг Азїа біп гу вле 50 сів обіу ага омаї тВпгоМет так Аг Ахротвт Зег отого АБа тиб оУаї ту 655 70 75 во
Меї сі їецч бек зегосеу Аг бег сі) АзроТпг Аа маї Тук тує Суб 8 90 95
Аїа зег о рго Мебє ї1іє Те рго А5потук Аїа Мех АбЗр о туг тер 61у со1и 100 105 115 оіу тагоїво Уа! тТНг Уві Хек обер
Ї 115 120 «ЕМ» 77 «вії» 449 «рай РТ «23» агжітісіа! «вед» ; «ВаЗ» Бх208Е2 Нваму спазп ВОЛІ ТІ Тепотв «ЩЮ» 77 сіп уд! сій їгеи Уа? сій бег сім Аза бі Ма1і Су5 був Рго сіу Аїа 1 5 10 15 ек ма! їух5 Маї бег Суз їм Аза б5ег біу туго ТВг о Рйе тиг зекотуг 20 25 30
Тук мет ні тгроУуві Ага біп діа рРго сіу бїп сту без бій теромат 35 40 45 сіу тер о Іїе ТгроБго сіу Ар осіу бек тв іїу5 Туг Аїа біп губ пле 50 55 50 сі віу Ага маї ТВгоМеї тТйг о дго Аероївйт его ТВгодяв ТВгоуа! ту 65 70 75 80 мет бій бен час б5ег гей дед зег сіб АБр о тВг оАТа уаї тує тує суб 90 95 діа зег рго ме 112 Те Бго Ай Туг Аіш Ммеї А5О Туг тер оту сій 100 105 о оту тйг зем Уа! Тагома? бек обег А18 Бек тс губ біу Рго бек Ма! 115 120 1275
Ріпа Вко зец Аза РКО Зег обег ру черг Тйгочеєс сіу бі тТНе Аів Аа 135 135 140
Ге бі1у був їеи мМаії 15 Ар о Туг Ре РгОо 01 Рго ува! Тк оМа! бег 145 150 155 150
Тгр о Адб5п 5ек біу Аїа гей тпг обеєб біу чаї нія те о РБе его йіа ді 165 17й 125 еп аїп бак бек б1іу ви Туб о бегоїви бек обег уаі Уа! Тк ома1ї вро 180 т85 190
Зегк бБег бег о їбец 91у ТВгостя тТвротує їТе суб Ап ма! Аа Ні Гу 195 200 205 вго бег А5пП ОТГ о Суз маії АЗр обу Ага ма? зії Рго Суб бек суб АЮ 210 217 220
Гуз ТйкК Ні тТвгРоСуз РО Рго Суз РгО А1Їа РГО ОТ) Без о бей с1у 01у 225 230 235 240
Бко Заг оуа!ї Ре бец Ре Рго ВБгОо Бу рго їу5 Бр о тайК гей Меї Пе 245 250 255 чек Ага Тс о?го бій маї ТВ Суз ма! ма? мМаії Азр омаї бег нів бі 250 255 270
Азрорго Фі маї цує Рпе А5поїгротук уУуаі дер оту ма! сій маї нів 275 2850 2855
Ах діа їу5 тТВг о Гу рРгОо дк бій біб біп Туг дз бег тиг тук АгО 290 295 3900
Уві ма! бек ма! цей Тк омаї бец нів бій Ар о терогви А5п бу цу 305 310 315 320 сій тугі Су5 уз Уві бег А5ЗПоОБуз Аїа цей Рго АТа Рго їТе 10 325 330 335 мує тег її бегоіух АТа уз біу сій его АкЯ З) РКО Фів ма! туг 340 345 350
ТБ Сей Рго РгОо 5вг Аг сів 51) Меї так оїуз дев обіп ма! 5ек цей 355 360 365 тик оСуз бе Уаї Гуз сіу РБе стук Рко 5ег Ар ті Афїа ма! 5іШ Тїгур 379 375 380 сбіц бБег А5п оіу 51п РРО оц АЗп о АЗп о Тук ту Тс отТвг о бго вго Уді 385 З90 53595 400
Сез Азр о бег А5р СІМ 5ек Ре Ре іси туго бек Гуз рев Те о маї АВ 405 4310 4-15 іу5 баг Аг тТгробїп біп бу Ап Уа! Ре 5ег сСух 5ег Уа! мет нів 420 У 430 сій Аза івеи ніз Азп ніз тує тБгобій уз 5ег сей бек фей 5ек рго 435 440 445 еіу «2105 7585 кг1ї5 120 «10» РЕТ «213» агтітгісів! «Ох «Ей3» пУгОБка2 Нейму спати НОВ, МН «НюЮ» 75 біп Уа! біп ївеи маї біп Бек біу дів бій чаї су5 бух Рго біу А1В 1 5 10 15 ек уаї їуз Уа! бек Суч (уз Аїа Чет б51у Туг Тиг о РИЙЄ ТИР бег Туг 20 25 30 тук жх1іе нів Тер охмаї Аго біп аа вро біу бій с1Уу Гей біб) Тер Меї 35 40 а5 біу тр отіє тгр о рго біу А5робіу бек тик мує туго Аа сп зу. Ре 50 55 50 біп оту адго уді тйгомес ТАгОАгУу Азротйг Зегб те бЗеготве ма! туг 55 70 75 850 мес біш їец зег бек гей Ага бек бій Абр Таг Аза ма! тує Тук сСує 85 І) 95
Аіа бБег вго Мет ї1е ТПгоРго Ап тує А1їа меж АБр Туг Тгр о віу с1й 100 105 150
Фу таг іви уаї Тйг о Уді бек 5ег 120 «гій» 79 «ої» 449 «еї2з РЕТ «213» аптітіста «ех «3» ПХ?ОВЕ2 Впеаму сваїп НОУЄ ж Тепутй «400» 79 сій ма! сій іївромаз сій 5ег о сіу Аза бін уаї їу5 вуз рго Є1у АВ 1 5 10 15
5ег Уаї іїуз уа! 5ек Сух їм5 Аїа чего б1у туг тпг о Рйе тТНгобетг туг зо тук іє нібє тер омаї Аг ій Аза вго біу отТй фу Гец сі) Тер омМеї
БІ 45 біу ткр її тгроРко біу А5розіу Бек тк уз тус їх Сіп бує РНе 50 оіп оту Ага Уа! ТЕГ омех Тйг о Аго Авротйг о бБег ти бег о тТНк о МУаї Туг 55 70 75 50
Меї оц гей бег озаг о їец Ага Заг обі) дер тТВг о Аїа ма! Тук о тук сСух 25 що 25
Аіа его вго Мет ї1е Тк оРко Ап тує Аїд Мет АброТуг тер осіу бій 100 105 по сіу тйг о іїєм ма! тт Уаі бег бек Аїа Бех тпгоїує сіу Рго Зек ма 115 120 125
Ре рго іви Аза вро ек 5ег був бек тйг б5ег сіу 51у ТВ АЇВ Аа 130 135 140 іец біу Су5 іє Уві губ А5роТук Рпе Рго бій Рго маї тб маї 5ег 145 150 155 160
Тктро дп о бег с1у АТа Ге) Тйгозег о біу Уві нів ТВгоРНе бго АТа ма! 165 170 175 мей біп б5ег заго пвіу Сей Туг Зекоїеу бек Заг Ууді маї лик мУаї вго 180 185 199
Зег зег Зег гбеу 01у Те бій ТвВеотує Зі сСу5 Аа уві Ап ОНів уз 195 200 2015
Рго Баг о дяй ТК Гу ма? А5рогсу Аго Маї бій го бух Бек Су А5р 210 215 820 гуя ТВг нія ТВгоСув о рго бго Су Рго Аза рго То ем без біу У га 230 235 240
РО бег Уа! Ре Се Ре рко Рга іУу5 РКО у Ар Тигоїез мет пе 245 250 255 5ег Ага Тйг ово Я1ін Уді тпгосСуєз уаії маї Уві Ар уві зекг нія и 250 285 270 дерпорко сій Уді уз вйе деп тер ту маї Ар соту Уві бі ма1 нів 275 280 285 деп АТа бу ТНг і ув ро Ага зіц біз біп Туг АБ бег Те о тук Ага 299 29 з00 ха! маії его Ммаї цей тіг ма! сецз ніз сій Азр Тгр о ге) дп су вух 305 310 315 320
Фі) туг їуз Суз ух Ууді Зег дп оїух А1їа їеб РГО АТа Рго Те о 325 330 335 їув5 таг о т1е бек о гух Аїа гу сіу біп Рго Ага ст бко біп маї тує 340 345 350
Твг осей Вго Рго беб АБО біц сів Меї ТВгоїуз Аза сів Уа! бек гей 355 3650 365
Те осСуз їей маї цує с1у Рйе Туг Рго 5ег дев те Аа ма! Єїш Тер 379 375 380 сін зег ди біу б1й РКО іш Ай деп оту вуз Таг о тТАговго РКО Ма
ЗК5 390 395 290 іем А5р бек Ар Біу бек Рпе РБе це) туг Зак о їуб5 рец їНг уд! Авр 405 410 4315 імя бЗег АРО тгрочіп біп саіу АбпоМаї Ре 5егосуз бег ма! Мет Ні зай 495 430 бій діх реп нів дей Ні Тук таб оси уз 5евг ве бег фе бек рго 435 340 445 5іу -20»5 ВО «гії» 150 «212» РЕТ «213» агтібісіа! «Ва» «й3» Б208Е? Неаму сипдій НОЙ, МН «4005 80 «іп Уа! сій їец Уа? сів бек сіу Аза сти маі ух бу5 Рго сіу Аїа 1 5 19 15
Зек ма! їу5 ма! его Суз Гуз А1в бегосіу Тук тТВг о РБе тТАг обег о тТуг
Тут тів нів тер оУзі Ага бій АТа рго біу бій біу без біц тТгр Меї еїу тер її тТгрорго с1іу Азр о біу заротТвг о губ туг АТа сій Бу5 Ре 50 сій сіу Ага ошмаї тб оМмеї твгодга Ар оте его твг о Зеботйг омаї тує 55 70 75 що
Мет сі зей бер 5ег Гем ага бБег сі) Азр Тпб АТа ува! Туг рРАйе сСуз 85 90 95
Аїа заг рга Мет ї1е Тит орго Ап отук А1їа Меї до тує теробїу 1 100 105 135 еіу титівий ув! тТВг Уді Зег 5ес 115 120 «210» 81 «й1Їїх 449 «вір» РТ. «213ж агжібісіа! «год» І «23» Бх208Р2 Беачу спдіп НО? ти Тепоєй -3005 81 сіпомаї сіп бен оуаї сій бег о сіу Азїа сій маі вуз уз Рго су Аа 1 З 10 15 зег ма! їуз ма1ї 5ег су5 ух АТа 5ег о сіу Туг ТНг РНе Твс 5ег о туг 20 25 30
Тук ті ні Тероуві Ако бій Аїа Рга біу бій біу без бій ТгроМмеє 35 40 45 сФіу теротіє тер овго «1іу А5росіу бек ТВгоїуз тугб АТа біп був рле 5О 55 50 сіп оіу Агу ма! тТйгоМеб Тпг о АгГУ А5роубе Беготве Бек отик маї туг 55 70 75 850
Мет зіцієй 5ек 5ег Гей Аго бег бі АЗр о тТпг о АТа маї туг вбе о сує 55 90 95
Аіа бзег рго мат їЛе ТК оРГО дп тує Аа мет АБО тує тер Є1уУ со1п 100 105 1195 сіу таб оієц Уа! ТК Уві его об5ег. А1а бег Тпгоїу5 0Ту Рго бег ма! 115 129 125 ве рко сей АТа Рго 5ег оЗег рук бек тк обвг о сфу біу ТНК АТа АЇТА 130 135 146 ів шіу Ссуз їви маї бу5 А5р тус Ре Рга бли Рго Уа! те ма! б5ег 145 150 155 1650 тероАхи 5ег біу Аїа цеу Тйг об5ег С1у ма! нія тТпг о Ре Рго Аза чаї 165 170 175
Сез іп бек бек о1у Тен Туг бек оїеу Зак о5ег удаі Ма! Так омаї Рго 180 155 190
Зек Заг баг їв сім Тк осів тТВготук їі Су5 Ай ма! Аза оніє Гу 195 200 205 вго бек АБИ тТвгогГух угі Ар обу АгЯ маї бін РгОо Суб бег Суб Аа 210 215 220 зу таг нії ТАК оСух ро Рго Су Рго Аів РКО сім вевобец Ту с1у 225 230 235 г вго бег уаї Рйе Гени Ре Рго Бго ух Рко 15 АБр Тпгоїеуи мМеї Те 245 250 255
Зег Ако ТВгобго бім маї тТвгоСуз Ма! Уа! маї Ар оуаї бек Ві 5 бо 255 270
Адзр Рго сім ма! Гу5 Ре д5поТкротук уаї Ар ооТУу уві бій маї не 275 280 285
АВ Аїа уз ТВгОмує Рго Аго бій бу їй Туб АЗИ бе ТВг Тує Аго 290 2935 300 ма! Мат 5ег Уа! Ген тйгб ма! веш ніз біп А5р тТерогеи дей бу у 305 310 315 320 бій тує зуб Суз губ5 ом! 5ек Азпобух Аїао гей Рго Аїа го 3161 325 зза 335 цу ТВг тів аег губ Аїа Гуз біу Фіп Рго Аку сів Рго бів ма! туг 340 345 350 тик Сем вРго Рго 5ег о Агу із бі меї ТНК огу5 дев біп ма! 5ег Гей 355 360 365
Тиг оСув гей Уді уз сі Ре туго ргО бек АБО Ї18 АЇТа ма! бій тер 379 375 зо бій бег д5и біу біп ро бій АБп Ай Ту вує Тит ТР оРго Рго Уді 385 390 395 400
Се аАбр зег Азр бу 5ег Ре веБе їец Туг 5ег вуз Ге те ма! АБО
Кк 410 415
Гуз бЗег дго тер обій сіп о б1ТУу дп Ма! Ре 5ег Сух бек Узі меж нів 420 425 30 сій Аїа іец о Нібв Ази нів туго твгобій рух бек їеи Бек ге бек о Рго 435 440 445 чіу

Claims (3)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Кон'югат антитіла з лікарським засобом наступної формули (І)
ді ГК, РУЧКА () або його фармацевтично прийнятна сіль, де: Ар являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, здатний до зв'язування з ІСЕ- 1К людини, де зазначене антитіло містить три визначаючі компліментарність ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності БЕО ІЮ МО: 1, 2 ї 3, і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЗЕО ІЮ МО: 4, 5 і 6; Ї являє собою лінкер; р являє собою угруповання лікарського засобу наступної формули (ІЇ): о ой - кое м и чн чно пи о шо оч я хи г тег Но и Маса вима р а в; шо Моя ТЯ В. 3 їх х ї А м. ак У й я М ве ее те х Мо 5 ї З ! т М В в й "у з , (І) де: В2 являє собою СООН, СООСН:» або тіазоліл; Вз являє собою Н або (С.1-Св)алкіл; В» являє собою Н або (С.1-Св)алкіл; т являє собою ціле число, що складає від 1 до 8; хвилястою лінією показана точка приєднання до; і п дорівнює від 1 до 12.
2. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 7,213, і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮО МО: 9, 5 і 11; р) антитіла, що містить три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності 5Е0 ІЮ МО: 7,213, і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 10, 5 і 11; с) антитіла, що містить три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 7,213, і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності «ЕО ІЮ МО: 9,51 12; ї а) антитіла, що містить три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 8, 2 і 3, і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 9, 5 і 11.
3. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1 або п. 2, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 13, ії три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 9, 5 і 11; р) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14, їі три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності 5ЕО ІЮО МО: 10, 5 і 11; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15, ії три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 9, 5 і 12; а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 16, і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності «»ЕО ІЮ МО: 9,5111;ї е) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17, ї три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЗЕО ІО МО: 9, 5 і 12.
4. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1 або 2, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 18, ї три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІО МО: 7,2 і З; р) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність 5Е0 ІЮ МО: 19, ї три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 7, 2 і 3;
с) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 20, ії три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 7, 2 і 3; а) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ФЕО ІЮ МО: 21, ії три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності «»ЕО ІЮ МО: 8,213; е) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22, і три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 7, 2 і 3.
5. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де АБ вибрано з антитіл 208Е2, 212А11, 2148, 21906 і 213810.
6. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де АБ містить: а) варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності 5ЕО ІО МО: 33, де дана послідовність ФЕО ІЮ МО: 33 містить щонайменше одну зворотну мутацію, вибрану із залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79,821 95; 1 Б) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності ЗЕО ІО МО: 35, де дана послідовність ФЕО ІЮ МО: 35 містить щонайменше одну зворотну мутацію, вибрану із залишків 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 або 87.
7. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де АБ вибрано з: а) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з ЗБЕО ІЮО МО: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80; і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності зЕО ІЮ МО: 9, 5 і 11; р) антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮО МО: 57 або 60; і три СОК ділянки важкого ланцюга, що мають послідовності ЗЕО ІЮ МО: 7,213; с) антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, вибрану з ЗБЕО ІЮО МО: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80; і три СОК ділянки легкого ланцюга, що мають послідовності «ЕО ІЮО МО: 57 або 60 або будь-яку послідовність, щонайменше на 80 95 ідентичну 5ЕО ІЮО МО: 57 або 60.
8. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де АБ містить: а) важкий ланцюг, що має послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79181; р) легкий ланцюг, що має послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 59 і 61.
9. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за будь-яким з пп. 1-8, де Ї являє собою лінкер наступної формули (ІП): дення й о ; (І) де: Ї» являє собою (С4-С:іо)циклоалкілкарбоніл, (С2-Св)алкіл, (Со-Св)алкілкарбоніл, МУ являє собою амінокислотну ланку; м/ являє собою ціле число, що складає від 0 до 5; к зе ТУ Г Ц бо» ме ак пса У являє собою РАВ-карбоніл, де РАВ являє собою М т у дорівнює 0 або 1; зірочкою вказана точка приєднання до Ю; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до АБ.
10. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 9, де І» має наступну формулу:
ху Я я я о й Ше а ее де зірочкою вказана точка приєднання до (М/м; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до атому азоту малеїмідного угруповання.
11. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 9, де (ММ)хж вибраний з: простого зв'язку, г ; х Н В ІЗ В Й Ве ие ик шк НА ша ше к меш й У т у М Ше ги їм ї М Й ту і М ї 5 СХ ї3 , а вч чі
«М. КУ шк, Ки х Я о Ши ва ех м й бе ще - ву де зірочкою вказана точка приєднання до (у; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до І».
12. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 9, де м дорівнює 0; або м дорівнює 2, і (МЛ) вибраний з: т у ке М Т Ж їх 7 В я ше і я в ту я я Те М Щ т Бош р ї У Е З Е М В і: х М й щ Щі й х ух Ка М їй М т х ! ; і ни шо В Й ї ; щ й ої що Ж хо -х де зірочкою вказана точка приєднання до (у; і хвилястою лінією вказана точка приєднання до І».
13. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за будь-яким з пп. 1-12, де (1-0) вибраний з:
ВУ дах МК і Н ц - б З КО с ім нок ЖЕ в З : В М я нн и нн А и НН ЧИ Дн В Не о но о В ас ЗЕ : ко С ЗНЗ З: ШЕУ : що Я Х Гак у, й сш хх х її СЯ - м. чі м. вах 2 а ке сю пк, Я «А ваша іс кХ р З ас Ся ГК Ме вся - га Бі о мех м х Н В В ІЯ Н і іч ЗХ ШЕ | М ї і х ЇХ кн нн Ши я К Ба їй У х ї В їх У х ї ї ся ї с В х х з ТУ М ї їх НЕ м: ЕК З ОЗ чу " М Й Б й х ко У Хом ОК КЗаНЕСУ Як Н м ден М х Бе в х. г Х х Х в, (Е-11) ї м Хлкдлх М з В:
х. ЕЕ щ ке о в Я я що М х Х КЕ хо Ж - ОМ ак му х ди нн и в вл х : У си нс - У І її ї КУ : екз п ї їх ГхЗ У І х я ху - з Є а се ср, В ї ХХ Т Х, МК 5. В сук ох - пане ше й Я В я т а ная У її н 7 ок, ж Коня їх че х ї ц їх м : З я їх х й Ї гу ЕЗ М и і ВЗ КІ ї і х ї ши ж ГУ а а ЧЕ НО а х тав в Мк Ва МИ ЗВО ВЕ: х 7 В " ре : х х (Є Я : щу Ж Н г ГУ чу ї ЩЕ мк, е ше ї - З її в; х їх ен Та Ми щу у ХМ рь НИХ ще і х ї ве лю АХ ох хо (Е- 3 і ; ;
В . кі Щ ях с дк це - х Ка нн А Ше ки гу З В х х се и Ос й В 5 в Кя 7 Кк Кути їх ї 1 х ГУ І ІВ т КУ я виш і Х і Б й КК У кн п С Мод МА ви иа а Є СМ -ї ЩІ нт Ех їн й їх х ІЗ т. 3 їх ї З а х Ї і К: ї ке хо ї ко п 1 У хх сх і її ще 7 во А З Ме є тю «З у х - м х 4 Х Х ВУ іо В хо у її СИНЯ М К Я Її у КЗ го хх - у З х. щу ач зео(в-12 щі мух ДИ Мамо е Ме Т і ї М їщй що т. з З НН ШК: х НІ и х ах п а а на а ня : пе оо в м - Е з : ШО ІН ї п ї ї х я «І що п ня ше я, : х ш: ТЕ ХУ мА ОХ КОМ ше т бю х МУ, Й і бро З стран ни Я З . ЦО Я ох Й а ож й ї Н т ті т. і що ЗУ нн нн чн нн на іх вва си М ЗНМ ЗИМИ НЕ х т ї Н : КЗ ї ї
І А.О В Е по ще т оту за БА Х А БУ х ще МА й х Ба у х М пу хх ши 5 «(Е-13)
В. у кі «ЕК 3 Ки - Що СУ З 3 ту г ї ІЗ М яко м їх г х ЕН ке х -к ОВ шо М я ко ее нь а я ак КУ З В в Ши а в опи п Вс МИ Є: Ж от й в ру ту ЕУ Ж М Ка ї К - ї М во кеша А г я с стеку БУ и а а У У У ВУ х с Мох : ЩЕ Пе и ЗЕ ВИ т : х се Н каш хе т КУ ке ву й с х вк йо х У х у х. Я КН хо ТВ БУ х п ня Хе х кт у ї Й х я СН ню ї х Н х х т. ХМК Е з ( Щі ск Н хо ії к ше ща и и ан Ж фот ТУ Я чани ще а че її ; У т КЗ Е х тод М їх В х ЇУ Це ї ІЗ . З дання й ї Н І ї г Е Ком ША ко т : кі їх Я що шик «ТМ. жк ше й З дон, хх Б ро іа В М КЗ х і ев ше У І у Ї х м Ух Іу їх ; В ї і КЗ КУ : Кая ї Н її га кова З до МУ У ї не су - ГУ і х сек АТ ГУ у т ж Хей а: Ма Ва В хх х З х Е року че (0-13 з (
МО. ше шт ох Ми - щи х гу Не й - ге В їх З НЯ . ноя Я Яку ве ше х сх --я Мои тт, М» Б з я Е : Я а и В В с В ЗВУ ІЗ щх и ї ІЗ ко ши М ї ї М ї : ї хх ц : М в на а ок . ГУ БЯ т х у т ЩтТ 3. що их Ка и нн че г ї ОК гу Х її ду ди в ТО т БУ ї г : : ї пдлХ, Шон - шо я т х ї Ву х ї х х х жк ми х и х т Н ї Х У ї Кх їх я Екс З Ше н оч, а и й нд кот м х х ов с х Хо г З енеи ан х х ах т ТУ х ї х х М ; (Е-15) сю ко и Неих г ЕФ ту ох я : Го т ; і З ре М ши ше ше що Я М 3 М ПК, я Я УК х че. і Ух в і о І а и м х. ї Си и ЧО Чо си М З У БУ ї З 4 й 7 и У Ми й ї їх ї Що ї. д Її Х. х К-Я - я й х : ї у СЯ х х й Ще : х х ї ї ме ЦП Н ТЗ г ков У х Її -ч їн І ї Ко ее х Му о ех Бе - Б З їз Бе я нь я гу х Ох х сен Іі ю хощ ВА х т ТУ Н ї. -ч кана 1 жк У хле : ШИ х х ХК шу К с 5 ж х х хх 5 (6-15)
Н х М Ким «М у пи г ри йо мишья їх у мА я ех оц и в я А : 5 г ас ки ом с к х ле ГУ н ї У 7 х Дн НИ й Е ї М Е : Е ЦЕ 5 В) й БЕДКСЯ ян : ї х їх т Б Ко о нау ЩІ в хор о вовна и не т х Н її ку, Б фе НО й я т г й у Я де їх нан У - М її ї Кх Х й у г. м От ме нн о НН и ме і шоці ее ие х х . хо ТВ Б) й Б й ї 3 тож рова и НЯ й Н х ся с , (Е- і г га а є вої її кн Б М Х їх М . ; Кк ї їх. тя, ян ше я м, БЕ со Ше Ки щ Же, х ке ан вас ти зм ее зом хе шх Ш гу Ж ща сяк гання ій т ї 11 ія : ІЗ Ге ї і З 2-7 т Її х у ГУ р Н т ІЗ ке х ї ке 7 - к ; Кк. Х Е В Х. - ї. х Хию г реж н С Хв ож х кр ши ур щи а ше тех вх З ож з Не Вк ї М : ІЗ х і КЗ ВУ Іс і її ХУ х г її си МЕ реа ку БУ ех т о Н Ме х тк. ск о ке зо х х у м «жу «о З у й Мдшиу (Б-62) нок КУ Ух З я, -кх їх Ії ї о ши ШК З ре М я в у ких ши з з че К- Ще СЕ бе и ек бує 35 ч ру МУ їх ї їх М ї х В хх т 5 : ще и їх Я Н Я 3 ї че " дн, Трою НУ ше нн нь о НН о о ня й й Зх я я з ще ик щ а ши М ж 7 З а те Кк В ще Кз х у Й і Х В і Х х М. З Фо : м За У ї не Мас КОТИ ХУ т х х тУмрот у ХУ я ІЧ їх вч 50, (Б-63) де хвилястою лінією вказана точка приєднання до АБ. ' Н Н "
14. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, що має формулу, вибрану з: 7 7 пт х ши: : : і Н І ММ Н ї пед МТ, ї ї Ву ї Н МА ї 1 и Тк у 1 Н ї : щоб і і-ї й М - Н 1 но ж Я в ї 1 ї В КУ ї х М - Н да о а а о Е Ки З а сп нн и М В : і тки К У НЕ З и : ЗИМИ і і їх х 2 Х 7 їх хм Х, КЕ М. « пише АЖ лиху й Н р Кох г. З буки км ке й Жим ет : 1 г ІЗ У й г Ко ї Ї : ро і їв. с: : : т о на о а а : 1 те Пд ди м я ик щ сь че о ке : ї ру В ї М 3 В ї . : і і х г і : З ПЗ : ї ї т Хо ї ї в ді : ї рик соня их ок ї Н і й Б Й : і х «лк Н Я ходи юи Я Н м 3 : і дк Н і Май Н і В й х : ї і В : : х А ню І С Її їх СУ і Я і : НН : п їі ї тот і їй ; БЕ ї я не у (дБ-
: т. и : І дк ЕЕ : і ня і : Ву і г ! їв - З Н тд м їх : - Н З ци ї ІЗ І і Ге я нт ач ко ШІ ее : чин І нн о о кн о і вх й Н Аля Я й І 7 ВНУ Кт. В : Я зе МІ х х г хх і і Н ! фе рим Ну за Її М як щі У х : рот дит хх и ой тм че; - Я че ще Н Н У ї Н К Но хе ї Ох Н Н т їх ї Х х х 1 мо Н : Б а в и о о а Я : : мМ В З о о т о За і Н Її ї х. Н х їх У КЗ ї : : пох. : ГЗК дин Н : ень шк ей Я Е : Що У Н : хо ещи Е Н 1 ; Н Н м х Н : г не ї : Єле : : ї х Е : род Н ШКО Ж хі Н - ї і і у І м і Хот 1 ; (АБ-Е- ТУ шу і ч ї ч ї Ц 1 1 ї- : ; ою ї У 1 З ї : їх я Кох хі Я : ок ск, шк, я т Ат, У. де . де : ТОЖ мин ра ПАЙ зх с. ин, М мк і ТМ их яке ни вес с Кк ох с ще Н ЖИ ме т і щі. її 2 В х : яАКОГУ м їх Н И Е т ї ї КЗ ї ЕХ Н ГУ Н І: х ї ї х Н Ток, т ие рено й А ек Я Ме : Н пох ем тки НЕ Сом и чи ери кий Е Н М м Ві 2 Но ї ГУ х і і ! 7 п Н З ІН 3 жк Е Н ! Її п : г га шен і і дит а ин Є ня : , я - я Бе» Н ' М і. Н ! : х і ! х С Н ї : ЗДУ : Кі і
Й А. : Н ТУ Я Н : Хо Й ї Н : ? Я ! : -х РО : КЗ -я кі Н ра г кі Е КОМ і з В і Н їх сей (Ар-а-12) з ї во да ШИ Н о а Н : ї ' Н х ! Н З Я Н 27 ї Н У Я Н ї Я Н У Я ї ї ї і т Сн ; НД - ро їх . : Сх я У У ЇЗН : її Н ї ї і : ан о и НН З ї ОТ А ши кі ди Мою, : ймАа С ї : х ї я х . Н КУ й В : : Я ї ; Ї і межи : ГІ 53 Б й Н ї х 1 ння «г ТХ й 2 УЧИ Б БУ х . . і Н т ях ху к с р и я п: че 1 Н г 2 - шику, дл - шко тт, я ! : й Х Н ї М ї : Ох і : А ї ї 7 ! ї : Н : й ана и и СЯ Ка Н Н ти ТЕО НТ тю ат : і і х Е Й Х ІЗ хо : Н з Гая ще Н т їх ке Н Н оо, ее сн Н Н и т і т їх Н Н Й ї Н Н кош Н : с і Н : кеш : : М х м і х Ше Н ще ї.. : Н сш ту : х х: : т і і За В Ї НН Ї Н ї Н ит ! АБ-Е з ( Щі Щ ! її Ух Я Н ца ті ! і ко зд : ! іх ! Н «МА Н в ме М і бл у к ГУ ї Я НЯ Не ІЯ і : з У Я ин с ще ге т кЕ г Ух її х: . ГУ МК Е раки На ї ї- Н х ї х Не їх : З 1 Жах : ї х М х : ІН п Е із Кк У 1 НУ : - ще й їх хх по се Х М У я ня ТЕ 1 Ак, с а со» од па во п и о 1 Н то ро г ни че КУ КЗ з М х х х ї Н с З ї В ; 3 ВУ їх : Н 7 Н х. З. ї Х х ї Н : т т ї їх її х. й ї В Й ке п до ке я - ї у лю. н. о у Н і ч у Н і їх АХ. Я Н ї у ру М ї хх у ї і - А Я Н и нн Я Н ле і Я : т х . Н Н 3. Я ї яд. ння 1 Н КК ший К Н х СН Ї х КУН о що (АЬ- з ) ну :огу : ' нку ! ! Ох кі хо і а аа а и здох че ання ня і Чий У Шк но ї Бай ї х че " 7 хо Н Кун : й ї х Е: М й 7 Н ЖЖ т М Н НУ . ї З М ру Не еЕ Н і ; Б це х Є М Х 3 я Н 1 Е Я З - ж що ех. я ній Н І: ет ву ве по В и В я з В В нь Н і ск ще се і ія з У і т у Н Н М їй ї 5 г х ІН у Н ї ж : їх Я ї В х х г Н Н Н гл ром Я їч г же Н : и ГО В ї З Кан і Н МК в ни Н Н т " Бо 1 ії Н х ї і ї х «ее В ї Н ше ЗУ Н ' 1 х : ! я їх Н і хх ра Н Н Я Шк : Н я я х : : 5 х Н Н ї і Ї Н о Кави ЧИН Н ї ке : УТ ШЕ хі Н же : ї БУ Н жк їж Н Бе НЕ м т Ар-О-13) щі нн
Кт. Н
: . . (є Н ; Наш Н : жде ї ї. ЩА ї Я ОТ у Не р г, Н : вок їх нн ! їх М ї х М : х є Я : Гобюдитют и и хм с днк з Ф й тк Ки, : ЧНУ й Ух х щУ її її т х 12 1 ї н і Н Ен ї КОМ: ї ї К ЕНН ї КВ і У Тх . у й НЕ А Не ї г КУ що с ШУ оо й : : -х НЕ х Ко в нн пуд ди дж Ж М т М Н Те, З в м че и и жд дя « в г її о я х Н ї я я м Би ій КЗ с БУ хх їх ї І х ЕУ м Н : ТЕ ІЗ ІЗ Я й ї ї : Х ї і х : Н х х її : : х 5 ; З х. у Н : АВ 4 о АВ рені і Е о мух З а и ня Н і Ко - її Н ; Е їх Н Й хом Н ї речи Н Н 7 У ї І і сих Н Н сей Н Н ї т :
ї ї. й Н АХ оті й м не Н щи ; (АБ-Е-15)
- пл ї г ї . ке з роя ке . ін ха побут» вт, м 5 ї г й Е Н Х Й ох КІ ї її І ІЗ а Н ї хх ї 5 с Ь 5 й їх. ї Кох я я ро я М що жк о ве Не шана ей реж М й Н хг ее и ви ка хи іх в ве І5У зу т х Н йо Е ї й Й т. ія : й ї х Н Ж : х й ї : й ї ; 4 ЕУ 3 Я : УТ Н х т Н : я й Н г кх Мо Н НИВА ГУ х. роки й Ко я и Ел Б А : Те С Бе Мо ту че Й х : ї Я їз х і ж х сф Я і ХА МН Е і - МЕ і Н ї х Н Н Її Б 7 Н і ї Я 1 ї З. ї 1 Кн ва і Грош жі і ХХ я щі Н й ; Б ї 7 х хі Н т : сте ОКХ /(АЬ-С-15) Н М СН : І она і Н : Н : Н ОК : Н - Н З : : ! Її : Н Н Н Ї ї Н Н : ! ! Н : Н ще Н ї їх з Н ї - ГУ - Н ІН ту я; : у і ії и ШО ше чик Як ск сл г МО Ме тки о ях і ши а и нн а - її ; я пит, А Я М й йо ї т М ї м 7 КЗ м У 7 У Н а Й І й М ї і ї У з З і: мо й і КоеХ її но с с нн с и а НН Н он хо кош ТА зт чи и з М злххх ї- ї : о т У - - МЕ ї 75 ї Е ї ї Н У що ї ї ї Я х. х ї : й і Кк, сп : хх Я я Н Н і: Ї в І «У Ї дней : Мт мес а В Н : х і: й У Х ї : х х : : у «ом Н і Хв НЯ Н і З Н Е Н - ї
Н . сова ї і м х : : КУ й Н : : «А ау Н ї У і іш В ще ; (АБ- ву мне і у ди с Н Н ВИМ ї Н хо ий : я: Н Н Н ї 1 Н Н і Б Н 1 т Н і і : Я : ї Н : і Н : і Н : Н З і ; Б: НЕ : їм в їх ГУ и Н 1 х : їх : х х К КІ г Х. х що Ко А ат ї ще я поь І о и НИ я они я В я І п Ше З ие иа: ха ких щ ше и х її ж - Тане : З ши Й х Я 15 т Т ї КУ г х з Я х 1 есе ї х й щ ї Н ІЗ ї Не Е У ще КЗ Н їх х т но ї їх ба х. Ба М Я их я М : ї дит КУ БИ ьо енд, си о. кн чн ОН нь Н хом Зх х ря й и в Ьх чо Б «М ох з у Н : м кої ї МЕ ЗЕ: їх в і : Н А й : г Х М і Н МКОодику, ме НН Знез : ї Ш т й в) х Н : їх Хв Н Н НС Н і и : Н й ХМ. Н : Зх : м ше ше : і ї ! ї їх. дети ї У т ї що ї х кі н 0 (АБ-Е- Н мМ ух : 1 х То зи Н Н ТЕ Я Я ом Е і | і ! і Е Кох й Її у це ї ше нот Ж в НУ ЕН ї х М Я Зк. ко Її НУ нь в о о в и а мч ке я . ї Ж шНе М ьо ех є М хх чех їх с І х в ше ! мк шен ни Шк оно Її їі У : Те Кон нн фе а о а на и ІІ ! і че Ол и кр и а ! Н гу Не х х УЖ й їх х : ' хо ї х х ї 5 ї х Як ї Н Н т ще 7 гу т КА ї Н «у М Ковка ! Н й тю А г «ЖЕ х ї Н їх ї ! : ок і ! ШИН і Я й ! Н Ен Й х Н Н Сб Н Н Я Н ! Н х х Н ; НЄ та і я Н Н ще Н Хв і Бе НЕ Є І та їх фармацевтично прийнятних солей, де АБ вибрано з групи, що складається з антитіл 208Е2, 212А11, 214Е8, 21906 і 213810.
15. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 13, де АБ вибраний з групи, що складається з: - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 56 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 56 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФБЕО ІЮ МО: 60, - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 62 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 64 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності «ЕО ІЮО МО: 64 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 60; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 66 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 68 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 68 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФБЕО ІЮ МО: 60; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 70 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності «ЕО ІЮО МО: 72 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 74 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 76 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 78 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО: 57; - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 78 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 60; та - антитіла, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності «ЕО ІО МО: 80 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФБЕО ІЮ МО: 57.
16. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 15, де АБ вибраний з групи, що складається з: - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІО МО: 58 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО ІО МО: 58 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 61; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО І МО: 63 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО І МО: 65 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО І МО: 65 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 61; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО ІО МО: 67 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО І МО: 69 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО І МО: 69 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 61; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕБЕО ІЮ МО 71 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІО МО: 73 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО ІО МО: 75 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІО МО: 77 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59; - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО ІО МО: 79 та легкий ланцюг 10) послідовності зЕО ІЮ МО: 59;
- антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕСО ІО МО: 79 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 61; та - антитіла, що містить важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО: 81 та легкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО: 59.
17. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 13, що має формулу: дв ж ваш Ше йо в 2 іх гу о З хто го кн | : і ше Кк : і тд : : дей, : або його фармацевтично прийнятна сіль, де АБ являє собою антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО: 80 та варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ МО: 57.
18. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 17, де АБ являє собою антитіло, що містить важкий ланцюг послідовності БЕО ІО МО: 81 та легкий ланцюг послідовності БЕО ІЮ МО: 59.
19. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де п дорівнює 2.
20. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 1, де п дорівнює 4.
21. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за будь-яким з попередніх пунктів для застосування як лікарського засобу.
22. Композиція, що містить щонайменше один кон'югат антитіла з лікарським засобом за будь- яким з попередніх пунктів.
23. Композиція за п. 22, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій.
24. Композиція за п. 22 або п. 23 для застосування при лікуванні І(Е-1 В-експресуючого раку.
25. Композиція за п. 24, де ІЗЕ-1В-експресуючий рак являє собою рак, вибраний з карциноми молочної залози, ободової кишки, стравоходу, печінково-клітинного раку, раку шлунка, гліоми, раку легені, меланоми, остеосаркоми, раку яєчника, передміхурової залози, рабдоміосаркоми, раку нирки, щитовидної залози, ендометрію матки, мезотеліоми, плоскоклітинної карциноми порожнини рота і будь-якого лікарсько-стійкого раку.
26. Спосіб лікування ІСЕ-1В-експресуючого раку у суб'єкта, що потребує цього, який включає введення суб'єкту ефективної кількості щонайменше одного кон'югата антитіла з лікарським засобом за будь-яким з пп. 1-20 або композиції за п. 22 або п. 23.
ІЗ А В ще | і 4 з СОМ КАН дк ДУ З дк не Кл т кВ шк хемерн АТ їх й » «ВЖИ ; ї що і Я ШИ ше Ше щ / За В ЕЕГ зо "й ТЕ | і НЕ ше ше п М ЕЕ й й ЕЕ її Ме е ЕІ і нн нн нн не , сс НС НИ С че о си я р в в ши нш ж с ї З К 5оЯ з ї ї щЕ з до ТЕ ша : ши ж шк киш шк шк с с МЕ, від авгійскої гавай Пистевсем іпбопейу «середня інтенсивність флуоресценції г. А В жо і з і | ж доОаЕе ж соОВЕЕ ! зу в смів В х виє зе Ж ен ій ж мак В ж «віче Ж і Я - КЗ я ФЕВ НЯ : Е І й й . жізкаихннаних ЕН; ЗЕ: ЗМ ЩЕ ЗМ СУ же: Є ВИ ЗИ МЕ З Бодімі оз Я
НГ. а о! во ж ща «ще м дит ою Як в кине щі ре ВО т ява щі 5 же - У ОН о к кру ЕЕ | се: ШК « СИ зв є 5 ВОЮ о в ВЧОВОВ зу і а щи я І з ки Як й с. ; дело війненвния не "т я і дей чне щі кА: ни оо 7 нан ря сх. що я т, Меч ов г, Я ІМмО д ж МпОоСса чі а товка ; Шон : як які я пи Ше ж ти 100 дя ш ! ЩІ ее талагВ х Х га Я й -х й ее тає1лАТ 4 «І -8 «В «Її В са (МІ чн. 4
А В
З. а ж ШИ З Мишині АТ «Ж а з Я мані А , во пере | і ї й жк Химерні АТ - б о -- ШИ щі ЩІ ЩІ А їн е сВШОЄ ! ши | | й і з ее БІ КЕ, ! Пс я ШИНИ з МЕЗО «В Я й. КІ ЗАЙ ща НВ ДО он Є фан І І о пмнувювь засн її | | і яко «а Невні ши ше ше ва в ше ши я щі пен ші ше ЩО ня ни юн і ЕВ: В ФИМКИ ко кН СаО с
ОН. ЕІ, снами ни о ОК но В З З нм и еконо ЗАМ Зам КЕНІЯ кот НМ 0 рова Е й ; ни вні кни ни С п я ше
В. ІЗ Ко і Ї она ниБЕвх ! Ге кн А НН В во - с ї «КВУ хо фе хихитят кидижуки ях зи боях и ни шоу м о чклжи кими Не ди ЕС НМ с: ЗМИВ нон ннннн «во «Об б 200 оо во що чюО об 05 08500 Час «Пити» в перекпаді з ангійскої - людський «соупс» в перекладі з амгійскої - мавпячий чіг. а хх Жвн (г ї . че 3 Е і ЩЕ З з ж ! ! З а мех 1 ї З й Ко «в ше ро В ав. ! Б о че о. ; та - « со Ф на - : Н Б с ж - - тп тд й «ЩЕ (З Ж іх се х їх У їху із КЗ з в що Б КЕ -
ФГ. пр б -к і Ме Я ЖЕ і «й щошоу
М з. в їх ї з 0 ! КИ 5 кВ ж нижня ан ШИ ШИ ке дчнкчнй дн ВИН по: зо АТ яааЕв там таза не ска Кунтини Мн нн нн ча ще
ФІГ. 8
1505 ШЕ шк що 5Оч ш щ щ що клан «0-й ка КИ ЗІ ИН о й с ме, ль о С
ФІГ. З . чає і Антитіла режтя Мн щІлиа пом в того дня -- Об й под ши І ЛИ в т пої3ВнО тоАМ Ома М о това ик ц ок ТЕ 188 б си ще о пріВОв ніша шана я 5 с теаюрв 00745 ОМ " а 5 87 Час інкувації ФІГ, о жан зер ВІН мене: медом сах ВовОгО «ке СВО ке «ет тонзазми Ж, аву ТОВ ще Дис ни НИ ка ще ц- | | Ши зві пеки Ша А ТУ ЖК они тем Те Ж сен ШЕ за фен Ух ЖК ї ом дк икжкдио, к їх ЕОчУМ і ве ай пен ЗМ и а Ева а ще Ша кока і а Кк ї й май 1 -к Шен жо: р шо хе а мкм кжжи алла» «Ач й : в вас Іс ШК Що ЖНОоа в и нн ор НИ
С. МНН оз В нн їх и ще а Ко у 5 КУ ї В ХО Б Оу ї ще їв ї ОО А ижужо У г Хе ку ", пк ж, зх Час інкубації (ха мас внкувації схва жан семи рама ВА скан Юма. с ВЕБ -- Всього як «ве Диуввааме ов заоіДнквмкама щоб. рн НИ во ши сно ше ! нн же, зво пестюснву ке чн ше Ко діежжжжежиту ; дюжажклу шві дис ша Шк НИ ВО ди осо ще щи сн ї Мк демо реа рух 4 р жк же : й ке ші й ша і ка Ши Се сЕ Ши пн Жим ПЕ етттстчнно їх ЩО МЖК п а Е ЗД пунк ее тту фот тт тт нтитну Час інхубації (хв. Час інкубації (кв) ВІ нен МОВО. сн Всього ЯМ яке Дема кзма ! нн нн шк ан Ши шов К сн дк ему я ки и Ще вна не -т Шк Е У КІ ау 7 ши ЗЕ НЯ нт кн ютннтннкнессснн Ще я КІ а в в. ЗЕ Ех ЗІ їх Має інкубації єв.)
ЯНГ.
о зара пн на и у НН и че її Ей ;, Ка ж ТИ З У Її цк УНН 5 х СО ЯК Яков. КІ ЕКОЛО Ж АВТ Я сн сити М ЕЙ ЩІ не а пе у М ЗИ ШТ т Кп их ЖИ ті : Ед ин Ян ї зе ен шо и, о ов Ди пн ЛЖВ тт Ин т шт киш аенна Не ЯК Штори ІТИ. ТИ ТІЙ пт Ж ТИ ЛИЖ т У Ота Я Ти же ОКУНЯ ПЕТ ПТ ТЕМ и Ко нан нен ЗОМ У п ти т ди пдггі ис, Овни ПД ТОЮ пошити ШИ ДИ пон НН У ев НН шин з ваш пт т Пп ЛО С Ли ШЕ УЖ зи и п ЛИ ВИТ ИУТ ТІ ЛЕКИКИ Я т г. и болт кт Пух 55 ЗВ о ВН в ННЯ ет МН ЛШ ІТ ПИТ оту й «рихютт, що ММ НЕ й Ба ПЛОВНЮТЯ ПТПШЕИН яру ПТУ ИН Т ОД. : я т ПИШИ ВІКО І и ПОДКМТИКИ, уран ве ї п т пт ГІ З с ПЕКИ ля и КЕ ШО Мт МИЖТИ ум ато СИЛИ В Я ННЯ Я ще с МАН НН КУ ХЕ слот и ТИ Іжа у У ПОТ ЕД у :
я. жав НИ не кн я З о нн ННЯ - ї ЗІДТУУИу «КПК й ПИТИ ЖИ МИТ МКК ЕМ т : ше п яд ПИЛ ЛИ ЛОТИ Що - ТИМ ПЛИТ. ї т ще Пи ПОМ о ШЕ Плх ої пк Ж ЖуТЮТ ед ПИ ИННК ке ПИ. Нх ща шт КІШКИ ЖЖ тм види т ДИ у ШК Я пит ІІ ПИЛИПЕНКО ПИШУ ие по пи ПИЖ ПИЖЕИ ТК ІМ ОЛЯ ПИТИ - АРТПТТТУ ПИ т и пе В ПКД ТИМ І или ПИЛИ от КО я их щит ще ПП и ПИШИ. ПИМПИИИВ, Син У що ї 7 : НТ ПІДО ДИЧИНИ дЛОДИО ПИТИ т -. ї в о в в о В В В КЕ носове ооо ово "ЗВУ Н ОПО АК ПЕ жи ЖИЛИ с. ІЕМ Я пил, г ща БАНЯ НО Ж МИ шт ДЮ т пд ЕІ ОП ТУТяЮ АЖ КОТ КУ НУ ДТ, ШУ ПИ п ДИ НН и ННЯ пакт, ПИ ВОДИ ХК нн и зн ПТ ПЛ МОЛМИЙ Ех К ТТ ПМЖ Ж т М ДМК ЛЕТИТЬ КТ ЗИМИ т ОД МИТ. ШИ и ПИТИ ИИЦИЛИ ПИТ ВК ЖИ пот ПЕ и т ВИК ення З Що ПЛИТИ оон в Зно НН ПИЛИ КП ПЕКИ и мих у тя. ТИ тх ШИ ТПП ППОЕЛИТ ДИИИ дт пт ЕКО У ех ши ни ЛО пи ДЕТУТ - ХТПП ШИТИ М ТИШИ, ПОЛИТИ ТУТ ШИТИ ПИТИ ни и КИ Ві ПІШИХ: пит їй пил зи а НН виш ка Кт ТЕМА, я ПИЛИ ПиЄ І ія ОК ТАКИО "ЗЕ Кот ТОСУТИТИ. я ТОГИЙ п Овна в пОДКу ШК Б паж ПЕТ ШИХ по ВН їх Б ї ї. ИН ТИКИ Ж тиж ши т пи р МК ВЕЖ Ти 7 ДИ ПОДА ШИ ОМАР ПУТТИНІ т-»55 ВОВК век пох он о о ЗХ СОНЯ ко пу ИН ТЕ я. Я па в нин я ще СС ЗОШНВДКЮ ЕТ ЖЕ, М ев х ж ВЖК и ВЕ ПИ мВ од ЛЯ ПО ТК М ПИТВО, п Бан ТТ ПИВ У КЕ ДИ ПИ ДЖ ТЕ т ї- «т. ДНО хх нови МИ 7 х Кк Я : ОСИ Ти ЕВ їх и З НН НН ННЯ ПДМ ДИН ДИМУ Стих ТОЛІ ТИ ій ях хх ванни із КИ Ж ев о о Я Мт пи - те як и. ай В Зв и АНЯ нн ВН нн що ще т ТИ ПИ Ди ТИВ Ки юх ПШОМСТЕИО Сп Но З пох ЛКК ТЯ Ж, ЩО. «ЛИПИ ТИЛ М ШИНИ М ОЛВЖ В п х -Е ПК т ШО де гИї ЯН Ж Сто ООН ти МІК нки Й ІЗ Мои м «ПЕ тик її ее ПИ и ПИ ПИ їн ТИМИ тд КЕ ши КК ди ТЕ пи ТЕМИ ВЖИ, ШЕ ЕЙ пл ПЕ ПОШИВ : те МИІ х 7 не ИМК. или КОЖ а ШИ ПІКИ ий Кс пнинК КСКК КК КК МАХАННАК М КК КТ КАК АКХ КА АЕН НИ НКТ АХ ККУ Ки дек КК КК З п ПИ ит, ПИШЕ ЖЕ. м шо ох, І ЖК. ТТ т г з. ї: й по Ту, плити ї вен х: жиле ПИЛИ ШИ ПМЖ т ШТОСМЕИМТ ши нт ЛК КЛ Ко: ло НИ ПИДИ ПИТИ ДИ ПИЛ Я о. . ПІЖТ ПИСК, ПК. я я по Во ом ях ЗО о По т ШУ й УСП ТИИШИ ПИ, ПИ ТИНИИ ЗНИК В Дн а И КИ Той ЦЕ Нр я шт ОМ ЩЕ ОПИШЕМО ДИ МИ ИМЕНИ и М ЖОВ КИ Д.О ШИЯ піт, ПЕ пили А ПИ КК ИН и ЛИВИМ ти ик "ЛХПб ди КИ КП ОМ КОЗЖИ сли ПИТИ, «у п Мол ши им ПУ МИ ТИ МИ п.п М Ки и ЕЕ ТИ ЛИЙ: Кк «ШЛЕ и ня діт М. ПЗШТЖИЙК ТЛ нн ее че ІТИ ЛЕМ ШИМИ ЛЕМ МИТ ШИ ЛИМНИ ЖИВ Ж І х. Ши ШО ШИ ТИ ІД . ЗА ЖК у ПМЖ ДЛ пи Кок хо Ко - з пи Ш ПОПИ Днх ;- Зинннн з в ПоооН енне В з Зона ОН ту ДОЛ ПЕ -- ПИОДИШИМ ПИМИТ МЛ ІЗ ща ї ет» жНннннннИ Мои ОН ПОЖИТИ СПИШ ШИ ДИМ ЮК. Що. СМ копи пт еп пил Ж ПИТИ ІЛЛЛИНИЛЯ 2 з В вин ння к под ШКО ШИ ДИ ОХ Я НЕННЯ ПОШИ ПИТИ ОТИТ З иа ж КИ ДИТИ ЛИ ИЖИК а ИМИ Ки м лит, т ППШИКИИЛИ Те, ще ППП А пт ПИТИ ИИИИ щ КО ни пр аченнни дО ОХ УВШЛИИПИ ПЕД ТМ тот. ой їх що ЛУ БУ тод ШИТИ ИМИШеМИМ их ЕЕ ПИИКО ППИМИМИ ЛІ ж ВЕК о вн МАН ПЕ В АЕН ТЕ пре в ВАВ сх Пен в СІ ТИМ пот т ЖК ШО ВТМ я ПОКИ КИМ ТИПИ сх М ИН а оон ННЯ ШИЛО ин дти т ЖЖ ї ПИ ПЛИНИ МУИТ МИ У З ЕДИМТМЬ о в Жов зе наніе КОНТ ОЕЕЕНМ НИ ТЕХ, Ж ЗМИПИНТ ПЕТТІ ППП ПИПИМИ І поли КО ТЕ ОСПАХЖЛЛИИ ПИВ Дт, ТАК. Си у т 1 ян ЗЕПКТИ ЖИТ, ПИ БОЛІ и Оож пит ЛИТІ Мк КО РОН Пп КАНТ ППКП ПИШЕТЕ КИ не КИНЕ ТЕЛ ВІКО ЗИМ МІЖ, - ИН ПИТ КОПИШИК ПЕИИИ ПЛ КТ типи с шОСпЖм т КИ т ит Ви ІДИ я ну ДИНИ, вен "Вова оон ин ЗВ ОНИ ЗИМИ ДЕ Й ПИЛ ПИЛИ ПИЄТ т. ен ТПП ПИТИ УТ ЛУ нн: о нн в ШО их Я ЖИ пот Я пт ПИШНИМ ПИТИ ев в в вом з оо вва я х ПТ пут ЕОМ ИКИНІ й : : о в и ПИТ ПИТ НИИ КТ Її : - пи пу РИН КДЖ ВН я Б поса тп ПИЛКИ. ПМ и пИМИ пт ПДИМЦИТЕ. ОО ТТ КО - ЛИЖ : ДЖ рН ТТ, я у ПМП «З ТД хм я ТИ І УПЖЕКК. ше ТАКЕ г ПОПИ ИН В ЛИЖ
КУ. я тихим СПАДИ. оо и ПИ шо ПЛИТА з НН ше - вх й З ФеЛИХ ППД У зр еи йЖ ТЕОДЛИ ТИ Мт ИН х ПОТ тя ШИШКИ о з уки ен жд М ЕЕ : ШО по вв В т. Пуми тт ре ОО : ПОЖИТИ ї ще ля. ПИШИ ТИ КУТИ р нення ПИТММИИИИ, ХЛ їх ПК Уют Кк си Пт От, ТИ, ТИПИ я ППД ЗП ве т п ТИЖ. я ит - г Щиро с КИТИ пу ПОД п ДАТИ ке - Я КИ ТЕ й По ох : є й ен я ІД кт й В п ПОЕМ м їх ПВЛ ЛИТТЯ ПЛЛИКИ НН ППП и ТІ з Си ОК М ПИ. В Ще Сн сх ПиТих МИПИИИИТ т Пи ЖИ: ШМК ПО Я ПЕ ние ОМЕЛИ Мт М ЛИПИ І ШИТИ Пл шт Ти ОК, шк ПУ я щі тя ІБК. Пот, ШІ ЕЕ ФО
ТК тн о оо вн в Зин Н Н п ЦЕ й ГТУ г ИН оон ее ВК ШК КЯ ще ОДА до зле с ПК и і. ; СУНИН х пд ни Ат» зорі: НН 6 Копокалізаня я Кт Кен В ШО пули 000 Ж ЖЖ Ж Вовк: пива НЯ БУ Ку З ПАК шій по. я З я Ку. ШО тши ЖИМ ЛЮК Не: бух 7 ЛІ Же От й пл, а Е 4 о р Не У и т ОМ ТИ ТК ЖМЖ ОН Я якчнн : 4 КОЖ пос Ж ту ТК ОМ : 7 т поло й - гл їх НН ХА МИИАТНК ди ШИТИ ки Ко жо Н Пи Ка шоу ї НІ ки не Е ва жди КО ПИШИ ТЕТ ТИНУ ТД УКОЛУ, Ше ще тт КОКО, . Тих НН КО Ве НК он о Ї Ж пИЯ ше ПК як ТЕ - Ши НИ в он НН и еко иа ДК ди У ВК КЗ тел Я Шйшт. с пе : : НКИ ЩОЖХ. ши пи А ЛК ТИМИ жі ХОМА о З ОЖ АК 3 ЖЕ Ен СИЛ Ж пули ШИ й хо В ОК, Ж Пи ТУ ши ТК п Пл пот ОДА РОКУ ПМ МК Мидшицен М. АТХ я ПЛ У, У ЗИ ї що ї п т еВ о я ДИ ПИТВО ПОМ тд ШЕ ЗОЛИ ПК й ХЛ ик ПИТИ й МолжК дви ПУЕТ ПИШИ ТМ КО пл до но . ШИ и Ал М. ТОЖ ит ПТ, й ТК ЩКе и КИ : хі Я ХХХ. Я ОД о НН и НО КНУ ДИНИ и т. «ТИ, ще ДМА тк ТАК Лу х пок ПИТИ ех Ко о ШИ ПИ ТИ ПИТИ . пн в НЯ плити М и т ШИ Ши ПЕ ЖД ОВ о иии ит ТодшиуК ЖЕ ди В ТИ ЛИЦЕ ЗИ ПИТИ ПИЛИ ДК ОТИТ ТИПИ ПП ЛЕ ПИ ИМт 3 ООП о К я ПЕК КК Ї СоБАШНИ ОІД й ВОК пт ШИ ШИХ Я ОТ ОДН В НЯ в НН По и ПИ и ТИП ИЙ КЕ ТПП и В МОЯ ОТ ИЛИрИНИТ КТК, ЄП КИ ПИЙ ІШЛИ доп ШИИ пути и ТПП Я
В. ПІТ Т ИМЕНИ ДИТ гу и І. ММ ли ПИТИ ТИПИ ДК КО ТТ ПИТИ ЛОЛИН МИТИ Т ПИТ ПЕ. СПИНИ ПИТИ т КИ ДІДИ ї т Пи ЛОТО и по й ТЛІ ЖИИИ рон и ПЛИНИ МИ КИ неон. щи ПОПИ Ма ЗИКІМТИТИ ПИТ ОТ. і ЗУ ЛИИ пНи ІК ТТ пгт. ПУТІ, к и МИТИ РІИИ ТО ШИМИ Я о В нн нон в но ТІ ще А у . ТАЖ Ж, я пи КОН ПОЛІ ОШИМ ПЖИ ПОЛУ ТОК ПИТ, СЯ Во я нКо р ши, ЖЕ ВЕ Мо и НН ен В ЕХ ди вив шу ви Й Ко КМТ, хх КК а ій ЗИПВИ и. х Ся я НИ З пи уже, ут, с п. 5 Ком с су а як жи з в М Ж Бойл рік имх МО Вид пт и В их Е ТОВ оо А Нв Ви ев НН ППД ТИЖ КМТ Ем ШИ ди и БОКОМ о ИНА о ЯК, ЩИТИ пдв виде ПТУ "он НК НН пути КН ШИМИ у ТИ я : о ПпОІДИЛ НК ТИ БОКОУу ти КК в В ММ и и и МКМ и ви в КАТЯ ПИТ т ЛИПИ БО нд ПОЛК ЕШ КК МИ ОМ ЖИТ ЗШ, ША, М дет : ПИТ ПИТ Бод им пихи ПУТ Іо ОО ДУХ МО тя, Ж Маки ин знан КІМ ЗШ ИН ПИТ тт Косик ДИ ВИ С М ПК КК тд рРНК аа ТО АК, ЯК я : холи ОЕМ. ПІНИ В МИ кю. ИКИ СюжиНх МК, МЕН З Не а шо В КУ ж З Кен Бо ЕМ ри й дУШИЖИИИТ У ж : и ї ТЕЖ, - пт ПОПИТ те є Ії ОО Ме Мо ВИШИВКИ ХХ Ед ДН в НН ее ВН попи ЛК ДИ ДИТИ ИМЯ УБИ Ви о в НН о о ва КУСОК нн ОР и НН я би Я ДЖ Яд их ТОЛІ ШНИИ «ШИ ит ПОПИТИ МисЯй пожити ВЕК и КИ нн мити І ю ПД стю М ТТ ши ту ПЕД ПК КК Пужетим лити ЖЖ Б їх я З т же ше то хі пит Я МОП ШТ, 7 ШИПИ Л в ЕЙ оф и ПИ Же КОжЯ пОЖК ТУ т Ку ти у Ж шия ЛОЛИ ОКЛИИИ вне К КОДИ ИИНТУ Н ТАЖ Ж МЖК 8 З шо ту ді ПЕ ТЕ : он м НН ; ди ТТ ТТДУ МИ ТЕ ЯК ще ТІТИИИ т ТИ ПЕТ Ве ОН ОКО ДИ МИ, т ун НН нині 3 шли ПИТИ ДИНИ ПИТИ ТИКИ ПУ АЛ ТВЕН КИ ЛИЖІ КТ НЕОН о ЩА пох нт пе я НН Я: ОК КОДИ ик ЕКОН ЗОВ ОСУЖ; «ДАТ поки, ЦИМИ Ти то, Й ПЕ ПМ КІ ТИМИ КМ п КК КОХ сах дк ко Ше ти МЛМ Пили лу оо но Кк НН в: КОМ вон нм нн НН в Кл М ско жи ШЕУ у КДЖ Ж Кт й ІЩЕ ни фа п ДИТИ ТОЖ ен КВ о рано хи КкОолокалізація ен З ВН ди т дня З Ж ОО ним ох ти ти я М хи и ди ДМК и ВЕК ци КИДОК ЩО пит лм ОК ОК пт ТИ ШИЄТтО ДИМ ПИ ПИЛИ Т ТИПИ ПИЛИ Ед ПМК ВД Ж ЛО ПИОКОО ЖЕ я ПИ лк, но ТЕКА и В Ин ШИ ПЛИНИ. ЛИ ПТИМИИЙ в и МЕМ су У нИ Ко КЕ п ки тод сК ПИШИ НД НП ЕД ПИВ ТОД Оток й тиЯннняни МИ ЖК ПИВ ПТК Ж и ТМДНМ ЛЕТИ ЖИ: МИМО М М Плпоие ет ли и Ми ТИ УП, ЗІ КК молю яти ОПЕК и их Пд ПИТИ ТИ ПЕТ ПИТ ОЛНИИКИ СИЛИ У : конання и нн в ШИ ОК при ЖК пи І7Е ше ЗЕ КІ че хв
В. 5 не ВАК, ПИ КК з ї ПИ о НИ пп ОТИТ, її ПТ. ук Тит ПОЯС ИМ ТИВИ. т. с он С ДОВ я ПОЖИМ ЛЕ ДИЯК От ТИХ Я МИ ЯН ТИ жк Х. В сон ан ФИТи ші, ПОДЖОЖХИ ЕН КАС, и ПИЛИ КЛИМ ТЕП Пи, НН: НВ пт Бе ОК аж Же Я я г ги ШЕ худ Е ТОМ Ди и ЖИВ ТОЖ ПІК ДЮ но ооо о М МИНЕ Я п кодах НИЖ ДИТ у тету ИНШИХ ПІТИ ИН. ПТО На МІ ЖИ ТИ ПИ Ж ЩЕ 7. хау З Ж ХУ ШЕ ТТ т КВК тЯНН ПЕК ОК нн о НН ш рев ї ОЗАВН Я ПИТ ЗМИТИ ЗЕД ШИ МІЙ ННЯ Кон в в ННЯ : Пт КИ ИтЖ. пох же ШЛАМУ ПДК КО ПИ ОВ Вели п пк Ж КТ т ПОВЕ ВТ ПИ ВВ их ШПШШШШИТУЕт липи ПИ В Кп дя ку Ж ПИ ЖИ ОК лих ПТК ЕК ПІТИ ТИ т ПИТИ ОЛЕНИ у ШИНИ МИТ перо ТД ТИМИ Ж ТЕТУ у Те ни ЮЛ І ДЖ шк ві ПІШЛИ ТД ПЛИТИ ОВ Блю жи ШУМ ТОП, КИ ПИКА Медик ния шко ОК ТІ т ШПОЛИ т МИСТ я т. ВДЕ Ниви по ЖИ К Т Ба поту ми ЖИЛИ т м РИ ТАТ ПИТ Б з ил И ХИТл їх оо нив З я ЗННШ ня Ж 5 як шо и ТК ШИНШИЛИ ЛИ ІТИ ТТ ЗЕ она нн о ен ЗШ лю пл. лу ПО тити: ПИТ тт кв Ж и КК мив Ко КАНОН я : Кене ни КК АКА КАК АН ОК КК ни ок Я кн в в о ооо окон а і ке А ки Я ще Мк ще к Ки еННи й щу ж и ан сйкк ПИ ЛИЖ ях о й я, лм, о ни МНН " Ком вьь БЕО и НЕННЯ й аа НН: КЕ шен ши Ж тод я ЛИМАН ПИТИ ЛЗ, Ото ОДИЛумамикю ж и Ж тий п ще ПрИЖШКу и ше : ПИ ПИТ ДЛ ПИЦИИИ ШИТИ он нн ННЯ ФОКС ре ання 7 ве НН Знак МНН за ТИШІ ИН ПИ Ки, ЦИ ж «Е УНН яхт, Кіт и ЖІ С ТМ ЖЕ ще п Я ПИЙ ЛИВМИИМИИИ, ОН З ди дню СЕХИ Ж У поли ПТК ПО т КИ ЛЮДИНИ НИ пд Вот 3 В НЯ їх. Ме Ще рн. Кам СТВ кмин ОО ПЕН НИ ЛИПИ ПИЛИ ТИЛ Ко з» НН Не: й : Шон 3 пт - ПІШКИ шия Я Те ЖИТ ВИДИ ин пи ї в ОС ВО с ПД ПИШИ пи они пи 7 воно В З і ще ше ЯК ЕК, дО ї й не Пор МИ ПЕТ я ТЕ г. ІТК Х з вазу ОЕМ ї и УНН тя Ма х с с т МИ. по я і Ми Жде дит ти ШЕ ЕК Оле пе 7 7: : Кох Й Й п ПИ ПИШЕ п Вон в а о аа И Кох жит ВЖК я у х : ШТ ИЖ ПИТИ ПИТ ППП ПОН в ЕЛЕКТ ї ОТ он ї х 1 я не ян : ев ІНН и ННЯ І я ой я ит ї Я : : Е; и КК ши ве МНК Я " т В ї - : ї й й БО жи ПД ІТК ДЛ І ї. ож з и х пої з Я ! ик ЗА ННЯ ЮК М ІЗ ши. ЖК - Ще ї. я СИНУ "й я ЖУК, ЕТ ЩИХ жо КИ, у ї- ї и т . ки ЦИТ ! : пк у Ж ших Ж. ДН. По кит їх та : . як ко ПИИПИИЬ. вне я о ЗНМ я н СЕ Я п пи ж п ШТ и ЛИН ЛИШ ПДМ ТИПИ ИИШИ з п ПП ЖЖ ОПИЕЕЖИД и ть мк вомнни не п ї пи ДТ ПК ИЛИИТ ПИ ПИ ПЕКИ ДИ ИИПИИИ "ВНННННЯ Яни ОНИ но чннни Н Жим по у с ЛИ пит ТЕ Ше ШЕ ДИБЄП ПИТИ ШИТИ ШИПИ,
Фіг. а
Во ! ши шошиш шу : шк: ї | а ішк о Ку | Н ї Гай : Го Я Я те її й 6 ш6 и шо . ! Х р і Р Шо які Е І Я ЩЕ Ж Е ! і Е і и ! 1 ! в До нку ні без пахло мщинНи к ї я ІЗ . М ! З Вк Я сю Вс ж ую и рег си Ж Ша , | щ ! СНИ. й ж ДО снЕуУЮВЦІ З БИ ВНЩИНОК А ОХ: Ка Я Н іже у Е; доз 1 З од ск іони теку З ії ще сі Ж ЩЕ ї | З ! й і жк вт куванні ве пафнтомищинУ А : 5 У її ї ше ї Я й те й У ; Хлвухіх х ї і й же ШЕ БешИШЕ І й о т інкубації з єдефічовцином А ни щи сш щу вк й : Я В Ж : 5 ! й ев: п ШО. їх шх ! й ї Ж й ш ЕЕ й ! б : а ЕЕ Ж я її Те ; го Н й я: шин сш Ши ШІ ЩЕ - | ВХ | ще й | ЩЕ ОО ЕО ВА ошшш БшишЕ ! ЩЕ як що ЗУ Еш Ен ВОДА о В. нн ННЯ й. пон, ОО ВЖе 00 ВАВ Ї зва іоожее о ро ожеНО:
г. З мякі ВЕНА ша з З е З 0-х еВ Я вх ї з жа, - ВЕН - ЗБ Я НЕ шо ВЕ й шк Щ БЕ : М яв зва - ! Ше і Е| зом ! ЧИ озМмЯ5 она овВмнех вет овнтя ра м БНяВ вн рн БНО вата одаж аж: зав жа БЕК засо шк тм доб щощмв В дев. ЩО с Ва М зжевні вав ; ші мед І ка ВДК су ше шк ШЕ Шк ШК. КН а мам ана омана ше ЯН. ве 5 ВН НЕО шаї ву ва чя ВиБА оон овБНеб вит БТ. НЕ ве ки ШИНИ щен ШЕ ! : є ЕЕ ЩЕ моя о ! ума БМ Ка ОБЧЕ уМУ ОДНУ одне Фа х й , с Й А ВО В От ї «ще як ЛЕ З з вюовУунвяя «з і па ши НИСУуДКХ ХМ ак рт ж я а ВИ, ве ре шу й Ж. Е фен сх, -к ; села ий Е а ков ее си дове а І я Кожний са гоошке " де ї жо Кох і ШО ва ТЕКУ ШЕ як ж КАРУ ї БОБ з кон важка. акме я АК? і Бамею 4 кох няня Кк ме я кома ШЕ ОО І НЕК НОАНЬЯ ГЕ ВН ВА УНІ У АОВВНЕ м п т ге п и М киш и в м См С С ювМ НЯ мк що У і- ВІН вх т ЗНЗ Тая» Ох ях з і ж їх ЕХ і « « ВВЕ ) шо ; 1 є вегумноМяа я М шо ; х Ж 7 Здхужкййзййійїдихи - а що й вх. «в | З 8 Я Ко: ле З З я ка ва
«ві. 38 Юа хво. . ше Ма ях Ще ше «ово БаЕЗ МЕНЕ УМА З
«г. 15 їн Е Е Е у СЯ Е : Е й : мо о їж КН: НЩ овввньль й Ї І Я Ї їх М дви І ! і нн НН а КО В РОЗ З ча й і Е : й, Е Кн зак і Е ож Е ів Е ож ї рен яко ' ї ; ДЕ я ха її Ще У Й ДВ В КД Ж. ДВ Я В В ВК В В В ВВ ВК В ВД Я ТЯ Д ВЕЖ В ЧК А М ЗК Ж КК о ія неї МЕНЕ їх і х в 5 "и ще Й с-- з я і Н Ж МО я зхннй Шу стихне юне ета века Уа окели о кек Юа кону какая екен я ха ає кох иха устя х ДУ хай ; ро оф ш Ге : : в іх ВЕ Е ЖЕ Ка ; в ж ГЕ: І М ОВ щі сх «ДН Я ЖК Я вето МК зохеюхеюаютитнян ру нюютетня теку жекит юн веде Ві ких ж кни и куки о МЄ кю ще нн І Ж | ях ; і Н КЕ І В її : ЕЕ МНЕ і 1 ; ЕЕ Ше : іс ср -5 Я ес м а пп и кання ї
В. З ОВ З Ж -ю Еш Ка ! : ; : ї І Час ; лада НВ ТТН ніж я я ж ж я я кт лю ЖЖ т тн ж ж кто нн нні тіні т тонік нн нюх ее ет КЕ КН Ром і м ЖЖЖЖ Ж ЖЖ Жде КА КУ ККУ ЖК Я кю чне ая лиже я Кісь че жів с: Ці Се ЯМИ.
ху. з же Й з я в фекееввнн, ! Її Е щ Іза й і Е ї За 4 Я Є. В : сопсюкюосслнссновЙ і
З. І К - Ї й : з я б і ; Н ї - мае дез с Н Е т | ЯМ. Е Е як ї 4 ї Е Ж І ке ососооююскняй М Я КО ї ! її Ж В огнла дл В ко Я ЕЕ 3 Ж і і З оо х ї я т ВА Е ТЕ ОО Щ 3 : Ж 5 ЕТ ї я ії ЗЕ і Н Кон ії з хе ї с: Я : ше і : : І З : ! «а ен НН М В НП М ОЛОВО Я Е Час (в ФІГ, В
Н Н і і З вч НВ ТОК Н Її ЕЇ їж ве ни нн в п ВО ! ро- ШЕ і:
ї З. х г ї ГО, ї В | : х їх "я т Ї гі ща нн с мин нн я я не : і о Ко: шин ин Бо о ге ще ' от ря 4 Еш Й | ! й ЩІ Е 5 за Ян нн тн кеюют 000 око дноететте тету хоткк Ві же, і ож ЩЕ | : - ШЕ 1 х ЕК кі ТОЖ Я пото ВВ с жяенх ся Кухня дАхккккх -- ще ЖЕ шк ЩЕ : ВН обся ниття Ї, дддлкдякктая длчлч ку ження нн. синя 3 : | : Е 1: Н Ж У ЯК хну ххх ооо сени пхкатджакнннїВ Коня і ї з е Є В Б В й щш ке й В 5 ; В 8 2-2 г - х ще є і ї с мм жк сх ру ка ще І 3 хх м як к З ще Е Н ! ЕК Ко яко : ОО | І і Н і ї Ж зва ше Ко я й Ї ли ТТ. Ке щей У ВА Тр ния Е Не КУН ТУ уж ю ккку их, при рдлкллнанкння ях СЯ КЕ 2 - фани ллдалалалахх, я | ІЕЕ В соя в ро ї що ем і й Пл, Милі х г | Б по й бе і що | ве о . ще Ши шли ш-екео ее ее Бен у Ї гм. и пк а: і щк : я не Бод шо і ї К Коти НКИ КО дення НО ------ Щ----- ВВ ВВння : ш се В р щ- х --ех з ше ен ОО ле ІЗ ї ща ш- в пд пе п приво : КОЖ НН ше спо ше НЕ ше і і БО» МКМ. ВНИМ ооо вна ванна він їх с я о цех сх Е і Ше ше ж що Ше ші і Ко та ов й ще 5. і ї С о г; ри Бої Ме я Н ї Ку зе че кі її Ср : ї З -- - 5. їж КЕ се Ї ї хх іо. кання !
ЯНГ. жо с Би У їх я сх т - сеемеях Бе вк « фору ємІ о нн ж БВДКЬЕИЗ в, к КАМИ 5 а ; ко ка Ж і ож х ВВІЗВОВЗ вв у ї ж уУмВимвяЗ жо» А з влЖВвоЗ в ШО я МР - во ех « вав Вовк В е ша Еа : іх В. з соди оз в з свв Б зк вже Жов а Що Я ще Ж з іч як Ех: МИ ВИ ЗМ М НЕ У: Ж: ПИШЕ НИ ЗИ ве ке КБ «ях Те їй св я дня ос фврнія, з ВАШЕ ЕАВ х ще чі В ж КІБАТЬКАВ що ч т КЕНЕ ще іч зе вумЕвкВ Т ву е СЕК ВУ че ск. в се ж ке: ШК: з З Не а 1 Фа а5во 4 . т А х ШК ЖОВ - ; дек же й - се щ чо То -Я- Контроль Ж і | пуф В В КК Я у йчна КВ В Е і Ї і -- БІОВЕО-БАЇ3 ОО мук ОО Є зов- «ті, --- Бпоковане СІОВЕ2-Е-13 ї : Ши 7 мож ОА во» їжи Е ше, а 0 9 я 50 60 7 Я ДНІ
ФЕ. ФА зов В й х тай Є зво і ШІ ї І ї К й й і М зо і ЖЕ | ш / -- Контроль : Е Х І я я н й 0 й Її ее БІОЯВОСМІ З У мкг ОТО ге ж І - ДЖ зей ВДОКОВаАНа СОПАКО-СМІЯ Ше ре В 7шахол З -й й ; ї вх БУ З т НК Дерек Й й йод З за а Я як Як 8 70 85 дні ФІ, ХВ ЗО ре зБ00 я до і ті Ж 1 Е Її і. -- Кепрочль З 800 5 Д|шО се озовколовз т меке отв -е ї ОК. сни ПЛОКОВаНО СИЦВКО-К-ВЗ А жу ЕЕ їм п» о і Та я Яке Нє с З «і Т зни що оси шо, 56 Я ОНР 96 30 46 5 в 7 во ДНІ
ЧІ. С ов; А | | -е- Контронь Я бе і ней СЛИВКА З 7 мкг СИНІХ а- ш чик ля ще ще Е Ї ія -енн БУСЬК Я У вуйко СЕЛ т : б о . ї | ї в В - Я ню Ід Ж ще- м ве - ; т ту в аю Шо Ще я ще 2 5 0 яв ло З 30 35 до 45 щ чн за чав | в | то Ковероль та Г-й- Ф30О8КО-0-137 меж ОТО 1208 - п дчя і ) у. ней ОКА 13 7 може О73 х й : й жо . роя . щк Ж г в00- ше ОВ - р х їв і ше. ЩЕ ле АК зо Шк Ворони Вт й 5 ло 45 90 55 30 35 40 45 50 дн
Фіг. ЗВ в.охто2- ШИ ш Ф 4дх10 ШИ м ще 2:ох102- ЩО ше ее а о. я, з 5 ще б о Ах в у І Ф щі я в
Фіг. мА нх208Е2 (НОТУ ОВ в.0х1095 см аю нії з.ох1о 3 В Б З З 5 ше ве р кош шк че -- ни М є З ру о
Фіг. мВ
У ШИ свого т МСЕ В 1004 Ві хе жіяжаяо а нВОМО Яни мн ин, т НРМЕС Во ко вв о ще Е БО Ко ббав Б о не 04 У | З не 5 403 ч з НАЕрС о ян Кк ше каш: ШЕ: Ви У М З вд ЇМ
Фіг. 25 104 дже тив
ЕТ. г" Гея «й. ж ча, Ко вва З Й ж 304 тя в, - соОВЕз-З-13 5 во. :чь й ж ВнЕгОВЕз (НОВА ОВ-О-ІЗ Б во хх : -к- НаезОВЕ? (НОТТЛОТВМОІВ ? «в у, « а х 404 ж Ж 305 й шк Ж з04 рення ча АТ ие ше ше ше ни я: Моз ЇМ) ФІГ, В зві Е ' -Я- Бувжрвмн» шо сяк ФО0ВЕІ-О-ІЗ3 З мруке СНІ - З е за З т зей ВУЖО ОО ОО КОМІ ЗХ віжкх СВ че З озудх гу вев дх соя жу 5 З Е яооо 4 Й зерня ВЕЗОВЕО СНОВ УЮ ВО У З між СМ гз т -Пу- ВОНО ЮЛ 18МО-13 З мок СОЯ Ве, | сад ліляат ть ШО зо | їі -мня ВУЛОБРО (НО ВІЗ У вик СК дове / б : яв я Й їз й що никами ни їх о с вени ен В Кт ке За «0 ЗО що дні ФІ ОКУ -з Щ Е ее Коятрель ВО КЕ др ок ; пк З ер ДОВ ОАСАЯ З уки СЕННЯ 1800 шО Е Т -й- СЗОВЕЗАО-1 З мене ін'єкців 400 я ще З ЕВ Ж ОО0 В У ше. к НО Е / еЕ : зі; - НО ; З во З ЇХ а щі го ше в в ЕС У ДН
«НГ. яВА зі шк : че ие Кожуроль зо | щи щ ок -к- ; нн БЕЗОВЕЯ СМ З мг СНІ ЩЕ і сен НУ2ОВЕ2-4--13 З мир феєкців ОВНЮт | ці лов К - ШЕ и х ча Е и Ж зав що ко ія 2 в з В: й я й 200 ги ке й ап ї «Дрнчерччнен ій з. ; ша син, Дерек 5 5 6 850 Б В во Дн чн. гав ї -- БОНУДОТЬ ще ! . Е ци ср ОСЕНІ Я З витку СНІВ Е ва ! . зей СВО ВАТ З мук ОВ в ОБО Е Ї и к х и я їх х Зк; . че, х гі пререрут а рру те ру З Б в же 50 5 30 55 43 55 55 ДН
ФІГ. А ше : , : -- Концюль щ- ши рчк дя ючи : Ки -вн ССО А межи СЬКІВ ке шк -е КО зе ВІОВР2--13 3 може СНІВ
Я. зав є ж в зі я и 2503 т Я вв ,7 Бе гай вк к т Є ї з ЕЕ ва : й а п 15 920 25 30 35 80 45 5 Дні
ФІГ. ХВ
UAA201611833A 2014-04-25 2015-04-27 Кон'югат антитіла до igf-1r з лікарським засобом UA120364C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14305620 2014-04-25
PCT/EP2015/059045 WO2015162291A1 (en) 2014-04-25 2015-04-27 Igf-1r antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120364C2 true UA120364C2 (uk) 2019-11-25

Family

ID=50630736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201611833A UA120364C2 (uk) 2014-04-25 2015-04-27 Кон'югат антитіла до igf-1r з лікарським засобом

Country Status (27)

Country Link
US (2) US10633448B2 (uk)
EP (2) EP3134124B1 (uk)
JP (1) JP6258523B2 (uk)
KR (1) KR101795984B1 (uk)
CN (1) CN106456800B (uk)
AU (1) AU2015250759B2 (uk)
BR (1) BR112016024619A2 (uk)
CA (1) CA2946469C (uk)
CY (1) CY1121783T1 (uk)
DK (1) DK3134124T3 (uk)
ES (1) ES2727103T3 (uk)
HR (1) HRP20190888T8 (uk)
HU (1) HUE044862T2 (uk)
IL (1) IL248455B (uk)
LT (1) LT3134124T (uk)
MA (2) MA47811A (uk)
MX (1) MX2016013704A (uk)
MY (1) MY186711A (uk)
PL (1) PL3134124T3 (uk)
PT (1) PT3134124T (uk)
RS (1) RS58742B1 (uk)
RU (1) RU2692563C2 (uk)
SA (1) SA516380120B1 (uk)
SI (1) SI3134124T1 (uk)
TN (1) TN2016000472A1 (uk)
UA (1) UA120364C2 (uk)
WO (1) WO2015162291A1 (uk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA47811A (fr) * 2014-04-25 2019-06-19 Pf Medicament Kit comprenant un conjugué anticorps-médicament igf-1r et son utilisation pour le traitement du cancer
JP6968790B2 (ja) 2015-10-26 2021-11-17 ピエール、ファーブル、メディカマン Ｉｇｆ−１ｒ発現癌の処置のための組成物
EP3427055A1 (en) 2016-03-07 2019-01-16 Pierre Fabre Medicament A new universal method to capture and analyze adcs for characterization of drug distribution and the drug-to-antibody ratio in biological samples
CN113453724A (zh) 2018-09-27 2021-09-28 皮埃尔法布雷医药公司 基于磺酰基马来酰亚胺的连接子和相应的偶联物
CN111327570B (zh) 2018-12-14 2021-09-17 北京京东尚科信息技术有限公司 验证方法、装置和计算机可读存储介质
EP3735991A1 (fr) * 2019-05-06 2020-11-11 Pierre Fabre Medicament Adc pour un traitement concomitant ou postérieur au docétaxel
EP3909612A1 (en) 2020-05-12 2021-11-17 Life Science Inkubator Betriebs GmbH & Co. KG Composition of nanoparticles
WO2023240223A2 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Acelyrin, Inc. Anti-igf-1r antibody compositions
EP4353220A1 (en) 2022-10-12 2024-04-17 Pierre Fabre Medicament Use of a liquid aqueous composition for solubilization and stabilization of an antibody-drug conjugate

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0731106B1 (en) 1993-10-01 2004-11-17 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin derivatives
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US20050276812A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
BRPI0617546A2 (pt) 2005-09-26 2011-07-26 Medarex Inc conjugado de fÁrmaco-anticorpo, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula de tumor, mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de um tumor em um sujeito mamÍfero e composto
TW200833711A (en) 2006-12-22 2008-08-16 Genentech Inc Antibodies to insulin-like growth factor receptor
AR065803A1 (es) 2007-03-23 2009-07-01 Smithkline Beecham Corp Uso de un polipeptido de il- 18 humana y un anticuerpo anti- cd para preparar unmedicamento
EP2144628B1 (en) 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
MX2010003718A (es) 2007-10-19 2010-04-21 Genentech Inc Anticuerpos anti-tenb2 producidos por ingenieria de cisteina y conjugados de farmaco y anticuerpo.
EP2276509B1 (en) 2008-04-11 2016-06-15 Seattle Genetics, Inc. Detection and tratment of pancreatic, ovarian and other cancers
EP2403524A4 (en) 2009-03-06 2012-09-26 Agensys Inc CONJUGATES ANTIBODY-DRUG (ADC) BINDING PROTEINS 24P4C12
WO2010146059A2 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
EP2579887B1 (de) 2010-06-10 2014-11-12 Seattle Genetics, Inc. Neue auristatin-derivate und ihre verwendung
ES2553874T3 (es) 2010-09-29 2015-12-14 Seattle Genetics, Inc. N-Carboxialquil-auristatinas y su uso
ES2730941T7 (es) * 2010-10-22 2020-05-27 Seattle Genetics Inc Efectos sinérgicos entre los conjugados de conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina e inhibidores de la ruta PI3K-AKT-mTOR
EP2635310A2 (en) 2010-11-05 2013-09-11 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
CN103764667B (zh) 2011-03-16 2017-06-20 西雅图基因公司 N‑羧烷基耳他汀类及其应用
US9150644B2 (en) 2011-04-12 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (IGF) I and II
EP3170821B1 (en) 2011-05-27 2021-09-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
JP6581774B2 (ja) 2011-05-27 2019-09-25 アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. 非天然アミノ酸結合ドラスタチン誘導体を含有する化合物またはその化合物の溶媒和物、およびドラスタチンアナログを誘導体化するための方法
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
AU2013270686B2 (en) 2012-06-07 2016-11-10 Ambrx, Inc. Prostate-specific membrane antigen antibody drug conjugates
EP2861262B1 (en) 2012-06-19 2018-11-28 Ambrx, Inc. Anti-cd70 antibody drug conjugates
US20140017265A1 (en) 2012-07-05 2014-01-16 Mersana Therapeutics, Inc. Terminally Modified Polymers and Conjugates Thereof
CN104781281A (zh) 2012-08-14 2015-07-15 安吉奥开米公司 包含抗体部分、穿过血脑屏障的多肽和细胞毒素的结合物
EP2934596A1 (en) 2012-12-21 2015-10-28 Glykos Finland Oy Linker-payload molecule conjugates
FR3005051A1 (fr) 2013-04-25 2014-10-31 Pf Medicament Derives de la dolastatine 10 et d'auristatines
MA47811A (fr) * 2014-04-25 2019-06-19 Pf Medicament Kit comprenant un conjugué anticorps-médicament igf-1r et son utilisation pour le traitement du cancer
RU2685259C2 (ru) 2014-04-25 2019-04-17 Пьер Фабр Медикамент Конъюгат антитела и лекарственного средства и его применение для лечения рака
CN112851808A (zh) * 2014-04-25 2021-05-28 皮埃尔法布雷医药公司 Igf-1r抗体及其作为定位载体用于治疗癌症的用途
JP6968790B2 (ja) * 2015-10-26 2021-11-17 ピエール、ファーブル、メディカマン Ｉｇｆ−１ｒ発現癌の処置のための組成物

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016145444A3 (uk) 2018-11-22
SI3134124T1 (sl) 2019-06-28
EP3498301A1 (en) 2019-06-19
IL248455A0 (en) 2016-11-30
PT3134124T (pt) 2019-06-03
TN2016000472A1 (en) 2018-04-04
US10633448B2 (en) 2020-04-28
CY1121783T1 (el) 2020-07-31
HRP20190888T1 (hr) 2019-07-12
EP3134124A1 (en) 2017-03-01
CA2946469A1 (en) 2015-10-29
MA39909A (fr) 2017-03-01
BR112016024619A2 (pt) 2017-10-10
MA47811A (fr) 2019-06-19
AU2015250759A1 (en) 2016-11-10
MY186711A (en) 2021-08-12
KR20160146817A (ko) 2016-12-21
PL3134124T3 (pl) 2019-09-30
RU2016145444A (ru) 2018-05-28
IL248455B (en) 2020-01-30
HRP20190888T8 (hr) 2019-10-04
AU2015250759B2 (en) 2017-11-30
US20170043031A1 (en) 2017-02-16
MX2016013704A (es) 2017-03-31
JP6258523B2 (ja) 2018-01-10
KR101795984B1 (ko) 2017-11-10
DK3134124T3 (da) 2019-05-06
CN106456800A (zh) 2017-02-22
WO2015162291A1 (en) 2015-10-29
US11661457B2 (en) 2023-05-30
LT3134124T (lt) 2019-05-27
MA39909B1 (fr) 2019-05-31
SA516380120B1 (ar) 2019-02-27
CN106456800B (zh) 2018-05-01
RS58742B1 (sr) 2019-06-28
EP3134124B1 (en) 2019-02-20
RU2692563C2 (ru) 2019-06-25
CA2946469C (en) 2019-10-29
HUE044862T2 (hu) 2019-11-28
JP2017513900A (ja) 2017-06-01
ES2727103T8 (es) 2020-03-02
US20200270352A1 (en) 2020-08-27
ES2727103T3 (es) 2019-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120364C2 (uk) Кон'югат антитіла до igf-1r з лікарським засобом
US11918656B2 (en) Antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
US11400094B2 (en) 2H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
US11806404B2 (en) Site specific homogeneous with KSP inhibitors
TWI609887B (zh) 新穎的抗原結合蛋白及其作爲治療癌症之定址產物的用途
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
US20110200627A1 (en) Anti-cd147 antibodies, methods and uses
UA119570C2 (uk) Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування
ES2841249T3 (es) Anticuerpo IGF-1R y su utilización como un vehículo de direccionamiento para el tratamiento del cáncer
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
AU2022259796A1 (en) Antibody drug conjugates comprising STING agonists
CN115515644A (zh) 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
CA3137516A1 (en) Methods of using a bispecific antigen-binding construct targeting her2 for the treatment of biliary tract cancers